CN105143444A - 无血清细胞培养基 - Google Patents

Abstract

本说明书描述一种改良的无血清动物细胞培养基，其可以用于产生目的蛋白。可以向无血清培养基或化学确定的培养基添加鸟氨酸或者鸟氨酸和腐胺的组合，以改善活细胞密度、减少细胞加倍时间和增加目的蛋白产生。

Description

无血清细胞培养基

技术领域

本发明涉及用于培养细胞和用于产生重组蛋白的培养基。本发明特别地涉及培养用于产生蛋白质生物治疗药的重组CHO细胞的无血清培养基。

背景技术

包含血清或蛋白质水解物组分(即，蛋白胨和胰蛋白胨)的细胞培养基具有用于从培养的细胞生产重组蛋白的漫长历史。这些组分含有生长因子和广泛类型的有益于细胞生长和培养的其他未表征要素。但是，它们还含有减少生长或否则不利影响重组蛋白生产的未表征要素。它们也可能是不受欢迎的潜在变异源。尽管它们有缺点，但是使用血清和水解物的益处已经超过某些缺点，并且它们已经广泛使用于许多细胞培养应用中。

人生物治疗药(生物药物)通常在哺乳动物细胞培养物、尤其CHO细胞培养物中产生。对于制造人用生物药物而言，未表征或部分表征的组分在这些细胞培养物中的存在高度不利。使用这类未表征的或部分表征的组分不仅引入生产和监管不相符性，它还带来病毒或真菌性感染生产培养物的可能性。

减少药品产生和组成的批次间变异性是选择培养过程中的另一个重要因素。血清、水解物和其他未确定的要素在生物制药生产批次的产率、组成和质量方面引入变异性。培养基要素的质量和纯度还可能影响产率，因为药物滴度经常部分地依赖于维持特定的养分平衡。在养分的相对量在一个培养基批次与另一个培养基批次间变动的情况下，药物产率可能变动并且这种变异可能不可接受或不经济。

使用含血清或基于水解物的培养基引入下游加工难题。培养物中所需生物制药的浓度通常在克/升级别。培养基中血清和水解物的存在可能增加超过10g/L的未表征肽和蛋白质，后者必须在后续加工步骤中移除。血清和水解物还可能在培养基中引入金属和其他微量元素数量的变异性。从培养基消除血清和水解物因此消除这些变异和生产和加工原料药的潜在障碍。

连同其他，使用无血清培养基和无水解物培养基的益处包括降低成本、减少药物批次间变异和最大限度降低从未确定和未精制的组分引入外源因子的风险。另外，在培养基在成批生产之间确定和均匀的情况下，可能最大限度地减少针对当前培养基而检验新培养基批次的资格确认性运行。因此，本领域需要用于培养哺乳动物细胞的培养基，其中该培养基是化学确定的并且不含血清和水解物，或是无血清的并且含有可管理的低水平水解物，然而允许健康和稳健的细胞生长和维持以及生物药物原料药的高滴度产生。

发明简述

发明人已经令人惊讶地发现在具有或没有腐胺的情况下在不含血清的细胞培养基(“OS”培养基)中包含鸟氨酸增加了细胞生存力和密度、减少细胞加倍时间并允许这些细胞产生高滴度蛋白质。发明人也已经发现含有少量或痕量蛋白质水解物或化学上确定(即，不含蛋白质水解物)的OS培养基尤其提供恢复的细胞生存力和密度、细胞加倍时间和高滴度蛋白质产量。

在一个方面，本发明提供无血清并且包含至少0.09mM±0.014mM鸟氨酸的细胞培养基。在一个实施方案中，鸟氨酸在培养基中以0.09±0.014mM至0.9±0.14mM的浓度存在，如0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.09mM或0.9±0.14mM鸟氨酸。在一些实施方案中，培养基还含有至少0.20±0.03mM腐胺。在一些实施方案中，额外的腐胺以0.20±0.03mM至0.714±0.11mM的浓度存在，如0.20±0.03mM、0.35±0.06mM或0.714±0.11mM腐胺。在一些实施方案中，培养基含有≤7.5g/L水解物。在一些实施方案中，培养基不含任何水解物。

在一个实施方案中，培养基含有化学确定的基础培养基，如订制制剂或市售基础培养基。在一个实施方案中，完整培养基是化学确定的，不含血清并且不含水解物。

在一些实施方案中，培养基在其可用浓度(即，1X)含有至少40±6mM或至少70±10.5mM的氨基酸或氨基酸盐混合物。在一个实施方案中，培养基含有至少40mM氨基酸混合物。在这个或另一个实施方案中，培养基含有至少70mM氨基酸混合物。在一个实施方案中，氨基酸的混合物(值得注意的例外是谷氨酰胺，它可以作为现场使用添加物再次添加至培养基)含有丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

在一些实施方案中，培养基含有一种或多种脂肪酸。在一个具体的实施方案中，培养基含有脂肪酸(或脂肪酸衍生物)混合物和α生育酚。脂肪酸或脂肪酸衍生物选自亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、酸、月桂酸、山萮酸、十烷酸、十二烷酸、己酸、木蜡酸、肉豆蔻酸和辛酸。

在一些实施方案中，培养基含有核苷混合物。在一个实施方案中，培养基含有腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤。

在一些实施方案中，培养基含有盐的混合物。盐包含二价阳离子，如钙和镁。在一个实施方案中，培养基含有氯化钙和硫酸镁。其他盐可以包括磷酸盐类。

在一个具体实施方案中，培养基(1)含有≤7.5g/L的水解物，(2)无血清，(3)含有0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.09mM或0.9±0.14mM鸟氨酸，(4)任选地额外含有0.20±0.03mM、0.35±0.06、或0.714±0.11mM腐胺、(5)含有至少约40mM或至少约70mM氨基酸混合物，所述氨基酸混合物包含丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸，(6)含有生育酚和脂肪酸混合物，(7)含有核苷混合物，所述核苷混合物包含腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤，并且(8)含有钙盐、镁盐和磷酸盐。

在另一个方面，本发明提供一种在细胞培养基如在前述方面描述的培养基的任何实施方案中培育细胞的方法。在一个实施方案中，该方法采用在培养基中增殖或维持细胞或多个细胞的步骤，所述培养基(1)含有≤7.5g/L水解物，或不含水解物，(2)不含血清，(3)以至少0.09mM±0.014mM的浓度含有鸟氨酸，(4)并且任选地含有腐胺，如至少0.20±0.03mM腐胺。

在一些实施方案中，细胞或多个细胞是哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞。在一个实施方案中，细胞是可用于产生重组蛋白的哺乳动物细胞，如CHO细胞或衍生物CHO-K1。在一些实施方案中，细胞表达目的蛋白，如生物治疗药蛋白。生物治疗药蛋白可以是抗原结合蛋白，其可以含有Fc结构域。在一些实施方案中，目的蛋白是受体-Fc-融合蛋白，如ScFv分子或捕捉分子。捕捉分子包括VEGF捕捉蛋白和IL-1捕捉蛋白。在一些实施方案中，目的蛋白是抗体，如人源化单克隆抗体、双特异性抗体或抗体片段。

鉴于无血清培养基中包含鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺组合对细胞生长的积极影响，根据这种方法培养的细胞具有不多于30小时的平均加倍时间。在一个实施方案中，细胞加倍时间不多于24小时。在一个实施方案中，与相比含有小于0.09±0.014mM鸟氨酸(或小于0.09±0.014mM鸟氨酸和小于0.2±0.03mM腐胺)的培养基中的细胞生长时，根据这种方法培养的细胞具有下述平均加倍时间，所述平均加倍时间是对比对照培养物加倍时间的至少三分之一。

同样地，在无血清培养基中包含单一鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺组合允许培养的细胞达到比不包含鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺组合情况下更高的活细胞计数密度。在一个无血清和无水解物的OS培养基实施方案中，细胞培养物能够达到比含有小于0.09±0.014mM鸟氨酸(或小于0.09±0.014mM鸟氨酸和小于0.2±0.03mM腐胺)的相似细胞培养基中相似细胞培养物大至少15％的活细胞计数密度。在另一个无血清和无水解物的OS培养基实施方案中，细胞培养物能够达到比含有小于0.09±0.014mM鸟氨酸(或小于0.09±0.014mM鸟氨酸和小于0.2±0.03mM腐胺)的相似细胞培养基中相似细胞培养物大至少3倍的活细胞计数密度。

