CN109923212A - 用于表达乙肝病毒(hbv)抗原的慢病毒载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸,包括慢病毒载体和慢病毒载体颗粒,其编码至少一种基因型A和/或C抗原的乙肝病毒(HBV)包膜表面,至少一种基因型A和/或C抗原的聚合酶,至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白,至少一种基因型A和/或C抗原的HBV共有核心,以及至少一种基因型A和/或C抗原的HBV共有核心MHCI和MHCII表位。本发明包括这些慢病毒载体和慢病毒载体颗粒,制备这些载体的方法,及其用途,包括医药用途。慢病毒载体和慢病毒载体颗粒用于向人给药以诱导针对HBV抗原的免疫应答。
Description
技术领域
本发明属于重组疫苗技术的领域并涉及慢病毒载体的改进,其可用作治疗性和预防性疫苗。该病毒提供优于其他病毒的改善的免疫应答诱导。
背景
重组疫苗已随重组DNA技术的进步而发展,允许修饰病毒基因组以产生修饰的病毒。通过这种方式,已能够将遗传序列引入非致病性病毒,从而它们编码需要在感染或转导后于靶细胞内得以表达的免疫原性蛋白质,以在其宿主内发展特定免疫应答。
这类载体构成了疫苗技术的主要优势(Kutzler等,Nat Rev Genet,9(10):776-788,2008)。具体而言,它们具有优于传统疫苗的优势:避免活(减毒的)病毒和消除灭活疫苗制造的相关风险。
在二十世纪八十年代早期由Mann等引入使用改性的逆转录病毒(逆转录病毒载体)的基因递送(Cell,33(1):153-9,1983)。最常用的致瘤性逆转录病毒基于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)。它们具有简单的基因组,从中产生多蛋白Gag、Pol和Env并且要求为反式以用于病毒复制(Breckpot等,2007,Gene Ther,14(11):847-62;He等,2007,Expert Rev vaccines,6(6):913-24)。一般需要的顺式序列是长末端重复序列(LTR)及其周边序列:用于整合的反向重复序列(IR或att位点)、包装序列Ψ、转运RNA结合位点(引物结合位点,PBS),和涉及逆转录的一些其它序列(正链起始必需的LTR内的重复R以及多嘌呤序列(PPT))。为了生成复制缺陷型逆转录病毒载体,通常使gag、pol和州v基因全部缺失,并且用表达盒替代。
源自慢病毒基因组的逆转录病毒载体(即,慢病毒载体)已涌现为用于基因治疗和免疫治疗目的的有希望的工具,因为它们显示优于其它病毒系统的若干优势。具体地,慢病毒本身没有毒性,并且与其它逆转录病毒不同,慢病毒能够转导非分裂细胞,尤其是树突状细胞(He等,2007,Expert Rev vaccines,6(6):913-24),使得通过内源性途径呈递抗原。
慢病毒通过遗传组成相似性、复制的分子机制和与其宿主的生物相互作用连接。它们最常称为缓慢疾病综合征的试剂,该综合征在延长的亚临床感染之后开始并缓慢发展;因此,它们被称作慢摂病毒(Narayan等,1989,J Gen Virol,70(7):1617-39)。其基本构成与所用逆转录病毒相同但由于附属基因(例如vif、vpr、vpu、nef、tat和rev)的存在而更为复杂,所述附属基因在慢病毒的体内复制中起关键作用。
慢病毒代表逆转录病毒科(Retroviridae)的一个慢病毒(slow virus)属,其包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒可以无限地持续存在于其宿主内,并且在一生的感染期间以不同速度连续复制。病毒在其宿主内的持续复制取决于其避开宿主防御的能力。
重组整合型慢病毒载体的设计基于慢病毒的顺式与反式作用序列的分离。非分裂细胞中的有效转导需要慢病毒基因组中存在两种顺式作用序列:中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。它们导致形成三链DNA结构,称为中心DNA“瓣(flap)”,该结构使基因进入非分裂细胞(包括树突细胞(DC))核内的效率最大化(Zennou等,2000,Cell,101(2)173-85;Arhel等,2007,EMBO j,26(12):3025-37)。
树突细胞对于抗原递呈而言具有重要作用,因为其构成了以递呈抗原和起始免疫应答为主要功能的抗原递呈细胞(APC)的主要类型。
为产生免疫应答,须由细胞将抗原蛋白加工成肽,所述肽通过主要组织相容性复合物蛋白(MHC)在细胞表面显示。循环的APC在引流淋巴结内将肽-MHC复合物递呈至T细胞,其在此处与T细胞受体相互作用并联合共刺激信号一起激活T细胞。
多项研究已显示,使用慢病毒载体的接种导致DC进行抗原呈递和抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL;CD8+T细胞)的强激活。因此,在过去的10年中,慢病毒载体已经工程改造用于基因转化和免疫疗法应用。
载体通常含有含增强子的强组成型启动子,如CMV启动子。Michelini等,Vaccine27(34):4622-29(2009);Karwacz等,J.Virol.83(7):30943103(2009);Negri等,MolecularTherapy 15(9):1716-23(2007);和Buffa等,J.General Virology 87:1625-1634(2006)。
已通过移除LTR U3序列,产生完全不含原先在LTR中存在的病毒启动子和增强子序列的“自动失活”载体,从而改善了慢病毒载体的安全性。
可通过在不同的DNA质粒瞬时转染细胞,例如HEK 293T人培养细胞后由重组技术产生含有慢病毒载体的慢病毒颗粒:
包装质粒,其表达至少Gag、Pol、Rev、Tat,并在一些情况下表达转移构建体的包装所必需的结构和酶蛋白;
原病毒转移质粒,其含有包装、逆转录和整合所必需的表达盒和HIV顺式作用因子;以及
编码包膜的质粒,在多数情况下是水泡性口炎病毒(VSV.G)的糖蛋白,该蛋白允许形成能够靶向多种细胞(尤其是主要组织相容性(MHC)抗原递呈细胞(APC),包括DC的混合颗粒(假型)。
该方法能够使转染的细胞瞬时生产慢病毒颗粒载体。然而,也可通过向细胞基因组中稳定地插入包装基因、原病毒编码DNA和包膜基因来连续产生慢病毒颗粒载体。这使得能够由细胞连续产生慢病毒颗粒载体而不需要瞬时转染。当然,也可使用这些方法的组合,其中将一些DNA/质粒整合至细胞基因组而其他的通过瞬时转染提供。
非整合型慢病毒载体已被设计用于降低与插入诱变事件相联系的潜在癌发生的风险,特别用于疫苗接种目的。非整合型慢病毒载体的示例提供于Coutant等,PLOS ONE 7(11):e48644(2102),Karwacz等,J.Virol.83(7):3094-3103(2009),Negri等,MolecularTherapy 15(9):1716-1723(2007);Hu等,Vaccine 28:6675-6683(2010)。因此,已有报告称与整合型系统相比,非整合型慢病毒载体系统可降低插入型诱变的潜在风险。Hu等,Vaccine 28:6675-6683(2010)。已经进一步报道,在一些功能分析中,由DC引导的整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)引发的免疫应答的幅度和质量都与其整合对应物相当。同上。因此,整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)被认为对于人类给药而言比整合载体更安全,具有相当的效果。
此外,自动失活的慢病毒载体中病毒启动子和增强子序列的3′LTR的U3区域的缺失限制了内源性启动子激活的可能性。这些对于安全性的关注直接体现了1998-1999年进行的SCID-X1基因治疗试验所获得的经验,该试验使用基于莫罗尼病毒的逆转录病毒载体针对患有罕见类型的X连锁(SCID-X1基因)严重免疫缺陷疾病的儿童进行(Cavazzana-Calvo等,2000,Science.,288(5466):669-72)。在该试验中,9名儿童中的4名由于莫罗尼衍生的慢病毒载体在非常靠近人LM02原癌基因处整合而发展出白血病(Hacein-Bey-Abina等,2008,J.Clin.Invest.,118(9):3132-3142)。这表明,恶性肿瘤是病毒U3启动子/增强子接近LM02原癌基因的结果。结果,安全性是向人给予慢病毒载体的主要问题。
增强子是顺式作用序列,其可相隔一定距离作为转录激活因子起作用。它们已广泛用于病毒衍生载体,因为它们似乎对于在多种细胞类型,特别是DC中获得转基因强表达而言是最高效的(Chinnasamy等,2000,Hum Gene Ther 11(13):1901-9;Rouas等,2008,Cancer Gene Ther 9(9):715-24;Kimura等,2007,Mol Ther 15(7):1390-9;Gruh等,2008,J Gene Med 10(1)21-32)。然而,考虑到插入诱变的安全问题,应将这类转录增强子序列从慢病毒载体构建体中删除以破坏增强子邻近效应所产生的插入诱变风险。迄今为止,该增强子邻近效应是最常见的插入突变机制并且是基因转移后人或动物肿瘤发生事件的病例中描述的唯一效应。
因此,需要研发不包括病毒增强子但仍然允许转基因编码的免疫原性肽足量表达的逆转录病毒,特别是慢病毒载体,如果可能,表达量与使用CMV启动子时观察到的相当。
最近的研究报道了使用主要组织相容性复合物II型基因(MHC II型)(Kimura等,2007,MolTher 15(7):1390-9)和dectin-2基因(Lopes等,2008,J Virol 82(1):86-95)来源的DC特异性启动子代替病毒启动子。Lopes等使用的dectin-2基因启动子包含推定的增强子和腺病毒保守序列(腺病毒启动子中的反向末端重复)(Bonkabara等,2001,J.Immunology,167:6893-6900)。Kimura等使用的MHC II型基因启动子不含任何已知增强子。
然而,当在静脉内给予时,在没有增强子的情况下,发现MHC II型启动子无法在DC中提供足够的转基因表达。具体而言,与使用CMV启动子/增强子所观察到的免疫应答相反,包含MHC II型启动子的慢病毒载体未能在免疫活性C57BL/6小鼠中引起免疫应答。虽然在小鼠中注射后观察到了整合和持续的转基因表达,但通过MHC II型启动子转录的慢病毒载体无法刺激抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞应答,甚至在疫苗接种加强后也是如此。因此,这些研究的作者的结论是使用MHC II型启动子仅对于在基因替换疗法中寻求持续表达的应用而言有兴趣,但在免疫疗法中没有兴趣。应注意,MHC II型启动子在大多数细胞类型中弱表达。
因此,对于通过IV注射诱导针对抗原的免疫应答,MHC II型启动子不是适当的慢病毒载体启动子。此外,dectin-2启动子在大多数细胞类型中弱表达并且似乎含有增强子。因此,由于安全原因,dectin-2启动子不是良好的慢病毒载体启动子。
优选地,在免疫治疗中,慢病毒载体提供了有效的转基因表达,其引发所需的特异性免疫应答。这需要APC(如树突细胞)中的表达处于高水平。
还优选通过免疫应答除去慢病毒载体所转导的细胞以提供更高水平的安全性。即,针对转基因产生的免疫应答可在宿主中引发足以除去慢病毒载体转导细胞的免疫应答。消除经转导的细胞消除了慢病毒载体在宿主中的持续存在,以及该载体的可能二级作用。为了消除经转导的细胞,在非树突细胞中需要一定水平的表达以由免疫应答进行消除。因此,需要适当地表达抗原。
同时,启动子应通过原初和记忆T细胞的激活中涉及的关键细胞(即树突细胞)使免疫刺激最大化并应使导致恶性肿瘤的干细胞中的插入诱变和基因毒性的风险最小化。因此,启动子应在树突和其他细胞中具有足够高的活性,但不含增强子。基于这些标准,由于强增强子的存在,病毒启动子(如CMV启动子)不是理想的。这些标准归纳如下:
在抗原递呈细胞(包括树突细胞)中高表达以诱导最大的免疫应答;
在其他转导的细胞类型中以足够的水平表达,该表达水平足以供于通过诱导的免疫应答进行消除;以及
缺少增强子元件以避免插入效应。
乙型肝炎是一种严重且常见的肝脏病毒传染病,如今有超过20亿人在其生命中的某个时间感染了HBV。3.5亿人仍处于慢性感染,世界上四分之三的人口生活在感染程度较高的地区(Fatusi等,East African Medical Journal 2000;77(11):608-612)。
