ES2329768T3 - Poxvirus recombinantes para las proteinas quimericas del virus de inmunodeficiencia humana. - Google Patents
Poxvirus recombinantes para las proteinas quimericas del virus de inmunodeficiencia humana. Download PDFInfo
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Abstract
Se describen genes quiméricos del VIH formados por la unión de fragmentos de diferentes genes de este virus, donde estos fragmentos contienen epitopos para células T citotóxicas (CTL) o T auxiliadoras del VIH-1, los cuales son presentados por una amplia gama de antígenos del Sistema Principal de Histocompatibilidad Humano tipo 1 (HLA-1). A partir de estos genes se obtienen poxvirus recombinantes útiles en la vacunación profiláctica y terapéutica contra la infección por VIH/SIDA capaces de generar una respuesta inmune celular protectora en animales de laboratorio inmunizados y siendo reconocidos por los linfocitos CTL de pacientes de VIH/SIDA.
Description
Poxvirus recombinantes para las proteínas
quiméricas del virus de inmunodeficiencia humana.
La presente invención se refiere al campo de la
inmunología y, en particular, al desarrollo de vacunas para la
prevención o tratamiento de Síndrome de Inmunodeficiencia adquirida
(SIDA). Se describen los genes quiméricios y Virus de la viruela
aviar que los expresan, útiles para el tratamiento y prevención de
SIDA.
\vskip1.000000\baselineskip
VIH es el agente etiológico del SIDA (Popovic M,
Sarngadharan M, Read G, and Gallo RC. Science 1984, 224:
497-500). Este virus infecta no solamente las
células T CD4+ (Klatzman D, Barre Sinoussi F, Nugeyre MT, Dauguet
C, Vilmer E, Griscelli C, Brun-Vezinet F, Rouzioux
C, Gluckman, JD, Chermannn JC y Montagnier L. Science 1984, 225:
59-63) sino también otros tipos de células tales
como macrófagos, células dendríticas, microglia y células
epiteliales.
epiteliales.
VIH puede escapar de la respuesta inmune humana
a pesar de los altos niveles de anticuerpos que persisten a lo
largo de toda la infección. A largo plazo, VIH provoca una profunda
inmunodeficiencia en el huésped, que llega a ser altamente
susceptible al ataque de infecciones oportunistas.
Más de 36 millones de personas están viviendo
con VIH/SIDA y 94% de las 16.000 infecciones diarias se producen en
los países desarrollados. (UNAIDS Report on the global VIH/AIDS
epidemic, junio 2000) debido a estos números alarmantes y la
ausencia de un tratamiento eficaz y económico para esta enfermedad,
existe una urgente necesidad del desarrollo de una vacuna de
VIH.
Entre varias características de VIH que hacen
esta tarea difícil lo más importante es quizás el alto grado de
variabilidad genética de sus antígenos, especialmente la
glicoproteína de envuelta (gp 120) donde se localizan los
principales dominios implicados en el proceso infeccioso y dirigidos
por los anticuerpos neutralizantes.
Los candidatos de vacuna basados en anticuerpos
neutralizantes han sido capaces de proteger contra el VIH en
chimpancés (Berman PW, Gregory TJ, Lavon R, Nakamura GR, Champe MA,
Porter JP, Wurm FM, Hershberg RD, Cobb GK Y Eichberg JW. Nature
1990, 345: 622-625; Girard M, Kieny MP, Pinter A;
Barre-Sinoussi F, Nara P, Kolbe H, Kusumi K, Chaput
A, Rainhart T, Muchmore E, Ronco J, Kaczorek M, Gomard E, Gluckman
JC y Fultz PN, PNAS 1991, 88: 542-546). Sin embargo
esos experimentos se realizaron en condiciones casi ideales donde la
dosis, vía y programación de la exposición viral eran muy
diferentes de la infección natural. Además, esos inmunógenos no
pueden proteger contra aislamientos de VIH divergentes y los
anticuerpos inducidos no neutralizan los aislamientos de VIH
primarios.
Se han evaluado diferentes candidatos de vacuna
en ensayos clínicos en fase I y II (Johnston MI. AIDS vaccine
development: status and future directions. 1999. XII Colloque des
Cent Gardes. Ed. Girard M y Dodet B.161-163). La
mayoría de éstos se basan en las proteínas de envuelta. gp 160 y gp
120. Solamente una vacuna, basada en la gp 120 recombinante está
actualmente experimentando en ensayos de Fase III de evaluación de
eficacia en Tailandia y Estados Unidos. Los resultados de los
ensayos previos sugieren que solamente se puede esperar una
protección muy limitada si la hay de esta vacuna.
Debido a estas serias limitaciones para generar
una respuesta humoral capaz de conferir protección contra
diferentes aislamientos y subtipos de VIH, los esfuerzos de los
investigadores se han desviado mayormente en los últimos años hacia
el desarrollo de candidatos de vacuna capaces de estimular
principalmente la rama celular del sistema inmune y particularmente
células T citotóxicas dirigidas contra los antígenos de VIH.
Entre los hallazgos experimentales que sugieren
fuertemente la relevancia clínica de los anti VIH CTL son: la
administración de anticuerpo monoclonal anti CD8 a los macacos
previamente inoculados con Virus de Inmunodeficiencia
Simia-Humana (VISH) marcadamente potenciaba los
niveles de viremia (Matano T, Shibata R, Simeón C, Connors M, Lane
C, Martín M, Administration of an Anti-C08
monoclonal antibody interferes with the clearance of chimeric
Simian/Human Immunodeficiencyvirus during primary infections of
rhesus macaques, J Virol, 1998, 72, 1: 164-169); las
variantes virales capaces de escapar al reconocimiento de las
células T CD8+ se seleccionan en tanto los individuos infectados
por VIH (Borrow, P., H. Lewicki, X. Wei, M. S. Horwitz, N. Peffer,
H. Meyers, J. A. Nelson, J. E. Gairin, B. H. Hahn, M. B. A.
Oldstone, y G. M. Shaw. 1997. Antiviral pressure exerted by
HIV-1-specific cytotoxic T
Iymphocytes (CTLs) during primary infection demonstrated by rapid
selection of CTL escape virus. Nature Med.
3:205-211.) y los macacos infectados por VIS (Allen,
1. M., O. C. DH, P. Jing, J. L. Dzuris, B. R. Mothe, 1. U. Vogel,
E. Dunphy, M. E. Liebl, C. Emerson, N. Wilson, K. J. Kunstman, X.
Wang, D. B. Allison, A. L. Hughes, R. C. Desrosiers, J. D. Altman,
S. M. Wolinsky, A. Sette, y D. 1. Watkins. 2000.
Tat-specific cytotoxic T Iymphocytes select for SIV
escape variants during resolution of primary viraemia. Nature. 407:
386-90); los ratones SCID poblados con PBMC de
voluntarios inyectados con Virus de Vaccinia (VV) recombinante de
VIH-1 se protegieron contra la exposición en la
ausencia de anticuerpos neutralizantes (Van Kuyk R, Torbett B,
Gulizia R et al, Human CTL specific for the nef protein of
HIV protect hu-PBL-SCID mice from
HIV infection. AIDS Res Hum Retroviruses, 1993; 9 (supl 1:S77); una
proporción significativa de personas no infectadas expuestas
muestran respuesta inmune celular específica para las proteínas de
VIH, esto es verdad para las personas profesionales del sexo
Africanas (Rowland-Jones SL, J Sotton, K Ariyoshi, T
Dong, F Gotch, s McAdams, D Whitby, S Sabally, A Gallimore, T
Corrah, M Takiguchi, T Schltz, A McMichael, H Whittle. 1995.
