RS59077B1 - Anti-egfrviii antitela i njihova primena - Google Patents

Anti-egfrviii antitela i njihova primena

Info

Publication number
RS59077B1
RS59077B1 RS20191002A RSP20191002A RS59077B1 RS 59077 B1 RS59077 B1 RS 59077B1 RS 20191002 A RS20191002 A RS 20191002A RS P20191002 A RSP20191002 A RS P20191002A RS 59077 B1 RS59077 B1 RS 59077B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
egfrviii
antigen
antibodies
binding
Prior art date
Application number
RS20191002A
Other languages
English (en)
Inventor
Jessica R Kirshner
Douglas Macdonald
Gavin Thurston
Joel H Martin
Frank Delfino
Thomas Nittoli
Marcus Kelly
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52875228&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59077(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS59077B1 publication Critical patent/RS59077B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001 ] Sadašnji pronalazak se odnosi na humana antitela i fragmente humanih antitela za vezivanje antigena koji specifično vezuju delecione mutante receptora humanog epidermalnog faktora rasta (EGFR), posebno, delecionog mutanta klase III, EGFRvIII, i terapeutske i dijagnostičke metode korišćenja ovih antitela.
POZADINA
[0002 ] Prekomerna ekspresija i/ili genska amplifikacija receptora epidermalnog faktora rasta (EGF), ili EGFR, zabeležena je kod više humanih tumora, uključujući one u karcinomu dojke, jajnika, bešici, mozgu i različitim skvamoznim karcinomima (Wong, A.J. i sar., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6899-6903; Harris i sar., 1992, Natl. Cancer Inst. Monogr.11:181-187). Međutim, ciljanje EGFR-a kao anti-neoplastične metode lečenja je problematično pošto mnoga normalna tkiva takođe, izražavaju ovaj receptor i mogu se ciljati zajedno sa neoplastičnim ciljevima. U međuvremenu, objavljeno je da mnogi glioblastomi koji imaju amplifikaciju gena EGFR-a često sadrže preuređenje gena (Ekstrand, A.J. i sar., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4309-4313; Wong A.J. i sar., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2965-2969). U jednoj studiji, nađeno je da 17 od 44 glioblastoma ima jednu ili više promena u sekvenci koja kodira EGFR, a svi ovi slučajevi su sadržali amplifikovani EGFR, dok nijedan od 22 slučaja bez genske amplifikacije nije pokazao bilo koje abnormalnosti sekvence specifične za tumor (Frederick, L. i sar., 2000, Cancer Res 60:1383-1387). Takođe, ista studija je pokazala da se kod pojedinačnih tumora može detektovati više tipova mutacija EGFR-a.
[0003] Varijanta klase III EGFR-a (EGFRvIII) je najčešće pronađena varijanta EGFR-a kod glioblastoma (Bigner i sar., 1990, Cancer Res 50: 8017-8022; Humphrey i sar., 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87: 4207-4211, Yamazaki i sar., 1990, Jap J Cancer Res 81: 773-779; Ekstrand i sar., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89: 4309-4313; Wikstrand i sar., 1995, Cancer Res 55: 3140-3148; i Frederick i sar., 2000, Cancer Res 60: 1383-1387). EGFRvIII je karakterisan delecijom egzona 2-7 EGFR gena, što rezultira unutar okvira delecijom 801 parova baza kodirajućeg regiona, tj., delecijom 6-273 aminokiselinskih ostataka (na osnovu broja ostataka zrelog EGFR-a), kao i generisanje novog glicina na fuzionom spoju (Humphrey i sar., 1988, Cancer Res 48: 2231-2238; Yamazaki i sar., 1990, supra). Pokazano je da EGFRvIII ima ligand-nezavisnu, slabu ali konstitutivno aktivnu kinaznu aktivnost, kao i povećanu tumorogenost (Nishikawa i sar., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:7727-7731; i Batra i sar., 1995, Ćelijski rast i diferencijacija 6: 1251-1259). Pored glioma, EGFRvIII je otkriven u duktalnom i intraduktalnom karcinomu dojke (Wikstrand i sar., 1995, Cancer Res 55: 3140-3148), karcinomima pluća koji nisu mikrocelularni (Garcia de Palazzo i sar., 1993, Cancer Res 53: 3217-3220), karcinomima jajnika (Moscatello i sar., 1995, Cancer Res 55:5536-5539), karcinomu prostate (Olapade-Olaopa i sar., 2000, British J Cancer 82: 186-194), i skvamoznom ćelijskom karcinomu glave i vrata (Tinhofer i sar., 2011, Clin Cancer Res 17 (15): 5197-5204). Suprotno tome, ove i druge studije pokazuju da normalna tkiva ne izražavaju EGFRvIII (Garcia de Palazzo i sar., 1993, supra; Wikstrand i sar., 1995, supra; i Wikstrand i sar., 1998, J Neuro Virol 4:148-158). Visoko specifična tumorska priroda EGFRvIII ga čini posebno korisnim ciljem za lečenje raka i tumora koji eksprimiraju ovaj molekul.
[0004] Sekvence nukleinske kiseline i aminokiseline humanog EGFR-a prikazane su u SEK ID BR-a: 145 i 146, respektivno, a aminokiselinska sekvenca EGFRvIII je prikazana u SEK ID BR: 147. Antitela za EGFRvIII su opisana u, na primer, US 5,212,290, US 7,736,644, US 7,589,180 i US 7,767,792. WO 2009/067242 opisuje anti EGFRvIII antitelo 11F8. WO 2006/009694 opisuje anti EGFRvIII antitelo cetuksimab. Freeman i sar. (J. Clin. Oncol., 26 ( Prilog 15): 14536, 2008) opisuju panitumumab i cetuksimab. WO 2005/010151 opisuje anti EGFRvIII antitela koja se vezuju unutar spojnog peptida. US 2009/269343 opisuje antitela koja vezuju EGFR i anti EGFRvIII. WO 2010/096434 opisuje anti EGFRvIII antitela mAt806, 528 i DH8.3. Modjtahedi i sar. (Int. J. Cancer 105(2):273-280, 2003) opisuju anti EGFRvIII antitelo ICR62. Jiang i sar. (J. Biol. Chem, 286(7): 5913-5920) opisuju anti EGFRvIII antitelo CH12.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
[0005] Sadašnji pronalazak obezbeđuje izolovana antitela i njihove fragmente za vezivanje antigena koji specifično vezuju humani EGFRvIII, pri čemu antitelo ili njegov fragment sadrže kombinaciju HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 aminokiselinskih sekvenci od SEK ID BR-a: 36/38/40/44/46/48. Antitela prema pronalasku su korisna, između ostalog, za ciljanje tumorskih ćelija koje izražavaju EGFRvIII. Anti-EGFRvIII antitela prema pronalasku i njihovi delovi koji se vezuju za antigen, mogu biti korišćeni samostalno u nemodifikovanom obliku, ili mogu biti uključeni kao deo konjugata antitelo-lek ili bispecifičnog antitela.
[0006] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutski preparat koji sadrži antitelo ili njegov fragment prema pronalasku koji specifično vezuju EGFRvIII i farmaceutski prihvatljiv nosač. Antitelo ili njegov fragment, mogu biti rekombinantno humano antitelo ili njegov fragment. U povezanom aspektu, pronalazak karakteriše preparat koji je kombinacija anti-EGFRvIII antitela i drugog terapeutskog agensa. U jednoj realizaciji, drugi terapeutski agens je bilo koji agens koji je povoljno kombinovan sa anti-EGFRvIII antitelom. Sadašnji pronalazak takođe, obezbeđuje konjugate antitelo-lek (ADC) koji sadrže anti-EGFRvIII antitelo konjugovano sa citokosičnim agensom. Primerne kombinovane terapije, koformulacije i ADC-i koji uključuju anti-EGFRvIII antitela prema sadašnjem pronalasku su ovde opisani na drugom mestu.
[0007] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje konjugat antitela i leka (ADC) za upotrebu u postupku za lečenje kancera, smanjenje rasta tumora i/ili izazivanja regresije tumora kod pacijenta, ADC koji sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i jedan citotoksin, pri čemu (a) antitelo ili antigen-vezujući fragment ADC-a specifično vezuje EGFRvIII, ali ne vezuje spojni peptid od SEK ID BR: 148 ili peptid od SEK ID BR: 165 i pri čemu antitelo ili njegov fragment sadrži kombinaciju HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 aminokiselinskih sekvenci od SEK ID BR-a: 36/38/40/44/46/48 i postupak obuhvata primenu ADC-a kod pacijenta kome je potreban; ili (b) antitelo ili antigen-vezujući fragment ADC-a specifično vezuje EGFRvIII i takođe, vezuje spojni peptid od SEK ID BR: 148 i/ili peptid od SEK ID BR: 165, a postupak obuhvata primenu kod pacijenta kome je potreban ADC i dodatnog ADC-a koji sadrži antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena i jedan citotoksin, pri čemu antitelo ili fragment za vezivanje antigena drugog ADC-a specifično vezuje EGFRvIII, ali ne vezuje spojni peptid od SEK ID BR: 148 ili peptid od SEK ID BR: 165 i gde antitelo ili njegov fragment dodatnog ADC-a sadrži kombinaciju od HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 aminokiselinskih sekvenci od SEK ID BR-a: 36/38/40/44/46/48.
[0008] Antitela prema pronalasku mogu biti pune dužine (na primer, IgG1 ili IgG4 antitelo) ili mogu sadržati samo deo za vezivanje antigena (na primer, Fab, F(ab')2ili scFv fragment), i mogu biti modifikovana da utiču na funkcionalnost, npr., da eliminišu rezidualne efektorske funkcije (Reddy i sar., 2000, J. Immunol.164:1925-1933).
[0009] Ovde su opisana anti-EGFRvIII antitela, navedena u Tabelama 1 i 2 ovde. Tabela 1 dalje prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca (HCVR), varijabilnih regiona lakog lanca (LCVR), regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) od primernih anti-EGFRvIII antitela. Tabela 2 prikazuje identifikatore sekvenci nukleinskih kiselina HCVR-ova, LCVR-ova, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 primernih anti-EGFRvIII antitela.
[0010] Ovde su opisana antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od bilo koje od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1, ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0011] Ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od bilo koje od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1, ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90% najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0012] Ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže HCVR i LCVR par aminokiselinskih sekvenci (HCVR/LCVR) koji sadrže bilo koju od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1, uparenih sa bilo kojom od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1. Ovde su opisani njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže par HCVR/LCVR aminokiselinske sekvence sadržane u bilo kom od primera anti-EGFRvIII antitela, navedenih u Tabeli 1. U određenim slučajevima, par HCVR/LCVR aminokiselinske sekvence je izabran iz grupe koja se sastoji od: 2/20, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122 i 130/138.
[0013] Ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže CDR1 teškog lanca (HCDR1) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od bilo koje od HCDR1 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0014] Ovde su opisana antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže CDR2 teškog lanca (HCDR2) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od bilo koje od HCDR2 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0015] Ovde su opisana antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže CDR3 teškog lanca (HCDR3) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od bilo koje od HCDR3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0016] Ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže CDR1 lakog lanca (LCDR1) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od bilo koje od LCDR1 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0017] Ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže CDR2 lakog lanca (LCDR2) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od bilo koje od LCDR2 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0018] Ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže CDR3 lakog lanca (LCDR3) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od bilo koje od LCDR3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ili suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0019] Ovde su opisana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže HCDR3 i LCDR3 par aminokiselinskih sekvenci (HCDR3/LCDR3) koji sadrži bilo koju od HCDR3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 uparenu sa bilo kojom od LCDR3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1. U određenim slučajevima, antitela, ili njihovi fragmenti za vezivanje antigena, sadrže HCDR3/LCDR3 par aminokiselinskih sekvenci sadržanih u bilo kom od primernih anti-EGFRvIII antitela, navedenih u Tabeli 1.
[0020] Ovde su opisana antitela ili njihovi fragmenti za vezivanje antigena koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže skup od šest CDR-a (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) sadržanih u bilo kojem od primernih anti-EGFRvIII antitela navedenih u Tabeli 1. U određenim slučajevima, skup aminokiselinskih sekvenci HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 je izabran iz grupe koja se sastoji od: 4-6-8-12-14-16; 20-22-24-28-30-32; 36-38-40-44-46-48; 52-54-56-60-62-64; 68-70-72-76-78-80; 84-86-88-92-94-96; 100-102-104-108-110-112; 116-118-120-124-126-128; i 132-134-136-140-142-144.
[0021] Ovde su opisana antitela ili njihovi fragmenti za vezivanje antigena koji specifično vezuju EGFRvIII, koji sadrže skup od šest CDR-a (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) sadržanih unutar HCVR/LCVR para aminokiselinskih sekvenci, kao što je definisano bilo kojim od primernih anti-EGFRvIII antitela navedenih u Tabeli 1. Na primer, uključena su antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji specifično vezuju EGFRvIII, koji(a) sadrže HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 skup aminokiselinskih sekvenci sadržanih unutar HCVR/LCVR para aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od: 18/26; 66/74; 274/282; 290/298; i 370/378. Postupci i tehnike za identifikovanje CDR-a unutar HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci su dobro poznate u struci i mogu se koristiti za identifikovanje CDR-a unutar specifikovanih HCVR i/ili LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane. Primeri konvencija koje se mogu koristiti za identifikovanje granica CDR-a uključuju, npr., Kabatovu definiciju, Chothia definiciju i AbM definiciju. Uopšteno govoreći, Kabatova definicija se zasniva na varijabilnosti sekvence, Chothia definicija se zasniva na lokaciji regiona strukturnih petlji, a definicija AbM-a je kompromis između pristupa Kabat i Chothia. Videti, npr., Kabat, "Sekvence proteina od imunološkog interesa", Nacionalni instituti zdravlja, Bethesda, Md (1991); Al-Lazikani i sar., J. Mol. Biol.273: 927-948 (1997); i Martin i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikovanje CDR sekvenci unutar antitela.
[0022] Ovde su takođe opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju anti-EGFRvIII antitela ili njihove delove. Na primer, ovde su opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekula nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu odabranu od bilo koje od HCVR sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili u osnovi slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0023] Ovde su opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekula nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu odabranu od bilo koje od LCVR sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% % identičnosti sekvence.
[0024] Ovde su opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od HCDR1 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekula nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu od bilo koje od HCDR1 sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% % identičnosti sekvence.
[0025] Ovde su opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od HCDR2 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekula nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu od bilo koje od HCDR2 sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% % identičnosti sekvence.
[0026] Ovde su opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od HCDR3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekula nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu od bilo koje od HCDR3 sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0027] Ovde su opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od LCDR1 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekula nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu odabranu od bilo koje od LCDR1 sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0028] Ovde su opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od LCDR2 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekula nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu od bilo koje od LCDR2 sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0029] Ovde su opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od LCDR3 aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekula nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu od bilo koje od LCDR3 sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili njihove suštinski slične sekvence koje imaju najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
[0030] Ovde su opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju HCVR, pri čemu HCVR sadrži skup od tri CDR-a (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3), pri čemu je skup HCDR1-HCDR2-HCDR3 aminokiselinskih sekvenci definisan bilo kojim od primernih anti-EGFRvIII antitela navedenih u Tabeli 1.
[0031] Ovde su opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju LCVR, pri čemu LCVR sadrži skup od tri CDR-a (tj., LCDR1-LCDR2-LCDR3), pri čemu je skup aminokiselinskih sekvenci LCDR1-LCDR2-LCDR3 definisan bilo kojim od primernih anti-EGFRvIII antitela navedenih u Tabeli 1.
[0032] Ovde su opisane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju i HCVR i LCVR, pri čemu HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 i gde LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1. U izvesnim sluičajevima, molekula nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu od bilo koje od HCVR sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili njihovu suštinski sličnu sekvencu koja k ovom ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence, i polinukleotidnu sekvencu izabranu od bilo koje od LCVR sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili njihovu suštinski sličnu sekvencu koja k ovom ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identitičnosti sekvence. U određenim slučajevima, molekula nukleinske kiseline kodira HCVR i LCVR, pri čemu su oba HCVR i LCVR izvedena iz istog anti-EGFRvIII antitela navedenog u Tabeli 1.
[0033] Ovde su opisani rekombinantni ekspresioni vektori sposobni da eksprimiraju polipeptid koji sadrži varijabilni region teškog ili lakog lanca anti-EGFRvIII antitela. Na primer, sadašnji pronalazak obuhvata rekombinantne ekspresione vektore koji sadrže bilo koje od gore pomenutih molekula nukleinske kiseline, tj., molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCVR, LCVR i/ili CDR sekvenci, kao što je prikazano u Tabeli 1. Takođe, obimom sadašnjeg pronalaska su obuhvaćene ćelije domaćina u koje se uvode takvi vektori, kao i postupci za proizvodnju antitela ili njihovih delova kultivisanjem ćelija domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela ili fragmenata antitela, i obnavljanje tako proizvedenih antitela i fragmenata antitela.
[0034] Sadašnji pronalazak uključuje anti-EGFRvIII antitela koja imaju modifikovani obrazac glikozilacije. U nekim realizacijama, modifikacija za uklanjanje nepoželjnih mesta glikozilacije može biti korisna, ili antitelo kojem nedostaje ostatak fukoze prisutan na oligosaharidnom lancu, na primer, da poveća funkciju ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) (videti Shield i sar. (2002) JBC 277:26733). U drugim primenama, modifikacija galaktozilacije se može izvršiti da bi se modifikovala citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).
[0035] Ovde su opisani postupci lečenja za uništavanje tumorskih ćelija ili za inhibiciju ili slabljenje rasta tumorskih ćelija, korišćenjem anti-EGFRvIII antitela ili dela antitela za vezivanje antigena. Terapijski postupci obuhvataju primenu terapeutski efikasne količine farmaceutskog preparata koji sadrži antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za antigen kod subjekta kome je to potrebno. Tretirani poremećaj je bilo koja bolest ili stanje koje je poboljšano, poboljšano, inhibirano ili sprečeno ciljanjem EGFRvIII i/ili inhibiranjem ćelijske signalizacije posredovane ligandom preko EGFRvIII.
[0036] Druge realizacije će postati očigledne iz pregleda sledećeg detaljnog opisa.
KRATAK OPIS SLIKA
[0037]
Slika 1 prikazuje rezultate Western blot-a EGFR-a i EGFRvIII korišćenjem anti-EGFRvIII antitela [tj., H1H1863N2 (Fuc-), i Kontrola I i II na Slici 1a; i H1H1911, H1H1912 i H1H1915 na Slici 1b], ili anti-His antitela, pod redukovanim (gornji paneli) i ne-redukovanim (donji paneli) uslovima. Trake 1 i 6: 10 μl BENCHMARK ™ standarda (INVITROGEN™); Trake 2 i 7: 400 ng hEGFR-mmh (SEK ID BR: 154); Trake 3 i 8: 400 ng hEGFRvIII-mmh (SEK ID BR: 152); i trake 4, 5, 9 i 10: blanko. Kontrola I: Humano anti-EGFRvIII antitelo veznog peptida (IgG1) otkriveno u US Patentu br.
7,736,644; i Kontrola II: Himerno anti-EGFRvIII/EGFR antitelo objavljeno u US Patentu br. 7,589,180.
Slika 2 prikazuje karakteristike vezivanja H1H1863N2 (Fuc-). Spojni peptid EGFRvIII ili peptid ostataka 311-326 EGFR ("EGFR311-326 peptid"), od kojih je svaki obeležen preko linkera sa biotinom na C-završetku, uhvaćen je za vrhove OCTET® obložene streptavidinom na FORTEBIO® OCTET® RED instrumentu i reagovao je sa H1H1863N2 (Fuc-) ili kontrolom I-III. Kontrole I i II: Isto kao gore; i Kontrola III: Humanizovano anti-EGFRvIII antitelo (hIgG1) otkriveno u US objavi patentne prijave br. 2010/0056762. (□): C-terminalni spojni peptid EGFRvIII obeležen biotinom (SEK ID BR: 149); i (■): C-terminalni peptid EGFR311-326 obeležen biotinom (SEK ID BR: 151).
Slika 3 prikazuje internalizaciju anti-EGFRvIII monoklonskih antitela pomoću HEK293 ćelija koje eksprimiraju EGFRvIII (HEK293/EGFRvIII). Anti-EGFRvIII antitela vezana za ćelijsku površinu i kontrolna antitela su detektovana pomoću sekundarnog antitela konjugovanog sa bojom (Fab); slike su dobijene pri 40x i internalizovane vezikule su kvantifikovane.
Kontrole I i II: Isto kao gore; i Kontrola IV: Himerno anti-EGFR antitelo objavljeno u US patentu br.7,060,808. (□): internalizacija na 37 ° C; i (■): internalizacija na 4 ° C.
