MXPA04012966A - Metodo para el cultivo de celulas primarias y para la amplificacion de virus bajo condiciones libres de suero. - Google Patents

Metodo para el cultivo de celulas primarias y para la amplificacion de virus bajo condiciones libres de suero.

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Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para el cultivo de celulas primarias. Las celulas primarias se cultivan en un medio libre de suero que comprende un factor seleccionado del grupo que consiste de factores de crecimiento y factores de union. El metodo para el cultivo de celulas primarias puede ser un paso en un metodo para la amplificacion de virus, tal como virus de viruela. De acuerdo con este ultimo metodo, las celulas primarias se cultivan en un medio libre de suero que comprende un factor seleccionado del grupo que consiste de factores de crecimiento y factores de union. Las celulas entonces se infectan con el virus y las celulas infectadas se cultivan en un medio libre de suero hasta que se produce el virus de progenie.

Description

MÉTODO PARA EL CULTIVO DE CÉLULAS PRIMARIAS Y PARA LA AMPLIFICACIÓN DE VIRUS BAJO CONDICIONES LIBRES DE SUERO La presente invención se refiere a un método para el cultivo de células primarias. Las células primarias se cultivan en - un medio libre de suero que comprende un factor seleccionado del grupo que consiste de factores de crecimiento y factores de unión. El- método para el cultivo de células primarias puede ser un paso en un método para la amplificación de virus, tal como virus de viruela. De acuerdo a este último método, las células primarias se cultivan en un medio libre de suero que comprende un factor seleccionado del grupo que . consiste de factores de crecimiento y factores de unión. Las células entonces se infecta ' con, el virus y las células infectadas se cultivan en medio libre de suero hasta qüe se produce el virus de progenie .
Antecedentes del a Invención Se elabora la mayoría- de las vacunas virales tal como virus atenuados, o recombinantes a partir de sistemas de cultivo de células. Las células usadas para la producción de virus/vacunas pueden ser líneas de células, es decir, células que crecen de forma continua in vitro, ya sea como cultivo de suspensión de células única en bioreactores o como una monocapa en una -superficie de soporte de células de matraces de cultivo - de tejido o botellas cilindricas. Algunos ejemplos para las líneas de células usadas para la producció ; de virus- son: La línea de células MRC-5 de pulmón fetal humano, usadas para la elaboración de virus de pollo y la línea de células WI-38 de pulmón fetal humano usadas para la elaboración de virus de. sarampión, virus de papera y virus de rubéola (M R II) (Merk Sharp & Dohme) No' sólo se usan líneas de células sino también células primarias de animales', para la- · elaboración de vacunas. Un ejemplo de células primarias que se usan para la producción de virus son' fibroblastos de embrión .de pollo (células CEF). Estas células se- usan para ' la producción del virus de sarampión y encefalitis Japonesa (Pasteur Merieux) , virus de paperas .. (elaborado por Provaccine) , virus 'de rabia (elaborado por Chiron Berhing GmbH & Co . ) , virus de fiebre amarilla '.(elaborado por Aprilvax) ,' virus de influenza (elaborado por Wyeth Labs and SmithKline & Beecham) y virus de Vaccinia modificado Ankara (MVA) . Frecuentemente se usan células CEF puesto que se elaboran muchas vacunas de virus al atenuar el virus virulento que provoca la enfermedad- al pasar en serie en células CEF. El virus atenuado no provoca por más tiempo la enfermedad pero' es aun- capaz de estimular una potente inmunidad protectora contra la. forma virulenta del virus. Un ejemplo para este' tipo de virus es el VA. Este virus es severamente restringido en la replicación en humanos y en la mayoría ' de los animales . El MVA se está desarrollando como un vector de vacuna debido a gue se puede usar para expresar antígenos derivados de una variedad de agentes que provocan enfermedades en humanos. Los virus atenuados, tal como el MVA no / se .propagan, preferentemente, en células humanas, puesto "que hay . un interés que los virus puedan nuevamente llegar a ser competentes en la replicación en células de origen humano.. Sin embargo, los virus que han vuelto a ganar la capacidad de replicarse en células humanas pueden ser un riesgo de salud si se administran a humanos, en particular, si los individuos están inmunocomprometidos . Por esta razón, algunos . virus atenuados, tal como MVA, se elaboran estrictamente a. partir de células CEF, si se proponen para el uso en humanos. Además, se usan células· CEF- para aquellos virus que crecen sólo en estas células. - Los ejemplos para estos virus son en particular virus aviares tal como virus de viruela aviar, en particular virus de viruela canaria, ALVAC, virus de viruela de aves de corral y YVAC. Las líneas de células y las células primarias cultivadas bajo condiciones de cultivo in vitro requieren un medio especial de crecimiento y mantenimiento que ' puede soportar (I) la replicación celular en.la fase logarítmica y - (II) el mantenimiento celular una vez que las. células no se están dividiendo por más tiempo, es decir, cuando las células están en la fase estacionaria. El medio de . cultivo celular comúnmente usado comprende, una solución con alto contenido de sal que contiene vitaminas, aminoácidos, pligoelementos esenciales y azucares. Usualmente se adicionan hormonas de crecimiento, enzimas y : proteínas biológicas activas requeridas para soportar el crecimiento y mantenimiento celular, como un complemento al medio en la forma de un producto sérico derivado de sangre de animal. Los ejemplos para los productos séricos derivados de' sangre de animal son suero de. becerro fetal, suero de pollo, suero de caballo y suero porcino. Estos sueros se derivan de sangre fraccionada, de la- cual se han removido las células sanguíneas rojas y las . células sanguíneas blancas. Las células primarias, tal como las células CEF aun son más dependientes de fuentes de sueros de animales que las líneas de células o líneas celulares. De esta manera, las células primarias usualmente se cultivan en medio de cultivo de células que comprende de 5 a 10 % en suero, en la mayoría de los casos, . suero de becerro fetal (FCS) . Los sueros de animales no sólo comprenden factores que se requieren para el crecimiento de células sino también factores que se requieren para que las células crezcan naturalmente como células adherentes para unirse a la superficie de soporte celular, del recipiente de cultivo. De esta manera, es . crítico para células ad erentes que. se adicione suficiente suero al medio para permitirles crecer y formar una monocapa . Desdichadamente, el suero de becerro fetal/bovino así como los sueros de otros animales pueden contener agentes patógenos inesperados tal como virus. Hay un riesgo potencial que estos agentes patógenos se transmitan al animal/humano que se trata con la vacuna o cualquier otro producto farmacéutico producido del cultivo celular. Esto es de pertinencia particular si se administran los productos de cultivo celular a humanos inmunocomprometidos . Uno de los muchos problemas principales, potenciales, asociados con el complemento sérico, bovino -comúnmente usado, es la posibilidad de . transmitir el agente que provoca la encefalopatía - espongiforme . bovina (BSE) a los animales/humanos_ que entren en contacto con los productos producidos a partir del cultivo celular. En vista- del posible- riesgo, asociado con el uso de sueros animales en el cultivo celular, ha