ES2914238T3 - Vectores lentivirales para la expresión de antígenos del virus de la hepatitis B (HBV) - Google Patents

Vectores lentivirales para la expresión de antígenos del virus de la hepatitis B (HBV) Download PDF

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Abstract

Un vector lentiviral que codifica: - al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y - al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, en donde el vector lentiviral codifica al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24 y al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores lentivirales para la expresión de antígenos del virus de la hepatitis B (HBV)
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se encuentra dentro del campo de la tecnología de vacunas recombinantes y se refiere a mejoras de vectores lentivirales, que se pueden usar como vacunas profilácticas y terapéuticas. Los vectores proporcionan una inducción mejorada de respuestas inmunitarias sobre otros vectores.
ANTECEDENTES
Las vacunas recombinantes se han desarrollado con el progreso de la tecnología de ADN recombinante, que permite la modificación de genomas virales para producir virus modificados. De este modo, ha sido posible introducir secuencias genéticas en virus no patógenos, de modo que codifiquen proteínas inmunogénicas para que se expresen en células diana tras la infección o transducción, a fin de desarrollar una respuesta inmunitaria específica en su anfitrión.
Estas vacunas constituyen un avance importante en la tecnología de las vacunas (Kutzler y cols., Nat Rev Genet, 9(10): 776-788, 2008). En particular, tienen la ventaja sobre las vacunas tradicionales de evitar el virus vivo (atenuado) y eliminar riesgos asociados con la fabricación de vacunas inactivadas.
El aporte génico usando retrovirus modificados (vectores retrovirales) fue introducido en los primeros 1980 por Mann y cols. (Cell, 33(1): 153-9, 1983). Los vectores retrovirales oncogénicos más comúnmente usados se basan en el virus de leucemia murina (MLV) de Moloney. Tienen un genoma simple a partir del cual se producen las poliproteínas Gag, Pol y Env y se requieren en trans para la replicación viral (Breckpot y cols., 2007, Gene Ther, 14(11 ):847-62; He y cols. 2007, Expert Rev vaccines, 6(6):913-24). Las secuencias generalmente requeridas en cis son las repeticiones terminales largas (LTRs) y su proximidad: las repeticiones invertidas (IR o sitios att) requeridas para la integración, la secuencia de empaquetamiento V, el sitio de unión a ARN de transporte (sitio de unión al cebador, PBS) y algunas secuencias adicionales implicadas en la transcripción inversa (la repetición R dentro de las LTRs, y los tramos de polipurina, PPT, necesarios para la iniciación de la hebra más). Para generar vectores retrovirales con replicación defectuosa, los genes gag, pol y env generalmente se eliminan totalmente y se reemplazan por un casete de expresión.
Vectores retrovirales que derivan de genomas de lentivirus (es decir, vectores lentivirales) han emergido como herramientas prometedoras con fines tanto de terapia génica como de inmunoterapia, debido a que exhiben varias ventajas sobre otros sistemas virales. En particular, los propios vectores lentivirales son atóxicos y, a diferencia de otros retrovirus, los lentivirus son capaces de transducir células que no se dividen, en particular células dendríticas (He y cols. 2007, Expert Rev vaccines, 6(6):913-24), permitiendo la presentación de antígenos a través de la ruta endógena.
Los lentivirus están conectados por similitudes en la composición genética, los mecanismos moleculares de replicación y las interacciones biológicas con sus anfitriones. Son mejor conocidos como agentes de síndromes de liberación lenta que comienzan gradualmente después de períodos prolongados de infección subclínica y progresan lentamente; así, se denominan los virus "lentos" (Narayan y cols., 1989, J Gen Virol, 70(7):1617-39). Tienen la misma organización básica que todos los retrovirus pero son más complejos debido a la presencia de genes accesorios (p. ej., vif, vpr, vpu, nef, tat y rev), que representan papeles clave en la replicación lentiviral in vivo.
Los lentivirus representan un género de virus lentos de la familia Retroviridae, que incluye los virus de inmunodeficiencia humana (HIV), el virus de inmunodeficiencia símica (SIV), el virus de la encefalitis infecciosa equina (EIAV), el virus de la encefalitis artrítica caprina (CAEV), el virus de inmunodeficiencia bovina (BIV) y el virus de inmunodeficiencia felina (FIV). Los lentivirus pueden persistir indefinidamente en sus anfitriones y replicarse continuamente a velocidades variables durante el curso de la infección de por vida. La replicación persistente de los virus en sus anfitriones depende de su capacidad para evitar las defensas del anfitrión.
Vectores de lentivirus recombinantes se describen en la técnica en Jamiluddin y cols. (International Journal of Medical and Health Sciences, Vol. 2, N°: 9, sept 2015 - "Lentiviral-Based Novel Bicistronic Therapeutic Vaccine against Chronic Hepatitis B Induces Robust Immune Response") y en el documento WO 2016/120492.
El diseño de vectores lentivirales integradores recombinantes se basa en la separación de las secuencias de acción cis y trans del lentivirus. La transducción eficaz en células que no se dividen requiere la presencia de dos secuencias de acción cis en el genoma lentiviral, el tramo de polipurina central (cPPT) y la secuencia de terminación central (CTS). Estos conducen a la formación de una estructura de ADN tricatenario llamada la "aleta" de ADN central, que maximiza la eficacia de la importación génica a los núcleos de células que no se dividen, incluyendo células dendríticas (DCs) (Zennou y cols., 2000, Cell, 101(2) 173-85; Arhel y cols., 2007, EMBO J, 26(12):3025-37).
Las células dendríticas son de principal importancia para la presentación de antígenos debido a que constituyen la clase principal de células presentadoras de antígenos (APCs) cuya principal función es presentar antígenos e iniciar una respuesta inmunitaria.
Para generar una respuesta inmunitaria, proteínas antigénicas deben ser procesadas por células en péptidos que son exhibidos sobre la superficie celular por proteínas del complejo principal de histocompatibilidad (MHCs). Las APCs en circulación presentan los complejos péptido-MHC a células T en los nódulos linfáticos drenantes, donde interactúan con receptores de células T y, junto con señales coestimulantes, activan las células T.
Una variedad de estudios ha mostrado que la inoculación con vectores lentivirales conduce a la presentación de antígenos por DCs y una fuerte activación de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno (CTLs; células T CD8+). Por lo tanto, se han manipulado vectores lentivirales durante los 10 últimos años para aplicaciones de transferencia génica e inmunoterapia.
Los vectores contienen normalmente promotores constitutivos fuertes que contienen potenciadores, tales como el promotor de CMV. Michelini y cols., Vaccine 27(34):4622-29 (2009); Karwacz y cols., J. Virol. 83(7):30943103 (2009); Negri y cols., Molecular Therapy 15(9):1716-23 (2007); y Buffa y cols., J. General Virology 87:1625-1634 (2006).
La seguridad de los vectores lentivirales se ha mejorado mediante la retirada de la secuencia U3 de LTR, dando como resultado vectores "autoinactivadores" que carecen totalmente de secuencias promotoras y potenciadoras virales originalmente presentes dentro de las LTRs.
Las partículas lentivirales, que contienen vectores lentivirales, se pueden producir mediante tecnología recombinante tras la transfección transitoria de células, por ejemplo células cultivadas humanas HEK 293T, mediante diferentes plásmidos de ADN:
(i) un plásmido de empaquetamiento, que expresa al menos las proteínas Gag, Pol Rev, Tat y, en algunos casos, proteínas estructurales y enzimáticas necesarias para el empaquetamiento de la construcción de transferencia;
(ii) un plásmido de transferencia proviral, que contiene un casete de expresión y factores de acción cis de VIH necesarios para el empaquetamiento, la transcripción inversa y la integración; y
(iii) un plásmido codificante de la envuelta, en la mayoría de los casos la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV.G), una proteína que permite la formación de partículas mixtas (seudotipos) que se pueden dirigir a una amplia variedad de células, especialmente células presentadoras de antígenos (APCs) de histocompatibilidad principal (MHC), incluyendo DCs.
Este procedimiento permite obtener la producción transitoria de vectores de partículas lentivirales por las células transfectadas. Sin embargo, los vectores de partículas lentivirales también pueden ser producidos continuamente por células al insertar establemente los genes de empaquetamiento, el ADN codificante proviral y el gen de envuelta en el genoma celular. Esto permite la producción continua de vectores de partículas lentivirales por las células sin la necesidad de transfección transitoria. Por supuesto, se puede usar una combinación de estos procedimientos, con algunos de los ADNs/plásmidos integrados en el genoma celular y otros proporcionados mediante transfección transitoria.
Se han diseñado vectores lentivirales no integradores para mitigar los riesgos de oncogénesis potencial relacionados con episodios de mutagénesis por inserción, particularmente con fines de vacunación. Ejemplos de vectores lentivirales no integradores se proporcionan en Coutant y cols., PLOS ONE 7(11):e48644 (2102), Karwacz y cols., J. Virol. 83(7):3094-3103 (2009), Negri y cols., Molecular Therapy 15(9):1716-1723 (2007); Hu y cols., Vaccine 28:6675-6683 (2010). Por consiguiente, se ha presentado que un sistema de vectores lentivirales no integrador puede mitigar el riesgo potencial de mutagénesis por inserción en comparación con un sistema integrador. Hu y cols., Vaccine 28:6675-6683 (2010). Se ha presentado además que en algún análisis funcional, tanto la magnitud como la calidad de las respuestas inmunitarias provocadas por vectores lentivirales de integración defectuosa (IDLVs) dirigidos por DC son comparables a las de su homólogo integrador. Id. Así, los vectores lentivirales de integración defectuosa (IDLVs) se han considerado vectores más seguros que los vectores integradores para la administración a seres humanos, con eficacia comparable.
Además, la eliminación en la región U3 de la LTR 3' de las secuencias promotoras y potenciadoras virales en vectores lentivirales autoinactivadores limita la probabilidad de activación endógena del promotor. Estas preocupaciones con la seguridad se dirigen directamente a las experiencias obtenidas a partir del experimento de terapia con el gen SCID-X1 llevado a cabo en 1998-1999, realizado con vectores retrovirales basados en virus de Moloney sobre niños que sufrían una forma rara de enfermedad de inmunodeficiencia grave relacionada con el cromosoma X (gen SCID-X1) (Cavazzana-Calvo y cols., 2000, Science., 288(5466):669-72). Durante este experimento, cuatro de nueve niños desarrollaban leucemia como resultado de la integración del vector retroviral derivado de Moloney en estrecha proximidad con el protooncogén LM02 humano (Hacein-Bey-Abina y cols., 2008, J.Clin.Invest., 118(9):3132-3142). Se demostró que el tumor maligno era la consecuencia de la proximidad del promotor/potenciador de U3 viral al protooncogén LM02. Como resultado, la seguridad es una preocupación importante para la administración de lentivectores a seres humanos.
Los potenciadores son secuencias de acción cis, que pueden actuar como activadores de la transcripción a distancia. Se han empleado ampliamente en vectores derivados de virus debido a que parecen ser los más eficaces para obtener la expresión fuerte del transgén en una variedad de tipos de células, en particular DCs (Chinnasamy y cols., 2000, Hum Gene Ther 11(13):1901 -9; Rouas y cols., 2008, Cancer Gene Ther 9(9):715-24; Kimura y cols., 2007, Mol Ther 15(7): 1390-9; Gruh y cols., 2008, J Gene Med 10(1) 21-32). Sin embargo, dado el problema de seguridad de la mutagénesis por inserción, estas secuencias potenciadoras de la transcripción se deben eliminar de las construcciones de vectores lentivirales para suprimir el riesgo de mutagénesis de inserción por un efecto de proximidad del potenciador. Este efecto de proximidad del potenciador es con mucho el mecanismo más frecuente de mutagénesis por inserción y es el único efecto descrito en casos de seres humanos o animales de episodios tumorigénicos después de la transferencia génica.
Así, existe una necesidad de desarrollar vectores retrovirales, particularmente lentivirales, que no incluyan potenciadores virales, pero que sin embargo permitan una expresión suficiente de transgenes que codifican péptidos inmunogénicos, si es posible, tanta expresión como la observada cuando se usa el promotor de CMV.
Estudios recientes han presentado la sustitución de promotores virales por promotores específicos de DC que se derivan de genes del complejo principal de histocompatibilidad clase II (MHC clase II) (Kimura y cols., 2007, Mol Ther 15(7):1390-9) y genes de dectina-2 (Lopes y cols., 2008, J Virol 82(1):86-95). El promotor del gen de dectina-2 usado en Lopes y cois. contiene un potenciador putativo y una secuencia conservada adenoviral (repeticiones terminales invertidas en promotor de adenovirus) (Bonkabara y cols., 2001, J. Immunology, 167:6893-6900). El promotor del gen del MHC clase II usado por Kimura y cols. no contiene ningún potenciador conocido.
No obstante, sin un potenciador, se encontró que el promotor del MHC clase II no proporcionaba suficiente expresión transgénica en DCs, cuando se administraba intravenosamente. En particular, los vectores lentivirales que incluyen promotores del MHC clase II no provocaban una reacción inmunitaria en ratones C57BL/6 inmunocompetentes, en contraste con las respuestas inmunitarias observadas con promotores/potenciadores de CMV. Aunque se observaron integración y expresión transgénica persistente después de inyección en ratones, los vectores lentivirales transcritos a través de promotores del MHC clase II no estimulaban una respuesta de linfocitos T citotóxicos CD8+ específicos de antígeno, incluso después de una revacunación. Por lo tanto, los autores de estos estudios concluyeron que el uso de promotores del MHC clase II era de interés solamente para aplicaciones en las que se buscara la persistencia de la expresión como en la genoterapia restitutiva, pero no en el contexto de la inmunoterapia. Cabe destacar que los promotores del MHC clase II se expresan escasamente en la mayoría de los tipos de células.
Así, el promotor del MHC clase II no es un promotor adecuado para vectores lentivirales para la inducción de una respuesta inmunitaria contra un antígeno a través de inyección IV. Por otra parte, el promotor de dectina-2 se expresa escasamente en la mayoría de los tipos de células y parece contener un potenciador. Así, el promotor de dectina-2 no es un buen promotor para vectores lentivirales por razones de seguridad.
