DE60320520T3 - Verfahren zur amplifikation von einem poxvirus in serumfreien verhältnissen - Google Patents

Verfahren zur amplifikation von einem poxvirus in serumfreien verhältnissen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Verfahren zur Amplifikation eines Poxvirus, wie in den Ansprüchen gekennzeichnet.
  • Stand der Technik
  • Die meisten viralen Impfstoffe, wie etwa abgeschwächte oder rekombinante Viren, werden aus Zellkultursystemen hergestellt. Bei den für die Virus/Impfstoff-Produktion verwendeten Zellen kann es sich um Zellinien handeln, d.h. Zellen, die kontinuierlich in vitro wachsen, und zwar entweder als Einzelzellensuspensionskultur in Bioreaktoren oder als Monolayer auf einer Zellträgeroberfläche von Gewebekulturkolben oder -rollerflaschen. Zu für die Produktion von Viren verwendeten Zellinien gehören beispielsweise unter anderem die für die Herstellung von Polioviren verwendete menschliche fötale Lungenzellinie MRC-5 und die für die Herstellung von Masernvirus, Mumpsvirus und Rötelnvirus (MMR II) (Merk Sharp & Dohme) verwendete menschliche fötale Lungenzellinie WI-38.
  • Für die Herstellung von Impfstoffen werden nicht nur Zellinien, sondern auch primäre Tierzellen verwendet. Primäre Zellen, die für die Virusproduktion verwendet werden, sind beispielsweise Hühnerembryofibroblasten (Chicken Embryo Fibroblasts, CEF-Zellen). Diese Zellen werden für die Produktion von Masernvirus und japanischem Encephalitisvirus (Pasteur Merieux), Mumpsvirus (hergestellt von Provaccine), Tollwutvirus (hergestellt von Chiron Berhing GmbH & Co.), Gelbfiebervirus (Herstellung von Aprilvax), Grippevirus (hergestellt von Wyeth Labs und SmithKline & Beecham) und modifiziertem Vacciniavirus Ankara (MVA) verwendet.
  • CEF-Zellen werden deswegen häufig verwendet, da viel Virusimpfstoffe durch Abschwächen des die Viruskrankheit verursachenden Virus über serielle Passagierung in CEF-Zellen hergestellt werden. Das abgeschwächte Virus führt zwar nicht mehr zur Krankheit, ist jedoch noch in der Lage, eine starke Schutzimmunität gegen die virulente Form des Virus zu stimulieren. Ein Beispiel für diesen Virustyp ist MVA. Dieses Virus weist im Menschen und in den meisten Tieren eine stark eingeschränkte Replikation auf. MVA wird als Impfstoffvektor entwickelt, da es sich zur Expression von aus verschiedenen krankheitsverursachenden Agentien beim Menschen stammenden Antigenen verwenden läßt. Abgeschwächte Viren, wie etwa MVA, werden vorzugsweise nicht auf menschlichen Zellen propagiert, da es Bedenken darüber gibt, daß die Viren in Zellen menschlichen Ursprungs wieder replikationskompetent werden könnten. Viren, die die Fähigkeit wiedererlangt haben, in menschlichen Zellen zu reproduzieren, könnten aber ein Gesundheitsrisiko darstellen, falls sie dem Menschen verabreicht werden, insbesondere wenn die Individuen immungeschwächt sind. Aus diesem Grunde werden einige abgeschwächte Viren, wie etwa MFA, strikt aus CEF-Zellen hergestellt, falls sie für die Verwendung beim Menschen vorgesehen sind.
  • Darüber hinaus werden CEF-Zellen für solche Viren verwendet, die nur auf diesen Zellen wachsen. Beispiele für derartige Viren sind insbesondere Vogelviren, wie etwa Avipoxviren, ganz besonders Canary Poxvirus, ALVAC, Fowl Poxvirus und NYVAC.
  • Zellinien und primäre Zellen, die unter In-vitro-Kulturbedingungen angezogen werden, erfordern ein spezielles Wachstums- und Haltungsmedium, das (I) die Zellreplikation in der logarithmischen Phase und (II) die Zellhaltung, sobald die Zellen sich nicht länger teilen, d.h. wenn sich die Zellen in der stationären Phase befinden, unterstützen kann. Die üblicherweise verwendeten Zellkulturmedien enthalten eine reiche Salzlösung mit Vitaminen, Aminosäuren, essentiellen Spurenelementen und Zuckern. Wachstumshormone, Enzyme und biologisch aktive Proteine, die für die Unterstützung des Zellwachstums und der Zellhaltung benötigt werden, werden üblicherweise als Zusatzpräparat in Form eines aus Tierblut stammenden Serumprodukts zum Medium gegeben. Beispiele für aus Tierblut stammenden Serumprodukte sind fötales Kälberserum, Hühnerserum, Pferdeserum und Schweineserum. Diese Seren werden aus fraktioniertem Blut gewonnen, aus dem die roten und die weißen Blutzellen entfernt wurden. Primäre Zellen, wie etwa CEF-Zellen sind sogar noch abhängiger von Tierserumquellen als andere Zellinien. So werden primäre Zellen normalerweise in Zellkulturmedien mit 5 bis 10% Serum, in den meisten Fällen fötalem Kälberserum (Fetal Calf Serum, FCS) kultiviert.
  • Die Tierseren enthalten nicht nur Faktoren, die für das Wachstum der Zellen benötigt werden, sondern auch Faktoren, die für Zellen benötigt werden, die natürlicherweise als adhärente Zellen wachsen, so daß diese an die Zellträgeroberfläche des Kulturgefäßes binden. Somit ist es für adhärente Zellen kritisch, daß dem Medium genug Serum zugesetzt wird, um ihnen das Wachstum und die Bildung eines Monolayer zu ermöglichen.
  • Unglücklicherweise können Rinderserum bzw. fötales Kälberserum ebenso wie Seren von anderen Tieren zufällige Krankheitserreger, wie etwa Viren, enthalten. Es besteht die mögliche Gefahr, daß diese Krankheitserreger auf das Tier bzw. den Menschen, das bzw. der mit dem Impfstoff oder einem anderen in Zellkultur hergestellten pharmazeutischen Produkt behandelt oder geimpft werden soll, übertragen werden. Dies ist besonders dann relevant, wenn Zellkulturprodukte an immungeschwächte Menschen verabreicht werden. Eines der vielen potentiellen Hauptprobleme, die mit dem allgemein verwendeten Rinderserumzusatzpräparat assoziiert sind, ist die mögliche Übertragung des BSE (Bovine Spongiforme Encephalopathy) verursachenden Agens auf die Tiere/Menschen, die mit dem aus Zellkultur hergestellten Produkten in Kontakt kommen.
  • Im Hinblick auf das mögliche, mit der Verwendung von Tierseren in Zellkultur verbundene Risiko wurde klar, daß Herstellungsprozesse, bei denen keinerlei Tierprodukte verwendet werden, hochwünschenswert sind.
  • Hierzu wurden für das kontinuierliche Wachstum von Zellinien bzw. für die Herstellung von Viren in kontinuierlich wachsenden Zellinien spezifische Medien entwickelt, die nicht mit Tierseren ergänzt werden brauchen. Ein Beispiel für ein solches serumfreies Medium, das zur Kultivierung von Zellinien verwendet werden kann, ist VP-SFM, hergestellt von der Firma Gibco BRL/Life Technologies. Gemäß den Angaben des Herstellers ist VP-SFM spezifisch für das Wachstum von VERO, COS-7, MDBK, Hep2, BHK-21 und anderen wichtigen Zellinien (Price, P. und Evege, E. Focus 1997, 19: 67-69) sowie zur Virusproduktion in den genannten Zellinien vorgesehen. Bezüglich der Kultivierung von primären Zellen in dem Medium liegen keine Informationen vor.
