JP5102930B2

JP5102930B2 - ワクチン接種方法

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Publication number: JP5102930B2
Application number: JP2002528294A
Authority: JP
Inventors: アドリアンブイエスヒル; ヘレンマクシェイン; サラギルバート; ウィリアムリース; イエルクシュナイダー
Original assignee: オクソンセラピュティクスリミテッド
Priority date: 2000-09-21
Filing date: 2001-09-13
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2021-09-13
Also published as: CA2422094C; GB0023203D0; CA2422094A1; AU2001286109B2; GB0308955D0; EP1320379A2; GB2384709A; JP2004509149A; US20040018177A1; AU8610901A; ATE465750T1; DE60141969D1; ES2345604T3; WO2002024224A2; EP1320379B1; EP1320379B8; WO2002024224A3; GB2384709B

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ源を含む組成物を用いることにより、標的抗原に対するＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を誘導する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
強力な抗体応答をもたらすサブユニットワクチンは何年も前に実用化されているが、細胞性免疫応答を活性化し強力な防御的Ｔリンパ球応答を産生するワクチンを設計することは困難であった。
【０００３】
細胞溶解性細胞であることが示唆され、ウイルス感染症の一部を防御することが解明されているＣＤ８⁺Ｔ細胞を誘導することは、これまで高い関心を集めてきた。他方、ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、抗体応答を増幅させることなどにより、他の免疫細胞を助け、防御を生じさせるという機能を有するヘルパーＴ細胞であると最近まで考えられていた。
【０００４】
しかし、ＣＤ４⁺Ｔ細胞も、より直接的に防御に関与しているエフェクター細胞であることが最近の研究で明らかになった。例えば、結核、マラリア、及びヘリコバクター・ピロリ感染症において、サイトカインやγ−インターフェロンの分泌能を有するＣＤ４⁺Ｔ細胞が防御に果たす役割が証明されている。
【０００５】
従って、効果的なＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を刺激することのできるワクチンの開発が求められている。ポックスウイルスは、細胞質間において発現されることから、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の好適な誘導因子であることが知られている。しかしながら、ポックスウイルスのＣＤ４ＭＨＣクラスII拘束性Ｔ細胞産生能は乏しいと、一般的に考えられている（Haslett et al. Journal of Infectious Diseases 181: 1264-72 (2000), page 1268を参照）。
【０００６】
結核
結核は、コッホがその病原生物を発見してから百年以上になるが、未だ世界的に深刻な健康問題である。毎年、８００万〜１０００万人が新たに発症していると推定され、年間死亡者数は、約３００万人である。現在使用されているワクチン、Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin （ＢＣＧ）の防御効果が変動しやすいこと（Fine, P.E. and Rodrigues, L.C., Lancet 1990. 335: 1016-1020）や、結核菌の多薬剤耐性株が出現していることから、より優れたワクチンが早急に求められている。
【０００７】
ヒト型結核菌（M. tuberculosis）は細胞内病原体であり、その優性免疫応答は細胞性免疫応答と関係がある。防御免疫発生には、ＣＤ４⁺Ｔ細胞が必要であることを示す強力な証拠が、動物やヒトを使った研究から見いだされている（Orme, I.M., J. Immunol. 1987. 138: 293-298, Barnes, P.F., Bloch, A.B., Davidson, P.T. and Snider, D.E., Jr., N. Engl. J. Med. 1991. 324: 1644-1650）。またＣＤ８⁺Ｔ細胞が、その役割の一端を担っていることも次々に証明されている（Flynn, J.L., Goldstein, M.M., Triebold, K.J., Koller, B. and Bloom, B, R., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. 89: 12013-12017, Lalvani, A., Brookes, R., Wilkinson, R.J., Malin, A.S., Pathan, A.A., Andersen, P., Dockrell, H., Pasvol, G. and Hill, A.V., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. 95: 270-275）。
【０００８】
ＤＮＡワクチンは、ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の両細胞を誘導する細胞性免疫応答誘導因子であるため、結核ワクチンのための有望な送達系の筆頭である。ヒト型結核菌由来の種々の抗原をコードするＤＮＡワクチンの防御効果を評価する多くの研究より、ＢＣＧがもたらす防御と同レベルの部分的防御が抗原投与による免疫（challenge）により誘導されることが示唆されている（Tascon, R.E., Colston, M.J., Ragno, S., Stavropoulos, E., Gregory, D. and Lowrie, D.B., Nat. Med. 1996. 2: 888-892, Huygen, K., Content, J., Denis, O., Montgomery, D.L., Yawman, A.M., Deck, R.R., DeWitt, C.M., et al, Nat. Med. 1996. 2: 893-898）。しかし、現在までに試験されたワクチン候補の中で、安定的にＢＣＧより優秀なワクチンはまだ見い出されていない。ＤＮＡワクチンは、ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方を誘導するのに優れてはいるが、抗原投与による免疫に対する防御を惹起させるためには、上記細胞が産出する応答細胞の頻度を、有意に増加させることが必要とされる。
【０００９】
従って、ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を、適宜ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答と共に、誘導する能力を有する代替的な改良ワクチンが、結核等の疾患に対する防御のために求められている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
複製欠損性ポックスウイルスが防御性のエフェクターＣＤ４⁺Ｔ細胞誘導能を有することを、本発明者らは明らかにした。細胞サブユニットを消失させたγ−インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、マウス及びヒトのいずれにおいても、かかるＣＤ４⁺エフェクターＴ細胞が免疫後に充分誘導されることを、本発明者らは証明した。複製欠損性ポックスウイルスを用いる異種プライム・ブーストレジームを行うことにより、強力なＣＤ４⁺Ｔ細胞応答が誘導される。
【００１１】
従って、本発明は、標的抗原に対するＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の誘導方法であって、少なくとも一投与量の
（ａ）前記標的抗原の１若しくは２以上のＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ源を含む第一組成物
及び、少なくとも一投与量の
（ｂ）かかる第一組成物におけるＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープと同じＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープを少なくとも１つ含めた、前記標的抗原の１若しくは２以上のＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ源を含む第二組成物
を、投与することを特徴とし、第一及び／又は第二組成物におけるＣＤ４⁺エピトープ源が、非複製若しくは複製欠損性組換えポックスウイルスベクターであり、かつ、第一及び第二組成物のいずれを先に投与してもよいことを特徴とする誘導方法を提供するものである。
【００１２】
ベクターが、ＣＤ８⁺Ｔ細胞エピトープ源をも供する場合には、本発明の方法により、ＣＤ４⁺／ＣＤ８⁺Ｔ細胞複合応答が誘導される可能性がある。
【００１３】
（ａ）におけるエピトープ源がウイルスベクターである場合、（ｂ）におけるウイルスベクターは、別種のウイルス由来であることが好ましい。
【００１４】
本発明の方法において使用される第一及び第二組成物は、便宜上、キット形態の物であってもよい。従って本発明はまた、同時に、個別に、若しくは連続して用いることにより標的抗原に対するＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を誘導する複合製剤としての第一及び第二組成物を含む産物を提供するものである。
【００１５】
本発明はまた、標的抗原に対するＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を誘導する薬剤の製造における、上記産物の使用方法を提供するものである。
【００１６】
本発明者らは、複製欠損性ポックスウイルスが、異種プライム・ブーストレジームにおいてだけでなく、既存のＣＤ４⁺Ｔ細胞応答に対する追加免疫剤としても作用し得ることを明らかにした。従って本発明はまた、前記に定義した「第二組成物」を含み、少なくとも一つの標的抗原に対し、初回免疫に対するＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を増強する薬剤を提供するものである。本発明はまた、初回免疫で生じたＣＤ４⁺Ｔ細胞応答に、かかる薬剤でブースターをかける（追加免疫する）方法、及びＣＤ４⁺Ｔ細胞免疫応答にブースターをかける（追加免疫する）薬剤の製造における組換え非複製又は複製欠損性ポックスウイルスベクターの使用方法を提供するものである。
【００１７】
かかる機能性ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を誘導する組換え複製欠損性ポックスウイルスベクターの能力には、単独使用及びプライム・ブーストでの複合使用のいずれにおいても、また動物及びヒトのいずれにおいても、予防目的及び治療目的いずれのワクチン接種においても汎用的な有用性がある。その適用対象例としては、結核、ＨＩＶ、マラリア、ヘリコバクター・ピロリ、インフルエンザ、肝炎、ＣＭＶ、ヘルペスウイルスに起因する疾患及び他のウイルス感染症、ハンセン病、トキソプラズマ等のマラリア以外の原虫類寄生虫性疾患、及び種々の悪性腫瘍に対する予防的ワクチン接種、また、結核、ＨＩＶ並びにＢ型及びＣ型慢性肝炎等の持続性ウイルス感染症、及び種々の悪性腫瘍に対する治療を目的とするワクチン接種が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
ＣＤ４⁺／ＣＤ８⁺免疫応答
