CN109912715A - 一种EGFRvIII抗体及其偶联物、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种EGFRvIII抗体及其偶联物、制备方法和应用。所述抗体包括EGFRvIII抗体的互补决定区(CDR)：重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3中的一种或多种，和/或，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3中的一种或多种，其氨基酸序列如本发明中所述。所述EGFRvIII抗体，与EGFRvIII蛋白具有高度亲和力，与小分子毒素如MMAE偶联后能够进入细胞，对EGFRvIII阳性细胞进行细胞毒杀伤作用。因此能够运用于治疗肿瘤等药物的制备中。

Description

一种EGFRvIII抗体及其偶联物、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种EGFRvIII抗体及其偶联物、制备方法和应用。
背景技术
人类表皮生长因子受体(EGFR，human epidermal growth factor receptor，也称为her-1或Erb-B1)是一个170kDa的跨膜蛋白受体，由原癌基因c-erbB编码，膜内区具有酪氨酸激酶活性(Modjtahedi et al.，Br.J.Cancer 73:228-235，1996；Herbst and Shin，Cancer 94:1593-1611，2002)。EGFR全长序列在SwissProt数据库的编号为P00533。EGFR通过酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节多种细胞生理过程，主要包括细胞增殖及分化、细胞存活及凋亡、血管生成、以及细胞的有丝分裂和细胞转移(Atalay et al.，Ann.Oncology14:1346-1363，2003；Tsao and Herbst，Signal 4:4-9，2003；Herbst and Shin，Cancer94:1593-1611，2002；Modjtahedi et al.，Br.J.Cancer 73:228-235，1996)。
EGFR的配体包括EGF，TGFA/TGF-alpha，amphiregulin，epigen/EPGN，BTC/betacellulin，epiregulin/EREG和HBEGF/heparin-binding EGF。受体-配体结合后会触发EGFR形成同源或者异源二聚体，从而使胞内区发生自身磷酸化，进一步激活复杂的下游信号级联反应，主要包括下列几条信号通路:RAS-RAF-MEK-ERK信号通路，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路，PLCgamma-PKC信号通路和STATs modules信号通路。
在多种肿瘤中发现了EGFR的过度表达，包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、和肾癌等(Atalay et al.，Ann.Oncology 14:1346-1363，2003；Herbst and Shin，Cancer 94:1593-1611，2002；and Modjtahedi et al.，Br.J.Cancer 73:228-235，1996)。在很多情况下，EGFR的过度表达与患者的不良预后相关。(Herbst and Shin，Cancer 94:1593-1611，2002；Modjtahedi et al.，Br.J.Cancer 73:228-235，1996)。EGFR也表达于正常组织中，在皮肤、肝脏和胃肠道的上皮组织中表达量较高，但表达水平远低于肿瘤组织(Herbst and Shin，Cancer 94:1593-1611，2002)。
在很大一部分肿瘤样本中可以同时检测到EGFR基因的扩增以及突变。EGFRvIII是其中一种突变型，也称作de2-7EGFR、ΔEGFR、或Δ2-7(Olapade-Olaopa et al.，Br.J.Cancer.82,186-94，2000)。成熟的EGFRvIII mRNA中缺失了外显子2-7的801个核苷酸，相应的EGFRvIII蛋白缺失了267个氨基酸(6-273)，同时插入了一个甘氨酸残基，形成了一个独特的连接肽(Wong et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89,2965-9，1992；Yamazakiet al.，Jpn.J.Cancer Res.81,773-9，1990；Yamazaki et al.，Mol.Cell.Biol.8,1816-20，1988；and Sugawa et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,8602-6，1990)。
多种肿瘤类型中报道了EGFRvIII的表达，包括神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌(Wikstrand et al.，Cancer Res.57,4130-40，1997；Olapade-Olaopa et al.，Br.J.Cancer.82,186-94，2000；Wikstrand,et al.，Cancer Res.55,3140-8，1995；Garciade Palazzo et al.，Cancer Res.53,3217-20，1993)。EGFRvIII不能与配体结合，但是它处于一种持续的低激活状态。在裸鼠的肿瘤异种移植模型中，EGFRvIII的表达可以显著促进神经胶质瘤细胞的生长(Nishikawa et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,7727-31，1994)。另外EGFRvIII的表达可以使NIH3T3细胞和MCF-7细胞发生转化，产生致癌性(Batraet al.，Cell Growth Differ.6,1251-9，1995)。EGFRvIII在神经胶质瘤中的作用机制并没有完全清楚，但是根据已有的报道，EGFRvIII可以降低神经胶质瘤细胞的凋亡，并小幅度的提高神经胶质瘤细胞的增殖(Nagane et al.，Cancer Res.56,5079-86，1996)。EGFRvIII特异性的表达于肿瘤组织中，在正常组织中不表达，因此在抗体治疗中是一个高度特异性的靶点。
单克隆抗体由于具有靶向性、特异性、专一性、高亲和力等优势，正发展成为新型治疗药物。然而，早期的临床试验揭示，在人体中使用非人源单克隆抗体，常常因为人抗小鼠抗体(HAMA)和人抗大鼠抗体(HARA)应答，导致严重的免疫反应，抗体被快速清除。随后开发出免疫原性较小的抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。根据人源化程度不同,治疗性单克隆抗体药物可分为4种：鼠源性抗体(无人源氨基酸序列)、嵌合抗体(60％～70％人源化氨基酸序列)、CDR移植抗体(90％～95％人源化氨基酸序列)以及全人源抗体(100％人源氨基酸序列)。随着人源化程度增加，非鼠源单克隆抗体可以减轻人体治疗过程中人抗鼠抗体反应(HAMA和HARA反应)，逐步消除异源性抗体的免疫原性问题，在保持对抗原高亲和力的同时，改善了抗体的药代动力学，临床上已大量使用这些抗体药物进行靶向治疗。
抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)是一种新型生物治疗方法，通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标肿瘤细胞表面，ADC被肿瘤细胞内吞后释放出小分子药物，从而产生对肿瘤细胞的特异性杀伤。
近一百年间，基于抗体的免疫疗法与基于化学药物的化学疗法，一直是临床上癌症治疗的两大治疗策略。抗体以肿瘤细胞过度表达的抗原为靶点，多种治疗性单抗已经在临床上取得了巨大成功。在临床实践中，治疗性抗体虽然具有很好的靶向性，但是杀伤作用存在局限性。小分子化学药物虽然具备对癌细胞的高效杀伤作用，但是对非癌细胞也造成同样的伤害。因此临床上抗体药物以及小分子药物各自的局限性，对药物研发提出了新的要求。新一代抗体药物偶联物，利用抗体对靶细胞的特异结合能力，输送高细胞毒的化学药物，实现对癌细胞的靶向高效杀伤。随着新型化学连接技术的出现，抗体药物偶联药在八十年代末开始进入临床研究，目前已经有4个ADC药物经FDA批准上市。
ADC药物的开发涉及：药物靶点的筛选、重组抗体的制备、连接物技术开发以及高细胞毒性化合物的筛选优化等几个方面。EGFRvIII只在肿瘤组织中表达，在正常组织中不表达，因此在抗体治疗中是一个高度特异性的靶点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服目前缺少EGFRvIII抗体的缺陷，提供一种亲和力高、特异性强的EGFRvIII抗体及其制备方法和应用。所述的EGFRvIII抗体，与EGFRvIII蛋白具有高度亲和力，与小分子毒素如MMAF偶联后能够进入细胞，对EGFRvIII阳性细胞进行细胞毒杀伤作用。因此能够运用于治疗肿瘤等药物的制备中。
本发明人以EGFRvIII蛋白或者过表达EGFRvIII蛋白的重组细胞株作为免疫原，采用传统的杂交瘤制备技术。该技术由Kohler and Milstein在40年前建立(Kohler andMilstein1975，Nature 256:495)，通过一系列的调整和改进，获得EGFRvIII抗体的先导抗体。再通过对先导抗体的初步生产、纯化和检定，获得具备抗体亲和力高、有与小分子毒素MMAF偶联后能够进入细胞，对EGFRvIII阳性细胞进行细胞毒杀伤作用等优异的生物性特性的EGFRvIII抗体。然后通过分子生物学方法测序获知EGFRvIII抗体的重链可变区和EGFRvIII抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
本领域中，抗体或抗原的结合区均含有一条轻链可变区和一条重链可变区，每一个可变区均含有CDR1、CDR2和CDR3三个结构域。
本发明提供一种EGFRvIII抗体，其包括互补决定区(CDR)：重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3中的一种或多种，和/或，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3中的一种或多种，其中，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ ID No.18、SEQID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ ID No.66、SEQID No.74、SEQ ID No.82、SEQ ID No.90或SEQ ID No.98所示；所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQID No.43、SEQ ID No.51、SEQ ID No.59、SEQ ID No.67、SEQ ID No.75、SEQ ID No.83、SEQID No.91、SEQ ID No.99、SEQ ID NO.184或SEQ ID NO.186所示；所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ ID No.60、SEQ ID No.68、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.84、SEQ ID No.92或SEQ ID No.100所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQID No.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70、SEQ ID No.78、SEQ ID No.86、SEQ ID No.94或SEQ ID No.102所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ IDNo.63、SEQ ID No.71、SEQ ID No.79、SEQ ID No.87、SEQ ID No.95或SEQ ID No.103所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ ID No.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72或SEQ ID No.80、SEQ ID No.88、SEQ ID No.96或SEQ ID No.104所示；
或者，所述重链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQID No.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQID No.66、SEQ ID No.74、SEQ ID No.82、SEQ ID No.90、SEQ ID No.98所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.51、SEQ ID No.59、SEQ ID No.67、SEQ ID No.75、SEQ ID No.83、SEQ IDNo.91、SEQ ID No.99、SEQ ID NO.184或SEQ ID NO.186所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.4、SEQID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQID No.60、SEQ ID No.68、SEQ ID No.76、SEQ ID No.84、SEQ ID No.92、SEQ ID No.100所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQ ID No.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70、SEQ ID No.78、SEQ IDNo.86、SEQ ID No.94、SEQ ID No.102所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ ID No.63、SEQID No.71、SEQ IDNo.79、SEQ ID No.87、SEQ ID No.95、SEQ ID No.103所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ ID No.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72、SEQ ID No.80、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.96、SEQ ID No.104所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；较佳地所述重链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ IDNo.66、SEQ ID No.74、SEQ ID No.82、SEQ ID No.90、SEQ ID No.98所示的氨基酸序列至少有90％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ IDNo.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.59、SEQ ID No.67、SEQ ID No.75、SEQ ID No.83、SEQ ID No.91、SEQ IDNo.99、SEQ ID NO.184或SEQ ID NO.186所示的氨基酸序列至少有90％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ ID No.60、SEQID No.68、SEQ ID No.76、SEQ ID No.84、SEQ ID No.92、SEQ ID No.100所示的氨基酸序列至少有90％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQ ID No.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70、SEQ ID No.78、SEQ ID No.86、SEQ IDNo.94、SEQ ID No.102所示的氨基酸序列至少有90％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQID No.31、SEQ ID No.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ ID No.63、SEQ ID No.71、SEQID No.79、SEQ ID No.87、SEQ ID No.95、SEQ ID No.103所示的氨基酸序列至少有90％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ IDNo.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72、SEQ ID No.80、SEQ ID No.88、SEQ ID No.96、SEQ IDNo.104所示的氨基酸序列至少有90％的序列同源性的氨基酸序列所示；更佳地，所述重链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ ID No.66、SEQ IDNo.74、SEQ ID No.82、SEQ ID No.90、SEQ ID No.98所示的氨基酸序列至少有95％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.3、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.51、SEQ IDNo.59、SEQ ID No.67、SEQ ID No.75、SEQ ID No.83、SEQ ID No.91、SEQ ID No.99、SEQ IDNO.184或SEQ ID NO.186所示的氨基酸序列至少有95％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ ID No.60、SEQ ID No.68、SEQID No.76、SEQ ID No.84、SEQ ID No.92、SEQ ID No.100所示的氨基酸序列至少有95％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70、SEQ ID No.78、SEQ ID No.86、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.102所示的氨基酸序列至少有95％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ ID No.63、SEQ ID No.71、SEQ ID No.79、SEQ IDNo.87、SEQ ID No.95、SEQ ID No.103所示的氨基酸序列至少有95％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQID No.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ ID No.56、SEQ ID No.64、SEQID No.72、SEQ ID No.80、SEQ ID No.88、SEQ ID No.96、SEQ ID No.104所示的氨基酸序列至少有95％的序列同源性的氨基酸序列所示；进一步更佳地，所述重链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ ID No.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ ID No.66、SEQ ID No.74、SEQ IDNo.82、SEQ ID No.90、SEQ ID No.98所示的氨基酸序列至少有99％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQ ID No.51、SEQ ID No.59、SEQ IDNo.67、SEQ ID No.75、SEQ ID No.83、SEQ ID No.91、SEQ ID No.99、SEQ ID NO.184或SEQID NO.186所示的氨基酸序列至少有99％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ ID No.60、SEQ ID No.68、SEQ IDNo.76、SEQ ID No.84、SEQ ID No.92、SEQ ID No.100所示的氨基酸序列至少有99％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.6、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQ ID No.54、SEQ IDNo.62、SEQ ID No.70、SEQ ID No.78、SEQ ID No.86、SEQ ID No.94、SEQ ID No.102所示的氨基酸序列至少有99％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39、SEQID No.47、SEQ ID No.55、SEQ ID No.63、SEQ ID No.71、SEQ ID No.79、SEQ ID No.87、SEQID No.95、SEQ ID No.103所示的氨基酸序列至少有99％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ ID No.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72、SEQID No.80、SEQ ID No.88、SEQ ID No.96、SEQ ID No.104所示的氨基酸序列至少有99％的序列同源性的氨基酸序列所示。
需知：虽然抗体药物中使用的抗体是由来自单一的抗体产生细胞的克隆得到的单克隆抗体，但抗体是生物大分子，结构非常复杂，因此在生产、运输、储存以及体内使用过程中会发生各种翻译后修饰和降解反应，如N末端环化、糖基化、脱酰胺、异构化、氧化、片段化、二硫键错配等。这些质量属性可能会对最终产品影响抗体稳定性、生物学活性及生物利用度，因此，控制产品质量的稳定性和一致性非常重要。本发明中所述的“至少有80％(或者90％、95％、99％)的序列同源性”的氨基酸序列是通过对前述序列中所示的氨基酸序列进行插入、缺失或者替换获得，以克服上述可能存在的不稳定性问题。例如，对序列进行计算机结构模拟分析，对可能存在的、特别是CDR区的转录后修饰(Potential post-translational modifications，PTMs)位点分析，包括抗体的聚集、脱酰胺基敏感(asparagine deamidation，位点(NG，NS，NH等)、天冬氨酸异构(DG，DP)敏感位点、N糖基化(N-{P}S/T)敏感位点及氧化敏感位点等分析和替换。
其中，脱酰胺是指天冬酰胺和天冬氨酸的侧链的酰胺转变成羧酸的反应，当为谷氨酰胺时，脱酰胺化速度通常是天冬酰胺时的十分之一，但机理是相同的。异构化是指位于天冬酰胺和天冬氨酸的侧链的羧基被位于C末端侧的残基的氮原子电子对攻击，导致天冬酰胺的脱酰胺化或天冬氨酸脱水形成不稳定的环状酰亚胺中间体，该中间体通过开裂，大部分变成异天冬氨酸，剩余部分变成天冬氨酸。另外，据报道，脱酰胺化反应特别容易在天冬酰胺和甘氨酸相邻位点(Asn-Gly)发生(Geiger等人(J.Biol.Chem.1987，262：785-794))。还有报道称，天冬氨酸通过水解反应发生肽链断裂，特别是C端侧存在脯氨酸的序列(Asp-Pro)容易发生酸性条件下的分解(Segalas等，FEBS Letters，1995,371:171-175)。在这些抗体或蛋白等的保存中发生脱酰胺化、异构化反应成为产品异质性的原因，所以希望尽可能地得到控制。为了抑制脱酰胺化、异构化和水解，可以适当实施去除作为接受脱酰胺化的位点的谷氨酰残基和天冬酰残基的氨基酸修饰。作为除去是特别有效的脱酰胺化位点的一个非限定性方案，优选列举脱酰胺化反应得到促进的位点，即以NG和QG序列的形式表示的模体中的甘氨酸残基，天冬酰胺残基或谷氨酰胺残基，其中任意一个氨基酸残基的(N、Q或G)的取代均可显著抑制脱酰胺化反应(WO2003/057881或WO2005/067620等)。另外，通过调整产生抗体的细胞的培养方法，或可以适当采用制备脱酰胺化反应得到了抑制的抗体的方法。
较佳地，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.4所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.11所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.12所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.18所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.19所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.20所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.26所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.27所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.34所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.35所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.36所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.42所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.43所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.44所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.50所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQID No.51所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.52所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.58所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.59所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.60所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.66所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.67所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.68所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.74所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.75所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.76所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.82所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.83所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.84所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.90所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.91所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.92所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.98所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.99所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.100所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.184所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；或者，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.186所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；
所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.7所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.8所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.14所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.15所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.16所示；或，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.22所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.23所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.24所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.30所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.31所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.38所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.39所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.40所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.46所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQID No.47所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.48所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.54所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.55所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.56所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.62所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.63所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.64所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.70所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.71所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.72所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.78所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.79所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.80所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.86所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.87所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.88所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.94所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.95所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.96所示；或，所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.102所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.103所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.104所示。
更佳地，所述EGFRvIII抗体包括含有所述CDR的EGFRvIII抗体的重链可变区和/或EGFRvIII抗体的轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1、SEQID No.9、SEQ ID No.17、SEQ ID No.25、SEQ ID No.33、SEQ ID No.41、SEQ ID No.49、SEQID No.57、SEQ ID No.65、SEQ ID No.73、SEQ ID No.81、SEQ ID No.89、SEQ ID No.97、SEQID No.179或SEQ ID No.180所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.29、SEQ ID No.37、SEQ ID No.45、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.61、SEQ ID No.69、SEQ ID No.77、SEQ ID No.85、SEQ ID No.93或SEQID No.101所示。
较佳地，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.5所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQID No.9所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.13所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.17所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.21所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.25所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.29所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.33所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.37所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.41所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.45所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.49所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.53所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.57所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.61所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.65所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.69所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.73所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.77所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.81所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.85所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.89所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.93所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.97所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.101所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.179所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.180所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示。
综上所述，上述氨基酸序列的编号如表1所示：
表1EGFRvIII抗体蛋白序列编号
其中，表1中的数字即为序列表中序列号，如75G7C6的重链蛋白可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1，而75G7C6的重链蛋白可变区中CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.2。
较佳地，所述的EGFRvIII抗体还包括构架区(或称框架区或骨架区)，所述构架区包括重链构架区和/或轻链构架区；较佳地，所述重链构架区为人或鼠抗体重链构架区，和/或，所述轻链构架区为人或鼠抗体轻链构架区；更佳地，所述重链构架区为人抗体重链构架区，且所述轻链构架区为人抗体轻链构架区。构架残基是轻链可变区或重链可变区的一部分，是除高变残基(高变残基多指互补决定区或CDR)或CDR残基外的抗体可变区残基，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。构架残基可以衍生自天然存在的人的抗体，例如基本上类似于鼠源抗EGFRvIII抗体75G7C6或63A10A7的构架区的人抗体的构架区。还可以使用代表个体序列之间的共有序列的人工构架区序列。当选择用于人源化的构架区时，在人类中广泛呈现的序列可能优于较不常见的序列。可以制备人构架受体序列的另外突变，以恢复被认为涉及抗原接触的鼠类残基和/或涉及抗原结合位点的结构完整性的残基，或改善抗体表达。肽结构预测可以用于分析人源化重链可变区和轻链可变区序列，以鉴定和避免由人源化设计引入的翻译后蛋白质修饰位点。
更佳地，当本发明所述的EGFRvIII抗体为人源化抗体或全人源抗体时，所述重链构架区为人抗体重链构架区，人抗体轻链构架区残基可以包含种系IGKV1-12、IGKV1-13、IGKV1-16、IGKV1-17、IGKV1-22、IGKV1-27、IGKV1-32、IGKV1-37、IGKV1-39、IGKV1-5、IGKV1-8、IGKV1-9、IGKV3-34、IGKV2-36、IGKV3-11、IGKV2-40、IGKV3-25、IGKV6-21、IGKV7-3、IGKV5-2、IGKV4-1、IGKV2-4、IGKV2-19、IGKV2-18、IGKV3-20、IGKV2-26和IGKV2-24，特别是这些种系的FR1、FR2、FR3；以及由Jk片段Jk1、Jk2、Jk3、Jk4和Jk5，特别是这些种系的FR4编码的序列。人抗体重链构架区残基可以包含种系IGHV7-81、IGHV4-80、IGHV3-79、IGHV(II)-78-1、IGHV5-78、IGHV3-76、IGHV3-73、IGHV3-72、IGHV2-70、IGHV1-69-2、IGHV2-70D、IGHV3-49、IGHV3-43、IGHV1-2、IGHV1-3、IGHV1-8、IGHV1-18、IGHV1-24、IGHV1-45、IGHV1-46、IGHV2-5、IGHV2-21、IGHV2-26、IGHV2-70、IGHD3-7、IGHV3-9、IGHV3-11、IGHV3-7、IGHV3-7和IGHD3-9，特别是这些种系的FR1、FR2、FR3；以及JH片段JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和JH6，特别是这些种系的FR4编码的序列，或重链构架区的共有序列。此类构架区序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在"VBase"人种系序列数据库(www.mrcco8.com.ac.uk/vbase)获得，以及在Kabat，E.A等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。在本发明人源化抗体的一较佳实施例中，所述人源化EGFRvIII抗体的人接受序列选自人种系外显子VH、JH、Vk和Jk序列，其中，抗体重链可变区的模板优选人种系抗体重链VH外显子的IGHV1-46*01、JH外显子的JH-4；或者人种系抗体重链VH外显子的IGHV1-46*01，JH外显子的JH-6b。抗体轻链可变区的模板优选人种系抗体轻链VK外显子的IGKV1-39*01、JK外显子的/JK-2；或者人种系抗体轻链VK外显子的IGKV3-11*01，JK外显子的JK-4。
较佳地，所述的蛋白质还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区为本领域常规，较佳地为小鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区，更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规，较佳地为小鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区，更佳地为人源抗体轻链恒定区。
其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1、9、17、25或者179所示的重链可变区以及序列如SEQ ID NO.5、13、21或者29所示的轻链可变区可与鼠源重链恒定区构成鼠源化EGFRvIII抗体、亦可与人源重链恒定区以及人源轻链恒定区构成EGFRvIII嵌合抗体(其中SEQ IDNO.179所示的氨基酸序列为经SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列突变获得，将后者CDR2区的NG突变为NA)。
进一步地，将上述嵌合抗体中氨基酸序列如SEQ ID NO.179或9所示的重链可变区中根据Kabat定义确定的序列如SEQ ID NO.2、184以及4(分别对应CDR1、2和3)，或者SEQ IDNO.10～12所示的重链CDR以及上述序列如SEQ ID NO.5或13所示的轻链可变区中根据Kabat定义确定的序列如SEQ ID NO.6～8或者SEQ ID NO.14～16所示的轻链CDR分别移植到所选人种系模板中，替换人种系模板的CDR区，即得人源化抗体；所述种系模板中的轻链构架区和重链构架区如上所述：人的抗体可变区框架经过选择，其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR序列，来源于人种系轻链包含1)IGKV1-39*01或IGKV3-11*01的FR1、FR2、FR3区，和2)JK-2或JK-4的FR4区的人抗体轻链构架区的组合；所述抗体的重链可变区上的重链FR序列，来源于人种系重链序列包含1)IGHV1-46*01的FR1、FR2、FR3区，和2)JH-4或JH-6b的FR4区的人抗体重链构架区的组合。一般而言，人受体构架区的选择应类似于供体抗体的构架区，或最类似于可变区亚家族的共有序列进行选择。移植后，可以在供体和/或受体序列中进行序列突变，以优化抗原结合、功能性、密码子使用、表达水平等，包括将非人残基引入构架区内。
较佳地，上述CDR区被移植到所选人种系模板中且构架区残基经过回复突变后的重链可变区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.133、134、135、136、143、144、145、146、147、141、142或者147所示；轻链可变区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.137、138、139、140、148、149、150、151、152或者153所示。
本发明中所述的人源化EGFRvIII抗体优选包含至少一个重链可变区和/或至少一个轻链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.133、SEQ IDNO.134、SEQ ID NO.135、SEQ ID NO.136、SEQ ID NO.141、SEQ ID NO.142、SEQ ID NO.143、SEQ ID NO.144、SEQ ID NO.145、SEQ ID NO.146或SEQ ID NO.147所示；所述的轻链可变区序列如序列表中SEQ ID NO.137、SEQ ID NO.138、SEQ ID NO.139、SEQ ID NO.140、SEQ IDNO.148、SEQ ID NO.149、SEQ ID NO.150、SEQ ID NO.151、SEQ ID NO.152或SEQ ID NO.153所示。
或者，所述的重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.133、SEQ IDNO.134、SEQ ID NO.135、SEQ ID NO.136、SEQ ID NO.141、SEQ ID NO.142、SEQ ID NO.143、SEQ ID NO.144、SEQ ID NO.145、SEQ ID NO.146或SEQ ID NO.147所示的氨基酸序列至少有80％序列同源的氨基酸序列所示；所述的轻链可变区序列如序列表中SEQ ID NO.137、SEQ ID NO.138、SEQ ID NO.139、SEQ ID NO.140、SEQ ID NO.148、SEQ ID NO.149、SEQ IDNO.150、SEQ ID NO.151、SEQ ID NO.152或SEQ ID NO.153所示的氨基酸序列至少有80％序列同源的氨基酸序列所示；更佳地，所述的重链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQID No.154、SEQ ID No.155、SEQ ID No.156、SEQ ID No.157、SEQ ID No.162、SEQ IDNo.163、SEQ ID No.164、SEQ ID No.165、SEQ ID No.166、SEQ ID No.167或SEQ ID No.168所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有90％序列同源的氨基酸序列；所述的轻链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.158、SEQ ID No.159、SEQ ID No.160、SEQ IDNo.161、SEQ ID No.169、SEQ ID No.170、SEQ ID No.171、SEQ ID No.172、SEQ ID No.173或SEQ ID No.174所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有90％序列同源的氨基酸序列；进一步更佳地，所述的重链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.154、SEQ IDNo.155、SEQ ID No.156、SEQ ID No.157、SEQ ID No.162、SEQ ID No.163、SEQ ID No.164、SEQ ID No.165、SEQ ID No.166、SEQ ID No.167或SEQ ID No.168所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有95％序列同源的氨基酸序列；所述的轻链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.158、SEQ ID No.159、SEQ ID No.160、SEQ ID No.161、SEQ ID No.169、SEQ ID No.170、SEQ ID No.171、SEQ ID No.172、SEQ ID No.173或SEQ ID No.174所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有95％序列同源的氨基酸序列；最佳地，所述的重链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.154、SEQ ID No.155、SEQ ID No.156、SEQ IDNo.157、SEQ ID No.162、SEQ ID No.163、SEQ ID No.164、SEQ ID No.165、SEQ ID No.166、SEQ ID No.167或SEQ ID No.168所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有99％序列同源的氨基酸序列；所述的轻链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.158、SEQ IDNo.159、SEQ ID No.160、SEQ ID No.161、SEQ ID No.169、SEQ ID No.170、SEQ ID No.171、SEQ ID No.172、SEQ ID No.173或SEQ ID No.174所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有99％序列同源的氨基酸序列.
较佳地，所述的重链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.154、SEQID No.155、SEQ ID No.156、SEQ ID No.157、SEQ ID No.162、SEQ ID No.163、SEQ IDNo.164、SEQ ID No.165、SEQ ID No.166、SEQ ID No.167或SEQ ID No.168所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有80％序列同源的氨基酸序列；所述的轻链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.158、SEQ ID No.159、SEQ ID No.160、SEQ ID No.161、SEQ IDNo.169、SEQ ID No.170、SEQ ID No.171、SEQ ID No.172、SEQ ID No.173或SEQ ID No.174所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有80％序列同源的氨基酸序列；更佳地，与如序列表中SEQ ID No.154、SEQ ID No.155、SEQ ID No.156、SEQ ID No.157、SEQ ID No.162、SEQID No.163、SEQ ID No.164、SEQ ID No.165、SEQ ID No.166、SEQ ID No.167或SEQ IDNo.168所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有90％序列同源的氨基酸序列；所述的轻链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.158、SEQ ID No.159、SEQ ID No.160、SEQID No.161、SEQ ID No.169、SEQ ID No.170、SEQ ID No.171、SEQ ID No.172、SEQ IDNo.173或SEQ ID No.174所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有90％序列同源的氨基酸序列；进一步更佳地，与如序列表中SEQ ID No.154、SEQ ID No.155、SEQ ID No.156、SEQ IDNo.157、SEQ ID No.162、SEQ ID No.163、SEQ ID No.164、SEQ ID No.165、SEQ ID No.166、SEQ ID No.167或SEQ ID No.168所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有95％序列同源的氨基酸序列；所述的轻链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQ ID No.158、SEQ IDNo.159、SEQ ID No.160、SEQ ID No.161、SEQ ID No.169、SEQ ID No.170、SEQ ID No.171、SEQ ID No.172、SEQ ID No.173或SEQ ID No.174所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有95％序列同源的氨基酸序列；最佳地，与如序列表中SEQ ID No.154、SEQ ID No.155、SEQID No.156、SEQ ID No.157、SEQ ID No.162、SEQ ID No.163、SEQ ID No.164、SEQ IDNo.165、SEQ ID No.166、SEQ ID No.167或SEQ ID No.168所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有99％序列同源的氨基酸序列；所述的轻链可变区的氨基酸序列为，与如序列表中SEQID No.158、SEQ ID No.159、SEQ ID No.160、SEQ ID No.161、SEQ ID No.169、SEQ IDNo.170、SEQ ID No.171、SEQ ID No.172、SEQ ID No.173或SEQ ID No.174所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列有99％序列同源的氨基酸序列。
较佳地，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.133所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.137所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.133所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQID No.138所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.133所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.139所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.133所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.140所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.134所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.137所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.134所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.138所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.134所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.139所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.134所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.140所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.135所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.137所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.135所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.138所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.135所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.139所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.135所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.140所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.136所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.137所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.136所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.138所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.136所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.139所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.136所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.140所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.144所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.145所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.146所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.147所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.148所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.150所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.151所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.152所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.153所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.141所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.141所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.150所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.141所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.151所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.141所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.152所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.141所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.153所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.142所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.142所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.150所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.142所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.151所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.142所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.152所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.142所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.153所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.145所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.148所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.146所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.148所示的序列；或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.147所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.148所示的序列。
综上所述，上述氨基酸序列的编号如表1-1所示。
表1-1.人源化EGFRvIII抗体蛋白序列编号
其中，表1-1中的数字即为序列表中序列号，如h75G7C6-1的重链蛋白可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.133，而h75G7C6-1的轻链蛋白可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.137。
其中，c75G7C6-1的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如序列表中SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.184和SEQ ID NO.4所示。
c75G7C6-2的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如序列表中SEQ ID NO.2、SEQID NO.186和SEQ ID NO.4所示。
较佳地，所述的人源化抗EGFRvIII抗体还包括人源抗体重链恒定区和/或人源抗体轻链恒定区。所述的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成人源化抗体全长蛋白。其中所述的人源化抗体重链恒定区为本领域常规，可以包含衍生自人恒定区的恒定区，其进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区；所述的人源化抗体轻链恒定区为本领域常规，可以包含衍生自人恒定区的恒定区，其进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
本发明的人源化抗EGFRvIII抗体以使用各种方法中的任何一种进行制备，包括互补决定区(CDRs)的镶饰、移植、缩短的CDRs的移植、特异性决定区(SDRs)的移植、和Frankenstein装配。其中，特异性决定区(SDRs)是与抗原直接相互作用的CDRs内的残基。SDRs对应高变残基。参见Padlan等人(1995)FASEB J.9:133-139)。
本发明的代表性人源化抗EGFRvIII抗体的制备在实施例1中得到描述。
本发明中所述的人源抗体广义上也是一类嵌合抗体，其中负责抗原结合的可变区残基，包括衍生自非人物种的互补决定区、缩短的互补决定区、或参与抗原结合的任何其它残基；而其余可变区残基如，构架区的残基和恒定区至少部分衍生自人抗体序列。人源化抗体的构架区残基和恒定区残基的一个子集可以衍生自非人来源。人源化抗体的可变区也描述为人源化的轻链可变区和/或重链可变区。非人物种一般是用于由抗原免疫接种的物种，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类、或其他非人哺乳动物物种。人源化抗体一般比传统嵌合抗体的免疫原性小，并且在给人施用后显示出改善的稳定性。
所述的人源化抗体还包括超人源化抗体，它是一种人源化抗体的制备方法，此方法不依赖于将人构架序列作为分析点，而是依赖于比较非人抗体的规范CDR结构类型和人抗体的CDR结构类型，尤其是人胚系序列所编码的人抗体，从中识别出可以得到适宜的人构架序列的候选的人抗体序列。例如，人残基可以置换CDRs中的非人残基，其中一个或多个变化已引入CDRs中。镶饰(veneering)的一个前提是鼠源抗体可变区的免疫原性起源于它的表面残基，且残基的运动性和溶剂的可及性是其成为抗原决定簇的基本条件。根据对现有的抗体晶体结构数据的分析结果统计，在序列配对位置上，人和鼠的抗体可变区残基的相对溶剂可及性分布的保真度达98％，这说明在异种间诱导免疫反应的残基是由其余的种特异性溶剂可及表面残基引起的。因此将鼠特异性表面残基换成人源性的，就可以模拟人源抗体的表面轮廓，逃避人体免疫系统的识别，达到人源化的目的。简单来说，镶饰基于通过用人氨基酸序列重建抗体的溶剂可及的表面来减少在啮齿类动物或其他非人抗体中的潜在免疫原性的氨基酸序列的概念。参见Padlan(1991)Mol.Immunol.28:489-980.通过鉴定非人抗体中暴露在表面的溶剂可及性残基的外部构架区残基(所述残基不同于人抗体的构架区中相同位置上的那些残基)，并用占据人抗体中的那些相同位置的氨基酸替换所鉴定的残基，以进行镶饰，即镶饰的抗体，其表面残基主要是人源序列，而包裹在内部的残基主要是最初的鼠源序列。CDRs的移植通过用供体抗体(如，非人抗体)的CDRs替换受体抗体(例如，包含所需构架残基的人抗体或其他抗体)的一个或多个CDRs来进行。受体抗体可以基于在候选受体抗体和供体抗体之间的构架残基的相似性进行选择。例如，根据Frankenstein方法，鉴定与相关的非人抗体的各构架区具有实质上的序列同源性的人构架区，并且将非人抗体的CDRs移植到这些不同的人构架区的复合物上。可以结合上述方法，以产生任何所需序列的抗EGFRvIII抗体。
本发明中所述的EGFRvIII抗体较佳地为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)、单域抗体(single domain antibody，sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种，以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白，其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地，所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段，其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地，所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)。
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体，其包括重链可变区和重链恒定区。
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体，其仅包括重链可变区。
本发明的所述EGFRvIII抗体还包括超人源化抗体、双抗体(diabody)等。
其中，所述EGFRvIII抗体的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为：从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法：将编码所述EGFRvIII抗体并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述EGFRvIII抗体。
本发明还提供一种核酸，其编码上述的EGFRvIII抗体。
较佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.105、SEQ ID No.107、SEQ ID No.109、SEQ ID No.111、SEQ ID No.113、SEQ ID No.115、SEQ IDNo.117、SEQ ID No.119、SEQ ID No.121、SEQ ID No.123、SEQ ID No.125、SEQ ID No.127、SEQ ID No.129、SEQ ID No.185、SEQ ID No.154、SEQ ID No.155、SEQ ID No.156、SEQ IDNo.157、SEQ ID No.162、SEQ ID No.163、SEQ ID No.164、SEQ ID No.165、SEQ ID No.166、SEQ ID No.167或SEQ ID No.168所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.106、SEQ ID No.108、SEQ ID No.110、SEQ ID No.112、SEQ IDNo.114、SEQ ID No.116、SEQ ID No.118、SEQ ID No.120、SEQ ID No.122、SEQ ID No.124、SEQ ID No.126、SEQ ID No.128、SEQ ID No.130、SEQ ID No.158、SEQ ID No.159、SEQ IDNo.160、SEQ ID No.161、SEQ ID No.169、SEQ ID No.170、SEQ ID No.171、SEQ ID No.172、SEQ ID No.173或SEQ ID No.174所示。
更佳地，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.105所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.106所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.107所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.108所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.109所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.110所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.111所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.112所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.113所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.114所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.115所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.116所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.117所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.118所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.119所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.120所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.121所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.122所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.123所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.124所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.125所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No126.所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.127所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.128所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.129所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.130所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.185所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.106所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.154所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.158所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.154所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.159所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.154所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.160所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.154所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.161所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.155所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.158所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.155所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.159所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.155所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.160所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.155所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.161所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.156所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.158所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.156所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.159所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.156所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.160所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.156所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.161所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.157所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.158所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.157所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.159所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.157所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.160所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.157所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.161所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.165所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.166所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.167所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.168所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.169所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.171所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.172所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.173所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.174所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.162所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.162所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.171所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.162所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.172所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.162所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.173所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.162所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.174所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.163所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.163所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.171所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.163所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.172所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.163所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.173所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.163所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.174所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.166所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.169所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.167所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.169所示；或者，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.168所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.169所示。
综上所述，上述核苷酸序列的编号如表1-2和表2所示。
表1-2.EGFRvIII抗体基因序列编号
其中，表1-2中的数字即为序列表中序列号，如h75G7C6-1的重链蛋白可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.154，而h75G7C6-1的轻链蛋白可变区的核苷酸序列为SEQ IDNo.158。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述人源化抗EGFRvIII抗体的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述人源化抗EGFRvIII抗体的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述人源化抗EGFRvIII抗体的核酸可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该人源化抗EGFRvIII抗体的核酸的一个或多个核苷酸在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
表2EGFRvIII抗体基因序列编号
其中，表2中的数字即为序列表中序列号，如编码75G7C6的重链蛋白可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.105。
本发明中所述的互补决定区(CDRs)是参与抗原结合的抗体可变区的残基。用于标识CDRs的几种编号系统是常用的，包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。概括地说，Kabat定义是基于序列的变异性、Chothia定义是基于结构环区的位置，AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折中。根据Kabat、Chothia或AbM算法，轻链可变区有三个CDR区，其CDR1位于由第24-34位氨基酸(CDR1-L)、CDR2位于第50-56位氨基酸(CDR2-L)、CDR3位于第89-97位氨基酸(CDR3-L)。由于可变区的长度变化，在不同的中枢或不同的亚群中，第27位可有1-6个氨基酸，第95位也可有1-6个氨基酸，它们在原编号的基础上加上英文字母进行编位，如：27A、27B、95A、95B等。根据Kabat定义，重链可变区的CDRs由在第31和35B位(CDR1-H)、第50和65位(CDR2-H)、以及第95和102位(CDR3-H)的残基界定(根据Kabat编号)。根据Chothia定义，重链可变区的CDRs由第26和32位(CDR1-H)、第52和56位(CDR2-H)、以及第95和102位(CDR3-H)上的残基界定(根据Chothia编号)。根据AbM定义，重链可变区的CDRs由26和35B位(CDR1-H)、第50和58位(CDR2-H)、以及第95和102位(CDR3-H)的残基界定(根据Kabat编号)。与轻链可变区类似，在第35位、52位、82位及100位也可有多个氨基酸，以A、B、C……等编号。参见Martin等人(1989)Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 86:9268-9272；Martin等人(1991)Methods Enzymol.203:121-153；Pedersen等人(1992)lmmunomethods 1:126；ProteinStructure Prediction,Oxford University Press,Oxford,第141-172页。本发明中以下鼠源抗体的CDR编号系统为Chothia，后续的人源化抗体采用了Kabat编号系统。
其中，编码75G7C6的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ IDNo.105中的第76位至第96位；
编码75G7C6的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.105中的第154位至第171位；
编码75G7C6的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.105中的第295位至第339位；
编码75G7C6的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.106中的第70位至第105位；
编码75G7C6的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.106中的第151位至第171位；
编码75G7C6的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.106中的第268位至第294位；
编码63A10A7的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.107中的第76位至第96位；
编码63A10A7的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.107中的第154位至第171位；
编码c75G7C6-1的重链蛋白可变区的CDR2的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.185中的第154位至第171位所示；
编码c75G7C6-2的重链蛋白可变区的CDR2的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.187中的第154位至第171位所示。
编码63A10A7的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.107中的第295位至第318位；
编码63A10A7的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.108中的第70位至第102位；
编码63A10A7的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.108中的第148位至第168位；
编码63A10A7的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.108中的第265位至第291位。
编码64F1F8的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.109中的第76位至第96位；
编码64F1F8的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.109中的第154位至第171位；
编码64F1F8的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.109中的第295位至第318位；
编码64F1F8的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.110中的第70位至第99位；
编码64F1F8的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.110中的第145位至第165位；
编码64F1F8的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.110中的第262位至第288位。
编码7E5-2A9的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.111中的第76位至第96位；
编码7E5-2A9的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.111中的第154位至第171位；
编码7E5-2A9的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.111中的第295位至第309位；
编码7E5-2A9的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.112中的第70位至第120位；
编码7E5-2A9的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.112中的第166位至第186位；
编码7E5-2A9的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.112中的第283位至第309位。
编码43H6A1的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.113中的第127位至第150位；
编码43H6A1的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.113中的第208位至第222位；
编码43H6A1的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.113中的第346位至第366位；
编码43H6A1的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.114中的第70位至第102位；
编码43H6A1的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.114中的第148位至第168位；
编码43H6A1的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.114中的第265位至第291位；
编码46C4A6的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.115中的第76位至第96位；
编码46C4A6的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.115中的第154位至第171位；
编码46C4A6的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.115中的第295位至第306位；
编码46C4A6的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.116中的第70位至第117位；
编码46C4A6的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.116中的第163位至第183位；
编码46C4A6的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.116中的第280位至第306位；
编码49G12G5的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.117中的第76位至第96位；
编码49G12G5的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.117中的第154位至第171位；
编码49G12G5的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.117中的第295位至第318位；
编码49G12G5的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.118中的第70位至第105位；
编码49G12G5的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.118中的第151位至第171位；
编码49G12G5的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.118中的第268位至第294位。
编码51G7C2的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.119中的第76位至第96位；
编码51G7C2的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.119中的第154位至第171位；
编码51G7C2的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.119中的第295位至第318位；
编码51G7C2的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.120中的第70位至第105位；
编码51G7C2的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.120中的第151位至第171位；
编码51G7C2的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.120中的第268位至第294位。
编码53D8H4的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.121中的第76位至第96位；
编码53D8H4的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.121中的第154位至第171位；
编码53D8H4的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.121中的第295位至第318位；
编码53D8H4的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.122中的第70位至第102位；
编码53D8H4的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.122中的第148位至第168位；
编码53D8H4的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.122中的第265位至第291位。
编码54D2G10的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.123中的第76位至第96位；
编码54D2G10的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.123中的第154位至第171位；
编码54D2G10的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.123中的第295位至第315位；
编码54D2G10的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.124中的第70位至第99位；
编码54D2G10的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.124中的第145位至第165位；
编码54D2G10的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.124中的第262位至第288位。
编码56F10G2的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.125中的第76位至第96位；
编码56F10G2的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.125中的第154位至第171位；
编码56F10G2的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.125中的第295位至第315位；
编码56F10G2的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.126中的第70位至第99位；
编码56F10G2的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.126中的第145位至第165位；
编码56F10G2的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.126中的第262位至第288位。
编码59G3F12的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.127中的第76位至第99位；
编码59G3F12的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.127中的第157位至第171位；
编码59G3F12的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.127中的第295位至第318位；
编码59G3F12的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.128中的第70位至第99位；
编码59G3F12的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.128中的第145位至第165位；
编码59G3F12的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.128中的第262位至第288位。
编码64B11F2的重链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.129中的第76位至第96位；
编码64B11F2的重链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.129中的第154位至第171位；
编码64B11F2的重链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.129中的第295位至第315位；
编码64B11F2的轻链蛋白可变区中CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.130中的第70位至第102位；
编码64B11F2的轻链蛋白可变区中CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.130中的第148位至第168位；
编码64B11F2的轻链蛋白可变区中CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.130中的第265位至第291位。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中，所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地，所述宿主细胞为E.coli TG1或BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
本发明还提供一种所述EGFRvIII抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得所述EGFRvIII抗体。
本发明还提供一种免疫偶联物，其包括共价附着至细胞毒剂的上述EGFRvIII抗体。
较佳地，所述的免疫偶联物中，上述的1当量的蛋白质通过x当量接头与y当量的细胞毒剂相连，具有式1的结构，
Ab-(L)x-(D)y
式1
其中，Ab为上述的EGFRvIII抗体；L为接头；D为细胞毒剂；所述x为本领域常规的交联度，x为自然数，优选为1～20；y为大于的自然数，优选为1～20的整数；x和y各自独立地优选为2w，w为1～5的整数、进一步优选为3～4；x和y的比例优选为1:1。
所述L是本领域常规的接头(或称交联剂或偶联剂)。所述L包含2个官能团，即与抗体反应的基团，和与药物反应的基团(例如，醛或酮)。
药物经由接头分子与上述的EGFRvIII抗体偶联。所述L进入细胞后释放，其包括但不限于如下的官能团，活性酯、碳酸盐类、氨基甲酸酯类、亚胺磷酸酯、肟类、腙类、缩醛类、原酸酯类、氨基类、小肽段或核苷酸片段，又例如马来酰亚胺基己酰(maleimidocaproyl，MC)、马来酰亚胺基己酰-L-缬氨酸-L-瓜氨酸对氨基苄醇(MC-VC-PAB)或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)。
较佳地，所述L主要含有式2的结构，其为L中离去基团离去后对应的剩余部分：
(CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)＝Q-Sp)
式2
其中，Alk1和Alk2独立地是键或分支的或不分支的(C1-C10)亚烷基链；Sp1是-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-、-NR’-、-N(CH2CH2)2N-、或-X-Ar’-Y-(CH2)n-Z，其中X、Y和Z是独立的键、-NR’-、-S-或-O-，条件是当n＝0时，Y和Z中的至少一个必须是键，且Ar’是由(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-(CH2)nCOOR’、S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’或-S(CH2)nCONHR’的1、2或3个基团任选取代的1，2-、1，3-或1，4-亚苯基，n是0-5的整数，条件是当Alk1是键时，Sp1是键；R’是由-OH、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、(C1-C3)二烷基氨基、或(C1-C3)三烷基铵-A的一个或2个基团任选取代的分支的或不分支的(C1-C5)链，其中A是完成盐的药学上可接受的阴离子；Ar是由(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR”或-S(CH2)nCONHR’的1、2或3个基团任选取代的1,2-、1,3-或1,4-亚苯基，其中n和R’如上述的定义，或Ar是1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-亚萘基，其中亚萘基或吩噻嗪各任选地由(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、或-S(CH2)nCONHR’的1、2、3或4个基团取代，其中n和R’如上文定义，条件是当Ar是吩噻嗪时，Sp1是仅与氮连接的键；
Sp2是键、-S-或-O-，条件是当Alk2是键时，Sp2是键；
Z1是H、(C1-C5)烷基、或由(C1-C5)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’或-S(CH2)nCONHR’的1、2、或3个基团任选取代的苯基，其中n和R’如上文定义；
Sp是直链或支链二价或三价(C1-C18)基团，二价或三价芳基或杂芳基基团，二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基基团，二价或三价芳基或杂芳基-芳基(C1-C18)基团，二价或三价环烷基或杂环烷基-烷基(C1-C18)基团，或二价或三价(C2-C18)不饱和的烷基基团，其中杂芳基优选是呋喃基、噻吩基，N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、噁唑基、嘧啶基。喹啉基、异喹啉基、N-甲基咔唑基、氨基豆素基、或吩嗪基、并且其中如果Sp是三价基团，那么Sp还可以由低级(C1-C5)二烷基氨基、低级(C1-C5)烷氧基、羟基、或低级(C1-C5)烷硫基任选取代；且，Q是＝NHNCO-、＝NHNCS-、＝NHNCONH-、＝NHNCSNH-或＝NHO-。
优选地，Alk1是分支或不分支的(C1-C5)亚烷基链，Sp1是键、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-或-NR’,其中R’如上文定义，条件是当Alk1是键时，Sp1是键；
Ar是由(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’或-S(CH2)nCONHR’的1、2或3个基团任选取代的1,2-、1,3-或1,4-亚苯基，其中n和R’如上文定义，或Ar是各自由C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’或-S(CH2)nCONHR’的1、2、3或4个基团任选取代的1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、1,8-、2,3-、2,6-或2,7-亚萘基。
Z1是(C1-C5)烷基、或由(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR’、-CONHR’、-O(CH2)nCOOR’、-S(CH2)nCOOR’、-O(CH2)nCONHR’或-S(CH2)nCONHR’的1、2、或3个基团任选取代的苯基；Alk2和Sp2均为键；且Sp和Q如仅在上文中所定义的。上述的键的含义为共价键。
所述L为马来酰亚胺基己酰(maleimidocaproyl，MC)。
所述D可为本领域常规的细胞毒剂，较佳地选自细胞毒素、化学治疗剂、放射性同位素、治疗性核酸、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖促凋亡剂或细胞溶解酶。
其中，所述细胞毒素为本领域常规的细胞毒素，一般指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的活性剂。较佳地选自抗生素、微管蛋白聚合的抑制剂、烷化剂、蛋白合成抑制剂、蛋白激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白激酶、磷酸酶、拓扑异构酶或细胞周期蛋白。更佳地选自多柔比星、柔红霉素、依达比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、诺加霉素、美诺立尔、吡柔比星、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他滨、曲氟尿苷、安西他滨、依诺他滨、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、喷司他丁、溴尿苷、卡培他滨、克拉屈滨、地西他滨、氟尿苷、氟达拉滨、谷氏菌素、嘌呤霉素、替加氟、噻唑羧胺核苷、阿霉素、顺铂、卡铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、长春碱、长春新碱、博来霉素、氮芥、强的松、甲基苄肼、氨甲喋呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素、泰素类似物、铂类(如顺铂和卡铂)、丝裂霉素、噻替派、紫杉烷、道诺红菌素、放线菌素、安曲霉素、氮丝氨酸、它莫西芬、多拉司他汀、奥瑞他汀及其衍生物、哈米特林、埃斯波霉素或美登素类化合物，进一步更佳地选自甲基奥瑞他汀E(MMAE)、甲基奥瑞他汀F(MMAF)或N2’-脱乙酰-N2’-3-巯基-1氧代丙基-美登素(DM1)。最佳地为甲基奥瑞他汀F(MMAF)或者甲基奥瑞他汀E(MMAE)。
其中，所述化学治疗剂为本领域常规的化学治疗剂，较佳地选自烷化剂、烷基磺酸酯类化学治疗剂、氮丙啶类化学治疗剂、乙烯酰胺类和甲基密胺类化学治疗剂、氮芥、硝基脲类化学治疗剂、抗生素、抗代谢物、叶酸类化学治疗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂、美登醇、多糖复合物、紫杉烷、铂类似物或类视黄醇，或者，其在药学上可接受的盐、酸和衍生物。
所述的烷化剂为本领域常规的烷化剂，较佳地选自噻替派或环磷酰胺。所述的烷基磺酸酯类化学治疗剂为本领域常规的烷基磺酸酯类化学治疗剂，较佳地选自白消安、英丙舒凡或哌泊舒凡。所述的氮丙啶类化学治疗剂为本领域常规的氮丙啶类化学治疗剂，较佳地选自氮丙唳如、卡巴醌、美妥替哌或乌瑞替派。所述乙烯酰胺类和甲基密胺类化学治疗剂为本领域常规的乙烯酰胺类和甲基密胺类化学治疗剂，较佳地选自六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺或三羟甲蜜胺。所述的氮芥为本领域常规的氮芥，较佳地选自苯丁酸氮芥、萘氮芥、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺、氮芥、氧氮芥盐酸盐、苯丙氨酸氮芥、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺或尿嘧啶氮芥。所述硝基脲类化学治疗剂为本领域常规的硝基脲类化学治疗剂，较佳地选自卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀或雷莫司汀。所述抗生素为本领域常规的抗生素，较佳地选自阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、加力车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、依达比星、发波霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、静司他丁或佐柔比星。所述的抗代谢物为本领域常规的抗代谢物，较佳地选自氨甲喋呤或5-氟尿嘧啶(5-FU)。所述的叶酸类化学治疗剂为本领域常规的叶酸类化学治疗剂，较佳地选自二甲叶酸、蝶罗呤或三甲曲沙。所述的嘌呤类似物为本领域常规的嘌呤类似物，较佳地选自氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤或硫鸟嘌呤。所述的嘧啶类似物为本领域常规的嘧啶类似物，较佳地选自安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷或5-EU。所述的雄激素为本领域常规的雄激素，较佳地选自卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷或睾内酯。所述的抗肾上腺素为本领域常规的抗肾上腺素，较佳地选自安鲁米特、米托坦或曲洛司坦。所述的叶酸补充剂为本领域常规的叶酸补充剂，较佳地选自亚叶酸、醋葡全内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基酮戊酸、安吖啶、阿莫司汀、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、埃坡西龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖或氯尼达明。所述的美登醇为本领域常规的美登醇，较佳地选自美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基酰肼或丙卡巴肼。所述的多糖复合物为本领域常规的多糖复合物，较佳地选自雷佐生、根霉素、西佐喃、锗螺胺、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌2，2′，2″-三氯三乙胺、单端孢霉烯族毒素、乌拉坦、长春地辛、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、gacytosine、阿糖胞苷、环磷酰胺或噻替派。更佳地选自T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A或anguidine。所述紫杉烷为本领域常规的紫杉烷，较佳地选自紫杉醇、无氢化蓖麻油、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American PharmaceuticalPartners，Schaumberg，Illinois)、多西他赛、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫代鸟嘌呤、巯嘌呤或甲氨蝶呤。所述的铂类似物为本领域常规的铂类似物，较佳地选自顺铂、卡铂、长春碱、依托泊苷、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、诺安托、替尼泊苷、依达曲沙、道诺霉素、氨基蝶呤、卡培他滨伊班膦酸盐、CPT-11、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000或二氟甲基鸟氨酸。所述的类视黄醇为本领域的类视黄醇，较佳地为视黄酸。
其中，所述放射性同位素为本领域常规的放射性同位素，较佳地，其与上述EGFRvIII抗体直接结合，或者通过螯合剂与上述EGFRvIII抗体结合。更佳地，其与所述EGFRvIII抗体的半胱氨酸残基直接结合。较佳地，所述放射性同位素选自适于放射治疗的α-发射体、β-发射体和俄歇电子以及适于诊断的正电子发射体或γ-发射体。更佳地，所述放射性同位素选自18氟、64铜、65铜。67镓、68镓、77溴、80m溴、95钌、97钌、103钌、105钌、99m锝、107汞、203汞、123碘、124碘、125碘、126碘、131碘、133碘、111铟、113铟、99m铼、105铼、101铼、186铼、188铼、121m碲、99锝、122m碲、125m碲、165铥、167铥、168铥、90钇、213铋、213铅或225锕，或者其衍生的氮化物或氧化物。
其中，所述治疗性核酸为本领域常规的核酸，较佳地为编码免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂或促凋亡剂的基因。所述治疗剂包括所述治疗剂、其衍生物和所述治疗剂在药学上可接受的盐、酸及衍生物。
其中，所述的免疫调节剂为本领域常规的免疫调节剂，即引发免疫应答，包括体液免疫应答(例如抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫应答(例如淋巴细胞增殖)的试剂。较佳地选自细胞因子、生长因子、激素、抗激素药、免疫抑制剂或皮质类固醇。所述细胞因子为本领域常规的细胞因子，较佳地选自黄嘌呤、白介素或干扰素。所述的生长因子为本领域常规的生长因子，较佳地选自TNF、CSF、GM-CSF或G-CSF。所述的激素为本领域常规的激素，较佳地选自雌激素、雄激素或孕激素。更佳地，所述的雌激素为已烯雌酚或雌二醇。更佳地，所述的雄激素为睾酮或氟甲睾酮。更佳地，所述的孕激素为乙酸甲地孕酮或乙酸甲羟孕酮。所述的皮质类固醇为本领域常规的皮质类固醇，较佳地选自强的松、地塞米松或化可的松。所述抗激素药为本领域常规的抗激素药，其能阻断激素对肿瘤的作用，抑制细胞因子生产，下调自身抗原表达、或掩蔽MHC抗原的免疫抑制剂。较佳地选自抗雌激素药、抗雄激素药或抗肾上腺素药。更佳地，所述抗雌激素药选自它莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑类、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬或托瑞米芬。所述抗雄激素药选自氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林或戈舍瑞林。所述免疫抑制剂为本领域常规的免疫抑制剂，较佳地选自2-氨基-6芳基-5取代的嘧啶类、硫唑嘌呤、环磷酰胺、溴隐亭、达那唑、氨苯砜、戊二醛、针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体、环孢菌素A、类固醇例如糖皮质类固醇、链激酶、TGFb、雷帕霉素、T细胞受体、T细胞受体片段、细胞因子受体拮抗剂或T细胞受体抗体。更佳地，所述细胞因子受体拮抗剂选自抗干扰素抗体、抗IL10抗体、抗TNFa抗体或抗IL2抗体。
其中，所述的抗血管生成剂为本领域常规的抗血管生成剂，较佳地选自法尼基转移酶抑制剂、COX-2抑制剂、VEGF抑制剂、bFGF抑制剂、类固醇硫酸酯酶抑制剂、白介素-24、凝血栓蛋白、metallospondin蛋白质、I类干扰素、白介素12、鱼精蛋白、血管他丁、层粘连蛋白、内皮他丁或催乳激素片段。更佳地为2-甲氧基雌二醇二氨基磺酸酯(2-MeOE2bisMATE)。
其中，所述抗增殖促凋亡剂为本领域常规的抗增殖促凋亡剂，较佳地选自PPAR-γ激活剂、类视黄醇、三萜类化合物、EGF受体抑制剂、端粒末端转移酶抑制剂、铁螯合剂、凋亡蛋白、Bcl-2和Bcl-X(L)的抑制剂、TNF-α/FAS配体/TNF相关的凋亡诱导配体及其信号传导的激活物或PI3K-Akt存活途径信号抑制剂。所述PPAR-γ激活剂为本领域常规的PPAR-γ激活剂，较佳地为环戊烯酮前列腺素(cyPGs)。所述三萜类化合物为本领域常规的三萜类化合物，较佳地选自环菠萝蜜烷、羽扇豆烷、乌苏烷、齐敦果烷、木栓烷、达玛烷、葫芦素、柠檬苦素类似物或三萜类化合物。所述EGF受体抑制剂为本领域常规的EGF受体抑制剂，较佳地选自HER4、雷帕霉素或1，25-二羟基胆钙化醇(维生素D)。所述的铁螯合物为本领域常规的铁螯合物，较佳地为3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲。所述的凋亡蛋白为本领域常规的凋亡蛋白，较佳地为鸡贫血病病毒的病毒蛋白质3-VP3。所述PI3K-Akt存活途径信号抑制剂为本领域常规的PI3K-Akt存活途径信号抑制剂，较佳地为UCN-01或格尔德霉素。
其中，所述细胞溶解酶为本领域常规的细胞溶解酶，较佳地为RNA酶。
本发明优选地，式1中x＝y＝n；所述D为微管蛋白合成酶抑制剂——甲基奥瑞他汀F，(MMAF)，且所述接头L为马来酰亚胺基己酰(maleimidocaproyl，MC)，所述免疫偶联物的结构如式3所示，
其中，mAb为上述的EGFRvIII抗体。其中，n为自然数，优选为1～20的整数，更优选为2w，w为1～5的整数、进一步优选为3～4。
所述的免疫偶联物的制备方法为本领域常规，较佳地采用Doronina，2006，Bioconjugate Chem.17,114-124所记载的制备方法。较佳地，所述的制备方法产生具有最低限度的低偶联级分(LCF)小于10％的免疫偶联物。
在本发明一较佳实施例中，所述的制备方法包括以下的步骤：将上述EGFRvIII抗体经过pH 6.5～8.5的硼酸钠缓冲液透析后，加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)，其中TCEP与上述EGFRvIII抗体的摩尔比比率为2～10，室温下还原2～4小时，经过G25脱盐填料去除多余的TCEP，加入一定比例的MC-MMAF(药物/抗体比率为5-20)反应4小时。再加入半胱氨酸用以中和多余的药物，并通过G25除去多余的小分子。得到纯化的抗体药物偶联物(偶联方法参见Doronina，2006，Bioconjugate Chem.17,114-124)。
所述的免疫偶联物能够以本领域所知的任何物理形态而存在，较佳地为澄清溶液。
本发明还提供一种药物组合物，其包括上述的EGFRvIII抗体或者免疫偶联物，以及药学可接受的载体。
所述的药学可接受的载体为本领域常规的载体，所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述EGFRvIII或者上述免疫偶联物，和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为肠胃外施用、注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，即可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。更佳地为经由血管内、皮下、腹膜内或肌内施用。较佳地，所述药物组合物还可以作为气雾剂或粗喷雾剂施用，即经鼻施用；或者，鞘内、髓内或心室内施用。更佳地，所述的药物组合物还可以透皮、经皮、局部、肠内、阴道内、舌下或经直肠施用。
本发明所述的药物组合物的给药剂量水平可以根据达到所需诊断或治疗结果的组合物量而调整。施用方案也可以为单次注射或多次注射，或进行调整。所选择的剂量水平和方案依赖于包括所述药物组合物的活性和稳定性(即，半衰期)、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、待检测和/或治疗的疾病或病症、以及待治疗的受试者的健康状况和先前医疗史等各种因素而进行合理地调整。
对于本发明的所述药物组合物的治疗有效剂量可以最初在细胞培养实验或动物模型例如啮齿类动物、兔、犬、猪和/或灵长类动物中进行估计。动物模型也可以用于测定合适的施用浓度范围和途径。随后可以用于确定在人中施用的有用剂量和途径。一般地，施用有效量或剂量的确定和调整以及何时和如何进行此类调整的评估为本领域技术人员已知。
对于组合疗法，上述EGFRvIII抗体、上述免疫偶联物和/或另外的治疗或诊断剂可以各自作为单一药剂，在适合于执行预期治疗或诊断的任何时间范围内进行使用。因此，这些单一药剂可以基本上同时(即作为单一制剂或在数分钟或数小时内)或以按顺序连续施用。例如，这些单一药剂可以在一年内，或10、8、6、4或2个月内，或4、3、2、或1周内，或5、4、3、2或1天内施用。
关于制剂、剂量、施用方案和可测量的治疗结果的另外指导，参见Berkow等人(2000)The Merck Manual of Medical Information(Merck医学信息手册)和Merck&Co.Inc.,Whitehouse Station,New Jersey；Ebadi(1998)CRC Desk Reference ofClinical Pharmacology(临床药理学手册)等著作。
本发明还提供一种上述抗体、上述偶联物或者上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供一种检测过表达EGFRvIII蛋白的细胞的方法，包括如下的步骤：将上述的EGFRvIII抗体与待检样品在体外接触，检测所述的EGFRvIII抗体与所述待检样品的结合即可。
本发明还提供一种检测过表达EGFRvIII蛋白的细胞的组合物，其包括上述的EGFRvIII抗体作为活性成分。
本发明还提供一种上述抗体、免疫偶联物或者药物组合物在制备预防或治疗与EGFRvIII表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用；较佳地，所述的与EGFRvIII表达或功能异常相关的疾病为肿瘤，所述肿瘤优选膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌或者肾癌。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的蛋白质是一种EGFRvIII抗体，其与EGFRvIII蛋白具有高度亲和力，能够在蛋白水平和细胞水平结合EGFRvIII蛋白受体的胞外区。所述的EGFRvIII抗体与MC-MMAF等小分子化合物偶联后得到的抗体交联药，能够有效的对EGFRvIII阳性细胞进行细胞毒杀伤作用。通过EGFRvIII抗体把小分子毒素，如MMAF，通过内吞作用带入细胞，并在细胞内降解释放小分子化合物，从而起到细胞毒的作用。因此所述的EGFRvIII抗体能够用于抗体交联药的制备、有效杀伤肿瘤细胞或，能够运用于治疗肿瘤的药物的制备中。
附图说明
图1为人EGFRvIII蛋白转染的CHO-K1细胞FACS筛选检测结果。
图2为人EGFR蛋白转染的CHO-K1细胞FACS筛选检测结果。
图3为人EGFRvIII蛋白转染的U87MG细胞FACS筛选检测结果。
图4为人EGFRvIII蛋白转染的293F细胞FACS筛选检测结果。
图5A和5B为ELISA检测EGFRvIII蛋白免疫后小鼠血清抗体效价情况。
图6为ELISA检测EGFRvIII抗体与人EGFRvIII-hFc蛋白的结合反应。
图7A为FACS检测EGFRvIII抗体与U87MG-hEGFRvIII的结合反应；图7B为FACS检测EGFRvIII抗体与A431的结合反应；图7C为FACS检测EGFRvIII抗体与U87MG的结合反应；图7D为FACS检测EGFRvIII抗体与HEB的结合反应。
图8A为EGFRvIII抗体-MMAF抗体偶联药对U87MG-EGFRvIII的细胞杀伤作用；图8B为EGFRvIII抗体-MMAF抗体偶联药对A431的细胞杀伤作用；图8C为EGFRvIII抗体-MMAF抗体偶联药对U87MG的细胞杀伤作用；图8D为EGFRvIII抗体-MMAF抗体偶联药对HEB的细胞杀伤作用。
图9A为FACS检测EGFRvIII抗体与人类正常组织HFF-1细胞系的结合反应；图9B为FACS检测EGFRvIII抗体与人类正常组织HFL-I细胞系的结合反应；图9C为FACS检测EGFRvIII抗体与人类正常组织QSG-7701细胞系的结合反应；图9D为FACS检测EGFRvIII抗体与人类正常组织HEEC细胞系的结合反应；图9E为FACS检测EGFRvIII抗体与人类正常组织HEB细胞系的结合反应；图9F为FACS检测EGFRvIII抗体与人类正常组织WPMY-1细胞系的结合反应；图9G为FACS检测EGFRvIII抗体与人类正常组织MCF-10A细胞系的结合反应。
图10A为EGFR抗体(鼠抗80E11)对人类脑胶质瘤组织芯片免疫组化染色结果；图10B为EGFR抗体(鼠抗80E11)对人类正常组织芯片免疫组化染色结果；图10C为EGFRvIII抗体(鼠抗63A10)对人类脑胶质瘤组织芯片免疫组化染色结果；图10D为EGFRvIII抗体(鼠抗63A10)对人类正常组织芯片免疫组化染色结果；图10E为EGFRvIII抗体(鼠抗75G7)对人类脑胶质瘤组织芯片免疫组化染色结果；图10F为EGFRvIII抗体(鼠抗75G7)对人类正常组织芯片免疫组化染色结果。
图11为酶联免疫吸附实验(ELISA)检测嵌合抗体与EGFRvIII蛋白的结合。
图12A为FACS检测EGFRvIII嵌合抗体与U87MG-hEGFRvIII的结合反应；图12B为FACS检测EGFRvIII嵌合抗体与A431的结合反应；图12C为FACS检测EGFRvIII嵌合抗体与U87MG的结合反应；图12D为FACS检测EGFRvIII嵌合抗体与HEB的结合反应。
图13A为EGFRvIII抗体-MMAF抗体偶联药对U87MG-EGFRvIII的细胞杀伤作用；图13B为EGFRvIII抗体-MMAF抗体偶联药对A431的细胞杀伤作用；图13C为EGFRvIII抗体-MMAF抗体偶联药对U87MG的细胞杀伤作用；图13D为EGFRvIII抗体-MMAF抗体偶联药对HEB的细胞杀伤作用。
图14A为U87MG-EGFRvIII异种移植荷瘤小鼠肿瘤体积变化；图14B为U87MG-EGFRvIII异种移植荷瘤小鼠体重变化。
图15为75G7C6抗体重链可变区CDR2的NG突变后的抗体的ELISA结合活性鉴定。
图16为75G7C6抗体重链可变区CDR3的NG突变后的抗体的ELISA结合活性鉴定。
图17A为FACS检测75G7C6抗体重链可变区CDR2的NG突变后的抗体与CHOK-EGFRvIII细胞结合活性；图17B为FACS检测75G7C6抗体重链可变区CDR2的NG突变后的抗体与CHOK-EGFR细胞结合活性。
图18A为FACS检测75G7C6抗体重链可变区CDR3的DG突变成SG、EG或DA后的突变抗体与CHOK-EGFRvIII细胞结合活性；图18B为FACS检测75G7C6抗体重链可变区CDR3的DG突变成SG、EG或DA后的突变抗体与CHOK-EGFR细胞结合活性。
图19为人源化抗EGFRvIII抗体h75G7C6重链可变区h75G7C6.VH及其变体与嵌合抗体c75G7C6.VH及人种系VH外显子IGHV1-46*01/JH6b的序列比较，方框处为CDR。
图20为人源化抗EGFRvIII抗体h75G7C6轻链可变区h75G7C6.VL及其变体与嵌合抗体c75G7C6.VL及人种系VL外显子IGKV3-11*01/JK4的序列比较，方框处为CDR。
图21为人源化抗EGFRvIII抗体h63A10A7重链可变区h63A10A7.VH及其变体与嵌合抗体c63A10A7.VH及人种系VH外显子IGHV1-46*01/JH4的序列比较，方框处为CDR。
图22为人源化抗EGFRvIII抗体h63A10A7轻链可变区h63A10A7.VL及其变体与嵌合抗体c63A10A7.VL及人种系VL外显子IGKV1-39*01/JK2的序列比较，方框处为CDR。
图23A-C为ELISA检测人源化抗体h75G7C6变体与人EGFRvIII-hFc蛋白的结合反应。
图24A-E为ELISA检测人源化抗体h63A10A7变体与人EGFRvIII-hFc蛋白的结合反应。
图25A-C为FACS检测人源化抗体h75G7C6变体与U87MG-EGFRvIII细胞的结合反应。
图26A-E为FACS检测人源化抗体h63A10A7变体与U87MG-EGFRvIII细胞的结合反应。
图27为FACS检测人源化h75G7C6变体与表面表达EGFR的肿瘤细胞A431和正常人原代肝细胞的结合。
图28A-B为FACS检测人源化h63A10A7变体与表面表达EGFR的肿瘤细胞A431和正常人原代肝细胞的结合。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，一般为10～30℃。
实施例1EGFRvIII抗体的制备
(一)、免疫原A的制备
将含有编码人源EGFRvIII蛋白胞外区氨基酸序列(NCBI：NP_005219.2，缺失30-297位氨基酸)的核苷酸序列克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen，V044-50)并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。对HEK293细胞(购自Invitrogen)进行瞬时转染(PEI，Polysciences)并使用FreeStyle TM 293(Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。4天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，得含EGFRvIII蛋白胞外区的培养上清液。将培养上清液上样到蛋白A亲和层析柱(MabselectSure，购自GEHealthcare)，同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280nm)的变化。上样后用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)清洗蛋白A亲和层析柱直到紫外吸收值回到基线，然后用0.1M甘氨酸盐酸(pH2.5)洗脱，收集从蛋白A亲和层析柱上洗脱下来的带hFc标签的EGFRvIII蛋白(EGFRvIII-hFc)，用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)在4℃冰箱透析过夜。透析后的蛋白经0.22微米无菌过滤后分装于-80℃保存，即获得纯化的免疫原A。
(二)、免疫原B的制备
编码人源EGFRvIII全长氨基酸序列(NCBI：NP_005219.2，缺失30-297位氨基酸)和编码人源EGFR全长氨基酸序列(NCBI：NP_005219.2)的核苷酸序列被克隆到pIRES载体(购自Clontech)并制备质粒。对HEK293细胞系、U87MG细胞系和CHO-K1细胞系(均购自Invitrogen)进行质粒转染(PEI，购自Polysciences)后，在含0.5μg/ml的含10％(w/w)胎牛血清的DMEM培养基中选择性培养2周，用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃，5％(v/v)CO2培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用已知的EGFRvIII抗体(购自Absoluteantibody，#Ab00184-1.1)经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存，即获得免疫原B。具体选择结果如表3和图1所示，IgG亚型对照为小鼠IgG对照。表3说明，已经制得一系列EGFRvIII阳性表达的CHO-K1，U87MG以及293F细胞系，以及EGFR阳性表达的CHO-K1细胞系。图1～4中，横坐标为细胞荧光强度，纵坐标为细胞数。图1，2，3，4的结果说明，CHO-K1-hEGFRvIII 1G10、CHO-K1-hEGFR 3G2、U87MG-hEGFRvIII 2G2以及293F-hEGFRvIII 1C10为EGFRvIII高水平表达细胞株；CHO-K1-hEGFR 3G2为EGFR高水平表达细胞株。EGFR抗体也是通过相同的免疫途径得到，主要是为了作为对照，证明EGFRvIII抗体相比较EGFR抗体具有更好的组织特异性。
表3人源EGFRvIII蛋白的CHO-K1稳转细胞系FACS检测结果
表4人源EGFR蛋白的CHO-K1稳转细胞系FACS检测结果
表5人源EGFRvIII蛋白的HEK293F稳转细胞系FACS检测结果
表6人源EGFRvIII蛋白的U87MG稳转细胞系FACS检测结果
(三)、杂交瘤细胞的制备和抗体筛选
A、免疫原A免疫采用6～8周龄BALB/cAnNCrl小鼠或SJL/JorllcoCrl小鼠(购自上海斯莱克公司)，小鼠在SPF条件下饲养。初次免疫时，免疫原A蛋白用弗氏完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原A蛋白。加强免疫时，免疫原A蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后腹腔注射0.25毫升，即每只小鼠注射50微克免疫原A蛋白。初次免疫与第一次加强免疫之间间隔2周，以后每次加强免疫之间间隔3周。每次加强免疫1周后采血，用ELISA和FACS检测血清中免疫原A的抗体效价和特异性，结果如图5和表7-8所示。表7-8说明，经人源EGFRvIII-hFc免疫的小鼠的免疫后血清对免疫原均有不同程度的结合，呈现抗原抗体反应，其中最高稀释度在一百万左右。其中空白对照为1％(w/w)BSA，其中批次指第二次加强免疫后第七天的小鼠血清，表中的数据为OD450nm值。
表7ELISA检测EGFRvIII蛋白免疫后Balb/c小鼠血清抗体效价
表8ELISA检测EGFRvIII蛋白免疫后SJL小鼠血清抗体效价
B、免疫原B免疫采用6～8周龄BALB/cAnNCrl小鼠或SJL/JorllcoCrl小鼠(购自上海斯莱克公司)，小鼠在SPF条件下饲养。含有编码人源EGFRvIII全长氨基酸序列的核苷酸序列的pIRES质粒[参见实施例1步骤(二)]转染HEK293细胞系，得含有人源EGFRvIII的HEK293稳定细胞系293F-hEGFRvIII 1C10(转染使用X-treme GENE HP DNA TransfectionReagent，购自Roche公司，货号Cat#06 366 236 001，并按说明书操作)在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用DMEM基础培养基(购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(购自Invitrogen)37℃处理直至细胞从培养皿壁上可脱落，收集细胞。用DMEM基础培养基洗涤2次，进行细胞计数后将细胞用磷酸盐缓冲液(pH7.2)稀释至2╳107细胞每毫升。每只小鼠每次免疫时腹腔注射0.5毫升细胞悬液。第一次与第二次免疫之间间隔2周，以后每次免疫间隔3周。除第一次免疫以外，每次免疫1周后采血，用FACS检测血清中抗体效价和特异性。在第二次加强免疫后，FACS检测血清抗体效价达到1:1000以上。
A～B步骤完成前，将所选择的每只小鼠最后一次免疫腹腔注射100微克纯化的免疫原A(针对免疫原A进行免疫反应的小鼠)或免疫原B(针对免疫原B进行免疫反应的小鼠)，5天后处死小鼠，收集脾细胞。加入NH4OH至终浓度1％(w/w)，裂解脾细胞中掺杂的红细胞，获得脾细胞悬液。用DMEM基础培养基1000转每分钟离心清洗细胞3次，然后按照活细胞数目5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(购自ATCC)混合，采用高效电融合方法(参见METHODS INENZYMOLOGY,VOL.220)进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20％胎牛血清、1╳HAT的DMEM培养基中，所述百分比为质量百分比。然后按1╳105/200微升每孔加入到96孔细胞培养板中，放入5％CO2、37℃培养箱中，所述百分比为体积百分比。14天后用ELISA和Acumen(微孔板细胞检测法)筛选细胞融合板上清，将ELISA中OD450nm>1.0和Acumen中MFI值>100的阳性克隆扩增到24孔板，在含10％(w/w)HT胎牛血清，DMEM(invitrogen)在37℃，5％(v/v)CO2条件下扩大培养。培养3天后取24孔板中扩大培养的培养液进行离心，收集上清液，对上清液进行抗体亚型分析，用ELISA、FACS确定对EGFRvIII蛋白和EGFRvIII阳性细胞的结合活性(结合活性的检测方法请分别参见实施例3A和实施例3B)，以及抗小鼠抗体-MMAF间接细胞毒杀伤实验(间接细胞毒杀伤活性检测方法请分别参见实施例4)。
根据24孔板筛选结果，挑选ELISA实验中OD450nm>1.0、FACS实验中MFI值>50和间接细胞毒杀伤实验中杂交瘤细胞培养上清对EGFRvIII阳性细胞杀伤率达到50％的杂交瘤细胞为符合条件的阳性克隆，选择符合条件的杂交瘤细胞用有限稀释法在96孔板进行亚克隆，在含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中(购自invitrogen)37℃，5％(v/v)CO2条件下培养。亚克隆后10天用ELISA和Acumen进行初步筛选，挑选单个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。3天后用FACS确定抗原结合阳性并用抗小鼠抗体-MMAF间接细胞毒杀伤实验评估生物活性(评估标准为ELISA实验中OD450nm>1.0、FACS实验中MFI值>50和间接细胞毒杀伤实验中杂交瘤细胞培养上清对EGFRvIII阳性细胞杀伤率达到50％)。
根据24孔板样品检测结果，挑选出最优的克隆，并于含10％(w/w)FBS的DMEM培养基中(购自invitrogen)在37℃，5％(v/v)CO2条件下将该最优的克隆进行扩大培养，液氮冻存即得本发明杂交瘤细胞，并可用于后续的抗体生产和纯化。
实施例2先导抗体的生产和纯化
杂交瘤细胞产生的抗体浓度较低，大约仅1～10μg/毫升，浓度变化较大。且培养基中细胞培养所产生的多种蛋白和培养基所含胎牛血清成分对很多生物活性分析方法都有不同程度的干扰，因此需要进行小规模(1～5毫克)抗体生产纯化。
将实施例1所得的杂交瘤细胞接种到T-75细胞培养瓶并用生产培养基(Hybridomaserum free medium，购自Invitrogen公司)驯化传代3代。待其生长状态良好，接种细胞培养转瓶。每个2升的培养转瓶中加入200毫升生产培养基，接种细胞密度为1.0╳105/毫升。盖紧瓶盖，将转瓶置于37℃培养箱中的转瓶机上，转速3转/分钟。连续旋转培养14天后，收集细胞培养液，过滤去除细胞，并用0.45微米的滤膜过滤至培养上清液澄清。澄清的培养上清液可马上进行纯化或-30℃冻存。
澄清的杂交瘤细胞的培养上清液(200mL)中的单克隆抗体用2mL蛋白A柱(购自GEHealthcare)纯化。蛋白G柱先用平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.4)平衡，然后将澄清的培养上清液上样到蛋白A柱，控制流速在3mL/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白G柱，平衡缓冲液的体积为4倍蛋白A柱柱床体积。用洗脱液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH3.5)洗脱结合在蛋白A柱上的EGFRvIII抗体，用紫外检测器监测洗脱情况(A280紫外吸收峰)。收集洗脱的抗体，加入10％1.0M Tris-HCl缓冲液中和pH，所述百分比为体积百分比，然后立即用PBS磷酸缓冲液透析过夜，第二天换液1次并继续透析3小时。收集透析后的EGFRvIII抗体，用0.22微米的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的EGFRvIII抗体。
将纯化的EGFRvIII抗体进行蛋白浓度(A280/1.4)、纯度、内毒(Lonza试剂盒)等检测分析，结果如表9所示，结果发现，抗体最终产品内毒素浓度在1.0EU/毫克以内。
表9纯化的EGFRvIII抗体质量控制
抗体名称 克隆号 抗体纯度 蛋白浓度(毫克/毫升) 内毒素(EU/毫克)
鼠抗75G7 75G7C6 >95％ 0.44 <1.0
鼠抗63A10 63A10A7 >95％ 1.26 <1.0
鼠抗64F1 64F1F8 >95％ 1.52 <1.0
鼠抗7E5 7E5-2A9 >95％ 0.81 <1.0
鼠抗43H6 43H6A1 >95％ 1.08 <1.0
鼠抗46C4 46C4A6 >95％ 1.43 <1.0
鼠抗49G12 49G12G5 >95％ 1.16 <1.0
鼠抗51G7 51G7C2 >95％ 1.07 <1.0
鼠抗53D8 53D8H4 >95％ 0.93 <1.0
鼠抗54D2 54D2G10 >95％ 1.29 <1.0
鼠抗56F10 56F10G2 >95％ 0.92 <1.0
鼠抗59G3 59G3F12 >95％ 1.29 <1.0
鼠抗64B11 64B11F2 >95％ 1.11 <1.0
实施例3先导抗体的检定
A、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与EGFRvIII蛋白的结合
对实施例2所得的纯化的EGFRvIII抗体进行与人EGFRvIII-hFc蛋白进行反应。
将实施例1获得的纯化的免疫原A(EGFRvIII-hFc)(其制备方法参见实施例1步骤(一)用PBS稀释到终浓度1.0μg/mL，然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板2次，加入封闭液[PBS+0.01％(v/v)Tween20+1％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入实施例2所得的纯化的EGFRvIII抗体100μl每孔。37℃孵育2小时后，用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Sigma)，37℃孵育2小时后，用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板3次。加入TMB底物100μl每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)100μl每孔。用ELISA读板机(SpectraMax 384plus，购自Molecular Device)读取A450nm数值，结果如图6和表10所示，表10说明，纯化后的抗体与EGFRvIII重组蛋白在ELISA水平结合。其中IgG对照为小鼠IgG，表中的数据为OD450nm值。
表10ELISA检测EGFRvIII抗体与人EGFRvIII-hFc蛋白的结合反应
B、流式细胞实验(FACS)检测抗体与EGFRvIII表达细胞的结合
将所需细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用HBSS缓冲液(Hanks Balanced Salt Solution)(购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(Versene solution:购自Life technology公司)处理和收集细胞。用HBSS缓冲液洗涤细胞2次，进行细胞计数后将细胞用HBSS缓冲液稀释至2╳106细胞每毫升，加入1％山羊血清封闭液，所述百分比为质量百分比，冰上孵育30分钟，然后用HBSS缓冲液离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液(HBSS+1％BSA，所述百分比为质量百分比)悬浮至2╳106细胞/mL，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，加入实施例2所得的纯化的EGFRvIII抗体待测样品每孔100微升，冰上孵育2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa488)标记的二抗(购自Invitrogen)，冰上孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔100微升固定液[4％(v/v)多聚甲醛]悬浮细胞，10分钟后用FACS缓冲液离心洗涤2次。用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACS Calibur，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(CellQuest)进行数据分析，的到细胞的平均荧光密度(MFI)。再通过软件(GraphPadPrism5)分析，进行数据拟合，计算EC50。分析结果如表11以及图7所示，待测抗体均可结合U87MG-hEGFRvIII细胞表面的EGFRvIII蛋白(图7A)。A431细胞(人表皮细胞癌细胞系)表面有大量野生型EGFR蛋白的表达，从图7B来看，鼠抗75G7，63A10和64F1可以与A431细胞表面的野生型EGFR蛋白弱结合，而鼠抗7E5(抗体克隆号7E5-2A9)不识别野生型EGFR蛋白，只能特异性识别突变型EGFRvIII蛋白。U87MG细胞(人脑胶质瘤细胞系)表面有少量野生型EGFR蛋白的表达，而HEB细胞(人脑胶质细胞系)表面有较高水平的野生型EGFR蛋白的表达。待测抗体与U87MG和HEB细胞均无结合反应，说明鼠抗75G7，63A10和64F1具有较好的特异性，只识别肿瘤组织中的突变型EGFRvIII蛋白以及超表达的野生型EGFR蛋白，不识别正常组织中的野生型EGFR蛋白(图7C、D)。
表11FACS检测EGFRvIII抗体与U87MG-hEGFRvIII、A431、U87MG和HEB细胞的结合反应
实施例4EGFRvIII抗体药物偶联物的细胞杀伤活性实验
抗体经过Ph6.5-8.5的硼酸钠缓冲液透析后，加入一定比例的TCEP还原(TCEP/抗体比率为2-10)，室温或37度进行还原2-4小时，经过G25脱盐填料去除多余的TCEP，加入一定比例的MC-MMAF(药物/抗体比率为5-20)反应4小时。再加入半胱氨酸用以中和多余的药物，并通过G25除去多余的小分子。得到纯化的抗体药物偶联物。(偶联方法参见Doronina，2006，Bioconjugate Chem.17,114-124)。通过HIC分析药物的交联率，纯度等参数后，进行细胞毒活性的分析。为了便于比较，所有抗体偶联物的药物交联率为8。
得到的抗体偶联物，分别用完全培养基进行梯度稀释，96孔细胞培养板以1000细胞/孔加入90微升U87MG-EGFRvIII细胞悬液，每孔再分别加入10微升不同浓度的抗体药物偶联物的稀释液，继续培养5天后，用CellTiter-Glo试剂盒(购自Promega，使用方法参照产品说明书)检测细胞活力。
结果如表12以及图8所示，其中表13-1的IC50指药物作用后，细胞的活性受到抑制的半数有效量，能够通过检测细胞的活性从而反映细胞杀伤活性。其中，图8为抗体药物偶联物对EGFRvIII阳性的重组肿瘤细胞系U87MG-EGFRvIII的细胞杀伤活性检测，结果说明，在体外实验中，待测抗体均可对表面有突变型EGFRvIII蛋白表达的U87MG-hEGFRvIII细胞产生良好的杀伤作用(图8A)。A431细胞(人表皮细胞癌细胞系)表面有大量野生型EGFR蛋白的表达，从图8B来看，鼠抗75G7，63A10和64F1对A431有较弱的杀伤作用。U87MG细胞(人脑胶质瘤细胞系)表面有少量野生型EGFR蛋白的表达，而HEB细胞(人脑胶质细胞系)表面有较高水平的野生型EGFR蛋白的表达。鼠抗75G7，63A10和64F1对U87MG和HEB细胞杀伤作用很弱或者没有杀伤作用，见图8C、图8D。说明鼠抗75G7，63A10和64F1具有较好的特异性，可以特异性杀伤表达突变型EGFRvIII蛋白以及超表达野生型EGFR蛋白的肿瘤组织，而对表达野生型EGFR蛋白的正常组织没有杀伤作用。
表12细胞杀伤实验检测抗体偶联物对EGFRvIII阳性细胞的特异性杀伤作用
实施例5EGFRvIII抗体的抗原表位分析
A、竞争性ELISA法分析抗原表位(Epitope Binning)
为了鉴定抗体对抗原的结合位点，采用竞争ELISA的方法对EGFRvIII抗体进行分组。
纯化的待测抗体用PBS稀释至1μg/mL，以50μL/孔包被96孔高吸附酶标板，4℃过夜包被后用250微升封闭液[含有0.01％(v/v)Tween20和1％(w/w)BSA的PBS]进行室温一小时封闭，每孔加入0.05μg/mL的生物素标记的重组EGFRvIII蛋白。同时加入5μg/mL的竞争抗体，即实施例2所得的纯化的EGFRvIII抗体，并于25-37℃孵育1～2小时。用洗板液[含有0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板3次，加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的链亲和素(购自Sigma)。37℃孵育0.5小时后，用洗板液[含有0.01％(v/v)Tween20的PBS]洗板3次。加入TMB底物100μL每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)100μL每孔。用ELISA读板机(SpectraMax 384plus，购自Molecular Device)读取A450nm数值，结果如图6所示。根据A450nm数值，计算出抗体相互之间的竞争率，结果如表13-1所示。竞争率的数值越高，表示两个抗体的抗原表面越是接近。
表13-1竞争性ELISA法分析抗原表位(Epitope Binning)
竞争性ELISA的结果显示，对照抗体02和鼠抗7E5，63A10和64F1的抗原表位具有竞争性，应该是相同或者相似表位。而鼠抗75G7与对照抗体02没有竞争性，因此鼠抗75G7的抗原表位应该与对照抗体02不同；其中对照抗体01是AMG-595(购自Amgen)，对照抗体02是ABT-414(购自Abbvie)。
B、多肽点阵ELISA法分析抗原表位(Epitope Mapping)
为了确定本发明的4个候选抗体特定的抗体结合表位，我们使用多肽点阵ELISA法来分析抗体的抗原结合表位。以EGFRvIII蛋白的1～50位氨基酸为模板，从N末端开始，以15个氨基酸重叠的方法进行移动，合成16个氨基酸长度的多肽。多肽C末端添加生物素标记。多肽合成由吉尔生化完成，共合成生物素标记多肽35条，详细序列见表13-2。
表13-2多肽点阵ELISA法分析抗原表位
多肽点阵ELISA的结果显示，对照抗体01和鼠抗7E5，鼠抗64F1，鼠抗63A10具有相同或者相似的抗原表位，即CGADSYEMEEDGVRKC。而鼠抗75G7与这35条多肽均不结合，因此鼠抗75G7的抗原表位应该与对照抗体01和对照抗体02均不同。其中对照抗体01是AMG-595(购自Amgen)，对照抗体02是ABT-414(购自Abbvie)。因此鼠抗75G7的抗原表位有待进一步的实验验证。
实施例6EGFRvIII抗体的结合特异性分析
所述EGFRvIII抗体能够特异性识别激活状态的EGFR，即肿瘤组织中的突变体EGFRvIII以及过度表达的野生型EGFR，但是不识别正常组织中的野生型EGFR。因此该抗体具有优秀的靶点特异性，可以有效避免抗体及其偶联物对人体正常组织的伤害，使抗体及其偶联物有效的聚集在肿瘤位置，从而精准地实现对肿瘤组织的有效杀伤以及大幅度降低药物对其他正常器官的毒副作用。
A、FACS检测EGFRvIII抗体对人类正常组织细胞系结合的特异性
选取了7个人类正常组织的细胞系，分别来自不同的组织，详细信息见表14。FACS检测分析了EGFRvIII抗体对这7个人类正常组织的细胞系的结合情况，结果如图9A～G所示，4个EGFRvIII嵌合抗体与人类正常组织的细胞系均无结合，仅嵌合抗体75G7与HEB和WPMY-1有较弱结合。说明这4个EGFRvIII嵌合抗体均具有良好的组织特异性，不识别正常组织中的野生型EGFR。
表14来源于7种不同人类正常组织的细胞系
B、免疫组化染色(IHC)检测EGFRvIII抗体的结合特异性
人类脑胶质瘤组织芯片(货号：GL805d)和人类多器官正常组织芯片(货号：FDA999n)均购于西安艾丽娜生物科技有限公司。
免疫组化染色的实验流程如下：
1)烤片，60℃，2小时。烤片的目的是将带有蜡的组织切片牢固地黏在载玻片上，以免染色过程中切片脱落。切片在56～60℃的恒温箱中至少放置1小时才能达到此目的，但是，通常的烤片温度为；8～60℃，时间为2～6小时。由于高温干燥可加速组织中抗原的氧化，因此高温烤片对抗原有破坏作用。
2)脱蜡和水化。分别在二甲苯I、Ⅱ中浸泡15～30分钟，以脱掉组织中的蜡。但是，进人组织中的二甲苯不能与水溶性染色液相溶，故需进一步通过下行梯度乙醇把组织中的二甲苯逐步替代出来。切片在100％乙醇I、Ⅱ中分别浸泡5分钟，95％、90％、80％和70％乙醇中分别浸泡2分钟，PBS漂洗3次，每次3分钟，置蒸馏水中待用。
3)抗原修复，将组织芯片放入pH9.0的EDTA溶液中，高温修复5分钟。
4)封闭内源性过氧化物酶，将组织芯片放入3％H2O2中，室温放置5分钟。
5)非免疫血清封闭，将组织芯片放入5％FBS中，室温放置15分钟。抗体能被组织切片中富有电荷的胶原和结缔组织成分吸附。从而导致背景着色，为了防止这种现象发生，最好在特异性抗体处理切片之前，选择与二抗种属相同的非免疫血清封闭电荷，阻止一抗与之结合，抑制非特异性背景着色。常用方法是用2％～10％羊血清或2％～5％牛血清白蛋白在室温下作用10～30分钟。
6)第一抗体孵育，室温放置1小时。
7)第二抗体孵育，室温放置0.5小时。
8)DAB显色，室温放置5分钟。
9)苏木精复染细胞核，室温放置10秒。
10)封片检测。
免疫组化染色的结果见图10A～F。鼠抗80E11是针对野生型EGFR的抗体，从图10A～F来看，野生型EGFR在人类脑胶质瘤组织和人类多器官正常组织中均有表达，且在肿瘤组织中的表达量高于正常组织。如表15所示，鼠抗7E5、鼠抗64F1与鼠抗63A10在人类脑胶质瘤组织芯片中的阳性率为34％，与人类多器官正常组织芯片反应基本为阴性，只有少数样本呈弱阳性。鼠抗75G7与人类脑胶质瘤组织芯片和人类多器官正常组织芯片反应均为阴性。因为鼠抗75G7的抗原结合表位与其他抗体不同，因此可能是因为芯片处理过程中破坏了鼠抗75G7的抗原结合表位。本次实验中所用组织芯片均为石蜡包埋，可能这种方法不适用于检测鼠抗75G7抗体。后续我们会尝试冷冻切片IHC。
表15EGFR抗体和EGFRvIII抗体对人类脑胶质瘤组织芯片的反应率
通过FACS和IHC实验证明了所述EGFRvIII抗体能够特异性识别肿瘤组织中的EGFR，但是不识别正常组织中的EGFR。因此该抗体具有优秀的靶点特异性，可以有效避免抗体及其偶联物对人体正常组织的伤害，使抗体及其偶联物有效的聚集在肿瘤位置，从而精准地实现对肿瘤组织的有效杀伤以及大幅度降低药物对其他正常器官的毒副作用。
实施例7轻重链可变区氨基酸序列测定
总RNA分离：通过离心搜集实施例1所得的杂交瘤细胞5×107个，加入1mL Trizol混匀并转移到1.5mL离心管中，室温静置5分钟。加0.2mL氯仿，振荡15秒，静置10分钟后于4℃，12000g离心5分钟，取上清转移到新的1.5mL离心管中。加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟后于4℃，12000g离心15分钟，弃上清。加入1mL 75％(v/v)乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，12000g离心5分钟后弃上清，将沉淀物晾干，加入DEPC处理过的H2O溶解(55℃水浴促进溶解10分钟)，即得总RNA。
逆转录与PCR：取1μg总RNA，配置20μL体系，加入逆转录酶后于42℃反应60分钟，于7℃反应10分钟终止反应。配置50μL PCR体系，包括1μL cDNA、每种引物25pmol、1μL DNA聚合酶以及相配的缓冲体系、250μmol dNTPs；设置PCR程序，95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸35秒，35个循环后再额外于72℃延伸5分钟，得PCR产物。其中逆转录所用的试剂盒为PrimeScript RT Master Mix，购自Takara，货号RR036；PCR所用的试剂盒包括Q5超保真酶，购自NEB，货号M0492。
克隆与测序：取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将检测阳性样品使用柱回收试剂盒纯化，其中回收试剂盒为Gel&PCR Clean-up，购自MACHEREY-NAGEL，货号740609。进行连接反应：样品50ng，T载体50ng，连接酶0.5μL，缓冲液1μL，反应体系10μL，于16℃反应半小时得连接产物。其中连接的试剂盒为T4DNA连接酶，购自NEB，货号M0402；取5μL连接产物加入100μL的感受态细胞(Ecos101competent cells，购自Yeastern，货号FYE607)中，冰浴5分钟，而后于42℃水浴热激1分钟，放回冰上1分钟后加入650μL无抗生素SOC培养基，于37℃摇床上以200RPM的速度复苏30分钟。取出200μL涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养。次日，使用T载体上引物M13F和M13R配置30μLPCR体系，进行菌落PCR，用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸，并吸出0.5μL点于另一块含100nM氨苄青霉素的LB固体培养皿上以保存菌株。PCR反应结束后，取出5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品进行测序和分析(其中CDR的划分是根据Chothia定义体系)。测序结果如表16～17所示。
表16EGFRvIII抗体蛋白序列编号
其中，表17中的数字即为序列表中序列号，如43H6A1的重链蛋白可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.1，而43H6A1的重链蛋白可变区中CDR1的氨基酸序列为SEQ ID No.2。
表17EGFRvIII抗体基因序列编号
克隆号 重链蛋白可变区 轻链蛋白可变区
75G7C6 105 106
63A10A7 107 108
64F1F8 109 110
7E5-2A9 111 112
43H6A1 113 114
46C4A6 115 116
49G12G5 117 118
51G7C2 119 120
53D8H4 121 122
54D2G10 123 124
56F10G2 125 126
59G3F12 127 128
64B11F2 129 130
其中，表18中的数字即为序列表中序列号，如编码75G7C6的重链蛋白可变区的核苷酸序列为SEQ ID No.105。
实施例8EGFRvIII人鼠嵌合抗体的生产和纯化
1)质粒构建与准备：将上述鼠源先导抗体的重链可变区序列重组到包含信号肽和人源重链抗体IgG1恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤也由上海睿智化学完成)中，将EGFRvIII抗体的轻链可变区序列重组到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤也由上海睿智化学完成)当中，得重组质粒(上述质粒重组的实验原理及步骤的出处见《分子克隆实验指南(第三版)》，(美)J.萨姆布鲁克等著)并经测序验证。使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22μm滤膜(购自Millopore)过滤，供转染使用。
2)细胞转染：在培养基Freestyle 293expression medium(购自Invitrogen)培养293E细胞(购自Invitrogen)。摇床设置为37℃、130RPM和8％CO2(v/v)。Freestyle293expression medium在转染时添加10％(v/v)F68(购自Invitrogen)至F68终浓度为0.1％(v/v)，得含0.1％(v/v)F68的Freestyle 293表达培养基，即培养基A。取5mL培养基A和200μg/mL PEI(购自Sigma)混匀，得培养基B。取5mL培养基A和100μg步骤1)所得的重组质粒(此处为上述重链重组质粒和轻链重组质粒按常规等比例混合的混合重组质粒)混匀，得培养基C。5分钟后将培养基B和培养基C合并混匀，静置15分钟，得混合液D。将10mL混合液D缓缓加入100mL含293E细胞的培养基Freestyle 293expression medium中至293E的细胞密度为1.5×106个/mL，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养。第二天加入蛋白胨至终浓度为0.5％(w/v)。第5～7天，测培养液抗体效价。第6～7天，离心(3500RPM，30分钟)收集上清，经0.22μm滤膜过滤，得滤好的细胞上清液，以供纯化。
3)抗体纯化：对于连续生产的无内毒素的层析柱和蛋白A填料，使用0.1M NaOH处理30min或者5个柱体积0.5M NaOH冲洗；对于长期未使用的柱料和层析柱至少使用1M NaOH浸泡1h，用无内毒的水冲洗至中性，用10倍柱体积的1％Triton X100对柱料清洗。使用5个柱体积的PBS进行平衡，将过滤好的细胞上清上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并用1/10体积的pH8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和。收获抗体后，在1×PBS中透析过夜，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒(购自Lonza)检测抗体内毒素含量。
分别获得纯化的EGFRvIII嵌合抗体75G7,63A10,64F1和7E5。
将纯化的EGFRvIII嵌合抗体进行蛋白浓度(A280/1.4)、纯度、内毒(Lonza试剂盒)等检测分析，结果如表18所示，结果发现，抗体最终产品内毒素浓度在1.0EU/毫克以内。
表18纯化的EGFRvIII嵌合抗体质量控制
实施例9EGFRvIII嵌合抗体的检定
A、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与EGFRvIII蛋白的结合
对实施例2所得的纯化的EGFRvIII嵌合抗体进行与人EGFRvIII-hFc蛋白进行反应。
将实施例1获得的纯化的免疫原A(EGFRvIII-hFc)(其制备方法参见实施例1步骤(一)用PBS稀释到终浓度1.0μg/mL，然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板2次，加入封闭液[PBS+0.01％(v/v)Tween20+1％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入实施例2所得的纯化的EGFRvIII嵌合抗体100μl每孔。37℃孵育2小时后，用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Sigma)，37℃孵育2小时后，用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板3次。加入TMB底物100μl每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)100μl每孔。用ELISA读板机(SpectraMax 384plus，购自MolecularDevice)读取A450nm数值，结果如图11和表19所示，表19说明，纯化后的抗体与EGFRvIII重组蛋白在ELISA水平结合。其中IgG对照为小鼠IgG，表中的数据为OD450nm值。
表19ELISA检测EGFRvIII嵌合抗体与人EGFRvIII-hFc蛋白的结合反应
B、流式细胞实验(FACS)检测抗体与EGFRvIII表达细胞的结合
将所需细胞在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用HBSS缓冲液(Hanks Balanced Salt Solution)(购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(Versene solution:购自Life technology公司)处理和收集细胞。用HBSS缓冲液洗涤细胞2次，进行细胞计数后将细胞用HBSS缓冲液稀释至2╳106细胞每毫升，加入1％山羊血清封闭液，所述百分比为质量百分比，冰上孵育30分钟，然后用HBSS缓冲液离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液(HBSS+1％BSA，所述百分比为质量百分比)悬浮至2╳106细胞/mL，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，加入实施例2所得的纯化的EGFRvIII抗体待测样品每孔100微升，冰上孵育2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升荧光(Alexa488)标记的二抗(购自Invitrogen)，冰上孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔100微升固定液[4％(v/v)多聚甲醛]悬浮细胞，10分钟后用FACS缓冲液离心洗涤2次。用100微升FACS缓冲液悬浮细胞，用FACS(FACS Calibur，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(CellQuest)进行数据分析，的到细胞的平均荧光密度(MFI)。再通过软件(GraphPadPrism5)分析，进行数据拟合，计算EC50。分析结果如表20以及图12A～D所示，待测嵌合抗体均可结合U87MG-hEGFRvIII细胞表面的EGFRvIII蛋白(图12A)。A431细胞(人表皮细胞癌细胞系)表面有大量野生型EGFR蛋白的表达，从图12B来看，嵌合抗体75G7、嵌合抗体63A10和嵌合抗体64F1可以与A431细胞表面的野生型EGFR蛋白弱结合，而嵌合抗体7E5不识别野生型EGFR蛋白，只能特异性识别突变型EGFRvIII蛋白。U87MG细胞(人脑胶质瘤细胞系)表面有少量野生型EGFR蛋白的表达，而HEB细胞(人脑胶质细胞系)表面有较高水平的野生型EGFR蛋白的表达。待测抗体与U87MG和HEB细胞均无结合反应，说明嵌合抗体75G7、嵌合抗体63A10和嵌合抗体64F1具有较好的特异性，只识别肿瘤组织中的突变型EGFRvIII蛋白以及超表达的野生型EGFR蛋白，不识别正常组织中的野生型EGFR蛋白(图12C、D)。
表20FACS检测EGFRvIII嵌合抗体与U87MG-hEGFRvIII、A431、U87MG和HEB细胞的结合反应
实施例10EGFRvIII嵌合抗体药物偶联物的细胞杀伤活性实验
抗体经过Ph6.5～8.5的硼酸钠缓冲液透析后，加入一定比例的TCEP还原(TCEP/抗体比率为2-10)，室温或37度进行还原2-4小时，经过G25脱盐填料去除多余的TCEP，加入一定比例的MC-MMAF(药物/抗体摩尔比率为4.5)反应4小时。再加入半胱氨酸用以中和多余的药物，并通过G25除去多余的小分子。得到纯化的抗体药物偶联物。(偶联方法参见Doronina，2006，Bioconjugate Chem.17,114-124)。通过HIC分析药物的交联率，纯度等参数后，进行细胞毒活性的分析。为了便于比较，所有抗体偶联物的药物交联率为8[通过实验调整DAR(毒物抗体偶联比率)达到预设的数值，后期对确切的DAR进行检测确定]。
得到的抗体偶联物，分别用完全培养基进行梯度稀释，96孔细胞培养板以1000细胞/孔加入90微升U87MG-EGFRvIII细胞悬液，每孔再分别加入10微升不同浓度的抗体药物偶联物的稀释液，继续培养5天后，用CellTiter-Glo试剂盒(购自Promega，使用方法参照产品说明书)检测细胞活力。
结果如表21以及图13A～D所示，其中表23的IC50指药物作用后，细胞的活性受到抑制的半数有效量，能够通过检测细胞的活性从而反映细胞杀伤活性。其中，图13为抗体药物偶联物对EGFRvIII阳性的重组肿瘤细胞系U87MG-EGFRvIII的细胞杀伤活性检测，结果说明，在体外实验中，待测抗体均可对表面有突变型EGFRvIII蛋白表达的U87MG-hEGFRvIII细胞产生良好的杀伤作用(图13A)。A431细胞(人表皮细胞癌细胞系)表面有大量野生型EGFR蛋白的表达，从图13B来看，嵌合抗体75G7,63A10和64F1对A431有较弱的杀伤作用。U87MG细胞(人脑胶质瘤细胞系)表面有少量野生型EGFR蛋白的表达，而HEB细胞(人脑胶质细胞系)表面有较高水平的野生型EGFR蛋白的表达。嵌合抗体75G7,63A10和64F1对U87MG和HEB细胞杀伤作用很弱或者没有杀伤作用，见图13C，图13D。说明嵌合抗体75G7、63A10和64F1具有较好的特异性，可以特异性杀伤表达突变型EGFRvIII蛋白以及超表达野生型EGFR蛋白的肿瘤组织，而对表达野生型EGFR蛋白的正常组织没有杀伤作用。
表21细胞杀伤实验检测嵌合抗体偶联物对EGFRvIII阳性细胞的杀伤作用
实施例11EGFRvIII嵌合抗体药物偶联物的体内药效学研究
由于EGFRvIII基因在肿瘤细胞体外培养的过程中会逐渐丧失表达，因此没有稳定表达EGFRvIII基因的内源性肿瘤细胞系。因此我们构建了U87MG-EGFRvIII重组细胞系，建立了U87MG-EGFRvIII皮下异种移植肿瘤模型，用来测试嵌合抗体药物偶联物的体内药效。
U87MG-EGFRvIII重组细胞系的构建方法见实施例1。将U87MG-EGFRvIII细胞悬液200μl(1×106个)接种于Balb/c nude小鼠右后背，待7天后肿瘤长至150-250mm3后，挑选合适肿瘤体积的荷瘤鼠，按肿瘤体积将小鼠随机分组，然后按照既定计划给药。具体研究计划及给药剂量见表22。
实验指标是考察肿瘤生长是否可以被抑制、延缓或治愈。隔天用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5×a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效(TGI)用TGI(％)评价。TGI％＝1-(TRTVn-TRTV1)/(CRTVn-CRTV1)×100％(TRTVn：治疗组最后一天的RTV；CRTV：阴性对照组RTV)。相对肿瘤体积RTV的计算公式为RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即Day0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。T/C(％)的百分比值反映肿瘤生长抑制率，根据药审中心抗肿瘤药物的指导原则TGI％≤58％，认为此药有效。
表22.EGFRvIII嵌合抗体药物偶联物的体内药效学研究
结果见图14A和图14B：所有受试小鼠体重未见明显变化，说明所有测试的抗体药物偶联物在U87MG-EGFRvIII异种移植荷瘤小鼠中具有良好的耐受性。与未治疗的溶剂对照组相比，所有抗体药物偶联物给药组的小鼠肿瘤体积都明显受到抑制，且高剂量组(3mg/kg)与低剂量组(1mg/kg)相比，具有明显的剂量依赖性。其中高剂量组(3mg/kg)在给药18天(每4天给药一次，共给药4次)后，完全抑制了肿瘤生长(TGI％>100％)。而低剂量组(1mg/kg)也表现出了较好的抗肿瘤活性(TGI％>58％)。测试的4个嵌合抗体药物偶联物63A10-MMAE，75G7-MMAE，64F1-MMAE，7E5-MMAE均表现出优于对照抗体药物偶联物对照抗体02-MMAE的抗肿瘤活性，且63A10-MMAE最佳。
实施例12抑制脱酰胺化、异构化、水解反应的突变的导入
通过对75G7C6和63A10A7的抗体序列分析，发现75G7C6抗体重链可变区(SEQ IDNo.1)CDR2(SEQ ID No.3)的第54和55位的NG存在脱酰胺化反应的可能，位于CDR3(SEQ IDNo.4)的第98和99位DG存在异构化的可能，为了抑制脱酰胺化、异构化和水解，经过计算和分析，将位于75G7C6抗体CDR2的NG突变成NA，突变后75G7C6抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.179所示；或将NG突变成QG，突变后75G7C6抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNo.180所示。同时将位于CDR3的DG突变成SG，突变后75G7C6抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.181所示(所对应的核酸序列如SEQ ID No.188所示)；或将DG突变成EG，突变后75G7C6抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.182所示(所对应的核酸序列如SEQ IDNo.131所示)；或将DG突变成DA，突变后75G7C6抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNo.183所示(所对应的核酸序列如SEQ ID No.132所示)。拟通过上述定点突变实施去除作为接受脱酰胺化的位点的天冬酰胺残基和天冬酰残基的氨基酸修饰。
嵌合75G7C6抗体重链可变区定点突变序列经基因合成后，按实施例8所述进行质粒构建、细胞转染和抗体纯化，纯化抗体经过如实施例9所述的ELISA和FACS进行突变后的嵌合抗体结合活性鉴定，ELISA鉴定结果如图15和图16及表23所示，其中图15是75G7C6抗体重链可变区CDR2的NG突变后的抗体的ELISA结合活性鉴定，图16是75G7C6抗体重链可变区CDR3的NG突变后的抗体的ELISA结合活性鉴定，表23汇总了c75G7C6野生型抗体及突变体抗体与EGFRvIII-hFc蛋白结合的EC50值，从表23可看出，位于重链CDR2的NG突变成NA或QG后的抗体突变体c75G7C6-1和c75G7C6-2与EGFRvIII-hFc的结合活性与野生型抗体c75G7C6接近，说明NG突变成NA或QG不影响抗体与EGFRvIII-hFc的结合。但位于CDR3的DG不管是突变成EG、SG或DA均影响了对EGFRvIII-hFc的结合活性，其中DG突变成EG后的突变抗体c75G7C6-3与EGFRvIII-hFc的结合能力比野生型嵌合抗体c75G7C6下降22倍，而DG突变成SG或DA后的突变抗体c75G7C6-4和c75G7C6-5与EGFRvIII-hFc没有结合，说明DG突变成EG、SG或DA均严重影响了抗体与EGFRvIII-hFc的结合。
表23.ELISA检测c75G7C6嵌合抗体突变体与人EGFRvIII-hFc蛋白的结合反应
抗体名称 点突变 EC50(单位：nM) 最大OD450值
hIgG 无 无 0.08
c75G7C6 wt(NG&DG) 0.02 3.03
c75G7C6-1 NG/NA 0.02 3.44
c75G7C6-2 NG/QG 0.03 3.23
c75G7C6-3 DG/EG 0.54 1.86
c75G7C6-4 DG/SG 7.94 0.79
c75G7C6-5 DG/DA 无 0.14
FACS鉴定结果如图17A-B和图28A-B及表24和表25所示，其中图17A是75G7C6抗体重链可变区CDR2的NG突变成NA或QG后的突变抗体c75G7C6-1和c75G7C6-2及野生型抗体c75G7C6与CHOK-EGFRvIII细胞结合活性检测，图17B是75G7C6抗体重链可变区CDR2的NG突变成NA或QG后的突变抗体c75G7C6-1和c75G7C6-2及野生型抗体c75G7C6与CHOK-EGFR细胞结合活性检测；图18A是75G7C6抗体重链可变区CDR3的DG突变成SG、EG或DA后的突变抗体c75G7C6-3、c75G7C6-4和c75G7C6-5及野生型抗体c75G7C6与CHOK-EGFRvIII细胞结合活性检测，图18B是75G7C6抗体重链可变区CDR3的DG突变成SG、EG或DA后的突变抗体c75G7C6-3、c75G7C6-4和c75G7C6-5及野生型抗体c75G7C6与CHOK-EGFR细胞结合活性检测。表24总结了中c75G7C6野生型抗体及突变抗体在CHOK-EGFRvIII细胞中的结合活性，表25总结了c75G7C6野生型抗体及突变抗体在CHOK-EGFR细胞中的结合活性。
表24.FACS检测c75G7C6嵌合抗体突变体与CHOk1-EGFRvIII细胞的结合反应
表25.FACS检测c75G7C6嵌合抗体突变体与CHOk1-EGFR细胞的结合反应
从表24和图17A、图18A来看，位于c75G7C6重链可变区CDR2的NG突变成NA或QG的突变抗体c75G7C6-1和c75G7C6-2与CHOk1-EGFRvIII细胞的结合活性与野生型抗体c75G7C6接近，说明NG突变成NA或QG不影响抗体与CHOK-EGFRvIII细胞的结合。而位于CDR3的DG不管是突变成EG、SG或DA均影响了抗体与对CHOK-EGFRvIII的结合活性，其中DG突变成EG或SG后的突变抗体c75G7C6-3和c75G7C6-4与CHOK-EGFRvIII的结合能力比野生型嵌合抗体c75G7C6下降约2.5倍，且最大平均荧光强度分别下降16％和53％，而DG突变成DA后的突变抗体c75G7C6-5与CHOK-EGFRvIII没有结合，说明DG突变成EG、SG或DA均严重影响了抗体与CHOK-EGFRvIII细胞的结合。
从表25和图17B、图18B来看，位于c75G7C6重链可变区CDR2的NG突变成NA或QG的突变抗体c75G7C6-1和c75G7C6-2与CHOk1-EGFR细胞的结合活性与野生型抗体c75G7C6接近，说明NG突变成NA或QG不影响抗体与CHOK-EGFR细胞的结合。而位于CDR3的DG不管是突变成EG、SG或DA均影响了抗体与对CHOK-EGFR的结合活性，其中DG突变成EG后的突变抗体c75G7C6-3与CHOK-EGFR的结合能力比野生型嵌合抗体c75G7C6下降约3倍，且最大平均荧光强度下降38％，而DG突变成SG或DA后的突变抗体c75G7C6-4和c75G7C6-5与CHOK-EGFR弱结合或没有结合，说明DG突变成EG、SG或DA均严重影响了抗体与CHOK-EGFR细胞的结合。
从上述ELISA和FACS结果来看，位于c75G7C6重链可变区CDR2的NG可突变成NA或QG，突变后抗体与抗原的结合活性不受影响，但位于CDR3的DG不管是突变成EG、SG或DA均影响了抗体与抗原的结合，不宜进行突变。因此，后续将选用CDR2的NG突变成NA后的抗体c75G7C6-1进行后续研究。
实施例13人源化EGFRvIII抗体的制备
在Germline数据库中选取与上述嵌合抗体63A10A7和75G7C6的非CDR区匹配最好的人种系抗体重链和轻链可变区模板。人源化EGFRvIII抗体的人接受序列选自人种系外显子VH、JH、Vk和Jk序列。其中63A10A7抗体重链可变区的模板为人种系抗体重链VH外显子的IGHV1-46*01，JH外显子的JH-4，轻链可变区的模板为人种系抗体轻链VK外显子的IGKV1-39*01，JK外显子的/JK-2。其中75G7C6抗体重链可变区的模板为人种系抗体重链VH外显子的IGHV1-46*01，JH外显子的JH-6b，轻链可变区的模板为人种系抗体轻链VK外显子的IGKV3-11*01，JK外显子的JK-4。
根据Kabat定义确定的嵌合抗体63A10A7和75G7C6的重链和轻链CDR分别移植到所选人种系模板中，替换人种系模板的CDR区，得到人源化的抗体。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的构架区的残基进行回复突变，得到人源化之后的抗体。简要说，产生跨越人源化VH或VL结构域的合成重叠寡核苷酸、并利用PCR重叠延伸来组装各结构域。利用掺入PCR产物的限制性位点将VH结构域定向克隆到包含信号肽和人源抗体重链IgG1恒定区的表达载体，将VL结构域定向克隆到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体中，得到的重组质粒经过测序验证，使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22μm滤膜(购自Millopore)过滤，供转染使用。
人源化抗EGFRVIII抗体变体的重链和轻链可变区与人种系重链和轻链可变区及嵌合抗体的重链和轻链可变区的序列比对如图19-22所示，其中图19为人源化抗EGFRvIII抗体h75G7C6重链可变区h75G7C6.VH及其变体与嵌合抗体c75G7C6.VH及人种系VH外显子IGHV1-46*01/JH6b的序列比较，图20为人源化抗EGFRvIII抗体h75G7C6轻链可变区h75G7C6.VL及其变体与嵌合抗体c75G7C6.VL及人种系VL外显子IGHV3-11*01/JK4的序列比较，图21为人源化抗EGFRvIII抗体h63A10A7重链可变区h63A10A7.VH及其变体与嵌合抗体c63A10A7.VH及人种系VH外显子IGHV1-46*01/JH4的序列比较，图22为人源化抗EGFRvIII抗体h63A10A7轻链可变区h63A10A7.VL及其变体与嵌合抗体c63A10A7.VL及人种系VL外显子IGKV1-39*01/JK2的序列比较，方框处为CDR。
人种系重链可变区模板IGHV1-46*01/JH4
IGHV1-46*01：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO.175)；
JH4：YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.189)。
人种系重链可变区模板IGHV1-46*01/JH6b
IGHV1-46*01：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO.176)
JH6b：YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.190)
人种系轻链可变区模板IGKV3-11*01/JK4
IGKV3-11*01：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP(SEQ ID NO.177)；
JK4：LTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO.191)。
人种系轻链可变区模板IGKV1-39*01/JK2
IGKV1-39*01：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP(SEQ ID NO.178)；
JK2：YTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.192)。
选择数个框架位置以重新引入小鼠供体残基。可通过在VH结构域中掺入小鼠框架供体残基或在VL结构域中掺入人CDR残基的不同组合产生数种人源化75G7C6和63A10A7变体。下表26和表27小结了这些变体。其中，表26和表27显示的是这些变体的可变区，不包括恒定区。表26、24中，c开头表示嵌合抗体，h开头表示人源化抗体；其中供体构架残基及回复突变栏中显示的、例如各人源化抗EGFRvIII抗体75G7C6重链可变区h75G7C6.VH及其变体中“Q1E”表明如图19中所示的第1位氨基酸由“Q”谷氨酰胺突变为“E”谷氨酸，回复突变的位点位于构架区，以此为例，不一一说明。
表26
表27
注：表中的“/”代表的含义是“和”，为并列关系。
根据各人源化抗体轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列合成cDNA(即分别为序列表中的SEQ ID NO.154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，,164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174所示序列)，重链cDNA用FspAI和AfeI消化，轻链cDNA用FspAI和BsiwI后，将cDNA片段通过FspAI/AfeI或FspAI/BsiwI酶切位点分别插入到包含信号肽和人源重链抗体IgG1恒定区的表达载体及包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体当中(其中表达载体购买自Invitrogen，重组步骤也由上海睿智化学完成)中，重组质粒并经测序验证，使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒，质量为500μg以上，经0.22μm滤膜(购自Millopore)过滤，供转染使用。
转染前，用培养基Freestyle 293expression medium(购自Invitrogen)培养293E细胞(购自Invitrogen)。转染时在Freestyle 293expression medium中添加10％(v/v)F68(购自Invitrogen)至F68终浓度为0.1％(v/v)，得含0.1％(v/v)F68的Freestyle 293表达培养基，即培养基A。取5mL培养基A和200μg/mL PEI(购自Sigma)混匀，得培养基B。取5mL培养基A和100μg重链和轻链重组质粒(重链重组质粒与轻链重组质粒的质量比为1:1-1:3范围)混匀，得培养基C。5分钟后将培养基B和培养基C合并混匀，静置15分钟，得混合液D。将10mL混合液D缓缓加入100mL含293E细胞的培养基Freestyle 293expression medium中至293E的细胞密度为1.5×106个/mL，边加边振荡，避免PEI过度集中，放入摇床培养，摇床设置为37℃、130RPM和8％CO2(v/v)。第二天加入蛋白胨至终浓度为0.5％(w/v)。第5～7天，测培养液抗体效价。第6～7天，离心(3500RPM，30分钟)收集上清，经0.22μm滤膜过滤，得滤好的细胞上清液，以供纯化。
抗体纯化时，对于连续生产的无内毒素的层析柱和蛋白A填料(购自GE)，使用5个柱体积的0.5M NaOH冲洗。然后用5个柱体积的PBS(PBS缓冲液，pH7.4)进行平衡至中性后，将过滤好的细胞上清液上柱，必要时收集流穿液。上柱完成后，使用5倍柱体积的PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH 3.0的Glycine-HCl进行洗脱，收集洗脱液，并立刻在洗脱液中加入0.1倍体积的pH 8.5的1MTris-HCl(1.5M NaCl)中和EGFRvIII抗体。上述所用溶液均需要新鲜配制。收获EGFRvIII抗体后，在1×PBS中透析4小时，避免内毒素污染。透析结束后，使用分光光度或试剂盒测定浓度，使用HPLC-SEC测定抗体纯度，使用内毒素检测试剂盒(购自Lonza)检测抗体内毒素含量。并对所获EGFRvIII抗体进行特性鉴定(操作步骤如下述实施例13所述)。
实施例14人源化抗EGFRvIII抗体的鉴定
A、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体与EGFRvIII蛋白的结合
对实施例12所得的纯化的人源化抗EGFRvIII抗体进行与人EGFRvIII-hFc蛋白进行反应。
将实施例1获得的纯化的免疫原A(EGFRvIII-hFc)(其制备方法参见实施例1步骤(一)用PBS稀释到终浓度1.0μg/mL，然后以100μl每孔加到96孔ELISA板。用塑料膜封好4℃孵育过夜，第二天用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板2次，加入封闭液[PBS+0.01％(v/v)Tween20+1％(w/w)BSA]室温封闭2小时。倒掉封闭液，加入实施例2所得的纯化的EGFRvIII嵌合抗体100μl每孔。37℃孵育2小时后，用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板3次。加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的二抗(购自Sigma)，37℃孵育2小时后，用洗板液[PBS+0.01％(v/v)Tween20]洗板3次。加入TMB底物100μl每孔，室温孵育30分钟后，加入终止液(1.0N HCl)100μl每孔。用ELISA读板机(SpectraMax 384plus，购自MolecularDevice)读取A450nm数值，结果如图23A-C和图24A-E及表28和表29所示，其中，图23A-C为纯化的人源化h75G7C6变体与人源EGFRVIII-hFc蛋白的结合反应，图24A-E为纯化的人源化h63A10A7变体与人源EGFRVIII-hFc蛋白的结合反应。表28和表29分别为h75G7C6变体和h63A10A7变体的根据OD450nm值计算出来的EC50值，说明纯化的人源化EGFRvIII抗体变体与EGFRvIII重组蛋白在ELISA水平有较好的结合。
表28ELISA检测人源化h75G7C6抗体变体与人EGFRvIII-hFc蛋白的结合反应
表29ELISA检测人源化h63A10A7抗体变体与人EGFRvIII-hFc蛋白的结合反应
B、流式细胞实验(FACS)检测抗体与EGFRvIII表达细胞的结合
FACS检测所需的U87MG-EGFRvIII制备如实施例1免疫原B的制备所述，正常人原代肝细胞购自BioreclamationIVT，肿瘤细胞A431购自ATCC。肝细胞复苏后直接用于FACS检测，U87MG-EGFRvIII和A431细胞复苏后在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度，吸尽培养基，用HBSS缓冲液(Hanks Balanced Salt Solution)(购自Invitrogen)洗涤2次，然后用无酶细胞解离液(Versene solution:购自Life technology公司)处理和收集细胞。用HBSS缓冲液洗涤细胞2次，进行细胞计数后将细胞用HBSS缓冲液稀释至2×106细胞每毫升，加入1％山羊血清封闭液，所述百分比为质量百分比，冰上孵育30分钟，然后用HBSS缓冲液离心洗涤2次。将收集的细胞用FACS缓冲液(HBSS+2％FBS，所述百分比为体积百分比)重悬至2×106细胞/mL，按每孔100微升加入到96孔FACS反应板中，加入实施例12所得的纯化的EGFRvIII抗体待测样品每孔100微升，冰上孵育2小时。用FACS缓冲液离心洗涤2次，加入每孔100微升1:1000稀释的荧光(Alexa 488)标记的二抗(购自Invitrogen)，冰上孵育1小时。用FACS缓冲液离心洗涤3次，加入每孔100微升固定液[4％(v/v)多聚甲醛]重悬细胞，10分钟后用FACS缓冲液离心洗涤2次。用100微升FACS缓冲液重悬细胞，用FACS(FACS Calibur，购自BD公司)检测和分析结果。通过软件(CellQuest)进行数据分析，的到细胞的平均荧光密度(MFI)。再通过软件(GraphPad Prism5)分析，进行数据拟合，计算EC50。
分析结果如表30和表31，以及图25A-C和图26A-E所示，待测人源化抗体均可与U87MG-hEGFRvIII细胞表面的EGFRvIII蛋白特异结合，图25A-C是人源化h75G7C6抗体变体与U87MG-hEGFRvIII细胞表面的EGFRvIII的结合，图26A-E人源化h63A10A7抗体变体与U87MG-hEGFRvIII细胞表面的EGFRvIII的结合。
表30.FACS检测人源化h75G7C6抗体变体与U87MG-hEGFRvIII细胞表面的EGFRvIII的结合反应
表31.FACS检测人源化h63A10A7抗体变体与U87MG-hEGFRvIII细胞表面的EGFRvIII的结合反应
此外，人源化75G7C6和63A10A7抗体变体还能与野生型EGFR弱结合。A431细胞(人表皮细胞癌细胞系)表面过表达大量野生型EGFR蛋白，正常人原代肝细胞表面也有一定量的野生型EGFR蛋白表达，如图27和图28A-B所示，相对于抗EGFR对照抗体Cetuximab，人源化75G7C6抗体变体及人源化63A10A7抗体变体均可以与肿瘤细胞A431过表达的EGFR，但与正常人原代肝细胞表面的野生型EGFR蛋白弱结合，这可能与人源化75G7C6和63A10A7抗体的抗原决定簇所处的空间位置有关。但人源化75G7C6抗体的各变体与A431和正常人原代肝细胞表面EGFR蛋白结合能力不同，如表32所示，待测抗体与正常人原代肝细胞弱结合或无结合，平均荧光强度MFI值在250左右，与阴性对照hIgG的结合能力相近(MFI值219)，但与肿瘤细胞A431表面的EGFR有较高水平结合，平均荧光强度MFI在10000-13000，显示出人源化75G7C6抗体具有选择性结合肿瘤细胞表面过表达的EGFR蛋白，而不结合或弱结合正常细胞表达的EGFR蛋白，选择性窗口在35-47倍。
类似地，人源化63A10A7抗体的各变体与A431和正常人原代肝细胞表面EGFR蛋白结合能力不同，如图28A-B和表33所示，部分待测抗体，如人源化抗体h63A10A7-17～26与正常人原代肝细胞的结合能力与抗EGFR抗体接近(MFI 433)，平均荧光强度MFI范围在433-677，因此认为此部分待测抗体对表达EGFR的正常细胞不具有选择性；但部分待测抗体表现出很好的对表达EGFR的肿瘤细胞和正常细胞的选择性，如人源化抗体h63A10A7-37～39，与正常人原代肝细胞弱结合或无结合，平均荧光强度MFI值在260左右，与阴性对照hIgG的结合能力相近(MFI值219)，但与肿瘤细胞A431表面的EGFR有一定水平的结合，平均荧光强度MFI在1000-2000，显示出部分人源化63A10A7抗体变体具有选择性结合肿瘤细胞表面过表达的EGFR蛋白，而不结合或弱结合正常细胞表达的EGFR蛋白，选择性窗口在5～7.5倍。
表32.FACS检测人源化h75G7C6抗体变体与肿瘤细胞A431和正常人原代肝细胞表面的EGFR的结合反应
表33.FACS检测人源化h63A10A7抗体变体与肿瘤细胞A431和正常人原代肝细胞表面的EGFR的结合反应
C.人源化抗EGFRvIII抗体的结合亲和力检测
为了评估人源化抗EGFRvIII抗体与EGFRvIII和EGFR蛋白的结合特异性和亲和力，在OctetRED(购自Pall)仪器上，使用抗人Fc的生物传感器AHC(购自ForteBio)结合待检测人源化h75G7C6抗体变体，然后再与EGFRvIII-his(购自Sino Biological)或EGFR-his(购自Sino Biological)蛋白结合，通过生物膜层光学干涉(BLI)技术进行检测。BLI技术通过检测当传感器上固定的分子与溶液中的分子发生相互作用时，生物膜厚度增加，干涉光谱曲线向波长增加的方向移动，光波相位移动由工作站实时探测，对光波的相位移动进行分析便可定量得出传感器表面分子数量变化及相关浓度和动力学数据。人源化h75G7C6抗体变体与EGFRvIII和EGFR蛋白的结合速率(Ka)、解离速率(Kdis)及结合亲和力(KD)如表34和表35所示，其中嵌合抗体c75G7C6作为对照。
表34.人源化h75G7C6抗体变体与EGFRvIII蛋白的结合亲和力
抗体名称 Ka(1/Ms) Kdis(1/s) KD(M)
嵌合抗体c75G7C6 9.14E+04 1.32E-04 1.45E-09
人源化抗体h75G7C6-1 8.28E+04 1.41E-04 1.71E-09
人源化抗体h75G7C6-2 9.06E+04 1.40E-04 1.54E-09
人源化抗体h75G7C6-9 9.89E+04 1.75E-04 1.77E-09
人源化抗体h75G7C6-13 1.25E+05 1.81E-04 1.45E-09
表35.人源化h75G7C6抗体变体与EGFR蛋白的结合亲和力
抗体名称 Ka(1/Ms) Kdis(1/s) KD(M)
嵌合抗体c75G7C6 1.65E+04 3.62E-03 2.20E-07
人源化抗体h75G7C6-1 1.72E+04 3.53E-03 2.05E-07
人源化抗体h75G7C6-2 2.03E+04 4.05E-03 2.00E-07
人源化抗体h75G7C6-9 2.02E+04 4.35E-03 2.15E-07
人源化抗体h75G7C6-13 2.25E+04 4.76E-03 2.11E-07
OctetRED结果显示，人源化h75G7C6抗体变体与EGFRvIII和EGFR蛋白的结合亲和力与嵌合抗体c75G7C6非常接近，这验证了人源化h75G7C6抗体与嵌合抗体相比，没有显著降低抗原结合活性。且人源化h75G7C6抗体变体与EGFRvIII蛋白的结合亲和力约为1.5nM，与EGFR蛋白的结合亲和力约为0.2uM。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 凯惠科技发展（上海）有限公司
<120> 一种EGFRvIII抗体及其偶联物、制备方法和应用
<130> P180117001C
<150> 201711329680.1
<151> 2017-12-13
<160> 192
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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20 25 30
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Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Pro Val Tyr Tyr Ala Met Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Phe
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Gly Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Gly Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Phe
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 11
Asn Pro Asn Ser Gly Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Gly Gly Gly Arg Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 13
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 14
His Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn Ile Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
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<400> 15
His Gly Thr Asn Leu Glu Asp
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 16
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Phe Thr
1 5
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<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ile Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
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<211> 7
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<213> Mus musculus
<400> 18
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
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<213> Mus musculus
<400> 19
Asn Pro Ser Ser Gly Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
Gly Gly Gly Arg Gly Phe Ala Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 21
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<211> 10
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<213> Mus musculus
<400> 22
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
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<211> 7
<212> PRT
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<400> 23
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Ser Leu Thr
1 5
<210> 25
<211> 114
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 25
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
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100 105 110
Ser Ser
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Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
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Gly Phe Phe Asp Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 29
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65 70 75 80
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100 105 110
Lys
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Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
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Thr
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1 5
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Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
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50 55 60
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<400> 39
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1 5
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Val Gln Tyr Ala His Phe Pro Pro Thr
1 5
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<211> 113
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 41
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Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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100 105 110
Ser
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<400> 42
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1 5
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1
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1 5
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<400> 49
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65 70 75 80
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100 105 110
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115
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 50
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
1 5
<210> 51
<211> 6
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<213> Mus musculus
<400> 51
Asp Pro Glu Asp Gly Glu
1 5
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<211> 8
<212> PRT
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<400> 52
Ser Ala Tyr Tyr Gly Arg Asn Tyr
1 5
<210> 53
<211> 108
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 53
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50 55 60
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<400> 54
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1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 56
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1 5
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<213> Mus musculus
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<400> 58
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Phe
1 5
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<213> Mus musculus
<400> 59
Asp Pro Glu Asp Gly Glu
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<211> 8
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<400> 60
Ser Ser Tyr Tyr Gly Asn Asn Tyr
1 5
<210> 61
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<211> 12
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<400> 62
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1 5
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<400> 68
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1 5
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<212> PRT
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<400> 69
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<400> 70
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<212> PRT
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<400> 71
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1 5
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<400> 72
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1 5
<210> 73
<211> 116
<212> PRT
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<400> 73
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
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<400> 74
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
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<400> 76
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<212> PRT
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<400> 77
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1 5
<210> 81
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 81
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Phe
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Cys Arg Thr Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 82
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Phe
1 5
<210> 83
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 83
Asp Pro Glu Asp Gly Glu
1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 84
Arg Thr Gly Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 85
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 85
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Ser Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 86
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 87
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 88
Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Trp Thr
1 5
<210> 89
<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 89
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Glu Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Ile Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Asn Ser Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 90
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 90
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr
1 5
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 91
Ser Tyr Asp Gly Ser
1 5
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 92
Asn Ser Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5
<210> 93
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 93
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 94
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 95
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 95
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 96
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Ser Leu Thr
1 5
<210> 97
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 97
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Asn Leu Pro Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Cys Arg Thr Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala
115
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 98
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
1 5
<210> 99
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 99
Asp Pro Glu Asp Gly Glu
1 5
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 100
Arg Thr Gly Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 101
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 101
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 102
His Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Asn Ile Gly
1 5 10
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 103
His Gly Thr Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 104
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 105
<211> 372
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 105
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta acaatggtga tactatctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aaggggggac 300
tatgatggtt actacccggt ttactatgct atggactatt ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 106
<211> 324
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 106
gaaaatgtgc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc 60
atgacctgca gggccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120
tcaggtgcct cccccaaact ctggattttt agcacatcca acttggctgc tggagtccct 180
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacagtcag cagtgtggag 240
gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtacagtg gttacccact cacgttcggt 300
gctgggacca agctggagct gaaa 324
<210> 107
<211> 351
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 107
caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggcgcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttatt agcttcacga tgcactgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta acagtggtta tactaagtac 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgcaggcc aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtac aagagggggg 300
ggacgagggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 108
<211> 321
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 108
gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcacc 60
atcacttgcc atgcaagtca ggacattaac agtaatatag ggtggttgca gcagaaacca 120
gggaaatcat ttaaggccct gatctatcat ggaaccaact tggaagatgg agttccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggagcagac tattctctca ccatcagcag cctggaatct 240
gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgctcagt ttccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
<210> 109
<211> 351
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 109
caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggtgcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttttct agctacacga tgcactgggc aaaacagagg 120
cctggacagg gtcttgaatg gattgggtac attaatccta gcagtggtta tacaaagtac 180
aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctat 240
atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctatagtct attactgtgc aagagggggg 300
ggacgagggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 110
<211> 318
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 110
Cys Ala Ala Ala Thr Thr Gly Thr Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Cys
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Thr
20 25 30
Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala
50 55 60
Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Thr Cys
65 70 75 80
Ala Ala Gly Thr Gly Thr Ala Ala Gly Thr Thr Ala Cys Ala Thr Gly
85 90 95
Thr Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys
115 120 125
Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Ala Thr
130 135 140
Gly Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly
145 150 155 160
Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr
165 170 175
Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr
180 185 190
Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Cys Thr Thr
195 200 205
Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly
210 215 220
Cys Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala
225 230 235 240
Gly Ala Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Thr Thr Ala Thr Thr
245 250 255
Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly
260 265 270
Thr Ala Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Cys Ala Cys Gly
275 280 285
Thr Thr Cys Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala
290 295 300
Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala
305 310 315
<210> 111
<211> 342
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 111
gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacaaca tgtactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggatat gttgatcctt ccaatggtgg tactaactac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240
atgcatctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagggttc 300
tttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca 342
<210> 112
<211> 339
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 112
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccaatagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaaaagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttataggtat 300
ccggtcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339
<210> 113
<211> 399
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 113
tgcctgcagg tcgacgattc taatacgact cactataggg caagcagtgg tatcaacgca 60
gagtacgcgg ggggacctgg cctggtgaaa ccttctcagt ctctgtccct cacctgcact 120
gtcactgact actcaatcac cagtgattat gcctggaact ggatccggca gtttccagga 180
aacaaactgg agtggatggg ttacataagc tacagtggta acactaacta caacccatct 240
ctcaaaagtc gaatctctat cacccgagac acatccaaga accagttctt cctgcagttg 300
aattctgtga ctactgagga cacagccaca tattactgtg caagactggg acgagggttt 360
gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctctgca 399
<210> 114
<211> 321
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 114
gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 60
atcacttgcc atgcaagtca ggacattaac agtaatattg ggtggctgca gcagaaacca 120
gggacatcat ttaagggcct gatctatcat ggaagaaact tggaagatgg agttccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tggagaagat tattctctca ccatcagcag cctggaatct 240
gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgctcatt ttcctcccac gttcggtgct 300
gggaccaaac tggagctgaa g 321
<210> 115
<211> 339
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 115
gaggttcacc tgcagcagtc tgtggccgag cttgtaaggc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa aacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180
gccccgaagt tccagggcaa ggccactata actgcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccatct attactgtgc tagtgacttt 300
gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca 339
<210> 116
<211> 336
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 116
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagtctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagcattgta aatagtaatg gaaataccca tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag gtcctgatct acaaagtttc caaacgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 117
<211> 351
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 117
gaggttcagc tgctgcagtc tggggcagaa cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactactata tgcactgggt gaaacagagg 120
actgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg aggatggtga aactaaatat 180
gccccgaaat tccagggcaa ggccactatg acagcggaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attattgtgc tagttccgcc 300
tactacggtc gtaactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc c 351
<210> 118
<211> 324
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 118
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctcctgggga gaaggtcacc 60
ttgacctgca gtgccagttc tagtttaagt tccagctact tgtactggta ccagcagaag 120
ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccct 180
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240
gctgaagatg ctgcctctta tttctgccat cagtggagta gttacccgta cacgttcgga 300
ggggggacca agctggaaat aaaa 324
<210> 119
<211> 351
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 119
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacttctata tacactgggt gaagcagagg 120
actgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg aggatggtga aactaaatat 180
gccccgaaat tccaggacaa ggccactata atagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagctcctcc 300
tactacggta ataactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351
<210> 120
<211> 324
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 120
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctcctgggga gaaggtcacc 60
ttgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tccaactact tgtactggta ccagcagaag 120
ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccct 180
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240
gctgaagatg ctgcctctta tttctgccat cagtggagta gtttcccgta cacgttcgga 300
ggggggacca agctggaaat aaaa 324
<210> 121
<211> 351
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 121
caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggtgcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agttacacga tgcactgggt aaaacagagg 120
cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gcagtggtta tactaagtac 180
aatcagattt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtgt attactgtac aagagggggg 300
ggacgagggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 122
<211> 321
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 122
gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 60
atcacttgcc atgcaagtca ggacattaac agtaatatag ggtggttgca gcagaaacca 120
gggaaatcat ttaagggcct gatctatcat ggaaccaact tggaagatgg agttccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggagcagat tattctctca ccatcagcag cctggaatct 240
gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgctcagt ttccattcac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
<210> 123
<211> 348
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 123
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caatattaaa gactactata tgcactgggt gaagcagagg 120
actgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg aggatggtga aactaaatat 180
gccccgaaat tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcaacctgcc atctgaggac actgccgtct attactgtgc ttgtaggacg 300
ggggggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 124
<211> 318
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 124
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagccgagt ggaggctgaa 240
gatgccgcca cttattactg ccagcagtgg agtagttact cactcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaa 318
<210> 125
<211> 348
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 125
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacttctata tgcactgggt gaagcagagg 120
actgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg aggatggtga aactaaatat 180
gccccgaaat tccagggcaa ggccactata acagcagata catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgg ttgtaggacg 300
ggggggtttg cgtactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
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<211> 318
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 126
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacctatact ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccca gcctcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattattg ccagcagtgg agtagaaacc catggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aaatcaaa 318
<210> 127
<211> 351
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 127
gatgtacaac ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60
acctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggcactg gatccggcag 120
tttccagaaa acaaactgga atggatgggc tacataagct acgatggtag caatatctac 180
aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240
ctgaagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aattaactcg 300
gactatgctt tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351
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<211> 318
<212> DNA
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caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtgagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagttact cactcacgtt cggtgctggg 300
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<212> DNA
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tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactactata tgcactgggt gaagcagagg 120
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gccccgaaat tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcaacctgcc atctgaggac actgccgtct attactgtgg ttgtaggacg 300
ggggggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
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<212> DNA
<213> Mus musculus
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atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aaggggggac 300
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accgtctcct ca 372
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<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体75G7C6重链可变区定点突变（DG/DA）
<400> 132
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta acaatggtga tactatctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aaggggggac 300
tatgatgctt actacccggt ttactatgct atggactatt ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct ca 372
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20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Ala Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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<213> Artificial Sequence
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<223> h63A10A7.VL-g8
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt gagacaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgac atcaacccca acaacgccga caccatctac 180
aaccagaagt tcaaaggtcg tgtgaccatg actcgtgaca ccagcacctc caccgtgtac 240
atggagctga gctctttaag gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtggcgac 300
tacgacggct actaccccgt gtactacgcc atggactact ggggccaagg taccacagtg 360
accgtgagct cc 372
<210> 155
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h75G7C6. VH-g1
<400> 155
caagttcagc tggtgcagag cggcgctgaa gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt gaggcaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatcggcgac attaacccca acaacgccga caccatctac 180
aaccagaagt tcaagggtcg tgtgacttta accgtggaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gctctttaag aagcgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtggcgac 300
tacgacggct actaccccgt gtactacgcc atggactatt ggggccaagg tacaaccgtg 360
accgtgagca gc 372
<210> 156
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h75G7C6. VH-g2
<400> 156
caagttcagc tggtgcagag cggcgctgaa gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt gaagcaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gattggcgac atcaacccca acaacgccga caccatctac 180
aaccagaagt tcaagggtcg tgtgacttta accgtggaca agagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gctctttaag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtggcgac 300
tacgacggct actaccccgt gtactacgcc atggactact ggggccaagg taccacagtg 360
accgtgagca gc 372
<210> 157
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h75G7C6. VH-g3
<400> 157
gaggtgcagc tggtgcagag cggcgctgaa gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt gaagcaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatcggcgac atcaacccca acaacgccga caccatctac 180
aaccagaagt tcaagggtcg tgtgacttta acagtggaca aaagcacctc caccgtgtac 240
atggagctgt cctctttaag gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgtggcgac 300
tacgacggct actaccccgt gtactacgcc atggactact ggggccaagg taccaccgtg 360
accgtgagca gc 372
<210> 158
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h75G7C6. VL-g0
<400> 158
gagatcgtgc tgacccagtc ccccgctaca ctgtctttat cccccggtga gagagccact 60
ttaagctgca gagccagcag cagcgtgagc agcagctatt tacactggta ccagcagaag 120
cccggacaag ctcccagact gctgatctac agcaccagca atttagctgc cggcatcccc 180
gctcgtttca gcggaagcgg aagcggcacc gacttcactt taaccatctc ctctttagag 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtacagcg gctaccctct gaccttcggc 300
ggaggcacca aggtggagat taag 324
<210> 159
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h75G7C6. VL-g1
<400> 159
gagaacgtgc tgacccagag ccccgccaca ctgtctttaa gccccggtga gagggccact 60
ttaagctgca gagccagcag cagcgtgagc agcagctatt tacactggta ccagcagaaa 120
cccggccaag ctcccagact gctgatcttc agcaccagca atttagctgc cggcatcccc 180
gctagattta gcggcagcgg cagcggaacc gactacactt taaccatcag ctctttagaa 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtacagcg gctatcctct gaccttcggc 300
ggcggcacca aggtggagat caag 324
<210> 160
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h75G7C6. VL-g2
<400> 160
gagaacgtgc tgacccagag ccccgctact ttatctttaa gccccggaga aagggccact 60
ttaagctgta gggccagcag cagcgtgagc agctcctatt tacactggta ccagcagaag 120
cccggtcaga gccctcgtct gctgatcttc agcacaagca atttagccgc cggcatcccc 180
gctagattct ccggaagcgg cagcggcacc gactacactt taaccatctc ctctttagag 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtactccg gctacccttt aacctttggc 300
ggaggcacca aggtggagat caag 324
<210> 161
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h75G7C6. VL-g3
<400> 161
gagaacgtgc tgacccagag ccccgctact ttatctttaa gccccggtga gagagccact 60
ttaagctgtc gtgccagcag cagcgtgagc tccagctatt tacactggta ccagcagaag 120
cccggccaga gccccagact gctgatcttc agcaccagca atctggccgc cggagtgccc 180
gctagattca gcggcagcgg aagcggcacc gactacactt taaccatcag ctctttagag 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtacagcg gctacccttt aacattcggc 300
ggaggcacca aggtggagat caag 324
<210> 162
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VH-g2
<400> 162
caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60
tcttgcaagg ccagcggcta caccttcatc agcttcacca tgcattgggt ccggcaggct 120
ccaggacagg gactcgagtg gatgggatac atcaacccca acagcggcta caccaagtac 180
aaccagaagt tcaaggaccg cgtgaccatg accagagaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggat acagccgtgt actattgcac caggggcgga 300
ggcagaggat tcgcttattg gggccaggga acactggtga cagtgtccag c 351
<210> 163
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VH-g3
<400> 163
caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60
tcttgcaagg ccagcggcta caccttcatc agcttcacca tgcattgggt ccggcaggct 120
ccaggacagg gactcgagtg gattggctac atcaacccca acagcggcta caccaagtac 180
aaccagaagt tcaaggaccg cgtgaccctg accagagaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggat acagccgtgt actattgcac caggggcgga 300
ggcagaggat tcgcttattg gggccaggga acactggtga cagtgtccag c 351
<210> 164
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VH-g4
<400> 164
caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60
tcttgcaagg ccagcggcta caccttcatc agcttcacca tgcattgggt caagcagagg 120
ccaggacagg gactcgagtg gattggctac atcaacccca acagcggcta caccaagtac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accagagaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggat acagccgtgt actattgcac caggggcgga 300
ggcagaggat tcgcttattg gggccaggga acactggtga cagtgtccag cgct 354
<210> 165
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VH-g5
<400> 165
caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60
tcttgcaagg ccagcggcta caccttcatc agcttcacca tgcattgggt caagcagagg 120
ccaggacagg gactcgagtg gattggctac atcaacccca acagcggcta caccaagtac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg acagccgatc agtctaccag caccgcctac 240
atggagctga gctctctgag gagcgaggac acagccgtgt actattgcac caggggcgga 300
ggcagaggat tcgcttattg gggccaggga acactggtga cagtgtccag cgct 354
<210> 166
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VH-g6, DNA
<400> 166
caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60
tcttgcaagg ccagcggcta caccttcatc agcttcacca tgcattgggt caagcagagg 120
ccaggacagg gactcgagtg gatgggctac atcaacccca acagcggcta caccaagtac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccatg accagagaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggat acagccgtgt actattgcac caggggcgga 300
ggcagaggat tcgcttattg gggccaggga acactggtga cagtgtccag cgct 354
<210> 167
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VH-g7
<400> 167
caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60
tcttgcaagg ccagcggcta caccttcatc agcttcacca tgcattgggt ccggcaggct 120
ccaggacagg gactcgagtg gattggctac atcaacccca acagcggcta caccaagtac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccctg accagagaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggat acagccgtgt actattgcac caggggcgga 300
ggcagaggat tcgcttattg gggccaggga acactggtga cagtgtccag cgct 354
<210> 168
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VH-g8
<400> 168
caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtgaagaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60
tcttgcaagg ccagcggcta caccttcatc agcttcacca tgcattgggt caagcagagg 120
ccaggacagg gactcgagtg gattggctac atcaacccca acagcggcta caccaagtac 180
aaccagaagt tcaaggaccg cgtgaccctg accagagaca ccagcaccag caccgtgtac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggat acagccgtgt actattgcac caggggcgga 300
ggcagaggat tcgcttattg gggccaggga acactggtga cagtgtccag cgct 354
<210> 169
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VL-g3
<400> 169
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggaga tagagtgacc 60
atcacttgcc acgccagcca ggacatcaac agcaacatcg gttggctgca gcagaagccc 120
ggcaagagct tcaaggccct gatctaccac ggcacaaatc tggaggacgg agtgcctagc 180
agattcagcg gcagcggaag cggagccgat tacaccctga ccatcagcag cctgcagcca 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcgtgcag tacgcccagt tccccttcac cttcggacag 300
ggaaccaagc tggagatcaa g 321
<210> 170
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VL-g4
<400> 170
gacatcctga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcta gcgtgggaga tagagtgacc 60
atcacttgcc acgccagcca ggacatcaac agcaacatcg gttggctgca gcagaagccc 120
ggcaagagct tcaaggccct gatctaccac ggcacaaatc tggaggacgg agtgcctagc 180
agattcagcg gcagcggaag cggagccgat tacaccctga ccatcagcag cctgcagcca 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcgtgcag tacgcccagt tccccttcac cttcggacag 300
ggaaccaagc tggagatcaa gcgtacg 327
<210> 171
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VL-g5
<400> 171
gacatcctga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga tagagtgacc 60
atcacttgcc acgccagcca ggacatcaac agcaacatcg gttggctgca gcagaagccc 120
ggcaaggctc ctaaggccct gatctaccac ggcacaaatc tggaggacgg agtgcctagc 180
agattcagcg gcagcggaag cggagccgat tacaccctga ccatcagcag cctgcagcca 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcgtgcag tacgcccagt tccccttcac cttcggacag 300
ggaaccaagc tggagatcaa gcgtacg 327
<210> 172
<211> 328
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VL-g6
<400> 172
ggacatcctg atgacccaga gccctagcag cctgagcgcc agcgtgggag atagagtgac 60
catcacttgc cacgccagcc aggacatcaa cagcaacatc ggttggctgc agcagaagcc 120
cggcaagagc ttcaaggccc tgatctacca cggcacaaat ctggaggacg gagtgcctag 180
cagattcagc ggcagcggaa gcggaacaga ttacaccctg accatcagca gcctgcagcc 240
agaggacttc gccacctact actgcgtgca gtacgcccag ttccccttca ccttcggaca 300
gggaaccaag ctggagatca agcgtacg 328
<210> 173
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VL-g7
<400> 173
gacatcctga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga tagagtgacc 60
atcacttgcc acgccagcca ggacatcaac agcaacatcg gttggtatca gcagaagccc 120
ggcaagagct tcaaggccct gatctaccac ggcacaaatc tggaggacgg agtgcctagc 180
agattcagcg gcagcggaag cggagccgat tacaccctga ccatcagcag cctgcagcca 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcgtgcag tacgcccagt tccccttcac cttcggacag 300
ggaaccaagc tggagatcaa gcgtacg 327
<210> 174
<211> 328
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h63A10A7.VL-g8
<400> 174
gacatcctga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga tagagtgacc 60
atcacttgcc acgccagcca ggacatcaac agcaacatcg gttggtatca gcagaagccc 120
ggcaagagct tcaaggccct gatctaccac ggcacaaatc tggaggacgg agtgcctagc 180
agattcagcg gcagcggaag cggagccgat ttcaccctga ccatcagcag cctgcagcca 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcgtgcag tacgcccagt tccccttcac cttcggacag 300
ggaaccaagc tggagatcaa gcgtacgg 328
<210> 175
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 175
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 176
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 176
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 177
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 177
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro
85 90 95
<210> 178
<211> 95
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 178
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 179
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体75G7C6重链可变区定点突变（NG/NA）
<400> 179
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Ala Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Pro Val Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 180
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体75G7C6重链可变区定点突变（NG/QG）
<400> 180
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Gln Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Pro Val Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 181
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体75G7C6重链可变区定点突变（DG/SG）
<400> 181
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Ser Gly Tyr Tyr Pro Val Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 182
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体75G7C6重链可变区定点突变（DG/EG）
<400> 182
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Tyr Pro Val Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 183
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体75G7C6重链可变区定点突变（DG/DA）
<400> 183
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Asp Ala Tyr Tyr Pro Val Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 184
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体75G7C6重链可变区CDR2定点突变序列（NG/NA）
<400> 184
Asn Pro Asn Asn Ala Asp
1 5
<210> 185
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体75G7C6重链可变区定点突变（NG/NA）
<400> 185
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta acaatgctga tactatctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aaggggggac 300
tatgatggtt actacccggt ttactatgct atggactatt ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 186
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体75G7C6重链可变区CDR2定点突变
<400> 186
Asn Pro Asn Gln Gly Asp
1 5
<210> 187
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体75G7C6重链可变区定点突变（NG/QG）
<400> 187
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta accaaggtga tactatctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aaggggggac 300
tatgatggtt actacccggt ttactatgct atggactatt ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 188
<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 嵌合抗体75G7C6重链可变区定点突变（DG/SG）
<400> 188
gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60
ccctgcaagg cttctggata cacattcact gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta acaatggtga tactatctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240
atggagctcc gcagcctgac atctgaggac actgcagtct attactgtgc aaggggggac 300
tattctggtt actacccggt ttactatgct atggactatt ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 189
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 189
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 190
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 190
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
1 5 10 15
Thr Val Ser Ser
20
<210> 191
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 191
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 192
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 192
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10

Claims (23)

1.一种EGFRvIII抗体，其特征在于，其包括互补决定区(CDR)：重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3中的一种或多种，和/或，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3中的一种或多种，其中，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ ID No.66、SEQ IDNo.74、SEQ ID No.82、SEQ ID No.90或SEQ ID No.98所示；所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQID No.43、SEQ ID No.51、SEQ ID No.59、SEQ ID No.67、SEQ ID No.75、SEQ ID No.83、SEQID No.91、SEQ ID No.99、SEQ ID NO.184或者SEQ ID NO.186所示；所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4、SEQ ID No.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ ID No.60、SEQ ID No.68、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.84、SEQ ID No.92或SEQ ID No.100所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQ ID No.46、SEQID No.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70、SEQ ID No.78、SEQ ID No.86、SEQ ID No.94或SEQ ID No.102所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ IDNo.63、SEQ ID No.71、SEQ ID No.79、SEQ ID No.87、SEQ ID No.95或SEQ ID No.103所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQ ID No.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72、SEQID No.80、SEQ ID No.88、SEQ ID No.96或SEQ ID No.104所示；
或者，所述重链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.2、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.18、SEQ ID No.26、SEQ ID No.34、SEQ ID No.42、SEQ ID No.50、SEQ ID No.58、SEQ IDNo.66、SEQ ID No.74、SEQ ID No.82、SEQ ID No.90或SEQ ID No.98所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQID No.3、SEQ ID No.11、SEQ ID No.19、SEQ ID No.27、SEQ ID No.35、SEQ ID No.43、SEQID No.51、SEQ ID No.59、SEQ ID No.67、SEQ ID No.75、SEQ ID No.83、SEQ ID No.91、SEQID No.99、SEQ ID NO.184或者SEQ ID NO.186所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述重链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.4、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.20、SEQ ID No.28、SEQ ID No.36、SEQ ID No.44、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.60、SEQ ID No.68、SEQ ID No.76、SEQ ID No.84、SEQ ID No.92或SEQ ID No.100所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.6、SEQ ID No.14、SEQ ID No.22、SEQ ID No.30、SEQ ID No.38、SEQID No.46、SEQ ID No.54、SEQ ID No.62、SEQ ID No.70、SEQ ID No.78、SEQ ID No.86、SEQID No.94或SEQ ID No.102所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR2的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID No.7、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.31、SEQ ID No.39、SEQ ID No.47、SEQ ID No.55、SEQ ID No.63、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.79、SEQ ID No.87、SEQ ID No.95或SEQ ID No.103所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示；所述轻链CDR3的氨基酸序列与如序列表中SEQID No.8、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.32、SEQ ID No.40、SEQ ID No.48、SEQID No.56、SEQ ID No.64、SEQ ID No.72、SEQ ID No.80、SEQ ID No.88、SEQ ID No.96或SEQ ID No.104所示的氨基酸序列至少有80％的序列同源性的氨基酸序列所示。
2.如权利要求1所述的EGFRvIII抗体，其特征在于，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.10所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.11所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.12所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.18所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.19所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列中表SEQ ID No.20所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.26所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.27所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.28所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.34所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.35所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.36所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.42所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.43所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.44所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.50所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.51所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.52所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.58所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.59所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.60所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.66所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.67所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.68所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.74所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.75所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.76所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.82所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.83所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.84所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.90所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.91所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.92所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.98所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.99所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.100所示；所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQID No.184所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；或者，所述重链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示，所述重链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.186所示，且所述重链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；
所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.14所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.15所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.16所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.22所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.23所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.24所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.30所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.31所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.32所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.38所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.39所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.40所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.46所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.47所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.48所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.54所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.55所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.56所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.62所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.63所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.64所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.70所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.71所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.72所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.78所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.79所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.80所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.86所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.87所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.88所示；所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.94所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.95所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.96所示；或所述轻链CDR1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.102所示，所述轻链CDR2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.103所示，且所述轻链CDR3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.104所示。
3.如权利要求1或2所述的EGFRvIII抗体，其特征在于，其还包括抗体的构架区，所述构架区包括重链构架区和/或轻链构架区；较佳地，所述重链构架区为人或鼠抗体重链构架区，和/或，所述轻链构架区为人或鼠抗体轻链构架区；更佳地，所述轻链构架区为人抗体轻链构架区，优选为人种系抗体轻链IGKV1-39*01或IGKV3-11*01的FR1、FR2、FR3区，和JK-2或JK-4的FR4区的人抗体轻链构架区的组合；且所述重链构架区为人抗体重链构架区，优选为人种系抗体重链IGHV1-46*01的FR1、FR2、FR3区，和JH-4或JH-6b的FR4区的人抗体重链构架区的组合。
4.如权利要求3所述的EGFRvIII抗体，其特征在于，所述EGFRvIII抗体包括含有所述CDR的重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.1、SEQ ID No.9、SEQ ID No.17、SEQ ID No.25、SEQ ID No.33、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.49、SEQ ID No.57、SEQ ID No.65、SEQ ID No.73、SEQ ID No.81、SEQ ID No.89、SEQ IDNo.97、SEQ ID No.179、SEQ ID No.180、SEQ ID NO.133、SEQ ID NO.134、SEQ ID NO.135、SEQ ID NO.136、SEQ ID NO.141、SEQ ID NO.142、SEQ ID NO.143、SEQ ID NO.144、SEQ IDNO.145、SEQ ID NO.146或SEQ ID NO.147所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.29、SEQ ID No.37、SEQ ID No.45、SEQ ID No.53、SEQ ID No.61、SEQ ID No.69、SEQ ID No.77、SEQ ID No.85、SEQ IDNo.93、SEQ ID No.101、SEQ ID NO.137、SEQ ID NO.138、SEQ ID NO.139、SEQ ID NO.140、SEQ ID NO.148、SEQ ID NO.149、SEQ ID NO.150、SEQ ID NO.151、SEQ ID NO.152或SEQ IDNO.153所示；
或者，所述的重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.25、SEQ ID No.33、SEQ ID No.41、SEQ ID No.49、SEQ ID No.57、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.73、SEQ ID No.81、SEQ ID No.89、SEQ ID No.97、SEQ ID No.179、SEQID No.180、SEQ ID NO.133、SEQ ID NO.134、SEQ ID NO.135、SEQ ID NO.136、SEQ IDNO.141、SEQ ID NO.142、SEQ ID NO.143、SEQ ID NO.144、SEQ ID NO.145、SEQ ID NO.146或SEQ ID NO.147所示的氨基酸序列至少有80％序列同源的氨基酸序列所示；所述的轻链可变区序列如序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.13、SEQ ID No.21、SEQ ID No.29、SEQ IDNo.37、SEQ ID No.45、SEQ ID No.53、SEQ ID No.61、SEQ ID No.69、SEQ ID No.77、SEQ IDNo.85、SEQ ID No.93、SEQ ID No.101、SEQ ID NO.137、SEQ ID NO.138、SEQ ID NO.139、SEQ ID NO.140、SEQ ID NO.148、SEQ ID NO.149、SEQ ID NO.150、SEQ ID NO.151、SEQ IDNO.152或SEQ ID NO.153所示的氨基酸序列至少有80％序列同源的氨基酸序列所示。
5.如权利要求4所述的EGFRvIII抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.9所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.13所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.17所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.21所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.25所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.29所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.33所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.37所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.41所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.45所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.49所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.53所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQID No.57所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.61所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.65所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.69所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.73所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.77所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.81所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.85所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.89所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.93所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.97所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.101所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.179所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.180所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.133所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.137所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.133所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.138所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.133所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.139所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.133所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.140所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.134所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.137所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.134所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.138所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.134所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.139所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.134所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.140所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.135所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.137所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.135所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.138所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.135所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.139所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.135所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.140所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.136所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.137所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.136所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.138所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.136所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.139所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.136所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.140所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.144所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.145所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.146所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.147所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.148所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.150所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.151所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.152所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.143所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.153所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.141所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.141所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.150所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.141所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.151所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.141所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.152所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.141所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.153所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.142所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.149所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.142所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.150所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.142所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.151所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.142所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.152所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.142所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.153所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.145所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.148所示的序列；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.146所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.148所示的序列；或者，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.147所示的序列，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.148所示的序列。
6.如权利要求1～5任一项所述的EGFRvIII抗体，其特征在于，所述的EGFRvIII抗体还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区，所述的抗体重链恒定区优选人源或小鼠源抗体重链恒定区，所述的抗体轻链恒定区优选人源或小鼠源抗体轻链恒定区。
7.如权利要求1～6任一项所述的EGFRvIII抗体，其特征在于，所述的EGFRvIII抗体是EGFRvIII的单克隆抗体、抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体、单域抗体或单区抗体。
8.一种核酸，其特征在于，其编码如权利要求1～7任一项所述的EGFRvIII抗体。
9.如权利要求8所述的核酸，其特征在于，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.105、SEQ ID No.107、SEQ ID No.109、SEQ ID No.111、SEQ IDNo.113、SEQ ID No.115、SEQ ID No.117、SEQ ID No.119、SEQ ID No.121、SEQ ID No.123、SEQ ID No.125、SEQ ID No.127、SEQ ID No.129、SEQ ID No.185、SEQ ID No.154、SEQ IDNo.155、SEQ ID No.156、SEQ ID No.157、SEQ ID No.162、SEQ ID No.163、SEQ ID No.164、SEQ ID No.165、SEQ ID No.166、SEQ ID No.167或SEQ ID No.168所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.106、SEQ ID No.108、SEQ IDNo.110、SEQ ID No.112、SEQ ID No.114、SEQ ID No.116、SEQ ID No.118、SEQ ID No.120、SEQ ID No.122、SEQ ID No.124、SEQ ID No.126、SEQ ID No.128、SEQ ID No.130、SEQ IDNo.158、SEQ ID No.159、SEQ ID No.160、SEQ ID No.161、SEQ ID No.169、SEQ ID No.170、SEQ ID No.171、SEQ ID No.172、SEQ ID No.173或SEQ ID No.174所示。
10.如权利要求9所述的核酸，其特征在于，编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.105所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.106所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.107所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.108所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.109所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.110所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.111所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.112所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQID No.113所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.114所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.115所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.116所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.117所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.118所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.119所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.120所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.121所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.122所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.123所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.124所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.125所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No126.所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.127所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.128所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.129所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.130所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.185所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.106所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.154所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.158所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.154所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.159所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.154所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.160所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQID No.154所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.161所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.155所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.158所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.155所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.159所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.155所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.160所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.155所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.161所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.156所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.158所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.156所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.159所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.156所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.160所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.156所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.161所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.157所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.158所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.157所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.159所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.157所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.160所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.157所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.161所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.165所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.166所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.167所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.168所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.169所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.171所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.172所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.173所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.164所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.174所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.162所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.162所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.171所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.162所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.172所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.162所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.173所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.162所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.174所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.163所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.170所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.163所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.171所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.163所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.172所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.163所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.173所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.163所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.174所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.166所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.169所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.167所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.169所示；编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.168所示，且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.169所示。
11.一种包含如权利要求8～10中任一项所述的核酸的重组表达载体。
12.一种包含如权利要求11所述的重组表达载体的重组表达转化体。
13.一种EGFRvIII抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养权利要求12所述的重组表达转化体，从培养物中获得EGFRvIII抗体。
14.一种免疫偶联物，其特征在于，其包括共价附着至细胞毒剂的如权利要求1～7任一项所述的EGFRvIII抗体。
15.如权利要求14所述的免疫偶联物，其特征在于，1当量如权利要求1～7任一项所述的EGFRvIII抗体通过x当量接头与y当量细胞毒剂相连，其具有式1所示结构，
Ab-(L)x-(D)y
式1
其中，Ab为如权利要求1～7中任一项所述的EGFRvIII抗体；L为接头；D为细胞毒剂；x为自然数，优选为1～20；y为大于0的自然数，优选为1～20；x和y各自独立地更优选为2w，w为1～5的整数、进一步优选为3～4；x和y的比例优选为1:1。
16.如权利要求15所述的免疫偶联物，其特征在于，所述接头L含有式2的结构，其为L中离去基团离去后对应的剩余部分：
(CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)＝Q-Sp)
式2
较佳地，所述的接头L为马来酰亚胺基己酰(MC)；和/或，所述D为甲基奥瑞他汀F(MMAF)或者甲基奥瑞他汀E(MMAE)。
17.如权利要求14～16任一项所述的免疫偶联物，其特征在于，所述式1中x＝y＝n，所述免疫偶联物的结构如式3所示，
式3中m为1～10，优选m为5，L为马来酰亚胺基己酰；D为甲基奥瑞他汀F(MMAF)；其中，n为自然数，优选为1～20的整数，更优选为2w，w为1～5的整数、进一步优选为3～4。
18.一种药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求1～7中任一项所述的EGFRvIII抗体或者权利要求14～17任一项所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如权利要求1～7中任一项所述的EGFRvIII抗体或者如权利要求14～17任一项所述的免疫偶联物，和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
20.一种如权利要求1～7任一项所述的EGFRvIII抗体、或者如权利要求14～17任一项所述的免疫偶联物、或者如权利要求18～19所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
21.一种检测过表达EGFRvIII蛋白的细胞的方法，其特征在于，包括如下的步骤：如权利要求1～7中任一项所述的EGFRvIII抗体与待检样品在体外接触，检测如权利要求1～7中任一项所述的EGFRvIII抗体与所述待检样品的结合即可。
22.一种检测过表达EGFRvIII蛋白的细胞的组合物，其特征在于，其包括如权利要求1～7中任一项所述的EGFRvIII抗体作为活性成分。
23.一种如权利要求1～7中任一项所述的EGFRvIII抗体、或者如权利要求14～17任一项所述的免疫偶联物、或者如权利要求18～19所述的药物组合物在制备预防或治疗与EGFRvIII表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用；较佳地，所述的与EGFRvIII表达或功能异常相关的疾病为肿瘤，所述肿瘤优选膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌或者肾癌。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114044826A (zh) * 2021-10-12 2022-02-15 南京融捷康生物科技有限公司 针对EGFRvIII的单域抗体及其衍生蛋白和应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2022312311A1 (en) * 2021-07-16 2024-02-08 Noile-Immune Biotech Inc. Anti-EGFRviii antibody, polypeptide, cell capable of expressing said polypeptide, pharmaceutical composition comprising said cell, method for producing said cell, and polynucleotide or vector comprising nucleotide sequence encoding said polypeptide
WO2023133594A2 (en) * 2022-01-10 2023-07-13 Tentarix Biotherapeutics, Inc. Stabilized single immunoglobulin variable domains

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1266009A2 (en) * 2000-02-25 2002-12-18 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES ANTI-EGFRvIII SCFVS WITH IMPROVED CYTOTOXICITY AND YIELD, IMMUNOTOXINS BASED THEREON, AND METHODS OF USE THEREOF
CN101484807A (zh) * 2006-03-31 2009-07-15 麻省理工学院 表达突变型egf受体的肿瘤的治疗
US8025878B2 (en) * 2006-03-23 2011-09-27 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril selective antibodies and the use thereof
WO2014130657A1 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using humanized anti-egfrviii chimeric antigen receptor
US9125846B2 (en) * 2010-10-15 2015-09-08 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies that bind amyloid oligomers
CN106459200A (zh) * 2014-03-21 2017-02-22 艾伯维公司 抗‑egfr抗体及抗体药物偶联物
CN107108735A (zh) * 2014-11-25 2017-08-29 药物抗体公司 新型egfrviii抗体和包含所述抗体的组合物

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3960855A1 (en) 2001-12-28 2022-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for stabilizing proteins
ES2362667T3 (es) 2004-01-09 2011-07-11 Pfizer Inc. ANTICUERPOS FRENTE A MAdCAM.
WO2012058592A2 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Immunogen, Inc. Non-antagonistic egfr-binding molecules and immunoconjugates thereof
PE20141937A1 (es) 2011-11-16 2014-12-18 Amgen Inc Metodos para tratar trastornos relacionados con mutante viii de eliminacion de factor de crecimiento epidermico
SG11201405087PA (en) * 2012-03-02 2014-09-26 Regeneron Pharma Human antibodies to clostridium difficile toxins
EP3126388B1 (en) 2014-03-11 2019-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-egfrviii antibodies and uses thereof
EP3288568A4 (en) * 2015-04-30 2019-01-02 University of Southern California Secretory tnt car cell immunotherapy
US10988528B2 (en) * 2015-08-13 2021-04-27 New York University Antibody-based molecules specific for the truncated ASP421 epitope of Tau and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
EP3405490B1 (en) 2016-01-21 2021-10-20 Pfizer Inc. Mono and bispecific antibodies for epidermal growth factor receptor variant iii and cd3 and their uses

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1266009A2 (en) * 2000-02-25 2002-12-18 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES ANTI-EGFRvIII SCFVS WITH IMPROVED CYTOTOXICITY AND YIELD, IMMUNOTOXINS BASED THEREON, AND METHODS OF USE THEREOF
US8025878B2 (en) * 2006-03-23 2011-09-27 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril selective antibodies and the use thereof
CN101484807A (zh) * 2006-03-31 2009-07-15 麻省理工学院 表达突变型egf受体的肿瘤的治疗
US9125846B2 (en) * 2010-10-15 2015-09-08 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies that bind amyloid oligomers
WO2014130657A1 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using humanized anti-egfrviii chimeric antigen receptor
CN106459200A (zh) * 2014-03-21 2017-02-22 艾伯维公司 抗‑egfr抗体及抗体药物偶联物
CN107108735A (zh) * 2014-11-25 2017-08-29 药物抗体公司 新型egfrviii抗体和包含所述抗体的组合物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUI K GAN等: "The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII)：where wild things are altered", 《FEBS J.》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114044826A (zh) * 2021-10-12 2022-02-15 南京融捷康生物科技有限公司 针对EGFRvIII的单域抗体及其衍生蛋白和应用
CN114044826B (zh) * 2021-10-12 2023-11-17 南京融捷康生物科技有限公司 针对EGFRvIII的单域抗体及其衍生蛋白和应用

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