CN106635953A - 无血清无蛋白细胞培养基 - Google Patents
无血清无蛋白细胞培养基 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106635953A CN106635953A CN201611146673.3A CN201611146673A CN106635953A CN 106635953 A CN106635953 A CN 106635953A CN 201611146673 A CN201611146673 A CN 201611146673A CN 106635953 A CN106635953 A CN 106635953A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- serum
- content
- derivative
- cell culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0043—Medium free of human- or animal-derived components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/005—Protein-free medium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/22—Zinc; Zn chelators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
- C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
- C12N2500/95—Protein-free medium and culture conditions
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体来说是无血清无蛋白细胞培养基；本发明的目的是提供一种支持细胞高细胞密度生长的无血清无蛋白成分界定的培养基，其具体技术方案包括氨基酸，维生素，无机盐和微量元素，碳水化合物和其它化学物，聚胺或者其衍生物,水解物；本发明无血清无蛋白细胞培养基制作成本低廉，稳定性高，活细胞密度和细胞存活率极高，适用于用于重组蛋白和疫苗生产的细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说是无血清无蛋白细胞培养基。
背景技术
动物细胞已被广泛用于重组蛋白药物和疫苗的生产，培养基是动物细胞大规模培养的关键技术。用传统的培养基培养细胞，需要在传统培养基中加入5-10％的血清。血清价格昂贵，容易被病毒和支原体感染，每批次间的质量不稳定，血清中含有大量的蛋白质，给重组蛋白细胞产品的分离纯化带来很大的困难。为了克服以上难题，科学家们对血清中各成分在细胞培养中的作用的研究发现，血清中的胰岛素，转铁蛋白和其他生长因子是促进细胞生长的主要成分，研发出用胰岛素、转铁蛋白和其他生长因子替代血清的无血清培养基。由于这些生长因子主要是从血清中提取或者是用基因重组技术生产的，价格昂贵，每批次间的质量也不稳定，大大地限制了此类无血清培养基的大规模生产应用。无血清无蛋白培养基可以避免使用动物源的成分，降低生产成本，简化下游分离纯化的步骤，避免外源传染性海绵状脑病，外源病毒和外源支原体的污染，实现大规模的生产应用。目前我国也研发出一些无血清无蛋白培养基，但这些培养基只能支持低细胞密度的细胞生长，重组蛋白的表达也比较低，研发支持高细胞密度生长和高重组蛋白表达的无血清无蛋白培养基是目前培养基研究领域中的一项重要课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种支持细胞高细胞密度生长的无血清无蛋白成分界定的培养基；一种支持细胞高细胞密度生长和高重组蛋白表达的无血清无蛋白培养基。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：无血清无蛋白细胞培养基，包括氨基酸，维生素，无机盐和微量元素，碳水化合物和其它化学物的成分，还包括聚胺或者其衍生物。
进一步的，所述氨基酸的成分及其在每升培养基中的含量如下：
进一步的，所述维生素的成分及其在每升培养基中的含量如下：
进一步的，所述无机盐和微量元素的成分及其在每升培养基中的含量如下：
进一步的，所述碳水化合物和其它化学物的成分及其在每升培养基中的含量如下：
进一步的，所述微量元素中还含有以下3种鋅盐中的任何一种或几种：I.盐酸鋅(ZnCl2)，II.硫酸鋅(ZnSO4-7H2O)，III.硝酸鋅[Zn(NO3)2-6H2O]，其在每升培养基中的含量分别如下:
ZnCl2 1–100μM
ZnSO4-7H2O 1–100μM
Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM
进一步的，所述微量元素中还含有以下3种螯合铁中的任何一种或几种：I.柠檬酸铁铵(Ferric ammonium citrate or Ammonium iron(III)citrate)，II.柠檬酸铁(Ferriccitrate or iron(III)citrate)，III.乙二胺四乙酸铁钠盐(Ethylenediaminetetraaceticacid Iron(III)sodium salt)，其在每升培养基中的含量分别如下：