Slika 4 prikazuje vezivanje i internalizaciju anti-EGFRvIII antitela H1H1863N2 (Fuc-)
1
od strane B16F10.9 tumora ili B16F10.9 tumora koji eksprimiraju EGFRvIII (B16F10.9/ EGFRvIII) ksenograftovani kod ozbiljno kombinovanih imunodeficijentnih (SCID) miševa. Vezano za ćelijsku površinu (Slika 4a) ili vezano za ćelijsku površinu plus internalizovano (Slika 4b) antitelo protiv EGFRvIII ili izotipsko kontrolno antitelo, otkriveno je pomoću anti-humanog Fc konjugovanog alofikocijaninom (hFc-APC) antitela korišćenjem protočne citometrije. Prikazani su prosečni intenziteti fluorescencije (MIF) pri 10 minuta (□), 4 sata ( ) i 24 sata (■), nakon injekcije antitela.
Slika 5 prikazuje rezultate farmakokinetičke analize za anti-EGFRvIII antitelo H1H863N2 (Fuc ) (Slika 5d) i kontrolna antitela (kao što je gore opisano), tj., Kontrola I (Slika 5b), Kontrola III (Slika 5c), i Kontrola IV (Slika 5a), kod miševa divljeg tipa (●) ili miševa koji eksprimiraju humani EGFR (■).
DETALJAN OPIS
[0038] Pre opisa sadašnjeg pronalaska, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene metode i opisane eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i uslovi mogu da variraju. Takođe treba razumeti da terminologija koja je ovde korišćena služi samo za opisivanje određenih realizacija i nije namenjena da bude ograničavajuća, pošto će obim sadašnjeg pronalaska biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.
[0039] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao što ih uobičajeno shvata prosečan stručnjak u struci kojoj ovaj pronalazak pripada. Kako se ovde koristi, izraz "oko", kada se koristi u odnosu na određenu navedenu numeričku vrednost, znači da vrednost može varirati od navedene vrednosti za ne više od 1%. Na primer, kako se ovde koristi, izraz "oko 100" uključuje 99 i 101 i sve vrednosti između (npr., 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, itd.).
[0040] Iako se bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili ispitivanju sadašnjeg pronalaska, poželjni postupci i materijali su sada opisani.
Definicije
[0041] Izraz "EGFRvIII", kako je ovde korišćen, odnosi se na humanu varijantu EGFR klase III koja ima sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 147, ili njegov biološki aktivni fragment, koji ispoljava bilo koje karakteristike specifične za EGFRvIII, za razliku od one zajedničke sa normalno izraženim EGFR-om, osim ako nije specifično drugačije naznačeno. EGFRvIII nedostaju aminokiselinski ostaci 6 do 273 zrelog EGFR-a (tj., SEK ID BR: 146 bez signalnog peptida, tj. ostataka 1-24) i sadrži novi ostatak glicina na položaju 6 između aminokiselinskih ostataka 5 i 274.
[0042] Sve reference na proteine, polipeptide i fragmente proteina ovde su namenjene da se odnose na humanu verziju odgovarajućeg proteina, polipeptida ili fragmenta proteina, osim ukoliko nije eksplicitno naznačeno da je iz vrste koja nije humana. Stoga, izraz "EGFRvIII" označava humani EGFRvIII osim ako se ne navodi da je iz ne-humanih vrsta, npr., "mišji EGFRvIII", "majmunski EGFRvIII", itd.
[0043] Kako se ovde koristi, izraz "EGFRvIII izražen na ćelijskoj površini" označava jedan ili više EGFRvIII proteina, ili njegov ekstracelularni domen, koji je/su eksprimirani na površini ćelije in vitro ili in vivo, tako da je najmanje deo EGFRvIII proteina izložen prema ekstracelularnoj strani ćelijske membrane i dostupan je delu antitela koji se vezuje za antigen. "EGFRvIII eksprimiran na površini ćelije" može da sadrži ili se sastoji od EGFRvIII proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno eksprimira EGFRvIII protein. Alternativno, "EGFRvIII izražen na ćelijskoj površini" može da sadrži ili se sastoji od EGFRvIII proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno ne eksprimira humani EGFRvIII na svojoj površini, ali je veštački konstruisana da eksprimira EGFRvIII na svojoj površini.
[0044] Kako se ovde koristi, izraz "anti-EGFRvIII antitelo" uključuje oba monovalentna antitela sa pojedinačnom specifičnošću, kao i bispecifična antitela koja sadrže prvi krak koji vezuje EGFRvIII i drugi krak koji vezuje drugi (ciljni) antigen, pri čemu krak anti-EGFRvIII sadrži bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR sekvenci, kao što je dalje izneto u Tabeli 1 ovde. Izraz "anti-EGFRvIII antitelo" takođe uključuje konjugate antitelo-lek (ADCs) koji sadrže anti-EGFRvIII antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen konjugovan sa lekom ili toksinom (tj. citotoksičnim agensom). Izraz "anti-EGFRvIII antitelo" takođe uključuje konjugate antitela i radionuklida (ARCs) koji sadrže anti-EGFRvIII antitelo ili njegov deo za vezivanje antigena konjugovan sa radionuklidom.
[0045] Izraz "antitelo", kako je ovde korišćen, označava bilo koji molekul koji vezuje antigen ili molekulski kompleks koji sadrži najmanje jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) koji se specifično vezuje za ili stupa u interakciju sa određenim antigenom (npr., EGFRvIII). Izraz "antitelo" uključuje imunoglobulinske molekule koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, kao i njihove multimere (npr., IgM). Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno kao LCVR ili VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sadrži jedan domen (CL1). VHi VLregioni dalje, mogu biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regionima za određivanje komplementarnosti (CDR), isprepletene sa regionima koji su više konzervirani, nazvani okvirni regioni (FR). Svaki VHi VLje sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino-završetka do karboksizavršetka sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U različitim realizacijama prema pronalasku, okvirni regioni anti-EGFRvIII antitela (ili njegovog dela za vezivanje antigena) mogu biti identični sa humanim sekvencama germinativne linije, ili mogu biti prirodno ili veštački modifikovani. Aminokiselinska konsenzus sekvenca može biti definisana na osnovu bočne analize dva ili više CDR-a.
[0046] Izraz "antitelo", kako se ovde koristi, takođe uključuje fragmente za vezivanje antigena od punih molekula antitela. Izrazi "deo koji vezuje antigen" antitela, "fragment koji se vezuje za antigen" antitela, i slično, kako je ovde korišćeno, uključuju bilo koji prirodni, enzimski dobijen, sintetski, ili genetski konstruisani polipeptid ili glikoprotein koji specifično vezuje antigen za formiranje kompleksa. Antigen-vezujući fragmenti antitela mogu biti izvedeni, npr., iz punih molekula antitela korišćenjem bilo kojih pogodnih standardnih tehnika, kao što su proteolitička digestija ili rekombinantne tehnike genetskog inženjeringa koje uključuju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira varijabilne i opciono konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, na primer, komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uključujući, na primer, biblioteke faga-antitela) ili mogu biti sintetizovane. DNK može biti sekvencirana i manipulisana hemijski ili korišćenjem tehnika molekularne biologije, na primer, da se jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena uredi u pogodnu konfiguraciju, ili da se uvedu kodoni, kreiraju cisteinski ostaci, modifikuju, dodaju ili izbrišu aminokiseline, itd.
[0047] Neograničavajući primeri fragmenata za vezivanje antigena uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jedno-lančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAt fragmente; i (vii) jedinice za minimalno prepoznavanje koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji oponašaju hipervarijabilni region antitela (npr., izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR), kao što je CDR3 peptid), ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Druge konstruisane molekule, kao što su domenski specifična antitela, antitela pojedinačnog domena, antitela sa obrisanim domenom, himerna antitela, CDR-graftovana antitela, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr., monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP),
1
i varijabilni IgNAR domeni ajkula, takođe su obuhvaćeni izrazom "fragment za vezivanje antigena", kako se ovde koristi.
[0048] Antigen-vezujući fragment antitela će tipično sadržati najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili aminokiselinskog sastava i generalno će sadržati najmanje jedan CDR koji je susedan ili u okviru sa jednom ili više okvirnih sekvenci. U fragmentima za vezivanje antigena koji imaju VHdomen povezan sa VLdomenom, VHi VLdomeni mogu biti smešteni jedan u odnosu na drugi u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimeran i sadrži VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, antigen-vezujući fragment antitela može da sadrži monomerni VHili VLdomen.
[0049] U izvesnim realizacijama, antigen-vezujući fragment antitela može da sadrži najmanje jedan varijabilni domen kovalentno vezan za najmanje jedan konstantni domen. Neograničavajuće, primerne konfiguracije varijabilnih i konstantnih domena koje se mogu naći unutar antigen-vezujućeg fragmenta antitela uključuju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od gore navedenih primernih konfiguracija, varijabilni i konstantni domeni mogu biti ili direktno povezani jedan sa drugim ili mogu biti povezani potpunim ili delimičnim zglobnim ili linker regionom. Zglobna regija se može sastojati od najmanje 2 (npr.5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina koje rezultiraju fleksibilnom ili polufleksibilnom vezom između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u pojedinačnoj polipeptidnoj molekuli. Štaviše, antigenvezujući fragment antitela može da sadrži homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija varijabilnih i konstantih domena gore navedenih, u nekovalentnoj vezi jednog sa drugim i / ili ili sa jednim ili više monomernih VHili VLdomena (npr., disulfidnom (-im) vezom(-ama).
[0050] Kao i kod punih molekula antitela, fragmenti za vezivanje antigena mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr. bispecifični). Multispecifični antigen-vezujući fragment antitela će tipično sadržati najmanje dva različita varijabilna domena, gde je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za odvojeni antigen ili za različiti epitop na istom antigenu. Bilo koji multispecifični format antitela, uključujući primerne formate bispecifičnih antitela koji su ovde opisani, mogu biti prilagođeni za upotrebu u kontekstu antigen-vezujućeg fragmenta antitela prema sadašnjem pronalasku koristeći rutinske tehnike koje su dostupne u struci.
[0051] Antitela prema sadašnjem pronalasku mogu da funkcionišu putem citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) ili ćelijski posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC). "Citotoksičnost zavisna od komplementa" (CDC) se odnosi na lizu ćelija koje eksprimiraju antigen pomoću antitela iz pronalaska u prisustvu komplementa. "Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela" (ADCC) se odnosi na reakciju posredovanu ćelijama u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR) (npr., ćelije prirodnih ubica (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnoj ćeliji i na taj način dovode do lize ciljne ćelije. CDC i ADCC se mogu meriti korišćenjem testova koji su dobro poznati i dostupni u struci. (Videti, npr., U.S. Patent Br.5,500,362 i 5,821,337, i Clynes i sar. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). Konstantni region antitela je važan u sposobnosti antitela da fiksira komplement i posreduje u citotoksičnosti zavisnoj od ćelija. Prema tome, izotip antitela može biti izabran na osnovu toga da li je poželjno da antitelo posreduje u citotoksičnosti.
[0052] U izvesnim realizacijama prema pronalasku, anti-EGFRvIII antitela prema pronalasku su humana antitela. Izraz "humano antitelo", kako je ovde korišćen, namenjen je da uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih sekvenci imunoglobulina germinativne linije. Humana antitela prema pronalasku, mogu uključiti aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim imunoglobulinskim sekvencama germinativne linije (npr., mutacije uvedene slučajnom ili mesto-specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-u i posebno u CDR3. Međutim, izraz "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije namenjen da uključuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz embrionske linije drugih vrsta sisara, kao što je miš, koje su presađene na ljudske okvirne sekvence.
[0053] Antitela prema pronalasku mogu, u nekim realizacijama, biti rekombinantna humana antitela. Izraz "rekombinantno humano antitelo", kako je ovde korišćen, namenjen je da obuhvati sva humana antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela izražena korišćenjem rekombinantnog vektora ekspresije transfektovanog u ćeliju domaćina (opisano dalje u daljem tekstu), antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanog antitela (opisana dalje u tekstu), antitela izolovana iz životinje (npr., miša) koja je transgena za humane imunoglobulinske gene (videti npr., Taylor i sar. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) ili antitela pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje sekvence humanog imunoglobulinskog gena sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih sekvenci
1
imunoglobulina germinativne linije. U nekim realizacijama, međutim, takva rekombinantna humana antitela su podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatska mutageneza) i time aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnog antitela su sekvence koje, iako su izvedene iz i koje se odnose na humane germinativne linije VHi VLsekvence, ne mogu prirodno da postoje u repertoaru germinativne linije humanog antitela in vivo.
[0054] Humana antitela mogu postojati u dva oblika koji su povezani sa heterogenošću šarke. U jednom obliku, molekul imunoglobulina sadrži stabilan četvorolančani konstrukt od približno 150-160 kDa u kome se dimeri drže zajedno preko međulančane disulfidne veze teškog lanca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani preko interlančanih disulfidnih veza i formiran je molekul od oko 75-80 kDa sastavljen od kovalentno vezanog lakog i teškog lanca (polu-antitelo). Ove oblike je veoma teško razdvojiti, čak i nakon afinitetnog prečišćavanja.
[0055] Učestalost pojavljivanja drugog oblika u različitim intaktnim IgG izotipovima je posledica, ali nije ograničena na, strukturne razlike povezane sa izotipom regiona šarke antitela. Pojedinačna aminokiselinska supstitucija u zglobnom regionu humanog IgG4 zgloba može značajno smanjiti pojavu drugog oblika (Angal i sar. (1993) Molecular Immunology 30: 105) do nivoa koji su tipično primećeni korišćenjem šarke humanog IgG1. Predmetni pronalazak obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobu, CH2 ili CH3 regionu koje mogu biti poželjne, na primer, u proizvodnji, da bi se poboljšao prinos željenog oblika antitela.
[0056] Antitela prema pronalasku su izolovana antitela. "Izolovano antitelo", kako se ovde koristi, označava antitelo koje je identifikovano i odvojeno i/ili obnovljeno iz najmanje jedne komponente njegovog prirodnog okruženja. Na primer, antitelo koje je odvojeno ili uklonjeno iz najmanje jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kojoj antitelo prirodno postoji ili je prirodno proizvedeno, je "izolovano antitelo" za svrhe sadašnjeg pronalaska. Izolovano antitelo takođe, uključuje antitelo in situ unutar rekombinantne ćelije. Izolovana antitela su antitela koja su bila podvrgnuta najmanje jednom koraku prečišćavanja ili izolacije. Prema izvesnim realizacijama, izolovano antitelo može biti suštinski bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.
[0057] Anti-EGFRvIII antitela koja su ovde opisana, mogu sadržati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, umetanja i/ili delecija u okviru i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim sekvencama embrionskih linija iz kojih su dobijena antitela. Takve mutacije se lako mogu utvrditi upoređivanjem ovde prikazanih aminokiselinskih sekvenci sa sekvencama germinativnih linija koje su dostupne, na
1
primer, iz javnih baza podataka o sekvencama antitela. Antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti, koji su izvedeni iz bilo koje od ovde opisanih aminokiselinskih sekvenci, mogu imati jednu ili više aminokiselina unutar jednog ili više okvira i/ili CDR regiona mutirane prema odgovarajućem ostatku (-cima) sekvence germinativne linije iz koje je izvedeno antitelo, ili prema odgovarajućem ostatku (-cima) druge humane sekvence germinativne linije, ili prema konzervativnoj aminokiselinskoj supstituciji odgovarajućeg ostatka (-aka) germinativne linije (takve promene sekvence se ovde navode zajedno kao "mutacije germinativne linije"). Prosečan stručnjak u ovoj oblasti, počevši od sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje su ovde opisane, može lako proizvesti brojna antitela i fragmente koji se vezuju za antigen koji(a) sadrže jednu ili više pojedinačnih mutacija germinativne linije ili njihove kombinacije. U izvesnim slučajevima, svi okvirni i/ili CDR ostaci unutar VHi/ili VLdomena su mutirani nazad prema ostacima koji su pronađeni u originalnoj sekvenci germinativne linije iz koje je izvedeno antitelo. U drugim slučajevima, samo određeni ostaci su mutirani nazad do originalne sekvence germinativne linije, npr., samo mutirani ostaci pronađeni unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci pronađeni unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim slučajevima, jedan ili više okvira i /ili CDR ostataka je mutirano do odgovarajućeg ostatka (-aka) različite sekvence embrionske linije (tj. sekvenca embrionske linije koja je različita od sekvence embrionske linije iz koje je antitelo bilo originalno izvedeno). Dalje, antitela mogu da sadrže bilo koju kombinaciju od dve ili više mutacija germinativne linije unutar okvira i/ili CDR regiona, na primer, gde su određeni pojedinačni ostaci mutirani do odgovarajućeg ostatka određene sekvence germinativne linije, dok su neki drugi ostaci koji se razlikuju od originalne sekvence germinativne linije održani ili su mutirani do odgovarajućeg ostatka različite sekvence germinativne linije. Jednom kada su dobijena, antitela i fragmenti koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više mutacija germinativne linije, mogu biti lako ispitivani na jedno ili više željenih svojstava, kao što su poboljšana specifičnost vezivanja, povećani afinitet vezivanja, poboljšana ili pojačana antagonistička ili agonistička biološka svojstva (kao što može biti slučaj), smanjena imunogenost, itd. Antitela i fragmenti za vezivanje antigena, dobijeni na ovaj opšti način, obuhvaćeni su sadašnjim pronalaskom.
[0058] Sadašnji pronalazak takođe, uključuje anti-EGFRvIII antitela koja sadrže varijante bilo kojih HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane i koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, sadašnji pronalazak uključuje anti-EGFRvIII antitela koja imaju HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, na primer, 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih aminokiselinskih
1
supstitucija u odnosu na bilo koje HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinske sekvence ovde prikazane u Tabeli 1.
[0059] Izraz "epitop" se odnosi na antigensku determinantu koja stupa u interakciju sa specifičnim mestom za vezivanje antigena u varijabilnom regionu molekule antitela poznatom kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela se mogu vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se proizvodi prostorno susednim aminokiselinama iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je jedan proizveden pomoću susednih aminokiselinskih ostataka u polipeptidnom lancu. U određenim okolnostima, epitop može uključiti ostatke saharida, fosforil grupu, ili sulfonil grupu na antigenu.
[0060] Izraz "suštinska identičnost" ili "suštinski identičan", kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada je optimalno poravnata sa odgovarajućim nukleotidnim umetanjima ili delecijama sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost nukleotidne sekvence u najmanje oko 95%, a još poželjnije najmanje oko 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, mereno bilo kojim dobro poznatim algoritmom identičnosti sekvence, kao što su FASTA, BLAST ili Gap, kao što je razmatrano u nastavku. Molekula nukleinske kiseline koja ima suštinsku identitičnost sa referentnom molekulom nukleinske kiseline može, u izvesnim slučajevima, kodirati polipeptid koji ima istu ili suštinski sličnu aminokiselinsku sekvencu kao polipeptid kodiran od strane referentne molekule nukleinske kiseline.
[0061] Kao što se primenjuje na polipeptide, izraz "suštinska sličnost" ili "suštinski sličan" označava da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je pomoću programa GAP ili BESTFIT koristeći podrazumevane težine praznina, dele najmanje 95% identičnosti sekvence, čak poželjnije najmanje 98% ili 99% identičnosti sekvence. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupa) sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće bitno izmeniti funkcionalna svojstva proteina. U slučajevima kada se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti sekvence ili stepen sličnosti može biti prilagođen naviše da bi se ispravila konzervativna priroda supstitucije. Sredstva za izradu ovog podešavanja su dobro poznata stručnjacima. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.
1
Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatično-hidroksilne bočne lance: serin i treonin; (3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; (5) osnovne bočne lance: lizin, arginin i histidin; (6) kiselinske bočne lance: aspartat i glutamat, i (7) bočne lance koji sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valinleucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparaginglutamin. Alternativno, konzervativna zamena je svaka promena koja ima pozitivnu vrednost u log-matrici verovatnoće PAM250 opisanoj u Gonnet i sar. (1992) Science 256: 1443-1445. "Umereno konzervativna" zamena je svaka promena koja ima nenegativnu vrednost u logaritamskoj matrici verovatnoće PAM250.
[0062] Sličnost sekvence za polipeptide, koja se takođe naziva identičnost sekvence, obično se meri pomoću softvera za analizu sekvenci. Softver za analizu proteina odgovara sličnim sekvencama koristeći mere sličnosti dodeljene različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiselina. Na primer, GCG softver sadrži programe, kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa standardnim parametrima za određivanje homologije sekvence ili identitičnosti sekvence između blisko povezanih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između njihovog divljeg tipa proteina i proteina sa izmenjenom aminokiselinskom sekvencom. Videti, npr., GCG Verzija 6.1. Polipeptidne sekvence takođe, mogu biti upoređivane korišćenjem FASTA koristeći standardne ili preporučene parametre, program u GCG verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procenat identičnosti sekvenci regiona najboljeg preklapanja između upita i sekvenci pretraživanja (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam kada se poredi sekvenca sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, koristeći standardne parametre. Videti, npr., Altschul i sar. (1990) J. Mol. Biol.215: 403-410 i Altschul i sar. (1997) Nucleic Acids Res.25: 3389-402.