HIV-specific cytotoxic T cells in
HIV-exposed but uninfected Gambian women. Nature
Medicine, 1: 59-64) y niños nacidos de madres
seropositivas (Rowland-Jones SL, DF Nixon, MC
Aldhous, F Gotch, K Aroyoshi, N Hallam, JS Kroll, K Froebel, A
McMichael. HIV specific cytotoxic T- cell activity in an HIV-
exposed but uninfected infant. Lancet, 1993, 341:
860-861). De manera adicional a largo plazo ningunos
de los que progresan muestran una fuerte respuesta de CTL (Cao, Y,
Qin L, Zhang 1, Safrit J y Ho DD, New Engl J Med, 1995, 332:
201-208; Riviere Y, McChesney MB, Porrot E, et
al. AIDS Res Hum Retroviruses, 11: 903-990); y
el tipo de clase I de HLA ha estado asociado a la velocidad de
progresión de enfermedad en los individuos infectados con
VIH-1 (Carrington, M., G. W. Nelson, M. P. Martin,
1. Kissner, D. Vlahov, J. J. Goedert, R. Kaslow, S. Buchbinder, K.
Hoots, y O. B. SJ. 1999. HLA and HIV-1: heterozygote
advantage and B*35-Cw*04 disadvantage. Science.
283: 1748-52). Las respuestas de CTL precede a los
anticuerpos neutralizantes en la infección natural y ha estado
asociada al control de viremia en infección aguda (Koup RA, Safrit
JT, Cao Y, et al, Temporal association of cellular immune
responses with the initial control of viremia in primary human
immunodeficiency syndrome, J Virol, 1994; 68:
4650-4655) y la progresión a SIDA se correlaciona en
gran medida con la alteración de CTL (Harrer T, Harrer E, Kalams S,
Elbeik T, Staprans S, Feinberg MB, Cao Y, Ho DD, Yilma T, Caliendo
A, Jonson RP, Buchbinder S, y Walker B.
HIV-specific CTL-response in healthy
long-term asymptomatic HIV infection. AIDS Res Hum
Retroviruses, 1996, 12, 7: 585-592). Finalmente las
vacunas que inducen las respuestas de células T CD8+ pueden afectar
de manera favorable los resultados de la infección en modelos de VIS
de infección de VIH (Barouch, D. H., S. Santra, J. E. Schmitz, M.
J. Kuroda, 1. M. Fu, W. Wagner, M. Bilska, A. Craiu, X. X. Zheng,
G. R. Krivulka, K. Beaudry, M. A. Lifton, C. E. Nickerson, W. L.
Trigona, K. Punt, D. C. Freed, L. Guan, S. Dubey, D. Casimiro, A.
Simon, M. E. Davies, M. Chastain, 1. B. Strom, R. S. Gelman, D. C.
Montefiori, M. G. Lewis, E. A. Emini, J. W. Shiver, y N. L. Letvin.
2000. Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus
monkeys by cytokine-augmented DNA vaccination.
Science. 290: 486-92; Gallimore, A., M. Cranage, N.
Cook, N. Almond, J. Bootman, E. Rud, P. Silvera, M. Dennis, T.
Corcoran, J. Stott, A. McMichael, y F. Gotch. 1995. Early
suppression of SIV replication by CD8+ nefspecific cytotoxic T cells
in vaccinated macaques. Nature Med. 1:
1167-1173.).
Todo este conjunto de hallazgos experimentales
sugieren en gran medida que las estrategias y profilácticas deben
incluir la inducción/conservación/restauración de este brazo de la
respuesta inmune como al menos uno de sus objetivos.
Se han desarrollado diferentes metodologías para
general los CTL en animales o seres humanos. La más eficaz hasta
ahora ha sido los vectores vivos recombinantes. Este procedimiento
usa virus o bacterias inofensivos para transportar genes
seleccionados del patógeno en las células del receptor para producir
ahí los antígenos seleccionados. Este procedimiento de
administración de gen en las células maximiza el procesamiento de
los epítopes de CTL y su presentación por moléculas de
MHC-I y posteriormente la estimulación eficaz de los
clones de CTL en el
huésped.
huésped.
Los virus que se han usado con más éxito como
vectores han sido los poxvirus (Familia Poxviridae). El miembro
mejor conocido de esta familia es el Virus Vaccinia (VV), que se usa
en gran medida en seres humanos durante una campaña de erradicación
de la viruela.
Se han llevado a cabo varios ensayos clínicos
con recombinante W para las proteínas de VIH (Corey L, McElrath J,
Weihold K, Matthewa T, Stablein D, Grahm B, Keefer M, Schwartz D,
Gorse G. Cytotoxic T Cell and Neutralizing Antibody Responses to
Human Immunodeficiency Virus Type 1 Envelope with a combination
vaccine regimen. J Infectious Dis, 35 1998, 177:
301-9; Graham BS, Matthews TJ, Belshe R, Clements
ML, Dolin R, Wright PF, Gorse GJ, Schwartz DH, Keefer MC, Bolognesi
DP, Corey L, Stablein D, Esterlitz JR, Hu SL, Smith GE, Fast P, Koff
W, J Infectious Dis, 1993, 167: 533-7). Sin embargo
VV tiene dos limitaciones principales para uso humano: (1) un
pequeño porcentaje de personas vacunadas mostraron fuertes
reacciones adversas que pueden ser letales en el caso de individuos
comprometidos inmunes (2) personas con historia previa de vacunación
de VV responden de manera pobre contra los antígenos
heterólogos.
Una solución a estos inconvenientes es ha sido
el uso de Avipoxvirus en lugar de W. Estos son miembros de la
familia poxvirus pero su replicación se restringe a células aviares
y su ciclo de replicación es abortivo en células humanas. Se han
usado dos Avipoxvirus con estos propósitos: Virus de la viruela de
canarios (CPV) y virus de la viruela aviar (FPV).
Los Avipoxvirus recombinantes para diversos
patógenos humanos de antígenos asociados a tumores inducen respuesta
de los CTL en animales (Limbach KJ, y E Paoletti. 1996.
Non-replicating expression vectors: applications in
vaccines development 45 and gene therapy. Epidemiol. Infect. 116:
241-256). y terapia génica Epidemiol. Infect 116:
241-256). El uso de Avipoxvirus recombinante para el
desarrollo de vacuna se ha patentado en los Estados Unidos
(Paoletti E y cols. 1992 US5174993, Paoletti E et al.. 1993
documento US5505941) y específicamente una solicitud de patente en
el uso de apoxivirus recombinantes para los antígenos lentivirales
se han presentado en Europa (Paoletti E et al., Documento
EP0956360).