柠檬酸铁铵 1–500mg/L
柠檬酸铁 1–500μM
乙二胺四乙酸铁钠盐 1–500μM
进一步的，所述聚胺或者其衍生物包括以下5种聚胺或者其衍生物中的一种或几种：I.L-鸟氨酸(L-Ornithine)或者其衍生物，II.腐胺(Putrescine)或者其衍生物，III.亚精胺(Spermidine)或者其衍生物， IV.精胺(Spermine)或者其衍生物，V.尸胺(Cadaverine)或者其衍生物，其在每升培养基中的含量分别如下：
进一步的，所述无血清无蛋白细胞培养基中还含有另外2种聚胺或者其衍生物，胍基丁胺(Agmatine)或者其衍生物和L-瓜氨酸(L-Citrulline)或者其衍生物，其在每升培养基中的含量分别如下：
胍基丁胺或者其衍生物 1–1000μM
L-瓜氨酸或者其衍生物 1–1000μM
进一步的，所述无血清无蛋白细胞培养基中还含有水解物，所述水解物是酵母抽提物，或者酵母抽提物和大豆水解物的混合物，或者酵母抽提物和棉子水解物的混合物。
进一步的，所述酵母抽提物在每升培养基中的含量为1–8g，所述酵母抽提物和大豆水解物的混合物中酵母抽提物和大豆水解物在每升培养基中的含量各为1–8g，所述酵母抽提物和棉子水解物的混合物中酵母抽提物和棉子水解物在每升培养基中的含量各为1–8g。
本发明的有益技术效果是：本发明无血清无蛋白细胞培养基中不含有蛋白质，所有成分都是来自无动物源的。本发明无血清无蛋白细胞培养基使用后活细胞密度，细胞成活率和重组蛋白的表达明显效果优异，远超其它细胞培养基。适用于用于重组蛋白和疫苗生产的细胞，尤其是CHO，NS0，Sp2/0，PerC.6，Cap，BHK，HEK293，Expi293，HT1080，Hela，MDCK，Vero细胞，可以很好的应用于重组蛋白和疫苗的生产，降低生产成本，减少污染风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。
图1为本发明中重组蛋白在不同无血清无蛋白细胞培养基中的表达对比图。
通过该附图可见：重组蛋白在含有水解物的无血清无蛋白细胞培养基中的表达明显高于在无血清无蛋白成分界定的细胞培养基中的表达，该附图对应实施例中表9。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
无血清无蛋白成分界定的细胞培养基，包括氨基酸、维生素、无机盐和微量元素、碳水化合物和其他化学物、聚胺或者其衍生物，其具体成分含量构成为：
氨基酸的成分及其在每升培养基中的含量如下：
维生素的成分及其在每升培养基中的含量如下：
无机盐和微量元素的成分及其在每升培养基中的含量如下：
其它微量元素及其在每升培养基中的含量如下：
ZnCl2 1–100μM
或者ZnSO4-7H2O 1–100μM
或者Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM
其它微量元素及其在每升培养基中的含量如下：
柠檬酸铁铵 1–500mg
或者柠檬酸铁 1–500μM
或者乙二胺四乙酸铁钠盐 1–500μM
碳水化合物和其它化学物的成分及其在每升培养基中的含量如下：
聚胺或者其衍生物的成分及其在每升培养基中的含量如下：
实施例2：
无血清无蛋白成分界定的细胞培养基，包括氨基酸、维生素、无机盐和微量元素、碳水化合物和其他化学物、聚胺或者其衍生物，其具体成分含量构成为：
氨基酸的成分及其含量：
维生素的成分及其含量：
无机盐的成分及其含量：
微量元素的成分及其含量：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
其它微量元素的成分及其含量：
ZnCl2 68.15mg/L
或者ZnSO4-7H2O 143.78mg/L
或者Zn(NO3)2-6H2O 148.745mg/L
其它微量元素的成分及其含量：
柠檬酸铁铵 2g/L
或者柠檬酸铁 489.88mg/L
或者乙二胺四乙酸铁钠盐 734.1mg/L
碳水化合物和其它化学物的成分及其含量：
其它化学物的成分及其含量：
次黄嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脱氧核苷 387.568mg/L
其它化学物的成分及其含量：
氯化胆碱 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
聚胺或者其衍生物的成分及其含量：
L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L
本实施例无血清无蛋白成分界定的细胞培养基的制备方法：
步骤1：将无血清无蛋白成分界定的细胞培养基的成分按照不同的组分配制成不同的浓缩液：
10倍的氨基酸浓缩液：
200倍的维生素浓缩液：
1倍的无机盐：
1000倍的微量元素浓缩液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
100倍的其它微量元素浓缩液：
ZnCl2 68.15mg/L
或者ZnSO4-7H2O 143.78mg/L
或者Zn(NO3)2-6H2O 148.745mg/L100倍的其它微量元素浓缩液：
柠檬酸铁铵 2g/L
或者柠檬酸铁 489.88mg/L
或者乙二胺四乙酸铁钠盐 734.1mg/L
1倍的碳水化合物和其它化学物：
100倍的其它化学物浓缩液：