持续性HBV感染的严重病理后果包括发展慢性肝功能不全肝硬化和肝细胞癌(HCC)。HBV携带者,可以传播疾病多年。慢性HBV(CHB)与肝细胞癌(HCC)发展风险增加100倍相关(Beasley等,Lancet.1981;2:1129-1133)。据估计,15-40%的CHB患者在其一生中发生肝硬化或HCC,每年导致超过100万人死亡(Mast等,Vaccine,第17卷,第13-14期,第1730-1733页,1999;McQuillan等,American Journal ofPublic Health,第89卷,第1期,第14-18页,1999)。尽管有效的预防性疫苗已有三十多年的历史,但HBV仍然是全球十大死亡原因之一。目前FDA批准的治疗效果有限(基金会HB。批准的成人药物。(In)。乙型肝炎基金会:美国宾夕法尼亚州多伊尔斯敦,2012年)。
为了治疗慢性HBV疾病,使用靶向HBV聚合酶的抗病毒化合物(Scaglione等,Gastroenterology 2012;142:1360-1368;de Clercq等,Viruses 2010;2:1279-1305)。
治疗的弱点是患者很少建立对HBV的免疫控制,应答很少持久,患者在治疗多年后可能会出现疾病复发,一旦治疗停止,HBV复制水平就会恢复到治疗前的水平,更重要的是,治疗失败在患者中很常见。长期治疗的毒性作用增加了选择耐药的HBV毒株的风险,并且经常在经济上无法负担(de Clercq等,Viruses 2010;2:1279-1305;Tong S等,EmergMicrobes Infect 2013;2:e10)。
目前靶向病毒的HBsAg的预防性HBV疫苗可在三次疫苗接种后有效诱导保护性抗体。仍有3.7亿人长期感染并且需要有效的治疗方法。预防性疫苗对已经感染的HBV携带者或肝炎患者无效。预防性疫苗显示治疗效果降低,因为针对HBsAg的彻底T细胞应答和HBsAb不能消除细胞内肝细胞HBV(Shen等,Vaccine 2010;28:7288-7296;Chen等,ClinVaccine Immunol 2011;18:1789-1795)。目前候选疫苗面临的一些主要挑战是无法诱导多种抗原靶标的体液和CMI,以及诱导针对HBV主要基因型的有效免疫应答。
用PEG化IFN-α的免疫疗法导致显著的不良应答和低耐受性(Lok等,Hepatology45:507-539)。因此,迫切需要治疗HBV的新型治疗方法。
治疗性疫苗接种为消除HBV的方法提供了一种有前景的策略。在过去几年中,已经在具有不同临床结果的患者中开发和研究了不同的治疗性疫苗(Kapoor等,FutureVirol.2014;9(6):565-585)。正在开发基于重组HBV蛋白,HBV包膜亚病毒颗粒,病毒和质粒DNA的疫苗(同上)。治疗性疫苗接种与抗病毒剂同时使用以诱导T细胞恢复,同时抑制病毒复制和抗原负荷可提供疫苗功效的改善(同上)。
通过治疗性疫苗接种可以实现诱导解决慢性HBV感染的有效多特异性抗HBV免疫应答。如果有效,它可以避免由于抗病毒抗性或副作用导致的长期治疗和可能的治疗失败。旨在触发非特异性或HBV特异性免疫应答的免疫疗法可以在适当的部分治疗后限制病毒负荷(Protzer等,Nat RevImmunol 2012;12(三月(3)):201-13)。临床观察表明,慢性HBV感染可能在接受HBV免疫供体骨髓的骨髓移植患者中得到解决,从而获得对T细胞功效的支持(Ilan等,Gastroenterology 1993;104(六月(6)):1818-21)。由于无法诱导针对各种抗原靶标的体液和细胞免疫以及针对HBV的主要基因型的有效免疫应答的刺激,几乎所有目前的候选疫苗都面临重大挑战。通过治疗性疫苗接种可诱导T细胞应答,并且黑猩猩的临床前研究显示出有希望的结果(Schirmbeck等,Biol Chem 1999;380(三月(3)):285-91;Pancholi等,Hepatology 2001;33(二月(2)):448-54)。
预防性疫苗单独或与干扰素-α和/或抗病毒化合物组合的临床研究不能在慢性乙型肝炎中诱导免疫应答(Heintges等,Dig Dis Sci 2001;46(四月(4)):901-6;Hilleman等,Vaccine.2003;21(十二月(32)):4626-49)。据推断,失败主要是由于铝佐剂疫苗诱导显著的Th2型免疫应答并且不刺激CTL。
HBcAg 18-27HLA-A2肽表位疫苗,脂肽和通用破伤风类毒素辅助T细胞表位在健康志愿者中引起CTL应答,但在慢性HBV患者中没有治疗效果(Vitiello等,JClin Invest 1995;95(一月(1)):341-9;Heathcote等,Hepatology 1999;30(八月(2)):531-6)。
佐剂MPL,QS21和含有HBsAg的水包油乳剂在健康志愿者中诱导特异性T细胞和抗体(Vandepapeliere等,Vaccine 2008;26(三月(10)):1375-86),但拉米夫定治疗下的HBeAg阳性慢性HBV患者中未能成功增加HBeAg血清转换率(Xu等,PLoS One 2008;3(7):e2565)。与抗-HBs复合的HBsAg在临床研究中也仅表现出轻微的影响(同上)。
在所有这些方法中,疫苗中仅包括单一HBV抗原。此外,颗粒抗原(例如,病毒样颗粒)与强效佐剂组合似乎更适合诱导稳健的CD4+和CD8+T细胞应答。
将M和L HBV包膜蛋白的更高免疫原性前S结构域纳入疫苗制剂以及使用不同的HBsAg亚型可能是诱导更有效的B细胞和T细胞应答的选择(Milich等,Science 228:1195-1199(1985);Schirmbeck等,Eur J Immunol 33:3342-3352(2003);Schumann等,J ViralHepat 14:592-598(2007))。
通过将HBsAg与HBcAg组合已经完成了基于蛋白质的疫苗接种的开发,因为后者已知具有意料之外的免疫原性。HBcAg能够通过激活B细胞来增加T细胞的引发,从而允许它们充当有效原代抗原呈递细胞(Milich等,Proc Natl Acad Sci USA 94:14648-14653(1997);Lazdina等,J Virol 75:6367-6374(2001))。
此外,它可以通过与其富含精氨酸的区域结合的核酸触发Toll样受体(TLR-)信号传导(Aguilar等,Immunol Cell Biol 82:539-546(2004);Storni等,J Immunol 172:1777-1785(2004))。因此,当旨在产生HBV特异性T细胞以及针对异源抗原,例如,HCV或肿瘤衍生抗原的T细胞时,HBcAg有资格用作强效佐剂(Chen等,J Immunol 186:5107-5118(2011))。
使用抗病毒化合物接种疫苗之前的病毒和抗原负荷降低提供了疫苗功效的潜在改善。通过核苷(核苷酸)类似物抑制病毒复制可导致慢性乙型肝炎患者的暂时CD4+T细胞应答(Boni等,J Clin Invest 102:968-975(1998))。
在土拨鼠模型中已经获得了联合抗病毒治疗和疫苗接种的持续治疗效果的其他证据(Menne等,J Virol 76:5305-5314(2002);Roggendorf等,Pathol Biol(Paris)58:308-314(2010))。
代替共同给药,在接种疫苗之前使用抗病毒预处理以减少抗原负荷是有效的,该抗原负荷是诱导耐受的可能原因(Horiike等,J Clin Virol 32:156-161(2005))。
在慢性HBV感染的患者中,结合HBsAg和高免疫原性HBcAg的疫苗接种方法是降低病毒负荷和诱导血清转化的有希望的策略。
应利用HBsAg和HBcAg的协同作用来刺激广泛和强烈的HBV特异性B细胞和T细胞应答,以减少抗原负荷并破坏慢性HBV感染患者的现有免疫耐受。
已经使用不同的动物模型(即HBV转基因小鼠,土拨鼠肝炎病毒模型或慢性HBV感染的黑猩猩)尝试了一系列不同的治疗性疫苗接种策略(Kosinska等,Hepat Res Treat2010:817580(2010))。
这些策略中的一些已达到具有不同结果的临床开发阶段(Beckebaum等,Rev MedVirol 12:297-319(2002);Akbar等,Antivir Ther 15:887-895(2010);Michel等,JHepatol 54:1286-1296(2011))。
优选地,人们将产生具有野生型除致病性质外的所有特征的疫苗。可以通过疫苗递送系统模拟的病原体的重要特征是它们的大小,形状和表面分子组织。此外,可以添加病原体相关的分子模式以促进激活适应性免疫的先天免疫应答(Bachmann等,Nat RevImmunol 10:787-796(2010))。
基于表位的疫苗代表了在不使用可能具有未知或致病性质的完整基因产物的情况下刺激针对来自多种抗原的保守表位的广泛定向免疫应答的主要方法。
来自包括我们自己在内的许多实验室的研究表明,编码最小CTL表位的疫苗可以同时诱导针对多个表位的应答。到目前为止,HBV的治疗性候选疫苗主要集中在HBsAg及其核心蛋白或部分的使用上(Bienzle等,Hepatology 38:811-819(2003);Jung等,Vaccine20:3598-3612(2002);Livingston等,J.Immunol.162:3088-3095(1999);Pol等,J.Hepatol.34:917-921(2001);Schneider等,J.Hepatol.44(增刊2):S277(2006))。
然而,对这些抗原的细胞免疫应答可能最容易产生抑制,耐受或其他功能障碍,因为这些蛋白质在感染的宿主中以非常高的水平循环(Kakimi等,J.Virol.76:8609-8620(2002);Reignat等,J.Exp.Med.195:1089-1101(2002))。HBV核心抗原在小动物,NHP和人类中引发强细胞免疫的有效性以及抗HBV包膜抗体的治疗效果表明,组合方法具有重要性(Kosinska AD等,J Virol 2012;86:9297-9310.Huang ZH等,World J Gastroenterol2001;102:6.Livingston BD等,Hum Immunol 1999;60:1013-1017)。最近,已经表明,使用组合方法的重组蛋白疫苗在I/II期人体试验中是安全且免疫原性的-引发针对HBV包膜和核心抗原靶标的抗体(Cassidy A等,Expert Rev Vaccines.2011;10:1709-1715)。
迄今为止,聚合酶抗原尚未像治疗性疫苗候选物一样被全面研究,尽管免疫系统可能更可能对该抗原产生应答,与HBsAg和核心抗原的产生相比,该抗原仅以少量产生。重要的是,在从HBV感染中恢复的患者中可以容易地检测到聚合酶特异性CTL和CD4+辅助应答。抗病毒药物治疗的慢性病患者在治疗的第一年内恢复了HBV聚合酶和核心特异性T细胞应答,但随后,应答下降,并且3年后,与未治疗的患者没有差别(Mizukoshi等,J.Immunol.173:5863-5871(2004))。
多功能调节蛋白HBV X蛋白(HBx)可参与病毒发病机理和致癌作用(Su等,ProcNatl Acad Sci U S A 1997;94:8744-8749)。HBx在肝炎和肝癌组织中高表达,它可能是诱导特异性CTL应答的免疫疗法的靶标。
抗体对HBV治愈的重要性通过病毒负荷的降低与HBV感染患者中抗HBs和抗HBe抗体的存在的相关性得到强化。对用目前HBV疫苗免疫的85%个体进行保护的血清转化也表明抗体在预防HBV中的作用。然而,由于其细胞内性质,在高效价抗体存在下HBV仍可能发展成疾病,因此细胞免疫可能对清除感染至关重要。
诱导细胞免疫应答以及涉及保护的显著B细胞应答的治疗性疫苗对于在治疗方案中靶向HBV可能是重要的。
因此,本领域存在对用于免疫人类的改善方法和载体的需求。本发明满足本领域中的这些需要。
发明概述
本发明包括编码以下的核酸分子和载体:
-基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位,
和它们作为药物或疫苗的用途。
优选地,本发明的载体是慢病毒载体。
特别地,本发明涉及编码以下的慢病毒载体:
-基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位。
在优选的实施方式中,本发明的慢病毒载体至少编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在优选的实施方式中,本发明的慢病毒载体至少编码SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
在特别优选的实施方式中,本发明的慢病毒载体编码至少SEQ ID NO:24的氨基酸序列和至少编码SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
在一个实施方式中,本发明的慢病毒载体包含β2-微球蛋白启动子。
在一个实施方式中,本发明的慢病毒载体包含土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。