\newpage
Un CPV recombinante para gag.pol y
env de VIH-1 se han evaluado en los ensayos
de la Fase I y II en voluntarios sanos
(Clements-Mann ML, KWeinhold, TJ Matthews, BS
Graham, GL Gorse, MC Keefer, MJ McElrath, R-H
Hsieh, J Mestecky, S Zolla-Pazner, J Mascola, D
Schwartz, R Siliciano, L Corey, PF Wright, R Belshe, R Dolin, S
Jackson, S Xu, P Fast, MC Walker, D Stablein, J-L
Excler, J Tartaglia, A-M Duliege, F Sinangil, E
Paoletti. 1998. Immune responses to Human Immunodeficiency Virus
(HIV) Type 1 induced by Canarypox expressing HIV-1
MN gp120, HIV-1 SF2 recombinant gp120, or both
vaccines in seronegative adults. J Infect Dis 177:
1230-1246; Egan MA, WA Pavlat, J Tartaglia, E
Paoletti, KJ Weinhold, ML Clements, RF Siliciano. 1995. Induction
of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (H IV-1) -
specific cytolytic T Iymphocyte responses in seronegative adults by
a nonreplicating,
host-range-restricted canarypox
vector (ALVAC) carrying the HIV-1MN env gene. J
Infect Dis 171: 1623-1627). Los CTL contra al menos
un antígeno de VIH se reseñaron en el 50% de personas vacunadas en
un ensayo de Fase I, 30% en un ensayo de Fase II y menos de 10% en
el último ensayo de Fase I en Uganda. Este CPVr (vCP205) se creó
mediante la inserción de los genes de VIH en tres regiones
diferentes no esenciales en el genoma para lograr una respuesta de
CTL contra más de una diana de VIH.
Por otra parte FPV también se ha usado para
inducir una respuesta de CTL en macacos contra los antígenos de VIH
en combinación con la inmunización de ADN (Robinson HL, DC
Montefiori, RP Johnson, KH Manson, ML Kalish, JD Lifson, TA 5
Rizvi, S Lu, S-L Hu, GP Mazzara, DL Panicali, JG
Herndon, R Glickmanm, MA Candido, SL Lydy, MS Wyand y HM McClure.
1999. Nature Medicine, 5: 526-534). Esta combinación
de inmunógenos proporciona algún nivel de protección en el modelo
de infección de nemestrina de macacos con VIH-1
(Kent SJ, AZhao, SJ Best, JD Chandler, DB Boyle, IA Ramshaw.
Enhanced T-Cell immunogenicity and protective
efficacy of a human immunodeficiency virus type 1 vaccine regime
consisting of a consecutive priming with DNA and boosting with
recombinant fowlpox virus. 1998. J Virol, 72:
10180-10188). Sin embargo el modelo animal presenta
importantes limitaciones ya que la infección de VIH en M
nemestrina es ineficaz y dificulta que se reproduzca.
Se ha reseñado también la generación de una
respuesta de CTL a través de la inmunización con minigenes
compuestos de una serie de epítopes de CTL exactos de varios
patógenos (Whitton, L, Sheng N, Oldstone MB, y McKee T.A "string
of beads" vaccine, comprising linked minigenes, confers
protection from lethal-dose virus challenge, J
Virol, 1993, 67, 1: 348-352;
Ling-Ling An y J. Lindsay Whitton, A multivalent
minigene vaccine, containing B-cell, cytotoxic
T-Lymphocyte and Th epitopes from several microbes,
induces appropriate responses in vivo and confers protection
against more than one pathogen. J Virol, 1997, 71, 3:
2292-2302).
El recombinante de Vaccinia Ankara modificado
(MVA) para un minigen derivado de gag conjuntamente con el gen gag
completo se ha usado para inducir una respuesta de CTL en ratones
(Hanke T, RV Samuel, TJ Blanchard, VC Neumann, TM Allen, JE Boyson,
SA Sharpe, N Cook, GL Smith, DI Watkins, MP Cranage, AJ McMichael.
1999. Effective induction of simian immunodeficiency
virus-specific cytotoxic T Iymphocytes in macaques
by using a multiepitope gene and DNA primeModified Vaccinia Virus
Ankara boost vaccination regimen. J Virol, 73, 9:
7524-7532). Esos minigenes constan de una hebra de
epítopes de CTL discretos de gag.
La principal limitación del planteamiento del
minigen es que la combinación de los epítopes de CTL individuales
solamente cubren un intervalo limitado de antígenos de HLA y por lo
tanto la respuesta de CTL inducida está por definición demasiado
restringida.
\vskip1.000000\baselineskip
La esencia de la presente invención es la
construcción de los genes quiméricos compuesta por las regiones
ricas en epítopes de las proteínas de VIH, donde las regiones se
seleccionan entre tanto las proteínas conservadas internas como las
proteínas reguladoras expresadas muy tempranamente en del ciclo de
vida viral.
La solución tiene ventajas sobre los minigenes
de VIH descritos debido a que permite el procesamiento simultáneo
de los epítopes de superposición de CTL presentados por muchos
alelos de HLA. Otra ventaja de esta solución en comparación con
otro apoxivirus recombinante para varias proteínas de
VIH-1 es que la concentración de regiones
inmunológicamente relevantes de varias proteínas en un solo gen
facilita la generación de virus recombinantes, y evitan la
necesidad de usar varios sistemas de resistencia a antibióticos en
el mismo virus recombinante. De manera adicional facilita la
combinación de epítopes de varios subtipos de VIH en un único virus
recombinante. Las regiones elegidas pertenecen a la mayoría de las
proteínas virales conservadas y a productos reguladores expresados
de manera temprana. Esas regiones ricas en epítopes de CTL se
combinan con epítopes de células T auxiliares conservadas
flanqueadas por dos lisinas para facilitar su procesamiento mediante
proteasas celulares. Finalmente se añade un epítope de células B,
reconocido por un anticuerpo monoclonal, para facilitar la detección
del polipéptido mediante técnicas inmunoquímicas.
El gen quimérico se ensambla mediante la unión
conjuntamente con fragmentos de ADN diferentes, algunos de ellos
generados mediante la síntesis química y otros amplificados por la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los genes de VIH
como moldes. Los fragmentos de ADN se clonan conjuntamente en un
vector plásmido apropiado, secuenciado y traducido a un vector de
recombinación de poxvirus.
Más particularmente esta invención se refiere
ala gen cr3, que contiene epítopes de células Th de proteínas
VIH-1 gp 120, gp41 y Vpr, el epítope sobre el bucle
V3 de gp 120 reconocido por Mab 2C4 (Duarte CA, Pérez L, Vázquez J,
Duenas M, Vilarubia OL, Navea L, Valdés R, Reyes O, Montero M, Ayala
M, y Gavilondo J. Epitope mapping, V region DNA sequence, and
neutralizing Fab fragments of two monoclonal antibodies against the
HIV-1 V3 loop. Immunotechnology 1996, 2:
11-20) y las regiones ricas en epítopes en las
proteínas RT, Gag y Nef.
Los genes quiméricos se insertan en el genoma de
un vector vivo bacterial o viral (por ejemplo, poxvirus,
herpesvirus, alfavirus, poliovirus, adenovirus, BCG, Salmonella),
siendo este vector preferiblemente un poxvirus, y todavía más
específicamente un avipoxvirus e incluso más específicamente FPV.
Los virus vivos recombinantes se usan para inducir una respuesta
inmune de TH1 y células T citotóxicas contra VIH en animales o seres
humanos.