在另一个实施方案中，该方法包括向细胞培养基添加一种或多种现场使用添加物的步骤。在一些实施方案中，现场使用添加物是以下任一种或多种：NaHCO₃、谷氨酰胺、胰岛素、葡萄糖、CuSO₄、ZnSO₄、FeCl₃、NiSO₄、Na₄EDTA和Na₃柠檬酸。在一个实施方案中，该方采用向细胞培养基添加以下每种现场使用化学品的步骤：NaHCO₃、谷氨酰胺、胰岛素、葡萄糖、CuSO₄、ZnSO₄、FeCl₃、NiSO₄、Na₄EDTA和Na₃柠檬酸。在一些实施方案中，现场使用添加物可以在一开始包含于培养基中。

在一个具体实施方案中，该方面提供一种在无血清培养基中培育细胞的方法，所述无血清培养基含有(1)0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.09mM或0.9±0.14mM的鸟氨酸；(2)任选地额外含有0.20±0.03mM、0.35±0.06mM或0.714±0.11mM腐胺；(3)至少约40mM或至少约70mM氨基酸混合物，所述氨基酸混合物包含丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸酸、甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，和缬氨酸；(4)生育酚和脂肪酸混合物；(6)包含腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤的核苷混合物，和(9)钙盐、镁盐和磷酸盐，其中根据这种方法培养的细胞具有这样的平均加倍时间，所述平均加倍时间不多于24小时或是对比对照培养物的加倍时间的至少三分之一；并且细胞培养能够达到比含有小于0.09±0.015mM鸟氨酸(或小于0.09±0.014mM鸟氨酸和小于0.2±0.03mM腐胺)的相似细胞培养基中的相似细胞培养物大至少15％或大至少3倍的活细胞计数密度。在另一个实施方案中，细胞培养物能够达到比含有小于0.09±0.014mM鸟氨酸(或小于0.09±0.014mM鸟氨酸和小于0.2±0.03mM腐胺)的相似细胞培养基中相似细胞培养物大至少3倍的活细胞计数密度。在一个实施方案中，培养基含有≤7.5g/L水解物；并在另一个实施方案中，不含水解物。

在另一个方面，本发明提供一种通过使用以下步骤产生目的蛋白的方法：(1)向细胞中引入编码目的蛋白的核酸序列；(2)选择携带该核酸序列的细胞；(3)在第一方面描述的无血清细胞培养基的一个实施方案中或根据在第二方面描述的方法的任何实施方案培养选择的细胞；和(4)在细胞中表达目的蛋白，其中目的蛋白分泌入培养基中。在一些实施方案中，在产生蛋白质中使用的细胞是能够产生生物治疗药的哺乳动物细胞，如CHO、293和BHK细胞或其任何衍生物。在一个实施方案中，细胞是CHO细胞，如CHO-K1细胞。

在一些实施方案中，目的蛋白是抗原结合蛋白。在一些实施方案中，目的蛋白是具有Fc结构域的蛋白质。在一些情况下，这两种目的蛋白可以重叠，如例如在受体-Fc-融合蛋白、抗体和ScFv蛋白的情况下。因此，在一些实施方案中，目的蛋白是抗体，如人抗体或人源化抗体、抗体片段，如Fab或F(ab’)₂、双特异性抗体、捕捉分子，如VEGF-捕捉分子或IL-1-捕捉分子、ScFv分子、可溶性TCR-Fc融合蛋白等。

在一个实施方案中，目的蛋白能够按这样的平均7日滴度产生，所述平均7日滴度至少7％大于、至少14％大于、至少80％大于、至少2倍大于或至少3倍大于含有小于0.09±0.014mM鸟氨酸(或小于0.09±0.014mM鸟氨酸和小于0.2±0.03mM腐胺)的无血清细胞培养基(“无OS”培养基)中通过相似细胞产生的平均7日滴度。

在一个具体实施方案中，通过以下方式产生目的蛋白：(1)向CHO细胞中引入编码目的蛋白(如抗体或其他抗原结合蛋白)的核酸序列；(2)选择携带该核酸序列的细胞；(3)在无血清细胞培养基中培养选择的细胞，所述无血清细胞培养基含有(a)0.09±0.014，0.3±0.05mM、0.6±0.09mM或0.9±0.14mM鸟氨酸；(b)任选地额外含有0.20±0.03mM、0.35±0.06mM或0.714±0.11mM腐胺；(c)至少40mM或至少70mM氨基酸混合物，所述氨基酸混合物包含丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；(d)生育酚和脂肪酸混合物；(e)包含腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤的核苷混合物，和(f)钙盐、镁盐和磷酸盐，和(d)在CHO细胞中表达目的蛋白，其中目的蛋白分泌入培养基中。在一些实施方案中，无血清细胞培养基可以包含≤7,5g/L水解物；或在其他实施方案中根本不含水解物。

详细描述

申请人已经令人惊讶地发现，相对于含有很少鸟氨酸或不含鸟氨酸或含有很少鸟氨酸和腐胺组合或不含鸟氨酸和腐胺组合的无血清培养基(“无OS培养基”)，添加鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺组合(“OS培养基”)改善细胞培养物中的活细胞密度、细胞加倍时间和细胞的蛋白质产生。

在描述本发明的细胞培养物和方法之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文中所用的术语其目的仅在于描述具体实施例，并且不意图是限制性的。

除非另外定义，否则本申请中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本申请中所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料可以用于实施或检验本发明，然而现在描述某些具体方法和材料。单位、前缀和符号可以按其SI接受的形式表示。本文中描述的数字范围是开放式的，意指它们包括限定该范围的数字。除非另外指出，否则术语“一个”或“一种”应解释为含义“至少一个(一种)”。本文所用的章节标题仅出于组织目的并且不得解释为限制所描述的主题。除非另外说明，否则本文所述的方法和技术通常根据本领域已知和如本说明书通篇范围内引用及讨论的多种普通和更具体参考文献中所述的常规方法进行。参见例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)以及Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992),Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1990),以及JulioE.Celis,CellBiology:ALaboratoryHandbook,第2版,AcademicPress,NewYork,N.Y.(1998),以及Dieffenbach和Dveksler,PCRPrimer:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1995)。本公开自始至终提到的全部出版物通过引用方式完整并入本文。

定义

如本文所用，“肽”、“多肽”和“蛋白质”自始至终互换使用并指分子包含彼此通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基。肽、多肽和蛋白质还可以包含修饰如糖基化、脂质接合、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ-羧化、烷基化、羟化和ADP-核糖基化。肽、多肽和蛋白质可以具有科学意义或商业意义，包括基于蛋白质的药物。肽、多肽和蛋白质包含抗体和嵌合或融合蛋白，连同其它。使用细胞培养方法，通过重组动物细胞系产生肽、多肽和蛋白质。

如本文所用，术语“异源多核苷酸序列”指编码作为生物制药原料药产生的目的蛋白如嵌合蛋白(如捕捉分子)、抗体或抗体部分(例如，VH、VL、CDR3)的核酸聚合物。异源多核苷酸序列可以通过基因工程技术(例如，如编码嵌合蛋白的序列或密码子优化序列、无内含子序列等)制造并引入细胞中，在那里它可以作为附加体驻留或整合入细胞的基因组。异源多核苷酸序列可以是引入生产细胞基因组内部的异位位点中的天然存在序列。异源多肽序列可以是来自另一种生物的天然存在序列，如编码人直向同源物的序列。

“抗体”指由4条多肽链(由二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链(L))组成的免疫球蛋白分子。每条重链具有一个重链可变区(HCVR或VH)和一个重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链具有一个轻链可变区和一个轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH和VL区可以进一步再划分为超变区，名为互补性决定区(CDR)，其间插有更保守的区域，名为构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括对任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白的称谓。术语“抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体分子，如从经转染以表达该抗体的宿主细胞分离的抗体。术语抗体还包括双特异性抗体，所述双特异性抗体包括可以与多于一个不同表位结合的异四聚体免疫球蛋白。双特异性抗体总体上在美国专利申请公开号2010/0331527中描述，所述专利申请通过引用的方式并本申请。

术语抗体(或“抗体片段”)的“抗原结合部分”指抗体中保留与抗原特异性结合的能力的一个或多个片段。在术语抗体的“抗原结合部分”内部所包括的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature241:544-546)；和(vi)分离的CDR，和(vii)由Fv片段的两个结构域VL和VH组成的scFv，所述两个结构域由合成性接头连接以形成其中VL区和VH区配对以形成单价分子的单条蛋白链。术语“抗体”下还涵盖其他形式的单链抗体，如双抗体(参见例如，Holliger等人,(1993)PNASUSA90:6444-6448；Poljak等人,(1994)Structure2:1121-1123)。