llegado a ser claro que son altamente deseables procesos de elaboración, libres del uso de . roductos de animales. Para este fin, se han: desarrollado medios específicos que no tienen que ser complementados con sueros de animales, - para cultivar de forma continúa líneas celulares y para la producción de virus en líneas celulares que crecen.de forma continúa, respectivamente. Un ejemplo para este medio libre de- suero que se puede usar para cultivar líneas celulares . es VP-SFM elaborado por Gibco BRL/Life Technologies. De acuerdo a la información de los fabricantes, · el VP-SFM se diseña específicamente par el cultivo de líneas de células VERO, COS-7, MDBK, Hep2 , BHK-21 y otras importantes. (Price, P. and Evege, E. Focus 1997, 19:67-69) y par la" producción de virus en estas líneas celulares. No esta disponible información con respecto al cultivo de células primarias en este medio. La patente de los Estados Unidos No. 5,503,582, describe el cultivo de células CEF en. medio que comprende 4 % de suero de becerro seguido por ¦ la infección de las células con virus de viruela de aves de corral en medio libre de suero. Spataro, A.C. et al., J. Cell. Sci . 1976; 21, 407-413 describe que las células CEF se pueden mantener en medio libre de suero durante .24 horas una vez que se ha formado una monocapa. De esta : manera, de acuerdo a ambas publicaciones, los medios que se usan para el cultivo de las células después del sembrado comprenden suero. Sólo para el mantenimiento de células que se unen ya a la superficie y que han alcanzado la fase estacionaria, se usa el medio libre de suero.' .Si el sembrado se realiza con medio convencional, tal como el medio 199 ó RPMI-1640 que carece de suero, · no se forma la monocapa y las células forman agregados no viables en el medio. La WO 98/15614 se refiere a un medio libre de suero, específico para el cultivo in vitro de células de animales. Las. células que se pueden" cultivar en el medio como se describe en la WO 98/15614 son aquellas .de origen animal, incluyendo células obtenidas a. partir de mamíferos, pájaros, insectos o peces. Las células de mamífero, pueden ser células primarias de origen humano. No se hace referencia a células primarias aviares. La patente de los Estados Unidos No. 5,405,772 describe un" medio libre de suero para la proliferación y desarrollo de células . Las células son de manera preferente células hematopoyéticas y células estromáticas de la médula ósea. No se mencionan células primarias aviares.' La WO 98/04680 describe un medio libre de suero para el cultivo de células de mamífero dependientes . de fijación, tal como las líneas de células BHK, Vero o MRC-5. La WO 98/04680 no se refiere ni a células primarias ni a células aviares . ' Objeto de la Invención Es -el objeto . de la presente invención proporcionar ¦ un método para permitir el cultivo de células primarias, en particular células aviares primarias en medio ' libre de suero, en donde el método permite (I) el cultivo o crecimiento de células durante la fase logarítmica y (II) el mantenimiento de las células en la · fase . estacionaria. Además, · si las células son adherentes/ el medio puede permitir de manera preferente (III) la unión de las células adherentes a la superficie, del recipiente de cultivo .celular. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para la producción de virus al usar células primarias bajo condiciones libres de suero.
Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un método para el cultivo de células primarias,, caracterizado en que las células se cultivan en un medio libre de suero que comprende un factor seleccionado del grupo que consiste de factores de crecimiento- y factores de unión. De acuerdo a la presente invención, células primarias que crecen . - de forma natural como células adherentes se unen a la superficie del recipiente de cultivo celular después del -sembrado y crecimiento en una fase logarítmica hasta que se forma una monocapa. De acuerdo a la presente invención, las células latentes se pueden mantener en el medio usado durante la unión y crecimiento logarítmico de las células. El método de la presente invención no se restringe a células que forman .monocapas . De acuerdo a una modalidad alternativa, el método de. acuerdo con la presente invención se puede . usar para todos los otros tipos de células primarias, tal como células que crecen de forma natural en el cultivo de suspensión (por ejemplo, linfocitos u otros tipos de células sanguíneas) o células que crecerán de forma natural como células adherentes pero que se han adaptado para crecer en el cultivo de suspensión. Como se muestra posteriormente, las células también se pueden usar para la amplificación libre de suero de los virus que pueden ser útiles como vacunas. Fue inesperado' .que las células primarias que crecen · de forma natural como células adherentes (I) puedan unirse de forma efectiva a la superficie del recipiente de cultivo celular sin formar cantidades inaceptables de agregados y (II) puedan crecer en la fase logarítmica en la ausencia de suero puesto que se creyó en general que las células primarias son dependientes de una ' multitud de diferentes factores y componentes comprendidos en el suero. Además, se creyó que las células adherentes forman agregados no viables, que no se unen a la superficie del recipiente de cultivo celular, cuando se cultivan en el medio libre de suero. De esta manera, fue inesperado que es suficiente adicionar a -un medio libre de suero un factor seleccionado del grupo que consiste' de factores de crecimiento y factores de unión a fin de obtener la unión - y crecimiento de las células primarias adherentes . Además, · también fue inesperado que las células primarias cultivadas en cultivo en suspensión se puedan cultivar con el medio usado en el método de acuerdo con la presente invención. Además, fue sorprendente que las células aviares primarias, tal como fibroblastos de embrión de pollo (CEF) se puedan cultivar para unirse a la .superficie de un recipiente -de cultivo celular sin formar cantidades inaceptables de agregados en un medio libre de suero que comprende un factor seleccionado del grupo que consiste de factores de crecimiento y factores de unión puesto que las células aviares se sabe que crecen de forma extremadamente mal en medio libre de suero que no comprende factores de crecimiento o factores de unión, es decir, fue inesperado que- se pudieran mejorar de manera significativa las pobres propiedades de crecimiento de las células aviares primarias, al adicionar un factor seleccionado de factores de crecimiento y factores de unión al medio libre de suero. El término "células primarias" como se usa en la presente descripción es bien" conocido para un experto en la técnica. Sin que se restrinja a la siguiente definición, el término "células primarias" se refiere a células que se han aislado recientemente a partir de un tejido animal o humano, órgano u organismo, en donde las células no son capaces de replicarse y. dividirse de forma continua " -e indefinida. Usualmente, las células -primarias se dividen en cultivo celular menos, de 100 .veces, frecuentemente menos de 50 veces, frecuentemente menos de 25 veces. De esta manera, las células · primarias no han sufrido un evento de inmortalización. Los ejemplos de células primarias son Ixnfocitos sanguíneos de cordón y fibroblastos humanos o de animal. Los ejemplos preferidos para fibroblastos de animal son fibroblastos aviares, de manera más preferente fibroblastos" de embrión de pollo (células CEF) . Un ejemplo preferido para fibroblastos humanos primarios es fibroblastos de prepucio