CN105567628A - 一种全悬浮培养mdck细胞的低血清培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基,所述培养基由含氯化钠5000-6500mg/L的DMEM/F12培养基和以下组分组成:氯化镍NiCl2·6H2O、七钼酸铵(NH4)6Mo7O24.4H2O、氯化亚锡SnCl2·2H2O、偏钒酸铵NH4VO3、硅酸钠Na2SiO3·9H2O、维生素A、维生素E、人转铁蛋白、重组胰岛素、谷胱甘肽、亚硒酸钠、植物蛋白水解物、重组人血白蛋白、PF68。在本发明的培养基中加入体积百分含量为3-5%的新生牛血清,接种MDCK细胞,能提高细胞密度,使其增至4.21×106/ml,此时,细胞活力仍达92.3%。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域,具体涉及一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基。
背景技术
近几年流感(禽流感)大面积爆发,严重影响了人和禽类动物的健康,接种疫苗仍是目前预防流感(禽流感)的最主要手段。传统流感疫苗的生产运用鸡胚培养法,该方法存在培养过程微生物污染几率高、产品内毒含量高、注射副反应大、废物有环境污染处理成本高、流感大流行爆发时鸡胚供应困难和生产周期长等工艺缺点,开发动物细胞基质的疫苗流感势在必行。
MDCK细胞(Madin-Darbycaninekidneycells)是从犬肾组织中分离培养获得的上皮样贴壁传代细胞,该细胞培养工艺相对简单、生长快且对流感病毒敏感,是目前生产流感疫苗常用的细胞系之一。传代细胞的规模化培养方式经历了转瓶培养、微载体培养、片状载体培养和单细胞悬浮培养等过程。
悬浮培养一般指的是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式,是细胞经过驯化后可完全悬浮于培养基中生长或维持。由于细胞本身的特性,有的细胞有很容易驯化成悬浮培养型的,也有部分细胞是很难驯化成功的。由于MDCK细胞已具有商业前景,近年来研究人员进行了大量驯化研究,1997年,美国AlbrechtGroner等人将MDCK细胞接种入转瓶中并调整转速为16rpm(正常速率为3rpm),使细胞不能有效的贴附到瓶壁上而悬浮于培养基中生长,利用此法连续传代培养便可得到MDCK悬浮细胞系,且该细胞对流感病毒敏感,此后有关MDCK悬浮培养的研究和应用的报道很多,欧洲诺华公司和美国医学免疫学公司已经有MDCK细胞基质的流感疫苗上市,取代了传统鸡胚工艺。据报道,在我国已有多株驯化的可全悬浮培养的MDCK细胞,但是批培养的密度都不高,大多在2.0×106/mL左右,其主要原因还是没有相应配套的全悬浮培养的培养基,实际应用中许多用户高价买来的无血清培养中加3-5%的新生牛血清才能正常培养细胞。无血清培养基配方中要添加大量血清替代物如:重组人表皮细胞生长因子、氢化可的松、胰岛素、前列腺素和甲状腺素等激素,这些添加物的价格通常是血清价格的好多倍。本发明提供一种以DMEM/F12为基础的低血清培养基,使用时添加3-5%新生牛血清,价格低,配制简单,能很好的支持MDCK细胞的全悬浮培养。
发明内容
本发明提供了一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基,价格低廉,配制方法简单,应用其培养MDCK细胞,细胞密度能够大大提高。
本发明的第一个目的是提供一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基,本申请人经试验发现,在DMEM/F12培养基中直接添加支持MDCK细胞低血清培养的添加物时会增加培养基的渗透压,从而影响细胞生长。因此,本申请人以DMEM/F12培养基配方(Gibco公司,货号:12500)为基础培养基,在此基础上添加添加物,并在pH缓冲盐碳酸氢钠2200mg/L的情况下,将基础培养基中氯化钠含量由6996mg/L降至5000-6500mg/L,此时渗透压为280-310mmol/kg,具体的添加物如下:(mg/L)
氯化镍NiCl2·6H2O0.000195
七钼酸铵(NH4)6Mo7O24.4H2O0.00124
氯化亚锡SnCl2·2H2O0.000095
偏钒酸铵NH4VO30.000585
硅酸钠Na2SiO3·9H2O0.061
维生素A0.1-0.2
维生素E0.05-0.1
人转铁蛋白5-10
