CN106459199B - 抗-egfrviii抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了与EGFR的III类变体(EGFRvIII)结合的抗体及其使用方法。根据某些实施方式，本申请的抗体以较高的亲和性与人EGFRvIII结合。本申请的抗体可以是全人源抗体。本申请包括与细胞毒剂、放射性核素或其他不利于细胞生长或增殖的部分缀合的抗‑EGFRvIII抗体。本申请的抗体用于治疗各种癌症。

Description

抗-EGFRVIII抗体及其用途
发明领域
本发明涉及与人表皮生长因子受体(EGFR)的缺失突变体(具体地为III型缺失突变体EGFRvIII)特异性结合的人源抗体和人源抗体的抗原结合片段，以及使用这些抗体的治疗和诊断方法。
背景技术
已报道在多种人类肿瘤中存在表皮生长因子(EGF)受体或EGFR的过表达和/或基因扩增，包括在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、脑癌和各种鳞癌中的那些(Wong,A.J.等，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:6899-6903；Harris等，1992,Natl.Cancer Inst.Monogr.11:181-187)。然而，因为多种正常组织也表达这种受体其可能与肿瘤靶点一起被靶向，靶向EGFR的抗肿瘤疗法一直存在问题。同时，已经报道了多种具有EGFR基因扩增的胶质母细胞瘤通常含有基因重排(Ekstrand,A.J.等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4309-4313；Wong A.J.等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:2965-2969)。在一项研究中，发现在44例胶质母细胞瘤中有17例在EGFR编码序列中具有一个或多个改变并且所有这些病例均含有扩增的EGFR，而无基因扩增的22个病例均未显示出任何肿瘤特异性序列的异常(Frederick,L.等，2000,Cancer Res 60:1383-1387)。同一项研究还显示在个别肿瘤中能够检测到多种类型EGFR的突变。
EGFR的III型变体(EGFRvIII)是在胶质母细胞瘤中最常见的EGFR变体(Bigner等，1990,Cancer Res 50:8017-8022；Humphrey等，1990,Proc Natl Acad Sci USA 87:4207-4211；Yamazaki等，1990,Jap J Cancer Res 81:773-779；Ekstrand等，1992,Proc NatlAcad Sci USA 89:4309-4313；Wikstrand等，1995,Cancer Res 55:3140-3148；和Frederick等，2000,Cancer Res 60:1383-1387)。EGFRvIII的特征为EGFR基因的外显子2-7缺失，结果导致编码区801个碱基对的框架内缺失，即缺失6-273个氨基酸残基(根据成熟EGFR的残基数)，以及在融合连接处产生新的甘氨酸(Humphrey等，1988,Cancer Res 48:2231-2238；Yamazaki等，1990，如上所述)。已证实EGFRvIII具有不依赖于配体、较弱但组成型地活化激酶的活性以及具有增强的致瘤性(Nishikawa等，1994,Proc Natl Acad SciUSA 91:7727-7731；和Batra等，1995,Cell Growth and Differentiation 6:1251-1259)。除了胶质瘤以外，已在导管和导管内乳腺癌(Wikstrand等，1995,Cancer Res 55:3140-3148)、非小细胞肺癌(Garcia de Palazzo等，1993,Cancer Res 53:3217-3220)、卵巢癌(Moscatello等，1995,Cancer Res 55:5536-5539)、前列腺癌(Olapade-Olaopa等，2000,British J Cancer 82:186-194)以及头颈部鳞状细胞癌(Tinhofer等，2011,Clin CancerRes 17(15):5197–5204)中检测到了EGFRvIII。而相反的是，这些和其他研究中报道正常组织不表达EGFRvIII(Garcia de Palazzo等，1993，如上所述；Wikstrand等，1995，如上所述；和Wikstrand等，1998,J Neuro Virol 4:148-158)。EGFRvIII高度肿瘤特异性的性质使其成为用于治疗表达这种分子的癌症和肿瘤的特别有用的靶点。
人EGFR的核酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：145和146所示，EGFRvIII的氨基酸序列如SEQ ID NO：147所示。在例如US 5,212,290、US 7,736,644、US 7,589,180和US 7,767,792中对EGFRvIII的抗体进行了描述。
发明简述
本发明提供了与EGFRvIII结合的抗体及其抗原结合片段。本发明的抗体是有用的，特别是用于靶向表达EGFRvIII的肿瘤细胞。本发明的抗EGFRvIII抗体及其抗原结合部分可以以未经修饰的形式单独使用，或者可以作为抗体-药物缀合物或双特异性抗体的一部分。
本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或者可以仅包括抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段)，以及可以对其进行修饰以影响其功能，例如以消除残留的效应器功能(Reddy等，2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
本发明抗EGFRvIII抗体的示例列于本申请中的表1和表2中。表1列出了示例性抗EGFRvIII抗体重链可变区(HCVR)、轻链可变区(LCVR)、重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识符。表2列出了示例性抗EGFRvIII抗体HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列标识符。
本发明提供了与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR含有选自表1中列出的任意HCVR氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似序列的氨基酸序列。
本发明还提供了与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含LCVR，所述LCVR含有选自表1中列出的任意LCVR氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似序列的氨基酸序列。
本发明还提供了与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR的氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，所述HCVR和LCVR的氨基酸序列对含有与表1中列出的任意LCVR氨基酸序列配对的表1中列出的任意HCVR氨基酸序列。根据某些实施方式，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含在表1中列出的任意示例性抗EGFRvIII抗体中含有的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在某些实施方式中，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对选自下组：2/20、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122和130/138。
本发明还提供了与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1(HCDR1)，所述重链CDR1含有选自表1中列出的任意HCDR1氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似序列的序列。
本发明还提供了与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2(HCDR2)，所述重链CDR2含有选自表1中列出的任意HCDR2氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似序列的序列。
本发明还提供了与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3(HCDR3)，所述重链CDR3含有选自表1中列出的任意HCDR3氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似序列的序列。
本发明还提供了与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1(LCDR1)，所述轻链CDR1含有选自表1中列出的任意LCDR1氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似序列的序列。
本发明还提供了与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR2(LCDR2)，所述轻链CDR2含有选自表1中列出的任意LCDR2氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似序列的序列。