humano. Son bien conocidos los métodos para la persona experta en la técnica de' cómo se pueden aislar las células primarias. En general, los cultivos, de células primarias se derivan directamente de tejidos, órganos' o embriones. Los tejidos, órganos o embriones se someten a tratamiento con. roteasa para obtener células individuales. Las células entonces se cultivan de acuerdo al método de acuerdo con la presente invención bajo condiciones de cultivo in vitro. De manera .más específica, se obtienen células CEF a partir de -embriones de pollo digeridos con proteasa. De acuerdo a la presente invención, las células CEF crecen mejor como células adherentés unidas a una superficie sólida de soporte, celular. Las células empiezan la replicación y establecen una monocapa. Si se cultivan células CEF (después de la digestión ' del embrión) in vitro con . un medio de cultivo normal sin suero de animal, las células se unirán ocasionalmente a la. superficie sólida de soporte celular, pero no se replicarán para formar una monocapa confluente de células y con el tiempo se desprenderá lentamente de la superficie sólida de, soporte de cultivo. Sn contraste, si la célula CEF se cultiva de" acuerdo ai método de la presente invención, las células se unen al soporte .sólido, crecen en la fase logarítmica hasta que se forma una monocapa y se pueden mantener en la fase estacionaria durante varios días. El término "cultivo de células" en un medio libre de suero en el contexto de las células primarias adherentes se refiere al sembrado de. las células en el recipiente de cultivo en un medio libre de - suero, al crecimiento de las células en un medio libre de suero en la fase logarítmica hasta que se forma una monocapa y/o al mantenimiento de las células en el medio libre de suero tan pronto como se forma la monocapa. De. manera más preferente, el término "cultivo de células" en un medio libre de suero se refiere a un método en el cual se realizan todos los pasos mencionados anteriormente con medio libre de suero, de modo que no están presentes productos de sueros animales durante el proceso completo de cultivo de las células. De esta manera, en un significado más general, el término "cultivo de células en medio libre de suero" se refiere al. hecho que todos los medios' que conducen a la formación de una monocapa son medios , libres de suero. Los medios usados en todos los pasos anteriores pueden comprender un factor seleccionado de factores de crecimiento y factores de unión. Sin embargo, puede ser suficiente adicionar este factor solo a los medios usados para la unión de las células y/o el crecimiento de las células bajo condiciones logarítmicas. El- término "cultivo de células" en un medio libre de suero en el contexto de células que crecen en cultivo en suspensión se refiere al sembrado de las células en el recipiente de cultivo en un medio libre de suero, el cultivo de las células en un medio libre de suero en la fase logarítmica y/o el mantenimiento de las células en el medio libre de suero tan pronto como se obtiene la densidad de saturación a la cual no se presenta replicación adicional. Además, el término "cultivo de células" en un medio libre de suero se refiere a un método en el cual se realizan todos los pasos mencionados anteriormente - con el medio libre de suero, de modo, que no están presentes productos de sueros animales durante el cultivo completo de las células. Los medios "usados en todos los · pasos anteriores - pueden comprender .de manera preferente un factor seleccionado del grupo de factores de crecimiento. Sin embargo, puede ser suficiente adicionar este factor sólo a los medios usados para el sembrado de las células y/o el cultivo de células bajo condiciones - logarítmicas. Como . se explica posteriormente en más. detalle, también puede ser posible cultivar células que normalmente no se cultivan como células" unidas o adheridas también como células de cultivo o suspensión- si ¦ se eligen las condiciones de incubación apropiadas (por ejemplo, al aplicar incubación de "onda") . El método de acuerdo con . la presente invención también aplica para este tipo- de- incubación. El término medio "libre de suero" se refiere a cualquier medio de cultivo celular que no contenga sueros de origen animal o humano. Los medios de cultivo celular adecuados se conocen por la persona experta en la técnica. Estos medios comprenden sales, vitaminas, amortiguadores, fuentes de energía, aminoácidos y otras sustancias. Un ejemplo de un medio adecuado para el cultivo libre de suero de células 'CEF es el medio 199 (Morgan, Morton y Parker; Proc . Soc . Exp. Biol . ed. 1950, 73, 1 ; ' que se puede obtener inter alia de LifeTechnologies) . Los medios- usados de acuerdo con el método de la presente invención, en particular los medios usados para células adherentes tal como células CEF contienen un factor seleccionado del grupo que consiste de factores de crecimiento y factores- de unión. Un ejemplo para un factor de unión es la fibronectina .
Para células que crecerán . de forma natural como células adherentes, que, sin embargo, se cultivan sin embargo en cultivo en suspensión (que es posible, por ejemplo, para células CEF, es particularmente preferido usar un factor seleccionado del grupo' de factores de crecimiento. Los ejemplos para factores.de crecimiento útiles para este tipo de cultivos · son factor de crecimiento bovino recombinante, de ratón, de pollo o factor de crecimiento epidérmico (EGF) humano. Más preferido es el EGF humano recombinante (rh-EGF)' (Chemicon Int., número de Catálogo: GF001) . Para células que crecen de manera '. natural en cultivo en suspensión, el medio . uede, comprender . de manera preferente un factor seleccionado del grupo de factores de crecimiento que incluyen EGF. De manera más preferente, los factores de crecimiento para . este tipo de células son factores específicos para células no adherentes. Los ejemplos para estos factores de crecimiento son interleucinas, GM-CSF, G-CSF y otros. La persona experta en la técnica puede determinar fácilmente por experimentación de rutina, que tipo de factor es adecuado para que tipo de células . Si el factor adicionado al medio libre de células es EGF, en particular . rh-EGF, se adiciona de manera preferénte al medio en una concentración de" 1 a 50 ng/ml, de manera más preferente de 5 a 20 ng/ml. Sin embargo, la persona experta en la técnica será conciente del hecho que diferentes tipos celulares pueden requerir una concentración algo diferente de EGF en el medio para resultados óptimos. Si el factor de unión adicionado al medio libre de suero es fibronectina -. (por ejemplo, Chemicon Int.; Human plasma fibronectina; número de catálogo FC010) , se adiciona de manera preferente al medio en una concentración de 1 a 50, de manera más preferente de 1 a 10 de superficie del recipiente de cultivo celular. "Sin embargo, la persona experta en la técnica estará consiente del hecho que diferentes tipos celulares pueden requerir una concentración algo diferente de fibronectina en el suero para resultados óptimos . De . acuerdo con la presente invención, es suficiente adicionar sólo un factor seleccionado de factores de crecimiento y factores de unión al medio, en particular, ¦si las células son células adherentes . Sin embargo, también es posible, adicionar dos o , más factores seleccionados de factores de - crecimiento y factores . de unión al medio. El medio puede comprender de manera preferente EGF y fibronectina, de manera preferente, en . los intervalos de concentración definidos anteriormente, en particular si las células primarias son células adherentes tal como células CEF.
