CN109988741A - 一种细胞培养用血清替代物及其制备方法、细胞培养用血清替代组合物、细胞培养基 - Google Patents

一种细胞培养用血清替代物及其制备方法、细胞培养用血清替代组合物、细胞培养基 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞培养用血清替代物及其制备方法、细胞培养用血清替代组合物、细胞培养基。本发明的细胞培养用血清替代物包括水和以下重量份数的组分：氨基酸18.5～67份、蛋白质200～815份、无机盐62.5～252份、乙醇胺1.0～3.8份、丙酮酸钠50～200.0份、抗坏血酸磷酸酯1.25～5.0份、谷胱甘肽0.5～2.0份、胰岛素5.0～20份。本发明的细胞培养用血清替代物可以添加到任何一种细胞培养基中，降低血清的添加量，从而节约成本。本发明的细胞培养用血清替代物适合用于重组蛋白和疫苗生产以及其他类的细胞培养，通用性强。

Description

一种细胞培养用血清替代物及其制备方法、细胞培养用血清 替代组合物、细胞培养基
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种细胞培养用血清替代物及其制备方法、细胞培养用血清替代组合物、细胞培养基。
背景技术
细胞培养技术的发展经历了百余年的时间，现已广泛应用于生物学和医学等研究领域。细胞根据是否附于支持物上生长的特性，分为贴附型细胞、悬浮型细胞。在培养细胞过程中细胞培养基既是供给细胞营养和促进细胞生殖增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。一般动物细胞培养需要添加10～15％(体积分数)的胎牛血清(FBS)，但是血清价格昂贵使得成本增加，并且血清容易被病毒和支原体感染，不同批次的血清的质量存在差异。
目前，针对重组蛋白及细胞治疗类的细胞已经开发出无血清培养基，无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。如申请公布号为CN107236708A的中国发明专利申请文件中公开了一种支持HeLa细胞贴壁培养的无血清培养基，由氨基酸、维生素、无机盐及其它添加物组成。其中氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸和L-脯氨酸，无机盐包括五水硫酸铜、磷酸二氢钠、七水硫酸锌、偏钒酸铵、亚硒酸钠。但是上述无血清培养基只适合HeLa细胞的培养，针对性强。目前尚没有适合各类细胞的通用无血清培养基。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通用性强的细胞培养用血清替代物。
本发明的目的还在于提供一种上述细胞培养用血清替代物的制备方法，该制备方法步骤简单，方便操作。
本发明的目的还在于提供一种细胞培养用血清替代组合物，该细胞培养用血清替代组合物适用于不同种类的细胞。
本发明的目的还在于提供一种细胞培养基，该培养基中血清使用量低，具有较低的成本。
为实现上述目的，本发明的细胞培养用血清替代物采用的技术方案为：
一种细胞培养用血清替代物，包括水和以下重量份数的组分：氨基酸18.5～67份、蛋白质200～815份、无机盐54～224份、乙醇胺1.0～3.8份、丙酮酸钠50～200.0份、抗坏血酸磷酸酯1.25～5.0份、谷胱甘肽0.5～2.0份、胰岛素5.0～20份。
在细胞相关的研究和生产过程中，由于细胞种类多及细胞自身的特性，有些贴附型细胞容易被训化为悬浮型，有些细胞则很难被驯化成悬浮型。因此需要一种介于无血清培养基和血清培养基之间的低血清培养基。本发明的细胞培养用血清替代物可代替血清加入到普通培养基中，从而降低血清的用量。本发明的培养细胞用血清替代物可以将培养基中血清的体积分数降低到2～5％，节约成本，降低不同血清由于批次不同导致的结果差异以及被病毒和支原体感染的机率。此外，使用本发明的细胞培养用血清替代物的培养基培养细胞时细胞密度和细胞成活率均较高，效果优异，适于用于重组蛋白和疫苗生产以及不同种类的细胞培养。