在一个实施方式中,本发明的慢病毒载体是DNA。
本发明还包括编码以下的慢病毒载体颗粒:
-基因型A和/或C抗原的乙肝病毒(HBV)至少一种包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位。
在优选的实施方式中,本发明的慢病毒载体颗粒的载体至少编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在优选的实施方式中,本发明的慢病毒载体颗粒的载体至少编码SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
在特别优选的实施方式中,本发明的慢病毒载体颗粒的载体编码至少SEQ ID NO:24的氨基酸序列和至少SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
在一个实施方式中,慢病毒载体颗粒包含功能性慢病毒整合酶蛋白。
在一个实施方式中,慢病毒载体颗粒包含水泡性口炎病毒糖蛋白。
在一个实施方式中,慢病毒载体颗粒包含HIV-1亚型D Gag和Pol蛋白。
本发明还包括分离的细胞,其包含本发明的慢病毒载体或本发明的慢病毒载体颗粒。
本发明还包括根据本发明的慢病毒载体或慢病毒载体颗粒,其用作药物或疫苗。
文本还描述了本发明的慢病毒载体或本发明的慢病毒载体颗粒在人体中诱导免疫应答的用途,特别是通过肌肉内给药。
本文还描述了一种在人体内诱导免疫应答的方法,包括向人,优选肌肉内给予本发明的慢病毒载体或本发明的慢病毒载体颗粒。
附图简要说明
图1描绘了根据本发明的慢病毒载体化的HBV疫苗构建体HBV-3。该构建体包含SEQID NO:24的氨基酸序列(HBV基因型A和C表面,Pol,HBX和共有核心MHCI和MHCII表位序列)和SEQ ID NO:25的氨基酸序列(具有基因型A和C序列的表面B细胞表位的嵌合VLP)。
图2描绘了具有HBV-3慢病毒载体的C57Bl/6j小鼠中累积的免疫应答和T细胞应答(IFN-γ分泌)的多样性。
比较不同剂量的注射慢病毒载体(1.107TU和1.106TU)以及不同的给药策略(初免/加强(P/B)或初免(P))。从底部到顶部的每个柱:VLP,PolA,EnvA,XA,PolC,EnvC,XC和核心。A和C是HBV基因型。
发明详述
本发明人已经发现,向动物肌内给予编码抗原的慢病毒载体导致针对蛋白质的高免疫应答,并且可以导致从动物中消除整合载体。因此,本发明提供了新慢病毒载体,其具有高免疫应答和增加的人类给药安全性。
本发明包括编码以下的慢病毒载体:
-基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位,
及其在宿主,优选在人体中诱导免疫应答,特别是通过肌肉内给药的用途。
慢病毒载体可以诱导强烈,持久和广泛的细胞介导的应答和体液应答。LV可以掺入多抗原盒,允许开发单剂量的多价疫苗。丝状病毒爆发意外发生并迅速传播。因此,在这些情况下,可能需要短疫苗方案。由于插入物的高表达水平和树突细胞的向性,THV慢病毒载体化的疫苗可以在短时间内引发强烈的免疫应答。相反,长期保护性免疫可能涉及由两次或更多次注射组成的初免-加强方案,该方案可诱导持久的T细胞记忆。
蛋白质
本发明包括编码包含以下至少一种的蛋白质的慢病毒载体构建体:
-基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位。
优选地,将基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面插入基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心中,从而形成嵌合蛋白。更优选地,所述嵌合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:25或由其组成。
基因型A和/或C抗原的HBV共有核心MHCI和MHCII表位由核心HBV的不同MHCI和MHCII表位组成,其通过短连接序列,优选通过两个氨基酸GS的短序列彼此融合和/或连接,并且优选包含氨基酸序列SEQID NO:26或由其组成:
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLGSALESPEHCSPHHTALRQAILGSELMTLATWVGSSRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPGSILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRT(SEQ ID NO:26)。
优选地,至少一种基因型A和/或C抗原的聚合酶,至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白,以及至少一种基因型A和/或C抗原的HBV共有核心MHCI和MHCII表位包含在氨基酸序列SEQ ID NO:24中或形成氨基酸序列SEQ ID NO:24。
优选地,根据本发明的至少一种基因型A和/或C抗原的聚合酶是基因型A的聚合酶和至少一种基因型C的聚合酶。
优选地,根据本发明的基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白是至少一种基因型A的HBX蛋白和至少一种基因型C的HBX蛋白。
优选地,根据本发明的基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面是至少一种基因型A的乙肝病毒(HBV)包膜表面和至少一种基因型C的乙肝病毒(HBV)包膜表面。
在优选实施方式中:
-根据本发明的基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶是至少一种基因型A的聚合酶和至少一种基因型C的聚合酶;
-根据本发明的基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白是至少一种基因型A的HBX蛋白和至少一种基因型C的HBX蛋白;和
-根据本发明的基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面是至少一种基因型A的乙肝病毒(HBV)包膜表面和至少一种基因型C的乙肝病毒(HBV)包膜表面。
HBV基因型A和C表面,Pol,HBX和核心MHC I和MHCII表位序列:
MWPAANQVGVGAFGPGLGSMQWNSTAFHQALQDPRVRGLGSSISARTGDPVGSVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFGSIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLGSCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNGSIPSSWAFAGSRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYIGSNVSIPWTHKVGNFTGLYSSTVPIGSVGPLTVNEKRRLKLIGSRHYLHTLWKAGILYKGSTPARVTGGVFGSESRLVVDFSQFSRGITRVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHIPLHPAAMPHLLIGSSGLSRYVARLGSLHLYSHPIVLGFRKIGSSAICSVVRRAFPHCLAFSYMDDVVLGAGSFLLSLGIHLGSKHCFRKLPVNRPIDWGSYPALMPLYACIQAKQAFTFSPTYKAFLSGSLCQVFADATPTGWGLGSKYTSFPWLLGCTANWILRGTSFVYVPGSSLYAVSPSVHLSLRGLPVGSVLHKRTLGLPAMSTTDLGSCVFKDWEELGEEIRLKVLFVLGGCRHKLGSWPEANQVGAGAFGPGFGSMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGGSTSLNFLGGAPTCPGQGSCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCGSGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYIGSNVSIPWTHKVGNFTGLYSSTVPVGSLHLYSHPIILGFRKIGSKQCFRKLPVNRPIDWGSKQAFTFSPTYKAFLCGSLCQVFADATPTGWGLGSAANWILRGTSFVYVPGSVLHKRTLGLSAMSTTDLGSCLFKDWEELGEEIRLMIFVLGGCRHKLGSMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLGSALESPEHCSPHHTALRQAILGSELMTLATWVGSSRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPGSILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRT(SEQ IDNO:24)。
具有基因型A和C的表面B细胞表位的嵌合VLP:
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDGGGGSGGGGTPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNGSASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDGSCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASGSPFVQWFVGLAMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDGSCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASGSGGGGSGGGGSRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC(SEQ ID NO:25)。
蛋白质可以被纯化。
优选地,纯化的蛋白质的纯度超过50%、75%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%。在本发明的内容中,纯度超过50%(等)的纯化的蛋白质表示纯化的蛋白质样品含有少于50%(等)的其他蛋白质。例如,如果从宿主细胞纯化的重组蛋白的样品含有少于1%的污染宿主细胞蛋白质,则其纯度可以是99%。
核酸
本发明包括编码以下的核酸:
-基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位。
该核酸可以是单链或双链的。核酸可以是RNA或DNA分子。
优选的核酸编码本文详述的任何SEQ ID NO的氨基酸序列,单独或组合,例如SEQID NO:24和SEQ ID NO:25。本发明包括插入载体中的本发明的分离的核酸。
核酸可经纯化。优选地,纯化的核酸的纯度超过50%、75%、85%、90%、95%、97%、98%、或99%。在本发明的范围内,纯度超过50%的纯化的核酸表示纯化的核酸含有少于50%的其他核酸。例如,如果从宿主细菌纯化的质粒样品含有少于1%的污染细菌DNA,则其纯度可以是至少99%。
优选地,由根据本发明的核酸编码的至少一种基因型A和/或C抗原的聚合酶是至少一种基因型A的聚合酶和至少一种基因型C的聚合酶。
优选地,由根据本发明的核酸编码的至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白是至少一种基因型A的HBX蛋白和至少一种基因型C的HBX蛋白。
优选地,由根据本发明的核酸编码的基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面是至少一种基因型A的乙肝病毒(HBV)包膜表面和至少一种基因型C的乙肝病毒(HBV)包膜表面。
在优选实施方式中:
-由根据本发明的核酸编码的至少一种基因型A和/或C抗原的聚合酶是至少一种基因型A的聚合酶和至少一种基因型C的聚合酶;
-由根据本发明的核酸编码的至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白是至少一种基因型A的HBX蛋白和至少一种基因型C的HBX蛋白;和
-由根据本发明的核酸编码的至少一种基因型A和/或C抗原的乙肝病毒(HBV)包膜表面是至少一种基因型A的乙肝病毒(HBV)包膜表面和至少一种基因型C的乙肝病毒(HBV)包膜表面。
载体