El medio, puede comprender además uno o más aditivos seleccionados de extracto microbiano, extracto vegetal y extracto de un animal no mamífero. El extracto microbiano es de manera preferente extracto de levadura o un ultrafiltrado de yeastolate. El extracto vegetal, es de manera preferente extracto de arroz o extracto de Soya. El extracto del animal no mamífero es de manera preferente extracto de pescado . De · acuerdo a una modalidad preferida de la presente invención, se puede adicionar Asparagina al medio libre de suero, comercialmente disponible, al cual se ha adicionado un factor seleccionado de factores de crecimiento y factores de unión.: De manera más preferente, se adiciona asparagina al medio- que se usa durante la infección con virus (ver posteriormente) . El medio libre de suero, comercial, comprende usualmente asparagin en un intervalo de concentración de 0.3 a 1.0 mM. Las cantidades preferidas de asparagina para complementar el medio están en el intervalo de 0.5 a 1.5 mM. Más preferido es un complemento de asparagina de 1 mM. La concentración total de asparagina en- el medio es de manera preferente menos de 2 mM y de manera más preferente en un intervalo de 0.8 a 1.8 mM. En la concentración más preferida en el medio es de 1.3 mM. Además, se puede adicionar de manera preferente glutamina al medio. De manera más preferente, se adiciona glutamina al medio que se- usa durante la infección con virus (ver posteriormente) . Las cantidades preferidas de glutamina para complementar el . medio -. están en un intervalo de 1 a 5 m , de . manera más preferente un. intervalo de 2 a 4 mM. Los intervalos indicados también corresponden' a las concentraciones totales preferidas en el medio puesto que la mayoría de los medios comercialmente disponibles no contienen glutamina. De acuerdo a una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para la amplificación de un virus, que comprende los siguientes . asos : en el primer paso, se cultivan células primarias de acuerdo al método descrito anteriormente, es decir, células primarias se' cultivan en un medio libre de suero que comprende un factor seleccionado del grupo que consiste de factores de crecimiento y factores de .. unión, dependiendo del. tipo celular. Todas las condiciones, definiciones, modalidades preferidas y también el orden de modalidades preferidas a más preferidas, dado para la descripción del método para el cultivo de células primarias anteriores, también aplican para la definición del -primer paso del método para la amplificación de virus de acuerdo a esta modalidad de la presente invención. En un segundo paso, células primarias se infectan con el virus. En el tercer paso, las. células infectadas „ se incuban en medio libre de suero hasta que se produce el virus de progenie.
El término "amplificación de' un -virus" . se usa para poner en .claro que el método de . acuerdo con la presente invención se usa de manera preferente para incrementar la cantidad de virus debido a una replicación. viral productiva, del virus en las células infectadas. En otras palabras, la relación del virus de salida al virus de entrada debe estar de manera preferente por arriba de 1. De esta manera, de acuerdo a la presente invención, aquellas células primarias se eligen a un virus específico, en el cual el virus es .capaz de replicarse de forma, productiva. El' término "replicación reproductiva" se refiere . al hecho que el virus específico se replica en la célula primaria específica a un grado tal que se produce el virus infeccioso de progenie, en donde la relación del virus de salida al virus de entrada esta por arriba de 1. La persona experta en la técnica conoce, que los virus se puede replicar de forma - productiva en que tipo de células primarias. A manera de ejemplo, las células primarias pueden ser fibroblastos de prepucio humano si el virus que se va amplificar es el Citomegalovirus humano, las células primarias pueden ser células CEF y el virus que se va a amplificar es el virus de sarampión, "virus -de paperas, virus de rabia, virus de encefalitis Japonesa, virus de fiebre amarilla,, virus de influenza o virus de viruela tal como virus de vaccinia, en particular, el virus modificado de vaccinia, Ankara (MVA) . Se conocen por la - persona experta en la técnica los métodos para infectar las células primarias de acuerdo con el segundo paso de la presente modalidad. A manera de ejemplo, el. virus se puede originar de forma simple al medio. De manera alternativa, el medio se puede remover y el virus se puede adicionar al medio fresco, que a su vez se adiciona a ' las células. Para obtener una infección eficiente, la cantidad de la suspensión del medio/virus debe ser tan baja como sea posible para tener una alta concentración del virus. Después se puede adicionar la unión del medio adicional del virus. En el tercer paso,' las células se inoculan en medio, libre de suero hasta que se produce el virus de progenie. - El medio libre de suero que se usa en el segundo y tercer páso del " método para la amplificación de un virus puede ser el mismo medio que se ha usado ya antes, es decir, un medio libre de suero que comprende un factor seleccionado de factores de crecimiento y factores de unión, dependiendo del tipo celular. Sin embargo, para ahorrar costo también se posible usar en uno ' o ambos del segundo " y tercer paso, un medio libre de suero que no contenga un factor seleccionado de factor de crecimiento y factores de unión-. Durante todas las etapas", el medio se puede complementar con asparagina y/o glutamina como se resume anteriormente, en donde la concentración total de asparagina en el medio es de manera preferente como se define de manera anterior. El virus de progenie se puede concentrar y purificar de acuerdo a métodos conocidos por la persona experta en la técnica. De acuerdo a una- modalidad preferida, el método para la amplificación de virus se usa para la amplificación de virus de viruela-. De esta manera, de '. acuerdo a esta modalidad preferida, la ¦ invención se refiere a un método para la amplificación de un virus de viruela que comprende los siguientes pasos: (I) cultivo de células primarias de acuerdo a un método como se describe , anteriormente, es decir, un método en el cual se cultivan las células primarias en medio libre de suero que comprende un factor seleccionado del grupo que consiste de factores de crecimiento y factores de' unión, dependiendo del tipo celular, (II) infección de. las células primarias con el virus de viruela y, (III) cultivo de las células infectadas en medio libre de suero hasta que se produzca el virus de progenie. Fue inesperado que se puedan amplificar virus de viruela en células cultivadas', bajo condiciones libres de suero puesto' que las células crecen muy malamente con el medio libre de suero, conocido. De esta manera, se esperó que la tensió adicional adicionada con una infección de virus de viruela aniquilara las células ya tensadas antes/de que se presentara una ; amplificación significativa del virus de viruela. · El virus ..de. viruela es de manera preferente un ortovirus de "viruela. Los ejemplos de ortovirus de viruela son virus de viruela , aviar y virus de vaccinia. El término "virus de viruela aviar" se refiere a cualquier virus, de viruela aviar, tal como virus de viruela de aves de corral, virus ' de viruela de canario, uncovirus de viruela Mynahvirus de viruela, virus de viruela de' paloma, virus de viruela de Psittacidos, virus de viruela- de codorniz, virus de viruela de pavorreal, virus de viruela de pingüino, virus de viruela de gorrión, virus de viruela de estornino y virus de viruela de pavo . Los virus de viruela aviar preferidos son virus de viruela de canario y virus de viruela de aves de corral. Un ejemplo de un virus de viruela de canario es la cepa Rentschler. Se depósito una cepa de viruela de canario purificada en placa llamada ALVAC (US 5,766,598) bajo los términos del tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivo de Especies (ATCC) , número de acceso VR-2547. Otra cepa de viruela de canario es la cepa de vacuna comercial de viruela de canario designada LF2 CEP 524 24 10 75, disponible de Institute Merieux, Inc. Los ejemplos de un. virus de viruela de ave de corral son las cepas FP-1, FP-5 y. TROVAC (US 5,766,598). La FP-1 es una cepa Duvette modificada, para ser usada como una vacuna en pollos de un' día. La cepa es una cepa comercial de vacuna de virus de viruela de aves de corral 'designada O DCEP 25/CEP67/2309 Octubre de 1980 y esta disponible de Institute Merieux, Inc. La FP-5 es- una cepa comercial de vacuna del virus de viruela de aves de corral de origen de embrión de pollo disponible de American Scientific Laboratorios (División of Schering Corp.) Madison, Wisconsin, United States Veterinary Licencia No. 165, No. de Serie 30321. Los ejemplos para cepas de virus de vaccinia son las cepas Temple of Heaven, Copenhagen, , Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, . Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM; B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health, Elstree, Ikeda and WR. La invención se lleva acabo de manera preferente con el virus modificado de vaccinia Ankara (MVA) (Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12: 1032-40) . Una cepa de MVA típica es la MVA 575 que se ha depositado en la . Colección Europea de Cultivo de Células Animales .bajo el número de depósito ECACC V00120707. Más preferido es MVA-BN o un derivado del mismo, que se ha descrito en la solicitud PCT PCT/EPOl/13628 presentada . en la Oficina Europea de Patentes., el 22 de Noviembre de 2001, titulada "Variante Modificada de Virus de Vaccinia Ankara". La MVA-BN se. -ha depositado .en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales con el número de depósito ECACC V00083008. Las características de MVA-BN, la descripción de ensayos biológicos que permiten evaluar si el MVA es MVA-BN o un derivado del mismo y los métodos qüe permiten obtener MVA-B o un derivado del mismo se describen en la solicitud PCT referida anteriormente que se incorpora en' la presente como referencia. El virus, que-' se va a amplificar de acuerdo con el método de la presente invención puede ser un virus tipo silvestre, ^un virus atenuado .o un virus recombinante . El término "virus recombinante" se refiere a cualquier virus que tenga insertado en el genoraa viral un gen heterólogo que no sea parte de form natural del genoma viral. Un ge heterólogo puede ser un gen terapéutico, un gen que codifique para un péptido que comprende al menos un epitope para inducir una respuesta inmunitaria, un cartucho de- expresión antisentido o un . gen de ribozima. Los métodos para construir los virus recombinantes se conocen por una persona experta en la técnica. El' vector de" virus de viruela más preferido es el MVA, en particular MVA 575 y MVA-BN (ver anteriormente) . Un- "virus atenuado" es un virus que se- origina de un virus patógeno pero que en la 'infección del organismo hospedador conduce a, una menor mortalidad y/o morbididad en comparación al virus de origen, no atenuado. Los ejemplos de virus de viruela .atenuados se conocen por la persona experta en la, técnica. Un" ejemplo para un virus de Vaccinia atenuado es la cepa MVA, en particular la cepa que se ha depositado en ECACC con el número de depósito V00083008 (ver anteriormente) . Como se señala anteriormente, para los virus de viruela, las células primarias . pueden; ser de manera preferente células aviares primarias tal' como células CEP o fibroblastos primarios de embrión de pato. Nuevamente, la persona experta en la técnica esta concienté de cuales células primarias son adecuadas para la amplificación de que virus de viruela. Las células CEF son particularmente preferidas para la amplificación de MVA. Para la amplificación de MVA en células . CEF es una modalidad preferida seleccionar uno o dos de los factores seleccionados de EGF y fibronectina.-\ Si el método de acuerdo con la presente invención se usa para la. amplificación de MVA en células CEF, se prefiere que el - pH inicie del medio este en un intervalo de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 8.5. Particularmente preferido es un pH de inicio de 7.0. La invención se refiere además . a virus, en particular virus de viruela obtenidos por el método descrito anteriormente. De. acuerdo a una modalidad preferida, el virus de viruela ' es un "virus- de vaccinia, de manera más preferente una cepa de MVA- tal como MVA-BN. La invención se refiere adicionalmente a una composición que comprende un virus, en particular un virus de viruela producido por el método de acuerdo con la presente invención. Como.se señala anteriormente, el virus de viruela es de manera preferente un virus de vaccinia, de manera más preferente una cepa MVA tal como MVA-BN. Debido al método para la amplificación del virus, la composición esta libre de cualquier producto y/o agente infeccioso comprendido en los sueros de animales. En contraste, las composiciones que comprenden virus , producidos de acuerdo a - métodos convencionales comprenden compuestos residuales derivados del suero de animal . Esto es especialmente el caso para composiciones que comprenden virus -de viruela tal como cepas de virus de vaccinia. La .invención se refiere adicionalmente a un virus, en particular a los virus como se define anteriormente como un medicamento o vacuna. Si el virus es un virus tipo silvestre o un virus atenuado, el virus se puede usar para la vacunación contra el virus como tal. Para este propósito, son particularmente preferidos los virus., atenuados. Si el virus es. un virus recombinante que expresa proteínas expresadas de genes heterólogos al genoma viral, es posible vacunar contra el virus' como tal y/o contra la proteína heteróloga expresada. Si el ' virus recombinante expresa un gen terapéutico tal como un ARN antisent'ido o una ribozima, el virus se puede usar como un" medicamento. La- invención se refiere adicionalmente al uso de un virus como se define anteriormente o una composición como se define anteriormente para la elaboración de una vacuna. La invención- se refiere adicionalmente a un método para el tratamiento o vacunación de un animal, incluyendo un humano, en necesidad del mismo, que comprende la administración de un : virus como se define anteriormente o una composición como se define anteriormente al animal o cuerpo humano.
Ej emplos Si no -se indica- de otro modo en los siguientes ejemplos, el medio libre de. suero es medio 199 (Life Technologies) . - El EGF adicionado es usualmente EGF humano recombinante obtenido de Chemicon. La fibronectina (FN) se obtiene de Chemicon.
Ejemplo 1: Preparación de células de fibroblasto de Embrión de Pollo (CEF) Se', almacenaron' huevos fertilizados libres de •patógeno específico . (SPF) por.no más de .12 días a 4°C. Los huevos se pusieron en una incubadora y se incubaron durante 10-12 días a 37.8°C ± 8°C. Se ' reparó una caja de Petri por máximo 11 huevos con 10-20 mi de PBS . Los huevos se pusieron en una caja dedicada de huevos y se trataron extensivamente con Bacillol para esterilizar el exterior de la cascara de huevo. Después del secado, se hizo un agujero en los huevos y. la cáscara se removió cuidadosamente. Se separó la membrana corioalantoica. Los embriones se levantaron por las patas y se cortaron sus cabezas. Los embriones entonces se transfirieron a las cajas de Petri preparadas. Después de remover las patas, los troncos se lavaron nuevamente con PBS. Se pusieron' un máximo de 11 troncos en una jeringa de ¦ plástico de 20 mi y se apretaron en un matraz Erlenmeyer. Se adicionaron 5 mi de solución de Tripsina/EDTA pre-calentada (37°C) por tronco y la solución se agitó durante 15 minutos con un medio libre de suero a temperatura' ambiente usando un agitador magnético. Las células tripsinadas se vertieron a través de una capa de malla en un vaso de precipitados.