Preferiblemente, en inmunoterapia, los vectores lentivirales proporcionan una expresión eficaz del transgén que provoca una respuesta inmunitaria específica deseada. Esto requiere que la expresión sea a un alto nivel en APCs, tales como células dendríticas.
También es preferible que las células transducidas por los vectores lentivirales sean eliminadas por la respuesta inmunitaria para proporcionar un grado de seguridad superior. Esto es, la respuesta inmunitaria generada contra el transgén puede provocar una respuesta inmunitaria en el anfitrión suficiente para eliminar las células que son transducidas por los vectores lentivirales. La eliminación de células transducidas elimina la persistencia del vector lentiviral en el anfitrión, y posibles efectos secundarios del vector. A fin de que las células transducidas sean eliminadas, se requiere expresión en células no dendríticas a un nivel que permita la eliminación por la respuesta inmunitaria. Así, es deseable la expresión apropiada de un antígeno.
Al mismo tiempo, el promotor debe maximizar la estimulación inmunitaria a través de las células clave (es decir, células dendríticas) implicadas en la activación de células T vírgenes y de memoria, y debe minimizar el riesgo de mutagénesis por inserción y genotoxicidad en células madre, que conducen a tumores malignos. Así, el promotor debe tener una actividad suficientemente alta en células dendríticas y otras, pero no contener un potenciador. Basándose en estos criterios, los promotores virales, tales como el promotor de CMV, no son ideales debido a la presencia de potenciadores fuertes. Estos criterios se resumen como sigue:
1. alta expresión en células presentadoras de antígenos, incluyendo células dendríticas, para inducir respuestas inmunitarias máximas;
2. expresión en otros tipos de células transducidas suficiente para la eliminación por la respuesta inmunitaria inducida; y
3. falta de un elemento potenciador para evitar efectos de inserción.
La hepatitis B es una enfermedad infecciosa viral grave y común del hígado, más de 2.000 millones de personas actualmente han sido infectadas con VHB en algún momento en sus vidas. 350 millones de personas siguen infectadas y tres cuartas partes de la población mundial vive en zonas en las que hay altos niveles de infección (Fatusi y cols., East African Medical Journal 2000; 77 (11): 608-612).
Las graves consecuencias patológicas de infecciones persistentes por HBV incluyen el desarrollo de cirrosis por insuficiencia hepática crónica y carcinoma hepatocelular (HCC). Los portadores de HBV pueden transmitir la enfermedad durante muchos años. La HBV crónica (CHB) se ha asociado con un incremento de 100 veces en el riesgo de desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC) (Beasley y cols., Lancet. 1981; 2:1129-1133). Se estima que 15-40% de pacientes con CHB desarrolla cirrosis o HCC en sus vidas, contribuyendo a más de 1 millón de muertes cada año (Mast y cols., Vaccine, vol. 17, n° 13-14, pp. 1730-1733, 1999; McQuillan y cols., American Journal of Public Health, vol. 89, n° 1, pp. 14-18, 1999.). Aunque ha estado disponible una vacuna profiláctica eficaz durante más de tres décadas, la HBV sigue estando entre las 10 causas principales de muerte en todo el mundo. Los tratamientos actuales aprobados por la FDA tienen una eficacia limitada (Foundation HB. Approved drugs for Adults. (In). Hepatitis B Foundation: Doylestown, PA, EE. UU. de A., 2012).
Para tratar la enfermedad HBV crónica, están en uso compuestos antivirales que se dirigen a HBV polimerasa (Scaglione y cols., Gastroenterology 2012; 142: 1360-1368; de Clercq y cols., Viruses 2010; 2: 1279-1305).
La debilidad de la terapia es que los pacientes rara vez establecen control inmunológico sobre HBV, la respuesta raramente es duradera, los pacientes pueden experimentar recaída de la enfermedad después de años de tratamiento, los niveles de replicación de HBV rebotan hasta niveles de pretratamiento una vez que el tratamiento se detiene, de forma más importante, el fracaso del tratamiento es común en los pacientes. Los efectos tóxicos de tratamientos a largo plazo potencian el riesgo de seleccionar cepas de HBV resistentes a fármacos y a menudo son económicamente inasequibles (de Clercq y cols., Viruses 2010; 2: 1279-1305; Tong S, y cols., Emerg Microbes Infect 2013; 2: e10).
La vacuna profiláctica actual para HBV, que se dirige al HBsAg del virus, es eficaz para inducir anticuerpos protectores después de tres programas de vacunación. Todavía hay 370 millones de personas que están infectados crónicamente y tienen necesidad de terapias eficaces. Las vacunas profilácticas son ineficaces en portadores de HBV ya infectados o pacientes con hepatitis. Las vacunas profilácticas muestran una disminución de la eficacia terapéutica, debido a una respuesta exhaustiva de células T contra HBsAg y HBs Ab no pueden eliminar HBV de hepatocitos intracelulares (Shen y cols., Vaccine 2010; 28: 7288-7296; Chen y cols., Clin Vaccine Immunol 2011; 18: 1789-1795). Algunos de los principales retos que afrontan los candidatos a vacunas actuales son la incapacidad de inducir inmunidad tanto humoral como CMI a múltiples dianas antigénicas y la inducción de respuestas inmunitarias potentes contra los principales genotipos de HBV.
La inmunoterapia con IFN-a PEGilado conduce a reacciones adversas significativas y baja tolerabilidad (Lok y cols., Hepatology 45: 507-539). Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos enfoques terapéuticos para combatir al HBV.
La vacunación terapéutica presenta una estrategia prometedora en un enfoque hacia la erradicación de HBV. Durante los últimos años, se han desarrollado e investigado diferentes vacunas terapéuticas en pacientes con diferentes resultados clínicos (Kapoor y cols., Future Virol. 2014;9(6):565-585). Se están desarrollando vacunas basadas en proteínas de HBV recombinantes, partículas subvirales de la envuelta de HBV, ADN viral y plasmídico (id.). La vacunación terapéutica usada concomitantemente con antígenos antivirales para inducir restauración de células T con supresión de la replicación viral y carga antigénica podría proporcionar una mejora en la eficacia de la vacuna (id.).
Se podría conseguir una respuesta inmunitaria anti-HBV multiespecífica eficaz inducida para resolver la infección crónica por HBV mediante vacunación terapéutica. Si es eficaz, puede evitar una terapia a largo plazo y un posible fracaso del tratamiento debido a resistencia antiviral o efectos secundarios. Las inmunoterapias destinadas a desencadenar respuestas inmunitarias bien inespecíficas o bien específicas de HBV podrían limitar la carga viral después de un tratamiento parcial apropiado (Protzer y cols., Nat Revlmmunol 2012;12(marzo (3)):201 -13). Un apoyo de la eficacia de las células T se ha alcanzado a partir de la observación clínica de que la infección crónica por h Bv se puede resolver en pacientes trasplantados de médula ósea que reciban médula ósea de un donante inmune a HBV (Ilan y cols., Gastroenterology 1993;104(June (6)):1818-21). Casi todos los candidatos actuales a vacuna que afrontan retos principales debido a su incapacidad para inducir inmunidad tanto humoral como celular a diversas diana antigénicas y la estimulación de respuestas inmunitarias potentes contra los principales genotipos de HBV. Podrían inducirse respuestas de células T mediante vacunación terapéutica, y estudios preclínicos en chimpancés mostraron un resultado prometedor (Schirmbeck y cols., Biol Chem 1999;380 (marzo (3)):285-91; Pancholi y cols., Hepatology 2001 ;33(Febrero (2)):448-54).
Los estudios clínicos con vacunas profilácticas, solas o en combinación con interferón-alfa y/o compuestos antivirales, no eran capaces de inducir una respuesta inmunitaria en la hepatitis B crónica (Heintges y cols., Dig Dis Sci 2001 ;46(Abril (4)):901 -6; Hilleman y cols. Vaccine. 2003;21 (Diciembre (32)):4626-49). Se razonaba que el fracaso se debía principalmente a que las vacunas con adyuvante de aluminio inducen una respuesta inmunitaria tipo Th2 pronunciada y no estimulan CTL.
La vacuna del epítopo del péptido HLA-A2 HBcAg 18-27, el lipopéptido Theradigm® y el epítopo de células T cooperadoras del toxoide del tétano universal provocaban una respuesta de CTL en voluntarios sanos, pero no tenían efecto terapéutico en pacientes con HBV crónicos (Vitiello y cols., J Clin Invest 1995;95(Enero (1)):341-9; Heathcote y cols., Hepatology 1999;30(Agosto (2)):531-6).
Los adyuvantes MPL, QS21 y una emulsión de aceite en agua con HBsAg inducían células T y anticuerpos específicos en voluntarios sanos (Vandepapeliere y cols., Vaccine 2008;26(Marzo (10)): 1375-86), pero en pacientes con HBV crónica positivos a HBeAg bajo tratamiento con lamivudina eran insatisfactorios para incrementar las velocidades de seroconversión de HBeAg (Xu y cols., PLoS One 2008;3(7):e2565). HBsAg complejado con anti-HBs también mostraba efectos solo menores en estudios clínicos (Id.).
Solamente se incluía un único antígeno de HBV en la vacuna en todos estos enfoques. Además, los antígenos en partículas (p. ej. partículas viroides) combinados con un adyuvante potente parecen más adecuados para inducir respuestas robustas de células T CD4+ y CD8+.
La incorporación de los dominios pre-S más inmunogénicos de las proteínas de envuelta de HBV M y L en formulaciones de vacuna así como la utilización de diferentes subtipos de HBsAg puede ser una elección para inducir respuestas más eficaces de células B y T (Milich y cols., Science 228: 1195-1199 (1985); Schirmbeck y cols., Eur J Immunol 33: 3342-3352 (2003); Schumann y cols., J Viral Hepat 14: 592-598 (2007)).
Se ha efectuado un desarrollo de la vacunación basada en proteínas al combinar HBsAg con HBcAg, ya que se sabe que el último tiene propiedades inmunogénicas excepcionales. HBcAg es capaz de aumentar la sensibilización de células T a través de la activación de células B permitiéndolas que actúen como células presentadoras de antígenos primarias eficaces (Milich y cols., Proc Natl Acad Sci USA 94: 14648-14653 (1997); Lazdina y cols., J Virol 75: 6367­ 6374 (2001)).
Por otra parte, puede desencadenar la señalización del receptor tipo Toll (TLR-) a través de ácidos nucleicos unidos a su región rica en arginina (Aguilar y cols., Immunol Cell Biol 82: 539-546 (2004); Storni y cols., J Immunol 172: 1777­ 1785 (2004)). Así, HBcAg está cualificado para la utilización como un adyuvante potente cuando esté destinado a generar células T específicas de HBV así como células T para antígeno heterólogo, p. ej. HCV o antígenos derivados de tumores (Chen y cols., J Immunol 186: 5107-5118 (2011)).
La reducción de la carga viral y antigénica antes de la vacunación usando compuestos antivirales ofrece una mejora potencial de la eficacia de la vacuna. La inhibición de la replicación viral a través de análogos nucleos(t)ídicos puede conducir a respuestas de células T CD4+ transitorias en pacientes con hepatitis B crónica (Boni y cols., J Clin Invest 102: 968-975 (1998) ).
Se ha obtenido una evidencia adicional de los efectos terapéuticos sostenidos del tratamiento antiviral y la vacunación combinados en el modelo de la marmota canadiense (Menne y cols., J Virol 76: 5305-5314 (2002); Roggendorf y cols., Pathol Biol (Paris) 58: 308-314 (2010)).
En lugar de la coadministración, es eficaz usar pretratamiento antiviral antes de la vacunación para reducir la carga antigénica que es una causa probable de la inducción de tolerancia (Horiike y cols., J Clin Virol 32: 156-161 (2005)).
En pacientes infectados con HBV crónicamente, tomados en conjunto, los enfoques de vacunación que combinan HBsAg y el HBcAg altamente inmunogénico son una estrategia prometedora para reducir la carga viral e inducir la seroconversión.
Se debe explotar el efecto sinérgico de HBsAg y HBcAg para estimular respuestas de células B y T específicas de HBV amplias y fuertes para recortar la carga antigénica y para romper inmunotolerancia existente en pacientes infectados con HBV crónicamente.
Se han intentado series de diferentes estrategias de vacunación terapéutica usando diferentes modelos en animales (es decir, ratones transgénicos para HBV, modelo del virus de la hepatitis de la marmota canadiense o chimpancés infectados con HBV crónicamente) (Kosinska y cols., Hepat Res Treat 2010: 817580 (2010)).
Varias de esas estrategias han alcanzado fases de desarrollo clínico con diferentes resultados (Beckebaum y cols., Rev Med Virol 12: 297-319 (2002); Akbar y cols., Antivir Ther 15: 887-895 (2010); Michel y cols., J Hepatol 54: 1286­ 1296 (2011)).
Preferiblemente, se generarían vacunas que tuvieran todas las características de las silvestres con la excepción de las propiedades patógenas. Rasgos importantes de los patógenos que pueden ser imitados por sistemas de aporte de vacunas son su tamaño, forma y organización superficial de la molécula. Además, se pueden añadir patrones moleculares relacionados con patógenos para estimular respuestas inmunitarias innatas que activan la inmunidad adaptativa (Bachmann y cols., Nat Rev Immunol 10: 787-796 (2010)).
Las vacunas basadas en epítopos representan un método dominante para estimular respuestas inmunitarias ampliamente dirigidas contra epítopos conservados procedentes de un número de antígenos sin la utilización de productos génicos intactos que pueden tener propiedades desconocidas o patógenas.
Estudios de numerosos laboratorios, incluyendo el propio, han mostrado que las vacunas que codifican epítopos de CTL mínimos pueden inducir simultáneamente respuestas contra múltiples epítopos. Hasta ahora, los candidatos a vacunas terapéuticas para HBV se han enfocado a la utilización de HBsAg y proteínas nucleares o sus partes (Bienzle y cols., Hepatology 38: 811-819 (2003) ; Jung y cols., Vaccine 20:3598-3612 (2002); Livingston y cols., J. Immunol.
162:3088-3095 (1999); Pol y cols., J. Hepatol. 34:917-921 (2001); Schneider y cols., J. Hepatol. 44(Supl. 2):S277 (2006)) .