本発明はまず、ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の誘導方法に関する。この方法は、ＣＤ８⁺免疫応答も同時に誘導することができる。
【００１９】
Ｔ細胞は、大きく２つのグループに分類され、両者はＣＤ４又はＣＤ８共受容体分子の発現によって区別される。ＣＤ８発現Ｔ細胞は、感染細胞を殺すその能力から細胞傷害性Ｔ細胞としてもよく知られている。他方、ＣＤ４発現Ｔ細胞は、主に免疫応答を「助ける」又は「誘導する」ことに関与してきた。
【００２０】
Ｔ細胞応答の性質は、細胞上の細胞表面マーカー発現によって特徴づけられる。一般的にＴ細胞は、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ５、又はＣＤ７（ヒトのみ）存在下において検出される。ＣＤ４⁺Ｔ細胞及びＣＤ８⁺Ｔ細胞は、その共受容体発現によって区別される（例えば本実施例に記載されているように、抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いることにより）。
【００２１】
ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスII分子が提示する抗原を認識し、ＣＤ８⁺は、ＭＨＣクラスＩ分子が提示する抗原を認識するため、ＣＤ４⁺とＣＤ８⁺Ｔ細胞は、それらが反応する抗原提示細胞から区別することもできる。
【００２２】
ある標的抗原内には、１若しくは２以上のＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ、及び１若しくは２以上のＣＤ８⁺Ｔ細胞エピトープが存在している可能性がある。既に特徴付けが済んでいるエピトープがあれば、そのエピトープを利用してＴ細胞の上記二種類のサブタイプを区別することもできる。例えば、そのエピトープを認識するＴ細胞サブセットが特異的に刺激されることに基づいて区別することもできる。
【００２３】
ＣＤ４⁺Ｔ細胞はさらに、そのサイトカイン分泌プロフィールをもとに細分類される。Ｔ_H１サブセット（時に「炎症性ＣＤ４Ｔ細胞」として知られる）は、ＩＬ−２及びＩＦＮγを特徴的に分泌し、細胞傷害性及び局在炎症反応と会合するいくつかの機能を仲介する。Ｔ_H１細胞は、マクロファージ活性化能を有し、その結果細胞が仲介する免疫が導かれる。Ｔ_H２サブセット（時に「ヘルパーＣＤ４Ｔ細胞」として知られる）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０を特徴的に分泌し、Ｂ細胞を刺激して増殖させて抗体を産出する役割を担っていると考えられている（液性免疫）。
【００２４】
Ｔ_H１及びＴ_H２細胞のエフェクター分子発現は、特徴的である。Ｔ_H１細胞は、膜結合型ＴＮＦを発現させ、Ｔ_H２細胞は、Ｂ細胞上でＣＤ４０と結合するＣＤ４０リガンドを発現させる。
【００２５】
本発明の方法により誘導されるＣＤ４⁺Ｔ細胞応答は、ＴＨ１型応答であることが好ましい。そして誘導されたＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＩＦＮγを分泌する能力を有していることが好ましい。
【００２６】
ＣＤ４⁺又はＣＤ８⁺免疫応答が誘導されることにより、対応するＴ細胞型の数が増加する。これは細胞数を調べることにより、又は、細胞群全体の変動を調べてＣＤ４⁺又はＣＤ８⁺Ｔ細胞の増加割合を反映することにより検出できる。ある細胞型における細胞数は、直接調べることができ（例えば、抗ＣＤ４／ＣＤ８抗体による染色後、蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳcan）解析にかけることにより）、また、特徴的サイトカイン等の産物を観察することによって間接的に調べることもできる。本実施例ではＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用い、特定のペプチドに応答する形でのＩＦＮγ分泌能によってＣＤ４⁺Ｔ細胞の存在を調べた。ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞応答は、１若しくは他のＴ細胞サブセットを、適当な抗体を使用して特異的に減少させ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより容易に識別される。また、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞応答は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）分析法によっても容易に識別が可能である。
【００２７】
ＣＤ４⁺／ＣＤ８⁺Ｔ細胞エピトープ
本方法は、標的抗原の１若しくは２以上のＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ（適宜に１若しくは２以上のＣＤ８⁺Ｔ細胞エピトープ）を投与することからなる。
【００２８】
Ｔ細胞エピトープは、タンパク質抗原に由来する短ペプチドである。抗原提示細胞は、抗原を内在化してＭＨＣ分子に結合可能な短い断片に形を変えさせる。ＭＨＣに対するペプチド結合特異性は、ペプチドと、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝との特異的相互作用に依存している。
【００２９】
ＭＨＣクラスＩ分子に結合する（そしてＣＤ８⁺Ｔ細胞によって認識される）ペプチドは、一般に６〜１２アミノ酸長であり、より一般的には８〜１０アミノ酸長である。かかるペプチドのアミノ末端のアミン基は、そのペプチド溝の一方の端部において不変領域と接触し、カルボキシ末端のカルボキシ基は、上記溝の他方の端部において不変領域と接触する。かかるペプチドは、さらに上記溝沿いの主鎖原子と保存されたアミノ酸側鎖の間を接触しながら、上記溝沿いに延びる構造をしている。ペプチド長の変化分は、ペプチドバックボーン内に、主にプロリン又はグリシン残基のねじれに吸収される。
【００３０】
ＭＨＣクラスII分子に結合するペプチドは、一般に少なくとも１０アミノ酸からなり、より一般的には少なくとも１３アミノ酸からなるが、さらに長い場合もある。これらのペプチドは、開口両端部を有するＭＨＣIIペプチド結合溝沿いに延びる構造をしている。主に、主鎖原子が上記ペプチド結合溝に並ぶ保存された残基に接触することにより、ペプチドは所定の場所に保持される。
【００３１】
所定の抗原におけるＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺エピトープは、当該技術分野で使用される数多くの方法によって特徴付けられる。細胞からペプチドを精製する場合、それらのペプチドに結合しているペプチドも同時に精製される。これらペプチド複合体を酸で変性させることにより、結合ペプチドを放出しながらＭＨＣ分子からペプチドを溶出させ、溶出したペプチドを精製し（例えばＨＰＬＣにより）、通常は配列決定を行う。
【００３２】
多くのＭＨＣクラスＩ及びII分子に対するペプチド結合は、結合したペプチドを溶出させ、Ｘ線クリスタログラフィーにかけることにより分析されてきた。クラスＩ及びクラスIIペプチドがどこに存在するかについては、標的抗原の配列に基づき、ある程度まで予測することが可能である。このことは特にＭＨＣクラスＩペプチドで可能である。何故なら、ＭＨＣクラスＩ分子の所定の変異種に結合するペプチドは、アンカー残基として知られる同一の若しくは非常によく似たアミノ酸残基を、そのペプチド配列沿いの特異的な２カ所又は３カ所に有しているからである。
【００３３】
また、標的抗原の長さにおよぶ重複ペプチドライブラリーを用いて、ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺エピトープを解明することもできる。ＣＤ４⁺又はＣＤ８⁺Ｔ細胞に対する上記ライブラリーの刺激能を調べることにより、どちらのペプチドがＴ細胞エピトープとして機能し得るかが判明する。本実施例では、ヒト型結核菌由来抗原二種のペプチドライブラリーをＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより解析した。
【００３４】
Ｔ細胞エピトープ源
本発明の方法は、「プライム・ブースト」投与レジームであり、少なくとも以下の２種類の組成物を投与することからなる。
（ａ）標的抗原の１若しくは２以上のＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ源を含む第一組成物
及び、
（ｂ）第一組成物におけるＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープと同じＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープを少なくとも１つ含めた、標的抗原の１若しくは２以上のＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ源を含む第二組成物であって、ＣＤ４⁺エピトープ源が、非複製若しくは複製欠損性組換えポックスウイルスベクターである第二組成物。
【００３５】
いずれも上記組成物中に存在するか、若しくは上記組成物にコードされるＣＤ４⁺や、ＣＤ８⁺Ｔ細胞エピトープは、適宜種々の形態で供される。例えば、１若しくは２以上のエピトープの組換え鎖として、又は無処理の標的抗原との関連において、又はこれらを組み合わせた形態で供される。ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞エピトープは、種々の疾患に関して同定されており文献に記載されている。かかるエピトープをもち任意に選択された抗原に対するＣＤ４⁺及び／又はＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を惹起せしめるエピトープ鎖を設計することが可能となっている。複数エピトープをもつ鎖中のエピトープ同士を、配列をいじることなく結合して不要な核酸及び／又はアミノ酸物質を都合よく排することができる。標的抗原由来のＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ以外にも、ヘルパーＴ細胞によって認識される１若しくは２以上の別のエピトープを含むことが、エピトープ鎖によって産出される免疫応答を増強させる上で好ましい。特に適切なＴヘルパー細胞エピトープの例としては、ＨＬＡ型が異なる人々において活性を示すものが挙げられ、破傷風（殆どの人間が既に初期免疫を獲得している）におけるヘルパーＴエピトープがその一例である。
【００３６】
種々のポックスウイルスが使用できるように、例えばＭＶＡを有する鶏痘又はその逆のような複製ウイルスベクターも使用できるが、本発明の方法に用いる第一組成物のＣＤ４⁺（及び適宜にＣＤ８⁺）Ｔ細胞エピトープ源は、非ウイルスベクター、非複製型ベクター、又は複製欠損性ウイルスベクターであることが好ましい。
【００３７】
第一と第二組成物の間に最小限の交叉反応を生じさせるために、第一組成物におけるＴ細胞エピトープ源は、ポックスウイルスベクター以外であることが好ましい。
【００３８】
本発明の第一組成物に用いられるウイルスベクターの別の好適例として、遺伝子操作で障害され、非複製又は複製欠損性となった種々のウイルスが挙げられる。かかるウイルスには、Ｅｌ欠損変異体等の非複製アデノウイルス各種が含まれる。非複製又は複製欠損性ベクターを作出するために遺伝子操作によってウイルスに障害を与えることは、広く知られていることである。
【００３９】
第一組成物に用いられるウイルスベクターとして適切な例としては他に、ヘルペスウイルス及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）がある。第一組成物に適したバクテリアベクターとしては、組換えＢＣＧ、組換えサルモネラ、及びプラスミドＤＮＡで形質転換したサルモネラが挙げられる（Darji A et al 1997 Cell 91: 765-775）。
【００４０】
一次免疫用組成物に使用する非ウイルスベクターとしての適切例としては他に、リポペプチドとして知られる脂質テイルドペプチド（lipid-tailed peptide）、融合タンパク質として或いは化学結合により、ＫＬＨ等の担体タンパク質に接合したペプチド、アジュバントをもつ全抗原(whole antigen)があり、またこれらに類似した系が上記以外にも挙げられる。