本发明包括编码以下的载体:
-基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位,优选包含本发明的SEQ ID。
优选地,由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体编码的至少一种基因型A和/或C抗原的聚合酶是至少一种基因型A的聚合酶和至少一种基因型C的聚合酶。
优选地,由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体编码的至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白是至少一种基因型A的HBX蛋白和至少一种基因型C的HBX蛋白。
优选地,由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体编码的至少一种基因型A和/或C抗原的乙肝病毒(HBV)包膜表面是至少一种基因型A的乙肝病毒(HBV)包膜表面和至少一种基因型C的乙肝病毒(HBV)包膜表面。
在优选实施方式中:
-由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体编码的至少一种基因型A和/或C抗原的聚合酶是至少一种基因型A的聚合酶和至少一种基因型C的聚合酶;
-由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体编码的至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白是至少一种基因型A的HBX蛋白和至少一种基因型C的HBX蛋白;和
-由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体编码的至少一种基因型A和/或C抗原的乙肝病毒(HBV)包膜表面是至少一种基因型A的乙肝病毒(HBV)包膜表面和至少一种基因型C的乙肝病毒(HBV)包膜表面。
优选的载体包含单独或组合地编码本文详述的任何SEQ ID NO的氨基酸序列的核酸序列,特别是SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25,优选SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。
载体可以是表达载体。载体可为质粒载体。优选地,该载体是慢病毒载体。
在本发明范围内,“慢病毒载体”指非复制型载体,其供于使用包含顺式作用慢病毒RNA或DNA序列的转基因转导宿主细胞,且需要以反式形式提供的慢病毒蛋白(例如Gag、Pol和/或Env)。慢病毒载体缺少功能性Gag、Pol和Env蛋白的表达。慢病毒载体可以RNA或DNA分子的形式存在,这取决于所述逆转录载体的产生或发展阶段。
慢病毒载体可以是重组DNA分子的形式,如质粒。慢病毒载体可以是慢病毒载体颗粒的形式,如慢病毒和其他蛋白质的复合物中的RNA分子。通常,对应于修饰或重组的慢病毒颗粒的慢病毒颗粒载体包含由两个单链RNA拷贝组成的基因组。这些RNA序列可通过从插入宿主细胞基因组的双链DNA序列(原病毒载体DNA)转录获得,或者可由转化的宿主细胞中质粒DNA(质粒载体DNA)的瞬时表达获得。
优选地,慢病毒载体颗粒具有整合能力。因此,它们含有功能性整合酶蛋白。
非整合载体颗粒有一个或多个突变,其消除了慢病毒载体颗粒的大部分或全部整合能力。例如,非整合载体颗粒可以包含由慢病毒pol基因编码的整合酶中的突变,其导致整合能力的降低。相反,整合载体颗粒包含功能性整合酶蛋白,其不含任何消除慢病毒载体颗粒的大部分或全部整合能力的突变。
慢病毒载体来源于慢病毒,尤其是人免疫缺陷病毒(HIV-1或HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV),其经修饰以除去涉及致病性的遗传决定簇并导入对获得治疗效果有用的新决定簇。
这类载体基于顺式和反式作用序列的分离。为制备复制缺陷型载体,可删除反式作用序列(如gag、pol、tat、rev和env基因)并使用编码转基因的表达盒代替。
非分裂细胞中的有效整合与复制通常需要慢病毒基因组中心存在两种顺式作用序列:中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。这导致形成三链DNA结构,称为中心DNA“瓣(flap)”,其作为对核孔处的整合前复合物脱包被并将表达盒有效导入非分裂细胞(如树突细胞)的细胞核的信号。
在一个实施方式中,本发明包括包含称为cPPT/CTS序列的中心多嘌呤序列和中心终止序列,具体地,在欧洲专利申请EP 2169073中。
其它序列通常以顺式出现,如参与载体原病毒DNA序列整合到宿主细胞基因组的长末端重复(LTR)。可通过使LTR序列突变以获得载体,例如在所述LTR的结构域U3中突变(ΔU3)(Miyoshi H等,1998,J Virol.72(10):8150-7;Zufferey等,1998,J Virol 72(12):9873-80),如图1所示。
优选地,载体不含增强子。在一个实施方式中,本发明包括包含LTR序列的慢病毒载体,优选具有移除了3’LTR中启动子和增强子序列的突变的U3区(ΔU3)。
还可以掺入包装序列Ψ(psi)以帮助将多核苷酸序列衣壳化为载体颗粒(Kessler等,2007,Leukemia,21(9):1859-74;Paschen等,2004,Cancer Immunol Immunother 12(6):196-203)。
在一个实施方式中,本发明包括包含慢病毒包装序列Ψ(psi)的慢病毒载体。
其它额外的功能性序列,如转运RNA-结合位点或引物结合位点(PBS)或土拨鼠转录后调控元件(WPRE)也可优选包含在本发明的慢病毒载体多核苷酸序列中,以得到转基因在体内更稳定的表达。
在一个实施方式中,本发明包括包含PBS的慢病毒载体。在一个实施方式中,本发明包括包含WPRE和/或IRES的慢病毒载体。
因此,在优选的实施方式中,慢病毒载体包含至少一种cPPT/CTS序列、一种Ψ序列、一种(优选2种)LTR序列和包括在β2m或MHC I型启动子转录控制下的转基因的表达盒。
启动子
在多个实施方式中,启动子在抗原递呈细胞(包括树突细胞)中驱动高表达以诱导最大免疫应答。优选地,启动子在其他转导的细胞类型中以足够的水平表达,该表达水平足以供于通过诱导的免疫应答进行消除。更优选地,该启动子缺少增强子元件以避免插入效应。
最优选地,启动子不是CMV启动子/增强子。优选地,启动子不是dectin-2或MHCII启动子。
多种哺乳动物(人)MHC I型启动子的序列如下所示:
HLA-A2(MHC I):
attggggagtcccagccttggggattccccaactccgcagtttcttttctccctctcccaacctatgtagggtccttcttcctggatactcacgacgcggacccagttctcactcccattgggtgtcgggtttccagagaagccaatcagtgtcgtcgcggtcgcggttctaaagtccgcacgcacccaccgggactcagattctccccagacgccgagg
(SEQ ID NO:1)
HLA-B7(MHC I):
ggggaggcgcagcgttggggattccccactcccctgagtttcacttcttctcccaacttgtgtcgggtccttcttccaggatactcgtgacgcgtccccacttcccactcccattgggtattggatatctagagaagccaatcagcgtcgccgcggtcccagttctaaagtccccacgcacccacccggactcagag(SEQ ID NO:2)
HLA-Cw5(MHC I):
cactggggaggcgccgcgttgaggattctccactcccctcagtttcacttcttctcccaacctgcgtcgggtccttcttcctgaatactcatgacgcgtccccaattcccactcccattgggtgtcgggttctagagaagccaatcagcgtctccgcagtcccggtctaaagtccccagtcacccacccggactcagattctccccagacgccgag
(SEQ ID NO:3)
HLA-E(MHC I):
taagaactgctgattgctgggaaactctgcagtttcccgttcctctcgtaacctggtcatgtgtccttcttcctggatactcatgacgcagactcagttctcattcccaatgggtgtcgggtttctagagaagccaatcagcgtcgccacgactcccgactataaagtccccatccggactcaagaagttctcaggactcagagg(SEQ ID NO:4)
HLA-F(MHC I):
aggccccgaggcggtgtctggggttggaaggctcagtattgagaattccccatctccccagagtttctctttctctcccaacccgtgtcaggtccttcatcctggatactcataacgcggccccatttctcactcccattgggcgtcgcgtttctagagaagccaatcagtgtcgccgcagttcccaggttctaaagtcccacgcaccccgcgggactcatatttttcccagacgcggaggttggggtcatg(SEQ ID NO:5)
人β2-微球蛋白启动子的序列如下所示:
Aacatcacgagactctaagaaaaggaaactgaaaacgggaaagtccctctctctaacctggcactgcgtcgctggcttggagacaggtgacggtccctgcgggccttgtcctgattggctgggcacgcgtttaatataagtggaggcgtcgcgctggcgggcattcctgaagctgacagcattcgggccgag(SEQ ID NO:6)。
MHCI和β2m启动子不含增强子。此外,这些启动子是树突细胞特异性的(APC),即BDCA+树突细胞中启动子的表达高于肾、平滑肌、肝脏和心脏细胞中的表达。它们在其他转导细胞类型中也具有相对高的表达,例如,BDCA+树突细胞中启动子的表达仅为骨骼肌细胞中该启动子表达的12-100倍,而MHCII HLA-DRα启动子则为900倍。同上。
在多个实施方式中,慢病毒载体包含β2m或MHC I型启动子。优选地,MHC I型启动子是HLA-A2启动子、HLA-B7启动子、HLA-Cw5启动子、HLA-F或HLA-E启动子。在各种实施方式中,启动子序列包含与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的启动子序列具有超过90%,优选超过95%,更优选超过99%相同性的多核苷酸序列。
本发明包括树突细胞特异性启动子。“树突细胞特异性启动子”是其中BDCA+树突细胞中启动子的表达高于肾,平滑肌,肝和心脏细胞中的表达的启动子。优选地,BDCA+树突细胞中启动子的表达比肾,平滑肌,肝和/或心脏细胞中的表达高至少2倍,3倍或4倍。启动子是否“比肾脏,平滑肌,肝脏和/或心脏细胞中的表达高(2倍,3倍或4倍)”可以通过参考http://biogps.org上的数据集来确定,在此引入作为参考,或通过使用Affimetrix探针,芯片和用于产生这些数据集的方法(特别是HG-U133集)。β2m,HLA-A2,HLA-B7,HLA-Cw5,HLA-F和HLA-E启动子是“树突细胞特异性启动子”。EF1α启动子不是。因此,优选地,启动子不是EF1α启动子。
优选地,启动子驱动其他转导细胞类型,例如肾,平滑肌,肝和/或心脏细胞和骨骼肌中的表达。优选地,启动子在BDCA+树突细胞中的表达是该启动子在骨骼肌细胞中表达的12-100倍。是否“启动子在BDCA+树突细胞中的表达是该启动子在骨骼肌细胞中表达的12-100倍”可以通过参考http://biogps.org上的数据集来确定,其通过引用纳入本文,或者通过使用Affimetrix探针,芯片和用于生成这些数据集的方法(特别是HG-U133集)。最优选地,启动子在BDCA+树突细胞中的表达是该启动子在骨骼肌细胞中表达的12-100倍,并且启动子在BDCA+树突细胞中的表达高于在肾,平滑肌,肝脏和心脏细胞中的表达。β2m,HLA-A2,HLA-B7,HLA-Cw5,HLA-F和HLA-E启动子是其中启动子在BDCA+树突细胞中的表达是该启动子在骨骼肌细胞中表达的12-100倍的启动子。HLA-A2启动子和UBC启动子不是。因此,优选地,启动子不是HLA-A2(MHCII)启动子或UBC(泛素)启动子。
在一些实施方式中,启动子在BDCA+树突细胞中的表达是该启动子在骨骼肌细胞中表达的至少10倍,12倍,15倍,20倍,25倍,30倍,35倍,40倍,50倍或60倍。