Sin embargo, las respuestas inmunitarias celulares a estos antígenos probablemente son las más propensas a supresión, tolerancia u otras disfunciones, puesto que estas proteínas circulan en niveles muy altos en el anfitrión infectado (Kakimi y cols., J. Virol. 76:8609-8620 (2002); Reignat y cols., J. Exp. Med. 195:1089-1101 (2002)). La eficacia de los antígenos nucleares de HBV para provocar inmunidad celular fuerte en animales pequeños, NHPs y seres humanos, y el efecto terapéutico de los anticuerpos contra la envuelta de HBV sugieren que un enfoque de combinación tiene importancia (Kosinska AD y cols., J Virol 2012; 86: 9297-9310.Huang ZH y cols., World J Gastroenterol 2001; 102: 6. Livingston BD y cols., Hum Immunol 1999; 60: 1013-1017). Recientemente, se ha mostrado que una vacuna de proteína recombinante que utiliza un enfoque de combinación ha sido segura y anticuerpos que provocan inmunogenicidad para dianas antigénicas de la envuelta y el núcleo de HBV en un experimento en fase I/II en seres humanos (Cassidy A y cols., Expert Rev Vaccines. 2011; 10: 1709-1715).
Hasta ahora, el antígeno de polimerasa no se ha investigado tan exhaustivamente como candidato a vacuna terapéutica, aunque el sistema inmunitario pueda ser más propenso a responder a este antígeno, que se produce solamente en cantidades insignificantes en comparación con la producción de1HBsAg y el antígeno nuclear. De forma importante, las respuestas de CTL y cooperadores CD4+ específicas de polimerasa se pueden detectar fácilmente en pacientes que se recuperan de infección por HBV. Los pacientes crónicos tratados fármacos antivirales restauraban la polimerasa de HBV y las respuestas de células T específicas del núcleo durante el primer año de tratamiento, pero posteriormente las respuestas disminuían y, después de 3 años, no eran diferentes que en pacientes no tratados (Mizukoshi y cols., J. Immunol. 173:5863-5871 (2004)).
La proteína reguladora multifuncional, proteína X de HBV (HBx), puede participar en la patogénesis viral y la carcinogénesis (Su y cols., Proc Natl Acad Sci U S A 1997;94:8744-8749). HBx se expresaba mucho en tejidos con hepatitis y hepatoma, podría ser una diana para inmunoterapia para inducir respuestas de CTL específicas.
La significación de los anticuerpos para la curación de HBV es reforzada por la correlación de la disminución en la carga viral con presencia de anticuerpos anti-HBs y anti-HBe en pacientes infectados con HBV. La seroconversión que protege al 85% de los individuos inmunizados con la vacuna actual para HBV también es una indicación del papel de los anticuerpos en la protección contra HBV. Sin embargo, debido a su naturaleza intracelular, HBV puede progresar todavía hasta la enfermedad en presencia de anticuerpos de título alto y así la inmunidad celular probablemente sea crucial para depurar la infección.
La vacuna terapéutica, que induce respuestas inmunitarias celulares junto con respuestas significativas de células B implicadas en la protección, probablemente sería importante para tratar HBV en protocolos de tratamiento.
Así, existe una necesidad en la técnica de vectores y métodos mejorados para la inmunización de seres humanos. La presente invención cumple estas necesidades de la técnica.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
El texto se refiere a, pero no reivindica, moléculas de ácido nucleico y vectores que codifican:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y su utilización como un medicamento o una vacuna.
En particular, el presente texto describe, pero no reivindica, un vector lentiviral que codifica:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C. Según una primera realización, la invención reivindicada se refiere a un vector lentiviral que codifica:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, and
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, en donde el vector lentiviral codifica al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24 y al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
En una realización, el vector lentiviral de la invención comprende un promotor de microglobulina p2.
En una realización, el vector lentiviral de la invención comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota canadiense (WPRE).
En una realización, el vector lentiviral de la invención es un ADN.
El texto describe además, pero no reivindica, una partícula de vector lentiviral que codifica:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C. Según otro aspecto, la invención reivindicada se refiere a una partícula de vector lentiviral que codifica:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, en donde el vector codifica al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24 y al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
En una realización, la partícula de vector lentiviral comprende una proteína integrasa lentiviral funcional.
En una realización, la partícula de vector lentiviral comprende una glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular. En una realización, la partícula de vector lentiviral comprende proteínas Gag y Pol de HIV-1 subtipo D.
La invención también abarca una célula aislada que comprende el vector lentiviral de la invención o la partícula de vector lentiviral de la invención.
La invención abarca además un vector lentiviral según la invención para la utilización como un medicamento o una vacuna.
El texto también describe, pero no reivindica, una partícula de vector lentiviral según la invención para la utilización como un medicamento o una vacuna.
El texto también describe, pero no reivindica, la utilización de un vector lentiviral de la invención o de una partícula de vector lentiviral de la invención para inducir una respuesta inmunitaria en un ser humano, en particular mediante administración intramuscular.
El texto también describe, pero no reivindica, un método para inducir una respuesta inmunitaria en un ser humano que comprende administrar, preferiblemente intramuscularmente, un vector lentiviral de la invención o una partícula de vector lentiviral de la invención a un ser humano.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 representa una construcción HBV-3 de vacuna para HBV con vector lentiviral según la invención. Esta construcción comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24 (secuencia de superficie, Pol, HBX y epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de genotipo A y C de HBV) y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25 (secuencia de VLP quimérica con epítopos de células B superficiales de genotipo A y C).
La Figura 2 representa una respuesta de consenso inmunitaria acumulada y la diversidad de la respuesta de células T (secreción de IFN-y) en ratones C57BI/6j con el vector lentiviral HBV-3.
Se comparan diferentes dosis de vectores lentivirales inyectados (1.107 TU y 1.106 TU) así como diferentes estrategias de administración (sensibilización/refuerzo (P/B) o sensibilización (P)). De la parte inferior a la superior de cada barra: VLP, PolA, EnvA, Xa , PolC, EnvC, XC y núcleo. A y C son genotipos de HBV.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Los inventores han descubierto que la administración intramuscular a un animal de un vector lentiviral que codifica un antígeno da como resultado una respuesta inmunitaria elevada contra la proteína y puede conducir a la eliminación del vector integrado del animal. Así, la invención proporciona nuevos lentivectores que tienen respuestas inmunitarias elevadas y una seguridad incrementada para la administración a seres humanos.
La presente invención abarca vectores lentivirales que codifican:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C,
en donde el vector lentiviral codifica al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24 y al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
Los vectores lentivirales pueden permitir la inducción de una respuesta mediada por células y humoral fuerte, duradera y amplia. Los LVs pueden incorporar casetes multiantigénicos que permitan el desarrollo de vacunas multivalentes en una sola dosis. Las epidemias filovirales se producen inesperadamente y se extienden rápidamente. Así, bajo estos escenarios, se pueden requerir regímenes de vacunación cortos. Debido a los elevados niveles de expresión de las inserciones y el tropismo para células dendríticas, las vacunas con vector lentiviral de THVs pueden provocar respuestas inmunitarias fuertes en un período corto. A la inversa, la inmunidad protectora a largo plazo probablemente implicará un régimen de sensibilización-refuerzo consistente en dos o más inyecciones que pueden inducir memoria de células T duradera.
PROTEÍNAS
Se describen pero no se reivindican en el presente texto construcciones de vector lentiviral que codifican proteínas que comprende al menos uno:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C.
El al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C se puede insertar en el al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, formando así una proteína quimérica. Más preferiblemente, dicha proteína quimérica comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25.
El antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C consiste en diferentes epítopos de MHCl y MHClI de HBV nuclear fusionados y/o ligados entre sí por secuencias de ligazón cortas, preferiblemente a través de una secuencia corta de dos aminoácidos GS, y preferiblemente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26:
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLGSALESPEHCSPHHTALRQAILGSELM
TLATWVGSSRDLWNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTP
PGSILSTLPETTWRRRDRGRSPRRRT (SEQ ID NO : 26).
El al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, el al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C y el al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C pueden estar comprendidos en o formar la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24.
El al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C puede ser al menos una polimerasa del genotipo A y al menos una polimerasa del genotipo C.
El al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C puede ser al menos una proteína HBX del genotipo A y al menos una proteína HBX del genotipo C.
El al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C puede ser al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo A y al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo C.
En una realización:
- el al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C puede ser al menos una polimerasa del genotipo A y al menos una polimerasa del genotipo C;
- el al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C puede ser al menos una proteína HBX del genotipo A y al menos una proteína HBX del genotipo C; y
- el al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C puede ser al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo A y al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo C.
Secuencia de superficie, Pol, HBX y epítopos de MHC I y MHClI nucleares de genotipo A y C de HBV:
MWPAANQVGVGAFGPGLGSMQWNSTAFHQALQDPRVRGLGSSISARTGDPVGS VLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICP GYRWMCLRRFGSIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLGSCTTPAQGNSMFPSCCCTKPT DGNGSIPSSWAFAGSRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSI VSPFIPLLPIFFCLWVYIGSNVSIPWTHKVGNFTGLYSSTVPIGSVGPLTVNEKRRLKL IGSRHYLHTLWKAGILYKGSTPARVTGGVFGSESRLWDFSQFSRGITRVSWPKFA VPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHIPLHPAAMPHLLIGSSGLSRYVARLGSLHL YSHPIVLGFRKIGSSAICSWRRAFPHCLAFSYMDDVVLGAGSFLLSLGIHLGSKHCF RKLPVNRPIDWGSYPALMPLYACIQAKQAFTFSPTYKAFLSGSLCQVFADATPTGW GLGSKYTSFPWLLGCTANWILRGTSFVYVPGSSLYAVSPSVHLSLRGLPVGSVLHK RTLGLPAMSTTDLGSCVFKDWEELGEEIRLKVLFVLGGCRHKLGSWPEANQVGAG AFGPGFGSMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGGSTSLNFLGGAPTCPG QGSCTIPAGGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCGSGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYN ILSPFLPLLPIFFCLWVYIGSNVSIPWTHKVGNFTGLYSSTVPVGSLHLYSHPIILGFRK IGSKQCFRKLPVNRPIDWGSKQAFTFSPTYKAFLCGSLCQVFADATPTGWGLGSAA NWILRGTSFVYVPGSVLHKRTLGLSAMSTTDLGSCLFKDWEELGEEIRLMIFVLGGC RHKLGSMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLGSALESPEHCSPHHTALRQAI LGSELMTLATWVGSSRDLWNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFG VWIRTPPGSILSTLPETTWRRRDRGRSPRRRT (SEQ ID NO:24).
Secuencia de VLP quimérica con epítopos de células B superficiales del genotipo A y C: MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQ AILCWGELMTLATWVGNNLEDGGGGSGGGGTPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDW DFNGSASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAG GSSSGTVNPAPNIASHISSISARTGDGSCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCT CIPIPSSWAFAKYLWEWASGSPFVQWFVGLAMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPA GGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDGSCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNC TCIPIPSSWAFARFLWEWASGSGGGGSGGGGSRDLWNYVNTNMGLKIRQLLWFH ISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTWRRRDRGRSPRRR TPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC (SEQ ID NO:25).
Las proteínas se pueden purificar.
La proteína purificada puede ser más de 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% pura. Una proteína purificada que es más de 50% (etc.) pura significa una muestra proteínica purificada que contiene menos de 50% (etc.) de otras proteínas. Por ejemplo, una muestra de una proteína recombinante purificada de una célula anfitriona puede ser 99% pura si contiene menos de 1% de proteínas de células anfitrionas contaminantes.
ÁCIDOS NUCLEICOS
También se describen pero no se reivindican ácido nucleicos que codifican:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C. El ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. El ácido nucleico puede ser una molécula de ARN o ADN. Dichos ácidos nucleicos pueden codificar una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los n° de SEQ ID detallados en la presente, bien solas o bien combinadas, tales como SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25. También se describe un ácido nucleico aislado insertado en un vector.
El ácido nucleico puede estar purificado. El ácido nucleico purificado puede ser más de 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% puro. Dentro del contexto de esta invención, un ácido nucleico que es más de 50% puro significa una muestra de ácido nucleico purificado que contiene menos de 50% de otros ácidos nucleicos. Por ejemplo, una muestra de un plásmido purificado de una bacteria anfitriona puede ser 99% pura si contiene menos de 1% de ADN bacteriano contaminante.
El al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C codificado por un ácido nucleico puede ser al menos una polimerasa del genotipo A y al menos una polimerasa del genotipo C.
El al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C codificado por un ácido nucleico puede ser al menos una proteína HBX del genotipo A y al menos una proteína HBX del genotipo C.
El al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C codificado por un ácido nucleico puede ser al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo A y al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo C.
En una realización:
- el al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C codificado por un ácido nucleico puede ser al menos una polimerasa del genotipo A y al menos una polimerasa del genotipo C;
- el al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C codificado por un ácido nucleico puede ser al menos una proteína HBX del genotipo A y al menos una proteína HBX del genotipo C; y
- el al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C codificado por un ácido nucleico puede ser al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo A y al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo C.
VECTORES
La invención abarca vectores lentivirales que codifican:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, en donde el vector lentiviral codifica al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24 y al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
Preferiblemente, el al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral según la invención es al menos una polimerasa del genotipo A y al menos una polimerasa del genotipo C.
Preferiblemente, el al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral según la invención es al menos una proteína HBX del genotipo A y al menos una proteína HBX del genotipo C. Preferiblemente, el al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral según la invención es al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo A y al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo C.
En una realización preferida:
- el al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral según la invención es al menos una polimerasa del genotipo A y al menos una polimerasa del genotipo C;
- el al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral según la invención es al menos una proteína HBX del genotipo A y al menos una proteína HBX del genotipo C; y - el al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral según la invención es al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo A y al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo C. Los vectores lentivirales de la invención comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de NO:24 y una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
El vector de la invención es un vector lentiviral.