【００４１】
本発明の好適例の一つとして、第一組成物におけるＴ細胞エピトープ源は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよいが、核酸、特に組換えＤＮＡプラスミドであることが挙げられる。かかるＤＮＡ又はＲＮＡは、リソソーム等にパッケージされていても、剥き出しの状態であってもよい。
【００４２】
本発明の好適例としては他にも、第一組成物におけるＴ細胞エピトープ源が、ＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープの組換え鎖又は標的抗原に存在する２又は３以上のＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープをもつペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリタンパク質、又は粒子であることが挙げられる。ポリタンパク質には、同じ、好ましくは異なる２又は３以上のタンパク質を結合したものが含まれる。第一又は第二組成物内に存在する、或いは第一又は第二組成物にコードされるエピトープは、標的抗原が由来する親生物において遺伝子発現産物として自然発生する配列以外の配列に存することが好ましい。
【００４３】
第二組成物におけるＴ細胞エピトープ源は、ＭＶＡ又はＮＹＶＡＣ等のワクシニアウイルスベクターであることが好ましく、修正ワクシニアウイルスAnkara株（ＭＶＡ）、又それに由来する株（ＭＶＡについては以下に詳細記載）が最も好ましい。ワクシニアベクターに代わるものとしては、鶏痘ベクター又はカナリアポックスベクター等のアビポックスベクターが列挙される。アビポックスベクターの中でも特に好適なのは、ＡＬＶＡＣ（Kanapoxとして市販）として知られるカナリアポックス株、若しくはそれに由来する株である。
【００４４】
第一及び第二組成物がいずれもＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ源を有しているからといって、両組成物が同じであってはならないとすることに何ら根拠はない。初期免疫にも追加免疫にも使用できる１種類の製剤は投与を簡便化する。
【００４５】
ポックスウイルスベクター
本発明の方法で用いられる「第二」組成物において、ＣＤ４⁺（及び適宜にＣＤ８⁺）エピトープは非複製又は複製欠損性組換えポックスウイルスベクターである。
【００４６】
ここに用いられる「非複製」又は「複製欠損性」なる用語は、殆どの正常哺乳類細胞又は正常ヒト細胞において有意レベルの複製ができないことを意味する。非複製又は複製欠損性ウイルスは、自然に（すなわち自然界から単離されて）、或いは、例えばインビトロでの培養や、複製に不可欠の遺伝子を欠失させるなどの遺伝子操作により人為的に、非複製又は複製欠損性となる。ウイルスが成育可能な細胞型は、ＭＶＡにおけるＣＥＦ細胞等、通常１若しくは数種である。
【００４７】
ウイルスの複製は通常、１）ＤＮＡ合成、及び２）ウイルス力価による２つの方法で測定できる。より正確には、ポックスウイルスに言及するときの「非複製又は複製欠損性」なる用語は、以下の定義の一方若しくは双方を満たすウイルスを意味する。
１）ワクシニアウイルス・コペンハーゲン株に比べ、ＭＲＣ−５細胞（ヒト細胞株）におけるＤＮＡ合成量が１ｌｏｇ（１０倍）の減少を示すこと。
２）ワクシニアウイルス・コペンハーゲン株に比べ、ＨＥＬＡ細胞（ヒト細胞株）におけるウイルス力価が２ｌｏｇの減少を示すこと。
【００４８】
上記定義に該当するポックスウイルスの例としては、ＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ、及びアビポックスウイルスがあり、同定義に該当しないウイルスとしては、弱毒化ワクシニアＭ７株がある。
【００４９】
修正ワクシニアウイルスAnkara株（ＭＶＡ）は、正常ヒト組織を含む殆どの細胞型において複製することのないワクシニアウイルス株である。ＭＶＡは、トルコ、アンカラのウマのポックス病巣由来物質を、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において５００回を超える回数、連続継代することにより得られた（Mayr et al. Infection (1975) 33: 6-14）。ＭＶＡは、複製欠損性でありながら、獣ポックスウイルス感染症に対する防御免疫を誘導することがわかっている。ＭＶＡは、天然痘撲滅キャンペーンの最終段階でヒト用ワクチンとして使われ、ドイツ南部の１２万人を超える被験者に、皮内、皮下、及び筋肉注射によって投与された。湿疹を伴うなどのハイリスクグループを意図的に対象としてワクチン接種を実施したにも係わらず、有意の副作用が生じたという記録はない（Mayr et al. Bakteriol B. (1978) 167:375-90）。
【００５０】
ＭＶＡの安全性は、放射線照射を受けたマウス、及びそれに続いて頭蓋内投与を受けた新生仔マウスを含む動物モデルにおける該ウイルスの無毒性を踏まえたものである。ＭＶＡが非複製型であることは、ニワトリ漿尿膜上における白いプラークの増殖、非アビアン細胞の不全感染、及び合計約３０ｋｂにおよぶ６箇所のゲノム欠失と相関関係にある。ヒトＴＫ−１４３細胞及びアフリカミドリザルＣＶ−１細胞においては限定的とはいえ依然としてウイルス複製がみられるものの、宿主域遺伝子Ｋ１Ｌ及びＣ７Ｌに影響を与える欠失が、ＭＶＡの無毒性の一原因であると考えられてきた。上記Ｋ１Ｌ遺伝子が修復されることによって修復されるＭＶＡ宿主域は一部分のみである。宿主域制限はウイルス粒子の成熟過程において生じるらしく、ヒトＨｅＬａ細胞では電子顕微鏡下でビリオンが僅かに認められただけであった（Sutter et al. 1992）。ウイルス複製を後期に阻止しても、ＭＶＡにおける組換え遺伝子の効率的発現を妨げることはなかった。
【００５１】
ポックスウイルスは、宿主免疫応答を回避するための戦略を進化させ、その戦略には、細胞サイトカイン受容体（ケモカイン受容体等）の細胞外ドメインと似た配列をもつ腫瘍壊死因子であるＩＬ−Ｉｐ、インターフェロン（ＩＦＮ）−ｏｃ／及びＩＦＮ−ｙに対する可溶性受容体として機能する分泌タンパク質の産出が含まれる。
【００５２】
上記ウイルス受容体は、通常、適切な宿主免疫応答を阻害若しくは消滅させ、その存在は、病原性の増加と関連している。その中でＩｌ−Ｉｐ受容体は例外である。何故なら、Ｉｌ−Ｉｐ受容体は宿主熱性応答を消失させ、感染に直面した宿主の生存を増強するからである。ＭＶＡは、インターフェロンｙ、インターフェロンａｐ、腫瘍壊死因子、及びＣＣケモカインに対する機能的サイトカイン受容体を欠失しているが、潜在的に有益なＩＬ−１受容体を有している。このようなサイトカイン受容体プロフィールをもつのは、ワクシニア株の中ではＭＶＡだけであり、ＭＶＡが他のポックスウイルスに比べて、より安全であり、また、より免疫原性が強いことを理論的に示している。複製欠損性であって安全なワクシニア株であり、もうひとつＮＹＶＡＣとして知られている株については、Tartaglia et al.が詳細に記載している（Virology 1992, 188: 217-232）。
【００５３】
ポックスウイルスゲノムは、大量の異種遺伝子情報をもつことができる。ワクチンに使用するウイルスベクターに対して求められる要件としては他に、良好な免疫原性と安全性等が挙げられる。一つの態様として、ポックスウイルスベクターとしては、鶏痘ベクター又はその誘導体が使用できる。
【００５４】
ＭＶＡ由来のワクシニアウイルス株、又は、ＭＶＡを特にワクチン使用に適したものにしているところの性質を備えながら別途進化してきた株もまた本発明での使用に適している。
【００５５】
エピトープの挿入鎖をもつＭＶＡ（実施例２に記載）については、ＷＯ９８／５６９１９に詳細な記述がみられる。
【００５６】
ワクチン接種戦略
異種プライム・ブーストレジームに用いたときに、複製欠損性ポックスウイルスがエフェクターＣＤ４Ｔ細胞（適宜にＣＤ８⁺Ｔ細胞も共に）に対する誘導能を示すことを本発明者らは明らかにした。
【００５７】
第一及び第二組成物を順不同で使用して、異種免疫レジームを実施することにより、強力な応答が得られたことは驚きに値する。第一組成物の後で第二組成物を投与した場合の方が、その逆の順番で投与した場合より、若干強い応答を示した。従って、本発明の実施例２における方法は、まず少なくとも一投与量の第一組成物を投与し、続いて少なくとも一投与量の第二組成物を投与することからなることが好ましい。
【００５８】
本発明の実施例２における方法は、複数投与量の第一組成物を投与し、続いて少なくとも一投与量の第二組成物を投与することからなるものであってもよい。
【００５９】
或いは、本発明の実施例２における方法は、複数投与量の第一組成物を投与し、続いて少なくとも一投与量の第二組成物を投与することからなるものであってもよい。
【００６０】
第一組成物を３回連続投与し、続いて一投与量の第二組成物を投与することが、特に効果的な免疫プロトコールであることがわかった。
【００６１】
それぞれの投与タイミングは、各人によって異なるが（下記「投与」の項を参照）、通常は１〜６週間の間隔をおいて投与し、一般的には約３週間の間隔をおいて投与する。
【００６２】
標的抗原
標的抗原は、標的とする疾患によって特徴付けられる。疾患が、感染病原体によって引き起こされる感染病の場合は、かかる感染病原体に由来する標的抗原であってもよい。
【００６３】
標的抗原は、疾患感染後に免疫系によって認識される抗原であってもよい。或いは、本方法によって非生理的Ｔ細胞応答が誘導されるよう、かかる抗原は免疫系に対し通常「不可視」であってよい。そうすることにより、攻撃の別の糸口が開かれ、効果的な免疫応答が惹起されない（感染を消失させられないなど）疾患に対して有用となる。
【００６４】
抗原は、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、又はＮＹ−ＥＳＯ等の腫瘍抗原であってよい。
抗原は、例えばチロシナーゼのように自己抗原であってよい。
【００６５】
本発明の好適例として、抗原がヒト型結核菌（M. tuberculosis）由来であることが挙げられる。例えば、ＥＳＡＴ６又はＭＰＴ６３抗原であってよい。
【００６６】
本発明のもう一つの好適例として、抗原が、マラリア会合病原体P. Falciparumに由来することが挙げられる。
【００６７】
本発明の組成物は、一種以上の抗原のＴ細胞エピトープを含むものであってよい（上記「エピトープ」の項を参照）。一例として本発明の組成物は、同一疾患と会合する２又は３以上の抗原に由来する１又は２以上のＴ細胞エピトープを含むものであってよい。これら２又は３以上の抗原は同じ病原菌生物由来であってよい。
【００６８】
また、上記組成物は、種々の供給源に由来するエピトープを含むものであってよい。例えば本実施例に記載されたＭＥ−ＴＲＡＰ挿入物には、P. falciparum、破傷風トキソイド、ヒト型結核菌、及びウシ型結核菌（M. bovis）に由来するＴ細胞エピトープが含まれている。
【００６９】
標的疾患
本発明の方法は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞（特にＴ_H１型）の存在が防御免疫に寄与すると想定される疾患に対する防御として有用である。
【００７０】
本発明の方法は、結核、ＨＩＶ、マラリア、ヘリコバクター・ピロリ、インフルエンザ、肝炎、ＣＭＶ、ヘルペスウイルスに起因する疾患及び他のウイルス感染症、ハンセン病、トキソプラズマ等のマラリア以外の原虫類寄生虫性疾患、及び種々の悪性腫瘍等の疾患に対する防御として特に有用である。
【００７１】
本発明の方法は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞（特にＴ_H１型）の存在により治療効果があがると想定される疾患に対する治療法として有用である。本発明の方法は、結核、ＨＩＶ並びにＢ型及びＣ型慢性肝炎等の持続性ウイルス感染症、及び種々の悪性腫瘍に対する治療目的のワクチン接種において特に有用であると考えられる。
【００７２】
本発明の方法は、結核に対する防御のためのワクチン接種戦略においてとりわけ有用である。
ここに記載するポックスウイルスベクターは、ＨＩＶ陽性者におけるＣＤ４Ｔ細胞応答を高めるために特に有用である。