本发明还提供了与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR3(LCDR3)，所述轻链CDR3含有选自表1中列出的任意LCDR3氨基酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似序列的序列。
本发明还提供了与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR3和LCDR3的氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，所述HCDR3和LCDR3的氨基酸序列对含有表1中列出的任意HCDR3氨基酸序列，其与表1中列出的任意LCVR3氨基酸序列配对。根据某些实施方式，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含在表1中列出的任意示例性抗EGFRvIII抗体中含有的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
本发明还提供了与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含在表1中列出的任意示例性抗EGFRvIII抗体中含有的一组6个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些实施方式中，所述HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合选自下组：4-6-8-12-14-16；20-22-24-28-30-32；36-38-40-44-46-48；52-54-56-60-62-64；68-70-72-76-78-80；84-86-88-92-94-96；100-102-104-108-110-112；116-118-120-124-126-128和132-134-136-140-142-144。
在一个相关的实施方式中，本发明提供了特异性与EGFRvIII结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由在表1中列出的任意示例性抗EGFRvIII抗体定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对中含有的一组6个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。例如，本发明包含与EGFRvIII特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含在选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对中含有的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合：18/26；66/74；274/282；290/298和370/378。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列中CDR的方法和技术是本领域熟知的并且可以用于鉴定本申请公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列中的CDR。能够用于标识CDR边界的示例性的规定包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。概括地说，Kabat定义是基于序列的变异性、Chothia定义是基于结构环区的位置和AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折中。参见例如Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest"National Institutesof Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)和Martin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。还可以利用公共数据库鉴定抗体中的CDR序列。
本发明还提供了编码抗EGFRvIII抗体或其部分的核酸分子。例如，本发明提供了编码表1中列出的任意HCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCVR核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表1中列出的任意LCVR氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCVR核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表1中列出的任意HCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCDR1核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表1中列出的任意HCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCDR2核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表1中列出的任意HCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意HCDR3核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表1中列出的任意LCDR1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCDR1核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表1中列出的任意LCDR2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCDR2核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表1中列出的任意LCDR3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方式中，所述核酸分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自表2中列出的任意LCDR3核酸序列或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码HCVR的核酸分子，其中所述HCVR包含一组3个CDR(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中所述HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列集合由表1中列出的任意示例性抗EGFRvIII抗体定义。
本发明还提供了编码LCVR的核酸分子，其中所述LCVR包含一组3个CDR(即，LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中所述LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合由表1中列出的任意示例性抗EGFRvIII抗体定义。
本发明还提供了编码HCVR和LCVR两者的核酸分子，其中所述HCVR包含表1中列出的任意HCVR氨基酸序列的氨基酸序列，和其中所述LCVR包含表1中列出的任意LCVR氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述核酸分子包含选自表2中列出的任意HCVR核酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似的序列的多核苷酸序列，以及选自表2中列出的任意LCVR核酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列一致性的基本上相似的序列的多核苷酸序列。在根据本发明这个方面的某些实施方式中，所述核酸分子编码HCVR和LCVR，其中所述HCVR和LCVR均来自表1中列出的同一抗EGFRvIII抗体。
本发明还提供了重组表达载体，所述重组表达载体能够表达包含抗EGFRvIII抗体的重链或轻链可变区的多肽。例如，本发明包括包含上文所述的任意核酸分子的重组表达载体，即编码表1中所示的任意HCVR、LCVR和/或CDR序列的核酸分子。在本发明的范围内还包括其中引入了此类载体的宿主细胞，以及通过在允许生产抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞生产抗体或其部分并回收所生产的抗体和抗体片段的方法。
本发明包括具有经修饰的糖基化模式的抗EGFRvIII抗体。在一些实施方式中，通过修饰除去不需要的糖基化位点可能是有用的，或者例如使抗体缺乏在寡糖链上存在的岩藻糖部分以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的功能(参见Shield等，(2002)JBC 277:26733)。在其他申请中，可以进行半乳糖苷化修饰以改进补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含与EGFRvIII特异性结合的重组人源抗体或其片段和药学上可接受的载体。在一个相关的方面，本发明表征了一种组合物，所述组合物是抗EGFRvIII抗体和第二种治疗剂的组合。在一个实施方式中，所述第二种治疗剂是与抗EGFRvIII抗体组合有益的任意药剂。本发明还提供了抗体药物缀合物(ADC)，所述抗体药物缀合物包含与细胞毒剂缀合的抗EGFRvIII抗体。在本申请的其他部分公开了包含本发明抗EGFRvIII抗体的示例性联用疗法、组合制剂和ADC。