此外，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽共价或非共价缔合所形成的较大免疫黏附分子的部分。此类免疫黏附分子的例子包括链霉亲和素核心区域产生四聚体scFv分子的用途(Kipriyanov等人(1995)HumanAntibodies和Hybridomas6:93-101)和半胱氨酸残基、标记肽和C端多组氨酸标签产生双价和生物素酰化scFv分子的用途(Kipriyanov等人(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)。可以使用常规技术(如通过木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体)从完整抗体制备抗体部分，如Fab和F(ab')₂片段。另外，可以使用本领域共知标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫黏附分子(参见Sambrook等人,1989)。

术语“人抗体”意在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括，例如在CDR和尤其CDR3中包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不意在包括其中已经将从另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系衍生的CDR序列移植到人构架序列上的抗体。

如本文所用，术语“重组人抗体”意在包括通过重组手段所制备、表达、产生或分离的全部人抗体，如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组人抗体组合文库分离的抗体、从相对于人免疫球蛋白基因而言转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(见例如，Taylor等人,(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段所制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体经历体外诱变(或，使用相对于人Ig序列为转基因的动物时，经历体内体细胞诱变)并且因此重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列是尽管衍生自人种系V_H和V_L序列并且与之相关，但可能在体内人抗体种系库内部不天然存在的序列。

“Fc融合蛋白”包含本来在自然界中并不一起存在的两种或更多种蛋白质的部分或全部，所述部分之一是免疫球蛋白分子的Fc部分。包含与抗体衍生多肽的各种部分(括Fc结构域)融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备已经例如由Ashkenazi等人,Proc.Natl.Acad.ScLUSA88:10535,1991；Byrn等人,Nature344:677,1990；以及Hollenbaugh等人,"ConstructionofImmunoglobulinFusionProteins",引自CurrentProtocolsinImmunology,Suppl.4,第10.19.1-10.19.11页,1992描述。“受体Fc融合蛋白”包含与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域，所述胞外结构域在一些实施方案中包含铰链区，后续免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc-融合蛋白含有与一种或多种配体结合的两条或更多条不同受体链。例如，Fc-融合蛋白是一种捕捉蛋白，如例如IL-1捕捉蛋白(例如，利洛西普，其含有与IL-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体结合区，所述IL-1R1胞外区与hIgG1的Fc融合；参见美国专利号6927004)，或VEGF捕捉蛋白(例如，阿柏西普(aflibercept)，其含有与VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2，所述Ig结构域3与hIgG1的Fc融合；参见美国专利号7,087,411和7279159)。

培养基

本发明提供可用于培养细胞和产生生物制药原料药的无血清培养基。“无血清”适用于不含有动物血清如胎牛血清的细胞培养基。无血清培养基可以含有≤7.5g/L的水解物，如大豆水解物。本发明还提供化学确定的培养基，所述培养基不仅无血清，而且还无水解物。“无水解物”适用于不含外源蛋白质水解物(如动物或植物蛋白水解物，例如蛋白胨、胰蛋白胨等)的细胞培养基。

从细胞培养基消除血清以及减少或消除水解物，尽管减少批间变异性并强化下游加工步骤，但遗憾地削弱细胞生长、生存力和蛋白质表达。因此，化学确定的无血清和低水解物或无水解物培养基需要额外成分以改善细胞生长和蛋白质产生。本发明的细胞培养基可以补充有额外成分如多胺或浓度增加的组分如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲剂、抗生素、脂质、微量元素等，这取决于待培养细胞的要求或所需的细胞培养参数。具体而言，细胞培养基这里补充有鸟氨酸，腐胺或这两者(“OS培养基”)以改善细胞生长、细胞生存力和重组蛋白产生。

在一些实施方案中，OS培养基以至少约90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、540、545、550、555、560、565、568、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、620、625、630、635、640、645、650、700、750、800、850或900μΜ的浓度(以微摩尔/升表述)含有鸟氨酸。

在一些实施方案中，培养基以约85、90、95、100、105、110、113或115μM的浓度含有鸟氨酸。在一个实施方案中，培养基含有100μM±15μM鸟氨酸。在一个实施方案中，培养基含有15mg/L±2.25mg/L鸟氨酸·HCl。

在一些实施方案中，培养基以约255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340或345μM的浓度含有鸟氨酸。在一个实施方案中，培养基含有300μM±45μM鸟氨酸。在一个实施方案中，培养基含有50mg/L±7.5mg/L鸟氨酸·HCl。

在一些实施方案中，培养基以约510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685或690μM的浓度含有鸟氨酸。在一个实施方案中，培养基含有600μM±90μM鸟氨酸。在一个实施方案中，培养基含有100mg/L±15mg/L鸟氨酸·HCl。

在一些实施方案中，培养基以765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、1,000、1,005、1,010、1,015、1,020、1,025、1,030、或1,035μM的浓度含有鸟氨酸。在一个实施方案中，培养基含有900μM±135μM鸟氨酸。在一个实施方案中，培养基含有150mg/L±22.5mg/L鸟氨酸·HCl。

腐胺可以任选地添加至补充有鸟氨酸的培养基。在一些细胞培养基配方中已经以很低浓度包含腐胺作为组分；参见例如WO2005/028626，其描述了0.02-0.08mg/L腐胺；美国专利号5,426,699(0.08mg/L)；美国专利号RE30,985(0.16mg/L)；美国专利号5811299(0.27mg/L)；美国专利号5,122,469(0.5635mg/L)；美国专利号5063157(1mg/L)；WO2008/154014(约100μΜ-～1000μΜ)；美国专利申请号2007/0212770(0.5–30mg/L多胺；2mg/L腐胺；2mg/L腐胺+2mg/L鸟氨酸；2mg/L腐胺+10mg/L鸟氨酸)。

在一些实施方案中，培养基含有鸟氨酸和腐胺组合，其中腐胺可以处于至少约150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、260、365、370、375、380、385、390、395、400、405或410μM的浓度。

在一些实施方案中，培养基以约170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225或230μM的浓度含有腐胺。在一个实施方案中，除≥90μM±14μM鸟氨酸之外，培养基还含有200μM±30μM腐胺。在一个实施方案中，除≥15mg/L±2.25mg/L鸟氨酸·HCl之外，培养基还含有30mg/L±4.5mg/L腐胺·2HCl。

在一些实施方案中，培养基以约295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400或405μM的浓度含有腐胺。在一个实施方案中，除≥90μM±14μM鸟氨酸之外，培养基还含有350μM±52.5μM腐胺。在一个实施方案中，除≥15mg/L±2.25mg/L鸟氨酸·HCl之外，培养基还含有57mg/L±8.55mg/L腐胺·2HCl。

在一些实施方案中，培养基以约595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800或805μM的浓度含有腐胺。在一个实施方案中，除≥90μM±14μM鸟氨酸之外，培养基还含有714μM±105μM腐胺。在一个实施方案中，除≥15mg/L±2.25mg/L鸟氨酸·HCl之外，培养基还含有115mg/L±17.25mg/L腐胺·2HCl。

在一些实施方案中，培养基含有任何浓度的腐胺和上文所列鸟氨酸的配对组合。在一些实施方案中，培养基含有约595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800或805μM腐胺和约510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685或690μM鸟氨酸的任何配对组合。例如在一个实施方案中，培养基含有约700μΜ腐胺加510、511、512μΜ(以下参照)鸟氨酸任一者；或701μΜ腐胺加510、511、512μΜ(以下参照)鸟氨酸任一者等。还例如在一个实施方案中，培养基含有约600μΜ鸟氨酸加700、701、702μΜ(以下参照)腐胺任一者；或601μΜ鸟氨酸加700、701、702μΜ(以下参照)腐胺任一者等。在一些实施方案中，培养基含有702μΜ±106μM腐胺+593μΜ±89μM鸟氨酸。在一个具体实施方案中，培养基含有约714μΜ腐胺和593μΜ鸟氨酸。在一个实施方案中，培养基含有115mg/L±17mg/L腐胺·2HCl和100mg/L±15mg/L鸟氨酸·HCl。在一个具体实施方案中，培养基含有115mg/L腐胺·2HCl和100mg/L鸟氨酸·HCl。