Todas las células se transfirieron a un tubo de centrífuga de 225 mi y se centrifugaron a 20°C, 470xg durante 7 minutos en una centrífuga superior de banco. Después de descartar el sobrenadante, el sedimento se re-dispersó en 1 mi de medio de crecimiento, libre de suero, pre-calentado (37°C) , fresco, que comprende 10 .ng/ml de EGF por tronco al pipetear hacia y hacia abajo completamente. El medio de crecimiento, libre de suero, pre-caléntado (37°C) , fresco, que comprende 10 ng/ml de EGF se adicionó a un volumen total de" 150 mi. Se repitió el paso de centrifugación. Un sobrenadante se removió y el sedimento se. re-dispersó como se describe anteriormente. El medio de crecimiento, libre de suero, pre-calentado (37°C) , fresco, que comprende 10 ng/ml de EGF se adicionó a un volumen total de' 100 mi . Las células se contaron como se describe en la siguiente sección. Las cuentas requeridas de células se sembraron en botellas cilindricas con medio de crecimiento libre de suero que-comprende 10 ng/ml de EGF y se incubaron a 370G . Las células estuvieron listas para la infección con virus- en el día cuatro después del sembrado.
Ej emplo 2 : Cuenta de Densidad "Celular · Una muestra de la suspensión celular (ver sección preparación de CEF) se tomó y se mezcló con un volumen de azul de Trypan, dando por resultado una cuenta celular final de 20 a 100 células por 16 cuadrados pequeños de un hemocitómetro ¦ suministrado por Fuchs-Rosenthal bajo el nombre de Homocytometer Fast Read 102 (dilución 1:2 - 1:10) . La muestra se . tomó inmediatamente después de la redispersión de- las células a fin de impedir la ¦ re-agregación/sedimentación de las. células. Después de unos pocos minutos, del tiempo de incubación con azul de Trypan a fin de obtener el tinte apropiadamente en células muertas, se adicionaron 10 . µ? de la suspensión celular al hemocitómetro . Sólo las células vivas, blancas, se contaron bajo un microscopio de luz usando un' objetivo de lOx. En total, se contaron 3 cuadrados, grandes representativos que consisten de pequeños de.- 3x16. De cada cuadrado grande sólo dos bordes . en forma de L se incluyeron en el conteo . El promedio de las células contadas se tomó y se calculó la concentración final de las células usando la siguiente fórmula: ¦ Número celular promedio x dilución x 104 células/ml . Finalmente, la suspensión celular se diluyó a la concentración deseada de trabajo.
Ej emplo 3 : . Efecto de la adición de un factor seleccionado de factores de crecimiento y fibronectina a un medio de cultivo libre de suero en la formación de una monocapa de CEF. En experimentos preliminares, los -inventores han mostrado que las células CEF no se unen a la superficie de los recipientes de cultivo celular si se- usa el medio 199 que no comprende FCS. Además, no se formaron monocapas . Se observa la formación normal de la monocapa si se usa el medio' 199 que contiene FCS al-.7 %. Se analizó si se puede lograr la unión- y crecimiento de células CEF en medio libre 199 libre de suero, si se adicionan aditivos al medio. Los . aditivos probados comprenden Factor de Crecimiento. Epidérmico recombinante (f-hEGP)- y Fibronectina (F ) . Para los experimentos, las células CEF se cultivaron en el medio 199 con los diferentes aditivos solos o' en combinación. Las células cultivadas en el medio 199 sin ningún aditivo sirvieron como control negativo. Las células cultivadas en el medio 199 que comprende FCS al 7 % sirvieron como control positivo. Todos los experimentos se llevaron a cabo en placas de cultivo celular de 6 cavidades con 3 mi de medio. Los aditivos se trataron de acuerdo a las hojas de datos del proveedor después de que. se usan para el cultivo celular. Se permitió que la fibronectina se absorbiera en la superficie de las placas de cultivo celular durante 25 minutos antes del uso. Se usó fibronectina en una concentración de 3 µg/cm2 y 'se. usó EGF en una concentración de 10 ng/ml . Antes de adicionar cualquier célula, las placas de cultivo celular se pusieron en contacto con el medio que contiene fibronectina durante 25 minutos. Cada medio de, cultivo más los aditivos que se van a probar se cultivó en duplicado. Las placas de cultivo celular de 6 cavidades se incubaron durante 4 días a 37°C. Desde el día 1 al 4,, se evaluó la unión y crecimiento de las células usando microscopio. Para el control -positivo, se ha observado una unión y crecimiento normal de las células CEF. Para el medio 199 sin aditivos no se puede observar casi unión de las células CEF. Una mejora crucial en la formación de una monocapa se dio por el uso de EGF adicionado al Medio 199 en comparación al medio 199 sin aditivos. Se encontró que las células se unieron y formaron la morfología típica de los fibroblastos. Además, se puede observar un crecimiento continúo durante el periodo completo de 4 días . ' . También se logró una .mejora de la unión celular al adicionar fibronectina al medio de cultivo. La adición de ambos, EGF y Fibronectina, . dio por resultado una ligera mejora en comparación- a la adición de EGF solo y fibronectina sola. ' En resumen, se ha concluido que se puede soportar la formación de la monocapa de - células CEF en el medio 199 libre de' suero - mediante el uso de los aditivos, EGF y fibronectina. Además, en conjuntos paralelos de experimentos se sembraron 1 x.107 células CEF en medio que comprende FCS al 10 %, medio que no comprende FCS y medio que no comprende FCS pero comprende EGF. El número celular se contó dos días después del sembrado.- El número de células dio una cuenta de 42 %, 6 % y 44 %, respectivamente, del número celular usado para- el sembrado.. De esta manera, los resultados para las células sembradas en medio libre de suero que comprende EGS fueron tan buenos como los resultados obtenidos con medio que comprende FCS y significativamente mejores que con el medio que no contiene ni suero ni EGF. Además, el medio que comprende FCS se comparó a varios medios formales libres de suero, tal como DMEM, Opti-Mem ó 293-SFM. Para este fin, se sembraron 1 x 107 células CEF en varios medios libres de' suero y se cultivaron durante 4 días . El número de células cultivadas en el medio que comprende EGF fue de 24, 5 y 12 veces mayor que el número de células cultivadas en DME libre de suero Opti.Mem y 293-SFM, respectivamente.