在又一个方面，本发明提供了使用本发明的抗EGFRvIII抗体或抗体的抗原结合部分杀死肿瘤细胞或者抑制或减弱肿瘤细胞生长的方法。根据本发明这个方面的治疗方法包括向需要其的对象施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体或抗体的抗原结合片段。所治疗的疾病是经由靶向EGFRvIII和/或经由通过EGFRvIII抑制配体介导的细胞信号改进、改善、抑制或预防的任意疾病或状况。
通过阅读下述的详细描述其他实施方式将是显而易见的。通过阅读下述的详细描述其他实施方式将是显而易见的。
附图简述
图1显示了在还原(上组)和非还原(下组)条件下使用抗EGFRvIII抗体[即，在图1a中的H1H1863N2(Fuc-)以及对照I和II；和在图1b中的H1H1911、H1H1912和H1H1915]或抗His抗体的EGFR和EGFRvIII的western印迹结果。第1和6道：10μl BENCHMARKTM标准品(INVITROGENTM)；第2和7道：400ng hEGFR-mmh(SEQ ID NO:154)；第3和8道：400nghEGFRvIII-mmh(SEQ ID NO:152)；第4、5、9和10道：空白。对照I：在美国专利号7,736,644中公开的人抗EGFRvIII连接肽抗体(IgG1)；对照II：在美国专利号7,589,180中公开的嵌合的抗EGFRvIII/EGFR抗体。
图2显示了H1H1863N2(Fuc-)的结合特性。将EGFRvIII连接肽或EGFR残基311-326的肽(“EGFR311-326”肽)捕获至
Figure BDA0001146921280000081
RED仪器上涂覆了链霉亲和素的
Figure BDA0001146921280000082
尖端上并与H1H1863N2(Fuc-)或对照I-III反应，EGFRvIII连接肽或EGFR残基311-326的肽均通过在C-末端具有生物素的接头进行了标记。对照I和II：同上；对照III：在美国专利申请公开号2010/0056762中公开的人源化的抗EGFRvIII抗体(hIgG1)。(□)：C-末端生物素标记的EGFRvIII连接肽(SEQ ID NO:149)；(■)：C-末端生物素标记的EGFR311-326肽(SEQ ID NO:151)。
图3显示了利用表达EGFRvIII的HEK293细胞(HEK293/EGFRvIII)内化抗EGFRvIIImAb。使用与染料缀合的二抗(Fab)检测与细胞表面结合的抗EGFRvIII抗体和对照抗体；在40x下采集图像并对内化的囊泡进行定量。对照I和II：同上；对照IV：在美国专利号7,060,808中公开的嵌合的抗EGFR抗体。(□)：在37℃下内化；和(■)：在4℃下内化。
图4显示了利用在重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠中移植的B16F10.9肿瘤或表达EGFRvIII的B16F10.9肿瘤(B16F10.9/EGFRvIII)结合和内化抗EGFRvIII抗体H1H1863N2(Fuc-)。通过使用流式细胞术利用与别藻蓝蛋白缀合的抗人Fc(hFc-APC)抗体检测细胞表面结合的(图4a)或细胞表面结合的加内化的(图4b)抗EGFRvIII抗体或同种型对照抗体。显示了抗体注射后10分钟(□)、4小时
Figure BDA0001146921280000083
和24小时(■)的平均荧光强度(MIF)。
图5显示了抗EGFRvIII抗体H1H863N2(Fuc+)(图5d)和对照抗体(如上所述)即对照I(图5b)、对照III(图5c)和对照IV(图5a)在野生型小鼠(●)或表达人EGFR的小鼠(■)中进行药代动力学分析的结果。
发明详述
在对本发明的方法进行描述以前，应理解本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件是可以改变的。还应理解本申请中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并非旨在限定，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求进行限定。
除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属技术领域普通技术人员的通常理解具有相同含义。在本申请中使用的术语“约”当用于指一个特定列举的数值时意味着该值可以在所列举的值不超过1％的范围内变动。例如，在本申请中使用的表述“约100”包括99和101以及其间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管与本申请中描述的那些类似或等效的任意方法和材料均可以用于实践或测试本发明，但是现在将描述优选的方法和材料。在本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用整体并入本申请。
定义
除非另外特别指出，在本申请中使用的术语“EGFRvIII”指具有SEQ ID NO:147中所示的氨基酸序列的人EGFR III类变体或其具有生物活性的片段，其显示出特异性针对EGFRvIII的任何特征，而不是与正常表达的EGFR相同的那些特征。EGFRvIII缺乏成熟EGFR的氨基酸残基6至273(即无信号肽(即残基1-24)的SEQ ID NO:146)并且在氨基酸残基5至274之间的位置6上含有新的甘氨酸残基。
除非明确指出来自非人物种，本申请中对蛋白、多肽和蛋白片段的所有参考文献均旨在指各蛋白、多肽或蛋白片段的人类版本。因此，除非明确指出来自非人物种(例如“小鼠EGFRvIII”、“猴EGFRvIII”等)，表述“EGFRvIII”指人EGFRvIII。
在本申请中使用的表述“细胞表面表达的EGFRvIII”指在体外或在体内的细胞表面上表达一种或多种EGFRvIII蛋白或其细胞外结构域，以使得EGFRvIII蛋白的至少一部分暴露于细胞膜的胞外一侧并且易于接近抗体的抗原结合部分。“细胞表面表达的EGFRvIII”可以包括或由通常表达EGFRvIII蛋白的细胞表面上表达的EGFRvIII蛋白组成。或者，“细胞表面表达的EGFRvIII”可以包括或由在其表面上通常不表达人EGFRvIII但是已经过人工基因工程改造以使得在其表面上表达EGFRvIII的细胞表面上表达的EGFRvIII蛋白组成。
在本申请中使用的表述“抗EGFRvIII抗体”包括具有单一特异性的单价抗体，以及包含结合EGFRvIII的第一臂和结合第二(靶点)抗原的第二臂的双特异性抗体，其中抗EGFRvIII臂包含本申请表1中所示的任意HCVR/LCVR或CDR序列。表述“抗EGFRvIII抗体”还包括抗体药物缀合物(ADC)，所述抗体药物缀合物包括与药物或毒素(即细胞毒剂)缀合的抗EGFRvIII抗体或其抗原结合部分。表述“抗EGFRvIII抗体”还包括抗体放射性核素缀合物(ARC)，所述抗体放射性核素缀合物包括与放射性核素缀合的抗EGFRvIII抗体或其抗原结合部分。
在本申请中使用的术语“抗体”指包含至少一个与特定抗原(例如EGFRvIII)特异性地结合或相互作用的互补性决定区(CDR)的任意抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括含有通过二硫键相互连接的四条多肽链两条重链(H)和两条轻链(L)的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(在本申请中简称为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本申请中简称为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。可以将VH和VL区进一步细分为分散在称为框架区(FR)的更加保守的区域中的称为互补性决定区(CDR)的高变区。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基末端到羧基末端按照下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方式中，抗EGFRvIII抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人源种系序列相同，或者可以是天然的或经人工修饰的。可以基于对两个或多个CDR的并行(side-by-side)分析定义氨基酸的共有序列。
在本申请中使用的术语“抗体”还包括全抗体分子的抗原结合片段。在本申请中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括与抗原特异性结合以形成复合物的任意天然存在的、酶促获得的、合成的或经基因工程改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以来源于例如使用任意适宜的标准技术制备的全抗体分子，如涉及编码抗体可变和任选地恒定结构域的DNA操作和表达的蛋白水解消化或重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得，或者能够被合成。所述DNA可以被测序和化学操作或通过使用分子生物学技术例如以便将一个或多个可变和/或恒定结构域排布成适宜的构型，或者引入密码子，形成半胱氨酸残基，修饰、增加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性示例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)最小识别单位，由模拟抗体的高变区的氨基酸残基(例如分离的互补性决定区(CDR)如CDR3肽)或受限制的FR3-CDR3-FR4肽组成。其他经工程改造的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双体、三体、四体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也均包括在本申请所使用的表述“抗原结合片段”中。
抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变结构域。所述可变结构域可以是任意尺寸或氨基酸的组合并且通常包含至少一个CDR，其一个或多个框架序列邻近或在框架中。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原结合片段中，所述VH和VL结构域可以处于相对于彼此在任意适宜的排布中。例如，所述可变区可以是二聚化的并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，所述抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方式中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可能存在于本发明抗体的抗原结合片段中的可变和恒定结构域的非限制性、示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在包括上文所列出的任意示例性构型的可变和恒定结构域的任意构型中，所述可变和恒定结构域可以直接彼此间连接或者可以通过完全或部分的铰链或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，这使得在单一多肽分子中相邻的可变和/或恒定结构域之间是柔性或半柔性的键。而且，本发明抗体的抗原结合片段可以包含彼此之间或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价结合的上文所列的任意可变和恒定结构域构型的同型二聚体或异二聚体(或其他多聚体)(例如通过二硫键)。
作为全抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段将通常包含至少两个不同的可变结构域，其中各可变结构域能够特异性地结合单独的抗原或同一抗原上的不同表位。任何多特异性抗体形式，包括本申请所公开的示例性双特异性抗体形式，可以适用于使用本领域的常规技术获得的本发明抗体的抗原结合片段的背景下。
本发明的抗体可以通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)发挥作用。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)指在存在补体的条件下利用本发明的抗体裂解表达抗原的细胞。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合靶细胞上的抗体，从而导致靶细胞的裂解。可以使用本领域公知和可以利用的测定方法对CDC和ADCC进行检测。(参见例如美国专利号5,500,362和5,821,337以及Clynes等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656)。抗体的恒定区在抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力中是重要的。因此，可以根据是否其是抗体介导细胞毒性所需的对抗体的同种型进行选择。
在本发明的某些实施方式中，本发明的抗EGFRvIII抗体是人源抗体。在本申请中使用的术语“人源抗体”旨在包括具有来源于人源种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人源抗体例如在CDR和特别是在CDR3中可以包括不是由人源种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过在体外的随机或位点特异性诱变或者通过在体内的体细胞突变引入突变)。然而，在本申请中使用的术语“人源抗体”并非旨在包括已将来源于另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的CDR序列移植到人源框架序列上的抗体。
在一些实施方式中，本发明的抗体可以是重组的人源抗体。在本申请中使用的术语“重组的人源抗体”旨在包括利用重组方法制备、表达、形成或分离的所有人源抗体，如使用转染进入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(在下文中进一步描述)，从重组的、组合人源抗体库分离的抗体(在下文中进一步描述)，从针对人源免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或者由涉及将人源免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任意其他方法制备、表达、形成或分离的抗体。此类重组的人源抗体具有来源于人源种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方式中，对此类重组的人源抗体进行体外诱变(或者当使用针对人Ig序列的转基因动物时进行体细胞诱变)，这样重组抗体VH和VL区的氨基酸序列尽管是来源于并且与人源种系VH和VL序列相关的序列，但是其可能不是体内人源抗体种系库中天然存在的。
人源抗体可以以两种形式存在，这与铰链的异质性有关。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定的四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接并且形成由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成的约75-80kDa的分子。即使在进行亲和纯化后，这些形式也非常难以分离。
第二种形式在不同完整IgG同种型中的出现频率与抗体的铰链区同种型相关的结构差异有关，但不仅限于此。在人IgG4铰链的铰链区中的单一氨基酸取代能够将第二种形式(Angal等，(1993)Molecular Immunology 30:105)的出现显著降至通常观察到的使用人IgG1铰链的水平。本发明包含在铰链、CH2或CH3区具有一个或多个突变的抗体，其在例如生产中可能是所需要的以提高所需抗体形式的收率。
本发明的抗体可以是分离的抗体。在本申请中使用的术语“分离的抗体”指已从其天然环境的至少一个组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，从生物体的至少一个组分或者从抗体天然存在或天然产生的组织或细胞中分离或除去的抗体是用于本发明目的的“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞原位中的抗体。分离的抗体是已进行了至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方式，分离的抗体可以是基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
本申请公开的抗EGFRvIII抗体可以包含与作为该抗体来源的相应种系序列相比在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中的一个或多个氨基酸的取代、插入和/或缺失。通过将本申请所公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库中获得的种系序列进行比较能够容易地确定此类突变。本发明包括抗体及其抗原结合片段，其来源于任意本申请所公开的氨基酸序列，其中在一个或多个框架和/或CDR区中的一个或多个氨基酸被突变为所述抗体来源的种系序列的相应残基，或另一种人源种系序列的相应的残基，或相应种系残基的保守性氨基酸取代(在本申请中将此类序列改变统称为“种系突变”)。本领域的普通技术人员以本申请所公开的重链和轻链可变区序列作为起始能够容易地生产多种抗体和抗原结合片段，所述抗体和抗原结合片段包含一个或多个单独的种系突变或其组合。在某些实施方式中，在所述VH和/或VL结构域中的全部框架和/或CDR残基均突变回存在于所述抗体来源的原始种系序列中的残基。在其他实施方式中，仅某些残基突变回原始种系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸或在FR4的后8个氨基酸中存在突变的残基，或者仅在CDR1、CDR2或CDR3中存在突变的残基。在其他实施方式中，一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列中的相应的残基(即不同于所述抗体原始来源的种系序列的种系序列)。而且，本发明的抗体在框架和/或CDR区中可以包含两种或多种种系突变的任意组合，例如某些单独的残基突变成特定种系序列的相应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基仍保持不变或突变成不同种系序列的相应残基。一旦获得，能够针对一个或多个所需的性质容易地对含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段进行检测，如改善的结合特异性、增加的结合亲和性、改善的或增加的拮抗或激动的生物学性质(可视情况而定)、降低的免疫原性等。采用这种一般方法获得的抗体和抗原结合片段包含在本发明中。
本发明还包括抗EGFRvIII抗体，所述抗EGFRvIII抗体包含本申请所公开的任意HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的具有一个或多个保守的取代的变体。例如，本发明包括抗EGFRvIII抗体，所述抗EGFRvIII抗体相对于本申请表1中所示的任意HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有带有例如10个或更少的、8个或更少的、6个或更少的、4个或更少的等等保守的氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列。