次黄嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脱氧核苷 387.568mg/L
100倍的其它化学物浓缩液:
氯化胆碱 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
100倍的聚胺或者其衍生物浓缩液：
L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L
步骤2：配制1倍的1L液体培养基：将以上成分按1倍的用量加入到含有500ml去离子水的1L烧杯中并混匀，再加入去离子水定容至1L；
步骤3：调节PH值和渗透压：用5N NaOH或者5N HCl调节pH至7.30，用NaCl调节渗透压至295mOsm/L；
步骤4：用0.22μM的过滤膜除菌。
CHO细胞在本实施例不同配方的无血清无蛋白成分界定的细胞培养基中的批次悬浮培养及其实验数据见表1和表2。培养条件和实验方法：在125ml的振荡培养瓶中分别加入30ml不同配方的无血清无蛋白成分界定的细胞培养 基，放入37℃含有5％二氧化碳的培养箱中，以每分钟120转摇床培养6天，每天取样用Trypan blue血球计数法记录活细胞密度(倍10E6cells/ml)和细胞存活率(％)。
表1
表2
实施例3：
无血清无蛋白成分界定的细胞培养基，包括氨基酸、维生素、无机盐和微量元素、碳水化合物和其他化学物、聚胺或者其衍生物，其具体成分含量构成为：
氨基酸的成分及其含量：
维生素的成分及其含量：
无机盐的成分及其含量：
微量元素的成分及其含量：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
其它微量元素的成分及其含量：
ZnCl2 68.15mg/L
其它微量元素的成分及其含量：
柠檬酸铁铵 2g/L
或者柠檬酸铁 489.88mg/L
或者乙二胺四乙酸铁钠盐 734.1mg/L
碳水化合物和其它化学物的成分及其含量：
其它化学物的成分及其含量：
次黄嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脱氧核苷 387.568mg/L
其它化学物的成分及其含量：
氯化胆碱 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
聚胺或者其衍生物的成分及其含量：
本实施例无血清无蛋白成分界定的细胞培养基的制备方法：
步骤1：培养基配制：将无血清无蛋白成分界定的细胞培养基的成分按照不同的组分配制成不同的浓缩液。
10倍的氨基酸浓缩液：
200倍的维生素浓缩液：
1倍的无机盐：
1000倍的微量元素浓缩液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
100倍的其它微量元素浓缩液：
ZnCl2 68.15mg/L
100倍的其它微量元素浓缩液：
柠檬酸铁铵 2g/L
或者 柠檬酸铁 489.88mg/L
或者 乙二胺四乙酸铁钠盐 734.1mg/L
1倍的碳水化合物和其它化学物：
100倍的其它化学物浓缩液：
次黄嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脱氧核苷 387.568mg/L
100倍的其它化学物浓缩液:
氯化胆碱 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
100倍的聚胺或者其衍生物浓缩液：
步骤2：配制1倍的1L液体培养基：将以上成分按1倍的用量加入到含有500ml去离子水的1L烧杯中并混匀，再加入去离子水定容至1L；
步骤3:调节PH值和渗透压：用5N NaOH或者5N HCl调节pH至7.30，用NaCl调节渗透压至295mOsm/L；
步骤4：用0.22μM的过滤膜除菌。
CHO细胞在本实施例不同配方的无血清无蛋白成分界定的细胞培养基中的批次悬浮培养及其实验数据见表3和表4。培养条件和实验方法：在125ml的振荡培养瓶中分别加入30ml不同配方的无血清无蛋白成分界定的细胞培养基，放入37℃含有5％二氧化碳的培养箱中，以每分钟120转摇床培养6天，每天取样用Trypan blue血球计数法记录活细胞密度(倍10E6cells/ml)和细胞存活率(％)。
表3
表4
实施例4：
无血清无蛋白细胞培养基，成分包括氨基酸，维生素，无机盐和微量元素，碳水化合物和其它化学物，聚胺或者其衍生物，水解物。其具体成分含量构成为：
氨基酸的成分及其在每升培养基中的含量如下：
维生素的成分及其在每升培养基中的含量如下：
无机盐和微量元素的成分及其在每升培养基中的含量如下：
其它微量元素及其在每升培养基中的含量如下：
ZnCl2 1–100μM
或者ZnSO4-7H2O 1–100μM
或者Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM
其它微量元素及其在每升培养基中的含量如下：
柠檬酸铁铵 1–500mg
或者柠檬酸铁 1–500μM
或者乙二胺四乙酸铁钠盐 1–500μM
碳水化合物和其它化学物的成分及其在每升培养基中的含量如下：
聚胺或者其衍生物的成分及其在每升培养基中的含量如下：
水解物的成分及其在每升培养基中的含量如下：
酵母抽提物 1–8g/L
或者 酵母抽提物1-8g/L和大豆水解物1-8g/L的混合物
或者 酵母抽提物1-8g/L和棉子水解物1-8g/L的混合物
实施例5：
无血清无蛋白细胞培养基，成分包括氨基酸，维生素，无机盐和微量元素，碳水化合物和其它化学物，聚胺或者其衍生物，水解物。其具体成分含量构成为：
