CN105462911B - 用于培养病毒的无血清培养液及其制备方法 - Google Patents

用于培养病毒的无血清培养液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于培养病毒的无血清培养液，包括DMEM培养基，其还包括：胰岛素5~45mg/L、牛血清白蛋白0.5~3mg/mL、微量元素0.1~2mg/L、酵母提取物0.2~3g/L、氨基酸溶液2~5 mg/L、纤连蛋白0.2~1.5mg/mL、辅酶R 0.01~0.15mg/L、烟酸0.5~2mg/L和维生素C 0.5~2 mg/L。本发明的用于培养病毒的无血清培养液，制备方法简单，降低了疫苗生产成本，易于操作，此外采用本发明无血清培养液培养得到的病毒具有效价高，质量好的优点。

Description

用于培养病毒的无血清培养液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种培养液及其制备方法，具体涉及用于培养病毒的无血清培养液及其制备方法。
背景技术
1996 年以来，哺乳动物细胞培养已经发展到能够自由扩大培养并且用于工业化生产。许多生物活性物质、疫苗、载体, 如单克隆抗体、药用蛋白质、高职病性蓝耳病疫等，都可以通过动物细胞大规模培养获得。通过细胞培养生产生物制品既能提高生物制品的质量, 又能促进细胞培养技术、蛋白质表达纯化技术、病毒培养技术等的发展。
目前，兽用疫苗很多都需要通过细胞培养来进行生产，在生产过程需要使用血清。血清培养存在成分不明确；保存期短；取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性；制作过程复杂、批间差异大，成分不能保持一致，使用使得实验和生产的标准化困难；质量不稳定，价格昂贵，进出口管制影响盈利.，使用不方便等缺点。而无血清培养可以消除来自血清的不均一性；降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害；提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响；供应充足、稳定 。因此从当前发趋势来看无血清培养，是近年世界范围内各大生物公司产业化生产的发展方向。
中国专利申请201410467191.2公开了无血清培养基及其用途和一种猪瘟病毒的培养方法，无血清培养基，所述无血清培养基为pH 为7.0~7.5 的水溶液，其组分如下：MEM基础培养基；丙酮酸钠；大豆蛋白水解物；胆固醇；碱性成纤维细胞生长因子；抑制素B；胰岛素；L- 丙氨酸；L- 缬氨酸；L- 亮氨酸；L- 异亮氨酸；L- 甲硫氨酸；L- 脯氨酸；L- 苯丙氨酸；L- 色氨酸；L- 甘氨酸；L- 丝氨酸；L- 苏氨酸；L- 半胱氨酸；L- 天冬酰胺；L- 谷氨酰胺；L- 酪氨酸；L- 天冬氨酸；L- 谷氨酸；L- 赖氨酸；L- 精氨酸；L- 组氨酸；羟脯氨酸；豆蔻酸；棕榈酸；棕榈油酸；硬脂酸；精胺；亚精胺；还原型谷胱甘肽；乙醇胺；β- 巯基乙醇；甘油；生物素；吡哆醇；抗坏血酸；维生素B-12；次黄嘌呤；胸苷；NaHCO3 ；FeSO47H2O；ZnSO4；Na2SeO3；柠檬酸铁。该培养基成分复杂，不利于制备，生产成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产成本低，易于制备的用于培养病毒的培养液及其制备方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：用于培养病毒的无血清培养液，包括DMEM培养基，还包括如下组分及其浓度：胰岛素5 ~ 45mg/L、牛血清白蛋白0.5~3mg/mL、微量元素0.1~2mg/L、酵母提取物0.2 ~ 3g/L、氨基酸溶液2~ 5 mg/L、纤连蛋白0.2~1.5mg/mL、辅酶R 0.01 ~ 0.15mg/L 、烟酸0.5 ~ 2mg/L 和维生素C 0.5 ~2 mg/L。