重组胰岛素10-20
谷胱甘肽0.1-0.5
亚硒酸钠0.003-0.006
植物蛋白水解物(HyPep1510)2000-2500
重组人血白蛋白200-300
PF68800-1200。
其中,氯化镍、七钼酸铵、氯化亚锡、偏钒酸铵、硅酸钠和亚硒酸钠为细胞补充微量元素,细胞在低血清时增加细胞的代谢功能,维持细胞的活性。
维生素A和维生素E为脂溶性维生素,维生素A有增强细胞免疫功能的作用,维生素E的主要作用是作为抗氧化剂,它能阻止游离基的积累,增加细胞代谢,提高细胞活性。
转铁蛋白能结合铁离子,减少其毒性和被细胞生长所利用。
重组胰岛素可促进糖和氨基酸的转运,提高合成代谢降低分解代谢,刺激细胞生长。
谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合,含有巯基的的三肽,具有抗氧化作用和整合解毒作用,还参与生物转化作用,从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质,增加细胞活性。
植物蛋白水解物主要是小分子肽和氨基酸组成,为细胞的主要营养物质。
重组人血白蛋白作为细胞的营养物质,也是激素、脂类等物质的转运载体,还有调节pH值和维持渗透压的作用。
PF68为表面活性剂,主要是提高细胞悬浮培养时的抗剪切力,增加细胞活性。(在脂溶性物质溶解乳化时起乳化剂的作用,量少在总配方中忽略此量)。
本发明的第二个目的是提供一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基的制备方法,是将脂溶性原料乳化冻干后与其它原料混合,磨细即得。
使用时,用注射用水溶解,每升加2200mgNaHCO3,用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.2。
本发明的第三个目的是提供一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基的制备方法,将脂溶性原料乳化后(不需要冻干)与其它原料依次溶解于注射用水,然后每升加入2200mgNaHCO3,最后用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.2。
本发明的第四个目的是提供上述培养基在MDCK细胞全悬浮培养中的应用。
本发明的第五个目的是提供应用上述的培养基全悬浮培养MDCK细胞的方法,在配制好的培养基中加入体积百分含量为3-5%的新生牛血清。
本发明的第六个目的是在权利要求1的培养基中加入体积百分含量为3-5%的新生牛血清,接种MDCK细胞,在37℃,110rpm的转速下摇床培养。
本发明的培养基价格低廉,配制方法简单;在本发明的培养基中加入体积百分含量为3-5%的新生牛血清,接种MDCK细胞,能提高细胞密度,使其增至4.21×106/ml,此时,细胞活力仍达92.3%。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为应用本发明的培养基悬浮培养MDCK细胞,细胞生长情况图;其中,图A为MDCK细胞初培养时细胞生长情况图;图B为MDCK细胞培养96小时后的细胞生长情况图。
具体实施方式
以下的实例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为市售。
材料来源:
培养基和血清:DMEM/F12(Gibco公司,货号:12500);新生牛血清(兰州民海生物工程有限公司,批号:20141028);
氨基酸:L-丙氨酸,L-精氨酸,L-天冬酰胺,L-天冬氨酸,L-胱氨酸,L-谷氨酸,L-谷氨酰胺,甘氨酸,L-组氨酸,L-异亮氨酸,L-亮氨酸,L-赖氨酸,L-蛋氨酸,L-苯丙氨酸,L-脯氨酸,L-丝氨酸,L-苏氨酸,L-色氨酸,L-酪氨酸,L-缬氨酸,L-胱氨酸,以上均采购自Solarbio公司;
维生素:氯化胆碱,次黄嘌呤钠,烟酰胺,泛酸,盐酸腐胺,盐酸吡哆醇,盐酸硫胺素,胸苷,维生素B12,D-生物素,叶酸,核黄素,维生素A,维生素E,亚油酸,硫辛酸,均为Sigma公司生产;
碳水化合物:D-葡萄糖,购自国药集团;
生长因子/激素:重组胰岛素,人转铁蛋白,均为Sigma公司生产;
植物蛋白水解物:HyPep1510,Sheffield公司生产;
其它:谷胱甘肽,吐温-80(均为Sigma公司生产);PF-68(Gibco生产,89-5080IP);
化学试剂为国产分析纯。
实施例1
