CN106163552A

CN106163552A - 用于产生针对人嗜t‑淋巴病毒1型的免疫应答的慢病毒载体

Info

Publication number: CN106163552A
Application number: CN201580016360.3A
Authority: CN
Inventors: D·勒沃; C·伯奇
Original assignee: Sai Lafukedisi Co
Current assignee: Sai Lafukedisi Co
Priority date: 2014-01-27
Filing date: 2015-01-27
Publication date: 2016-11-23
Also published as: JP2017506222A; KR20160111973A; CA2937741A1; SG11201606148UA; BR112016017242A2; WO2015111024A1; US20160331831A1; ZA201605147B; EP3099321A1; JP6612237B2; AU2015208731A1; IL246840A0; US9987351B2

Abstract

本发明涉及采用慢病毒载体通过给予人来诱导免疫应答的组合物、方法和用途，其中慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体，其中慢病毒载体的DNA包含引导HTLV‑1Tax和/或HBZ抗原、和/或p12I和/或p30II抗原表达的启动子。本发明包括这些载体，制备载体的方法和使用载体的方法，包括医疗用途。

Description

用于产生针对人嗜T-淋巴病毒1型的免疫应答的慢病毒载体

技术领域

本发明涉及重组疫苗技术领域，并且涉及慢病毒载体的改进，其可用于在感染人嗜T-淋巴病毒1型(HTLV-1)的患者中产生免疫应答。该病毒提供优于其他病毒的改善的免疫应答。

背景

重组疫苗已随重组DNA技术的进步而发展，允许修饰病毒基因组以产生修饰的病毒。通过这种方式，已能够将遗传序列引入非致病性病毒，从而它们编码需要在感染或转导后于靶细胞内得以表达的免疫原性蛋白质，以在其宿主内发展特定免疫应答。

这类载体构成了疫苗技术的主要优势(Kutzler等，Nat Rev Genet，9(10)：776-788，2008)。具体而言，它们具有优于传统疫苗的优势：避免活(减毒的)病毒和消除灭活疫苗制造的相关风险。

在二十世纪八十年代早期由Mann等引入使用改性的逆转录病毒(逆转录病毒载体)的基因递送(Cell，33(1)：153-9，1983)。最常用的致瘤性逆转录病毒基于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)。它们具有简单的基因组，从中产生多蛋白Gag、Pol和Env并且要求为反式以用于病毒复制(Breckpot等，2007，Gene Ther，14(11)：847-62；He等，2007，Expert Rev vaccines，6(6)：913-24)。一般需要的顺式序列是长末端重复序列(LTR)及其周边序列：用于整合的反向重复序列(IR或att位点)、包装序列Ψ、转运RNA结合位点(引物结合位点，PBS)，和涉及逆转录的一些其它序列(正链起始必需的LTR内的重复R以及多嘌呤序列(PPT))。为了生成复制缺陷型逆转录病毒载体，通常使gag、pol和env基因全部缺失，并且用表达盒替代。

源自慢病毒基因组的逆转录病毒载体(即，慢病毒载体)已涌现为用于基因治疗和免疫治疗目的的有希望的工具，因为它们显示优于其它病毒系统的若干优势。具体地，慢病毒本身没有毒性，并且与其它逆转录病毒不同，慢病毒能够转导非分裂细胞，尤其是树突状细胞(He等，2007，ExpertRev vaccines，6(6)：913-24)，使得通过内源性途径呈递抗原。

慢病毒通过遗传组成相似性、复制的分子机制和与其宿主的生物相互作用连接。它们最常称为缓慢疾病综合征的试剂，该综合征在延长的亚临床感染之后开始并缓慢发展；因此，它们被称作“慢”病毒(Narayan等，1989，J Gen Virol，70(7)：1617-39)。其基本构成与所用逆转录病毒相同但由于附属基因(例如vif、vpr、vpu、nef、tat和rev)的存在而更为复杂，所述附属基因在慢病毒的体内复制中起关键作用。

慢病毒代表逆转录病毒科(Retroviridae)的一个慢病毒(slow virus)属，其包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒可以无限地持续存在于其宿主内，并且在一生的感染期间以不同速度连续复制。病毒在其宿主内的持续复制取决于其避开宿主防御的能力。

重组整合型慢病毒载体的设计基于慢病毒的顺式与反式作用序列的分离。非分裂细胞中的有效转导需要慢病毒基因组中存在两种顺式作用序列：中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。它们导致形成三链DNA结构，称为中心DNA“瓣(flap)”，该结构使基因进入非分裂细胞(包括树突细胞(DC))核内的效率最大化(Zennou等，2000，Cell，101(2)173-85；Arhel等，2007，EMBO J，26(12)：3025-37)。

树突细胞对于抗原递呈而言具有重要作用，因为其构成了以递呈抗原和起始免疫应答为主要功能的抗原递呈细胞(APC)的主要类型。

为产生免疫应答，须由细胞将抗原蛋白加工成肽，所述肽通过主要组织相容性复合物蛋白(MHC)在细胞表面显示。循环的APC在引流淋巴结内将肽-MHC复合物递呈至T细胞，其在此处与T细胞受体相互作用并联合共刺激信号一起激活T细胞。

多项研究已显示，使用慢病毒载体的接种导致DC进行抗原呈递和抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL；CD8⁺T细胞)的强激活。因此，在过去的10年中，慢病毒载体已经工程改造用于基因转化和免疫疗法应用。

载体通常含有含增强子的强组成型启动子，如CMV启动子(Michelini等，Vaccine27(34)：4622-29(2009)；Karwacz等，J.Virol.83(7)：30943103(2009)；Negri等，MolecularTherapy 15(9)：1716-23(2007)；和Buffa等，J.General Virology 87：1625-1634(2006))。

已通过移除LTR U3序列，产生完全不含原先在LTR中存在的病毒启动子和增强子序列的“自动失活”载体，从而改善了慢病毒载体的安全性。

可通过在不同的DNA质粒瞬时转染细胞，例如HEK 293T人培养细胞后由重组技术产生含有慢病毒载体的慢病毒颗粒：

(i)包装质粒，其表达至少Gag、Pol、Rev、Tat，并在一些情况下表达转移构建体的包装所必需的结构和酶蛋白；

(ii)原病毒转移质粒，其含有包装、逆转录和整合所必需的表达盒和HIV顺式作用因子；以及

(iii)编码包膜的质粒，在多数情况下是水泡性口炎病毒(VSV.G)的糖蛋白，该蛋白允许形成能够靶向多种细胞(尤其是主要组织相容性(MHC)抗原递呈细胞(APC)，包括DC的混合颗粒(假型)。

该方法能够使转染的细胞瞬时生产慢病毒颗粒载体。然而，也可通过向细胞基因组中稳定地插入包装基因、原病毒编码DNA和包膜基因来连续产生慢病毒颗粒载体。这使得能够由细胞连续产生慢病毒颗粒载体而不需要瞬时转染。当然，也可使用这些方法的组合，其中将一些DNA/质粒整合至细胞基因组而其他的通过瞬时转染提供。

已经设计非整合的慢病毒载体。非整合的慢病毒载体的示例提供于Coutant等，PLOS ONE 7(11)：e48644(2102)，Karwacz等，J.Virol.83(7)：3094-3103(2009)，Negri等，Molecular Therapy 15(9)：1716-1723(2007)；Hu等，Vaccine 28：6675-6683(2010)。

自动失活的慢病毒载体中病毒启动子和增强子序列的3′LTR的U3区域的缺失限制了内源性启动子激活的可能性。这些对于安全性的关注直接体现了1998-1999年进行的SCID-X1基因治疗试验所获得的经验，该试验使用基于莫罗尼病毒的逆转录病毒载体针对患有罕见类型的X连锁(SCID-X1基因)严重免疫缺陷疾病的儿童进行(Cavazzana-Calvo等，2000，Science.，288(5466)：669-72)。在该试验中，9名儿童中的4名由于莫罗尼衍生的慢病毒载体在非常靠近人LM02原癌基因处整合而发展出白血病(Hacein-Bey-Abina等，2008，J.Clin.Invest.，118(9)：3132-3142)。这表明，恶性肿瘤是病毒U3启动子/增强子接近LM02原癌基因的结果。结果，安全性是向人给予慢病毒载体的主要问题。

启动子可含有增强子，其是可相隔一定距离作为转录激活因子起作用的顺式作用序列。启动子含有增强子已经在病毒衍生的载体中广泛采用，因为它们似乎对于在多种细胞类型中获得转基因强表达而言最高效(Chinnasamy，Chinnasamy等，2000，Hum Gene Ther11(13)：1901-9；Rouas等，2008，Cancer Gene Ther 9(9)：715-24；Kimura等，2007，MolTher 15(7)：1390-9；Gruh等，2008，J Gene Med 10(1)21-32)。然而，考虑到插入诱变的安全问题，应将这类转录增强子序列从慢病毒载体构建体中删除以破坏增强子邻近效应所产生的插入诱变风险。迄今为止，该增强子邻近效应是最常见的插入突变机制并且是基因转移后人或动物肿瘤发生事件的病例中描述的唯一效应。

因此，需要研发不包括病毒增强子但仍然允许转基因编码的免疫原性肽足量表达的逆转录病毒，特别是慢病毒载体，如果可能，表达量与使用CMV启动子时观察到的相当。

最近的研究报道了使用主要组织相容性复合物II型基因(MHC II型)(Kimura等，2007，MolTher 15(7)：1390-9)和dectin-2基因(Lopes等，2008，J Virol 82(1)：86-95)来源的DC特异性启动子代替病毒启动子。Lopes等使用的dectin-2基因启动子包含推定的增强子和腺病毒保守序列(腺病毒启动子中的反向末端重复)(Bonkabara等，2001，J.Immunology，167：6893-6900)。Kimura等使用的MHC II型基因启动子不含任何已知增强子。

然而，当在静脉内给予时，在没有增强子的情况下，发现MHC II型启动子无法在DC中提供足够的转基因表达。具体而言，与使用CMV启动子/增强子所观察到的免疫应答相反，包含MHC II型启动子的慢病毒载体未能在免疫活性C57BL/6小鼠中引起免疫反应。虽然在小鼠中注射后观察到了整合和持续的转基因表达，但通过MHC II型启动子转录的慢病毒载体无法刺激抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞应答，甚至在疫苗接种加强后也是如此。因此，这些研究的作者的结论是使用MHC II型启动子仅对于在基因替换疗法中寻求持续表达的应用而言有兴趣，但在免疫疗法中没有兴趣。应注意，MHC II型启动子在大多数细胞类型中弱表达。

因此，对于通过IV注射诱导针对抗原的免疫应答，MHC II型启动子不是适当的慢病毒载体启动子。此外，dectin-2启动子在大多数细胞类型中弱表达并且似乎含有增强子。因此，由于安全原因，dectin-2启动子不是良好的慢病毒载体启动子。

优选地，在免疫治疗中，慢病毒载体提供了有效的转基因表达，其引发所需的特异性免疫应答。这需要APC(如树突细胞)中的表达处于高水平。

还优选通过免疫应答除去慢病毒载体所转导的细胞以提供更高水平的安全性。即，针对转基因产生的免疫应答可在宿主中引发足以除去慢病毒载体转导细胞的免疫应答。消除经转导的细胞消除了慢病毒载体在宿主中的持续存在，以及该载体的可能二级作用。为了消除经转导的细胞，在非树突细胞中需要一定水平的表达以由免疫应答进行消除。因此，需要适当地表达抗原。

同时，启动子应通过原初和记忆T细胞的激活中涉及的关键细胞(即树突细胞)使免疫刺激最大化并应使导致恶性肿瘤的干细胞中的插入诱变和基因毒性的风险最小化。因此，启动子应在树突和其他细胞中具有足够高的活性，但不含增强子。基于这些标准，由于强增强子的存在，病毒启动子(如CMV启动子)不是理想的。这些标准归纳如下：