Dentro del contexto de esta invención, un "vector lentiviral" significa un vector no replicativo para la transducción de una célula anfitriona con un transgén que comprende secuencias de ARN o ADN lentiviral de acción cis, y que requiere proteínas lentivirales (p. ej., Gag, Pol y/o Env) que se proporcionan en trans. El vector lentiviral carece de expresión de proteínas Gag, Pol y Env funcionales. El vector lentiviral puede estar presente en la forma de una molécula de ARN o ADN, dependiendo de la fase de producción o desarrollo de dichos vectores retrovirales.
El vector lentiviral puede estar en la forma de una molécula de ADN recombinante, tal como un plásmido. El vector lentiviral puede estar en la forma de una partícula de vector lentiviral, tal como una molécula o moléculas de ARN dentro de un complejo de proteínas lentivirales y otras. Típicamente, los vectores de partículas lentivirales, que corresponden a partículas de lentivirus modificadas o recombinantes, comprenden un genoma que está compuesto por dos copias de ARN monocatenario. Estas secuencias de ARN se pueden obtener mediante transcripción a partir de una secuencia de ADN bicatenario insertada en un genoma de célula anfitriona (ADN de vector proviral) o se pueden obtener a partir de la expresión transitoria de ADN plasmídico (ADN de vector plasmídico) en una célula anfitriona transformada.
Preferiblemente, las partículas de vector lentiviral de la invención tienen la capacidad de integración. Como tales, pueden contener una proteína integrasa funcional.
Las partículas de vector no integradoras tienen una o más mutaciones que eliminan la mayoría de o toda la capacidad de integración de las partículas de vector lentiviral. Por, ejemplo, una partícula de vector no integradora puede contener una mutación o mutaciones en la integrasa codificada por el gen pol lentiviral que provocan una reducción en la capacidad de integración. En contraste, una partícula de vector integradora comprende una proteína integrasa funcional que no contiene mutaciones que eliminen la mayoría o la totalidad de la capacidad de integración de las partículas de vector lentiviral.
Los vectores lentivirales derivan de lentivirus, en particular virus de inmunodeficiencia humana (HIV-1 o HIV-2), virus de inmunodeficiencia símica (SIV), virus de la encefalitis infecciosa equina (EIAV), virus de la encefalitis artrítica caprina (CAEV), virus de inmunodeficiencia bovina (BIV) y virus de inmunodeficiencia felina (FIV), que están modificados para retirar determinantes genéticos implicados en la patogenicidad e introducir nuevos determinantes útiles para obtener efectos terapéuticos.
Estos vectores se basan en la separación de las secuencias de acción cis y trans. A fin de generar vectores con replicación defectuosa, las secuencias de acción trans (p. ej., genes gag, pol, tat, rev y env) se pueden eliminar y reemplazar por un casete de expresión que codifica un transgén.
La integración y la replicación eficaces en células que no se dividen requiere generalmente la presencia de dos secuencias de acción cis en el centro del genoma lentiviral, el tramo de polipurina central (cPPT) y la secuencia de terminación central (CTS). Estos conducen a la formación de una estructura tricatenaria ADN llamada la "aleta" de ADN central, que actúa como una señal para la eliminación del revestimiento del complejo de preintegración en el poro nuclear y la importación eficaz del casete de expresión al núcleo de células que no se dividen, tales como células dendríticas.
En una realización, el vector lentiviral comprende un tramo de polipurina central y una secuencia de terminación central denominada secuencia cPPT/CTS que se describe, en particular, en la solicitud de patente europea EP 2169073.
Secuencias adicionales están presentes habitualmente en cis, tales como las repeticiones terminales largas (LTRs) que están implicadas en la integración de la secuencia de ADN proviral del vector en un genoma de célula anfitriona. Los vectores se pueden obtener al mutar las secuencias de LTR, a modo de ejemplo, en el dominio U3 de dicha LTR (AU3) (Miyoshi H y cols, 1998, J Virol. 72(10):8150-7; Zufferey y cols., 1998, J Virol 72(12):9873-80) como se muestra en la figura 1.
Preferiblemente, el vector no contiene un potenciador. En una realización, el vector lentiviral comprende
secuencias de LTR, preferiblemente con una región U3 mutada (AU3) que retiran secuencias promotoras y potenciadoras en la LTR 3'.
También se puede incorporar la secuencia de empaquetamiento ^ (psi) para ayudar en la encapsidación de la secuencia polinucleotídica en las partículas de vector (Kessler y cols., 2007, Leukemia, 21(9):1859-74; Paschen y cols., 2004, Cancer Immunol Immunother 12(6): 196-203).
En una realización, el vector lentiviral comprende una secuencia de empaquetamiento lentiviral ^ (psi).
También se pueden incluir ventajosamente en la secuencia polinucleotídica del vector lentiviral de la presente invención otras secuencias funcionales adicionales, tales como un sitio de unión a ARN de transporte o un sitio de unión a cebador (PBS) o un elemento regulador postranscripcional de marmota canadiense (WPRE), para obtener una expresión más estable del transgén in vivo.
En una realización, el vector lentiviral comprende un PBS. En una realización, el vector lentiviral comprende un WPRE y/o un IRES.
Así, en una realización preferida, el vector lentiviral comprende al menos una secuencia cPPT/CTS, una secuencia una (preferiblemente 2) secuencia LTR y un casete de expresión que incluye un transgén bajo el control de la transcripción de un promotor de p2m o m Hc clase I.
PROMOTOR
En diversas realizaciones, el promotor conduce una expresión elevada en células presentadoras de antígenos, incluyendo células dendríticas, para inducir respuestas inmunitarias máximas. Preferiblemente, el promotor conduce la expresión en otros tipos de células transducidas suficiente para la eliminación por la respuesta inmunitaria inducida. Lo más preferiblemente, el promotor carece de un elemento potenciador para evitar efectos de inserción.
Lo más preferiblemente, el promotor no es un promotor/potenciador de CMV. Preferiblemente, el promotor no es un promotor de dectina-2 o MHClI.
Las secuencias de diversos promotores de MHC clase I de mamífero (ser humano) se muestran a continuación: HLA-A2 (MHC I):
attggggagtcccagccttggggattccccaactccgcagtttcttttctccctctcccaac ctatgtagggtccttcttcctggatactcacgacgcggacccagttctcactcccattgggt gtcgggtttccagagaagccaatcagtgtcgtcgcggtcgcggttctaaagtccgcacgcac ccaccgggactcagattctccccagacgccgagg
(SEQ ID NO: 1)
HLA-B7 (MHC I):
ggggaggcgcagcgttggggattccccactcccctgagtttcacttcttctcccaacttgtg tcgggtccttcttccaggatactcgtgacgcgtccccacttcccactcccattgggtattgg atatctagagaagccaatcagcgtcgccgcggtcccagttctaaagtccccacgcacccacc cggactcagag (SEQ ID NO: 2)
HLA-Cw5 (MHC I):
cactggggaggcgccgcgttgaggattctccactcccctcagtttcacttcttctcccaacc tgcgtcgggtccttcttcctgaatactcatgacgcgtccccaattcccactcccattgggtg tcgggttctagagaagccaatcagcgtctccgcagtcccggtctaaagtccccagtcaccca cccggactcagattctccccagacgccgag
(SEQ ID NO: 3)
HLA-E (MHC I):
taagaactgctgattgctgggaaactctgcagtttcccgttcctctcgtaacctggtcatgt gtccttcttcctggatactcatgacgcagactcagttctcattcccaatgggtgtcgggttt ctagagaagccaatcagcgtcgccacgactcccgactataaagtccccatccggactcaaga agttctcaggactcagagg (SEQ ID NO: 4)
HLA-F (MHC I):
aggccccgaggcggtgtctggggttggaaggctcagtattgagaattccccatctccccaga
gtttctctttctctcccaacccgtgtcaggtccttcatcctggatactcataacgcggcccc
atttctcactcccattgggcgtcgcgtttctagagaagccaatcagtgtcgccgcagttccc
aggttctaaagtcccacgcaccccgcgggactcatatttttcccagacgcggaggttggggt
catg (SEQ ID NO: 5)
Una secuencia del promotor de microglobulina p2 humana se muestra a continuación:
Aacatcacgagactctaagaaaaggaaactgaaaacgggaaagtccctctctctaacctggc
actgcgtcgctggcttggagacaggtgacggtccctgcgggccttgtcctgattggctgggc
acgcgtttaatataagtggaggcgtcgcgctggcgggcattcctgaagctgacagcattcgg
gccgag (SEQ ID NO:6).
Los promotores de MHCl y p2m no contienen un potenciador. Por otra parte, estos promotores son específicos de células dendríticas (APCs) ya que la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es superior que la expresión en células de riñón, músculo liso, hígado y corazón. También tienen una expresión relativamente elevada en otros tipos de células transducidas, por ejemplo, la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es solo 12-100 veces la expresión de ese promotor en células de músculo esquelético, en contraste con 900 veces con el promotor de HLA-DRa de MHCII. Id.
En diversas realizaciones, el vector lentiviral comprende un promotor de p2m o MHC clase I. Preferiblemente, el promotor de MHC clase I es un promotor de HLA-A2, un promotor de HLA-B7, un promotor de HLA-Cw5, un promotor de HLA-F o uno de HLA-E. En diversas realizaciones, la secuencia promotora comprende una secuencia polinucleotídica que comparte más de 90%, preferiblemente más de 95%, más preferiblemente más de 99% de identidad con la secuencia promotora de SeQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6.
Un vector lentiviral según la invención puede abarcar además promotores específicos de células dendríticas. Un "promotor específico de células dendríticas" es uno en el que la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es superior que la expresión en células de riñón, músculo liso, hígado y corazón. Preferiblemente, la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es al menos 2 veces, 3 veces o 4 veces superior que la expresión en células de riñón, músculo liso, hígado y/o corazón. Que un promotor sea "(2 veces, 3 veces o 4 veces) superior que la expresión en células de riñón, músculo liso, hígado y/o corazón" se puede determinar mediante referencia a los conjuntos de datos de http://biogps.org, o mediante el uso de las sondas, los chips y los métodos de Affimetrix usados para generar estos conjuntos de datos (particularmente el conjunto HG-U133). Los promotores de p2m, HLA-A2, HLA-B7, HLA-Cw5, HLA-F y HLA-E son " promotores específicos de células dendríticas". El promotor de EF1a no lo es. Así, preferiblemente, el promotor no es un promotor de EF1a.
Preferiblemente, el promotor conduce la expresión en otros tipos de células transducidas, tales como células de riñón, músculo liso, hígado y/o corazón, y el músculo esquelético. Preferiblemente, la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es 12-100 veces la expresión de ese promotor en células del músculo esquelético. Que "la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ sea 12-100 veces la expresión de ese promotor en células de músculo esquelético" se puede determinar mediante referencia a los grupos de datos de http://biogps.org, o mediante la utilización de las sondas, chips y métodos de Affimetrix utilizados para generar estos conjuntos de datos (particularmente el conjunto HG-U133). Lo más preferiblemente, la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es 12-100 veces la expresión de ese promotor en células de músculo esquelético y la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es superior que la expresión en células de riñón, músculo liso, hígado y corazón. Los promotores de p2m, HLA-A2, HLA-B7, HLA-Cw5, HLA-F y HLA-E son promotores en los que la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es 12-100 veces la expresión de ese promotor en células de músculo esquelético. El promotor de HLA-A2 y el promotor de UBC no lo son. Así, preferiblemente, el promotor no es un promotor de HLA-A2 (MHCII) ni un promotor de UBC (ubiquitina).
En algunas realizaciones, la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es al menos 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 o 60 veces la expresión de ese promotor en células de músculo esquelético.
En una realización, las partículas de vector lentiviral comprenden un vector lentiviral que comprende un promotor específico de células dendríticas que dirige la expresión de al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV), antígeno de polimerasa, proteína HBX y núcleo de consenso de HBV de genotipos A y C, en donde las partículas de vector lentiviral exhiben una expresión superior del antígeno en células BDCM que en células T HEK 293.
En diversas realizaciones, el vector lentiviral que comprende el promotor induce una mayor respuesta de CTL in vivo contra el polipéptido inmunogénico codificado que un vector en el que la secuencia transgénica esté bajo el control transcripcional de un promotor de CMV. Dentro del contexto de esta invención, que un vector "induzca una mayor respuesta de CTL in vivo contra el polipéptido inmunogénico codificado que un vector en el que la secuencia transgénica esté bajo el control transcripcional de un promotor de CMV" se puede determinar usando el ensayo indicado en los ejemplos. También se pueden usar otros ensayos que proporcionen resultados similares.
En diversas realizaciones, el vector lentiviral que comprende el promotor induce una mayor respuesta de CTL in vivo contra el polipéptido inmunogénico codificado que un vector en el que la secuencia transgénica esté bajo el control transcripcional de un promotor de EF1a. Preferiblemente, la respuesta de CTL con el promotor es al menos 2 veces o 3 veces superior que con el promotor de EF1a. Dentro del contexto de esta invención, que un vector "induzca una mayor respuesta de CTL in vivo contra el polipéptido inmunogénico codificado que un vector en el que la secuencia transgénica esté bajo el control transcripcional de un promotor de EF1a" se puede determinar utilizando el ensayo indicado en los ejemplos. También se pueden usar otros ensayos que proporcionen resultados similares.
En diversas realizaciones, el vector lentiviral que comprende el promotor induce una mayor respuesta de CTL in vivo contra el polipéptido inmunogénico codificado que un vector en el que la secuencia transgénica esté bajo el control transcripcional de un promotor de ubiquitina. Dentro del contexto de esta invención, que un vector "induzca una mayor respuesta de CTL in vivo contra el polipéptido inmunogénico codificado que un vector en el que la secuencia transgénica esté bajo el control transcripcional de un promotor de ubiquitina" se puede determinar usando el ensayo indicado en los ejemplos. También se pueden usar otros ensayos que proporcionen resultados similares.
Los vectores lentivirales según la invención pueden contener además un promotor que no contenga un potenciador.
Un vector lentiviral según la invención se puede caracterizar por que comprende además la inserción de un promotor, promotor de MHC Clase I (MHCI) o promotor de microglobulina p2 (p2m). Según se usa en la presente, un "promotor de MHC Clase I (MHCl)" o "promotor de microglobulina p2" incluye un promotor de MHC Clase I o promotor de microglobulina p2 presente natural o sintético. El término "promotor de MHC Clase I" no incluye un promotor de p2m.
