JP6781039B2 - 無血清細胞培養培地 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の培養のためおよび組換えタンパク質の生成のための培地に関する。本発明は、具体的には、タンパク質生物治療剤の生成のための組換えＣＨＯ細胞の培養のための無血清培地に関する。

血清またはタンパク質加水分解物構成要素（即ち、ペプトンおよびトリプトン）を含む細胞培養培地は、培養細胞からの組換えタンパク質の生成における使用の長い歴史を有する。これらの構成要素は、増殖因子ならびに細胞の増殖および培養にとって有益な広範な種々の他の特徴付けられていない要素を含む。しかし、これらは、増殖を低減させる、または組換えタンパク質生成に他の方法で負の影響を与える、特徴付けられていない要素もまた含む。これらは、可変性の、歓迎されない潜在的供給源でもあり得る。それらの欠点にもかかわらず、血清および加水分解物を使用することの利点は、欠点のいくつかを凌いでおり、多くの細胞培養適用において広く使用されてきた。

ヒト生物学的治療剤（バイオ医薬品）は、哺乳動物細胞培養物、特にＣＨＯ細胞培養物において一般に生成される。それらの細胞培養物中の特徴付けられていない構成要素または部分的に特徴付けられた構成要素の存在は、ヒト使用のためのバイオ医薬品の製造にとって非常に望ましくない。かかる特徴付けられていない構成要素または部分的に特徴付けられた構成要素の使用は、生成および調節の矛盾を導入するだけではなく、生成培養物のウイルス感染または真菌感染の可能性を上昇させる。

薬物生成物の収量および組成のロットごとの可変性の低減は、培養プロセスを選択する際の別の重要な因子である。血清、加水分解物および他の未定義の要素は、バイオ医薬品生成ロットの収量、組成および品質において可変性を導入する。培地要素の品質および純度は、収量にも影響を与え得るが、これは、薬物力価が、栄養素の特定のバランスを維持することに一部依存する場合が多いからである。栄養素の相対的な量が、培地ロットによって変動する場合、薬物収量は変動し得、この変動は、許容できないまたは経済的でない可能性がある。

血清含有培地または加水分解物ベースの培地を使用することは、下流の加工の課題を導入する。培養物中の所望のバイオ医薬品の濃度は、一般に、グラム／リットルのオーダーである。培地中の血清および加水分解物の存在は、引き続く加工ステップにおいて除去すべき、１０ｇ／Ｌ超の特徴付けられていないペプチドおよびタンパク質を追加し得る。血清および加水分解物は、培地中の金属および他の微量元素の量においても、可変性を導入し得る。従って、培養培地からの血清および加水分解物の排除は、これらのバリエーションならびに薬物物質の生成および加工に対する潜在的妨害を排除する。

とりわけ、無血清で加水分解物を含まない培地を使用することの利点は、費用の低減、薬物ロット間の可変性における低減、ならびに未規定および未精錬の構成要素からの偶発的な因子を導入する危険性の最小化が含まれる。さらに、培地がバッチ試行間で規定されており均一である場合、現在の培地に対して新たな培養バッチを試験するための検定試行が、同様に最小化される。従って、哺乳動物細胞を培養するための培地が当技術分野で必要とされており、ここで、この培地は、化学的に規定されており血清および加水分解物を含まないか、または無血清であり低い管理可能なレベルの加水分解物を含み、健康で頑強な細胞の増殖および維持、ならびにバイオ医薬品薬物物質の高力価生成をなおも可能にする。

本発明者らは、血清を含まない細胞培養培地（「ＯＳ」培地）中に、オルニチンをプトレシンありまたはなしのいずれかで含めることが、細胞の生存度および密度を増加させ、細胞倍加時間を低減させ、これらの細胞による高力価タンパク質生成を可能にすることを、驚くべきことに発見した。本発明者らは、低い量または微量のタンパク質加水分解物を含むＯＳ培地または化学的に規定された（即ち、タンパク質加水分解物を含まない）ＯＳ培地が、特に、回復された細胞の生存度および密度、細胞倍加時間、ならびに高力価タンパク質生成を提供することもまた発見した。

一態様では、本発明は、無血清であり、少なくとも０．０９ｍＭ±０．０１４ｍＭのオルニチンを含む、細胞培養培地を提供する。一実施形態では、このオルニチンは、０．０９±０．０１４ｍＭ〜０．９±０．１４ｍＭの範囲、例えば、０．０９±０．０１４ｍＭ、０．３±０．０５ｍＭ、０．６±０．０９ｍＭまたは０．９±０．１４ｍＭの濃度のオルニチンで、培地中に存在する。一部の実施形態では、この培地は、少なくとも０．２０±０．０３ｍＭのプトレシンもまた含む。一部の実施形態では、このさらなるプトレシンは、０．２０±０．０３ｍＭ〜０．７１４±０．１１ｍＭの範囲、例えば０．２０±０．０３ｍＭ、０．３５±０．０６または０．７１４±０．１１ｍＭの濃度のプトレシンである。一部の実施形態では、この培地は、≦７．５ｇ／Ｌの加水分解物を含む。一部の実施形態では、この培地は、いずれの加水分解物も含まない。

一実施形態では、この培地は、化学的に規定された基本培地、例えば、カスタム処方のまたは市販の基本培地を含む。一実施形態では、完全培地は、化学的に規定され、血清を含まず、加水分解物を含まない。

一部の実施形態では、その有用な濃度（即ち、１×）での培地は、少なくとも４０±６ｍＭまたは少なくとも７０±１０．５ｍＭの、アミノ酸またはアミノ酸塩の混合物を含む。一実施形態では、この培地は、少なくとも４０ｍＭのアミノ酸の混合物を含む。この実施形態または別の実施形態では、この培地は、少なくとも７０ｍＭのアミノ酸の混合物を含む。一実施形態では、このアミノ酸の混合物（ユースポイント添加物として培地に後で添加され得るグルタミンを明らかに除く）は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含む。

一部の実施形態では、この培地は、１種または複数の脂肪酸を含む。特定の一実施形態では、この培地は、脂肪酸（または脂肪酸誘導体）の混合物およびアルファトコフェロールを含む。脂肪酸または脂肪酸誘導体は、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸およびオクタン酸からなる群より選択される。

一部の実施形態では、この培地は、ヌクレオシドの混合物を含む。一実施形態では、この培地は、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含む。

一部の実施形態では、この培地は、塩の混合物を含む。塩は、二価カチオン、例えばカルシウムおよびマグネシウムを含む。一実施形態では、この培地は、塩化カルシウムおよび硫酸マグネシウムを含む。他の塩には、リン酸の塩が含まれ得る。

具体的な一実施形態では、この培地は、（１）≦７．５ｇ／Ｌの加水分解物を含む、（２）無血清である、（３）０．０９±０．０１４ｍＭ、０．３±０．０５ｍＭ、０．６±０．０９ｍＭまたは０．９±０．１４ｍＭのオルニチンを含む、（４）任意選択でさらに、０．２０±０．０３ｍＭ、０．３５±０．０６または０．７１４±０．１１ｍＭのプトレシンを含む、（５）少なくとも約４０ｍＭまたは少なくとも約７０ｍＭの、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含むアミノ酸の混合物を含む、（６）トコフェロールおよび脂肪酸の混合物を含む、（７）アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含むヌクレオシドの混合物を含む、ならびに（８）カルシウム、マグネシウムおよびリン酸の塩を含む。

別の一態様では、本発明は、上述の態様に記載された培地の任意の実施形態などの細胞培養培地中で細胞を培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）方法を提供する。一実施形態では、この方法は、（１）≦７．５ｇ／Ｌの加水分解物を含むまたは加水分解物を含まない、（２）血清を含まない、（３）少なくとも０．０９ｍＭ±０．０１４ｍＭの濃度でオルニチンを含む、および（４）任意選択で、少なくとも０．２０±０．０３ｍＭなどのプトレシンを含む培地中で、細胞（単数または複数）を成長させまたは維持するステップを使用する。

一部の実施形態では、この細胞（単数または複数）は、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、酵母細胞または細菌細胞である。一実施形態では、これらの細胞は、組換えタンパク質の生成において有用な哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞または誘導体ＣＨＯ−Ｋ１である。一部の実施形態では、これらの細胞は、目的のタンパク質、例えば生物治療剤タンパク質を発現する。この生物治療剤タンパク質は、Ｆｃドメインを含み得る抗原結合性タンパク質であり得る。一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質、例えばＳｃＦｖ分子またはｔｒａｐ分子である。ｔｒａｐ分子には、ＶＥＧＦ ｔｒａｐタンパク質およびＩＬ−１ Ｔｒａｐタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体、二重特異性抗体または抗体断片である。

無血清培地中にオルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの組合せを含めることによる細胞増殖に対する正の影響を考慮すると、この方法に従って培養された細胞は、３０時間以下の平均倍加時間を有する。一実施形態では、この細胞倍加時間は、２４時間以下である。一実施形態では、０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチン（または０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチンおよび０．２±０．０３ｍＭ未満のプトレシン）を含む培地中での細胞増殖と比較した場合、この方法に従って増殖した細胞は、コンパレーター対照培養物の倍加時間の少なくとも３分の１である平均倍加時間を有する。

同様に、無血清培地中にオルニチン単独またはオルニチンおよびプトレシンの組合せを含めることは、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの組合せを含めない場合よりも高い生存細胞計数密度に培養細胞が達するのを可能にする。ＯＳ培地の１つの無血清で加水分解物を含まない実施形態では、この細胞培養物は、０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチン（または０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチンおよび０．２±０．０３ｍＭ未満のプトレシン）を含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも１５％大きい生存細胞計数密度に達することが可能である。ＯＳ培地の別の無血清で加水分解物を含まない実施形態では、この細胞培養物は、０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチン（または０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチンおよび０．２±０．０３ｍＭ未満のプトレシン）を含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも３倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である。

別の一実施形態では、この方法は、１種または複数のユースポイント添加物を細胞培養培地に添加するステップを含む。一部の実施形態では、このユースポイント添加物は、ＮａＨＣＯ_３、グルタミン、インスリン、グルコース、ＣｕＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、ＦｅＣｌ_３、ＮｉＳＯ_４、Ｎａ_４ ＥＤＴＡおよびクエン酸Ｎａ_３のうちの任意の１種または複数である。一実施形態では、この方法は、以下のユースポイント化学物質の各々を細胞培養培地に添加するステップを使用する：ＮａＨＣＯ_３、グルタミン、インスリン、グルコース、ＣｕＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、ＦｅＣｌ_３、ＮｉＳＯ_４、Ｎａ_４ ＥＤＴＡおよびクエン酸Ｎａ_３。一部の実施形態では、これらのユースポイント添加物は、開始時に培地中に含まれ得る。