氨基酸的成分及其含量：
维生素的成分及其含量：
无机盐的成分及其含量：
微量元素的成分及其含量：
其它微量元素的成分及其含量：
柠檬酸铁铵 2g/L
或者柠檬酸铁 489.88mg/L
或者乙二胺四乙酸铁钠盐 734.1mg/L
碳水化合物和其它化学物的成分及其含量：
聚胺或者其衍生物的成分及其含量：
L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L
水解物的成分及其含量：
酵母抽提物2g/L
或者 酵母抽提物2g/L和大豆水解物2g/L的混合物
或者 酵母提物2g/L和棉子水解物2g/L的混合物
本实施例无血清无蛋白细胞培养基的制备方法：
步骤1：培养基配制：将无血清无蛋白细胞培养基的成分按照不同的组分配制成不同的浓缩液：
10倍的氨基酸浓缩液：
200倍的维生素浓缩液：
1倍的无机盐：
1000倍的微量元素浓缩液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
100倍的其它微量元素浓缩液：
ZnCl2 68.15mg/L
100倍的其它微量元素浓缩液：
柠檬酸铁铵 2g/L
或者柠檬酸铁 489.88mg/L
或者 乙二胺四乙酸铁钠盐 734.1mg/L
1倍的碳水化合物和其它化学物：
100倍的其它化学物浓缩液：
次黄嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脱氧核苷 387.568mg/L
100倍的其它化学物浓缩液:
氯化胆碱 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
100倍的聚胺或者其衍生物浓缩液：
L-Ornithine monohydrochloride 500mg/L
1倍的水解物：
酵母物抽提物2g/L
或者酵母抽提物2g/L和大豆水解物2g/L的混合物
或者酵母抽提物2g/L和棉子水解物2g/L的混合物
步骤2：配制1倍的1L液体培养基：将以上成分按1倍的用量加入到含有500ml去离子水的1L烧杯中并混匀，再加入去离子水定容至1L；
步骤3：调节PH值和渗透压：用5N NaOH或者5N HCl调节pH至7.30，用NaCl调节渗透压至295mOsm/L；
步骤4：用0.22μM的过滤膜除菌。
CHO细胞在本实施例不同配方的无血清无蛋白细胞培养基中的批次悬浮培养及其实验数据见表5和表6。培养条件和实验方法：在125ml的振荡培养 瓶中分别加入30ml不同配方的无血清无蛋白细胞培养基，放入37℃含有5％二氧化碳的培养箱中，以每分钟120转摇床培养6天，每天取样用Trypan blue血球计数法记录活细胞密度(倍10E6cells/ml)和细胞存活率(％)。
表5
表6
实施例6：
无血清无蛋白细胞培养基，成分包括氨基酸，维生素，无机盐和微量元素，碳水化合物和其它化学物，聚胺或者其衍生物，水解物。其具体成分含量构成为：
氨基酸的成分及其含量：
维生素的成分及其含量：
无机盐的成分及其含量：
微量元素的成分及其含量：
其它微量元素的成分及其含量：
柠檬酸铁铵 2g/L
或者 柠檬酸铁 489.88mg/L
或者 乙二胺四乙酸铁钠盐 734.1mg/L
碳水化合物和其它化学物的成分及其含量：
其它化学物的成分及其含量：
次黄嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脱氧核苷 387.568mg/L
其它化学物的成分及其含量：
氯化胆碱 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
聚胺或者其衍生物的成分及其含量：
水解物的成分及其含量：
酵母抽提物2g/L和棉子水解物2g/L的混合物
本实施例无血清无蛋白细胞培养基的制备方法：
步骤1：培养基配制：将无血清无蛋白细胞培养基的成分按照不同的组分配制成不同的浓缩液：
10倍的氨基酸浓缩液：
200倍的维生素浓缩液：
1倍的无机盐：
1000倍的微量元素浓缩液：
CuSO4-7H2O 124.84mg/L
MnCl2-4H2O 98.955mg/L
Na2SeO3 17.294mg/L
100倍的其它微量元素浓缩液：
ZnCl2 68.15mg/L
100倍的其它微量元素浓缩液：
柠檬酸铁铵 2g/L
或者柠檬酸铁 489.88mg/L
或者 乙二胺四乙酸铁钠盐 734.1mg/L
1倍的碳水化合物和其它化学物：
100倍的其它化学物浓缩液：
次黄嘌呤 1.361g/L
胸腺嘧啶脱氧核苷 387.568mg/L
100倍的其它化学物浓缩液:
氯化胆碱 3g/L
肌醇 1g/L
氯化乙醇胺 200mg/L
100倍的聚胺或者其衍生物浓缩液：
1倍的水解物：
酵母抽提物2g/L和棉子水解物2g/L的混合物
步骤2：配制1倍的1L液体培养基：将以上成分按1倍的用量加入到含有500ml去离子水的1L烧杯中并混匀，再加入去离子水定容至1L；
步骤3：调节PH值和渗透压：用5N NaOH或者5N HCl调节pH至7.30，用NaCl调节渗透压至295mOsm/L；
步骤4：用0.22μM的过滤膜除菌。
CHO细胞在本实施例不同配方的无血清无蛋白细胞培养基中的批次悬浮培养及其实验数据见表7和表8。培养条件和实验方法：在125ml的振荡培养瓶中分别加入30ml不同配方的无血清无蛋白细胞培养基，放入37℃含有5％二氧化碳的培养箱中，以每分钟120转摇床培养6天，每天取样用Trypan blue血球计数法记录活细胞密度(倍10E6cells/ml)和细胞存活率(％)。