在一个实施方案中并且除包含鸟氨酸或腐胺之外，培养基以至少50μΜ、至少60μΜ、至少70μΜ、至少80μΜ、至少90μΜ、至少100μΜ、至少110μΜ、至少115μΜ、至少120μΜ、至少125μΜ、至少130μΜ、至少135μΜ、至少140μΜ、至少145μΜ、至少150μΜ、至少155μΜ、至少160μΜ、至少165μΜ或至少170μΜ的累积浓度含有核苷混合物。在一个实施方案中，培养基含有约174μΜ±26μΜ核苷。在一个实施方案中，培养基以至少40μΜ、至少45μΜ、至少50μΜ、至少55μΜ、至少60μΜ、至少65μΜ、至少70μΜ、至少75μΜ、至少80μΜ、至少85μΜ、至少90μΜ、至少95μΜ、至少100μΜ或至少105μΜ的累积浓度含有嘌呤衍生物。在一个实施方案中，培养基含有约106μΜ±5μΜ的嘌呤衍生物。嘌呤衍生物包含次黄嘌呤和核苷腺苷和鸟苷。在一个实施方案中，培养基以至少30μΜ、至少35μΜ、至少40μΜ、至少45μΜ、至少50μΜ、至少55μΜ、至少60μΜ或至少65μΜ的累积浓度含有嘧啶衍生物。在一个实施方案中，培养基含有约68μΜ±5μΜ的嘧啶衍生物。嘧啶衍生物包括核苷胸苷、尿苷和胞苷。在一个具体实施方案中，培养基含有腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤。

除包含鸟氨酸或腐胺之外，在一个实施方案中，培养基还以至少40mM的累积浓度含有氨基酸，其中计算累积性总量时不包括谷氨酰胺的量。在一个实施方案中，谷氨酰胺不包括于培养基中，但是可以在培养细胞期间如在产生蛋白质期间作为“现场使用添加物”供应给培养基。因此，在一些实施方案中，如在培养细胞的方法或产生目的蛋白的方法中，培养基可以补充有作为现场使用添加物的谷氨酰胺。在这样一个实施方案中，谷氨酰胺以小于约40mΜ、小于约35mΜ、小于约30mΜ、小于约25mΜ、小于约20mΜ、小于约15mΜ、小于约10mΜ、小于约8mΜ、小于约7mΜ、小于约6mΜ、小于约5mΜ、小于约4mΜ、小于约3mΜ，或小于约2.5mΜ的量添加。在一个实施方案中，谷氨酰胺在补充有谷氨酰胺的培养基中的量是约2mΜ±0.5mΜ。

在一个实施方案中，除包含鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺二者组合之外，培养基还含有浓度为至少15mM、至少24mΜ、至少25mΜ、至少26mΜ、至少27mΜ、至少28mΜ、至少29mΜ或至少30mΜ的具有非极性侧基团的氨基酸。在一个实施方案中，培养基含有约30mΜ的具有非极性侧基团的氨基酸。在一个实施方案中，培养基内部以摩尔计所含的氨基酸的总量当中，至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％或至少41％是具有非极性侧基团的氨基酸。在一个实施方案中，培养基中以摩尔计约42％±1％的氨基酸是具有非极性侧基团的氨基酸。具有非极性侧基团的氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。

在一个实施方案中，除包含鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺二者组合之外，培养基还含有浓度为约10mΜ至34mΜ、约11mΜ至33mΜ、约12mΜ至32mM、约13mΜ至31mM、约14mM至30mM、约15mM至29mΜ、约16mΜ至28mΜ、约17mΜ至27mΜ、约18mΜ至26mΜ、约19mΜ至25mΜ、约20mΜ至24mΜ、约21mΜ至23mΜ或约22mΜ具有不带电荷极性侧基团的氨基酸。在一个实施方案中，培养基含有约22mΜ具有不带电荷极性侧基团的氨基酸。在另一个实施方案中，培养基含有约12mM具有不带电荷极性侧基团的氨基酸。在一个实施方案中，培养基内部以摩尔计所含的氨基酸的总量当中，约14％至46％、约15％至45％、约16％至44％、约17％至43％、约18％至42％、约19％至41％、约20％至40％、约21％至39％、约22％至38％、约23％至37％、约24％至36％、约25％至35％、约26％至34％、约27％至33％、约28％至32％、约29％至31％、或约30％是具有不带电荷极性侧基团的氨基酸。在一个实施方案中，培养基中以摩尔计约30％±3％的氨基酸是具有不带电荷极性侧基团的氨基酸。具有不带电荷极性侧基团的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。

在一个实施方案中，除包含鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺二者组合之外，培养基还含有浓度为约4mΜ至14mΜ、约5mΜ至13mΜ、约6mΜ至12mM、约7mΜ至11mM、约8mM至10mM、约9mΜ或约4mM在pH6具有负电荷的氨基酸(即，酸性氨基酸)。在一个实施方案中，培养基含有约9mΜ酸性氨基酸。在一个实施方案中，培养基含有9mΜ±1mΜ酸性氨基酸。在一个实施方案中，培养基内部以摩尔计所含的氨基酸的总量当中，约8％至18％、约9％至17％、约10％至16％、约11％至15％、约12％至14％或约13％是酸性氨基酸。在一个实施方案中，培养基中以摩尔计约12.6％±1％的氨基酸是酸性氨基酸。酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

在一个实施方案中，除包含鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺二者组合之外，培养基还含有浓度为至少3.5mΜ、至少4mΜ、至少5mΜ、至少6mΜ、至少7mΜ、至少8mΜ、至少9mΜ、至少10mΜ或至少11mΜ在pH6具有正电荷的氨基酸(即，碱性氨基酸)。在一个实施方案中，培养基含有约11mΜ碱性氨基酸。在一个实施方案中，培养基含有约11.42mΜ±1mΜ碱性氨基酸。在一个实施方案中，培养基内部以摩尔计所含的氨基酸的总量当中，至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％或至少15％是碱性氨基酸。在一个实施方案中，培养基中以摩尔计约16％的氨基酸是碱性氨基酸。在一个实施方案中，培养基中以摩尔计约15.8％±2.4％的氨基酸是碱性氨基酸。在一个实施方案中，培养基中以摩尔计约21％±3.2％的氨基酸是碱性氨基酸。碱性氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

在一个实施方案中，除包含鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺二者组合之外，培养基还含有约30mΜ非极性氨基酸、约22mΜ不带电荷极性氨基酸、约9mΜ酸性氨基酸和约11mΜ碱性氨基酸。在一个实施方案中，培养基中的氨基酸中以摩尔计约42％是非极性氨基酸，以摩尔计约30％是不带电荷的极性氨基酸，以摩尔计约13％是酸性氨基酸并且以摩尔计约16％是碱性氨基酸。

除包含鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺二者组合之外，在一个实施方案中，培养基含有微摩尔量的脂肪酸(或脂肪酸衍生物)和生育酚。在一个实施方案中，脂肪酸包括以下任一者或多者：亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、花生四烯酸、月桂酸、山萮酸、十烷酸、十二烷酸、己酸、木蜡酸、肉豆蔻酸和辛酸。在一个实施方案中，培养基含有生育酚、亚油酸和硫辛酸。

在一个实施方案中，培养基还含有维生素的混合物，所述混合物按至少约700μM或至少约2mM累积浓度包含其他养分和必需养分。在一个实施方案中，维生素的混合物含有以下一者或多者：D-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、HCl吡多醇、D-泛酸(hemiCa)、核黄素、HCl硫胺素、维生素B12等。在一个实施方案中，维生素的混合物含有以下全部：D-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、HCl吡多醇、D-泛酸(hemiCa)、核黄素、HCl硫胺素和维生素B12。

本发明培养基的多种实施方案包括上述实施方案的任何组合，包括化学确定的、无水解物无血清培养基，所述培养基以所示量包含鸟氨酸或腐胺，尤其外加(a)氨基酸；(b)任选地核苷；(c)二价阳离子的盐；(d)脂肪酸和生育酚；和(e)维生素。在一些实施方案中，全部少量水解物均可以添加至OS培养基。