优选地，所述的用于培养病毒的无血清培养液，包括DMEM培养基，还包括如下组分及其浓度：胰岛素5 mg/L、牛血清白蛋白0.5mg/mL、微量元素0.5mg/L、酵母提取物0.2g/L、氨基酸溶液2mg/L、纤连蛋白0.2mg/mL、辅酶R 0.01mg/L 、烟酸0.5 mg/L 和维生素C 0.5mg/L。
优选地，所述的用于培养病毒的无血清培养液，包括DMEM培养基，其特征在于还包括如下组分及其浓度：胰岛素25mg/L、牛血清白蛋白2mg/mL、微量元素1mg/L、酵母提取物1.5g/L、氨基酸溶液2.5mg/L、纤连蛋白1mg/mL、辅酶R0.5mg/L 、烟酸1mg/L 、维生素C1 mg/L。
优选地，所述的用于培养病毒的无血清培养液，包括DMEM培养基，其特征在于还包括如下组分及其浓度：胰岛素45mg/L、牛血清白蛋白3mg/mL、微量元素2mg/L、酵母提取物3g/L、氨基酸溶液5 mg/L、纤连蛋白1.5mg/mL、辅酶R 0.15mg/L 、烟酸2mg/L 和维生素C 2mg/L。
优选地，所述氨基酸溶液由以下重量份数的组分组成：甘氨酸0.2~1份、异亮氨酸0.5~2份、丝氨酸0~1.5份、丙氨酸0.1~1.5份、苯丙氨酸0.1~0.5份、酪氨酸0.1~2份、缬氨酸0.2~1.5份、脯氨酸0.1~0.5份、半胱氨酸0.5~2份、亮氨酸0~1份、色氨酸0.5~2份、蛋氨酸0.5~1.5份、天冬酰胺0.05~0.25份、谷氨酰胺0.5~2.5份、苏氨酸0.2~1.5份、天冬氨酸0.05~2份、谷氨酸0~0.5份、赖氨酸0.5~1份、精氨酸0.1~0.5份、组氨酸0~0.5份和蒸馏水5~10份。
优选地，所述氨基酸溶液由以下质量百分数计的组分组成：甘氨酸0.5份、异亮氨酸1份、丝氨酸0.6份、丙氨酸1份、苯丙氨酸0.3份、酪氨酸1.5份、缬氨酸1份、脯氨酸0.2份、半胱氨酸0.8份、亮氨酸0.5份、色氨酸1.2份、蛋氨酸1.5份、天冬酰胺0.15份、谷氨酰胺1.5份、苏氨酸0.9份、天冬氨酸1份、谷氨酸0.3份、赖氨酸0.6份、精氨酸0.3份、组氨酸0.3份和蒸馏水8份。
优选地，所述微量元素由硒、铜、钴、锌、镍按1~2:1.5~3:1~1.5:2~3:1~1.5的重量比组成。
优选地，所述培养液的pH为7.0~7.2。
本发明还提供了所述的用于培养病毒的培养液的制备方法，包括以下步骤：取配方量的DMEM培养基溶于1000ml蒸馏水，加入所述胰岛素、牛血清白蛋白、微量元素、酵母提取物、氨基酸溶液、纤连蛋白、辅酶R 、烟酸和维生素C，充分混合，调节pH，即得。
优选地，所述氨基酸溶液由如下方法制备：取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的蒸馏水中，得到氨基酸溶液。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明用于培养病毒的培养液，在接种病毒后，为细胞的培养和扩增中提供了细胞生长所需的足够的营养物质，并且通过各种成分的配比，保证其生长分裂情况良好、增殖获得的细胞完整，经本发明培养液培养的病毒具有效价高、质量好的优点；此外，该培养液的制备方法简单、易操作，降低了病毒生产成本，便于实现大规模生产的需要。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中的各组分均为常规市售产品，例如DMEM培养基为Gibco DMEM干粉培养基（高糖，含丙酮酸钠），货号12800017。