1.在抗原递呈细胞(包括树突细胞)中高表达以诱导最大的免疫应答；

2.在其他转导的细胞类型中以足够的水平表达，该表达水平足以供于通过诱导的免疫应答进行消除；以及

3.缺少增强子元件以避免插入效应。

嗜人T淋巴病毒1型(HTLV-1)是成人T-细胞白血病/淋巴瘤(ATL)的病原体(Poiesz等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77(12)：7415-7419；Yoshida等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：2031-2035)。HTLV-1在病因上也与其他病原体相关，还没有针对其的治愈或有效治疗：脊髓病/热带痉挛性瘫痪(HAM/TSP)、带血管周围脱髓鞘和轴突变性的脊髓中灰质和白质的炎性慢性脊膜脊髓炎；以及葡萄膜炎和自身免疫疾病。因此，一种病毒，HTLV-1能导致至少两种疾病(ATL和HAM/TSP)；感染的个体不会同时发展这两种疾病。

全球估计有大约2000万个体感染了HTLV-1，确定的地方性区域(即，日本，一些非洲国家，加勒比岛国和中南美洲)和不同的病毒亚型(全球主要是A亚型)显示低的遗传变异性(Gessain和Cassar，2012，Front.Microbiol，3：388)然而，通常在感染发生后的20-30年中，HTLV-1感染者发展ATL和炎性慢性疾病(HAM/TSP)的估计终身风险低于5％。大多数感染者保持无症状携带者，破解HTLV-1发病机理是个问题。

ATL是一种恶性淋巴细胞异常增生症，其已经被分成四种亚型：郁积型、慢性、淋巴瘤和急性(Shimoyama，1991，Br.J.Haematology，79(3)：428-437)。按照以下标准进行分类：淋巴细胞计数、异常淋巴细胞百分比、乳酸脱氢酶(LDH)水平、钙水平和皮肤损伤。第五种状态有时也被成为“前-ATL”，其特征为无症状疾病，具有一定百分比的带典型ATL形态的异常外周血淋巴细胞。ATL细胞实际具有所谓的“花细胞”方面，其具有缩聚的染色质，小或没有核以及嗜碱性白细胞和嗜碱性粒细胞胞质。

发展ATL的患者通常经历淋巴结病、发热、皮肤损伤、白细胞增多和肝脾肿大。对于无痛性ATL亚型(即，慢性和郁积型亚型)，平均存活时间大约是4年(Takasaki等，2010，Blood，115(22)：4337-4343)：慢性压型为2-5年，并且郁积型大约为3年。然而，患有侵袭性亚型(即，急性、淋巴瘤、或不利的慢性型ATL)的患者的平均存活时间降至5-13个月，甚至在采用多药物化疗的预测试验中也是如此。

预后因素是晚期功能状态、高钙水平、高乳酸脱氢酶水平、年龄(超过40岁)和多于三个涉及的损伤。应注意，发展ATL的个体更易于发生机会性感染(Oliere等，2011，Cytokine Growth Factor Rev，22(4)：197-210)。

ATL的治疗取决于疾病亚型(Oliere等，2011，Cytokine Growth Factor Rev，22(4)：197-210)。然而，治疗选项非常首先并且可用的疗法仅仅延迟了复发时间。

虽然，作用机制仍不明确，评价叠氮胸苷(AZT，Zidovudine)和干扰素-α组合的功效的研究给出了振奋人心的结果。对评价AZT加干扰素-α的试验的元分析显示5年总体存活率达到了46％，该值从未在任何其他实验ATL治疗中报道(Bazarbachi等，2010，J.Clin.Oncol.，28(27)：4177-4183)。尤其是在白血病ATL亚型(急性，慢性和郁积型)中并且以第一线给予治疗时观察到存活益处。然而，用AZT/干扰素-α进行治疗存在许多副作用并且这是一个没有中断的终身治疗。

向该组合疗法中加入三氧化二砷的初步结果表明，作为巩固治疗这可能是有益的，并且值得进一步研究(Kchour等，2013，Retrovirology，10：91)。

在日本，三期临床试验显示在新诊断的急性、淋巴瘤和不利慢性ATL中由依次给予三种药物组合(VCAP(长春新碱，环磷酰胺，多柔比星，泼尼松龙)，AMP(多柔比星，雷莫司汀，泼尼松龙)和VECP(长春地辛，依托泊苷，卡铂，泼尼松龙))组成的mLSG15方案优于每两周CHOP(环磷酰胺-羟基多柔比星-安可平-泼尼松龙)，中值无进展存活是7.0个月并且总体存活是12.7个月(Tsukasaki等，2007，J.Clin.Oncol.，25(34)：5458-5464)。

迄今为止，当选择的治疗选项是多药物化疗时，仍然由临床医师根据个体效益/风险比决定是否使用CHOP或VCAP-AMP-CECP。

在经过复发或难治性ATL的患者上进行的II期临床试验期间，人源化的单克隆抗-CC趋化因子受体4(CCR4)抗体已经显示对于ATL有效，尤其是在急性亚型疾病中。用抗体莫加利珠单抗(mogamulizumab)治疗研究中招募的27名患者。在可评价的26名患者中，13名实现了目标应答，并且其中8名实现完全应答(Ishida等，2012，J.Clin.Oncol.，30(8)：837-842)。在2012年3月，莫加利珠单抗在日本批准用于治疗复发或难治性ATL(商品名)。上市后监督报告了多个严重的皮肤相关不良事件，包括斯蒂文斯-约翰逊综合症(它们之一是致命的)，强烈需要对用莫加利珠单抗的最优治疗策略有更好的理解(Ishida等，2013，Cancer Sci.，104(5)：647-650)。最近，与单独mLSG15相比，在加至mLSG15时，在患有急性、淋巴瘤和不利慢性ATL的患者中莫加利珠单抗结合提供了额外的无进展存活(PFS)。

其他单克隆抗体正处于研究中，如针对CD25的抗体，其已经在临床试验中单独或与钇-90偶联评价。一种抗-转铁蛋白抗体也在临床前阶段给出了振奋人心的结果。

已经用同种异体造血干细胞移植(allo HSCT)作为对ATL的治愈性治疗获得理想的结果。虽然，可能受益于该选项的患者数量非常有限(发展ATL的患者通常老龄并且因此临床医师不愿意进行该操作；另外，发现相容性供体可能是困难的)(Obama等，1999，Int.J.Hematol.，69(3)：203-205)。此外，在allo HSCT的少数适格患者中，30％的患者发生移植物抗宿主疾病，带有严重的副作用或导致死亡，约30％的患者复发，并且仅大约30％的患者被治愈。

一份感兴趣的研究报告了在化疗治疗失败后，用莫加利珠单抗和之后的alloHSCT成功治疗患者(Motohashi等，2013，Int.J.Hematol，98(2)：258-260)。

因此，虽然一些临床试验已经通过增加应答率给出了振奋人心的结果，大多数疗法无法在长期存活上实现显著影响。此外，测试的治疗主要是侵袭性的。

正在ATL患者中评价已批准或未批准用于治疗其他T-细胞淋巴瘤的新药。这些是，例如，伏立诺他和罗咪酯肽组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC)，经FDA-批准用于治疗复发和难治性皮肤T-细胞淋巴瘤或阿来组单抗，和一种抗-CD52抗体，经批准用于治疗慢性淋巴性白血病。

拼命寻找在疾病的侵袭性或无痛形式中具有更好的总体存活影响、低副作用和可能不用终身治疗的对ATL患者的新疗法。

一种解释无症状HTLV-1携带者(AC)发展ATL之前的长潜伏期的假设是宿主免疫应答和HTLV-1基因组表达之间的平衡(Yoshida，2010，Proc.JpnAcad.Ser.B.Phys.Biol.Sci.，86(2)：117-130)。

事实上，多个观察和实验指出了宿主免疫系统在受感染患者中控制HTLV-1扩散和HTLV-1相关疾病中的关键作用。其中，在动物模型(大鼠)中，通过哺乳的HTLV-1垂直传播导致造成较高ATL风险的免疫耐受(Hasegawa等，2003，J.Virol.，77(5)：2956-2963；Komori等，2006，J.Virol.，80(15)：7375-7381)。然而，口腔感染之间皮下注射HTLV-1感染的大鼠细胞防止ATL出现。其他人已经报告了在肝移植后用免疫抑制剂治疗的无症状携带者(AC)中ATL的发展(Kawano等，2006，Transplantation，82(6)：840-843；Suzuki等，2006，Int.J.Hematol.，83(5)：429-432)。此外，已经观察到用allo-HSCT治疗的ATL患者中的抗-HTLV-1免疫应答增加，并被称为移植物抗白血病(GVL)效应，导致患者缓解(Harashima等，2004，Cancer Res.，64(1)：391-399)。此外，已经描述了在ATL中的低抗-HTLV-1免疫应答，其可能有利于患者中疾病的引发和进展(Kannagi等，2011，Cancer Sci.，102(4)：670-676；Kannagi等，2012，Front.Microbiol.，3：323)。

体外实验证明对HTLV-1有特异性的CTL主要识别Tax并且在较低的程度上识别包膜、聚合酶、p12、p30和HBZ(在(Kannagi等，2012，Front.Microbiol，3：323)中综述)。已经评价了来自AC和ATL患者的CD8+T细胞的频率、多样性和多功能性；结果证明在ATL对比AC患者中这三种参数的受损响应(Kozako等，2006，J.Immunol.，177(8)：5718-5726；Manuel等，2013，J.Clin.Immunol.，33(7)：1223-1239)。

这些和其他研究证明，特异性HTLV-1细胞免疫应答在已经发展ATL的患者中严重受损。因此，目标在于刺激针对HTLV-1感染的细胞的细胞免疫应答的疗法可能是治疗ATL的合适治疗选项。

临床前研究已经证明，针对HTLV-1病毒蛋白Tax的疫苗在动物模型中治疗ATL表型的功效。事实上，在ATL表型的大鼠模型中(Ohashi等，1999，J.Virol.，73(7)：6031-6040)，用Tax DNA进行体内疫苗接种诱导了能够在体外裂解HTLV-1细胞的Tax特异性CTL的刺激。这些CTL过继转移同时用HTLV-1感染的细胞注射在体内抑制肿瘤生长((Ohashi等，2000，J.Virol.，74(20)：9610-9616)。

在另一个研究中，植入来自急性或慢性ATL亚型患者的ATL CD4+细胞导致NOG小鼠中ATL样表型。同时注射用Tax肽体外刺激的来自患者的CTL，由于肿瘤部位处识别并杀伤HTLV-1肿瘤细胞的CTL渗透而导致ATL损伤减少。

最近，使用由来自病毒蛋白质Tax的肽脉冲处理的自体树突细胞的治疗性疫苗作为ATL治疗的I期临床试验显示初步的振奋人心的结果：原病毒负荷降低和表面淋巴结大小降低(Suehiro等，2013，来自人逆转录病毒：HTLV和相关病毒的第十六次国际会议的摘要册(abstract book from the 16th International Conference on Human Retrovirology：HTLV and RelatedViruses))。更令人注目的是，完成研究的2名患者之一实现了部分缓解，而另一个有稳定的疾病而没有严重副作用。

所有这些数据确认了用针对HTLV-1细胞的细胞免疫应答刺激将成为治疗ATL患者的强治疗选项。

仅在测试针对HTLV-1的疫苗接种的临床试验中使用的离体肽疫苗接种的第一个缺点在于根据其HLA单倍型选择适于治疗的患者。其次，自体DC的离体成熟需要从患者的PBMC中纯化的步骤，导致重复消耗循环的单核细胞。在病理上，这可能对于患者的免疫系统而言是不利的。此外，自体DC的纯化是非常昂贵的并且为了实现良好性能而有技术挑战(例如，参见用于前列腺癌治疗的来自丹德里昂公司(Dendreon)的疫苗(Huber等，2012，J.Natl.Cancer Inst.，104(4)：273-279))。