Vezivanje zavisno od pH
[0063] Sadašnji pronalazak uključuje anti-EGFRvIII antitela sa vezivnim karakteristikama zavisnim od pH vrednosti. Na primer, anti-EGFRvIII antitelo prema sadačnjem pronalasku može ispoljiti redukovano vezivanje za EGFRvIII pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Alternativno, anti-EGFRvIII antitela prema pronalasku mogu ispoljiti pojačano vezivanje
1
za EGFRvIII pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Izraz "kiseli pH" uključuje pH vrednosti manje od oko 6,2, npr., oko 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 ili manje. Kako se ovde koristi, izraz "neutralni pH" označava pH od oko 7,0 do oko 7,4. Izraz "neutralni pH" uključuje pH vrednosti od oko 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 i 7,4.
[0064] U izvesnim slučajevima, "redukovano vezivanje za EGFRvIII pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH" je izraženo u izrazima odnosa KDvrednosti vezivanja antitela za EGFRvIII pri kiselom pH prema KDvrednosti vezivanja antitela za EGFRvIII pri neutralnom pH (ili obrnuto). Na primer, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena se može smatrati da pokazuje "redukovano vezivanje za EGFRvIII pri kiselom pH, u poređenju sa neutralnim pH" za svrhe sadašnjeg pronalaska, ako antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena pokazuju kiseli/neutralni KDodnos od oko 3,0 ili veći. U izvesnim primerima realizacija, kiseli/neutralni KDodnos za antitelo ili antigen-vezujući fragment sadašnjeg pronalaska može biti oko 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 ili viši.
[0065] Antitela sa pH-zavisnim karakteristikama vezivanja mogu biti dobijena, npr., skriningom populacije antitela za redukovano (ili pojačano) vezivanje za određeni antigen, pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Dodatno, modifikacije domena za vezivanje antigena na nivou aminokiselina mogu dati antitela sa karakteristikama koje zavise od pH. Na primer, supstitucijom jedne ili više aminokiselina domena za vezivanje antigena (npr., unutar CDR-a) sa histidinskim ostatkom, može biti dobijeno antitelo sa redukovanim vezivanjem antigena pri kiselom pH, u odnosu na neutralni pH.
Anti-EGFRvIII antitela koja sadrže Fc varijante
[0066] Prema određenim realizacijama iz sadašnjeg pronalaska, obezbeđena su anti-EGFRvIII antitela koja sadrže Fc domen koji sadrži jednu ili više mutacija koje pojačavaju ili smanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr., pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH. Na primer, sadašnji pronalazak uključuje anti-EGFRvIII antitela koja sadrže mutaciju u CH2 ili CH3 regionu Fc domena, pri čemu mutacija(e) povećava(ju) afinitet Fc domena za FcRn u kiseloj sredini (npr., u endozomu gde je pH u opsegu od oko 5,5 do oko 6,0). Takve mutacije mogu dovesti do povećanja poluživota antitela u serumu kada su primenjene na životinji. Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uključuju, npr., modifikaciju na položaju 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T) i 256 (npr.,
2
S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na položaju 428 i/ili 433 (npr., H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., A, W, H, F ili Y [N434A, N434W, N434H, N434F ili N434Y]); ili modifikaciju na položaju 250 i/ili 428; ili modifikaciju na položaju 307 ili 308 (npr., 308F, V308F) i 434. U jednoj realizaciji, modifikacija sadrži 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr., V259I) i 308F (npr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254 i 256 (npr., 252Y, 254T i 256E) modifikaciju; modifikaciju 250Q i 428L (npr., T250Q i M428L); i modifikaciju 307 i/ili 308 (npr., 308F ili 308P). U još jednoj realizaciji, modifikacija sadrži 265A (npr., D265A) i/ili 297A (npr., N297A) modifikaciju.
[0067] Na primer, sadašnji pronalazak obuhvata anti-EGFRvIII antitela koja sadrže Fc domen koji sadrži jedan ili više parova ili grupa mutacija odabranih iz grupe koja se sastoji od: 250Q i 248L (npr., T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr., M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr., M428L i N434S); 257I i 3111 (npr., P257I i Q3111); 257I i 434H (npr., P257I i N434H); 376V i 434H (npr., D376V i N434H); 307A, 380A i 434A (npr., T307A, E380A i N434A); i 433K i 434F (npr., H433K i N434F). Sve moguće kombinacije prethodno navedenih mutacija Fc domena i druge mutacije u okviru varijabilnih domena antitela koje su ovde opisane, razmatrane su u okviru obima sadašnjeg pronalaska.
[0068] Sadašnji pronalazak takođe, uključuje anti-EGFRvIII antitela koja sadrže konstantni (CH) region himernog teškog lanca, gde himerni CHregion sadrži segmente izvedene iz CHregiona više od jednog imunoglobulinskog izotipa. Na primer, antitela prema pronalasku mogu da sadrže himerni CHregion koji obuhvata deo ili ceo CH2 domen izveden iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 molekula, kombinovan sa delom ili celim domenom CH3 izvedenim iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 molekula. Prema određenim realizacijama, antitela prema pronalasku sadrže himerni CHregion koji ima himerni zglobni region. Na primer, himerni zglob može da sadrži aminokiselinsku sekvencu "gornji zglob" (aminokiselinski ostaci od položaja 216 do 227 prema EU numerisanju) izvedenu iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 zglobnog regiona, kombinovanu sa sekvencom "donji zglob" (aminokiselinski ostaci od položaja 228 do 236 prema EU numerisanju) izvedenu iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 zglobnog regiona. Prema određenim realizacijama, himerni zglobni region sadrži aminokiselinske ostatke izvedene iz humanog IgG1 ili humanog IgG4 gornjeg zgloba i aminokiselinske ostatke izvedene iz humanog IgG2 donjeg zgloba. Antitelo koje sadrži himerni CHregion, kao što je ovde opisano može, u izvesnim realizacijama, ispoljiti modifikovane Fc efektorne funkcije bez negativnog uticaja na terapeutska ili farmakokinetička svojstva antitela. (Videti, npr., WO 2014/022540, podnet 31 Jula 2013).
Konjugati antitela i leka (ADC)
[0069] Sadašnji pronalazak obezbeđuje konjugate antitela-leka (ADCs) koji sadrže anti-EGFRvIII antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment konjugovan sa terapeutskom grupom kao što je citotoksični agens, hemioterapijski lek ili radioizotop.
[0070] Citotoksični agensi uključuju bilo koji agens koje je štetan za rast, održivost ili razmnožavanje ćelija. Primeri pogodnih citotoksičnih agenasa i hemioterapeutskih agenasa koji mogu biti konjugovani sa anti-EGFRvIII antitelima u skladu sa ovim aspektom pronalaska uključuju, na primer, 1-(2-hloroetil)-1,2-dimetansulfonil hidrazid, 1,8-dihidroksi-biciklo [7.3.1] trideka-4,9-dien-2,6-diin-13-on, 1-dehidrotestosteron, 5-fluorouracil, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, 9-amino kamptotecin, aktinomicin D, amanitine, aminopterin, angvidin, antraciklin, antramicin (AMC), auristatine, bleomicin, busulfan, butiričnu kiselinu, kaliheamicine, kamptotecin, karminomicine, karmustin, cemadotine, cisplatin, kolhicin, kombretastatine, ciklofosfamid, citarabin, citokalazin B, daktinomicin, daunorubicin, dekarbazin, diacetoksipentildoksorubicin, dibromomanitol, dihidroksi antracin dion, disorazole, dolastatin, doksorubicin, duokarmicin, ehinomicine, eleuterobine, emetin, epotilone, esperamicin, estramustine, etidijum bromid, etopozid, fluorouracile, geldanamicine, gramicidin D, glukokortikoide, irinotekane, leptomicine, leurozine, lidokain, lomustin (CCNU), majtanzinoide, mehloretamin, melfalan, merkatopurine, metopterine, metotreksat, mitramicin, mitomicin, mitoksantron, N8-acetil spermidin, podofilotoksine, prokain, propranolol, pteridine, puromicin, pirolobenzodiazepine (PDB), rizoksine, streptozotocin, talizomicine, taksol, tenopozid, tetrakain, tioepa hlorambucil, tomajmicine, topotekane, tubulizin, vinblastin, vinkristin, vindezin, vinorelbine i derivate bilo kojeg od prethodno navedenih. Prema određenim realizacijama, citotoksični agens koji je konjugovan sa anti-EGFRvIII antitelom je majtanzinoid, kao što je DM1 ili DM4, derivat tomajmicina, ili derivat dolastatina. Drugi citotoksični agensi poznati u stanju tehnike su razmatrani unutar obima sadašnjeg pronalaska, uključujući, na primer, proteinske toksine kao što su ricin, toksin C. difficile, egzotoksin pseudomonasa, ricin, difterijski toksin, botulinski toksin, briodin, saporin, pokeweed toksini (tj. fitolakatoksin i fitolacigenin), i drugi kao što su oni dalje izneti od strane Sapra i sar., Pharmacol. & Therapeutics, 2013, 138: 452-469.
[0071] Sadašnji pronalazak takođe, uključuje konjugate antitela i radionuklida (ARCs) koji sadrže anti-EGFRvIII antitela konjugovana sa jednim ili više radionuklida. Primeri radionuklida koji mogu biti korišćeni u kontekstu ovog aspekta prema pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, npr.,<225>Ac,<212>Bi,<213>Bi,<131>I,<186>Re,<227>Th,<222>Rn,<223>Ra,<224>Ra i<90>Y.
[0072] U određenim realizacijama prema sadašnjem pronalasku, obezbeđeni su konjugati antitela i leka koji sadrže anti-EGFRvIII antitelo konjugovano sa citotoksičnim agensom (npr., bilo koji od gore navedenih citotoksičnih agenasa) preko vezivnog molekula. Bilo koji vezivni molekul ili linker tehnologija poznata u tehnici, može biti korišćena za kreiranje ili konstrukciju ADC-a iz sadašnjeg pronalaska. U izvesnim realizacijama, linker je linker koji se može otcepiti. Prema drugim realizacijama, linker je linker koji se ne može odvojiti. Primeri linkera koji mogu biti korišćeni u kontekstu sadašnjeg pronalaska uključuju, linkere koji sadrže ili se sastoje od npr., MC (6-maleimidokaproila), MP (maleimidopropanoila), val-cit (valinacitrulina), val-ala (valina-alanina), dipeptidnog položaja u linkeru koji se može otcepiti proteazom, ala-phe (alanina-fenilalanina), dipeptidnog položaja u linkeru koji se može otcepiti proteazom, PAB (p-aminobenziloksikarbonila), SPP (N-sukcinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoata), SMCC (N-Sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1 karboksilata), SIAB (N-Sukcinimidil (4-jodoacetil) aminobenzoata), i njihovih varijanti i kombinacija. Dodatni primeri linkera koji mogu biti korišćeni u kontekstu sadašnjeg pronalaska su opisani, npr., u US 7,754,681 i u Ducry, Bioconjugate Chem., 2010, 21: 5-13, i referencama koje su tamo citirane.
[0073] Sadašnji pronalazak obuhvata ADC konjugate u kojima linker povezuje anti-EGFRvIII antitelo ili molekulu koja vezuje antigen sa lekom ili citotoksinom, preko vezivanja na određenu aminokiselinu unutar antitela ili molekulu koja vezuje antigen. Primeri vezivanja aminokiselina koji se mogu koristiti u kontekstu ovog aspekta prema pronalasku uključuju, na primer, lizin (videti, na primer, US 5,208,020; US 2010/0129314; Hollander i sar., Bioconjugate Chem., 2008, 19: 358-361); WO 2005/089808; US 5,714,586; US 2013/0101546; i US 2012/0585592), cistein (videti, npr., US 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; US 2013/0101546; i US 7,750,116), selenocistein (videti, npr., WO 2008/122039; i Hofer i sar., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2008, 105: 12451-12456), formil glicin (videti, npr., Carrico i sar., Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal i sar., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 110: 46-51, i Rabuka i sar., Nat. Protocols, 2012, 10: 1052-1067), ne-prirodne aminokiseline (videti, npr., WO 2013/068874 i WO 2012/166559), i kisele aminokiseline (videti, npr., WO 2012/05982). Linkeri takođe, mogu biti konjugovani sa antigen-vezujućim proteinom preko
2
vezivanja za ugljene hidrate (videti, na primer, US 2008/0305497, i Ryan i sar., Food & Agriculture Immunol., 2001, 13: 127-130) i disulfidne linkere (videti npr., WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611, i Shaunak i sar., Nat. Chem. Biol., 2006, 2: 312-313.
[0074] Bilo koji postupak poznat u struci za konjugovanje hemijskog ostatka sa peptidom, polipeptidom ili drugom makromolekulom, može biti korišćen u kontekstu sadašnjeg pronalaska da bi se izradio anti-EGFRvIII ADC, kao što je ovde opisano. Primerni metod za konjugaciju antitela i leka preko linkera je ovde prikazan u Primeru 12. Varijacije ovog primernog postupka će biti uvažene od strane prosečnog stručnjaka u ovoj oblasti i razmatrane su unutar obima sadašnjeg pronalaska.
[0075] Prema određenim realizacijama, sadašnji pronalazak obezbeđuje konjugate antitela i leka, gde je anti-EGFRvIII antitelo (npr., antitelo označeno H1H1863N2) konjugovano sa preparatom linkera i leka, kao što je dalje izneto u WO2014/145090 (npr., jedinjenje "7", koje se takođe ovde naziva kao "M0026") (videti takođe Primer 12, ovde).
Mapiranje epitopa i srodne tehnologije
[0076] Epitop za koji se vezuju ovde opisana antitela se može sastojati od pojedinačne susedne sekvence od 3 ili više (npr., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina EGFRvIII proteina. Alternativno, epitop se može sastojati od mnoštva nesusednih aminokiselina (ili aminokiselinskih sekvenci) EGFRvIII. U nekim slučajevima, epitop se nalazi na ili blizu domena EGFRvIII za vezivanje liganda. U drugim slučajevima, epitop se nalazi izvan ligand-vezujućeg domena EGFRvIII, npr., na lokaciji na površini EGFRvIII na kojoj antitelo, kada je vezano za takav epitop, ne interferira sa vezivanjem liganda za EGFRIII.
[0077] Sadašnji pronalazak se prema određenim realizacijama odnosi na anti-EGFRvIII antitela koja specifično vezuju EGFRvIII (i ne vezuju EGFR), pri čemu antitela prepoznaju spojni peptid EGFRvIII (npr., SEK ID BR: 148). Ovakva antitela se ovde mogu označavati kao "vezivna sredstva spojnog peptida", "EGFRvIII peptid-vezujuća antitela", i slično. Sadašnji pronalazak se prema drugim realizacijama odnosi na anti-EGFRvIII antitela koja specifično vezuju EGFRvIII (i ne vezuju EGFR), pri čemu antitela ne prepoznaju EGFRvIII spojni peptid (npr., ne prepoznaju spojni peptid od SEK ID BR: 148, i/ili ne prepoznaju peptid od SEK ID BR: 165). Ovakva antitela se ovde mogu označavati kao "konformaciona veziva," " vezivna sredstva EGFRvIII konformacionog epitopa", i slično.
[0078] Različite tehnike koje su poznate prosečnim stručnjacima iz ove oblasti tehnike, mogu biti korišćene za određivanje da li antitelo "stupa u interakciju sa jednom ili više aminokiselina" unutar polipeptida ili proteina. Primerne tehnike obuhvataju, na primer, rutinski test unakrsnogblokiranja, kao što je onaj opisan u Antibodies, Harlow i Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), mutaciona analiza alaninskog skeniranja, analiza peptidnih mrlja (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248: 443-463), i analiza peptidnog cepanja. Pored toga, mogu biti korišćene metode kao što su ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer, 2000, Protein Science 9: 487-496). Drugi metod koji može biti korišćen za identifikaciju aminokiselina unutar polipeptida sa kojim antitelo interaguje je razmena vodonika/deuterijuma detektovana pomoću masene spektrometrije. Obično, metoda razmene vodonika/deuterijuma uključuje, obeležavanje proteina od interesa sa deuterijumom, nakon čega sledi vezivanje antitela za protein označen deuterijumom. Zatim, kompleks protein/ antitelo je prenet u vodu da bi se omogućila razmena vodonika i deuterijuma na svim ostacima, osim ostataka zaštićenih pomoću antitela (koji ostaju obeleženi deuterijumom). Nakon disocijacije antitela, ciljni protein je podvrgnut analizama proteaznog cepanja i masene spektrometrije, na taj način se otkrivaju ostaci obeleženi sa deuterijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo interaguje. Videti, npr., Ehring (1999) Analitička biohemija 267 (2): 252-259; Engen i Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A- 265A.
[0079] Ovde su obelodanjena anti-EGFRvIII antitela koja se vezuju za isti epitop kao bilo koje od specifičnih primernih antitela koja su ovde opisana (npr., antitela koja sadrže bilo koju od aminokiselinskih sekvenci, kao što je ovde dalje izneto u Tabeli 1). Takođe su ovde opisana anti-EGFRvIII antitela koja se takmiče za vezivanje za EGFRvIII sa bilo kojim od specifičnih primernih antitela koja su ovde opisana (npr., antitela koja sadrže bilo koju od aminokiselinskih sekvenci, kao što je ovde prikazano u Tabeli 1).
[0080] Neko može lako odrediti da li se antitelo vezuje za isti epitop kao, ili se takmiči za vezivanje sa referentnim anti-EGFRvIII antitelom, korišćenjem rutinskih metoda poznatih u struci i ovde prikazanih primera. Na primer, da bi se odredilo da li se ispitivano antitelo vezuje za isti epitop kao referentno anti-EGFRvIII antitelo, referentnom antitelu se dozvoljava da se veže za jedan EGFRvIII protein. Zatim se procenjuje sposobnost testiranog antitela da se veže za molekul EGFRvIII. Ako je ispitivano antitelo sposobno da se veže za EGFRvIII nakon saturacionog vezivanja sa referentnim anti-EGFRvIII antitelom, može se zaključiti da se ispitivano antitelo vezuje za različiti epitop od referentnog anti-EGFRvIII antitela. S druge strane, ako ispitivano antitelo nije u stanju da se veže za molekul EGFRvIII nakon saturacionog vezivanja sa referentnim anti-EGFRvIII antitelom, onda se ispitivano antitelo može vezati za
2
isti epitop kao epitop koji je vezan od strane referentnog anti-EGFRvIII antitela. Dodatna rutinska eksperimentisanja (npr. peptidne mutacije i analize vezivanja) mogu zatim biti izvedene da bi se potvrdilo da li je uočeni nedostatak vezivanja ispitivanog antitela u stvari posledica vezivanja za isti epitop kao referentno antitelo ili ako je sterna blokada (ili drugi fenomen) odgovoran za nedostatak posmatranog vezivanja. Eksperimenti ove vrste, mogu biti izvedeni korišćenjem ELISA, RIA, Biacore, protočne citometrije ili bilo kog drugog kvantitativnog ili kvalitativnog testa za vezivanje antitela koji je dostupan u struci. U nekim slučajevima, dva antitela se vezuju za isti (ili preklapajući) epitop ako, na primer, 1-, 5-, 10-, 20- ili 100- puta višak jednog antitela inhibira vezivanje drugog pri najmanje 50%, ali poželjno 75%, 90% ili čak 99%, kao što je izmereno u testu kompetitivnog vezivanja (videti, npr., Junghans i sar., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alternativno, smatra se da se dva antitela vezuju za isti epitop ako u osnovi sve aminokiselinske mutacije u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Smatra se da dva antitela imaju "preklapajuće epitope" ako samo podgrupa aminokiselinskih mutacija koja smanjuje ili eliminiše vezivanje jednog antitela smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog.
[0081] Da bi se odredilo da li se neko antitelo takmiči za vezivanje (ili unakrsno-takmiči za vezivanje) sa referentnim anti-EGFRvIII antitelom, gore opisana metodologija vezivanja je izvedena u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentnom antitelu je dozvoljeno da se veže za EGFRvIII protein pod uslovima zasićenja, praćeno procenom vezivanja ispitivanog antitela za EGFRvIII molukul. U drugoj orijentaciji, ispitivanom antitelu je dozvoljeno da se veže za EGFRvIII molekul pod uslovima zasićenja, praćeno procenom vezivanja referentnog antitela za EGFRvIII molekul. Ako je, u obe orijentacije, samo prvo (zasićeno) antitelo sposobno da se veže za molekul EGFRvIII, onda je zaključeno da se ispitivano antitelo i referentno antitelo takmiče za vezivanje za EGFRvIII. Kao što će biti razumljivo od strane prosečnog stručnjaka u struci, antitelo koje se takmiči za vezivanje sa referentnim antitelom ne mora obavezno da se veže za isti epitop kao referentno antitelo, ali može sterno blokirati vezivanje referentnog antitela pomoću vezivanja preklapajućeg ili susednog epitopa.
Priprema humanih antitela
[0082] Anti-EGFRvIII antitela prema sadašnjem pronalaska, mogu biti potpuno humana antitela. Postupci za generisanje monoklonskih antitela, uključujući potpuno humana monoklonska antitela su poznati u struci. Bilo koji takvi poznati postupci, mogu biti korišćeni
2
u kontekstu sadašnjeg pronalaska da bi se izradila humana antitela koja se specifično vezuju za humani EGFRvIII.