具体的な一実施形態では、この態様は、以下：（１）０．０９±０．０１４ｍＭ、０．３±０．０５ｍＭ、０．６±０．０９ｍＭまたは０．９±０．１４ｍＭのいずれかのオルニチンの細胞培養培地；（２）任意選択でさらに、０．２０±０．０３ｍＭ、０．３５±０．０６または０．７１４±０．１１ｍＭのいずれかのプトレシン；（３）少なくとも約４０ｍＭまたは少なくとも約７０ｍＭの、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含むアミノ酸の混合物；（４）トコフェロールおよび脂肪酸の混合物；（６）アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含むヌクレオシドの混合物、ならびに（９）カルシウム、マグネシウムおよびリン酸の塩を含む無血清培地において細胞を培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）方法を提供し、この方法に従って培養された細胞は、２４時間以下の平均倍加時間またはコンパレーター対照培養物の倍加時間の少なくとも３分の１の平均倍加時間を有し；培養された細胞は、０．０９±０．０１５ｍＭ未満のオルニチン（または０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチンおよび０．２±０．０３ｍＭ未満のプトレシン）を含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも１５％大きいまたは少なくとも３倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である。別の一実施形態では、この細胞培養物は、０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチン（または０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチンおよび０．２±０．０３ｍＭ未満のプトレシン）を含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも３倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である。一実施形態では、この培地は、≦７．５ｇ／Ｌの加水分解物を含む；別の一実施形態では、加水分解物を含まない。

別の一態様では、本発明は、（１）目的のタンパク質をコードする核酸配列を細胞中に導入するステップ；（２）この核酸配列を保有する細胞を選択するステップ；（３）第１の態様に記載される無血清細胞培養培地の一実施形態において、または第２の態様に記載される方法の任意の実施形態に従って、この選択された細胞を培養するステップ；および（４）この細胞において目的のタンパク質を発現させるステップを使用することによって、目的のタンパク質を生成する方法を提供し、目的のタンパク質は培地中に分泌される。一部の実施形態では、タンパク質の生成において使用される細胞は、生物治療剤を生成することが可能な哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、２９３およびＢＨＫ細胞、またはこれらの任意の誘導体である。一実施形態では、この細胞は、ＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞である。

一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、抗原結合性タンパク質である。一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、Ｆｃドメインを有するタンパク質である。一部の場合には、例えば、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質、抗体およびＳｃＦｖタンパク質などの場合には、これら２つの目的のタンパク質は、重複し得る。従って、一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、抗体、例えばヒト抗体またはヒト化抗体、抗体断片、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２、二重特異性抗体、ｔｒａｐ分子、例えばＶＥＧＦ−ＴｒａｐまたはＩＬ−１−Ｔｒａｐ、ＳｃＦｖ分子、可溶性ＴＣＲ−Ｆｃ融合タンパク質などである。

一実施形態では、この目的のタンパク質は、０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチン（または０．０９±０．０１４ｍＭ未満のオルニチンおよび０．２±０．０３ｍＭ未満のプトレシン）を含む無血清細胞培養培地（「非ＯＳ」培地）中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも７％大きい、少なくとも１４％大きい、少なくとも８０％大きい、少なくとも２倍大きい、または少なくとも３倍大きい、平均７日目力価で生成されることが可能である。

具体的な一実施形態では、この目的のタンパク質は、（１）目的のタンパク質、例えば抗体または他の抗原結合性タンパク質をコードする核酸配列をＣＨＯ細胞中に導入すること；（２）この核酸配列を保有する細胞を選択すること；（３）（ａ）０．０９±０．０１４、０．３±０．０５ｍＭ、０．６±０．０９ｍＭまたは０．９±０．１４ｍＭのいずれかのオルニチン；（ｂ）任意選択でさらに、０．２０±０．０３ｍＭ、０．３５±０．０６または０．７１４±０．１１ｍＭのいずれかのプトレシン；（ｃ）少なくとも４０ｍＭまたは少なくとも７０ｍＭの、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含むアミノ酸の混合物；（ｄ）トコフェロールおよび脂肪酸の混合物；（ｅ）アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含むヌクレオシドの混合物、ならびに（ｆ）カルシウム、マグネシウムおよびリン酸の塩を含む無血清細胞培養培地中で、この選択された細胞を培養すること；ならびに（ｄ）このＣＨＯ細胞において目的のタンパク質を発現させることによって生成され、目的のタンパク質は培地中に分泌される。一部の実施形態では、この無血清細胞培養培地は、≦７．５ｇ／Ｌの加水分解物を含み得る；または他の実施形態では、加水分解物を全く含まなくてもよい。
[本発明1001]
≧0．09ｍＭ±0．014ｍＭのオルニチンを含む、無血清である細胞培養培地。
[本発明1002]
≧0．20±0．03ｍＭのプトレシンを含む、本発明1001の細胞培養培地。
[本発明1003]
0．09±0．014ｍＭ〜0．9±0．14ｍＭのオルニチンを含む、本発明1001および1002のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1004]
0．09±0．014ｍＭ、0．3±0．05ｍＭ、0．6±0．09ｍＭまたは0．9±0．14ｍＭでオルニチンを含む、本発明1001から1003のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1005]
0．20±0．03ｍＭ〜0．714±0．11ｍＭのプトレシンを含む、本発明1001から1004のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1006]
0．20±0．03ｍＭ、0．35±0．06または0．714±0．11ｍＭでプトレシンを含む、本発明1001から1004のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1007]
加水分解物を含まない、本発明1001から1006のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1008]
化学的に規定されている、本発明1001から1006のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1009]
≧40±6ｍＭのアミノ酸またはその塩の混合物を含む、本発明1001から1008のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1010]
アミノ酸の前記混合物が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる、本発明1009の細胞培養培地。
[本発明1011]
1種または複数の脂肪酸を含む、本発明1001から1010のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1012]
前記1種または複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸およびオクタン酸からなる群より選択される、本発明1011の細胞培養培地。
[本発明1013]
ヌクレオシドの混合物を含む、本発明1001から1012のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1014]
ヌクレオシドの前記混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンのうちの1種または複数を含む、本発明1013の細胞培養培地。
[本発明1015]
アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含む、本発明1001から1014のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1016]
1種または複数の二価カチオンを含む、本発明1001から1015のいずれかの細胞
培養培地。
[本発明1017]
前記二価カチオンが、マグネシウム、カルシウムまたはそれらの両方である、本発明1016の細胞培養培地。
[本発明1018]
Ｃａ ^2＋ およびＭｇ ^2＋ を含む、本発明1001から1017のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1019]
細胞を培養するための方法であって、（ａ）本発明1001から1018のいずれかの細胞培養培地を提供するステップ、および（ｂ）前記細胞培養培地中で細胞を成長させるかまたは維持して、細胞培養物を形成するステップを含む、方法。
[本発明1020]
前記細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群より選択される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記細胞がＣＨＯ細胞である、本発明1019または本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記細胞が目的のタンパク質を発現する、本発明1019から1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記目的のタンパク質が抗原結合性タンパク質である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、本発明1022または1023の方法。
[本発明1025]
前記目的のタンパク質が受容体−Ｆｃ−融合タンパク質である、本発明1022から1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記受容体−Ｆｃ−融合タンパク質がｔｒａｐタンパク質である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記ｔｒａｐタンパク質が、ＩＬ−1アンタゴニストまたはＶＥＧＦアンタゴニストである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記目的のタンパク質が、抗体または抗体断片である、本発明1022または1023の方法。
[本発明1029]
前記抗体または前記抗体断片が、組換えヒト抗体またはその断片である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記細胞が、≦30時間の平均倍加時間を有する、本発明1019から1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記細胞が、≦24時間の平均倍加時間を有する、本発明1019から1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記細胞が、＜0．3±0．045ｍＭのオルニチンおよび＜0．2±0．03ｍＭのプトレシンを含む細胞培養培地において増殖した細胞の平均倍加時間の少なくとも3分の1である平均倍加時間を有する、本発明1019から1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記細胞培養物が、＜0．09±0．014ｍＭのオルニチンおよび＜0．2±0．0
3ｍＭのプトレシンを含む培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも15％大きい生存細胞計数密度に達することが可能である、本発明1019から1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記細胞培養物が、＜0．09±0．014ｍＭのオルニチンおよび＜0．2±0．03ｍＭのプトレシンを含む類似の細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも3倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である、本発明1019から1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
1種または複数のユースポイント添加物を、前記細胞培養培地に添加するステップを含む、本発明1019から1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記ユースポイント添加物が、ＮａＨＣＯ ₃ 、グルタミン、インスリン、グルコース、ＣｕＳＯ ₄ 、ＺｎＳＯ ₄ 、ＦｅＣｌ ₃ 、ＮｉＳＯ ₄ 、Ｎａ ₄ ＥＤＴＡおよびクエン酸Ｎａ ₃ のうちの1種または複数を含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
ＮａＨＣＯ ₃ 、グルタミン、インスリン、グルコース、ＣｕＳＯ ₄ 、ＺｎＳＯ ₄ 、ＦｅＣｌ ₃ 、ＮｉＳＯ ₄ 、Ｎａ ₄ ＥＤＴＡおよびクエン酸Ｎａ ₃ の各々が、ユースポイント添加物として前記培地に添加される、本発明1035または1036の方法。
[本発明1038]
タンパク質を生成するための方法であって、前記方法は、（ａ）目的のタンパク質をコードする配列を含む核酸を細胞中に導入するステップ；（ｂ）前記核酸を保有する細胞を選択するステップ；（ｃ）本発明1001から1018のいずれかの細胞培養培地において、または本発明1019から1037のいずれかの方法に従って、選択された前記細胞を培養するステップ；および（ｄ）前記細胞において前記目的のタンパク質を発現させるステップを含み、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される、方法。
[本発明1039]
前記細胞が、ＣＨＯ細胞、293細胞またはＢＨＫ細胞である、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記目的のタンパク質が抗原結合性タンパク質である、本発明1038または1039の方法。
[本発明1041]
前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む、本発明1038から1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記目的のタンパク質が、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、可溶性ＴＣＲ−Ｆｃ融合タンパク質、抗体、Ｆｃ−融合タンパク質およびＳｃＦｖタンパク質からなる群より選択される、本発明1038から1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記目的のタンパク質が、0．09±0．014ｍＭ未満のオルニチンおよび0．2±0．03ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも7％大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記目的のタンパク質が、0．09±0．014ｍＭ未満のオルニチンおよび0．2±0．03ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも14％大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記目的のタンパク質が、0．09±0．014ｍＭ未満のオルニチンおよび0．2±0．03ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも80％大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記目的のタンパク質が、0．09±0．014ｍＭ未満のオルニチンおよび0．2±0．03ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも2倍大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記目的のタンパク質が、0．09±0．014ｍＭ未満のオルニチンおよび0．2±0．03ｍＭ未満のプトレシンを含む細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均7日目力価よりも少なくとも3倍大きい平均7日目力価で生成される、本発明1038から1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記目的のタンパク質が組換えヒト抗体である、本発明1038から1047のいずれかの方法。