因此，本领存在对改善在人中治疗HTLV-1的方法和载体的需求。本发明满足本领域中的这些需要。

发明内容

本发明包括包含慢病毒载体的组合物以及使用该组合物的方法和用途。本发明包括用于在人中诱导免疫应答的方法、组合物和用途。慢病毒载体颗粒可包含慢病毒载体，其中慢病毒载体的DNA包含引导包含HTLV-1 p12p30-Tax-HBZ融合蛋白的多肽表达的启动子。

在一个实施方式中，本发明包括包含慢病毒载体颗粒的组合物通过向人肌肉内给予诱导免疫应答的用途，其中该慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体；其中慢病毒载体的DNA包含引导包含HTLV-1 p12p30-Tax-HBZ融合蛋白的多肽表达的启动子。

在一个实施方式中，本发明包括包含慢病毒载体颗粒的组合物用于通过向人肌肉内给予诱导免疫应答，其中该慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体；其中慢病毒载体的DNA包含引导包含HTLV-1 p12p30-Tax-HBZ融合蛋白的多肽表达的启动子。

在一些实施方式中，慢病毒载体包含β2m启动子或MHC I型启动子。

在一些实施方式中，由具有SEQ ID NO：20的核苷酸序列的DNA编码HTLV-1p12p30-Tax-HBZ融合蛋白。

在一些实施方式中，HTLV-1 p12p30-Tax-HBZ融合蛋白包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列。

在一些实施方式中，该组合物包含至少10⁷个慢病毒载体颗粒。

附图的简要说明

图1显示了按照用于刺激T细胞的肽的集合(p12I或p30II特异性)，在注射不同剂量(1.10e6，1.10e7，1.10e8TU/小鼠)的含p12Ip30II HTLV-1抗原的慢病毒载体后在C57B1/6j小鼠中引发的T-细胞特异性免疫应答(ELISpot IFN-γ)(累积应答，中值)。

图2显示了按照用于刺激T细胞的肽的集合(Tax或HBZ特异性)，在注射不同剂量(1.10e6，1.10e7，1.10e8TU/小鼠)的含抗原Tax和HBZ的不同组合，即Tax-HBZ、Tax-2A-HBZ、HBZ-Tax、HBZ-2A-Tax的慢病毒载体后在C57B1/6j小鼠中引发的T-细胞特异性免疫应答(ELISpot IFN-γ)(累积应答，中值)。

图3显示了按照用于刺激T细胞的肽的集合(Tax，HBZ，p12I或p30II特异性)，在注射不同剂量(1.10e6，1.10e7，1.10e8TU/小鼠)的含抗原Tax和HBZ的不同组合，即Tax-HBZ-p12Ip30II和p12Ip30II-Tax-HBZ的慢病毒载体后在C57B1/6j小鼠中引发的T-细胞特异性免疫应答(ELISpot IFN-γ)(累积应答，中值)。

图4A-C显示表达HTLV抗原的慢病毒载体在体外对永生化的MEF中没有影响。A.转导的永生化MEF的增殖曲线。B.MEF中整合的载体的拷贝。C.转导的永生化MEF的生长速率。

图5显示在体内，表达HTLV抗原的慢病毒载体对小鼠重量没有影响。

图6显示转导的小鼠的体内荧光素酶表达的动力学(腹侧接触)。S5-S8是仅表达荧光素酶的慢病毒载体。S35-S38是表达p12Ip30II-Tax-HBZ抗原和荧光素酶基因(通过IRES从抗原分离)的慢病毒载体。S39-S40是未注射对照。

图7显示转导的小鼠的体内荧光素酶表达的动力学(背侧接触)。S5-S8是单独荧光素酶。S35-S38是表达p12Ip30II-Tax-HBZ抗原和荧光素酶基因(通过IRES从抗原分离)的慢病毒载体。S39-S40是未注射对照。

发明详述

慢病毒可诱导强力、持久和多样性的T-细胞介导的应答。然后，激活针对由慢病毒载体编码的抗原的细胞免疫应答。另外，与例如对于带强烈副作用(即，自身免疫疾病)的终身治疗的AZT与干扰素-α的组合相反，高效的治疗性疫苗接种可能使得患者停止接受治疗维持一段可持续的时间，从而降低了副作用、成本等。

与其他逆转录病毒相反，HTLV-1显示出显著的遗传稳定性；可能是由于通过感染的细胞的克隆扩增(由有丝分裂驱动的复制)而不是易于错误的逆转录(即，之前未感染的细胞的从头感染)的病毒扩散。因此，可使用编码抗-HTLV-1抗原的慢病毒载体来治疗全世界的患者。

基于它们参与增殖和转化的宿主细胞调节机制，选择4种HTLV-1蛋白来设计抗-HTLV-1抗原：Tax、HBZ、p12I和p30II。

Tax蛋白

通过HTLV-1转化CD4+T淋巴细胞的早期步骤与其主要癌基因Tax的致癌性质相关。该病毒蛋白位于宿主细胞的细胞核中并且与转录因子或染色质模塑酶(modeller)相互作用来促进细胞增殖(Haller等，2000，AIDSRes.Hum.Retroviruses，16(16)：1683-1688；Jeang，2001，Cytokine Growth Factor Rev.，12(2-3)：207-217；Azran等，Retrovirology，1：202004；Boxus等，2008，Retrovirology，5：76)。已经证明Tax的表达通过激活多个细胞信号转导通路(即，NF-kB，SRF或AP1)导致T淋巴细胞的增殖和分化。Tax也通过调节复制起点活化的时间和产生DNA双链断裂的活性氧化物质的生成削弱了基因组稳定性。另外，Tax已经描述为显示出关于宿主细胞凋亡相反的作用。事实上，在低表达水平下，Tax抑制细胞凋亡(Brauweiler等，1997，Virology，231(1)：135-140；Tsukahara等，1999，J.Virol.，73(10)：7981-7987；Kasai和Jeang，2004，Retrovirology，1：7)，并且被认为是致突变和致癌的(参见(Boxus等，2008，Retrovirology，5：76)的综述)。相反，在高表达水平下，Tax似乎对细胞有毒并且诱导凋亡和迅速衰老(Chen等，1997，J.Gen.Virol.，78(Pt12)：3277-3285；deLa Fuente等，2000，J.Virol.，74(16)：7270-7283；Kao等，2000，Oncogene，19(18)：2240-2248；Nicot和Harrod 2000，Mol.Cell.Biol.，20(22)：8580-8589；de la Fuente等，2003，Mol.Cell.Biochem.，245(1-2)：99-113；Zhang等，2009，Retrovirology，6：35；Ho等，2012，J.Virol.，86(17)：9474-9483)。Tax由受感染的细胞表达，尤其是在感染早期的受感染的细胞。然而，观察已经报道Tax表达经常在急性形式的ATL；至少HTLV-1感染的细胞的优势循环克隆中关闭(Kannagi等，2012，Front.Microbiol.，3：323)。

HTLV-1bZIP因子(HBZ)

HTLV-1bZIP因子(HBZ)是参与T淋巴细胞增殖的另一种病毒蛋白。其由原病毒的负链编码并且位于宿主细胞的细胞核中。其具有双重作用，HBZ RNA促进细胞增殖(Satou等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103(3)：720-725；Arnold等，2008，Blood，112(9)：3788-3797)并且HBZ蛋白可能通过抑制经典NF-κB通路并且通过下调Tax的表达来促进HTLV-1感染的细胞从逃脱宿主免疫攻击，Tax是感染患者的免疫系统的主要靶标(Gaudray等，2002，J.Virol.，76(24)：12813-12822；Lemasson等，2007，J.Virol.，81(4)：1543-1553；Zhao等，2009，Blood，113(12)：2755-2764)。另外，HBZ在维持转化状态中起主要作用并且可能使得HTLV-1能够将T淋巴细胞转化成调节T细胞，其被认为对于病毒持续而言关键。

辅助蛋白P12I和P30II

P12I位于内质网(ER)和高尔基体的膜中。其参与细胞增殖(Nicot等，2005，Oncogene，24(39)：6026-6034；Edwards等，2011，Viruses，3(6)：861-885)。此外，p12I使MHCI靶向降解并且抑制自然杀伤(NK)细胞与细胞的粘附；防止HTLV-1感染的细胞被免疫系统识别(Nicot等，2005，Oncogene，24(39)：6026-6034；Banerjee等，2007，J.Virol.，81(18)：9707-9717)。P8I蛋白，一种膜结合的P12I的截短形式，下调Tax活性(Fukumoto等，2007，J.Virol.，81(17)：9088-9099)。

最后，p30II同时是核和核仁蛋白，其是病毒蛋白表达的负调节物(Nicot等，2004，Nat.Meth.，10(2)：197-201；Michael等，2006，Virology，354(2)：225-239)。P30II导致参与细胞过程、细胞信号转导、凋亡、DNA复制和修复、血管生成以及细胞迁移的数种基因的转录和转录后调节(Taylor等，2009，BMC Genomics，10：311)。另外，p30II与DNA修复通路相互作用(Baydoun等，2011，Blood，117(22)：5897-5906)。应注意，p13II，p30II的剪接同种型，同时位于线粒体和核中，参与钙稳态和钙依赖基因表达的调控，参与ROS产生和凋亡(Biasiotto等，2010，Biochim.Biophys.Acta，1797(6-7)：945-951；Silic-benussi等，2010，Molecular Aspects Med.，31(5)：350-358)并且参与对Tax活性的抑制(Andresen等，2011，Blood，118(6)：1549-1559)。

选择的病毒蛋白在ATL发病中的推定作用

Tax、HBZ、p12I和p30II与细胞器相互作用并破坏其代谢。通过它们对细胞增殖、DNA修复和免疫系统应答的作用，它们被认为是可由白细胞表达致癌蛋白，尽管在ATL患者中发现低的体内表达(Kannagi等，2012，Front.Microbiol.，3：323)。事实上，Tax是在ATL患者中发现的免疫显性靶抗原(Kannagi等，1991，Int.Immunol.，3(8)：761-767；Pique等，1996，J.Virol.，70(8)：4919-4926)。另外，已经在用allo-HSCT治疗的实现缓解的ATL患者中观察到靶向Tax的免疫应答(Harashima等，2004，Cancer Res.，64(1)：391-399)。在HTLV-1感染的T细胞和巨噬细胞中离体和体外检测到p12I/p8I的RNA(Koralnik等，1992，AIDSRes Hum Retroviruses，8(11)：1845-1849)。此外，无论临床状态如何，由HTLV-1患者的免疫系统体内靶向p12I和p30II(Chen等，1997，Int.J.Cancer，71(2)：196-202；Dekaban等，2000，Virology，274(1)：86-93；Pique和Dokhelar，2000，AIDS Res.Hum.Retroviruses，16(16)：1783-1786)。如果体内HTLV-1蛋白表达仍有争议，那么HBZ表达似乎在研究的所有ATL患者病例中是保守的(Zhao和Matsuoka，2012，Front.Microbiol.，3：247)。另外，已经观察到在HTLV-1携带者中针对HBZ的免疫应答(Macnamara等，2010，PloS Pathog.，6(9)：e1001117；Enose-Akahata等，2013，Retrovirology，10：19)。

因此，同时含有Tax和HBZ肽序列的抗原可以是在患者体内刺激针对ATL细胞的免疫应答的相关策略，无论病毒蛋白表的水平如何，因为假设强调了细胞中白细胞的不同病毒蛋白表达模式的模式(Umino等，2011，Blood，117(20)：5473-5478)。Tax和HBZ抗原的另一个优点在于序列上的低遗传变异(Kubota等，2007，J.Immunol.，178(9)：5966-5972；Zhao和Matsuoka，2012，Front.Microbiol，3：247)。最后，p12I和p13II位于内质网而p8I位于细胞膜的脂阀中。由于从细胞内的膜向胞质膜的转运，来自这些蛋白质的序列可能存在于细胞表面上。选择同种型蛋白质P12I/P8I和P30II/P13II的共有序列中的表位可能导致增强的免疫应答。

