JP2005517639A - ワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は、1種又は複数の野生型FPV遺伝子に改変を有する鶏痘ウイルスゲノムに関する。本発明はまた、かかるゲノムを含むウイルス粒子及び目的とするヌクレオチド(NOI)を標的細胞に送達するためのその使用に関する。本発明はまた、ワクチン接種法、詳しくは、疾病を治療及び/又は予防するために、初回抗原刺激組成物(第1の非複製ウイルスベクターを含む)と追加免疫組成物(第2の非複製ウイルスベクターを含む)とを患者に投与することを含む方法に関する。
Description
本発明はポックスウイルスに関する。詳しくは、本発明は、1種又は複数の野生型FPV遺伝子に改変を有する、鶏痘ウイルスゲノム、かかるゲノムを含むウイルス粒子、及び目的とするヌクレオチド(「NOI」)を標的細胞に送達するためのその使用に関する。
本発明はまた、ウイルスベクターを用いるワクチン接種法、詳しくは、2種の異なる非複製ウイルスベクター組成物を用いる異種プライム−ブーストワクチン接種レジメンに関する。
ポックスウイルス
ポックスウイルスは、これまで外来タンパク質の異種発現用組換えベクターとして利用されてきた。詳しくは、組換えワクシニアウイルスが、哺乳類細胞において遺伝子を一過的に発現させるためのツール及び実験用組換えワクチンベクターとして研究されている(Moss、1991、Proc Natl Acad Sci USA 93、11341〜8頁及びMoss、1996、Proc Natl Acad Sci USA 93、11341〜8頁に概説されている)。
ポックスウイルスは、これまで外来タンパク質の異種発現用組換えベクターとして利用されてきた。詳しくは、組換えワクシニアウイルスが、哺乳類細胞において遺伝子を一過的に発現させるためのツール及び実験用組換えワクチンベクターとして研究されている(Moss、1991、Proc Natl Acad Sci USA 93、11341〜8頁及びMoss、1996、Proc Natl Acad Sci USA 93、11341〜8頁に概説されている)。
その他のポックスウイルスと共通して、ワクシニアウイルスは細胞の細胞質内に存在し、そこでウイルス複製に必要なタンパク質を発現する。したがって、組換えワクシニアは、外来抗原を哺乳類細胞の細胞質に送達することができ、それによって、抗原処理経路への直接アクセスが可能となり、この結果、MHCクラスI及びクラスII分子と関連して、細胞表面に抗原由来ペプチドが提示される(Moss、1991、Proc Natl Acad Sci USA 93、11341〜8頁)。この性質のためにワクシニアは、特に、CD8+及びCD4+T細胞免疫応答を刺激するための組換えワクチンとして有用である。
ワクシニアウイルスの、哺乳類細胞において複製する能力に関して懸念があるため、その臨床使用は制限されており、より安全な代替物が探索されることとなった。これらとしては、ヒト細胞における複製が制限された(Blanchardら、1998、J Gen Virol 79、1159〜67頁)、弱毒ワクシニアウイルス、例えば、改変ワクシニアアンカラ(Ankara)(MVA)(Meyerら、1991、J Gen Virol 72、1031〜8頁、Sutter及びMoss、1992、Proc Natl Acad Sci USA 89、10847〜51頁、Sutterら、1994、Vaccine 12、1032〜40頁)、哺乳類細胞では増殖しない(Somogyiら、1993、Virology 197、439〜44頁)、アビポックスウイルス、例えば、鶏痘が挙げられる。
トリでは稀に致死性となる、増殖性皮膚病変を引き起こす野生型鶏痘ウイルスは、家畜産業では、商業上の懸念事項である。鶏痘ウイルスに対する弱毒生ワクチンが、トリ細胞でウイルスを複数回継代することによって得られている。家畜病原由来の抗原を発現するこのような弱毒鶏痘ウイルスが、トリに使用するための組換えワクチンとして広く利用されてきた(Boyle及びHeine、1993、Immunol Cell Biol 71、391〜7頁、Paoletti、1996、Proc Natl Acad Sci USA 93、11349〜53頁に概説されている)。実際、米国では、獣医学で使用するための、ニューカッスル病ウイルス由来の抗原を発現する2種の組換え鶏痘ウイルスが市販されている(Paoletti、1996、Proc Natl Acad Sci USA 93、11349〜53頁)。
アビポックスウイルスは、哺乳類細胞において抗原を発現でき、哺乳類病原に対する保護的免疫応答を誘導できるという知見(Taylor及びPaoletti、1998、Vaccine 6、466〜8頁、Taylorら、1998a、Vaccine 6、504〜8、Taylorら、1988b、Vaccine 6、497〜503頁)から、哺乳類において使用するワクチンとして、組換え鶏痘ウイルスが開発されることとなった。最も重要なことに、HIV由来抗原を発現する組換え鶏痘が、非ヒト霊長類においてワクチンとして効果を発揮している(Daleら、2000、J Med Primatol 29、240〜7頁、Kentら、1988、J Virol 72、10180〜8頁、Kentら、2000、Vaccine 18、2250〜6頁)。さらに、腫瘍関連抗原をコードする組換え鶏痘ワクチンが、動物において評価されており(Grosenbachら、2001、Cancer Res 61、4497〜505頁、Irvineら、1997、J Natl Cancer Inst 89、1595〜601頁、Wangら、1995、J Immunol 154、4685〜92頁)、現在ヒト臨床試験を受けている。
大部分の弱毒鶏痘ワクチン株は、そのゲノム組成及び正確な配列の点では十分に定義されていない。実際、いくつかのゲノムは、最近、トリ細網内皮症ウイルス(REV)のプロウイルスの感染コピーを保持していることがわかり(Hertigら、1997、Virology 235、367〜76頁)、これによって組換えベクターとしてのその使用が制限されることもある。
ポックスウイルス由来ベクターのゲノムの大きさには上限がある。ワクシニアに関しては、効率的にパッケージングされ、送達され得る異種配列の最大の大きさは、ゲノムの大きさの10%であると考えられている。
したがって、哺乳類細胞において複製する能力を欠くが、より特性決定され、T細胞免疫応答の生起の点でより良好であり、異種DNAに適応し、送達する能力が改善され、且つ/又は既知の弱毒鶏痘ワクチン株よりも安全性が改善された、改良ベクター系が必要である。
ワクチン接種法
被験体において、疾病を予防及び/又は治療するために免疫応答を刺激するには、当技術分野で公知の多数の方法がある。ワクチンとして用いられる抗原性製剤の例を以下の表(表1)に示す。
被験体において、疾病を予防及び/又は治療するために免疫応答を刺激するには、当技術分野で公知の多数の方法がある。ワクチンとして用いられる抗原性製剤の例を以下の表(表1)に示す。
その他の種類の抗原をベースとしない免疫化もあり、これには、受動的免疫化(抗体の直接投与)及び非特異的免疫化(サイトカイン又はサイトカイン阻害剤の投与によるなど)が挙げられる。
これらのアプローチの多くに関する問題は、免疫応答が経時的に弱くなり、その結果、例えば、感染を制御又は根絶するにはもはや有効でなくなることである。
ワクチンが、疾病に対して正しい種類の免疫応答を誘導することが重要である。多数の既知のワクチンは、抗体を作製するのに有用であるが、大きな細胞媒介性免疫応答は誘導しない。いくつかの疾病は、T細胞免疫応答による予防及び/又は治療に対して特に感受性がある。例えば、細胞溶解性CD8+T細胞は、ウイルス感染から保護するか、それを排除するのに役立ち得る。また、結核、マラリア及びH.ピロリ(pylori)感染などの疾病の場合には、IFNγを分泌し得るCD4+T細胞の保護的役割に関する証拠がある。
既知のウイルスワクチン接種法では、いくつかの合併症及び副作用を伴うこともある。例えば、天然痘ワクチン接種は、汎発性痘疹、種痘性湿疹、進行性種痘疹並びに神経系及び心臓系の合併症を引き起こすことがある(Feery(1977)Med J.Aust 6 180〜183頁、Goldsteinら(1975)Pediatrics 55 342〜7頁)。
したがって、改良ワクチン接種法、特に、最小の副作用しか引き起こさない、免疫系のT細胞部門を刺激又は追加免疫可能なものが必要である。
本発明者らは、弱毒鶏痘ウイルス株(FP9)の全ゲノム配列を得た。
FP9は、野生型鶏痘ウイルス(FPV)に存在するいくつかの遺伝子を欠く(又はこれらに改変を有する)。FP9のゲノムは266kbpであり、これまでにベクター系として記載されているFPV−M、鶏痘ワクチン株のゲノムよりも小さい(Couparら(1990) Virology 179 159〜167頁)。本発明者らは、FP9は、CD8+T細胞免疫応答を生起するその能力がFPV−Mよりも優れていることを示した。
したがって、本発明は、1種又は複数の以下の野生型FPV遺伝子(Afonsoら(2000)J.Virol 74 3815〜3831頁による遺伝子命名法)の改変型を含む弱毒鶏痘ウイルスゲノムを提供する:
FPV001、FPV018、FPV054、FPV063、FPV066、FPV070、FPV071、FPV093、FPV097/098、FPV115、FPV124、FPV125、FPV127、FPV158、FPV159、FPV160、FPV190、FPV191、FPV207、FPV219、FPV220、FPV221、FPV222、FPV239、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260。
FPV001、FPV018、FPV054、FPV063、FPV066、FPV070、FPV071、FPV093、FPV097/098、FPV115、FPV124、FPV125、FPV127、FPV158、FPV159、FPV160、FPV190、FPV191、FPV207、FPV219、FPV220、FPV221、FPV222、FPV239、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260。
本発明はまた、1種又は複数の前記遺伝子を改変することを含む、鶏痘を弱毒化する方法を提供する。前記遺伝子は、以下に、より詳細に記載されたように改変されることが好ましい。
本発明はまた、大きさが275kbp未満である弱毒鶏痘ウイルスゲノムを提供する。ウイルスによって効率的にパッケージングされ得るゲノムの全長には上限がある。ゲノム自身が小さい場合には、より多量の異種配列を保持できる。
好ましい一実施形態では、弱毒鶏痘ウイルスゲノムは、配列番号1に示された配列を含む。
本発明の弱毒鶏痘ゲノムはまた、目的とするヌクレオチド「NOI」を含む。「NOI」は治療用遺伝子であり得る。
本発明はまた、かかるゲノムを含むウイルス粒子を提供する。ゲノムがNOIを含む場合には、ウイルス粒子がNOIを標的細胞へ送達できることが好ましい。あるいは(又は、さらに)、ウイルス粒子は予め発現されたタンパク質を標的細胞へ到達可能なものであり得る。
本発明はまた、かかるゲノム又はウイルス粒子を含むワクチン、初回抗原刺激剤又は追加免疫剤を提供する。
本発明はまた、非複製ウイルスベクターを含む追加免疫組成物を提供する。好ましい一実施形態では、組成物は、霊長類において、ウシ結核菌(M.bovis)BCGによって初回免疫刺激された免疫応答を追加免疫可能である。
ワクチン接種(及び治療)目的では、免疫応答の発生時には、ワクチンの単回投与よりも複数回投与法がより効果的であることが多い。プライム−ブーストレジメンは同種(同一組成物を2回又は複数回投与する場合)であっても異種であってもよい。
本発明はまた、
(i)FP9鶏痘ウイルス粒子を含む第1の組成物と、
(ii)同時、個別又は逐次投与するための第2の組成物
とを含むワクチンキットを提供する。
(i)FP9鶏痘ウイルス粒子を含む第1の組成物と、
(ii)同時、個別又は逐次投与するための第2の組成物
とを含むワクチンキットを提供する。
初回抗原刺激剤又は追加免疫剤のいずれかがDNAワクチンである異種ワクチン接種レジメンにおけるウイルスベクターの使用は、これまでに認められている(Schneiderら(1998)Nature Medicine 4(4)397〜402頁、Kentら(1998)J.Gen.Virol 72(12)10180〜8頁、Robinsonら(1999)Nature Medicine 5(5):526〜534頁)。
しかし、本発明者らは、まず、2種の異なる非複製ウイルスベクターを用いる異種プライムブーストレジメンが、霊長類におけるT細胞免疫応答の誘導で驚くべきほどに効果的であることを示した。非複製ベクターの使用により、ウイルスの複製に付随して起こる副作用(天然痘など、前記参照)が避けられる。
したがって、本発明はまた、いずれかの順序で逐次投与するための
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物
とを含む、ワクチン接種キットを提供する。
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物
とを含む、ワクチン接種キットを提供する。
好ましい一実施形態では、ワクチン接種キットは、いずれかの順序で逐次投与するための
(i)第1の非複製ポックスウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ポックスウイルスベクターを含む第2の組成物
とを含む。
(i)第1の非複製ポックスウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ポックスウイルスベクターを含む第2の組成物
とを含む。
このキットは、疾病を治療及び/又は予防するための霊長類被験体への投与に適したものであり得る。
本発明のキットでは、第1及び第2の組成物が同一抗原を発現可能であることが好ましい。
本発明はまた、被験体にかかるワクチン、初回抗原刺激若しくは追加免疫組成物又はキットを投与するステップを含むワクチン接種法を提供する。かかる投与は被験体においてT細胞免疫応答を生起するはずである。
ワクチン接種法は、例えば、慢性感染によって、又はそのために起きた疾病、例えば、HIV、マラリア、結核及び東海岸熱を治療又は予防するために使用できる。
本発明の1種又は複数のゲノム、ウイルス粒子、ワクチン、初回抗原刺激剤/組成物、追加免疫剤/組成物、構築物又はキットは、HIVに関係しているか、又は少なくとも一部はHIV由来のものであり、したがって、前記ゲノム、ウイルス粒子、ワクチン、初回抗原刺激剤/組成物、追加免疫剤/組成物、構築物又はキットは、WO02/068654(PCT/CU02/00001に相当する)に開示されたものではない。詳しくは、本発明は、WO02/068654の実施例1などのWO02/068654に記載されたような組換えCR3遺伝子を含まない。
ウイルス及びウイルスベクター
本発明は、非複製ウイルスベクターを用いるワクチン接種レジメンに関する。
本発明は、非複製ウイルスベクターを用いるワクチン接種レジメンに関する。
当技術分野では、標的細胞の感染を介してNOIを送達できる多数のウイルスベクターが知られている。適した組換えウイルスベクターとしては、それだけには限らないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター又はパルボウイルスベクターが挙げられる(Kestlerら 1999 Human Gene Ther 10(10):1619〜32頁)。
レトロウイルスの例としては、それだけには限らないが、マウス白血病ウイルス(MLV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、藤波肉腫ウイルス(FuSV)、モロニーマウス白血病ウイルス(Mo−MLV)、FBRマウス骨肉種ウイルス(FBR MSV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(Mo−MSV)、アベルソン(Abelson)マウス白血病ウイルス(A−MLV)、トリミエロサイトマトシス(myelocytomatosis)ウイルス29(MC29)及びトリ赤芽球症ウイルス(AEV)が挙げられる。
レトロウイルスの詳細なリストは、Coffinら(「Retroviruses」1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press編:JM Coffin、SM Hughes、HE Varmus 758〜763頁)に見ることができる。
ポックスウイルス
好ましい一実施形態では、本発明は、非複製ポックスウイルスベクターを含むワクチン、初回抗原刺激又は追加免疫組成物を提供する。
好ましい一実施形態では、本発明は、非複製ポックスウイルスベクターを含むワクチン、初回抗原刺激又は追加免疫組成物を提供する。
ポックスウイルスファミリーは2つのサブファミリー、すなわちコードポックスウイルス亜科(Chordopoxvirinae)とエントモポックスウイルス亜科(Entomopoxviriniae)に分けられる。コードポックスウイルス亜科(脊椎動物のポックスウイルス)としては、オルトポックスウイルス(orthopoxviruses)、パラポックスウイルス(parapoxviruses)、アビポックスウイルス(avipoxviruses)、カリポックスウイルス(caripoxviruses)、レポリポックスウイルス(leporipoxviruses)、スイポックスウイルス(suipoxviruses)、モラシポックスウイルス(molluscipoxviruses)及びヤタポックスウイルス(yatapoxviruses)が挙げられる。ポックスウイルス、その構造及び組成、生物学的特性及び抗原性についての総説は、Murphyら(1995) Virus Taxonomy Springer Verlag、Vienna 79〜87頁に示されている。以下の表(表2)は、ポックスウイルスファミリーの各属内の種のいくつかの例を示す。
本発明は、いずれかの順序で逐次投与するための
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物
とを含むワクチン接種キットを提供する。
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物
とを含むワクチン接種キットを提供する。
第1及び/又は第2のウイルスベクターは、ポックスウイルスベクターであり得る。
好ましい一実施形態では、本発明は、いずれかの順序で逐次投与するための
(i)第1の非複製ポックスウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ポックスウイルスベクターを含む第2の組成物
を含む、ワクチン接種キットを提供する。
(i)第1の非複製ポックスウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ポックスウイルスベクターを含む第2の組成物
を含む、ワクチン接種キットを提供する。
組成物の一方が、最初に投与される「初回抗原刺激」組成物として作用し、もう一方の組成物が、適当な時間間隔(3週間など)後に投与される「追加免疫」組成物として作用し得る。
第1及び第2の非複製ウイルスベクターは、有意な交差反応が起こらないほど十分に異なっているべきである。
2種のウイルスベクターは、異なるファミリーに属するウイルス、例えば、ポックスウイルスベクターとアデノウイルスベクター由来のものであってもよい。あるいは、2種のウイルスベクターは、同一ファミリー(ポックスウイルスなど)に属するが、異なる属(geni)であるウイルス由来のものであってもよい。例えば、第1の非複製ポックスウイルスベクターがアビポックスウイルスベクターであり、第2の非複製ポックスウイルスベクターがオルトポックウイルスベクターであってもよい。
2種の非複製ウイルスベクターは、種が十分に異なっていれば、同一属内の異なる種由来のものでさえあってもよい。
各ポックスウイルス属の際立った特徴は、当技術分野では公知であり、例えば、Murphyら(1995前記)参照。
好ましい一実施形態では、2種の非複製ポックスウイルスベクターのうち一方は鶏痘ウイルスベクター(すなわち、鶏痘(fowl−pox)由来のもの)である。例えば、鶏痘ウイルスベクターは、本発明のゲノムを含み得る。
非複製性
本発明に用いるウイルスベクターは、被験体の細胞において(例えば、ヒト細胞において)非複製性でなければならない。本明細書において用語「非複製」又は「複製障害」とは、正常な被験体の細胞の大部分において十分な程度までは複製できないことを意味する。非複製性であるか又は複製障害のあるウイルスは、自然にそのようになった場合もあり(すなわち、天然からそのようなものとして単離することができる)、又は人工的に、例えば、in vitroでの育種によって、又は遺伝子操作、例えば、複製にとって重要な遺伝子の欠失によってそのようになった場合もある。一般に、このようなウイルスが増殖できる、1種又は少数の細胞種がある、例えば、CEF細胞である。
本発明に用いるウイルスベクターは、被験体の細胞において(例えば、ヒト細胞において)非複製性でなければならない。本明細書において用語「非複製」又は「複製障害」とは、正常な被験体の細胞の大部分において十分な程度までは複製できないことを意味する。非複製性であるか又は複製障害のあるウイルスは、自然にそのようになった場合もあり(すなわち、天然からそのようなものとして単離することができる)、又は人工的に、例えば、in vitroでの育種によって、又は遺伝子操作、例えば、複製にとって重要な遺伝子の欠失によってそのようになった場合もある。一般に、このようなウイルスが増殖できる、1種又は少数の細胞種がある、例えば、CEF細胞である。
一般に、ウイルスの複製は2つの方法で測定する:1)DNA合成及び2)ウイルス力価。より正確には、本明細書において用語「非複製」又は「複製障害」とは、ポックスウイルスに適用する場合には、以下の基準のいずれか又は双方を満たすウイルスを意味する:
1)MRC−5細胞(ヒト細胞株)において、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン(Copenhagen)株と比較して、DNA合成の1log(10倍)減少を示す、
2)HELA細胞(ヒト細胞株)において、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株と比較して、ウイルス力価の2log減少を示す。
1)MRC−5細胞(ヒト細胞株)において、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン(Copenhagen)株と比較して、DNA合成の1log(10倍)減少を示す、
2)HELA細胞(ヒト細胞株)において、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株と比較して、ウイルス力価の2log減少を示す。
鶏痘ウイルス
前記のように、野生型鶏痘ウイルスは、トリでは増殖性皮膚病変を引き起こす。家畜感染部から集めたかさぶた材料からFPVの屋外単離物を得ることができる(Boyleら(1997)Arch.Virol.142:737〜748頁)。病原性鶏痘ウイルスのゲノム配列は入手可能である(Afonsoら(2000)J.Gen.Virol.74(8)3815〜3831頁)。