En una realización, las partículas de vector lentiviral que comprenden el promotor exhiben una expresión superior del antígeno en células BDCM que en células T HEK 293.
El promotor puede ser un promotor natural. Ejemplos de promotores naturales son los promotores de genes p2m, HLA-A2, HLA-B7, HLA-Cw5, HLA-E, HLA-F humanos. Estos promotores de MHCl naturales generalmente se clonan o se reproducen a partir de la región promotora de un gen que codifica la proteína del MHC clase I, o denominados putativamente codificantes de estas proteínas en bases de datos genómicas (ej: base de datos de polinucleótidos del NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/dna-rna). Las proteínas tanto de p2m como del MHC clase I se incluyen en el complejo principal de histocompatibilidad (MHC).
Las proteínas codificadas por estos genes se encuentran en casi todos los tipos de células. Las proteínas del MHCl están presentes generalmente en la superficie de la membrana de leucocitos, donde están asociadas con la microglobulina p2 (p2m). El papel de estas proteínas asociadas es presentar péptidos procedentes de fuentes endógenas a células T CD8+. Así, representan un papel principal en la generación de la respuesta inmunitaria específica para antígenos. Debido a que las proteínas del MHC clase I se han estudiado y descrito ampliamente durante muchos años, sus genes están bien caracterizados y son bien detectables utilizando herramientas comunes de comparación de secuencias, tales como el método BLAST (Altschul, S.F. y cols. (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215(3):403-410). Los promotores del MHC clase I comparten la capacidad para ser fuertemente activados en células presentadoras de antígenos, incluyendo células dendríticas, así como, en una menor intensidad, en la mayoría de los otros tejidos del cuerpo humano.
Los promotores pueden contener elementos reguladores adicionales, tales como uno o más sitios de unión a Sp1 y ETs. En una realización preferida, el promotor del MHC clase I contiene 2 sitios de unión a Sp1 y 1 sitio de unión a Ets. En otras realizaciones, adicionalmente están contenidos en el promotor sitios Ap1 y/o Ap2.
Promotores preferidos son promotores de p2m, HLA-A2, HLA-B7, HLA-Cw5, HLA-E y HLA-F humanos naturales.
Los promotores también pueden ser sintéticos. Promotores sintéticos incluyen promotores que se sintetizan usando técnicas biológicas moleculares para ensamblar los componentes individuales de un promotor o que se derivan de promotores naturales utilizando técnicas biológicas moleculares.
En diversas realizaciones, el promotor sintético comprende una secuencia polinucleotídica que comparte más de 90%, preferiblemente más de 95%, más preferiblemente más de 99% de identidad, o 100%, con la secuencia promotora de un promotor del gen de p2m o MHC clase I (p. ej., SEQ ID NOs: 1-6 y 19).
La transcripción de genes de clase MHC está mediada habitualmente por dos elementos reguladores principales: Elemento de respuesta estimulado por interferón (ISRE) y el módulo SXY (que abarca los elementos reguladores W/S, X1X2/S itio a e Y/potenciador B) (véase la figura 1). Véase además Van den Elsen, Immunogenetics (1998) 48:208-211.
Estos elementos promotores reguladores se localizan en una región que se extiende aproximadamente de los nucleótidos -220 a -95 aguas arriba el sitio de iniciación de la transcripción. Median en la transcripción específica de tejidos e inducida por citocinas de genes del MHC clase I.
El ISRE de promotores de genes del MHC clase I contiene generalmente sitios de unión para miembros de la familia de factores reguladores de interferón (IRF). Así, una propiedad de los promotores del MHC clase I es unirse a miembros de la familia de factores reguladores de interferón (IRF). Esto se puede verificar, por ejemplo, mediante ensayos de desplazamiento en gel.
Otro elemento regulador, el potenciador A (que contiene sitios de unión para factor de transcripción nuclear kB (NF-kB)) está presente en la mayoría de los casos. Así, una propiedad de los promotores del MHC clase I es unirse a factor de transcripción nuclear kB (NF-kB). Esto se puede verificar, por ejemplo, mediante ensayos de desplazamiento en gel.
Además del ISRE, los promotores del MHC clase I generalmente comparten otro conjunto de motivos de secuencia aguas arriba conservados, que consisten en tres elementos reguladores: la “caja” S o W, las “cajas” X1/CREX2 o el sitio a, y la “caja” Y o el potenciador B, que juntos se denominan el módulo SXY. Este módulo SXY generalmente está unido cooperativamente por un complejo multiproteínico que contiene el factor regulador X (RFX; que consiste en RFX5, RFXB/ANK y RFXAP), la proteína de unión al elemento de respuesta cAMP (CREB)/el factor de transcripción activador (ATF) y el factor nuclear Y (NFY), que actúa como un potenciosoma que conduce la transactivación de estos genes. Así, una propiedad de los promotores del MHC clase I es unirse a estos factores. Esto se puede verificar, por ejemplo, mediante ensayos de desplazamiento en gel.
En contraste, los promotores del MHC clase II no exhiben los elementos potenciador A ni ISRE (Van den Elsen, P.J. y cols, 1998, Immunogenetics. 48:208-221). Por otra parte, se ha encontrado que RFX y ClITA en la regulación de genes del MHC clase II son de importancia crucial según se ilustra por estudios con líneas celulares establecidas a partir de pacientes con el síndrome del linfocito desnudo (BLS), una inmunodeficiencia combinada grave debida a mutaciones en una de las subunidades RFX o CIITA (DeSandro, A. y cols., 1999, Am J Hum Genet, 65:279-286). Además, la falta bien de CIITA o bien de una de las subunidades RFX afecta al funcionamiento y el ensamblaje del potenciosoma del MHC, respectivamente, conduciendo a una falta de transcripción de MHC clase II y niveles reducidos de transcripción del MHC clase I (Van den Elsen, P.J. y cols. 2004, Current Opinion in Immunology, 16:67-75).
También se describe un método fuera de la invención reivindicada que comprende insertar un promotor de la invención, particularmente un promotor de p2m o MHC clase I, en un vector lentiviral para dirigir la expresión de un transgén, que preferiblemente codifica un polipéptido inmunogénico, lo más preferiblemente que codifica al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV), antígeno de polimerasa, proteína HBX y núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y C. El método puede comprender además insertar cualquiera de los otros elementos de ácido nucleico mencionados en la presente, tales como una secuencia de aleta de a Dn .
CÉLULAS AISLADAS
La invención abarca células aisladas que comprenden vectores o partículas de vector lentiviral que codifican:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, and
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C,
en donde el vector codifica al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24 y al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
En una realización, la célula contiene el vector integrado en el genoma celular.
En una realización, la célula contiene el vector que expresa transitoriamente el al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C y al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C.
En una realización, la célula produce partículas de vector lentiviral que codifican al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C y al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C.
En diversas realizaciones, la invención abarca una línea celular, una población de células o un cultivo celular que comprende vectores y partículas de vector lentiviral según la invención.
Preferiblemente, el al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral o una partícula de vector lentiviral según la invención es al menos una polimerasa del genotipo A y al menos una polimerasa del genotipo C.
Preferiblemente, el al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral o una partícula de vector lentiviral según la invención es al menos una proteína HBX del genotipo A y al menos una proteína HBX del genotipo C.
Preferiblemente, el al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral o una partícula de vector lentiviral según la invención es al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo A y al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo C.
En una realización preferida:
- el al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral o una partícula de vector lentiviral según la invención es al menos una polimerasa del genotipo A y al menos una polimerasa del genotipo C;
- el al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral o una partícula de vector lentiviral según la invención es al menos una proteína HBX del genotipo A y al menos una proteína HBX del genotipo C; y
- el al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C codificado por un vector lentiviral o una partícula de vector lentiviral según la invención es al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo A y al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo C.
PARTÍCULAS DE VECTOR LENTIVIRAL
El presente texto describe, pero no reivindica, un método para producir una partícula de vector lentiviral. Una partícula de vector lentiviral (o vector de partícula lentiviral) comprende un vector lentiviral en asociación con proteínas virales. El vector puede ser un vector integrador.
Las partículas de vector lentiviral pueden codificar:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C.
El al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C codificado por una partícula de vector lentiviral puede ser al menos una polimerasa del genotipo A y al menos una polimerasa del genotipo C.
El al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C codificado por una partícula de vector lentiviral puede ser al menos una proteína HBX del genotipo A y al menos una proteína HBX del genotipo C.
El al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C codificado por una partícula de vector lentiviral puede ser al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo A y al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo C.
En una realización:
- el al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C codificado por una partícula de vector lentiviral según la invención puede ser al menos una polimerasa del genotipo A y al menos una polimerasa del genotipo C; - el al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C codificado por una partícula de vector lentiviral según la invención puede ser al menos una proteína HBX del genotipo A y al menos una proteína HBX del genotipo C; y
- el al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C codificado por una partícula de vector lentiviral según la invención puede ser al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo A y al menos una superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) del genotipo C.
Las partículas de vector lentiviral del método pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los n° SEQ ID detallados en la presente, bien sola o bien combinada, tal como SEQ ID NO:24 y/o SEQ ID NO:25, y preferiblemente que codifica al menos SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 25. En una realización, la partícula de vector lentiviral comprende proteínas Gag y Pol de HIV-1. Preferiblemente, la partícula de vector lentiviral comprende el subtipo D, especialmente proteínas Gag y Pol de HIV-1ndk.
Según una realización de este método, las partículas de lentivector se obtienen en una célula anfitriona transformada con un plásmido de ADN.
Este plásmido de ADN puede comprender:
- origen de replicación bacteriano (ej: pUC ori);
- gen de resistencia a antibiótico (ej: KanR) para selección; y más particularmente:
- un vector lentiviral que comprende al menos un transgén ligado transcripcionalmente a un promotor del MHC clase I. Este método permite producir una partícula de vector recombinante según la invención, que comprende las siguientes etapas de:
i) transfectar una célula anfitriona adecuada con un vector lentiviral;
ii) transfectar dicha célula anfitriona con un vector plasmídico de empaquetamiento, que contiene secuencias de ADN viral que codifican al menos actividades estructurales y de polimerasa (integrasa ) de un retrovirus (preferiblemente lentivirus); Estos plásmidos de empaquetamiento se describen en la técnica (Dull y cols., 1998, J Virol, 72(11):8463-71; Zufferey y cols., 1998, J Virol 72(12):9873-80).
iii) cultivar dicha célula anfitriona transfectada a fin de obtener expresión y empaquetamiento de dicho vector lentiviral en partículas de vector lentiviral; y
iv) recoger las partículas de vector lentiviral resultantes de la expresión y el empaquetamiento de la etapa iii) en dichas células anfitrionas cultivadas.
Por diferentes razones, puede ser provechoso seudotipar las partículas retrovirales obtenidas, es decir añadir o reemplazar proteínas de la envuelta de partículas específicas. A modo de ejemplo, esto puede ser ventajoso para tener diferentes proteínas de la envuelta a fin de distinguir la partícula recombinante de partículas naturales u otras partículas recombinantes. En materia de estrategia de vacunación, es más probable que los vectores de partículas seudotipadas escapen del sistema inmunitario cuando este último ya haya desarrollado inmunidad contra lentivirus.
Esto es particularmente provechoso cuando se requieran inyecciones sucesivas de vectores de partículas similares para inmunizar a un paciente contra una enfermedad.
A fin de seudotipar las partículas retrovirales, la célula anfitriona se puede transfectar adicionalmente con uno o varios plásmidos de ADN de envuelta que codifiquen una proteína o proteínas de envuelta virales, preferiblemente una proteína de envuelta VSV-G.
Una célula anfitriona apropiada es preferiblemente una línea celular cultivada humana como, por ejemplo, una línea
celular HEK.
Alternativamente, el método para producir la partícula de vector se lleva a cabo en una célula anfitriona, cuyo genoma
ya se ha transformado establemente con uno o más de los siguientes componentes: una secuencia de ADN de vector lentiviral, los genes de empaquetamiento y el gen de envuelta. Esta secuencia de ADN se puede considerar similar a un vector proviral, comprendiendo un promotor adicional para permitir la transcripción de la secuencia del vector y mejorar la velocidad de producción de partículas.
En una realización, la célula anfitriona se puede modificar adicionalmente para que sea capaz de producir partícula
viral en un medio de cultivo de modo continuo, sin que todas las células se hinchen o mueran. Se puede hacer referencia a Strang y cols., 2005, J Virol 79(3):1165-71; Relander y cols., 2005, Mol Ther 11 (3):452-9; Stewart y cols.,
2009, Gene Ther, 16(6):805-14; y Stuart y cols., 2011, Hum gene Ther., con respecto a estas técnicas para producir partículas virales.
El presente texto describe, pero no reivindica, una célula anfitriona transformada con un vector de partícula lentiviral.
Los vectores de partículas lentivirales pueden comprender los siguientes elementos, según se define previamente:
- secuencia polinucleotídica de cPPT/CTS; y
- una secuencia de transgén bajo el control de un promotor de la invención, y opcionalmente uno de los elementos adicionales descritos anteriormente.
Preferiblemente, las partículas de lentivector están en una dosis de 106, 2 x
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5x 106, 107, 2 x 107 , x 108, 5 x 108 o 109 TU.
MÉTODOS PARA EXPRESAR UN TRANSGÉN EN UNA CÉLULA
El presente texto describe además, pero no reivindica, métodos para expresar un transgén en una célula, preferiblemente una célula que no se divide. El método comprende transducir una célula con un vector lentiviral o un
vector de partícula lentiviral de la invención bajo condiciones que permitan la expresión del transgén.
Las células pueden ser células de mamífero, particularmente células humanas. Particularmente, pueden ser células humanas que no se dividen.
El transgén puede codificar al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV), antígeno
de polimerasa, proteína HBX y núcleo de consenso de HBV de genotipos A y C. El método puede comprender además recoger o aislar el polipéptido.
El vector lentiviral o el vector de partícula lentiviral puede comprender un promotor de la invención.
El presente texto también describe, pero no reivindica, un método para expresar un transgén que comprende insertar un promotor en un vector lentiviral de modo que dirija la expresión de un transgén y transducir una célula con el vector que contiene el promotor.