本出願人らは、オルニチン、またはオルニチンおよびプトレシンの組合せの添加（「ＯＳ培地」）が、オルニチンをごく僅かしか含まないもしくは全く含まない、またはオルニチンおよびプトレシンの組合せをごく僅かしか含まないもしくは全く含まない無血清培地（「非ＯＳ培地」）と比較して、細胞培養物中の細胞による生存細胞密度、細胞倍加時間およびタンパク質生成を改善することを、驚くべきことに発見した。

本発明の細胞培養物および方法を記載する前に、本発明が、記載される特定の方法および実験条件に限定されず、かかる方法および条件が変動し得ることを理解すべきである。本明細書で使用される専門用語が、特定の実施形態のみを記載することを目的とするものであって、限定を意図しないこともまた理解すべきである。

特記しない限り、本出願で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本出願に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、特定の具体的な方法および材料がここに記載されている。単位、接頭辞および記号は、そのＳＩ承認された形態で示され得る。本明細書に引用される数値範囲は、オープンブラケットであり、それらがその範囲を規定する数字を含んでいることを意味する。特記しない限り、用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、「〜のうち少なくとも１つ」を意味すると解釈すべきである。本明細書で使用されるセクション見出しは、組織化を目的とするに過ぎず、記載された主題を限定すると解釈すべきではない。本明細書に記載される方法および技術は、一般に、当技術分野で公知の、ならびに特記しない限り本明細書を通じて引用および議論される種々の一般的な参考文献およびより具体的な参考文献中に記載される従来の方法に従って、実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１年）ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２年）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９０年）、ならびにＪｕｌｉｏ Ｅ． Ｃｅｌｉｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９８年）、ならびにＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９５年）を参照のこと。本開示を通じて言及される全ての刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

定義
本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、至る所で相互交換可能に使用され、ペプチド結合によって互いに接続された２つまたはそれ超のアミノ酸残基を含む分子を指す。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、改変、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化もまた含み得る。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、タンパク質ベースの薬物を含む、科学的または商業的に興味を持たれるものであり得る。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質には、とりわけ、抗体およびキメラまたは融合タンパク質が含まれる。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、細胞培養方法を使用して組換え動物細胞株によって生成される。

用語「異種ポリヌクレオチド配列」とは、本明細書で使用する場合、バイオ医薬品薬物物質として生成される、目的のタンパク質、例えばキメラタンパク質（ｔｒａｐ分子など）、抗体または抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸ポリマーを指す。この異種ポリヌクレオチド配列は、遺伝子操作技術（例えば、キメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、イントロン無し配列、など）によって製造され得、細胞中に導入され得、この細胞中で、この異種ポリヌクレオチド配列は、エピソームとして存在し得るか、または細胞のゲノム中に組み込まれ得る。この異種ポリヌクレオチド配列は、生成細胞ゲノム内の異所的部位中に導入された天然に存在する配列であり得る。この異種ポリペプチド配列は、別の生物由来の天然に存在する配列、例えばヒトオルソログをコードする配列であり得る。

「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、１つの重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）および１つの重鎖定常領域を有する。この重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、１つの軽鎖可変領域および１つの軽鎖定常領域を有する。この軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに下位分割され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと整列された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。用語「抗体」は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化免疫グロブリンおよび非グリコシル化免疫グロブリンの両方に対する言及を含む。用語「抗体」には、組換え手段によって調製、発現、創出または単離された抗体分子、例えば、その抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体、が含まれる。用語抗体には、１つよりも多い異なるエピトープに結合し得るヘテロ四量体免疫グロブリンを含む二重特異性抗体もまた含まれる。二重特異性抗体は、参照によって本出願に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号中に一般に記載されている。

用語、抗体の「抗原結合性部分」（または「抗体断片」）とは、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片を指す。用語、抗体の「抗原結合性部分」内に包含される結合性断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ２４１巻：５４４〜５４６頁）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、ならびに（ｖｉｉ）単一のタンパク質鎖を形成するように合成リンカーによって接続されたＦｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨからなるｓｃＦｖであって、ここで、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する、ｓｃＦｖ、が含まれる。他の形態の単鎖抗体、例えばディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）もまた、用語「抗体」の下に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０巻：６４４４〜６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋら（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２巻：１１２１〜１１２３頁を参照のこと）。

なおさらに、抗体またはその抗原結合性部分は、１つまたは複数の他タンパク質またはペプチドとの、抗体または抗体部分の共有結合的会合または非共有結合的会合によって形成される、より大きい免疫接着分子の一部であり得る。かかる免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９５年）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６巻：９３〜１０１頁）、および二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９４年）Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１巻：１０４７〜１０５８頁）が含まれる。抗体部分、例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、従来の技術を使用して、例えば、抗体全体のパパイン消化またはペプシン消化によって、抗体全体から調製され得る。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、当技術分野で一般に公知の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年を参照のこと）。

用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変領域および定常領域を有する抗体を含む意図である。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲおよび特にＣＤＲ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えば、ランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってｉｎ ｖｉｔｒｏで、または体細胞変異によってｉｎ ｖｉｖｏで導入された変異）を含み得る。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列から誘導されたＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことは意図しない。

用語「組換えヒト抗体」は、本明細書で使用する場合、組換え手段によって調製、発現、創出もしくは単離された全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２年）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０巻：６２８７〜６２９５頁を参照のこと）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、創出もしくは単離された抗体を含む意図である。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変領域および定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に関してトランスジェニックの動物を使用する場合、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞変異誘発）に供され、従って、これらの組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列およびＶＬ配列から誘導され、ヒト生殖系列ＶＨ配列およびＶＬ配列と関連してはいるが、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト抗体生殖系列レパートリー内には天然に存在しない可能性がある配列である。

「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つまたはそれ超のタンパク質の一部または全てを含み、そのうち１つは、免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、これらは、天然には別なふうに一緒には見出されない。抗体由来ポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインを含む）に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ ８８巻：１０５３５頁、１９９１年；Ｂｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４４巻：６７７頁、１９９０年；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 補遺４、１０．１９．１〜１０．１９．１１頁、１９９２年によって記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分にカップリングされた受容体の１つまたは複数の細胞外ドメイン（複数可）を含み、一部の実施形態では、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインが後に続くヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、このＦｃ−融合タンパク質は、１つまたは複数のリガンド（複数可）と結合する２つまたはそれ超の別個の受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ−融合タンパク質は、ｔｒａｐ、例えば、ＩＬ−１ ｔｒａｐ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＩＬ−１Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ−１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含むリロナセプト；米国特許第６，９２７，００４号を参照のこと）、またはＶＥＧＦ ｔｒａｐ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含むアフリベルセプト；米国特許第７，０８７，４１１号および米国特許第７，２７９，１５９号を参照のこと）などである。

培地
本発明は、細胞を培養する際およびバイオ医薬品薬物物質を生成する際に有用な無血清培地を提供する。「無血清」は、動物血清、例えば胎仔ウシ血清を含まない細胞培養培地に適用される。この無血清培地は、≦７．５ｇ／Ｌの加水分解物、例えばダイズ加水分解物を含み得る。本発明はまた、無血清なだけでなく、加水分解物もまた含まない、化学的に規定された培地を提供する。「加水分解物を含まない」は、外因性タンパク質加水分解物、例えば動物または植物のタンパク質加水分解物、例えば、ペプトン、トリプトンなどを含まない細胞培養培地に適用される。

細胞培養培地からの血清の排除および加水分解物を低減または排除することは、ロットごとの可変性を低減させ、下流の加工ステップを増強するが、残念ながら、細胞増殖、生存度およびタンパク質発現を減退させる。従って、化学的に規定された、無血清で低い加水分解物〜加水分解物なしの培地は、細胞増殖およびタンパク質生成を改善するためのさらなる成分を必要とする。本発明の細胞培養培地には、培養される細胞の要件または所望の細胞培養パラメーターに依存して、ポリアミンなどのさらなる成分、または増加した濃度の構成要素、例えばアミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素などが補充され得る。具体的には、本明細書の細胞培養培地は、細胞増殖、細胞生存度および組換えタンパク質生成を改善するために、オルニチン、プトレシン、または両方が補充される（「ＯＳ培地」）。

一部の実施形態では、このＯＳ培地は、少なくとも約９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５６８、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、７００、７５０、８００、８５０または９００μＭの濃度（マイクロモル／リットルで表される）で、オルニチンを含む。

一部の実施形態では、この培地は、約８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１３または１１５μＭの濃度でオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、１００μＭ±１５μＭのオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、１５ｍｇ／Ｌ±２．２５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌを含む。

一部の実施形態では、この培地は、約２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０または３４５μＭの濃度でオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、３００μＭ±４５μＭのオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、５０ｍｇ／Ｌ±７．５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌを含む。

一部の実施形態では、この培地は、約５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５または６９０μＭの濃度でオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、６００μＭ±９０μＭのオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、１００ｍｇ／Ｌ±１５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌを含む。

一部の実施形態では、この培地は、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、１，０００、１，００５、１，０１０、１，０１５、１，０２０、１，０２５、１，０３０または１，０３５μＭの濃度でオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、９００μＭ±１３５μＭのオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、１５０ｍｇ／Ｌ±２２．５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌを含む。

プトレシンは、任意選択で、オルニチン補充培地に添加され得る。プトレシンは、非常に低い濃度で、いくつかの細胞培養培地処方において構成要素として含まれてきた；例えば、０．０２〜０．０８ｍｇ／Ｌのプトレシンを記載するＷＯ２００５／０２８６２６；米国特許第５，４２６，６９９号（０．０８ｍｇ／Ｌ）；米国再発行特許第３０，９８５号（０．１６ｍｇ／Ｌ）；米国特許第５，８１１，２９９号（０．２７ｍｇ／Ｌ）；米国特許第５，１２２，４６９号（０．５６３５ｍｇ／Ｌ）；米国特許第５，０６３，１５７号（１ｍｇ／１）；ＷＯ２００８／１５４０１４（約１００μＭ〜約１０００μＭ）；米国特許出願公開第２００７／０２１２７７０号（０．５〜３０ｍｇ／Ｌのポリアミン；２ｍｇ／Ｌのプトレシン；２ｍｇ／Ｌのプトレシン＋２ｍｇ／Ｌのオルニチン；２ｍｇ／Ｌのプトレシン＋１０ｍｇ／Ｌのオルニチン）を参照のこと。