Incluso más específicamente esta invenciones
refiere a FPv recombinante para las proteínas quiméricas y
particularmente a las cepas de FPV recombinantes denominadas FPCR3
y FPSCR3gpt, que contiene el gen quimérico cr3. una vez ensamblado
como se ha descrito anteriormente cr3 se clona en un vector
de recombinación de poxvirus, en particular un vector de
recombinación de FPV. En este caso particular se usaron los
plásmidos pEFL29 y pFP67xgpt como vectores de recombinación. pEFL29
presenta regiones homólogas al fragmento terminal de 6 kb BamHI del
genoma de FPB, que flanquea la unidad de transcripción, en la que el
gen heterólogo se inserta en el control del promotor VV 7,5 K, y
contiene también el gen indicador lacZ en el control del promotor 4b
de FPV. pFP67xgpt emplea 6 y 7 marcos abiertos de lectura de la
región BamHi de 11,2 kb como señales de recombinación homólogas.
Esas regiones flanquean la unidad de transcripción en la que el gen
heterólogo se coloca en el promotor E/L poxviral sintético y
también contiene el gen gpt que confiere resistencia a ácido
micofenólico que permite la selección de virus recombinantes.
Los plásmidos resultantes se denominaron pFPCR3
y pFPSCR3gpt respectivamente. Los plásmidos se transfectan en un
primer cultivo de Fibroblastos de Embriones de pollo (CEF) usando
una de las varias técnicas de transfección disponibles en la
técnica. En este caso particular la transfección se lleva a cabo
usando lipofectina (Sigma, Estados Unidos) en CEF infectados
previamente con la cepa FP29 de FPV pero se pueden usar otros
procedimientos tales como electroporación y DEAE dextrano, entre
otros. Como resultado de la recombinación homológa entre entre
plásmido y las regiones no esenciales correspondientes del genoma de
FPV, se pueden recuperar virus recombinantes que expresaban la
galactosidasa B en el caso de pFPCR3 o resistente al ácido
micofenólico en el caso de pFPSCR3gpt. La presencia del marcador de
selección permite la identificación de placas virales recombinantes
y su purificación mediante varios pases sobre CEF. La presencia del
gen heterólogo sobre los virus seleccionados se puede verificar
mediante PCR y la expresión de la proteína se puede verificar
mediante transferencia de Western.
La invención se refiere también al uso del FPV
recombinante, obtenido como se ha descrito, para inducir una
respuesta de TH1 inmune con actividad de CTL en ratones Balb/c solos
o en combinación con una formulación farmacéuticamente aceptada
seleccionada entre los que se conocen en la técnica.
Esta invención se refiere también a una
combinación terapéutica o preventiva de FPV recombinante para los
genes quiméricos descritos, y particularmente FPCR3 y FPSCR3gpt, con
inmunomoduladores o adyuvantes en particular con titoquinas tales
como IL-2, IL-12, IFN\gamma,
GMSCF, GSCF, entre otros, que estimulan preferentemente la respuesta
inmune de TH1.
En particular se refiere a una combinación de
los virus de FPCR3 y FPSCR3gpt con dosis diarias de IL2 en un
intervalo entre 10^{2} y 10^{7} IU en animales o seres humanos.
La administración diaria de IL2 a ratones Balb/c comenzando el día
de la administración del FPV o más tarde potencia la respuesta
inmune celular contra CR3.
Aunque se refiere en particular a CR3, está en
la esencia de esta invención que también se pueden usar los
fragmentos ricos en CTL diferentes de aquellos en CR3 o los
fragmentos equivalentes a aquellos en CR3 pero de otros aislamientos
de VIH-1.
De manera similar, aunque se refiere en
particular a la cepa FP9 de FPV, está en la esencia de esta
invención que otras cepas parentales de FPV se pueden usar para
construir los virus recombinantes, así comootros apoxivirus tal
como CPV, otros poxvirus tales como VV o MVA o incluso otros virus
tales como herpesvirus, alfavirus, adenovirus, poliovirus o incluso
bacterias tales como BCG o Salmonella.
En otra realización de la presente invención el
gen se puede clonar en un vector de plásmido apropiado para la
expresión en células de mamífero y se inyectan en un mamífero para
inducir una respuesta inmune de TH1 y actividad de CTL en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En todavía otra realización de la invención
también se incluye una combinación terapéutica o preventiva de los
plásmidos recombinantes descritos anteriormente con
inmunomoduladores o adyuvantes como se ha descrito o incluso otros
tales como liposomas, polisacáridos, lipopéptidos, lípidos,
proteoliposomas o sus combinaciones.
En todavía otra realización de la invención esos
genes se pueden clonar en otros plásmidos para la expresión de las
proteínas recombinantes en bacterias, levaduras, hongos, células de
insecto o de mamífero, plantas o en la leche de animales no
transgénicas no humanas. Las proteínas recuperadas de estos sistemas
también se pueden usar para inducir una respuesta inmune de TH1 y
actividad de CTL en animales o seres humanos cuando se administran
en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Todavía otra realización de la invención incluye
combinaciones terapéuticos o preventivas de la proteína CR3 con
inmunomoduladores o adyuvantes tal como se ha descrito anteriormente
o incluso otros tales como liposomas, polisacáridos, lipopéptidos,
lípidos, proteoliposomas u otros adyuvantes disponibles de acuerdo
con la técnica capaces de potenciar la respuesta inmune de tipo TH1
y actividad de CTL en animales o seres humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Plásmido pEL-cr3, para
la recombinación homóloga en la viruela aviar usando el
ORF-1 de la región terminal de 6 Kb de BamHI como
sitio de inserción. El gen cr3 está bajo el control del promotor VV
p7,5 K y el gen indicador LacZ bajo el promotor de FPV 4b.
Figura 2. Plásmido FP67xgpt, para la
recombinación homóloga en FPV usando la región de ADN entre
ORF-6 y ORF-7 del fragmento de 11,2
Kb de BamHI como sitio de inserción. El gen cr3 se coloca bajo el
control del promotor sintético E/L y el gen Ecogpt bajo el
promotor de W 7,5 K.
Figura 3. (A) PCR y (B) transferencia de Western
de tres FPV recombinantes de cr3 independientes: (1) FPCR3.1; (2)
FPCR3.2; (3) FPCR3.3; (4) FLP29.4; (5) marcador del peso molecular
de ADN.
Figura 4. (A) PCR con oligonucleótidos internos
de cr3 (B) transferencia de Western de tres FPV recombinantes
de cr3 independientes (1) FPSCR3GPT.1; (2) FPSCR3GPT.2; (3)
FPSCR3GPT.3; (4) virus parental; (5) Marcador de peso molecular.
Figura 5. Estabilidad de la expersión de CR3
determinada mediante transferencia de Western. Las calles
representan tres muestras independientes de FPV infectadas con
FPSCR3GPT de la reserva viral (1,2,3) o purificadas mediante lecho
de sacarosa (4,5,6). La calle 7 representa los CEF infectado con el
virus parental.
Figura 6. Se produce a partir dos experimentos
independientes ELlSPOT usando esplenocitos de ratones inmunizados
con células FPSCR3gpt y P815 cargadas con el péptido 32 o infectados
con VV recombinante para CR3, Gag o Nef. Los resultados se expresan
como número de células que segregan IFN gamma por 10^{6}
esplenocitos. Los valores de los controles negativos
correspondientes (P815 solo o infectado con VV WR) se han
restado.
Figura 7. Experimentos ELlSPOT de IFN gamma
usando esplenocitos de ratones inmunizados con FPCR3 o FPSCR3gpt y
P815 transfectados de manera estable con el gen cr3 gene. Los
resultados se expresan como número de células que secretan IFN gamma
por 10^{6} esplenocitos. Los valores de los controles negativos
(P815 parental) se han restado.