表7
表8
重组蛋白CHO细胞在不同配方的无血清无蛋白细胞培养基中的批次悬浮培养表达实验见表9和图1。培养条件和实验方法：在125ml的振荡培养瓶中分别加入30ml不同配方的无血清无蛋白细胞培养基，放入37℃含有5％二氧化碳的培养箱中，以每分钟120转摇床培养6天，取样做Western blot。
表9
如图1所示重组蛋白在含有水解物的无血清无蛋白细胞培养基中的表达明显高于在无血清无蛋白成分界定的细胞培养基中的表达。
不限上述实施例的本发明所述无血清无蛋白细胞培养基各成分具体作用以及原理表达如下：
氨基酸：氨基酸是构成蛋白质的主要成分，同时通过氨基酸的代谢为细胞的生长提供能源。细胞培养基中的氨基酸主要包括21种，其中9种必须氨基酸：L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-缬氨酸和12种非必须氨基酸：L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸，L-胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-酪氨酸。由于谷氨酰胺在培养基中的不稳 定性，常用相同摩尔浓度的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺取代谷氨酰胺。CHO细胞是脯氨酸缺陷型细胞，CHO细胞的生长需要脯氨酸。由于传统细胞培养基中的氨基酸浓度过低，传统细胞培养基只能支持低细胞密度的贴壁培养，要支持高细胞密度的悬浮培养，必须大幅提高培养基中的氨基酸浓度，同时保证各氨基酸浓度的平衡，避免因某种氨基酸的耗尽限制细胞的生长和重组蛋白的表达。
维生素：维生素是细胞生长和代谢中许多重要酶的辅基和辅酶，细胞培养基中的维生素主要是B族维生素包括：泛酸钙，烟酰胺，盐酸吡哆醇，盐酸硫胺，维生素B12，生物素，叶酸，核黄素等。
无机盐：无机盐对维持细胞膜的渗透压，对营养物质通过细胞膜起着重要的调节作用。培养基中的无机盐主要包括：Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Cl-，HPO42-，HCO3-等，其中磷是构成DNA和RNA的重要元素，HCO3-起到培养基PH的调节作用。
微量元素：微量元素是细胞生长和代谢中许多重要酶的辅基，培养基中的微量元素主要包括：Fe，Zn，Cu，Mn，Se等。
锌盐和螯合铁：血清中的胰岛素和转铁蛋白是促进细胞生长的主要生长因子，锌离子(Zn2+)具有调节葡萄糖代谢的功能，可以替代胰岛素。螯合铁：柠檬酸铁铵或者柠檬酸铁或者乙二胺四乙酸铁钠盐能有效地把铁离子传递给细胞，可以替代转铁蛋白。
碳水化合物：碳水化合物主要是为细胞的生长提供能源，为氨基酸，DNA的合成提供前体物质，细胞培养基中的碳水化合物主要是葡萄糖。
其它化学物：培养基中还含有一些其它化学物，次黄嘌呤，胸腺嘧啶脱氧核苷是DNA补救合成途径中的主要前体物，氯化胆碱、肌醇和氯化乙醇胺是构成细胞膜磷脂的重要成分，丙酮酸钠和柠檬酸钠能快速进入细胞的代谢并且对培养基起到稳定的作用，在培养基中加入葡聚糖硫酸钠可以减少细胞在高细胞密度悬浮培养中的细胞聚团。在培养基中加入表面活性剂Kolliphor p188可以降低细胞在悬浮培养过程中所产生的剪切力对细胞的损伤。由于葡聚糖硫酸钠和表面活性剂Kolliphor p188会降低细胞的附着能力，对于培养贴壁和附着生长的细胞，应除去无血清无蛋白细胞培养基中的葡聚糖硫酸钠和表面活性剂Kolliphor p188。
聚胺(Polyamine)：聚胺对促进细胞的生长起着重要的作用。
水解物：通常重组蛋白在无血清无蛋白成分界定的细胞培养基中的表达都比较低，酵母抽提物，大豆水解物和棉子水解物已被广泛用于提高重组蛋白的表达，在成分界定的无血清无蛋白细胞培养基中加入水解物可以提高重组蛋白的表达。
本发明中的水解物均为市场上买得到的无动物源水解物，酵母抽提物是在市场上买得到的无动物源酵母抽提物，例如BD Biosciences的Yeast extract UF 210929等，大豆水解物是在市场上买得到的酶分解的无动物源大豆水解物，例如Kerry BioScience orSheffield BioScience的酶分解的大豆水解物HyPep1502等，棉子水解物是在市场上买得到的酶分解的无动物源棉子水解物，例如Kerry BioScience or Sheffield BioScience的酶分解的棉子水解物HyPep7504等。
本发明的培养基中不含有蛋白质，所有成分都是来自无动物源的，本发明无血清无蛋白细胞培养基使用后活细胞密度，细胞成活率和重组蛋白的表达明显效果优异，远超其它细胞培养基。适用于用于重组蛋白和疫苗生产的细胞，尤其是CHO，NS0，Sp2/0，PerC.6，Cap，BHK，HEK293，Expi293，HT1080，Hela，MDCK，Vero细胞，可以很好的应用于重组蛋白和疫苗的生产，降低生产成本，减少污染风险。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.无血清无蛋白细胞培养基，其特征在于，包括氨基酸，维生素，无机盐和微量元素，碳水化合物和其它化学物的成分，还包括聚胺或者其衍生物。
2.根据权利要求1所述的无血清无蛋白细胞培养基，其特征在于，所述氨基酸的成分及其在每升培养基中的含量如下：