在一个实施方式中,本发明包括慢病毒载体颗粒,其包含慢病毒载体,所述慢病毒载体包含指导基因型A和C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面抗原、聚合酶、HBX蛋白和HBV共有核心的表达的树突细胞特异性启动子,其中慢病毒载体颗粒在BDCM细胞中表现出比在HEK 293T细胞中更高的抗原表达。
在各实施方式中,与其中转基因序列处于CMV启动子的转录控制下的载体相比,包含启动子的慢病毒载体在体内诱导针对编码的免疫原性多肽的更强CTL应答。在本发明的上下文中,载体是否“与其中转基因序列处于CMV启动子的转录控制下的载体相比,在体内诱导针对编码的免疫原性多肽的更强CTL应答”可以使用实施例所述的测定来确定。也可以使用提供类似结果的其他测定。
在各实施方式中,与其中转基因序列处于EF1α启动子的转录控制下的载体相比,包含启动子的慢病毒载体在体内诱导针对编码的免疫原性多肽的更大CTL应答。优选地,用该启动子的CTL应答比用EF1α启动子高至少2倍或3倍。在本发明的上下文中,载体是否“与其中转基因序列处于EF1α启动子的转录控制下的载体相比,在体内诱导针对编码的免疫原性多肽的更强CTL应答”可以使用实施例所述的测定来确定。也可以使用提供类似结果的其他测定。
在各实施方式中,与其中转基因序列处于泛素启动子的转录控制下的载体相比,包含启动子的慢病毒载体在体内诱导针对编码的免疫原性多肽的更大CTL应答。在本发明的上下文中,载体是否“与其中转基因序列处于泛素启动子的转录控制下的载体相比,在体内诱导针对编码的免疫原性多肽的更强CTL应答”可以使用实施例所述的测定来确定。也可以使用提供类似结果的其他测定。
本发明包括含有不含增强子的启动子的慢病毒载体。
本发明包括将MHC I型(MHCI)或β2微球蛋白(β2m)启动子插入慢病毒载体中。如本文中所用,“MHC I型(MHCI)启动子”或“β2微球蛋白启动子”包括天然产生或合成的MHC I型启动子或β2微球蛋白启动子。术语“MHC I型启动子”不包括β2m启动子。
在一个实施方式中,包含启动子的慢病毒载体颗粒在BDCM细胞中表现出比在HEK293 T细胞中更高的抗原表达。
启动子可以是天然产生的启动子。天然产生的启动子的示例是人β2m、HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E、HLA-F基因启动子。这些天然产生的MHCI启动子一般从编码MHC I型蛋白的基因的启动子区中克隆或复制,后称为推定的编码,如基因组数据库中的蛋白质(如:NCBI多核苷酸数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/dna-rna)。β2m和MHC I型蛋白都进入主要组织相容性复合物(MHC)。
这些基因编码的蛋白质发现于几乎所有细胞类型中。MHCI蛋白一般存在于白细胞膜的表面处,其中它们与β2-微球蛋白(β2m)结合。这些相关联蛋白质的作用是将内源性来源的肽递呈至CD8+T细胞。因此,其在抗原特异性免疫应答的产生过程中起核心作用。因为多年来MHC I型蛋白已得到了广泛研究和描述,所以其基因已被成熟表征并可使用序列比对工具(如BLAST法)良好地检测(Altschul,S.F.等(1990).Basic local alignmentsearch tool.(局部比对检索基本工具)J.Mol.Biol.215(3):403-410)。
MHC I型启动子也共有在抗原呈递细胞(包括树突细胞)中被强激活的能力,以及,在大多数其它人体组织中降低强度的能力。
本发明的启动子还可含有调控元件,如一个或多个Sp1和ETs结合位点。在一个优选实施方式中,MHC I型启动子含有2个Sp1结合位点和1个Ets结合位点。在其他实施方式中,Ap1和/或Ap2位点也包含在启动子中。
优选的启动子是天然产生的人β2m、HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E和HLA-F启动子。
启动子也可以是合成的。合成的启动子包括使用分子生物学技术组装启动子的个体组分合成的启动子或者使用分子生物学技术由天然产生的启动子衍生的启动子。
在各种实施方式中,合成的启动子包含与β2m或MHC I型基因启动子的启动子序列共享超过90%,优选超过95%,更优选超过99%相同性或100%的多核苷酸序列(例如,SEQID NO:1-6和19)。
MHC类基因的转录通常由两个主要的调节元件介导:干扰素刺激的应答元件(ISRE)和SXY模块(包括W/S,X1X2/位点α和Y/增强子B调节元件)(见图1)。还参见Van denElsen,Immunogenetics(1998)48:208-211。
这些调控启动子元件位于延伸自大约转录起始位点上游第-220至-95核苷酸的区域中。其介导MHC I型基因的组织特异性和细胞因子诱导的转录。
MHC I型基因启动子的ISRE通常含有干扰素调节因子(IRF)家族成员的结合位点。因此,I型MHC启动子的一个特性是结合干扰素调节因子(IRF)家族成员。这可由,例如,凝胶迁移试验验证。
另一种调控元件,增强子A(含有细胞核转录因子κB(NF-κB)的结合位点)存在于大多数情况中。因此,MHC I型启动子的一个特性是结合核转录因子κB(NF-κB)。这可由,例如,凝胶迁移试验验证。
除了ISRE,MHC I型启动子通常共享另一组保守的上游序列基序,由三个调控元件组成:S或W盒,X1/CREX2盒或位点α,以及Y盒或增强子B,它们在一起被称为SXY模块。该SXY模块通常与含有调节因子X(RFX;由RFX5、RFXB/ANK和RFXAP组成)、cAMP应答元件结合蛋白(CREB)/激活转录因子(ATF)和作为增强体驱动这些基因反式激活的核因子Y(NFY)的多蛋白复合物协同地结合。因此,MHC I型启动子的一个特性是与这些因子结合。这可由,例如,凝胶迁移试验验证。
相反地,MHC II型启动子不显示增强子A或ISRE元件(Van den Elsen,P.J等,1998,Immunogenetics.48:208-221)。此外,如使用从裸淋巴细胞综合征(BLS;一种由于RFX亚基之一或CIITA中发生突变产生的重症联合免疫缺陷)患者建立的细胞系进行的研究所示,发现II型MHC基因调控中的RFX和CIITA是至关重要的。此外,缺少CIITA或RFX亚基之一分别影响MHC增强体的功能和组装,导致缺少II型MHC且I型MHC转录水平下降(Van denElsen,P.J.等,2004,Current Opinion in Immunology,16:67-75)。
在一个实施方式中,本发明包括一种方法,包括:将本发明的启动子,特别是β2m或MHC I型启动子插入慢病毒载体中以引导转基因的表达,所述转基因优选编码免疫原性多肽,最优选编码基因型A和C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面抗原、聚合酶、HBX蛋白和HBV共有核心。该方法还可包括插入本文中所述任意其他核酸元件,如DNA瓣序列。
分离的细胞
本发明包括含有编码以下的载体和慢病毒载体颗粒的细胞:
-基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位。
在一个实施方式中,所述细胞含有整合到细胞基因组中的载体。
在一个实施方式中,细胞含有瞬时表达以下的载体:基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,以及基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位。
在一个实施方式中,细胞产生编码以下的慢病毒载体颗粒:基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,以及基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位。
在各种实施方式中,本发明包括细胞系,细胞群,或包含根据本发明的载体和慢病毒载体颗粒的细胞培养物。
优选地,由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体,或慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的聚合酶是至少一种基因型A的聚合酶和至少一种基因型C的聚合酶。
优选地,由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体,或慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白是至少一种基因型A的HBX蛋白和至少一种基因型C的HBX蛋白。
优选地,由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体,或慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的乙肝病毒(HBV)包膜表面是至少一种基因型A的乙肝病毒(HBV)包膜表面和至少一种基因型C的乙肝病毒(HBV)包膜表面。
在优选实施方式中:
-由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体,或慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的聚合酶是至少一种基因型A的聚合酶和至少一种基因型C的聚合酶;
-由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体,或慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白是至少一种基因型A的HBX蛋白和至少一种基因型C的HBX蛋白;和
-由根据本发明的载体,特别是慢病毒载体,或慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的乙肝病毒(HBV)包膜表面是至少一种基因型A的乙肝病毒(HBV)包膜表面和至少一种基因型C的乙肝病毒(HBV)包膜表面。
慢病毒载体颗粒
本发明提供了一种制备慢病毒载体颗粒的方法。慢病毒载体颗粒(或慢病毒颗粒载体)包括与病毒蛋白质相关联的慢病毒载体。该载体优选是整合载体。
在一个实施方式中,慢病毒载体颗粒编码:
-基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位。
优选地,由根据本发明的慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的聚合酶是至少一种基因型A的聚合酶和至少一种基因型C的聚合酶。
优选地,由根据本发明的慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白是至少一种基因型A的HBX蛋白和至少一种基因型C的HBX蛋白。
优选地,由根据本发明的慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的乙肝病毒(HBV)包膜表面是至少一种基因型A的乙肝病毒(HBV)包膜表面和至少一种基因型C的乙肝病毒(HBV)包膜表面。
在优选实施方式中:
-由根据本发明的慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的聚合酶是至少一种基因型A的聚合酶和至少一种基因型C的聚合酶;
-由根据本发明的慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的HBX蛋白是至少一种基因型A的HBX蛋白和至少一种基因型C的HBX蛋白;和
-由根据本发明的慢病毒载体颗粒编码的至少一种基因型A和/或C抗原的乙肝病毒(HBV)包膜表面是至少一种基因型A的乙肝病毒(HBV)包膜表面和至少一种基因型C的乙肝病毒(HBV)包膜表面。
优选地,慢病毒载体颗粒包含单独或组合地编码本文详述的任何SEQ ID NO的氨基酸序列的核酸序列,如SEQ ID NO:24和/或SEQ ID NO:25,并且优选至少编码SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。
在一个实施方式中,慢病毒载体颗粒包含HIV-1Gag和Pol蛋白。优选地,慢病毒载体颗粒包含亚型D,尤其是HIV-1NDK,Gag和Pol蛋白。
根据该方法的一个实施方式,慢病毒载体颗粒在转化有DNA质粒的宿主细胞中获得。
这种DNA质粒可包含:
-细菌复制起点(如pUC ori);
-用于选择的抗生素抗性基因(如KanR);且更具体地:
-慢病毒载体,其包含至少一个与MHC I型启动子转录连接的转基因。
该方法允许产生根据本发明的重组载体颗粒,包括以下步骤:
i)使用慢病毒载体转染合适的宿主细胞;