实施例1：用于培养病毒的无血清培养液。
一种用于培养病毒的无血清培养液，所述的用于培养病毒的无血清培养液，包括DMEM培养基，还包括如下组分及其浓度：胰岛素5 mg/L、牛血清白蛋白0.5mg/mL、微量元素0.5mg/L、酵母提取物0.2g/L、氨基酸溶液2mg/L、纤连蛋白0.2mg/mL、辅酶R 0.01mg/L 、烟酸0.5 mg/L 和维生素C 0.5 mg/L。
其中，所述氨基酸溶液由以下质量百分数计的组分组成：甘氨酸0.2份、异亮氨酸0.5份、丝氨酸0.2份、丙氨酸0.1份、苯丙氨酸0.1份、酪氨酸0.1份、缬氨酸0.2份、脯氨酸0.1份、半胱氨酸0.5份、亮氨酸0.2份、色氨酸0.5份、蛋氨酸0.5份、天冬酰胺0.05份、谷氨酰胺0.5份、苏氨酸0.2份、天冬氨酸0.05份、谷氨酸0.1份、赖氨酸0.5份、精氨酸0.1份、组氨酸0.1份和蒸馏水5份；所述微量元素由硒0.1份、铜0.1份、钴0.1份、锌0.1份和镍0.1份组成。
所述用于培养病毒的无血清培养液的制备方法，包括以下步骤：取配方量的DMEM培养基溶于1000ml蒸馏水，加入所述胰岛素、牛血清白蛋白、微量元素、酵母提取物、氨基酸溶液、纤连蛋白、辅酶R 、烟酸、维生素C，充分混合，调节pH，即得。
所述氨基酸溶液由如下方法制备：取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰
胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的蒸馏水中，得到氨基酸溶液。
实施例2：用于培养病毒的无血清培养液。
一种用于培养病毒的无血清培养液，所述的用于培养病毒的无血清培养液，包括DMEM培养基，其特征在于还包括如下组分及其浓度：胰岛素25mg/L、牛血清白蛋白2mg/mL、微量元素1mg/L、酵母提取物1.5g/L、氨基酸溶液2.5mg/L、纤连蛋白1mg/mL、辅酶R0.5mg/L、烟酸1mg/L 和维生素C1 mg/L。
其中，所述氨基酸溶液由以下重量份数的组分组成：甘氨酸0.5份、异亮氨酸1份、丝氨酸0.6份、丙氨酸1份、苯丙氨酸0.3份、酪氨酸1.5份、缬氨酸1份、脯氨酸0.2份、半胱氨酸0.8份、亮氨酸0.5份、色氨酸1.2份、蛋氨酸1.5份、天冬酰胺0.15份、谷氨酰胺1.5份、苏氨酸0.9份、天冬氨酸1份、谷氨酸0.3份、赖氨酸0.6份、精氨酸0.3份、组氨酸0.3份和蒸馏水8份；所述微量元素由硒0.2份、铜0.2份、钴0.2份、锌0.2份和镍0.2份组成。
所述用于培养病毒的无血清培养液的制备方法，包括以下步骤：取配方量的DMEM培养基溶于1000ml蒸馏水，加入所述胰岛素、牛血清白蛋白、微量元素、酵母提取物、氨基酸溶液、纤连蛋白、辅酶R 、烟酸、维生素C，充分混合，调节pH，即得。
所述氨基酸溶液由如下方法制备：取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰
胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的蒸馏水中，得到氨基酸溶液。
实施例3：用于培养病毒的无血清培养液。
一种用于培养病毒的无血清培养液，所述的用于培养病毒的无血清培养液，包括DMEM培养基，其特征在于还包括如下组分及其浓度：胰岛素45mg/L、牛血清白蛋白3mg/mL、微量元素2mg/L、酵母提取物3g/L、氨基酸溶液5 mg/L、纤连蛋白1.5mg/mL、辅酶R 0.15mg/L、烟酸2mg/L 和维生素C 2 mg/L。