3.根据权利要求1所述的无血清无蛋白细胞培养基，其特征在于，所述维生素的成分及其在每升培养基中的含量如下：
4.根据权利要求1所述的无血清无蛋白细胞培养基，其特征在于，所述无机盐和微量元素的成分及其在每升培养基中的含量如下：
5.根据权利要求1所述的无血清无蛋白细胞培养基，其特征在于，所述碳水化合物和其它化学物的成分及其在每升培养基中的含量如下：
6.根据权利要求1—5任一种所述的无血清无蛋白细胞培养基，其特征在于，所述微量元素中还含有以下3种鋅盐中的任何一种或几种：I.盐酸鋅(ZnCl2)，II.硫酸鋅(ZnSO4-7H2O)，III.硝酸鋅[Zn(NO3)2-6H2O]，其在每升培养基中的含量分别如下:
ZnCl2 1–100μM
ZnSO4-7H2O 1–100μM
Zn(NO3)2-6H2O 1–100μM。
7.根据权利要求6所述的无血清无蛋白细胞培养基，其特征在于，所述微量元素中还含有以下3种螯合铁中的任何一种或几种：I.柠檬酸铁铵(Ferric ammonium citrate orAmmonium iron(III)citrate)，II.柠檬酸铁(Ferric citrate or iron(III)citrate)，III.乙二胺四乙酸铁钠盐(Ethylenediaminetetraacetic acid Iron(III)sodium salt)，其在每升培养基中的含量分别如下：
柠檬酸铁铵 1–500mg/L
柠檬酸铁 1–500μM
乙二胺四乙酸铁钠盐 1–500μM。
8.根据权利要求6或7任一种所述的无血清无蛋白细胞培养基，其特征在于，所述聚胺或者其衍生物包括以下5种聚胺或者其衍生物中的一种或几种：I.L-鸟氨酸(L-Ornithine)或者其衍生物，II.腐胺(Putrescine)或者其衍生物，III.亚精胺(Spermidine)或者其衍生物，IV.精胺(Spermine)或者其衍生物，V.尸胺(Cadaverine)或者其衍生物，其在每升培养基中的含量分别如下：
9.根据权利要求8所述的无血清无蛋白细胞培养基，其特征在于，所述无血清无蛋白细胞培养基中还含有另外2种聚胺或者其衍生物，胍基丁胺(Agmatine)或者其衍生物和L-瓜氨酸(L-Citrulline)或者其衍生物，其在每升培养基中的含量分别如下：
胍基丁胺或者其衍生物 1–1000μM
L-瓜氨酸或者其衍生物 1–1000μM。
10.根据权利要求9所述的无血清无蛋白细胞培养基，其特征在于，所述无血清无蛋白细胞培养基中还含有水解物，所述水解物是酵母抽提物，或者酵母抽提物和大豆水解物的混合物，或者酵母抽提物和棉子水解物的混合物。
11.根据权利要求10所述的无血清无蛋白细胞培养基，其特征在于，所述酵母抽提物在每升培养基中的含量为1–8g。
所述酵母抽提物和大豆水解物的混合物中酵母抽提物和大豆水解物在每升培养基中的含量各为1–8g。
所述酵母抽提物和棉子水解物的混合物中酵母抽提物和棉子水解物在每升培养基中的含量各为1–8g。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611146673.3A CN106635953B (zh) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | 无血清无蛋白细胞培养基 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611146673.3A CN106635953B (zh) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | 无血清无蛋白细胞培养基 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106635953A true CN106635953A (zh) | 2017-05-10 |
| CN106635953B CN106635953B (zh) | 2021-02-19 |
Family
ID=58825630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611146673.3A Active CN106635953B (zh) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | 无血清无蛋白细胞培养基 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106635953B (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107502592A (zh) * | 2017-10-13 | 2017-12-22 | 江苏省肿瘤医院 | 一种免疫细胞无血清培养基及其制备方法 |
| CN107603941A (zh) * | 2017-09-14 | 2018-01-19 | 丙申南京网络技术有限公司 | 一种高效能血清添加剂及其制备方法和使用方法 |
| WO2018224673A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Zaklady Farmaceutyczne Polpharma S.A. | Improved methods of cell culture |