术语“表位”指与在被称为互补位的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。一个单个的抗原可以具有一个以上的表位。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物效应。表位可以是具有构象或线形的。具有构象的表位是由线形多肽链的不同区段在空间上靠近的氨基酸产生的。线形表位是由多肽链中相邻的氨基酸残基产生的。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖类部分、磷酰基或磺酰基。
当涉及核酸或其片段时，术语“基本上的一致性”或“基本上一致的”表示当将适当的核苷酸插入或缺失与其他核酸(或其互补链)进行最佳比对时，根据如下文所讨论的任意本领域熟知的序列一致性算法如FASTA、BLAST或Gap的测定结果，核苷酸序列的一致性至少约95％，更优选地至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基。在某些例子中，与对照核酸分子具有基本上的一致性的核酸分子可以编码与由所述对照核酸分子编码的所述多肽具有相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
在用于多肽时，术语“基本上的相似性”或“基本上相似的”指当对两条多肽序列进行最佳比对如通过使用缺省缺口权重的程序GAP或BESTFIT时具有至少95％的序列一致性，甚至更优选地至少98％或99％的序列一致性。优选地，不相同的残基位置的差别为保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被带有具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸取代。在通常情况下，保守性氨基酸取代将不会实质性改变蛋白的功能性性质。在两个多个氨基酸序列彼此之间的差别为保守性取代的案例中，可以对相似性的百分比或程度进行上调以校正所述取代的保守性性质。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，其通过引用并入本申请。含有具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的示例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)羟基脂肪族侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性取代是在Gonnet等((1992)Science 256:1443 45)所公开的PAM250对数-似然性矩阵中具有正值的任意改变。“适度的保守性”取代是在PAN250对数似然性矩阵中具有非负值的任意改变。
多肽的序列相似性(也将其称为序列一致性)通常使用序列分析软件测定。使用与相似序列匹配的蛋白分析软件测定针对不同取代、缺失和其他修饰包括保守性氨基酸取代的相似性。例如，含有程序如Gap和Bestfit的GCG软件可以使用缺省参数用于确定密切相关的多肽之间的序列同源性或序列一致性，如不同物种生物体或者野生型蛋白与其突变蛋白之间的同源性多肽。参见例如GCG 6.1版。也可以使用采用缺省或推荐参数的在GCG 6.1版中的程序FASTA对多肽序列进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询和检索序列之间最佳重叠区域的比对和序列一致性百分率(Pearson(2000)，如上所述)。当将本发明的序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是计算机程序BLAST,，特别是使用缺省参数的BLASTP或TBLASTN。参见例如Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403 410和Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389 402，其均通过引用并入本申请。
pH依赖性结合
本发明包括具有pH依赖性结合特性的抗EGFRvIII抗体。例如，本发明的抗EGFRvIII抗体在酸性pH下与在中性pH下相比可以显示出与EGFRvIII减少的结合。或者，本发明的抗EGFRvIII抗体在酸性pH下与在中性pH下相比可以显示出与EGFRvIII增加的结合。表述“酸性pH”包括小于约6.2的pH值，例如约6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更低。在本申请中使用的表述“中性pH”指约7.0至约7.4的pH。表述“中性pH”包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4的pH值。
在某些例子中，“在酸性pH下与在中性pH下相比与EGFRvIII的结合减少”以在酸性pH下抗体与EGFRvIII结合的KD值与在中性pH下抗体与EGFRvIII结合的KD值的比值表示(或者反之亦然)。例如，如果抗体或其抗原结合片段显示出的酸性/中性KD的比值为约3.0或更高，则可以认为抗体或其抗原结合片段显示出针对本发明目的的“在酸性pH下与在中性pH下相比与EGFRvIII的结合减少”。在某些示例性的实施方式中，针对本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性KD的比值可以是约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更高。
可以例如通过筛选在酸性pH下与在中性pH下相比与特定抗原的结合减少(或增加)的一群抗体获得具有pH依赖性结合特性的抗体。此外，在氨基酸水平上对抗原结合结构域的修饰可以产生具有pH依赖性特性的抗体。例如，通过使用组氨酸残基取代抗原结合结构域(例如在CDR中)的一个或多个氨基酸，可以获得在酸性pH下与在中性pH下相比抗原结合减少的抗体。
包含Fc变体的抗EGFRvIII抗体
根据本发明的某些实施方式，提供了包含Fc结构域的抗EGFRvIII抗体，所述Fc结构域含有例如在酸性pH下与在中性pH下相比增加或减少抗体与FcRn受体结合的一个或多个突变。例如，本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变的抗EGFRvIII抗体，其中所述突变在酸性环境中增加Fc结构域与FcRn的亲和性(例如，在pH范围从约5.5至约6.0的核内体中)。当向动物施用时，此类突变可以导致抗体血清半衰期的增加。此类Fc修饰的非限制性示例包括例如在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L和F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或者在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])的修饰；或者在位置250和/或428的修饰；或者在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)的修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308I)的修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)的修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)的修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。在又一个实施方式中，所述修饰包括265A(例如D265A)和/或297A(例如N297A)的修饰。
例如，本发明包括包含Fc结构域的抗EGFRvIII抗体，所述Fc结构域含有一对或多对或者一组或多组选自下组的突变：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；257I和311I(例如P257I和Q311I)；257I和434H(例如P257I和N434H)；376V和434H(例如D376V和N434H)；307A、380A和434A(例如T307A、E380A和N434A)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。前述Fc结构域突变的所有可能的组合以及本申请所公开的抗体可变结构域中的其他突变均包含在本发明的范围内。
本发明还包括包含嵌合的重链恒定(CH)区的抗EGFRvIII抗体，其中所述嵌合的CH区包含来源于一个以上免疫球蛋白同种型的CH区的区段。例如，本发明的抗体可以包含嵌合的CH区，所述嵌合的CH区包含来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的部分或全部的CH2结构域，其与来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的部分或全部的CH3结构域组合。根据某些实施方式，本发明的抗体包含具有嵌合的铰链区的嵌合的CH区。例如，嵌合的铰链可以包含来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上部铰链”氨基酸序列(来自根据EU编号的位置216至227的氨基酸残基)，其与来源于人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下部铰链”序列(来自根据EU编号的位置228至236的氨基酸残基)组合。根据某些实施方式，所述嵌合的铰链区包含来源于人IgG1或人IgG4上部铰链的氨基酸残基和来源于人IgG2下部铰链的氨基酸残基。在某些实施方式中，如本申请所述的包含嵌合的CH区的抗体显示出改善的Fc效应器功能且对抗体的治疗或药代动力学性质未产生不利影响。(参见例如2013年2月1日提交的美国临时申请号61/759,578，其公开的全部内容通过引用并入本申请)。
抗体药物缀合物(ADC)
本发明提供了抗体药物缀合物(ADC)，所述抗体药物缀合物包含与治疗部分如细胞毒剂、化疗药物或放射性同位素缀合的抗EGFRvIII抗体或其抗原结合片段。
细胞毒剂包括不利于细胞的生长、存活或繁殖的任何药剂。根据本发明的这个方面能够与抗EGFRvIII抗体缀合的适宜的细胞毒剂和化疗剂的示例包括例如1-(2氯乙基)-1,2-二甲磺酰肼、1,8-二羟基-双环[7.3.1]十三烷基-4,9-二烯-2,6-二炔-13-酮、1-脱氢睾酮、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、9-氨基喜树碱、放线菌素D、鹅膏蕈碱、氨基蝶呤、蛇形菌素、蒽环类、氨茴霉素(AMC)、阿里司汀、博莱霉素、白消安、丁酸、刺孢霉素、喜树碱、洋红霉素、卡莫司汀、西马多丁、顺铂、秋水仙碱、考布他汀、环磷酰胺、阿糖胞苷、细胞松弛素B、更生霉素、柔红霉素、达卡巴嗪、二乙酰氧基苯基多柔比星、二溴甘露醇、二羟基炭疽菌二酮、地索拉唑、多拉司他汀、多柔比星、倍癌霉素、棘霉素、艾榴素、吐根碱、埃坡霉素、埃斯波霉素、雌莫司汀、溴化乙锭、依托泊苷、氟尿嘧啶、格尔德霉素、短杆菌肽D、糖皮质激素、依立替康、细霉素、环氧长春碱、利多卡因、洛莫司汀(CCNU)、美登素、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲基叶酸、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌，N8乙酰亚精胺、鬼臼毒素、普鲁卡因、普萘洛尔、蝶啶、嘌呤霉素、吡咯并苯二氮
Figure BDA0001146921280000181
类(PDBS)、利索新、链脲霉素、他利霉素、紫杉醇、替尼泊苷(tenoposide)、丁卡因、苯丁酸氮芥、茅屋霉素、托泊替康、微管溶素、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和任意前述的衍生物。根据某些实施方式，与抗EGFRvIII抗体缀合的细胞毒剂是美登素如DM1或DM4、茅屋霉素衍生物或多拉司他汀衍生物。本领域公知的其他细胞毒剂包括在本发明的范围内，包括例如蛋白毒素如蓖麻毒素、艰难梭菌毒素、假单胞菌外毒素、蓖麻毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、异株腹泻毒蛋白(bryodin)、皂草素、美洲商陆毒素(即商陆毒素和商路皂苷元)以及其他如在Sapra等，Pharmacol.&Therapeutics,2013,138:452-469中所示的那些。
本发明还包括抗体放射性核素缀合物(ARC)，所述抗体放射性核素缀合物包含与一个或多个放射性核素缀合的抗EGFRvIII抗体。能够在本发明这一方面背景下使用的示例性的放射性核素包括但不限于，例如225Ac、212Bi、213Bi、131I、186Re、227Th、222Rn、223Ra、224Ra和90Y。
在本发明的某些方面，提供了包含通过接头分子与细胞毒剂(例如上文所公开的任意细胞毒剂)缀合的抗EGFRvIII抗体的ADC。可以使用本领域公知的任意接头分子或接头技术形成或构建本发明的ADC。在某些实施方式中，接头是可裂解的接头。根据其他实施方式，接头是不可裂解的接头。能够在本发明背景下使用的示例性接头包括包含或由例如MC(6-马来酰亚胺己酰基)、MP(马来酰亚胺丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、蛋白酶裂解接头中的二肽位点、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、蛋白酶裂解接头中的二肽位点、PAB(对氨基苄氧基羰基)、SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯)、SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸酯)及其变体和组合组成的接头。其他能够在本发明背景下使用的接头的示例参见例如US 7,754,681和Ducry,Bioconjugate Chem.,2010,21:5-13，以及其中引用的参考文献，其全部内容通过引用并入本申请。
本发明包括在其中接头通过在抗体或抗原结合分子中在特定氨基酸的连接将抗EGFRvIII抗体或抗原结合分子与药物或细胞毒素连接在一起的ADC。能够在本发明这一方面背景下使用的示例性氨基酸的连接包括，例如赖氨酸(参见例如US5,208,020；US 2010/0129314；Hollander等，Bioconjugate Chem.,2008,19:358-361；WO 2005/089808；US 5,714,586；US 2013/0101546和US 2012/0585592)、半胱氨酸(参见例如US 2007/0258987；WO2013/055993；WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US2013/0101546和US 7,750,116)、硒代半胱氨酸(参见例如WO 2008/122039和Hofer等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451-12456)、甲酰基甘氨酸(参见例如Carrico等，Nat.Chem.Biol.,2007,3:321-322；Agarwal等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2013,110:46-51和Rabuka等，Nat.Protocols,2012,10:1052-1067)、非天然氨基酸(参见例如WO 2013/068874和WO 2012/166559)以及酸性氨基酸(参见例如WO 2012/05982)。接头还可以是通过与碳水化合物(参见例如US 2008/0305497和Ryan等，Food&Agriculture Immunol.,2001,13:127-130)和二硫键接头(参见例如WO 2013/085925、WO 2010/010324、WO 2011/018611和Shaunak等，Nat.Chem.Biol.,2006,2:312-313)连接与抗原结合蛋白缀合。
可以将本领域公知的用于将化学部分与肽、多肽或其他大分子缀合的任意方法用于本发明的背景中以制备本申请所述的抗EGFRvIII ADC。针对通过接头的抗体-药物缀合的示例性方法如本申请的实施例12中所示。对该示例性方法的变化是本领域的普通技术人员能够预期的并且包括在本发明的范围内。
根据某些实施方式，本发明提供了ADC，其中本申请所述的抗EGFRvIII抗体(例如称为H1H1863N2的抗体)与WO2014/145090中所示的接头-药物组合物(例如，化合物“7”，在本申请中也称为“M0026”)缀合，其公开的全部内容通过引用在此并入本申请(亦参见本申请中的实施例12)。
表位展示和相关技术
本发明的抗体结合的表位可以由EGFRvIII蛋白的3个或多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单一连续的序列组成。或者，表位可以由EGFRvIII的多个非连续的氨基酸(或氨基酸序列)组成。在一些实施方式中，表位位于或接近EGFRvIII的配体结合结构域。在其他实施方式中，表位位于EGFRvIII的配体结合结构域以外，例如在EGFRvIII表面上的一个位置，在其上当抗体与此类表位结合时不会干扰EGFRvIII与配体结合。
根据某些实施方式，本发明包括特异性与EGFRvIII结合(并且不与EGFR结合)的抗EGFRvIII抗体，其中所述抗体识别EGFRvIII连接肽(例如SEQ ID NO:148)。在本申请中可以将此类抗体称为“连接肽连接子”、“EGFRvIII肽结合抗体”等。根据其他实施方式，本发明包括特异性与EGFRvIII结合(并且不与EGFR结合)的抗EGFRvIII抗体，其中所述抗体不识别EGFRvIII连接肽(例如不识别SEQ ID NO:148所示的连接肽和/或不识别SEQ ID NO:165所示的肽)。在本申请中可以将此列抗体称为“构象连接子”、“EGFRvIII构象表位连接子”等。
可以采用本领域的普通技术人员公知的多种技术确定抗体是否与多肽或蛋白中的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性的技术包括例如可以采用常规的交叉阻断检测如Antibodies,Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中所描述的、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)和肽裂解分析。此外，可以使用方法如抗原的表位删除、表位提取和化学修饰(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。另一种能够用于鉴定与抗体相互作用的多肽中的氨基酸的方法是通过质谱检测的氢/氘交换。一般而言，所述氢/氘交换的方法涉及用氘标记目的蛋白、随后将所述抗体与氘标记的蛋白结合。接下来，将该蛋白/抗体复合物转移至水中以使得在除了受抗体保护的残基(其仍为氘标记)以外的所有残基发生氢-氘交换。在抗体解离后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，从而揭示对应于同抗体相互作用的特定氨基酸的氘标记残基。参见例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