E emplo 4 : Infección de células CEF con VA Las células CEF se infectaron cuatro días después del sembrado en botellas cilindricas. En ese punto de tiempo, las células lian crecido a una.monocapa adecuada. Las células se infectaron con un MOI de 1 ó 0.1 MVA. Para la infección, el medio de crecimiento se removió de los matraces. La cantidad deseada de virus por botella cilindrica se diluyó en 20 mi del medio de infección apropiado sin suero. En esta etapa, el medio libre de suero puede comprender., o no, un factor .seleccionado de factores de crecimiento y fibronectina . Las células se incubaron con el virus durante 1 hora a,37°C a 0.3-0.5 rpm en un incubador de botellas ' cilindricas . Después de 1 hora, las botellas cilindricas se rellenaron con el medio de crecimiento, libre de suero, apropiado, a un volumen total de 200 mi por botella cilindrica. En esta etapa, el medio libre de suero puede comprender, o no, un factor seleccionado de factores de crecimiento y fibronectina . Se detuvo la replicación del. virus después, de 48 ó 72 horas al congelar las botellas cilindricas a -20°C.
Ejemplo 5: Preparación de Extractos Virales a partir de Células CEF infectadas^ y Titulación de MVA. Las botellas. cilindricas congeladas se descongelaron a temperatura ambiente. Durante el proceso de descongelación, las células se desprendieron de la superficie de las botellas cilindricas y se puede' remover mecánicamente al agitar los matraces. Se recolectó la suspensión de virus/célula y se hicieron alícuotas a volúmenes pequeños. Para liberar el virus de. las células infectadas, se congelaron/descongelaron las suspensiones de virus/célula tres veces. Las muestras de virus congeladas/descongeladas se usaron para la "titulación . Las tltulaciones. se realizaron . en células CEF de Ia pasada, en placas de 96 cavidades, usando diluciones de 10 veces de la suspensión viral y 8 replicas por dilución. Después de la infección, . las células infectadas se visualizaron con. el anticuerpo anti-virus de vaccinia y una solución de tinción apropiada. En detalle, en el día cero del ensayo, se tripsaron células CEF primarias (ver sección "preparación de Células de Fibroblastos de Embrión de Pollo (CEF)") se contaron como se describe en la- sección "conteo de densidad celular". Las células se diluyeron a 1 x 105 células/ml en medio RPMI con FCS al 7 %. Después de esta dilución, se sembraron 100. µ? en cada cavidad de las placas de 96 cavidades usando una pipeta de multicanal . Las células se incubaron durante la noche a '37°C y C02 al 5 % . Las muestras de virus que se van a titular (ver sección "preparación de extractos virales a partir de células CEF infectadas) se diluyero en serie en pasos de 10 veces desde 10"1 - 10"12 usando RPMI si suero. Esta dilución en serie se lleva a cabo al adicionar 96 µ? de RPMI a todas las cavidades de una placa de 96 cavidades profundas. Se adicionaron 100 µ? de muestra de virus a todas las ' cavidades de la primera fila y se mezclaron. Posteriormente, 100 µ? de cada muestra se transfirieron a la siguiente fila de cavidades usando una pipeta de . multicanal . Las placas de, 96 cavidades, profundas se mantuvieron en hielo cuando se realizaban diluciones. Las placas se incubaron durante 5 días, a 37 °C y C02 al 5 % para permitir que prosiga la infección. Después de 5 dias, las células se , tiñeron inmunohistoquímicamente con anticuerpo específico de virus de vaccinia.' Para la tinción, el medio de cultivo se removió al voltear . hacia abajo la placa de 96 cavidades sobre u receptáculo. Las células se fijaron con 100 µ?/cavidad de una mezcla de metanol/acetona (1:1) durante 10 minutos temperatura ambiente. La solución de fijación se removió y las placas se secaron con aire. Después del secado, las células se lavaron una vez con PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo anti-virus de vaccinia (Anticuerpo anti-virus de vaccinia, policlonal de conejo, fracción de IgG (Quartet, Berlín, Alemania #9503-2057) diluido a 1:100 en PBS con FCS al 3 %. Después de la remoción del anticuerpo, la células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo anti-conejo acoplado con HRP (par de Peroxidasa de' Rábano) (Anticuerpo Anti-IgG de Conejo, policlonal de cabra acoplado con HRP (Promega, Manheim, Alemania #W4011) diluido a 1:1000 en PBS con FCS al 3 %. Nuevamente, las células se lavaron con PBS y se tiñeron ya sea con o-Dianisidina o TMB. Para usar el método de tensión con o-Dianisidina, las células se incubaron con 100 µ?/cavidad de solución de tensión que consiste .de 5 .mg de o-Dianisidina ,y -180- µ? de H202 al 30 '% por 60 mi de amortiguador de fosfato-citrato 50 mM. Las- células se incubaron a temperatura ambiente .hasta que se tiñeron café. Las células infectadas fueron claramente visibles después de 1-3 horas;. Usando el método de tinción con TMB, las células se incubaron con 30. µ?/cavidad de TMB 1.2 ,mM (Seramun Diagnostica GMBH) . Después de 15 minutos de tiempo de incubación, la solució de TMB se removió y las células se elevaron una vez con PBS . Las células infectadas aparecieron azul . oscuro. Las "placas se clasificaron para células infectadas.' El título viral se calculó usando la fórmula de Spearman y Kaerber.. Para el cálculo de la TCID50, cada cavidad que muestra células cafés o azules se marcó positiva. Debido a que los parámetros de ensayo se mantienen constantes, se usó la siguiente fórmula simplificada: Titulo de virus ¦ [TCIDso/ml] =10 ta+1'5+xa/8+xb/8+xc/8] a = factor de dilución de última columna, en la cual las ocho cavidades son positivas xa = número de cavidades positivas en columna a+1 ¾> = número de cavidades positivas en columna a+2 xc = número de cavidades positivas. en columna a+3 Ejemplo 6: Densidad óptima de sembrado para células CEF en medio libre ..de suero y cantidad óptima de MVA para infección de "células CEF.
Una densidad óptima de sembrado de células de 7.5 x 107 células/850 c 2 (superficie de un matraz cilindrico) se determin para el crecimiento de CEF libre de suero. Las células fueron capaces, de acumularse a- una buena monocapa sin formar grandes aglomeraciones en el día cuatro después del sembrado y se pueden infectar en este punto de tiempo. Se llevaron a cabo experimentos para determinar el mejor nivel de inoculació viral y la duración de la infección para la máxima producción de MVA a partir de células CEF cultivadas en un proceso libre de suero. Se sembraron .células CEF a una densidad de . '7.5 x 107 células/850 cm2 en medio' de acuerdo a la presente invención. En el día cuatro después del' sembrado, las células se infectaron con diferentes cantidades de MVA en el intervalo de 0.05 a 1.0 TCID50/célula de MVA. Los mejores resultados se obtuvieron con 0.1 TClD50/célula de MVA.