  • Aus der US 5,503,582 ist die Kultivierung der CEF-Zellen in Medium mit 4% Kälberserum und anschließender Infektion der Zellen mit Fowlpoxvirus in serumfreiem Medium bekannt. Von Spataro, A.C. et al., J. Cell. Sci. 1976; 21. 407-413, wird offenbart, daß die CEF-Zellen in serumfreiem Medium 24 Stunden nach Bildung eines Monolayer gehalten werden können. Somit umfassen nach beiden Veröffentlichungen die für die Kultivierung der Zellen nach dem Aussäen verwendeten Medien Serum. Lediglich für das Halten der Zellen, die bereits an der Oberfläche gebunden sind und die die stationäre Phase erreicht haben, wurde serumfreies Medium verwendet. Erfolgt das Aussäen mit herkömmlichem Medium, wie beispielsweise Medium 199 oder RPMI-1640 ohne Serum, wird kein Monolayer gebildet, und die Zellen bilden in den Medien nicht lebensfähige Aggregate.
  • Die WO 98/15614 bezieht sich auf ein spezifisches serumfreies Medium für die In-vitro-Kultivierung von Tierzellen. Zu den Zellen, die sich in dem Medium kultivieren lassen, wie in der WO 98/15614 offenbart, gehören solche tierischen Ursprungs, einschließlich Zellen, die aus Säugern, Vögeln, Insekten oder Fischen gewonnen werden. Bei den Säugerzellen kann es sich um primäre Zellen menschlichen Ursprungs handeln. Primäre Vogelzellen werden nicht erwähnt.
  • Aus der US 5,405,772 ist ein serumfreies Medium für die Proliferation und Entwicklung von Zellen bekannt. Bei den Zellen handelt es sich vorzugsweise um hämatopoetische Zellen und Knochenmarkstromazellen. Primäre Vogelzellen werden nicht genannt.
  • Aus der WO 98/04680 ist ein serumfreies Medium für die Anzucht ankerabhängiger Säugerzellen, wie etwa der Zellinien BHK, Vero oder MRC-5 bekannt. Die WO 98/04680 bezieht sich weder auf primäre Zellen noch auf Vogelzellen.
  • Von Pietrzkowski et al. Folia Histochemica et Cytobiologica 1988, 26: 123-132 wird beschrieben, daß Dextran T-500 das Überleben und das Ausbreiten von Hühnerembryozellen in serumfreiem Medium verbessert. Allerdings betrifft Pietrzkowski et al. nicht die Amplifikation von Viren.
  • In der US 4,072,565 wird die Anzucht von Zellen in Gewebekultur sowie die Virusimpfstoffproduktion in Gewebekultur in Abwesenheit von Serum beschrieben.
  • Allerdings schweigt sich die US 4,072,565 über die Amplifikation von Poxviren aus.
  • Aufgabe der Erfindung
  • Die Aufgabe der vorliegenden Offenbarung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens, das die Kultivierung primärer Vogelzellen in serumfreiem Medium gestattet, wobei das Verfahren (I) das Wachstum der Zellen während der logarithmischen Phase und (II) die Haltung der Zellen in der stationären Phase gestattet. Darüber hinaus kann, falls es sich bei den Zellen um adhärente Zellen handelt, das Medium vorzugsweise (III) die Bindung der adhärenten Zellen an die Oberfläche des Zellkulturgefäßes gestatten. Somit besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Amplifikation von Poxvirus unter Verwendung primärer Vogelzellen unter serumfreien Bedingungen, wie in den Ansprüchen gekennzeichnet.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Durch die vorliegende Offenbarung wird das beanspruchte Verfahren bereitgestellt.
  • Primäre Vogelzellen, die natürlicherweise als adhärente Zellen wachsen, binden nach Aussäen an die Oberfläche des Zellkulturgefäßes und wachsen in einer logarithmischen Phase bis zur Ausbildung eines Monolayer, wobei die ruhenden Zellen in dem während der Anbindung und des logarithmischen Wachstums der Zellen verwendeten Medium gehalten werden können.
  • Das offenbarte Verfahren ist nicht auf Zellen, die Monolayer bilden, beschränkt. Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann das Verfahren für alle anderen Arten primärer Vogelzellen verwendet werden, wie etwa Zellen, die natürlicherweise in Suspensionskultur wachsen (z.B. Lymphozyten oder andere Arten von Blutzellen), oder Zellen, die natürlicherweise als adhärente Zellen wachsen würden, die jedoch an das Wachstum in Suspensionskultur angepaßt wurden.
  • Wie nachfolgend dargestellt, lassen sich die primären Vogelzellen auch für die serumfreie Amplifikation von Poxviren, die sich als Impfstoffe eignen könnten, einsetzen.
  • Unerwarteterweise können natürlicherweise als adhärente Zellen wachsende primäre Vogelzellen (I) wirksam an die Oberfläche des Zellkulturgefäßes ohne Ausbildung nicht akzeptierbarer Mengen von Aggregaten binden und (II) in der logarithmischen Phase bei Abwesenheit von Serum angezogen werden, da allgemein angenommen wurde, daß primäre Vogelzellen von einer Vielzahl unterschiedlicher Faktoren und Komponenten, die in Serum enthalten sind, abhängen. Zudem wurde angenommen, daß adhärente Zellen nicht lebensfähige Aggregate bilden, die nicht an die Oberfläche des Zellkulturgefäßes binden, wenn sie in serumfreiem Medium kultiviert werden. Somit stellte es sich unerwarteterweise heraus, daß es ausreicht, serumfreies Medium mit EGF und gegebenenfalls Anwendungsfaktoren zu versetzen, um die Anbindung und das Wachstum adhärenter primärer Vogelzellen zu erreichen. Zudem stellte sich unerwarteterweise heraus, daß in Suspensionskultur kultivierte primäre Vogelzellen mit den in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Medien angezogen werden können. Eine weitere Überraschung war, daß primäre Vogelzellen, wie etwa CEF-Zellen (Chicken Embryo Fibroblasts) in einem EGF und gegebenenfalls Anbindungsfaktoren enthaltenden serumfreien Medium so kultiviert werden können, daß sie an die Oberfläche eines Zellkulturgefäßes ohne Ausbildung nicht akzeptierbarer Mengen von Aggregaten binden, da Vogelzellen bekanntermaßen äußerst schlecht in serumfreiem Medium, das keine Wachstumsfaktoren oder Anbindungsfaktoren enthält, wuchsen, d.h. es wurde nicht erwartet, daß die schlechten Wachstumseigenschaften primärer Vogelzellen durch Zugabe von EGF und gegebenenfalls Anbindungsfaktoren zu serumfreien Medium signifikant verbessert werden könnten.
  • Der Begriff „primäre Zellen“, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, ist dem Fachmann allgemein bekannt. Ohne auf die folgende Definition beschränkt zu sein, bezieht sich der Begriff „primäre Zellen“ allgemein auf Zellen, die aus einem tierischen oder menschlichen Gewebe, Organ oder Organismus frisch isoliert wurden, wobei die Zellen nicht in der Lage sind, kontinuierlich und endlos zu replizieren und sich zu teilen. Normalerweise teilen sich primäre Zellen in Zellkultur weniger als 100mal, häufig weniger als 50mal, häufig weniger als 25mal. Somit haben primäre Zellen kein Immortalisierungsereignis durchlaufen. Primäre Zellen sind beispielsweise Nabelschnurblutlymphozyten sowie menschliche oder tierische Fibroblasten. Zur beispielhaften Veranschaulichung der Erfindung sind Vogelfibroblasten, ganz besonders CEF-Zellen (Chicken Embryo Fibroblasts), bevorzugt.