本发明还包括与本申请所述的任意特异性的示例性抗体(例如包含本申请的表1中所示的任意氨基酸序列的抗体)结合相同表位的抗EGFRvIII抗体。同样地，本发明还包括与本申请所述的任意特异性的示例性抗体(例如包含本申请的表1中所示的任意氨基酸序列的抗体)竞争性地与EGFRvIII结合的抗EGFRvIII抗体。
通过使用本领域公知的常规方法和本申请中的示例能够容易地确定是否抗体与对照抗EGFRvIII抗体结合至相同表位或竞争性地与之结合。例如，为确定是否待测抗体与本发明的对照抗EGFRvIII抗体结合至相同表位，将对照抗体与EGFRvIII蛋白结合。接下来，评估待测抗体与EGFRvIII分子结合的能力。在使用对照抗EGFRvIII抗体饱和结合后，如果待测抗体能够与EGFRvIII结合，则能够得出结论待测抗体与对照抗EGFRvIII抗体结合至不同的表位。另一方面，在使用对照抗EGFRvIII抗体饱和结合后，如果待测抗体不能与EGFRvIII分子结合，则待测抗体可能结合至与本发明的对照抗EGFRvIII抗体结合的表位相同的表位。然后可以进行附加的常规实验(例如肽突变和结合分析)以确证是否所观察到的待测抗体结合的缺乏事实上是由于与对照抗体结合相同的表位导致的或者是否是空间位阻(或另外的现象)导致了所观察到的结合缺乏。可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域中任意其他定量或定性的抗体结合检测进行这种类型的实验。根据本发明的某些实施方式，如果例如根据竞争性结合测定的结果(参见例如Junghans等，Cancer Res.1990:50:1495-1502)1、5、10、20或100倍过量的一个抗体对另一个结合的抑制为至少50％但优选地75％、90％或甚至99％，则两个抗体结合至相同的(或重叠的)表位。或者，如果抗原中降低或消除一个抗体结合的基本上所有氨基酸的突变降低或消除另一个的结合，则认为两个抗体结合相同的表位。如果仅有一个子集的氨基酸的突变降低或消除一个抗体结合也降低或消除另一个的结合，则认为两个抗体具有“重叠的表位”。
为确定是否抗体与对照抗EGFRvIII抗体竞争性地结合(或交叉竞争性地结合)，在两个方向上进行上文所述的结合方法：在第一个方向上，在饱和条件下将对照抗体与EGFRvIII蛋白结合，随后评估待测抗体与EGFRvIII分子的结合。在第二个方向上，在饱和条件下将待测抗体与EGFRvIII分子结合，随后评估对照抗体与EGFRvIII分子的结合。如果在这两个方向上仅第一(饱和的)抗体能够与EGFRvIII分子结合，则得出结论待测抗体和对照抗体与EGFRvIII竞争性地结合。根据本领域普通技术人员的理解，竞争性地与对照抗体结合的抗体并不一定与对照抗体结合至相同表位，但可能通过与重叠或邻近表位的结合在空间上阻断对照抗体的结合。
人源抗体的制备
本发明的抗EGFRvIII抗体可以是全人源抗体。用于产生单克隆抗体包括全人源单克隆抗体的方法是本领域公知的。可以将任意此类公知的方法用于本发明的背景下以制备特异性与人EGFRvIII结合的人源抗体。
例如使用VELOCIMMUNETM技术或用于产生全人源单克隆抗体的任意其他相似的公知方法，最初分离了具有人源可变区和小鼠恒定区的EGFRvIII的高亲和性嵌合抗体。如下述实验部分所述，针对所需特性对抗体进行表征和选择，包括亲和性、配体阻断活性、选择性、表位等。如有必要，使用所需人源恒定区取代小鼠恒定区以产生全人源的抗EGFRvIII抗体，例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。尽管可以根据特定用途改变所选择的恒定区，但是在可变区中保留了高亲和性抗原结合和靶向特异性特征。在某些例子中，直接从抗原阳性的B细胞中分离全人源抗EGFRvIII抗体。
生物等价物
本发明的抗EGFRvIII抗体和抗体片段包含具有不同于本申请所述抗体的那些的氨基酸序列，但是仍保持了结合人源EGFRvIII的能力。此类变体抗体和抗体片段当与母体序列进行比较时包含一个或多个氨基酸插入、缺失或取代，但是显示出基本上与所述抗体等价的生物活性。同样地，本发明的编码抗EGFRvIII抗体的DNA序列与所公开的序列相比包含一个或多个核苷酸插入、缺失或取代，但是其编码的抗EGFRvIII抗体或抗体片段基本上是本发明的抗EGFRvIII抗体或抗体片段的生物等价物。此类变体氨基酸和DNA序列的示例如上文所讨论的。
如果例如两种抗原结合蛋白或抗体是药学等价物或药学替代物，即在类似的实验条件下单剂量或多剂量给予相同摩尔剂量时其吸收速率和程度未显示出显著差异，则认为这两者是生物等价物。如果一些抗体在其吸收程度上而不是吸收速率上是等价的仍可以将其认为是等价物并且仍可以认为其是生物等价物，因为这种在吸收速率上的差异是有意的并且已经反映在标签中，其对例如长期使用时达到有效的机体药物浓度不是必要的，并且针对所研究的特定药品认为其在医学上是无足轻重的。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和效能方面不存在具有临床意义的差异，则认为其是生物等价物。
在一个实施方式中，如果患者能够在对照产品和生物产品之间进行一次或多次的转换而在不良反应的风险方面无预期的增加，则认为这两种抗原结合蛋白是生物等价物，所述不良反应包括与无这种转换的连续疗法相比免疫原性出现具有临床意义的改变或有效性降低。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白针对使用的状况通过共同的机制或作用机制发挥作用并且此类作用机制在公知的范围内，则认为其是生物等价物。
生物等效性可以通过体内和/或体外方法证明。生物等效性的测定包括，例如(a)在人或其他哺乳动物中的体内检测，测定在血液、血浆、血清或其他生物液体中的抗体或其代谢产物的浓度对时间的函数；(b)进行具有相关性的体外检测并合理的预测在人体内的生物利用度数据；(c)在人或其他哺乳动物中进行体内检测，测定适当的抗体(或其靶点)的急性药理学作用作为时间的函数；和(d)在控制良好的临床试验中确定抗体的安全性、有效性或者生物利用度或生物等效性。
可以通过例如对残基或序列进行各种取代或者缺失生物活性不需要的末端或中间的残基构建本发明的抗EGFRvIII抗体的生物等价物变体。例如，半胱氨酸残基不是生物活性所必须的，可以将其缺失或使用其他氨基酸取代以防止在复性过程中形成不必要的或不正确的分子内二硫键桥。在其他情况下，生物等价物抗体可以包括包含氨基酸改变的抗EGFRvIII抗体变体，其改变了所述抗体的糖基化特征，例如消除或除去糖基化的突变。物种选择性和物种交叉反应性
根据某些实施方式，本发明提供了与人EGFRvIII结合，但是不与其他物种的EGFRvIII结合的抗EGFRvIII抗体。本发明还包括与人EGFRvIII和来自一个或多个非人物种的EGFRvIII结合的抗EGFRvIII抗体。例如，本发明的抗EGFRvIII抗体可以与人EGFRvIII结合并且根据情况可以与小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔子、山羊、绵羊、奶牛、马、骆驼、猕猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩的EGFRvIII结合或者不结合。根据本发明的某些示例性的实施方式，提供了与人的EGFRvIII和猕猴(例如Macaca fascicularis)的EGFRvIII特异性结合的抗EGFRvIII抗体。本发明的其他EGFRvIII抗体与人的EGFRvIII结合，但不与猕猴的EGFRvIII结合或仅与其具有较弱的结合。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性)。多特异性抗体可以对一个靶向的多肽的不同表位是特异性的或者可以含有对一个以上的靶向的多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如Tutt等，1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等，2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本发明的抗EGFRvIII抗体可以连接至或与另一种功能性分子例如另一种肽或蛋白共表达。例如，抗体或其片段可以功能性地连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)至一个或多个其他的分子实体，如另一个抗体或抗体片段，以产生具有第二个结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂与人EGFRvIII结合，并且免疫球蛋白的另一个臂对第二抗原具有特异性。与EGFRvIII结合的臂可以包含本申请的表1中所示的任意HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。在某些实施方式中，与EGFRvIII结合的臂结合人EGFRvIII并阻断配体与EGFRvIII结合。在其他实施方式中，与EGFRvIII结合的臂与人EGFRvIII结合，但是不阻断配体与EGFRvIII结合。
能够用于本发明背景下的示例性双特异性抗体形式包括使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中所述第一和第二Ig CH3结构域彼此间存在至少一个氨基酸的差异，并且与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比其中至少一个氨基酸的差异降低了双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方式中，所述第一Ig CH3结构域结合蛋白A并且所述第二Ig CH3结构域含有使与蛋白A的结合减少或消除的突变如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。所述第二CH3还可以包括Y96F修饰(根据IMGT；根据EU为Y436F)。可以存在于第二CH3中的进一步的修饰包括：在IgG1抗体的情况下D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU为N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上文所述的双特异性抗体形式的变体包括在本发明的范围内。