一部の実施形態では、この培地は、オルニチンおよびプトレシンの組合せを含み、ここで、プトレシンは、少なくとも約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、２６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５または４１０μＭの濃度であり得る。

一部の実施形態では、この培地は、約１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５または２３０μＭの濃度でプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧９０μＭ±１４μＭのオルニチンに加えて、２００μＭ±３０μＭのプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧１５ｍｇ／Ｌ±２．２５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌに加えて、３０ｍｇ／Ｌ±４．５ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌを含む。

一部の実施形態では、この培地は、約２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００または４０５μＭの濃度でプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧９０μＭ±１４μＭのオルニチンに加えて、３５０μＭ±５２．５μＭのプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧１５ｍｇ／Ｌ±２．２５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌに加えて、５７ｍｇ／Ｌ±８．５５ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌを含む。

一部の実施形態では、この培地は、約５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００または８０５μＭの濃度でプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧９０μＭ±１４μＭのオルニチンに加えて、７１４μＭ±１０５μＭのプトレシンを含む。一実施形態では、この培地は、≧１５ｍｇ／Ｌ±２．２５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌに加えて、１１５ｍｇ／Ｌ±１７．２５ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌを含む。

一部の実施形態では、この培地は、上に列挙した任意の濃度のプトレシンおよびオルニチンのペアになった組合せを含む。一部の実施形態では、この培地は、約５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００または８０５μＭのプトレシンおよび約５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５または６９０μＭのオルニチンの、任意のペアになった組合せを含む。例えば、この培地は、一実施形態では、約７００μＭのプトレシン＋５１０、５１１、５１２μＭ、以下参照のオルニチンのいずれか１つ；または７０１μＭのプトレシン＋５１０、５１１、５１２μＭ、以下参照のオルニチンのいずれか１つ；などを含む。また例えば、この培地は、一実施形態では、約６００μＭのオルニチン＋７００、７０１、７０２μＭ、以下参照のプトレシンのいずれか１つ；または６０１μＭのオルニチン＋７００、７０１、７０２μＭ、以下参照のプトレシンのいずれか１つ；などを含む。一部の実施形態では、この培地は、７０２μＭ±１０６μＭのプトレシン（ｐｕｒｅｓｃｉｎｅ）＋５９３μＭ±８９μＭのオルニチンを含む。特定の一実施形態では、この培地は、約７１４μＭのプトレシンおよび５９３μＭのオルニチンを含む。一実施形態では、この培地は、１１５ｍｇ／Ｌ±１７ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌおよび１００ｍｇ／Ｌ±１５ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌを含む。特定の一実施形態では、この培地は、１１５ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌおよび１００ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌを含む。

一実施形態では、オルニチンまたはプトレシンを含めることに加えて、この培地は、少なくとも５０μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１１０μＭ、少なくとも１１５μＭ、少なくとも１２０μＭ、少なくとも１２５μＭ、少なくとも１３０μＭ、少なくとも１３５μＭ、少なくとも１４０μＭ、少なくとも１４５μＭ、少なくとも１５０μＭ、少なくとも１５５μＭ、少なくとも１６０μＭ、少なくとも１６５μＭまたは少なくとも１７０μＭの累積濃度で、ヌクレオシドの混合物を含む。一実施形態では、この培地は、約１７４μＭ±２６μＭのヌクレオシドを含む。一実施形態では、この培地は、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも６５μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも７５μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも８５μＭ、少なくとも９０μＭ、少なくとも９５μＭ、少なくとも１００μＭまたは少なくとも１０５μＭの累積濃度で、プリン誘導体を含む。一実施形態では、この培地は、約１０６μＭ±５μＭのプリン誘導体を含む。プリン誘導体には、ヒポキサンチンならびにヌクレオシドアデノシンおよびグアノシンが含まれる。一実施形態では、この培地は、少なくとも３０μＭ、少なくとも３５μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも４５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも５５μＭ、少なくとも６０μＭまたは少なくとも６５μＭの累積濃度で、ピリミジン誘導体を含む。一実施形態では、この培地は、約６８μＭ±５μＭのピリミジン誘導体を含む。ピリミジン誘導体には、ヌクレオシドチミジン、ウリジンおよびシチジンが含まれる。特定の一実施形態では、この培地は、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含む。

オルニチンまたはプトレシンを含めることに加えて、一実施形態では、この培地はまた、少なくとも４０ｍＭの累積濃度でアミノ酸を含み、ここで、グルタミンの量は、累計の計算に含めない。一実施形態では、グルタミンは、培地中には含まれないが、タンパク質の生成の間などの細胞の培養の間に、培地に「ユースポイント添加物」として供給され得る。従って、一部の実施形態では、細胞を培養する方法または目的のタンパク質を生成する方法などにおいて、この培地には、ユースポイント添加物としてグルタミンが補充され得る。かかる一実施形態では、グルタミンは、約４０ｍＭ未満、約３５ｍＭ未満、約３０ｍＭ未満、約２５ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、約１５ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満、約８ｍＭ未満、約７ｍＭ未満、約６ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約４ｍＭ未満、約３ｍＭ未満または約２．５ｍＭ未満の量で添加される。一実施形態では、グルタミンが補充された培地中のグルタミンの量は、約２ｍＭ±０．５ｍＭである。

一実施形態では、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、この培地は、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２４ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも２６ｍＭ、少なくとも２７ｍＭ、少なくとも２８ｍＭ、少なくとも２９ｍＭまたは少なくとも３０ｍＭの濃度で、非極性側基を有するアミノ酸もまた含む。一実施形態では、この培地は、約３０ｍＭの、非極性側基を有するアミノ酸を含む。一実施形態では、培地内に含まれるアミノ酸の総量の少なくとも３２モル％、少なくとも３３モル％、少なくとも３４モル％、少なくとも３５モル％、少なくとも３６モル％、少なくとも３７モル％、少なくとも３８モル％、少なくとも３９モル％、少なくとも４０モル％または少なくとも４１モル％は、非極性側基を有するアミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約４２モル％±１モル％が、非極性側基を有するアミノ酸である。非極性側基を有するアミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。

一実施形態では、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、この培地は、約１０ｍＭ〜３４ｍＭ、約１１ｍＭ〜３３ｍＭ、約１２ｍＭ〜３２ｍＭ、約１３ｍＭ〜３１ｍＭ、約１４ｍＭ〜３０ｍＭ、約１５ｍＭ〜２９ｍＭ、約１６ｍＭ〜２８ｍＭ、約１７ｍＭ〜２７ｍＭ、約１８ｍＭ〜２６ｍＭ、約１９ｍＭ〜２５ｍＭ、約２０ｍＭ〜２４ｍＭ、約２１ｍＭ〜２３ｍＭまたは約２２ｍＭの濃度で、非荷電極性側基を有するアミノ酸もまた含む。一実施形態では、この培地は、約２２ｍＭの、非荷電極性側基を有するアミノ酸を含む。別の一実施形態では、この培地は、約１２ｍＭの、非荷電極性側基を有するアミノ酸を含む。一実施形態では、培地内に含まれるアミノ酸の総量の約１４モル％〜４６モル％、約１５モル％〜４５モル％、約１６モル％〜４４モル％、約１７モル％〜４３モル％、約１８モル％〜４２モル％、約１９モル％〜４１モル％、約２０モル％〜４０モル％、約２１モル％〜３９モル％、約２２モル％〜３８モル％、約２３モル％〜３７モル％、約２４モル％〜３６モル％、約２５モル％〜３５モル％、約２６モル％〜３４モル％、約２７モル％〜３３モル％、約２８モル％〜３２モル％、約２９モル％〜３１モル％または約３０モル％が、非荷電極性側基を有するアミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約３０モル％±３モル％が、非荷電極性側基を有するアミノ酸である。非荷電極性側基を有するアミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。

一実施形態では、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、この培地は、約４ｍＭ〜１４ｍＭ、約５ｍＭ〜１３ｍＭ、約６ｍＭ〜１２ｍＭ、約７ｍＭ〜１１ｍＭ、約８ｍＭ〜１０ｍＭ、約９ｍＭまたは約４ｍＭの濃度で、ｐＨ６において負の電荷を有するアミノ酸（即ち、酸性アミノ酸）もまた含む。一実施形態では、この培地は、約９ｍＭの酸性アミノ酸を含む。一実施形態では、この培地は、９ｍＭ±１ｍＭの酸性アミノ酸を含む。一実施形態では、培地内に含まれるアミノ酸の総量の約８モル％〜１８モル％、約９モル％〜１７モル％、約１０モル％〜１６モル％、約１１モル％〜１５モル％、約１２モル％〜１４モル％または約１３モル％が、酸性アミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約１２．６モル％±１モル％が、酸性アミノ酸である。酸性アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。

一実施形態では、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、この培地は、少なくとも３．５ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも６ｍＭ、少なくとも７ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭまたは少なくとも１１ｍＭの濃度で、ｐＨ６において正の電荷を有するアミノ酸（即ち、塩基性アミノ酸）もまた含む。一実施形態では、この培地は、約１１ｍＭの塩基性アミノ酸を含む。一実施形態では、この培地は、約１１．４２ｍＭ±１ｍＭの塩基性アミノ酸を含む。一実施形態では、培地内に含まれるアミノ酸の総量の少なくとも５モル％、少なくとも６モル％、少なくとも７モル％、少なくとも８モル％、少なくとも９モル％、少なくとも１０モル％、少なくとも１１モル％、少なくとも１２モル％、少なくとも１３モル％、少なくとも１４モル％または少なくとも１５モル％が、塩基性アミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約１６モル％が、塩基性アミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約１５．８モル％±２．４モル％が、塩基性アミノ酸である。一実施形態では、培地中のアミノ酸の約２１モル％±３．２モル％が、塩基性アミノ酸である。塩基性アミノ酸には、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。

一実施形態では、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、この培地は、約３０ｍＭの非極性アミノ酸、約２２ｍＭの非荷電極性アミノ酸、約９ｍＭの酸性アミノ酸および約１１ｍＭの塩基性アミノ酸もまた含む。一実施形態では、培地中のアミノ酸のうち、約４２モル％が非極性アミノ酸であり、約３０モル％が非荷電極性アミノ酸であり、約１３モル％が酸性アミノ酸であり、約１６モル％が塩基性アミノ酸である。

オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せを含めることに加えて、一実施形態では、この培地は、マイクロモル濃度量の脂肪酸（または脂肪酸誘導体）およびトコフェロールを含む。一実施形態では、この脂肪酸には、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸およびオクタン酸のうちのいずれか１種または複数が含まれる。一実施形態では、この培地は、トコフェロール、リノール酸およびチオクト酸を含む。