【００７３】
ここに記載する種々の組成物は、治療目的又は予防目的のワクチンとして用いることができる。予防若しくは治療のいずれを目的とした免疫がより適当であるかは、通常疾患の性質による。例えば癌の場合は、診断前に投与するよりむしろ治療としての免疫が期待されているし、他方、抗マラリアワクチンは、必須ではないものの予防的に用いることが好ましい。
【００７４】
キット
本発明の方法で用いられる第一及び第二組成物は便宜的に「複合製剤」又はキット形態として供されてもよい。第一及び第二組成物は、一緒に包装されていても、別売のために個別包装されていてもよい。標的抗原に対するＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を誘導するために、第一及び第二組成物は、同時に、個別に、若しくは連続して使用してよい。
【００７５】
キットには、第一及び第二組成物のいずれか、又は両方と投与前に混合する組成物が他に含まれていてもよい。
キットにはワクチン接種プロトコールに関する書面による説明書を添付してもよい。
【００７６】
製剤組成物／ワクチン
本発明はまた、前記に定義した第一及び第二組成物を含む産物、並びに初回免疫で生じたＣＤ４⁺Ｔ細胞応答をブーストする薬剤に関する。かかる産物／薬剤は製剤組成物の形態であってよい。
かかる製剤組成物には、例えば薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は助剤を含んでいてもよい。製剤上の担体、賦形剤、又は希釈剤は、意図する投与経路や標準的な薬理学的手法を考慮して選択される。
【００７７】
特にＤＮＡプラスミドベクターを含む組成物は、助剤として顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、又はそれをコードするプラスミドを含んでいてもよい。ＧＭ−ＣＳＦをポリペプチド形態で使用すると好結果が得られる。Ｔ細胞応答の誘導を増強するため、ＱＳ２１又はＳＢＡＳ２（Stoute J A et al. 1997 N Engl J Medicine 226: 86-91）等の助剤は、タンパク質、ペプチド、又は核酸と共に使用してよい。
【００７８】
本発明の製剤組成物における組成物は、適当な結合剤（１又は２種以上）、潤滑剤（１又は２種以上）、懸濁剤（１又は２種以上）、コーティング剤（１又は２種以上）、又は可溶化剤（１又は２種以上）と混合してもよい。
上記製剤組成物は、獣用（すなわち動物用）又はヒトに用いられる。
【００７９】
投与
治療上効果的な本発明の組成物における一日あたりの経口又は静脈内投与量は、治療対象者の体重１ｋｇあたり０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇが一般的であり、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇが好ましい。本発明の組成物はまた、静脈輸液による投与も可能であり、その場合の投与量は、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／時の範囲が考えられる。
上記薬剤の錠剤又はカプセル剤は、必要に応じて一度に１錠、２錠、若しくは３錠以上投与してもよい。また、本発明の組成物は徐放性としてもよい。
【００８０】
医師は通常、各患者に対して最適と考えられる実際の投与量を決定するので、投与量は、患者の年齢、体重、及び患者の反応性によって異なる。上述したのは、平均的な投与量である。従って、上記例よりも高量投与若しくは低量投与が効果的な事例も個々に当然あり、それらの投与量の範囲もまた、本発明の範疇に含まれる。
【００８１】
上記製剤組成物は、それが適当である場合には、吸入により、座剤又はペッサリーとして、皮膚用パッチ剤を使用してローション、溶液、クリーム、軟膏、若しくは粉剤として局所的に、澱粉又はラクトース等の賦形剤を含む錠剤として経口的に、単独若しくは賦形剤と混合したカプセル剤若しくは胚珠（ovule）として、香味料や着色料を含むエリキシル剤、溶液、又は懸濁剤として投与が可能であり、また、例えば鼻腔内、静脈内、筋肉内、若しくは皮下等の非経口注射も可能である。非経口投与においては、組成物を滅菌水溶液の形態で用いることが最適であり、かかる水溶液には、例えば溶液を血液と等張とするために充分量の塩若しくは単糖類が含まれていてもよい。口腔内若しくは舌下投与において組成物は、錠剤若しくはトローチ剤として投与でき、それらは従来法により処方できる。
【００８２】
使用に際しては、組成物を、澱粉若しくはラクトース等の賦形剤を含む錠剤、又は単独若しくは賦形剤と混合したカプセル剤若しくは胚珠（ovule）として、又は香味料や着色料を含むエリキシル剤や溶液や懸濁剤としてとして経口投与されることが好ましい場合がある。
【００８３】
非経口投与の場合には、組成物を滅菌水溶液の形態で用いることが最適であり、かかる水溶液には例えば、溶液を血液と等張とするために充分量の塩若しくは単糖類が含まれていてもよい。
口腔内若しくは舌下投与において組成物は、錠剤若しくはトローチ剤として投与でき、それらは従来法により処方できる。
【００８４】
対象者（患者など）に対する経口、非経口、口腔内及び舌下投与においては、本発明の薬剤の一日あたり投与量は、一般的に１０〜５００ｍｇ（一度に、又は複数回に分けて）である。従って一例として、一回あたり適宜１錠、２錠、若しくは３錠以上投与するために、錠剤やカプセル剤に５〜１００ｍｇの有効成分を含有させることができる。上述したとおり、医師は通常、各患者に対して最適と思われる実際の投与量を決定するので、投与量は患者の年齢、体重、及び患者の反応性によって異なる。上記の投与量は平均的な場合を例にとったものであり、上記例よりも高量投与若しくは低量投与がふさわしい事例も個々に当然あり、それらの投与量の範囲もまた、本発明の範疇に含まれる。
【００８５】
経口投与は最も便宜に適い、また例えば鼻腔内（ｉｃ）投与に付随する欠点などの他の投与経路に伴う欠点を避け得る場合もあることから、ヒトに使用する場合、一般的に本発明の薬剤は経口投与することが好ましい。薬剤摂取者に嚥下障害、若しくは経口投与後の薬剤吸収不全がある場合には、舌下若しくは口腔内投与等の非経口投与が可能である。
【００８６】
獣用として使用する場合、本発明の組成物は獣用の通常の実施慣例に従い、適切に許容される処方として一般的に投与され、獣医は、個々の動物に最適の投与レジメン及び投与経路を決定する。しかし、ヒトに対する治療同様、獣に対する治療においても組成物を単独で投与することが可能である。
【００８７】
【実施例】
実施例１：結核に対する免疫原性及び防御効果
実施例１Ａ−ＥＳＡＴ６及びＭＰＴ６３抗原
防御免疫を生じさせる上で、生きたマイコバクテリアから放たれる分泌抗原が重要であると考えられていることから、本発明者らは、ヒト結核菌に由来する二種類の分泌抗原を選択してワクチンに含有した。まず、ＥＳＡＴ６（early-secreted antigenic target ６）は、ヒト結核菌に対し比較的特異的であり、また重要なことは、ウシ結核菌ＢＣＧには存在しないことである（Infect. Immun. 1996. 64: 16-22）。ＥＳＡＴ６は、マウス感染初期における重要な抗原標的であり（J. Immunol. 1996. 157: 3527-3533）、またヒトＣＴＬ標的である（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. 95: 270-275）。もう一つの抗原であるＭＰＴ６３（mycobacterial protein tuberculosis 63）は、ウシ結核菌ＢＣＧのいくつかの株に存在している（Infect. Immun. 1997. 65: 16-23）。上記二種の抗原を含むポリタンパク質ＤＮＡ構築物及び組換えＭＶＡウイルスを作製し、かかる構築物の免疫原性を、個別に、また併せて調べた。ヒト結核菌を用いたマウス投与試験において、最も免疫原性の強力なワクチンの組合せを考察した。
【００８８】
プラスミドＤＮＡ及び組換えＭＶＡ結核ワクチンの構築
ＴＰＡリーダー配列、ＥＳＡＴ６及びＭＰＴ６３遺伝子、及びＰｋ抗体エピトープ（ＴＥＭＰｋ）を含む一本のコーディング配列を構築し、プラスミドベクターｐＳＧ２に組み込み、ＤＮＡワクチンｐＳＧ２．ＴＥＭＰｋを作製した。この融合タンパク質の発現は、細胞質において認められた。
ＴＥＭＰｋ配列を含むワクシニアシャトルベクターを、野生型ＭＶＡに形質導入することにより、かかる組換えＭＶＡを精製した。
【００８９】
ＤＮＡ及びＭＶＡワクチンはいずれもペプチド特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ４⁺Ｔ細胞を誘導する。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＤＮＡ（ｉm：筋肉）、ＭＶＡ（ｉｄ：皮内）又はそれら両方により免疫した。両抗原の長さにおよぶ重複ペプチドを用い、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、免疫マウスの脾細胞のいくつかのペプチドに対する応答を同定した。ＥＳＡＴ６では２個のペプチド（Ｅ１及びＥ２）において、ＭＰＴ６３では４個のペプチド（Ｍ３、１５、２７及び２８）において応答が認められた（表１）。これらのペプチドに応答する細胞の表現型を調べるために、磁気ビーズを用いてＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺細胞を消失させた。ＣＤ４⁺Ｔ細胞を消失せしめたときには、上記６個のペプチドに対する応答は完全に失われ、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を消失せしめたときには、応答は影響を受けなかった（表１）。アッセイはいずれもエクスビボで行い（ペプチドＥ１及びＥ２）、また、ペプチド共存下で細胞を５〜７日間培養した後に行った（全ペプチドについて：方法参照）。
【００９０】
【表１】

【００９１】
ＤＮＡ及びＭＶＡに誘導される応答の異種追加免疫
ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞（ＳＦＣ）の頻度が最も高いのは、第１ＥＳＡＴ６ペプチドＥ１であった（表２）。一投与量のＤＮＡでは、検出可能な応答は認められなかったが、二週間の間隔をおいて２回若しくは３回繰り返すことにより、安定的な応答が認められた。３回免疫したところＳＦＣ数は、２回免疫後の数値の倍になり、脾細胞１０⁶個あたりのＥ１に対する平均応答は、２回投与後に３０ＳＦＣ、３回投与後に７５ＳＦＣだった。一回のＭＶＡ免疫の結果生じたＥ１に対するスポット・フォーミング細胞の平均頻度で見る応答は、１００万個あたり２０個であり、さらに２回目のＭＶＡ投与により、緩やかに上昇した（Ｅ１に対するＳＦＣの平均頻度＝３０）。従って、この複製欠損性ポックスウイルスで免疫することによって、γ−インターフェロン分泌ＣＤ４Ｔ細胞応答は、コードされたＣＤ４Ｔ細胞エピトープに対して誘導される。
【００９２】
【表２】

【００９３】
異種プライム・ブーストレジームにより、ＣＤ４Ｔリンパ球応答の大幅な増加が観察された
ワクチンの個別使用によりこれらの応答を調べたことを受け、次に異種プライム・ブーストレジームの、すなわちＤＮＡ又はＭＶＡ構築物のいずれかにより初回応答を惹起せしめ、その２週間後にもう一方の構築物を使って追加応答を惹起せしめるレジームの役割について考察した。ＤＭ又はＭＤによる異種追加免疫の結果、ＤＤ又はＭＭいずれかによる同種追加免疫よりも強い応答が生じた（表２）。ペプチドＥ１に対する平均応答レベルは、４倍以上の１３０ＳＦＣまで増加した。ＣＤ８Ｔ細胞応答の誘導に関する知見（Nat. Med. 1998. 4: 397-402）からすれば驚きに値することであるが、この現象は２種類のワクチンの投与順とは無関係に生じた。ペプチドＥ２に対する応答は、ＭＶＡの次にＤＮＡを投与したときの方が、その逆の順番で投与するときより若干強力だった。ペプチドＭ３及びＭ１５に対する応答は、ワクチンの投与順に関係なく、異種追加免疫を行ったときの方が強かったが、ペプチドＭ２７及びＭ２８に対する応答は弱く、追加免疫により増強しなかった。最も強力な応答が認められたのは、ＤＮＡを３回投与し、その後ＭＶＡ投与により１回追加免疫を行ったときだった（ＤＤＤＭ）。この場合、Ｅ１に対する平均応答レベルは、７５ＳＦＣから３６０ＳＦＣへと、約５倍に増加した。その他のペプチドに対する応答もＤＭ投与の場合に比べ、ＤＤＤＭ投与後の方が高かった。