基于这些发现、这些蛋白的表达及其在ATL发病和维持中的作用，临床上的相关策略是引发针对TAX、HBZ、p12和p30中的1种、2种、3种或全部4种的强效和选择性细胞免疫应答。

安全抗原的设计

将病毒蛋白靶向亚细胞定位(其中它们展示出它们的活性)的所有序列被截短或删除。另外，不是主要表位的部分的参与转录因子或其他效应物的相互作用的跨膜结构域和序列已经截短或删除以消除任何野生型活性。来自Tax、HBZ、p12I和p30II的表位使用接头序列或直接融合和组合。关于Tax的致癌活性，其他病毒对Tax表达的下调可能限制其被免疫系统识别和表达Tax的细胞的裂解。在慢病毒载体中，包含来自Tax、HBZ、P12I和P30II的肽的抗原的表达处于β2微球蛋白启动子的控制下，因此，抗原在宿主细胞中组成型表达并且不能通过病毒肽与β2微球蛋白启动子的相互作用来调节表达，限制了Tax多肽致癌作用的风险。

在本发明的研究中，已经测试了Tax、HBZ、p12I和p30II抗原的不同组合在C57B1/6j小鼠中诱导细胞免疫应答的能力。

已经通过Elispot试验在C57B1/6j小鼠中评价了HTLV-1抗原的各种组合的T-细胞特异性应答(图1、2和3)。首次证明针对HBZ、p12I和p30II的免疫接种可在动物模型中诱导T-细胞免疫应答。

令人惊讶的是，T-细胞应答不仅根据抗原(Tax、HBZ、p12I或p30II)变化，也根据这些抗原的组合和构造变化。

例如，图1证明Tax-HBZ抗原诱导了比HBZ-Tax更强的T-细胞应答。另外，与HBZ-TAX相反，Tax-HBZ抗原似乎在1.10e6TU/小鼠的情况中有明显免疫原性。有趣的是，构建体Tax-2A-HBZ在C57B1/6j中比不带2A序列的直接融合的Tax-HBZ的免疫原性低，其中HBZ-Tax和HBZ-2A-Tax有相似的效果。

选择Tax-HBZ和p12Ip30II抗原以包括在一起。在两种组合中，Tax-HBZ抗原直接融合至抗原p12Ip30II：p12Ip30II-Tax-HBZ和Tax-HBZ-p12Ip30II。如之前所观察，结果证明T-细胞免疫应答根据组合明显变化，即，p12Ip30II-Tax-HBZ抗原在C57B1/6j小鼠中诱导比Tax-HBZ-p12Ip30II更强的T-细胞应答。

抗-HTLV-1疫苗的设计已经揭示了不同选择抗原的组合在C57B1/6j小鼠中诱导强效且合适的T-细胞免疫应答的重要性。为了开发具有最高的刺激特异性免疫应答能力的疫苗，多肽的预测构象与合适表位的选择一样重要。观察到的最佳抗原组合是p12Ip30II-Tax-HBZ抗原。

进行了对表达p12Ip30II-Tax-HBZ抗原的慢病毒载体的致癌性的体外评价。进行了安全性评价以确保抗原性组合物不会在转导后干扰细胞代谢。用载体以及阳性和阴性对照转导原代永生化细胞(原代且自发永生化的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和原代人胚胎成纤维细胞MRC5)。评价包括在内含培养基(琼脂)中生长，生长持续3周，因为在3D内的细胞不增殖/生长，除非它们显示出致癌性质。评价也包括对菌落的显微观察和检测试剂盒。结果示于图4。

用表达p12Ip30II-Tax-HBZ抗原的慢病毒载体转导原代成纤维细胞没有导致MRC5形态变化。用表达p12Ip30II-Tax-HBZ抗原的慢病毒载体转导永生化MEF在大约1个月期间没有导致生长变化。在用表达p12Ip30II-Tax-HBZ抗原的慢病毒载体，或者甚至用野生型HTLV-1蛋白转导的永生化MEF中没有发现克隆原性细胞。

用阴性对照评价表达p12Ip30II-Tax-HBZ抗原的慢病毒载体+VPX载体在NOG小鼠中的致癌性。结果示于图5。没有观察到对小鼠的影响。

通过将荧光素酶表达盒插入慢病毒载体以及对照载体中来检验在体内来自表达p12Ip30II-Tax-HBZ抗原的慢病毒载体的表达。在腹侧或背侧肌肉内注射到NOG小鼠之后，通过生物发光检测荧光素酶表达。结果见图6和7。

从给予后6小时开始看到荧光素酶表达。在组1(HTLV-荧光素酶)中，观察到生物发光随着时间降低。在组2(仅荧光素酶)中，观察到生物发光随着时间增加。

直至研究结束(第66天)也没有观察到肿瘤生长。

向动物肌肉内给予具有驱动免疫原性蛋白的表达的特定启动子的整合的慢病毒载体产生意料之外的针对该蛋白质的高且延长的免疫应答，其导致从该动物中消除整合的载体。因此，本发明提供了具有高且延长的免疫应答以及增加的人给药安全性的新慢病毒载体。

因此，本发明包括采用慢病毒载体颗粒通过给予人来诱导免疫应答的组合物、方法和用途，其中慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体，其中慢病毒载体的DNA包含引导HTLV-1Tax和/或HBZ抗原、和/或p12I和p30II抗原表达的启动子。优选地，由具有SEQ ID NO：8、SEQID NO：10、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：14-SEQ ID NO：21的核苷酸序列的DNA编码抗原。更优选地，抗原由SEQ ID NO：20编码。

MHC I型和β2m启动子

MHC I型启动子显示NF-Kb结合位点、干扰素刺激应答元件(ISRE)和SXY调控模块(SXY)的保守性。人β2-微球蛋白(β2m)启动子与MHC I型启动子有一定的相似性，因为其包含ISRE，尽管是在单个NF-Kb结合位点的上游。

MHC II型启动子被认为是抗原递呈细胞(包括树突细胞)特异性启动子。虽然MHCII型启动子含有SXY模块，其不含NF-Kb结合位点或ISRE(Van den Helsen等，1998，Immunogenetics，48：208-221)。因此，MHC II型启动子和MHC I型启动子截然不同。因此，它们也有非常不同的细胞表达模式(图24)。

另一个抗原递呈细胞特异性启动子dectin-2含有干扰素刺激应答元件(ISRE)；但不含SXY模块(Bonkabara等，2001，J.Immunology，167：6893-6900)。

多种哺乳动物(人)MHC I型启动子的序列如下所示：

HLA-A2(MHC I)：

attggggagtcccagccttggggattccccaactccgcagtttcttttctccctctcccaacctatgtagggtccttcttcctggatactcacgacgcggacccagttctcactcccattgggtgtcgggtttccagagaagccaatcagtgtcgtcgcggtcgcggttctaaagtccgcacgcacccaccgggactcagattctccccagacgccgagg

(SEQ ID NO：1)

HLA-B7(MHC I)：

ggggaggcgcagcgttggggattccccactcccctgagtttcacttcttctcccaacttgtgtcgggtccttcttccaggatactcgtgacgcgtccccacttcccactcccattgggtattggatatctagagaagccaatcagcgtcgccgcggtcccagttctaaagtccccacgcacccacccggactcagag(SEQ ID NO：2)

HLA-Cw5(MHC I)：

cactggggaggcgccgcgttgaggattctccactcccctcagtttcacttcttctcccaacctgcgtcgggtccttcttcctgaatactcatgacgcgtccccaattcccactcccattgggtgtcgggttctagagaagccaatcagcgtctccgcagtcccggtctaaagtccccagtcacccacccggactcagattctccccagacgccgag

(SEQ ID NO：3)

HLA-E(MHC I)：

taagaactgctgattgctgggaaactctgcagtttcccgttcctctcgtaacctggtcatgtgtccttcttcctggatactcatgacgcagactcagttctcattcccaatgggtgtcgggtttctagagaagccaatcagcgtcgccacgactcccgactataaagtccccatccggactcaagaagttctcaggactcagagg(SEQ ID NO：4)

HLA-F(MHC I)：

aggccccgaggcggtgtctggggttggaaggctcagtattgagaattccccatctccccagagtttctctttctctcccaacccgtgtcaggtccttcatcctggatactcataacgcggccccatttctcactcccattgggcgtcgcgtttctagagaagccaatcagtgtcgccgcagttcccaggttctaaagtcccacgcaccccgcgggactcatatttttcccagacgcggaggttggggtcatg(SEQ ID NO：5)

人β2-微球蛋白启动子的序列如下所示：

aacatcacgagactctaagaaaaggaaactgaaaacgggaaagtccctctctctaacctggcactgcgtcgctggcttggagacaggtgacggtccctgcgggccttgtcctgattggctgggcacgcgtttaatataagtggaggcgtcgcgctggcgggcattcctgaagctgacagcattcgggccgag(SEQ ID NO：6).

MHCI和β2m启动子不含增强子。此外，这些启动子是树突细胞特异性的，即BDCA+树突细胞中启动子的表达高于肾、平滑肌、肝脏和心脏细胞中的表达(http：//biogps.org)。它们也在其他转导的细胞类型中有较高的表达，例如，在BDCA+树突细胞中启动子的表达仅仅是在骨骼肌细胞中该启动子表达的12-100倍，与MHCII HLA-DRα启动子的900倍相反。同上。

本发明包括包含MHCI和β2m启动子的慢病毒载体，及其通过肌肉内给药在宿主中诱导免疫应答的用途。

本发明包括一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含来自引导转基因转录的MHC I型或β2m基因启动子的启动子序列，其在宿主细胞中，优选在树突细胞(DC)中优选编码免疫原性多肽。

给药方法

本发明包括向人给予慢病毒的载体(或“慢病毒载体”)的方法。优选地，慢病毒载体含有驱动抗原在抗原呈递细胞(包括树突细胞)中高表达，并且驱动在其他转导的细胞类型中表达足以被诱导的免疫应答消除的启动子。更优选地，该启动子缺少增强子元件以避免插入效应。

优选地，给药是肌肉内。在一个实施方式中，使用针将慢病毒载体注射到肌肉中。

优选地，慢病毒颗粒是包含功能性整合酶蛋白的整合的慢病毒颗粒。

在一个实施方式中，本发明包括用于在人中诱导免疫应答的方法，包括肌肉内给予慢病毒载体颗粒。本发明包括采用慢病毒载体颗粒通过肌肉内给予人来诱导免疫应答的方法，其中慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体，其中慢病毒载体的DNA包含引导HTLV-1 Tax和/或HBZ抗原、和/或p12I和p30II抗原表达的启动子。优选地，由具有SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：14-SEQ ID NO：21，最优选SEQ ID NO：20的核苷酸序列的DNA编码抗原。

优选地，慢病毒载体颗粒的剂量是10⁶、2x10⁶、5x 10⁶、10⁷、2x 10⁷、5x 10⁷、10⁸、2x10⁸、5x 10⁸、或10⁹TU。

可以单剂，或多(即，2、3、4等)剂向对象给予慢病毒颗粒。可以首次(初免)和第二次(加强)给药给予慢病毒颗粒。在一个实施方式中，第一剂包含10⁷至10⁸TU的慢病毒载体颗粒，而第二剂包含10⁷至10⁸TU的慢病毒载体颗粒。

第一次给药和第二次给药之间以及给药和后续给药之间的时间可能变化。在一个实施方式中，给药之间的时间是2-6周。在多个实施方式中，给药之间的时间是至少2、4、6、8、10、12、15、30、或52周。在多个实施方式中，给药之间的时间是至少1、3、6、9、12、24、36、或48个月。在多个实施方式中，给药之间的时间是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。