一実施形態では、この培地は、少なくとも約７００μＭまたは少なくとも約２ｍＭの累積濃度で、他の栄養素および必須栄養素を含むビタミンの混合物もまた含む。一実施形態では、このビタミンの混合物は、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、Ｄ−パントテン酸（ｈｅｍｉＣａ）、リボフラビン、チアミンＨＣｌ、ビタミンＢ１２などのうち１種または複数を含む。一実施形態では、このビタミンの混合物は、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、Ｄ−パントテン酸（ｈｅｍｉＣａ）、リボフラビン、チアミンＨＣｌおよびビタミンＢ１２の全てを含む。

本発明の培地の種々の実施形態は、示された量のオルニチンまたはプトレシン＋とりわけ（ａ）アミノ酸；（ｂ）任意選択でヌクレオシド；（ｃ）二価カチオンの塩；（ｄ）脂肪酸およびトコフェロール；ならびに（ｅ）ビタミンを含む、化学的に規定された加水分解物を含まない無血清培地を含む、上記実施形態の組合せのいずれかを含む。一部の実施形態では、全ての少量の加水分解物が、ＯＳ培地に添加され得る。

本出願人らは、本発明の実施において、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せが添加される種々の基本培地またはそれらの組合せのうちの任意の１つまたは複数が使用され得ることを想定している。基本培地は、当技術分野で一般に公知であり、とりわけ以下が含まれる：イーグルＭＥＭＥ（最小必須培地）（Ｅａｇｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９５５年、１１２巻（３１６８号）：５０１〜５０４頁）、ハムＦ１２（Ｈａｍ、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９６５年、５３巻：２８８〜２９３頁）、Ｆ−１２ Ｋ培地、ダルベッコ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．、１９５２年８月；３８巻（８号）：７４７〜７５２頁）、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２ １：１、ＴｒｏｗｅｌｌのＴ８、Ａ２培地（ＨｏｌｍｅｓおよびＷｏｌｆ、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｌ．、１９６１年、１０巻：３８９〜４０１頁）、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地（ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＷａｙｍｏｕｔｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、１９４５年、３９巻（２号）：１８８〜１９９頁）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓら、Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、１９７１年、６９巻：１０５頁以下参照）、ＲＰＭＩ １６４０（Ｍｏｏｒｅら、Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ．、１９６７年、１９９巻：５１９〜５２４頁）、ＭＣＤＢ １０４／１１０培地（Ｂｅｔｔｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９８１年、７８巻（９号）：５５８８〜５５９２頁）、Ｖｅｎｔｒｅｘ ＨＬ−１培地、アルブミン−グロブリン培地（Ｏｒｒら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９７３年、２５巻（１号）：４９〜５４頁）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地、および無血清培地、例えばＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３００ Ｓｅｒｉｅｓ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）、プロタミン−亜鉛−インスリン培地（Ｗｅｉｓｓら、１９７４年、米国特許第４，０７２，５６５号）、ビオチン−フォレート培地（Ｃａｒｔａｙａ、１９７８年、米国再発行特許第３０，９８５号）、トランスフェリン−脂肪酸培地（Ｂａｋｅｒ、１９８２年、米国特許第４，５６０，６５５号）、トランスフェリン−ＥＧＦ培地（Ｈａｓｅｇａｗａ、１９８２年、米国特許第４，６１５，９７７号；Ｃｈｅｓｓｅｂｅｕｆ、１９８４年、米国特許第４，７８６，５９９号）、ならびに他の培地の順列（Ｉｎｌｏｗ、米国特許第６，０４８，７２８号；Ｄｒａｐｅａｕ、米国特許第７，２９４，４８４号；Ｍａｔｈｅｒ、米国特許第５，１２２，４６９号；Ｆｕｒｕｋａｗａ、米国特許第５，９７６，８３３号；Ｃｈｅｎ、米国特許第６，１８０，４０１号；Ｃｈｅｎ、米国特許第５，８５６，１７９号；Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ、米国特許第５，７０５，３６４号；Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ、米国特許第７，６６６，４１６号；Ｒｙｌｌ、米国特許第６，５２８，２８６号；Ｓｉｎｇｈ、米国特許第６，９２４，１２４号；Ｌｕａｎ、米国特許第７，４２９，４９１号；などを参照のこと）。

特定の一実施形態では、この培地は、化学的に規定されており、オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの両方の組合せに加えて以下を含む：ＣａＣｌ_２ ２Ｈ_２Ｏ；ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＫＣｌ；ＭｇＳＯ_４；ＮａＣｌ；Ｎａ_２ＨＰＯ_４または他のリン酸塩；ピルベート；Ｌ−アラニン；Ｌ−アルギニンＨＣｌ；Ｌ−アスパラギンＨ_２Ｏ；Ｌ−アスパラギン酸；Ｌ−システインＨＣｌ Ｈ_２Ｏ；Ｌ−グルタミン酸；グリシン；Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ Ｈ_２Ｏ；Ｌ−イソロイシン；Ｌ−ロイシン；Ｌ−リシンＨＣｌ；Ｌ−メチオニン；Ｌ−オルニチンＨＣｌ；Ｌ−フェニルアラニン；Ｌ−プロリン；Ｌ−セリン；Ｌ−スレオニン；Ｌ−トリプトファン；Ｌ−チロシン２Ｎａ ２Ｈ_２Ｏ；Ｌ−バリン；Ｄ−ビオチン；塩化コリン；葉酸；ミオイノシトール；ナイアシンアミド；ピリドキシンＨＣｌ；Ｄ−パントテン酸；リボフラビン；チアミンＨＣｌ；ビタミンＢ１２；ρ−アミノ安息香酸；エタノールアミンＨＣｌ；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８；リン酸ＤＬ−ａ−トコフェロール；リノール酸；Ｎａ_２ＳｅＯ_３；チオクト酸；およびグルコース；ならびに任意選択でアデノシン；グアノシン；シチジン；ウリジン；チミジン；およびヒポキサンチン２Ｎａ。

一実施形態では、本発明の培地の出発モル浸透圧濃度は、２００〜５００、２５０〜４００、２７５〜３５０または約３００ｍＯｓｍである。本発明の培地中での細胞の増殖の間、特に流加プロトコールに従う任意の供給の後、培養物のモル浸透圧濃度は、最大で約３５０、４００、４５０または５００ｍＯｓｍの高さまで増加し得る。

規定された培地のモル浸透圧濃度が約３００未満である一部の実施形態では、このモル浸透圧濃度は、特定した量を超えた１種または複数の塩の添加によって、約３００にされる。一実施形態では、モル浸透圧濃度は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マグネシウム塩、カルシウム塩、アミノ酸塩、脂肪酸の塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、塩であるキレーター、糖（例えば、ガラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、フコースなど）、ならびにそれらの組合せから選択される浸透圧調節物質のうちの１種または複数を添加することによって、所望のレベルまで増加される。一実施形態では、この浸透圧調節物質は、規定された培地中に既に存在する構成要素におけるその濃度を超えおよび上回って、添加される（例えば、糖が、糖構成要素について特定された濃度を超えおよび上回って、添加される）。

上記培地の各々および全ての実施形態、ならびに少なくとも約９０μＭのオルニチンを含む（または少なくとも約１００μＭのオルニチン＋少なくとも約２００μＭのプトレシンの組合せを含む）任意の他の無血清培地は、本明細書で以降、オルニチン補充（「ＯＳ」）培地と称される。逆に、オルニチンを含まない（もしくはオルニチン／プトレシンの組合せを含まない）培地、または１００μＭ未満のオルニチンを含む培地（もしくは１００μＭ未満のオルニチンおよび２００μＭ未満のプトレシンを含む培地）は、本明細書で以降、非オルニチン補充（「非ＯＳ」）培地と称される。

細胞培養物
本発明は、上記ＯＳ培地中に目的のタンパク質を発現する細胞株を含む細胞培養物を提供する。一実施形態では、この細胞培養物は、ユースポイント成分として培地に添加され得るまたは培地処方中に含まれ得る、インスリンを含む。一実施形態では、この細胞株は、生物治療剤タンパク質を生成することが可能な細胞を含む。タンパク質生物治療剤を生成するために慣用的に使用される細胞株の例には、とりわけ、初代細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ−ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＮＳ−１細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞およびニワトリ胚細胞が含まれる。一実施形態では、この細胞株は、ＣＨＯ細胞株、または大規模タンパク質生成のために最適化されたいくつかの特定のＣＨＯ細胞バリアントのうちの１つもしくは複数、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１である。

「細胞培養物」または「培養物」は、多細胞生物または組織の外側での細胞の増殖および成長を意味する。哺乳動物細胞に適切な培養条件は、当技術分野で公知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｄ． Ｒｉｃｋｗｏｏｄ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年）を参照のこと。哺乳動物細胞は、懸濁物中で、または固体基材に結合させながら、培養され得る。マイクロキャリアありまたはなしの、バッチ、流加、連続、半連続または灌流モードで動作する、流動床バイオリアクタ、中空線維バイオリアクタ、ローラーボトル、振盪フラスコまたは撹拌タンクバイオリアクタが、哺乳動物細胞培養のために利用可能である。細胞培養培地または濃縮供給培地は、培養の間、培養物に連続的に、または間隔を置いて添加され得る。例えば、培養物は、１日１回、１日毎に、３日毎に供給され得、またはモニタリングされている特定の培地構成要素の濃度が所望の範囲の外側にある場合に供給され得る。

動物細胞、例えばＣＨＯ細胞は、小規模培養物中で、例えば、約２５ｍｌの培地を有する１２５ｍｌコンテナ中で、約５０〜１００ｍｌの培地を有する２５０ｍｌコンテナ中で、約１００〜２００ｍｌの培地を有する５００ｍｌコンテナ中で、培養され得る。あるいは、これらの培養物は、例えば、約３００〜１０００ｍｌの培地を有する１０００ｍｌコンテナ、約５００ｍｌ〜３０００ｍｌの培地を有する３０００ｍｌコンテナ、約２０００ｍｌ〜８０００ｍｌの培地を有する８０００ｍｌコンテナ、および約４０００ｍｌ〜１５０００ｍｌの培地を有する１５０００ｍｌコンテナなど、大規模であり得る。製造のための培養物は、１０，０００Ｌまたはそれ超の培地を含み得る。例えばタンパク質治療剤の臨床的製造のための大規模細胞培養物は、典型的には、細胞が所望のタンパク質（複数可）を生成する間、数日間またはさらには数週間にわたって維持される。この時間の間に、培養物には、培養の過程の間に消費される構成要素、例えば栄養素およびアミノ酸を含む濃縮供給培地が補充され得る。濃縮供給培地は、任意の細胞培養培地処方に基づき得る。かかる濃縮供給培地は、その通常の有用な量の、例えば約５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１２×、１４×、１６×、２０×、３０×、５０×、１００×、２００×、４００×、６００×、８００×またはさらには約１０００×で、細胞培養培地の構成要素のほとんどを含み得る。濃縮供給培地は、流加培養プロセスで使用される場合が多い。

一部の実施形態では、この細胞培養培地には、細胞増殖またはタンパク質生成の過程の間に、添加物、ユースポイント成分またはユースポイント化学物質としても知られる「ユースポイント添加物」が補充される。ユースポイント添加物には、増殖因子または他のタンパク質、緩衝液、エネルギー供給源、塩、アミノ酸、金属およびキレーターのうちの任意の１種または複数を含む。他のタンパク質には、トランスフェリンおよびアルブミンが含まれる。サイトカインおよびケモカインが含まれる増殖因子は、当技術分野で一般に公知であり、細胞増殖、または一部の場合には細胞分化を刺激することが公知である。増殖因子は通常、タンパク質（例えば、インスリン）、小ペプチド、またはステロイドホルモン、例えばエストロゲン、ＤＨＥＡ、テストステロンなどである。一部の場合には、増殖因子は、細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）またはタンパク質生成を促進する非天然の化学物質、例えば、テトラヒドロフォレート（ＴＨＦ）、メトトレキセートなどであり得る。タンパク質およびペプチド増殖因子の非限定的な例には、アンジオポエチン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経増殖因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ｗｎｔシグナル伝達経路アゴニスト、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、胎仔ウシソマトトロピン（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈｉｎ）（ＦＢＳ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７などが含まれる。一実施形態では、この細胞培養培地には、ユースポイント添加物増殖因子インスリンが補充される。一実施形態では、培地中のインスリンの濃度、即ち、添加後の細胞培養培地中のインスリンの量は、約０．１μＭ〜１０μＭである。１種または複数のユースポイント添加物もまた、一部の実施形態の培地処方中に含まれ得る。

緩衝液は、当技術分野で一般に公知である。本発明は、任意の特定の緩衝液（単数または複数）に限定されず、いずれの当業者も、特定のタンパク質を生成する特定の細胞株との使用に適切な緩衝液または緩衝液系を選択できる。一実施形態では、ユースポイント添加物緩衝液は、ＮａＨＣＯ_３である。一実施形態では、このユースポイント添加物緩衝液は、ＮａＨＣＯ_３を含む。別の一実施形態では、この緩衝液はＨＥＰＥＳである。

細胞培養におけるユースポイント添加物としての使用のためのエネルギー供給源もまた、当技術分野で周知である。限定ではなく、一実施形態では、このユースポイント添加物エネルギー供給源は、グルコースである。特定の細胞株および生成されるタンパク質の特定のおよび具体的な要件を考慮して、一実施形態では、このグルコースは、培地中に約１〜２０ｍＭの濃度になるように添加され得る。一部の場合には、グルコースは、最大で１０ｇ／Ｌの高いレベルで添加され得る。

キレーターは、細胞培養およびタンパク質生成の分野で同様に周知である。四ナトリウムＥＤＴＡの二水和物（ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）およびクエン酸塩は、当技術分野で使用される２種の一般的キレーターであるが、他のキレーターが、本発明の実施において使用され得る。一実施形態では、ユースポイント添加物キレーターは、四ナトリウムＥＤＴＡ二水和物である。一実施形態では、ユースポイント添加物キレーターは、クエン酸塩、例えばＮａ_３Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７である。

一実施形態では、この細胞培養物には、例えばグルタミンなどの１種または複数のユースポイント添加物アミノ酸が補充され得る。一実施形態では、この細胞培養培地には、約１ｍＭ〜１３ｍＭの最終濃度で、ユースポイント添加物グルタミンが補充される。

他のユースポイント添加物は、種々の金属塩、例えば鉄、ニッケル、亜鉛および銅の塩のうちの１種または複数を含む。一実施形態では、この細胞培養培地には、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化第二鉄（ｆｅｒｒｉｃ ｃｈｌｒｏｉｄｅ）；および硫酸ニッケルのうちの任意の１種または複数が補充される。

一実施形態では、この細胞培養培地には、以下のユースポイント添加物のうちの任意の１種もしくは複数または全てが補充される：約２９．８ｍΜのＮａＨＣＯ３、約２ｍΜのグルタミン、約０．８６μΜのインスリン、約１１．１ｍΜのグルコース、約６．５４μΜの硫酸亜鉛、約０．１６８μΜの硫酸銅、約７５μΜの塩化第二鉄、約０．６３９μΜの硫酸ニッケル、約８５μΜのＥＤＴＡおよび約５０μΜのクエン酸塩。

一実施形態では、この培地は、流加プロセスに従う細胞培養の間に間隔を置いて補充される。流加培養は、当技術分野で一般に公知であり、最適化されたタンパク質生成のために使用される（Ｙ．Ｍ． Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． ２０１０年９月〜１０月；２６巻（５号）：１４００〜１０頁を参照のこと）。

細胞生存度、生存細胞密度および細胞倍加は、オルニチンもプトレシンも含まない培養物中で増殖した細胞と比較して改善される。細胞生存度に関して、ＯＳ培地中で増殖した細胞は、非ＯＳ培地中で増殖した類似のまたは同一の細胞の生存度よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％または少なくとも３倍大きい生存度を示す。

一部の実施形態では、ＯＳ培地中での生存哺乳動物細胞の倍加速度は、非ＯＳ培地中で培養した哺乳動物細胞の倍加速度よりも、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％または少なくとも３倍大きい。一部の実施形態では、ＯＳ培地中の生存哺乳動物細胞の倍加速度は、非ＯＳ培地中の哺乳動物細胞の倍加速度よりも、約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％大きい。

一部の実施形態では、活発にサイクルしている哺乳動物細胞の倍加時間は、ＯＳ培地中で、３０時間未満、２９時間未満、２８時間未満、２７時間未満、２６時間未満、２５時間未満、２４時間未満、２３時間未満、２２時間未満、２１時間未満、２０時間未満、１９時間未満または１８時間未満である。一部の実施形態では、活発に増殖している哺乳動物細胞の倍加時間は、ＯＳ培地中で２８時間未満である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞の倍加時間は、ＯＳ培地中で、約２７±１時間、約２６±１時間、約２５±１時間、約２４±１時間、約２３±１時間、約２２±１時間または約２１±１時間である。一部の実施形態では、活発にサイクルしている哺乳動物細胞の倍加時間は、ＯＳ培地中で約２４±１時間である。一部の実施形態では、ＯＳ培地中で培養された活発に分裂している細胞の倍加時間は、非ＯＳ培地中で培養された活発にサイクルしている細胞の倍加時間よりも、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％または少なくとも２５％短い。

タンパク質生成
化学的に規定されたＯＳ培地およびＯＳ培地中で細胞を培養する方法に加えて、本発明は、ＯＳ培地中で培養された細胞において、タンパク質、例えば、治療的に有効な抗体または他のバイオ医薬品薬物物質を生成する方法を提供する。

一部の実施形態では、ＯＳ培地中で培養された哺乳動物細胞によるタンパク質の生成の速度は、非ＯＳ培地中で培養された同一の哺乳動物細胞によるタンパク質の生成の速度よりも、少なくとも５％、１０％、１５％または２０％大きい。一部の実施形態では、ＯＳ培地中で培養された細胞におけるタンパク質の生成の速度は、少なくとも１ρｇ／細胞／日（「ＰＣＤ」）、少なくとも２ＰＣＤ、少なくとも３ＰＣＤ、少なくとも４ＰＣＤ、少なくとも５ＰＣＤ、少なくとも６ＰＣＤ、少なくとも７ＰＣＤ、少なくとも８ＰＣＤ、少なくとも９ＰＣＤ、少なくとも１０ＰＣＤ、少なくとも１５ＰＣＤ、少なくとも２０ＰＣＤ、少なくとも２５ＰＣＤ、少なくとも３０ＰＣＤ、少なくとも３５ＰＣＤ、少なくとも４０ＰＣＤ、少なくとも４５ＰＣＤ、少なくとも５０ＰＣＤ、少なくとも７５ＰＣＤまたは少なくとも１００ＰＣＤである。

一部の実施形態では、１リットルの培養培地当たりのタンパク質生成物のグラム数で表され得る、ＯＳ培地中で培養された細胞からのこのタンパク質の生成収量または力価は、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．２ｇ／Ｌ、少なくとも１．４ｇ／Ｌ、少なくとも１．６ｇ／Ｌ、少なくとも１．８ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ、少なくとも３ｇ／Ｌ、少なくとも、３．５ｇ／Ｌ、少なくとも４ｇ／Ｌ、少なくとも４．５ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも５．５ｇ／Ｌ、少なくとも６ｇ／Ｌ、少なくとも６．５ｇ／Ｌ、少なくとも７ｇ／Ｌ、少なくとも７．５ｇ／Ｌ、少なくとも８ｇ／Ｌ、少なくとも８．５ｇ／Ｌ、少なくとも９ｇ／Ｌ、少なくとも９．５ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌまたは少なくとも２０ｇ／Ｌである。

一部の実施形態では、このタンパク質生成物（目的のタンパク質）は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合性抗体断片、単鎖抗体、ディアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）もしくはテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、Ｆａｂ断片もしくはＦ（ａｂ’）２断片、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体またはＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、この抗体はＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、この抗体はＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、この抗体はＩｇＧ４抗体である。

一部の実施形態では、この目的のタンパク質は、Ｆｃ部分および別のドメインを含む組換えタンパク質（例えば、Ｆｃ−融合タンパク質）である。一部の実施形態では、Ｆｃ−融合タンパク質は、Ｆｃ部分にカップリングされた受容体の１つまたは複数の細胞外ドメイン（複数可）のうちの１つまたは複数を含む受容体Ｆｃ−融合タンパク質である。一部の実施形態では、このＦｃ部分は、ＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインが後に続くヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、この受容体Ｆｃ−融合タンパク質は、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいずれかと結合する２つまたはそれ超の別個の受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ−融合タンパク質は、ｔｒａｐ、例えば、ＩＬ−１ ｔｒａｐ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＩｌ−１Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ−１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含むリロナセプト；その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９２７，００４号を参照のこと）、またはＶＥＧＦ ｔｒａｐ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含むアフリベルセプト；米国特許第７，０８７，４１１号および米国特許第７，２７９，１５９号を参照のこと）などである。