| CN110894487A (zh) * | 2019-12-23 | 2020-03-20 | 新乡医学院 | 一种无血清无蛋白cho细胞培养基及其制备方法、应用 |
| CN111304149A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-06-19 | 新乡医学院 | 一种支持hek293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其制备方法和应用 |
| CN112852730A (zh) * | 2021-02-01 | 2021-05-28 | 河南省遗传资源细胞库有限公司 | 一种基于car技术的cart-20细胞扩增培养方法 |
| CN113817666A (zh) * | 2021-10-13 | 2021-12-21 | 无锡多宁生物科技有限公司 | 一种全悬浮培养bhk-21细胞的cd培养基及其摇瓶培养工艺 |
| CN113913368A (zh) * | 2021-10-12 | 2022-01-11 | 浙江省立同德医院 | 适合cho细胞大规模悬浮扩增培养的无血清培养基及其制备和应用 |
| CN113957042A (zh) * | 2020-07-20 | 2022-01-21 | 维他利肤(北京)生物科技有限公司 | 一种干细胞零蛋白培养基及干细胞生长因子的制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101065480A (zh) * | 2004-10-29 | 2007-10-31 | 巴克斯特国际公司 | 用于细胞培养的无动物蛋白培养基 |
| CN101360820A (zh) * | 2006-01-04 | 2009-02-04 | 巴克斯特国际公司 | 无寡肽的细胞培养基 |
| CN101724600A (zh) * | 2009-11-30 | 2010-06-09 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种支持cho细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基 |
| CN105143444A (zh) * | 2013-03-15 | 2015-12-09 | 瑞泽恩制药公司 | 无血清细胞培养基 |
| CN105985926A (zh) * | 2015-03-06 | 2016-10-05 | 王玉 | 一种用于cho细胞培养的无血清培养基 |
| CN106190950A (zh) * | 2016-07-01 | 2016-12-07 | 北京双鹭药业股份有限公司 | 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其制备方法 |
-
2016
- 2016-12-13 CN CN201611146673.3A patent/CN106635953B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101065480A (zh) * | 2004-10-29 | 2007-10-31 | 巴克斯特国际公司 | 用于细胞培养的无动物蛋白培养基 |
| CN101360820A (zh) * | 2006-01-04 | 2009-02-04 | 巴克斯特国际公司 | 无寡肽的细胞培养基 |
| CN101724600A (zh) * | 2009-11-30 | 2010-06-09 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种支持cho细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基 |
| CN105143444A (zh) * | 2013-03-15 | 2015-12-09 | 瑞泽恩制药公司 | 无血清细胞培养基 |
| CN105985926A (zh) * | 2015-03-06 | 2016-10-05 | 王玉 | 一种用于cho细胞培养的无血清培养基 |
| CN106190950A (zh) * | 2016-07-01 | 2016-12-07 | 北京双鹭药业股份有限公司 | 一种cho细胞无血清无蛋白培养基及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 郑惠惠等: "CHO细胞表达系统研究", 《生物技术进展》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018224673A1 (en) | 2017-06-08 | 2018-12-13 | Zaklady Farmaceutyczne Polpharma S.A. | Improved methods of cell culture |
| US20200199525A1 (en) * | 2017-06-08 | 2020-06-25 | Polpharma Biologics S.A. | Improved Methods of Cell Culture |
| CN107603941A (zh) * | 2017-09-14 | 2018-01-19 | 丙申南京网络技术有限公司 | 一种高效能血清添加剂及其制备方法和使用方法 |