本发明的细胞培养用血清替代物中，胰岛素可促进糖和氨基酸的转运，提高合成代谢而降低分解代谢，刺激细胞的生长。谷胱甘肽具有抗氧化作用和整合解读作用，还参与生物转化，从而分解机体内有害的物质，增加细胞活性。抗坏血酸磷酸酯以辅酶形式参与生物催化剂-酶系的活动，以及参与细胞的蛋白质代谢、脂肪代谢和糖代谢等重要生命活动。丙酮酸钠能快速进入细胞的代谢并且对培养基起到稳定的作用。乙醇胺是磷脂酰乙醇胺的前体分子，磷脂酰乙醇胺在细胞增殖分裂中起到重要作用，因此添加乙醇胺能够促进细胞的增殖。
所述氨基酸包括以下重量份数的组分：丙氨酸2.25～9份、天冬酰胺3.5～15份、天冬氨酸3.25～13份、谷氨酸3.5～15份、脯氨酸6～15份。
目前，现有的细胞培养基中的氨基酸主要包括21种，为9种必需氨基酸和12种非必需氨基酸。必需氨基酸为组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸；非必需氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸。但是在一些培养基中，不含丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。为适应不同种类的细胞生长，本发明的细胞培养用血清替代物中包含丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。并且有些细胞如CHO细胞是脯氨酸缺陷型细胞，其生长需要脯氨酸，因此本发明的细胞培养用血清替代物中包含脯氨酸。
所述蛋白质包括如下重量份数的组分：白蛋白200～800份、转铁蛋白3.0～15份。
白蛋白作为细胞的营养物质，也是激素、脂类等物质的转运载体，还有调节pH值和维持渗透压的作用；转铁蛋白能结合铁离子，减少铁离子的毒性并提高其细胞利用率。
所述无机盐包括如下重量份数的组分：硫酸锌0.24～1.0份、偏钒酸铵0.00015～0.0006份、硫酸铜0.000625～0.0025份、氯化亚锰0.000025～0.00010份、亚硒酸钠0.0025～0.010份、磷酸一氢钠54～222份。
无机盐对维持细胞膜的渗透压以及营养物质通过细胞膜起着重要的调节作用。本发明的细胞培养用血清替代物的无机盐中主要包括Na+、HPO4 2-、HCO3 -等离子，其中磷是构成DNA和RNA的重要元素，HCO3 -起到调节pH的作用。偏钒酸铵和Zn、Cu、Se元素为细胞补充微量元素，是细胞生长和代谢中许多重要酶的辅酶，在低血清时增加细胞的代谢功能，维持细胞的活性。
上述细胞培养用血清替代物的制备方法采用的技术方案为：
一种上述细胞培养用血清替代物的制备方法，包括以下步骤：将各组分溶解于水中，然后过滤除菌，即得。
本发明的细胞培养用血清替代物的制备方法简单，易于操作。
本发明的细胞培养用血清替代组合物采用的技术方案为：
一种细胞培养用血清替代组合物，包括如下重量份数的组分：氨基酸18.5～67份、蛋白质200～815份、无机盐54～224份、乙醇胺1.0～3.8份、丙酮酸钠50～200.0份、抗坏血酸磷酸酯1.25～5.0份、谷胱甘肽0.5～2.0份、胰岛素5.0～20份。
本发明的细胞培养用血清替代组合物可起到替代血清的作用，添加到细胞培养基中，能够降低血清的使用量。本发明的细胞培养用血清替代组合物适用于不同种类的细胞的培养。
本发明的细胞培养基采用的技术方案为：
一种细胞培养基，包括基础培养基、血清和血清替代物，所述血清替代物为上述细胞培养用血清替代物。
本发明的细胞培养基中采用细胞培养用血清替代物，使血清的使用量降低到了2～5％(体积分数)，并且可以支持细胞的良好生长。本发明的细胞培养基适于培养各种细胞尤其是各类哺乳动物细胞。
附图说明
图1为本发明的细胞培养基培养细胞时不同时间的胃癌SGC-7901细胞生长情况图；
图2为本发明的细胞培养基培养细胞时不同时间的胃癌SGC-7901细胞活性图；
图3为本发明的细胞培养基培养细胞时不同时间的CHO细胞生长情况图；
图4为本发明的细胞培养基培养细胞时不同时间的CHO细胞活性图；
图5为本发明的细胞培养基培养细胞时不同时间的HepG-2细胞生长情况图；
图6为本发明的细胞培养基培养细胞时不同时间的HepG-2细胞活性图；
图7为本发明的细胞培养基培养细胞时不同时间的QBC939细胞生长情况图；
图8为本发明的细胞培养基培养细胞时不同时间的QBC939细胞活性图。
具体实施方式