  • Verfahren, wie primäre Zellen isoliert werden können, sind dem Fachmann allgemein bekannt. Im allgemeinen werden primäre Zellkulturen direkt aus Geweben, Organen oder Embryos gewonnen. Die Gewebe, Organe oder Embryos werden dabei einer Proteasebehandlung unterzogen, um Einzelzellen zu gewinnen. Die primären Vogelzellen werden dann nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung unter In-vitro-Kulturbedingungen kultiviert.
  • Insbesondere werden CEF-Zellen aus mit Protease verdauten Hühnerembryos isoliert. CEF-Zellen wachsen am besten als adhärente Zellen, die an eine feste Zellträgeroberfläche gebunden sind. Die Zellen beginnen zu replizieren und bilden einen Monolayer. Werden CEF-Zellen (nach Embryoverdauung) in vitro mit einem Standardkulturmedium ohne Tierserum kultiviert, so binden die Zellen gelegentlich an die feste Zellträgeroberfläche, replizieren jedoch nicht unter Bildung eines konfluenten Monolayer von Zellen und lösen sich nach und nach langsam von der festen Kultivierungsträgeroberfläche ab. Werden die CEF-Zellen hingegen nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kultiviert, so binden die Zellen an den festen Träger, wachsen in der logarithmischen Phase bis zur Ausbildung eines Monolayer und können in der stationären Phase mehrere Tage gehalten werden.
  • Der Begriff „Kultivierung von Zellen“ in einem serumfreien Medium im Zusammenhang mit adhärenten primären Zellen bezieht sich auf das Aussäen der Zellen in das Kulturgefäß in einem serumfreien Medium, auf das Wachsen der Zellen in einem serumfreien Medium in der logarithmischen Phase bis zur Ausbildung eines Monolayer und/oder auf die Haltung der Zellen in serumfreiem Medium, sobald der Monolayer ausgebildet ist. Der Begriff „Kultivierung von Zellen“ in einem serumfreien Medium bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem alle obenerwähnten Schritte mit serumfreiem Medium durchgeführt werden, so daß während des gesamten Kultivierungsvorgangs der Zellen keine Tierserumprodukte vorhanden sind. Somit bezieht sich in einer allgemeineren Bedeutung der Begriff „Kultivierung von Zellen in einem serumfreien Medium“ auf die Tatsache, daß alle zur Ausbildung eines Monolayer führenden Medien serumfreie Medien sind. Das in allen obigen Schritten verwendete Medium enthält EGF und gegebenenfalls Anbindungsfaktoren.
  • Der Begriff „Kultivierung von Zellen“ in einem serumfreien Medium im Zusammenhang mit in Suspensionskultur wachsenden Zellen bezieht sich auf das Aussäen der Zellen in das Kulturgefäß in einem serumfreien Medium, das Wachsen der Zellen in einem serumfreien Medium in der logarithmischen Phase und/oder die Haltung der Zellen in serumfreiem Medium, sobald die Sättigungsdichte, bei der keine weitere Replikation stattfindet, erreicht ist. Der Begriff „Kultivierung von Zellen“ in einem serumfreien Medium bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem alle obenerwähnten Schritte mit serumfreien Medium ausgeführt werden, so daß während der gesamten Kultivierung der Zellen keine Tierserumprodukte vorhanden sind. Das in allen obigen Schritten verwendete Medium enthält EGF.
  • Wie nachfolgend ausführlicher erläutert, könnte es auch möglich sein, Zellen, die normalerweise als angebundene Zellen wachsen würden, auch als Suspensionskulturzellen zu kultivieren, falls entsprechende Inkubationsbedingungen gewählt werden (z.B. durch Anwenden einer „Wave“-Inkubation). Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gilt auch für diese Art der Inkubation.
  • Der Begriff „serumfreies“ Medium bezieht sich auf alle Zellkulturmedien, die keine Seren tierischen oder menschlichen Ursprungs enthalten. Geeignete Zellkulturmedien sind dem Fachmann bekannt. Diese Medien enthalten Salze, Vitamine, Puffer, Energiequellen, Aminosäuren und andere Substanzen. Ein Beispiel für ein für die serumfreie Kultivierung von CEF-Zellen geeignetes Medium ist Medium 199 (Morgan, Morton und Parker; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950, 73, 1; unter anderem erhältlich bei Life Technologies).
  • Die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Medien, insbesondere die für adhärente Zellen, wie etwa CEF-Zellen, verwendeten Medien, enthalten EGF und gegebenenfalls Anbindungsfaktoren. Ein Anbindungsfaktor ist beispielsweise Fibronectin.
  • Bei Zellen, die natürlicherweise als adhärente Zellen wachsen würden, die jedoch nichtsdestoweniger in Suspensionskultur kultiviert werden (was z.B. bei CEF-Zellen möglich ist), die EGF enthält. Beispiele für EGFs sind rekombinante epidermale Wachstumsfaktoren (Epidermal Growth Factors, EGFs) aus Rind, Maus, Huhn und Mensch. Am stärksten bevorzugt ist rekombinanter menschlicher EGF (rh-EGF) (Chemicon Int., Katalog-Nr GF001).
  • Bei Zellen, die natürlicherweise in Suspensionskultur wachsen, enthält das Medium EGF. Es handelt sich bei zusätzlichen Wachstumsfaktoren für diese Art von Zellen um Faktoren, die spezifisch für nicht adhärente Zellen sind. Zu diesen Wachstumsfaktoren zählen beispielsweise Interleukine, GM-CSF, G-CSF und andere. Der Fachmann kann leicht durch Routineversuche bestimmen, welche Art von Faktor für welche Art von Zellen geeignet ist.
  • Est ist bevorzugt, EGF, insbesondere rh-EGF, in einer Konzentration von 1 bis 50 ng/ml, stärker bevorzugt 5 bis 20 ng/ml, zum Medium zu geben. Allerdings ist sich der Fachmann über die Tatsache im Klaren, daß unterschiedliche Zellarten eine etwas andere EGF-Konzentration im Serum für optimale Ergebnisse benötigen können.
  • Falls es sich bei dem zum serumfreien Medium gegebenen Anbindungsfaktor um Fibronectin handelt (z.B. Chemicon Int.; Fibronectin aus menschlichem Plasma; Katalognummer FC010), so ist es bevorzugt, dieses in einer Konzentration von 1 bis 50, stärker bevorzugt 1 bis 10, µg/cm2 Oberfläche des Zellkulturgefäßes zum Medium zu geben. Allerdings ist sich der Fachmann der Tatsache bewußt, daß unterschiedliche Zellarten eine etwas andere Fibronectinkonzentration im Serum für optimale Ergebnisse benötigen können.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung reicht es aus, nur EGF und gegebenenfalls Anbindungsfaktoren zum Medium zu geben, insbesondere, wenn es sich bei den Zellen um adhärente Zellen handelt. Es ist allerdings auch möglich, zwei oder mehr aus Wachstumsfaktoren und Anbindungsfaktoren ausgewählte Faktoren zum Medium zu geben. Das Medium kann vorzugsweise EGF und Fibronectin, vorzugsweise in den oben definierten Konzentrationsbereichen, enthalten, insbesondere, wenn es sich bei den primären Zellen um adhärente Zellen, wie etwa CEF-Zellen, handelt.