[0083] Korišćenjem VELOCIMMUNE ™ tehnologije, na primer, ili bilo koje druge slične poznate metode za generisanje potpuno humanih monoklonskih antitela, visoko afinitetna himerna antitela za EGFRvIII su inicijalno izolovana koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kao što je niže prikazano u eksperimentalnom delu, antitela su karakterisana i odabrana na željene karakteristike, uključujući afinitet, aktivnost blokiranja liganda, selektivnost, epitop, itd. Ako je potrebno, mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom, na primer divljeg tipa ili modifikovanim IgG1 ili IgG4, za generisanje potpuno humanog anti-EGFRvIII antitela. Dok izabrani konstantni region može varirati u skladu sa specifičnom upotrebom, karakteristike visoko afinitetnog vezivanja antigena i ciljne specifičnosti se nalaze u varijabilnom regionu. U određenim slučajevima, potpuno humana anti-EGFRvIII antitela su izolovana direktno iz antigen-pozitivnih B ćelija.
Bioekvivalenti
[0084] Anti-EGFRvIII antitela i fragmenti antitela iz sadašnjeg pronalaska obuhvataju proteine koji imaju aminokiselinske sekvence koje variraju od onih opisanih antitela, ali koje zadržavaju sposobnost da vezuju humani EGFRvIII. Takva varijantna antitela i fragmenti antitela sadrže jedan ili više dodataka, delecija ili supstitucija aminokiselina u poređenju sa roditeljskom sekvencom, ali pokazuju biološku aktivnost koja je u suštini ekvivalentna onoj od opisanih antitela. Slično tome, sekvence DNK koje kodiraju anti-EGFRvIII antitela prema predmetnom pronalasku obuhvataju sekvence koje sadrže jedan ili više dodataka, delecija ili supstitucija nukleotida kada su upoređivane sa opisanom sekvencom, ali one kodiraju anti-EGFRvIII antitelo ili fragment antitela koji je suštinski bioekvivalentan sa anti-EGFRvIII antitelom ili fragmentom antitela prema pronalasku. Primeri takvih varijantni aminokiselina i DNK sekvenci su gore razmatrani.
[0085] Dva antigen-vezujuća proteina, ili antitela, smatraju se bioekvivalentnim ako su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i stepen apsorpcije ne pokazuju značajne razlike kada se primenjuju pri istoj molarnoj dozi, pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo pojedinačnom dozom ili u više doza. Neka antitela će se smatrati ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ako su ekvivalentna u stepenu njihove apsorpcije, ali ne u njihovoj brzini apsorpcije i ipak se mogu smatrati bioekvivalentnim, jer su takve razlike u brzini apsorpcije namerne i odražavaju se u obeležavanju, nisu suštinske za
2
postizanje efikasne koncentracije leka u telu, npr. kod hronične upotrebe, i smatraju se medicinski beznačajnim za određeni ispitivani lekoviti proizvod.
[0086] U jednoj realizaciji, dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalentna ako ne postoje klinički značajne razlike u njihovoj bezbednosti, čistoći i jačini.
[0087] U jednoj realizaciji, dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalentna ako se pacijent može prebaciti jedan ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda bez očekivanog povećanja rizika od neželjenih efekata, uključujući klinički značajnu promenu u imunogenosti, ili smanjenu efikasnost, u poređenju sa kontinuiranom terapijom bez takvog prebacivanja.
[0088] U jednoj realizaciji, dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalentna ako oba deluju pomoću zajedničkog mehanizma ili mehanizama delovanja za stanje ili uslove korišćenja, u meri u kojoj su takvi mehanizmi poznati.
[0089] Bioekvivalencija se može pokazati in vivo i in vitro metodama. Merenja bioekvivalencije obuhvataju, npr., (a) in vivo test kod ljudi ili drugih sisara, u kojem je koncentracija antitela ili njegovih metabolita izmerena u krvi, plazmi, serumu ili drugoj biološkoj tečnosti kao funkcija vremena; (b) in vitro test koji je u korelaciji sa humanim in vivo bioraspoloživim podacima i koji je razumno predvidljiv; (c) in vivo test kod ljudi ili drugih sisara u kojem je odgovarajući akutni farmakološki efekat antitela (ili njegovog cilja) izmeren kao funkcija vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju kojim se utvrđuje bezbednost, efikasnost, ili bioraspoloživost ili bioekvivalencija antitela.
[0090] Bioekvivalentne varijante anti-EGFRvIII antitela prema pronalasku mogu biti konstruisane, na primer, izradom različitih supstitucija ostataka ili sekvenci ili brisanjem terminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, cisteinski ostaci koji nisu bitni za biološku aktivnost mogu biti izbrisani ili zamenjeni sa drugim aminokiselinama da bi se sprečilo obrazovanje nepotrebnih ili netačnih intramolekularnih disulfidnih mostova na renaturaciji. U drugim kontekstima, bioekvivalentna antitela mogu uključiti varijante anti-EGFRvIII antitela koje sadrže aminokiselinske promene koje modifikuju glikozilacione karakteristike antitela, npr., mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.
Selektivnost vrsta i unakrsna reaktivnost vrsta
[0091] Sadašnji pronalazak, u skladu sa određenim realizacijama, obezbeđuje anti-EGFRvIII antitela koja se vezuju za humani EGFRvIII, ali ne i za EGFRvIII iz drugih vrsta. Sadašnji
2
pronalazak takođe, uključuje anti-EGFRvIII antitela koja se vezuju za humani EGFRvIII i za EGFRvIII iz jedne ili više ne-humanih vrsta. Na primer, anti-EGFRvIII antitela prema pronalasku mogu da se vežu za humani EGFRvIII i mogu da se vezuju ili ne vezuju, u zavisnosti od slučaja, za jedan ili više EGFRvIII miša, pacova, morskog praseta, hrčka, skočimiša, svinje, mačke, psa, zeca, koze, ovce, krave, konja, kamile, cynomologous, marmoset, rezusa ili šimpanze. U skladu sa određenim primerima izvođenja iz predmetnog pronalaska, obezbeđena su anti-EGFRvIII antitela koja specifično vezuju humani EGFRvIII i EGFRvIII cinomolgus majmunа (npr., Macaca fascicularis). Druga antitela protiv EGFRvIII iz pronalaska vezuju humani EGFRvIII, ali se ne vezuju, ili se vezuju samo slabo, za EGFRvIII cinomolgus majmuna.
Multispecifična antitela
[0092] Antitela prema sadašnjem pronalasku mogu biti monospecifična ili multispecifična (npr., bispecifična). Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu da sadrže domene za vezivanje antigena specifične za više od jednog ciljnog polipeptida. Videti, npr., Tutt i sar., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer i sar., 2004, Trends Biotechnol.22:238-244. Anti-EGFRvIII antitela iz sadašnjeg pronalaska mogu biti povezana ili zajedno eksprimirana sa drugom funkcionalnom molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment mogu biti funkcionalno povezani (npr., hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na drugi način) sa jednim ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela da bi se proizvelo bispecifično ili multispecifično antitelo sa drugom specifičnošću vezivanja.
[0093] Sadašnji pronalazak uključuje bispecifična antitela u kojima jedan kraj imunoglobulina vezuje humani EGFRvIII, a drugi kraj imunoglobulina je specifičan za drugi antigen. U određenim realizacijama, krak koji vezuje EGFRvIII vezuje humani EGFRvIII i blokira vezivanje liganda za EGFRvIII. U drugim realizacijama, krak koji vezuje EGFRvIII vezuje humani EGFRvIII, ali ne blokira vezivanje liganda za EGFRvIII.
[0094] Primerni oblik bispecifičnog antitela koji može biti korišćen u kontekstu sadašnjeg pronalaska uključuje upotrebu prvog imunoglobulinskog (Ig) CH3 domena i drugog Ig CH3 domena, gde se prvi i drugi Ig CH3 domeni razlikuju jedan od drugoga pomoću najmanje jedne aminokiseline, i pri čemu najmanje jedna aminokiselinska razlika smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za protein A, u poređenju sa bispecifičnim antitelom kome nedostaje
2
aminokiselinska razlika. U jednom izvođenju, prvi Ig CH3 domen vezuje protein A i drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje proteina A, kao što je H95R modifikacija (pomoću IMGT numerisanja eksona; H435R kod EU numerisanja). Drugi CH3 može dalje da sadrži modifikaciju Y96F (po IMGT; Y436F kod EU). Dalje modifikacije koje mogu biti nađene unutar drugog CH3 uključuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (po IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I prema EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N i V422I prema EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (prema IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I prema EU) u slučaju IgG4 antitela. Varijacije oblika bispecifičnog antitela koje su gore opisane, razmatrane su u okviru obima sadašnjeg pronalaska.
[0095] Drugi primerni bispecifični oblici koji mogu biti korišćeni u kontekstu sadašnjeg pronalaska uključuju, bez ograničenja, npr., na bazi scFv ili diatela bispecifičnih formata, IgG-scFv fuzije, dualni varijabilni domen (DVD)-Ig, kvadrom, čvorove-u-otvorima, zajednički laki lanac (npr., zajednički laki lanac sa čvorovima u otvorima, itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED) telo, leucinski zatvarač, Duotelo, IgG1/IgG2, dvostruko aktivne Fab (DAF)-IgG, i Mab<2>bispecifične formate (videti, na primer, Klein i sar.2012, mAbs 4: 6, 1-11, i reference koje su tamo citirane, za pregled prethodnih oblika). Bispecifična antitela takođe, mogu biti konstruisana korišćenjem konjugacije peptida/nukleinske kiseline, npr., pri čemu su korišćene neprirodne aminokiseline sa ortogonalnom hemijskom reaktivnošću da se generišu konjugati antitela-oligonukleotida specifični za mesto koji se zatim samoudružuju u multimerne komplekse sa definisanim sastavom, valencijom i geometrijom. (Videti, npr., Kazane i sar., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec.4, 2012]).
Terapeutska formulacija i primena
[0096] Pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže anti-EGFRvIII antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente prema sadašnjem pronalasku. Farmaceutski preparati prema pronalasku su formulisani sa pogodnim nosačima, ekscipijensima i drugim agensima koji obezbeđuju poboljšani transfer, isporuku, toleranciju i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija se može naći u formularu koja je poznat svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anionske) (kao što su LIPOFECTIN ™, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNK konjugate, anhidrovane absorpcione paste, emulzije ulje u vodi i voda u ulju, carbowax emulzije (polietilenglikoli različitih molekulskih masa), polučvrste gelove i polučvrste smeše koje sadrže carbowax. Videti takođe Powell i sar. " Kompendijum ekscipijenasa za parenteralne formulacije "PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.
[0097] Doza primenjenog antitela kod pacijenta može da varira u zavisnosti od starosti i veličine pacijenta, ciljne bolesti, stanja, puta primene i slično. Poželjna doza se obično izračunava u skladu sa telesnom težinom ili površinom tela. Kod odraslog pacijenta, može biti korisno intravenozno davanje antitela iz sadašnjeg pronalaska normalno pri pojedinačnoj dozi od oko 0,01 do oko 20 mg/kg telesne težine, poželjnije oko 0,02 do oko 7, oko 0,03 do oko 5, ili oko 0,05 do oko 3 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od težine stanja, može se prilagoditi učestalost i trajanje tretmana. Efikasne doze i rasporedi za primenu anti-EGFRvIII antitela mogu se odrediti empirijski; na primer, napredovanje pacijenta se može pratiti periodičnom procenom, a doza se prilagođava u skladu sa tim. Štaviše, određivanje doza među vrstama se može izvesti korišćenjem dobro poznatih metoda u tehnici (npr., Mordenti i sar., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
[0098] Poznati su različiti sistemi isporuke i mogu biti korišćeni za primenu farmaceutskog preparata prema pronalasku, npr., inkapsuliranje u liposome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne za ekspresiju mutantnih virusa, endocitoza posredovana receptorom (videti, npr., Wu i sar., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Postupci unošenja uključuju, ali nisu ograničeni na, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, subkutane, intranazalne, epiduralne i oralne puteve. Preparat može biti primenjen bilo kojim pogodnim putem, na primer infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpcijom kroz epitelijalne ili mukokutane obloge (npr., oralna mukoza, rektalna i intestinalna mukoza, itd.) i mogu se primenjivati zajedno sa drugim biološki aktivnim sredstvima. Primena može biti sistemska ili lokalna.
[0099] Farmaceutski preparat prema sadašnjem pronalasku, može biti isporučen subkutano ili intravenski sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, što se tiče subkutane isporuke, uređaj za isporuku tipa pena ima laku primenu u isporuci farmaceutskog preparata iz predmetnog pronalaska. Takav pen uređaj za isporuku može biti ponovo upotrebljiv ili za jednokratnu upotrebu. Pen uređaj za isporuku za višekratnu upotrebu, generalno koristi zamenljiv uložak koji sadrži farmaceutski preparat. Kada je primenjen sav farmaceutski preparat unutar uloška i kada je uložak prazan, prazni uložak se lako može odbaciti i zameniti novim uloškom koji sadrži farmaceutski preparat. Pen uređaj za isporuku se zatim može ponovo koristiti. U uređaju za isporuku tipa pena za jednokratnu upotrebu nema zamenljivog uloška. Umesto toga, uređaj
1
za isporuku pena za jednokratnu upotrebu dolazi napunjen sa farmaceutskim preparatom koji se drži u rezervoaru unutar uređaja. Kada je rezervoar ispražnjen od farmaceutskog preparata, čitav uređaj se odbacuje.
[0100] Brojni pen uređaji za višekratnu upotrebu i autoinjektori imaju primene u subkutanoj isporuci farmaceutskog preparata prema sadašnjem pronalasku. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na AUTOPEN ™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC ™ pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Švajcarska), HUMALOG MIX 75/25 ™ pen, HUMALOG ™ pen, HUMALIN 70/30 ™ pen (Eli Lilly and Co, Indianapolis, IN), NOVOPEN ™ I, II i III (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), NOVOPEN JUNIOR ™ (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), BD ™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN ™, OPTIPEN PRO ™, OPTIPEN STARLET ™ i OPTICLIK ™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Nemačka), da navedemo samo neke. Primeri raspoloživih pen uređaja za isporuku koji imaju primene u subkutanoj isporuci farmaceutskog preparata iz sadašnjeg pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na SOLOSTAR ™ pen (Sanofi-Aventis), FLEXPEN ™ (Novo Nordisk) i KWIKPEN ™ (Eli Lilly), autoinjektor SURECLICK ™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET ™ (Haselmeier, Štutgart, Nemačka), EPIPEN (Dey, L.P.) i HUMIRA ™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), da navedemo samo nekoliko.
[0101] U određenim situacijama, farmaceutski preparat može biti isporučen u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. U jednoj realizaciji, može biti korišćena pumpa (videti Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). U drugoj realizaciji, mogu biti korišćeni polimerni materijali; videti, Medicinske primene kontrolisanog oslobađanja, Langer i Wise (izd.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. U još jednoj realizaciji, sistem za kontrolisano oslobađanje može biti smešten u blizini cilja preparata, stoga zahtevajući samo deo sistemske doze (videti, npr., Goodson, 1984, u Medicinskim primenama kontrolisanog oslobađanja, supra, vol. 2, str. 115-138). Drugi sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem su razmatrani u pregledu od strane Langer, 1990, Science 249: 1527-1533.
[0102] Injekcioni preparati mogu uključivati dozne oblike za intravenske, subkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, kapajuće infuzije, itd. Ovi injektabilni preparati mogu biti pripremljeni metodama koje su javno poznate. Na primer, injekcioni preparati mogu biti pripremljeni, npr., rastvaranjem, suspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njegove soli gore opisane, u sterilnom vodenom medijumu ili uljanom medijumu koji je konvencionalno korišćen za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije postoje, na primer, fiziološki rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druga pomoćna sredstva, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim sredstvom za solubilizaciju, kao što su alkohol (npr., etanol),
2
polialkohol (npr., propilenglikol, polietilenglikol), nejonski surfaktant [npr., polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljani medijum, koriste se, npr., sezamovo ulje, sojino ulje, itd., koja se mogu koristiti u kombinaciji sa sredstvom za solubilizaciju, kao što su benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Tako pripremljena injekcija je poželjno napunjena u odgovarajuću ampulu.
[0103] Povoljno, farmaceutski preparati za oralnu ili parenteralnu upotrebu, gore opisani, pripremljeni su u doznim oblicima u jediničnoj dozi primernoj da odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi uključuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Sadržaj prethodno pomenutih antitela je generalno oko 5 do oko 500 mg po doznom obliku u jediničnoj dozi; posebno u obliku injekcije, poželjno je da je gore pomenuto antitelo sadržano u oko 5 do oko 100 mg i u oko 10 do oko 250 mg za druge dozne oblike.
Terapijska upotreba antitela
[0104] Sadašnji pronalazak uključuje, preparate za upotrebu u postupku za lečenje raka ili tumora koji izražava EGFRvIII. Postupak može sadržati primenu terapeutskog preparata kod subjekta kome je to potrebno, koji sadrži anti-EGFRvIII antitelo prema pronalasku ili konjugat antitelo-lek koji sadrži anti-EGFRvIII antitelo iz pronalaska. Terapeutski preparat može takođe da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
[0105] Antitela i ADC prema pronalasku su korisni, između ostalog, za lečenje, prevenciju i/ili poboljšanje bilo koje bolesti ili poremećaja koji je povezan sa ili posredovan pomoću ekspresije ili aktivnosti EGFRvIII, ili tretiran blokiranjem interakcije između EGFRvIII i EGFR liganda ili na drugi način inhibirajući aktivnost EGFRvIII i/ili signalizaciju, i/ili promovišući internalizaciju receptora i/ili smanjenje broja receptora na površini ćelije. Na primer, antitela i ADC iz sadašnjeg pronalaska su korisni za lečenje tumora koji eksprimiraju EGFRvIII i/ili koji reaguju na signalizaciju posredovanu ligandom. Antitela i fragmenti za vezivanje antigena iz sadašnjeg pronalaska, mogu takođe biti korišćeni za lečenje primarnih i/ili metastatskih tumora koji se javljaju u mozgu i meningama, orofarinksu, plućnom i bronhijalnom stablu, gastrointestinalnom traktu, muškom i ženskom reproduktivnom traktu, mišićima, kostima, koži i dodacima, vezivnom tkivu, slezini, imunološkom sistemu, ćelijama za stvaranje krvi i koštanoj srži, jetri i urinarnom traktu, i posebnim senzornim organima kao što je oko. U izvesnim izvođenjima, antitela i ADC konjugati iz pronalaska se koriste za lečenje jednog ili više sledećih karcinoma: karcinoma bubrežnih ćelija, karcinoma pankreasa, raka glave i vrata, raka prostate, malignih glioma, osteosarkoma, kolorektalnog raka, raka želuca (npr., rak želuca sa MET amplifikacijom), malignog mezotelioma, multiplog mijeloma, raka jajnika, sitnoćelijskog raka pluća, raka pluća koji nije sitnoćelijski, sinovijalnog sarkoma, raka štitne žlezde, raka dojke ili melanoma.
[0106] U kontekstu ovde opisanih metoda lečenja, anti-EGFRvIII antitelo može biti primenjeno kao monoterapija (tj. kao jedino terapeutsko sredstvo) ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa (primeri koji su ovde opisani na drugom mestu).
[0107] Prema specifičnim realizacijama, sadašnji pronalazak obezbeđuje preparate za upotrebu u postupcima za lečenje kancera, smanjenje rasta tumora i/ili izazivanje regresije tumora kod pacijenta. Postupci mogu da obuhvate primenu kod pacijenta prvog konjugata antitela-leka (ADC), bilo samostalno ili u kombinaciji EGFRvIII sa drugim anti-EGFRvIII antitelom ili ADC-om. Prvi ADC će tipično sadržati antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela i citotoksin, pri čemu antitelo ili fragment za vezivanje antigena prvog ADC-a specifično vezuje EGFRvIII, ali ne vezuje spojni peptid EGFRvIII od SEK ID BR: 148 ili peptid SEK ID BR: 165 (tj. prvi ADC sadrži konformaciono EGFRvIII-vezujuće antitelo). U realizacijama u kojima se primenjuje drugo antitelo ili ADC, drugo antitelo ili ADC će tipično sadržati antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela i citotoksin, pri čemu drugo antitelo ili antigen-vezujući fragment specifično vezuje EGFRvIII i takođe vezuje spojni peptid EGFRvIII od SEK ID BR: 148 i/ili peptid od SEK ID BR: 165 (tj., drugo antitelo ili ADC sadrži antitelo za vezivanje spojnog peptida EGFRvIII). Kada se u kontekstu ovog aspekta pronalaska koriste dva odvojena anti-EGFRvIII ADC-a, oba ADC-a mogu, u izvesnim realizacijama, da sadrže isti citotoksični agens ili istu klasu citotoksičnog agensa. U drugim realizacijama gde su korišćena dva odvojena anti-EGFRvIII ADC-a, svaki ADC može da sadrži različiti citotoksični agens i/ili različitu klasu citotoksičnog agensa. Neograničavajući primeri realizacija ovog aspekta prema pronalasku su ovde dalje izneti u Primeru 14. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prvog ADC-a (tj., konformaciono EGFRvIII vezujuće antitelo) sadrži regione za određivanje komplementarnosti teškog i lakog lanca koji sadrže SEK ID BR-a: 36, 38, 40, 44, 46 i 48 ili varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR: 34 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR: 42.