Figura 8. Reconocimiento de células B autólogas
infectadas con VVCR3 por linfocitos T de pacientes con SIDA. Los
resultados de un IFNy ELlSPOT se expresan como el número de células
que secretan IFN gamma por 10^{6} de células mononucleares de
sangre periférica.
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cr3 es un gen quimérico ensamblado por
fragmentos de diferentes genes de VIH. Se ensambló sobre plásmido
pTAB11, que es esencialmente igual a pTAB9 (Gómez CE, Navea L,
Lobaina L, Dubed M, Expósito N, Soto A y Duarte CA. El Polipéptido
TAB9 Multi-Epítope basado en el bucle he V3
adyuvantado con Montanide ISA720 es altamente inmunogénico en
primates no humanos e Induce anticuerpos neutralizantes contra cinco
aislamientos de VIH-1. Vaccine 17:
2311-2319, 1999), pero tiene los epítopes de células
auxiliares T T1 y T2 T de gp120 en el extreme del terminal 5' del
gen en lugar del fragmento que codifica la parte
N-terminal de la proteína P64K. Un fragmento de ADN
sintético de 186 pares de bases blunt-BamHI que
codifica el epítope T2 de gp120, el V3 epítope de la cepa MN, y
epítopes de células auxiliares T de gp41 y vpr, se clonó en pTAB11
previamente digerido por EcoRV-BamHI. Las secuencias
de ADN que codifican dos lisinas consecutivas se insertaron entre
epítopes individuales para facilitar el procesamiento intracelular.
El plásmido resultante se denominó pCR1. Un fragmento de 603 pares
de bases que codifica la proteína p66/p51 (RT) (pos.
2663-3109 de VIH-1 SF2 provirus) se
amplificó mediante PCR usando los cebadores O.2660 y O.2661 (tabla
1). El fragmento de PCR se extrajo de agarosa de bajo punto de
fusión digerido por BglII-EcoRI y subclonado en el
vector pCR1 cortado por BglII-EcoRI para obtenerle
plásmido pCR2 que codifica la proteína CR2. A continuación, un
fragmento de 324 pares de bases, que comprende una secuencia de del
gen nef (pos. 8516-8818 de aislamiento LAI de
VIH-1), se amplificó mediante PCR con los cebadores
O.2660 y O.2663. Finalmente, otro segmento de 267 pares de bases en
el gen gag (pos. 1451-1696 de VIH-1
SF2) se amplificó usando los cebadores O.2664 y O.2665 (tabla 1).
Después, se llevó a cabo una PCR de superposición usando 20 pmol de
los cebadores O.2660 y O.2666 (tabla 1). Se mezcló una cantidad
igual de cada banda (0,47 pmol) en tampón de PCR [KCl 50 mM;
Tris-HCl 10 mM, (pH 8,3), a 25ºC; gelatina 0,001%],
MgCl_{2} 2,5 mM, dNTP 0,2 mM de cada uno y 4 U de Taq Polimerasa,
en un volumen de 50 \mul. Para promover la hibridación de las
bandas mediante los extremos de 9 pares de bases complementarios de
los oligonucleótidos O.2663 y O.2664, la mezcla se calentó primero a
92ºC durante 2 min y después se enfrió a 50ºC. Finalmente, la
temperatura se incremento hasta 72ºC durante 5 min para extender los
segmentos de hibridación. Después, se añadieron 10 \mul de la
anterior reacción a la mezcla de tampón de PCR que contenía 2,5 mM
de MgCl_{2}, 0,2 mM de dNTPs, 20 pmol de O.2662 y 20 pmol de
O.2666 y 4 U Vent poI. en 50 \mul como volumen total. Las
condiciones de amplificación convencionales eran 92ºC durante 2 min,
seguido de 30 ciclos de 92ºC durante 40 seg, 50ºC durante 1 min y
72ºC durante 1 min, y una extensión final a 72ºC durante 5 mino A
continuación, la banda amplificada de nef-p24 de
superposición se purificaron en electroforesis en agarosa de bajo
punto de fisión y digerido con XbaI. Finalmente, la banda anterior
blunt-XbaI se clonó en un vector pCR2 cortado
previamente por NruI-XbaI para obtener el plásmido
pCR3. cr3 codifica por lo tanto una proteína quimérica que
incluye células auxiliares T y epítopes de CTL de gp120, gp41, vpr,
RT, nef y gag presentados mediante un amplio intervalo de antígenos
de HLA (tabla 2).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En pCR3, el gen cr3 se clonó bajo el
control de pTryp, con un sitio a Cial sobre el 5' y el terminador
del gen del fago T4 y un sitio HindIII en 3'. Este plásmido se
digirió con ClaI e HindIII, y se trató con Klenow I obteniendo un
gen r3 con ATG en el extremo 5' y los codones de parada de
traducción en 3'. Este fragmento de ADN se clonó en el vector de
recombinación de poxvirus pEFL29.
pEFL29 tiene el fragmento terminal BamHI de 6Kb
de FPV como regiones no esenciales para la recombinación homóloga
en el genoma de FPV. Este fragmento contiene tres ORF y el ORF1 está
interrumpido. Franqueadas por estas regiones de homología están VV
p7.5K, promotor, seguido de un sitio SmaI y el gen indicador lacZ
bajo el control de del último promotor 4b de FPV. Este plásmido
incluye también el gen de resistencia a kanamicina y un origen
bacteriano de replicación.
PEFL29 se digirió por SmaI, se trató con
fosfatasa alcalina y se ligó con una banda digerida por ClaII
HindIII que contenía el gen cr3. Se seleccionaron varios clones con
cr3 en la orientación derecha con bajo el p7.5K. La cepa
DH5\alpha de E. coli (\Phi80dlacZ\DeltaM15, recA1,
endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rK- mK+), supE44,
relA1, deoR, \Delta (lacZYA-argF)U169) se
usó para la propagación y selección de plásmidos recombinantes en
medio LB que contenía kanamicina (25 \mug/ml). Todas las
manipulaciones genéticas se realizaron de acuerdo con Sambrook y
col (Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A
Laboratory Manual. Seg. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y.)
El ADN secuenciado del clon
pEFL-cr3 (Figura 1), se verificó usando procesador
de secuencia automático (Pharmacia). Este clon se purificó usando
gradiente de CsCI y se usó para transfectar fibroblastos de
embriones de pollo (CEF).
El gen cr3 se amplificó mediante PCR y se
clonó en el vector pMosblue (Amersham, Reino Unido). El plásmido
resultante se denominó pTCR3. pTCR3 se digirió por HpaI/BamHI y la
banda más corta que contenía cr3 se clonó en el vector poxvirus
pFP67xgpt.
pFP67xgpt tiene un fragmento del 11,2 Kb BamHI
de genoma de FPV como una región no esencial de recombinación
homóloga en el genoma de FPV (Tomley F, Binns M, Campwell J,
Boursnell M. Sequence Analysis of an 11.2 Kilobase,
near-terminal, BamHI fragment of fowlpox virus, J
Gen Virol, 1988, 69, 1025-1040). Este fragmento
contiene el marco abierto de lectura 6 y 7 de esta región y la
inserción se produce en la región intergénica. Flanqueadas por
estas regiones homólogas son están un promotor sintético de E/L
(Carroll MW, Moss B. E. coli B-glucoronidase
(GUS) as a marker for recombinant vaccinia viruses, Biotechniques,
1995, 19,3: 352-354), y el gen indicador
Ecogpt bajo el control del promotor 7,5K de VV. Este plásmido
incluye también el gen de resistencia a kanamicina y un origen
bacteriano de replicación.