申请人构思在实施本发明时，可以使用向其添加鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺二者组合的多种基础培养基或其组合的任一者或多者。基础培养基通常是本领域已知的并且尤其包括EagleMEME(极限基本培养基)(Eagle,Science,1955,112(3168):501-504)、Ham’sF12(Ham,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,1965,53:288-293)、F-12K培养基、Dulbecco培养基、Dulbecco改良Eagle培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1952August；38(8):747–752)、DMEM/Ham’sF121:1、Trowell’sT8、A2培养基，Holmes和Wolf,Biophys.Biochem.Cytol.,1961,10:389-401)、Waymouth培养基(Davidson和Waymouth,Biochem.J.,1945,39(2):188–199)、WilliamsE培养基(William’s等人,Exp.CellRes.,1971,69:105，参照以下)、RPMI1640(Moore等人,J.Amer.Med.Assoc.,1967,199:519-524)、MCDB104/110培养基(Bettger等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,1981,78(9):5588-5592)、VentrexHL-1培养基、白蛋白-球蛋白培养基(Orr等人,Appl.Microbiol.,1973,25(1):49-54)、RPMI-1640培养基、RPMI-1641培养基、Iscove改良Dulbecco培养基、McCoy's5A培养基、Leibovitz'sL-15培养基和无血清培养基如EX-CELL^TM300系列(JRHBiosciences,Lenexa,Kansas)、鱼精蛋白-锌-胰岛素培养基(Weiss等人,1974,US4,072,565)、生物素-叶酸培养基(Cartaya,1978,USRe30,985)、转铁蛋白-脂肪酸培养基(Baker,1982,US4,560,655)、转铁蛋白-EGF培养基(Hasegawa,1982,US4,615,977；Chessebeuf,1984,US4,786,599)和其他培养基组合(参见Inlow,US6,048,728；Drapeau,US7,294,484；Mather,US5,122,469；Furukawa,US5,976,833；Chen,US6,180,401；Chen,US5,856,179；Etcheverry,US5,705,364；Etcheverry,US7,666,416；Ryll,US6,528,286；Singh,US6,924,124；Luan,US7,429,491等)。

在一个具体实施方案中，培养基是化学确定的并且除含有鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺二者组合之外还含有：CaCl₂2H₂O；HEPES缓冲液，KCl；MgSO₄；NaCl；Na₂HPO₄或其他磷酸盐；丙酮酸；L-丙氨酸；L-精氨酸HCl；L-天冬氨酸H₂O；L-天冬氨酸；L-半胱氨酸HClH₂O；L-谷氨酸；甘氨酸；L-组氨酸HClH₂O；L-异亮氨酸；L-亮氨酸；L-赖氨酸HCl；L-甲硫氨酸；L-鸟氨酸HCl；L-苯丙氨酸；L-脯氨酸；L-丝氨酸；L-苏氨酸；L-色氨酸；L-酪氨酸二钠2H₂O；L-缬氨酸；D-生物素；氯化胆碱；叶酸；肌醇；烟酰胺；HCl吡多醇；D-泛酸；核黄素；HCl硫胺素；维生素B12；ρ-氨基苯甲酸；乙醇胺HCl；PluronicF68；磷酸DL-a-生育酚；亚油酸；Na₂SeO₃；硫辛酸；和葡萄糖；和任选地腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤二钠。

在一个实施方案中，本发明培养基的起始克分子渗透压浓度是200-500、250-400、275-350或约300mOsm。在细胞于本发明培养基中生长期间并且尤其在根据补料分批方案任何进料之后，培养物的克分子渗透压浓度可以增加直到约350、400、450mOsm或高达500mOsm。

在其中确定成分培养基的克分子渗透压浓度小于约300的一些实施方案中，通过添加超过指定量的一种或多种盐使克分子渗透压浓度达到约300mOsm。在一个实施方案中，通过添加选自以下的一种或多种渗压剂：氯化钠、氯化钾、镁盐、钙盐、氨基酸盐、脂肪酸盐、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、作为盐的螯合剂、糖(例如，半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、岩藻糖等)及其组合，将克分子渗透压浓度增加所需的水平。在一个实施方案中，添加渗压剂超过并高于其在确定成分培养基内存在的某组分中的浓度(例如，添加糖超过并高于糖组分的指定浓度)。

上文所述培养基的每种和各个实施方案以及任何其他无血清培养基含有至少约90μM鸟氨酸(或含有至少约100μM鸟氨酸加至少约200μM腐胺的组合)在此称作补充有鸟氨酸(“OS”)的培养基。相反，不含鸟氨酸(或不含鸟氨酸/腐胺组合)的培养基或含有小于100μΜ鸟氨酸的培养基(或含有小于100μM鸟氨酸和小于200μΜ腐胺的培养基)在下文称作未补充由鸟氨酸(“无OS”)的培养基。

细胞培养物

本发明提供细胞培养物，包括在如上文所述的OS培养基中表达目的蛋白的细胞系。在一个实施方案中，细胞培养物含有胰岛素，所述胰岛素可以作为现场使用成分添加至培养基，或可以包含于培养基配方中。在一个实施方案中，细胞系包含能够产生生物治疗药蛋白的细胞。常规用来产生蛋白质生物治疗药的细胞系的例子尤其包括原代细胞、BSC细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞和鸡胚细胞。在一个实施方案中，细胞系是CHO细胞系或为大规模蛋白质生产而优化的几种特殊CHO细胞变体的一者或多者，例如，CHO-K1。

“细胞培养物”或“培养物”意指细胞在多细胞生物或组织外部的生长和增殖。用于哺乳动物细胞的合适培养条件是本领域已知的。参见例如Animalcellculture:APracticalApproach,D.Rickwood编著,OxfordUniversityPress,NewYork(1992)。哺乳动物细胞可以悬浮培养或同时贴附于固体基质。具有或没有微载体并且以分批、补料分批、连续、半连续或灌流模式运行的流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、转瓶、摇瓶或搅拌罐生物反应器可用于哺乳动物细胞培养。可以在培养期间将细胞培养基或浓缩进料培养基连续地或以多种间隔时间添加至培养物。例如，培养物可以每日、每隔一日、每三天补料一次或可以在持续被监测的特定培养基组分的浓度落在所需范围外部时补料。

动物细胞，如CHO细胞，可以按小规模培养法培养，如在具有约25ml培养基的125ml容器、具有约50至100ml培养基的250ml容器，具有约100至200ml培养基的500ml容器中培养。备选地，培养可以是大规模的，如例如在具有约300至1000ml培养基的1000ml容器、具有约500ml至3000ml培养基的3000ml容器、具有约2000ml至8000ml培养基的8000ml容器和具有约4000ml至15000ml培养基的15000ml容器中培养。制造用培养物可以含有10,000L或更多的培养基。大规模细胞培养物(如用于蛋白质治疗药临床生产)，一般维持数天或甚至数周，同时细胞产生所需的蛋白质。在这段时间期间，可以对培养物补充含有培养过程期间被消耗的组分(如养分和氨基酸)的浓缩进料培养基。浓缩进料培养基可以基于任何细胞培养基配方。这种浓缩进料培养基可以按例如约5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、400倍、600倍、800倍或甚至约1000倍其正常使用量含有大部分细胞培养基组分。浓缩进料培养基经常用于分批培养工艺中。

在一些实施方案中，在细胞生长或蛋白质产生期间，对细胞培养基补充“现场使用添加物”，也称作添加物、现场使用成分、或现场使用化学品。现场使用添加物包含以下任一种或多种：生长因子或其他蛋白质、缓冲剂、能量源、盐、氨基酸、金属和螯合剂。其他蛋白质包括转铁蛋白和白蛋白。生长因子，包括细胞因子和趋化因子，通常是本领域已知的并且已知刺激细胞生长，或在一些情况下刺激细胞分化。生长因子通常是蛋白质(例如，胰岛素)、小肽或类固醇激素，如雌激素、DHEA、睾酮等。在一些情况下，生长因子可以是促进细胞增殖或蛋白质产生的非天然化学品，例如，四氢叶酸(THF)、甲氨蝶呤等。蛋白质和肽生长因子的非限制性例子包括血管生成素、骨形态发生蛋白(BMP)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝瘤衍生生长因子(HDGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、移行刺激因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经生长因子(NGF)和其他神经营养因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、促血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、wnt信号传导途径激动剂、胎盘生长因子(PlGF)、胎牛生长激素(FBS)、白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7等。在一个实施方案中，对细胞培养基补充现场使用添加物生长因子胰岛素。在一个实施方案中，培养基中胰岛素的浓度，即，添加后细胞培养基中胰岛素的量，是约0.1μΜ至10μΜ。一种或多种现场使用添加物也可以包含于一些实施方案的培养基配方中。