  • Das Medium kann ferner einen oder mehrere Zusatzstoffe, ausgewählt aus mikrobiellem Extrakt, Pflanzenextrakt und Extrakt aus einem Nichtsäugetier, enthalten. Bei dem mikrobiellen Extrakt handelt es sich vorzugsweise um Hefeextrakt oder Yeastolate-Ultrafiltrat. Bei dem Pflanzenextrakt handelt es sich vorzugsweise um Reisextrakt oder Sojaextrakt. Bei dem Extrakt aus einem Nichtsäugetier handelt es sich vorzugsweise um Fischextrakt.
  • Man kann das kommerziell erhältliche serumfreie Medium, das bereits EGF und gegebenenfalls Anbindungsfaktoren enthält, mit Asparagin versetzen. Besonders bevorzugt wird Asparagin zu dem Medium gegeben, das während der Infektion mit Virus verwendet wird (siehe unten). Kommerzielle serumfreie Medien enthalten üblicherweise Asparagin in einem Konzentrationsbereich von 0,3 bis 1,0 mM. Bevorzugte Asparaginmengen zur Ergänzung des Mediums liegen im Bereich von 0,5 bis 1,5 mM. Am stärksten bevorzugt ist eine Ergänzung mit 1 mM Asparagin. Die Gesamtkonzentration von Asparagin im Medium liegt vorzugsweise unterhalb von 2 mM und stärker bevorzugt in einem Bereich von 0,8 bis 1,8 mM. Am stärksten bevorzugt ist eine Asparaginkonzentration von 1,3 mM im Medium.
  • Zudem kann vorzugsweise Glutamin zum Medium gegeben werden. Stärker bevorzugt wird Glutamin zu dem Medium gegeben, das während der Infektion mit Virus verwendet wird (siehe unten). Bevorzugte Glutaminmengen zur Ergänzung des Mediums liegen im Bereich von 1 bis 5 mM, stärker bevorzugt in einem Bereich von 2 bis 4 mM. Die angegebenen Bereiche entsprechen auch den bevorzugten Gesamtkonzentrationen im Medium, da die meisten der kommerziell erhältlichen Medien kein Glutamin enthalten.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation eines Poxvirus, das die folgenden Schritte umfaßt: Im ersten Schritt werden primäre Vogelzellen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren kultiviert, d.h. primäre Vogelzellen werden in einem serumfreien Medium kultiviert, das EGF und gegebenenfalls Anbindungsfaktoren je nach Zellart enthält. Alle Bedingungen, Definitionen, bevorzugten Ausführungsformen und auch die Reihenfolge von bevorzugten bis am stärksten bevorzugten Ausführungsformen, die für die Beschreibung des Verfahrens der Kultivierung primärer Vogelzellen oben angegeben sind, gelten für die Definition des ersten Schritts des Verfahrens zur Amplifikation von Poxvirus gemäß der vorliegenden Erfindung. In einem zweiten Schritt werden die primären Vogelzellen mit dem Poxvirus in serumfreiem Medium mit EGF infiziert. Im dritten Schritt werden die infizierten Zellen in serumfreiem Medium mit EGF inkubiert, bis Virusnachkommen produziert werden.
  • Der Begriff „Amplifikation eines Poxvirus“ wird dazu verwendet, um klarzumachen, daß das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zur Erhöhung der Virusmenge aufgrund einer produktiven viralen Replikation des Virus in den infizierten Zellen verwendet wird. Mit anderen Worten: Das Verhältnis von Virusausgabe zu Viruseingabe sollte vorzugsweise oberhalb von 1 liegen. Somit werden gemäß der vorliegenden Erfindung solche primären Vogelzellen für ein spezifisches Poxvirus gewählt, in denen das Virus in der Lage ist, produktiv zu replizieren. Der Begriff „reproduktive Replikation“ bezieht sich auf die Tatsache, daß das spezifische Virus in der spezifischen primären Vogelzelle in einem solchen Ausmaß repliziert, daß infektiöse Virusnachkommen produziert werden, wobei das Verhältnis von Virusausgabe zu Viruseingabe oberhalb von 1 liegt.
  • Dem Fachmann ist bekannt, welche Viren sich in welcher Art von primären Zellen produktiv replizieren lassen. Im allgemeinen können als primäre Zellen menschliche Vorhautfibroblasten dienen, falls es sich bei dem zu amplifizierenden Virus um das menschliche Cutomegalovirus handelt; die primären Zellen können CEF-Zellen sein, wenn es sich bei dem zu amplifizierenden Virus um das Masernvirus, Mumpsvirus, Tollwutvirus, japanische Encephalitisvirus, Gelbfiebervirus, Grippevirus oder erfindungsgemäß ein Poxvirus, wie etwa Vacciniavirus, insbesondere das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA), handelt.
  • Die Infektion primärer Vogelzellen gemäß dem zweiten Schritt der vorliegenden Erfindung ist dem Fachmann bekannt. Beispielhaft kann das Virus einfach dem Medium zugesetzt werden. Als Alternative kann das Medium entfernt und das Virus zu frischem Medium gegeben werden, das wiederum zu den Zellen gegeben wird. Zur Erreichung einer effizienten Infektion sollte die Menge an Virus/Medium-Suspension so gering wie möglich sein, damit eine hohe Viruskonzentration vorliegt. Nach der Anbindung des Virus kann zusätzliches Medium hinzugefügt werden.
  • Im dritten erfindungsgemäßen Schritt werden die Zellen in serumfreiem Medium mit EGF kultiviert, bis Poxvirusnachkommen produziert werden.
  • Das im zweiten und dritten Schritt des wie beanspruchten Verfahrens zur Amplifikation eines Poxvirus verwendete serumfreie Medium ist das gleiche Medium, das bereits zuvor verwendet wurde, d.h. ein serumfreies Medium, das EGF und gegebenenfalls Anbindungsfaktoren je nach der Zellart enthält.
  • Während aller Stufen kann das Medium mit Asparagin und/oder Glutamin ergänzt werden, wie oben skizziert, wobei die Gesamtkonzentration an Asparagin im Medium vorzugsweise wie oben definiert ist.
  • Die Poxvirusnachkommen können nach dem Fachmann bekannten Verfahren aufkonzentriert und aufgereinigt werden.
  • Unerwarteterweise stellte sich heraus, daß Poxviren sich auf unter serumfreien Bedingungen kultivierten Zellen amplifizieren lassen, da Zellen nur sehr schlecht mit dem bekannten serumfreien Medium wachsen. Somit wurde erwartet, daß der mit einer Poxvirusinfektion verbundene zusätzliche Streß die bereits gestreßten Zellen abtöten würde, bevor eine signifikante Amplifikation des Poxvirus stattfand.
  • Bei dem Poxvirus handelt es sich vorzugsweise um ein Orthopoxvirus. Orthopoxviren sind beispielsweise Avipoxviren und Vacciniaviren.
  • Der Begriff „Avipoxvirus“ bezieht sich auf ein beliebiges Avipoxvirus, wie etwa Fowlpoxvirus, Canarypoxvirus, Uncopoxvirus, Mynahpoxvirus, Pigeonpoxvirus, Psittacinepoxvirus, Quailpoxvirus, Peacockpoxvirus, Penguinpoxvirus, Sparrowpoxvirus, Starlingpoxvirus und Turkeypoxvirus. Bevorzugte Avipoxviren sind Canarypoxvirus und Fowlpoxvirus.
  • Ein Beispiel für ein Caranarypoxvirus ist der Stamm Rentschler. Ein plaquegereinigter Canarypoxstamm mit der Bezeichnung ALVAC ( US. 5,766,598 ) wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection (ATCC), Zugangsnummer VR-2547, hinterlegt. Ein weiterer Canarypoxstamm ist der kommerzielle Canarypoximpfstamm mit der Bezeichnung LF2 CEP 524 24 10 75, erhältlich bei Institute Merieux, Inc.