El plásmido pFP67xgp se cortó por StuI/BamHI y
se ligó con un fragmento de ADN que contenía cr3 derivado de la
digestión por HpaI/BamHI de pTCR3. Se seleccionaron varios clones
con cr3 en la propia orientación bajo el promotor sintético
de E/L (Figura 1). La cepa DH5a de E. coli
(\Phi80dlacZ\DeltaM15, recA1, endA1, gyrA96,
thi-1, hsdR17 (rK- mK+), supE44, relA1, deoR,
\Delta(lacZYA-argF)U169) se usó para
la propagación y selección de plásmidos recombinantes en medio LB
que contenía ampicilina (50 \mug/ml). Todas las manipulaciones
genéticas se realizaron de acuerdo con Sambrook et al. El ADN
secuenciado del clon pFP67xgptct se verificó usando un procesador
de secuencia automático (Pharmacia). Este clon se purificó usando un
gradiente de CsCI y se usó para transfectar
CEF).
CEF).
\vskip1.000000\baselineskip
El FPV parental usado para la generación de
recombinantes era la cepa atenuada de HP-438, que se
derivó de la cepa HP-1 patógena mediante seis pases
consecutivos sobre CEF, dos pases adicionales sobre las membranas
corioalantoicas, y finalmente 438 pases a través de los CEF (Mayr A
y K Malicki. 1966. Attenuierung von virulentem Huhnerpockenvirus in
Zellkulturen und Eigenschaften des attenuierten Virus. Zentralbl.
Veterinaermed. Reihe B 13: 1-13). Un aislamiento
purificado dos veces en placa de HP438 (FP9) se pasó después seis
veces para constituir una reserva de FPV. Las reservas de FPV se
desarrollaron sobre los CEF en medio 199 que contenía 2% de suero de
ternera recién nacida (NBCS).
Los FPV recombinante se generaron mediante
recombinación homóloga entre FP9 y el plásmido pEFL29 o sus
derivados como se ha descrito previamente. Los CEF desarrollados en
matraces de 25 cm^{2} se infectaron con FP9 a una multiplicidad
de infección (m.o.i) de 2 unidades formadoras de placa (pfu)/célula,
2 horas más tarde las células se transfectaron con 10 \mug de
CsCI purificado de ADN de plásmido (pEFL-cr3 o
pFP67xgptctl) usando 20 \mug de Lipofectina (Gibco BRL, Estados
Unidos). Se añadió medio reciente (3 ml de medio 199 que contenía
10% de caldo de triptosa fosfato más 2% de NBCS) y se incubaron las
células a 37ºC en un incubador de CO_{2}. Se añadió medio
reciente de Nuevo después de 24 h, y después las células se
incubaron durante 3 a 4 días adicionales. Después de ese tiempo,
las células se congelaron descongelaron tres veces. Después el
lisado celular se valoró en CEF para determinar los virus
recombinantes selectivos. Después de 2 hrs de adsorción el inóculo
viral se retiró y se añadió una capa de agarosa que contenía EMEN.
Se preparó esta fase mezclando volúmenes iguales de 2% de agarosa
de bajo punto de fusión y EMEN 2X. (Gibco, Grand Island, NY) con 4%
de suero de ternera fetal (Gibco, Grand Island, NY). El día cuatro
eran evidentes placas virales. Se transfectaron los CEF con
pEFL-cr3 se tiñeron mediante la adición de otra capa
de agarosa con 0,33% de Xgal (Melford Laboratories, Reino Unido) a
los cultivos. Las placas de color azul se seleccionaron y se
purificaron tres veces hasta que el 100% de las placas virales eran
positivas para la expresión de galactosidasa B. Las reservas de
virus lacZ+ se amplificaron después en CEF desarrollados en
matraces de 25 cm^{2} en medio 199 que contenía 10% de caldo de
triptosa fosfato más 2% de NBCS. El FPV seleccionado recombinante se
denominó FPCR3.
El medio selectivo para la transfección con el
plásmido pFP67xgptctl contenía ácido micofenólico (25 \mug/ml),
xantina (250 \mug/ml) e hipoxantina (1 \mug/ml). El día cuatro
eran evidentes placas virales. Ya que los genes gpt y cr3
estaban flanqueados por las mismas regiones de homología el
aislamiento de las placas virales en medio selectivo indican que se
produjo recombinación y ambos genes se insertan en el genoma de
FPV. Se purificaron las placas tres veces consecutivas en CEF. El
virus recombinante seleccionado se denominó FPSCR3G PT.
\newpage
Se usó análisis de PCR para comprobar que los
recombinantes de FPCR3 contenían el gen cr3. Los FPV recombinantes
se prepararon en CEF durante 6 días y después las células se
recogieron y se sedimentaron. Se suspendió el gránulo y se incubó
durante 2 h a 55ºC en 200 \mul de tampón de extracción (10 mM de
Tris HCl, 100 mM de NaCl, 10 mM de EDTA, 0,5% de SDS, 2% de
\beta-mercaptoetanol) que contenía 1,25 mg/ml de
proteinasa K. El ADN se extrajo después con
fenol-cloroformo y se precipitó en etanol. El ADN de
cada virus se ensayó mediante PCR con los cebadores descritos más
adelante, complementarios con las secuencias en el 5' y 3' del gen
cr3, respectivamente. Las condiciones de PCR usadas eran 5 min a
94ºC, seguido de 25 ciclos de 1 min a 94ºC, 1 min 30 seg a 45ºC y 1
min 30 seg a 72ºC, y una extensión final a 72ºC durante 10 min. Las
secuencias de los cebadores eran como sigue:
| cebador 775, | 5' TATIAACATIGCCTAGTAG 3' |
| cebador 776, | 5' GAAGTAGAATCATAAAGAAC 3' |
\vskip1.000000\baselineskip
Tres virus recombinantes de CR3 independientes
(FPCR3.1; FPCR3.2; FPCR3.3), mostraron la banda de 1,3kb esperada
después de la reacción de PCR. Esta banda no estaba en el virus
parental FPL29 (Figura 3A).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó análisis de PCR para comprobar que los
recombinantes de FPSCR3GPT contenían el gen cr3. Los FPV
recombinantes se propagaron en los CEF durante 6 días, y después
las células se recogieron y se sedimentaron. El sedimento se
suspendió y se incubó durante 2 h a 55ºC en 200 \muI de tampón de
extracción (10 mM de Tris HCl, 100 mM de NaCl, 10 mM de EDTA, 0,5%
de SDS, 2% de \beta-mercaptoetanol) que contenía
1,25 mg/ml de proteinasa K. El ADN se extrajo después con
fenol-cloroformo y se precipitó en etanol. El ADN de
cada virus se ensayó mediante PCR con los cebadores descritos más
adelante, complementarios con las secuencias en el 5' y 3' del gen
cr3, respectivamente. Las condiciones de PCR usadas eran 5 min a
94ºC, seguido de 25 ciclos de 1 min a 94ºC, 1 min 30 seg a 45ºC y 1
min 30 seg a 72ºC, y una extensión final a 72ºC durante 10 min. Las
secuencias de los cebadores eran como sigue:
| cebador 2660, (257-279) | 5' GAAGATCTGTACAGAAATGGAAAAG 3' |
| cebador 2663, (1029-1059) | 5' CCCTGCATGTGGCTCAACTGGTACTAGCTIG 3' |
\vskip1.000000\baselineskip
Tres virus recombinantes independientes
(FPSCR3gpt.1; FPSCR3gpt.2; FPSCR3gpt.3), mostraron la banda de de
800 pares de bases esperada después de la reacción de PCR. Esta
banda no estaba en el virus parental FPL29 (Figura 4A).