慢病毒载体

在本发明范围内，“慢病毒载体”指非复制型载体，其供于使用包含顺式作用慢病毒RNA或DNA序列的转基因转导宿主细胞，且需要以反式形式提供的慢病毒蛋白(例如Gag、Pol和/或Env)。慢病毒载体缺少功能性Gag、Pol和Env蛋白的表达。慢病毒载体可以RNA或DNA分子的形式存在，这取决于所述逆转录载体的产生或发展阶段。

慢病毒载体可以是重组DNA分子的形式，如质粒。慢病毒载体可以是慢病毒颗粒载体的形式，如慢病毒和其他蛋白质的复合物中的RNA分子。通常，对应于修饰或重组的慢病毒颗粒的慢病毒颗粒载体包含由两个单链RNA拷贝组成的基因组。这些RNA序列可通过从插入宿主细胞基因组的双链DNA序列(原病毒载体DNA)转录获得，或者可由转化的宿主细胞中质粒DNA(质粒载体DNA)的瞬时表达获得。

优选地，慢病毒载体颗粒具有整合能力。因此，它们含有功能性整合酶蛋白。非整合载体颗粒有一个或多个突变，其消除了慢病毒载体颗粒的大部分或全部整合能力。例如，非整合载体颗粒可在由慢病毒pol基因编码的整合酶中含有突变，其导致整合能力降低。相反，整合载体颗粒包含功能性整合酶蛋白，其不含任何消除慢病毒载体颗粒的大部分或全部整合能力的突变。

慢病毒载体来源于慢病毒，尤其是人免疫缺陷病毒(HIV-1或HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)，其经修饰以除去涉及致病性的遗传决定簇并导入对获得治疗效果有用的新决定簇。

这类载体基于顺式和反式作用序列的分离。为制备复制缺陷型载体，可删除反式作用序列(如gag、pol、tat、rev和env基因)并使用编码转基因的表达盒代替。

非分裂细胞中的有效整合与复制通常需要慢病毒基因组中心存在两种顺式作用序列：中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。这导致形成三链DNA结构，称为中心DNA“瓣(flap)”，其作为对核孔处的整合前复合物脱包被并将表达盒有效导入非分裂细胞(如树突细胞)的细胞核的信号。

在一个实施方式中，本发明包括包含称为cPPT/CTS序列的中心多嘌呤序列和中心终止序列，具体地，在欧洲专利申请EP 2169073中。

其它序列通常以顺式出现，如参与载体原病毒DNA序列整合到宿主细胞基因组的长末端重复(LTR)。可通过使LTR序列突变以获得载体，例如在所述LTR的结构域U3中突变(ΔU3)(Miyoshi H等，1998，J Virol.72(10)：8150-7；Zufferey等，1998，J Virol 72(12)：9873-80)。

优选地，载体不含增强子。在一个实施方式中，本发明包括包含LTR序列的慢病毒载体，优选具有移除了3’LTR中启动子和增强子序列的突变的U3区(ΔU3)。

也可整合包装序列Ψ(psi)以辅助多核苷酸序列衣壳化成载体颗粒(Kessler等，2007，Leukemia，21(9)：1859-74；Paschen等，2004，CancerImmunol Immunother 12(6)：196-203)。

在一个实施方式中，本发明包括包含慢病毒包装序列Ψ(psi)的慢病毒载体。

其它额外的功能性序列，如转运RNA-结合位点或引物结合位点(PBS)或土拨鼠后调控元件(WPRE)也可优选包含在本发明的慢病毒载体多核苷酸序列中，以得到转基因在体内更稳定的表达。

在一个实施方式中，本发明包括包含PBS的慢病毒载体。在一个实施方式中，本发明包括包含WPRE和/或IRES的慢病毒载体。

因此，在优选的实施方式中，慢病毒载体包含至少一种cPPT/CTS序列、一种Ψ序列、一种(优选2种)LTR序列和包括在β2m或MHC I型启动子转录控制下的转基因(优选包含SEQ ID NO：20的核苷酸序列)的表达盒。

启动子

在多个实施方式中，启动子在抗原递呈细胞(包括树突细胞)中驱动高表达以诱导最大免疫应答。优选地，启动子在其他转导的细胞类型中诱导足够表达，该表达足以供于通过诱导的免疫应答进行消除。更优选地，该启动子缺少增强子元件以避免插入效应。

最优选地，启动子不是CMV启动子/增强子。优选地，启动子不是dectin-2或MHCII启动子。

在多个实施方式中，慢病毒载体包含β2m或MHC I型启动子。优选地，MHC I型启动子是HLA-A2启动子、HLA-B7启动子、HLA-Cw5启动子、HLA-F或HLA-E启动子。在多个实施方式中，启动子序列包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的启动子序列具有超过90％、优选超过95％、更优选超过99％相同性的多核苷酸序列。

本发明包括含有不含增强子的启动子的慢病毒载体。

本发明包括将MHC I型(MHCI)或β2m微球蛋白(β2m)启动子插入慢病毒载体中。如本文中所用，“MHC I型(MHCI)启动子”或“β2微球蛋白启动子”包括天然产生或合成的MHC I型启动子或β2微球蛋白启动子。术语“MHC I型启动子”并不包括β2m启动子。

启动子可以是天然产生的启动子。天然产生的启动子的示例是人β2m、HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E、HLA-G基因启动子。这些天然产生的MHCI启动子一般从编码MHC I型蛋白的基因的启动子区域中克隆或复制，后称为推定的编码，如基因组数据库中的蛋白质(如NCBI多核苷酸数据库http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/dna-rna)。β2m和MHC I型蛋白都进入主要组织相容性复合物(MHC)。

这些基因编码的蛋白质发现于几乎所有细胞类型中。MHCI蛋白一般存在于白细胞膜的表面处，其中它们与β2-微球蛋白(β2m)结合。这些相关联蛋白质的作用是将内源性来源的肽递呈至CD8+T细胞。因此，其在抗原特异性免疫应答的产生过程中起核心作用。因为多年来MHC I型蛋白已得到了广泛研究和描述，所以其基因已被成熟表征并可使用序列比对工具(如BLAST法)良好地检测(Altschul，S.F.等(1990).Basic local alignmentsearch tool.(局部比对检索基本工具)J.Mol.Biol.215(3)：403-410)。

MHC I型启动子也共有在抗原递呈细胞(包括树突细胞)中被强激活的能力，以及，在大多数其它人体组织中降低强度的能力。

本发明的启动子还可含有调控元件，如一个或多个Sp1和ETs结合位点。在一个优选实施方式中，MHC I型启动子含有2个Sp1结合位点和1个Ets结合位点。在其他实施方式中，Ap1和/或Ap2位点也包含在启动子中。

优选的启动子是天然产生的人β2m、HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E和HLA-F启动子。

启动子也可以是合成的。合成的启动子包括使用分子生物学技术组装启动子的个体组分合成的启动子或者使用分子生物学技术由天然产生的启动子衍生的启动子。

在多个实施方式中，合成的启动子包含与β2m或MHC I型基因启动子(SEQ ID NO：1-6)的启动子序列具有超过90％、优选超过95％、更优选超过99％、或100％相同性的多核苷酸序列。

在一个实施方式中，本发明包括一种方法，该方法包括将β2m或MHC I型启动子插入慢病毒载体中以引导转基因的表达，所述转基因优选编码HTLV-1 Tax、HTLV-1 bZIP因子(HBZ)、和/或辅助蛋白P12I和P30II抗原，最优选包含或由SEQ ID NO：66的氨基酸序列组成。该方法还可包括插入本文中所述任意其他核酸元件，如DNA瓣序列。

转基因

在本发明范围内，“转基因”指待用慢病毒载体转导的慢病毒载体中的核酸序列，其正常情况下不存在于细胞中。慢病毒用于将该序列导入经转导的细胞。术语“转基因”不包括促进转基因转导的那些载体序列。转基因可以是来自另一种生物体的核酸序列。或者，转基因可以是来自相同生物体的核酸序列，但具有控制其表达的不同调控序列。转基因可以是正义或反义核酸分子。根据本发明的优选实施方式，转基因序列编码抗原或免疫原性多肽。

优选地，该抗原或免疫原性多肽是HTLV-1 Tax、HTLV-1 bZIP因子(HBZ)、和/或辅助蛋白P12I和/或P30II抗原或免疫原性多肽。优选地，由本发明的转基因编码几种表位形成多表位。在多个实施方式中，转基因包含由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：14-SEQID NO：21编码的抗原中的至少1个、2个、3个或4个。

优选地，抗原或免疫原性多肽包含或由HTLV-1 p12p30-Tax-HBZ融合蛋白组成。

特别优选的TLV-1 p12p30-Tax-HBZ融合蛋白包含以下氨基酸序列：

MPKTRRRPRRSQRKRPPTPWQPPPFSLQGLHLAFQLSSIAINPQLLHFFFPSTMLFRLLSPLSPLALATSAAFFSARLLRRALTMLIISPLPRVWTEMAHFPGFGQSLLFGYPVYVFGDCVDGRVIGSALQFLIPRLPSFPTQRTSKTLKVLTPPITHTTPNIPPSFLQAMRKYSPFRNGYMEPTLGQHLPTLSFPDPGLRPQNLYTLWGGSVVCMYLYQLSPPITWPLLPHVIFCHPGQLGAFLTNVPYKRIEKLLYKISLTTGALIILPEDCLPTTLFQPARAPVTLTAWQNGLLPFHSTLTTPGLIWTFTDGTPMISGPCPKDGQPSLVLQSSSFIFHKFQTKAYHPSFLLSHGLIQYSSFHNLHLLFEEYTNIPISMLFRCLPVSCPEDLLVEELVDGLLSLEEELKDKEEEKAVLDGLLSLEEESRGRLRRGPPGEKAPPRGETHRDRQRRAEEEREKEEEKQIAEYLKRKEEEKAREKKAADVARRKQEEQER(SEQ ID NO：66).

可由相同的抗原诱导基于B细胞和基于T细胞的免疫应答。

慢病毒载体颗粒产生

本发明提供了生产慢病毒颗粒载体的方法，其优选不包括启动子系列而是含有β2m或MHCI启动子。慢病毒颗粒载体(或慢病毒载体颗粒)包括与病毒蛋白质相关联的慢病毒载体。该载体优选是整合载体。

用不含增强子的β2m或MHCI启动子替换在现有技术载体中使用的用于驱动基因表达的病毒增强子序列可通过以下改善整合逆转录病毒载体的安全性：

1)降低与增强子序列有关的插入诱变的风险；并且

2)引发针对转基因产物的免疫应答，使得整合载体的所有细胞(无论细胞类型)被免疫系统清除。因此，一段时间后，人体可不含这类载体的任何复制物。

根据该方法的一个实施方式，慢病毒载体颗粒在转化有DNA质粒的宿主细胞中获得。这种DNA质粒可包含：

-细菌复制起点(如pUCori)；

-用于选择的抗生素抗性基因(如KanR)；且更具体地：

-含有与β2m或MHC I型启动子转录相关的至少一种转基因的慢病毒载体。

该方法允许产生根据本发明的重组载体颗粒，包括以下步骤：

i)使用慢病毒载体转染合适的宿主细胞；

ii)使用包装质粒载体转染所述宿主细胞，所述包装质粒载体含有编码反转录病毒(优选慢病毒)的至少结构和聚合酶(+/-整合酶)活性的病毒DNA序列，；这类包装质粒在本领域中已有描述(Dull等，1998，J Virol，72(11)：8463-71；Zufferey等，1998，J Virol72(12)：9873-80)。

iii)培养所述转染的宿主细胞以使所述慢病毒载体表达并包装成慢病毒载体颗粒；以及

iv)收获所述培养的宿主细胞中由步骤iii)的表达和包装所得到的慢病毒载体颗粒。

基于不同原因，制备获得的逆转录病毒颗粒的假型(即增加或代替特定颗粒包膜蛋白)可能是有帮助的。例如，具有不同的包膜蛋白以区分重组颗粒与天然颗粒或其他重组颗粒可能是有利的。在疫苗接种策略中，当后者已经发展出针对慢病毒的免疫时，假型颗粒载体更有可能逃避免疫系统。如果类似的颗粒载体的连续注射是使患者对疾病产生免疫所必需的，那么这是特别有帮助的。