  • Beispiele für ein Fowlpoxvirus sind die Stämme FP-1, FP-5 und TROVAC ( US 5, 768, 598 ). Bei FP-1 handelt es sich um einen Duvette-Stamm, der so modifiziert ist, daß er als Impfstoff in einen Tag alten Hühnern verwendet werden kann. Bei dem Stamm handelt es sich um einen kommerziellen Fowlpoxvirusimpfstammm mit der Bezeichnung 0 DCEP 25/CEP67/2309 Oktober 1980, der bei Institute Merieux, Inc. erhältlich ist. Bei FP-5 handelt es sich um einen kommerziellen Fowlpoxvirusimpfstamm aus Hühnerembryo, der bei American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.) Madison, Wisconsin, United States Veterinary License Nr. 165, Serien-Nr. 30321 erhältlich ist.
  • Beispiele für Vacciniavirusstämme sind die Stämme Temple of Heaven, Copenhagen, Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health, Elstree, Ikeda und WR. Vorzugsweise wird die Erfindung mit modifiziertem Vacciniavirus Ankara (MVA) (Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12: 1032-40) durchgeführt. Ein typischer MVA-Stamm ist MVA 575, der bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter der Hinterlegungsnummer ECACC V00120707 hinterlegt wurde. Am stärksten bevorzugt ist MVA-BN oder ein Derivat davon, das in der beim europäischen Patentamt am 22. November 2001 unter dem Titel „Modified Vaccinia Ankara Virus Variant“ eingereichten PCT-Anmeldung PCT/ EP01/13628 beschrieben ist. MVA-BN wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008 hinterlegt. Die Merkmale von MVA-BN, die Beschreibung biologischer Testverfahren, die die Bewertung darüber gestatten, ob es sich bei einem MVA um MVA-BN oder ein Derivat davon handelt, sowie Verfahren, die die Gewinnung von MVA-BN oder ein Derivat davon gestatten, sind in der oben als Literaturstelle aufgeführten PCT-Anmeldung offenbart.
  • Bei dem gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu amplifizierenden Virus kann es sich um ein Wildtypvirus, ein abgeschwächtes Virus oder ein rekombinantes Virus handeln.
  • Der Begriff „rekombinantes Virus“ bezieht sich auf alle Viren, deren Genom eine Insertion eines heterologen Gens aufweist, das nicht natürlicherweise Teil des Virusgenoms ist. Ein heterologes Gen kann ein therapeutisches Gen, ein für ein Peptid, das wenigstens ein Epitop zur Induktion einer Immunantwort umfaßt, codierendes Gen, eine Antisense-Expressionskassette oder ein Ribozymgen sein. Verfahren zur Konstruktion rekombinanter Viren sind dem Fachmann bekannt. Als Poxvirusvektor ist MVA, insbesondere MVA 575 bzw. MVA-BN (siehe oben), am stärksten bevorzugt.
  • Ein „abgeschwächtes Virus“ ist ein Virus, das von einem krankheitserregenden Virus abstammt, das jedoch bei Infektion des Wirtsorganismus zu einer geringeren Mortalität und/oder Morbidität im Vergleich mit dem nicht abgeschwächten Elternvirus führt. Beispiele für abgeschwächte Poxviren sind dem Fachmann bekannt. Ein Beispiel für ein abgeschwächtes Vacciniavirus ist der Stamm MVA, insbesondere der Stamm, der bei der ECACC mit der Hinterlegungsnummer V00083008 hinterlegt wurde (siehe oben).
  • Wie oben bereits erläutert, können als primäre Vogelzellen bei Poxviren CEF-Zellen oder primäre Entenembryofibroblasten bevorzugt sein. Wiederum ist sich der Fachmann darüber bewußt, welche primären Vogelzellen für die Amplifikation von welchem Poxvirus geeignet sind. CEF-Zellen sind besonders für die Amplifikation von MVA bevorzugt. Bei der MVA-Amplifikation in CEF-Zellen besteht eine bevorzugte Ausführungsform darin, einen oder zwei der aus EGF und Fibronectin ausgewählten Faktoren auszuwählen.
  • Wird das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Amplifikation von MVA in CEF-Zellen verwendet, so ist bevorzugt, daß der Ausgangs-pH-Wert des Mediums in einem Bereich von etwa 7,0 bis etwa 8,5 liegt. Sonst bevorzugt ist ein Ausgangs-pH-Wert von 7,0.
  • Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Poxviren, insbesondere Vacciniaviren, am stärksten bevorzugt MVA-Stämme, wie etwa MVA-BN, unter serumfreien Bedingungen erhalten.
  • Aufgrund des Verfahrens zur Amplifikation des Virus sind das Poxvirus enthaltende Zusammensetzungen frei von allen Produkten und/oder infektiösen Agentien, die in Tierseren enthalten sind. Dagegen enthalten Zusammensetzungen, die nach herkömmlichen Verfahren produzierte Viren enthalten, aus Tierserum stammende Restverbindungen. Dies ist vor allem der Fall bei Zusammensetzungen, die Poxviren, wie etwa Vacciniavirusstämme, insbesondere MVA-Stämme, wie etwa MVA-BN, enthalten.
  • Falls es sich bei dem Poxvirus um ein Wildtypvirus oder ein abgeschwächtes Virus handelt, so kann das Poxvirus für die Impfung gegen das Virus als solches verwendet werden. Zu diesem Zweck sind abgeschwächte Viren besonders bevorzugt. Handelt es sich bei dem Virus um ein rekombinantes Virus, das von zum Virusgenom heterologen Genen exprimierte Proteine exprimiert, so besteht die Möglichkeit, gegen das Virus als solches und/oder gegen das exprimierte heterologe Protein zu impfen. Falls das rekombinante Virus ein therapeutisches Gen, wie etwa eine Antisense-RNA oder ein Ribozym, exprimiert, so kann das Virus als Arzneimittel verwendet werden.
  • Beispiele
  • Falls nicht anders angegeben, handelt es sich in den folgenden Beispielen bei dem serumfreien Medium um Medium 199 (Life Technologies). Bei dem zugegebenen EGF handelt es sich üblicherweise um den von der Firma Chemicon erhaltenen rekombinanten menschlichen EGF. Fibronectin (FN) wurde von der Firma Chemicon bezogen.
  • Beispiel 1: Präparation von Hühnerembryofibroblasten (CEF)-Zellen
  • Befruchtete SPF (Specific Pathogen Free)-Eier wurden nicht länger als 12 Tage bei 4°C gelagert. Die Eier wurden in einen Brutschrank gelegt und 10-12 Tage bei 37,8°C ± 8°C gebrütet. Eine Petrischale für maximal 11 Eier wurde mit 10-20 ml PBS vorbereitet. Die Eier wurden in einen speziellen Eierkarton gegeben und zur Sterilisierung der Außenseite der Eierschale ausgiebig mit Bacillol behandelt. Nach dem Trocknen wurde jeweils ein Loch in die Eier gemacht und die Schale vorsichtig entfernt. Die Chorioallantoismembran wurde zur Seite gelegt. Die Embryos wurden an den Füßen herausgezogen und anschließend dekapitiert. Danach wurden die Embryos in die vorbereiteten Petrischalen überführt. Nach Abtrennen der Füße wurden die Körper wiederum mit PBS gewaschen. Maximal 11 Körper wurden in eine 20 ml-Plastikspritze gegeben und in einen Erlenmeyerkolben ausgedrückt. Pro Körper wurden 5 ml vorgewärmte (37°C) Trypsin/EDTA-Lösung hinzugegeben, und die Lösung wurde 15 Minuten mit serumfreiem Medium bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt. Trypsinierte Zellen wurden durch eine Gaseschicht in einen Becher gegossen. Alle Zellen wurden in ein 225 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 7 Minuten bei 20°C 470 x g in einer Tischzentrifuge herunterzentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Sediment in 1 ml frischem vorgewärmtem (37°C) serumfreiem Wachstumsmedium mit 10 ng/ml EGF pro Körper durch ausgiebiges Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Das Gesamtvolumen wurde auf 150 ml mit frischem vorgewärmtem (37°C) serumfreien Wachstumsmedium mit 10 ng/ml EGF gebracht. Der Zentrifugationsschritt wurde wiederholt. Der Überstand wurde abgetrennt und das Sediment wie oben beschrieben resuspendiert. Das Gesamtvolumen wurde auf 100 ml mit frischem vorgewärmtem (37°C) serumfreien Wachstumsmedium mit 10 ng/ml EGF gebracht. Die Zellen wurden wie im folgenden Abschnitt geschrieben gezählt. Die benötigten Zellmengen wurden in Rollerflaschen mit serumfreiem Wachstumsmedium mit 10 ng/ml EGF ausgesät und bei 37°C inkubiert. Am vierten Tag nach dem Aussäen standen die Zellen für die Virusinfektion bereit.