本発明は、タンパク質生成のための任意の特定の型の細胞に限定されない。タンパク質生成に適切な細胞型の例には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、細菌細胞および酵母細胞が含まれる。これらの細胞は、組換え遺伝子発現のためのベクターで形質転換された幹細胞もしくは組換え細胞、またはウイルス生成物を生成するためにウイルスでトランスフェクトされた細胞であり得る。これらの細胞は、目的のタンパク質をコードする組換え異種ポリヌクレオチド構築物を含み得る。この構築物は、エピソームであり得、または細胞のゲノム中に物理的に組み込まれるエレメントであり得る。これらの細胞はまた、異種ポリペプチド構築物上にコードされたそのタンパク質を有することなく、目的のタンパク質を生成し得る。言い換えると、この細胞は、抗体を生成するＢ細胞のように、目的のタンパク質を天然にコードし得る。これらの細胞は、初代細胞、例えばニワトリ胚細胞、または初代細胞株でもあり得る。有用な細胞の例には、ＢＳＣ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ−ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ニワトリ胚細胞、ＮＳ−１細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞およびＣＨＯ細胞が含まれる。種々の実施形態では、この細胞株は、ＣＨＯ細胞誘導体、例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ ＤＵＸ Ｂ−１１、ＣＨＯ ＤＧ−４４、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ、ＧＳ−ＣＨＯ、Ｓ−ＣＨＯまたはＣＨＯ ｌｅｃ変異体株である。

一実施形態では、ＣＨＯ細胞であるこの細胞は、タンパク質を異所的に発現する。一実施形態では、このタンパク質は、免疫グロブリン重鎖領域、例えばＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３領域を含む。一実施形態では、このタンパク質は、ヒトまたはげっ歯類の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。一実施形態では、このタンパク質は、ヒトまたはげっ歯類の免疫グロブリンＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。一実施形態では、このタンパク質は、ヒンジ領域ならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。具体的な一実施形態では、このタンパク質は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む。具体的な一実施形態では、このタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。具体的な一実施形態では、このタンパク質は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。具体的な一実施形態では、このタンパク質は、抗体、例えばヒト抗体、げっ歯類抗体またはキメラヒト／げっ歯類抗体（例えば、ヒト／マウス、ヒト／ラットまたはヒト ハムスター）である。

生成期は、個々のフラスコおよびシェーカーフラスコまたはウェイブバッグから、１リットルのバイオリアクタまで、および大規模な個々のバイオリアクタまでの、任意の規模の培養物で実施され得る。大規模プロセスは、約１００リットル〜２０，０００リットルまたはそれ超の体積で実施され得る。いくつかの手段のうちの１つまたは複数、例えば温度シフトまたは化学的誘導が、タンパク質生成を制御するために使用され得る。増殖期は、生成期よりも高い温度で生じ得る。例えば、増殖期は、約３５℃〜３８℃の第１の温度において生じ得、生成期は、約２９℃〜３７℃の、任意選択で約３０℃〜３６℃または約３０℃〜３４℃の第２の温度において生じ得る。さらに、タンパク質生成の化学的誘導剤、例えばカフェイン、ブチレート、タモキシフェン、エストロゲン、テトラサイクリン、ドキシサイクリンおよびヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）が、温度シフトと同時発生的に、温度シフトの前に、または温度シフトの後に、添加され得る。誘導剤が温度シフトの後に添加される場合、これらの誘導剤は、温度シフトの１時間後〜５日後、例えば、温度シフトの１〜２日後に添加され得る。生成細胞培養物は、ケモスタットなどにおいて（Ｃ． Ａｌｔａｍｉｒａｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． ２００１年１１月〜１２月；１７巻（６号）：１０３２〜４１頁を参照のこと）、または流加プロセス（Ｈｕａｎｇ、２０１０年）に従って、連続供給培養系として実行され得る。

本発明は、細胞培養プロセスを介したタンパク質生成を改善するために有用である。本発明において使用される細胞株は、商業的または科学的に興味を持たれるポリペプチドを発現させるために、遺伝子操作され得る。細胞株を遺伝子操作することは、宿主細胞に所望の組換えポリペプチドを発現させるように、組換えポリヌクレオチド分子で細胞をトランスフェクト、形質転換もしくは形質導入すること、または他の方法で変更すること（例えば、相同組換えおよび遺伝子活性化、または組換え細胞と非組換え細胞との融合による）を含む。目的のポリペプチドを発現させるために細胞または細胞株を遺伝子操作するための方法およびベクターは、当業者に周知である；例えば、種々の技術が、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ａｕｓｕｂｅｌら、編（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８年および四半期毎の改定）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）；Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ． Ｊ．、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９９０年、１５〜６９頁中に示されている。培養物中での増殖に適切な広範な種々の細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）および供給業者から入手可能である。産業において一般に使用される細胞株の例には、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶｌ（Ｃｏｓを含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞株（例えば、ＮＳＯ、ＮＳｌ）、ＰＣ１２、ＷＩ３８細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。ＣＨＯ細胞は、複雑な組換えタンパク質、例えばサイトカイン、凝固因子および抗体の生成のために広く使用される（Ｂｒａｓｅｌら（１９９６年）、Ｂｌｏｏｄ ８８巻：２００４〜２０１２頁；Ｋａｕｆｍａｎら（１９８８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３巻：６３５２〜６３６２頁；ＭｃＫｉｎｎｏｎら（１９９１年）、Ｊ ＭｏＩ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６巻：２３１〜２３９頁；Ｗｏｏｄら（１９９０年）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５巻：３０１１〜３０１６頁）。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損変異体細胞株（Ｕｒｌａｕｂら（１９８０年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７巻：４２１６〜４２２０頁）、ＤＸＢｌ １およびＤＧ−４４が望ましいＣＨＯ宿主細胞株であるが、それは、効率的なＤＨＦＲ選択可能で増幅可能な遺伝子発現系が、これらの細胞において高レベルの組換えタンパク質発現を可能にするからである（Ｋａｕｆｍａｎ ＲＪ．（１９９０年）、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５巻：５３７〜５６６頁）。さらに、これらの細胞は、接着培養物または懸濁培養物として操作することが容易であり、比較的良好な遺伝的安定性を示す。ＣＨＯ細胞およびそれらによって組換え発現されたタンパク質は、広範に特徴付けられており、規制機関によって臨床的および商業的製造における使用のために承認されている。一部の実施形態では、このＣＨＯ細胞株は、米国特許出願公開第２０１０／０３０４４３６号、米国特許出願公開第２００９／０１６２９０１号および米国特許出願公開第２００９／０１３７４１６号、ならびに米国特許第７，４５５，９８８号、米国特許第７，４３５，５５３号および米国特許第７，１０５，３４８号に記載されるような細胞株である。

本発明は、本発明の個々の態様または実施形態の例示として解釈される、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されることはない。機能的に等価な方法および構成要素が、本発明の範囲内である。本明細書に記載されるものに加えて、本発明の種々の改変が、上述の説明および添付の図面から、当業者に明らかである。かかる改変は、本発明の範囲内に入る。

本発明は、無血清細胞培養培地へのオルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンの組合せの添加が、増加した細胞増殖、生存度、および目的のタンパク質を発現する組換え操作された動物細胞株（または天然細胞）からのポリペプチド生成を生じ、それによって、培養物の頑強さを増強し、目的のポリペプチドの収量を改善するという発見に、一部基づく。

（実施例１）
改善された生存細胞培養物密度
２５０ｍＬ振盪フラスコに、ＣＨＯ Ｋ１から誘導した組換え抗体生成細胞株の種培養物を接種した。接種した細胞を、３６．５℃で７日間増殖させ、３日目および５日目にグルコースを供給した。細胞を、２つの別々の化学的に規定された（加水分解物を含まない無血清の）培地の各々において増殖させた。第１の培地は、約７５ｍＭのアミノ酸を含み（培地１）、第２の培地は、約４０ｍＭのアミノ酸を含み（培地２）、両方の処方が、２．５μＭ（０．４ｍｇ／Ｌ）以下のプトレシンを含んだ。別の群の培地条件を、７．５ｇ／Ｌの濃度のダイズ加水分解物を培地２に添加することによって生成した。３つの対照培地の各々に、約５９３μＭのオルニチン（１００ｍｇ／ＬのＬ−オルニチン・ＨＣｌとして）、または約５９３μＭのオルニチン（１００ｍｇ／ＬのＬ−オルニチン・ＨＣｌとして）および約７１４μＭのプトレシン（１１５ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌとして）の組合せを添加した。３ｍＬ培養物のアリコートを、３日目、５日目および７日目に取り出し、生存細胞計数を、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ＦＬＥＸ（商標）機器（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）でトリパンブルー排除を使用して実施した。０日目に、全ての培養物が、１ｍＬ当たり０．８×１０^６の生存細胞を含んだ。所与の培地（培地１、培地２または培地２＋ダイズ）について、７日の期間にわたる生存細胞計数により、オルニチン（ｏｒｎｉｔｉｈｉｎｅ）またはオルニチン＋プトレシンを補充した培地中で増殖したＣＨＯ細胞が、増加した生存細胞密度を有したことが明らかになった。この効果は、７日の期間の間、加水分解物を含まない培地において特に顕著であった（即ち、生存細胞密度における２倍〜４倍またはそれ超の増加）。加水分解物を含まないＯＳ培地２は、ダイズ含有非ＯＳ培地２と同等に機能し、ダイズ加水分解物の細胞増殖利益がオルニチン置き換えによって複製できることを示す。オルニチンまたはオルニチンおよびプトレシンを培地２＋ダイズに添加することによって増加した細胞密度もまた観察された。結果を表１に示す。

本発明者らはまた、約７５ｍＭのアミノ酸および０．４ｍｇ／ＬのプトレシンＨＣｌを含む培地３（「培地３」）における生存細胞密度に対する種々の量のオルニチン・ＨＣｌ（即ち、５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬおよび１５０ｍｇ／ｍＬ）の影響を試験した。ＣＨＯ Ｋ１から誘導した組換え抗体生成細胞株の単一の種訓練培養物を使用して、１５ｍＬの作業体積で０．４×１０^６細胞／ｍＬで、５０ｍＬ ＴｕｂｅＳｐｉｎ（登録商標）Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ（ＴＰＰ）を接種した。細胞を、３７℃インキュベーター中で３日間増殖させた。３ｍＬ培養物のアリコートを、３日目に取り出し、生存細胞計数を、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ＦＬＥＸ（商標）機器（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）でトリパンブルー排除を使用して実施した。３つ全てのレベルのオルニチンが、２倍よりも僅かに多く、平均して細胞密度を改善した（Ｎ＝３）。結果を表２に示す。