本发明的细胞培养用血清替代物，包括水和以下重量份数的组分：氨基酸18.5～67份、蛋白质200～815份、无机盐54～224份、乙醇胺1.0～3.8份、丙酮酸钠50～200.0份、抗坏血酸磷酸酯1.25～5.0份、谷胱甘肽0.5～2.0份、胰岛素5.0～20份。
优选的，本发明的细胞培养用替代物先配制成10倍或20倍的浓缩物，然后在使用时稀释。
本发明的细胞培养用血清替代物的制备方法，包括以下步骤：将各组分溶解于水中，然后过滤除菌，即得。
优选的，各组分溶解于水中包括先溶解到450～550mL水中，然后再定容。先将各组分溶解于水中，有利于各组分的充分溶解以及混合。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
细胞培养用血清替代物的实施例1
本实施例的细胞培养用血清替代物由水和以下质量含量的组分组成：每升细胞培养用血清替代物中的氨基酸为18.5mg、蛋白质为203mg、无机盐为62.9mg、乙醇胺为1mg、丙酮酸钠为50mg、抗坏血酸磷酸酯为1.25mg、还原型谷胱甘肽为0.5mg、胰岛素为5mg。
氨基酸由2.25mg丙氨酸、3.5mg天冬酰胺、3.25mg天冬氨酸、3.5mg谷氨酸和6mg脯氨酸组成；无机盐由0.43mg ZnSO4·7H2O、0.00015mg偏钒酸铵、0.000625mg硫酸铜、0.000025mg氯化亚锰、0.0025mg亚硒酸钠和62.5mg Na2HPO4·H2O组成；蛋白质由200mg白蛋白、3mg转铁蛋白组成。
本实施例的细胞培养用血清替代物先配制成10倍浓缩液，使用时再用水稀释10倍。
细胞培养用血清替代物的实施例2
本实施例的细胞培养用血清替代物由水和以下质量含量的组分组成：每升细胞培养用血清替代物中的氨基酸为67mg、蛋白质为815mg、无机盐为251.8mg、乙醇胺为3.8mg、丙酮酸钠为200mg、抗坏血酸磷酸酯为5mg、还原型谷胱甘肽为2mg、胰岛素为20mg。
氨基酸由9mg丙氨酸、15mg天冬酰胺、13mg天冬氨酸、15mg谷氨酸、15mg脯氨酸；无机盐由1.75mg ZnSO4·7H2O、0.0006mg偏钒酸铵、0.0025mg硫酸铜、0.00010mg氯化亚锰、0.01mg亚硒酸钠、250mg Na2HPO4·H2O组成；蛋白质由800mg白蛋白、15mg转铁蛋白组成。
本实施例的细胞培养用血清替代物先配制成10倍浓缩液，使用时再用水稀释10倍。
细胞培养用血清替代物的实施例3
本实施例的细胞培养用血清替代物由水和以下质量含量的组分组成：每升细胞培养用血清替代物中的氨基酸为28.3mg、蛋白质为407.2mg、无机盐为125.9mg、乙醇胺为1.9mg、丙酮酸钠为110mg、抗坏血酸磷酸酯为5mg、还原型谷胱甘肽为1mg、胰岛素为10mg。
氨基酸由4.45mg丙氨酸、7.5mg天冬酰胺、6.5mg天冬氨酸、7.35mg谷氨酸、2.5mg脯氨酸组成；无机盐为：0.874mg ZnSO4·7H2O、0.00034mg偏钒酸铵、0.00125mg硫酸铜、0.00005mg氯化亚锰、0.005mg亚硒酸钠、125mg Na2HPO4·H2O组成；蛋白质由400mg白蛋白、7.2mg转铁蛋白。
本实施例的细胞培养用血清替代物先配制成10倍浓缩液，使用时再用水稀释10倍。
细胞培养用血清替代物的制备方法的实施例1
本实施例为细胞培养用血清替代物的实施例1的血清替代物的制备方法，具体包括以下步骤：称取各组分，然后加入到含有500mL注射用水的1L的烧杯中并混匀，然后再用注射用水定容至1L；之后用孔径大小为0.22μm的过滤膜除菌。
细胞培养用血清替代物的制备方法的实施例2～3
实施例2～3分别为细胞培养用血清替代物的实施例2和3的血清替代物的制备方法，制备过程参照细胞培养用血清替代物的制备方法的实施例1，区别仅在于各组分质量含量不同，其余均相同。
细胞培养用血清替代组合物的实施例1
本实施例的细胞培养用血清替代组合物包括以下重量份数的组分：氨基酸18.5份、蛋白质203份、无机盐62.9份、乙醇胺1份、丙酮酸钠50份、抗坏血酸磷酸酯1.25份、还原型谷胱甘肽0.5份、胰岛素5份。
氨基酸由2.25份丙氨酸、3.5份天冬酰胺、3.25份天冬氨酸、3.5份谷氨酸、6份脯氨酸组成；无机盐由0.43份ZnSO4·7H2O、0.00015份偏钒酸铵、0.000625份硫酸铜、0.000025份氯化亚锰、0.0025份亚硒酸钠、62.5份Na2HPO4·H2O组成；蛋白质由200份白蛋白、3份转铁蛋白组成。