  • Beispiel 2: Zählen der Zelldichte
  • Eine Probe der Zellsuspension (siehe Abschnitt CEF-Präparation) wurde entnommen und mit einem Volumen Trypan-Blau gemischt, was eine endgültige Zellzahl von 20 bis 100 Zellen pro 16 kleinen Quadraten eines von der Firma Fuchs-Rosenthal unter dem Namen Hemocytometer Fast Read 102 gelieferten Hämocytometers ergab (Verdünnung: 1:2 - 1:10). Die Probe wurde sofort nach dem Resuspendieren der Zellen entnommen, um eine Reaggregation/Sedimentation der Zellen zu verhindern. Nach einigen Minuten Inkubationszeit mit Trypan-Blau, so daß der Farbstoff gut in die toten Zellen eindringen konnte, wurden 10 µl der Zellsuspension in das Hämocytometer gegeben. Lediglich weiße, lebende Zellen wurden unter einem Lichtmikroskop mittels eines 10fach-Objektivs gezählt. Insgesamt wurden 3 repräsentative große Quadrate, die jeweils aus 16 kleinen Quadraten bestanden, gezählt. Dabei wurden bei jedem großen Quadrat lediglich zwei Grenzseiten in L-Form bei der Zählung miteinbezogen. Der Durchschnitt der gezählten Zellen wurde ermittelt und die endgültige Zellkonzentration unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: durchschnittliche Zellzahl x Verdünnung × 104 = Zellen/ml. Schließlich wurde die Zellsuspension in die gewünschte Arbeitskonzentration verdünnt.
  • Beispiel 3: Effekt der Zugabe eines aus Wachstumsfaktoren und Fibronectin ausgewählten Faktors zu einem serumfreien Kulturmedium bei Ausbildung eines CEF-Monolayer
  • In Vorversuchen wurde von den Erfindern gezeigt, daß CEF-Zellen nicht an die Oberfläche von Zellkulturgefäßen binden, falls Medium 199, das kein FCS enthält, verwendet wird. Zudem werden keine Monolayer gebildet. Eine normale Monolayerbildung wird beobachtet, wenn Medium 199 mit 7% FCS verwendet wird. Es wurde analysiert, ob die Anbindung und das Wachstum von CEF-Zellen in serumfreiem Medium 199 sich unter Zugabe von Zusatzstoffen zum Medium erreichen läßt.
    Die getesteten Zusatzstoffe umfassen rekombinanten epidermalen Wachstumsfaktor (Epidermal Growth Factor, r-hEGF) und Fibronectin (FN).
  • Für die Experimente wurden CEF-Zellen in Medium 199 mit den unterschiedlichen Zusatzstoffen, die entweder allein oder in Kombination vorlagen, angezogen. In Medium 199 ohne jegliche Zusatzstoffe gewachsene Zellen dienten als Negativkontrolle. In Medium 199 mit 7% FCS kultivierte Zellen dienten als Positivkontrolle. Alle Experimente wurden in 6-Loch-Zellkulturplatten mit 3 ml Medium ausgeführt. Die Zusatzstoffe wurden nach den Datenblättern der Lieferfirma behandelt, bevor sie für die Zellkultur verwendet wurden. So ließ man Fibronectin 25 Minuten vor Verwendung an die Oberfläche der Zellkulturplatten adsorbieren. Fibronectin wurde in einer Konzentration von 3 µg/cm2 und EGF in einer Konzentration von 10 ng/ml verwendet. Vor Zugabe der Zellen wurden die Zellkulturplatten 25 Minuten mit dem fibronectinhaltigen Medium in Kontakt gebracht.
  • Jedes Kulturmedium plus zu testenden Zusatzstoffen wurde in Doppelbestimmungen kultiviert. Die 6-Loch-Zellkulturplatten wurden 4 Tage bei 37°C inkubiert. Von Tag 1 bis 4 wurde das Anbinden und Wachstum der Zellen unter Verwendung eines Mikroskops bewertet.
  • Bei der Positivkontrolle wurde eine normale Anbindung und normales Wachstum der CEF-Zellen beobachtet. Bei Medium 199 ohne Zusatzstoffe ließ sich fast keine Anbindung von CEF-Zellen beobachten.
    Eine entscheidende Verbesserung bei der Ausbildung eines Monolayers wurde mit Verwendung von zu Medium 199 zugesetztem EGF im Vergleich zu Medium 199 ohne Zusatzstoffe beobachtet. Es stellte sich heraus, daß die Anbindung der Zellen unter Ausbildung der typischen Fibroblastenmorphologie erfolgte. Weiterhin ließ sich ein kontinuierliches Wachstum über den gesamten Zeitraum von 4 Tagen beobachten.
    Eine Verbesserung der Zellanbindung wurde ebenso durch Zugabe von Fibronectin zum Kulturmedium erzielt. Die Zugabe von sowohl EGT als auch Fibronectin führte im Vergleich zur Zugabe von lediglich EGF oder Fibronectin zu einer geringfügigen Verbesserung.
  • Zusammenfassend kann daraus geschlossen werden, daß die Monolayerausbildung von CEF-Zellen im serumfreien Medium 199 durch die Verwendung der Zusatzstoffe EGF und Fibronectin unterstützt werden kann.
  • Darüber hinaus wurden in parallelen Sätzen von Experimenten 1 × 107 CEF-Zellen in Medium mit 10% FCS, Medium ohne FCS und Medium ohne FCS, aber mit EGF ausgesät. Die Zellzahl wurde 2 Tage nach dem Aussäen bestimmt. Die Anzahl der Zellen ergab 42%, 6% bzw. 44% der für das Aussäen verwendeten Zellzahl. Somit waren die Ergebnisse für die in serumfreiem Medium mit EGS ausgesäten Zellen genauso gut wie die mit Medium mit FCS erzielten Ergebnisse und deutlich besser als die Ergebnisse mit Medium, das weder Serum noch EGF enthielt. Darüber hinaus wurde das Medium mit EGF mit verschiedenen serumfreien Standardmedien, wie etwa DMEM, Opti-Mem oder 293-SFM, verglichen. Hierzu wurden 1 × 107 CEF-Zellen in die verschiedenen serumfreien Medien ausgesät und 4 Tage kultiviert. Die Anzahl der im Medium mit EGF kultivierten Zellen war 24, 5 bzw. 12mal höher als die Anzahl von im serumfreien DMEM, Opti.Mem bzw. 293-SFM kultivierten Zellen.