UTILIZACIÓN TERAPÉUTICA DE VECTORES LENTIVIRALES
El presente texto también describe, pero no reivindica, el uso de los vectores lentivirales según la invención, especialmente en la forma de partículas de vector lentiviral, para la preparación de composiciones o vacunas terapéuticas que sean capaces de inducir o contribuir a la presencia o la mejora de una reacción inmunológica contra epítopos, más particularmente los codificados por el transgén presente en los vectores bajo el control transcripcional de cualquiera de los promotores de la invención.
Se describen métodos fuera de la invención reivindicada de administración de un vector lentiviral (o "lentivector") a un ser humano. Preferiblemente, el lentivector contiene un promotor que conduce una expresión elevada de un antígeno en células presentadoras de antígenos, incluyendo células dendríticas, y conduce la expresión en otros tipos de células transducidas suficiente para la eliminación por la respuesta inmunitaria inducida. Lo más preferiblemente, el promotor carece de un elemento potenciador para evitar efectos de inserción.
La administración puede ser intramuscular. En una realización, el lentivector se inyecta en el músculo usando una aguja.
Los antígenos adecuados pueden ser:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C.
La partícula de lentivector puede ser una partícula de lentivector integradora, que comprende una proteína integrasa funcional.
La administración puede eliminar al menos 95%, 99%, 99,9%, o 99,99% del ADN lentiviral integrado en las células musculares de un modelo en animales el día 4 después de la administración se elimina para el día 21 después de la administración.
También se describe un método fuera de la invención reivindicada para inducir una respuesta inmunitaria en un ser humano que comprende administrar intramuscularmente partículas de vector lentiviral que comprenden una proteína integrasa funcional y un vector lentiviral a un ser humano; en donde el vector lentiviral integrador comprende un promotor que dirige la expresión de al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C y al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, en donde el promotor no contiene un potenciador, y en donde las partículas de vector lentiviral exhiben una expresión superior de los antígenos en células BDCM que en células T HEK 293; integrar el ADN del vector lentiviral en células del ser humano; expresar los antígenos en las células del ser humano; y generar una respuesta inmunitaria contra los antígenos.
También se describe un método fuera de la invención reivindicada para inducir una respuesta inmunitaria en un ser humano que comprende administrar intramuscularmente partículas de vector lentiviral que comprenden una proteína integrasa funcional y un vector lentiviral a un ser humano; en donde el vector lentiviral integrador comprende un promotor que dirige la expresión de al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C y al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, en donde el promotor no contiene un potenciador, en donde la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es superior que la expresión en células de riñón, músculo liso, hígado y corazón; integrar el ADN del vector lentiviral en células del ser humano; expresar los antígenos en las células del ser humano; y generar una respuesta inmunitaria contra los antígenos.
Además, se describe un método fuera de la invención reivindicada para inducir una respuesta inmunitaria en un ser humano que comprende administrar intramuscularmente partículas de vector lentiviral que comprenden una proteína integrasa funcional y un vector lentiviral a un ser humano; en donde el vector lentiviral integrador comprende un promotor que dirige la expresión de al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C y al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, en donde el promotor no contiene un potenciador, en donde la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es 12-100 veces la expresión de ese promotor en células de músculo esquelético; integrar el ADN del vector lentiviral en células del ser humano; expresar los antígenos en las células del ser humano; y generar una respuesta inmunitaria contra los antígenos.
Además, se describe un método fuera de la invención reivindicada para inducir una respuesta inmunitaria en un ser humano que comprende administrar intramuscularmente partículas de vector lentiviral que comprenden una proteína integrasa funcional y un vector lentiviral a un ser humano; en donde el vector lentiviral integrador comprende un promotor que dirige la expresión de al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C y al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, en donde el promotor no contiene un potenciador, en donde la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es superior que la expresión en células de riñón, músculo liso, hígado y corazón, y en donde la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es 12-100 veces la expresión de ese promotor en células de músculo esquelético; integrar el ADN del vector lentiviral en células del ser humano; expresar los antígenos en las células del ser humano; y generar una respuesta inmunitaria contra los antígenos.
En algunas realizaciones, el método comprende eliminar al menos 95%, 99%, 99,9% o 99,99% del ADN lentiviral integrado en las células musculares de un modelo en animales el día 4 después de la administración para el día 21, el día 25, el día 33 o el día 66 después de la administración. La eliminación del lentiviral integrado en células musculares se puede medir según se describe en los ejemplos y mediante otras técnicas similares. Por ejemplo, se puede recoger una biopsia en la zona de la inyección de un ratón o rata a los 4 días y a los 21 días la cantidad de ADN integrado en las células se puede determinar en estos momentos mediante PCR.
Además, se describe un método fuera de la invención reivindicada para inducir una respuesta inmunitaria en un ser humano que comprende administrar intramuscularmente partículas de vector lentiviral que comprenden una proteína integrasa funcional y un vector lentiviral a un ser humano; en donde el vector lentiviral integrador comprende un promotor que dirige la expresión de al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C y al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, en donde el promotor no contiene un potenciador; integrar el ADN del vector lentiviral en células del ser humano; expresar los antígenos en las células del ser humano; y generar una respuesta inmunitaria.
Preferiblemente, las partículas de lentivector están en una dosis de 106, 2 x 106, 5x 106, 107, 2 x 107, 5 x 107, 108, 2 x 108, 5 x 108 o 109 TU. Más preferiblemente, las partículas de lentivector están en una dosis de al menos 1 x 107 TU, en particular al menos 7 x 107 TU.
La respuesta inmunitaria inducida por el vector lentiviral puede ser una respuesta de células B, una respuesta de células T CD4+ y/o una respuesta de células T CD8+.
La presente invención proporciona así vectores que son útiles como un medicamento o una vacuna, particularmente para administración intramuscular. Un objetivo de la presente invención se refiere a un vector lentiviral de la invención para el uso como un medicamento o una vacuna.
Estos vectores se utilizan preferentemente en el tratamiento o la profilaxis de enfermedades infecciosas, especialmente enfermedades asociadas con una infección viral y más particularmente con infección por HBV.
Como los vectores de la invención se dirigen más específicamente a células dendríticas para obtener una respuesta inmunitaria mediada por células y especialmente la respuesta de CTL asociada con el antígeno expresado por el transgén en estas células, son particularmente útiles como vacunas que se dirigen a HBV.
Según esto, de describe pero no se reivindica una composición inmunogénica que comprende un vector lentiviral como el definido previamente.
Las composiciones inmunogénicas contienen preferiblemente secuencias de cPPT y CTS en el vector y las partículas de vector para inducir o para estimular la importación nuclear del genoma del vector en las células diana.
Durante la transcripción inversa, las secuencias de cPPT y CTS inducen la formación de una estructura de ADN tricatenario denominada tríplex de ADN, que estimula la importación nuclear de la secuencia del vector de ADN. Preferiblemente, el vector comprende un transgén y señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o seudorretroviral, en donde la composición es capaz de inducir o de estimular una respuesta de CTL (linfocitos T citotóxicos) y/o CD4 contra uno o varios epítopos codificados por la secuencia transgénica presente en el vector.
La expresión del transgén se mejora mucho mediante la inclusión de un promotor en el vector.
Así, los vectores lentivirales según la invención tienen la capacidad de inducir, mejorar o en general estar asociados con la presencia de una respuesta de células B, una respuesta de células T CD4+ y/o una respuesta de células T CD8+, especialmente una respuesta de CTL de memoria, en particular contra HBV. En otras palabras, se pueden utilizar para la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento de alergias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades tumorales o enfermedades infecciosas, en particular de HBV, mediante inducción de, estimulación de o participación en la presencia de una respuesta inmunitaria mediada por células, especialmente una respuesta de CTL o una respuesta de memoria.
Los vectores lentivirales de la invención se pueden utilizar en métodos de tratamiento y métodos de inducción de una respuesta inmunitaria, en particular contra HBV, que comprenden administrar el vector lentiviral a un anfitrión y generar una respuesta inmunitaria específica contra el transgén en el anfitrión. Las células y los anticuerpos generados en estos anfitriones se pueden usar como reactivos de diagnóstico.
Los vectores lentivirales según la invención son preferiblemente para administración intramuscular, lo más preferiblemente mediante inyección con una aguja.
En una realización particular, la composición inmunogénica se puede administrar directamente al paciente, de tal modo que induzca, mejore o participe in vivo en la presencia de una respuesta de células B, una respuesta de células T CD4+ y/o una respuesta de células T CD8+, especialmente una respuesta inmunitaria mediada por CTL, en particular contra HBV.
En otra realización, las composiciones inmunogénicas se usan una vez o con administración repetida, preferiblemente al menos con dos administraciones, de modo que puedan permitir la presencia de una respuesta mediada por células de memoria a largo plazo.
Una ventaja particular de las composiciones inmunogénicas es que se pueden utilizar para provocar o estimular una respuesta inmunitaria mediada por células contra múltiples epítopos codificados por la secuencia nucleotídica de interés o el transgén presente en el vector o las partículas de vector, en particular contra HBV, y también se pueden usar para provocar o estimular una respuesta inmunitaria mediada por células contra el producto de toda la secuencia de un gen.
También se describe un vector lentiviral fuera de la invención reivindicada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una repetición múltiple (al menos 2 secuencias idénticas) de dicha secuencia de aminoácidos que induce una respuesta celular y/o una secuencia de aminoácidos que contiene al menos 2 secuencias diferentes.
Como resultado, una composición fuera de la invención reivindicada que se podría usar en protocolos de vacunación profiláctica y/o terapéutica, en particular contra HBV.
En particular, se puede utilizar en combinación con adyuvantes, otras composiciones inmunogénicas, quimioterapia o cualquier otro tratamiento terapéutico, en particular contra HBV.
También se describe una composición fuera de la invención reivindicada para administración intramuscular a un ser humano que comprende partículas de vector lentiviral que comprenden una proteína integrasa funcional y un vector lentiviral; en donde el ADN del vector lentiviral comprende un promotor que dirige la expresión de un aminoácido que comprende o que consiste en al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C y al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, particularmente codificado por una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los SEQ ID NOs detallados en la presente.
Se describe además una composición fuera de la invención para la administración intramuscular a un ser humano que comprende partículas de vector lentiviral que comprenden una proteína integrasa funcional y un vector lentiviral; en donde el ADN del vector lentiviral comprende un promotor que dirige la expresión de un aminoácido que comprende o que consiste en al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C y al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, particularmente codificado por una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los n° SEQ ID detallados en la presente, en donde el promotor no contiene un potenciador, y en donde la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es 12-100 veces la expresión de ese promotor en células de músculo esquelético y la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es superior que la expresión en células de riñón, músculo liso, hígado y corazón.
También se describe la utilización de una composición que comprende partículas de vector lentiviral para la administración intramuscular a un ser humano, en donde las partículas de vector lentiviral comprenden una proteína integrasa funcional y un vector lentiviral; en donde el ADN del vector lentiviral comprende un promotor que dirige la expresión de un aminoácido que comprende o que consiste en al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C y al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, particularmente codificado por una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los n° SEQ ID detallados en la presente.
Se describe además la utilización de una composición que comprende partículas de vector lentiviral para la administración intramuscular a un ser humano, en donde las partículas de vector lentiviral comprenden una proteína integrasa funcional y un vector lentiviral; en donde el DNA del vector lentiviral comprende un promotor que dirige la expresión de un aminoácido que comprende o que consiste en al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C, al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C y al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, particularmente codificado por una secuencia de aminoácidos de cualquiera de los n° SEQ ID detallados en la presente, en donde el promotor no contiene un potenciador, y en donde la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es 12-100 veces la expresión de ese promotor en células de músculo esquelético y la expresión del promotor en células dendríticas BDCA+ es superior que la expresión en células de riñón, músculo liso, hígado y corazón.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Construcciones moleculares
Se realizó una amplificación por PCR de la región proviral del pTRIPAU3-CMV-GFP(15) utilizando los oligonucleótidos directo (5'-CTTACTAGTTGGAAGGGCTAATTCACT CCCAAC-3'; SEQ ID NO: 7) e inverso (5'-CATTCTAGAACTGCTAGAG ATTTTCCACACTG-3'; SEQ ID NO: 8) que abarcan respectivamente los sitios de restricción Spel y Xbal. El fragmento resultante se digirió y se clonó entre los sitios Spel y Xbal del plásmido pVAX-1 (Invitrogen, Lifetech) del que se ha eliminado el sitio Mlul. El plásmido resultante se denominó pFLAP-CMV-GFP. La secuencia de SV40 se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pTRIPAU3-CMV-GFP (utilizando los oligonucleótidos 5'-TACCCCGGGCCA TGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTC-3' (SEQ ID NO: 9) y 5'-ACTCCCGGGTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAG GCCGCC-3' (SEQ ID NO: 10)) y se clonó en el sitio Pml1 del pFLAP-CMV-GFP, denominándose entonces el plásmido resultante pFLAP-CMV-GFP-SV. El promotor de CMV se amplificó con oligonucleótidos directo (5'-TACACGCGTGGAGTTCCGCGTTACATA ACTTACGG-3'; SEQ ID NO: 11) e inverso (5'-CGTGGATCCGATCGCGGT GTCTTCTATGGAGGTCAAAAC-3'; SEQ ID NO: 12) que abarcan los sitios Mlul y BamHI, respectivamente. El fragmento resultante se clonó de nuevo entre los sitios Mlul y BamHI del pFlap-CMV-GFP-SV permitiendo la sustitución fácil de los promotores dentro de los vectores lentivirales. A continuación, el promotor se amplificó mediante PCR a partir de ADN de células HEK 293T con 5'-GCCGGCGCGCCGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCC-3' (SEQ ID NO: 13) y 5'-CGTGGATCCGATCGCTCGGCCCGAATGCTGTCAGCTTCAGG-3' (SEQ ID NO: 14) para el promotor de p2m y se clonó entre los sitios Mlul y BamH1 de pFLAP-CMV-GFP-SV para crear pFlap-p2m-SV. La secuencia del promotor de p2m amplificado es la siguiente:
GAG AAAC C CTG C AG GG AATT CCCCAGCTGTAGTTAT AAAC AG AAGTTCTC
CTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAA
TGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCGGGGGCACCATTAGCAAGTCAC
TTAGCATCTCTGGGGCCAGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTC
CAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCAAGCTGGGGCGCGCACC
CCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCAT
GCCTTCTTAAACATCACGAGACTCTAAGAAAAGGAAACTGAAAACGGGAAAGTC
CCTCTCTCTAACCTGGCACTGCGTCGCTGGCTTGGAGACAGGTGACGGTCCCT
GCGGGCCTTGTCCTGATTGGCTGGGCACGCGTTTAATATAAGTGGAGGCGTCG
CGCTGGCGGGCATTCCTGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAG (SEQ ID NO: 15).