Kombinovane terapije i formulacije
[0108] Predmetni pronalazak uključuje preparate i terapeutske formulacije koje sadrže bilo koje od anti-EGFRvIII antitela prema pronalasku u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih
4
terapeutski aktivnih komponenti, i postupke lečenja koji obuhvataju primenu takvih kombinacija, kod subjekata kojima je to potrebno.
[0109] Anti-EGFRvIII antitela iz sadašnjeg pronalaska, mogu biti ko-formulisana sa i/ili primenjena u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih terapeutski aktivnih komponenata izabranih iz grupe koja se sastoji od: PRLR antagonista (npr., anti-PRLR antitelo ili mali molekulski inhibitor PRLR-a), EGFR antagonista (npr., anti-EGFR antitelo [npr., cetuksimab ili panitumumab] ili mali molekulski inhibitor EGFR-a [npr., gefitinib ili erlotinib]), antagoniste drugog člana porodice EGFR-a, kao što su Her2/ErbB2, ErbB3 ili ErbB4 (npr., anti-ErbB2 [npr. trastuzumab ili T-DM1]{KADCYLA®}, anti-ErbB3 ili anti-ErbB4 antitelo ili mali molekulski inhibitor ErbB2, ErbB3 ili ErbB4 aktivnosti), cMET antagonista (npr., anticMET antitelo), IGF1R antagonista (npr., anti-IGF1R antitelo), B-raf inhibitora (npr., vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-α inhibitora (npr., anti-PDGFR-α antitelo), PDGFR-β inhibitora (npr., anti-PDGFR-β antitelo ili inhibitor kinaze male molekule kao što su, na primer, imatinib mezilat ili sunitinib malat), inhibitora PDGF liganda (npr., anti-PDGF-A, -B, -C ili -D antitelo, aptamer , siRNK, itd.), VEGF antagonista (npr., VEGF-Trap kao su aflibercept, videti, npr., US 7,087,411 (ovde se takođe naziva kao "VEGF-inhibirajući fuzioni protein"), anti-VEGF antitelo (npr. bevacizumab), inhibitor kinaze male molekule VEGF receptora (npr., sunitinib, sorafenib ili pazopanib)), DLL4 antagonista (npr., anti-DLL4 antitelo opisano u US 2009/0142354 kao što je REGN421), antagoniste Ang2 (npr., anti-Ang2 antitelo opisano u US 2011/0027286 poput H1H685P), antagoniste FOLH1 (npr., anti-FOLH1 antitelo), antagoniste STEAP1 ili STEAP2 (npr., anti-STEAP1 antitelo ili anti-STEAP2 antitelo), antagoniste TMPRSS2 (npr., anti-TMPRSS2 antitelo), antagoniste MSLN (npr., anti-MSLN antitelo), antagoniste CA9 (npr., anti-CA9 antitelo), antagoniste uroplakina (npr., antiuroplakin [npr., anti-UPK3A]) antitelo), antagoniste MUC16 (npr., anti-MUC16 antitelo), antagoniste Tn antigena (npr., anti-Tn antitelo), antagoniste CLEC12A (npr., anti-CLEC12A antitelo), antagoniste TNFRSF17 (npr., anti-TNFRSF17 antitelo), antagoniste LGR5 (npr., anti-LGR5 antitelo), monovalentnog CD20 antagoniste (npr., monovalentno anti-CD20 antitelo kao što je rituksimab), PD-1 antitelo, PD-L1 antitelo, CD3 antitelo, CTLA-4 antitelo itd. Drugi agensi koji se mogu korisno primenjivati u kombinaciji sa bispecifičnim molekulima za vezivanje antigena iz pronalaska uključuju, npr., tamoksifen, inhibitore aromataze i inhibitore citokina, uključujući inhibitore citokina malih molekula i antitela koja se vezuju za citokine kao što su IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 ili za njihove odgovarajuće receptore.
[0110] Sadašnji pronalazak uključuje preparate i terapeutske formulacije koje sadrže bilo koje od opisanih anti-EGFRvIII antitela iz pronalaska u kombinaciji sa jednim ili više hemioterapeutskih agenasa. Primeri hemioterapeutskih agenasa uključuju agense za alkilovanje kao što su tiotepa i ciklosfosfamid (Cytoxan ™); alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosfaoramid i trimetilolomelamin; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozouree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotike kao što su aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, kaliheamicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin, epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenalne agense kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; sredstva za dodavanje folne kiseline kao što su folinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elfornitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; mitogvazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK ™; razoksan; sizofiran; spirogermanium; tenuazonska kiselina; triazikvon; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksani, npr. paklitaksel (Taxol ™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i docetaksel (Taxotere ™; Aventis Antony, Francuska); hlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analoge platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novantron; tenipozid; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoična kiselina; esperamicini; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kojeg od gore navedenih. Takođe su uključeni u ovu definiciju anti-hormonalni agensi koji deluju da regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumore kao što su anti-estrogeni, uključujući na primer tamoksifen, raloksifen, 4 (5)-imidazoli koji inhibiraju aromatazu, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY 117018, onapriston i toremifen (Fareston); i anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore navedenih.
[0111] Anti-EGFRvIII antitela prema pronalasku takođe, mogu biti primenjena i/ili koformulisana u kombinaciji sa antivirusnim agensima, antibioticima, analgeticima, kortikosteroidima, steroidima, kiseonikom, antioksidansima, COX inhibitorima, kardioprotektantima, metalnim helatorima, IFN-gama, i / ili NSAID.
[0112] Dodatna terapeutski aktivna(e) komponenta(e), npr., bilo koji od gore navedenih agenasa ili njihovih derivata, može biti primenjivan neposredno pre, istovremeno sa ili neposredno nakon primene anti-EGFRvIII antitela iz sadašnjeg pronalaska; (za svrhe sadašnjeg otkrića, takvi režimi primene se smatraju primenom anti-EGFRvIII antitela "u kombinaciji sa" dodatnom terapeutski aktivnom komponentom). Sadašnji pronalazak uključuje farmaceutske preparate u kojima je anti-EGFRvIII antitelo iz sadašnjeg pronalaska zajedno formulisano sa jednom ili više dodatnih terapeutski aktivnih komponenata, kao što je ovde opisano na drugom mestu.
Režimi primene
[0113] Prema određenim realizacijama iz sadašnjeg pronalaska, anti-EGFRvIII antitelo (ili farmaceutski preparat koji sadrži kombinaciju anti-EGFRvIII antitela i bilo kojeg od dodatnih ovde pomenutih terapeutski aktivnih agenasa) može biti za primenu u višestrukim dozama, kod subjekta iznad definisanog vremenskog toka. Postupci u skladu sa ovim aspektom pronalaska obuhvataju sekvencijalnu primenu višestrukih doza anti-EGFRvIII antitela kod subjekta prema pronalasku. Kao što je ovde korišćeno, "sekvencijalna primena" znači da se svaka doza anti-EGFRvIII antitela primenjuje kod subjekta u različitom trenutku u vremenu, npr., u različitim danima odvojenim pomoću unapred određenog intervala (npr., sati, dana, nedelja ili meseci). Sadašnji pronalazak obuhvata postupke koji sadrže sekvencijalnu primenu pojedinačne početne doze anti-EGFRvIII antitela kod pacijenta, praćene jednom ili više sekundarnih doza anti-EGFRvIII antitela, i opciono praćene jednom ili više tercijarnih doza anti-EGFRvIII antitela.
[0114] Izrazi "početna doza", "sekundarne doze" i "tercijarne doze" se odnose na vremensku sekvencu primene anti-EGFRvIII antitela prema pronalasku. Prema tome, "početna doza" je doza koja se primenjuje na početku režima lečenja (koja se takođe naziva "osnovna doza"); "sekundarne doze" su doze koje su primenjivane nakon početne doze; i "tercijarne doze" su doze koje su primenjivane nakon sekundarnih doza. Sve početne, sekundarne i tercijarne doze mogu sadržati istu količinu anti-EGFRvIII antitela, ali generalno se mogu razlikovati jedna od druge u smislu učestalosti primene. Međutim, u izvesnim realizacijama, količina anti-EGFRvIII antitela sadržana u početnim, sekundarnim i/ili tercijarnim dozama međusobno varira (npr., podešena naviše ili naniže, kako je pogodno) tokom toka tretmana. U izvesnim realizacijama, dve ili više (npr., 2, 3, 4 ili 5) doza je primenjeno na početku režima lečenja kao "doze punjenja" praćene naknadnim dozama koje se primenjuju na osnovama manje učestalosti (npr., " doze održavanja “).
[0115] U izvesnim primernim realizacijama iz sadašnjeg pronalaska, svaka sekundarna i/ili tercijarna doza je primenjivana 1 do 26 (npr., 1, 1<1>/2, 2, 2<1>/2, 3, 3<1>/2, 4, 4<1>/2, 5, 5<1>/2, 6, 6<1>/2, 7, 7<1>/2, 8, 8<1>/2, 9, 9<1>/2, 10, 10<1>/2, 11, 11<1>/2, 12, 12<1>/2, 13, 13<1>/2, 14, 14<1>/2, 15, 15<1>/2, 16, 16<1>/2, 17, 17<1>/2, 18, 18<1>/2, 19, 19<1>/2, 20, 20<1>/2, 21, 21<1>/2, 22, 22<1>/2, 23, 23<1>/2, 24, 24<1>/2, 25, 25<1>/2, 26, 26<1>/2ili više) nedelja nakon doze koja neposredno prethodi. Fraza "neposredno prethodna doza", kako se ovde koristi, označava, u nizu višestrukih primena, dozu anti-EGFRvIII antitela koja se primenjuje kod pacijenta pre primene sledeće doze u nizu bez doza između.
[0116] Postupci prema ovom aspektu pronalaska, mogu obuhvatiti primenu kod pacijenta bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijarnih doza anti-EGFRvIII antitela. Na primer, u određenim realizacijama, kod pacijenta je primenjena samo jedna sekundarna doza. U drugim realizacijama, dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) sekundarnih doza je primenjeno kod pacijenta. Slično tome, u određenim realizacijama, kod pacijenta je primenjuje samo jedna tercijarna doza. U drugim realizacijama, dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više) tercijarnih doza je primenjeno kod pacijenta. Režim primene može da se izvodi neograničeno tokom životnog veka određenog subjekta, ili dok takvo lečenje više nije terapeutski neophodno ili korisno.
[0117] U realizacijama koje uključuju višestruke sekundarne doze, svaka sekundarna doza može biti primenjivana istom učestalošću kao i druge sekundarne doze. Na primer, svaka sekundarna doza može biti primenjena kod pacijenta 1 do 2 nedelje ili 1 do 2 meseca nakon doze koja neposredno prethodi. Slično, u realizacijama koje uključuju višestruke tercijarne doze, svaka tercijarna doza može biti primenjivana istom učestalošću kao i druge tercijarne doze. Na primer, svaka tercijarna doza može biti primenjena kod pacijenta 2 do 12 nedelje nakon doze koja neposredno prethodi. U izvesnim realizacijama prema pronalasku, učestalost primene sekundarnih i / ili tercijarnih doza kod pacijenta može da varira u toku režima lečenja. Učestalost primene takođe, može biti prilagođena tokom lečenja od strane lekara, u zavisnosti od potreba individualnog pacijenta nakon kliničkog pregleda.
[0118] Predmetni pronalazak obuhvata režime primene u kojima je kod pacijenta primenjeno 2 do 6 doza unošenja pri prvoj učestalosti (npr., jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom mesečno, jednom svaka dva meseca, itd.), praćenih primenom dve ili više doza održavanja kod pacijenta, na osnovu manje učestalosti. Na primer, prema ovom aspektu pronalaska, ako se doze unošenja primenjuju pri učestalosti jednom mesečno, tada se doze održavanja mogu primenjivati kod pacijenta jednom svakih šest nedelja, jednom svaka dva meseca, jednom svaka tri meseca, itd.
Dijagnostičke upotrebe antitela
[0119] Anti-EGFRvIII antitela prema sadašnjem pronalaska, mogu takođe biti korišćena za detekciju i/ili merenje EGFRvIII, ili ćelija koje izražavaju EGFRvIII u uzorku, npr., za dijagnostičke svrhe. Na primer, anti-EGFRvIII antitelo, ili njegov fragment, može biti korišćen za dijagnostikovanje stanja ili bolesti koje karakteriše abnormalna ekspresija (npr., prekomerna ekspresija, nedovoljna ekspresija, nedostatak ekspresije, itd.) EGFRvIII. Primeri dijagnostičkih testova za EGFRvIII mogu sadržati, npr., kontaktiranje uzorka, dobijenog od pacijenta, sa anti-EGFRvIII antitelom prema pronalasku, pri čemu je anti-EGFRvIII antitelo obeleženo sa detektabilnom oznakom ili reporterskim molekulom. Alternativno, neobeleženo anti-EGFRvIII antitelo, može biti korišćeno u dijagnostičkim aplikacijama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo detektabilno obeleženo. Detektabilna oznaka ili reporterski molekul može biti radioizotop, kao što su<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, ili<125>I; fluorescentna ili hemiluminescentna grupa, kao što su fluorescein izotiocijanat ili rodamin; ili enzimi kao što su alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, peroksidaza rena ili luciferaza. Specifični primerni testovi koji se mogu koristiti za detekciju ili merenje EGFRvIII u uzorku uključuju, enzimski povezan imunosorbentni test (ELISA), radioimunoesej (RIA) i sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS).
[0120] Uzorci koji se mogu koristiti u dijagnostičkim testovima EGFRvIII prema predmetnom pronalasku uključuju, bilo koji uzorak tkiva ili tečnosti koji se može dobiti od pacijenta koji sadrži detektabilne količine proteina EGFRvIII, ili njegovih fragmenata, pod normalnim ili patološkim stanjima. Generalno, nivoi EGFRvIII u određenom uzorku, dobijenom od zdravog pacijenta (npr., pacijenta koji nije pogođen bolešću ili stanjem povezanim sa abnormalnim nivoima ili aktivnošću EGFRvIII) biće izmeren da bi se početno uspostavio osnovni, ili standardni nivo EGFRvIII. Ovaj osnovni nivo EGFRvIII zatim, može biti poređen nasuprot nivoima EGFRvIII izmerenim u uzorcima dobijenim od pojedinaca za koje se sumnja da imaju bolest ili stanje povezano sa EGFRvIII.
PRIMERI
[0121] Sledeći primeri su izloženi tako da pruže prosečnim stručnjacima u ovoj oblasti tehnike kompletno obelodanjivanje i opis kako izraditi i koristiti postupke i preparate iz pronalaska, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju njihovim pronalaskom. Učinjeni su napori da se osigura tačnost u odnosu na korišćene vrednosti, ali treba uzeti u obzir i neke eksperimentalne greške i odstupanja. Ukoliko nije drugačije naznačeno, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je na ili blizu atmosferskom.
Primer 1. Generisanje anti-EGFRvIII antitela
[0122] Anti-EGFRvIII antitela su dobijena imunizacijom VELOCIMMUNE® miša (tj. projektovanog miša koji sadrži DNK koja kodira varijabilne regione teškog i kapa lakog lanca humanog imunoglobulina) sa imunogenom koji obuhvata ekstracelularni domen EGFRvIII. Antitela prvog seta uključuju antitela koja su označena kao H1H2194P, H1H2195P, H2M1 863N2, H2M1911N, H2M1912N, H2M1915N, H2M1917N, H2M1918N i H3M1913N (kao što je prikazano u tabelama 1 i 2).
[0123] Imunski odgovor antitela je praćen pomoću EGFRvIII-specifičnog imunotesta. Kada je postignut željeni imunski odgovor, splenociti su sakupljeni i fuzionisani sa mišjim ćelijama mijeloma da bi se očuvala njihova održivost i formirale ćelijske linije hibridoma. Ćelijske linije hibridoma su pregledane i odabrane da identifikuju ćelijske linije koje proizvode EGFRvIII-specifična antitela. Korišćenjem ove tehnike dobijeno je nekoliko anti-EGFRvIII himernih antitela (tj., antitela koja poseduju humane varijabilne domene i mišje konstantne domene). Pored toga, izolovano je nekoliko potpuno humanih anti-EGFRvIII antitela direktno iz antigenpozitivnih B ćelija bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u US 2007/0280945A1.
[0124] Odvojeno, H1H1863N2 sa redukovanom fukozilacijom ["H1H1863N2(Fuc-)"] je takođe pripremljen u CHO ćelijskoj liniji domaćina koja je opisana kao "8088" u US publikaciji
4
patentne prijave br. 2010/0304436A1. Ukratko, sekvence lakog lanca i teškog lanca H1H1863N2 su klonirane u ekspresione vektore. Dva miliona 8088 ćelija je transfektovano sa lakim i teškim lancima plazmida i pR4004 vektorom koji sadrži gen koji kodira Cre. Transfektovane ćelije koje su preživele selekciju sa 400 μg/ml higromicina su prilagođene rastu u suspenziji, u medijumu bez seruma, bez fukoze. Ćelije koje izražavaju fluorescentni protein EGFP, ali ne i DsRed ili ECFP iz transfektovanih ćelija su izolovane protočnom citometrijom. Izabrane ćelije su zasađene u posudu za trešenje pri 4 x 10<5>ćelija/ml, a tri dana kasnije, medijum za kulturu je sakupljen i protein antitela u njemu [tj., H1H1863N2(Fuc-)] je prečišćen Protein A hromatografijom. Analiza masene spektrometrije dobijenih H1H1863N2 (Fuc-) je potvrdila da je jezgro fukoze uklonjeno u odnosu na H1H1863N2 (Fuc+), originalno antitelo. Oznake, "H1H1863N2" i "H1H1863N2(Fuc+)" ovde, obe ukazuju na originalno antitelo bez modifikacija fukozilacije.
[0125] Određena biološka svojstva primernih anti-EGFRvIII antitela, generisanih u skladu sa postupcima iz ovog Primera su detaljno opisana u Primerima, koji su dalje niže izneti.
Primer 2. Sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina varijabilnog regiona teškog i lakog lanca
[0126] Tabela 1 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teškog i lakog lanca i CDR regione odabranih anti-EGFRvIII antitela prema pronalasku. Odgovarajući identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina su prikazani u Tabeli 2.
Tabela 1: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci
(nastavak)
Tabela 2: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina
[0127] Antitela se ovde obično odnose na sledeću nomenklaturu: Fc prefiks (npr.,"H1H", "H2M", "H3M," itd.), praćen numeričkim identifikatorom (npr., "2194", "2195", "1863," itd.), praćen "P" ili "N "sufiksom, kao što je prikazano u tabelama 1 i 2. Stoga, prema ovoj nomenklaturi, antitelo se ovde može nazivati kao, npr., "H1H2194N", "H2M1911N", "H3M1913N," itd. Prefiksi H1H, H2M i H3M na oznakama antitela koji su ovde korišćeni ukazuju na poseban Fc region izotipa antitela. Na primer, antitelo "H1H" ima humani IgG1 Fc, "H2M" antitelo ima mišji IgG2 Fc, a "H3M" antitelo ima mišji IgG3 Fc, (svi varijabilni regioni su potpuno humani, kao što je označeno prvim 'Η' u oznaci antitela). Kao što će biti razumljivo od strane prosečnog stručnjaka u tehnici, antitelo koje ima određeni Fc izotip, može biti konvertovano u antitelo sa različitim Fc izotipom (npr., antitelo sa mišjim IgG1 Fc može biti pretvoreno u antitelo sa humanim IgG4, itd.), ali u svakom slučaju, varijabilni domeni (uključujući CDR) - koji su označeni numeričkim identifikatorima prikazanim u tabelama 1 i 2 - ostaju isti, a karakteristike vezivanja se očekuju da budu identične ili suštinski slične bez obzira na prirodu Fc domena.