  • Beispiel 4: Infektion von CEF-Zellen mit MVA (Referenzbeispiel)
  • CEF-Zellen wurden vier Tage nach dem Aussäen in Rollerflaschen infiziert. Zu diesem Zeitpunkt haben die Zellen einen angemessenen Monolayer gebildet. Die Zellen wurden mit einem MOI-Wert von 1 oder 0,1 MVA infiziert. Zur Infektion wurde das Wachstumsmedium aus dem Kolben genommen. Die gewünschte Virusmenge pro Rollerflasche wurde in 20 ml des entsprechenden Infektionsmediums ohne Serum verdünnt. An diesem Punkt kann das serumfreie Medium einen aus Wachstumsfaktoren und Fibronektin ausgewählten Faktor enthalten oder nicht. Die Zellen wurden mit dem Virus 1 Stunde bei 37°C und 0,3-0,5 UpM in einem Rollerflascheninkubator inkubiert. Nach 1 Stunde wurden die Rollerflaschen mit dem entsprechenden serumfreien Wachstumsmedium auf ein Gesamtvolumen von 200 ml pro Rollerflasche gefüllt. An diesem Punkt kann das serumfreie Medium einen aus Wachstumsfaktoren und Fibronectin ausgewählten Faktor enthalten oder nicht. Die Virusreplikation wurde nach 48 oder 72 Stunden durch Einfrieren der Rollerflaschen auf -20°C gestoppt.
  • Beispiel 5: Herstellung viraler Extrakte aus infizierten CEF-Zellen und Titration von MVA
  • Die gefrorenen Rollerflaschen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut. Während des Auftauvorgangs lösen sich die Zellen von der Oberfläche der Rollerflaschen ab und können mechanisch durch Schütteln der Kolben entfernt werden. Die Virus-/Zellsuspension wurde geerntet und in kleinere Volumen portioniert. Zur Freisetzung des Virus aus den infizierten Zellen wurden die Virus-/Zellsuspensionen 3mal eingefroren/aufgetaut. Die durch Einfrieren/Auftauen erhaltenen Virusproben wurden für die Titration verwendet.
  • Titrationen wurden mit der 1. Passage von CEF-Zellen in 96-Loch-Platten unter Verwendung 10 facher Verdünnungen der Virussuspension und 8 Replikaten pro Verdünnung ausgeführt. Nach der Infektion wurden infizierte Zellen mit einem Anti-Vacciniavirus-Antikörper und einer entsprechenden Färbelösung sichtbar gemacht.
    Ausführliche Beschreibung: Am Tag Null des Testverfahrens wurden primäre CEF-Zellen (siehe Abschnitt „Präparation von Hühnerembryofibroblasten (CEF)-Zellen“) trypsinisiert und wie im Abschnitt „Zählen der Zelldichte“ beschrieben gezählt. Die Zellen wurden auf 1 × 105 Zellen/ml in RPMI-Medium mit 7% FCS verdünnt. Nach diesem Verdünnungsschritt wurden jeweils 100 µl in die Vertiefungen der 96-LochPlatten mittels einer Multikanalpipette ausgesät. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die zu titrierenden Virusproben (siehe Abschnitt „Präparation viraler Extrakte aus infizierten CEF-Zellen) wurden in Verdünnungsreihen mit jeweils 10 Schritten von 10-1 - 10-12 mit RPMI ohne Serum verdünnt. Diese Verdünnungsreihe wird unter Zugabe von jeweils 900 µl RPMI in alle Vertiefungen einer Platte mit 96 tiefen Löchern durchgeführt. In alle Vertiefungen der ersten Reihe wurden jeweils 100 µl Virusprobe gegeben und gemischt. Danach wurden jeweils 100 µl einer jeden Probe in die nächste Reihe von Vertiefungen mittels einer Multikanalpipette überführt. Die Platten mit 96 tiefen Löchern wurden bei Durchführung der Verdünnungen auf Eis gehalten. Die Platten wurden 5 Tage bei 37°C und 5% CO2 inkubiert, so daß die Infektion ablaufen konnte. Nach 5 Tagen wurden die Zellen immunhistochemisch mit einem Vacciniavirus-spezifischen Antikörper angefärbt. Zur Anfärbung wurde das Kulturmedium entfernt, indem die 96-Loch-Platte über einem Auffangbehälter umgedreht wurde. Die Zellen wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 µl/Loch Methanol-/Aceton-Gemisch (1:1) fixiert. Die fixierte Lösung wurde abgetrennt und die Platten an der Luft getrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem Anti-Vacciniavirus-Antikörper (Anti-Vacciniavirus-Antikörper, polyklonal aus Kaninchen, IgG-Fraktion (Quartett, Berlin, Deutschland, #9503-2057) auf 1:1000 in PBS mit 3% FCS) inkubiert. Nach Entfernen des Antikörpers wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und 1 Stunde bei Raumtemperatur mit HRP (Horse Raddish Peroxidase [Meerrettichperoxidase])-gekoppeltem Anti-Kaninchen-Antikörper (Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, HRP-gekoppelt, polyklonal aus Ziege (Promega, Mannheim, Deutschland, # W4011) verdünnt auf 1:1000 in PBS mit 3% FCS) inkubiert. Die Zellen wurden wiederum mit PBS gewaschen und entweder mit o-Dianisidin oder TMB angefärbt. Zur Verwendung des o-Dianisidin-Färbeverfahrens wurden die Zellen mit 100 µl/Loch Färbelösung, bestehend aus 5 mg o-Dianisidin und 180 µl 30% H2O2 pro 60 ml 50 mM Phosphat-Citrat-Puffer, inkubiert. Dabei wurden die Zellen solange bei Raumtemperatur inkubiert, bis sie sich braun färbten. Infizierte Zellen waren nach 1-3 Stunden deutlich sichtbar. Bei Verwendung des TMB-Färbeverfahrens wurden die Zellen mit 30 µl/Loch 1,2 mM TMB (Seramun Diagnostica GmbH) inkubiert. Nach 15 Minuten Inkubationszeit wurde die TMB-Lösung entfernt, und die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen. Infizierte Zellen erschienen dunkelblau. Die Platten wurden hinsichtlich infizierter Zellen bewertet. Der Virustiter wurde nach der Formel von Spearman und Kaerber berechnet. Zur Berechnung des TCID50-Werts wurden die braune oder blaue Zellen zeigenden Löcher jeweils positiv markiert. Da die Testparameter konstant gehalten werden, wurde die folgende vereinfachte Formel verwendet: Virustiter   [ TCID 5 0 / ml ] = 1 0 [ a + 1 ,   5 + x a / 8 + x b / 8 + x c / 8 ]
    Figure DE000060320520T3_0001
    • a = Verdünnungsfaktor der letzten Säule, bei dem alle acht Vertiefungen positiv sind
    • Xa = Anzahl positiver Vertiefungen in Säule a+1
    • Xb = Anzahl positiver Vertiefungen in Säule a+2
    • Xc = Anzahl positiver Vertiefungen in Säule a+3
  • Beispiel 6: Optimale Aussädichte für CEF-Zellen in serumfreiem Medium und optimale Menge von MVA zur Infektion von CEF-Zellen
  • Für serumfreies CEF-Wachstum wurde eine optimale Aussäzelldichte von 7,5 × 107 Zellen/850 cm2 (Oberfläche eines Rollerkolbens) bestimmt. Die Zellen waren am Tag 4 nach dem Aussäen in der Lage, einen guten Monolayer ohne die Ausbildung großer Haufen aufzubauen und konnten zu diesem Zeitpunkt infiziert werden.