其中，所述氨基酸溶液由以下重量份数的组分组成：甘氨酸1份、异亮氨酸2份、丝氨酸1.5份、丙氨酸1.5份、苯丙氨酸0.5份、酪氨酸2份、缬氨酸1.5份、脯氨酸0.5份、半胱氨酸2份、亮氨酸1份、色氨酸2份、蛋氨酸1.5份、天冬酰胺0.25份、谷氨酰胺2.5份、苏氨酸1.5份、天冬氨酸2份、谷氨酸0.5份、赖氨酸1份、精氨酸0.5份、组氨酸0.5份和蒸馏水10份；所述微量元素由硒0.4份、铜0.4份、钴0.4份、锌0.4份和镍0.4份组成。
所述用于培养病毒的无血清培养液的制备方法，包括以下步骤：取配方量的DMEM培养基溶于1000ml蒸馏水，加入所述胰岛素、牛血清白蛋白、微量元素、酵母提取物、氨基酸溶液、纤连蛋白、辅酶R 、烟酸、维生素C，充分混合，调节pH，即得。
所述氨基酸溶液由如下方法制备：取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰
胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的蒸馏水中，得到氨基酸溶液。
试验例一、本发明用于培养病毒的无血清培养液对Marc-145细胞生长状况的影响
1、试验样品：本发明实施例1-3无血清培养液。
2、试验方法：按常规方式培养Marc-145 细胞，在接种高致病性蓝耳病病毒后，将Marc-145细胞移入本实施例1-3的无血清培养液中，观察Marc-145 细胞在培养4h、12h、1d、2d、3d时的生长状况，观察结果如表1 ；在Marc-145 细胞培养4d、5d、6d、7d、8 d时进行收毒，用酶联免疫吸附法测定高致病性蓝耳病病毒效价，测定结果如表2。
表1、Marc-145 细胞生长状况表
表1 中，“+”表示：Marc-145 细胞95％以上的细胞已经贴壁，但是不生长；“++”表示：Marc-145 细胞出现生长分裂的情况，分裂的细胞较少，细胞瓶中约50-60％面积没有细胞；“+++”表示：Marc-145 细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约20-30％面积没有细胞；“++++”表示：Marc-145 细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约1-3％面积没有细胞，且细胞已经生长致密。
表2、高致病性蓝耳病病毒效价测定结果
组别 4d 5d 6d 7d 8d
实施例1 5万 10万 15万 20万 20万
实施例2 4万 9万 14万 18万 19万
实施例3 5万 9万 15万 20万 19万
由上表可知，采用本发明实施例所公开的无血清病毒培养液培养的鸡新城疫病毒具有效价高的优点。
试验例二、本发明用于培养病毒的无血清培养液对MDCK细胞生长状况的影响
1、试验样品：本发明实施例1-3无血清培养液。
2、试验方法：按常规方式培养MDCK 细胞，在接种鸡新城疫病毒后，将MDCK 细胞移入本实施例1-3的无血清培养液中；观察MDCK 细胞在培养4h、12h、1d、2d、3d时的生长状况，观察结果如表3 ；在MDCK 细胞培养4d、5d、6d、7d、8 d时进行收毒，用酶联免疫吸附法测定高致病性蓝耳病病毒效价，测定结果如表4。
表3、MDCK 细胞生长状况表
表1 中，“+”表示：Marc-145 细胞95％以上的细胞已经贴壁，但是不生长；“++”表示：Marc-145 细胞出现生长分裂的情况，分裂的细胞较少，细胞瓶中约50-60％面积没有细胞；“+++”表示：Marc-145 细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约20-30％面积没有细胞；“++++”表示：Marc-145 细胞生长分裂状况良好，细胞瓶中约1-3％面积没有细胞，且细胞已经生长致密。
表4、鸡新城疫病毒效价测定结果
组别 4d 5d 6d 7d 8d
实施例1 5万 10万 15万 25万 20万