细胞培养用血清替代组合物的实施例2
本实施例的细胞培养用血清替代组合物包括以下重量份数的组分：氨基酸67份、蛋白质815份、无机盐251.8份、乙醇胺3.8份、丙酮酸钠200份、抗坏血酸磷酸酯5份、还原型谷胱甘肽2份、胰岛素20份。
氨基酸由9份丙氨酸、15份天冬酰胺、13份天冬氨酸、15份谷氨酸、15份脯氨酸组成；无机盐由1.75份ZnSO4·7H2O、0.0006份偏钒酸铵、0.0025份硫酸铜、0.00010份氯化亚锰、0.01份亚硒酸钠、250份Na2HPO4·H2O组成；蛋白质由800份白蛋白、15份转铁蛋白组成。
细胞培养用血清替代组合物的实施例3
本实施例的细胞培养用血清替代组合物包括以下重量份数的组分：氨基酸28.3份、蛋白质407.2份、无机盐125.9份、乙醇胺1.9份、丙酮酸钠110份、抗坏血酸磷酸酯5份、还原型谷胱甘肽1份、胰岛素10份。
氨基酸由4.45份丙氨酸、7.5份天冬酰胺、6.5份天冬氨酸、7.35份谷氨酸、2.5份脯氨酸组成；无机盐由0.874份ZnSO4·7H2O、0.00034份偏钒酸铵、0.00125份硫酸铜、0.00005份氯化亚锰、0.005份亚硒酸钠、125份Na2HPO4·H2O组成；蛋白质由400份白蛋白、7.2份转铁蛋白组成。
细胞培养基的实施例1～3
实施例1～3的细胞培养基，包括基础培养基、血清和血清替代物，其中基础培养基为1640培养基(购自赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)有限公司)，血清为胎牛血清，血清的添加量为2％(体积分数)。实施例1的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例1的细胞培养用血清替代物。实施例2的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例2的细胞培养用血清替代物。实施例3的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例3的细胞培养用血清替代物。
细胞培养基的实施例4～6
实施例4～6的细胞培养基，包括基础培养基、血清和血清替代物，其中基础培养基为DMEM/F12培养基(DMEM/F12：杜氏改良Eagle培养基：营养混合物F-12，购自赛默飞世尔科技有限公司)，血清为胎牛血清，血清的添加量为2％(体积分数)。实施例4的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例1的细胞培养用血清替代物。实施例5的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例2的细胞培养用血清替代物。实施例6的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例3的细胞培养用血清替代物。
细胞培养基的实施例7～9
实施例7～9的细胞培养基，包括基础培养基、血清和血清替代物，其中基础培养基为高糖DMEM培养基(购自赛默飞世尔科技有限公司)，血清为胎牛血清，血清的添加量为2％(体积分数)。实施例7的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例1的细胞培养用血清替代物。实施例8的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例2的细胞培养用血清替代物。实施例9的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例3的细胞培养用血清替代物。
细胞培养基的实施例10～12
实施例10～12的细胞培养基，包括基础培养基、血清和血清替代物，其中基础培养基为低糖DMEM培养基(购自赛默飞世尔科技有限公司)，血清为胎牛血清，血清的添加量为2％(体积分数)。实施例10的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例1的细胞培养用血清替代物。实施例11的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例2的细胞培养用血清替代物。实施例12的细胞培养基中所用血清替代物为细胞培养用血清替代物的实施例3的细胞培养用血清替代物。