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de CR3 por el FPCR3 se confirmó
mediante transferencia de Western. Se infectaron los CEF confluentes
en placas Petri de 60 mm a 0,5 pfu/célula con FPV recombinantes.
Después de 24 horas se recogieron las células, se sedimentaron y se
suspendieron en tampón de carga de del 1 X SDS (50 mM de Tris HCl pH
6.8, 100 mM de DTT, 2% de SDS, 0,1% de azul de bromofenol, 10% de
glicerol). Se fraccionaron las proteínas mediante electroforesis de
gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida
(SDS-PAGE) sobre un gel al 15%. Después se
electrotransfirieron en una membrana de nitrocelulosa
(Hybond-C, Amersham, Reino Unido) siguiendo
protocolos convencionales. Después de la transferencia, la membrana
se bloqueó durante toda una noche en 5% de leche en polvo no grasa
en solución salina tamponada con fosfato (PBS: 2,68 mM de KCl, 1,47
mM de KH_{2}P0_{4}, 0,137 M NaCl, 8,06 mM Na_{2}HP0_{4}).
Después se incubó durante 2 h a temperatura ambiente con 10 ug/ml de
anticuerpo monoclonal 6.2, diluido en PBS que contenía 1% de leche
en polvo. Este anticuerpo monoclonal se produjo en ratones
inmunizados CR3 (Iglesias E, Ruiz M, Carrazana Y, Cruz LJ, Aguilar
A, Jiménez V, Carpio E, Martínez M, Perez M. Martinez C, Cruz O,
Martín A, Duarte C. Chimeric proteins containing
VIH-1 epítopes. Journal Biochemistry, Molecular
Biology and Biophysics, 2001, 5: 109-20.). La
membrana después se lavó y se incubó con anticuerpo
anti-ratón de oveja (1 : 2000) conjugado a
peroxidasa de rábano picante (HRPO) (Amersham, Reino Unido). Después
de varios lavados, las inmunotransferencias se desarrollaron usando
el sistema de detección de transferencia de Western ECL (Amersham,
Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una
banda específica con un peso molecular entre 50 y 64 kDa se detectó
en cultivos infectados con FPCR3. No se detectó proteína en CEF
infectado con virus FP9 parental (figura 3 B).
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de CR3 por el FPSCR3gpt se confirmó
por transferencia de Western siguiendo un procedimiento similar al
descrito en el ejemplo previo. También se detectó una banda
específica con un peso molecular entre 50 y 64 kDa en cultivos
infectados con FPSCR3gpt mientras no se detectó proteína en CEF
infectado con el virus parental FP9 (figura 4 B).
Se desarrollaron reservas grandes de FPV
recombinante sobre los CEF obtenidos de huevos de una multitud
específica sin patógenos. Se purificó FPV mediante centrifugación
de extractos citoplásmicos a través de un lecho de sacarosa al 25%
(p/v) en un agitador Beckman SW28 a 29000 rpm durante 2 horas.
Después se determinaron las valoraciones de virus mediante ensayo
en placa sobre monocapas de CEF. La Figura 5 muestra que la
expresión de CR3 no variaba después del aumento a escala del
cultivo.
Ratones adultos jóvenes hembras Balb/c (cinco a
ocho semanas de edad) (obtenidos de la colonia de crianza SPF en el
Instituto para la salud animal, Compton, Reino Unido, o el Centro
Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), Cuba)
se cebaron mediante las vías intravenosa (i. v), intraperitoneal (i.
p), o subcutánea (s.c) con 2,5 - 5 x 10^{7} pfu de FPCR3,
FPSCR3gpt o el virus de control negativo en 200 \muI de PBS
estéril. Dos a cuatro semanas más tarde, los ratones se volvieron a
inmunizar por la misma vía con una segunda dosis de 2,5 - 9 x
10^{7} pfu de los mismos virus en 200 \muI de PBS estéril.
Se realizaron ensayos de in inmunotransferencia
ligada a Enzima (ELlSPOT) para la detección de células de
liberación de IFN-\gamma específicas de antígeno
usando un procedimiento basado en la descrita previamente (Tanguay
S y JJ Killion. Direct comparison of ELISPOT and
ELISA-based assays for detection of individual
cytokine-secreting cells. 1994. Lymphokine Cytokine
Res, 13: 259-263). En resumen, placas de 96 pocillos
de membrana immobilon-P (Millipore, Molsheim,
Francia) se recubrieron con 100 \muI/pocillo de 5 \mug/ml de
anticuerpo monoclonal R4 específico de IFN-\gamma
murino (Pharmingen, San Diego, California) durante toda una noche a
4ºC, se lavó 3 X con PBS y se bloqueó usando medio RPMI 1640
suplementado con 10% de FBS a 37ºC durante 1h. Después se añadieron
células de ensayo: éstas eran o bien suspensiones de esplenocitos
ex vivo (preparadas como se ha descrito anteriormente) de
ratones cebados y vueltos a inmunizar con FPCR3 o FPSCR3gpt. Se
añadieron por pocillo diferentes números de células de ensayo:
10^{6}, 2 x 10^{5} y 4 x 10^{4}. Las células se estimularon
mediante la adición de células P815 incubadas con péptidos
sintéticos a 1 \muM o infectadas con recombinante W para CR3, 15
Gag, o Nef a una m.o.i de 5 pfu/célula. Las células P815 sin péptido
o infectadas con virus vaccinia control (vSC8 o la cepa de vaccinia
de tipo salvaje WR) se incluyeron para revelar los números
antecedentes de células que producían IFN-\gamma.
Cada pocillo tenía una concentración final de 200 \mul de medio
R10 más hIL-2. Todas las variables de ensayo se
ensayaron por duplicado. Después de la incubación durante toda una
noche (al menos 17 horas), las placas se lavaron 3 X con PBS y 5 X
con PBS más 0,05% de Tween 20, después un anticuerpo secundario
XMG1.2 conjugado a biotina (Pharmingen, San Diego, California) se
añadió a 0,5 \mug/ml y se hizo reaccionar a temperatura ambiente
durante 2h. Los pocillos se lavaron 5X con PBS más 0,05% de Tween
20, y se añadió estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina (AP)
(Vector Labs, CA, Estados Unidos) a una dilución 1/1000 en PBS más
0,05% de Tween 20 durante 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos
se lavaron de nuevo 3X con PBS más 0,05% de Tween 20 y 3X con PBS, y
se desarrollaron las manchas usando un kit de actividad de AP
(Biorad, CA, Estados Unidos). Después de 15 min, los pocillos se
lavaron con agua potable, se secaron y las manchas se contaron en un
microscopio estereoscópico (Leica Microscopy System, Heerbrugg,
Suiza). Como alternativa, en algunos ensayos los inventores
estreptavidina marcada con HRPO (Amersham, Reino Unido), diluida
1/800; después las manchas se desarrollaron con 0,1% de
3,3'diaminobencidina (Sigma, Saint Louis, Estados Unidos) en
Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 y 0,1% de peróxido de
hidrógeno. Los resultados se expresaron como el número de células
formadoras de mancha (SFC) por 10^{6} esplenocitos o células
fraccionadas. Los valores de más de dos veces el control negativo
para cada grupo (P815 sin péptido o infectado con control W) se
consideraron positivos.