El antígeno de HBV se puede sintetizar y clonar entre los sitios BamHI y Xhol del pFlap-p2m-SV, en lugar del gen de GFP.
Por ejemplo, pFlap-p2m-GFP-SV se puede digerir mediante BamHI y Xhol, y un conector de ADN que contiene un sitio de clonación múltiple (MCS, que tiene los sitios de restricción Sail, Sacll, Ndel, Ascl y Nhel) se puede clonar entre esos sitios, en lugar del gen de GFP, para permitir la inserción de una secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno de HBV.
El plásmido de empaquetamiento pTHV-GP-N se construyó al amplificar el genoma de HIV-1 NDK mediante PCR (utilizando los siguientes oligonucleótidos con 5'-atgcatgcgtcgacctcgagttaatcctcatcctgtctacttgccac-3' (SEQ ID NO: 16) y 5' -gcatgcatcggccggggcggcgactgGTgagagGCCACCatgggtgcgagagcgtcagtattaag-3' (SEQ ID NO: 17). El fragmento resultante se ha digerido mediante las enzimas de restricción Eagl y Sail e insertado en el plásmido de empaquetamiento p8.74 (15) del que previamente se ha retirado el fragmento Eag1-Sall.
Se generaron plásmido de seudotipado al sintetizar los genes optimizados codónicamente correspondientes a las cepas de virus de estomatitis vesicular de Indiana (GenBank #CAX62728.1), Nueva Jersey GenBank #CAX62729.1) y Cocal (GenBank # CAX62731.1). A continuación, esos genes se digirieron con EcoR1 y BamH1 y se clonaron entre los sitios de restricción correspondientes del plásmido pVAX1 (Invitrogen, Lifetech).
Los plásmidos se pueden producir utilizando una columna Nucleobond Xtra Maxi EF según las instrucciones del fabricante (Macherey Nagel).
Ejemplo 2. Producción lentiviral
Producciones para I+D: Los vectores se pueden producir mediante transfección transitoria con fosfato cálcico de HEK 293T según se describe previamente (25).
Producción preclínicas y de prácticas correctas de fabricación: El día antes de la transfección, se siembran células HEK 293T en medio de cultivo sobre 24 unidades de Cell Factory 10 (CF-10, Nunc). Las células se transfectaron mediante un método de fosfato cálcico según se presentaba previamente (25). De 18 a 24 horas después de la transfección, el medio de cultivo se cambia por medio de producción correspondiente a medio de Eagle con modificación de Dubelcco (DMEM/High modified, Hyclone) complementado con 2% de suero de ternero fetal (FCS, PAA) termoinactivado, 1 % de L-glutamina (Gibco de Life technologies), 1 % de penicilina-estreptomicina (Gibco de Life technologies), 1% de piruvato sódico (Gibco de Life technologies), BENZONASe® (calidad farmacéutica I, 100.000 U, Merck Millipore) y MgCl21 M. Mínimamente 24 horas después de la renovación del medio, el sobrenadante de las 24 CF-10 se recoge y se reúne. Después de un segundo tratamiento con BENZONASE®, el sobrenadante se clarifica mediante filtración sobre un cartucho Kleenpak Nova Profile II (Pall). Después de la clarificación, se aplica durante la noche un tercer tratamiento con BENZONASE® a 2/+8°C. El vector viral se purificó utilizando cromatografía de intercambio aniónico sobre un casete Mustang-Q XT (Pall). Las partículas lentivirales se eluyen en dos etapas con NaCl 0,5 M y 1,2 M. Ambas fracciones se diluyen para disminuir la concentración de NaCl hasta ± 150 mM antes de reunirse. El eluato de IEX se concentra adicionalmente aproximadamente 40 veces mediante ultrafiltración usando un filtro de la serie Omega T de 100 KDa, 0,1 m2 (Pall) y se diafiltró con 40 mg.l-1 de PBS-lactosa. El volumen purificado (sustancia farmacológica) se filtra finalmente a través de un filtro Sartobran H5 de 0,2 pM, 300 cm2 (Sartorius Stedim) y se distribuye asépticamente sobre viales de 3 ml 2R con un volumen de llenado buscado de 650 pl (1200 pl para lotes piloto). Después de la inspección visual de todos los viales (aproximadamente 350 viales por lote clínico), el producto farmacológico se almacena a -70°C±10°C.
Para la caracterización y la liberación farmacéutica del producto, se pueden realizar pruebas de calidad según textos reguladores sobre vacunas: el control de calidad requerido para las vacunas según la Farmacopea Europea (sección 6.16), las "guideline on quality, non-clinical and clinical aspects of live recombinant viral vectored vaccines" (EMA/CHMP/141697/2009), las "guideline on development and manufacture of lentiviral vectors" (CHMP/BWP/2458/03); un texto regulador sobre productos medicinales para terapia génica: los controles de calidad requeridos para productos medicinales de transferencia génica para uso humano según la Farmacopea Europea (sección 5.14), los controles de calidad específicos para productos de terapia génica que se definen en la "note for guidance on the quality, preclinical and clinical aspects of gene transfer medicinal products" (CHMP/BWP/3088/99); textos reguladores sobre productos biotecnológicos (ICH Q5A a ICH Q5E); textos reguladores sobre especificaciones (ICH Q6A y ICH Q6B) los controles de calidad requeridos para preparaciones parenterales según la Farmacopea Europea (sección 7.0).
Ejemplo 3. Titulación del vector lentiviral
Reacciones qPCR: Se siembran células HEK 293T en placas de 6 pocillos (BD Falcon) en medio de cultivo y se incuban durante 4 h a 37°C, 5% de CO2 en atmósfera húmeda. Las células se transducen con 3 diluciones sucesivas de vector lentiviral. 72 h después de la incubación, las células se recogen y se producen pellas de células HEK 293T transducidas. El ADN genómico total procedente de pellas celulares transducidas se extrae utilizando un método basado en el manual de QIAGEN QIAamp DNA mini kit. La cuantificación proviral se realiza utilizando qPCR de Taqman. La amplificación se realiza con la mezcla madre (Fermentas Thermo Scientific), los cebadores Flap A (CCCAAGAACCCAAGGAACA; SEQ ID NO: 18) y Flap S (AGACAA GATAGAGGAAGAGCAAAAC; SEQ ID NO: 19) y la sonda LENTI TM (6FAM-AACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGG-BBQ; SEQ ID NO: 20). La normalización se realiza con la cuantificación del gen de actina (misma mezcla, actina A -CGGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT- (SEQ ID NO: 21), cebadores de actina S - AACACCCCAGCCATGTACGT-(SEQ ID NO: 22) y sonda HUMURA ACT TM 6FAM-CCAGCCAGGTCCAGACGCAGGA-BBQ-(SEQ ID NO: 23). Ambas reacciones se consiguen en MasterCycler Ep Realplex S (Eppendorf, 2 min a 50°C, 10 min a 95°C y 40 ciclos de 15 segundos a 95°C y 1 min a 63°C). El análisis se realiza con el programa MasterCycler Ep Realplex.
A continuación, se realizan análisis de FACS.
Ejemplo 4. Respuesta específica para T (mediana) en ratones C57BI/6j con o sin inmunización de cebadorefuerzo
Animales: Se adquirieron ratones hembra (C57BI/6J) de cuatro semanas o ratones hembra Sprague Dawley RjHan:SD (Sprague Dawley) de ocho semanas de Janvier Laboratories (Francia).
Los animales se alojaron en las instalaciones para animales del Institute Pasteur según las regulaciones del Instituto al respecto de procedimientos éticos de experimentación en animales.
Dos grupos de 5 ratones fueron inmunizados intramuscularmente según una estrategia de cebado-refuerzo (P/B):
(i) el primero con 7 x 107 TU de la construcción de HBV con vector lentivira1HBV-3 de la invención en la sensibilización y 7 x 107 TU de construcción de HBV con vector lentivira1HBV-3 de la invención en el refuerzo;
(ii) el segundo grupo con 7 x 106 TU de construcción de HBV con vector lentivira1HBV-3 en la sensibilización y 7 x 106 TU de construcción de HBV con vector lentiviral HBV-3 en el refuerzo.
En estos dos grupos, 7 semanas separan las inyecciones de sensibilización y refuerzo.
Otros dos grupos de ratones fueron inmunizados intramuscularmente según una estrategia de inyección de sensibilización (P):
(i) el primero (2 ratones) con 7 x 107 TU de construcción de HBV con vector lentivira1HBV-3;
(ii) el segundo grupo (5 ratones) con 7 x 106 TU de construcción de HBV con vector lentivira1HBV-3.
Los ratones de control fueron inyectados intramuscularmente con PBS-lactosa.
Los lentivectores en los que la expresión de la construcción HBV-3 de la invención es conducida por un promotor (p. ej., p2m o MHCl). 15 días después de la inmunización de sensibilización, o después de la inmunización de refuerzo para los dos grupos implicados, las respuestas de células T específicas se pueden comprobar en esplenocitos de ratones mediante ELISPOT de IFN-y.
Placas de cultivo tisular de noventa y seis pocillos (Millipore) se revisten durante la noche a 4°C con 50 gl/pocillo de 5 gg/ml de mAb anti-IFN-y de ratón (Mouse IFN-y Elispot pair; BD Biosciences Pharmingen). Las placas se lavan tres veces con 200 gl de DPBS/pocillo y se bloquean con 200 gl/pocillo de DPBS/10% de suero bovino fetal durante 2 h a 37°C. Las placas se lavan tres veces con 200 gl de DPBS/pocillo. Se añaden esplenocitos a las placas por triplicado en 2,5, 4,1 o 5,1x105 células/pocillo y se estimulan con 2 gg/ml de péptidos estimuladores (específicos para el antígeno), concanavalina A (5 gg/ml; fuente) o medio de cultivo solo. Las placas se incuban durante 18 h a 37°C y a continuación se enjuagan tres veces con 200 gl/pocillo de DPBS/0,05% de Tween 20 y tres veces con 200 gl/pocillo de DPBS. Para la detección, se añaden 50 gl/pocillo de 2 gg/ml de anticuerpo monoclonal anti-IFN-y de ratón biotinilado (BD Pharmingen) durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavan y se añaden 100 gl/pocillo de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Roche) diluidas 1:2000 en PBS de Dulbecco durante 90 min a temperatura ambiente. Después de la lavar las placas, se visualizan manchas (células que secretan IFN-y) al añadir 60 gl/pocillo de solución BCIP/NBT (Sigma). Las placas se incuban durante 15-30 min a temperatura ambiente hasta que se desarrollan manchas azules y se lavan a fondo con agua corriente y se secan al aire durante 24 h. Finalmente, las manchas se cuentan utilizando un Bioreader 2000 (Biosys).
La respuesta inmunitaria acumulada y la diversidad de la respuesta inmunitaria T medida en este experimento se representa en la Figura 2. Por otra parte, la Figura 2 ilustra la proporción de respuesta inmunitaria para cada antígeno en los resultados acumulados.
Los resultados obtenidos demuestran que se obtiene una respuesta inmunitaria significativa en comparación con el grupo de control cuando se inyecta (en los grupos tanto de sensibilización (P) como de sensibilización/refuerzo (P/B)) con los vectores a la dosis de 7 x 107 TU.
Se obtiene una respuesta inmunitaria mejorada en comparación con el grupo de control cuando se inyecta con vectores que comprenden la construcción de la invención, a la dosis de 7 x 106 TU según una estrategia de sensibilización/refuerzo (P/B).
Se obtienen mejores resultados de respuesta inmunitaria cuando se inyecta en una dosis de 7 x 107 TU en comparación con la dosis de 7 x 106 TU, ambas con las estrategias de (P/B) y (P).
A dosis similares (es decir 7 x 107 TU o 7 x 106 TU), la respuesta inmunitaria inducida por vectores administrados según una estrategia de sensibilización-refuerzo (P/B) es significativamente superior que la respuesta inmunitaria inducida por vectores administrados según una estrategia de sensibilización (P).
Dicha respuesta inmunitaria inducida es más particularmente fuerte contra Núcleo, PolA, XC, EnvC y VLP en el grupo de ratones inmunizados según una estrategia de sensibilización-refuerzo (P/B) con 7 x 107 TU.
La respuesta inmunitaria inducida es más particularmente fuerte contra XC y EnvC en el grupo de ratones inmunizados según una estrategia de sensibilización-refuerzo (P/B) con 7 x 106 TU.
La respuesta inmunitaria inducida es más particularmente fuerte contra Núcleo, PolA, PolC y XA, en particular contra Núcleo en el grupo de ratones inmunizados según una estrategia de sensibilización (P) con 7 x 107 TU.
Ejemplo 5. Antígenos de HBV
Una vacuna terapéutica para HBV, diseñada para la utilización en la población general, necesita basarse en numerosos epítopos restringidos por múltiples tipos de HLA a fin de proporcionar niveles aceptables de cobertura de población.
Para inducir respuestas de CTL multiespecíficas, que son clave para la resolución de infección por HBV, se construyó un vector lentiviral que tiene antígeno superficial de envuelta, antígenos de polimerasa, proteína HBX y núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y C.
Se puede construir VLP quimérica basada en proteína del núcleo de HBV para estimular inmunidad multivalente contra antígeno superficial y núcleo de HBV, ya que las respuestas inmunitarias específicas tanto para Ag nuclear de HBV como para Ag superficial de HBV representan un papel importante en el control de infección por HBV. Los anticuerpos específicos para Ag superficial de HBV median en la eliminación de viriones en una fase temprana de la infección y evitan la extensión del virus. La VLP quimérica se puede construir al insertar el determinante de unión a anticuerpo inmunodominante del Ag superficial de HBV en el Ag nuclear de HBV.