实施例2 4万 10万 15万 20万 20万
实施例3 5万 10万 15万 23万 20万
由上表可知，采用本发明实施例所公开的无血清病毒培养液培养的鸡新城疫病毒具有效价高的优点。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种用于培养病毒的无血清培养液，所述培养液由DMEM培养基及以下组分组成：胰岛素5 ~ 45mg/L、牛血清白蛋白0.5~3mg/mL、微量元素0.1~2mg/L、酵母提取物0.2 ~ 3g/L、氨基酸溶液2~ 5 mg/L、纤连蛋白0.2~1.5mg/mL、辅酶R 0.01 ~ 0.15mg/L 、烟酸0.5 ~2mg/L 和维生素C 0.5 ~2 mg/L，所述微量元素由硒、铜、钴、锌、镍按1~2:1.5~3:1~1.5:2~3:1~1.5的重量比组成，所述培养液的pH为7.0~7.2，所述氨基酸溶液由以下重量份数的组分组成：甘氨酸0.2~1份、异亮氨酸0.5~2份、丝氨酸0~1.5份、丙氨酸0.1~1.5份、苯丙氨酸0.1~0.5份、酪氨酸0.1~2份、缬氨酸0.2~1.5份、脯氨酸0.1~0.5份、半胱氨酸0.5~2份、亮氨酸0~1份、色氨酸0.5~2份、蛋氨酸0.5~1.5份、天冬酰胺0.05~0.25份、谷氨酰胺0.5~2.5份、苏氨酸0.2~1.5份、天冬氨酸0.05~2份、谷氨酸0~0.5份、赖氨酸0.5~1份、精氨酸0.1~0.5份、组氨酸0~0.5份和蒸馏水5~10份。
2.如权利要求1所述的用于培养病毒的无血清培养液，其特征在于：胰岛素5 mg/L、牛血清白蛋白0.5mg/mL、微量元素0.5mg/L、酵母提取物0.2g/L、氨基酸溶液2mg/L、纤连蛋白0.2mg/mL、辅酶R 0.01mg/L 、烟酸0.5 mg/L 和维生素C 0.5 mg/L。
3.如权利要求1所述的用于培养病毒的无血清培养液，其特征在于：胰岛素25mg/L、牛血清白蛋白2mg/mL、微量元素1mg/L、酵母提取物1.5g/L、氨基酸溶液2.5mg/L、纤连蛋白1mg/mL、辅酶R0.5mg/L 、烟酸1mg/L和维生素C1 mg/L。
4.如权利要求1所述的用于培养病毒的无血清培养液，其特征在于：胰岛素45mg/L、牛血清白蛋白3mg/mL、微量元素2mg/L、酵母提取物3g/L、氨基酸溶液5 mg/L、纤连蛋白1.5mg/mL、辅酶R 0.15mg/L 、烟酸2mg/L 和维生素C 2 mg/L。
5.如权利要求1所述的用于培养病毒的无血清培养液，其特征在于，所述氨基酸溶液由以下重量份数的组分组成：甘氨酸0.5份、异亮氨酸1份、丝氨酸0.6份、丙氨酸1份、苯丙氨酸0.3份、酪氨酸1.5份、缬氨酸1份、脯氨酸0.2份、半胱氨酸0.8份、亮氨酸0.5份、色氨酸1.2份、蛋氨酸1.5份、天冬酰胺0.15份、谷氨酰胺1.5份、苏氨酸0.9份、天冬氨酸1份、谷氨酸0.3份、赖氨酸0.6份、精氨酸0.3份、组氨酸0.3份和蒸馏水8份。
6.一种如权利要求1 所述的用于培养病毒的无血清培养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取配方量的DMEM培养基溶于1000ml蒸馏水，加入所述胰岛素、牛血清白蛋白、微量元素、酵母提取物、氨基酸溶液、纤连蛋白、辅酶R 、烟酸和维生素C，充分混合，调节pH，即得。
7.如权利要求6 所述的用于培养病毒的无血清培养液的制备方法，所述氨基酸溶液由如下方法制备：取配方量的甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，然后溶解在配方量的蒸馏水中，得到氨基酸溶液。
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