Los resultados de dos ensayos independientes de
ELlSPOT se muestran en la Figura 6. Una fracción significativa de
esplenocitos de ratones Balb/c inmunizados con FPCR3 pero no con
virus negativo era positivo en ELlSPOT de IFN gamma contra P815
infectados con o bien WCR3 o Wgag y Wnef o cebados con los péptidos
V3 MN (LKKKRIHIGPGRAFYERY).
En otro experimento los ratones Balb/c se
inmunizaron con FPCR3 o FPSCR3gpt como se ha descrito y la inducción
de los CTL se midió usando un P815 transfectado establemente con cr3
(P815cr3). Los resultados de este experimento se muestran en la
figura 7. Ambos FPV recombinantes inducían una fracción
significativa de células que secretan IFB gamma específicas para
CR3.
\vskip1.000000\baselineskip
Células B autólogas de pacientes infectados con
VIH se transformaron por EBV y se infectaron con un recombinante de
VV para CR3 (VVCR3). Las células diana se incubaron con linfocitos
de sangre periférica de pacientes con VIH y se calculó el número de
esplenocitos que secretan IFN-\gamma mediante
ELlSPOT. Este experimento demostró que el gen cr3 expresado por
poxvirus es capaz de presentar de manera eficaz sus epítopes para
los linfocitos de CTL de pacientes infectados con VIH.
<110> CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA y
BIOTECNOLOGÍA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POXVIRUS RECOMBINANTES PARA
PROTEINAS QUIMERICAS DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA
\vskip0.400000\baselineskip
<130> poxvirus
\vskip0.400000\baselineskip
<150> CU 2001-0057
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
28-02-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (27)
1. Un gen quimérico que contiene fragmentos de
diferentes genes de VIH-1, en el que dichos
fragmentos codifican los epítopes de células T citotóxicas (CTL) de
superposición, que se presentan mediante un amplio intervalo de
antígenos de Complejo de Histocompatiblidad Principal
(HLA-1), codificando dichos fragmentos opcionalmente
además epítopes de células T auxiliares (Th) de VIH y al menos un
epítope de células B que es la diana de un anticuerpo monoclonal
(Mab).
2. Un gen de acuerdo con la reivindicación 1 que
codifica una poliproteína quimérica que contiene fragmentos de al
menos una proteína estructural de VIH y una proteína no estructural
de VIH.
3. Un gen de acuerdo con la reivindicación 2 que
codifica una poliproteína quimérica que contiene fragmentos de las
Proteínas de VIH-1 Transcriptasa Inversa, P24 y Nef,
los epítopes de gp120, gp41 y vpr y un epítope de células B de
gp120.
4. Un gen de acuerdo con la reivindicación 3 que
codifica una poliproteína quimérica que contiene los fragmentos
203-259 de la Transcriptasa Inversa,
219-307 de P24, y 45-147 de Nef,
epítopes de células Th T1 y T2 de gp120, 580-594 de
gp41 y 566-580 de vpr y un epítope de células B de
de la región V3 de la cepa MN reconocida por Mab 2C4.
5. Un gen de acuerdo con la reivindicación 4,
que tiene una secuencia de ADN que se corresponde esencialmente con
la del gen cr3, SEQ ID NO.1.
6. Una proteína quimérica que tiene una
secuencia de aminoácidos que se corresponde esencialmente con la
secuencia de la proteína CR3 codificada por el gen cr3, SEQ ID NO
1.
7. Un virus recombinante para un gen heterólogo,
que contiene fragmentos de diferentes genes de
VIH-1, en el que dichos fragmentos codifican los
epítopes de CTL de superposición, que se presentan mediante un
amplio intervalo de antígenos de HLA-1, codificando
dichos fragmentos opcionalmente además epítopes de células T
auxiliares de VIH-1 y al menos un epítope de células
B reconocido por un Mab.
8. Un virus recombinante de acuerdo con la
reivindicación 7 en el que el gen heterólogo codifica una proteína
quimérica que contiene fragmentos de al menos una proteína
estructural de VIH y una proteína no estructural de VIH.
9. Un virus recombinante de acuerdo con la
reivindicación 8 en el que el gen heterólogo codifica una proteína
quimérica que contiene fragmentos de proteínas de
VIH-1 RT, P24 y Nef, epítopes Th de gp120, gp41 y
vpr y un epítope de células B de gp120.
10. Un virus recombinante de acuerdo con la
reivindicación 9 en el que el gen heterólogo codifica una proteína
quimérica que contiene los fragmentos 203-259 de RT,
219-307 de P24, y 45-147 de NEF y
los epítopes de células Th T1 y T2 de gp120, 580-594
de gp41 y 566-580 de vpr y epítope de células B de
la región V3 de la cepa MN reconocida por Mab 2C4.
11. Un virus recombinante de acuerdo con la
reivindicación 10 en el que la secuencia de ADN del gen heterólogo
corresponde esencialmente a cr3, SEQ ID NO.1.
12. Un virus de acuerdo con las reivindicaciones
7-11 en el que el virus es un poxvirus.
13. Un virus de acuerdo con las reivindicaciones
7-12 en el que el virus es un Avipoxvirus.
14. Un virus de acuerdo con las reivindicaciones
7-13 en el que el virus es un Virus de la viruela
aviar.
15. Un virus de acuerdo con las reivindicaciones
7-14 en el que el virus es FPCR3, un Virus de la
viruela aviar que comprende el gen cr3.
16. Un virus de acuerdo con las reivindicaciones
7-14 en el que el virus es FPSCR3gpt, un Virus de la
viruela aviar que comprende el gen cr3 y el gen gpt.
17. Una formulación de vacuna que contiene un
virus recombinante de acuerdo con las reivindicaciones
7-16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Uso del virus recombinante de acuerdo con
las reivindicaciones 7-16 para la fabricación de una
vacuna para inducir una respuesta inmune contra VIH en pacientes de
SIDA o personas no infectadas.
19. Una combinación preventiva o terapéutica
compuesta de la formulación de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 17 y una sustancia inmunopotenciadora.
\newpage
20. Una combinación preventiva o terapéutica de
acuerdo con la reivindicación 19 en la que la sustancia
inmunopotenciadora es una citoquina.
21. Una combinación preventiva o terapéutica de
acuerdo con la reivindicación 20 en la que dicha citoquina es
IL2.
22. Un vector de plásmido que contiene un gen
quimérico de acuerdo con las reivindicaciones 1-5
bajo el control de un promotor de células de mamífero.
23. Una formulación de vacuna que contiene un
vector de plásmido recombinante de acuerdo con la reivindicación 22
y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
24. Uso de un vector de plásmido recombinante de
acuerdo con la reivindicación 22 para la fabricación de una
formulación de vacuna para inducir una respuesta inmune contra
diferentes proteínas de VIH en pacientes de SIDA o personas no
infectadas.
25. Una combinación preventiva o terapéutica
compuesta de la formulación de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 23 y una sustancia inmunoprotectora.
26. Una combinación preventiva o terapéutica de
acuerdo con la reivindicación 25 en la que la sustancia
inmunoprotectora es una citoquina.
27. Una combinación preventiva o terapéutica de
acuerdo con la reivindicación 26 en la que dicha citoquina es
IL2.
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