本发明的全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基的配方如下,默认单位:mg/L;其中,下划线部分为DMEM/F12培养基成分:
1)无机盐和微量元素:
氯化钙CaCl
2
116.6
氯化钾KCl311.8
硫酸镁MgSO
4
48.84
无水磷酸氢二钠Na
2
HPO
4
71.02
磷酸二氢钠NaH
2
PO
4
-H
2
O62.5
氯化镁MgCl
2
28.64
硫酸铜CuSO
4
·5H
2
O0.0013
硝酸铁Fe(NO
3
)
3
·9H
2
O0.05
硫酸亚铁FeSO
4
·7H
2
O0.417
硫酸锌ZnSO
4
·7H
2
O0.432
丙酮酸钠C
3
H
3
NaO
3
55
氯化镍NiCl2·6H2O0.000195
七钼酸铵(NH4)6Mo7O24.4H2O0.00124
氯化亚锡SnCl2·2H2O0.000095
偏钒酸铵NH4VO30.000585
硅酸钠Na2SiO3·9H2O0.061
亚硒酸钠Na2SeO30.005
氯化钠NaCl6400
2)氨基酸
L-丙氨酸4.45
L-精氨酸147.5
L-天冬酰胺7.5
L-天冬氨酸6.65
L-胱氨酸盐酸盐31.29
L-半胱氨酸17.56
L-谷氨酸7.35
L-谷氨酰胺365
甘氨酸18.75
L-组氨酸盐酸盐31.48
L-异亮氨酸54.47
L-亮氨酸59.05
L-赖氨酸盐酸盐91.25
L-蛋氨酸17.24
L-苯丙氨酸35.48
L-脯氨酸17.25
L-丝氨酸26.25
L-苏氨酸53.45
L-色氨酸9.02
L-酪氨酸55.79
L-盐缬氨酸52.86
3)水溶性维生素:(直接添加)
D-生物素0.0035
泛酸钙2.24
氯化胆碱8.89
叶酸2.65
肌醇12.6
烟酰胺2.02
吡哆醇盐酸盐2.013
核黄素0.219
硫胺素盐酸盐2.17
维生素B10.68
4)脂溶性材料:(通过乳化后使用,配制1000L干粉)
亚油酸0.042mg/L×1000L=42mg
硫辛酸0.105mg/L×1000L=105mg
腐胺0.081mg/L×1000L=81mg
维生素A0.14mg/L×1000L=140mg
维生素E0.06mg/L×1000L=60mg
脂溶性材料乳化方法:取2.5ml吐温-80至50ml无水乙醇中,充分搅拌至完全溶解,将配方量的亚油酸、硫辛酸、腐胺、维生素A、维生素E依次加入,待每种物质完全溶解后再加入另一种物质,得到脂溶性维生素混合物。另取一烧杯中加入60ml注射用水,先打开磁力搅拌器,缓慢加入10gPF68干粉,保证加入的完全溶解后再加入少量继续搅拌至10g完全溶解。溶解过程中搅拌速度不要太快,尽量避免产生太多泡沫。PF68干粉全部加完后,定容至100ml,混合均匀。将配制好的脂溶性维生素混合物与PF68超声波乳化,冻干后按所配干粉的比例加入。
5)其它添加物:
胸苷0.365
次黄嘌呤2.39
葡萄糖3151
人转铁蛋白7.5
重组胰岛素10
谷胱甘肽0.5
植物蛋白水解物2000
重组人血白蛋白250
PF681000
酚红8.1(pH指示剂)
将上述组分制备粉剂培养基:将所有材料(脂溶性材料乳化后冻干)混合后磨细即得。使用时按常规方法用注射用水溶解,加NaHCO32200mg/L,调pH值至所需值、除菌过滤即可使用。
将上述组分制备液体培养基:将上述所有材料依次溶解,脂溶性材料乳化后不需要冻干可直接使用,最后加入NaHCO32200mg/L,调pH值至所需值、除菌过滤即可使用。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于:
培养基中:
亚硒酸钠0.004mg/L
氯化钠NaCl6500mg/L
维生素A0.1mg/L
维生素E0.1mg/L
人转铁蛋白5mg/L
重组胰岛素20mg/L
谷胱甘肽0.3mg/L
植物蛋白水解物2250mg/L
重组人血白蛋白200mg/L
PF68800mg/L。
培养基其余组分和培养基的制备方法均与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于:
培养基中:
亚硒酸钠0.003mg/L
氯化钠NaCl5000mg/L
维生素A0.2mg/L
维生素E0.08mg/L
人转铁蛋白10mg/L
重组胰岛素15mg/L
谷胱甘肽0.1mg/L
植物蛋白水解物2500mg/L
重组人血白蛋白300mg/L
PF681200mg/L。