| CN107502592A (zh) * | 2017-10-13 | 2017-12-22 | 江苏省肿瘤医院 | 一种免疫细胞无血清培养基及其制备方法 |
| CN110894487A (zh) * | 2019-12-23 | 2020-03-20 | 新乡医学院 | 一种无血清无蛋白cho细胞培养基及其制备方法、应用 |
| CN111304149A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-06-19 | 新乡医学院 | 一种支持hek293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其制备方法和应用 |
| CN111304149B (zh) * | 2020-02-21 | 2022-07-05 | 新乡医学院 | 一种支持hek293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其制备方法和应用 |
| CN113957042A (zh) * | 2020-07-20 | 2022-01-21 | 维他利肤(北京)生物科技有限公司 | 一种干细胞零蛋白培养基及干细胞生长因子的制备方法 |
| CN112852730A (zh) * | 2021-02-01 | 2021-05-28 | 河南省遗传资源细胞库有限公司 | 一种基于car技术的cart-20细胞扩增培养方法 |
| CN113913368A (zh) * | 2021-10-12 | 2022-01-11 | 浙江省立同德医院 | 适合cho细胞大规模悬浮扩增培养的无血清培养基及其制备和应用 |
| CN113817666A (zh) * | 2021-10-13 | 2021-12-21 | 无锡多宁生物科技有限公司 | 一种全悬浮培养bhk-21细胞的cd培养基及其摇瓶培养工艺 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106635953B (zh) | 2021-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106635953A (zh) | 无血清无蛋白细胞培养基 | |
| CN105018416B (zh) | 一种悬浮培养bhk-21细胞的无血清无动物源培养基及其配制方法 | |
| US4533637A (en) | Culture medium | |
| CN109337861B (zh) | 一种支持产物高表达的cho细胞无血清培养基 | |
| CN100362098C (zh) | 适用于多种动物细胞大规模培养的无血清培养基 | |
| CN106399224A (zh) | 无血清无蛋白细胞培养基 | |
| CN102827804B (zh) | 适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基及方法 | |
| CN101974481A (zh) | 一种用于多种肾脏组织来源细胞生长的无血清培养基 | |
| CN101418330B (zh) | 适于nso细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基 | |
| PT2213725E (pt) | Meios sem proteína animal para cultivo de células | |
| KR101594046B1 (ko) | 개선된 배양 배지 첨가제 및 이를 이용한 방법 | |
| CN1962857A (zh) | 一种哺乳动物细胞无血清培养基 | |
| CN107460159A (zh) | 无血清、无蛋白补料培养基及其制备方法和运用 | |
| CN105255810A (zh) | 一种适合昆虫细胞Sf-9的无血清无动物源培养基 | |
| CN101988047A (zh) | 一种低成本的昆虫细胞无血清培养基 | |
| CN110894487B (zh) | 一种无血清无蛋白cho细胞培养基及其制备方法、应用 | |
| CN101195817A (zh) | 一种杂交瘤细胞扩增培养基及其用途 | |
| CN105861415A (zh) | 用于昆虫细胞悬浮培养的无血清培养基及其应用 | |
| EP0659880A1 (en) | Medium for culturing animal cells or antibody-producing cells | |
| CN102021139A (zh) | 一种中国仓鼠卵巢细胞培养基及其制备方法和应用 | |
| CN105567628B (zh) | 一种全悬浮培养mdck细胞的低血清培养基 | |
| WO2001016294A2 (en) | Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions | |
| CN106754634A (zh) | 一种无血清培养基及其制备方法 | |
| CN105462911B (zh) | 用于培养病毒的无血清培养液及其制备方法 | |
| CN109628411B (zh) | 一种fmd抗原增强培养基及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |