JP2024527235A - 抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物コンジュゲート及びその使用 - Google Patents

Abstract

本開示は、テシリンにコンジュゲートされた、ＥＧＦＲのクラスＩＩＩバリアント（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に結合する抗体を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、及びそれらを使用する方法を提供する。ある特定の実施形態によると、本明細書で有用な抗体又はその抗原結合断片は、高い親和性でヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。本明細書で有用な抗体又はその抗原結合断片は、完全ヒト抗体であってもよい。本明細書に提供されるＡＤＣは、様々ながんの治療に有用である。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／２１３，４７８号、及び２０２１年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／２４２，９２９号の利益を主張するものであり、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

開示の分野
本開示は、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の欠失変異体、具体的には、クラスＩＩＩ欠失変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する、ヒト抗体、及びヒト抗体の抗原結合断片を含む、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（抗体又はその抗原結合断片は、テシリンにコンジュゲートされている）、及びそれらのＡＤＣを使用する治療方法に関する。

配列表
配列表の公的な写しは、ファイル名「１０９６６ＷＯ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」、作成日２０２２年６月２１日、及びサイズ約４９，１５２バイトのＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマット書面に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

背景
上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体又はＥＧＦＲの過剰発現及び／又は遺伝子増幅は、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、脳癌、及び様々な扁平上皮癌におけるものを含む複数のヒト腫瘍で報告されている（Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：６８９９－６９０３（非特許文献１）、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．１１：１８１－１８７（非特許文献２））。しかしながら、多くの正常組織もそれらの受容体を発現し、新生物標的とともに標的とされ得るため、抗新生物治療方法としてＥＧＦＲを標的とすることは、問題となっている。一方、ＥＧＦＲ遺伝子増幅を有する多くの膠芽腫は、遺伝子再構成を含有することが多いことが報告されている（Ｅｋｓｔｒａｎｄ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４３０９－４３１３（非特許文献３）、Ｗｏｎｇ Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２９６５－２９６９（非特許文献４））。１つの研究では、４４個中１７個の膠芽腫がＥＧＦＲコード配列に１つ以上の変化を有することが見出され、これらの症例の全てが増幅されたＥＧＦＲを含有したが、遺伝子増幅を伴わない２２個の症例のいずれも腫瘍特異的配列異常を示さなかった（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：１３８３－１３８７（非特許文献５））。同じ研究はまた、個々の腫瘍において複数のタイプのＥＧＦＲ変異が検出され得ることも示した。

ＥＧＦＲのクラスＩＩＩバリアント（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、膠芽腫において最も頻繁に見られるＥＧＦＲバリアントである（Ｂｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０：８０１７－８０２２（非特許文献６）、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：４２０７－４２１１（非特許文献７）、Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊａｐ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８１：７７３－７７９（非特許文献８）、Ｅｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４３０９－４３１３（非特許文献３）、Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３１４０－３１４８（非特許文献９）、及びＦｒｅｄｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：１３８３－１３８７（非特許文献５））。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２～７の欠失を特徴とし、コード領域の８０１個の塩基対のインフレーム欠失、すなわち、６～２７３個のアミノ酸残基の欠失（成熟ＥＧＦＲの残基数に基づく）、並びに融合接合部における新しいグリシンの生成をもたらす（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２２３１－２２３８（非特許文献１０）、Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０、上記）。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、リガンド非依存性で、弱いが構成的に活性なキナーゼ活性、並びに強化された腫瘍原性を有することが示されている（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：７７２７－７７３１（非特許文献１１）、及びＢａｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６：１２５１－１２５９（非特許文献１２））。神経膠腫に加えて、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、乳管癌及び乳管内癌（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３１４０－３１４８（非特許文献９））、非小細胞肺癌（Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｐａｌａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３２１７－３２２０（非特許文献１３））、卵巣癌（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：５５３６－５５３９（非特許文献１４））、前立腺がん（Ｏｌａｐａｄｅ－Ｏｌａｏｐａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８２：１８６－１９４（非特許文献１５））、並びに頭頸部の扁平上皮癌（Ｔｉｎｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７（１５）：５１９７－５２０４（非特許文献１６））において検出されている。対照的に、これら及び他の研究は、正常組織がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しないと報告している（Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｐａｌａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３、上記、Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５、上記、及びＷｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｎｅｕｒｏ Ｖｉｒｏｌ ４：１４８－１５８（非特許文献１７））。ＥＧＦＲｖＩＩＩの高度に腫瘍特異的な性質により、この分子を発現するがん及び腫瘍を治療するための特に有用な標的となる。

ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列が配列番号２７に示され、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸配列が配列番号２８に示される。ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体は、例えば、ＵＳ５，２１２，２９０（特許文献１）、ＵＳ７，７３６，６４４（特許文献２）、ＵＳ７，５８９，１８０（特許文献３）、及びＵＳ７，７６７，７９２（特許文献４）に記載されている。

本明細書に言及される全ての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

ＵＳ５，２１２，２９０ ＵＳ７，７３６，６４４ ＵＳ７，５８９，１８０ ＵＳ７，７６７，７９２

Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：６８９９－６９０３ Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．１１：１８１－１８７ Ｅｋｓｔｒａｎｄ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４３０９－４３１３ Ｗｏｎｇ Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２９６５－２９６９ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：１３８３－１３８７ Ｂｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０：８０１７－８０２２ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：４２０７－４２１１ Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊａｐ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８１：７７３－７７９ Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：３１４０－３１４８ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２２３１－２２３８ Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：７７２７－７７３１ Ｂａｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６：１２５１－１２５９ Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｐａｌａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３２１７－３２２０ Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：５５３６－５５３９ Ｏｌａｐａｄｅ－Ｏｌａｏｐａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８２：１８６－１９４ Ｔｉｎｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７（１５）：５１９７－５２０４ Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ Ｎｅｕｒｏ Ｖｉｒｏｌ ４：１４８－１５８

開示の概要
本開示は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体及びその抗原結合断片を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供し、抗体及びその抗原結合断片は、テシリンにコンジュゲートされている。テシリンは、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ペイロード／ウォーヘッド、ＳＧ３１９９を含有する（Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＡＣＳ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ７（１１）：９８３－９８７）。ＡＤＣは、特に、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍細胞を標的とするのに有用である。

本明細書に提供されるＡＤＣで有用な抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１抗体若しくはＩｇＧ４抗体）であり得るか、又は抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、若しくはｓｃＦｖ断片）のみを含んでいてもよく、かつ例えば、残存するエフェクター機能を排除するために、機能性に影響を与えるように改変されていてもよい（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５－１９３３）。

本明細書で有用な例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が、表１に列挙される。表１は、例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）、並びに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を記載する。表２は、例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の完全な重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を記載する。表３は、例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を記載する。

本開示は、配列番号２のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含むＨＣＶＲ内に、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。

本開示はまた、配列番号１０のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含むＬＣＶＲ内に、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。

本開示は、配列番号２のアミノ酸、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含むＨＣＶＲを含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。

本開示はまた、配列番号１０のアミノ酸、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含むＬＣＶＲを含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。

本開示はまた、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。

本開示はまた、配列番号４のアミノ酸、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。

本開示はまた、配列番号６のアミノ酸、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。

本開示はまた、配列番号８のアミノ酸、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。

本開示はまた、配列番号１２のアミノ酸、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。

本開示はまた、配列番号１４のアミノ酸、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。

本開示はまた、配列番号１６のアミノ酸、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。

本開示はまた、配列番号２のＨＣＶＲ及び配列番号１０のＬＣＶＲ内に含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＤＣを提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットは、それぞれ、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１６である。

ＨＣＶＲアミノ酸配列及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法及び手法は、当技術分野で周知されており、本明細書に開示の特定のＨＣＶＲアミノ酸配列及び／又はＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用することができる例示的な規則としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、及びＡｂＭ定義が挙げられる。一般的な条件では、Ｋａｂａｔ定義は配列変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ手法との間の折衷物である。例えば、Ｋａｂａｔ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）、及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。パブリックデータベースもまた、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。

本開示は、改変グリコシル化パターンを有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む、ＡＤＣを含む。いくつかの実施形態では、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変、又はオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠損している抗体が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照）。他の適用では、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を改変するために、ガラクトシル化の修飾を行うことができる。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、アグリコシル化されている。アグリコシル化抗体は、グリコシル化を防止するために好適な残基で点変異されている。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、コンジュゲーション効率を改善するために、例えば、Ｎ２９７（ＥＵインデックス番号付けによる）でアグリコシル化された重鎖を含む。特定の実施形態では、Ｎ２９７は、グルタミン（Ｑ）残基に変異されており、すなわち、抗体は、Ｎ２９７Ｑ変異を含む。

別の態様では、本発明は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンＡＤＣを含む複合体を提供し、ここで、抗体又はその抗原結合断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合されている。

別の態様では、本発明は、テシリン及びＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する組換えヒト抗体又はその断片を含むＡＤＣと、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンＡＤＣ及び第２の治療剤の組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンＡＤＣと有利に組み合わされる任意の薬剤である。本開示の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンＡＤＣを含む例示的な併用療法及び共製剤は、本明細書の別の箇所で開示されている。

更に別の態様では、本発明は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲート又はテシリンにコンジュゲートされた抗体の抗原結合部分を使用して、腫瘍細胞を殺傷するための、又は腫瘍細胞成長を阻害若しくは軽減するための治療方法を提供する。本開示の本態様による治療方法は、抗体－テシリンコンジュゲート又はテシリンにコンジュゲートされた抗体の抗原結合断片を含む治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。治療される障害は、ＡＤＣをＥＧＦＲｖＩＩＩにターゲティングすることによって改善、回復、阻害、又は予防される任意の疾患又は状態である。

他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態の検討から明らかになるものとなる。他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態の検討から明らかになるものとなる。

雌のＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下注射した０．５×１０^６個のＭＭＴ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の移植の６１日後の腫瘍体積及び体重についての、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンコンジュゲート又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－メイタンシノイドＤＭ１コンジュゲートの比較を示す。

詳細な説明
本開示を説明する前に、本発明が記載される特定の方法及び実験条件に限定されず、したがって、方法及び条件が異なり得ることが理解されるべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であり、制限することを意図しないことも理解されるべきである。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書にて使用される場合、「約」という用語は、特定の言及される数値に関して使用される場合、値が言及された値から１％以下まで変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現には、９９及び１０１、並びにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）が含まれる。

本開示を説明及び定義するために、本明細書では、任意の定量的比較、値、測定、又は他の表現に起因し得る固有の不確実性の程度を表すために、「実質的に」、「概して」、「およそ」などの相対的な用語の使用が利用されることに留意されたい。これらの用語はまた、本明細書では、定量的表現が、問題の主題の基本的な機能の変化をもたらすことなく、記載された参照から変動し得る程度を表すために利用される。

いくつかの例では、所与のパラメータ、特性、又は状態に関する「実質的に」という用語は、所与のパラメータ、特性、又は状態が、許容可能な製作公差内など、小さな程度の分散を伴って満たされることを、当業者が理解するであろう程度まで意味し、かつそれを含み得る。一例として、実質的に満たされた特定のパラメータ、特性、又は状態に応じて、パラメータ、特性、又は状態は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％満たされ得るか、又は完全に満たされ得る。

本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料が、本開示の実施又は試験で使用され得るが、例示的な方法及び材料をこれから記載する。本明細書にて言及される全ての特許、特許出願、及び非特許出版物は、参照によりそれらの全体が本発明に組み込まれる。

定義
本明細書で使用される場合、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」という用語は、特に指示されない限り、通常発現されるＥＧＦＲと共通するものとは対照的にＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的な任意の特徴を示す、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するヒトＥＧＦＲクラスＩＩＩバリアント又はその生物学的に活性な断片を指す。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、成熟ＥＧＦＲ（すなわち、シグナルペプチド（すなわち、残基１～２４）を有しない配列番号２７）のアミノ酸残基６～２７３を欠き、アミノ酸残基５と２７４との間の６位に新しいグリシン残基を含有する。

本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片への全ての言及は、非ヒト種由来であると明示的に指定されていない限り、ヒトバージョンのそれぞれのタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質断片を指すことが意図されている。したがって、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」という表現は、例えば、「マウスＥＧＦＲｖＩＩＩ」、「サルＥＧＦＲｖＩＩＩ」など、非ヒト種由来であると特定されていない限り、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩを意味する。

本明細書で使用される場合、「細胞表面発現ＥＧＦＲｖＩＩＩ」という表現は、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の少なくとも一部分が、細胞膜の細胞外側に露出し、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロ又はインビボで細胞の表面上に発現される、１つ以上のＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質又はその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面発現ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、通常ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を発現する細胞の表面上で発現されるＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を含むか、又はそれからなり得る。あるいは、「細胞表面発現ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、通常はその表面上にヒトＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しないがその表面上にＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するように人為的に操作されている細胞の表面上で発現されるＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を含むか、又はそれからなり得る。

「抗体」という用語には、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続した２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む、免疫グロブリン分子が包含される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶ_Ｈと省略される）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶ_Ｌと省略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存された領域が間に配された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へと更に細分することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本開示の異なる実施形態では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよいか、又は自然に若しくは人為的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。

本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などという用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変領域及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を伴う、タンパク質消化又は組換え遺伝子工学技術などの、あらゆる好適な標準的方法を使用する、完全抗体分子に由来してもよい。そのようなＤＮＡは既知であり、かつ／又は例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、若しくは合成することができる。ＤＮＡを配列決定し、化学的に又は分子生物学技法を使用することによって操作して、例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／若しくは定常ドメインを好適な構成に配置するか、又はコドンを導入する、システイン残基を作成する、アミノ酸を修飾、付加、若しくは欠失させるなどが可能である。

抗原結合断片の非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、又は拘束ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失した抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子もまた、本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という表現に包含される。

抗体の抗原結合断片は、典型的に、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意の大きさ又はアミノ酸組成であってもよく、一般的には、１つ以上のフレームワーク配列に隣接するか、又はインフレームである、少なくとも１つのＣＤＲを含むものとなる。Ｖ_Ｌドメインに会合するＶ_Ｈドメインを有する抗原結合断片において、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインは、任意の適切な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ又はＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌ二量体を含有してもよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインを含有してもよい。

ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含有していてもよい。本開示の抗体の抗原結合断片内で見出され得る可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的な例示的な構成としては、（ｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１、（ｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２、（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ３、（ｉｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２、（ｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｖｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｖｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｌ、（ｖｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１、（ｉｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２、（ｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ３、（ｘｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２、（ｘｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｘｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、及び（ｘｉｖ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌが挙げられる。上で列挙されたいずれかの例示的な構成を含む、可変ドメイン及び定常ドメインのいずれかの構成において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接的に連結されていてもよいし、完全若しくは部分ヒンジ又はリンカー領域により連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子における隣接する可変ドメイン及び／又は定常ドメイン間の可動性又は半可動性連鎖をもたらす、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個以上）のアミノ酸からなってもよい。更に、本開示の抗体の抗原結合断片は、互いとの、及び／又は１つ以上の単量体Ｖ_Ｈ若しくはＶ_Ｌドメインとの（例えば、ジスルフィド結合による）非共有会合で、上に列挙される可変ドメイン構成及び定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含み得る。

本明細書で有用な抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して機能し得る。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下での本開示の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上の結合抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解をもたらす、細胞媒介性反応を指す。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、当該技術分野で周知かつ利用可能であるアッセイを使用して測定され得る。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号及び同第５，８２１，３３７号、並びにＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６を参照されたい）。抗体の定常領域は、抗体が補体を固定し、細胞依存性細胞傷害性を媒介する能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいかどうかに基づいて選択され得る。

本開示のある特定の実施形態では、本明細書で使用される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本開示のヒト抗体は、例えばＣＤＲにおいて、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでの無作為若しくは部位特異的な突然変異誘発により、又はインビボでの体細胞変異により変異が導入される）。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むようには意図されていない。

本明細書で有用な抗体は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体であってもよい。「遺伝子組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子組換え手段によって、調製される、発現する、作成される、又は単離される全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞（以下で詳述する）中に形質導入された組換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組換え体から単離され抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリ（以下で詳述する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照されたい）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列から他のＤＮＡ配列へスプライスすることを含むあらゆるその他の手段によって調製される、発現する、作成される、若しくは単離される抗体などを含むように意図される。そのような遺伝子組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような遺伝子組換えヒト抗体はインビトロでの突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボでの体細胞の突然変異誘発）に供されるため、組換え抗体のＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_Ｈ配列及びＶ_Ｌ配列に由来し、関連する配列である一方で、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー中には自然に存在し得ない。

ヒト抗体は、ヒンジ不均一性に関連する２つの形態で存在し得る。一形態では、免疫グロブリン分子は、およそ１５０～１６０ｋＤａの安定した４つの鎖構築物を含み、二量体が、鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されている。第２の形態では、二量体が、鎖間ジスルフィド結合を介して結合されず、約７５～８０ｋＤａの分子は、共有結合した軽鎖及び重鎖から構成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後であっても、分離が非常に困難であった。

様々なインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造的差異によるが、これに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、第２の形態の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで著しく低減し得る（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２領域又はＣ_Ｈ３領域において１つ以上の変異を有する抗体を包含し、それら変異は、例えば、産生において、所望の抗体型の収率を改善するために望ましいものであり得る。

本明細書で有用な抗体は、単離抗体であってもよい。本明細書で使用される場合、「単離抗体」とは、その天然環境の少なくとも１つの構成要素から特定され、及び分離され、及び／又は回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの構成要素から、又は当該抗体が自然に存在するか、若しくは自然に産生される組織若しくは細胞から分離された、又は取り出された抗体は、本開示の目的で「単離抗体」である。単離抗体はまた、組換え細胞内の原位置の抗体を含む。単離抗体は、少なくとも１つの精製工程又は単離工程を受けた抗体である。ある特定の実施形態によると、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。

本明細書で有用な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域における１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含んでもよい。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認され得る。本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体及びその抗原結合断片を含むＡＤＣを含み、１つ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基、又は対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異している（そのような配列変化は、本明細書において集合的に「生殖系列変異」と称される）。当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列から開始して、１つ以上の個々の生殖系列変異又はそれらの組み合わせを含む、多くの抗体及び抗原結合断片を容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基の全てが、抗体が由来する元の生殖系列配列に見られる残基に再び変異する。他の実施形態では、ある特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内、若しくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見出される変異残基のみ、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３内に見出される変異残基のみが、元の生殖系列配列に再び変異される。他の実施形態では、フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基のうちの１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基に変異する。更に、本明細書で有用な抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異する一方で、元の生殖系列配列とは異なる、ある特定の他の残基が維持されるか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基に変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体及び抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合アフィニティの増大、アンタゴニスト又はアゴニストの生物学的特性の改善又は強化（場合により得る）、免疫原性の低減などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られた抗体及び抗原結合断片は、本開示に包含される。

本開示は、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む、本明細書で有用な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体も含む。例えば、本開示は、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、又は４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む。

「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原性決定基を指す。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合してもよく、異なる生物学的効果を有してもよい。エピトープは、立体構造的又は直線状のいずれであってもよい。立体構造的エピトープは、直線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基によって生成されるエピトープである。ある特定の状況では、エピトープは、抗原上の糖、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含み得る。

ポリペプチドに言及する場合、「実質的な同一性」又は「実質的に同一な」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列された場合、少なくとも９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能性特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、配列同一性のパーセント又は類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整されてもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに（７）含硫側鎖はシステイン及びメチオニンである、が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸及びアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示される、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する何らかの変化である。

ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも称され、典型的には配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の改変へ割り当てられた類似性の尺度を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、又は野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性又は配列同一性を判定するためのデフォルトパラメータとともに使用することができる、Ｇａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムである、デフォルトパラメータ又は推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複の領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。本開示の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを用いるコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。

対象は、哺乳動物、好ましくはヒトである。

Ｆｃバリアントを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体
本開示のある特定の実施形態によると、本明細書で有用な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を強化するか又は減少させる１つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む。例えば、本開示は、ＦｃドメインのＣ_Ｈ２又はＣ_Ｈ３領域に変異を含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含むＡＤＣを含み、変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲であるエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を高める。そのような変異によって、動物に投与されたときの抗体の血清半減期が延長され得る。このようなＦｃ改変の非限定的な例としては例えば、２５０位（例えば、Ｅ又はＱ）、２５０位及び４２８位（例えば、Ｌ又はＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ又はＴ）、２５４位（例えば、Ｓ又はＴ）、及び２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／Ｄ、又はＴ）における改変、又は４２８位及び／若しくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑ又はＫ）及び／若しくは４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、又はＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、又はＮ４３４Ｙ］）における改変、あるいは２５０位及び／若しくは４２８位における改変、あるいは３０７位若しくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４位における改変が含まれる。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変、２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の改変、２５０Ｑ及び４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）、並びに３０７及び／又は３０８の改変（例えば、３０８Ｆ及び／又は３０８Ｐ）を含む。更に別の実施形態では、改変は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）及び／又は２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）の改変を含む。

例えば、本開示は、以下からなる群から選択される変異の１つ以上の対又は群を含むＦｃドメインを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含むＡＤＣを含む：２５０Ｑ及び２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ２４８Ｌ）、２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）、４２８Ｌ及び４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ）、２５７Ｉ及び３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７Ｉ及びＱ３１１Ｉ）、２５７Ｉ及び４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７Ｉ及びＮ４３４Ｈ）、３７６Ｖ及び４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６Ｖ及びＮ４３４Ｈ）、３０７Ａ、３８０Ａ及び４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａ）、並びに４３３Ｋ及び４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）。前述のＦｃドメイン変異、及び本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異のあらゆる可能な組み合わせが、本開示の範囲内にあることが想定される。

本開示はまた、キメラ重鎖定常（Ｃ_Ｈ）領域を有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含むＡＤＣを含み、キメラＣ_Ｈ領域は、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプのＣ_Ｈ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本明細書で有用な抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、又はヒトＩｇＧ４分子に由来するＣ_Ｈ３ドメインの一部又は全部と組み合わせて、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、又はヒトＩｇＧ４分子に由来するＣ_Ｈ２ドメインの一部又は全部を含むキメラＣ_Ｈ領域を含み得る。ある特定の実施形態によると、本明細書で有用な抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣ_Ｈ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けによる位置２２８～２３６のアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けによる位置２１６～２２７のアミノ酸残基）を含んでもよい。特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１上部ヒンジ又はヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基及びヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基を含む。本明細書において説明されるキメラＣ_Ｈ領域を含む抗体は、特定の実施形態では、抗体の治療特性又は薬物動態学的特性に負に影響を与えることなく改変Ｆｃエフェクター機能を呈する。（例えば、２０１３年２月１日出願の米国仮出願第６１／７５９，５７８号を参照されたく、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

本発明の一実施形態では、Ｆｃは、変異Ｓ１０８Ｐを有するＩｇＧ４である。

抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
テシリンにコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、本明細書に提供される。

テシリンは、以下の構造を有する。

テシリンは、ＳＧ３２４９とも称される。

以下の構造を有する化合物が本明細書に提供され、

式中、Ａｂは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含み、－Ｓ－は、当該抗体又はその抗原結合断片のシステイン残基でのスルフィド結合である。特定の実施形態では、Ａｂは、配列番号２を含むＨＣＶＲアミノ酸配列内に３つの重鎖ＣＤＲ、及び配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列内に３つの軽鎖ＣＤＲを含む。特定の実施形態では、Ａｂは、配列番号４のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号８のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号１２のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ａｂは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＨＣＶＲアミノ酸配列、及び配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ａｂは、配列番号２のＨＣＶＲアミノ酸配列、及び／又は配列番号１０のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。

以下の構造を有する化合物も本明細書に提供され、

式中、Ａｂは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含み、－Ｓ－は、当該抗体又はその抗原結合断片のシステイン残基でのスルフィド結合である。特定の実施形態では、Ａｂは、完全抗体である。特定の実施形態では、Ａｂは、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ａｂは、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ａｂは、重鎖及び軽鎖を含み、軽鎖は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、Ａｂは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、Ａｂは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＤＡＲ（薬物－抗体比）は、約１～約４である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは、約２～約４である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは、約２～約３である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは、約３～約４である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは、約２である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは、約３である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは、約４である。

テシリンの合成は、例えば、Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．（ＡＣＳ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１６，７（１１）：９８３－９８７）に記載される手順を使用して実施され得る。テシリンは、ピロロベンゾジアゼピンウォーヘッド／ペイロード成分ＳＧ３１９９を含み、これは、以下の構造を有する。

エピトープマッピング及びその関連技術
本明細書で有用な抗体が結合するエピトープは、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の３個以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなってもよい。あるいは、エピトープは、ＥＧＦＲｖＩＩＩの複数の非連続的アミノ酸（又はアミノ酸配列）からなってもよい。いくつかの実施形態では、エピトープは、ＥＧＦＲｖＩＩＩのリガンド結合ドメイン上又はその付近に位置する。他の実施形態では、エピトープは、ＥＧＦＲｖＩＩＩのリガンド結合ドメインの外側に位置し、例えば、抗体がそのようなエピトープに結合したときにＥＧＦＲｖＩＩＩへのリガンド結合に干渉しない、ＥＧＦＲｖＩＩＩ表面上の位置にある。

ある特定の実施形態によると、本明細書で有用な抗体及びその抗原結合断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する（かつＥＧＦＲに結合しない）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含み、抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合ペプチド（例えば、配列番号２３）を認識する。そのような抗体は、本明細書では、「接合ペプチドバインダー」、「ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合抗体」などと称され得る。他の実施形態によると、本明細書で有用な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し（かつＥＧＦＲに結合せず）、抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合ペプチドを認識しない（例えば、配列番号２３の接合ペプチドを認識しない、かつ／又は配列番号２４のペプチドを認識しない）。そのような抗体は、本明細書では、「立体構造的バインダー」、「ＥＧＦＲｖＩＩＩ立体構造的エピトープバインダー」などと称され得る。

本明細書で有用な抗体及びその抗原結合断片は、ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ ＥＣＤ（Ｌ２５－Ａ３８０）．ｍｍＨ（配列番号２９）内の１つ以上の残基に結合するか、又はそれらと相互作用する、例えば、配列番号２５又は配列番号２９のアミノ酸６４～８２ ＧＰＣＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬ（配列番号２６）に対応する１つ以上の残基に結合するか、又はそれらと相互作用する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む。

当業者にとって既知の様々な技法を使用して、抗体又はその抗原結合断片が、ポリペプチド又はタンパク質内の「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載されているような常套的な交差遮断アッセイ、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－４６３）、及びペプチド切断解析などが挙げられる。更に、抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出、及び化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。抗体と相互作用するポリペプチド内のアミノ酸の特定に使用できる別の方法は、質量分析法により検出される水素／重水素交換である。総称的な用語としては、水素／重水素交換は、対象タンパク質を重水素標識すること、次いで抗体をこの重水素標識タンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体によって保護された残基（重水素標識のまま残る）を除く全ての残基で、水素－重水素交換を生じさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析解析にかけ、それと抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。

本開示は、本明細書に記載される特定の例示的な抗体（例えば、本明細書の表１に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含むＡＤＣを更に含む。同様に、本開示はまた、本明細書に記載される特定の例示的な抗体（例えば、本明細書の表１に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと、ＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合に関して競合する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含むＡＤＣも含む。

当技術分野で既知であり、本明細書で例証される定型的な方法を使用することによって、抗体が参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と同じエピトープに結合するか、又は参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と結合について競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、被験抗体が、本開示の参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と同じエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体を、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質に結合させる。次に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子に結合する被験抗体の能力が評価される。参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体との飽和結合後に被験抗体がＥＧＦＲｖＩＩＩに結合することができた場合、当該被験抗体は、参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方で、参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体との飽和結合後に被験抗体がＥＧＦＲｖＩＩＩ分子に結合することができなかった場合、被験抗体は、本開示の参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。次いで、追加の定型的な実験（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を実施して、観察された被験抗体の結合の欠落が実際に、参照抗体と同じエピトープに結合することに起因するのか、又は立体遮断（又は別の現象）が、観察された結合の欠落の原因であるのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、又は当分野で利用可能な任意の他の定量的又は定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。本開示の特定の実施形態によると、競合結合アッセイにおいて測定したとき、ある抗体の、例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、又は１００倍の余剰量が、他の抗体の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％、又は更には９９％まで阻害する場合、２つの抗体は同じ（又は重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５－１５０２を参照されたい）。別の方法として、１個の抗体の結合を減少又は排除する抗原中の本質的に全てのアミノ酸突然変異が、他方の抗体の結合を減少又は排除する場合、２個の抗体は同一エピトープに結合するとみなされる。１個の抗体の結合を減少又は排除するアミノ酸突然変異のサブセットのみが、他方の抗体の結合を減少又は排除する場合、２個の抗体は「重複エピトープ」を有するとみなされる。

抗体が参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と結合について競合する（又は結合について交差競合する）かを決定するために、以下の２つの方向性で上述の結合方法が実施される：第１の方針では、参照抗体は、飽和条件下でＥＧＦＲｖＩＩＩ分子に結合され、その後、ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子への被験抗体の結合が評価される。第２の方針では、被験抗体が、飽和条件下でＥＧＦＲｖＩＩＩ分子に結合され、その後、ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子への参照抗体の結合が評価される。両方の方針で、第１の（飽和）抗体のみがＥＧＦＲｖＩＩＩ分子に結合することができた場合、被験抗体及び参照抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合について競合するものと結論付けられる。当業者によって理解されるように、参照抗体への結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しないことがあるが、重複したエピトープ又は隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断することがある。

抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣの生物学的特徴
本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンＡＤＣを含む。いくつかの態様では、ＡＤＣは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含み、（ｉ）配列番号２３の接合ペプチドにも、（ｉｉ）配列番号２４のペプチドにも結合しない。いくつかの態様では、ＡＤＣは、３７℃の表面プラズモン共鳴アッセイによって測定された場合、約５００ｎＭの、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ単量体についての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの態様では、ＡＤＣは、３７℃の表面プラズモン共鳴アッセイによって測定された場合、約１０ｎＭ以下の、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ二量体についての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの態様では、ＡＤＣは、表面プラズモン共鳴アッセイによって検出可能なレベルでＥＧＦＲ二量体に結合しない、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片を含む。

いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンＡＤＣは、以下の特徴のうちの１つ以上を示す：（ａ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞においてインビボでの生存率の低減を示す、（ｂ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞と共培養された非ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に対するインビボでのバイスタンダー細胞傷害性を示す、（ｃ）ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する頭蓋内多形性膠芽腫を有するマウスにおいて、生存の延長を示す、（ｄ）治療関連体重減少の非存在下で、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍を有するマウスにおいて抗腫瘍効果を示す、（ｅ）患者由来の多形性膠芽腫を有するマウスにおいて、腫瘍退縮を示す、（ｆ）ＭＭＡＦにコンジュゲートされた比較対照抗体と比較して、より低い投与量でより大きな殺腫瘍性を示す、及び／又は（ｇ）腫瘍担持マウスにおいて、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－メイタンシノイドＡＤＣよりも大きな抗腫瘍効力を示す。

ヒト抗体の調製
本明細書で有用な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片は、完全ヒト抗体であり得る。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体の生成方法は、当技術分野に既知である。ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本開示の状況で任意のそのような既知の方法を使用することができる。

例えばＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術、又は完全ヒトモノクローナル抗体を生成するための任意の他の類似した既知の方法を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。以下の実験セクションと同様に、抗体を、親和性、リガンド遮断活性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付け、選択する。必要であれば、マウス定常領域は、所望のヒト定常領域、例えば野生型又は改変型のＩｇＧ１又はＩｇＧ４に置き換えられて、完全ヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を生成する。選択される定常領域が、特定の用途に応じて変わり得る一方で、高親和性の抗原結合性及び標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。ある特定の例において、完全ヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離される。

本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する本発明の抗体又はその抗原結合断片を含むＡＤＣを作製するための方法を含み、方法は、ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で、培養培地中で、当該抗体又は断片のＨＣＶＲを含む免疫グロブリン及び当該抗体又は断片のＬＣＶＲを含む免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することを含む。次いで、そのように産生された抗体又は断片の免疫グロブリンのうちの１つ以上は、例えば、免疫グロブリン鎖を（例えば、ジチオスレイトールの存在下で）還元し、当該テシリンを還元免疫グロブリン鎖とインキュベートすることによって、テシリンにコンジュゲートされ得る。そのような抗体又は断片が発現され得る宿主細胞は、真核又は原核宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞である。かかる宿主細胞は、当該技術分野で周知であり、多くは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である。これらの宿主細胞としては、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ－２９３細胞及び多数の他の細胞株が挙げられる。哺乳類宿主細胞には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ及びハムスター細胞が挙げられる。使用され得る他の細胞株は、昆虫細胞株（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）又はトリコプラスシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ））、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞及び真菌細胞である。真菌細胞としては、例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピキア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピキア・コクラマエ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピキア・メンブラナエファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピキア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピキア・オプンティアエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピキア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピキア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピキア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピキア・ピジュペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピキア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア属の種、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス属の種、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の種、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナトゥム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）、及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）を含む、酵母並びに糸状真菌細胞が挙げられる。そのような方法によって産生されたＡＤＣは、本発明の一部を形成する。

生物学的同等物
本明細書で有用な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体及び抗体断片は、記載される抗体のアミノ酸配列とは異なるがヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有する、タンパク質を包含する。このようなバリアント抗体及び抗体断片は、親配列と比較して１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含むが、記載された抗体の生物学的活性と本質的に同等である生物学的活性を呈する。同様に、そのような抗体の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示される配列と比較してヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、本開示の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又は抗体断片と本質的に生物学的に同等である抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又は抗体断片をコードする配列を包含する。そのようなバリアントアミノ酸配列及びＤＮＡ配列の例は、上記に検討される。

２つの抗原結合タンパク質又は抗体が、薬学的同等物又は薬学的代替物であり、類似した実験条件下で、単回投与又は複数回投与のいずれかで同モル投与量で投与されたときに、その吸収の速度及び範囲が有意な差を示さない場合、それら２つの抗原結合タンパク質又は抗体は、生物学的に同等であるとみなされる。いくつかの抗体で、吸収の範囲は同等であるが、吸収の速度は同等ではなく、しかし吸収速度における当該差異が意図的であり、ラベリングに反映されており、例えば長期的使用での有効身体薬物濃度の達成に必須ではなく、試験された特定の医薬品にとって医学的に重要ではないとみなされるためにそれら抗体が生物学的に同等であるとみなされ得る場合、それら抗体は同等物、又は薬学的代替物とみなされる。

一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度、及び効力において臨床的に意義のある差異が無ければ、生物学的に同等である。

一実施形態では、参照生成物と生物学的製品との間で１回又は複数回の切り替えを行わない持続的療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化を含めた有害作用のリスクの上昇が予想されないか、又は有効性が減退することなく、患者がそのような切り替えを行うことができる場合に、２つの抗原結合タンパク質は生物学的に同等である。

一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、１つ以上の使用条件について１つ以上の共通の機序によって、このような機序の既知の程度まで作用する場合に、生物学的に同等である。

生物学的に同等であることは、インビボ及びインビトロの方法により実証され得る。生物学的同等性の測定方法としては例えば、（ａ）時間の関数として血液、血漿、血清又は他の生体液中で抗体又はその代謝物の濃度が測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ検査、（ｂ）ヒトのインビボ生体利用効率データと相関し、このデータを合理的に予測するインビトロ検査、（ｃ）抗体（又はその標的）の適切な急性薬理学的作用が時間の関数として計測される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ検査、及び（ｄ）抗体の安全性、有効性、又は生体利用効率若しくは生物学的同等性を立証する、適切に管理された臨床試験が挙げられる。

本発明で有用な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の生物学的に同等なバリアントは、例えば、残基若しくは配列の様々な置換を行うこと、又は生物学的活性に必要とされない末端若しくは内部の残基若しくは配列を欠失させることによって構築されてもよい。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失又は他のアミノ酸で置換することができる。他の状況では、生物学的に同等の抗体は、抗体のグリコシル化特徴を改変するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除又は除去する変異を含む、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体バリアントを含んでもよい。

種選択性及び種交差反応性
ある特定の実施形態によると、本開示は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するが、他の種由来のＥＧＦＲｖＩＩＩには結合しない、本明細書で有用な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を提供する。本開示はまた、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ及び１つ以上の非ヒト種に由来するＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体も提供する。例えば、本明細書で有用な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合してもよく、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル又はチンパンジーのＥＧＦＲｖＩＩＩのうちの１つ以上にも結合してもよいか、又は結合しなくてもよい。ある特定の例示的な実施形態によると、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ及びカニクイザル（例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が提供される。本開示の他の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩには結合するが、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩには結合しないか、又は弱くしか結合しない。

治療用製剤及び投与
本開示は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲート、すなわち、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンＡＤＣを含む医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、及び輸送、送達、忍容性などの改善をもたらす他の薬剤とともに製剤化される。数多くの適切な製剤が、全ての薬剤師に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見出され得る。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞を含有する脂質（カチオン性又はアニオン性）（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水乳剤、乳剤カルボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、並びにカルボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。

患者に投与されるＡＤＣの用量は、患者の年齢及び大きさ、標的の疾患、状態、投与経路などに応じて変化し得る。好ましい用量は、典型的には体重又は体表面積に従い計算される。成人患者では、本開示の抗体を、約０．００１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．００２～約７、約０．００３～約５、又は約０．００５～約３ｍｇ／ｋｇ体重で、通常は単回投与で静脈内投与することが有益であり得る。例示的な投与量としては、１ｕｇ／ｋｇ、３．５ｕｇ／ｋｇ、７ｕｇ／ｋｇ、及び１０ｕｇ／ｋｇが挙げられる。状態の重症度に応じて、治療の頻度及び期間を調整できる。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体コンジュゲートを投与するための有効な投与量及びスケジュールは、経験的に決定され得るが、例えば、患者の進行は、定期的な評価によってモニタリングされ得、それに応じて用量が調整される。更に投与量の種間スケーリングは、当分野に周知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。

例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシスなど、様々な送達系が既知であり、本開示の医薬組成物を投与するために使用され得る（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照されたい）。導入方法としては限定されないが、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路及び経口経路が挙げられる。組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入若しくはボーラス注射によって、上皮若しくは粘膜皮膚内層（ｍｕｃｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｉｎｉｎｇ）（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、かつ他の生物活性剤と一緒に投与することができる。投与は全身性又は局所性であってもよい。したがって、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンＡＤＣを対象の身体内に投与するための方法が本明細書に提供され、方法は、ＡＤＣを対象の身体内に注射することを含む。いくつかの態様では、ＡＤＣは、対象の体内に皮下注射される。いくつかの態様では、ＡＤＣは、対象の体内に静脈内注射される。いくつかの態様では、ＡＤＣは、対象の体内に筋肉内注射される。

本開示の医薬組成物は、容器内で提供され得る。本開示の医薬組成物は、注射用デバイスで提供され得る。医薬組成物は、標準的な針及びシリンジを用いて皮下送達されてもよく、又は静脈内送達されてもよい。更に皮下送達に関しては、ペン型送達デバイスが、本開示の医薬組成物の送達に容易に応用される。そのようなペン型送達デバイスは、再利用可能であるか、又は使い捨てであり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、概して、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内部の医薬組成物の全てが投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは、容易に廃棄することができ、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換され得る。次に、ペン型送達デバイスは再利用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、医薬組成物がデバイス内部のリザーバ内に保持された事前に充填された状態で販売される。いったんリザーバの医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。

多数の再利用可能なペン型及び自動注射装置送達デバイスは、本開示の医薬組成物の皮下送達において用途を見出す。例としては限定されないが、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられる。本開示の医薬組成物の皮下送達での用途を有するディスポーザブルペン送達デバイスの例としては、いくつか例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、及びＨＵＭＩＲＡ（商標）Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の状況では、医薬組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプを使用してもよい（上記のＬａｎｇｅｒ、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、多量体性材料を使用することができる。Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。更に別の実施形態では、制御放出系を組成物の標的の近傍に配置することができる。したがって全身用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、上記、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照されたい）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３によるレビューにおいて検討されている。

注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、及び筋肉内注射、点滴などのための剤形を含み得る。これらの注射用調製物は、公知の方法によって調製されてもよい。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射に従来使用される無菌水性媒体又は油性媒体に、上述される抗体又はその塩を溶解、懸濁、又は乳化させることによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースを含有する等張液、及び他の助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが採用され、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用され得る。このようにして調製した注射液は、好ましくは、適切なアンプル中に充填される。

有利に、上述の経口又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量を適合させるのに適した単位用量で剤形に調製される。単位用量におけるこのような剤形には、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル剤）、坐剤などが含まれる。含有される前述の抗体の量は、一般的に単位用量で剤形当たり約５～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、上記の抗体は約５～約１００ｍｇに含有されることが好ましく、及びその他の剤形に対しては約１０～約２５０ｍｇに含有されることが好ましい。

したがって、本発明は、本発明のＡＤＣを対象（例えば、対象は、がんに罹患している）に投与するための方法を含み、方法は、例えば、注射又は本明細書で考察される方法のいずれかによって、ＡＤＣを対象の体内に導入する工程を含む。

本発明はまた、容器（例えば、ガラス若しくはプラスチックバイアル、又は静脈内注入バッグなどのバッグ）、あるいは本発明のＡＤＣを含むそのようなデバイス、例えば、バレル、プランジャー、及び針を含むシリンジのいずれかも含む。

抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体コンジュゲートの治療的使用
本開示は、その必要のある対象に、テシリンにコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（例えば、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ又はＣＤＲ配列のいずれかを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はＡＤＣ）を含む抗体－薬物コンジュゲートを含む治療用組成物を投与することを含む方法を含む。治療用組成物は、テシリンにコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片のいずれかと、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含むことができる。

本開示のＡＤＣは、とりわけ、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現若しくは活性、又は過剰発現に関連する、又はそれによって媒介される、あるいはＥＧＦＲｖＩＩＩとＥＧＦＲリガンドとの間の相互作用を遮断すること、又は別の方法でＥＧＦＲｖＩＩＩの活性及び／若しくはシグナル伝達を阻害すること、並びに／又は受容体内在化を促進すること、並びに／又は細胞表面受容体の数を減少させることによって治療可能な、任意の疾患若しくは障害の治療、予防、及び／又は改善に有用である。例えば、本開示のＡＤＣは、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する、及び／又はリガンド媒介性シグナル伝達に応答する腫瘍の治療に有用である。本開示のＡＤＣはまた、脳及び髄膜、中咽頭、肺及び気管支樹、消化管、男性及び女性生殖器、筋肉、骨、皮膚及び付属器官、結合組織、脾臓、免疫系、血液形成細胞及び骨髄、肝臓及び尿路、並びに眼などの特殊感覚器官において生じる原発性及び／又は転移性の腫瘍を治療するために使用され得る。ある特定の実施形態では、本開示のＡＤＣは、以下のがんのうちの１つ以上を治療するために使用される：膠芽腫、腎細胞癌、膵癌、頭頸部がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん（例えば、ＭＥＴ増幅を有する胃がん）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、乳がん（管若しくは管内）、又は黒色腫。

本明細書に記載される治療方法の背景において、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートは、単剤療法として（すなわち、唯一の治療剤として）、又は１つ以上の追加の治療剤（その例は、本明細書の別の箇所に記載されている）と組み合わせて投与されてもよい。

特定の実施形態によると、本開示は、患者においてがんを治療する、腫瘍成長を低減する、及び／又は腫瘍退縮を引き起こすための方法を提供する。本開示の本態様による方法は、第１の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を単独で、又は第２の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体若しくはＡＤＣと組み合わせて、患者に投与することを含む。第１のＡＤＣは、典型的には、抗体又は抗体の抗原結合断片及びテシリンを含み、第１のＡＤＣの抗体又は抗原結合断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するが、配列番号２３の接合ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドにも配列番号２４のペプチドにも結合しない（すなわち、第１のＡＤＣは、立体構造的ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合抗体を含む）。第２の抗体又はＡＤＣが投与される実施形態では、第２の抗体又はＡＤＣは、典型的には、抗体又は抗体の抗原結合断片及び細胞毒素を含み、第２の抗体又は抗原結合断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、配列番号２３の接合ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド及び／又は配列番号２４のペプチドにも結合する（すなわち、第２の抗体又はＡＤＣは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合ペプチド結合抗体を含む）。２つの別個の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣが本開示の本態様の文脈で使用される場合、両方のＡＤＣは、ある特定の実施形態では、同じ細胞傷害剤を含んでもよく、すなわち、両方が、テシリン、又は同じクラスの細胞傷害剤を含んでもよい。２つの別個の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣが使用される他の実施形態では、各ＡＤＣは、異なる細胞傷害剤及び／又は異なるクラスの細胞傷害剤を含んでもよい。ある特定の実施形態によると、第１のＡＤＣの抗体又は抗原結合断片（すなわち、立体構造的ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合抗体）は、配列番号４、６、８、１２、１４、及び１６を含む重鎖及び軽鎖相補性決定領域、又は配列番号２を含む重鎖可変領域及び配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含む。

併用療法及び製剤
本開示は、本明細書に記載される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートのいずれかを、１つ以上の追加の治療活性成分と組み合わせて含む組成物及び治療用製剤、並びにその必要のある対象にそのような組み合わせを投与することを含む治療方法を含む。

本明細書で有用な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートは、以下からなる群から選択される１つ以上の追加の治療活性成分と共製剤化され、かつ／又は組み合わせて投与され得る：ＰＲＬＲアンタゴニスト（例えば、抗ＰＲＬＲ抗体又はＰＲＬＲの小分子阻害剤）、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブ若しくはパニツムマブ］、又はＥＧＦＲの小分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブ若しくはエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４などの別のＥＧＦＲファミリーメンバーのアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ２［例えば、トラスツズマブ又はＴ－ＤＭ１｛ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）｝］、抗ＥｒｂＢ３若しくは抗ＥｒｂＢ４抗体、又はＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、若しくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ｃＭＥＴアンタゴニスト（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ－ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０）、ＰＤＧＦＲ－α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－α抗体）、ＰＤＧＦＲ－β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－β抗体又は小分子キナーゼ阻害剤、例えば、イマチニブメシル酸塩又はスニチニブリンゴ酸塩）、ＰＤＧＦリガンド阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、又は－Ｄ抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡなど）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ、例えば、ＵＳ７，０８７，４１１を参照されたい（本明細書では、「ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質」とも称される）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、又はパゾパニブ））、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＲＥＧＮ４２１などのＵＳ２００９／０１４２３５４に開示されている抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、Ｈ１Ｈ６８５ＰなどのＵＳ２０１１／００２７２８６に開示されている抗Ａｎｇ２抗体）、ＦＯＬＨ１アンタゴニスト（例えば、抗ＦＯＬＨ１抗体）、ＳＴＥＡＰ１又はＳＴＥＡＰ２アンタゴニスト（例えば、抗ＳＴＥＡＰ１抗体又は抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２アンタゴニスト（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮアンタゴニスト（例えば、抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９アンタゴニスト（例えば、抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキンアンタゴニスト（例えば、抗ウロプラキン［例えば、抗ＵＰＫ３Ａ］抗体）、ＭＵＣ１６アンタゴニスト（例えば、抗ＭＵＣ１６抗体）、Ｔｎ抗原アンタゴニスト（例えば、抗Ｔｎ抗体）、ＣＬＥＣ１２Ａアンタゴニスト（例えば、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体）、ＴＮＦＲＳＦ１７アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦＲＳＦ１７抗体）、ＬＧＲ５アンタゴニスト（例えば、抗ＬＧＲ５抗体）、一価ＣＤ２０アンタゴニスト（例えば、リツキシマブなどの一価抗ＣＤ２０抗体）、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＤ３抗体、ＣＴＬＡ－４抗体など。本開示の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートと組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤としては、例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、及びサイトカイン阻害剤が挙げられ、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８などのサイトカイン、又はそれらのそれぞれの受容体に結合する低分子サイトカイン阻害剤及び抗体が挙げられる。

本開示は、本明細書に記載される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のいずれかを１つ以上の化学療法剤と組み合わせて含む、組成物及び治療用製剤を含む。化学療法剤の例示としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン及びメチラメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補液（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）、Ａｖｅｎｔｉｓ Ａｎｔｏｎｙ Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及び上述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体が挙げられる。この定義には、腫瘍に対するホルモンの作用を制御する、又は阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）をはじめとする抗エストロゲン；例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；並びに上述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体が挙げられる。

本開示の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体コンジュゲートはまた、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、ステロイド、酸素、抗酸化剤、ＣＯＸ阻害剤、心臓保護剤、金属キレート剤、ＩＦＮ－ガンマ、及び／又はＮＳＡＩＤと組み合わせて投与及び／又は共製剤化されてもよい。

追加の治療活性成分、例えば、上記に列記される薬剤又はそれらの誘導体のいずれかは、本開示の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートの投与の直前に、それと同時に、又はその直後に投与されてもよい（本開示の目的で、そのような投与レジメンは、追加の治療活性成分「と組み合わせた」抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートの投与とみなされる）。本開示は、本開示の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートが、本明細書の別の箇所に記載されている追加の治療活性成分のうちの１つ以上と共製剤化される医薬組成物を含む。

投与レジメン
本開示の特定の実施形態によると、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲート（又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲート及び本明細書に言及される追加の治療活性剤のいずれかの組み合わせを含む医薬組成物）の複数回用量が、規定の時間経過にわたって対象に投与されてもよい。本開示の本態様による方法は、複数回用量の本開示の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートを対象に逐次的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「逐次的に投与すること」とは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の各用量が、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、時間、日、週、又は月）をあけた異なる日に、対象に投与されることを意味する。本開示は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートの単回初回用量、続いて、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートの１回以上の二次用量、及び任意選択的に続いて、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートの１回以上の三次用量を患者に逐次的に投与することを含む方法を含む。

「初回用量」、「二次用量」、及び「三次用量」という用語は、本開示の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートの投与の時間的な順序を指す。したがって、「初回用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量である（また「ベースライン用量」とも称される）、「二次用量」は初回用量の後に投与される用量であり、「三次用量」は二次用量の後に投与される用量である。初回用量、二次用量、及び三次用量は全て、同じ量の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートを含有し得るが、概して、投与頻度に関しては互いに異なり得る。しかしながら、ある特定の実施形態では、初回用量、二次用量、及び／又は三次用量に含有される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートの量は、治療経過の間に互いに異なる（例えば、適宜上方又は下方に調整される）。ある特定の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、又は５）の用量が、治療レジメンの開始時に「負荷用量」として投与され、その後に続く用量は、より少ない頻度ベースで投与される（例えば、「維持用量」）。

本開示の特定の例示的な実施形態では、各二次用量及び／又は三次用量は、直前の用量の１～２６週間後（例えば、１週間後、１週間半後、２週間後、２週間半後、３週間後、３週間半後、４週間後、４週間半後、５週間後、５週間半後、６週間後、６週間半後、７週間後、７週間半後、８週間後、８週間半後、９週間後、９週間半後、１０週間後、１０週間半後、１１週間後、１１週間半後、１２週間後、１２週間半後、１３週間後、１３週間半後、１４週間後、１４週間半後、１５週間後、１５週間半後、１６週間後、１６週間半後、１７週間後、１７週間半後、１８週間後、１８週間半後、１９週間後、１９週間半後、２０週間後、２０週間半後、２１週間後、２１週間半後、２２週間後、２２週間半後、２３週間後、２３週間半後、２４週間後、２４週間半後、２５週間後、２５週間半後、２６週間後、２６週間半後、又はそれ以上）に投与される。本明細書で使用される場合、「直前の用量」という語句は、複数回の投与の順序において、介在する用量なくその順序のすぐ次の用量の投与の前に患者に投与される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートの用量を意味する。

本開示の本態様による方法は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンコンジュゲートの任意の数の二次用量及び／又は三次用量を患者に投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、患者に単回の二次用量のみが投与される。他の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上）の二次用量を患者に投与する。同様に、ある特定の実施形態では、患者に単回の三次用量のみが投与される。他の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上）の三次用量を患者に投与する。投与レジメンは、特定の対象の生涯にわたって、又はそのような治療がもはや治療上必要とされなくなるか、又は有益でなくなるまで、無期限に行われてもよい。

複数の二次用量を含む実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各二次用量は、直前の用量の１～２週間後又は１～２か月後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各三次用量は、直前の用量の２～１２週間後に患者に投与されてもよい。本開示のある特定の実施形態では、二次及び／又は三次用量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの過程にわたって変化し得る。投与の頻度は、臨床検査後の個々の患者のニーズに応じて、医師による治療過程の間に、調節され得る。

本開示は、２～６回の負荷用量が、第１の頻度で患者に投与され（例えば、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、１か月に１回、２か月に１回など）、その後、より少ない頻度ベースで患者に２回以上の維持用量が投与される投与レジメンを含む。例えば、本開示の本態様によると、負荷用量が月に１回の頻度で投与される場合、維持用量は、６週間に１回、２か月に１回、３か月に１回などで、患者に投与され得る。

以下の実施例は、本開示の方法及び組成物をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図していない。使用した数字に対する正確さを確保するために努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差を考慮に入れるべきである。別途示さない限り、分子量は、平均分子量であり、温度は、摂氏であり、圧力は、大気圧又はその付近である。

実施例１．抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の生成
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を、ＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞外ドメインを含む免疫原を用いて、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを含む操作マウス）を免疫化することによって得た。

抗体の免疫応答を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的免疫測定法によってモニタリングした。所望の免疫応答が得られたときに、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存性を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニング及び選択して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技法を使用して、例示的なＨ１Ｈ１８６３Ｎ２抗ＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを有する）を得た。この抗体の可変ドメイン配列は、最初にＵＳ９，４７５，８７５に開示されている。この抗体は、本明細書ではＲＥＧＮ１０７６と称される。ＲＥＧＮ１０７６抗体重鎖のＥＵインデックス番号付けによって測定される残基２９７でのアスパラギン（Ｎ）が、グルタミン（Ｑ）に変異した、抗体のアグリコシル化バージョン（すなわち、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２－Ｎ２９７Ｑ）は、本明細書ではＲＥＧＮ３１２４と称される。可変領域配列並びに完全重鎖及び軽鎖配列が、以下に提供される。

これとは別に、フコシル化が低減されたＲＥＧＮ１０７６［「ＲＥＧＮ１０７６（Ｆｕｃ－）」］を、米国特許出願第２０１０／０３０４４３６Ａ１号（これは、参照によりその全体が具体的に組み込まれる）に「８０８８」として記載されたＣＨＯ宿主細胞株中で調製した。得られた（Ｆｕｃ－）抗体の質量分析により、元の抗体と比較してコアフコースが除去されたことが確認された。

表１は、本明細書で有用な例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域並びにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載し、一方で、表２は、完全長重鎖及び軽鎖アミノ酸配列の配列識別子を提供する。対応する核酸配列識別子は、表３に記載される。

（表１）ＲＥＧＮ１０７６及びＲＥＧＮ３１２４の可変領域アミノ酸配列の配列識別子

（表２）ＲＥＧＮ１０７６及びＲＥＧＮ３１２４の完全重鎖及び軽鎖アミノ酸配列の配列識別子

（表３）ＲＥＧＮ１０７６及びＲＥＧＮ３１２４の可変領域核酸配列の配列識別子

当業者によって理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換することができる、など）が、いずれの場合でも、表１に示される数値識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は、同じままであり、結合特性は、Ｆｃドメインの性質に関わらず同一又は実質的に類似していると予想される。

抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍細胞中に急速に内部移行することが見出された。本実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のある特定の追加の生物学的特性が、以下に記載される実施例において詳細に記載される。

以下の実施例で使用される対照及び比較対照構築物
対照構築物を、比較目的で以下の実験に含んだ。本明細書でＣＯＭＰと称される比較対照抗体は、米国特許出願公開第２０１０／００５６７６２号に開示される「ｈｕ８０６」抗体の、それぞれ配列番号４２及び４７に対応するアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖可変ドメインを有する、ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（ｈＩｇＧ１）である。抗体は、ＡＢＴ－４１４とも称される。「ｈｕ８０６」抗体は、増幅若しくは過剰発現されるＥＧＦＲ（配列番号２７）の残基３１１～３２６（配列番号２４）、又はＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号２８）の残基４４～５９に結合することが知られている。ＣＯＭＰ－ＭＭＡＦは、非切断可能なリンカーを介してモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）にコンジュゲートされたＡＢＴ－４１４抗体を指す。

対照１９３２及び対照３８９２は、アイソタイプ対照抗体である。対照１９３２は、Ｆｃ改変を有さず、対照３８９２は、Ｎ２９７Ｑ改変を有する。

実施例２．テシリン－抗体のコンジュゲーション及び特徴解析
５０ｍＭのＨＥＰＥＳ又はＰＢＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５中の抗体ＲＥＧＮ１０７６及びＲＥＧＮ３１２４、並びにアイソタイプ対照抗体の対照１９３２（Ｆｃ改変なし）及び対照３８９２（Ｎ２９７Ｑ改変を有する）の各々１０ｍｇ／ｍＬを、３７℃で３０分間、１ｍＭのジチオスレイトールで処理した。ゲル濾過後（Ｇ－２５、ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム）、ＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍＬ）中のマレイミドリンカーペイロードテシリン（別名、ＳＧ３２４９、Ｔｉｂｅｒｇｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＡＣＳ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ７（１１）：９８３－９８７に開示されるように合成）（１．２当量／ＳＨ基）を還元抗体に添加し、混合物を１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）でｐＨ７．０に調整した。コンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、滅菌濾過した。タンパク質濃度をＵＶによって決定し、ペイロード対抗体比を質量分析によって決定した。サイズ排除ＨＰＬＣにより、使用した全てのコンジュゲートが９５％を超えて単量体であったことが確認され、ＬＣ－ＭＳにより、０．５％未満の非コンジュゲートリンカーペイロードがあったことが確認された。ペイロード対抗体比が、表４に示される。

抗体上のテシリンの担持量を判定するために、コンジュゲートを脱グリコシル化し、還元し、ＬＣ－ＭＳによって分析した。

このアッセイについて、５０μｇのコンジュゲートをミリＱ水で希釈し、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度とした。１０μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆ溶液［ＰＮＧａｓｅ Ｆ溶液は、１５０μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆストック（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｐ０７０４Ｌ）及び８５０μＬのミリＱ水を添加し、よく混合することによって調製された］を希釈コンジュゲート溶液に添加し、次いで３７℃で一晩インキュベートした。得られた物質が２０ｍＭの最終ＴＣＥＰ濃度を有するように、２．４μＬの０．５Ｍ ＴＣＥＰを試料に添加し、次いでこれを５０℃で３０分間インキュベートした。各試料の１０μＬをＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｔ Ｇ２－Ｓｉ）上に注入し、２５分かけて０．１ｍＬ／分の勾配移動相（２０～４０％）で溶出した（移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ中、０．１％ｖ／ｖ ＦＡ、移動相Ｂ：アセトニトリル中、０．１％ｖ／ｖ ＦＡ）。ＬＣ分離を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．０×５０ｍＭ、１．７μＭ）で実施した。

質量分析スペクトルをデコンボリューションした。識別された軽鎖及び重鎖のピークは、リンカー－ペイロード値＝０及び１を有する軽鎖（Ｌ）、リンカー－ペイロード値＝０、１、２、及び３を有する重鎖（Ｈ）を表す。各種の強度値から、ホモ二量体抗体コンジュゲートについて以下の方程式１を使用して、薬物対抗体比（ＤＡＲ）を計算した。各コンジュゲートのＤＡＲが、表４に提供される。
方程式１：

（表４）収率及びペイロード 対 抗体比

実施例３．ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合速度
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のＰＤＢコンジュゲートに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ結合についての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００又は３０００装置でのリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを使用して決定した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃ＢＲ－１００８－３９）とのアミンカップリングによって誘導体化して、ヒト定常領域と共に発現された抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物コンジュゲート及び親非改変抗体を捕捉した。Ｂｉａｃｏｒｅ結合研究を、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液）中で実施した。ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で調製したＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグと共に発現された異なる濃度（３倍希釈）のヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞外ドメイン（ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＭＨ、配列番号２９（６００ｎＭ～２２．２ｎＭの範囲））を、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物コンジュゲート又は抗体捕捉表面上に、５０μＬ／分の流量で注入した。捕捉された抗体薬物コンジュゲート及びモノクローナル抗体の各々へのｈＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＭＨの会合を、４分間モニタリングした。その後、ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＭＨ解離を、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で６～８分間モニタリングした。抗ヒトＦｃ表面を、２０ｍＭのＨ_３ＰＯ_４の注入を使用して再生した。全ての結合速度実験を２５℃で実施した。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線フィッティングソフトウェアを使用して、リアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルにフィッティングすることによって、速度論的会合（ｋ_ａ）及び解離（ｋ_ｄ）速度定数を決定した。全てのセンサーグラムを、対応する分析物センサーグラムから緩衝液注入センサーグラム信号を減算することによって二重参照し、それによって、捕捉表面からの抗体の解離によって引き起こされるアーチファクトを除去した。結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）及び解離半減期（ｔ^１／２）を、以下：

のように速度定数から計算した。

２５℃での抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物コンジュゲート及び抗体に対するｈＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＭＨ結合の結合速度パラメータが、表５に示される。示されるように、親抗体及びそれらの対応する抗体薬物コンジュゲートは、試験した条件下で、ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＭＨと類似の結合Ｋ_Ｄ値を示した。

（表５）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩコンジュゲート及び親非改変抗体に対するヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＭＭＨ結合のＢｉａｃｏｒｅ速度

実施例４．抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンＡＤＣの細胞殺傷活性
本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物コンジュゲートの相対的な細胞殺傷能力を決定するために、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する細胞株上で細胞殺傷アッセイを実施した。細胞株を開発するために、Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを含むＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを使用して、本明細書でＵ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩと称される、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ；アミノ酸３０～２９７の欠失及び接合グリシン残基の生成を含むアクセッション番号ＮＰ＿００５２１９．２のアミノ酸１～３８０、すなわち、配列番号２５）を発現するＵ２５１細胞（Ｓｉｇｍａ、＃９０６３００１）を作製した。Ｕ２５１株を、完全成長培地（ＭＥＭアール塩＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｌ－グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン＋１％非必須アミノ酸＋ピルビン酸ナトリウム）中で維持した。

抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物コンジュゲートのインビトロ細胞傷害性を測定するために、抗体薬物コンジュゲートを用いた６日間の処理後の核数を評価した。Ｕ２５１ＭＧ細胞及びＵ２５１／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞について、完全成長培地中で、９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、＃６０５５３０８）に３０００個の細胞／ウェルで細胞を播種し、５％ＣＯ_２中３７℃で一晩成長させた。細胞生存率曲線については、連続希釈された抗体薬物コンジュゲート及びペイロードを、（毒素濃度に基づいて）１００ｎＭ～１．５ｐＭの範囲の最終濃度で細胞に添加し、次いで、５％ＣＯ_２中３７℃で６日間インキュベートした。各希釈系列における最後のウェル（未処理ウェル）は、培地単独（ＡＤＣ）又は培地＋０．２％ＤＭＳＯ（ペイロード）のいずれかを含有するブランク対照としての役割を果たし、３倍連続希釈の継続としてプロットした。その後、細胞を、４％ホルムアルデヒド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃２８９０８）で固定しながら、３ｕｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ｈ３５７０）で処理し、画像をＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ（ＰｅｒｋｉｎＥＬｍｅｒ）で取得した。核数を、Ｈａｒｍｏｎｙ画像分析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥＬｍｅｒ）を介して決定し、細胞生存率を、未処理（１００％生存）細胞に対する割合として表した。ＩＣ_５０値を、１０点の用量応答曲線にわたる４パラメータロジスティック方程式を使用して決定した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。最大殺傷％を、以下のように、各被験物質について決定した：１００－最小生存率。各被験物質のＩＣ_５０値及び最大殺傷％は、表６に示される。

表６に要約されるように、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－薬物コンジュゲートのＲＥＧＮ３１２４－テシリン及びＲＥＧＮ１０７６－テシリン（ＲＥＧＮ３１２４のグリコシル化バージョン）は、細胞生存率を低減し、ＩＣ_５０値は、Ｕ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞において、ＲＥＧＮ３１２４－テシリンについては３３ｐＭ、及びＲＥＧＮ１０７６－テシリンについては８４ｐＭであった。ＲＥＧＮ３１２４－テシリン及びＲＥＧＮ１０７６－テシリンは、親Ｕ２５１ＭＧ細胞を殺傷し、ＩＣ_５０値は、ＲＥＧＮ３１２４－テシリンについては２．６ｎＭ、及びＲＥＧＮ１０７６－テシリンについては４．９ｎＭであった。同様にコンジュゲートされたアイソタイプ対照抗体の対照３８９２－テシリンは、細胞生存率を低減し、ＩＣ_５０値は、Ｕ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞において３．９ｎＭ、及びＵ２５１ＭＧ親細胞において１．８ｎＭであった。テシリンの遊離ペイロード（ＳＧ３１９９）は、１０ｐＭのＩＣ_５０値でＵ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を殺傷し、２ｐＭのＩＣ_５０値でＵ２５１ＭＧ親細胞を殺傷した。

比較対照ＭＭＡＦペイロードにコンジュゲートされたＲＥＧＮ１０７６（ＲＥＧＮ１０７６－ＭＭＡＦ）も、細胞傷害性について試験した。他の試験された抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣと同様に、ＲＥＧＮ１０７６－ＭＭＡＦは、４７ｐＭのＩＣ_５０値でＵ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を殺傷した。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣ ＲＥＧＮ１０７６－ＭＭＡＦは、親Ｕ２５１ＭＧ細胞において５２ｎＭのＩＣ_５０値で弱い細胞傷害性を示した。ＭＭＡＦに対する非結合の同様にコンジュゲートされたアイソタイプ対照抗体（対照１９３２－ＭＭＡＦ）は、１００ｎＭを超えるＩＣ_５０で、全ての試験された株において弱い細胞傷害性を示した。

（表６）Ｕ２５１／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ及び親細胞株における細胞生存率

ＡＤＣによるバイスタンダー殺傷は、細胞傷害性ペイロードが標的細胞から放出され、次いで周囲の抗原陰性（バイスタンダー）細胞によって取り込まれるときに起こり得る。ＲＥＧＮ３１２４－テシリン及びＲＥＧＮ１０７６－テシリンによる潜在的なバイスタンダー殺傷を評価するために、Ｕ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｆａｒ ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ｃ３４５６４）で予め標識した。１５００個の細胞／ウェルの遠赤色標識Ｕ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞及び１５００個の細胞／ウェルの非標識Ｕ２５１ＭＧ細胞の１：１の共培養物を、ＡＤＣ又は遊離ペイロードＭ３１のいずれかと、ある範囲の濃度（１００ｎＭ～１．５ｐＭ）で６日間インキュベートした。その後、細胞を、４％ホルムアルデヒド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃２８９０８）で固定しながら、３ｕｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２核染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ｈ３５７０）で処理した。画像をＯｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＰｅｒｋｉｎＥＬｍｅｒ）で取得した。全ての細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ標識核によって同定し、細胞数を、Ｈａｒｍｏｎｙ画像分析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥＬｍｅｒ）を介して、遠赤色陽性Ｕ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞（共培養中のＵ２５１）及び遠赤色陰性親Ｕ２５１ＭＧ細胞集団に分離した。細胞生存率を各細胞集団について別々に決定し、未処理（１００％生存）細胞に対する割合として表した。ＩＣ_５０及び最大殺傷％値を、前述したように決定し、表６に要約した。

ＲＥＧＮ３１２４－テシリン及びＲＥＧＮ１０７６－テシリンは、それぞれ４３ｐＭ及び８２ｐＭのＩＣ_５０値で、共培養物からのＵ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を殺傷し、殺傷は、Ｕ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ単培養物で観察されたものと類似していた。ＲＥＧＮ３１２４－テシリン及びＲＥＧＮ１０７６－テシリンはまた、それぞれ２８ｐＭ及び５９ｐＭのＩＣ_５０値で、共培養物からのＵ２５１ＭＧ親細胞を殺傷し、これらのＡＤＣによるバイスタンダー殺傷活性を示唆している。非結合ＡＤＣの対照３８９２－テシリンは、それぞれ４．０ｎＭ及び２．４ｎＭのＩＣ_５０値で、Ｕ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＵ２５１ＭＧ親細胞を殺傷した。

比較対照ＭＭＡＦペイロードにコンジュゲートされたＲＥＧＮ１０７６（ＲＥＧＮ１０７６－ＭＭＡＦ）も、バイスタンダー活性について試験した。ＲＥＧＮ１０７６－ＭＭＡＦは、１５ｐＭのＩＣ_５０値で、共培養物からのＵ２５１ＭＧ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対する強力な細胞傷害性を示した。テシリンコンジュゲートとは対照的に、ＲＥＧＮ１０７６－ＭＭＡＦは、２８ｎＭのＩＣ_５０値で、共培養物からのＵ２５１親細胞において弱い細胞傷害性であった。ＭＭＡＦにコンジュゲートされた非結合ＡＤＣ（対照１９３２－ＭＭＡＦ）は、共培養アッセイにおいて、１００ｎＭ未満のＩＣ_５０値で弱い細胞傷害性であった。

実施例５．ヒト上皮成長因子受容体バリアント（ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ）上の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換ベースのエピトープマッピング
ＲＥＧＮ３１２４と相互作用する上皮成長因子受容体バリアント３（ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ ＥＣＤ（Ｌ２５－Ａ３８０）．ｍｍＨ（配列番号２９）、付録のアミノ酸配列）のアミノ酸残基を決定するために、水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）を実施した。ＨＤＸ－ＭＳ方法の概要説明は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９、及びＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａに記載されている。

ＨＤＸ－ＭＳ実験を、重水素標識及びクエンチングのための、Ｌｅａｐｔｅｃ ＨＤＸ ＰＡＬシステム、試料消化及び添加のための、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（Ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）、解析勾配のための、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－Ｃｌａｓｓ（μＢｉｎａｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｎａｇｅｒ）、及びペプチド質量測定のための、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析器からなる、統合ＨＤＸ／ＭＳプラットフォームで実施した。

標識溶液を、ｐＤ７．０でＤ_２Ｏ中のＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、及び３ｍＭ ＫＣｌ、２５℃でｐＨ７．４と同等）として調製した。重水素標識については、１０μＬのＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｍｙｃヒスチジンタグを有するＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞外ドメイン（Ｌ２５－Ａ３８０）、配列番号２９、６６μＭ）、又は１：０．６のモル比でＲＥＧＮ３１２４と予混合されたＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ａｇ－Ａｂ複合体）を、様々な時点（例えば、非重水素化対照は０秒、重水素標識は５分、２０分、及び８０分）に９０μＬのＤ_２Ｏ標識溶液と２０℃でインキュベートした。時点の各々について、実験を二連で実施した。１００μＬの予め冷却されたクエンチ緩衝液（０．５Ｍ ＴＣＥＰ－ＨＣｌ、８Ｍ尿素、及び１％ギ酸）を１００μＬの試料に添加することによって、重水素化反応をクエンチした。混合試料を２０℃で５分間インキュベートした。次いで、クエンチされた試料を、オンラインペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化用のＷａｔｅｒｓ ＨＤＸ Ｍａｎａｇｅｒに注入した。消化ペプチドを、１．０ｍｍ×５０ｍｍ Ｃ８カラム（ＮｏｖａＢｉｏａｓｓａｙｓ）上に捕捉し、１０％～３２％Ｂ（移動相Ａ：水中０．５％ギ酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸）の１３分の勾配分離によって分離した。分離されたペプチドを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳモード又はＬＣ－ＭＳモードでＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析によって解析した。

非重水素化ＥＧＦＲｖＩＩＩ試料のＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びその無作為化配列を含むデータベースに対して、非特異的酵素消化についてのデフォルトパラメータを用いたＢｙｏｎｉｃ検索エンジン（タンパク質指標）を使用して検索した。共通ヒトグリカンのリストは、潜在的な可変修飾として定義される。次いで特定されたペプチドのリストを、全ての重水素化試料からのＬＣ－ＭＳデータと一緒に、ＨＤＸ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（バージョン３．３）にインポートして、３つのＨＤＸ時点の各複製における個々のペプチドの重水素取り込みを計算した。

所与のペプチドについて、スペクトルのセントロイド質量（強度加重平均質量）を、最初に非重水素化（０秒）対照について計算する。抗原及びＡｇ－Ａｂ複合体の非重水素化対照の平均セントロイド質量は、０％重水素組み込みの質量（０％Ｄの質量）とみなされる。各重水素化試料について、絶対Ｄ取り込みは、重水素化試料のセントロイド質量及び０％Ｄの質量の質量差として定義される。重水素組み込みパーセント（％Ｄ）は、セントロイド質量を０及び１００％Ｄの質量と比較することによって決定される（Ｎ－２重水素原子とＮ－２水素原子との間の質量差の８０％として定義される最大Ｄ取り込み質量シフトであって、Ｎは、ペプチド中の非プロリンアミノ酸の数に等しい）。

各ペプチドについて、絶対Ｄ取り込み値及び％Ｄ値を、各ＨＤＸ時点の２つの複製について個別に計算した。各ＨＤＸ時点について、重複する絶対Ｄ取り込み値及び％Ｄ値を抗原及びＡｇ－Ａｂ複合体について平均化した。次いで、５分及び２０分のＨＤＸ時点における％Ｄ値の平均を、「抗原％Ｄ」又は「Ａｇ－Ａｂ％Ｄ」として定義される、抗原又はＡｇ－Ａｂ複合体についての単一の％Ｄ値として提示する。抗原％ＤとＡｇ－Ａｂ％Ｄとの間の差を、所与のペプチドについての、抗原及びＡｇ－Ａｂ複合体を比較する重水素組み込みの全体的な変化を表すデルタ％Ｄ（Δ％）として定義する。

ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ由来の合計２００個のペプチドを、ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ単独及びＲＥＧＮ３１２４試料を含む複合体のｈＥＧＦＲｖＩＩＩの両方から同定し、これは、ｈＥＧＦＲｖＩＩＩの８４％の配列カバレッジを表していた。重水素取り込みの割合において５％超の減少を呈した任意のペプチドを、有意に保護されたものとして定義した（Δ％Ｄ＜－５％）。ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ上のアミノ酸６４～８２ ＧＰＣＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬ（配列番号２６）に対応するペプチドは、ＲＥＧＮ３１２４によって有意に保護された。

（表７）ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ単独と比較して、ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＲＥＧＮ３１２４複合体の形成時に有意な保護を有するｈＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド

ＥＧＦＲｖｌｌｌ ＥＣＤ（Ｌ２５－Ａ３８０）．ｍｍＨ（ｍｍＨタグは下線が引かれている）

実施例６．抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンＡＤＣは、ＥＧＦＲｖＩＩＩトランスフェクト多形性膠芽腫細胞株異種移植片に対して有意な抗腫瘍有効性を示す
ＲＥＧＮ１０７６－テシリン及びＲＥＧＮ３１２４－テシリンＡＤＣの抗腫瘍有効性を、インビトロ培養後に標的の内因性発現が失われるため、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するようにトランスフェクトされた膠芽腫細胞株異種移植片モデルで最初に評価した。評価した第１のモデルは、Ｕ２５１／ＥＧＦＲｖＩＩＩであり、腫瘍を、１０×１０^６個の細胞をマトリゲルと１：１で混合したものを雄のＳＣＩＤマウスの右脇腹上に皮下移植することによって定着させた。腫瘍を、処置開始前、移植の約３０日後に約１３０ｍｍ^３まで成長させた。Ｕ８７／ＥＧＦＲｖＩＩＩにおけるＡＤＣの有効性も評価し、腫瘍を、３×１０^６個の細胞を雄のＳＣＩＤマウスの右脇腹上に皮下移植することによって定着させた。Ｕ８７／ＥＧＦｖＩＩＩ腫瘍を、処置開始前、移植の約２５日後に約１９０ｍｍ^３まで成長させた。マウスを７～８匹の群に無作為化し、単回投与の試験ＡＤＣ又は対照ＡＤＣで処置した。処置後６０～７０日間、腫瘍成長をモニタリングした。

実験結果：
Ｕ２５１／ＥＧＦＲｖＩＩＩ異種移植片担持マウスにおける初期研究は、２．５又は５ｕｇ／ｋｇのＰＢＤペイロードを送達するように設計された単回投与後のＲＥＧＮ１０７６－テシリン及びＲＥＧＮ３１２４－テシリン抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣの活性を評価した（表８）。対照－テシリン又は対照－Ｎ２９７Ｑ－テシリンＡＤＣで処置した異種移植片の成長は、ビヒクル対照処置腫瘍と比較して有意に遅延しなかった。しかしながら、研究の過程にわたって、２．５ｕｇ／ｋｇのペイロード用量のＲＥＧＮ１０７６－テシリン又はＲＥＧＮ３１２４－テシリンＡＤＣで処置した腫瘍において、腫瘍成長の有意な遅延が観察された。５ｕｇ／ｋｇのＰＢＤペイロードを送達したより高いＡＤＣ用量は、対照処置と比較して更に大きな抗腫瘍効果を有した。ＲＥＧＮ３１２４－テシリンＡＤＣは、同等の用量レベルでのＲＥＧＮ１０７６－テシリンと比較して、より持続的な抗腫瘍効果をもたらした。全体として、全ての抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ処置群は、投与後約６０日目に研究が完了するまで生存した。体重に関連する処置は観察されず、全ての群は、研究の過程にわたって体重の約１０～１５％の増加が観察された。

ＲＥＧＮ１０７６－テシリンＡＤＣ及びＲＥＧＮ３１２４－テシリンＡＤＣの活性も、Ｕ８７／ＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍異種移植片モデルにおいて評価した（表９）。ここで、２．５ｕｇ／ｋｇのＰＢＤペイロードを送達した用量での、ＲＥＧＮ１０７６－テシリン及びＲＥＧＮ３１２４－テシリンＡＤＣの単回投与を比較した。このモデルは、非常に急速な成長を示し、腫瘍が研究エンドポイントに達したため、ビヒクル対照で処置した動物を投与の１０日後に安楽死させた。対照－テシリン又は対照－Ｎ２９７Ｑ－テシリンＡＤＣは、腫瘍成長のある程度の遅延を媒介したが、全ての腫瘍は成長し、腫瘍が研究エンドポイントに達したため、動物を投与の２４日後に安楽死させた。２．５ｕｇ／ｋｇのＰＢＤペイロードを送達したＲＥＧＮ１０７６－テシリン及びＲＥＧＮ３１２４－テシリンの両方が、腫瘍異種移植片の有意かつ持続的な退縮を媒介した。全ての抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ処置動物は、投与後７０日目に研究が完了するまで生存した。ＲＥＧＮ１０７６－テシリンにおける単一の腫瘍は、研究終了に向かって再成長を示した。ＲＥＧＮ３１２４－テシリンで処置した全ての腫瘍は、抑制されたままであった。体重に関連する処置は観察されず、全ての群は、研究の過程にわたって体重の約５％の増加が観察された。

（表８）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンＰＢＤ ＡＤＣは、対照と比較してＵ２５１／ＥＧＦＲｖＩＩＩ異種移植片の退縮を媒介した（処置後３６日目）

（表９）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンコンジュゲートは、対照と比較してＵ８７／ＥＧＦＲｖＩＩＩ異種移植片の退縮を媒介した（処置後１０日目）

実施例７．抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－テシリンＡＤＣは、同所性に配置されたＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性多形性膠芽腫患者由来の異種移植片に対して有意な抗腫瘍有効性を示す
脳に同所性に配置したＧＢＭ腫瘍に対する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣの有効性を評価するために、頭蓋内ＧＢＭ６（高くかつ均一なＥＧＦＲｖＩＩＩ発現）又はＧＢＭ５９（中程度かつ不均一なＥＧＦＲｖＩＩＩ発現）患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍を、３×１０^５個のＰＤＸ細胞の注射によって定着させた。頭蓋内注射を、３ｍｍの深さで、前頂の１ｍｍ前側及び２ｍｍ外側で実施した。全ての同所性ＧＢＭ ＰＤＸ研究は、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．によって実施された。同所性ＧＢＭ６ ＰＤＸを１４＋－１日間定着させ、ＧＢＭ５９ ＰＤＸを２５＋－１日間定着させた後、マウスを７～８匹の群に無作為化し、試験ＡＤＣ又は対照ＡＤＣの単回投与で処置した。マウスを、周囲罹患（ｐｅｒｉ－ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）の兆候について約９０日間モニタリングし、瀕死状態に達する前に安楽死させた。

実験結果：
同所性ＧＢＭ６ ＰＤＸ腫瘍担持マウスを用いた初期研究（研究Ａ）では、ビヒクルで処置したマウスは、急速に悪化する臨床兆候を示し、８匹のうち７匹のマウスを、処置の３０日以内に安楽死させた（表１０）。アイソタイプ対照ＡＤＣは、いかなる臨床的効果ももたらさず、この群のマウスを、腫瘍によって誘導された過度の罹患（ｐｅｒ－ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）により迅速に安楽死させた。対照群で観察された短い２５日及び２６．５日の生存中央値とは対照的に、７ｕｇ／ｋｇペイロード用量でのＲＥＧＮ３１２４－テシリン（ＤＡＲ ３．４）を用いた処置は、生存の非常に有意な延長をもたらした。８匹のうち５匹のマウスが投与後９４日目の最終観察時点まで生存したため、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンＡＤＣ群の生存中央値は得られなかった。

同所性に配置されたＧＢＭ６ ＰＤＸ腫瘍を担持するマウスにおいて、第２の研究（研究Ｂ）を開始した（表１１）。この場合もやはり、媒介されたアイソタイプ対照ＡＤＣは、ビヒクル処置マウスと比較して生存を延長せず、両方の群の生存中央値は２０日近くであり、生存したマウスはいなかった。ＲＥＧＮ３１２４－テシリン（ＤＡＲ ３．４）は、３．５及び７ｕｇ／ｋｇのペイロード用量レベルの両方で生存を延長したが、より高い用量は、処置後９５日目の研究完了まで生存するより多くのマウス（８匹のうち５匹）をもたらした。ＲＥＧＮ３１２４－テシリン（ＤＡＲ １．９）は、ＲＥＧＮ３１２４－テシリン（ＤＡＲ ３．４）に対して同様に有効であり、生存中央値は処置後７７日であり、研究終了まで生存したマウスは８匹のうち４匹であった。腫瘍によって誘導された周囲罹患（ｐｅｒｉ－ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）を示すマウスにおいて、動物体重の急速な悪化が観察された。対照的に、長期生存を示したＲＥＧＮ３１２４－テシリンで処置した動物は、処置後の観察期間の過程にわたって関連する１０～１５％の体重の増加を示した。

ＲＥＧＮ３１２４－テシリンの有効性も、同所性に配置されたＧＢＭ５９ ＰＤＸ腫瘍に対して評価した（表１２）。本研究（研究Ｃ）では、ビヒクルで処置した８匹全てのマウスが、３０日間で、腫瘍負荷で死んだ。アイソタイプ対照ＡＤＣは、ビヒクル対照と比較して生存の部分的な延長を媒介したが、全てのマウスを、処置後４２日で周囲罹患（ｐｅｒｉ－ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）により安楽死させ、３２．５日の生存中央値をもたらした。ＧＢＭ６モデルについては、ＲＥＧＮ３１２４－テシリンの単回の７ｕｇ／ｋｇのペイロード用量を受けたマウスにおいて、生存の非常に有意な延長が観察された。ＤＡＲ １．９及びＤＡＲ ３．４を有するＲＥＧＮ３１２４－テシリンは、処置後９４日目に研究が完了するまで生存する８匹のうち７匹のマウスをもたらし、したがって、これらの群における生存期間中央値は得られなかった。本研究では、ＤＡＲ ３．４ ＡＤＣと比較してＤＡＲ １．９ ＲＥＧＮ３１２４－テシリンで処置したマウスにおいて、あまり堅固ではない体重増加が観察された。研究Ｃのマウスからの脳を様々な時点で、特に、明らかな疾患、体重減少、若しくは他の臨床的尺度によりマウスを安楽死させたとき、又は処置後９４日目の研究の完了時に採取した。組織学的分析を実施した。ＲＥＧＮ３１２４－テシリンで処置したマウス由来の脳のいずれにおいても、ＧＢＭ５９細胞は見られなかった。同様の結果がＧＢＭ６ ＰＤＸ研究（研究Ａ）で見られた。その後の免疫組織化学により、ＧＭＢ５９ ＰＤＸがＥＧＦＲｖＩＩＩの中程度かつ不均一な発現を示したことが示された。

（表１０）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンＡＤＣは、頭蓋内ＧＢＭ６ ＧＢＭ ＰＤＸを有するマウスの生存を有意に延長した（研究Ａ）

（表１１）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンＡＤＣは、頭蓋内ＧＢＭ６ ＧＢＭ ＰＤＸを有するマウスの生存を有意に延長した（研究Ｂ）

（表１２）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンＡＤＣは、頭蓋内ＧＢＭ５９ ＧＢＭ ＰＤＸを有するマウスの生存を有意に延長した（研究Ｃ）

実施例８．ＲＥＧＮ１０７６－テシリン及びＲＥＧＮ３１２４－テシリンＡＤＣは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性多形性膠芽腫患者由来の異種移植片に対して有意な抗腫瘍有効性を示す
多形性膠芽腫の腫瘍生物学を表すＥＧＦＲｖＩＩＩの内因性発現を有する患者由来の異種移植片を使用して、ＲＥＧＮ１０７６－テシリン及びＲＥＧＮ３１２４－テシリンＡＤＣの有効性を更に調べた。ＧＢＭ ＰＤＸ研究は、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．によって実施された。ＧＢＭ６又はＧＢＭ５９ ＰＤＸの皮下腫瘍を、約５０ｍｇのＰＤＸ断片をヌードマウスの脇腹に移植することによって定着させた。腫瘍体積が移植後１６～１８日目に約１２５ｍｍ^３に達すると、マウスを７～８匹の群に無作為化し、３．５又は７ｕｇ／ｋｇのピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ペイロード用量のいずれかに等しい用量を送達した試験ＡＤＣ又は対照ＡＤＣの単回投与で処置した。処置後６０日間、腫瘍成長をモニタリングした。

実験結果：
ビヒクルで処置したＧＢＭ６ ＰＤＸ腫瘍担持マウスでは、急速な腫瘍成長が観察され、腫瘍は、処置の１８日後、研究エンドポイントに達した。アイソタイプ対照－テシリンＡＤＣは、腫瘍成長のわずかな遅延のみを媒介し、腫瘍は、処置後２２日目に研究エンドポイントに達した。ビヒクル及び対照処置腫瘍とは対照的に、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣは、非常に有意かつ持続的な腫瘍退縮を媒介した（表１３）。ＧＢＭ６モデルでは、ＲＥＧＮ１０７６－テシリン又はＲＥＧＮ３１２４－テシリンからの３．５ｕｇ／ｋｇのペイロード用量は、概して、同等の抗腫瘍有効性を有し、８匹のうち５匹及び８匹のうち４匹の動物が、処置後６０日目の研究の完了時に腫瘍を有していなかった。７ｕｇ／ｋｇのＰＢＤペイロードを送達したＲＥＧＮ１０７６－テシリン又はＲＥＧＮ３１２４－テシリン処置は、より大きくかつ持続的な有効性をもたらし、８匹のうち７匹及び８匹のうち８匹が、処置の６０日後の研究の完了時に腫瘍を有していなかった。処置に関連する体重減少は観察されず、動物の体重は、研究の過程にわたって約１５％増加した。

（表１３）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンＡＤＣは、対照と比較してＧＢＭ６ ＰＤＸ腫瘍の退縮を媒介した（処置後１８日目）

１．９及び３．４の薬物：抗体比（ＤＡＲ）を有するＲＥＧＮ３１２４－テシリンＡＤＣの相対効果を、ＧＢＭ５９腫瘍担持マウスにおいて評価した。ビヒクルＡＤＣ及び対照ＡＤＣで処置したマウスの急速な腫瘍成長が、この場合もやはり観察され、これらの群の両方が、処置の１９日後に研究エンドポイントに達した（表１４）。３．５ｕｇ／ｋｇのＰＢＤ用量では、ＲＥＧＮ３１２４－テシリン（ＤＡＲ ３．４）は、中程度の抗腫瘍効果を媒介し、腫瘍は、処置後３０日目に研究エンドポイントに達した。ＲＥＧＮ３１２４－テシリン（ＤＡＲ １．９）も活性であり、腫瘍は、この薬剤を用いた処置後５１日目に研究エンドポイントに達した。他の研究と一致して、７ｕｇ／ｋｇのペイロード用量を送達したＲＥＧＮ３１２４－テシリンＡＤＣ処置は、ＧＢＭ５９腫瘍成長のより大きくかつより持続的な阻害をもたらした。この用量では、ＲＥＧＮ３１２４－テシリン（ＤＡＲ １．９）は、６０日目の研究の完了時に７つのうち３つの腫瘍が５０ｍｍ^３未満という結果になり、一方、ＲＥＧＮ３１２４－テシリン（ＤＡＲ ３．４）は、研究の完了時に７つのうち５つの腫瘍が５０ｍｍ^３未満という結果になった。処置に関連する体重減少は観察されず、動物の体重は、研究の過程にわたって約１０％増加した。

（表１４）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンコンジュゲートは、対照と比較してＧＢＭ５９ ＰＤＸ腫瘍の退縮を媒介した（処置後１９日目）

実施例９．ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＧＢＭ５９ ＰＤＸ腫瘍担持マウスにおけるＲＥＧＮ３１２４－テシリンＡＤＣの分割用量スケジュールの評価
抗腫瘍有効性に対するＲＥＧＮ３１２４－テシリンコンジュゲートの様々な用量スケジュールの効果を評価するために、皮下ＧＢＭ５９ ＰＤＸ腫瘍モデルを使用して研究を実施した。本研究の場合もやはり、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．によって実施された。皮下腫瘍ＧＢＭ５９ ＰＤＸを、約５０ｍｇのＰＤＸ断片をヌードマウスの脇腹に移植することによって定着させた。腫瘍体積が移植後１３日目におよそ１２５ｍｍ^３に達すると、マウスを７匹の群に無作為化し、試験ＡＤＣ又は対照ＡＤＣで処置した。アイソタイプ対照ＡＤＣを、７ｕｇ／ｋｇのＰＢＤペイロードに等しい単回用量で投与した。低用量群の動物は、処置後０及び４日目に１用量当たり１．７５ｕｇ／ｋｇでＡＤＣ ＲＥＧＮ３１２４－テシリンコンジュゲートを受け、これは、３．５ｕｇ／ｋｇの累積ＰＢＤ用量をもたらした。更なる群は、累積７ｕｇ／ｋｇ用量を送達するＲＥＧＮ３１２４－テシリンを受けた。これは、０、４、及び８日目（２．３３ｕｇ／ｋｇ）、０及び４日目（３．５ｕｇ／ｋｇ、又は０日目（７ｕｇ／ｋｇ）に送達した、３×２．３３ｕｇ／ｋｇ、２×３．５ｕｇ／ｋｇ、又は１×７ｕｇ／ｋｇの個々の用量に分割された。処置後６０日間、腫瘍成長をモニタリングした。

実験結果：
本研究では、アイソタイプ対照ＡＤＣは、ビヒクル対照と比較して腫瘍成長のいかなる遅延も引き起こさず、平均腫瘍体積が研究エンドポイントに達したため、処置後１９日目に両方の群を安楽死させた（表１５）。２×１．７５ｕｇ／ｋｇのＲＥＧＮ３１２４－テシリンを受けた動物では、腫瘍体積の有意な阻害が観察され、全てのマウスは、処置の６０日後に研究が完了するまで生存した。７ｕｇ／ｋｇの累積ＰＢＤペイロード用量をもたらした用量スケジュールの全てが、更なるかつ非常に有意な抗腫瘍効果をもたらした。３×２．３３ｕｇ／ｋｇ ＰＢＤ用量でＲＥＧＮ３１２４－テシリンを投与したマウスでは、７匹のうち３匹が、研究の完了時に腫瘍を有しておらず、平均腫瘍体積は、９０ｍｍ^３未満であった。２×３．５ｕｇ／ｋｇ及び１×７ｕｇ／ｋｇ ＰＢＤ用量を送達したＲＥＧＮ３１２４－テシリンを受けた群では、７匹のうち２匹及び７匹のうち３匹のマウスが、研究の完了時に腫瘍を有しておらず、両方の群の平均腫瘍体積は、５ｍｍ^３未満であり、これは、本研究におけるＲＥＧＮ３１２４－テシリンの有意かつ持続的な有効性を示している。処置に関連する体重減少は観察されず、動物の体重は、研究の過程にわたって約１０％増加した。