为制备本发明的逆转录病毒颗粒的假型，还可使用编码病毒包膜蛋白(优选VSV-G包膜蛋白)的一种或数种包膜DNA质粒来转染宿主细胞。

合适的宿主细胞优选是人培养细胞系，例如HEK细胞系。

或者用于生产载体颗粒的方法可在宿主细胞中进行，其基因组已使用如下一种或多种组分稳定转化：慢病毒载体DNA序列、包装基因和包膜基因。这类DNA序列可被视作与本发明的原病毒载体类似，包含额外的启动子以允许载体序列转录并提高颗粒生产率。

在优选实施方式中，还对宿主细胞进行修饰，使其能够在培养基中以连续的方式生产病毒颗粒，同时整个细胞不发生溶胀或死亡。关于用于生产病毒颗粒的这类技术，可参见Strang等，2005，J Virol 79(3)：1165-71；Relander等，2005，MolTher 11(3)：452-9；Stewart等，2009，Gene Ther，16(6)：805-14；和Stuart等，2011，Hum gene Ther。

本发明的目的由用慢病毒颗粒载体转化的宿主细胞组成。

慢病毒颗粒载体可包括以下元件，如前文所定义：

-cPPT/CTS多核苷酸序列；以及

-β2m或MHC I型启动子控制下的转基因序列，和可选的上文所述其他元件中的一种。

细胞中表达转基因的方法

本发明包括用于在细胞(优选非分裂细胞)中表达转基因的方法。该方法包括在允许转基因表达的条件下，使用本发明的慢病毒载体或慢病毒颗粒载体转导细胞。

细胞优选是哺乳动物细胞，特别是人细胞。特别优选的是人非分裂细胞。

转基因优选编码免疫原性多肽。该方法还可包括收获或分离所述多肽。特别优选的多肽是由SEQ ID NO：8、10、12、14、和15-21，最优选SEQ ID NO：20的核苷酸序列编码的那些。

慢病毒载体或慢病毒颗粒载体优选包含β2m或MHCI启动子。

在一个实施方式中，本发明包括表达转基因的方法，包括将本发明的转基因插入慢病毒载体并且用含有转基因的载体转导细胞。

慢病毒载体的治疗性用途

本发明还涉及本发明的慢病毒载体，尤其是慢病毒载体颗粒形式，用于制备治疗性组合物或疫苗的应用，所述治疗性组合物或疫苗能够诱导或造成针对表位发生免疫反应或该反应的增强，所述免疫反应更特定地是针对由存在于所述载体中的转基因编码的那些表位。

因此，本发明提供了用作药物或疫苗，尤其是用于肌肉内给药的载体。

这些载体优选用于治疗或预防感染性疾病，尤其是与HTLV-1病毒感染相关的疾病。

由于本发明的载体更特异性地靶向树突细胞以获得细胞介导的免疫应答，特别是与这些细胞中的转基因表达的抗原相关联的CTL应答，其作为靶向HTLV-1的疫苗时特别有用。

因此，本发明涉及包含前文所定义的慢病毒载体的免疫原性组合物。

本发明的免疫原性组合物优选包含载体和载体颗粒中的cPPT和CTS序列，以诱导或刺激载体基因组在靶细胞中的核输入。

逆转录期间，cPPT和CTS序列诱导称作DNA三链体的三链DNA结构的形成，其刺激DNA载体序列的核输入。优选地，该载体包含转基因以及逆转录病毒或逆转录病毒样来源逆转录、表达和壳体化的调控信号，该组合物能够诱导或刺激CTL(细胞毒性T淋巴细胞)和/或CD4对载体中存在的转基因序列所编码的一种或数种表位产生应答。

载体中包含β2m或MHCI启动子极大地改善了转基因的表达。

因此，本发明的慢病毒载体能够诱导、提高记忆CTL应答的发生或通常与之相关联。换言之，通过诱导、刺激或参与细胞介导免疫应答(特别是CTL应答或记忆应答)的发生，它们可用于制备用于治疗HTLV-1-相关疾病的治疗性组合物。

本发明的慢病毒载体可用于治疗方法和诱导免疫应答的方法，包括向宿主给予慢病毒载体并在宿主中产生针对转基因的特异性免疫应答。这些宿主中生成的细胞和抗体可用作诊断试剂。

本发明的慢病毒载体优选用于肌肉内给予，最优选通过用针注射。

在特定实施方式中，本发明的免疫原性组合物可直接给予患者，以可诱导、提高或在体内参与细胞介导的免疫应答(特别是CTL介导的免疫应答)的发生的方式给予。

在另一个实施方式中，免疫原性组合物可单次使用或重复给予后使用，使其能够产生长期记忆型细胞介导的应答。

本发明的免疫原性组合物的一个具体优势在于它们可用于引发或刺激针对由载体或载体颗粒中存在的转基因或感兴趣的核苷酸序列编码的多表位的细胞介导的免疫应答。

本发明还包括包含核苷酸序列的慢病毒载体，所述核苷酸序列编码诱导细胞应答的氨基酸序列的多个重复(至少2条相同序列)和/或含有至少2条不同序列(对应于不同抗原的2个表位)的氨基酸序列。特别优选的抗原是由SEQ ID NO：8、10、12、14、和15-21，最优选SEQ ID NO：20的核苷酸序列编码的那些。

结果，本发明包括可用于预防性和/或治疗性免疫接种方案的组合物，用于治疗HTLV-1相关疾病。

具体而言，其可与佐剂、其他免疫原性组合物、化疗或任何其他治疗性处理联用。

本发明包括用于向人肌肉内给药的包含慢病毒载体颗粒的组合物，该慢病毒载体颗粒包含功能性整合酶蛋白和慢病毒载体；其中慢病毒载体的DNA包含引导抗原表达的β2m或MHCI启动子。特别优选的抗原是由SEQ ID NO：8、10、12、14、和15-21的核苷酸序列编码的那些。

本发明包括用于通过向人肌肉内给药来诱导免疫应答的包含慢病毒载体颗粒的组合物，其中该慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体；其中慢病毒载体的DNA包含引导HTLV-1Tax抗原表达的启动子，并且其中HTLV-1 Tax抗原由具有SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、或SEQ ID NO：21的核苷酸序列的DNA编码。

本发明包括用于通过向人肌肉内给药来诱导免疫应答的包含慢病毒载体颗粒的组合物，其中该慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体；其中慢病毒载体的DNA包含引导HTLV-1HBZ抗原表达的启动子，并且其中HTLV-1 HBZ抗原由具有SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、或SEQ ID NO：21的核苷酸序列的DNA编码。

本发明包括用于通过向人肌肉内给药来诱导免疫应答的包含慢病毒载体颗粒的组合物，其中该慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体；其中慢病毒载体的DNA包含引导P12I抗原(p12I Ag)或P30II抗原(p30II Ag)表达的启动子，并且其中P12I抗原(p12I Ag)或P30II抗原(p30II Ag)抗原由具有SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、或SEQ ID NO：21的核苷酸序列的DNA编码。

本发明包括包含慢病毒载体颗粒的组合物用于通过向人肌肉内给药来诱导免疫应答的用途，其中该慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体；其中慢病毒载体的DNA包含引导任意上述抗原表达的启动子，并且其中该抗原由具有SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、或SEQ ID NO：21的核苷酸序列的DNA编码。

本发明包括包含慢病毒载体颗粒的组合物用于通过向人肌肉内给药来诱导免疫应答的用途，其中该慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体，其中慢病毒载体的DNA包含引导HTLV-1 p12p30-Tax-HBZ融合蛋白的多肽表达的启动子，优选地其中该抗原由具有SEQ IDNO：20的核苷酸序列的DNA编码和/或具有SEQ ID NO：66的氨基酸序列。

因此，已经描述了本发明的不同实施方式，本领域技术人员应注意，本文所公开的内容仅是示例性的，且多种其他替代、调整或修改可包括在本发明的范围内。因此，本发明不限于本文所示特定实施方式。

实施例

实施例1.抗原

已经使用以下病毒蛋白来这几用于疫苗候选的HTLV-1抗原：Tax、HBZ、p12I和p30II。下文描述了相应的DNA编码序列和表位设计。

Tax序列

野生型编码序列：atggcccacttcccagggtttggacagagtcttcttttcggatacccagtctacgtgtttggagactgtgtacaaggcgactggtgccccatctctgggggactatgttcggcccgcctacatcgtcacgccctactggccacctgtccagagcatcagatcacctgggaccccatcgatggacgcgttatcggctcagctctacagttccttatccctcgactcccctccttccccacccagagaacctctaagacccttaaggtccttaccccgccaatcactcatacaacccccaacattccaccctccttcctccaggccatgcgcaaatactcccccttccgaaatggatacatggaacccacccttgggcagcacctcccaaccctgtcttttccagaccccggactccggccccaaaacctgtacaccctctggggaggctccgttgtctgcatgtacctctaccagctttccccccccatcacctggcccctcctgccccatgtgattttttgccaccccggccagctcggggccttcctcaccaatgttccctacaaacgaatagaaaaactcctctataaaatttcccttaccacaggggccctaataattctacccgaggactgtttgcccaccacccttttccagcctgctagggcacccgtcacgctgacagcctggcaaaacggcctccttccgttccactcaaccctcaccactccaggccttatttggacatttaccgatggcacgcctatgatttccgggccctgccctaaagatggccagccatctttagtactacagtcctcctcctttatatttcacaaatttcaaaccaaggcctaccacccctcatttctactctcacacggcctcatacagtactcttcctttcataatttgcatctcctatttgaagaatacaccaacatccccatttctctactttttaacgaaaaagaggcagatgacaatgaccatgagccccaaatatcccccgggggcttagagcctctcagtgaaaaacatttccgtgaaacagaagtctga(SEQ ID NO：7).

Tax蛋白的主要活性区：aa 1-165，核定位序列；aa 4-174，与Creb 1相互作用的结构域；aa 67-147，锌指结构域；aa 217-240，SH3结合结构域；aa 241-285，与CrebbP/P300相互作用结构域；aa 316-333，与Ikbkg相互作用结构域；aa 337-738，与NF-κB相互作用结构域；aa 346-435和aa 637-744，同二聚化结构域；aa 562-606，核输出信号；aa 865-966，反式活化结构域；aa 934-957，与Crebb-Cter相互作用结构域；aa 1048-1059，PDZ结合结构域。

Tax抗原(Tax Ag)

atggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctcc(SEQ ID NO：8).

已经从Tax野生型(WT)中去除的核苷酸序列：aa73-174；aa955-1059。在ATL患者中发现激活T淋巴细胞的主要表位：aa 31-60；aa 262-288；aa 391-435；aa 451-501；aa 526-585；aa 814-840；aa 901-927(Kannagi等，1992；Arnulf等，2004；Suzuki等，2012)。截短或删除的活性结构域：aa 1-165，核定位序列；aa 4-174，与Creb 1相互作用结构域；aa 67-147，锌指结构域；aa 865-966，反式活化结构域；aa 934-957，与Crebb-Cter相互作用结构域；aa 1048-1059，PDZ结合结构域。

HBZ序列

野生型编码序列：atggcggcctcagggctgtttcgatgcttgcctgtgtcatgcccggaggacctgctggtggaggaattggtggacgggctattatccttggaggaagagttaaaggacaaggaggaggagaaagctgtgcttgacggtttgctatccttagaagaggaaagccgcggccggctgcgacggggccctccaggggagaaagcgccacctcgcggggaaacgcatcgtgatcggcagcgacgggctgaggagaagaggaagcgaaaaaaagagcgggagaaagaggaggaaaagcagattgctgagtatttgaaaaggaaggaagaggagaaggcacggcgcaggaggcgggcggagaagaaggccgctgacgtcgccaggaggaagcaggaagagcaggagcgccgtgagcgcaagtggagacaaggggctgagaaggcgaaacagcatagtgctaggaaagaaaaaatgcaggagttggggattgatggctatactagacagttggaaggcgaggtggagtccttggaggctgaacggaggaagttgctgcaggagaaggaggatttgatgggagaggttaattattggcaggggaggctggaggcgatgtggttgcaataa(SEQ ID NO：9).