【００９４】
ヒト結核菌抗原Ａｇ８５Ａ及び同抗原を発現する組換えＭＶＡをそれぞれ発現するプラスミドＤＮＡを用いてさらに研究を進めたところ、ＣＤ４Ｔ細胞エピトープに対するＣＤ４Ｔ細胞の誘導が、Ｂａｌｂ／ｃマウスで観察された。抗体でコーティングしたビーズを使った消去法を行ったところ、上記抗原におけるＰ１５ペプチドに対する応答がＣＤ４依存型であることが確認できた。同じ実験において、ＤＮＡ免疫及び組換えＭＶＡ免疫のいずれを受けた場合においても、ＣＤ８Ｔ細胞もまたＡｇ８５中のＰ１５ＣＴＬエピトープに対して誘導された。ＤＮＡで初回免疫してＭＶＡで追加免疫することからなるプライム・ブースト免疫後に、ＣＤ４及びＣＤ８の両エピトープに対するより強力な応答が観察された。従って、組換えＭＶＡによる免疫及び異種プライム・ブーストによる免疫のいずれによっても同一抗原におけるエピトープに対するＣＤ４及びＣＤ８γ−インターフェロン−分泌Ｔ細胞応答を生じさせることができる。
【００９５】
投与試験
異種プライム・ブーストレジームを実施したときに、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４⁺Ｔ細胞は最も高レベルを示したので、これらのレジームによる防御効果を、ＥＳＡＴ−ＭＰＴ６３構築物を用いた投与試験で調べた。１回目の投与試験においては、ＤＮＡ初回免疫／ＭＶＡ追加免疫（ＤＭ）と、ＭＶＡ初回免疫／ＤＮＡ追加免疫（ＭＤ）の防御効果を比較した。いずれの場合もさらにもう１回ＭＶＡで追加免疫した。２回目の投与試験では、ＤＮＡで３回連続して免疫し、その後ＭＶＡで１回免疫する（ＤＤＤＭ）ことによる防御を調べた。ＢＣＧを両試験での正のコントロールとして用いた。２〜３匹のマウスをグループから取り出し、それらを用いてグループの他のマウスが投与を受ける前に各ワクチンレジームの免疫原性を調べた。１回目の試験での免疫応答は、これまでのもの（対Ｅ１応答の平均が２５ＳＦＣ）程強くなかった。従ってこの場合には、両グループに対し、投与試験に先だって２回目のＭＶＡ投与を実施した。２回目の投与試験における優性ペプチドＥ１に対する平均応答レベルは、２２５ＳＦＣだった。最後にサブユニットワクチンで免疫を行った２週間後、Ｔ細胞応答が水平域に達した直後に投与試験を行った（未公開データ）。
【００９６】
免疫レジーム８週間経過後の効果を調べるため、８週間後に生存している全てのマウスから臓器を回収してＣＦＵ数を測定した。予想どおり両投与試験では、３種類の臓器全てにおいてＢＣＧグループのＣＦＵは、無処理グループと比較して顕著に少なかった（ｐ＜０．０５、図１）。１回目の投与試験では、３種類の臓器全てにおいてＤＭＭグループのＣＦＵ数は、無処理グループと比較して顕著に少なかった（ｐ＜０．０５）。３種類の臓器全てにおいてＭＤＭグループと無処理コントロールグループのＣＦＵ数は有意の差を示さなかった。しかし２回目の投与試験で、無処理コントロールグループに比べてＤＤＤＭグループのＣＦＵ数が著しく少なかったのは、肺においてのみだった（ｐ＜０．０５）。肝臓と脾臓におけるＣＦＵ数は、これら２グループ間で有意の差を示さなかった。１回目及び２回目いずれの投与試験においても、ＤＭＭ／ＭＤＭ／ＤＤＤＭグループとＢＣＧグループのＣＦＵ数が有意の差を示した臓器はなかった。
【００９７】
上記の結果は、γ−インターフェロン分泌ＣＤ４Ｔリンパ球応答を誘導するＭＶＡ及びＤＮＡワクチンベクターの、また、これらワクチンを用いた異種プライム・ブースト免疫レジームの、ヒト結核菌に対する免疫原性及び防御効果を示すものである。ＤＮＡワクチン接種によりＴ_H１型免疫応答が誘導されることが知られており、よって本発明者らは、機能的結果を測定する方法として、Ｔ_H１サイトカインであるＩＦＮ−γをＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより定量化した。このアッセイ法は、Ｔ細胞機能を定量化する上で、非常に高感度な方法である（J. Exp. Med. 1993. 178: 2243-2247）。ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の別の測定法として増殖アッセイがあるが、増殖アッセイはエフェクター応答を数値化するものではなく、また肝心なことにγ−インターフェロン分泌量と増殖応答は負の相関関係にあることがしばしば見受けられる（Troye-Blomberg et al., Flanagan et al 2000）。ヒト結核菌投与モデルにおける結果測定法としてＩＦＮ−γ産物を測定することが、より適切である理由は二点ある。ＩＦＮ−γノックアウトマウスは同種の野生型に比べ、ヒト結核菌投与によって、より強く感作されやすいことから、結核に対する防御免疫応答においてＩＦＮ−γが重要な要素であること（J. Exp. Med. 1993. 178: 2243-2247）。さらに、ヒトＩＦＮ−γ受容体遺伝子に変異が生じると、非定型マイコバクテリア感染に対する感作性が生じることである（N. Engl. J. Med. 1996. 335: 1941-1949）。
【００９８】
組換えＭＶＡとＤＮＡワクチンはそれぞれ、同じペプチドに対する特異的ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４⁺Ｔ細胞を産生する。これら構築物に対するＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は認められなかったが、これは、対応するＭＨＣクラスＩ分子との結合高親和性をもつペプチドが、このマウス株（Ｃ５７／ＢＬ６）に存在しないためであろうと考えられる。かかる応答を調べるために用いたペプチドの長さは、抗原２種それぞれの長さの範囲にわたっているので、上記マウス株におけるＣＤ８エピトープの存在が事実上否定される。従って上記構築物は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答に対する各ワクチン型及びプライム・ブーストレジームの効果を調べる上で有用である。両ワクチン型とも、それぞれ明らかにＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を誘導していたが、これら２種類のワクチンを用いる異種プライム・ブーストレジームの方が、同種ブースターを用いたときより、強いＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を作出した。２種のワクチンの投与順によって、誘導される免疫応答の強度に明確な差異が生じなかったことは興味深い点である。ＤＮＡで初回免疫してＭＶＡで追加免疫する、又はＭＶＡで初回免疫してＤＮＡで追加免疫する、いずれによっても第一ＥＳＡＴ６ペプチドに特異的なＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４⁺Ｔ細胞数が３〜４倍に増加した。この結果は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答に関する研究において、まずＤＮＡで初回免疫して次にＭＶＡで追加免疫するという順番によってのみ高レベルの免疫原性及び防御が観察されたとする文献記載の結果と異なっている（Nat. Med. 1998. 4: 397-402）。
【００９９】
ＤＮＡ／ＭＶＡ免疫レジームによる８週間後の防御レベルは、ＢＣＧによって得られるレベルと同等であり、ＢＣＧ免疫グループにおける防御は文献（Nat. Med. 1996. 2: 888-892）に記載されている防御と同位であった。
【０１００】
１回目の投与試験では、ＤＮＡ／ＭＶＡで免疫したグループが、臓器３種類全てにおいてＢＣＧと同等の防御レベルを示した。２回目の試験では、ＤＮＡ／ＭＶＡ免疫グループの防御は８週間後に肺のみで認められた。これまで文献に発表している研究者たちは、投与から分析までの期間に応じて種々の臓器で防御効果が変化する様子が観察されたことを報告している。Zhu et al.は、投与４週間後の肺におけるＤＮＡ免疫後の防御に関して報告しているが、投与１２週間後に肺と脾臓での防御を観察しただけであった（J. Immunol. 1997. 158: 5921-5926）。ヒトの主要感染経路は肺であることから、肺は、防御同定に最適の臓器である。ヒト結核菌投与試験用として、より適切な吸入器のモデルが開発されており、投与試験において全ての経路に防御性を与えるワクチンが、吸入器による投与に対しても防御性を損なうことがないか、また、肺での防御性が維持されているか否かを検討することは重要なことである。
【０１０１】
１回目の投与試験では、ＤＭＭグループで防御が観察されたが、ＭＤＭグループでは観察されなかったことから、投与試験で防御を生じさせるためには、ＤＮＡで初回免疫することが必要であることが考えられる。２４時間後及び８週間後にＭＤＭグループで防御が認められなかったことから、投与試験２週間前までに投与されたサブユニットワクチンに非特異的防御効果がなかったことが確認されたことに留意すべきである。免疫する順番（表２）は免疫原性に影響を及ぼさないと考えられるのに、何故ＤＭＭグループで防御が確立され、ＭＤＭグループでは確立されなかったのかは明らかでない。しかし、Ｍ／Ｄ／Ｍグループにおける２度のＭＶＡ投与には１ヶ月の間隔があったことから、この違いは２回目のＭＶＡ追加免疫の実施時期と関連していることも考えられる。上記投与間隔の間にＭＶＡに対して生じた抗体応答によって追加免疫効果が消失した可能性が考えられる。
【０１０２】
ＤＮＡ初回免疫ワクチン接種に対する応答が、その後同じ抗原をコードする組換えウイルスで免疫することによって増強される機構は、まだ完全に解明されていない。本発明者らは理論にこだわることなく、同じエピトープをもつ組換えウイルスに曝されることによって急速に増加する、免疫優性エピトープに対する記憶Ｔ細胞をＤＮＡが誘導することと、上記の機構が関連しているとの予想をたてた（Immunological Reviews 1999. 170: 29-38）。ＣＤ８⁺Ｔ細胞増強に関与する機構は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞増強に関与する機構と異なることが考えられる。
【０１０３】
実施例１Ｂ−８５Ａ抗原
８５Ａ抗原を発現するＤＮＡ及びＭＶＡを使い、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６の２種のマウス株を免疫した。ＩＦＮ−γＥｌｉｓｐｏｔアッセイにより、８５Ａ抗原の長さにわたる重複ペプチドを用いて調べたところ、免疫マウスの脾細胞から若干のペプチド応答が認められた。最適の免疫レジームを決定するため、ＤＮＡ及び／又はＭＶＡの単独使用又は併用により、マウスを免疫した。
【０１０４】
同定された最強の応答は全てＢＡＬＢ／ｃマウスで観察された。上記構築物を使用する以下の試験には、全てこのマウス株だけを使用した。ＤＮＡ及びＭＶＡ構築物は、同じペプチドに対する応答を誘導した。免疫マウスの脾細胞を用いて、重複ペプチドのうち、ｐ１１、ｐ１５、ｐ２４及びｐ２７の４ペプチドに対する応答を同定した。最強の応答は、ペプチドｐ１１及びｐ１５に対するものだった。
【０１０５】
消失実験
上記各ペプチドに対するＴ細胞応答の表現型を考察するため、磁気ビーズを用いてＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞を消失させた。ＣＤ８⁺Ｔ細胞を消失させることにより、ｐ１１に対する応答は殆ど完全に消滅した。ＣＤ４⁺Ｔ細胞を消失させることにより、ｐ１５に対する応答は完全に消滅した。それより弱いｐ２４及びｐ２７に対する応答は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を消失させることにより、いずれも完全に消滅した。これらの結果を表３にまとめた。
【０１０６】
簡潔に述べると、８５Ａ抗原を発現するＤＮＡ及びＭＶＡ構築物による免疫の結果、免疫優性ＣＤ８⁺エピトープ（ｐ１１）、免疫優性ＣＤ４⁺エピトープ（ｐ１５）、及び、それらより弱い２つのＣＤ４⁺エピトープ（ｐ２４及びｐ２７）が誘導された。
【０１０７】
【表３】

【０１０８】