缓冲剂通常是本领域已知的。本发明不限于任何特定缓冲剂或多种缓冲剂，并且任一个本领域普通技术人员可以选择用于产生特定蛋白质的特定细胞系的适宜缓冲剂或缓冲体系。在一个实施方案中，现场使用添加物缓冲剂是NaHCO₃。在一个实施方案中，现场使用添加物缓冲剂包含NaHCO₃。在另一个实施方案中，缓冲剂是HEPES。

在细胞培养物中作为现场使用添加物使用的能量源也是本领域熟知的。不受限制，在一个实施方案中，现场使用添加物能量源是葡萄糖。鉴于特定细胞系和待产生蛋白质的特定和专门要求，在一个实施方案中可以在培养基中添加葡萄糖至约1至20mΜ浓度。在一些情况下，可以按直至10g/L的高水平添加葡萄糖。

螯合剂同样地是细胞培养和蛋白质产生领域熟知的。无水EDTA四钠和柠檬酸盐是本领域使用的两种常见螯合剂，不过可以本发明的实施中使用其他螯合剂。在一个实施方案中，现场使用添加物螯合剂是EDTA四钠二水合物。在一个实施方案中，现场使用添加物螯合剂是柠檬酸盐，如Na₃C₆H₅O₇。

在一个实施方案中，可以对细胞培养物补充一种或多种现场使用添加物氨基酸，例如，谷氨酰胺。在一个实施方案中，按约1mΜ至13mΜ终浓度对细胞培养基补充现场使用添加物谷氨酰胺。

其他现场使用添加物包含各种金属盐的一种或多种，如铁盐，镍盐、锌盐和铜盐。在一个实施方案中，对细胞培养基补充以下任一者或多者：硫酸铜、硫酸锌、氯化亚铁和硫酸镍。

在一个实施方案中，对细胞培养基补充以下任一种或多种或全部的以下现场使用添加物：约29.8mΜNaHCO₃、约2mΜ谷氨酰胺、约0.86μΜ胰岛素、约11.1mΜ葡萄糖、约6.54μΜ硫酸锌、约0.168μΜ硫酸铜、约75μΜ氯化亚铁、约0.639μΜ硫酸镍、约85μΜEDTA和约50μΜ柠檬酸盐。

在一个实施方案中，根据补料分批工艺在细胞培养期间按间隔时间补充培养基。补料分批培养法是本领域公知的并用于优化的蛋白质生产(参见Y.M.Huang等人,BiotechnolProg.2010Sep-Oct；26(5):1400-10)。

相对于无鸟氨酸或腐胺的培养物中培育的细胞，细胞生存力、活细胞密度和细胞加倍时间改善。就细胞生存力而言，在OS培养基中培育的细胞显示比无OS培养基中培育的相似或相同细胞的生存力大至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少，55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、至少100％或至少3倍的生存力。

在一些实施方案中，活哺乳动物细胞在OS培养基中的加倍速率比无OS培养基中培养的哺乳动物细胞的加倍速率大至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或至少3倍。在一些实施方案中，活哺乳动物细胞在OS培养基中的加倍速率比无OS培养基在无OS培养基中的加倍速率大约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。

在一些实施方案中，活跃连续分裂的哺乳动物细胞的加倍时间在OS培养基中小于30小时、小于29小时、小于28小时、小于27小时、小于26小时、小于25小时、小于24小时、小于23小时、小于22小时、小于21小时、小于20小时、小于19小时或小于18小时。在一些实施方案中，活跃生长的哺乳动物细胞的加倍时间在OS培养基中小于28小时。在一些实施方案中，哺乳动物细胞的加倍时间在OS培养基中是约27±1小时、约26±1小时、约25±1小时、约24±1小时、约23±1小时、约22±1小时或约21±1小时。在一些实施方案中，活跃连续分裂的哺乳动物细胞的加倍时间在OS培养基中是约24±1小时。在一些实施方案中，OS培养基中培育的活跃分裂的哺乳动物细胞的加倍时间比无OS培养基中培育的活跃连续分裂的细胞的加倍时间短至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％或至少25％。

蛋白质产生

除化学确定的OS培养基和在OS培养基中培养细胞的方法之外，本发明还提供在OS培养基内培养的细胞中产生蛋白质(如治疗有效的抗体或其他生物制药原料药)的方法。

在一些实施方案中，OS培养基中培养的哺乳动物细胞产生蛋白质的速率比无OS培养基中培养的相同哺乳动物细胞产生蛋白质的速率高至少5％、10％、15％或20％。在一些实施方案中，OS培养基中培养的细胞内产生蛋白质的速率是至少1ρg/细胞/日(“PCD”)、至少2PCD、至少3PCD、至少4PCD、至少5PCD、至少6PCD、至少7PCD、至少8PCD、至少9PCD、至少10PCD、至少15PCD、至少20PCD、至少25PCD、至少30PCD、至少35PCD、至少40PCD、至少45PCD、至少50PCD、至少75PCD或至少100PCD.

在一些实施方案中，可以按克蛋白质产物/升培养基表述的从OS培养基中培养的细胞产生蛋白质的产率或滴度是至少100mg/L、至少1g/L、至少1.2g/L、至少1.4g/L、至少1.6g/L、至少1.8g/L、至少2g/L、至少2.5g/L、至少3g/L、至少，3.5g/L、至少4g/L、至少4.5g/L、至少5g/L、至少5.5g/L、至少6g/L、至少6.5g/L、至少7g/L、至少7.5g/L、至少8g/L、至少8.5g/L、至少9g/L、至少9.5g/L、至少10g/L或至少20g/L。

在一些实施方案中，蛋白质产物(目的蛋白)是抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体，结合抗原的抗体片段、单链抗体、双抗体、三体抗体或四体抗体、Fab片段或F(ab')₂片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2体、IgG3体或IgG4体。在一个实施方案中，抗体是IgG1抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG2抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG4抗体。

在一些实施方案中，目的蛋白是含有Fc部分和另一个结构域的重组蛋白(例如，Fc-融合蛋白)。在一些实施方案中，Fc-融合蛋白是一种受体Fc-融合蛋白，所述蛋白质含有一个或多个与Fc部分偶联的一种或多种受体胞外结构域。在一些实施方案中，Fc部分包含铰链区，随后是IgG的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，受体Fc-融合蛋白含有与单个配体或多个配体结合的两条或更多条不同受体链。例如，Fc-融合蛋白是一种捕捉蛋白，如例如IL-1捕捉蛋白(例如，利洛西普，其含有与IL-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体结合区，所述IL-1R1胞外区与hIgG1的Fc融合；参见美国专利号6927004，所述文献通过引用的方式完整并入本文)，或VEGF捕捉蛋白(例如，阿柏西普(aflibercept)，其含有与VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2，所述Ig结构域3与hIgG1的Fc融合；参见美国专利号7,087,411和7279159)。

本发明不限于任何特定类型用于蛋白质产生的细胞。适于蛋白质产生的细胞类型的例子包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、细菌细胞和酵母细胞。细胞可以是以用于重组基因表达的载体转化的干细胞或重组细胞或用产生病毒产物的病毒转染的细胞。细胞可以含有编码目的蛋白的重组异源多核苷酸构建体。这种构建体可以是附加体或它可以是物理整合入细胞基因组的元件。这些细胞还可以在异源多肽构建体上不编码目的蛋白的情况下产生目的蛋白。也就是说，细胞可以天然地编码目的蛋白，如产生抗体的B细胞。这些细胞也可以是原代细胞，如鸡胚细胞，或原代细胞系。可用细胞的例子包括BSC细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK-21细胞、鸡胚细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞和CHO细胞。在多种实施方案中，细胞系是CHO细胞衍生物，如CHO-K1、CHODUXB-11、CHODG-44、Veggie-CHO、GS-CHO、S-CHO或CHOlec突变系。

在一个实施方案中，作为CHO细胞的细胞异位表达蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质包含免疫球蛋白重链区域，如CH1区、CH2区或CH3区。在一个实施方案中，蛋白质包含人或啮齿类免疫球蛋白CH2区和CH3区。在一个实施方案中，蛋白质包含人或啮齿类免疫球蛋白CH1区、CH2区和CH3区。在一个实施方案中，蛋白质包含铰链区和CH1区、CH2区和CH3区。在一个具体实施方案中，蛋白质包含免疫球蛋白重链可变结构域。在一个具体实施方案中，蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变结构域。在一个具体实施方案中，蛋白质包含免疫球蛋白重链可变结构域和免疫球蛋白轻链可变结构域。在一个具体实施方案中，蛋白质是抗体，如人抗体、啮齿类抗体或嵌合人/啮齿类抗体(例如，人/小鼠、人/大鼠或人仓鼠)。