HBZ蛋白的主要活性区：aa 1-24，转录活化的RNA活性结构域；aa259-276，aa 346-360和aa 412-423，核定位信号；aa 418-576，亮氨酸拉链基序。

HBZ抗原(HBZ Ag)

atgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacgg(SEQ ID NO：10).

已经从HBZ WT中去除的核苷酸序列：aa 1-24；aa 259-276；aa 346-360；aa 412-627。在ATL患者中发现激活T淋巴细胞的主要表位：aa 37-111；aa 133-159；aa 172-198；aa232-258；aa 310-381；aa 475-621(MacNamara等，2010)。截短或删除的活性结构域：aa 1-24，转录活化的RNA活性结构域；aa 259-276，aa 346-360和aa 412-423，核定位信号；aa418-576，亮氨酸拉链基序。

P12I/p27I同种型序列：

野生型编码序列：

atgcccaagacccgtcggaggccccgccgatcccaaagaaaaagacctccaacaccatggcagcctcctccgttcagcctccaaggactccacctcgccttccaactgtctagtatagccatcaatccccaactcctgcattttttctttcctagcactatgctgtttcgccttctcagccccttgtctccacttgcgctcacggcgctcctgctcttcctgcttcctcctagcgacgtcagcggccttcttctccgcccgcctcctgcgccgtgccttctcctcttccttccttttcaaatactcagcggtctgcttttcctcctctttctcccgctctttttttcgcttcctcttctcctcagcccgtcgctgccgatcacgatgcgtttccccgcgaggtggcgctttctcccctggagggccccgtcgcagccggccgcggctttcctcttctaa(SEQ ID NO：11).

p12I/p27I同种型蛋白的主要活性区：aa 184-249和aa 301-360，螺旋跨膜结构域；aa 235-252和aa 319-387，亮氨酸拉链；aa 169-183，aa 256-273，aa367-390和aa 421-438，SH3结合结构域。

P12I抗原(p12I Ag)

atgcccaagaccagaaggcggcccagaagaagccagagaaagaggccccctaccccctggcagcctcctccattcagtctgcagggcctgcacctggccttccagctgagcagcattgccatcaacccccagctgctgcacttcttcttcccttccaccatgctgttccggctgctgagccctctgtctcctctggccctg(SEQ ID NO：12).

*已经从p12I WT中去除的核苷酸序列：aa 202-456。在ATL患者中发现激活T淋巴细胞的主要表位：aa 91-138；aa 169-195；aa235-279；aa 364-411和aa 415-456(Dekaban等，2000；Pique等，2000)。截短或删除的活性结构域：aa 184-249和aa 301-360，螺旋跨膜结构域；aa 235-252和aa 319-387，亮氨酸拉链；aa 256-273，aa 367-390和aa 421-438，SH3结合结构域。

P30II序列

野生型编码序列：

atggcactatgctgtttcgccttctcagccccttgtctccacttgcgctcacggcgctcctgctcttcctgcttcctcctagcgacgtcagcggccttcttctccgcccgcctcctgcgccgtgccttctcctcttccttccttttcaaatactcagcggtctgcttttcctcctctttctcccgctctttttttcgcttcctcttctcctcagcccgtcgctgccgatcacgatgcgtttccccgcgaggtggcgctttctcccctggagggccccgtcgcagccggccgcggctttcctcttctaaggatagcaaaccgtcaagcacagcttcctcctcctccttgtcctttaactcttcctccaaggataatagcccgtccaccaattcctccaccagcaggtcctccgggcatgacacaggcaagcatcgaaacagccctgcagatacaaagttaaccatgcttattatcagcccacttcccagggtttggacagagtcttcttttcggatacccagtctacgtgtttggagactgtgtacaaggcgactggtgccccatctctgggggactatgttcggcccgcctacatcgtcacgccctactggccacctgtccagagcatcagatcacctgggaccccatcgatggacgcgttatcggctcagctctacagttccttatccctcgactcccctccttccccacccagagaacctctaa(SEQ ID NO：13).

p30II蛋白的主要活性区：aa 217-234和aa 271-294，核定位信号；aa 523-552，线粒体靶向信号。

P30II抗原(p30II Ag)

gccaccagcgccgccttttttagcgccagactgctgcggagagccctgaccatgctgatcatcagccccctgcccagagtgtggaccgag(SEQ ID NO：14).

已经从p30II WT中去除的核苷酸序列：aa 1-81；aa 127-456；aa 502-723。在ATL患者中发现激活T淋巴细胞的主要表位：aa 91-117；aa 466-492(Pique等，2000)。截短或删除的活性结构域：aa 217-234和aa 271-294，核定位信号；aa 523-552，线粒体靶向信号。

实施例2.质粒构建

已经进行了对选择抗原的不同质粒构建，抗原直接融合或由2A序列(acg cgt gcccct gtg aag cag acc ctg aat ttc gat ctg ctg aag ctg gcc ggc gac gtg gag tctaat cct ggc cea act agt)隔开，该序列是被认为辅助多肽加工的蛋白水解序列(Luke，2007)。不同的组合是：以优化的密码子合成的Tax-HBZ、Tax-2A-HBZ、HBZ-Tax、HBZ-2A-Tax、p12Ip30II、Tax-HBZ-p12Ip30II和p12Ip30II-Tax-HBZ。抗原性组合的表达处于人β2-微球蛋白启动子的控制下。

测试的HTLV-1抗原的不同组合的序列：

TAX-HBZ

atggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctccatgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggtgatga(SEQ ID NO：15).

HBZ-TAX CO

atgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggatggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctcctgatga(SEQ ID NO：16).

TAX-2A-HBZ

atggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctccacgcgtgcccctgtgaagcagaccctgaatttcgatctgctgaagctggccggcgacgtggagtctaatcctggcccaactagtatgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggtgatga(SEQ ID NO：17).

HBZ-2A-TAX

atgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggacgcgtgcccctgtgaagcagaccctgaatttcgatctgctgaagctggccggcgacgtggagtctaatcctggcccaactagtatggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctcctgatga(SEQ ID NO：18).

p12Ip30II

atgcccaagaccagaaggcggcccagaagaagccagagaaagaggccccctaccccctggcagcctcctccattcagtctgcagggcctgcacctggccttccagctgagcagcattgccatcaacccccagctgctgcacttcttcttcccttccaccatgctgttccggctgctgagccctctgtctcctctggccctggccaccagcgccgccttttttagcgccagactgctgcggagagccctgaccatgctgatcatcagccccctgcccagagtgtggaccgag(SEQ ID NO：19).

p12Ip30II-Tax-HBZ

atgcccaagaccagaaggcggcccagaagaagccagagaaagaggccccctaccccctggcagcctcctccattcagtctgcagggcctgcacctggccttccagctgagcagcattgccatcaacccccagctgctgcacttcttcttcccttccaccatgctgttccggctgctgagccctctgtctcctctggccctggccaccagcgccgccttttttagcgccagactgctgcggagagccctgaccatgctgatcatcagccccctgcccagagtgtggaccgagatggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctccatgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggtgatga(SEQ ID NO：20).

Tax-HBZ-p12Ip30II

atggcccacttccccggctttggccagagcctgctgttcggctaccccgtgtacgtgttcggcgactgcgtggacggcagagtgatcggcagcgccctgcagttcctgatccccagactgcccagcttccccacccagcggaccagcaagaccctgaaggtgctgaccccccccatcacccacaccacccccaatatcccccccagcttcctgcaggccatgcggaagtacagccccttccggaacggctacatggaacccaccctgggccagcatctgcccaccctgagcttccccgatcctggcctgcggccccagaacctgtataccctgtggggcggcagcgtcgtgtgcatgtacctgtaccagctgagccctcctatcacctggcccctgctgccccacgtgatcttttgccaccctggacagctgggcgccttcctgaccaacgtgccctacaagcggatcgagaagctgctgtacaagatcagcctgaccacaggcgccctgatcatcctgcccgaggactgcctgcccaccaccctgtttcagcccgccagagcccctgtgaccctgaccgcctggcagaacggcctgctgcccttccacagcaccctgaccacccctggcctgatctggaccttcaccgacggcacccccatgatcagcggcccctgccctaaggacggccagcctagcctggtgctgcagagcagcagcttcatcttccacaagttccagaccaaggcctaccaccccagctttctgctgagccacggcctgatccagtactccagcttccacaacctgcatctgctgttcgaagagtacaccaacatccccatctccatgctgttcagatgcctgcccgtgtcctgccccgaggacctgctggtggaagaactggtggacggcctgctgagcctggaagaggaactgaaggacaaagaggaagagaaggccgtcctggatggcctgctgtctctggaagaagagagccggggcagactgcggagaggccctcctggcgagaaagccccccctagaggcgagacacaccgggacagacagagaagggccgaggaagagcgcgagaaagaagaggaaaagcagatcgccgagtacctgaagcggaaagaagaagagaaagcccgcgagaagaaagccgccgacgtggccagacggaagcaggaagaacaggaacggtgatgaatgcccaagaccagaaggcggcccagaagaagccagagaaagaggccccctaccccctggcagcctcctccattcagtctgcagggcctgcacctggccttccagctgagcagcattgccatcaacccccagctgctgcacttcttcttcccttccaccatgctgttccggctgctgagccctctgtctcctctggccctggccaccagcgccgccttttttagcgccagactgctgcggagagccctgaccatgctgatcatcagccccctgcccagagtgtggaccgag(SEQ ID NO：21).

使用BamHI和XhoI限制性位点将抗原克隆到pFlap-AG主链中。通过在pVAX-1质粒(英杰公司(Invitrogen))的Spe1和Xba1位点之间扩增并克隆pTRIPΔU3-CMV-GFP的原病毒区生成pFLAP-AG。用SV40序列(从pTRIPΔU3-CMV-GFP中扩增并在Pml1位点之间克隆)补充所得的质粒，pFLAP-CMV-GFP，产生pFLAP-CMV-GFP-SV质粒。然后去除CMV启动子并用人β2-微球蛋白启动子替换(在MluI和BamH1位点之间)。其中可将抗原克隆到GFP标记物的位置上(BamH1-XhI位点)的所得质粒命名为pFLAP-AG。

Tax_Ag-HBz_Ag，HBz_Ag Tax_Ag，Tax_Ag-HBz_P12IP30II和P12IP30II-Tax_Ag-HBz_Ag。从GeneArt(生命技术公司(Lifetechnologies))分开获得抗原并使用融合PCR结合在一起。简言之，对于各抗原性构建体，进行3次分开的PCR反应：第一次PCR扩增第一抗原，第二次PCR扩增第二抗原，包括与第一抗原的末端同源的25bp突出端。PCR1和2产物然后经过凝胶纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，凯杰公司(QIAGEN))并用作第三次PCR的基质：PCR1和2的产物杂交，产生用于扩增完整抗原的基质。用于各构建体的三次PCR的引物示于表1。PCR 3产物经凝胶纯化并在(生命技术公司)中克隆、测序、由BamHI和XhoI限制性酶消化并克隆到pFlap-AG中的相同位点之间。

Tax_Ag-2A-HBz_Ag和HBz_Ag-Tax_Ag。从GeneArt(生命技术公司(Lifetechnologies))分开获得抗原并使用PCR结合在一起。在此，使用了两种PCR技术来构建两种抗原。首先，使用2个连续延长PCR来在第一抗原的末端处添加2A肽的前50个核苷酸，并且用2个连续延长PCR来在第二抗原的开始处添加2A肽的后50个核苷酸。由于2个抗原共享20个相同核苷酸，使用融合PCR来重构建最后的抗原(参见上述融合PCR的说明)。用于PCR的引物示于表2和3。最后的PCR产物经凝胶纯化并在(生命技术公司)中克隆、测序、由BamHI和XhoI限制性酶消化并克隆到pFlap-AG中的相同位点之间。

P12IP30II。密码子优化的P12IP30II购自GeneArt(生命技术公司)，并且使用BamHI和XhoI限制性位点直接克隆到pFlap-AG中。

使用的引物序列示于表1、2和3。

表1.用于实现扩增抗原性构建体的三次PCR的引物。加粗的序列代表与第一抗原的末端同源的5’突出端。

表2.用于连续延长PCR的引物。

表3.用于实现扩增全抗原性构建体的融合PCR的引物。

实施例3.慢病毒载体产生

通过在HEK 293 T细胞中与含有待测试的HTLV-1抗原的质粒，一种衣壳化质粒、一种提供VSV.G包膜的质粒共转染来包装慢病毒载体，基本如Naldini等，1996，Science 272：263-7中所述。

实施例4.免疫监测

为了监测HTLV-1抗原的各组合的特异性T-细胞应答，用1x10⁶TU、1x10⁷TU和1x10⁸TU的慢病毒载体肌肉内免疫C57B1/6j小鼠，其中由人β2-微球蛋白启动子驱动HTLV-1抗原表达。免疫后14天，从用慢病毒载体免疫的小鼠脾脏中分离脾细胞并用于ELISPOT试验。在4℃下，用100ul/孔的5μg/ml抗小鼠IFNγ mAb(小鼠IFNγ Elispot对；BD生物科学法敏进公司(BD Biosciences Pharmingen))过夜包被96孔组织培养板。用200μl DPBS/孔洗涤三次，并使用200μl/孔的RPMI培养基/10％胎牛血清在37℃下封闭2小时。用200μl DPBS/孔洗涤三次。将脾细胞以1×10⁵细胞/孔一式三份加入平板中，并且用2μg/ml的肽刺激集合(对抗原有特异性)、伴刀豆球蛋白A(5μg/ml；来源)或仅培养基刺激。平板在37℃下孵育18小时，然后用200μl/孔的DPBS/0.05％TWEEN^TM 20洗涤三次，并用200μl/孔的DPBS洗涤三次。为进行检测，以10μl/孔加入2μg/ml抗小鼠IFNγ-生物素化单克隆抗体(BD法敏进公司(BDPharmingen))，室温下反应2小时。洗涤板并加入100μl/孔的以1∶2000在杜尔伯科(Dulbecco′s)PBS中稀释的链酶亲和素-碱性磷酸酶(罗氏公司(Roche))，室温下反应90分钟。在洗涤平板之后，通过加入100μl/孔的BCIP/NBT溶液(西格玛公司)使斑点(IFNγ-分泌细胞)可视化。将板在室温下孵育15-30分钟直至蓝斑点出现并随后使用自来水充分洗涤并空气干燥24小时。使用AID读数仪(德国的自身免疫诊断公司(Autoimmun DiagnostikaGmbH))对斑点进行计数。在减去来自对照孔(在不含肽的培养基中培养)的一个之后，从三个重复孔中计算的每一百万中IFNg斑点形成细胞(SFC)的平均数。使用用于疫苗接种的覆盖HTLV-1完全序列的重叠合成肽(GS公司(GenScript))。

实施例5.体外致癌性研究

细胞培养

在10次连续传代之后，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF；ATCC参考SCRC-1008)自发永生化(MEFi)。它们在补充了10％热灭活FBS(新英格兰的海克隆公司(Hyclone))、2mM谷氨酰胺(法国的生命公司(Life))、100Units/mL青霉素-链霉素(法国的生命公司)、1mM丙酮酸钠(法国的生命公司)的达氏改良伊氏培养基(DMEM)中在37℃下含5％CO2的潮湿气氛中培养。

转导

以100000个细胞/孔中6孔板(多孔TC板，法国Falcon)中接种并且允许在37℃，5％CO2和潮湿气氛下粘附。然后，它们被转导两次：初始持续2小时，然后持续6小时，用补充4μg/mL海美溴铵(法国西格玛公司)的10慢病毒GFP、THV02、WT TAX、WT HBZ或WT p12载体的MOI。第二天去除培养基以允许转导的细胞在无慢病毒载体的培养基中生长2天。使用绿色荧光显微镜(Olympus CKX41)获取对照GFP转导的细胞的图像来验证转导效率。

集落形成试验

在含trypLE Select(生命公司，法国)的无慢病毒载体的培养基中3天后用胰蛋白酶消化MEFi和转导的MEFi细胞，计数并且在用0.8％琼脂糖(生命公司，法国)包被的24孔白色板(伯赫公司(Berthold)，法国)中包含在补充完全培养基(生命公司，法国)的0.4％软琼脂中。为了生成参考曲线，接种0-32000个非转导的MEFi细胞；同时接种8000个转导的MEFi细胞。细胞生长21天并且监测潜在集落形成。所有实验在2个独立实验中一式两份进行。

集落的显微评价

所有的平板孔在亮场条件下用Olympus CKX41检验，并且使用10X/0.25透镜和XC30相机AnalySIS getIT软件记录。集落定义为超过10个计数细胞。

使用Olympus CKX41显微镜在荧光下通过Cyquant直接细胞增殖试验(参见下文)观察细胞活力。

细胞增殖试验

按照生产商的推荐进行Cyquant直接细胞增殖试验(生命公司，法国)并且使用AnalySIS getIT软件通过对活细胞和活克隆性细胞计数进行分析。

按照生产商的说明进行细胞效价Glo ATP生物发光试验(普洛麦格公司(Promega)，法国)，除了孵育持续时间(37℃下1小时)以更好地裂解包含的细胞。使用Tristar2多模式酶标仪(伯赫公司，法国)进行分析。当生物发光强度范围从0到至少16000个细胞上呈线性时，该试验被认为是有效的。

通过在一个月期间每4-5天对细胞计数来得到扩增曲线。细胞用TrypLE select(生命公司，法国)胰蛋白酶消化并且在Nuclecounter盒(萨托瑞斯公司(Sartorius)，法国)上计数。然后，以500000个细胞在TC烧瓶T162(康宁公司，法国)中接种并在37℃和5％CO2的潮湿气氛中培养。

DNA提取和qPCR

在4天的转导后，用胰蛋白酶消化2.10^⁶个细胞并且通过在450g下离心来沉淀，并按照生产商的防范用凯杰DNA提取小试剂盒(凯杰公司，法国)提取。

使用qPCR来确定瓣整合拷贝数/ng DNA。按照CFX-96(伯乐公司，法国)中的内部过程用瓣引物和特异性FAM探针进行qPCR。使用的序列是：TGG AGG AGG AGA TAT GAG GG(Fw)(SEQ ID NO：67)，CTG CTG CAC TAT ACC AGA CA(Rv)(SEQ ID NO：68)，和FAM-AACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGG-BBQ2(探针)(SEQ ID NO：69)。

用Nanodrop(热科学公司(ThermoScientific)，法国)测量DNA浓度。

RNA提取和qRT-PCR

在用SuperScript II逆转录酶(生命公司，法国)逆转录并按照CFX-96(伯乐公司，法国)生产商的说明用SsoAdvanced SYBR Green Supermix(伯乐公司，法国)扩增之前，用NucleoSpin RNA Extraction(MN公司(Macherey Nagel)，法国)从MEFi和MEFi THV02转导的细胞中提取总RNA。用于检测THV02的引物序列是TCATCTTCCACAAGTTCCAGAC(正向)(SEQID NO：70)和GATAGGGATGTTGGTGTACTCTTC(反向)(SEQ ID NO：71)。在伯乐CFX-Manager软件上实时观察扩增产物。

实施例6.体内致癌性研究

CIEA NOG免疫缺陷型小鼠购自塔可尼克公司(TACONIC)。接受后，动物分离，并每组5只动物关到笼子中并适应一周。在适应后，将动物随机分入测试组。在研究开始时，所有动物都是7周龄。研究由对照组(未处理的小鼠)和三个处理组(HTLV-1.VPX载体、空VPX载体和安慰剂组-PBS-乳糖)组成。每组含有7只小鼠，并且在3个月期间观察动物。慢病毒载体和安慰剂用研究载体可以达到的最大剂量肌肉内给予，分别是：2,08x 10⁷TU/小鼠的HTLV-1.VPX载体和3.53x 10⁸TU/小鼠的空VPX载体。每周观察所有测试动物的一般生理条件和行为，并且记录观察情况。以每周的间隔对各动物进行详细的生理检查以评价各参数的异常变化，如皮毛情况、肌紧张、呼吸、移动和姿势。检查动物外部可触摸肿瘤的存在。评价体重和食物消耗。研究结束时，对动物进行尸检并且固定组织用于后续的组织病理学评价。

实施例7.体内生物发光/表达研究

CIEA NOG免疫缺陷型小鼠购自塔可尼克公司(TACONIC)。接受后，动物分离，并每组4或5只动物关到笼子中并适应2周。在适应后，将动物随机分入测试组。在研究开始时，所有动物都是5周龄。研究由对照组(未处理的小鼠)和两个处理组(HTLV-1荧光素酶载体、荧光素酶载体)组成。每组含19只小鼠(经处理的动物)和17只小鼠-未处理组。在3个月期间观察动物。慢病毒载体用研究载体可以达到的最大剂量肌肉内给予，分别是：2.98x10⁸TU/小鼠的HTLV-1荧光素酶载体和5.56x10⁷TU/小鼠的荧光素酶载体。每周观察所有测试动物的一般生理条件和行为，并且记录观察情况。以每周的间隔对各动物进行详细的生理检查以评价各参数的异常变化，如皮毛情况、肌紧张、呼吸、移动和姿势。检查动物外部可触摸肿瘤的存在。评价体重和食物消耗。研究结束时，对动物进行尸检并且固定组织用于后续的组织病理学评价。

体内生物发光的成像和定量：用不透光照相盒(IVIS谱，Xenogen)内固定的超灵敏冷却CDD相机进行测量。使用Living图像软件2.5(Xenogen)获取并分析生物发光信号的图像和测量值。为了进行成像，通过吸入异氟烷麻醉动物并且通过腹膜内注射给予200μL的15mg/mL D-荧光素(卡钳生命科学公司(Caliper Lifesciences))。在D-荧光素注射后1分钟获取图像。

Claims

1.包含慢病毒载体颗粒的组合物用于通过向人肌肉内给药来诱导免疫应答的用途，

其中所述慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体；

其中所述慢病毒载体的DNA包含引导多肽表达的启动子，所述多肽包含HTLV-1p12p30-Tax-HBZ融合蛋白。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述慢病毒载体包含β2m启动子。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述慢病毒载体包含MHC I型启动子。

4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，由具有SEQ ID NO：20的核苷酸序列的DNA编码所述HTLV-1 p12p30-Tax-HBZ融合蛋白。

5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其特征在于，所述HTLV-1 p12p30-Tax-HBZ融合蛋白包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列。

6.如权利要求1-5中任一项所述的用途，包含至少10⁷个慢病毒载体颗粒。

7.一种用于通过向人肌肉内给药来诱导免疫应答的包含慢病毒载体颗粒的组合物，

其中所述慢病毒载体颗粒包含慢病毒载体；

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述慢病毒载体包含β2m启动子。

9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述慢病毒载体包含MHC I型启动子。

10.如权利要求7-9中任一项所述的组合物，其特征在于，由具有SEQ ID NO：20的核苷酸序列的DNA编码所述HTLV-1 p12p30-Tax-HBZ融合蛋白。

11.如权利要求7-10中任一项所述的组合物，其特征在于，所述HTLV-1 p12p30-Tax-HBZ融合蛋白包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列。

12.如权利要求7-11中任一项所述的组合物，包含至少10⁷个慢病毒载体颗粒。