Kontrolni konstrukti korišćeni u sledećim primerima
[0128] Kontrolni konstrukti su uključeni u sledeće eksperimente za poredbene svrhe: Kontrola I: Humano anti-EGFRvIII antitelo (IgG1) sa varijabilnim domenima teškog i lakog lanca koji imaju aminokiselinske sekvence koje odgovaraju SEK ID BR-a: 142 i 144, respektivno, od "13.1.2" antitela opisanog u US Patentu br. 7,736,644; Kontrola II: Himerno anti-EGFRvIII antitelo (hIgG1) sa varijabilnim domenima teškog i lakog lanca koji imaju aminokiselinske sekvence koje odgovaraju SEK ID BR-a: 11 i 12, respektivno, od "ch806" antitela obelodanjenog u US Patentu br. 7,589,180; Kontrola III: Humanizovano anti-EGFRvIII antitelo (hIgG1) sa varijabilnim domenima teškog i lakog lanca koji imaju aminokiselinske sekvence koje odgovaraju SEK ID BR-a: 42 i 47, respektivno, od "hu806" antitela opisanog u US objavi patentne prijave br. 2010/0056762; Kontrola IV: himerno anti-EGFR antitelo sa varijabilnim domenima teškog i lakog lanca koji imaju aminokiselinske sekvence odgovarajućih domena od "C225", kao što je izneto u US 7,060,808; i Kontrola V: Humano anti-EGFRvIII antitelo (IgG1) sa varijabilnim domenima teškog i lakog lanca koji imaju sekvence aminokiselina koje odgovaraju SEK ID BR-a: 2 i 19, respektivno, od "131" antitela iz US Patenta br.7,736,644 B2. Poznato je da je "13.1.2" antitelo specifično za spojni peptid (SEK ID BR: 148) od EGFRvIII; i poznato je da se "ch806" i "hu806" antitela vezuju za ostatke 311-326 (SEK ID BR: 165) EGFR-a (SEK ID BR: 146), koji je amplifikovan ili prekomerno eksprimiran, ili ostatke 44-59 EGFRvIII (SEK ID BR: 147).
Primer 3. Određivanje afiniteta vezivanja EGFRvIII
[0129] Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante humanih monoklonskih anti-EGFRvIII antitela su određene površinskom plazmonskom rezonancom na 37 ° C. Merenja su izvršena na instrumentu T100 BIACORE ™. Antitela, koja su izražena kao humani IgG1 Fc (tj., oznake "H1H"), su uhvaćena na senzorskoj površini anti-humanog Fc (oblik hvatanja mAt), i rastvorljivi monomerni [EGFR-mmh (SEK ID BR: 154) i EGFRvIII-mmh (SEK ID BR: 152)] ili dimerni [EGFR-mFc (SEK ID BR: 155) i EGFRvIII-mFc (SEK ID BR: 153)] proteini su injektovani preko površine. U obliku za hvatanje receptora, uhvaćen je bilo EGFRvIII-mFc ili EGFR-mFc, na BIACORE ™ čipu i odgovarajuća antitela su proticala iznad. Konstante brzine kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) su određene obradom i uklapanjem podataka u 1: 1 modelu vezivanja, korišćenjem softvera za podešavanje krive Scrubber 2.0. Konstante
4
ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i disocijativnih poluvremena raspada (t1/2) su izračunate iz konstanti kinetičke brzine kao: KD(M) = kd/ ka; i t1/ 2(min) = In2/(60*kd).
[0130] Rezultati su prikazani u tabelama 3 i 4. NB = nema vezivanja pod ispitivanim uslovima; NT = nije testirano.
Tabela 3 (kinetike vezivanja humanih Fc antitela)
4 (nastavak)
Tabela 4 (kinetike vezivanja humanih Fc antitela)
4
(nastavak)
[0131] Kao što je prikazano u tabelama 3 i 4, nekoliko antitela je pokazalo selektivnost za EGFRvIII i nije vezalo EGFR divljeg tipa u formatu hvatanja mAt. U formatu za hvatanje receptora (Tabela 4) H1H863N2, H1H1915N I Kontrola I su pokazali najveću selektivnost.
Eksperiment 4: Specifičnost antitela određena pomoću ELISA
[0132] Da bi se dalje karakterisala anti-hEGFRvIII mAt-a, njihova specifičnost vezivanja je ispitivana pomoću ELISA. Ploče su obložene sa jednim od sledećih: EGFR-mmh (SEK ID BR: 154); EGFRvIII-mmh (SEK ID BR: 152); i spojnim peptidom (J-peptid) (SEK ID BR: 148). Za vezne peptide koji su bili povezani sa biotinom bilo na C-završetku (SEK ID BR: 149) ili N-završetku (SEK ID BR: 150) preko linkera, ploče su bile prethodno obložene sa avidinom. Takođe, obložen je irelevantan peptid (kontrolni peptid) sa ili bez biotina na njegovom N-terminalu. Anti-EGFRvIII antitela kao i izotipsko kontrolno antitelo su dodata na obložene ploče i ostavljena da se inkubiraju tokom 1 sata na 25 ° C. Ploče su zatim isprane i vezana anti-EGFRvIII mAt-a su detektovana sa anti-humanim Fc antitelima konjugovanim sa peroksidazom rena (HRP). Ploče su razvijene sa rastvorom supstrata tetra-metil-benzidina
4
(TMB) da bi se dobila kolorimetrijska reakcija i neutralizovala sa sumpornom kiselinom pre očitavanja apsorbance na 450 nm, na čitaču ploče VICTOFR ™ X5. Analiza podataka je koristila model sigmoidalnog doznog odgovora u okviru PRISM ™ softvera. Izračunata vrednost EC50, definisana kao 50% koncentracije antitela potrebne za razvijanje maksimalnog odgovora, korišćena je kao indikator jačine vezivanja. Rezultati su prikazani u Tabeli 5. NT: Nije testirano. Kontrole I-III: Kao što je gore opisano.
Tabela 5
[0133] Antitela H1H1863N2, H1H1915 i Kontrola I pokazuju jako vezivanje za EGFRvIII, ali bez vezivanja (> 10 nM) za divlji tip EGFR-a. Nijedno od antitela, osim Kontrole I (koja imaju
4
sekvence koje odgovaraju sekvencama teškog i lakog lanca "13.1.2" antitela izvedene iz miševa imunizovanih sa spojnim peptidom (US Patent br.7,736,644), pokazuje vezivanje za spojne peptide.
Primer 5: Western Blot EGFR-a i EGFRvIII korišćenjem anti-EGFRvIII antitela
[0134] Jedno od antitela, H1H1863N2 je ispitivano na njegove karakteristike vezivanja sa Western blotom pod redukovanim i ne-redukovanim uslovima. EGFR-mmh (SEK ID BR: 154) ili EGFRvIII-mmh (SEK ID BR: 152) je napunjen na Tris-Glicin SDS PAGE gelove, propušten i zatim prebačen na nitrocelulozu. Nakon blokiranja, membrane su presečene na pola i ispitivane ili sa anti-EGFRvIII antitelima ili anti-His antitelom. Kontrole I i II su kao što je gore opisano.
[0135] Kao što je prikazano na Slici 1a, H1H1862N2 (Fuc-) ne vezuje redukovani ili neredukovani EGFRvIII-mmh ili EGFR-mmh i stoga ima konformacioni epitop za EGFRvIII. Nasuprot tome, Kontrola II vezuje i divlji tip i varijantu III EGFR-a pod smanjenim i neredukovanim uslovima, dok je Kontrola I, sredstvo za vezivanje spojnog peptida, specifična za EGFRvIII. Obe Kontrola I i II, za razliku od H1H1863N2, imaju linearne vezivne epitope. Slika 1b prikazuje druga EGFRvIII antitela, koja pokazuju mešovito ponašanje na Western blotovima.
Primer 6: Ispitivanja vezivanja peptida EGFR/EGFRvIII i kompeticije antitela
[0136] H1H1863N2 (Fuc-) je ispitivan na njegove karakteristike vezivanja, korišćenjem testova vezivanja peptida i kompeticije antitela. Za eksperimente vezivanja peptida EGFRvIII spojni peptid (SEK ID BR: 148) označen preko linkera sa biotinom na njegovom C-završetku [tj., LEEKKGNYVVDHGGGGSK (SEK ID BR: 149)-biotin] ili peptid koji se sastoji od ostataka 311-326 od EGFR ("EGFR 311-326 peptid"; SEK ID BR: 165" označen preko linkera sa biotinom na njegovom C-završetku [tj., CGADSYEMEEDGVRKCGGGGSK (SEK ID BR: 151)-biotin] uhvaćeni su do ~0.4 nM debljine, korišćenjem streptavidinom obloženih OCTET® vrhova na FORTEBIO® OCTET® RED instrumentu. Nakon hvatanja peptida, obloženi vrhovi su postavljeni u 1 μΜ rastvora antitela i snimljeni su odgovori vezivanja (videti sliku 2). Kontrole I-III su iste kao one gore opisane.
4
[0137] Kao što je predviđeno, Kontrola I vezuje spojni peptid sa C-terminalnim biotinom i Kontrole II i III vezuju EGFR311-326 peptid sa C-terminalnim biotinom. H1H1863N2 (Fuc-) nije uspeo da veže ni jedan od peptida.
[0138] Za unakrsnu kompeticiju antitela, -200 rezonantnih jedinica (RU) hEGFRvIII-mmh (SEK ID BR: 152) je uhvaćeno na površini BIACORE ™ obloženoj sa anti-penta-histidinskim poliklonskim antitelom visoke gustine (kat.# 34660, QUIAGEN). Korišćenjem metodologije koinjekcije, zarobljeni hEGFRvIII-mmh je zasićen pomoću 5-minutne injekcije od 500 nM prvog mAt-a, praćeno odmah drugom 5-minutnom injekcijom od drugog mAt-a (500 nM) koje je dopunjeno sa 500 nM prvog mAt-a. Značajno vezivanje, izraženo kao RU, drugog mAt-a je interpretirano da se ono ne takmiči za vezivanje sa prvim mAt-om. Za kontrolne eksperimente korišćena su izotipski podešena mAt-a, bilo kao prvo mAt ili kao drugo mAt. Rezultati su prikazani u tabeli 6.
Tabela 6
[0139] H1H1863N2(Fuc-) se nije takmičio sa bilo kojim od kontrolnih antitela I-III za vezivanje za površinu za hvatanje hEGFRvIII-mmh. Kao što se očekivalo, kontrole II i III, za koje je poznato da se vezuju za ostatke 311-326 EGFR-a, takmičile su se međusobno za vezivanje za EGFRvIII-mmh površinu za hvatanje.
Primer 7: Selektivnost ćelijskog vezivanja anti-EGFRvIII antitela
[0140] Da bi se odredila specifičnost anti-EGFRvIII mAt-a, njihovo vezivanje za HEK293, HEK293 ćelije koje izražavaju EGFRvIII (HEK293 / EGFRvIII) i A431 ćelije, analizirano je fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS). HEK293/EGFRvIII ćelije su pripremljene transfekcijom HEK293 ćelija sa DNK vektorima rezistentnim na neomicin koji konstitutivno eksprimiraju hEGFRvIII pune dužine (SEK ID BR: 147) koristeći LIPOFECTAMINE ™ 2000 transfekcioni reagens (INVITROGEN ™). Dva dana nakon transfekcije, ćelije su postavljene pod selekciju G418 tokom približno dve nedelje. Populacije koje su pozitivno eksprimirale EGFRvIII su bile izolovane pomoću fluorescentno aktiviranog sortiranja ćelija (FACS). U eksperimentu su korišćene HEK293 ćelije koje eksprimiraju ~ 3 x 10<6>kopija EGFRvIII po ćeliji. Ukratko, anti-EGFRvIII antitela pri 10 μg/ml inkubirana su sa ćelijama tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, isprana, inkubirana sa sekundarnim antitelom, tj., fikoeritrinom (PE)-obeleženim kozjim F(ab')2protiv humanog IgG (kat # 109-116-170, Jackson ImmunoResearch Laboratories), nakon čega sledi završno pranje pre FACS analize. U drugom setu eksperimenta, anti-EGFRvIII antitela su direktno konjugovana preko njihovih lizinskih ostataka sa fluorescentnom bojom, ALEXA FLUOR® 488 Dye (INVITROGEN ™), na taj način eliminišući korak korišćenja sekundarnog antitela. Rezultati iz HEK293 ćelija i HEK293/EGFRvIII ćelija, upotrebom direktno obeleženih anti-EGFRvIII antitela su prikazani u Tabeli 7, a oni koji koriste sekundarni PE-obeleženi anti-Fc (humani ili mišji) su prikazani u Tabeli 8. Rezultati iz A431 ćelija korišćenjem direktno obeleženih anti-EGFRvIII antitela su prikazani u Tabeli 9, a oni koji koriste sekundarni PE-obeleženi anti-Fc (humani ili mišji) su prikazani u Tabeli 10. Kontrole I, II, III, IV i V su gore opisane. MFI: Srednji intenzitet fluorescencije.
Tabela 7
1
(nastavak)
Tabela 8
Tabela 9
2
Tabela 10
[0141] Nekoliko anti-EGFRvIII antitela je pokazalo posebnu prednost vezivanja za ćelijsku liniju HEK293/EGFRvIII nad roditeljskim HEK293 ćelijama, kada su detektovana bilo korišćenjem direktno obeleženih anti-EGFRvIII antitela (Tabela 7) ili sekundarnog PE-obeleženog anti-humanog IgG (Tabela 8). Većina antitela kada je inkubirana sa ćelijama A431 (30 minuta na 4 ° C) ispoljava minimalno do izostanka vezivanja, izuzev za Kontrole III i IV antitela (Tabele 9 i 10).
Primer 8: Internalizacija anti-EGFRvIII mAt-a od strane HEK293/EGFRvIII ćelija
[0142] Anti-EGFRvIII mAt-a (10 ug/ml) su inkubirana sa ćelijama HEK293/EGFRvIII (videti Primer 7, supra) tokom 2 sata na ledu, praćeno sa dva ispiranja PBS-om. Ćelije su zatim podvrgnute 30-minutnoj inkubaciji na ledu sa sekundarnim DYLIGHT ™ 488-konjugovanim anti-humanim IgG Fab fragmentima (Jackson ImmunoResearch Laboratories) praćeno sa dva dodatna PBS ispiranja. Antitelima je omogućeno da se internalizuju tokom 1 h na 37 ° C, u internalizacionom puferu (PBS FBS) ili su ostala na 4 ° C. Ćelije su fiksirane u 4% formaldehidu, a jezgra obojena sa DRAQ5® DNK bojom (Cell Signaling Technology, Inc.). Slike su dobijene pri 40x na IMAGEXPRESS ™ sistemu visokog sadržaja (Molekulski uređaji) i internalizovane vezikule su kvantifikovane korišćenjem Columbus softvera (Perkin Elmer). Rezultati su prikazani u tabeli 11 i slici 3.
Tabela 11
[0143] Snažna internalizacija se dogodila na 37 ° C za H1H1863N2, Kontrolu II i Kontrolu IV. Internalizacija je takođe primećena za H1H1911N, H1H1912N i Kontrolu I.
Primer 9: Vezivanje anti-EGFRvIII antitela za U87/EGFRvIII ksenograft tumora
[0144] Da bi se dalje odredila specifičnost H1H1863N2, ćelijska linija humanog glioblastoma U87 koja eksprimira EGFRvIII, pripremljena je kao što je opisano za HEK293/EGFRvIII ćelije u Primeru 7. U eksperimentu su korišćene ćelije U87 koje eksprimiraju ~ 1,5 x 10<5>kopija EGFRvIII po ćeliji (U87/EGFRvIII). Ćelije U87/EGFRvIII (3 x 10<6>ćelija) su ksenograftirane kod miševa sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom (SCID) i tumorima je omogućen rast dok nije dobijena srednja veličina od 200-300 mm<3>. Miševima je zatim ubrizgan H1H1863N2 (Fuc-) ili izotipska kontrola preko repne vene. Na 10 minuta, 4 sata i 24 sata nakon injekcije antitela, miševi su žrtvovani i tumori su uklonjeni i stavljeni u PBS. Tumori su odmah izdvojeni i obojeni sa anti-humanim Fc (hFc-APC) antitelom konjugovanim sa alofikocijaninom (APC). Obojene ćelije su isprane 3 puta sa protočnim PBS-om koji sadrži 2% fetalnog telećeg seruma i 0,1% natrijum azida. Tumori pri vremenskim tačkama od 10 minuta i 4 sata su fiksirani preko noći i zatim mereni protočnim citometrom. Tumori sakupljeni u 24-
4
časovnoj vremenskoj tački su mereni bez fiksiranja. Svi uzorci su sakupljeni na ACCURI® C6 FLOW CYTOMETER® (Accuri Cytometers, Inc.) i određen je srednji intenzitet fluorescencije (MFI). Rezultati su prikazani u Tabeli 12. Vrednosti MFI su prosek od 2-3 biološka replikata ± standardna greška srednje vrednosti (SEM).
Tabela 12
[0145] Poređeno sa izotipskom-kontrolom, H1H1863N2(Fuc-) antitelo efikasno vezuje U87/EGFRvIII tumorske ćelije u zavisnosti od vremena.
Primer 10: Vezivanje anti-EGFRvIII antitela za B16F10.9/EGFRvIII tumorski ksenograft
[0146] SCID miševima je implantirano pedeset hiljada ćelija mišjih melanoma B16F10.9 ili B16F10.9 koje prekomerno eksprimiraju EGFRvIII (B16F10.9/EGFRvIII). Ćelije B16F10.9/ EGFRvIII su pripremljene kao što je opisano za ćelije HEK293/EGFRvIII u Primeru 7. Za ovaj eksperiment korišćene su ćelije B16F10.9 koje eksprimiraju ~ 1,5x10<5>kopija EGFRvIII po ćeliji. Tumorima je omogućen rast tokom približno 14 dana, dok nije dobijena srednja veličina od 200-300 mm<3>. Miševima je zatim injektovano H1H1863N2(Fuc-) ili izotipska kontrola preko repne vene. Pri 10 minuta, 4 sata i 24 sata nakon injekcije antitela, miševi su žrtvovani i tumori su uklonjeni i stavljeni u PBS. Tumori su odmah izolovani i obojeni sa anti-humanim Fc (hFc-APC) antitelom konjugovanim sa alofikocijaninom. Obojene ćelije su isprane 3X sa protočnim PBS-om (1 xPBS, 2% fetalnog telećeg seruma, 0.1% natrijum azida), fiksirane i permealizovane standardnim metodama. Protočna citometrija je korišćena za detekciju H1H1863N2 (Fuc-) vezanog za površinu ćelije i analiza je izvršena korišćenjem softvera FlowJo (Tree Star, Inc.). Rezultati su prikazani u Tabeli 13 i na Slici 4a. Da bi se detektovala i antitela vezana za ćelijsku površinu i vezana intracelularno, ćelije su obojene drugi put upotrebom istog anti-humanog Fc (hFc-APC) antitela nakon koraka fiksacije i permeabilizacije. Ovo je omogućilo detekciju intracelularnog antitela. Rezultati su prikazani u Tabeli 14 i na Slici 4b. Svi uzorci su sakupljeni na ACCURI® C6 FLOW CYTOMETER® i određena je srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI). MFI za svaki uzorak je prijavljen nakon oduzimanja MFI od neobojene kontrole. Vrednosti MFI su prosek dva biološka ponavljanja (N = 2) ± standardna greška srednje vrednosti (SEM). *N = 1 za ovu vremensku tačku.
Tabela 13
Tabela 14
[0147] H1H1863N2(Fuc-) se efikasno vezuje za površinu B16F10.9 ćelija koje eksprimiraju EGFRvIII na način koji je vremenski zavisan, dok je vezivanje izotipske kontrole bilo minimalno. Povećanje ukupnog vezivanja (tj., vezanog za površinu ćelije plus interno vezanog) H1H1863N2 (Fuc-), u poređenju sa njegovim vezivanjem samo za ćelijsku površinu, pokazalo je da su antitela vezana na površini ćelija efikasno internalizovana pomoću B16F10.0 ćelija.
Primer 11: Farmakokinetika anti-EGFRvIII antitela kod miševa
[0148] Da bi se odredila in vivo selektivnost anti-EGFRvIII antitela, izvedena je farmakokinetička studija pomoću miševa divljeg tipa ("WT miševi") koji prirodno eksprimiraju mišji EGFR, i humaniziovanih EGFR miševa ("hEGFR miševi") koji eksprimiraju humani EGFR. Miševi su bili iz ukrštenih sojeva sa podlogom koja sadrži C57BL6 (75%) i 129Sv (25%). Kohorte su sadržale svakih 5 bilo WT ili hEGFR miševa. Sva antitela su primenjivana subkutano, u dozi od 0,2 mg/kg. Krv je sakupljena pri 0, 6 sati, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 7 dana, 10 dana, 14 dana, 21 dan i 30 dana nakon primene. Serumski nivoi humanih antitela su određeni putem sendvič ELISA. Ukratko, kozje poliklonsko antihumano IgG (Fc-specifično) antitelo (Jackson ImmunoResearch) je obloženo u pločama sa 96 bazenčića, pri koncentraciji od 1 μg/ml i inkubirano preko noći na 4 ° C. Nakon što su ploče blokirane sa BSA, uzorci seruma u serijskim razblaženjima od šest doza i referentnim standardima odgovarajućih antitela u serijskim razblaženjima od dvanaest doza su dodati na ploču i inkubirani tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja da bi se uklonilo nevezano antitelo, detektovana su zarobljena humana antitela korišćenjem istog kozjeg poliklonskog anti-humanog IgG (Fc-specifičnog) antitela konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP) (Jackson ImmunoResearch) i razvijena pomoću standardnog kolorimetrijskog tetrametilbenzidinskog (TMB) supstrata prema preporuci proizvođača. Apsorbance na 450 nm su zabeležene na čitaču ploče i koncentracija hIgG u uzorcima seruma je izračunata korišćenjem referentne standardne krive generisane u ploči uzorka. Mišja anti-humana antitela (MAHA) su izmerena korišćenjem standardnih metoda i generalno su bila niska.