ii)使用包装质粒载体转染所述宿主细胞,所述包装质粒载体含有至少编码反转录病毒(优选慢病毒)的结构和聚合酶(+/-整合酶)活性的病毒DNA序列;这类包装质粒在本领域中已有描述(Dull等,1998,J Virol,72(11):8463-71;Zufferey等,1998,J Virol 72(12):9873-80)。
iii)培养所述转染的宿主细胞以使所述慢病毒载体表达并包装成慢病毒载体颗粒;以及
iv)收获所述培养的宿主细胞中由步骤iii)的表达和包装所得到的慢病毒载体颗粒。
基于不同原因,制备获得的逆转录病毒颗粒的假型(即增加或代替特定颗粒包膜蛋白)可能是有帮助的。例如,具有不同的包膜蛋白以区分重组颗粒与天然颗粒或其他重组颗粒可能是有利的。在疫苗接种策略中,当后者已经发展出针对慢病毒的免疫时,假型颗粒载体更有可能逃避免疫系统。如果类似的颗粒载体的连续注射是使患者对疾病产生免疫所必需的,那么这是特别有帮助的。
为制备本发明的逆转录病毒颗粒的假型,还可使用编码病毒包膜蛋白(优选VSV-G包膜蛋白)的一种或数种包膜DNA质粒来转染宿主细胞。
合适的宿主细胞优选是人培养细胞系,例如HEK细胞系。
或者用于生产载体颗粒的方法可在宿主细胞中进行,其基因组已使用如下一种或多种组分稳定转化:慢病毒载体DNA序列、包装基因和包膜基因。这类DNA序列可被视作与本发明的原病毒载体类似,包含额外的启动子以允许载体序列转录并提高颗粒生产率。
在优选实施方式中,还对宿主细胞进行修饰,使其能够在培养基中以连续的方式生产病毒颗粒,同时整个细胞不发生溶胀或死亡。关于这种产生病毒颗粒的技术,可以参考Strang等,2005,J Virol 79(3):1165-71;Relander等,2005,Mol Ther 11(3):452-9;Stewart等,2009,Gene Ther,16(6):805-14;和Stuart等,2011,Hum gene Ther.。
本发明的目的由用慢病毒颗粒载体转化的宿主细胞组成。
慢病毒颗粒载体可包括以下元件,如前文所定义:
-cPPT/CTS多核苷酸序列;以及
-本发明的启动子控制下的转基因序列,以及任选的上述附加元件之一。
优选地,慢病毒载体颗粒的剂量是106、2x 106、5x 106、107、2x 107、5x 107、108、2x108、5x 108、或109TU。
细胞中表达转基因的方法
本发明包括用于在细胞(优选非分裂细胞)中表达转基因的方法。该方法包括在允许转基因表达的条件下,使用本发明的慢病毒载体或慢病毒颗粒载体转导细胞。
细胞优选是哺乳动物细胞,特别是人细胞。特别优选的是人非分裂细胞。
转基因优选编码至少一种基因型A和C抗原的乙肝病毒(HBV)包膜表面抗原,聚合酶,HBX蛋白和HBV共有核心。该方法还可包括收获或分离所述多肽。
慢病毒载体或慢病毒颗粒载体优选包含本发明的启动子。
在一个实施方式中,本发明包括表达转基因的方法,包括将本发明的启动子插入慢病毒载体,使得其引导转基因的表达并用含有启动子的载体转导细胞。
慢病毒载体的治疗性用途
本发明还涉及本发明的慢病毒载体,尤其是慢病毒载体颗粒形式,用于制备治疗性组合物或疫苗的应用,所述治疗性组合物或疫苗能够诱导或有利于针对表位发生免疫应答或该应答的增强,所述免疫应答更特定地是针对由存在于在本发明任何启动子的转录控制下的所述载体中的转基因编码的那些表位。
本发明包括向人给予慢病毒的载体(或“慢病毒载体”)的方法。优选地,该慢病毒载体含有在抗原呈递细胞(包括树突细胞)中驱动抗原高表达,并驱动足以通过诱导的免疫应答消除的其他转导细胞类型中的表达的启动子。最优选地,该启动子缺少增强子元件以避免插入效应。
优选地,给药是肌肉内。在一个实施方式中,使用针将慢病毒载体注射到肌肉中。
根据本发明的抗原是:
-基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位。
优选地,慢病毒颗粒是包含功能性整合酶蛋白的整合的慢病毒颗粒。
最优选地,给药消除了给药后第21天消除了给药后第4天时在动物模型的肌肉细胞中整合的慢病毒DNA的至少95%,99%,99.9%或99.99%。
在一个实施方式中,本发明包括在人体内诱导免疫应答的方法,包括向人肌内给予包含功能性整合酶蛋白和慢病毒载体的慢病毒载体颗粒;其中所述整合慢病毒载体包含引导基因型A和/或C抗原的至少一种乙型肝炎病毒(HBV)包膜表面,基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位的表达的启动子,其中该启动子不含有增强子,并且其中慢病毒载体颗粒在BDCM细胞中表现出比在HEK293 T细胞中更高的抗原表达;将慢病毒载体的DNA整合到人的细胞中;在人的细胞中表达抗原;并产生针对抗原的免疫应答。
在一个实施方式中,本发明包括在人体内诱导免疫应答的方法,包括向人肌内给予包含功能性整合酶蛋白和慢病毒载体的慢病毒载体颗粒;其中所述整合慢病毒载体包含引导基因型A和/或C抗原的至少一种乙型肝炎病毒(HBV)包膜表面,基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位的表达的启动子,其中启动子不含有增强子,其中启动子在BDCA+树突细胞中的表达高于在肾,平滑肌,肝和心脏细胞中的表达;将慢病毒载体的DNA整合到人的细胞中;在人的细胞中表达抗原;并产生针对抗原的免疫应答。
在一个实施方式中,本发明包括在人体内诱导免疫应答的方法,包括向人肌内给予包含功能性整合酶蛋白和慢病毒载体的慢病毒载体颗粒;其中所述整合慢病毒载体包含引导基因型A和/或C抗原的至少一种乙型肝炎病毒(HBV)包膜表面,基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位的表达的启动子,其中启动子不含有增强子,其中启动子在BDCA+树突细胞中的表达是该启动子在骨骼肌细胞中表达的12-100倍;将慢病毒载体的DNA整合到人的细胞中;在人的细胞中表达抗原;并产生针对抗原的免疫应答。
在一个实施方式中,本发明包括在人体内诱导免疫应答的方法,包括向人肌内给予包含功能性整合酶蛋白和慢病毒载体的慢病毒载体颗粒;其中所述整合慢病毒载体包含引导基因型A和/或C抗原的至少一种乙型肝炎病毒(HBV)包膜表面,基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位的表达的启动子,其中启动子不含有增强子,其中启动子在BDCA+树突细胞中的表达高于肾,平滑肌,肝和心脏细胞中的表达,并且其中启动子在BDCA+树突细胞中的表达是该启动子在骨骼肌细胞中表达的12-100倍;将慢病毒载体的DNA整合到人的细胞中;在人的细胞中表达抗原;并产生针对抗原的免疫应答。
在一些实施方式中,该方法包括在给药后第21天,第25天,第33天或第66天消除了给药后第4天时动物模型的肌肉细胞中整合的慢病毒DNA的至少95%,99%,99.9%或99.99%。可以如实施例和其他类似技术中所述测量肌肉细胞中整合的慢病毒的消除。例如,可以在第4天和第21天小鼠或大鼠的注射部位进行活组织检查,并且通过PCR测定这些时间点细胞中整合的DNA的量。
在一个实施方式中,本发明包括在人体内诱导免疫应答的方法,包括向人肌内给予包含功能性整合酶蛋白和慢病毒载体的慢病毒载体颗粒;其中所述整合慢病毒载体包含引导基因型A和/或C抗原的至少一种乙型肝炎病毒(HBV)包膜表面,基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位的表达的启动子,其中启动子不含有增强子;将慢病毒载体的DNA整合到人的细胞中;在人的细胞中表达抗原;并产生免疫应答。
优选地,慢病毒载体颗粒的剂量是106、2x 106、5x 106、107、2x 107、5x 107、108、2x108、5x 108、或109TU。更优选地,所述慢病毒颗粒的剂量为至少1x 107TU,特别是至少7x107TU。
由慢病毒载体诱导的免疫应答可以是B细胞应答,CD4+T细胞应答和/或CD8+T细胞应答。
因此,本发明提供了用作药物或疫苗,尤其是用于肌肉内给药的载体。
这些载体优选用于治疗或预防感染性疾病,尤其是与病毒感染有关的疾病,更具体地说,与HBV感染有关的疾病。
由于本发明的载体更特异性地靶向树突细胞以获得细胞介导的免疫应答,特别是与这些细胞中的转基因表达的抗原相关联的CTL应答,其作为靶向HBV的疫苗时其特别有用。
因此,本发明涉及包含前文所定义的慢病毒载体的免疫原性组合物。
本发明的免疫原性组合物优选包含载体和载体颗粒中的cPPT和CTS序列,以诱导或刺激载体基因组在靶细胞中的核输入。
逆转录期间,cPPT和CTS序列诱导称作DNA三链体的三链DNA结构的形成,其刺激DNA载体序列的核输入。优选地,该载体包含转基因以及逆转录病毒或逆转录病毒样来源逆转录、表达和壳体化的调控信号,该组合物能够诱导或刺激CTL(细胞毒性T淋巴细胞)和/或CD4对载体中存在的转基因序列所编码的一种或数种表位产生应答。
通过在载体中包含本发明的启动子,极大地改善了转基因的表达。
因此,根据本发明的慢病毒载体具有诱导、改善B细胞应答、CD4+T细胞应答和/或CD8+T细胞应答,特别是记忆CTL应答的发生的能力或总体与之相关的能力,特别是针对HBV。换句话说,它们可用于制备治疗组合物,用于通过诱导,刺激或参与细胞介导的免疫应答,特别是CTL应答或记忆应答的发生来治疗变态应答,自身免疫疾病,肿瘤疾病或传染病,特别是HBV。
本发明的慢病毒载体可用于治疗方法和诱导免疫应答,特别是针对HBV的方法,包括向宿主给予慢病毒载体并在宿主中产生针对转基因的特异性免疫应答。这些宿主中生成的细胞和抗体可用作诊断试剂。
本发明的慢病毒载体优选用于肌肉内给予,最优选通过用针注射。
在特定实施方式中,本发明的免疫原性组合物可直接给予患者,以可在体内诱导、提高或参与B细胞应答,CD4+T细胞应答,和/或CD8+T细胞应答,尤其是CTL介导的免疫应答(特别是针对HBV)的发生的方式给予。
在另一个实施方式中,免疫原性组合物可单次使用或重复给药,优选至少两次给药后使用,使其能够产生长期记忆型细胞介导的应答。
本发明的免疫原性组合物的一个特别的优点是它们可以用于引发或刺激细胞介导的免疫应答,所述免疫应答针对由感兴趣的核苷酸序列或存在于载体或载体颗粒中的转基因编码的多个表位,特别是针对HBV,并且它们也可用于引发或刺激针对基因整个序列序列产物的细胞介导的免疫应答。
本发明还包括包含核苷酸序列的慢病毒载体,所述核苷酸序列编码诱导细胞应答的氨基酸序列的多个重复(至少2条相同序列)和/或含有对应于不同抗原的2个表位的氨基酸序列。
因此,本发明包括可用于预防性和/或治疗性疫苗接种方案的组合物,特别是针对HBV。
具体而言,其可与佐剂、其他免疫原性组合物、化疗或任何其他治疗性处理(特别是针对HBV)联用。
本发明包括用于向人肌内给药的组合物,其包含含有功能性整合酶蛋白和慢病毒载体的慢病毒载体颗粒;其中慢病毒载体的DNA包含启动子,所述启动子引导包含以下或由以下组成的氨基酸的表达:基因型A和/或C抗原的至少一种乙型肝炎病毒(HBV)包膜表面,基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,以及基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位(特别是由本文详述的任何SEQ ID NO的氨基酸序列编码)。
在一个实施方式中,本发明包括用于肌内给予人的组合物,其包含慢病毒载体颗粒,所述慢病毒载体颗粒包含功能性整合酶蛋白和慢病毒载体;其中所述整合慢病毒载体的DNA包含引导基因型A和/或C抗原的至少一种乙型肝炎病毒(HBV)包膜表面,基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位(特别是由本文详述的任何SEQ ID NO的氨基酸序列编码)的表达的启动子,其中启动子不含有增强子,并且其中启动子在BDCA+树突细胞中的表达是该启动子在骨骼肌细胞中表达的12-100倍,并且启动子在BDCA+树突状细胞中的表达高于在肾,平滑肌,肝和心脏细胞中的表达。
本发明包括组合物在人肌内给药中的用途,所述组合物包含慢病毒载体颗粒,其中慢病毒载体颗粒包含功能性整合酶蛋白和慢病毒载体;其中慢病毒载体的DNA包含启动子,所述启动子引导包含以下或由其组成的氨基酸的表达:基因型A和/或C抗原的至少一种乙型肝炎病毒(HBV)包膜表面,基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,以及基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位(特别是由本文详述的任何SEQ ID NO的氨基酸序列编码)。