（実施例２）
改善された細胞培養物の倍加時間
対数増殖期にある、ＣＨＯ Ｋ１細胞から誘導した組換え抗体生成細胞株の倍加時間を、種々の細胞培養培地条件下で決定した。種訓練培養物を、３つの別々の培地：培地１、培地２、およびダイズ加水分解物を含む培地２（培地２＋ダイズ）の各々において、１４日間の期間にわたって２５０ｍＬシェーカーフラスコ中で３６．５℃で継代した。１ｍＬのアリコートを、０日目および種訓練継代の時点（２日毎または３日毎）で各条件から取り出し、生存細胞計数を、ＣＤＶ（商標）機器（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）でトリパンブルー排除を使用して実施した。培地１を、未補充で、または１００ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌもしくは１１５ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌおよび１００ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌの両方を補充して試験した。低プトレシン・２ＨＣｌ（０．４ｍｇ／Ｌ）を含む培地２を、未補充で、または１００ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌもしくは１１５ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌおよび１００ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌの両方を補充して試験した。結果を表３および４に示す。プトレシンありまたはなしのいずれかでの培地１へのオルニチン補充が、顕著な増殖を達成するために必要であった。オルニチンまたはオルニチン＋プトレシンを、加水分解物を含まない培地２に補充することで、細胞倍加時間は約２５％〜３０％減少した。倍加時間はまた、加水分解物含有培地２へのオルニチンまたはオルニチン＋プトレシンの添加の際に、より小さい程度まで低減された。

（実施例３）
改善された抗体力価
オルニチンまたはオルニチン＋プトレシンを含めることが培養物中の細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および生存細胞密度を改善することを確立してから、本発明者らは、組換えタンパク質生成力価に対するこれらの条件の影響をさらに調査した。本発明者らは、ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞株による組換えＩｇＧの発現および分泌を試験した。この実験では、平均抗体力価を、種々の培地形式下の培養物中で７日目に決定した。上記のように、低いプトレシン（０．４ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌ）、オルニチン（１００ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌ）、ならびにオルニチンおよびプトレシンの両方（１００ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌ／１１５ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌ）を含む培地１を試験した。低いプトレシン（０．４ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌ）、オルニチン（１００ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌ）、ならびにオルニチンおよびプトレシンの両方（１００ｍｇ／Ｌのオルニチン・ＨＣｌ／１１５ｍｇ／Ｌのプトレシン・２ＨＣｌ）を含む培地２および培地２＋ダイズもまた試験した。全ての場合において、オルニチンまたはオルニチンおよび０．４ｍｇ／Ｌ超のレベルのプトレシンを含めることは、顕著により高いタンパク質力価、即ち、少なくとも約２倍高い力価を生じた。結果を表５に示す。

本発明者らは、抗体生成に対する、培地３中の種々の量のオルニチン・ＨＣｌ（即ち、５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬおよび１５０ｍｇ／ｍＬ）の影響もまた試験した。ＣＨＯ Ｋ１から誘導した組換え抗体生成細胞株の単一の種訓練培養物を使用して、１５ｍＬの作業体積で０．４×１０^６細胞／ｍＬで、５０ｍＬ ＴｕｂｅＳｐｉｎ（登録商標）Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ（ＴＰＰ）に播種した。細胞を、３７℃インキュベーター中で３日間増殖させた。３つ全てのレベルのオルニチン補充が、５０％よりも僅かに多く、平均して抗体力価を改善した（Ｎ＝３）。結果を表６に示す。

Claims (29)

1. ０．６±０．０９ｍＭのオルニチンおよび０．７１４±０．１１ｍＭのプトレシンを含む、血清および外因性タンパク質加水分解物を含まない細胞培養培地。
2. （a）前記培地が、≧４０±６ｍＭのアミノ酸またはその塩の混合物を含む；
   （b）前記培地が、１種または複数の脂肪酸を含む；
   （c）前記培地が、ヌクレオシドの混合物を含む；
   （d）前記培地が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンを含む；
   （e）前記培地が、１種または複数の二価カチオンを含む；ならびに／または
   （f）前記培地が、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含む、
   請求項１に記載の細胞培養培地。
3. 前記アミノ酸の混合物が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる、請求項２に記載の細胞培養培地。
4. 前記１種または複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸およびオクタン酸からなる群より選択される、請求項２または３に記載の細胞培養培地。
5. 前記ヌクレオシドの混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンからなる群より選択される１種または複数を含む、請求項２乃至４のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
6. 前記二価カチオンが、マグネシウム、カルシウムまたは両方である、請求項２乃至５のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
7. 細胞を培養するための方法であって、（ａ）請求項１乃至６のいずれか一項に記載の細胞培養培地を提供するステップ、および（ｂ）前記細胞培養培地中で細胞を成長させるかまたは維持して、細胞培養物を形成するステップを含む、方法。
8. 前記細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項８に記載の方法。
10. 前記細胞が、目的のタンパク質を発現し、および
    （ａ）前記目的のタンパク質が抗原結合性タンパク質である；
    （ｂ）前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む；ならびに／または
    （ｃ）前記目的のタンパク質が受容体−Ｆｃ−融合タンパク質である、
    請求項８または９に記載の方法。
11. 前記受容体−Ｆｃ−融合タンパク質が、ｔｒａｐタンパク質である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ｔｒａｐタンパク質が、ＩＬ−１アンタゴニストまたはＶＥＧＦアンタゴニストである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記目的のタンパク質が、抗体または抗体断片である、請求項１０に記載の方法。
14. 前記抗体または前記抗体断片が、組換えヒト抗体またはその断片である、請求項１３に記載の方法。
15. （ａ）前記細胞が、前記細胞培養培地中で培養した場合に、≦３０時間の平均倍加時間を有する；
    （ｂ）前記細胞が、前記細胞培養培地中で培養した場合に、≦２４時間の平均倍加時間を有する；
    （ｃ）前記細胞が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地において増殖した細胞の平均倍加時間の少なくとも３分の１である平均倍加時間を有する；
    （ｄ）前記細胞培養物が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも１５％大きい生存細胞計数密度に達することが可能である；
    （ｅ）前記細胞培養物が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞培養物よりも少なくとも３倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である；ならびに／または
    （ｆ）前記方法が、１種または複数のユースポイント添加物を前記細胞培養培地に添加するステップを含む、
    請求項７乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記ユースポイント添加物が、ＮａＨＣＯ_３、グルタミン、インスリン、グルコース、ＣｕＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、ＦｅＣｌ_３、ＮｉＳＯ_４、Ｎａ_４ ＥＤＴＡおよびクエン酸Ｎａ_３からなる群より選択される１種または複数を含む、請求項１５に記載の方法。
17. タンパク質を生成するための方法であって、
    （ａ）目的のタンパク質をコードする配列を含む核酸を細胞中に導入するステップ；
    （ｂ）前記核酸を保有する細胞を選択するステップ；
    （ｃ）請求項１乃至６のいずれか一項に記載の細胞培養培地において、または請求項７乃至１６のいずれか一項に記載の方法に従って、選択された前記細胞を培養するステップ；ならびに
    （ｄ）前記細胞において前記目的のタンパク質を発現させるステップであって、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される、ステップ
    を含む、方法。
18. 前記細胞が、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、またはＢＨＫ細胞である、請求項１７に記載の方法。
19. （ａ）前記目的のタンパク質が抗原結合性タンパク質である；
    （ｂ）前記目的のタンパク質がＦｃドメインを含む；ならびに／または
    （ｃ）前記目的のタンパク質が、受容体−Ｆｃ−融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、可溶性ＴＣＲ−Ｆｃ融合タンパク質、抗体、Ｆｃ−融合タンパク質およびＳｃＦｖタンパク質からなる群より選択される、
    請求項１７または１８に記載の方法。
20. （ａ）前記目的のタンパク質が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも７％大きい平均７日目力価で生成される；
    （ｂ）前記目的のタンパク質が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも１４％大きい平均７日目力価で生成される；
    （ｃ）前記目的のタンパク質が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも８０％大きい平均７日目力価で生成される；
    （ｄ）前記目的のタンパク質が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも２倍大きい平均７日目力価で生成される；ならびに／または
    （ｅ）前記目的のタンパク質が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも３倍大きい平均７日目力価で生成される、
    請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記目的のタンパク質が組換えヒト抗体である、請求項１７乃至２０のいずれか一項に記載の方法。
22. ０．６±０．０９ｍＭのオルニチンおよび０．７１４±０．１１ｍＭのプトレシンを含む細胞培養培地中で細胞を培養するステップであって、前記細胞が目的の外因性タンパク質をコードする核酸を含む、ステップ；ならびに
    前記細胞から前記目的の外因性タンパク質を生成するステップ
    を含む、方法。
23. 前記細胞が、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＣＨＯ細胞からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
24. ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＣＨＯ細胞からなる群より選択される細胞を提供するステップ；ならびに
    ０．６±０．０９ｍＭのオルニチンおよび０．７１４±０．１１ｍＭのプトレシンを含む細胞培養培地中で前記細胞を培養するステップ
    を含む、方法。
25. 前記細胞が、目的の外因性タンパク質を発現する、請求項２４に記載の方法。
26. 前記目的の外因性タンパク質が、
    （ａ）抗体；
    （ｂ）抗原結合タンパク質；
    （ｃ）Ｆｃドメインを含むタンパク質；ならびに
    （ｄ）受容体−Ｆｃ−融合タンパク質
    からなる群より選択される、請求項２２、２３および２５のいずれか一項に記載の方法。
27. （ａ）前記細胞が、前記細胞培養培地中で培養した場合に、≦２３時間の平均倍加時間を有する；
    （ｂ）前記細胞が、前記細胞培養培地中で培養した場合に、≦２１時間の平均倍加時間を有する；
    （ｃ）前記細胞が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中で増殖された細胞の平均倍加時間と比較した場合、少なくとも７０％減少した平均倍加時間を有する；または
    （ｄ）前記細胞が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中で増殖された細胞の平均倍加時間と比較した場合、少なくとも２２％減少した平均倍加時間を有する、
    請求項２４乃至２６のいずれか一項に記載の方法。
28. （ａ）前記細胞が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中で培養された類似の細胞よりも少なくとも１５％大きい生存細胞計数密度に達することが可能である；または
    （ｂ）前記細胞が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中で培養された類似の細胞よりも２倍〜４倍大きい生存細胞計数密度に達することが可能である、
    請求項２４乃至２７のいずれか一項に記載の方法。
29. （ａ）前記目的のタンパク質が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均力価よりも少なくとも４０％大きい平均最終力価で生成される；または
    （ｂ）前記目的のタンパク質が、２．５μＭ以下のプトレシンを含み、およびオルニチンを全く含まない対照細胞培養培地中の類似の細胞によって生成される平均７日目力価よりも少なくとも２倍大きい平均７日目力価で生成される、
    請求項２２乃至２５のいずれか一項に記載の方法。