Ejemplo 7: pH óptimo de medio libre de suero para cultivo de infección con MVA. El MVA y otras infecciones el virus de viruela son sensibles a pH por abajo de 7.0. Los virus de viruela no son estables a pH' ácido y se recomienda Jque se almacenen los virus de .viruela purificados en -una solución amortiguada por arriba de pH 7.0 para asegurar la estabilidad e integridad viral en . el almacenamiento como una preparación viral líquida. Se llevaron a cabo experimentos para determinar el efecto en la producción de virus cuando se lleva a cabo la infección a diferentes pH de inicio. Se sembraron botellas cilindricas con células CEF de la manera usual en el medio libre de suero que comprende 10 ng/ml de EGF más L-Glutamina 4 mM se cultivaron durante cuatro días. Las células se infectaron con MVA a 0.1 TCID50/célula en medio libre de suero que comprende 10 ng/ml de EGF más L-Glutamina y Asparagina 1 mM a diferentes pH que varían desde 6.5 a 9.0. A las 72 horas después de la infección, el pH del medio se midió y se determinaron los rendimientos virales por tritulación de los extractos celulares de la manera usual . Los resultados ' que' se presentan en la siguiente tabla, demuestra el efecto del pH inicial del medio al inicio de la infección en el rendimiento del virus .
Medio libre de suero que comprende 10 ng/ml de EGF pH de inicio pH a 72 h p.i. [Titulo TCID50/ML] 6.5 7.05 0.56 x 107 7.0 7.3 10.0 x 107 7.5 7.53 5.60 X 107 8.0 7.63 8.60 X 107 8.5 7.75 7.80 X 107 9.0 8.03 0.65 x 107 Para las infecciones llevadas a cabo en medio libre de suero se comprende 10 ng/ml de EGF complementado con L-Glutamina y Asparagina, la producción viral fue relativamente constante con ,un pH de inicio · de 7.0 a 8.5, pero las producciones virales fueron bajas al pH de inicio de 6.5 y 9.0/ Se obtiene el mejor rendimiento a un pH - de inicio de 7.0. Los medios libres de suero, normales, comercialmente-. disponibles . tienen · usualmente un pH de 7.4. Por lo tanto, . el ajuste del pH del medio libre de suero a 7.0 puede ayudar a mejorar el rendimiento del vi us.
Ej emplo 8 : Efecto de Asparagina adicionada al medio libre de suero . . Los experimentos preliminares han revelado que la cantidad de Asparagina puede ser limitante durante el cultivo de células CEF y la infección de células CEF con MVA. Para superar el - agotamiento de -Asparagina en los medios libres de suero durante cultivo . y el proceso de infección, se adicionó - Asparagina adicional al medio como un complemento antes de inyectar las células CEF. Para determinar la . cantidad óptima de Asparagina para complementar el medio, botellas cilindricas se sembraron con células CEF (7.5 x 107 células/850 era2) "en medio libre de suero que comprende 10 ng/ml de EGF más L-Glutamina a 4 mM. Cuatro días después del sembrado, las células se infectaron con MVA a 0.1 TCIDS0/célula' en medio -libre de suero que comprende 10' ng/ml de EGF más L-Glutamina 4 mM complementada con diferentes concentraciones de Asparagina (0.5, 1.0 y 1.5 mM) . La replicación viral se detuvo" a 72 horas después de la infección y se - determinaron los títulos virales. Los resultados se muestran en la siguiente tabla que muestra la producción - de MVA a partir de células CEF complementadas con diferentes niveles de Asparagina para la etapa de infección. Los títulos representan los promedios de tres botellas cilindricas por complementación con Asparagina.
Los resultados demuestran que la complementación del medio libre de suero ' que comprende 10 ng/ml de EGF, del medio con Asparagina puede mejorar la producció ' viral y que fue óptima la complementación a 1 mM para el proceso de infección.

Claims (13)

  1. - ; REIVINDICACIONES 1- Método... para la amplificación de un virus, que comprende los siguientes pasos: - cultivo de células aviares primarias en un medio libre de suero que comprende un factor seleccionado del grupo que consiste de factores de crecimiento , y factores de · unión; - infección de células aviares primarias con el virus; - cultivo de las células infectadas en el medio libre de suero hasta que se produzca el virus de progenie; en donde las células aviares primarias son células que . permiten la . replicación productiva del virus .
  2. 2. Un método según la reivindicación 1, en donde las células áviares primarias son fibroblastos de embrión de pollo (CEP) . .
  3. 3. El método según ' cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 , en donde el factor de crecimiento es un factor de crecimiento epidérmico (EGF) en particular EGF humano, recombinante.
  4. 4. El' método según la reivindicación 3, en donde la concentración de EGF esta en un intervalo de 5 a 20 ng/ml del medio .
  5. 5. El ' método - según cualquiera de las reivindicaciones l a 4, en donde el' factor de unión es fibronectina .
  6. 6. El método según la reivindicación 5 , en donde la concentración de fibronectina está en el intervalo de 1 a 10 )iq/cm2 de superficie del recipiente de cultivo celular.
  7. 7. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el medio comprende dos o más factores seleccionados de factores de crecimiento y factores de unión.
  8. 8. El método según la reivindicación 7, en donde el medio comprende EGF y fibronectina en intervalos de concentración como se define en las reivindicaciones 4 a S.
  9. 9. Un método' según cualquiera de las reivindicaciones 1 a " 8, en donde el . medio comprende además uno o más aditivos seleccionados de extracto microbiano, extractos vegetales y extracto de un animal no mamífero.
  10. 10. El método según la reivindicación 9, en donde el extracto microbiano es extracto de levadura o ultrafiltxado de yeastolato.
  11. 11. El método según la reivindicación 9, en donde el extracto vegetal es extracto de arroz o extracto de soya.'
  12. 12. El método según .la reivindicación 9, en donde el extracto de animal no mamífero es extracto de pescado.
  13. 13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el virus se selecciona de virus de paperas, virus de sarampión, virus de rabia, virus de encefalitis j aponesa,- virus' de fiebre amarilla r virus de ^influenza y virus de viruela. 14: Un método- según la reivindicación 13, en donde el virus de viruela" en un ortovirus de viruela. 15. El método según la reivindicación 14, en donde el . ortovirus de viruela es un virus de vaccinia. 16. 'El método, según la reivindicación 15, en donde el virus de vaccinia es virus Ankara modificado de vaccinia. 17. ..· El método según- cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el virus de viruela es un virus atenuado o un virus recombi ante . · 18. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 , en donde el medio libre de suero en uno o ambos de los pasos de: - infección de células aviares primarias con el virus; y - cultivo de las células infectadas en medio libre de suero hasta que se produzca la progenie; carece de los factores seleccionados de factores de crecimiento y factores de unión. 19. El método segú cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde subsiguiente al paso de cultivo de las células infectadas en medio libre de suero, hasta que se produzca el virus de progenie se hacen uno o más pasos de purificación. 20. Composición que comprende - un virus de viruela producido por un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones l a 19. 21. La composición según la reivindicación 20, que está libre de cualquier producto y/o. agente infeccioso comprendido en los sueros de animal. 22. Composición según cualquiera de las reivindicaciones' 20- a 21 como un medicamento o vacuna. , 23. Uso de una composición' de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21 para, la elaboración de una vacuna . 24. Método para el tratamiento o- acunación de un animal, que incluye un humano, necesidad del mismo, que comprende la administración de una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21 al animal humano.
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