培养基其余组分和培养基的制备方法均与实施例1相同。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于:
培养基中:
亚硒酸钠0.006mg/L
氯化钠NaCl5500mg/L
维生素A0.12mg/L
维生素E0.05mg/L
人转铁蛋白6mg/L
重组胰岛素12mg/L
谷胱甘肽0.2mg/L
植物蛋白水解物2400mg/L
重组人血白蛋白260mg/L
PF68900mg/L。
培养基其余组分和培养基的制备方法均与实施例1相同。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处在于:
培养基中:
亚硒酸钠0.005mg/L
氯化钠NaCl5800mg/L
维生素A0.18mg/L
维生素E0.07mg/L
人转铁蛋白9mg/L
重组胰岛素17mg/L
谷胱甘肽0.4mg/L
植物蛋白水解物2100mg/L
重组人血白蛋白230mg/L
PF681100mg/L。
培养基其余组分和培养基的制备方法均与实施例1相同。
实施例6应用本发明的培养基悬浮培养MDCK悬浮细胞的实验
一、材料
1细胞
MDCK悬浮细胞,甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供。
2设备
CO2培养箱(美国Thermo3111),普通显微镜(日本Olympus,CX21),倒置相差显微镜(日本OLYMPUSCKX41+DP72),细胞计数仪(美国,INNOVATIS,CASYTT),摇床(上海智诚分析仪器制造公司,ZHWY-2102C)和电子天平(上海,梅特勒托利多上海总公司,AR2140)等。
二、细胞培养测试
在配制好的液体培养基中加入3-5%新生牛血清(V/V)进行MDCK悬浮测试,细胞以75×104/ml密度接种,摇床37℃,110rpm,每24小时抽样计数。表1-5为测试结果。
表1实施例1配方细胞培养测试结果(加5%新生牛血清)
表2实施例2配方细胞培养测试结果(加5%新生牛血清)
表3实施例3配方细胞培养测试结果(加4%新生牛血清)
表4实施例4配方细胞培养测试结果(加3%新生牛血清)
表5实施例5配方细胞培养测试结果(加3%新生牛血清)
由表1-5可以看出,本发明的培养基能够很好的支持MDCK细胞的全悬浮生长,生长96小时后,细胞密度最高可达4.21×106/ml,此时细胞活力为92.3%。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基,其特征在于:所述培养基由含氯化钠5000-6500mg/L的DMEM/F12培养基和以下组分组成:
氯化镍NiCl2·6H2O0.000195mg/L
七钼酸铵(NH4)6Mo7O24.4H2O0.00124mg/L
氯化亚锡SnCl2·2H2O0.000095mg/L
偏钒酸铵NH4VO30.000585mg/L
硅酸钠Na2SiO3·9H2O0.061mg/L
维生素A0.1-0.2mg/L
维生素E0.05-0.1mg/L
人转铁蛋白5-10mg/L
重组胰岛素10-20mg/L
谷胱甘肽0.1-0.5mg/L
亚硒酸钠0.003-0.006mg/L
植物蛋白水解物2000-2500mg/L
重组人血白蛋白200-300mg/L
PF68800-1200mg/L。
2.权利要求1所述的一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基的制备方法,其特征在于:是将脂溶性原料乳化冻干后与其它原料混合,磨细即得。
3.权利要求1所述的一种全悬浮培养MDCK细胞的低血清培养基的制备方法,其特征在于:将脂溶性原料乳化后(不需要冻干)与其它原料依次溶解于注射用水,然后每升加入2200mgNaHCO3,最后用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.2。
4.权利要求1所述的培养基在MDCK细胞全悬浮培养中的应用。
5.应用权利要求1所述的培养基全悬浮培养MDCK细胞的方法,其特征在于:在配制好的培养基中加入体积百分含量为3-5%的新生牛血清。
6.MDCK细胞全悬浮培养的方法,其特征在于:是在权利要求1的培养基中加入体积百分含量为3-5%的新生牛血清,接种MDCK细胞,在37℃,110rpm的转速下摇床培养。
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