どちらか一方の構築物で一度免疫することによって生じる応答は弱く、同じ構築物を同種追加免疫することによって僅増しただけだった。ＤＮＡとＭＶＡによる異種追加免疫の結果、ＣＤ４⁺（ｐ１５）及びＣＤ８⁺（ｐ１１）Ｔ細胞の頻度が、有意に上昇する現象が認められた。ＭＶＡとＤＮＡによる異種追加免疫の結果、ＣＤ４⁺Ｔ細胞（ｐ１５）の頻度は高くなったが、ＣＤ８⁺（ｐ１１）Ｔ細胞応答は増加しなかった。ＤＮＡで３回免疫し、その後ＭＶＡで１回追加免疫したときに（ＤＤＤＭ）、ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞頻度は、最高レベルとなった。この結果は、ＥＳＡＴ６／ＭＰＴ６３発現構築物を用いて調べた結果と合致するものであり、その場合の最強の免疫原性を示すレジームはＤＤＤＭＭだった。
これらの結果を表４にまとめた。
【０１０９】
【表４】

【０１１０】
投与試験
８５Ａ抗原構築物を用いる最適免疫レジームが決定されたので、次にヒト結核菌を使った投与試験を行い、それらレジームの防御効果を考察した。まず、投与試験における投与量として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに使用した投与量の１／２対数（half a log）である１×１０⁶ｃｆｕのヒト結核菌を使用した。その理由は、ＢＡＬＢ／ｃマウスはヒト結核菌投与に対し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスより若干感作されやすいことが文献に記載されているからである。ＥＳＡＴ６／ＭＰＴ６３構築物投与で得られた結果との比較を可能にするため、回収時期は８週間後とした。ヒト結核菌の腹腔内投与６週間後にＢＡＬＢ／ｃマウスに防御効果が認められたことが先行文献により明らかになっている。
【０１１１】
異種プライム・ブーストレジームと同種プライム・ブーストレジームとの比較
８５Ａ抗原発現構築物を使用して、異種と同種プライム・ブーストレジームの防御効果を比較する投与試験を行った。これらの構築物を用いた免疫原性試験の結果、異種追加免疫を行った方が、同種追加免疫を行うより高レベルの特異的ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞が産出されることが確認された。三投与量の８５Ａ抗原ＤＮＡを接種され、次に一投与量の非組換えＭＶＡを接種されたコントロールグループのマウスを試験に用い、ＭＶＡ追加免疫効果の特異性を考察した。
この試験では以下の５グループを使用した。
・無処理
・ＢＣＧ
・ＤＤＤ
・ＤＤＤＭ
・ＤＤＤ（非組換えＭＶＡ［ＮＲＭ］）
【０１１２】
各グループは１０匹のマウスからなり、ＤＤＤＭグループだけが７匹だった。投与試験時の免疫原性を調べるために、各グループから２〜３匹のマウスを取り出した。ＤＮＡによる初回免疫と同時期にＢＣＧを接種した。最終免疫の２週間後に１０⁶ｃｆｕのヒト結核菌をマウス腹腔内に投与し、投与８週間後に回収した。

【０１１３】
ＤＤＤＭグループに対して行ったＥｌｉｓｐｏｔアッセイの結果、高レベルのＴ細胞応答が認められたが、これは、このレジームの免疫原性に関する前述の結果と一致するものであった。ＤＤＤ及びＤＤＤ（ＮＲＭ）グループの結果における応答は低レベルだった。非組換えＭＶＡによる追加免疫効果はみられなかった。これらの結果を表５にまとめた。
【０１１４】
【表５】

【０１１５】
ＤＤＤＭグループのマウス由来脾細胞を、Ａ⁵¹Ｃｒ放出アッセイにかけた。このアッセイの結果、ＤＤＤＭグループから取り出した２匹のマウスの内１匹の特異的溶解度が高レベルを示した（６０〜７０％）。もう１匹のマウスの溶解度は、はるかに低かった（２０〜３０％）。これらの結果を図２にまとめた。
【０１１６】
無処理コントロールグループに比べ、異種プライム・ブーストレジーム（ＤＤＤＭ）では、ＢＣＧに匹敵する防御が肺で認められた（ｐ＝０．０１０）。ＤＤＤＭグループの脾臓では、防御は観察されなかった。同種レジームＤＤＤにおいては、ＤＤＤ単独によっても、非組換えＭＶＡ追加免疫併用（ＤＤＤ（ＮＲＭ））によっても、投与に対する有意の防御は生じなかった。無処理コントロールグループと比較した場合、ＤＤＤＭグループでは予想どおり、肺及び脾臓の両方でＢＣＧによる有意の防御効果がみられた（肺：ｐ＝０．００９；脾臓：ｐ＜０．００１）。以上の結果を図３に示した。
【０１１７】
ディスカッション
ＤＮＡワクチン及び８５Ａ抗原を発現する組換えＭＶＡは、同じ４種類のペプチドに対して特異的なＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞を産生した。これら２種類のワクチンを用いた異種プライム・ブーストレジームにより、同種追加免疫を行う場合より高頻度のＴ細胞応答が誘導された。免疫を行う順番に関係なくＣＤ４⁺Ｔ細胞応答が増加した。これは、ＥＳＡＴ６／ＭＰＴ６３発現構築物を使用して得られた結果と合致している（実施例１Ａ）。８５Ａ抗原発現構築物に誘導されるＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、初回免疫にＤＮＡ、追加免疫にＭＶＡを使用する免疫レジームを行ったときにのみ認められ、その逆の順番で構築物を投与したときには認められなかった。この結果は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を増強させる既発表の研究における結果と一致している。
【０１１８】
クラスＩ拘束性ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答及びクラスII拘束性ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を誘導するプロセシング経路は異なる。ＤＮＡ免疫によりＣＤ４⁺Ｔ細胞応答は増強するのに、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は増強されない理由は、このことから説明できると考えられる。内因的に産出された抗原はクラスＩ経路にアクセスすることができることから、初回免疫によってＤＮＡワクチンが、クラスＩ拘束性ＣＤ８⁺Ｔ細胞頻度をよく高めることが知られている。恐らく組換えウイルスベクターもまた、内因性クラスＩ経路を利用している。その理由としては、ＭＶＡ免疫によって、ＤＮＡ免疫によるものとは異なるサイトカインが誘導されることが挙げられる。その可能性のあるサイトカインとしては、例えばＩＬ４がある。ＭＶＡによる追加免疫効果は、ＩＬ４抗体とＭＶＡを共投与することにより消滅する（Sheu、個人的なコミュニケーションによる）。記憶ＣＤ８⁺応答を増強する上でＩＬ４は必要だが、ＣＤ４⁺応答を増強するのには不要と考えられる。
【０１１９】
投与試験の結果、異種プライム・ブースト免疫レジームに誘導され増強したＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞応答により、ＢＣＧに優ることはないものの同程度の防御が肺において観察された。
【０１２０】
実施例２：マウス及びヒトにおけるマラリアワクチン候補に対するγ−ＩＦＮ分泌ＣＤ４Ｔ細胞応答の誘導
主にマラリア（P. falciparum）ＣＤ８Ｔ細胞ペプチドエピトープのポリペプチド鎖については前述した。この構築物は、破傷風トキソイド由来、及びヒト結核菌やウシ結核菌（引用文献２３の標識ＢＣＧ）の種々の株における３８Ｋｄマイコバクテリア抗原由来のＣＤ４Ｔ細胞エピトープも発現させる。このポリエピトープ鎖をコードするＤＮＡを、P. falciparum（Ｔ９／９６株）トロンボスポンジン関連接着タンパク質（ＴＲＡＰ）抗原の全コード配列をコードするＤＮＡに結合させた。この所謂ＭＥ−ＴＲＡＰ（マルチエピトープＴＲＡＰ）挿入物をプラスミドＤＮＡ発現ベクター及びＭＶＡにクローニングした。これら構築物は、マウスＢａｌｂ／ｃ及びＣ５７／ＢＬ６株のγ−インターフェロン分泌Ｔ細胞誘導に対して免疫原性を有していた。これらの候補ＤＮＡ及びＭＶＡマラリアワクチンは、ＧＭＰガイドラインに則って作製した。
【０１２１】
０．５ｍｇ若しくは１ｍｇのプラスミドＤＮＡ筋肉内投与（ｉｍＤＮＡ）、又は４μｇの遺伝子銃（ｇｇＤＮＡ）のいずれかによる免疫、或いは組換えＭＶＡ（５×１０⁷プラーク・フォーミング・ユニット（ｐｆｕ）の皮内投与）による免疫からなる３回のワクチン接種を、健常被験者に対して実施した。
以下の４方法のワクチン接種レジームで実施した。
１．ｉｍＤＮＡを１回、その後ＭＶＡを２回接種（ＤＭ２）（ｎ＝３）。
２．ｉｍＤＮＡを２回、その後ＭＶＡを１回接種（Ｄ２Ｍ）（ｎ＝３）。
３．ｉｍＤＮＡを３回、その後ＭＶＡを１回接種（Ｄ３Ｍ）（ｎ＝６）。
４．ｇｇＤＮＡを２回、その後ＭＶＡを１回接種（Ｇ２Ｍ）（ｎ＝６）。
５．ｇｇＤＮＡを３回、その後ＭＶＡを１回接種（Ｇ３Ｍ）（ｎ＝２）。
６．ＭＶＡを３回接種（Ｍ３）（ｎ＝１０）。
ワクチン接種前（ｄ０）における応答も図４に示した（ｎ＝３０）。
【０１２２】
最終接種７日後にＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のアッセイを行い、P. falciparumＴ９／９６株由来ＴＲＡＰの最初の１１０アミノ酸にまたがるペプチド集団（ＴＴ１−１０、表６に配列を示す）に対する応答性を調べた。これらのペプチドセットに対し、一番強力な応答を誘導したのはＧ２Ｍによる異種ワクチン接種を実施したときで、同種ワクチン単独接種（Ｍ３）により誘導された応答より有意に高く（図４、Ｐ＝０．０１７２、Mann-Whitney 検定）、また、ワクチン接種前（ｄ０）の試料と比較しても、有意に高い応答が誘導された（Ｐ＝０．０２３５）。全般的に、プライム・ブーストを受けた被験者の応答は、同種ワクチン接種を受けた被験者の応答に比し有意に高く（Ｐ＝０．００７４）、異種プライム・ブーストワクチン接種により、上記ペプチド集団に対する応答が誘導されたことを示唆している。
【０１２３】
【表６】

【０１２４】
ＴＲＡＰ抗原に由来するＴＴ１−１０集団に対してワクチン接種により誘導された応答は、試験した被験者３名全てにおいて、ＣＤ４⁺Ｔ細胞依存型だったが、ＣＤ８⁺Ｔ細胞依存型ではなかった（図５）。被験者３名から得たＰＢＭＣをワクチン接種７日目（ドナー０１２及び０２８）、又はワクチン接種２１日目（ドナー０４９）に冷凍し、解凍後、Dynal Dynabead systemを用いてＣＤ４⁺Ｔ細胞若しくはＣＤ８⁺Ｔ細胞を除去してから、ＴＴ１−１０集団を試験した。３例全てにおけるこの集団に対する応答は、ＣＤ４⁺細胞依存性だったが、ＣＤ８⁺細胞依存性ではなかった（図５）。
【０１２５】
従って、ＴＲＡＰ集団ＴＴ１−１０においては、異種プライム・ブーストワクチン接種によって、同種ワクチン接種を実施したときよりも有意に高い応答が誘導され、かかる応答は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞に依存していた。
【０１２６】
よく特徴付けられたＣＤ４⁺Ｔ細胞破傷風トキソイドエピトープ（ＦＴＴｐ、配列：QFIKANSKFIGITE）に対し、異種プライム・ブーストワクチン接種の結果、図４に示す被験者においても応答が誘導された（図６）。Mann-Whitney 検定では、いずれのグループもｄ０応答を有意に上回る応答を示さなかった一方で、全グループで得られた結果を総合すると、異種プライム・ブーストワクチン接種を受けた被験者では、このＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープに対する応答が有意に誘導されていた（Ｐ＝０．００６４）。上記前臨床データから予想されたように、プライム・ブーストワクチン接種を受けた被験者における応答は、同種ワクチン接種を受けた被験者における応答より高かった（図６）。
【０１２７】
このことより、組換えＭＶＡにより、ＩＦＮγ分泌ＣＤ４⁺Ｔ細胞がヒトにおいて誘導され、しかも同種ワクチン接種戦略よりも異種プライム・ブーストワクチン接種戦略を実施する方が、より効率よく誘導される。
【０１２８】