[0149] Slike 5a-5d prikazuju dijagrame koncentracije antitela nasuprot vremenu za četiri testirana antitela. Za kontrolu IV ("Mab C225") je poznato da vezuje humani EGFR, ali ne i njegov mišji homolog. Kao što je očekivano, ovo antitelo je pokazalo brzo uklanjanje kod hEGFR miševa i sporu eliminaciju (tj. bez ciljno-posredovanog klirensa) kod miševa divljeg tipa (Slika 5a). Za kontrolu I ("Mab 13.1.2") je poznato da vezuje EGFRvIII spojni peptid "LEEKKGNYVVTDH" koji nije prisutan u humanom ili mišjem EGFR-u. Antitelo ne vezuje humani ili mišji EGFR in vivo. Kao što je očekivano, ovo antitelo je pokazalo identične usporene farmakokinetičke brzine klirensa kod oba tipa miševa (Slika 5b) i nije primećen ciljno-posredovani klirens. Kontrolno III antitelo ("Mab hu806") je pokazalo povećan klirens kod hEGFR miševa u odnosu na WT miševe (Slika 5c). Ovaj nalaz je u skladu sa njegovom sposobnošću da vezuje hEGFR in vitro, kao što je određeno pomoću Biacore (videti Primer 3, Tabela 4) i FACS-a (Primer 7, Tabela 9). Slika 5d prikazuje klirens H1H1863N2 (Fuc ). Ovo antitelo, slično kontroli I, pokazalo je identične usporene brzine klirense kod oba tipa miševa. Stoga, H1H1863N2 ne vezuje humani ili mišji EGFR in vivo.
Primer 12: Konjugat anti-EGFRvIII antitela i leka inhibira rast tumora na in vivo modelima alografta EGFRvIII-pozitivnog raka dojke
[0150] U ovom Primeru, dva različita konjugata antitela i leka od primernog anti-EGFRvIII antitela H1H1863N2 su ispitivana na njihovu sposobnost da inhibiraju rast tumora in vivo. Prvi ADC je proizveden konjugovanjem H1H1863N2 sa toksinom majtanzinoida DM1 preko MCC linkera koji se ne može otcepiti (videti, npr., US 5,208,020 i objavu Američke prijave br.
2010/0129314) da bi se proizveo "H1H1863N2-MCC-DM1". Drugi ADC je proizveden konjugovanjem H1H1863N2 sa modifikovanom verzijom DM1 vezanom za novi cepivi linker, koji se naziva" M0026" (takođe poznat kao "jedinjenje 7" u WO2014/145090, da se dobije "H1H1863N2-M0026". Kada je ispitivan na citotoksičnost in vitro protiv MMT/EGFRvIII ćelija, H1H1863N2-MCC-DM1 je pokazao IC50od 12 nM, dok je H1H1863N2-7 pokazao IC50od 0,8 nM, na osnovu ekvivalenata leka.
[0151] Da bi se uporedila in vivo efikasnost anti-EGFRvIII antitela konjugovanih sa DM1 i M0026, izvođene su studije kod imunokompromitovanih miševa koji nose EGFRvIII pozitivne alografte raka dojke.
[0152] Ukratko, tumorski alografti su uspostavljeni subkutanom implantacijom 0,5x10<6>MMT/EGFRvIII ćelija u levi bok ženki CB17 SCID miševa (Taconic, Hudson, NY). Kada su tumori dostigli prosečnu zapreminu od 140 mm<3>(~ 8 dan), miševi su randomizovani u grupe od sedam, i dozirani sa anti-EGFRvIII ADC-ovima, korišćenjem formata MCC-DM1 ili M0026 linkera-leka. Takođe su procenjeni kontrolni reagensi, uključujući ne-vezujuće ADC-ove korišćenjem ili formata MCC-DM1 ili M0026 linkera-leka, i PBS nosača. Konjugati antitela i leka su dozirani pri 1 i 5 mg/kg tri puta preko jedne nedelje i nakon toga praćeni sve dok se nije dostigla prosečna veličina tumora od približno 2000 mm<3>u grupi primenjenoj samo sa nosačem. U ovoj tački, inhibicija rasta tumora je izračunata kao što je niže opisano.
[0153] Prosečna veličina tumora u odnosu na grupu koja je tretirana nosačem je izračunata na sledeći način: tumori su mereni sa šestarima dva puta nedeljno sve dok srednja veličina grupe nosača nije dostigla 1000 mm<3>; veličina tumora je izračunata korišćenjem formule (dužina x širina<2>)/2. Inhibicija rasta tumora je izračunata prema sledećoj formuli: (1-((Tkonačno-Tinicijalno)/ (Ckonačno-Cinicijalno)))*100, pri čemu T (tretirana grupa) i C (kontrolna grupa) predstavlja srednju masu tumora na dan kada je grupa sa nosačem dostigla 1000mm<3>. Rezultati su sumirani u tabeli 15.
Tabela 15
[0154] Kao što je sumirano u tabeli 15, najveća inhibicija tumora je uočena kod miševa doziranih sa 5 mg/kg H1H1863N2-M0026, gde je primećena regresija početnog tumora. Inhibicija rasta tumora od 102% koja je rezultat tretmana sa 5 mg/kg H1H1863N2-M0026 je bila značajno veća u odnosu na onu koja je primećena nakon tretmana tumora sa 5 mg/kg H1H1862N2-MCC-DM1 (83%). Superiornost inhibicije rasta tumora indukovane pomoću H1H1863N2-M0026 u poređenju sa H1H1863N2-mcc-DM1 je takođe održavana pri dozi od 1 mg/kg. Nije primećen anti-tumorski efekat u grupama koje su tretirane sa kontrolnim ADC, korišćenjem MCC-DM1 ili M0026.
[0155] Ovaj primer stoga pokazuje da su anti-EGFRvIII antitela iz sadašnjeg pronalaska, kada su primenjena u obliku konjugata antitela i leka, veoma jaka u inhibiranju rasta tumora. Predmetni primer dodatno podržava ulogu ADC-a iz pronalaska da stvarno promovišu tumorsku regresiju, posebno u kontekstu anti-EGFRvIII antitela prema pronalasku (npr., H1H1863N2) konjugovanih sa novim molekulom linkera/leka M0026.
[0156] Sadašnji pronalazak ne treba da bude ograničen u obimu ovde opisanim specifičnim realizacijama. Zaista, različite modifikacije pronalaska pored onih koje su ovde opisane biće očigledne stručnjacima iz prethodnog opisa i priloženih slika. Takve modifikacije su obuhvaćene obimom priloženih patentnih zahteva.
Primer 13: Anti-EGFRvIII-DM1 antitela pokazuju specifičnost za ćelije koje izražavaju EGFRvIII i pokazuju jaku aktivnost ubijanja ćelija
[0157] U ovom primeru, sposobnost anti-humanih EGFRvIII antitela konjugovanih sa majtanzinskim toksinom DM1 da se smanji vijabilnost ćelija je određena korišćenjem in vitro testova na ćelijskoj bazi.
[0158] Humani EGFRvIII pune dužine (SEK ID BR: 147) ili humani EGFR divljeg tipa (SEK ID BR: 146) je stabilno uveden u HEK293 (293/hEGFRvIII, 293/hEGFRwt), U251 ( U251/hEGFRvIII) i MMT 060562 (MMT/ hEGFRvIII) ćelijske linije. Sve ćelije su generisane preko metodologija zasnovanih na lipofektaminu 2000 i kultivisane su u kompletnom medijumu za rast u prisustvu G418.
[0159] Ekspresija EGFR wt ili EGFRvIII na površini ćelije je merena pomoću FACS analize. Ukratko, 1 x 10<6>ćelija je inkubirano sa 10 μg/ml anti-EGFRvIII antitela H1H1863N2, anti-EGFRwt kontrolnim mAt (Kontrola IV) ili izotipskom kontrolom tokom 30 min. na ledu, u puferu za razblaživanje antitela. Nakon dva ispiranja sa puferom za razblaživanje antitela, ćelije su inkubirane sa 10 μg/ml PE konjugovanog anti-humanog sekundarnog antitela tokom 30 minuta na ledu. Nakon dva dodatna ispiranja, uzorci su propuštani na Accuri C6 (BD) ili Hypercyt (Intellicyt) citometru i analizirani podaci analizirani korišćenjem softvera FlowJo. Rezultati su sumirani u Tabeli 16. n.d. = nije određeno.
Tabela 16: Ekspresija na ćelijskoj površini kod EGFRwt i EGFRvIII konstruisanih ćelijskih linija
[0160] Ovi rezultati pokazuju da je površinska ekspresija EGFRvIII bila uporediva u ćelijskim linijama HEK293 /hEGFRvIII i MMT/hEGFRvIII, dok su ekspresioni nivoi U251/EGFRvIII bili približno 20 puta niži nego u ćelijskim sistemima HEK293/hEGFRvIII i MMT/hEGFRvIII. Vezivanje EGFRvIII preko H1H1863N2 nije bilo moguće detektovati u roditeljskim ćelijskim linijama. Nasuprot tome, anti-EGFRwt kontrolno antitelo (Kontrola IV) je vezano za HEK293 roditeljske ćelije pri 49 puta iznad izotipske kontrole. Stabilna ugradnja EGFRwt ekspresionog vektora u HEK293 ćelije povećala je ekspresiju do 332 puta iznad pozadine i bila je uporediva sa ekspresijom EGFRvIII u HEK293/hEGFRvIII i MMT/hEGFRvIII ćelijama.
[0161] Selektivno vezivanje anti-EGFRvIII antitela H1H1863N2 za EGFRvIII je procenjeno putem FACS-a korišćenjem HEK293 roditeljskih, HEK293/hEGFRwt, HEK293/hEGFRvIII i A431 ćelijskih linija. Rezultati su prikazani u Tabeli 17.
Tabela 17: Specifičnost vezivanja anti-EGFRvIII antitela za ćelijske linije koje izražavaju EGFRvIII
[0162] Kao što je prikazano u Tabeli 17, oba H1H1863N2 i anti-EGFRwt kontrolno antitelo (Kontrola IV) su ispoljila snažno vezivanje (> 650 puta iznad podloge) za HEK293/EGFRvIII ćelije u odnosu na izotipsku kontrolu. Nasuprot tome, H1H1863N2 se slabo vezuje za wt-EGFR HEK293 ćelijsku liniju (3-puta iznad podloge) i endogeno eksprimirajuću EGFR ćelijsku liniju A431 (13 puta iznad kontrole). Anti-EGFR-wt kontrolna antitela se snažno vezuju za ćelije koje eksprimiraju EGFR divljkeg tipa, potvrđujući selektivnost H1H1863N2 za EGFRvIII preko divljeg tipa EGFR.
1
[0163] Zatim, sposobnost anti-humanih EGFRvIII antitela konjugovanih sa majtanzinskim toksinom DM1 da bi se smanjila vijabilnost ćelija je određen korišćenjem in vitro testova na bazi ćelija. Ćelije su zasejane u pločama sa 96 bazenčića obloženim sa PDL-om, pri 250-2000 ćelija po bazenčiću, u kompletnom medijumu za rast i ostavljene da rastu preko noći. Za krive ćelijske vijabilnosti, ADC-ovi ili slobodni lek (DM1-SMe) su dodati u ćelije, pri konačnim koncentracijama u rasponu od 500 nM do 5 pM i inkubirani tokom 3 dana. Ćelije su inkubirane sa CCK8 (Dojindo) tokom poslednjih 1-3 h i apsorbancija na 450nm (OD450) je određena na Flexstation3 (Molecular Devices). Nivo OD450 podloge iz ćelija tretiranih digitoninom (40 nM) je oduzet od svih bazenčića i vijabilnost je izražena kao procenat netretiranih kontrola. IC50 vrednosti su određene iz logističke jednačine sa četiri parametra preko krive odgovora od 10 tačaka (GraphPad Prism). Rezultati su prikazani u tabelama 18A i 18B. IC50vrednosti su u nM i normalizovane su za odnos određenog leka/antitela (DAR).
Tabela 18A: Jačina ćelijskog ubijanja konjugata anti-EGFRvIII-DM1 antitela-leka
Tabela 18B: Potentnost ćelijskog ubijanja konjugata anti-EGFRvIII-DM1 antitela-leka
2
[0164] Kao što je prikazano u tabelama 18A i 18B, H1H1863N2-MCC-DM1 smanjuje vijabilnost HEK293/hEGFRvIII, U251/ hEGFRvIII i MMT/ hEGFRvIII ćelijskih linija sa IC50 vrednostima u opsegu od 1,0 do 4,0 nM. Suprotno tome, izotipska kontrola konjugovana sa DM1 je smanjila održivost 293/EGFRvIII i MMT/hEGFRvIII ćelija sa vrednostima IC50 većim od 100 nM i U251/hEGFRvIII ćelija sa IC50 od 35 nM. H1H1863N2-MCC-DM1 nije imao uticaja na HEK293 ćelije koje eksprimiraju divlji tip EGFR-a (293/hEGFRwt) ili na kontrolne roditeljske ćelijske linije što sugeriše specifičnost za ćelije koje izražavaju EGFRvIII.
[0165] Stoga, ovaj primer pokazuje da EGFRvIII antitelo H1H1863N2 ima specifičnost za EGFRvIII-eksprimirajuće ćelijske linije i pokazuje specifičnu sposobnost ubijanja ćelija kada je konjugovan sa DM1 toksinom.
Primer 14: Poboljšana jačina ubijanja ćelija je postignuta kada je
Konjugat antitela i leka za konformaciono vezivanje EGFRvIII doziran u kombinaciji sa konjugatom antitela-leka za vezivanje spojnog peptida EGFRvIII
[0166] U ovom primeru, određena je sposobnost da se poboljša ubijanje ćelija zajedničkom primenom dva različita tipa anti-EGFRvIII konjugata antitela i leka. Za ovaj primer, ispitivane kombinacije su se sastojale od dva različita anti-EGFRvIII antitela: (1) anti-EGFRvIll specifično antitelo koje ne prepoznaje spojni peptid EGFRvIII ADC (ovde se označava kao "konformaciono vezivo"); i (2) anti-EGFRvIII specifično antitelo koje prepoznaje spojni peptid EGFRvIII (ovde označeno kao "peptidno vezivo"). Kao što je pokazano u Primeru 6, anti-EGFRvIII antitelo H1H1863N2 se ne vezuje za EGFRvIII spojni peptid ili ostatke 311-326 humanog EGFR i stoga se smatra "konformacionim vezivom".
Unakrsna kompeticija in vitro
[0167] Prvo, sposobnost H1H1863N2 da se unakrsno takmiči sa antitelom koje vezuje spojni peptid EGFRvIII je određena putem testa kompetitivnog vezivanja. Anti-EGFRvIII antitelo koje vezuje spojni peptid korišćeno u ovom primeru je Kontrola V.
[0168] Unakrsna kompeticija je određivana korišćenjem u realnom vremenu, testa interferometrije bio-sloja bez obeležavanja (BLI) na Octet HTX biosenzoru (ForteBio Corp., A Division of Pall Life Sciences). Ceo eksperiment je izveden na 25 ° C, u puferu koji se sastoji od 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCl, 3mM EDTA, 0,05% v/v surfaktanta P20, 1,0 mg/mL BSA (Octet HBST pufer) sa tresenjem ploče pri brzini od 1000 rpm. Da bi se procenilo da li se dva antitela unakrsno takmiče za vezivanje na rekombinantnom humanom EGFRvIII (hEGFRvIII.mmh; SEK ID: 152), približno ~ 0,35nm hEGFRvIII.mmh je zarobljeno na antipenta-His obloženim Octet biosenzorima. Biosenzori zarobljenog antigena su zatim zasićeni sa prvim anti-EGFRvIII monoklonskim antitelom (kasnije označenim kao mAt-1) uranjanjem u bazenčiće koji sadrže 50 µg/mL rastvora mAt-1, tokom 5 minuta. Biosenzori su zatim naknadno potopljeni u bazenčiće koji sadrže 50 µg/mL rastvora drugog anti-EGFRvIII monoklonskog antitela (naknadno označenog kao mAt-2) tokom 3 minuta. Svi biosenzori su isprani u Octet HBST puferu između svakog koraka eksperimenta. Odgovor vezivanja u realnom vremenu je praćen tokom trajanja eksperimenta i zabeležen je odgovor vezanja na kraju svakog koraka. Poređen je odgovor vezivanja mAt-2 za hEGFRvIII prethodnokompleksiran sa mAt-1 i određeno je kompetitivno/ nekompetitivno ponašanje različitih anti-EGFRvIII monoklonskih antitela.
[0169] Korišćenjem ovog eksperimentalnog formata unakrsne kompeticije, H1H1863N2 nije ispoljio unakrsnu kompeticiju sa ispitivanim vezivom EGFRvIII veznog peptida, niti se unakrsno takmičio za vezivanje za EGFRvIII sa kontrolom I ili kontrolom IV. Rezultati ovog testa unakrsnog takmičenja ukazuju da H1H1863N2 ima poseban epitop za vezivanje prema onom od vezivnog sredstva spojnog peptida EGFRvIII, kao i Kontrole II i IV.
4
Aktivnost ubijanja ćelija pojedinačnih konjugata anti-EGFRvIII antitela-leka
[0170] Zatim, procenjena je sposobnost H1H1863N2-MCC-DM1 i anti-EGFRvIII peptidvezujućeg ADC-a da smanje vijabilnost ćelija kada su primenjivani u kombinaciji. Sposobnost Kontrole V da indukuje ubijanje ćelija kada je konjugovana sa SMCC-DM1 (tj., Kontrola V-MCC-DM1) je određena korišćenjem in vitro testa na bazi ćelija, kao što je opisano u Primeru 13. Rezultati su sumirani u tabeli 19.
Tabela 19: Jačina ubijanja ćelija od strane konjugata anti-EGFRvIII-DM1 antitela i leka
[0171] Kao što je sumirano u Tabeli 19, konjugati anti-EGFRvIII antitela i leka smanjuju vijabilnost ćelija različitih ćelijskih linija koje prekomerno izražavaju EGFRvIII sa IC50vrednostima koje su u opsegu od 0,25 nM do 3,25 nM.
Aktivnost uništavanja ćelija kombinacijama parova konjugata anti-EGFRvIII antitela i leka
[0172] Zatim, jačina uništavanja ćelija H1H1863N2-MCC-DM1 uparenog sa anti-EGFRvIII peptid-vezujućim konjugatom antitela i leka, ispitivana je na ćelijskim linijama koje prekomerno izražavaju EGFRvIII, u odnosu 1: 1. Rezultati su prikazani u Tabeli 20.
Tabela 20: Jačina ubijanja ćelija kombinacijama parova anti-EGFRvIII-DM1 ADC-a
[0173] Kao što je sumirano u Tabeli 20, kombinacija H1H1863N2-MCC-DM1 (vezivno sredstvo konformacionog epitopa) i Kontrole V-MCC-DM1 (vezivno sredstvo spojnog peptida) rezultira jačinom ubijanja ćelija koja je bila najmanje ekvivalentna sa, ili u određenim slučajevima, poboljšana u poređenju sa tretmanima sa pojedinačnim konjugatom antitela i leka. Nedostatak interferencije između dva tipa antitela sugeriše efikasnu upotrebu dva nekonkurentska antitela sa različitim citotoksinima, ili različitim klasama citotoksina koje imaju različite mehanizme delovanja.
[0174] Zbirno, ovaj primer pokazuje da se H1H1863N2 ne takmiči unakrsno sa kontrolnim antitelom za vezivanje peptida EGFRvIII. Ovaj jedinstveni epitop dozvoljava njegovu kombinaciju sa konjugatima antitela i leka koji vezuju peptid EGFRvIII da bi se poboljšala jačina ubijanja ćelija. Ova nova kombinacija EGFRvIII ADC-a može omogućiti bolju terapeutsku efikasnost.
LISTING SEKVENCI
[0175]
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
�
1
�
�
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Izolovano antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani EGFRvIII, naznačen time, da antitelo ili njegov fragment sadrži kombinaciju od
HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 aminokiselinskih sekvenci od SEK ID BR-a: 36/38/40/44/46/48.
2. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, da antitelo ili njegov fragment pokazuje konstantu ravnoteže disocijacije (KD) za humani EGFRvIII dimer od oko 50 nM ili manje, oko 20 nM ili manje, oko 10 nM ili manje, oko 5,0 nM ili manje, oko 1,0 nM ili manje, ili oko 0,5 nM ili manje, kako je izmereno ispitivanjem površinske plazmonske rezonance.
3. Antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, da je antitelo ili antigen-vezujući fragment konjugovan sa citotoksinom, opciono, gde je citotoksin izabran iz grupe koja se sastoji od (i) biotoksina, hemoterapeutskih agenasa i radioizotopa ili (ii) majtanzinoida, auristatina, tomajmicina, duokarmicina,<225>Ac,<227>Th i bilo kojih njihovih derivata.
4. Antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema patentnom zahtevu 2, naznačen time, da antitelo ili njegov fragment pokazuje KDza humani EGFR dimer viši od onoga za dimer EGFRvIII za najmanje oko 4 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 50 puta, najmanje oko 100 puta, najmanje oko 500 puta, najmanje oko 1000 puta, najmanje oko 2000 puta, ili najmanje oko 3000 puta, kao što je izmereno testom površinske plazmonske rezonance, opciono, pri čemu antitelo ili njegov fragment ne vezuje EGFR dimer pri nivou koji se može detektovati ispitivanjem površinske plazmonske rezonance.
5. Antitelo ili fragment za vezivanje antigena iz patentnog zahteva 1, gde:
(a) HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 34; ili
(b) LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 42.
6. Antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema patentnom zahtevu 5, naznačen time, da antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži jedan HCVR/LCVR sekvencijski par od SEK ID BR: 34/42.
7. Farmaceutski preparat koji sadrži antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema patentnom zahtevu 1 i farmaceutski prihvatljiv nosač i opciono, jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa izabranih iz grupe koja se sastoji od hemoterapeutskog agensa, antiinflamatornih agenasa i analgetika.
8. Farmaceutski preparat kao što je definisan u patentnom zahtevu 7, za upotrebu u postupku za lečenje raka ili tumora koji izražava EGFRvIII, postupak koji obuhvata primenu kod subjekta kome je to potrebno terapeutski efikasne količine farmaceutskog preparata prema patentnom zahtevu 7.
9. Farmaceutski preparat za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačen time, da je kancer ili tumor izabran iz grupe koju čine glioblastom, duktalni ili intraduktalni karcinom dojke, karcinomi pluća koji nisu mikrocelularni, karcinomi jajnika, rak prostate i karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata.
10. Antitelo-lek konjugat (ADC) za upotrebu u postupku za lečenje kancera, smanjenje rasta tumora i/ili izazivanja regresije tumora kod pacijenta, ADC koji sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i jedan citotoksin, naznačen time, da se antitelo ili antigenvezujući fragment ADC-a specifično vezuje za EGFRvIII, ali ne vezuje spojni peptid od SEK ID BR: 148 ili peptid od SEK ID BR: 165 i pri čemu antitelo ili njegov fragment sadrži kombinaciju HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 aminokiselinskih sekvenci od SEK ID BR-a: 36/38/40/44/46/48 i postupak obuhvata primenu ADC-a kod pacijenta kome je potreban.
11. ADC za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što postupak dalje obuhvata primenu kod pacijenta dodatnog ADC-a koji sadrži antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena i citotoksin, pri čemu se antitelo ili fragment za vezivanje antigena dodatnog ADC-a specifično vezuje za EGFRvIII i takođe, vezuje spojni peptid od SEK ID BR: 148 i/ili peptid od SEK ID BR: 165.
1
12. ADC za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što antitelo ili fragment za vezivanje antigena ADC-a sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR: 34 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR: 42.
13. Antitelo-lek konjugat (ADC) za upotrebu u postupku za lečenje kancera, smanjenje rasta tumora i/ili izazivanja regresije tumora kod pacijenta, ADC koji sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i jedan citotoksin, naznačen time, da antitelo ili antigen-vezujući fragment prvog ADC-a specifično vezuje EGFRvIII i takođe vezuje spojni peptid od SEK ID BR: 148 ili peptid od SEK ID BR: 165, a postupak obuhvata primenu kod pacijenta kome je potreban ADC i dodatni ADC koji sadrži koji sadrži antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena i citotoksin, pri čemu antitelo ili fragment za vezivanje antigena dodatnog ADC-a specifično vezuje EGFRvIII, ali ne vezuje spojni peptid od SEK ID BR: 148 ili peptid od SEK ID BR: 165 i gde antitelo ili njegov fragment dodatnog ADC-a sadrži kombinaciju HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 aminokiselinskih sekvenci od SEK ID BR-a: 36/38/40/44/46/48.
1
RS20191002A 2014-03-11 2015-03-10 Anti-egfrviii antitela i njihova primena RS59077B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461950963P 2014-03-11 2014-03-11
PCT/US2015/019722 WO2015138460A1 (en) 2014-03-11 2015-03-10 Anti-egfrviii antibodies and uses thereof
EP15712472.8A EP3126388B1 (en) 2014-03-11 2015-03-10 Anti-egfrviii antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59077B1 true RS59077B1 (sr) 2019-09-30

Family

ID=52875228

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191002A RS59077B1 (sr) 2014-03-11 2015-03-10 Anti-egfrviii antitela i njihova primena

Country Status (31)

Country Link
US (4) US9475875B2 (sr)
EP (1) EP3126388B1 (sr)
JP (1) JP6632984B2 (sr)
KR (1) KR102399005B1 (sr)
CN (1) CN106459199B (sr)
AU (1) AU2015229591B2 (sr)
BR (1) BR112016020752B1 (sr)
CA (1) CA2940685C (sr)
CL (1) CL2016002252A1 (sr)
CY (1) CY1121870T1 (sr)
DK (1) DK3126388T3 (sr)
EA (1) EA035809B1 (sr)
ES (1) ES2736126T3 (sr)
HR (1) HRP20191335T1 (sr)
HU (1) HUE045307T2 (sr)
IL (1) IL247407B (sr)
LT (1) LT3126388T (sr)
MA (1) MA39313B1 (sr)
ME (1) ME03525B (sr)
MX (1) MX373280B (sr)
MY (1) MY178160A (sr)
NZ (1) NZ724229A (sr)
PH (1) PH12016501680B1 (sr)
PL (1) PL3126388T3 (sr)
PT (1) PT3126388T (sr)
RS (1) RS59077B1 (sr)
SG (1) SG11201606979TA (sr)
SI (1) SI3126388T1 (sr)
SM (1) SMT201900439T1 (sr)
WO (1) WO2015138460A1 (sr)
ZA (1) ZA201605894B (sr)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
RS59077B1 (sr) 2014-03-11 2019-09-30 Regeneron Pharma Anti-egfrviii antitela i njihova primena
WO2016070051A2 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treatment of disease
TWI899515B (zh) 2015-08-04 2025-10-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
KR20250157457A (ko) * 2015-10-23 2025-11-04 메뤼스 엔.페. 암 성장을 억제하는 결합 분자
WO2018039499A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Host cell protein modification
WO2018091724A1 (en) * 2016-11-21 2018-05-24 Cureab Gmbh Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
AU2018219909B2 (en) * 2017-02-10 2025-02-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled anti-LAG3 antibodies for immuno-PET imaging
CN114075269A (zh) 2017-07-06 2022-02-22 菲仕兰坎皮纳荷兰私人有限公司 用于制备糖蛋白的细胞培养工艺
TWI799432B (zh) * 2017-07-27 2023-04-21 美商再生元醫藥公司 抗ctla-4抗體及其用途
PL3665198T3 (pl) 2017-08-09 2025-06-09 Merus N.V. Przeciwciała wiążące egfr i cmet
KR102119783B1 (ko) * 2017-08-14 2020-06-08 사회복지법인 삼성생명공익재단 인간 상피 성장 인자 수용체 변이체 ⅲ에 결합하는 항체 및 그의 항체 단편
CN109912715A (zh) * 2017-12-13 2019-06-21 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种EGFRvIII抗体及其偶联物、制备方法和应用
CN111479618B (zh) 2017-12-22 2022-08-02 瑞泽恩制药公司 用于表征药物产品杂质的系统和方法
KR20200115485A (ko) 2018-01-31 2020-10-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 약물 생성물 불순물을 특성화하기 위한 시스템 및 방법
TWI786265B (zh) 2018-02-02 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
US12460270B2 (en) 2018-02-28 2025-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for identifying viral contaminants
BR112020015291B1 (pt) 2018-03-19 2023-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Tampão de amostra de eletroforese aquoso, método para identificar contaminantes ou impurezas em uma amostra de fármaco proteico, e, kit
US12253490B2 (en) 2018-03-19 2025-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
US12259355B2 (en) 2018-03-19 2025-03-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
TW202016125A (zh) 2018-05-10 2020-05-01 美商再生元醫藥公司 用於定量及調節蛋白質黏度之系統與方法
CN112218877B (zh) 2018-08-27 2025-07-25 瑞泽恩制药公司 拉曼光谱在下游纯化中的应用
KR20210053816A (ko) 2018-08-30 2021-05-12 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단백질 복합체를 특성화하기 위한 방법
IL284471B2 (en) 2019-01-16 2025-01-01 Regeneron Pharma Methods for identifying free thiols in proteins
KR20210148228A (ko) 2019-03-27 2021-12-07 내셔날 리서치 카운실 오브 캐나다 항-EGFRvIII 항체 및 그의 항원-결합 단편
EP3969908A1 (en) 2019-05-13 2022-03-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Improved competitive ligand binding assays
AU2020299382A1 (en) * 2019-07-02 2022-01-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind EGFRvIII and their use
EP4653865A3 (en) 2019-09-24 2026-02-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for chromatography use and regeneration
US12297451B1 (en) 2019-10-25 2025-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium
MX2022006236A (es) 2019-11-25 2022-06-22 Regeneron Pharma Formulaciones de liberacion sostenida con emulsiones no acuosas.
KR102544013B1 (ko) 2020-01-21 2023-06-19 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 당질화된 단백질의 전기영동을 위한 탈당질화 방법
AU2021261681A1 (en) * 2020-04-24 2022-12-08 Merus B.V. Treatment of cancers with an antibody that binds LGR5 and EGFR
CA3192999A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Asparagine feed strategies to improve cell culture performance and mitigate asparagine sequence variants
EP4251128A1 (en) 2020-11-25 2023-10-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained release formulations using non-aqueous membrane emulsification
WO2022133135A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fabrication of protein-encapsulating microgels
CN116635064A (zh) 2020-12-18 2023-08-22 世纪治疗股份有限公司 具有适应性受体特异性的嵌合抗原受体系统
CN116761880A (zh) 2021-01-20 2023-09-15 瑞泽恩制药公司 改进细胞培养物中的蛋白质滴度的方法
WO2022177676A1 (en) * 2021-02-16 2022-08-25 City Of Hope Anti-domain iv egfr antibodies and uses thereof
CA3207883A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Xiaobin Xu Systems and methods for quantifying and modifying protein viscosity
US20220309215A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for developing mixing protocols
AU2022286340A1 (en) 2021-06-01 2024-01-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
CA3212850A1 (en) * 2021-06-22 2022-12-29 Frank DELFINO Anti-egfrviii antibody drug conjugates and uses thereof
WO2023039457A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. A high-throughput and mass-spectrometry-based method for quantitating antibodies and other fc-containing proteins
AU2022348521A1 (en) 2021-09-20 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of controlling antibody heterogeneity
JP2024539550A (ja) * 2021-09-29 2024-10-29 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ ヒト化抗ｅｇｆｒｖｉｉｉ抗体及びその抗原結合断片
KR20240090312A (ko) 2021-10-07 2024-06-21 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ph 미터 보정 및 교정
CN118076894A (zh) 2021-10-07 2024-05-24 里珍纳龙药品有限公司 pH建模和控制的系统及方法
KR20240097864A (ko) 2021-10-26 2024-06-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 상이한 온도에서 실험실 용수를 생성하고 실험실 용수를 분배하는 시스템 및 방법
CA3245647A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR ANALYZING POLYPEPTIDE VARIANTS
KR20250011926A (ko) * 2022-05-18 2025-01-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Cd38 및 4-1bb에 결합하는 다중특이적 항원 결합 분자, 및 이의 용도
TW202435942A (zh) 2022-12-16 2024-09-16 美商里珍納龍藥品有限公司 評估層析管柱完整性的方法及系統
US20240245779A1 (en) 2023-01-25 2024-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modeling liquid protein composition stability
TW202445126A (zh) 2023-01-25 2024-11-16 美商再生元醫藥公司 基於質譜法之體內共表現抗體之表徵
TW202445138A (zh) 2023-02-01 2024-11-16 美商再生元醫藥公司 用於生物巨分子分析之具質譜法的不對稱流場流分離
WO2024178213A2 (en) 2023-02-22 2024-08-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. System suitability parameters and column aging
TW202508625A (zh) 2023-05-01 2025-03-01 美商再生元醫藥公司 使用苯酚或苯甲醇之多劑量抗體藥物產品
AU2024305352A1 (en) 2023-06-12 2025-12-04 Amgen Inc. Lymphotoxin beta receptor agonist binding proteins
WO2025014896A1 (en) * 2023-07-07 2025-01-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Humanized 40h3 antibody
US20250086164A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for assessing chromatographic column integrity
WO2025064403A2 (en) 2023-09-18 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for developing chromatography protocols
US20250109905A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Lyophilization using controlled nucleation
US20250129117A1 (en) 2023-10-18 2025-04-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rapid purification of monoclonal antibody from in-process upstream cell culture material
US20250145662A1 (en) 2023-11-02 2025-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lipase activity using stress
WO2025166281A1 (en) 2024-02-01 2025-08-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Platform for charge-detection mass spectrometry analysis of aavs
WO2025175164A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing concentrated formulated drug substances comprising proteins, and concentrated formulated drug substance made by the methods
WO2025194043A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Polysorbate and polyoxyethylene sorbitan as excipients for stable protein formulations
WO2025259840A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for scaled chromatography
WO2026025058A1 (en) 2024-07-25 2026-01-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aav viral particles retargeted to egfr-expressing cancer cells
WO2026025028A1 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making ultra-high concentrated protein formulations using lyophilization

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU639726B2 (en) 1989-09-08 1993-08-05 Duke University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US7060808B1 (en) 1995-06-07 2006-06-13 Imclone Systems Incorporated Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody
AUPP380498A0 (en) 1998-05-29 1998-06-25 Biomolecular Research Institute Limited Egf receptor agonists and antagonists
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US20070258987A1 (en) 2000-11-28 2007-11-08 Seattle Genetics, Inc. Recombinant Anti-Cd30 Antibodies and Uses Thereof
US20100056762A1 (en) * 2001-05-11 2010-03-04 Old Lloyd J Specific binding proteins and uses thereof
DE60234094D1 (de) 2001-05-11 2009-12-03 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Spezifische bindungsproteine und ihre verwendung
US7744882B2 (en) 2001-05-31 2010-06-29 Tumor Biology Investment Group, Inc. Soluble ErbB3 methods of detection and antibodies
JP2005508887A (ja) 2001-08-03 2005-04-07 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション Ｅｇｆ受容体の結晶構造に基づいたスクリーニング方法
CA2530172A1 (en) * 2003-06-27 2005-02-10 Abgenix, Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
US7767792B2 (en) 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
EP1718667B1 (en) 2004-02-23 2013-01-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
TW200539855A (en) 2004-03-15 2005-12-16 Wyeth Corp Calicheamicin conjugates
US20110142822A1 (en) * 2004-06-14 2011-06-16 Kussie Paul H Crystal of egfr extracellular domain and cetuximab fab fragment, and uses thereof
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
RS52176B (sr) 2006-06-02 2012-08-31 Regeneron Pharmaceuticals Inc. Antitela visokog afiniteta prema humanom il-6 receptoru
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
WO2008122039A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
JP2010528285A (ja) 2007-05-23 2010-08-19 ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド 免疫組織化学およびｉｎｓｉｔｕハイブリダーゼーションのためのポリマー担体
WO2009067242A2 (en) * 2007-11-20 2009-05-28 Imclone Llc Co-crystal of antibody 11f8 fab fragment and egfr extracellular domain and uses thereof
US20090269343A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-29 Duke University Dual Specific Immunotoxin for Brain Tumor Therapy
CN102083461B (zh) 2008-04-30 2014-09-17 伊缪诺金公司 有效的偶联物和亲水性连接体
ES2536882T3 (es) 2008-07-21 2015-05-29 Polytherics Limited Nuevos reactivos y procedimiento de conjugación de moléculas biológicas
NZ594665A (en) 2009-03-20 2013-08-30 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
BRPI1010035A2 (pt) 2009-06-02 2015-08-25 Regeneron Pharma Células deficientes em fucosilação
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
EP2464654B1 (en) 2009-08-10 2014-10-08 UCL Business PLC Thiol protecting group
WO2011130598A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2012005982A2 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Reporter for rna polymerase ii termination
ME03353B (me) * 2011-03-29 2019-10-20 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
EP2714685B1 (en) 2011-05-27 2016-10-19 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
US8815226B2 (en) 2011-06-10 2014-08-26 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates
US9526798B2 (en) 2011-10-14 2016-12-27 Seattle Genetics, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and targeted conjugates
EP2751076B1 (en) 2011-10-14 2018-04-25 MedImmune Limited Synthesis method and intermediates useful in the preparation of pyrrolobenzodiazepines
MX358757B (es) 2011-10-14 2018-09-03 Seattle Genetics Inc Pirrolobenzodiazepinas y conjugados dirigidos.
BR112014008888A2 (pt) 2011-10-14 2017-04-18 Seattle Genetics Inc pirrolobenzodiazepinas
WO2013068874A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Pfizer Inc. Antibody-drug conjugates
EA201490974A1 (ru) 2011-11-16 2014-09-30 Эмджен Инк. СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАССТРОЙСТВ, СВЯЗАННЫХ С ДЕЛЕЦИОННЫМ МУТАНТОМ vIII ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА
MX2014006739A (es) 2011-12-05 2015-06-05 Igenica Biotherapeutics Inc Conjugados de anticuerpo-farmaco y compuestos relacionados, composiciones , y metodos.
AU2014233385C1 (en) 2013-03-15 2019-09-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Biologically active molecules, conjugates thereof, and therapeutic uses
SI3030581T1 (sl) 2013-08-07 2021-07-30 Affimed Gmbh Mesta za vezavo na protitelo, ki so specifična za EGFRVIII
RS59077B1 (sr) 2014-03-11 2019-09-30 Regeneron Pharma Anti-egfrviii antitela i njihova primena

Also Published As

Publication number Publication date
MX373280B (es) 2020-04-16
EP3126388B1 (en) 2019-05-08
US10738124B2 (en) 2020-08-11
JP2017510559A (ja) 2017-04-13
CL2016002252A1 (es) 2017-06-30
SMT201900439T1 (it) 2019-09-09
US10047160B2 (en) 2018-08-14
AU2015229591B2 (en) 2020-10-22
KR20160131026A (ko) 2016-11-15
EP3126388A1 (en) 2017-02-08
US20150259423A1 (en) 2015-09-17
EA035809B1 (ru) 2020-08-14
SI3126388T1 (sl) 2019-08-30
US20180312594A1 (en) 2018-11-01
EA201691824A1 (ru) 2016-12-30
US11608380B2 (en) 2023-03-21
HRP20191335T1 (hr) 2019-10-18
CA2940685A1 (en) 2015-09-17
US9475875B2 (en) 2016-10-25
PL3126388T3 (pl) 2019-10-31
CN106459199A (zh) 2017-02-22
JP6632984B2 (ja) 2020-01-22
US20160304615A1 (en) 2016-10-20
PH12016501680A1 (en) 2016-10-24
CY1121870T1 (el) 2020-10-14
IL247407A0 (en) 2016-11-30
ES2736126T3 (es) 2019-12-26
NZ724229A (en) 2023-06-30
PH12016501680B1 (en) 2016-10-24
ZA201605894B (en) 2019-07-31
MY178160A (en) 2020-10-06
MA39313A1 (fr) 2018-01-31
BR112016020752B1 (pt) 2023-11-14
ME03525B (me) 2020-04-20
AU2015229591A1 (en) 2016-09-29
HUE045307T2 (hu) 2019-12-30
MX2016011619A (es) 2016-12-12
IL247407B (en) 2020-05-31
SG11201606979TA (en) 2016-09-29
MA39313B1 (fr) 2018-12-31
LT3126388T (lt) 2019-08-26
CA2940685C (en) 2023-10-24
KR102399005B1 (ko) 2022-05-17
CN106459199B (zh) 2021-01-01
US20210147557A1 (en) 2021-05-20
BR112016020752A2 (pt) 2018-01-23
DK3126388T3 (da) 2019-07-29
WO2015138460A1 (en) 2015-09-17
PT3126388T (pt) 2019-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11608380B2 (en) Anti-EGFRvIII antibodies and uses thereof
US10683354B2 (en) Antibody-drug conjugates comprising anti-prolactin receptor (PRLR) antibodies and methods of use thereof to kill PRLR-expressing cells
JP2025131732A (ja) 抗ｓｔｅａｐ２抗体、抗体－薬物複合体、およびｓｔｅａｐ２とｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらの使用
US9545451B2 (en) Anti-PRLR antibodies and methods for killing PRLR-expressing cells
CA3044534A1 (en) Methods of treating prlr positive breast cancer
JP2024527235A (ja) 抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物コンジュゲート及びその使用
HK1232899A1 (en) Anti-egfrviii antibodies and uses thereof
HK1232899B (en) Anti-egfrviii antibodies and uses thereof
EA040545B1 (ru) Анти-prlr антитела и их применение