  • Es wurden Versuche durchgeführt, um das beste Niveau der Virusinokulation und die Infektionslänge für die maximale Produktion von MVA aus in einem serumfreien Verfahren kultivierten CEF-Zellen zu bestimmen. Dabei wurden CEF-Zellen mit einer Dichte von 7,5 × 107 Zellen/850 cm2 in Medium gemäß der vorliegenden Erfindung ausgesät. Am Tag 4 nach dem Aussäen wurden die Zellen mit unterschiedlichen Mengen MVA im Bereich von 0,05 bis 1,0 TCID50/Zelle MVA infiziert. Die besten Ergebnisse wurden mit 0,1 TCID50/Zelle MVA erhalten.
  • Beispiel 7: Optimaler pH-Wert von serumfreien Medium zur Kultivierung und Infektion mit MVA
  • Infektionen mit MVA und anderen Poxviren sind gegenüber einem pH-Wert unterhalb von 7,0 empfindlich. Poxviren sind bei saurem pH-Wert nicht stabil, und es wird empfohlen, daß aufgereinigte Poxviren in einer gepufferten Lösung oberhalb von pH 7,0 gelagert werden, um die Stabilität und virale Integrität bei Lagerung als flüssige Viruspräparation sicherzustellen. Es wurden Versuche durchgeführt, um den Effekt auf die Virusausbeute bei Durchführung von Infektion bei unterschiedlichen Ausgangs-pH-Werten zu bestimmen. Rollerflaschen wurden mit CEF-Zellen in üblicher Weise in serumfreiem Medium mit 10 ng/ml EGF plus 4 mM L-Glutamin beimpft und 4 Tage kultiviert. Die Zellen wurden mit MVA bei 0,1 TCID50/Zelle in serumfreiem Medium mit 10 ng/ml EGF plus L-Glutamin und 1 mM Asparagin bei unterschiedlichen pH-Werten im Bereich von 6,5 bis 9,0 infiziert. 72 Stunden nach der Infektion wurde der pH-Wert des Mediums gemessen, und die Virusausbeuten wurden durch Titrieren der Zellextrakte in üblicher Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt, wobei die Tabelle den Effekt des Ausgangs-pH-Werts des Mediums beim Start der Infektion auf die Virusausbeute zeigt.
    serumfreies Medium mit 10 ng/ml EGF
    Ausgangs-pH pH 72 h nach Infektion Titer [TCID50/ml]
    6,5 7,05 0,56 × 107
    7,0 7,34 10,0 × 107
    7,5 7,53 5,60 × 107
    8,0 7, 68 8,60 × 107
    8, 5 7,75 7,80 × 107
    9,0 8,03 0,65 × 107
  • Bei den im serumfreien Medium mit 10 ng/ml EGF, das mit L-Glutamin und Asparagin ergänzt wurde, durchgeführten Infektionen war die Virusproduktion bei einem Ausgangs-pH-Wert von 7,0 bis 8,5 relativ konstant, doch waren die Virusproduktionen bei einem Ausgangs-pH-Wert von 6,5 und 9,0 gering. Die beste Ausbeute wurde bei einem Ausgangs-pH-Wert von 7,0 erhalten. Im Handel erhältliche serumfreie Standardmedien weisen üblicherweise einen pH-Wert von 7,4 auf. Daher kann die Einstellung des pH-Werts des serumfreien Mediums auf 7,0 bei der Verbesserung der Virusausbeute helfen.
  • Beispiel 8: Effekt der Zugabe von Asparagin zum serumfreien Medium
  • In Vorversuchen wurde deutlich, daß die Menge an Asparagin während der Kultivierung von CEF-Zellen und der Infektion von CEF-Zellen mit MVA limitierend sein kann. Zur Überwindung der Verarmung der serumfreien Medien an Asparagin während des Kultivierungs- und Infektionsvorgangs wurde das Medium mit zusätzlichem Asparagin ergänzt, bevor die CEF-Zellen infiziert wurden. Zur Bestimmung der optimalen Menge an Asparagin zur Ergänzung des Mediums wurden Rollerflaschen mit CEF-Zellen (7,5 × 107 Zellen/850 cm2) in serumfreiem Medium mit 10 ng/ml EGF plus 4 mM L-Glutamin beimpft. Vier Tage nach dem Beimpfen wurden die Zellen mit MVA bei 0,1 TCID50/Zelle in serumfreiem Medium mit 10 ng/ml EGF plus 4 mM L-Glutamin, das mit unterschiedlichen Asparaginkonzentrationen (0,5, 1,0 bzw. 1,5 mM) ergänzt war, infiziert. Die Virusreplikation wurde 72 Stunden nach der Infektion gestoppt, und die Virustiter wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt, in der die Produktion von MVA aus CEF-Zellen, die mit unterschiedlichen Asparaginkonzentrationen für das Infektionsstadium ergänzt wurden, gezeigt ist. Die Titer repräsentieren die Durchschnittswerte von jeweils 3 Rollerflaschen pro Asparaginergänzung.
    Asparaginergänzung Virustiter 72 Stunden nach Infektion [TCID50/ml]
    0,0 mM 1,8 × 108
    0,5 mM 1,3 × 108
    1,0 mM 6,8 × 108
    1,5 mM 1,0 × 108
  • Die Ergebnisse zeigen, daß sich die Virusproduktion durch Ergänzen des 10 ng/ml EGF enthaltenden serumfreien Mediums mit Asparagin verbessern ließ und daß die Ergänzung auf 1 mM für den Infektionsvorgang optimal war.

Claims (17)

  1. Verfahren zur Amplifikation eines Poxvirus, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: (a) Kultivierung primärer Vogelzellen in einem serumfreien Medium; (b) Infektion der primären Vogelzellen mit dem Poxvirus; und (c) Kultivierung der infizierten Zellen in serumfreiem Medium bis zur Produktion von Poxvirusnachkommen, wobei es sich bei den primären Vogelzellen um Zellen handelt, die die produktive Replikation des Poxvirus gestatten, und wobei das serumfreie Medium der Schritte (a) bis (c) den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den primären Vogelzellen um Hühnerembryofibroblasten (Chicken Embryo Fibroblasts, CEF) handelt.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei es sich bei EGF um den rekombinanten menschlichen EGF handelt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die EGF-Konzentration im Bereich von 5 bis 20 ng/ml Medium liegt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das serumfreie Medium der Schritte (a) bis (c) ferner einen Anbindungsfaktor, bevorzugt Fibronectin, umfasst.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Fibronectinkonzentration im Bereich von 1 bis 10 µg/cm2 Zellkulturgefäßoberfläche liegt.
  7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 5, wobei das Medium mindestens zwei aus Wachstumsfaktoren und Anbindungsfaktoren ausgewählte Faktoren umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Medium EGF und Fibronectin in wie in den Ansprüchen 4 und 6 definierten Konzentrationsbereichen umfasst.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Medium ferner einen oder mehrere Zusätze, ausgewählt aus mikrobiellem Extrakt, Pflanzenextrakt und Extrakt aus einem Nichtsäuger, umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem mikrobiellen Extrakt um Hefeextrakt oder Yeastolate-Ultrafiltrat handelt.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Pflanzenextrakt um Reisextrakt oder Sojaextrakt handelt.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Extrakt aus einem Nichtsäuger um Fischextrakt handelt.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei es sich bei dem Poxvirus um ein Orthopoxvirus handelt.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem Orthopoxvirus um ein Vacciniavirus handelt.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem Vacciniavirus um Modifiziertes Vacciniavirus Ankara handelt.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei es sich bei dem Poxvirus um ein abgeschwächtes Virus oder ein rekombinantes Virus handelt.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei im Anschluss an den Schritt der Kultivierung der infizierten Zellen in serumfreiem Medium bis zur Produktion von Poxvirusnachkommen ein oder mehrere Aufreiniungsschritte durchgeführt werden.
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