Se recogieron más de mil secuencias de antígenos de hepatitis del genotipo A y el genotipo C de bases de datos de HBV, HBVdb, (https://hbvdb.ibcp.fr/ HBVdb/HBVdbIndex) y se obtuvieron las secuencias de consenso de antígeno de genotipo específico al realizar múltiples alineamientos de secuencia.
Se utilizó ClustalW (https://hbvdb.ibcp.fr/HBVdb/HBVdbDataset?seqtype=2) para crear múltiples alineamientos necesarios para generar una secuencia de consenso.
Se seleccionan péptidos derivados de HBV altamente conservados que se unen a múltiples alelos de HLA clase I y clase II con alta afinidad son reconocidos como epítopos de CTL en pacientes infectados agudamente (Reignat y cols., J. Exp. Med. 195:1089-1101 (2002); Mizukoshi y cols., J. Immunol. 173:5863-5871 (2004); Su y cols., Proc Natl Acad Sci U S A 1997;94:8744-8749; Desmond y cols., Antiviral Therapy 2007; 13:161-175; Bertoni y cols., J Clin Invest. 1 de agosto de 1997;100(3):503-13; Nayersina y cols., J Immunol. 15 de mayo de 1993;150(10):4659-71; Rehermann y cols., J Clin Invest. 1 de abril de 1996;97(7):1655-65; Kakimi y cols., J Virol. septiembre 2002;76(17):8609-20; Mizukoshi y cols., J Immunol. 1 de noviembre de 2004;173(9):5863-71; Depla y cols., J Virol. enero 2008;82(1):435-50; Ding y cols., Hepatology. mayo de 2009; 49(5):1492-502).
El orden de los epítopos de HLA se seleccionó para distribuir epítopos a lo largo de la construcción. La construcción se muestra en la Figura 1.
Para evitar el tratamiento farmacológico tóxico a largo plazo o para apoyar solo parcialmente una terapia antiviral eficaz, una vacuna terapéutica para HBV basada en LV puede aumentar el sistema inmunitario del paciente para combatir y controlar el virus.
La inclusión de antígenos virales clave asegura una estimulación eficaz de respuestas de células T - además de la activación de una respuesta inmunitaria humoral.
La vacuna terapéutica para HBV puede romper la tolerancia e inducir la infiltración de células T en el hígado. La construcción de vacuna multiantigénica se diseñó para provocar respuestas celulares y humorales multifuncionales multiespecíficas, imitando la depuración de la infección natural por HBV. La VLP quimérica basada en núcleo de HBV puede actuar como un adyuvante. Puesto que se puede usar sin adyuvante, puede eliminar la mayoría de las reacciones adversas.
Ejemplo 6. Evaluación preclínica
Estudios de eficacia en animales:
Se utilizarán para el trabajo propuesto ratones transgénicos HBV (HBV-Tg) de ambos géneros. En primer lugar se someterán a hepatectomía parcial de 1/3 para establecer los niveles de replicación del virus en el hígado antes de la vacunación.
Después de la recuperación de los ratones HBV-Tg de la hepatectomía, se vacunarán una vez, y tres semanas más tarde se vacunarán de nuevo (refuerzo).
La vacuna está compuesta por un vector lentiviral que expresa una combinación de antígenos de HBV.
Tres semanas después del refuerzo, se extraerá sangre retroorbitariamente de los ratones y se probarán con respecto a la presencia de ADN de HBV en sangre mediante qPCR en tiempo real.
Suero recogido antes de la inmunización y tres semanas más tardes después del refuerzo se probará con respecto a los niveles de biomarcadores asociados con HBV, preferiblemente HBsAg, anti-HBs y ALT.
Al final del período de observación, los ratones se sacrificarán y plantillas intrahepáticas que apoyan la replicación de HBV se analizarán y cuantificarán mediante hibridación por transferencia Southern.
También se probará la presencia de ADN de HBV integrado. Los hígados se teñirán con respecto a biomarcadores asociados con HBV, preferiblemente HBsAg, anti-HBs y ALT.
Los resultados se compararán entre antes y después de la vacunación en grupos de prueba y control.
Como un control para estos estudios, también se utilizarán camadas no transgénicas. Otros dos grupos de ratones se vacunarán como se describe anteriormente, pero también se inyectarán i. p. con anti-PD-1 en el momento de la inmunización inicial y de nuevo en el momento del refuerzo.
Se realizarán estudios de toxicidad utilizando el volumen inyectable máximo en rata, 200 pl en el músculo de la pata posterior izquierda más 200 pl de la derecha, a través de inyección intramuscular. De ahí que la toxicidad de la dosis factible máxima se establezca utilizando la vía clínica elegida. La inyección intravenosa (infusión lenta en la vena caudal) utilizando el mismo volumen total (400 pl) se realizará en otros animales para establecer la exposición sistémica. La dosis correspondiente a este volumen todavía no es conocida ya que el título de los lotes (expresado en TU ml-1) varía de un lote a otro. En caso de que se produzca un episodio adverso considerado significativo, se evaluará una segunda dosis inferior. Esta dosis inferior será 1/5 de la MAD para que sea coherente con i. Los datos preclínicos reunidos sobre las vacunas terapéuticas para HIV y otros planos de desarrollo preclínicos; ii. la sensibilidad de los métodos utilizados para la titulación del vector y durante la inyección. Siguiendo las recomendaciones de las directrices ("The WHO guidelines on nonclinical evaluation of vaccines"), se constituirán grupos de 10 machos y 10 hembras más grupos de control (se ha de definir el control a establecer como la composición final de los vectores) excepto para el estudio de tolerancia local durante el cual se planean 5 animales/sexo/grupo. La toxicidad después de la inyección IV se evaluará sin evaluación de la tolerancia local.
Intramuscularmente (la vía clínica), se planean dos fechas de sacrificio: el día 4 para el sacrificio provisional para evaluar la tolerancia local (en la zona de inyección) y el día 15 y el día 47 para el sacrificio terminal con un ELISPOT para evaluar la inmunogenicidad después de la inyección de HBV-3. Los animales inyectados intravenosamente se sacrificarán solo el D15 y no se realizará ELISPOT.
La evaluación de la toxicidad se realizará al comprobar la mortalidad, los signos clínicos, el peso corporal (una vez al día), el consumo de alimento (una vez a la semana), la temperatura corporal (antes de la inyección, 6 h después de la inyección y a continuación una vez al día hasta el día 5 y a continuación una vez cada 2 días), las enzimas hepáticas (ASAT, ALAT, el día 2). El examen microscópico del hígado se realizará después del sacrificio terminal.
Se han diseñado estudios para evaluar la biodistribución, la propagación y la persistencia de las secuencias de vectores integradas de los vectores lentivirales inyectados.
Cada una de las vacunas lentivirales se inyectará a la dosis alcanzable máxima en ratas Sprague-Dawley, usando la vía clínica elegida, es decir inyección intramuscular. Los sacrificios de 5 machos 5 hembras se realizarán en los días 3, 21, 33 y 56 días; para ser coherentes con datos reunidos previamente sobre las vacunas terapéuticas para HIV THV01 y otros vectores lentivirales desarrollados por el Solicitante. En efecto, se realizaron estudios similares sobre las vacunas THV01, vacunas terapéuticas para HIV con diseño de vector similar pero que codifican un antígeno diferente. Se detectaron señales positivas significativas solamente en la zona de inyección, los nódulos linfáticos drenantes y el bazo los días 4 y 21. Secuencias diana de elementos de prueba residuales se encontraron el Día 33 y 56 pero los resultados no eran significativamente diferentes de los controles.
Se recogieron sangre, orina y heces un día antes de la inyección, y durante 3 días después de la inyección para evaluar la propagación del vector en varios momentos posteriores. Esto se realizará después de la extracción de ARN en estas muestras.
Los estudios de biodistribución descritos anteriormente permitirán obtener datos sobre la biodistribución del vector integrado.
La respuesta biológica inducida por el vector lentiviral HBV-3 se medirá al cuantificar la respuesta inmunitaria mediada por células T generada mediante un ensayo de IFN-y por ELISPOT. En efecto, la eficacia esperada de estas vacunas se basa en la inducción de una respuesta inmunitaria de células T fuerte, diversa y de larga duración. De ahí que en lugar de generar una "evidencia no clínica que apoye el efecto clínico potencial”, se establecerá "el efecto biológico relacionado".
La respuesta humoral contra el vector HBV-3 consistirá principalmente en anticuerpos generados contra las proteínas de envuelta VSV utilizadas para seudotipar vectores. Por lo tanto, esta respuesta humoral se considera una "inmunogenicidad no deseada".
La respuesta inmunitaria celular se evaluará al realizar ELISPOT que medirá el número de linfocitos T efectores específicos a través de secreción de IFN-y. Los vectores lentivirales se inyectarán en los animales, a continuación sus esplenocitos se aislarán y la respuesta inmunitaria se establecerá contra un conjunto de péptidos de HBV representativos de los epítopos según se indica anteriormente en la presente. Estos estudios permitirán la evaluación de la dosis eficaz.
Finalmente, la caracterización de la respuesta inmunitaria se realizará al cuantificar la respuesta de células T CD4+ y de células T CD8+.
La inmunidad preexistente y la inducción de una respuesta inmunitaria a la proteína VSV-G pueden dar como resultado una disminución de la eficacia de la vacunación. En efecto, si los anticuerpos del anfitrión se unen a las partículas del vector HBV-3, menos DCs serán transducidas por estas partículas, lo que podría conducir a la inducción de respuestas inmunitarias de menor magnitud.
Para establecer este riesgo, se establecieron o se establecerán tanto la presencia de anticuerpos anti-VSV-G preexistentes como la inducción de estos anticuerpos después de cada vacunación:
La prevalencia de anticuerpos anti-VSV-G se ha establecido usando sueros humanos y un ELISA desarrollado en las instalaciones propias. Brevemente, vectores seudotipados por los serotipos de VSV-G pero que codifican la luciferasa se incubaron a varias diluciones con aproximadamente 100 sueros humanos. El porcentaje de células transducidas se cuantificó mediante FACS después de la adición de luciferina: cuanto más elevado fuera el porcentaje, menor actividad neutralizadora. Se considera que esta actividad neutralizadora se debe a anticuerpos contra el serotipo de envuelta específico; de ahí que se realice el establecimiento indirecto de la prevalencia. Los resultados mostraban que un porcentaje insignificante de los pacientes exhibe anticuerpos anti-VSV-G preexistentes. Esta evaluación podría ser pertinente para ser realizada en clínicas si los experimentos se mantienen en regiones en las que la prevalencia de la infección por VSV sea superior que en Europa.
El ELISA se realizará sobre muestras de sangre tomadas de ratas inyectadas con los lotes preclínicos de los vectores y establecerá la respuesta humoral específica para cada uno de los serotipos.
La tolerancia local se establecerá durante el estudio de toxicidad aguda mediante observación macroscópica y microscópica cadavérica de la zona de inyección.
El efecto esperado del tratamiento con HBV-3 es la inducción de una respuesta inmunitaria celular. Esto conducirá a la eliminación del anfitrión de las células infectadas así como las transducidas por el vector HBV-3.
Como los vectores se inyectarán intramuscularmente y no sistémicamente, el riesgo de transmisión a la línea germinal es reducido.
Se llevará a cabo un estudio en fase I/II en pacientes infectados crónicamente.
Además de los criterios de valoración primarios, se estudiará la respuesta inmunitaria celular provocada por el candidato a vacuna al comprobar la respuesta inmunitaria celular mediante la cuantificación de citocinas e integrinas.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un vector lentiviral que codifica:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, en donde el vector lentiviral codifica al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24 y al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
2. El vector lentiviral según la reivindicación 1, en donde el vector lentiviral comprende un promotor de microglobulina p2.
3. El vector lentiviral según la reivindicación 1 o 2, en donde el vector lentiviral es un ADN.
4. Una partícula de vector lentiviral que codifica:
- al menos un antígeno de la superficie de envuelta del virus de la hepatitis B (HBV) de los genotipos A y/o C, - al menos un antígeno de polimerasa de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno de proteína HBX de los genotipos A y/o C,
- al menos un antígeno del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, y
- al menos un antígeno de los epítopos de MHCI y MHCII del núcleo de consenso de HBV de los genotipos A y/o C, en donde el vector codifica al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24 y al menos la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
5. La partícula de vector lentiviral según la reivindicación 4, en donde la partícula de vector lentiviral comprende una proteína integrasa lentiviral funcional.
6. La partícula de vector lentiviral según la reivindicación 4 o 5, en donde la partícula de vector lentiviral comprende una glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular.
7. La partícula de vector lentiviral según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la partícula de vector lentiviral comprende proteínas Gag y Pol de HIV-1 subtipo D.
8. Una célula aislada que comprende el vector lentiviral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la partícula de vector lentiviral según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.
9. Un vector lentiviral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para el uso como un medicamento o una vacuna.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1076715B1 (en) * 1998-05-13 2007-07-18 Genetix Pharmaceuticals Inc. Lentiviral packaging cells
DK2169073T3 (da) 1999-10-11 2014-02-10 Pasteur Institut Vektor til fremstilling af immunterapeutiske præparater
WO2008103380A2 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Fox Chase Cancer Center Hepatitis b virus compositions and methods of use
MX2012001592A (es) * 2009-08-07 2012-05-22 Transgene Sa Composicion para el tratamiento de la infección del virus de la hepatitis b.
CN102038948B (zh) * 2009-10-10 2013-04-10 复旦大学 一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗
EP2666477A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-27 Theravectys Lentiviral vectors containing an MHC class I promoter
WO2012109404A1 (en) * 2011-02-12 2012-08-16 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis b infection
EP3143144A4 (en) * 2014-05-16 2017-12-20 Yale University VIRUS LIKE VESICLES (VLVs) BASED VACCINES TO PREVENT OR TREAT CHRONIC HEPATITIS B VIRUS (HBV) INFECTION
WO2016120492A1 (en) * 2015-02-01 2016-08-04 Theravectys Lentiviral vectors for expression of hepatitis b virus (hbv) antigens

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