生产阶段可以按任何培养规模(从独立瓶和摇瓶或摇袋到1升生物反应器并且到大规模工业生物反应器)实施。大规模工艺可以按约100升至20,000升或更大的体积实施。几种手段的一种或多种可以用来控制蛋白产生，如温度变动或化学诱导。生长阶段可以在比生产阶段更高的温度进行。例如，生长阶段可以在约35℃至38℃的第一温度进行，并且生产阶段可以在约29℃至37℃、任选地约30℃至36℃或约30℃至34℃的第二温度进行。此外，可以与温度变动同时、在其之前或之后添加用于蛋白质产生的化学诱导物，如咖啡因、丁酸盐、他莫昔芬、雌激素、四环素、多西环素和六亚甲基双乙酰胺(HMBA)。如果添加诱导物，则可以将它们在温度变动后1小时至5天添加，如在温度变动后1至2天添加。生产细胞培养物可以作为连续进料培养系统运行，如恒化器中那样(参见C.Altamirano等人,BiotechnolProg.2001Nov-Dec；17(6):1032-41)，或根据补料分批法(Huang，2010)运行。

本发明通过细胞培养过程可用于改善蛋白质产生。本发明中使用的细胞系可以按遗传方式工程化以表达商业或科学目的多肽。按遗传方式工程化细胞系包括用重组多核苷酸分子转染、转化或转导细胞，或否则改变(例如，通过同源重组和基因激活或重组细胞与非重组细胞融合)从而引起宿主细胞表达所需的重组多肽。用于基因工程化细胞或细胞系以表达目的多肽的方法和载体是本领域技术人员熟知的；例如，多种技术在以下文献中展示：CurrentProtocolsinMolecularBiology.Ausubel等人编著(Wiley&Sons,NewYork,1988和季度更新)；Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual(ColdSpringLaboratoryPress,1989)；Kaufman,R.J.,LargeScaleMammalianCellCulture,1990,第15-69页。广泛类型适于培养生长的细胞系从美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州)和商业供应商可获得。产业中常使用的细胞系的例子包括VERO、BHK、HeLa、CVI(包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤细胞系(例如，NSO、NSI)、PC12、WI38细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。CHO细胞广泛用于产生复杂的重组蛋白，如细胞因子、凝血因子和抗体(Brasel等人,(1996),Blood88:2004-2012；Kaufman等人,(1988),J.BiolChem263:6352-6362；McKinnon等人,(1991),JMolEndocrinol6:231-239；Wood等人,(1990),JImmunol.145:3011-3016)。二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型突变体细胞系(Urlaub等人,(1980)，ProcNatlAcadSciUSA77:4216-4220)DXBI1和DG-44是合乎需要的CHO宿主细胞系，因为高效的DHF可选性和可扩增基因表达系统允许这些细胞中高水平的重组蛋白表达(KaufmanRJ.(1990),MethEnzymol185:537-566)。此外，这些细胞易于作为贴壁或悬浮培养物操作并显示出相对良好的遗传稳定性。CHO细胞类和通过它们重组表达的蛋白质已经充分表征并且已经由监管机构批准用于临床生产和商业生产。在一些实施方案中，CHO细胞系是如美国专利申请公开号2010/0304436A1、2009/0162901A1和2009/0137416A1和美国专利号7,455,988B2、7,435,553B2和7,105,348B2中所述的细胞系。

本发明在范围方面不受本文所述的具体实施方案限制，所述具体实施方案意在作为本发明各个方面或实施方案的说明。功能上等同的方法和组分处于本发明的范围内。除了本文描述的那些修改之外，对本发明的各种修改也因前文描述和附图而是本领域技术人员显而易见的。这类修改落于本发明的范围内。

本发明部分地基于以下发现：向无血清细胞培养基添加鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺组合导致细胞生长、生存力和来自表达目的蛋白的重组工程化动物细胞系(或天然细胞)的多肽生产增加，因而增强培养物稳健性，改善目的多肽的产率。

实施例1：改良的活细胞培养物密度

从衍生自CHOK1的产生重组抗体的细胞株系的种子培养物接种一个250mL摇瓶。将接种的细胞在36.5℃培育7天并且在第3天和第5天补入葡萄糖。将细胞分别在两种独立的化学确定(无水解物和无血清)培养基中培育。第一培养基含有约75mM氨基酸(培养基1)，第二培养基含有约40mM氨基酸(培养基2)，并且两种配方均含有不多于2.5μΜ(0.4mg/L)腐胺。通过以7.5g/L的浓度添加大豆水解物至培养基2，产生另一组培养基条件。向三种对照培养基的每一者，添加约593μΜ鸟氨酸(作为100mg/LL-鸟氨酸·HCl)或约593μΜ鸟氨酸(作为100mg/LL-鸟氨酸·HCl)和约714μΜ腐胺(作为115mg/L腐胺·2HCl)的组合。在第3、5和7日取出3mL培养物等分试样并使用台盼蓝拒染法在BioProfileFLEX^TM仪(NovaBiomedical)上实施活细胞计数。在第零日，全部培养物均含有0.8x10⁶个(活)细胞/mL。对于给定的培养基(培养基1、培养基2或培养基2+大豆)，经7天时间的活细胞计数揭示，在补充有鸟氨酸或鸟氨酸加腐胺的培养基中培育的CHO细胞具有增加的活细胞密度。在这段7天时间期间，这种效应在无水解物培养基中特别明显(即，活细胞密度增加2倍至4倍或更多)。无水解物OS培养基2的表现与含有大豆的无OS培养基2相当，这表明可以通过鸟氨酸替代重复出大豆水解物的细胞生长益处。还观察到因向培养基2+大豆添加鸟氨酸或鸟氨酸和腐胺而增加的细胞密度。表1中呈现结果。

表1：平均活细胞培养物密度(10⁶个细胞/毫升)和超过基线的增加倍数*

*基线是在给定日期相对于给定的培养基配方而言未补充的培养基。

我们还研究了含有约75mM氨基酸和0.4mg/L腐胺HCl的培养基3(“培养基3”)中各种量的鸟氨酸·HCl(即，50mg/mL、100mg/mL和150mg/mL)对活细胞密度的影响。衍生自CHOK1的产生重组抗体的细胞株系的单一种子培养物用来以0.4X10⁶个细胞/mL以15mL工作容积接种50mL生物反应器(TPP)。将细胞在37℃培养箱中培育三天。在第3日取出3mL培养物等分试样并使用台盼蓝拒染法在BioProfileFLEX^TM仪(NovaBiomedical)上实施活细胞计数。全部三个水平的鸟氨酸平均改善细胞密度(N＝3)略高于2倍。表2中描述结果。

表2：活细胞培养物密度(10⁶个细胞/毫升)和超过基线的增加倍数*

*基线是未补充的培养基3。

实施例2：改良的细胞培养物加倍时间

在多种细胞培养基条件下测定处于对数生长阶段的衍生自CHOK1的产生重组抗体的细胞株系细胞的加倍时间。将种子培养培养物在36.5℃于250mL摇瓶中的以下三种独立培养基内各自传代14天时间：培养基1、培养基2和含有大豆水解物的培养基2(培养基2+大豆)。在第0日并且在种子培养传代(每2天或每3天)时从每种条件取出1mL等分试样，并且使用台盼蓝拒染法在CDV^TM仪(NovaBiomedical)上施活细胞计数。测试了未补充或补充有100mg/L鸟氨酸·HCl或补充有115mg/L腐胺·2HCl和100mg/L鸟氨酸·HCl二者的培养基1。测试了未补充或补充有100mg/L鸟氨酸·HCl或补充有115mg/L腐胺·2HCl和100mg/L鸟氨酸·HCl二者的含有低腐胺·2HCl(0.4mg/L)的培养基2。表3和表4中描述结果。为了实现明显的生长，需要向培养基1连同或不连同腐胺一起补充鸟氨酸。用鸟氨酸或鸟氨酸+腐胺补充无水解物培养基2减少细胞加倍时间约25％至30％。向含水解物的培养基2添加鸟氨酸或鸟氨酸+腐胺时，还减少加倍时间至更低程度。