前記のように、野生型鶏痘ウイルスは、トリでは増殖性皮膚病変を引き起こす。家畜感染部から集めたかさぶた材料からFPVの屋外単離物を得ることができる(Boyleら(1997)Arch.Virol.142:737〜748頁)。病原性鶏痘ウイルスのゲノム配列は入手可能である(Afonsoら(2000)J.Gen.Virol.74(8)3815〜3831頁)。
弱毒生ウイルス株は、トリ細胞においてウイルスを複数回継代することによって得ることができる。Cyanamid−Websters PtY、LtdAustraliaから入手可能な、FPV M(穏やかなワクチン株)及びFPV S(標準ワクチン株)など、鶏痘ウイルスの種々の弱毒ウイルス株が知られている。
ポックスウイルスは、宿主免疫応答から逃れるための進化した戦略を持っており、これには腫瘍壊死因子、IL−Ip、インターフェロン(IFN)−oc/及びIFN−γの可溶性受容体として機能する分泌タンパク質の産生が含まれており、これらは、通常、細胞性サイトカイン受容体(ケモカイン受容体など)の細胞外ドメインと同様の配列を有する。これらのウイルス受容体は、一般に、適切な宿主免疫応答を阻害又は妨害し、その存在は病原性の増加を伴う。
FPV遺伝子
鶏痘ウイルスのゲノムは、共有結合された末端ヘアピンを含む単一の二本鎖DNA分子からなる。制限エンドヌクレアーゼ切断部位についての基本情報は入手可能である(Couparら(1990)前記)。
鶏痘ウイルスのゲノムは、共有結合された末端ヘアピンを含む単一の二本鎖DNA分子からなる。制限エンドヌクレアーゼ切断部位についての基本情報は入手可能である(Couparら(1990)前記)。
米国農務省スタンダードチャレンジ(Standard Challenge)(病原性)鶏痘株のゲノムは、配列決定されており、本明細書ではこの株に用いた命名法に従っている(Afonsoら(2000)J.Virol.74 3815〜3831頁)。この総説にはまた、この鶏痘株の260のORF(表1)が、その推定構造及び/又は機能及びアクセッション番号とともに列挙されている。
本発明者らは、FP9(HP1)の病原性前駆体を、FP9の配列がこの配列と異なっているすべての位置で配列決定した。この方法により、系統変動に起因する相違及び組織培養継代、適応の間に許容したもの、及び付随する弱毒化が示される。FP1中の、CEF組織培養での継代の間に、HP1から改変された遺伝子を図2に示す。
本発明の鶏痘ウイルスゲノムは、1種又は複数の以下の野生型遺伝子に改変を含み得る:
FPV001、FPV018、FPV054、FPV063、FPV066、FPV070、FPV071、FPV093、FPV097/098、FPV115、FPV124、FPV125、FPV127、FPV158、FPV159、FPV160、FPV190、FPV191、FPV207、FPV219、FPV220、FPV221、FPV222、FPV239、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260。
FPV001、FPV018、FPV054、FPV063、FPV066、FPV070、FPV071、FPV093、FPV097/098、FPV115、FPV124、FPV125、FPV127、FPV158、FPV159、FPV160、FPV190、FPV191、FPV207、FPV219、FPV220、FPV221、FPV222、FPV239、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260。
用語「改変」とは、野生型配列からの変化(欠失、置換又は付加など)を意味するものとする。
遺伝子がタンパク質をコードする場合には、改変された遺伝子配列は、異なるアミノ酸配列のタンパク質をコードし得る。例えば、このアミノ酸配列は、野生型配列と比較すると、1個又は複数個のアミノ酸欠失、付加又は置換を含み得る。
好ましい一実施形態では、本発明の鶏痘ウイルスゲノムは、1種又は複数の以下の遺伝子に非保存的アミノ酸置換をもたらす改変を含む:
FPV018、FPV063、FPV066、FPV093、FPV127、FPV191、FPV207。
FPV018、FPV063、FPV066、FPV093、FPV127、FPV191、FPV207。
あるいは(又は、さらに)、本ゲノムは、1種又は複数の野生型遺伝子にかなりの改変を含み得る。用語「かなりの改変」とは、遺伝子がもはや野生型遺伝子としては機能しないような方法で改変されていることを意味するものとする。例えば、野生型遺伝子がタンパク質をコードする場合には、かなり改変された遺伝子はタンパク質をコードすることができないこともあり、又は野生型タンパク質としては機能することができないタンパク質又は野生型タンパク質として機能する能力が大幅に低下したタンパク質をコードすることもある。
この改変は欠失であり得る。例えば、全遺伝子が欠失されている場合もある。あるいは、改変遺伝子が、その遺伝子の機能をなくすか又は大幅に低下させるのに十分な1種又は複数の部分欠失を含む場合もある。
あるいは、この改変は置換又は付加であり得る。例えば、組換え事象が起こり、ゲノムのどこかの配列部分が遺伝子に組み込まれる(場合によっては、野生型配列がそれに対応して喪失する)よう働く場合もある。
部分欠失、置換又は付加は、「フレームシフト」突然変異を引き起こし、その結果、下流配列の不適当な読み取りをもたらすことがある。あるいは(又は、さらに)、突然変異が停止コドンの生成をもたらし(「終結突然変異」)、その結果、下流配列が無視される場合もある。
突然変異が、停止コドンの除去をもたらし、その結果、2つの遺伝子が融合されることとなりキメラ遺伝子を形成することもある。
好ましい一実施形態では、ゲノムは、1種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を含む:
FPV158、FPV219、FPV222。
FPV158、FPV219、FPV222。
もう1つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、1種又は複数の以下の遺伝子を完全に欠いている:
FPVOO1、FPV124、FPV125、FPV159、FPV160、FPV220、FPV221、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260。
FPVOO1、FPV124、FPV125、FPV159、FPV160、FPV220、FPV221、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260。
もう1つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、1種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を含む:
FPV054、FPV070、FPV071、FPV115、FPV190、FPV207。
FPV054、FPV070、FPV071、FPV115、FPV190、FPV207。
もう1つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、1種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を含む:
FPV071、FPV239。
FPV071、FPV239。
もう1つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、遺伝子FPV097とFPV098の融合に(欠失に)起因するキメラ遺伝子を含む。
ゲノムの大きさ
FPV−Mのゲノムは、308kbの領域であると推定されている(Couparら(1990)前記)。ウイルスゲノムが小さいほど、多くの異種DNAを含むことができる。
FPV−Mのゲノムは、308kbの領域であると推定されている(Couparら(1990)前記)。ウイルスゲノムが小さいほど、多くの異種DNAを含むことができる。
本発明の鶏痘ウイルスゲノムは、大きさが275kb未満であることが好ましい。本ゲノムは約266kbpであることがより好ましい。ゲノムの大きさは、異種配列(例えば、「目的とするヌクレオチド」(NOI)以下参照)を含まずに考慮される。鶏痘ウイルスをベクター系として使用するために、相同組換えによって、送達する異種配列を鶏痘ゲノムに組み込むことができる。大きさ決定の目的上、かかる組換え事象の前にゲノムの大きさを考慮する。
請求項1に記載の鶏痘ウイルスゲノムは、配列番号1に示された配列を含むことが好ましい。この「配列」は、鶏痘ゲノムが全体として、ベクター系として作用し得る(すなわち、相同組換えによって異種遺伝子を受けとり、ウイルス粒子に組み込まれると、異種遺伝子を標的細胞に送達する)限りは、この配列の相同体を包含するものとする。
相同体
本明細書において用語「相同体」とは、配列番号1に示された配列と、ある程度の相同性を有する核酸配列を意味する。本明細書において用語「相同性」とは、「同一性」と同等と見なすことができる。
本明細書において用語「相同体」とは、配列番号1に示された配列と、ある程度の相同性を有する核酸配列を意味する。本明細書において用語「相同性」とは、「同一性」と同等と見なすことができる。
これに関連して、相同配列は、主題配列と、少なくとも75、85又は90%同一、好ましくは、少なくとも95又は98%同一であり得るヌクレオチド配列を含むととられる。一般に、相同体は、コードされたタンパク質の機能的部分(活性部位など)をコードする配列を含み、これは主題配列と同一であるが、他の領域では異なり得る。相同性は、類似性(すなわち、類似の化学特性/官能基を有するアミノ酸残基)という用語でも考えることができるが、本発明の範囲では、配列同一性という用語で相同性を表現することが好ましい。
相同性比較は、目測で、より通常は、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施することができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、2つ又は複数の配列間の相同性%を計算することができる。
相同性%は、連続配列にわたって計算することができる、すなわち、一方の配列をもう一方の配列とアラインし、一方の配列中の各塩基を、一残基ずつ、もう一方の配列中の対応する塩基と直接比較する。これは「ギャップを入れない」アラインメントと呼ばれている。通常、このようなギャップを入れないアラインメントは、比較的短い数の残基にわたってのみ実施する。
これは極めて単純で一貫した方法であるが、例えば、別の同一の配列対において、ある挿入又は欠失が、続く核酸残基をアラインメントから外させ、そのために、全アラインメントを実施する場合に、相同性%の大きな低下をもたらす可能性を考慮できない。このために、ほとんどの配列比較法は、相同性スコア全体には過度のペナルティーを科さずに、可能性ある挿入及び欠失を考慮する最適アラインメントが得られるように設計されている。これは、局所相同性を最大にしようとして、配列アラインメントに「ギャップ(gaps)」を挿入することによって達成される。
しかし、これらのより複雑な方法では、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー(gap penalties)」を割り当て、その結果、同数の同一塩基に対して、2つの比較される配列間のより高い関連性を反映する、できるだけ少ないギャップを含む配列アラインメントが、多数のギャップを含むものよりも高いスコアを達成する。通常、ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ中の各後続残基に対してはより小さなペナルティーを課す、「アファインギャップコスト」を用いる。これが、最も普通に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーによって、当然、より少ないギャップを含む最適化されたアラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティーを改変することができる。しかし、配列比較にこのようなソフトウェアを用いる場合にはデフォルト値を用いることが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージを用いる場合には、核酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップに対して−12であり、各伸長に対しては−4である。
したがって、最大相同性%の計算には、まず、ギャップペナルティーを考慮した、最適アラインメントの作製が必要である。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータープログラムには、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ(ウィスコンシン大学、米国、Devereuxら、1984、Nucleic Acids Research 12:387)がある。配列比較を実施できるその他のソフトウェアの例としては、それだけには限らないが、BLASTパッケージ(Ausubelら、1999 ibid−第18章参照)、FASTA(Atschulら、1990、J.Mol.Biol.、403〜410頁)及びGENEWORKS比較ツールパッケージソフトが挙げられる。BLAST及びFASTAは双方とも、オフライン及びオンライン検索に使用可能である(Ausubelら、1999 ibid、7−58〜7−60頁参照)。しかし、いくつかの適用には、GCG Bestfitプログラムを用いることが好ましい。BLAST2シークエンスと呼ばれる新しいツールはまた、タンパク質及びヌクレオチド配列の比較に使用可能である(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247〜50頁、FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187〜8頁及びtatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照)。
同一性という点では、最終相同性%を求めることができるが、アラインメント法自体は、通常、オールオアナッシングの対比較には基づいていない。代わりに、一般に、化学的類似性又は進化距離に基づいて、スコアを各対比較に割り当てるスケール付き類似性スコアマトリックスを用いる。このような通常用いられるマトリックスの例としては、BLOSUM62マトリックス−BLASTプログラムパッケージソフトのデフォルトマトリックスがある。GCG Wisconsinプログラムは一般に、公開デフォルト値か提供されていればカスタム記号比較表のいずれかを用いる(さらなる詳細についてはユーザーマニュアル参照)。いくつかのアプリケーションには、GCGパッケージに公開デフォルト値を、その他のソフトウェアの場合には、デフォルトマトリックス、例えば、BLOSUM62を用いることが好ましい。
ソフトウェアによって最適アラインメントを得れば、相同性%を、好ましくは配列同一性%を計算することが可能である。通常、ソフトウェアはこれを配列比較の一環として行い、数的結果が得られる。
配列はまた、サイレント変化をもたらし、その結果、機能的に同等な物質をもたらす、核酸残基の欠失、挿入又は置換を含み得る。遺伝子がタンパク質をコードする場合には、相同体によってコードされたタンパク質は同一であるか(遺伝暗号の縮重のために)、又は機能的に同等であり得る(例えば、保存的突然変異が配列に現れることがある)。相同体は、配列番号1の遺伝子によってコードされるタンパク質と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の相同性を有するタンパク質をコードすることが好ましい。
保存的置換は、例えば、以下の表に従って行うことができる。第2列の同一ブロック内の、好ましくは第3列の同一行内のアミノ酸を互いに置換することができる。
鶏痘ウイルスベクター
本発明はまた、このような鶏痘ウイルスゲノムを含むウイルス粒子に関する。
本発明はまた、このような鶏痘ウイルスゲノムを含むウイルス粒子に関する。
ウイルス粒子(又はその一部)は、目的とするヌクレオチド(NOI)を標的細胞に送達するためのベクター系として使用できる。この意味では、本明細書において用語「ウイルス粒子」は、NOI又は予め発現されたタンパク質を標的細胞に送達可能な粒子(又はその一部)を含むウイルスベクターを含む。NOIは、当技術分野で公知の方法を用いて相同組換えによってウイルスゲノムに挿入することができる(例えば、Schneiderら(1998) Nature Medicine 4(4)397〜402頁参照)。
NOIを発現する組換えポックスウイルスの構築には、NOIの挿入を、ウイルスゲノムの複製に必須でない部位で行うことが必要である。FP9の適した挿入部位は記載されている(Pollittら(1998) 17:5〜9頁;Laidlawら 1998 J Virol 72 6742頁)。
予め発現されたタンパク質
本発明の鶏痘ウイルス(又はその一部)を用いて、予め発現されたタンパク質を標的細胞に送達することができる。「予め発現されたタンパク質」とは、標的細胞に到達する前に翻訳されているタンパク質である。例えば、ウイルス粒子が増殖する細胞がタンパク質を発現し、次いでそれがウイルス粒子に組み込まれ得る。
本発明の鶏痘ウイルス(又はその一部)を用いて、予め発現されたタンパク質を標的細胞に送達することができる。「予め発現されたタンパク質」とは、標的細胞に到達する前に翻訳されているタンパク質である。例えば、ウイルス粒子が増殖する細胞がタンパク質を発現し、次いでそれがウイルス粒子に組み込まれ得る。
ウイルス粒子が増殖する細胞は、1種又は複数の目的とするタンパク質(POI)を発現するよう操作することができる。細胞が霊長類の細胞(CEF細胞など)である場合には、かかるPOIをコードするヌクレオチドを用いて一過的にトランスフェクトすることができる。あるいは、安定にトランスフェクトされた細胞株、例えば、ウズラ細胞株QT35を増殖に用いてもよい。
予め発現されたタンパク質はウイルス粒子に組み込まれるよう標的とされることが好ましい。
NOI
本発明では、用語NOIは、適したヌクレオチド配列であればいずれも、例えば、合成RNA/DNA配列、組換えRNA/DNA配列(すなわち、組換えDNA技術を用いて調製した)、cDNA配列又は部分ゲノムDNA配列を、それらの組合せも含めて含む。配列はコード配列である必要はない。コード領域である場合には、全コード領域である必要はない。さらに、RNA/DNA配列はセンス方向である場合も、アンチセンス方向である場合もある。センス方向であることが好ましい。配列はcDNAを含むか、又はそれから転写されることが好ましい。
本発明では、用語NOIは、適したヌクレオチド配列であればいずれも、例えば、合成RNA/DNA配列、組換えRNA/DNA配列(すなわち、組換えDNA技術を用いて調製した)、cDNA配列又は部分ゲノムDNA配列を、それらの組合せも含めて含む。配列はコード配列である必要はない。コード領域である場合には、全コード領域である必要はない。さらに、RNA/DNA配列はセンス方向である場合も、アンチセンス方向である場合もある。センス方向であることが好ましい。配列はcDNAを含むか、又はそれから転写されることが好ましい。
NOIは、目的とするタンパク質(「POI」)をコードし得る。このようにして、ベクター系を用いて、標的細胞に対する外来遺伝子発現の作用を調べられる可能性がある。例えば、鶏痘ウイルス送達系を用いて、標的細胞への特定の作用についてcDNAライブラリーをスクリーニングできる可能性がある。
NOIは、標的細胞における遺伝子の発現をブロック又は阻害可能なものであり得る。例えば、NOIはアンチセンス配列であり得る。アンチセンス技術を用いる遺伝子発現の阻害は十分に公知である。
NOI又はNOI由来の配列は、標的細胞において特定の遺伝子の発現を「ノックアウト」可能なものであり得る。当技術分野では、いくつかの「ノックアウト」戦略が知られている。例えば、NOIは、特定の遺伝子の発現を破壊するよう標的細胞のゲノムに組み込み可能なものであり得る。NOIは、例えば、中途での停止コドンを導入することによって、下流コード配列をフレームから外すことによって、又はコードされたタンパク質の折り畳み能に影響を及ぼすことによって、発現を破壊し得る。
あるいは、NOIは、標的細胞における遺伝子の異所性発現を増強又は誘導可能なものであり得る。NOI又はそれから導かれる配列は、特定の遺伝子の発現を「ノックイン」可能なものであり得る。
ベクター送達系によって送達されるNOIは、標的細胞を不死化し得るものであり得る。当技術分野では、いくつかの不死化技術知られている(例えば、Katakura Yら(1998)Methods Cell Biol.57:69〜91頁参照)。
ベクター送達系によって送達されるNOIは、選抜のために又はマーカー目的で使用できる。例えば、NOIは選抜遺伝子、又はマーカー遺伝子であり得る。レトロウイルスベクターでは、多数の種々の選択マーカーが上手く用いられている。これらは「Retroviruses」(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press編 JM Coffin、SM Hughes、HE Varmus 444頁)に概説されており、それだけには限らないが、それぞれG418及びハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌のネオマイシン及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、メトトレキセートに対する耐性を付与する突然変異マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、細胞をマイコフェノール酸(mycophenolic acid)、キサンチンを含有する培地で増殖可能にする細菌のgpt遺伝子、細胞をヒスチジンを含まないがヒスチジノールを含有する培地で増殖可能にする細菌hisD遺伝子、種々の薬物に対する耐性を付与する多剤耐性遺伝子(mdr)及びピューロマイシン(puromycin)又はフレオマイシン(phleomycin)に対する耐性を付与する、細菌の遺伝子が挙げられる。これらのマーカーのすべては、優性選抜可能であり、これらの遺伝子を発現するほとんどの細胞の化学選抜が可能となる。
しかし、好ましい一実施形態では、NOIは、治療作用を有するタンパク質を有するか、又はそれをコードし得る。例えば、ベクター送達系によって送達されるNOIは、遺伝子自身が治療作用を惹起可能なものであり得る、又は治療作用を惹起可能である産物をコードすることができるという意味で、治療用遺伝子であり得る。
NOIは、例えば、以下のもののうちの1種であるか、又はコードすることができる:サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、人工的に作り出された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫同時刺激分子、免疫調節性分子、アンチセンスRNA、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ突然変異体、毒素、条件毒素、抗原、腫瘍サプレッサータンパク質及び増殖タンパク質、膜タンパク質、血管作動性タンパク質及びペプチド、抗ウイルス性タンパク質及びリボザイム、並びにそれらの誘導体(関連レポーター群を含むものなど)。
好ましい一実施形態では、NOIは、疾病関連抗原をコード可能なものである。鶏痘ベクターに関しては、抗原に対する曝露によって、抗原に対する免疫応答を誘発又は追加免疫でき、その結果、既存の又はその後のチャレンジがより効果的に扱われる。
抗原の性質は疾病に応じて変わる。疾病が生物又は感染性病原体(細菌、ウイルス、原生動物、プリオン)によって起こる場合には、抗原はこの生物又は病原体から誘導可能であり得る。疾病が腫瘍によって起こる場合には、抗原はHER−2/neu、MUC01、癌精巣抗原又はオンコジーン若しくは産物などの腫瘍関連抗原であることが好ましい。
疾病関連抗原は、1種又は複数のT細胞エピトープを含むことが好ましい。抗原は、疾病を引き起こす生物由来の完全タンパク質(結核菌由来のAntigen85Aなど)を含むことができる。あるいは、抗原は、疾病を引き起こす生物由来の1種又は複数のタンパク質由来のT細胞エピトープの鎖を含むこともある。この例として、熱帯熱マラリア原虫由来のMEPfTrapポリペプチドがあり、これは熱帯熱マラリア原虫TRAP遺伝子と融合している、熱帯熱マラリア原虫CSPとPb9エピトープ由来のT細胞エピトープの鎖を含む。
本発明に従って鶏痘構築物を作製するには、プラスミドpEFL又はその誘導体、好ましくはプラスミドpEFL29を用いることが好ましい。pEFL29は、相同な領域を含み、これによってORF1でFP9に組み込むことができる。これによってORF−1は破壊されるが、欠失させるわけではない。プラスミドは3個の遺伝子lacA、lacY及びlacZをゲノムに付加する。この破壊は挿入であり、いくつかのヌクレオチドが欠失する。pEFL29から欠失される鶏痘Orf1遺伝子塩基は以下の通りである(大文字):
AgagatcccgccagacggggaacctgggtcaacgACTGGTGCGAAGATCTCtgcgtatggatatggtctccg
tgttgttacgtcaagagatgtattcg
ワクチン
本発明のゲノム及び/又は粒子は、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法に使用できる。
AgagatcccgccagacggggaacctgggtcaacgACTGGTGCGAAGATCTCtgcgtatggatatggtctccg
tgttgttacgtcaagagatgtattcg
ワクチン
本発明のゲノム及び/又は粒子は、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法に使用できる。
例えば、ゲノム及び/又は粒子は、予防又は治療目的で被験体に投与するワクチンに使用できる。ワクチンはまたアジュバントも含むことができる(以下参照)。
複数回投与ワクチン接種(治療又は疾病予防のための)は、単回投与よりも効果的であることが多いことがわかっている。複数回投与ワクチン接種プログラムは、同一組成物の反復投与又は2種若しくは複数の異なる組成物の1回若しくは複数の投与を含み得る。
同種ワクチン接種プログラム用に、本発明は、反復投与を容易にする方法で提供されるワクチンを含むワクチンパックを提供する。例えば、パックには、患者に注射されるよう準備ができている適切な用量のワクチンを含む複数のバイアルを含めることができる。ワクチンが経口投与される場合には、用量は丸剤又はカプセル剤として存在することができる。
異種ワクチン接種プログラム用には、通常、患者に最初に投与される「初回抗原投与」組成物と、いくらか後に投与される「追加免疫」組成物がある。本発明のゲノム及び/又はウイルス粒子は、初回抗原投与組成物及び/又は追加免疫組成物に使用できる。
いくつかの他の組成物を、異種ワクチン接種プログラムに使用できる。本発明のゲノム/粒子がNOI(場合によって、POIをコード可能である)を含む場合には、他の組成物は、同一のNOI又はPOIを含むことが好ましい。他の組成物としては、「裸のDNA」、非ウイルスベクター系及び他のウイルスベクター系が挙げられる。
裸のDNA(又はRNA)は、線状であっても環状(例えば、プラスミド)であってもよい。リポソームなどの担体中で、又は遊離型で提供される場合もある。
初回抗原刺激組成物に使用するための、適した非ウイルスベクターとしては、リポペプチドとして知られる脂質が末端に付加されたペプチド、融合タンパク質としてか化学結合によってのいずれかでKLHなどの担体タンパク質と融合しているペプチド、アジュバントを含む完全抗原、及びその他の類似の系が挙げられる。
ウイルスベクター系を用いる場合には、異なるウイルス由来のもの(すなわち、鶏痘ではない)であれば交差反応を最小にするのに有利であり得る。ベクターは別のアビポックスウイルス由来のもの、又は異なる属のポックスウイルス由来のもの(表2に示されるような)であってもよい。MVA又はNVYACなどの弱毒ワクチンベクター系が特に好ましい。その他の適したウイルスベクターとしては、非ポックスウイルスに基づいたベクター、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス及びベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEE)がある。適した細菌ベクターとしては、組換えBCG及び組換えサルモネラ及びプラスミドDNAで形質転換されたサルモネラが挙げられる(Darji Aら 1997 Cell 91:765〜775頁)。
異種ワクチンプログラムには、本発明は、
(i)鶏痘ウイルス粒子を含む第1の組成物と、
(ii)同時、個別又は逐次投与するための第2の組成物。
とを含むワクチン接種キットを提供する。
(i)鶏痘ウイルス粒子を含む第1の組成物と、
(ii)同時、個別又は逐次投与するための第2の組成物。
とを含むワクチン接種キットを提供する。
異種ワクチン接種レジメン
本発明はまた、概ね、2種の異なる非複製ウイルスベクターを用いる異種ワクチン接種レジメンに関する。
本発明はまた、概ね、2種の異なる非複製ウイルスベクターを用いる異種ワクチン接種レジメンに関する。
本発明者らは、まず、2種の異なる非複製ウイルスベクターを用いる異種プライム−ブーストレジメンが、霊長類被験体において免疫応答を生じさせるのに効率的であることを示した。
詳しくは、本発明は、
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物
とを、いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物
とを、いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
被験体が哺乳類であることが好ましく、被験体が霊長類であることがより好ましく、被験体がヒトであることが最も好ましい。
好ましい一実施形態では、第1及び/又は第2の組成物はポックスウイルスベクターである。
したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、
(i)第1の非複製ポックスウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ポックスウイルスベクターを含む第2の組成物とを、
いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
(i)第1の非複製ポックスウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ポックスウイルスベクターを含む第2の組成物とを、
いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
もう1つの態様では、本発明は、
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物とを、
いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法に関する。
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物とを、
いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、
(i)DNAワクチンを含む第1の組成物と、
(ii)第1の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物と、
(iii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第3の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
(i)DNAワクチンを含む第1の組成物と、
(ii)第1の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物と、
(iii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第3の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
もう1つの態様では、本発明は、
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物と、
(iii)第3の非複製ウイルスベクターを含む第3の組成物
とを被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物と、
(iii)第3の非複製ウイルスベクターを含む第3の組成物
とを被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
もう1つの態様では、本発明は、組成物のうちの少なくとも1つがポックスウイルスベクターを含む前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、前記非複製ウイルスベクターがポックスウイルスベクターを含む前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、少なくとも2種のポックスウイルスベクターが、異なる属のポックスウイルスベクターから誘導可能である前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、少なくとも1種のポックスウイルスベクターがアビポックスウイルスから誘導可能であり、少なくとも1種のポックスウイルスベクターがオルトポックスウイルスから誘導可能である、前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、少なくとも1種のベクターが鶏痘ウイルスから誘導可能である前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、少なくとも1種のベクターがFP9であるか、それから誘導可能である、前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、ベクターのうちの1種が、以下から選択される鶏痘ウイルスゲノムを含む、前記の方法に関する:
(i)1種又は複数の以下の野生型FPV遺伝子の改変型を含む鶏痘ゲノム:
FPV001、FPV018、FPV054、FPV063、FPV066、FPV070、FPV071、FPV093、FPV097、FPV098、FPV115、FPV124、FPV125、FPV127、FPV158、FPV159、FPV160、FPV190、FPV191、FPV207、FPV219、FPV220、FPV221、FPV222、FPV239、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260、
(ii)1種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を含む鶏痘ウイルスゲノム:
FPV158、FPV219、FPV222、
(iii)1種又は複数の以下の遺伝子を欠く鶏痘ウイルスゲノム:
FPV001、FPV124、FPV125、FPV159、FPV160、FPV220、FPV221、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260、
(iv)1種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を含む鶏痘ウイルスゲノム:
FPV054、FPV070、FPV071、FPV115、FPV190、FPV207、
(v)1種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を含む鶏痘ウイルスゲノム:
FPV071、FPV239、
(vi)遺伝子FPV097及びFPV098の融合によって(欠失によって)生じたキメラ遺伝子を含む鶏痘ウイルスゲノム、
(vii)大きさが275kbp未満である鶏痘ウイルスゲノム、
(viii)配列番号1に示される配列を含む鶏痘ウイルスゲノム、
(ix)ORF1からACTGGTGCGAAGATCTCが欠失した配列番号1に示される配列を含む鶏痘ウイルスゲノム。
(i)1種又は複数の以下の野生型FPV遺伝子の改変型を含む鶏痘ゲノム:
FPV001、FPV018、FPV054、FPV063、FPV066、FPV070、FPV071、FPV093、FPV097、FPV098、FPV115、FPV124、FPV125、FPV127、FPV158、FPV159、FPV160、FPV190、FPV191、FPV207、FPV219、FPV220、FPV221、FPV222、FPV239、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260、
(ii)1種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を含む鶏痘ウイルスゲノム:
FPV158、FPV219、FPV222、
(iii)1種又は複数の以下の遺伝子を欠く鶏痘ウイルスゲノム:
FPV001、FPV124、FPV125、FPV159、FPV160、FPV220、FPV221、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260、
(iv)1種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を含む鶏痘ウイルスゲノム:
FPV054、FPV070、FPV071、FPV115、FPV190、FPV207、
(v)1種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を含む鶏痘ウイルスゲノム:
FPV071、FPV239、
(vi)遺伝子FPV097及びFPV098の融合によって(欠失によって)生じたキメラ遺伝子を含む鶏痘ウイルスゲノム、
(vii)大きさが275kbp未満である鶏痘ウイルスゲノム、
(viii)配列番号1に示される配列を含む鶏痘ウイルスゲノム、
(ix)ORF1からACTGGTGCGAAGATCTCが欠失した配列番号1に示される配列を含む鶏痘ウイルスゲノム。
もう1つの態様では、本発明は、鶏痘ウイルスゲノムがまたNOIも含む、前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、NOIがポックスウイルスプロモーターの制御下にある、前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、NOIがネズミマラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、P.シノモルギ、三日熱マラリア原虫、結核菌又はT.パルバ由来の抗原をコードする、前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、アビポックスウイルス由来のウイルスベクターを含む組成物を追加免疫組成物として投与する、前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、アビポックスウイルス由来のウイルスベクターを含む組成物を初回抗原刺激組成物として投与する、前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は被験体が霊長類である、前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は被験体がヒトである、前記の方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は動物用ワクチンにおける、FP9であるか、それから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用に関する。
もう1つの態様では、本発明は前記動物が哺乳類である、前記のような使用に関する。
もう1つの態様では、本発明は前記哺乳類が霊長類である、前記のような使用に関する。
もう1つの態様では、本発明は、前記霊長類がヒトである、前記のような使用に関する。
もう1つの態様では、本発明は、医薬における、FP9であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用に関する。
もう1つの態様では、本発明は、FP9であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を被験体に投与することを含む、被験体において免疫応答を生起する方法に関する。
もう1つの態様では、本発明は、FP9であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を被験体に投与することを含む、被験体において既存の免疫応答を追加免疫する方法に関する。
被験体は霊長類、特に、ヒトであることが好ましい。
ベクターは、異なる属のポックスウイルスから誘導可能であることが好ましい。詳しくは、一方はアビポックスウイルスから、他方はオルトポックスウイルスから誘導可能であり得る(表2参照)。
組成物の一方が、アビポックスウイルスから誘導可能なベクターを含む場合には、この組成物は追加免疫組成物として投与することが好ましい。
好ましい一実施形態では、ベクターのうちの1種が、鶏痘ウイルスから誘導可能である。ベクターのうちの1種がFP9であるか、又はそれから誘導可能であることがより好ましい。例えば、ベクターのうちの1種は、本発明の第1の態様の鶏痘ウイルスゲノムを含み得る。高度に好ましい一実施形態では、ベクターは配列番号1に示される配列を含むゲノムを含む。
疾病がマラリアである場合には、FP9又はFP9由来ベクターを、初回抗原刺激として用いることが好ましい。
疾病が結核である場合には、FP9又はFP9由来ベクターを、追加免疫として用いることが好ましい。
第1及び第2の組成物が、同一抗原を発現可能であることが好ましい。
第1及び第2の組成物は、一緒に、又は別個に販売するために個別に詰められていてもよい。
キットは、投与前に組成物の一方又は双方と混合するための他の成分(希釈剤、担体、アジュバントなど−以下参照)を含み得る。
キットはまた、ワクチン接種プロトコールに関する取扱説明書を含み得る。
追加免疫組成物
本発明者らは、本発明の非複製ウイルスベクターは、抗原に対する既存の免疫応答の追加免疫で有効であることを示した。詳しくは、本発明者らは、まず、非複製ウイルスを用いて、マウスにおいて及び霊長類においてウシ型結核菌(M.bovis)BCGによって、並びにヒトなどの霊長類のメラノーマによって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫できることを示した。
本発明者らは、本発明の非複製ウイルスベクターは、抗原に対する既存の免疫応答の追加免疫で有効であることを示した。詳しくは、本発明者らは、まず、非複製ウイルスを用いて、マウスにおいて及び霊長類においてウシ型結核菌(M.bovis)BCGによって、並びにヒトなどの霊長類のメラノーマによって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫できることを示した。
既存の免疫応答は、ワクチンによって生じたものであり得る。いくつかの異なる種類のワクチンが開発されており、当技術分野では公知であり、これらとしては、生存生物、無傷の非生存生物、細胞成分断片、トキソイド、DNAをベースにしたワクチン及び抗イディオタイプが挙げられる(表1参照)。高度に好ましい一実施形態では、既存の応答は弱毒生存病原体、例えば、BCGによって生じたものである。
本発明は、被験体において既存の免疫応答を追加免疫可能な非複製ウイルスベクターを含む追加免疫組成物を提供する。
被験体は霊長類であることが好ましい。
ウイルスベクターはポックスウイルスベクターであることが好ましい。例えば、ウイルスベクターは本発明の第1の態様のゲノムを含み得る。
3重及び多重レジメン
本発明はまた、一般に、異なる非複製ウイルスベクターを用いる、多重異種ワクチン接種レジメン、例えば、3重異種レジメンに関する。
本発明はまた、一般に、異なる非複製ウイルスベクターを用いる、多重異種ワクチン接種レジメン、例えば、3重異種レジメンに関する。
したがって、本発明は、被験体に3種の異種組成物を投与することを含む3重レジメンを提供する。前記の3種の組成物は、各々がその近接する組成物とは異なることが好ましい。例えば、第1の組成物がXを含む場合には、第2の組成物はXとは異なることが好ましい。この実施形態では、第3の組成物が第1の組成物と類似又は同一であり得ることが可能であることは明らかである。3種の組成物すべてが互いに異なっていることが好ましい。
一実施形態では、組成物のうちの1種は、DNAワクチンなどのDNAをベースとする組成物であり得る。少なくとも第2の及び第3の組成物が、非複製ウイルスベクターを含むことが好ましい。
したがって、本発明は、
(i)DNAワクチンを含む第1の組成物と、
(ii)第1の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物と、
(iii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第3の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
(i)DNAワクチンを含む第1の組成物と、
(ii)第1の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物と、
(iii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第3の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
好ましい一実施形態では、本発明は、
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物と、
(iii)第3の非複製ウイルスベクターを含む第3の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物と、
(iii)第3の非複製ウイルスベクターを含む第3の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法を提供する。
好ましい一実施形態では、第1と第2の組成物は異種であり、第2と第3の組成物が異種である。第1及び第2及び第3の組成物が異種であることがより好ましい。前記組成物が、前記組成物のウイルスベクター成分に関して異種であることが最も好ましい。例えば、一治療レジメンは、pDNA初回抗原刺激とそれに続く組換えMVA追加免疫とそれに続く組換えFP9追加免疫とそれに続く組換えアデノウイルス追加免疫などを含み得る。これらの治療/免疫化サイクルは、治療的設定において治療的T細胞応答を持続するために反復することができることが有利である。
本発明の3重異種レジメンには、3種又は複数の異なるウイルスベクターを用いることが好ましい。
高度に好ましい一実施形態では、免疫化は以下のベクター:DNA−FP9−MVA−アデノウイルス−組換えヘルペスをいずれかの順序で用いて実施する。各ベクターが同一抗原を発現することが好ましい。ベクターは、DNA−FP9−MVA−アデノウイルス−組換えヘルペスの順序で投与することが好ましい。
さらに好ましい免疫化順序及び免疫化レジメンとしては、DNA−FP9−MVA及びDNA−MVA−FP9がある。
ベクターは、異なる属のポックスウイルスから誘導可能であることが好ましい。詳しくは、1種はアビポックスウイルスから誘導可能であり、もう1種はオルトポックスウイルスから誘導可能であり得る(表2参照)。
好ましい一実施形態では、ベクターのうちの1種は鶏痘ウイルスから誘導可能である。例えば、ベクターのうちの1種は、本発明の第1の態様の鶏痘ウイルスゲノムを含み得る。高度に好ましい一実施形態では、ベクターは、配列番号1に示される配列を含むゲノムを含む。
第1及び第2及び第3の組成物が同一抗原を発現可能であることが好ましい。
実施例12(例えば、図11−DDFM)は、3重レジメンの有効性を実証する。
被験体は霊長類、特に、ヒトであることが好ましい。
第1及び第2及び第3の組成物は、一緒に、又は別個に販売するために個別にパッケージされていてもよい。
キットは、投与前に1種又は複数の組成物と混合するための他の成分(希釈剤、担体、アジュバントなど−以下参照)を含み得る。
キットはまた、ワクチン接種プロトコールに関する取扱説明書を含み得る。
T細胞応答
本ワクチン接種法又はプログラムは、被験体においてT細胞免疫応答を生起するはずである。
本ワクチン接種法又はプログラムは、被験体においてT細胞免疫応答を生起するはずである。
T細胞免疫応答の性質は、細胞上の細胞表面マーカーの発現に基づいて特性決定することができる。一般に、T細胞は、TCR、CD3、CD2、CD28、CD5又はCD7(ヒトのみ)の存在によって検出することができる。CD4+T細胞とCD8+T細胞は、その補助受容体発現によって区別することができる(例えば、抗CD4又は抗CD8モノクローナル抗体によって)。
CD4+T細胞は、MHCクラスII分子によって提示される場合に抗原を認識し、CD8+はMHCクラスI分子によって提示される場合に認識するので、CD4+とCD8+T細胞はまた、それらが反応する抗原提示細胞に基づいて区別することもできる。
特定の標的抗原内に、1種又は複数のCD4+T細胞エピトープと1種又は複数のCD8+T細胞エピトープがある場合もある。特定のエピトープがすでに特性決定されている場合には、これを用いて、例えば、特定のエピトープを認識するT細胞サブセットの特異的刺激に基づいてT細胞の2種のサブタイプ間を区別することができる。
CD4+T細胞はまた、そのサイトカイン分泌プロフィールに基づいて細分することもできる。TH1サブセット(「炎症性CD4T細胞」として知られることもある)は、IL−2及びIFNγを特徴的に分泌し、細胞傷害性及び局所炎症反応と関連しているいくつかの機能を媒介する。TH1細胞は、マクロファージを活性化することができ、細胞媒介性免疫を導く。TH2サブセット(「ヘルパーCD4T細胞」として知られることもある)は、IL−4、IL−5、IL−6及びIL−10を特徴的に分泌し、B細胞を増殖し、抗体を産生するよう(体液性免疫)刺激することにおいて役割を有すると考えられている。
TH1及びTH2細胞はまた、エフェクター分子を特徴的に発現する。TH1細胞は膜結合型TNFを発現し、TH2細胞はB細胞上にCD40と結合するCD40リガンドを発現する。
したがって、細胞免疫応答の種類は、例えば、蛍光活性化細胞スキャニング(FACScan)を用いて容易に決定することができる。
標的抗原
標的抗原は、標的疾病に特有のものであり得る。疾病が、感染性病原体によって起こる感染性疾病である場合には、標的抗原は感染性病原体から誘導可能なものであり得る。
標的抗原は、標的疾病に特有のものであり得る。疾病が、感染性病原体によって起こる感染性疾病である場合には、標的抗原は感染性病原体から誘導可能なものであり得る。
標的抗原は、疾病の感染後に免疫系によって認識される抗原であり得る。あるいは、抗原は、通常は、免疫系には「見えない」ものであり、その結果、本方法が非生理学的T細胞応答を誘導する場合もある。これは、別の攻撃路を開くことができるために、疾病によって誘発された免疫応答が有効でない(例えば、感染の排除に成功しない)疾病では有用であり得る。
好ましい乳癌抗原には、MUC−1、HER2、CEAがある。
好ましい結腸癌抗原:CEA、MUC−1、MAGE−12、突然変異体P53。
好ましい脳癌抗原:ヒトパピローマウイルスタンパク質E6及びE7。
好ましいEBV誘導性B及びT細胞リンパ腫抗原:BBNA1及び2、LMP1。
好ましい腎臓癌抗原:HER−2neu、RAGE、MUC−1。
好ましいHPV抗原には、ウイルスタンパク質E1−8、L1及びL2がある。
好ましいHSV抗原には、ウイルスタンパク質gM、gH、gK、GG、gDがある。
好ましいHBV抗原には、ウイルスタンパク質小、中及び大表面抗原、コア抗原、ポリメラーゼがある。
好ましいHCVタンパク質には、ウイルスタンパク質コアタンパク質、エンベロープタンパク質、NS2、NS3、NS4及びNS5領域がある。
抗原は、腫瘍抗原、例えば、HER2/neu、MUC−1、MAGE−1、MAGE−3又はNY−ESOであり得る。
抗原は、自己抗原、例えば、チロシナーゼであり得る。
本発明の好ましい一実施形態では、抗原は結核菌から誘導可能である。例えば、抗原はESAT6又はMPT63であり得る。
本発明のもう1つの好ましい実施形態では、抗原は、マラリア関連病原体熱帯熱マラリア原虫から誘導可能である。
本発明の組成物は、2種以上の抗原由来のT細胞エピトープを含み得る。例えば、本組成物は、同一の疾病と関連している2種又は複数の抗原由来の1種又は複数のT細胞エピトープを含み得る。2種又は複数の抗原は、同一の病原性生物から誘導可能であり得る。
あるいは、本組成物は、種々の供給源由来のエピトープを含み得る。例えば、実施例に記載したME−TRAPインサートは、熱帯熱マラリア原虫、破傷風トキソイド、結核菌及びウシ型結核菌由来のT細胞エピトープを含む。
標的疾病
本発明の方法は、いくつかの疾病、特に、T細胞媒介性免疫応答に感受性のあるものの治療及び/又は予防に有用である。
本発明の方法は、いくつかの疾病、特に、T細胞媒介性免疫応答に感受性のあるものの治療及び/又は予防に有用である。
詳しくは、本発明の方法は、慢性感染症、特に、持続性潜在性感染症であるか、又はそれから起こる疾病の治療及び/又は予防に有用である。
適した疾病の網羅するものではないリストとして、結核、HIV、マラリア、H.ピロリ、インフルエンザ、肝炎、CMV、ヒトパピローマウイルス(HPV)、ヘルペスウイルス誘導性疾病及び他のウイルス感染、ライ病、トキソプラズマなどの非マラリア原虫寄生虫、並びに腫瘍及び/又は癌などの種々の悪性のもの、原虫:マラリア、特に、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ、タイレリアパルバ(Theileria parva)、トリパノソマスクルジ(Trypanosomas cruzi)によって起こる感染症、結核及びライ病などの放線菌によって起こる感染症、肺炎クラミジア及びヘリコバクターピロリなどの細菌によって起こる感染症、HIV、EBV、CMV、HBV、HCV、HPV、HSV、RSV、インフルエンザウイルスなどのウイルスによって起こる感染症並びに腎臓癌、結腸直腸癌、肺癌、皮膚癌(メラノーマ)、肝臓癌、卵巣癌、精巣癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部癌、頸部癌、乳癌及び種々のリンパ腫などの種々の悪性のもの、並びにHIV/AIDS、B型肝炎、C型肝炎、マラリア、結核、HPV感染及び疾病、HSV感染及び疾病、CMV感染及び疾病、EBv感染及び疾病、レーシュマニア症、リステリア症、タイレリア(Theileria)、HTLV感染及び疾病、肺炎球菌病、ブドウ球菌病、肺癌、乳癌、結腸癌、メラノーマ、骨髄腫、リンパ腫、腎細胞癌腫が挙げられる。
本発明の方法は、結核、マラリア及び東海岸熱から保護するためのワクチン接種法において特に有用である。
本明細書に記載した組成物は、治療用又は予防用ワクチンとして使用できる。予防的免疫化と治療的免疫化のどちらがより適当であるかは、通常、疾病の性質に応じて変わる。例えば、癌は、診断される前よりもむしろ治療的に免疫化され、抗マラリアワクチンは、必ずしもそうではないが、予防薬として用いられることが好ましいと予想される。
医薬組成物/ワクチン
本発明はまた、ワクチン、初回抗原刺激剤又は追加免疫剤などの医薬組成物に関する。
本発明はまた、ワクチン、初回抗原刺激剤又は追加免疫剤などの医薬組成物に関する。
医薬組成物はまた、例えば、製薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含むことができる。製薬上の担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図する投与経路及び標準的な薬務に関連して選択することができる。
詳しくは、DNAプラスミドベクターを含む組成物は、アジュバントとして作用するよう、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、又はそれをコードするプラスミドを含むことができ、ポリペプチドの形でGM−CSFを用いると有益な作用が見られる。QS21又はSBAS2などのアジュバント(Stoute J Aら 1997 N Engl J Medicine 226:8691頁)は、タンパク質、ペプチド又は核酸とともに使用してT細胞応答の誘導を増強することができる。
本発明の医薬組成物では、組成物は、何らかの適した結合剤、滑沢剤、沈殿防止剤、被覆剤又は可溶化剤と混合することもできる。
医薬組成物は獣医学(すなわち、動物)利用のためのであっても、ヒト利用のためのものであってもよい。獣医学利用としては、組成物は、例えば、哺乳類(特に、ウシ)又はトリを治療するために使用できる。
被験体は哺乳類被験体、特に、霊長類(例えば、ヒト)又は有蹄動物(例えば、ウシ)被験体であることが好ましい。
投与
一般に、本発明の組成物の治療上有効な皮内又は筋内日用量は、105〜1010プラーク形成単位(pfu)に及ぶことが多い。
一般に、本発明の組成物の治療上有効な皮内又は筋内日用量は、105〜1010プラーク形成単位(pfu)に及ぶことが多い。
通常、医師又は獣医が、個々の患者に最も適した実際の投与量を決定し、これは特定の患者の年齢、体重及び応答によって変わる。前記投与量は平均的な場合の典型的なものである。もちろん、より高い又はより低い投与量がふさわしい個々の例があり得、そのようなものも本発明の範囲内にある。
コードポックスウイルス亜科のメンバーの伝染は、エアゾールによって起こり得る(Murphyら(1995)前記)。本発明の組成物はまた、被験体が吸入するためのエアゾールによって投与することができる。本発明の組成物はまた、注射、例えば、皮内及び/又は筋内注射によって投与できることが好都合である。さらに、組成物は、適したデバイン(devine)を用いて皮膚又はその他の組織に投与できる(例えば、「遺伝子銃」又は類似物を用いて)。
必要に応じて、本医薬組成物はまた、座剤又はペッサリーの形で、ローション、溶液、クリーム、軟膏又は散布剤の形で局所的に、皮膚パッチを用いて、デンプン又は乳糖などの賦形剤を含有する錠剤、又はカプセル剤若しくは卵型剤の形で、単独又は賦形剤と混合して経口的に、又は矯味矯臭剤若しくは着色剤を含有するエリキシル、溶液又は懸濁液の形で投与でき、あるいはそれらは非経口的に、例えば、海綿体内に、静脈内若しくは皮下注射することもできる。非経口投与には、本組成物は、その他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖を含むことができる滅菌水溶液の形で用いることが最良であり得る。頬側又は舌下投与には、本組成物は、従来法で製剤できる錠剤又はトローチ剤の形で投与できる。
本発明の組成物を徐放性製剤で投与することも可能である。
ポックスウイルス増殖法
野生型及び組換えポックスウイルスを培養ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)でin vitroで増殖させることは公知である。驚くべきことに、本発明者らは、非培養CEFを用いることによって、アビポックスウイルスについて、プラーク形成及びウイルス収率の大幅な改善を得ることができるということを見出した。
野生型及び組換えポックスウイルスを培養ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)でin vitroで増殖させることは公知である。驚くべきことに、本発明者らは、非培養CEFを用いることによって、アビポックスウイルスについて、プラーク形成及びウイルス収率の大幅な改善を得ることができるということを見出した。
本発明は、アビポックスウウイルスを増殖させるための非培養CEF細胞の使用を提供する。
アビポックスウイルスは鶏痘ウイルス、特に、本発明の第1の態様の鶏痘ゲノムを含むものであることが好ましい。
用語「非培養」とは、細胞が培養において何らかの有意な程度まで増殖する前に用いられることを示すよう用いられる。細胞が集団中の細胞数が二倍になるには不十分な時間の間培養されていることが好ましい。
定期的に継代し増殖培地を補充することによって、一次培養CEF細胞を最大1ヶ月間維持することは通常の手順である。本発明の非培養CEF細胞は継代せずに用いられなければならない。
一次非培養CEFは、新しく調製したCEFを、増殖させずにコンフルエント単層とするのに十分な濃度で組織培養皿に入れることによって得ることができる。次いで、プレートを、プレーティングしてから24時間以内に用いることが好ましい。
本発明を、単に例示目的で、以下の実施例でさらに記載する。
鶏痘株FP9の産生及び特性決定
鶏痘FP9は、病原性野生型鶏痘HP−1株から、組織培養でニワトリ胚線維芽細胞によって438回継代することによって得(Mayr及びMalicki(1966)Zentralbl Veterinarmed 13 1〜3頁)、次いで、プラーク精製した。
鶏痘FP9は、病原性野生型鶏痘HP−1株から、組織培養でニワトリ胚線維芽細胞によって438回継代することによって得(Mayr及びMalicki(1966)Zentralbl Veterinarmed 13 1〜3頁)、次いで、プラーク精製した。
Fp9のゲノムは十分に配列決定されており(配列番号1)、注解されている(図1)。FP9は、REVプロウイルスを含まない。FP9のゲノムは266kbpで、FPV−Mの推定される大きさ(300kbpより大きい)よりも幾分か小さい。
組換えFP9及びFPV−Mによって生起される免疫応答の比較
組換えFP9が、組換え抗原に対するT細胞応答を生起するその能力においてFPV−Mに対して優れているかどうかを調べるために、ネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲の表面タンパク質(PbCSP)を、相同組換えによって、両ウイルスのゲノムの末端6.8kbpBamHI断片(Boursnellら、1990a、J Gen Virol 71、621〜8頁、Boursnellら、1990b、Vet Microbiol 23、305〜16頁、Campbellら、1989、J Gen Virol 70、145〜54頁)に挿入した(Quingzhongら、1994、Vaccine 12、569〜73頁)。両組換えウイルスでは、ワクシニアp7.5初期−後期プロモーターを用いて挿入した遺伝子を発現させた。PbCSPタンパク質は、H−2Kd拘束性9アミノ酸ペプチドのエピトープを含み、これはBalb/cマウスでは肝臓段階のネズミマラリア原虫感染に対して保護的CD8+T細胞応答を誘導できる(Plebanskiら、1998、Eur J Immunol 28、4345〜55頁、Schneiderら、1998、Nat Med 4、397〜402頁)。驚くべきことに、PbCSP遺伝子をコードするFP9(FP9PbCSP)は、Balb/cマウスにおいて、CSP遺伝子をコードするFPV−M(FPV−MPbCSP)によって生起されたものよりもかなり高いCD8+媒介性T細胞応答を生起した。ただし、両ウイルスともウイルス抗原に対してかなりのT細胞応答を誘導した。(図3)。
組換えFP9が、組換え抗原に対するT細胞応答を生起するその能力においてFPV−Mに対して優れているかどうかを調べるために、ネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲の表面タンパク質(PbCSP)を、相同組換えによって、両ウイルスのゲノムの末端6.8kbpBamHI断片(Boursnellら、1990a、J Gen Virol 71、621〜8頁、Boursnellら、1990b、Vet Microbiol 23、305〜16頁、Campbellら、1989、J Gen Virol 70、145〜54頁)に挿入した(Quingzhongら、1994、Vaccine 12、569〜73頁)。両組換えウイルスでは、ワクシニアp7.5初期−後期プロモーターを用いて挿入した遺伝子を発現させた。PbCSPタンパク質は、H−2Kd拘束性9アミノ酸ペプチドのエピトープを含み、これはBalb/cマウスでは肝臓段階のネズミマラリア原虫感染に対して保護的CD8+T細胞応答を誘導できる(Plebanskiら、1998、Eur J Immunol 28、4345〜55頁、Schneiderら、1998、Nat Med 4、397〜402頁)。驚くべきことに、PbCSP遺伝子をコードするFP9(FP9PbCSP)は、Balb/cマウスにおいて、CSP遺伝子をコードするFPV−M(FPV−MPbCSP)によって生起されたものよりもかなり高いCD8+媒介性T細胞応答を生起した。ただし、両ウイルスともウイルス抗原に対してかなりのT細胞応答を誘導した。(図3)。
方法
雌のBalb/cマウスを1×106PFUのFP9又はFPV−M単独又はネズミマラリア原虫CSP(PbCSP)を発現するものを用いて静脈内注射により免疫化した。免疫化の7日後、脾細胞において生起されたT細胞免疫応答を、IFNγELSPOTアッセイを用いて測定した。組換え抗原、PbCSPに対する応答を、MHCクラスI拘束性Pb9エピトープ(CD8+T細胞によって認識される)を用いて測定した。陽性対照として、全ウイルスに対するT細胞応答を、免疫脾細胞を鶏痘ウイルスに感染したものに曝露することによって測定した。図1のカラムは、100万個の脾細胞当たりの平均IFN−γスポット形成細胞(SFC)±群当たり4個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
雌のBalb/cマウスを1×106PFUのFP9又はFPV−M単独又はネズミマラリア原虫CSP(PbCSP)を発現するものを用いて静脈内注射により免疫化した。免疫化の7日後、脾細胞において生起されたT細胞免疫応答を、IFNγELSPOTアッセイを用いて測定した。組換え抗原、PbCSPに対する応答を、MHCクラスI拘束性Pb9エピトープ(CD8+T細胞によって認識される)を用いて測定した。陽性対照として、全ウイルスに対するT細胞応答を、免疫脾細胞を鶏痘ウイルスに感染したものに曝露することによって測定した。図1のカラムは、100万個の脾細胞当たりの平均IFN−γスポット形成細胞(SFC)±群当たり4個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
FP9PbCSPを用いるプライム−ブースト免疫化レジメン及びネズミマラリア原虫に対する保護的免疫応答の誘導
Balb/cマウスにおける、FP9PbCSPによって生起されたCD8+T細胞応答と、DNAワクチン及びPbCSP抗原をコードするMVAによって生起されたCD8+T細胞応答との比較(図4)により、組換えFP9によって生起された応答は、組換えMVAによって生起されたものよりも低いが、DNAワクチンによって生起されたものよりもかなり高いということが示された。それにもかかわらず、FP9PbCSPは、DNAワクチンによって初回抗原刺激されたCD8+T細胞応答を追加免疫し、並びに、MVAPbCSPと組合せて初回抗原刺激剤又は追加免疫剤として作用した(図5)。注目に値すべきことに、FP9PbCSPを用いる初回抗原刺激と、それに続くMVAPbCSPを用いる追加免疫は、その他の同種又は異種プライム−ブースト免疫化レジメンよりも相当に高レベルの、ネズミマラリア原虫スポロゾイトを用いたチャレンジからの保護を誘導した。
Balb/cマウスにおける、FP9PbCSPによって生起されたCD8+T細胞応答と、DNAワクチン及びPbCSP抗原をコードするMVAによって生起されたCD8+T細胞応答との比較(図4)により、組換えFP9によって生起された応答は、組換えMVAによって生起されたものよりも低いが、DNAワクチンによって生起されたものよりもかなり高いということが示された。それにもかかわらず、FP9PbCSPは、DNAワクチンによって初回抗原刺激されたCD8+T細胞応答を追加免疫し、並びに、MVAPbCSPと組合せて初回抗原刺激剤又は追加免疫剤として作用した(図5)。注目に値すべきことに、FP9PbCSPを用いる初回抗原刺激と、それに続くMVAPbCSPを用いる追加免疫は、その他の同種又は異種プライム−ブースト免疫化レジメンよりも相当に高レベルの、ネズミマラリア原虫スポロゾイトを用いたチャレンジからの保護を誘導した。
方法
雌のBalb/cマウスを1×106PFUのFP9PbCSP(FP9)又はMVAPbCSP(MVA)を用いて静脈内注射により、又は50μgのpSG2PbCSP(DNA)を用いて筋内注射により免疫化し、2週間後、FP9PbCSP又はMVAPbCSPのいずれかを用いて追加免疫した。PbCSPに対する応答を、追加免疫の14日後にIFNγ ELISPOTアッセイで、MHCクラスI拘束性Pb9エピトープを用いて測定した。カラムは、100万個の脾細胞当たりの平均IFNγスポット形成細胞(SFC)±群当たり3個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
雌のBalb/cマウスを1×106PFUのFP9PbCSP(FP9)又はMVAPbCSP(MVA)を用いて静脈内注射により、又は50μgのpSG2PbCSP(DNA)を用いて筋内注射により免疫化し、2週間後、FP9PbCSP又はMVAPbCSPのいずれかを用いて追加免疫した。PbCSPに対する応答を、追加免疫の14日後にIFNγ ELISPOTアッセイで、MHCクラスI拘束性Pb9エピトープを用いて測定した。カラムは、100万個の脾細胞当たりの平均IFNγスポット形成細胞(SFC)±群当たり3個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
追加免疫の2週間後、動物を2000個のネズミマラリア原虫スポロゾイトを用いて静脈注射によってチャレンジし、続いて、チャレンジ後6〜14日、血液段階感染の間モニターした(表2)。結果は4実験を累積したものである。
種々の外来組換え抗原及びエピトープの鎖をコードするFP9ウイルスの構築
FP9を組換え抗原を送達するための一般的な系として使用できることを証明するために、原核生物及び真核生物双方を起源とする全抗原をコードする遺伝子並びにポリエピトープ及びポリタンパク質融合物をコードする合成遺伝子を、相同組換えによってFP9のゲノムに挿入した(表4)。これらの遺伝子は、構造が大きく異なり、種々の異なる病原体に由来する抗原をコードする。表4に列挙した各組換えFP9誘導体は、高濃度までニワトリ胚線維芽細胞でin vitro増殖させてあり、このことはそれらが生存可能であり、且つ、安定していることを示す。組換えウイルスのすべてで、ワクシニアp7.5初期−後期プロモーターを用いてコードされた抗原を発現させた。コードされた抗原は、これを調べたすべての場合で発現されることがわかった(表4)。これにはこれらの構築物のうち最大のもの、6種の融合マラリア抗原として発現されるポリタンパク質をコードする9.9kbpの合成遺伝子を含むFP9L3SEPTLが含まれる。
FP9を組換え抗原を送達するための一般的な系として使用できることを証明するために、原核生物及び真核生物双方を起源とする全抗原をコードする遺伝子並びにポリエピトープ及びポリタンパク質融合物をコードする合成遺伝子を、相同組換えによってFP9のゲノムに挿入した(表4)。これらの遺伝子は、構造が大きく異なり、種々の異なる病原体に由来する抗原をコードする。表4に列挙した各組換えFP9誘導体は、高濃度までニワトリ胚線維芽細胞でin vitro増殖させてあり、このことはそれらが生存可能であり、且つ、安定していることを示す。組換えウイルスのすべてで、ワクシニアp7.5初期−後期プロモーターを用いてコードされた抗原を発現させた。コードされた抗原は、これを調べたすべての場合で発現されることがわかった(表4)。これにはこれらの構築物のうち最大のもの、6種の融合マラリア抗原として発現されるポリタンパク質をコードする9.9kbpの合成遺伝子を含むFP9L3SEPTLが含まれる。
FP9による熱帯熱マラリア原虫抗原に対するT細胞免疫応答の誘導
熱帯熱TRAP遺伝子(Robsonら、1988、Nature 335、79〜82頁)と融合している熱帯熱マラリア原虫CSP由来のT細胞エピトープ及びPb9エピトープの鎖(Gilbertら、1997 Nat Biotechnol 15、1280〜4頁)を含むMEPfTrapポリペプチドを、ヒトにおける熱帯熱マラリアに対するワクチン接種用抗原として開発した。MEPfTrapをコードするFP9を構築し(表4)、Balb/cマウスで実施した力価試験でCD8+T細胞応答を生起することを示した(107±20個 IFNγスポット形成細胞/100万個脾細胞)。
熱帯熱TRAP遺伝子(Robsonら、1988、Nature 335、79〜82頁)と融合している熱帯熱マラリア原虫CSP由来のT細胞エピトープ及びPb9エピトープの鎖(Gilbertら、1997 Nat Biotechnol 15、1280〜4頁)を含むMEPfTrapポリペプチドを、ヒトにおける熱帯熱マラリアに対するワクチン接種用抗原として開発した。MEPfTrapをコードするFP9を構築し(表4)、Balb/cマウスで実施した力価試験でCD8+T細胞応答を生起することを示した(107±20個 IFNγスポット形成細胞/100万個脾細胞)。
FP9による、結核菌の抗原85Aに対するCD8+及びCD4+T誘導免疫応答の誘導
抗原85A(Ag85A)は、結核菌由来の主要な分泌及び保護抗原である。まず、結核菌由来のAg85AをコードするFP9によって生起された免疫応答をBalb/cマウスで測定した(図6)。抗原85Aは、20個のアミノ酸のH−2dMHCクラスII拘束性ペプチドエピトープ(CD4+T細胞によって認識される)と9個のアミノ酸のH−2dMHCクラスI拘束性エピトープ(CD8+T細胞によって認識される)とを含む(Huygenら、1994)。FP9Ag85Aを用いる免疫化によって、Ag85Aに対するCD4+とCD8+T細胞応答の双方が誘導され、このことは、FP9がマウスにおいて、コードされた抗原に対するCD4+並びにCD8+T細胞応答を誘導することを示す。さらなる実験では、アカゲザル(Rhesus macaque)において、FP9Ag85Aが、MVA85Aを用いる免疫化によって誘導されたT細胞応答の相当な追加免疫を誘導することがわかった(図7)。
抗原85A(Ag85A)は、結核菌由来の主要な分泌及び保護抗原である。まず、結核菌由来のAg85AをコードするFP9によって生起された免疫応答をBalb/cマウスで測定した(図6)。抗原85Aは、20個のアミノ酸のH−2dMHCクラスII拘束性ペプチドエピトープ(CD4+T細胞によって認識される)と9個のアミノ酸のH−2dMHCクラスI拘束性エピトープ(CD8+T細胞によって認識される)とを含む(Huygenら、1994)。FP9Ag85Aを用いる免疫化によって、Ag85Aに対するCD4+とCD8+T細胞応答の双方が誘導され、このことは、FP9がマウスにおいて、コードされた抗原に対するCD4+並びにCD8+T細胞応答を誘導することを示す。さらなる実験では、アカゲザル(Rhesus macaque)において、FP9Ag85Aが、MVA85Aを用いる免疫化によって誘導されたT細胞応答の相当な追加免疫を誘導することがわかった(図7)。
方法
雌のBalb/cマウスを1×107PFUの結核菌由来の抗原85Aをコードする組換えFP9(FP9Ag85A)を用いて、又は比較用に、1×106PFUの同一抗原をコードするMVAを用いて静脈内免疫化を施した。85Aに対する応答を、免疫化の6日後にIFNγ ELISPOTアッセイで、MHCクラスII拘束性P15エピトープ(CD4+T細胞によって認識される)及びMHCクラスI拘束性P11エピトープ(CD8+T細胞によって認識される)を用いて測定した。カラムは、100万個の脾細胞当たりの平均IFNγスポット形成細胞(SFC)±群当たり3個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
雌のBalb/cマウスを1×107PFUの結核菌由来の抗原85Aをコードする組換えFP9(FP9Ag85A)を用いて、又は比較用に、1×106PFUの同一抗原をコードするMVAを用いて静脈内免疫化を施した。85Aに対する応答を、免疫化の6日後にIFNγ ELISPOTアッセイで、MHCクラスII拘束性P15エピトープ(CD4+T細胞によって認識される)及びMHCクラスI拘束性P11エピトープ(CD8+T細胞によって認識される)を用いて測定した。カラムは、100万個の脾細胞当たりの平均IFNγスポット形成細胞(SFC)±群当たり3個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
抗原85Aをコードする組換えMVA(MVA85A)を用いて2回免疫化した雄のアカゲザルを、21及び26週後に5×108PFUのFP9Ag85Aを用いて追加免疫した(↓)。Ag85Aに対する応答を、IFNγ ELISPOTアッセイで、Ag85Aポリペプチドのアミノ酸配列にわたるオーバーラップペプチドのプールを用いて末梢血モノヌクレオサイト(mononucleocytes)(PBMC)で測定した。曲線は、4プールのペプチドの、100万個のPBMC当たりの平均IFNγスポット形成細胞(SFC)を表す。
FP9及びMVAは、ウイルス抗原に対する交差反応性T細胞を生起しない
様々であるが同一でないウイルスベクターを用いるプライム−ブースト免疫化が、組換え抗原に対するT細胞応答の増強を生起することを示唆する証拠がある(Gilbertら、Vaccine、印刷中)。最近の証拠により、ウイルスベクターに対するCD8+T細胞応答は、初回抗原刺激剤及び追加免疫剤として同一組換えウイルスを用いる場合には、追加免疫を阻害することが示唆されている(非公開の知見、Eric G.Sheu)。FP9PbCSPを用いて免疫化されたマウス由来の免疫脾細胞は、MVAに感染したナイーブ細胞に曝露した場合にはIFNγを産生しないが、FP9に感染した細胞に曝露した場合には産生する(図8)。逆に、MVAPbCSP免疫脾細胞は、MVAに感染したナイーブ細胞を認識するがFP9ではそうではない(図8)。これにもかかわらず、FP9PbCSP免疫脾細胞をMVAPbCSPに感染した脾細胞に曝露すると、又はその逆、IFNγ分泌T細胞応答を観察することができる(図8)。合わせて考えると、これらの結果は、組換えFP9及び組換えMVAが、両ウイルス由来の抗原と交差反応するT細胞を生起することなく、コードされた抗原に対するT細胞応答を生起することを示す。
様々であるが同一でないウイルスベクターを用いるプライム−ブースト免疫化が、組換え抗原に対するT細胞応答の増強を生起することを示唆する証拠がある(Gilbertら、Vaccine、印刷中)。最近の証拠により、ウイルスベクターに対するCD8+T細胞応答は、初回抗原刺激剤及び追加免疫剤として同一組換えウイルスを用いる場合には、追加免疫を阻害することが示唆されている(非公開の知見、Eric G.Sheu)。FP9PbCSPを用いて免疫化されたマウス由来の免疫脾細胞は、MVAに感染したナイーブ細胞に曝露した場合にはIFNγを産生しないが、FP9に感染した細胞に曝露した場合には産生する(図8)。逆に、MVAPbCSP免疫脾細胞は、MVAに感染したナイーブ細胞を認識するがFP9ではそうではない(図8)。これにもかかわらず、FP9PbCSP免疫脾細胞をMVAPbCSPに感染した脾細胞に曝露すると、又はその逆、IFNγ分泌T細胞応答を観察することができる(図8)。合わせて考えると、これらの結果は、組換えFP9及び組換えMVAが、両ウイルス由来の抗原と交差反応するT細胞を生起することなく、コードされた抗原に対するT細胞応答を生起することを示す。
さらなる予備的結果も、非複製カナリア痘ウイルスも、MVAと交差反応しないことが示す。したがって、一般に、アビポックスウイルス及びオルトポックスウイルスは、交差反応性T細胞を生起しない可能性があり、これにより、これらは同一のワクチン接種レジメンにおいて初回抗原刺激剤又は追加免疫剤として適したものとなる。
方法
Ex vivo IFNγ elispotは、FP9PbCSP又はMVAPbCSPのいずれかを用いる静脈内免疫化の14日後にマウスから単離した脾細胞において、PbCSP及びウイルス抗原に対して応答する。IFNγ応答は、免疫化した動物から単離した脾細胞を、Pb9ペプチドを用いてパルスしたナイーブな脾細胞又はFP9、FP9PbCSP、MVA又はMVAPbCSPに感染したものに曝露することによって測定した。カラム(図8)は、群当たり3個体のマウスの、100万個の脾細胞当たりのIFNγスポット形成細胞(sfc)の平均数±標準誤差を表す。
Ex vivo IFNγ elispotは、FP9PbCSP又はMVAPbCSPのいずれかを用いる静脈内免疫化の14日後にマウスから単離した脾細胞において、PbCSP及びウイルス抗原に対して応答する。IFNγ応答は、免疫化した動物から単離した脾細胞を、Pb9ペプチドを用いてパルスしたナイーブな脾細胞又はFP9、FP9PbCSP、MVA又はMVAPbCSPに感染したものに曝露することによって測定した。カラム(図8)は、群当たり3個体のマウスの、100万個の脾細胞当たりのIFNγスポット形成細胞(sfc)の平均数±標準誤差を表す。
アビポックスウイルスのin vitro増殖
野生型及び組換えポックスウイルスは、通常、培養ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)でin vitro増殖させる。本発明者らの研究室での、培養CEF単層に感染させることによって組換えFP9を増殖させる最初の試みでは、一貫性のないウイルスプラーク形成及び低いウイルス収率が認められた(表5)。対照的に、同様の培養CEFの感染後に、MVAの良好なプラーク形成及び一貫した高収率が認められた(表5)。新たに調製したCEFを、増殖させずにコンフルエント単層を得るのに十分な濃度で組織培養皿に入れることによって、一次「非培養」CEFを得ることができる。本発明者らは、FP9及び組換えFP9が、一次「非培養」CEFの単層の感染後に目に見えるウイルスプラークを形成し、ウイルスの良好な収率が得られることを見出した(表5)。同様に、本発明者らによって、一次「非培養」CEFを用いて、弱毒化カナリア痘ウイルス、ALVACのプラーク形成及び高収率が得られている。
野生型及び組換えポックスウイルスは、通常、培養ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)でin vitro増殖させる。本発明者らの研究室での、培養CEF単層に感染させることによって組換えFP9を増殖させる最初の試みでは、一貫性のないウイルスプラーク形成及び低いウイルス収率が認められた(表5)。対照的に、同様の培養CEFの感染後に、MVAの良好なプラーク形成及び一貫した高収率が認められた(表5)。新たに調製したCEFを、増殖させずにコンフルエント単層を得るのに十分な濃度で組織培養皿に入れることによって、一次「非培養」CEFを得ることができる。本発明者らは、FP9及び組換えFP9が、一次「非培養」CEFの単層の感染後に目に見えるウイルスプラークを形成し、ウイルスの良好な収率が得られることを見出した(表5)。同様に、本発明者らによって、一次「非培養」CEFを用いて、弱毒化カナリア痘ウイルス、ALVACのプラーク形成及び高収率が得られている。
これらの研究をまとめると、アビポックスウイルスは、増殖必要条件の点では、MVA及びおそらくはその他のオルトポックスウイルスよりも選好性であるということが示唆される。理論に拘束されようとは思わないが、本発明者らは、CEF内でのアビポックスウイルスの複製には、CEFがin vitro培養されると失われる特定の宿主分子が必要であると考えている。対照的に、一般に、MVA及びおそらくはオルトポックスウイルスは、この宿主分子を複製に必要としない。この知見の主な結果は、一次非培養CEFが、多量の組換えアビポックスウイルスの生産に必要とされることが多いということである。したがって、実際、第1相臨床試験用の組換えFP9の大規模生産は、「非培養」CEFを用いてのみ達成されている。
ヒトボランティアにおけるFP9による熱帯熱マラリア原虫マラリアに対する保護的免疫応答の誘導
FP9MEPfTrapの第1相臨床試験(実施例5参照):
健常な成人のボランティアを、3×107PFUを上回るFP9MEPfTrapを用いて2回免疫化し、続いて、同容量のMVAMEPfTrapを用いて追加免疫した。5人の免疫化したボランティアのうち2人が、病原性熱帯熱マラリア原虫マラリアに感染した雌のハマダラカ(anopheles stephensii mosquitoes)に刺されることによるチャレンジから保護された。
FP9MEPfTrapの第1相臨床試験(実施例5参照):
健常な成人のボランティアを、3×107PFUを上回るFP9MEPfTrapを用いて2回免疫化し、続いて、同容量のMVAMEPfTrapを用いて追加免疫した。5人の免疫化したボランティアのうち2人が、病原性熱帯熱マラリア原虫マラリアに感染した雌のハマダラカ(anopheles stephensii mosquitoes)に刺されることによるチャレンジから保護された。
対照的に、同一実験で、5人のマラリアナイーブなボランティアのうち4人は、熱帯熱マラリア原虫マラリアに屈した。したがって、まず、ヒトボランティアの組換え非複製ウイルスを用いる異種プライム−ブースト免疫化により、感染性疾病に対する保護的免疫応答を生起できることを証明すること。
保護は、ポックスウイルス免疫化が肝臓における熱帯熱マラリア原虫感染を防ぐことを証明する、ボランティアが血液段階マラリアを発症しないことによって測定した。
実験ではまた、MEPfTrapポリペプチドに対して生起されたT細胞応答によって媒介されると思われるが、保護の機序も調べている。
マラリアが風土病である領域における臨床試験
第1相試験
組換えFP9とMVAとを用いる異種プライム−ブースト免疫化レジメンが、マラリアに曝露された集団において免疫応答を追加免疫できるかどうかを調べるために、MEPfTrap分子をコードする構築物を用いる第1相臨床試験をガンビアで実施した。
第1相試験
組換えFP9とMVAとを用いる異種プライム−ブースト免疫化レジメンが、マラリアに曝露された集団において免疫応答を追加免疫できるかどうかを調べるために、MEPfTrap分子をコードする構築物を用いる第1相臨床試験をガンビアで実施した。
成人ボランティア(約12人)を、FP9MEPfTrap構築物を用いて2回免疫化し、単回用量のMVAMEPfTrapを用いて追加免疫した。血中T細胞及び抗体免疫応答を測定し、この研究の主な目的は、組換え非複製ポックスウイルスを用いる免疫化が、自然感染によって初回抗原刺激された既存の抗マラリア応答を追加免疫するかどうかを調べることである。
第2b相試験
第2b相試験はガンビア人の成人で、同一免疫化レジメンを用いて実施されている。
第2b相試験はガンビア人の成人で、同一免疫化レジメンを用いて実施されている。
ボランティアは、マラリアシーズン(6月〜12月)にわたって実施される試験の過程のあいだ、免疫応答の増強及び血液段階感染の証拠についてモニターされている。
さらなる試験
さらなる第1相試験も、結核菌及びHIVに対してワクチン接種するために適当な組換えFP9及びMVAを用いて、ガンビアで2002年の間実施されている。両試験は、それぞれの病原体に感染しているボランティアを用いて実施され、FP9及び2種の非複製ウイルスを用いる異種プライム−ブースト免疫化レジメン双方の、治療用ワクチンとして働く能力を評価している。
さらなる第1相試験も、結核菌及びHIVに対してワクチン接種するために適当な組換えFP9及びMVAを用いて、ガンビアで2002年の間実施されている。両試験は、それぞれの病原体に感染しているボランティアを用いて実施され、FP9及び2種の非複製ウイルスを用いる異種プライム−ブースト免疫化レジメン双方の、治療用ワクチンとして働く能力を評価している。
このようにして、本発明のワクチン接種が保護的応答を生じさせ、且つ/又は増強することが証明される。
非複製組換えポックスウイルスを用いる、ウシ結核菌BCGによって初回抗原刺激されたAg85Aに対するT細胞応答の追加免疫
ウシ結核菌BCGは、結核菌によって起こる結核に対するワクチンとして発展途上国中で子供に広く投与されている。重症幼児期型の結核に対して有効であるが、成人型の疾病に対するウシ結核菌BCGの保護的効力はかなり可変性であり、時間が経つと薄れると考えられている。Ag85Aはウシ結核菌BCG及び結核菌双方の主要な分泌抗原であるので、ウシ結核菌BCG免疫化によってAg85Aに対して生起された免疫応答を追加免疫することは、このワクチンの成人結核に対する保護的効力を増強するための確かな戦略である。この戦略は、他者によってマウスモデルにおいて、組換えAg85Aタンパク質を用いて(Brooksら、2001 Infect Immun 69、2714〜7頁)又はこの抗原をコードするDNAワクチンを用いて(Tangheら、2001 Infect Immun 69、3041〜7頁)追加免疫することによって実施されている。
ウシ結核菌BCGは、結核菌によって起こる結核に対するワクチンとして発展途上国中で子供に広く投与されている。重症幼児期型の結核に対して有効であるが、成人型の疾病に対するウシ結核菌BCGの保護的効力はかなり可変性であり、時間が経つと薄れると考えられている。Ag85Aはウシ結核菌BCG及び結核菌双方の主要な分泌抗原であるので、ウシ結核菌BCG免疫化によってAg85Aに対して生起された免疫応答を追加免疫することは、このワクチンの成人結核に対する保護的効力を増強するための確かな戦略である。この戦略は、他者によってマウスモデルにおいて、組換えAg85Aタンパク質を用いて(Brooksら、2001 Infect Immun 69、2714〜7頁)又はこの抗原をコードするDNAワクチンを用いて(Tangheら、2001 Infect Immun 69、3041〜7頁)追加免疫することによって実施されている。
FP9Ag85Aは、MVA85Aを用いた免疫化によって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫できるという知見に基づいて、本発明らは、ポックスウイルス構築物が、ウシ結核菌BCGによって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫できるかどうかを調べようとした。Balb/cマウスで実施した予備実験では、ウシ結核菌BCGを用いた免疫化によって初回抗原刺激されたAg85A CD4+とCD8+T細胞応答の双方とも追加免疫できることが示された(図9)。アカゲザルを用いて実施したさらなる実験によって、皮内又はエアゾール経路のいずれかによるウシ結核菌BCGを用いた免疫化が、Ag85Aに対するT細胞応答を誘導することが示された。ウシ結核菌BCGの投与後早期にMVA85Aを用いて追加免疫することにより、PPD及びAg85Aタンパク質に対する免疫応答の、可変性で短命の増強が生起された。しかし、FP9Ag85Aを用いたその後の追加免疫は、これらのタンパク質に対する(図10)、並びにAg85Aタンパク質配列にわたるペプチドプールに対するT細胞免疫応答を大きく増強した。さらなる実験は、免疫化された動物において生起されたT細胞応答の性質及び位置を測定する。
これらの実験は、マウスにおいて及び霊長類において、非複製ウイルスを、ウシ結核菌BCGによって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫するために使用できるという第1の例を提供する。さらに、それらにより、非複製ポックスウイルスは、ヒトにおいて結核筋による持続性潜在性感染症に対する治療用ワクチンとして有効であり得るという概念が確立される。
方法
Balb/cマウスをウシ結核菌BCGを用いて皮内(i.d.)で免疫化し、12週後に1×106PFUのMVA85Aを用いて皮内で追加免疫した。対照動物はウシ結核菌BCG又はMVA85A単独を用いて免疫化した。T細胞免疫応答は、免疫化の12日後にIFNγELISPOTアッセイでP15(CD4+)及びP11(CD8+)エピトープを用いて、PPD及びAg85Aに対して測定した。カラム(図9)は、100万個の脾細胞当たりの平均IFNγスポット形成細胞(SFC)±群当たり3個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
Balb/cマウスをウシ結核菌BCGを用いて皮内(i.d.)で免疫化し、12週後に1×106PFUのMVA85Aを用いて皮内で追加免疫した。対照動物はウシ結核菌BCG又はMVA85A単独を用いて免疫化した。T細胞免疫応答は、免疫化の12日後にIFNγELISPOTアッセイでP15(CD4+)及びP11(CD8+)エピトープを用いて、PPD及びAg85Aに対して測定した。カラム(図9)は、100万個の脾細胞当たりの平均IFNγスポット形成細胞(SFC)±群当たり3個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
雄のアカゲザルを、BCGを用いて皮内又はエアゾール送達のいずれかで免疫化し、5×108PFUの組換えMVA85Aを用いて2回及び5×108PFUのFP9Ag85Aを用いて2回追加免疫した。Ag85Aに対する応答を、IFNγELISPOTアッセイにおいて、精製Ag85A、組換えAg85B(Ag85Aと約80%の相同性を共有する)又は結核菌由来の精製タンパク質(PPD)を用いて末梢血モノヌクレオサイト(PBMC)で測定した。曲線(図10)は、単一の動物の100万個のPBMC当たりのIFNγスポット形成細胞(SFC)を表す。
鶏痘は有効なブーストである
3人の健常なマラリアナイーブなヒトボランティアを以下の通りに免疫化した:
0週に2mgのDNA−ME.TRAP筋内、
3週(21日目)に再度2mgの同一ワクチン筋内、
7週に1×108pfuのFP9−ME.TRAP皮内、及び
11週に1.5×108pfuのMVA−ME.TRAP皮内。
3人の健常なマラリアナイーブなヒトボランティアを以下の通りに免疫化した:
0週に2mgのDNA−ME.TRAP筋内、
3週(21日目)に再度2mgの同一ワクチン筋内、
7週に1×108pfuのFP9−ME.TRAP皮内、及び
11週に1.5×108pfuのMVA−ME.TRAP皮内。
PBMCにおいてELISPOTによって測定された平均応答を図11に示す。
ME応答は、大部分はCD8T細胞エピトープに対するものである。T996応答はTRAPの同種株に対するものであり、3D7応答はTRAPの異種株に対するものである。
FP9−ME.TRAPがDNAによって初回抗原刺激されたT細胞応答を追加免疫することは明らかである。MVA−ME.TRAPを用いたさらなる免疫化が、DDFレジメンによって誘導された応答を増強することも明らかである。
FP9が、ヒト霊長類においてT細胞応答に対する有効なブーストを提供することもさらに証明される。
ヒト霊長類におけるDNA、次いでFP9、次いでMVAを用いる三重免疫化レジメン(DDFM)の有効性もまた証明される。
鶏痘は有効なプライムである
マラリアナイーブなヒトボランティアを、FP9−MVAプライム−ブーストレジメンを用いて以下の通りに免疫化した:
この実施例では、2つのコホートがあり、一方は5人のワクチン接種された人であり、もう一方は12人のワクチン接種された人である。
マラリアナイーブなヒトボランティアを、FP9−MVAプライム−ブーストレジメンを用いて以下の通りに免疫化した:
この実施例では、2つのコホートがあり、一方は5人のワクチン接種された人であり、もう一方は12人のワクチン接種された人である。
FFMレジメン
0日目に、FP9−ME.TRAPを1×108pfuで皮内投与した
21日目に、FP9−ME.TRAPを1×108pfuで皮内投与した
49日目に、MVA−ME.TRAPを1.5×108pfuの用量で皮内投与した。
0日目に、FP9−ME.TRAPを1×108pfuで皮内投与した
21日目に、FP9−ME.TRAPを1×108pfuで皮内投与した
49日目に、MVA−ME.TRAPを1.5×108pfuの用量で皮内投与した。
すべてのボランティア及び非ワクチン接種対照を、感染性蚊が刺すことによって3D7株熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトを投与してチャレンジした。
第1のコホートでは、2/5のFFMワクチン接種された人が感染から十分に保護された。このレベルの保護は、種々の時点で同様にチャレンジされた24プールの非ワクチン接種対照とは有意に異なり(P<0.05、カイ二乗検定)、すべての対照が感染した。
保護された、2人のワクチン接種された人が6ヶ月後に再チャレンジされたが、1人は依然として十分に保護されていた。
第2のコホートでは11人のボランティアが同じようにチャレンジされたが、これらのワクチンにより、パテントマラリア寄生虫血症が対照ワクチンよりもかなり遅くに発生した(P<0.05)。
図12は、寄生虫は末梢血中では48時間毎に8倍に増殖すると仮定して算出した、ワクチン接種に起因する肝臓段階寄生虫の減少を示す。「後期FFM」群は、2人の再チャレンジを受けた人(前記参照)を表し、さらなるボランティアはまず、ワクチン接種の5ヶ月後にチャレンジされた(FFM群は最後のワクチン接種の13〜50日後にチャレンジされた)。
FP9を用いる単回の初回抗原刺激免疫化のみを投与された4人のワクチン接種を受けた人(「FM」)の結果も示す。ワクチン及び非ワクチン接種チャレンジ対照における、寄生虫血症に対する時間のログランク検定カプランマイヤー解析から危険率有意水準を算出する。
全体として、FFMワクチンでは、対照と比べて高度に有意な保護が認められた(P<0.01)。
DDMFレジメン(4週間間隔で2mg筋内の2回のDNA投与と、それに続く3〜4週間後の1.5×108MVA ME.TRAPと、それに続く3〜4週間後の1.0×108FP9−ME.TRAP)を用いて免疫化した4人の個人もまた、有意に保護された(P<0.05)。
したがって、FP9などの鶏痘は、本発明の方法において有効なプライム並びに有効なブーストであるということが証明される。
高用量免疫化レジメンの臨床試験
高用量プライム−ブーストレジメンを、マラリア感染に長期間曝露されていた地方のガンビア人の成人男性で調べた。
高用量プライム−ブーストレジメンを、マラリア感染に長期間曝露されていた地方のガンビア人の成人男性で調べた。
28人の被験者をME.TRAPワクチンを用いて、以下に示したレジメンの一方に従って免疫化した(群当たり14人の被験者/レジメン):
1)DDMレジメン
3〜4週間隔で2回(DDM)又は3回(DDDM)投与するDNA(2mg筋内)と、それに続くMVA−ME.TRAP1.5×108皮内(DDM群−図13ではDDM及びDDDMワクチン亜群は、これらの間に有意差がないのでまとめられている)
1)DDMレジメン
3〜4週間隔で2回(DDM)又は3回(DDDM)投与するDNA(2mg筋内)と、それに続くMVA−ME.TRAP1.5×108皮内(DDM群−図13ではDDM及びDDDMワクチン亜群は、これらの間に有意差がないのでまとめられている)
2)FFMレジメン
3週間隔で2回投与するFP9(1×108皮内)と、それに続くMVA−ME.TRAP1.5×108皮内(FFM群)。
3週間隔で2回投与するFP9(1×108皮内)と、それに続くMVA−ME.TRAP1.5×108皮内(FFM群)。
データは図13に示されている。
両群とも、ワクチン接種の前にマラリアME.TRAPインサートに対してT細胞応答を示した。これらの応答は、DNA免疫化よりもFP9免疫化によって追加免疫され(DD+7日とFF+7日を比較)、このことは、FP9免疫化がヒト霊長類において自然に初回抗原刺激されたT細胞応答を追加免疫することを示す。
DDMとFFMレジメンは双方とも、マラリアに自然に曝露されているこれらのボランティア被験体において高レベル(>250/100万個)T細胞応答を誘導した。
プライム−ブーストレジメン(DDM及びFFM)は、これらの個体におけるT細胞応答が自然マラリア感染によって初回抗原刺激されていても、FP9単独及びMVA単独よりも免疫原性であるということが証明される。
誘導された応答は、良好なマラリア株交差反応性を示す−TRAPのワクチン株(T996)と3D7非ワクチン株に対する応答の大きさは同等であることも証明される。
同一FFMレジメンを用いて免疫化した11人のヒト霊長類ボランティアにおいて同程度の免疫原性が認められた(図14参照)。
したがって、本発明による被験者の処置によって、被験者に保護的免疫応答が生じることが証明される。
霊長類におけるTB抗原に対する免疫化
結核に対するプライム−ブースト免疫化の潜在的に可能な保護効力を評価するために、以下の研究では、霊長類において組換えFP9を追加免疫剤として使用することを実施した。
結核に対するプライム−ブースト免疫化の潜在的に可能な保護効力を評価するために、以下の研究では、霊長類において組換えFP9を追加免疫剤として使用することを実施した。
この実施例では、霊長類は、マカク属のサル、天然に結核菌に対して感受性のある動物である。
オランダの生物医学霊長類センター(biomedical primate centre)(BPRC)で3個体のカニクイザル(cynomolgous macaques)を、BCGを用いて皮内で免疫化し、MVA−Ag85Aを8週間後に皮内投与し、さらに4週間後にFP9−Ag85Aを皮内投与した。対応する3個体の他のマカク属のサルは、BCG単独を用いて免疫化した。最終免疫化の4週間後、これらすべてのマカク属のサル及び免疫化していないマカク属のサルを、結核菌の多量気管内投与(1000CFU)でチャレンジした。動物は28週間観察し、イムノアッセイを実施し、動物をチャレンジ後28週で犠牲にし、剖検を実施した。
剖検時に、免疫化していないマカク属のサルはすべて、結核の巨視的証拠があり、1/3のBCGを用いて免疫化したマカク属のサルには結核の巨視的証拠がなく、2/3のBCG−MVA−FP9を用いて免疫化したマカク属のサルには結核の証拠がなかった。
PPD及びESAT−6を放線菌抗原として用いるチャレンジ後のELISPOTアッセイにより、BCG−MVA−FP9を用いて免疫化した動物において、チャレンジ対照よりもかなり低い応答が示された。
PPDを放線菌抗原として用いるチャレンジ後インターフェロンγELISAアッセイにより、BCG−MVA−FP9を用いて免疫化した動物において、BCG単独で、又はアジュバント単独(対照動物)で免疫化したチャレンジ対照よりもかなり低い応答が示され、このことは、これらのBCG−MVA−FP9プライム−ブーストされたマカク属のサルは、結核から極めて大きく保護されたという考えをサポートするものである(図18)。図は、カニクイザルの気管内結核菌チャレンジ後種々の週でのPPDに対する平均インターフェロンγ応答を示す。BCG−MVA−FP9動物は、PPDに対して最低の免疫応答を有し、このことにより、チャレンジ後の最小の結核菌複製、ひいては最大度の保護が示される。ESAT6を抗原として同様のデータを得た。
したがって、本発明に従ってプライム−ブースト免疫化されたマカク属のサルなどの霊長類は、結核から極めて大きく保護されていることが証明される。
FP9株は、CD8T細胞応答の初回抗原刺激及び追加免疫では、ウェブスター(Webster)のFPV−Mより強力である。
目的:FP9PbCSPが、MVAPbCSPと臨床上関連のある経路によって、プライム/ブーストレジメンで投与された場合に、FPV−MPbCSPと比べて抗原特異的T細胞応答の増強を生起するかどうかを調べること。
方法
雌のBALB/c(6〜8週齢)を、FPPbCSP、FPV−MPbCSP又はMVA PbCSPを用いて皮内で免疫化し、2週間後に同様の方法で追加免疫した。ウイルスは発熱物質を含まないPBSで2×107PFU/mlに希釈し、本願の実施例1及び2に記載したように特性決定し、25ulをマウスの各耳に両側注射することによって皮内投与した。免疫化の14日後、マウスを頸部脱臼によって犠牲にし、PbCSPのPb9エピトープ及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたT細胞応答を、以下に記載したようにIFNγアッセイを用いて測定した。
雌のBALB/c(6〜8週齢)を、FPPbCSP、FPV−MPbCSP又はMVA PbCSPを用いて皮内で免疫化し、2週間後に同様の方法で追加免疫した。ウイルスは発熱物質を含まないPBSで2×107PFU/mlに希釈し、本願の実施例1及び2に記載したように特性決定し、25ulをマウスの各耳に両側注射することによって皮内投与した。免疫化の14日後、マウスを頸部脱臼によって犠牲にし、PbCSPのPb9エピトープ及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたT細胞応答を、以下に記載したようにIFNγアッセイを用いて測定した。
マウスIFNγ ELISPOTプロトコール
A.材料
IFNγELISpot ALPキットMabtech3321−2A
600μg 抗IFNγ精製Mab AN18
50μg 抗INFγビオチン化Mab R46A2
50μl ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ
完全αMEM培地
500ml MEMα改変Sigma M−4526
50ml FCS[10%]Sigma F−2442
5ml ペニシリン/ストレプトマイシン[100Uペニシリン100μgストレプトマイシン]Sigma P−0781
10ml L−グルタミン[4mM]Sigma G−7513
500μl 2−メルカプトエタノール[50μm]Gibco BRL 31350−010
ACKバッファー
8.29g NH4Cl[0.15M](Sigma A−4514)
1g KHCO3[1mM](Sigma P−9144)
37.2mg Na2EDTA(Sigma ED2SS)
800ml ミリQ水
pHをHCl(Sigma S−7653)で7.2〜7.4に調製
水を加えて1000mlとし、オートクレーブ処理
呈色バッファー:
BioRad APコンジュゲート基質キット(170−6432)
1プレートにつき:
5ml 脱イオン水
200μlの25×バッファー
50μl 試薬A
50μl 試薬B
十分に混合し直ちに用いる
プロトコール
1.プレートの調製:
1.1 プレートのコーティング:MAIPマルチスクリーンプレート(Millipore MAIPS4510)をラット抗マウスIFNγ(Mab AN18)抗体でコーティングする。リン酸緩衝生理食塩水(PBS;Sigma P−3813)で10μg/mlに希釈し、ウェルあたり50μlをMAIPプレートに加える。加湿されたチャンバー内で4℃で一晩インキュベートする。
A.材料
IFNγELISpot ALPキットMabtech3321−2A
600μg 抗IFNγ精製Mab AN18
50μg 抗INFγビオチン化Mab R46A2
50μl ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ
完全αMEM培地
500ml MEMα改変Sigma M−4526
50ml FCS[10%]Sigma F−2442
5ml ペニシリン/ストレプトマイシン[100Uペニシリン100μgストレプトマイシン]Sigma P−0781
10ml L−グルタミン[4mM]Sigma G−7513
500μl 2−メルカプトエタノール[50μm]Gibco BRL 31350−010
ACKバッファー
8.29g NH4Cl[0.15M](Sigma A−4514)
1g KHCO3[1mM](Sigma P−9144)
37.2mg Na2EDTA(Sigma ED2SS)
800ml ミリQ水
pHをHCl(Sigma S−7653)で7.2〜7.4に調製
水を加えて1000mlとし、オートクレーブ処理
呈色バッファー:
BioRad APコンジュゲート基質キット(170−6432)
1プレートにつき:
5ml 脱イオン水
200μlの25×バッファー
50μl 試薬A
50μl 試薬B
十分に混合し直ちに用いる
プロトコール
1.プレートの調製:
1.1 プレートのコーティング:MAIPマルチスクリーンプレート(Millipore MAIPS4510)をラット抗マウスIFNγ(Mab AN18)抗体でコーティングする。リン酸緩衝生理食塩水(PBS;Sigma P−3813)で10μg/mlに希釈し、ウェルあたり50μlをMAIPプレートに加える。加湿されたチャンバー内で4℃で一晩インキュベートする。
1.2 プレートのブロッキング:コーティング抗体を振り捨て、マルチチャンネルピペットを用いて、プレートをウェル当たり150μlの滅菌PBS(Sigma P−3813)で1回洗浄する。PBSを振り捨て、ウェル当たり100μlの完全α−MEM培地を加え、室温で1+時間インキュベートする。この段階ではプレートを滅菌状態で維持することが重要である。
2.脾細胞調製:
2.1 個々の脾臓を、2mlのPBS中でペトリ皿に入れた細胞濾過器(Falcon352350)中の10mlシリンジのプランジャーで粉砕し、5mlのPBSを加え、ピペッティングすることによって脾細胞を懸濁し、50mlの試験管に移す。さらに10mlのPBSで細胞濾過器及び皿をすすぎ、50mlの試験管に加える。1500rpmで5分間遠心分離する。
2.1 個々の脾臓を、2mlのPBS中でペトリ皿に入れた細胞濾過器(Falcon352350)中の10mlシリンジのプランジャーで粉砕し、5mlのPBSを加え、ピペッティングすることによって脾細胞を懸濁し、50mlの試験管に移す。さらに10mlのPBSで細胞濾過器及び皿をすすぎ、50mlの試験管に加える。1500rpmで5分間遠心分離する。
2.2 上清を除去し、試験管をタッピングすることによって細胞を再懸濁し、5mlのACKバッファーを加え、反転することによって混合する。室温でわずか5分間インキュベートする。25mlのPBSを加え、反転することによって混合し、1500rpmで5分間遠心分離する。
2.3 上清を除去し、試験管をタッピングすることによってペレットを再懸濁し、10mlのPBSを加え、ボルテックス処理する。改良型ノイバウエル(Neubauer)血球計算器を用い、0.4%トリパンブルー溶液(Sigma T−8154)で1:10希釈することによって計数する。Elispotに必要な量をアリコートとし、1500rpmで5分間遠心分離し、適当な容量の完全αMEM培地中でボルテックス処理することによって再懸濁して1000万個細胞/mlの濃度とする。
3.プレート配置:
注意:プレートレイアウトは、特定の実験の必要に応じてオペレーターによって選択できる。
3.1 ブロッキング培地をプレートから振り捨て、3、4、7、8、11及び12列に50μlの完全αMEM培地を加える。
3.2 2連で、150μlの脾細胞を2、6及び10列に加える(プレート当たり最大12サンプル)。
3.3 50μlの脾細胞を2、6及び10列から採取し、1、5及び9列にそれぞれ移す:これらは負の対照ウェルである。
3.4 50μlを2、6及び10列から採取して3、7及び11列に入れ、十分に混合し、50μlを4、9及び12列に移すことによって各サンプルを段階希釈する。希釈の最終列をよく混合した後50μl廃棄する。
3.5 試験ペプチド及び対照ペプチドを、所望の最終濃度の2倍に、1000万個/完全α−MEM培地1mlで未処理の脾細胞に加える。50μlの対照ペプチド及び標的細胞を、1、5及び9列に加える。50μlの試験ペプチド及び標的細胞を残りの列に加える。
3.6 37℃で18〜20時間インキュベートする。
4.アッセイの発現
4.1 プレートを、0.05%Tween20(Sigma P1379)を含有するPBSで2回、蒸留水で1回、及びPBSTで2回洗浄する。
4.1 プレートを、0.05%Tween20(Sigma P1379)を含有するPBSで2回、蒸留水で1回、及びPBSTで2回洗浄する。
4.2 PBSで1μg/mlに希釈した、50μl/ウェルのビオチン化ラット抗マウスインターフェロンγを加える。室温で2時間インキュベートする。
4.3 プレートをPBSTで4回洗浄し、次いで、PBSで1μg/mlに希釈した、50μlのストレプトアビジンアルカリホスファターゼ(Mabtech)を加える。室温で1時間インキュベートする。
4.4 プレートをPBSTで4回洗浄し、50μl/ウェルの呈色バッファーを加える。
4.5 室温で、スポットが発現するまで(約10分)インキュベートする。プレートを水道水で十分に洗浄し、プラスチックの底部を剥がし、ペーパータオル上で一晩乾燥させる。
結果
結果は抗原特異的IFNγスポット形成細胞/100万個脾細胞(sfc/100万個)の数として算出した。マイクロソフトエクセル2000を用いて、スチューデントのT検定(等しい分散を仮定する2サンプル)によって群間の相違を調べた。
結果は抗原特異的IFNγスポット形成細胞/100万個脾細胞(sfc/100万個)の数として算出した。マイクロソフトエクセル2000を用いて、スチューデントのT検定(等しい分散を仮定する2サンプル)によって群間の相違を調べた。
FP9PbCSPは、初回抗原刺激剤として(P=0.002)又は追加免疫剤として(P=0.004)MVAPbCSPと併用した場合に、FPV−MPbCSPと比べて有意に増強されたPbCSPに対する抗原特異的T細胞応答を生起した(図15)。興味深いことに、FP9PbCSPを用いて初回抗原刺激されており、MVAPbCSPを用いて追加免疫された群とその逆の間に有意な相違はなかった。
したがって、FP9PbCSPは、初回抗原刺激剤及び/又は追加免疫剤としてFPV−MPbCSPよりも強力であり、組換えMVAと併用した初回抗原刺激剤又は追加免疫剤としては同程度に強力であることを証明した。
組換えFP9はウイルス疾病から保護する
目的
組換えFP9を単独で又はプライム/ブーストレジメンで用いた免疫化が、ウイルス及び腫瘍抗原由来のCD4+及びCD8+T細胞エピトープに対するT細胞応答を生起するかどうかを調べること。
目的
組換えFP9を単独で又はプライム/ブーストレジメンで用いた免疫化が、ウイルス及び腫瘍抗原由来のCD4+及びCD8+T細胞エピトープに対するT細胞応答を生起するかどうかを調べること。
方法
リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)抗原及びマウス腫瘍(P815及びCT26)抗原由来の、特性決定されたCD8+及びCD4+拘束性エピトープからなる新規ポリペプチドをコードする440bpの合成遺伝子(ME1)を、以下の通りに合成した:
ME1モデルエピトープ鎖:
慢性感染(LCMV)及び癌(P815/CT26)のマウスモデルにおいて関連のある、腫瘍及びウイルスエピトープをコードするT細胞エピトープ鎖を以下に示すように作製した。
リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)抗原及びマウス腫瘍(P815及びCT26)抗原由来の、特性決定されたCD8+及びCD4+拘束性エピトープからなる新規ポリペプチドをコードする440bpの合成遺伝子(ME1)を、以下の通りに合成した:
ME1モデルエピトープ鎖:
慢性感染(LCMV)及び癌(P815/CT26)のマウスモデルにおいて関連のある、腫瘍及びウイルスエピトープをコードするT細胞エピトープ鎖を以下に示すように作製した。
潜在的に可能な免疫競合を避けるために、LCMV由来エピトープはH−2b拘束性とし、癌エピトープはH−2d拘束性とする。エピトープの順序はH−2dとH−2b間で交代にする。
エピトープ鎖配列
エピトープを示すもの:
クローニング部位Kozak M[GLNGPDIYKGVYQFKSVEFD][KAVYNFATCGI][LPYLGWLVF][FQPQNGQFI][GYCGLRGTGV][SGVENPGGYCL][SPSYAYHQF][YTVKYPNL][TPHPARIGL][CSANNSHHYI][SGEGWPYIACRTSIVGRAWE][DAPIYTNV][YPYDVPDYA]AA(停止シグナル)
アミノ酸鎖:
MGLNGPDIYKGVYQFKSVEFDKAVYNFATCGILPYLGWLVFFQPQNGQFIGYCGLRGTGVSGVENPGGYCLSPSYAYHQFYTVKYPNLTPHPARIGLCSANNSHHYISGEGWPYIACRTSIVGRAWEDAPIYTNVYPYDVPDYAAA
フランキングヌクレオチド及びアミノ酸
GGGCCCGCCGCCACCATGG...
MGLNGPDIYKGVYQFKSVEFDKAVYNFATCGIL
PYLGWLVFFQPQNGQFIGYCGLRGTGVSGVENPGGYCLSPSYAYHQFYTVKYPNLTP
HPARIGLCSANNSHHYISGEGWPYIACRTSIVGRAWEDAPI
...TAAGGCGCGCC
YTNVYPYDVPDYAAA
エピトープ鎖はApaIもAscI標的配列も含まない。
エピトープを示すもの:
クローニング部位Kozak M[GLNGPDIYKGVYQFKSVEFD][KAVYNFATCGI][LPYLGWLVF][FQPQNGQFI][GYCGLRGTGV][SGVENPGGYCL][SPSYAYHQF][YTVKYPNL][TPHPARIGL][CSANNSHHYI][SGEGWPYIACRTSIVGRAWE][DAPIYTNV][YPYDVPDYA]AA(停止シグナル)
アミノ酸鎖:
MGLNGPDIYKGVYQFKSVEFDKAVYNFATCGILPYLGWLVFFQPQNGQFIGYCGLRGTGVSGVENPGGYCLSPSYAYHQFYTVKYPNLTPHPARIGLCSANNSHHYISGEGWPYIACRTSIVGRAWEDAPIYTNVYPYDVPDYAAA
フランキングヌクレオチド及びアミノ酸
GGGCCCGCCGCCACCATGG...
MGLNGPDIYKGVYQFKSVEFDKAVYNFATCGIL
PYLGWLVFFQPQNGQFIGYCGLRGTGVSGVENPGGYCLSPSYAYHQFYTVKYPNLTP
HPARIGLCSANNSHHYISGEGWPYIACRTSIVGRAWEDAPI
...TAAGGCGCGCC
YTNVYPYDVPDYAAA
エピトープ鎖はApaIもAscI標的配列も含まない。
エピトープ鎖は、ポックスウイルス初期遺伝子転写終結配列、TTTTTNTを含まない。
ベクター製造
ME1エピトープ鎖をDNAワクチンベクター(PSG2)及び鶏痘シャトルベクターpEFL29に連結した。次いで、プラスミドpEFL29.ME1を、確立された方法に従ってFP9の染色体に組換え、FP9.ME1を構築した。
ME1エピトープ鎖をDNAワクチンベクター(PSG2)及び鶏痘シャトルベクターpEFL29に連結した。次いで、プラスミドpEFL29.ME1を、確立された方法に従ってFP9の染色体に組換え、FP9.ME1を構築した。
次いで、このウイルスを、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)で増殖させ、30%ショ糖クッションを通して遠心分離することによって大量精製した。ウイルスの力価を、確立された方法にしたがって、CEFで滴定し、X−galで染色することによって確認した。ウイルスは、発熱物質を含まないPBSに1×107PFU/mlに懸濁することによって免疫化用に調製した。プラスミドPSG2.ME1は、Qiagen Gigaカラムを用いて大量精製し、発熱物質を含まないPBSに1mg/mlで再懸濁した。
雌のBALB/c(H−2d)C57BL/6(H−2b)マウス(6〜8週齢)を、PSG2.ME1又は無関係なエピトープ鎖を含む対照プラスミドpSG2.Mel3を用いて筋内(im.)で免疫化した。ウイルスFP9.ME1及び空の対照ウイルスFP9.EFL29を、尾の静脈に1×106PFUの用量で静脈内(iv.)投与した。動物を、免疫化の2週間後に追加免疫した。追加免疫の14日後、マウスを頸部脱臼によって犠牲にし、LCMV、P815、CT26及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたT細胞応答を、実施例16に記載したようなIFNγアッセイを用いて測定した。
結果は、抗原特異的IFNγスポット形成細胞/100万個の脾細胞(sfc/100万個)として算出した。群間の相違は、マイクロソフトエクセル2000を用いてスチューデントのT検定(等しい分散を仮定する2サンプル)及びANOVAによって調べた。
実験設計及び結果
ウイルスと腫瘍エピトープ間の競合を避けるために、ME1は、H−2bハプロタイプマウスに特徴的なLCMV抗原由来のエピトープと、H−2dハプロタイプマウスに特徴的な腫瘍抗原由来のものとをコードする。したがって、FP9.ME1の、CD4+及びCD8+T細胞エピトープを生起する能力を、表6に記載したようにBALB/c(H−2d)C57BL/6(H−2d)マウス双方で調べた。これらの実験の結果を表6に示す。
ウイルスと腫瘍エピトープ間の競合を避けるために、ME1は、H−2bハプロタイプマウスに特徴的なLCMV抗原由来のエピトープと、H−2dハプロタイプマウスに特徴的な腫瘍抗原由来のものとをコードする。したがって、FP9.ME1の、CD4+及びCD8+T細胞エピトープを生起する能力を、表6に記載したようにBALB/c(H−2d)C57BL/6(H−2d)マウス双方で調べた。これらの実験の結果を表6に示す。
実験1及び2を平行して実施した。各群には4個体の6〜8週齢の雌のマウスを含めた。ワクチンは、方法に記載した通りに投与し、初回抗原刺激と追加免疫は14〜16日離れている。T細胞応答は、実施例16におけるようなIFNγ ELISPOTアッセイによって、LCMV、腫瘍及び前記のモデルエピトープを用いて測定した。結果は、LCMV及び腫瘍由来エピトープに対する累積応答に関し、これはマウスマラリア及び結核モデルを用いた知見に基づいている。
組換え体FP9は癌から保護する
目的
マウスにおいて、FP9.ME1を単独で又はpSG2.ME1とともにプライム/ブーストレジメンで用いた免疫化が、CT26腫瘍チャレンジに対する保護的免疫応答を生起するかどうかを調べること。したがって、組換えFP9が、癌から保護する抗原特異的T細胞応答を生起できることを概ね証明すること。
目的
マウスにおいて、FP9.ME1を単独で又はpSG2.ME1とともにプライム/ブーストレジメンで用いた免疫化が、CT26腫瘍チャレンジに対する保護的免疫応答を生起するかどうかを調べること。したがって、組換えFP9が、癌から保護する抗原特異的T細胞応答を生起できることを概ね証明すること。
方法
雌のBALB/c(H−2d)マウス(6〜8週齢)に、pSG2.ME1、FP9.ME1又は前記のような対照構築物pSG.Mel3及びFP9.EFL29を用いて注射する。動物に免疫化の2週間後に追加免疫を行う。追加免疫の14日後、マウスの左脇腹に、以下の通りに5×105個CT26腫瘍細胞を用いて皮下(sc.)注射することによってチャレンジする。
雌のBALB/c(H−2d)マウス(6〜8週齢)に、pSG2.ME1、FP9.ME1又は前記のような対照構築物pSG.Mel3及びFP9.EFL29を用いて注射する。動物に免疫化の2週間後に追加免疫を行う。追加免疫の14日後、マウスの左脇腹に、以下の通りに5×105個CT26腫瘍細胞を用いて皮下(sc.)注射することによってチャレンジする。
CT26腫瘍の皮下増殖
いくつかの実験上の問題は、皮下に移植した測定可能な充実腫瘍塊を用いることで最良に対処される。CT26細胞はこの実験アプローチを受け入れられる。従来の野生型CT26細胞は、皮下空間では横方向拡大様式で増殖するが、高度にトランスフェクト可能な変異体、CT26は、おそらくは接着性の増加と関連して、より緻密な腫瘍塊として良好に増殖し、これによって測定値がより再現性のあるものとなる。
いくつかの実験上の問題は、皮下に移植した測定可能な充実腫瘍塊を用いることで最良に対処される。CT26細胞はこの実験アプローチを受け入れられる。従来の野生型CT26細胞は、皮下空間では横方向拡大様式で増殖するが、高度にトランスフェクト可能な変異体、CT26は、おそらくは接着性の増加と関連して、より緻密な腫瘍塊として良好に増殖し、これによって測定値がより再現性のあるものとなる。
材料
CT26細胞
10%(w/v)FCSを含む完全DMEM培地
滅菌PBS
BALB/cマウス、6〜8週齢
1ml滅菌使い捨てシリンジ
16−G及び25−Gのニードル
ノギス
細胞を計数するためのさらなる試薬及び装置。
CT26細胞
10%(w/v)FCSを含む完全DMEM培地
滅菌PBS
BALB/cマウス、6〜8週齢
1ml滅菌使い捨てシリンジ
16−G及び25−Gのニードル
ノギス
細胞を計数するためのさらなる試薬及び装置。
1.10%FCSを含む完全DMEM培地でCT26細胞を培養する。
2.細胞を回収し、200×g、室温で5分間遠心分離することによってPBSで2回すすぐ。
3.細胞を計数し、PBSに2×107個細胞/mlで再懸濁する。懸濁液を1mlシリンジに移し、次いで16−Gニードルを25−Gニードルに変更する。
4.50μl/マウスを皮下注射することによってBALB/cマウスに播種する。
穏やかにタッピングし、反転することによって、注射の直前にシリンジ中で細胞が確実に均一に再懸濁されるようにする。
所与の条件により106個の腫瘍細胞が移植されることとなる。2×105〜1×107個細胞の細胞濃度を用いることに成功した。
5.手順は1人のオペレーターによって迅速に達成することができる。マウスを左手に持ち、首筋を最初の2本の指の間に入れ、尾を掌と4番目の指で挟む。右手は、シリンジを持ち、ニードルをマウスの左脇腹の皮膚のみを通して挿入する。手段としてのシリンジとニードルを用いながら、皮膚をマウスの体から離して穏やかに持ち上げ、確実にニードルの先が皮下空間にあるようにしなければならない。その時に初めて50μl容量を押し出す。
マウスを、少なくとも週に2回、腫瘍増殖について調べるために、及び全身の健康状態を評価するために調査する。腫瘍が現れれば、ノギスを用いて最長及び最短寸法を測定及び記録する。
これらの2つの測定値の平均により、そのマウスのその時点での平均腫瘍直径が得られる。
腫瘍はまず、移植の1週間後には触診できる。測定値は0.5mm近くになっているはずである。
マウスは、腫瘍発達の証拠についてチャレンジ後2週間観察し、その後犠牲にし、解剖する。腫瘍の大きさは、腫瘍の長さと幅を測定し、次いで、これらの測定値の平均をとることによって求める。GraphPrism Instatを用いて、フィッシャーの精密検定によって求められる腫瘍発生率の相違について、及びスチューデントのT検定(等しくない分散を仮定する2サンプル)を用いて腫瘍の大きさの相違について統計解析を実施する。
実験設計及び予想される結果
CT26は、BALB/cマウス由来の結腸癌腫細胞株である。DT26は、BALB/cマウスにおいて、皮下注射の約1週間後に充実腫瘍を形成する。ME1エピトープ鎖は、CT26腫瘍によって発現される(前記参照)、MuLVgp70エンベロープタンパク質由来の保護的CD8+拘束性エピトープを含む。pSG2.ME1とそれに続いてFP9.ME1を用いるプライム/ブースト免疫化レジメンは、このエピロープに対して増強されたCD8+T細胞免疫応答を生起するので(前記参照)、本発明者らは、この免疫化レジメンは、BALB/cマウスにいおてCT26チャレンジからの保護を生起するということを示した。表7は結果を示す。
CT26は、BALB/cマウス由来の結腸癌腫細胞株である。DT26は、BALB/cマウスにおいて、皮下注射の約1週間後に充実腫瘍を形成する。ME1エピトープ鎖は、CT26腫瘍によって発現される(前記参照)、MuLVgp70エンベロープタンパク質由来の保護的CD8+拘束性エピトープを含む。pSG2.ME1とそれに続いてFP9.ME1を用いるプライム/ブースト免疫化レジメンは、このエピロープに対して増強されたCD8+T細胞免疫応答を生起するので(前記参照)、本発明者らは、この免疫化レジメンは、BALB/cマウスにいおてCT26チャレンジからの保護を生起するということを示した。表7は結果を示す。
12BALB/cマウスの群を、14日離して、示したように初回抗原刺激及び追加免疫する。追加免疫の14日後、動物をCT26細胞を用いて左脇腹に皮下注射することによってチャレンジする。動物は2週間観察し、次いで、解剖し、腫瘍の存在及び大きさを方法に記載したように測定する。
表は16で示された免疫原性データに基づいた腫瘍発生率を示す。各群の平均の腫瘍の大きさの相違も予測されるが、表には示していない。
組換えFP9は、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)から保護する
目的:マウスにおいて、FP9.ME1を単独で又はPSG2.ME1とともにプライムブーストレジメンで用いた免疫化が、LCMVチャレンジに対する保護的免疫応答を生起するかどうかを調べること。
目的:マウスにおいて、FP9.ME1を単独で又はPSG2.ME1とともにプライムブーストレジメンで用いた免疫化が、LCMVチャレンジに対する保護的免疫応答を生起するかどうかを調べること。
これにより、組換えFP9が、本発明に従って用いた場合に、ウイルス感染から保護する抗原特異的CD4+及びCD8+T細胞応答を生起できることが証明される。
方法
雌のC57BL/6(H−2b)マウス(6〜8週齢)に、PSG2.ME1、FP9.ME1又は前記のような対照構築物pSG2.Mel3及びFP9.EFL29を用いて注射した。動物には免疫化の2週間後に追加免疫を行った。追加免疫の14日後、群当たり6個体の動物を2×105PFU LCMV Armstrong(穏やかな感染)を用いて腹腔内(ip.)注射することによって、また6個体の動物を2×106PFU LCMVクローン13(重症感染)を用いてiv.でチャレンジした。
雌のC57BL/6(H−2b)マウス(6〜8週齢)に、PSG2.ME1、FP9.ME1又は前記のような対照構築物pSG2.Mel3及びFP9.EFL29を用いて注射した。動物には免疫化の2週間後に追加免疫を行った。追加免疫の14日後、群当たり6個体の動物を2×105PFU LCMV Armstrong(穏やかな感染)を用いて腹腔内(ip.)注射することによって、また6個体の動物を2×106PFU LCMVクローン13(重症感染)を用いてiv.でチャレンジした。
LCMV Armstrongを用いてチャレンジした動物は、チャレンジの3日後に犠牲にし、LCMVクローン13を用いてチャレンジしたものはチャレンジの7日後に犠牲にした。
チャレンジされた動物の脾臓中のウイルス含量を以下の通りに測定する:
LCMVの滴定のためのプラークアッセイ
1. 3mlの培地中の3×105個のベロ細胞をアリコートとし、6ウェルプレートの各ウェルに入れ、5%CO2下、コンフルエント単層を形成するまで37℃で一晩培養する。
LCMVの滴定のためのプラークアッセイ
1. 3mlの培地中の3×105個のベロ細胞をアリコートとし、6ウェルプレートの各ウェルに入れ、5%CO2下、コンフルエント単層を形成するまで37℃で一晩培養する。
2. 1:100(10μlサンプル+1ml培地)で出発して、その後10倍希釈(100μl+900μl培地)を作製し、氷上で試験サンプルの段階希釈を作製する。
3. ベロ細胞から培地を除去し(単層を破損しないよう注意しながら)、ウェル当たり500μlの希釈した試験サンプルを加える。培地のみを加えたウェルを負の対照として、アッセイ当たり少なくとも1つ含める。プレートを、5%CO2下37℃で1時間インキュベートしてウイルス感染させる。
4. 各ウェルを3〜4mlの、1%アガロース水溶液と10%FBSを含有する2×199培地の1:1混合物で覆う。プレートをホイルに包み、5%CO2インキュベーター下37℃で6日間培養する。
5. 固定及び染色する。
エクセル2000を用いて、カイ二乗検定によって求められる感染の発生率の相違について、及びスチューデントのT検定(等しい分散を仮定する2サンプル)を用いて求められるウイルス含量の相違について統計解析を実施した。両側P値をすべての場合に求めた。
結果
LCMVは十分に特性決定されたウイルスであり、マウスにおいて慢性及び急性感染を引き起こす。Armstrong株は、穏やかな、自己回復性感染を引き起こし、他方、クローン13株は、慢性感染に発達し得る重症感染を引き起こす。ME1エピトープ株は、LCMV由来の2種のCD4+エピトープといくつかのCD8+拘束性エピトープ(前記参照)を含むよう設計し、それらのうちのいくつかはLCMV感染に対して保護的であると特性決定されている。FP9.ME1を用いるプライム/ブースト免疫化は、ME1中のLCMVエピトープに対する有意に増強されたT細胞応答を生起するので(図17)、この免疫化レジメンは、LCMVのArmstrong及びクローン13株の双方を用いるチャレンジに対して保護的効力を示す。表8は結果を示す。
LCMVは十分に特性決定されたウイルスであり、マウスにおいて慢性及び急性感染を引き起こす。Armstrong株は、穏やかな、自己回復性感染を引き起こし、他方、クローン13株は、慢性感染に発達し得る重症感染を引き起こす。ME1エピトープ株は、LCMV由来の2種のCD4+エピトープといくつかのCD8+拘束性エピトープ(前記参照)を含むよう設計し、それらのうちのいくつかはLCMV感染に対して保護的であると特性決定されている。FP9.ME1を用いるプライム/ブースト免疫化は、ME1中のLCMVエピトープに対する有意に増強されたT細胞応答を生起するので(図17)、この免疫化レジメンは、LCMVのArmstrong及びクローン13株の双方を用いるチャレンジに対して保護的効力を示す。表8は結果を示す。
12個体のC57BL/6マウスの群を、14日間離して、示した通りに初回抗原刺激及び追加免疫する。追加免疫の14日後、群当たり6個体の動物を、LCMV Armstrong(穏やかな感染)及びLCMVクローン13(重症感染)を用いて方法に記載した通りにチャレンジする。このアッセイの検出限界は1000pfu/器官(log103.00)である。
群A、B及びCのウイルス含量は、群当たり6個体を用いる結果に基づいている。D、E及びFのウイルス含量は、図17に示される免疫原性結果に基づいている。
図15は、FP9PbCSP、FPV−MPbCSP及びMVAPbCSPを用いる異種プライム/ブースト免疫化後の抗原特異的免疫応答を示す。BALB/cマウスを、FP9PbCSP(FP9)、FPV−MPbCSP(FPV−M)又はMVAPbCSPを用いて両側の耳に皮内で免疫化し、14日後同様の方法で異種追加免疫した。ブースター免疫化の14日後、PbCSPのPb9エピトープ及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたT細胞応答を、脾細胞においてIFNγELISPOTアッセイを用いて測定した。カラムは、平均抗原特異的IFNγsfc/100万個脾細胞±群当たり4個体のマウスの1標準偏差を表す。P値は、マイクロソフトエクセル2000を用いて、等しい分散を仮定するスチューデントのT検定によって求めた。
ウェブスターの弱毒鶏痘はFP9とは異なっている
この実施例では、既存の鶏痘ベクターと比較したFP9の独特の特性が証明される。FP9の遺伝子組成を前記のように調べ、既存のポックスベクター「ウェブスター」と比較する。データを表9に示す。
この実施例では、既存の鶏痘ベクターと比較したFP9の独特の特性が証明される。FP9の遺伝子組成を前記のように調べ、既存のポックスベクター「ウェブスター」と比較する。データを表9に示す。
欠失
FP9には、病原性US FPV配列(FPV US;Afonsoら、2000)と比べて25の欠失が認められた。これらのうち6はUSとヨーロッパ系統間の相違であり、19は継代(及び付随する弱毒化)の間に生じ、これが最終的にFP9をもたらした。
FP9には、病原性US FPV配列(FPV US;Afonsoら、2000)と比べて25の欠失が認められた。これらのうち6はUSとヨーロッパ系統間の相違であり、19は継代(及び付随する弱毒化)の間に生じ、これが最終的にFP9をもたらした。
19の継代特異的欠失遺伝子座のうち、15をウェブスター(FPV−M)で調べたところ、すべてがFPVUSと同一であるがFP9のものとは異なる配列を示す。
挿入
同様に、15の挿入がFP9とFPV USを区別する。これらのうち、5は継代及び弱毒化の間に生じた。
同様に、15の挿入がFP9とFPV USを区別する。これらのうち、5は継代及び弱毒化の間に生じた。
これら5つのうち1つの継代特異的挿入遺伝子座をウェブスターで調べたところ、FPV USと同一であるが、FP9とは異なる配列を示す。
塩基置換
77の一塩基置換によって、FP9はFPV USと区別される。これらのうち、25は継代及び弱毒化の間に生じた。
77の一塩基置換によって、FP9はFPV USと区別される。これらのうち、25は継代及び弱毒化の間に生じた。
これら25のうち11の継代特異的置換部位をウェブスターで調べたところ、すべての場合で、FPV USと同一であるが、FP9とは異なる配列を有している。したがって、HP1にも認められる別のFP9突然変異は系統特異的突然変異であり、ウェブスターではFPV USと同一である。
したがって、ウェブスター弱毒化ワクチンは、FP9とは明らかに遺伝的に区別される。
組換えFP9は、ウイルス及び腫瘍由来エピトープに対するCD4及びCD8T細胞応答を生起する
目的
実施例17に加え、この実施例では、組換えFP9を単独で又はプライム/ブーストレジメンで用いた免疫化が、ウイルス及び腫瘍抗原由来のCD4+及びCD8+T細胞エピトープに対するT細胞応答を生起するかどうかをさらに調べる。
目的
実施例17に加え、この実施例では、組換えFP9を単独で又はプライム/ブーストレジメンで用いた免疫化が、ウイルス及び腫瘍抗原由来のCD4+及びCD8+T細胞エピトープに対するT細胞応答を生起するかどうかをさらに調べる。
方法
リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)抗原及びマウス腫瘍(P815及びCT26)抗原由来の、特性決定されたCD8+及びCD4+拘束性エピトープからなる新規ポリペプチド(ME1)をコードする440bpの合成遺伝子を合成した(前記参照)。ME1をDNAワクチンベクター(PSG2)及び鶏痘シャトルベクターpEFL29に連結した。次いで、プラスミドpEFL29.ME1を、確立された方法に従ってFP9の染色体に組換え、FP9.ME1を構築した。次いで、このウイルスを、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)で増殖させ、30%ショ糖クッションを通して遠心分離することによって大量精製した。ウイルスの力価は、確立された方法にしたがって、CEFで滴定し、X−galで染色することによって確認した。ウイルスは、発熱物質を含まないPBSに1×107PFU/mlに懸濁することによって免疫化用に調製した。プラスミドpSG2.ME1は、Qiagen Gigaカラムを用いて大量精製し、発熱物質を含まないPBSに1mg/mlで再懸濁した。
リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)抗原及びマウス腫瘍(P815及びCT26)抗原由来の、特性決定されたCD8+及びCD4+拘束性エピトープからなる新規ポリペプチド(ME1)をコードする440bpの合成遺伝子を合成した(前記参照)。ME1をDNAワクチンベクター(PSG2)及び鶏痘シャトルベクターpEFL29に連結した。次いで、プラスミドpEFL29.ME1を、確立された方法に従ってFP9の染色体に組換え、FP9.ME1を構築した。次いで、このウイルスを、ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)で増殖させ、30%ショ糖クッションを通して遠心分離することによって大量精製した。ウイルスの力価は、確立された方法にしたがって、CEFで滴定し、X−galで染色することによって確認した。ウイルスは、発熱物質を含まないPBSに1×107PFU/mlに懸濁することによって免疫化用に調製した。プラスミドpSG2.ME1は、Qiagen Gigaカラムを用いて大量精製し、発熱物質を含まないPBSに1mg/mlで再懸濁した。
雌のBALB/c(H−2d)又はC57BL/6(H−2b)マウス(6〜8週齢)を、50μgのpSG2.ME1又は無関係なエピトープ鎖を含む対照プラスミドpSG2.Mel3を用いて筋内(im.)で免疫化した。ウイルスFP9.ME1及び空の対照ウイルスFP9.EFL29を、尾の静脈に1×106PFUの用量で静脈内(iv.)投与した。動物は免疫化の14〜15日後に追加免疫した。追加免疫の14〜15日後、マウスを頸部脱臼によって犠牲にし、LCMV、P815、CT26及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたT細胞応答を、前記のようにIFNγアッセイを用いて測定した。結果は、抗原特異的IFNγスポット形成細胞/100万個の脾細胞(sfc/100万個)として算出した。群間の相違は、マイクロソフトエクセル2000を用い、スチューデントのT検定(等しくない分散を仮定する2サンプル)によって調べた。片側P値をすべての場合で得る。
結果
ウイルスと腫瘍エピトープ間の競合を避けるために、ME1は、H−2bハプロタイプマウスに特徴的なLCMV抗原由来のエピトープと、H−2dハプロタイプマウスに特徴的な腫瘍抗原由来のものとをコードする(別表II)。したがって、FP9.ME1の、免疫応答を生起する能力を、BALB/c(H−2d)及びC57BL/6(H−2d)マウスで調べた。
ウイルスと腫瘍エピトープ間の競合を避けるために、ME1は、H−2bハプロタイプマウスに特徴的なLCMV抗原由来のエピトープと、H−2dハプロタイプマウスに特徴的な腫瘍抗原由来のものとをコードする(別表II)。したがって、FP9.ME1の、免疫応答を生起する能力を、BALB/c(H−2d)及びC57BL/6(H−2d)マウスで調べた。
pSG2.ME1及び/又はFP9.ME1を用いたBALB/cマウスの免疫化は、腫瘍エピトープ(H−2d)に対してIFNγ分泌性T細胞を生起した(図16)が、LCMVエピトープ(H−2b)に対しては生起しなかった。pSG2.ME1/FP9.ME1を用いた異種プライム/ブースト免疫化後に、腫瘍エピトープに対して生起されたIFNγ分泌性T細胞の総度数は、他の異種又は同種免疫化レジメンよりも有意に高かった(P<0.004)(図16)。その他のレジメンを用いた免疫化は、対照構築物を用いた免疫化よりも有意に高いT細胞応答を生起したが、互いには有意に異ならなかった(P>0.05)。pSG2.ME1/FP9.ME1を用いたプライム/ブースト免疫化が、CT26由来のイムノドミナントエピトープ、P815由来のMSRエピトープ及びβ−ガラクトシダーゼ由来のモデルLd−拘束性エピトープに対して相当なT細胞応答を生起したことが重要である。これらのエピトープの中で、CT26エピトープに対する応答が最も大きく、この実験に用いたIFNγELISPOTアッセイの検出限界(2000sfc/100万個)を超えていた。これらの結果は、pSG2.ME1/FP9.ME1を用いるプライム/ブースト免疫化は、BALB/cマウスにおいてCT26結腸癌腫に対する保護的免疫応答を生起すると思われるということを示す(前記参照)。
pSG2.ME1及び/又はFP9.ME1を用いたC57BL/6マウスの免疫化は、LCMVエピトープ(H−2b)に対してIFNγ分泌性T細胞を生起したが、腫瘍エピトープ(H−2b)に対しては生起しなかった(図17)。pSG2.ME1/FP9.ME1を用いたプライム/ブースト免疫化によって、LCMVエピトープに対して生起されたIFNγ分泌性T細胞の総度数は、FP9.ME1単独又はpSG2.ME1単独を用いた同種免疫化によって生起されたものよりも有意に高かった(P=0.003)。興味深いことに。pSG2.ME1及びFP9.ME1を用いる異種プライム/ブースト免疫化レジメンは、pSG2.ME1及びFP9.ME1を単独で用いる同種免疫化レジメンと比べて、ドミナント及びサブドミナントとして特性決定されたCD8+エピトープに対する、及びCD4+T細胞によって認識されるものに対する大幅に増強された免疫応答を生起した。したがって、このプライム/ブースト免疫化レジメンは、C57BL/6マウスにおいてLCMV感染に対して、同種プライム/ブースト免疫化レジメンよりも有効であると思われる(前記参照)。
前記の明細書に記載したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。当業者であれば、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することのない、本発明の記載した方法及び系の種々の改変及び変法は明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求された本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、化学、生物学又は関連分野の当業者には自明である、記載した本発明の実施様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
Claims (55)
- 被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法であって、
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物とを、
いずれかの順序で被験体に投与するステップを含み、少なくとも1つの組成物が、鶏痘ウイルスから誘導可能なポックスウイルスベクターを含む方法。 - 被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法であって、
(i)DNAワクチンを含む第1の組成物と、
(ii)第1の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物と、
(iii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第3の組成物とを、
被験体に投与するステップを含み、少なくとも1つの組成物が、鶏痘ウイルスから誘導可能なポックスウイルスベクターを含む方法。 - 被験体において疾病を治療及び/又は予防する方法であって、
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物と、
(iii)第3の非複製ウイルスベクターを含む第3の組成物とを、
被験体に投与するステップを含み、少なくとも1つの組成物が、鶏痘ウイルスから誘導可能なポックスウイルスベクターを含む方法。 - 少なくとも1種のベクターがFP9であるか、又はそれから誘導可能である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非複製ウイルスベクターの各々がポックスウイルスベクターを含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2種のポックスウイルスベクターが異なる属のポックスウイルスから誘導可能である、請求項5に記載の方法。
- 少なくとも1種のポックスウイルスベクターがアビポックスウイルスから誘導可能であり、少なくとも1種のポックスウイルスベクターがオルトポックスウイルスから誘導可能である、請求項6に記載の方法。
- ベクターのうちの1種が、以下から選択される鶏痘ウイルスゲノムを含む、請求項1から7のいずれかに記載の方法:
(i)1種又は複数の以下の野生型FPV遺伝子の改変型を有する、鶏痘ウイルスゲノム:
FPV001、FPV018、FPV054、FPV063、FPV066、FPV070、FPV071、FPV093、FPV097、FPV098、FPV115、FPV124、FPV125、FPV127、FPV158、FPV159、FPV160、FPV190、FPV191、FPV207、FPV219、FPV220、FPV221、FPV222、FPV239、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260、
(ii)1種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を有する、鶏痘ウイルスゲノム:
FPV158、FPV219、FPV222、
(iii)1種又は複数の以下の遺伝子が欠損している、鶏痘ウイルスゲノム:
FPV001、FPV124、FPV125、FPV159、FPV160、FPV220、FPV221、FPV241、FPV242、FPV243、 FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260、
(iv)1種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を有する、鶏痘ウイルスゲノム:
FPV054、FPV070、FPV071、FPV115、FPV190、FPV207、
(v)1種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を有する、鶏痘ウイルスゲノム:
FPV071、FPV239、
(vi)遺伝子FPV097及びFPV098の融合によって(欠失によって)生じるキメラ遺伝子を有する、鶏痘ウイルスゲノム、
(vii)大きさが275kbp未満である鶏痘ウイルスゲノム、
(viii)配列番号1に示される配列を含む、鶏痘ウイルスゲノム、
(ix)ORF1からACTGGTGCGAAGATCTCが欠失している配列番号1に示される配列を含む、鶏痘ウイルスゲノム。 - 鶏痘ウイルスゲノムがNOIも含む、請求項8に記載の方法。
- NOIがポックスウイルスプロモーターの制御下にある、請求項9に記載の方法。
- NOIが、ネズミマラリア原虫(P. berghei)、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、P.シノモルギ(cynomolgi)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、結核菌(M. tuberculosis)又はT.パルバ(parva)由来の抗原をコードする、請求項9又は10に記載の方法。
- アビポックスウイルスから誘導可能なウイルスベクターを含む組成物を、追加免疫組成物として投与する、請求項7に記載の方法。
- アビポックスウイルスから誘導可能なウイルスベクターを含む組成物を、初回抗原刺激組成物として投与する、請求項7に記載の方法。
- 被験体が霊長類である、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
- 被験体がヒトである、請求項14に記載の方法。
- 動物用ワクチンにおける、FP9であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用。
- 前記動物が哺乳類である、請求項16に記載の使用。
- 前記哺乳類が霊長類である、請求項17に記載の使用。
- 前記霊長類がヒトである、請求項18に記載の使用。
- 医薬における、FP9であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用。
- 被験体において免疫応答を生起する方法であって、FP9であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を、前記被験体に投与することを含む方法。
- 被験体において既存の免疫応答に追加免疫する方法であって、FP9であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を、前記被験体に投与することを含む方法。
- 1種又は複数の以下の野生型FPV遺伝子の改変型を有する、鶏痘ウイルスゲノム:
FPV001、FPV018、FPV054、FPV063、FPV066、FPV070、FPV071、FPV093、FPV097、FPV098、FPV115、FPV124、FPV125、FPV127、FPV158、FPV159、FPV160、FPV190、FPV191、FPV207、FPV219、FPV220、FPV221、FPV222、FPV239、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260。 - 1種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を有する、請求項23に記載の鶏痘ウイルスゲノム:
FPV158、FPV219、FPV222。 - 1種又は複数の以下の遺伝子を欠失している、請求項23又は24に記載の鶏痘ウイルスゲノム:
FPV001、FPV124、FPV125、FPV159、FPV160、FPV220、FPV221、FPV241、FPV242、FPV243、FPV244、FPV245、FPV246、FPV247、FPV260。 - 1種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を有する、請求項1から25のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム:
FPV054、FPV070、FPV071、FPV115、FPV190、FPV207。 - 1種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を有する、請求項1から26のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム:
FPV071、FPV239。 - 遺伝子FPV097及びFPV098の融合によって(欠失によって)生じるキメラ遺伝子を有する、請求項1から27のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム。
- 大きさが275kbp未満である、鶏痘ウイルスゲノム。
- 配列番号1に示される配列を含む、請求項1から29のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム。
- NOIも含む、請求項1から30のいずれかに記載のゲノム。
- NOIがポックスウイルスプロモーターの制御下にある、請求項31に記載のゲノム。
- NOIが、ネズミマラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、P.シノモルギ、三日熱マラリア原虫、結核菌又はT.パルバ由来の抗原をコードする、請求項31又は32に記載のゲノム。
- 請求項1から33のいずれかに記載のゲノムを含むウイルス粒子。
- 請求項31から33のいずれかに記載のゲノムを含み、NOIを標的細胞へ送達可能なウイルス粒子。
- 請求項34又は35に記載のウイルス粒子を含むワクチン。
- 請求項34又は35に記載のウイルス粒子を含む、初回抗原刺激剤又は追加免疫剤。
- (i)請求項34又は35に記載の鶏痘ウイルス粒子を含む第1の組成物と、
(ii)同時、個別又は逐次投与するための第2の組成物
とを含むワクチン接種キット。 - (i)請求項34又は35に記載の鶏痘ウイルス粒子を含む初回抗原刺激組成物と、
(ii)ワクシニアウイルス粒子を含む追加免疫組成物
とを含む、請求項38に記載のキット。 - 霊長類にいずれかの順序で逐次投与するための、
(i)第1の非複製ウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ウイルスベクターを含む第2の組成物
とを含む、ワクチン接種キット。 - (i)第1の非複製ポックスウイルスベクターを含む第1の組成物と、
(ii)第2の非複製ポックスウイルスベクターを含む第2の組成物
とを含む、請求項40に記載のワクチン接種キット。 - 第1の非複製ポックルウイルスベクターがアビポックスウイルスベクターであり、第2の非複製ポックルウイルスベクターがオルトポックスウイルスベクターである、請求項41に記載のキット。
- 第1の非複製ポックスウイルスベクターが鶏痘ウイルスベクターである、請求項41又は42に記載のキット。
- 第1の非複製ポックスウイルスベクターが請求項34又は35に記載のウイルス粒子であるか、又はそれから誘導可能である、請求項43に記載のキット。
- 第1及び第2の組成物が同一抗原を発現可能である、請求項38から44のいずれかに記載のキット。
- 霊長類被験体において既存の免疫応答を追加免疫可能な非複製ウイルスベクターを含む追加免疫組成物。
- 鶏痘ウイルスベクターを含む、請求項46に記載の追加免疫組成物。
- 請求項34又は35に記載のウイルス粒子であるか、又はそれから誘導可能である、請求項47に記載の追加免疫組成物。
- 被験体に、請求項36に記載のワクチン、請求項37、46、47又は48のいずれかに記載の初回抗原刺激若しくは追加免疫組成物又は請求項38から45のいずれかに記載のキットを投与するステップを含む、ワクチン接種法。
- 請求項36に記載のワクチン、請求項37、46、47又は48のいずれかに記載の初回抗原刺激若しくは追加免疫組成物又は請求項38から45のいずれかに記載のキットの、被験体において疾病を治療及び/又は予防するための医薬の製造における使用。
- 被験体においてT細胞免疫応答を生起する、請求項49に記載の方法、又は請求項50に記載の使用。
- 疾病が、マラリア、結核又は東海岸熱(East Coast Fever)などの慢性感染であるか、又はそれに起因するものである、請求項49から51のいずれかに記載の方法又は使用。
- 非培養CEF細胞の、アビポックスウイルスを増殖させるための使用。
- アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、請求項53に記載の使用。
- ポックスウイルスが請求項34又は35に記載のウイルス粒子である、請求項54に記載の使用。
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