単独及びプライム・ブースト併用の両方で、また、動物及びヒトの両方で示される上記機能的ＣＤ４Ｔ細胞応答を誘導する組換え複製欠損性ポックスウイルスベクターの能力は、予防的及び治療的ワクチン接種のいずれにおいても汎用的な有用性を持つものである。その適用範囲は、結核、ＨＩＶ、マラリア、ヘリコバクター・ピロリ、インフルエンザ、肝炎、ＣＭＶ、ヘルペスウイルスに起因する疾患及び他のウイルス感染症、ハンセン病、トキソプラズマ等のマラリア以外の原虫類寄生虫性疾患、及び種々の悪性腫瘍に対する予防目的のワクチン接種、また、結核、ＨＩＶ並びにＢ型及びＣ型慢性肝炎等の持続性ウイルス感染症、及び多くの悪性腫瘍に対する治療目的のワクチン接種に及ぶが、これらに限定されるものではない。
【０１２９】
材料と方法
ヒト結核菌株ヒト結核菌（Ｈ３７Ｒｖ）は、デュボス培地上で成育させ、３７℃下で２１〜２８日間インキュベートした。この培養液を遠心分離にかけ、ＴＳＢ／グリセロールに再度懸濁し、滴定後に−７０℃で保存した。保存した溶液は使用前に超音波分解にかけた。
【０１３０】
プラスミドＤＮＡ構築物ヒト結核菌（Ｈ３７Ｒｖ）を熱で不活化させ、ＤＮＡ抽出を行った（QIAamp, Qiagen社製, Hilden, Germany）。オリゴヌクレオチドプライマー（Genosys Biotechnologies社製、Pampisford, Cambs）を用いてＥＳＡＴ６及びＭＰＴ６３遺伝子を増幅した。これらのＰＣＲ産物をアガロースゲルから抽出し、精製した（QIAquick kit、 Qiagen社製）。組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のリーダー配列も増幅した。上記ＰＣＲ産物３種の配列決定を行い、それらを結合して３’末端にＰｋ抗体エピトープをもつ一本のコード配列（ＴＥＭＰｋ）を形成した。このＴＥＭＰｋ断片をプラスミドベクターｐＳＧ２に組み込み、ｐＳＧ２．ＴＥＭＰｋを作製した。このプラスミドには、イントロンＡを有するＣＭＶプロモーター、ウシ成長ホルモンポリＡ配列、及び選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子が含まれている。ＣＯＳ−１細胞におけるＴＥＭＰｋ融合タンパク質の発現を、まずＰｋタグ（Serotech社製、UK）に対する抗体を用い、次にフルオレセイン・イソシアネート・アイソマー（ＦＩＴＣ）で標識した二次抗体（Sigma社製）を用いる免疫蛍光法により検出した。核染色を行ったところ、このタンパク質は細胞質内に局在していた。陰イオン交換クロマトグラフィー（Qiagen社製）により、注射用プラスミドＤＮＡを精製し、内毒素を含まないリン酸緩衝食塩水（Sigma社製）で希釈した。
【０１３１】
組換え修正ワクシニア Ankara （ＭＶＡ）の構築ＤＮＡ配列ＴＥＭＰｋを、ワクシニアシャトルベクターｐＳＣ１１にクローニングした。ＢＨＫ細胞を、野生型ＭＶＡ（A Mayer, Veterinary Faculty, University of Munich, Germany）に感染多重度０．０５で感染させ、組換えシャトルベクターにトランスフェクトした。ブロモデオキシウリジン染色により組換えウイルスを選択し、ＣＥＦ細胞上でプラークを精製した。
【０１３２】
動物と免疫プラスミドＤＮＡ（２５μｇ／筋肉）を、４〜６週齢のＣ５７／ＢＬ６雌マウス（Harlan Orlac社製、Shaws Farm, Blackthorn, UK）の両頸骨筋に麻酔下にて注射した。組換えＭＶＡ（１０⁶ｐｆｕ）を皮内注射した。２週間の間隔をおいてマウスを免疫し、最終免疫の２週間後に回収して免疫原性を調べた。投与試験を行うために、最終免疫の２週間後にマウスを感染させた。ＢＣＧコントロールグループは、初回ＤＮＡ／ＭＶＡでの免疫時に４×１０⁵ｃｆｕのウシ結核菌（Glaxo社製）を皮内投与して免疫した。
【０１３３】
脾細胞の調製マウスを殺して無菌法により脾臓を摘出した。脾臓を粉砕して得た一種類の細胞懸濁液をストレーナーで濾過した（Falcon、７０μｍ、 Becton Dickson社製、New Jersey）。細胞をペレット状にし、低張性溶解緩衝液を用いて赤血球を溶解した。次に細胞を洗浄し、計数した。１０％ＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）（全てGibco社製）を添加したα−ＭＥＭ培地に脾細胞を再度懸濁した。
【０１３４】
ペプチド両方の抗原の長さにわたる重複ペプチドを、Research Genetics社（Huntsville, AL, USA）より購入した。これらペプチドは、１５アミノ酸長であり、１０アミノ酸が重複していた（表１）。
【０１３５】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイＩＦＮ−γ分泌ペプチド特異的Ｔ細胞数を、重複ペプチドを用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイで計数した（Nat. Med. 1998. 4: 397-402）。以下に手順を示す。９６ウエルのニトロセルロース・プレート（Milliscreen MAHA、 Millipore社製、 Bedford, MA）を１５μｇ／ｍｌの抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体Ｒ４−６Ａ２（Animal Cell Cultures のEuropean Collectionから購入したハイブリドーマ）でコーティングした。４℃下で一晩インキュベートした後、このウエルをＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＣＳを添加した１００μＬのＲＰＭＩにおいて、室温で１時間ブロックした。脾細胞をペプチドの入ったウエルに加えた（１０⁶細胞／ウエル）（最終濃度２μｇ／ｍｌ）。コンカナバリンＡ（Sigma-Aldrich社製、Poole, UK）をアッセイ用の正のコントロールとした。コントロールウエルにはペプチドを入れなかった。上記プレートを３７℃、５％ＣＯ₂大気下で一晩インキュベートしたところ、文献記載のとおりに増加していた（Nat. Med. 1998. 4: 397-402）。スポットを解剖顕微鏡下で数えた。数字は、エフェクター細胞１００万個あたりのスポット・フォーミング細胞（ＳＦＣ）数を表す。
【０１３６】
細胞消失鉄ビーズ（Dynal社製、 Oslo）に結合させた抗ＣＤ４モノクローナル抗体又は抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いて、ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞を消失させた。免疫マウスから得た脾細胞を、６ウエルの組織培養プレート中にて、１μｇ／ｍｌの対応ペプチドで再刺激し、培養３日目に、１０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ２（Lymphocult-T Biotest社製、Dreieich, Germany）を加えた。５〜７日目に、再刺激した脾細胞を２回洗浄し、上記２種の抗体いずれかの共存下（ビーズ：細胞＝５：１）において、３０分間の氷上インキュベーションを行った。次に、消失した細胞群を使用して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを前述の手順で行った。ペプチドＥ１及びＥ２のアッセイもエクスビボで行った。各ペプチド応答における消失試験を２回行った。
【０１３７】
投与試験カテゴリーIIIアイソレーターユニットにおいて、マウスに５×１０⁶ｃｆｕのヒト結核菌（Ｈ３７Ｒｖ）を腹腔内注射して感染させた。感染のバセリンレベルを調べるため、感染２４時間後に各グループから２〜５匹のマウスを取り出し、肝臓、肺、及び脾臓を回収し、重さを計測した。各グループ残りの７〜１０匹のマウスからは、投与８週間後に臓器を回収した。それら臓器を、１ｍｌの無菌ＰＢＳ中で、５ｍｍのガラス製ビーズを使用する渦流によりホモジナイズし、希釈物を順次Middlebrookプレート上に移した。このプレートを３７℃下にて２１日間インキュベートし、組織１ｇあたりのコロニー数を計算した。グループ間のＣＦＵ数の比較は、Mann-WhitneyのＵ検定により行った。
【０１３８】
細胞調製フィコール分離法により末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。教本の記載に従って、新鮮血、又はアッセイ前に１０％ＤＭＳＯ／９０％ＦＣＳ中にて冷凍した血液のいずれかを用いてアッセイを行った。全ての培養培地に、１０％ヒトＡＢ血清、２ｍＭのグルタミン及び１００Ｕｍｌ−１のペニシリン／ストレプトマイシンを添加した。５〜１０ビーズ／細胞の割合でDynal Dynabeadシステムを実施し、細胞を消失させた。
【０１３９】
エクスビボでのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ培養培地はＲＰＭＩ１６４０を使用した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは製造者のマニュアルに従い、Millipore MAIP S45プレート上でMabTech抗体を使用して行った。各２５μｇ／ｍｌのペプチド共存下にて１８〜２０時間、４×１０⁵個のＰＢＭＣをＥＬＩＳＰＯＴプレート上でインキュベートした。これらのプレートを、０．５％Ｔｗｅｅｎ―２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ＰＢＳで希釈したビオチン標識化抗ＩＦＮγ抗体を加え、２〜２４時間インキュベートした。インキュベート後のプレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳで１０００倍に希釈したストレプトアビジンアルカリホスファターゼを加えた。室温下で１〜２時間後、プレートを洗浄し、ＢｉｏＲａｄ沈降基質キットを用いて展開させた。AutoImmun Diagnostikaシステムにより、プレートの計数を行った。結果は、ウエルに加えた１００万個の細胞あたりのスポット・フォーミング・ユニット（ｓｆｕ）として表し、試験での応答結果と、培地単独に対する応答との差を計算した。
【０１４０】
当該分野の専門家であれば、本発明の範囲や精神から逸脱することなく本発明で用いた方法及びシステムに、種々の修正や変更を加えることが可能である。本発明は具体的に好ましい実施例との関連で説明しているが、本発明のクレーム範囲は、それらの具体的な実施例に不当に限定されるべきではない。実際には、化学、生物、若しくは関連分野における専門家にとっては自明であるところの、本発明を実施する上での種々の修正や変更も本発明の範疇に入る。上記明細書中で言及した刊行物は全て引用文献として後記した。
【０１４１】
引用文献
1 Fine, P. E. and Rodrigues, L. C., Lancet 1990.335: 1016-1020.
2 Orme, I. M., J.Immunol. 1987.138: 293-298.
3 Barnes, P. F., Bloch, A. B., Davidson, P. T. and Snider, D. E., Jr., N. Engl. J. Med. 1991.324: 1644-1650.
4 Flynn, J. L., Goldstein, M. M., Triebold, K. J., Koller, B. and Bloom, B. R., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. 89: 12013-12017.
5 Lalvani, A., Brookes, R., Wilkinson, R. J., Malin, A. S., Pathan, A. A., Andersen, P., Dockrell, H., Pasvol, G. and Hill, A. V., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998.95: 270-275.
6 Tascon, R. E., Colston, M. J., Ragno, S., Stavropoulos, E., Gregory, D. and Lowrie, D. B., Nat. Med. 1996.2: 888-892.
7 Huygen, K., Content, J., Denis, O., Montgomery, D. L., Yawman, A. M., Deck, R. R., DeWitt, C. M., et al, Nat. Med. 1996.2: 893-898.