表3：培养基1中相对于基线*的细胞加倍时间(小时)和近似加倍时间下降％

*基线是未补充的培养基1。

表4：培养基2中相对于基线*的细胞加倍时间(小时)和近似加倍时间下降％

*基线是未补充的培养基2。

实施例3：改良的抗体滴度

已经确立包含鸟氨酸或鸟氨酸+腐胺改善了培养物中的细胞增殖和活细胞密度，我们进一步研究了这些条件对重组蛋白生产滴度的影响。我们研究了CHO-K1衍生细胞系的重组IgG表达和分泌。在这个实验中，在第7日在培养物中各种培养基模式下测定平均抗体滴度。如上，测试了具有低腐胺(0.4mg/L腐胺·2HCl)、鸟氨酸(100mg/L鸟氨酸·HCl)以及同时具有鸟氨酸和腐胺(100mg/L鸟氨酸·HCl/115mg/L腐胺·2HCl)的培养基1。还测试了具有低腐胺(0.4mg/L腐胺·2HCl)、鸟氨酸(100mg/L鸟氨酸·HCl)以及同时具有鸟氨酸和腐胺(100mg/L鸟氨酸·HCl/115mg/L腐胺·2HCl)的培养基2和培养基2+大豆。在全部情况下，以0.4mg/L以上的水平包含鸟氨酸或者鸟氨酸和腐胺产生显著更高的蛋白质滴度，即至少约两倍更高的滴度。表5中描述结果。

表5：相对基线*的平均7日抗体滴度和近似滴度增加倍数(X)

*基线设定在每种类型的未补充培养基的滴度处。

我们还研究了培养基3中各种量的鸟氨酸·HCl(即，50mg/mL、100mg/mL和150mg/mL)对抗体产生的影响。衍生自CHOK1的产生重组抗体的细胞株系的单一种子培养物用来以0.4X10⁶个细胞/mL以15mL工作容积接种50mL生物反应器(TPP)。将细胞在37℃培养箱中培育三天。全部三个水平的鸟氨酸补充均平均(N＝3)改进抗体滴度略高于50％。表6中描述结果。

表6：抗体滴度(克/升)和滴度超过基线*的增加倍数

*基线是未补充的培养基3。

Claims (48)

1.细胞培养基，其是无血清的，包含≥0.09mM±0.014mM鸟氨酸。

2.根据权利要求1所述的细胞培养基，包含≥0.20±0.03mM腐胺。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的细胞培养基，包含0.09±0.014至0.9±0.14mM鸟氨酸。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞培养基，包含0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.09mM或0.9±0.14mM的鸟氨酸。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞培养基，包含0.20±0.03mM至0.714±0.11mM腐胺。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞培养基，包含0.20±0.03mM、0.35±0.06mM、或0.714±0.11mM的腐胺。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的细胞培养基，其中培养基是无水解物的。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的细胞培养基，其中培养基是化学确定的。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的细胞培养基，包含≥40±6mM氨基酸或其盐的混合物。

10.根据权利要求9所述的细胞培养基，其中氨基酸的混合物由丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的细胞培养基，包含一种或多种脂肪酸。

12.根据权利要求11所述的细胞培养基，其中一种或多种脂肪酸选自亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、花生四烯酸、月桂酸、山萮酸、十烷酸、十二烷酸、己酸、木蜡酸、肉豆蔻酸和辛酸。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞培养基，包含核苷混合物。

14.根据权利要求13所述的细胞培养基，其中核苷混合物包含以下一种或多种：腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的细胞培养基，包含腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的细胞培养基，包含一种或多种二价阳离子。

17.根据权利要求16所述的细胞培养基，其中二价阳离子是镁、钙或二者。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的细胞培养基，包含Ca²⁺和Mg²⁺。

19.一种用于培育细胞的方法，包括步骤：(a)提供根据权利要求1-18中任一项所述的细胞培养基，和(b)在细胞培养基中增殖或维持细胞以形成细胞培养物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中细胞选自哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞、细菌细胞和酵母细胞。

21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中细胞是CHO细胞。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中细胞表达目的蛋白。

23.根据权利要求22所述的方法，其中目的蛋白是抗原结合蛋白。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中目的蛋白包含Fc结构域。

25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中目的蛋白是受体-Fc-融合蛋白。

26.根据权利要求25所述的方法，其中受体-Fc-融合蛋白是捕捉蛋白。

27.根据权利要求26所述的方法，其中捕捉蛋白是IL-1拮抗物或VEGF拮抗物。

28.根据权利要求22或23所述的方法，其中目的蛋白是抗体或抗体片段。

29.根据权利要求28所述的方法，其中抗体或抗体片段是重组人抗体或其片段。

30.根据权利要求19-29中任一项所述的方法，其中细胞具有≤30小时的平均加倍时间。

31.根据权利要求19-30中任一项所述的方法，其中细胞具有≤24小时的平均加倍时间。

32.根据权利要求19-31中任一项所述的方法，其中细胞具有下述平均加倍时间，所述平均加倍时间是含有<0.3±0.045mM鸟氨酸和<0.2±0.03mM腐胺的细胞培养基中培育的细胞的平均加倍时间的至少三分之一。

33.根据权利要求19-32中任一项所述的方法，其中细胞培养物能够达到比含有<0.09±0.014mM鸟氨酸和<0.2±0.03mM腐胺的培养基中的相似细胞培养物大至少15％的活细胞计数密度。

34.根据权利要求19-33中任一项所述的方法，其中细胞培养物能够达到含有<0.09±0.014mM鸟氨酸和<0.2±0.03mM腐胺的相似细胞培养基中的相似细胞培养物的至少3倍的活细胞计数密度。

35.根据权利要求19-34中任一项所述的方法，包括向细胞培养基添加一种或多种现场使用添加物的步骤。

36.根据权利要求35所述的方法、其中现场使用添加物包括以下一种或多种：NaHCO₃、谷氨酰胺、胰岛素、葡萄糖、CuSO₄、ZnSO₄、FeCl₃、NiSO₄、Na₄EDTA和Na₃柠檬酸盐。

37.根据权利要求35或36所述的方法，其中将NaHCO₃、谷氨酰胺、胰岛素、葡萄糖、CuSO₄、ZnSO₄、FeCl₃、NiSO₄、Na₄EDTA和Na₃柠檬酸盐作为现场使用添加物各自添加培养基。

38.用于产生蛋白质的方法，包括步骤：(a)向细胞中引入包含编码目的蛋白的序列的核酸；(b)选择携带所述核酸的细胞；(c)在根据权利要求1-18中任一项所述的细胞培养基中或根据权利要求19-37中任一项所述的方法培养选择的细胞；和(d)在细胞中表达目的蛋白，其中目的蛋白分泌入培养基中。

39.根据权利要求38所述的方法，其中细胞是CHO细胞、293细胞或BHK细胞。

40.根据权利要求38或39所述的方法，其中目的蛋白是抗原结合蛋白。

41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中目的蛋白包含Fc结构域。

42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中目的蛋白选自受体-Fc-融合蛋白(TRAP)，可溶性TCR-Fc融合蛋白、抗体、Fc-融合蛋白和ScFv蛋白。

43.根据权利要求38-42中任一项所述的方法，其中按照比通过相似细胞在含有小于0.09±0.014mM鸟氨酸和小于0.2±0.03mM腐胺的细胞培养基中产生的平均7日滴度大至少7％的平均7日滴度目的蛋白。

44.根据权利要求38-43中任一项所述的方法，其中按照比通过相似细胞在含有小于0.09±0.014mM鸟氨酸和小于0.2±0.03mM腐胺的细胞培养基中产生的平均7日滴度大至少14％的平均7日滴度目的蛋白。

45.根据权利要求38-44中任一项所述的方法，其中按照比通过相似细胞在含有小于0.09±0.014mM鸟氨酸和小于0.2±0.03mM腐胺的细胞培养基中产生的平均7日滴度大至少80％的平均7日滴度目的蛋白。

46.根据权利要求38-45中任一项所述的方法，其中按照通过相似细胞在含有小于0.09±0.014mM鸟氨酸和小于0.2±0.03mM腐胺的细胞培养基中产生的平均7日滴度的至少2倍的平均7日滴度目的蛋白。

47.根据权利要求38-46中任一项所述的方法，其中按照通过相似细胞在含有小于0.09±0.014mM鸟氨酸和小于0.2±0.03mM腐胺的细胞培养基中产生的平均7日滴度的至少3倍的平均7日滴度目的蛋白。

48.根据权利要求38-47中任一项所述的方法，其中目的蛋白是重组人抗体。