在一个实施方式中,本发明包括组合物在人肌内给药中的用途,所述组合物包含慢病毒载体颗粒,其中慢病毒载体颗粒包含功能性整合酶蛋白和慢病毒载体;其中所述整合慢病毒载体的DNA包含引导基因型A和/或C抗原的至少一种乙型肝炎病毒(HBV)包膜表面,基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位(特别是由本文详述的任何SEQ IDNO的氨基酸序列编码)的表达的启动子,其中启动子不含有增强子,并且其中启动子在BDCA+树突细胞中的表达是该启动子在骨骼肌细胞中表达的12-100倍,并且启动子在BDCA+树突状细胞中的表达高于在肾,平滑肌,肝和心脏细胞中的表达。
因此,已经描述了本发明的不同实施方式,本领域技术人员应注意,本文所公开的内容仅是示例性的,且多种其他替代、调整或修改可包括在本发明的范围内。因此,本发明不限于本文所示特定实施方式。
实施例
实施例1.分子构建体
使用分别包含SpeI和XbaI限制性位点的直接(5’-CTTACTAGTTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAC-3’;SEQ ID NO:7)和反向(5’-CATTCTAGAACTGCTAGAG ATTTTCCACACTG-3’;SEQ IDNO:8)寡核苷酸进行pTRIPAU3-CMV-GFP(15)的原病毒区域的PCR扩增。将得到的片段消化并克隆到pVAX-1质粒(英杰公司(Invitrogen),生命技术公司(Lifetech))的SpeI和XbaI位点之间,其中MluI位点已被删除。得到的质粒命名为pFLAP-CMV-GFP。通过PCR从pTRIPΔU3-CMV-GFP质粒(使用5′-TACCCCGGGCCATGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTC-3′(SEQ ID NO:9)和5′-ACTCCCGGGTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAG GCCGCC-3′(SEQ ID NO:10)寡核苷酸)扩增SV40序列,并将其克隆到pFLAP-CMV-GFP的Pml1位点中,然后将得到的质粒命名为pFLAP-CMV-GFP-SV。用分别包含MluI和BamHI位点的直接(5′-TACACGCGTGGAGTTCCGCGTTACATA ACTTACGG-3′;SEQ ID NO:11)和反向(5′-CGTGGATCCGATCGCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAAC-3′;SEQ ID NO:12)寡核苷酸扩增CMV启动子。将得到的片段克隆回pFlap-CMV-GFP-SV的MluI和BamHI位点之间,允许容易地替换慢病毒载体内的启动子。然后针对β2m启动子用5′-GCCGGCGCGCCGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCC-3′(SEQ ID NO:13)和5′-CGTGGATCCGATCGCTCGGCCCGAATGCTGTCAGCTTCAGG-3′(SEQ ID NO:14)通过PCR从HEK293T细胞DNA扩增启动子,并克隆在pFLAP-CMV-GFP-SV的MluI和BamH1位点之间,产生pFlap-β2m-SV。扩增的β2m启动子序列如下:
GAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAGCTGTAGTTATAAACAGAAGTTCTCCTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAATGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCGGGGGCACCATTAGCAAGTCACTTAGCATCTCTGGGGCCAGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTCCAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCAAGCTGGGGCGCGCACCCCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCATGCCTTCTTAAACATCACGAGACTCTAAGAAAAGGAAACTGAAAACGGGAAAGTCCCTCTCTCTAACCTGGCACTGCGTCGCTGGCTTGGAGACAGGTGACGGTCCCTGCGGGCCTTGTCCTGATTGGCTGGGCACGCGTTTAATATAAGTGGAGGCGTCGCGCTGGCGGGCATTCCTGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAG(SEQ IDNO:15)。可以合成HBV抗原并克隆到pFlap-β2m-SV的BamHI和XhoI位点之间,代替GFP基因。
例如,pFlap-β2m-GFP-SV可以被BamHI和XhoI消化,并且可以在这些位点之间克隆含有多克隆位点(MCS,携带SalI,SacII,NdeI,AscI和NheI限制性位点)的DNA接头,代替GFP基因以允许插入编码HBV抗原的核酸序列。
通过PCR扩增HIV-1NDK基因组来构建包装质粒pTHV-GP-N(使用以下寡核苷酸,5’-atgcatgcgtcgacctcgagttaatcctcatcctgtctacttgccac-3’(SEQ IDNO:16)和5’-gcatgcatcggccggggcggcgactgGTgagagGCCACCatgggtgcgagagcgtcagtattaag-3’(SEQ ID NO:17))。所得的片段用EagI和SalI限制性酶消化并插入p8.74包装质粒(15)中,已在之前从该质粒中去除了Eag1-SalI片段。
通过合成对应于水泡性口炎病毒Indiana(GenBank#CAX62728.1)、New Jersey(GenBank#CAX62729.1)和Cocal(GenBank#CAX62731.1)毒株的密码子优化基因来生成假型化质粒。然后,这些基因用EcoR1和BamH1消化并且克隆到pVAX1质粒(英杰公司,生命技术公司)的相应限制性位点之间。
可按照生产商的说明(MN公司)使用Nucleobond Xtra Maxi EF柱来产生质粒。
实施例2.慢病毒产生
R&D生产:可如之前所述通过HEK 293T的瞬时磷酸钙转染来产生载体(25)。
临床前和GMP生产:转染前一天,将HEK 293T细胞接种在24单位Cell Factory 10(CF-10,Nunc)的培养基中。如先前报道的,通过磷酸钙方法转染细胞(25)。转染后18至24小时,用对应于达氏改良伊氏培养基(DMEM/高改良,Hyclone)的生产培养基更换培养基,所述培养基补充有2%热灭活的胎牛血清(FCS,PAA),1%L-谷氨酰胺(Gibco,生命技术公司),1%青霉素-链霉素(Gibco,生命技术公司),1%丙酮酸钠(Gibco,生命技术公司),(制药级I,100000U,默克密理博(Merck Millipore))和MgCl21M。培养基更新后至少24小时,收获24CF-10的上清液并合并。在第二次处理后,通过在Kleenpak Nova Profile II柱(珀尔公司(Pall))上过滤澄清上清液。澄清后,第三次处理在+2/+8℃下过夜进行。使用Mustang-Q XT盒(珀尔公司)上的阴离子交换色谱法纯化病毒载体。慢病毒颗粒用0.5M和1,2MNaCl分两步洗脱。在合并之前,将两种级分均稀释以将NaCl浓度降低至±150mM。通过使用100KDa Omega T系列过滤器,0.1m2(珀尔公司)进行超滤,并用PBS-乳糖40mg.L-1渗滤,将IEX洗脱液进一步浓缩约40倍。最后将纯化的体积(药物物质)通过0.2μM Sartobran H5过滤器(300cm2)(Sartorius Stedim)过滤,无菌分布在2R3mL玻璃小瓶上,目标填充体积为650μL(试验批次为1200μL)。在目视检查所有小瓶(临床批次约350个小瓶)后,将药物产品储存在-70℃±10℃。
对于产物表征和药物释放,可按照以下进行质量测试:疫苗的法规文本:疫苗所要求的质量控制按照欧洲药典(6.16部分),“活重组病毒载体疫苗的质量、非临床和临床方面指南”(EMA/CHMP/141697/2009),“慢病毒载体的开发和生产指南”(CHMP/BWP/2458/03);基因治疗药物产物的法规文本:人类使用的转基因药物产物所要求的质量控制按照欧洲药典(5.14部分),基因治疗产物特定的质量控制,如“转基因移走无产物的质量、临床前和临床方面的指南注意”(CHMP/BWP/3088/99)中所定义;对生物技术产品的法规文本(ICH Q5A至ICH Q5E);对说明书的法规文本(ICH Q6A和ICH Q6B)以及按照欧洲药典(7.0部分)的胃肠外制剂所需的质量控制。
实施例3.慢病毒载体滴定
qPCR应答:HEK 293T细胞接种在培养基的6-孔平板(BD Falcon)并在37℃,5%CO2下的潮湿气氛中孵育4小时。用慢病毒载体的3个连续稀释来转导细胞。孵育后72小时,收获细胞并产生转导的HEK 293T细胞沉淀。使用基于QIAGEN QIAamp DNA小型试剂盒手册的方法提取来自转导的细胞-沉淀的总基因组DNA。使用Taqman qPCR进行原病毒定量。使用主混合物(Fermentas赛默飞世尔科技公司(Fermentas Thermo Scientific)),Flap A(CCCAAGAACCCAAGGAACA;SEQ ID NO:18)和Flap S(AGACAA GATAGAGGAAGAGCAAAAC;SEQ IDNO:19)引物和LENTI TM探针(6FAM-AACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGG-BBQ;SEQ ID NO:20)进行扩增。用肌动蛋白基因(相同的混合物,肌动蛋白A-CGGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT-(SEQ IDNO:21),肌动蛋白S-AACACCCCAGCCATGTACGT-(SEQ ID NO:22)引物和HUMURA ACT TM探针-6FAM-CCAGCCAGGTCCAGACGCAGGA-BBQ-(SEQ ID NO:23)的定量进行标准化。在MasterCyclerEp Realplex S(Eppendorf,50℃下2分钟,95℃下10分钟,和40个循环的95℃下15秒和63℃下1分钟)上进行两种应答。在MasterCycler Ep Realplex软件上进行分析。
然后进行FACS分析。
实施例4.在有和没有初免-加强免疫的C57B1/6j小鼠中的T特异性应答(中值)
动物:4周龄的雌性小鼠(C57B1/6J)或8周龄的Sprague Dawley RjHan:SD(SD公司(Sprague Dawley))雌性小鼠购自詹维尔实验室(Janvier Laboratories)(法国)。
根据研究所关于动物实验伦理程序的规定,将动物饲养在巴斯德研究所动物设施中。
根据初免-加强策略(P/B)对两组5只小鼠进行肌肉内免疫:
(i)第一组,初免用7×107TU的本发明的慢病毒载体化的HBV构建体HBV-3,加强用7×107TU的本发明的慢病毒载体化的HBV构建体HBV-3;
(ii)第二组,初免用7×106TU的慢病毒载体化的HBV构建体HBV-3,加强用7×106TU的慢病毒载体化的HBV构建体HBV-3。
在这两组中,初免和加强注射隔开7周。
根据初免注射策略(P)肌肉免疫另外两个小鼠组:
(i)第一组(2只小鼠)用7×107TU的慢病毒载体化的HBV构建体HBV-3;
(ii)第二组(5只小鼠)用7×106TU的慢病毒载体化的HBV构建体HBV-3。
对照小鼠肌内注射PBS-乳糖。
慢病毒载体中本发明的HBV-3构建体表达由启动子(例如β2m或MHCI)驱动。初次免疫后15天,或在有关两组的加强免疫后,可通过IFN-γELISPOT在小鼠脾细胞中监测特异性T细胞应答。
将96孔组织培养板(密理博(Millipore))在4℃下用50μl/孔的5μg/ml抗小鼠IFN-γmAb(小鼠IFN-γElispot对:BD生物科学法敏进公司(BDBiosciences Pharmingen))包被过夜。将板用200ulDPBS/孔洗涤三次,并用200μl/孔的DPBS/10%胎牛血清在37℃下封闭2小时。将板用200ulDPBS/孔洗涤三次。将脾细胞以2.5、4.1或5.1×105个细胞/孔一式三份加入板中,并用2μg/ml刺激性肽(对抗原特异),伴刀豆球蛋白A(5μg/ml;来源)或单独培养基刺激。将板在37℃下孵育18小时,然后用200μl/孔的DPBS/0.05%Tween 20冲洗三次,并用200μl/孔的DPBS冲洗三次。为进行检测,以50μl/孔加入2μg/ml抗小鼠IFNγ-生物素化单克隆抗体(BD法敏进公司(BD Pharmingen)),室温下应答2小时。洗涤板并加入100μl/孔的以1∶2000在达氏PBS中稀释的链酶亲和素-碱性磷酸酶(罗氏公司(Roche)),室温下应答90分钟。洗涤平板后,通过加入60μl/孔的BCIP/NBT溶液(西格玛公司(Sigma))显现斑点(IFN-γ分泌细胞)。将板在室温下孵育15-30分钟直至出现蓝色斑点,并用流动的自来水彻底洗涤并风干24小时。最后,使用Bioreader 2000(生物系统公司(Biosys))计数斑点。
在该实验中测量的累积免疫应答和T免疫应答的多样性在图2中示出。图2还示出了累积结果中每种抗原的免疫应答的比例。
获得的结果表明,当用7×107TU剂量的载体注射时(在初免(P)和初免/加强(P/B)组中),与对照组相比,获得显著的免疫应答。
当根据初免/加强策略(P/B),以7×106TU的剂量注射含有本发明构建体的载体时,与对照组相比,获得了改善的免疫应答。
当以7×107TU的剂量注射时,与7×106TU的剂量相比,使用(P/B)和(P)策略,都获得更好的免疫应答结果。
在相似剂量(即7×107TU或7×106TU)下,根据初免-加强策略(P/B)给药的载体诱导的免疫应答显著高于由根据初免策略(P)给药的载体诱导的免疫应答。
在根据用7×107TU的初免-加强策略(P/B)免疫的小鼠组中,所述诱导的免疫应答特别对核心,PolA,XC,EnvC和VLP更强。
在根据用7×106TU的初免-加强策略(P/B)免疫的小鼠组中,所述诱导的免疫应答特别对XC和EnvC更强。
在根据用7×107TU的初免策略(P)免疫的小鼠组中,所述诱导的免疫应答对核心,PolA,PolC和XA特别强,特别地对核心更强。
实施例5.HBV抗原
设计用于一般人群的HBV治疗性疫苗需要基于多种HLA类型限制的许多表位,以提供可接受水平的群体覆盖。
为了诱导多特异性CTL应答(这是解决HBV感染的关键),构建了携带基因型A和C抗原的包膜表面抗原,聚合酶,HBX蛋白和HBV共有核心的慢病毒载体。
可以构建基于HBV核心蛋白的嵌合VLP以刺激针对表面抗原和HBV核心的多价免疫,因为对HBV核心Ag和HBV表面Ag特异性的免疫应答在控制HBV感染中起重要作用。HBV表面Ag特异性抗体介导在感染早期消除病毒粒子并防止病毒传播。可以通过将HBV表面Ag的免疫显性抗体结合决定簇插入HBV核心Ag来构建嵌合VLP。
从HBV数据库HBVdb(https://hbvdb.ibcp.fr/HBVdb/HBVdbIndex)收集超过一千个肝炎基因型A和基因型C抗原序列,并通过进行多序列比对获得基因型特异性抗原共有序列。
ClustalW(https://hbvdb.ibcp.fr/HBVdb/HBVdbDataset?seqtype=2)用于创建生成共有序列所需的多个比对。
以高亲和力结合多个HLA I型和II型等位基因的高度保守的HBV衍生肽被认为是急性感染患者中的CTL表位(Reignat等,J.Exp.Med.195:1089-1101(2002);Mizukoshi等,J.Immunol.173:5863-5871(2004);Su等,Proc Natl Acad Sci U S A 1997;94:8744-8749;Desmond等,Antiviral Therapy 2007;13:161-175;Bertoni等,J Clin Invest.1997年8月1日;100(3):503-13;Nayersina等,J Immunol.1993年5月15日;150(10):4659-71;Rehermann等,J Clin Invest.1996年4月1日;97(7):1655-65;Kakimi等,J Virol.2002年9月;76(17):8609-20;Mizukoshi等,J Immunol.2004年11月1日;173(9):5863-71;Depla等,J Virol.2008年1月;82(1):435-50;Ding等,Hepatology.2009年5月;49(5):1492-502)。
选择HLA表位的顺序以在整个构建体中分配表位。构建体如图1所示。
为了避免有毒的长期药物治疗或仅支持部分有效的抗病毒治疗,基于LV的HBV治疗性疫苗可以有效地增强患者的免疫系统以对抗和控制病毒。
包含关键的病毒抗原可确保有效刺激T细胞应答-此外还可激活体液免疫应答。
HBV治疗性疫苗可以破坏耐受性并诱导T细胞浸润到肝脏中。多抗原疫苗构建体旨在引发多特异性,多功能细胞和体液应答,模仿天然HBV感染的清除。基于HBV核心的嵌合VLP可以充当佐剂。由于它可以在没有佐剂的情况下使用,因此可以消除大部分不良应答。
实施例6.临床前评价
动物功效研究:
两种性别的HBV转基因小鼠(HBV-Tg)将用于所提出的工作。首先对它们进行1/3部分肝切除术,以评估疫苗接种前肝脏中的病毒复制水平。
在HBV-Tg小鼠从肝切除术恢复后,他们将接种一次,并在三周后再次接种疫苗(加强免疫)。
疫苗由表达HBV抗原组合的慢病毒载体组成。
加强免疫后3周,对小鼠进行逆眼眶放血,并通过实时qPCR检测血液中HBV DNA的存在。
在免疫前和加强后3周收集的血清将测试HBV相关生物标志物,优选HBsAg,抗HBs和ALT的水平。
在观察期结束时,对小鼠实施安乐死,并通过Southern印迹杂交分析和定量支持HBV复制的肝内模板。
还将评估整合的HBV DNA的存在。肝脏将被针对HBV相关的生物标志物,优选HBsAg,抗HBs和ALT染色。
将在测试组和对照组中比较疫苗接种之前和之后的结果。
作为这些研究的对照,也将使用非转基因同窝小鼠。另外两组小鼠将如上所述接种疫苗,但也将在初次免疫时腹膜内注射抗PD-1并且在加强时再次注射抗PD-1。
使用大鼠的最大可注射体积,左后肢肌肉200μl加右后肢肌肉200μl,通过肌内注射进行毒性研究。因此,将使用临床选择的途径评估最大可行剂量的毒性。使用相同总体积(400μl)的静脉内注射(在尾静脉中缓慢输注)将在其他动物中进行以评估全身暴露。对应于该体积的剂量尚不清楚,因批次的效价(以TU mL-1表示)在批次间变化。如果发生重大不良事件,将评估第二低的剂量。该较低剂量将是MAD的1/5与以下一致:i.收集的有关治疗性HIV疫苗和其他临床前开发计划的临床前数据;ii.用于载体滴定和注射过程期间方法的灵敏度。遵循指南建议(“世界卫生组织疫苗非临床评估指南”),将由10名雄性和10名雌性加上对照组(对照组确定为载体的最终组成)构成组,除了局部耐受性研究期间计划5个动物/性别/群体。将在不评估局部耐受性的情况下评估IV注射后的毒性。
肌内(临床途径),计划两个处死日期:在第4天进行中期处死以评估局部耐受性(在注射部位)以及在第15天和第47天进行终末处死,用ELISPOT评估HBV-3注射后的免疫原性。静脉注射的动物仅在第15天处死,不进行ELISPOT。
通过监测死亡率,临床体征和体重(每天一次),食物消耗(每周一次),体温(注射前,注射后6小时,然后每天一次,直到第5天,然后每2天一次),肝酶(ASAT,ALAT,第2天)来进行毒性评估。在终末处死后进行肝脏的显微镜检查。
已经设计了研究以评估注射的慢病毒载体的整合载体序列的生物分布,脱落和持久性。
使用临床选择的途径,即肌内注射,在Sprague-Dawley大鼠中以最大可达到剂量注射每种慢病毒疫苗。在第3天,第21天,第33天和第56天将进行5名雄性+5名雌性处死;与先前收集的THV01治疗性HIV疫苗和申请人开发的其他慢病毒载体的数据一致。实际上,对THV01疫苗进行了类似的研究,这些疫苗是具有相似载体设计但编码不同抗原的治疗性HIV疫苗。在第4天和第21天仅在注射部位,引流淋巴结和脾脏中检测到显著的阳性信号。在第33和56天发现残留测试项靶序列,但结果与对照没有显著差异。
将在注射前一天和注射后3天收集血液,尿液和粪便,以评估载体在几个晚期时间点的脱落情况。这将在这些样品上进行RNA提取后进行。
上述生物分布研究将能够获得有关整合载体生物分布的数据。
HBV-3慢病毒载体诱导的生物应答将通过ELISPOT IFN-γ测定法定量产生的T细胞介导的免疫应答来测量。实际上,这些疫苗的预期功效依赖于诱导强烈,多样且持久的T细胞免疫应答。因此,不是产生“支持潜在临床效果的非临床证据”,而是评估“相关的生物学效应”。
针对HBV-3载体的体液应答主要由针对用于载体假型化的VSV包膜蛋白产生的抗体组成。因此,这种体液应答被认为是“不需要的免疫原性”。
通过进行ELISPOT评估细胞免疫应答,所述ELISPOT将通过IFN-γ分泌测量特异性效应T淋巴细胞的数量。将慢病毒载体注射到动物中,然后分离它们的脾细胞,并针对代表上述表位的一组HBV肽评估免疫应答。这些研究将能够评估有效剂量。
最后,通过定量CD4+T细胞和CD8+T细胞应答来进行免疫应答的表征。
预先存在的免疫力和对VSV-G蛋白的免疫应答的诱导可导致疫苗接种的功效降低。实际上,如果宿主的抗体与HBV-3载体颗粒结合,则这些颗粒将转导较少的DC,这可能导致诱导较低量级的免疫应答。
为了评估这种风险,已经或将要评估每种疫苗接种后预先存在的抗VSV-G抗体的存在和这些抗体的诱导:
已经使用人血清和内部开发的ELISA评估了抗VSV-G抗体的流行率。简而言之,由VSV-G血清型假型化但编码荧光素酶的载体在几个稀释度下与约100个人血清一起孵育。加入荧光素后,通过FACS定量转导细胞的百分比:百分比越高,中和活性越低。这种中和活性被认为是由于针对特异性包膜血清型的抗体;因此,对流行率进行间接评估。结果显示,可忽略不计的患者百分比显示预先存在的抗VSV-G抗体。如果在VSV感染率高于欧洲的地区进行试验,这种评估可能与临床相关。
将对从注射了临床前批次载体的大鼠取得的血液样品进行ELISA,并评估对每种血清型特异性的体液应答。
在急性毒性研究期间,通过注射部位的宏观和事后显微镜观察评估局部耐受性。
HBV-3处理的预期效果是诱导细胞免疫应答。这将导致感染细胞以及用HBV-3载体转导的细胞从宿主消除。
由于载体将肌内注射而非全身注射,因此种系传播的风险降低。
将在慢性感染患者中进行I/II期研究。
除了主要终点之外,将通过细胞因子和整联蛋白定量监测细胞免疫应答来研究候选疫苗引发的细胞免疫应答。
Claims (15)
1.一种慢病毒载体,所述载体编码:
-基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位。
2.如权利要求1所述的慢病毒载体,其中所述慢病毒载体至少编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的慢病毒载体,其中所述载体至少编码SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的慢病毒载体,其中所述慢病毒载体至少编码SEQ IDNO:25的氨基酸序列和至少编码SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的慢病毒载体,其中所述慢病毒载体包含β2-微球蛋白启动子。
6.如权利要求1-5中任一项所述的慢病毒载体,其中所述慢病毒载体是DNA。
7.一种慢病毒载体颗粒,所述慢病毒载体颗粒编码:
-基因型A和/或C抗原的至少一种乙肝病毒(HBV)包膜表面,
-基因型A和/或C抗原的至少一种聚合酶,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBX蛋白,
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心,和
-基因型A和/或C抗原的至少一种HBV共有核心MHCI和MHCII表位。
8.如权利要求7所述的慢病毒载体颗粒,其中所述载体至少编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
9.如权利要求7或8所述的慢病毒载体颗粒,其中所述载体至少编码SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
10.如权利要求7-9中任一项所述的慢病毒载体颗粒,其中所述载体至少编码SEQ IDNO:24的氨基酸序列和至少编码SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
11.如权利要求7-10中任一项所述的慢病毒载体颗粒,其中所述慢病毒载体颗粒包含功能性慢病毒整合酶蛋白。
12.如权利要求7-11中任一项所述的慢病毒载体颗粒,其中所述慢病毒载体颗粒包含水泡性口炎病毒糖蛋白。
13.如权利要求7-12中任一项所述的慢病毒载体颗粒,其中所述慢病毒载体颗粒包含HIV-1D亚型Gag和Pol蛋白。
14.一种分离的细胞,所述细胞包含如权利要求1-6中任一项所述的慢病毒载体或如权利要求7-13中任一项所述的慢病毒载体颗粒。
15.如权利要求1-6中任一项所述的慢病毒载体,所述慢病毒载体用作药物或疫苗。
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