8 Schneider, J., Gilbert, S. C., Blanchard, T. J., Hanke, T., Robson, K. J., Hannan, C. M., Becker, M., et al, Nat. Med. 1998.4: 397-402.
9 Sedegah, M., Jones, T. R., Kaur, M., Hedstrom, R., Hobart, P., Tine, J. A. and Hoffman, S. L., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998.95: 7648-7653.
10 Harboe, M., Oettinger, T., Wiker, H. G., Rosenkrands, I. and Andersen, P., Infect. Immun. 1996.64: 16-22.
11 Brandt, L., Oettinger, T., Holm, A., Andersen, A. B. and Andersen, P., J. Immunol. 1996.157: 3527-3533.
12 Manca, C., Lyashchenko, K., Wiker, H. G., Usai, D., Colangeli, R. and Gennaro, M. L., Infect. Immun. 1997.65: 16-23.
13 Lalvani, A., Brookes, R., Hambleton, S., Britton, W. J., Hill, A. V. and McMichael, A. J., J. Exp. MED. 1997.186: 859-865.
14 Cooper, A. M., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Griffin, J. P., Russell, D. G. and Orme, I. M., J. Exp. Med. 1993.178: 2243-2247.
15 Newport, M. J., Huxley, C. M., Huston, S., Hawrylowicz, C. M., Oostra, B. A., Williamson, R. and Levin, M., N. Engl. J. Med. 1996.335: 1941-1949.
16 Zhu, X., Venkataprasad, N., Thangaraj, H. S., Hill, M., Singh, M., Ivanyi, J. and Vordermeier, H. M., J. Immunol. 1997.158: 5921-5926.
17 Tighe, H., Corr, M., Roman, M. and Raz, E., ImmunoL Today 1998.19: 89-97.
18 Schneider, J., Gilbert, S. C., Hannan, C. M., Degano, P., Prieur, E., Sheu, E. G., Plebanski, M. and Hill, A. V. S., Immunological Reviews 1999.170: 29-38.
19 Blanchard, T. J., Alcami, A., Andrea, P. and Smith, G. L., J. Gen. Virol. 1998.79: 1159-1167.
20 Rosenberg, E. S., Billingsley, J. M., Caliendo, A. M., Boswell, S. L., Sax, P. E., Kalams, S. A. and Walker, B. D., Science 1997. 278: 1447-1450.
21 Stoute, J. A., Slaoui, M., Heppner, D. G., Momin, P., Kester, K. E., Desmons, P., Wellde, B. T., et al, N. Engl. J. Med. 1997.336: 86-91.
22 Lalvani, A., Moris, P., Voss, G., Pathan, A. A., Kester, K. E., Brookes, R., Lee, E., et al, J. Infect. Dis. 1999.180: 1656-1664.
23 Gilbert SC, Plebanski M, Harris SJ, Allsopp CE, Thomas R, Layton GT, Hill AV. Nat Biotechnol. 1997 Nov; 15 (12): 1280-4.
24. Robson KJ, Hall JR, Jennings MW, Harris TJ, Marsh K, Newbold CI, Tate VE, Weatherall DJ. Nature. 1988 Sep 1; 335: 79-82.
【０１４２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】種々の免疫レジームの８週間経過後における効果を示すグラフである。データは、１グループあたり７〜１５匹のマウスにおける平均値及び標準誤差を示す。
【図２】ＤＤＤＭグループのマウスの脾細胞で行った⁵¹Ｃｒ放出アッセイの結果を示すグラフである。
【図３】投与試験に対する異種及び同種レジームによる防御を比較するグラフである。ＣＦＵ数／臓器の平均値は、投与８週間後に調べたものである。無処理コントロールグループと比較した場合：^*、ｐ＜０．０５、^**、ｐ＜０．０１。
【図４】異種プライム・ブーストワクチン接種の方が同種ワクチン接種より、ＴＴ１−１０集団に対して強力な応答を誘導することを示すグラフである。同種（Ｍ３）若しくは異種（Ｄ２Ｍ、ＤＭ２、Ｇ２Ｍ）いずれかのワクチン接種レジームによる３回のワクチン接種７日後における応答の大きさを棒グラフで表した。図中に示す応答は、（ａ）ＴＲＡＰＴ９／９６株のＮ末端１１０アミノ酸にわたるペプチド集団に対するエクスビボでのＥＬＩＳＰＯＴ応答である。
【図５】試験したドナー３名全てにおけるＴＴ１−１０ペプチド集団に対するマラリアワクチン特異的応答が、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を除去することによって消失し、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を除去しても消失しないことを示すグラフである。本発明では、３名のドナーから得たＰＢＭＣを、最終免疫７日後（ドナー０１２及び０２８）、又は最終免疫２１日後（ドナー０４９）に調べた。ＴＲＡＰＴＴ１−１１０に対する応答（消失せず；未処理）、ＣＤ４⁺Ｔを消失させたとき（ＣＤ４）、又はＣＤ８⁺Ｔ細胞を消失させたとき（ＣＤ８）について、ＰＢＭＣを調べた。
【図６】異種及び同種プライム・ブーストワクチン接種レジーム７日後における破傷風トキソイドエピトープＦＴＴｐに対する応答を示すグラフである。

Claims

（ａ）結核菌抗原の１若しくは２以上のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープ源を含む第一組成物であって、前記第一組成物におけるＴ細胞エピトープ源がポックスウイルスベクター以外の、前記１若しくは２以上のＣＤ４ ^＋Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡベクターである第一組成物と、
（ｂ）前記第一組成物におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープと同じＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを少なくとも１つ含む、前記結核菌抗原の１若しくは２以上のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープ源を含む第二組成物
とを含む複合製剤であって、
前記第二組成物におけるＣＤ４^＋エピトープ源が、前記１若しくは２以上のＣＤ４ ^＋Ｔ細胞エピトープをコードする改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株（ＭＶＡ）であることを特徴とし、同時に、個別に、若しくは順不同で連続して前記複合製剤を用いることにより、前記結核菌抗原に対するＴ_Ｈ１型ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を誘導し、結核を予防又は治療する複合製剤。
（ａ）結核菌抗原の１若しくは２以上のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープ源、及び１若しくは２以上のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープ源を含む第一組成物であって、前記第一組成物におけるＴ細胞エピトープ源がポックスウイルスベクター以外の、前記１若しくは２以上のＣＤ４ ^＋Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡベクターである第一組成物と、
（ｂ）（ｉ）前記第一組成物におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープと同じＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを少なくとも１つ含む、前記結核菌抗原の１若しくは２以上のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープ源、及び
（ii）前記第一組成物におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープと同じＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープを少なくとも１つ含む、前記結核菌抗原の１若しくは２以上のＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープ源
を含む第二組成物と
を含む複合製剤であって、前記第二組成物におけるＣＤ４^＋エピトープ源が、前記１若しくは２以上のＣＤ４ ^＋Ｔ細胞エピトープをコードする改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株（ＭＶＡ）であることを特徴とし、同時に、個別に、若しくは順不同で連続して前記複合製剤を用いることにより、結核菌抗原に対するＴ_Ｈ１型ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答及びＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫応答の両応答を誘導し、結核を予防又は治療する複合製剤。
ＤＮＡベクターが、パッケージされているか又は剥き出しであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合製剤。
ＤＮＡベクターが、ＤＮＡプラスミドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の複合製剤。
第一若しくは第二組成物におけるエピトープ又は第一若しくは第二組成物によってコードされるエピトープが、ヒト型結核菌の遺伝子発現産物として自然に生じることのない配列によってもたらされることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の複合製剤。
誘導されたＴ_Ｈ１型ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答が、γ−インターフェロン分泌型であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の複合製剤。
組成物を皮内投与することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の複合製剤。
第一組成物を少なくとも一回投与し、続いて第二組成物を少なくとも一回投与することを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の複合製剤。
第一組成物を複数回に渡り連続投与し、続いて第二組成物を少なくとも一回投与することを特徴とする請求項８記載の複合製剤。
第一組成物を３回連続投与し、続いて第二組成物を一回投与することを特徴とする請求項９記載の複合製剤。
結核菌抗原が、ＥＳＡＴ−６、ＭＰＴ６３又は８５Ａであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか記載の複合製剤。
結核菌抗原に対するＴ_Ｈ１型ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を誘導する薬剤製造における請求項１〜１１のいずれか記載の複合製剤の使用。
結核菌抗原の１又は２以上のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープをコードする改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株（ＭＶＡ）と、薬学的に許容される担体とを含む、初回免疫されたＴ_Ｈ１型ＣＤ４^＋Ｔ細胞の結核菌に対する応答を高めるために用いる医薬組成物であって、前記Ｔ_Ｈ１型ＣＤ４^＋Ｔ細胞の結核菌に対する応答が、請求項１〜１１のいずれか記載の第一組成物を用いて初回免疫され、かつ前記改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株が、前記第一組成物におけるＣＤ４ ^＋Ｔ細胞エピトープと同じ少なくとも一つのＣＤ４ ^＋Ｔ細胞エピトープをコードする、医薬組成物。
初回免疫されたＴ_Ｈ１型ＣＤ４^＋Ｔ細胞の、少なくとも一種類の結核菌抗原に対する応答を高める薬剤であって、前記Ｔ_Ｈ１型ＣＤ４^＋Ｔ細胞の結核菌に対する応答が、請求項１〜１１のいずれか記載の第一組成物を用いて初回免疫され、前記薬剤が、前記結核菌抗原の１若しくは２以上のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープ源を含み、前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープ源が、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株（ＭＶＡ）であり、かつ前記改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株が、前記第一組成物におけるＣＤ４ ^＋Ｔ細胞エピトープと同じ少なくとも一つのＣＤ４ ^＋Ｔ細胞エピトープをコードすることを特徴とする薬剤。
改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株（ＭＶＡ）が、ＥＳＡＴ−６、ＭＰＴ６３、及び８５Ａから選択される結核菌抗原をコードすることを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物又は請求項１４記載の薬剤。
１又は２以上のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープが、ＴＦＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰＴ、ＱＲＮＤＰＬＬＮＶＧＫＬＩＡＮＮＴＲＶＷ、及びＬＧＧＮＮＬＰＡＫＦＬＥＧＦＶＲＴＳＮＩから選択される１又は２以上を含むことを特徴とする請求項１３若しくは１５記載の医薬組成物又は請求項１４若しくは１５記載の薬剤。
改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株が、ヒト型結核菌抗原８５Ａをコードすることを特徴とする請求項１３、１５、及び１６のいずれか記載の医薬組成物又は請求項１４〜１６のいずれか記載の薬剤。
初回免疫されたＴ_Ｈ１型ＣＤ４^＋Ｔ細胞の、結核菌抗原に対する免疫応答を高めるための薬剤製造における、前記結核菌抗原の１若しくは２以上のＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープ源を含む、組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株（ＭＶＡ）の使用であって、前記Ｔ_Ｈ１型ＣＤ４^＋Ｔ細胞の結核菌に対する応答が、請求項１〜１１のいずれか記載の第一組成物を用いて初回免疫され、かつ前記改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株が、前記第一組成物におけるＣＤ４ ^＋Ｔ細胞エピトープと同じ少なくとも一つのＣＤ４ ^＋Ｔ細胞エピトープをコードする、使用。
改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株（ＭＶＡ）が、請求項１５〜１７のいずれか記載の改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ株（ＭＶＡ）であることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。