（表１５）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンコンジュゲートは、対照と比較してＧＢＭ６ ＰＤＸ腫瘍の退縮を媒介した（処置後１８日目）

実施例１０．抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンＡＤＣの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－メイタンシノイドＤＭ１ ＡＤＣとの比較
腫瘍を定着させるために、０．５×１０^６個のＭＭＴ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を雌のＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍体積が約１４０ｍｍ^３に達すると（８日目）、マウスを７匹の群に無作為化し、テシリン又はＤＭ１ペイロードのいずれかを使用して試験ＡＤＣ及び対照ＡＤＣで処置した。薬剤を１７日間にわたって３日投与した。移植後６１日間、腫瘍成長をモニタリングした。

次いで、それぞれのＥＧＦＲｖＩＩＩ ＡＤＣの抗腫瘍有効性を経時的に評価した（図１）。１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１０７６－テシリンＡＤＣで処置したマウスでは、研究の継続期間中、完全な腫瘍根絶が観察された。対照－テシリンＡＤＣは、一過性の抗腫瘍効果を媒介したが、全ての腫瘍は最終的に、プロトコルエンドポイントの腫瘍体積に向かって急速な進行を示した。ＲＥＧＮ１０７６－テシリンの投与後に観察された有意な有効性とは対照的に、１又は１５ｍｇ／ｋｇのいずれかで投与したＲＥＧＮ１０７６－ＤＭ１は、腫瘍成長の中程度の遅延のみを誘導し、全ての腫瘍は、プロトコルエンドポイントに向かって急速に進行した。対照ＤＭ１ ＡＤＣは、ビヒクル対照と比較して効果はなかった。１ｍｇ／ｋｇ用量レベルでの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩの結果は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－メイタンシノイドＤＭ１コンジュゲートと比較して、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンコンジュゲートのより大きな効力を示す。本研究では、いずれの処置も重度の体重減少を誘導しなかった。

実施例１１．ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍モデルにおける抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンコンジュゲート及びＣＯＭＰ－ＭＭＡＦ ＡＤＣの評価
ＲＥＧＮ３１２４－テシリンＡＤＣの活性を、Ｕ２５１／ＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍異種移植片モデル及び頭蓋内同所性ＧＢＭ５９ ＰＤＸモデルにおいて、比較対照ＡＤＣ、ＣＯＭＰ－ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１５（４）：６６１－６６９に記載される手順に基づいて調製されたアウリスタチンベースのＡＤＣ、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７：１１４－１２４も参照されたい）の活性と同時に評価した。最初の異種移植片研究のために、Ｕ２５１／ＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍を、１０×１０^６個の細胞をマトリゲルと１：１で混合したものを雄のＳＣＩＤマウスの右脇腹上に皮下移植することによって定着させた。腫瘍を、処置開始前、移植の約３０日後に約１７５ｍｍ^３まで成長させた。マウスを８匹の群に無作為化し、単回投与の試験ＡＤＣ又は対照ＡＤＣで処置した。処置後７１日間、腫瘍成長をモニタリングした。

脳内に同所性に配置したＧＢＭ腫瘍に対するＲＥＧＮ３１２４－テシリン及びＣＯＭＰ－ＭＭＡＦ ＡＤＣの有効性を評価するために、頭蓋内ＧＢＭ５９ ＰＤＸ腫瘍を、３×１０^５個のＰＤＸ細胞の注射によって定着させた。頭蓋内注射を、３ｍｍの深さで、前頂の１ｍｍ前側及び２ｍｍ外側で実施した。全ての同所性ＧＢＭ ＰＤＸ研究は、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．によって実施された。同所性ＧＢＭ５９ ＰＤＸを２５日間定着させた後、マウスを８匹の群に無作為化し、試験ＡＤＣ又は対照ＡＤＣの単回投与で処置した。マウスを、周囲罹患（ｐｅｒｉ－ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）の兆候について９４日間モニタリングし、瀕死状態に達する前に安楽死させた。

実験結果：
Ｕ２５１／ＥＧＦＲｖＩＩＩ異種移植片担持マウスにおける研究は、７ｕｇ／ｋｇのＰＢＤペイロードを送達するように設計されたＲＥＧＮ３１２４－テシリンの活性、並びに１、２．５、及び５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ用量でのＣＯＭＰ－ＭＭＡＦ ＡＤＣの活性を評価した（表１６）。アイソタイプ対照を本研究の全ての用量レベルについて含んだが、これらの対照薬剤では中程度の抗腫瘍効果しか観察されなかった。ＲＥＧＮ３１２４－テシリンは、０．５３ｍｇ／ｋｇのＡＤＣの単回投与（７ｕｇ／ｋｇのＰＢＤペイロード用量）が異種移植片の持続的な退縮を誘導することができたため、本研究において明らかな抗腫瘍活性を示した。１ｍｇ／ｋｇのＣＯＭＰ－ＭＭＡＦで処置した腫瘍では、持続的な退縮は観察されなかった。２．５ｍｇ／ｋｇのＣＯＭＰ－ＭＭＡＦを使用して腫瘍に対する活性が見られたが、投与後７１日目の研究の完了時に、ＲＥＧＮ３１２４－テシリンを用いた処置による活性と同様の持続的な活性を達成するために、５ｍｇ／ｋｇのＣＯＭＰ－ＭＭＡＦが必要であった。本研究の全ての動物が、処置後の観察期間にわたって体重の１０％の増加を示した。

（表１６）対照と比較したＵ２５１／ＥＧＦＲｖＩＩＩ異種移植片の、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－テシリンコンジュゲート及びＣＯＭＰ－ＭＭＡＦコンジュゲートによって媒介された退縮（治療後３６日目）

ＲＥＧＮ３１２４－テシリン（ＤＡＲ １．９）及びＣＯＭＰ－ＭＭＡＦ ＡＤＣの有効性も、同所性に配置されたＧＢＭ５９ ＰＤＸ腫瘍に対して評価した（表１７）。本研究では、ビヒクルで処置した８匹全てのマウスが、２５日間で、腫瘍負荷で死んだ。アイソタイプ対照－テシリン及び対照ＭＭＡＦ ＡＤＣは、ビヒクル対照群と比較して生存を延長しなかった。対照とは対照的に、ＲＥＧＮ３１２４－テシリンは、生存の非常に有意な延長を媒介し、この群の８匹のうち５匹のマウスが、投与後９５日目の研究の完了まで生存した。１ｍｇ／ｋｇでのＣＯＭＰ－ＭＭＡＦ ＡＤＣは、この群の生存中央値が、５ｍｇ／ｋｇでの対照－ＭＭＡＦと同じであったため、生存の有意な増加を誘導しなかった。より高い５ｍｇ／ｋｇのＣＯＭＰ－ＭＭＡＦ処置は、ＭＭＡＦ対照と比較して生存の程度の増加を誘導したが、全てのマウスは、処置の３５日以内に腫瘍負荷で死に、２３．５日の生存中央値をもたらした。

（表１７）同所性に配置されたＧＢＭ５９ ＧＢＭ ＰＤＸ腫瘍を有するマウスにおけるＲＥＧＮ３１２４－テシリンコンジュゲート及びＣＯＭＰ－ＭＭＡＦコンジュゲートの活性

非公式配列表
本明細書に開示される配列を列挙する非公式配列表が、以下に提供される。

（表１８）配列識別子並びに対応する核酸及びアミノ酸配列

本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、本開示の種々の修飾は、本明細書に記載されるものに加えて、上記の記述及び付随する図から、当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付される特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

Claims (37)

1. ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、前記抗体又はその抗原結合断片が、
   配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、
   配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と
   を含み、前記抗体が、テシリンにコンジュゲートされている、前記抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
2. 抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体又はその抗原結合断片が、
   （ｉ）配列番号２３の接合ペプチドにも
   （ｉｉ）配列番号２４のペプチドにも
   結合しない、請求項１に記載のＡＤＣ。
3. 前記抗体又はその抗原結合断片が、３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイによって測定された場合、約５００ｎＭの、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ単量体についての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す、請求項１又は２に記載のＡＤＣ。
4. 前記抗体又はその抗原結合断片が、３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイによって測定された場合、約１０ｎＭ以下の、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ二量体についての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を示す、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
5. 前記抗体又はその抗原結合断片が、表面プラズモン共鳴アッセイによって検出可能なレベルでＥＧＦＲ二量体に結合しない、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
6. 前記抗体又はその抗原結合断片が、
   配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
   配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
   配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
   を含むＨＣＶＲと、
   配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
   配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
   配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
   を含むＬＣＶＲと
   を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
7. 前記抗体又はその抗原結合断片が、
   配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
   配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと
   を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
8. 前記抗体又はその抗原結合断片が、
   配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
   配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと
   を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
9. 前記抗体又はその抗原結合断片が、
   配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
   配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと
   を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
10. 前記抗体又はその抗原結合断片が、
    配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、
    配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと
    を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
11. 前記抗体又はその抗原結合断片が、完全抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
12. 前記抗体又はその抗原結合断片が、重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
13. 前記抗体又はその抗原結合断片が、重鎖及び軽鎖を含み、前記軽鎖が、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
14. 前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
15. 前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
16. 薬物対抗体比（ＤＡＲ）が、約１～約４である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
17. 前記抗体が、Ｎ２９７でアグリコシル化されている、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
18. 前記抗体が、ＥＵインデックス番号付けによって決定されるＮ２９７Ｑ変異をｈＩｇＧ１ Ｆｃ中に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
19. 前記抗体又はその抗原結合断片が、
    配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
    配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、
    配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
    配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
    配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
    配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
    を含み、前記抗体又は断片の前記重鎖が、アグリコシル化されており、かつＮ２９７Ｑ変異を含み、前記抗体又は断片が、テシリンにコンジュゲートされている、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
20. 前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号２６のアミノ酸配列内の少なくとも１つの残基と相互作用する、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
21. 以下の特徴：
    （ａ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞においてインビボでの生存率の低減を示す、
    （ｂ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞と共培養された非ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に対するインビボでのバイスタンダー細胞傷害性を示す、
    （ｃ）ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する頭蓋内多形性膠芽腫を有するマウスにおいて、生存の延長を示す、
    （ｄ）治療関連体重減少の非存在下で、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍を有するマウスにおいて抗腫瘍効果を示す、
    （ｅ）患者由来の多形性膠芽腫を有するマウスにおいて、腫瘍退縮を示す、
    （ｆ）ＭＭＡＦにコンジュゲートされた比較対照抗体と比較して、より低い投与量でより大きな殺腫瘍性を示す、及び
    （ｇ）腫瘍担持マウスにおいて、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ－メイタンシノイドＡＤＣよりも大きな抗腫瘍効力を示す
    のうちの１つ以上を有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＡＤＣ。
22. 前記抗体又はその抗原結合断片が、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＡＤＣを含む複合体。
23. 請求項１～２１のいずれか一項に記載のＡＤＣを含む、容器又は注射用デバイス。
24. 請求項１～２１のいずれか一項に記載のＡＤＣ、及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
25. 化学療法剤、抗炎症剤、及び鎮痛剤からなる群から選択される１つ以上の追加の治療剤を更に含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
26. ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍に罹患している、その必要のある対象においてがんを治療する方法であって、治療有効量の請求項１～２１のいずれか一項に記載のＡＤＣ又は請求項２４に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
27. その必要のある対象において、がん若しくは腫瘍を治療する、又は腫瘍成長を低減させる、及び／又は腫瘍退縮を誘発するための方法であって、治療有効量の請求項１～２１のいずれか一項に記載のＡＤＣ又は請求項２４に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
28. 前記がん又は腫瘍が、膠芽腫、乳管癌又は乳管内癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺がん、及び頭頸部の扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
29. 化学療法剤、抗炎症剤、及び鎮痛剤からなる群から選択される１つ以上の追加の治療剤を投与することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
30. 抗体又はその抗原結合断片及び細胞毒素を含む第２のＡＤＣを投与することを更に含み、前記第２のＡＤＣの前記抗体又はその抗原結合断片が、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、配列番号２３の接合ペプチド及び／又は配列番号２４のペプチドにも結合する、請求項２６に記載の方法。
31. 請求項１～２１のいずれか一項に記載のＡＤＣを対象の身体に投与するための方法であって、前記ＡＤＣを前記対象の身体に注射することを含む、前記方法。
32. 前記ＡＤＣが、前記対象の身体に皮下、静脈内、又は筋肉内注射される、請求項３１に記載の方法。
33. 前記ＡＤＣのＨＣＶＲを含む免疫グロブリン及び前記ＡＤＣのＬＣＶＲを含む免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、前記ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で、培養培地中で培養することを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＡＤＣを作製するための方法。
34. テシリンを前記免疫グロブリンのうちの１つ以上にコンジュゲートすることを更に含む、請求項３３に記載の方法。
35. 前記コンジュゲーションが、還元剤の存在下で前記免疫グロブリン鎖を還元すること、及び還元された前記免疫グロブリン鎖と前記テシリンをインキュベートすることによって実施される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記還元剤が、ジチオスレイトールである、請求項３５に記載の方法。
37. 請求項３３～３６のいずれか一項からの生成物である、ＡＤＣ。

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