对比例1
本对比例的细胞培养基为1640培养基，添加10％(体积分数)的胎牛血清。
对比例2
本对比例的细胞培养基为DMEM/F12培养基，添加10％(体积分数)的胎牛血清。
对比例3
本对比例的细胞培养基为高糖DMEM培养基，添加15％(体积分数)的胎牛血清。
对比例4
本对比例的细胞培养基为低糖DMEM培养基，添加10％(体积分数)的胎牛血清。
试验例1
用细胞培养基的实施例1～3和对比例1的细胞培养基分别培养胃癌细胞SGC-7901细胞，于0h、24h、48h、72h分别用血球计数板做细胞计数。同时取样，采用台盼蓝染色，对细胞进行计数，记录总细胞数及细胞活率。测试结果如图1和图2所示。由图1和图2可知，SGC-7901细胞在本发明的细胞培养基的生长数量和增殖速率均高于对比例1的细胞培养基，细胞活性也高于对比例1的细胞培养基。因此本发明的细胞培养用血清替代物，不仅能够很好地促进细胞的生长增殖，同时能降低血清的使用，提高细胞培养的质量。
试验例2
用细胞培养基的实施例4～6和对比例2的细胞培养基分别培养CHO细胞，进行贴壁培养，于0h、24h、48h、72h分别用血球计数板做细胞计数。同时取样，采用台盼蓝染色，对细胞进行计数，记录总细胞数及细胞活率。测试结果如图3和图4所示。由图3和图4可知，CHO细胞在本发明的细胞培养基中的生长数量和增殖速率高于对比例2的细胞培养基。
试验例3
用细胞培养基的实施例7～9和对比例3的细胞培养基分别培养人肝癌HepG-2细胞，进行贴壁培养，于0h、24h、48h、72h分别用血球计数板做细胞计数。同时取样，采用台盼蓝染色，对细胞进行计数，记录总细胞数及细胞活率。测试结果如图5和图6所示。由图5和图6可知，HepG-2细胞在本发明的细胞培养基中的生长数量和增殖速率高于对比例3的细胞培养基。
试验例4
用细胞培养基的实施例10～12和对比例4的细胞培养基分别培养胆管癌QBC939细胞，进行贴壁培养，于0h、24h、48h、72h分别用血球计数板做细胞计数。同时取样，采用台盼蓝染色，对细胞进行计数，记录总细胞数及细胞活率。测试结果如图7和图8所示。由图7和图8可知，QBC939细胞在本发明的细胞培养基中的生长数量和增殖速率高于对比例4的细胞培养基。

Claims (7)

1.一种细胞培养用血清替代物，其特征在于，包括水和以下重量份数的组分：氨基酸18.5～67份、蛋白质200～815份、无机盐54～224份、乙醇胺1.0～3.8份、丙酮酸钠50～200.0份、抗坏血酸磷酸酯1.25～5.0份、谷胱甘肽0.5～2.0份、胰岛素5.0～20份。
2.根据权利要求1所述的细胞培养用血清替代物，其特征在于，所述氨基酸包括以下重量份数的组分：丙氨酸2.25～9份、天冬酰胺3.5～15份、天冬氨酸3.25～13份、谷氨酸3.5～15份、脯氨酸6～15份。
3.根据权利要求1所述的细胞培养用血清替代物，其特征在于，所述蛋白质包括如下重量份数的组分：白蛋白200～800份、转铁蛋白3.0～15份。
4.根据权利要求1所述的细胞培养用血清替代物，其特征在于，所述无机盐包括如下重量份数的组分：硫酸锌0.24～1.0份、偏钒酸铵0.00015～0.0006份、硫酸铜0.000625～0.0025份、氯化亚锰0.000025～0.00010份、亚硒酸钠0.0025～0.010份、磷酸一氢钠54～222份。
5.一种如权利要求1所述的细胞培养用血清替代物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将各组分溶解于水中，然后过滤除菌，即得。
6.一种细胞培养用血清替代组合物，其特征在于，包括如下重量份数的组分：氨基酸18.5～67份、蛋白质200～815份、无机盐54～224份、乙醇胺1.0～3.8份、丙酮酸钠50～200.0份、抗坏血酸磷酸酯1.25～5.0份、谷胱甘肽0.5～2.0份、胰岛素5.0～20份。
7.一种细胞培养基，包括基础培养基、血清和血清替代物，其特征在于，所述血清替代物为权利要求1所述的细胞培养用血清替代物。
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