能够用于本发明背景下的其他示例性的双特异性形式包括，但不限于，例如基于scFv的或双体双特异性形式、IgG-scFv融合、双可变结构域(DVD)-Ig、四价体杂交瘤、凸起-进入-孔洞(knob-into-hole)、共有轻链(例如具有凸起-进入-孔洞等的共有轻链)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性形式(参见例如Klein等，2012,mAbs 4:6,1-11，并且作为本申请中引用的参考文献，其对前述的形式进行了综述)。也可以使用肽/核酸缀合构建双特异性抗体，例如其中将具有正交化学反应性的非天然氨基酸用于生成位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，然后其自组装成具有所定义的组分、价态和几何形状的多聚体复合物(参见例如Kazane等，J.Am.Chem.Soc.[Epub:Dec.4,2012])。
治疗性制剂和施用
本发明提供了包含本发明的抗EGFRvIII抗体或其抗原结合片段的药物组合物。使用提供改善的转移、递送、耐受等的适宜的载体、赋形剂和其他试剂对本发明的药物组合物制剂。多种适宜的制剂能够在所有药物化学家公知的处方集Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Easton,PA中找到。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LIPOFECTINTM，LifeTechnologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有半固体混合物的碳蜡。亦参见Powell等，"Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm SciTechnol 52:238-311。
可以根据患者的年龄和身材、靶标疾病、状况、施用途径等改变向患者施用的抗体的剂量。通常根据体重或体表面积计算优选剂量。在成人患者中，通常以约0.01至约20mg/kg体重、更优选地约0.02至约7、约0.03至约5或者约0.05至约3mg/kg体重的单一剂量静脉内施用本发明的抗体是有利的。可以根据所述状况的严重程度调整治疗的频率和持续时间。可以根据经验确定施用抗EGFRvIII抗体的有效剂量和方案；例如可以通过周期性评估监测患者的进展并相应地对剂量进行调整。而且，可以使用本领域公知的方法确定物种间的剂量比例(例如Mordenti等，1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
各种递送系统是公知的并且可以用于施用本发明的药物组合物，例如包封在脂质体中、微粒、微囊、能够表达突变型病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu等，1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述组合物可以通过任意常规的途径施用，例如通过输注或推注、通过经上皮或粘膜层(例如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜等)的吸收和可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。
可以使用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。此外，对于皮下递送，笔递送装置能够容易地用于递送本发明的药物组合物。此类笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常使用含有药物组合物的可替换的药筒。一旦药筒中的所有药物组合物已经施用并且所述药筒是空的时，所述空的药筒能够容易地被弃去并且被含有所述药物组合物的新药筒替换。然后可以重复使用所述药物递送装置。在一次性的笔递送装置中，无可替换的药筒。相反地，所述一次性笔递送装置在所述装置中的储液槽中预充了所述药物组合物。一旦所述药物组合物的储液槽变空，则将整个装置弃去。
多种可重复使用的笔和自动注射器递送装置已应用于本发明药物组合物的皮下递送。例如包括但不一定限于(仅列举了其中的几个)AUTOPENTM(欧文芒福德公司，伍德斯托克，UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic医疗系统，Burghdorf，瑞士)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(礼来公司，印第安纳波利斯，IN)、NOVOPENTMI、II和III(诺和诺德，哥本哈根，丹麦)、NOVOPEN JUNIORTM(诺和诺德，哥本哈根，丹麦)、BDTM笔(Becton Dickinson公司，富兰克林湖，NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(赛诺菲-安万特，法兰克福，德国)。应用于本发明的药物组合物皮下递送的一次性笔递送装置的例子包括但不一定限于(仅列举了其中的几个)SOLOSTARTM笔(赛诺菲-安万特)、FLEXPENTM(诺和诺德)和KWIKPENTM(礼来)、SURECLICKTM自动注射器(安进公司，千橡郡，CA)、PENLETTM(Haselmeier，斯图加特，德国)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(雅培实验室，雅培公园，IL)。
在某些情况下，所述药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施方式中，可以使用泵(参见Langer，如上所述；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方式中，可以使用多聚体材料，参见Medical Applications of ControlledRelease,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又一个实施方式中，可以将控释系统置于所述组合物的靶点附近，以使得仅需要递送全身剂量的一部分。(参见例如Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138)。在Langer，1990,Science 249:1527-1533的综述中对其他控释系统进行了讨论。
可注射的制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射，点滴输注等的剂型。可以采用公知的方法制备这些可注射剂型。例如，可以通过例如将上文所述的抗体或其盐溶解、混悬或乳化于常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中制备可注射制剂。作为用于注射的水性介质，例如有生理盐水、含有葡萄糖和其他辅助剂等的等渗溶液，可以将其与适宜的增溶剂如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等联用。作为油性介质，使用例如芝麻油、豆油等，其可以与助溶剂如苯甲酸苄酯、苄醇等联用。因此，优选将所制备的注射剂填充入适宜的安瓿中。
有利地，将上文所述的用于口服或胃肠外使用的药物组合物制成适于适宜的活性成分剂量的单位剂量剂型。单位剂量的这种剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含的上述抗体的量通常为约5至约500mg每单位剂量剂型；特别是在注射剂形式，所含的上述抗体优选地为约5至约100mg并且对于其他剂型为约10至约250mg。
抗体的治疗用途
本发明包括方法，所述方法包括向需要其的对象施用治疗组合物，所述治疗组合物包括抗EGFRvIII抗体或包含抗EGFRvIII抗体的抗体药物缀合物(例如包含本申请的表1中所示的任意HCVR/LCVR或CDR序列的抗EGFRvIII抗体或ADC)。所述治疗组合物可以包含本申请公开的任意抗EGFRvIII抗体、其抗原结合片段或ADC和药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明的抗体和ADC特别地用于治疗、预防和/或改善与EGFRvIII的表达或活性相关的或由其介导的任意疾病或病症，或者可以通过阻断EGFRvIII和EGFR配体之间的相互作用或以其他方式抑制EGFRvIII的活性和/或信号，和/或促进受体内化和/或减少细胞表面的受体数量进行治疗。例如，本发明的抗体和ADC用于治疗表达EGFRvIII和/或对配体介导的信号产生应答的肿瘤。本发明的抗体和抗原结合片段还可以用于治疗在脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮肤和附属物、结缔组织、脾脏、免疫系统、血液形成细胞和骨髓、肝和泌尿道以及特殊感觉器官如眼产生的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施方式中，本发明的抗体和ADC用于治疗一种或多种下述癌症：肾细胞癌、胰腺癌、头颈部癌、前列腺癌、恶性神经胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌(例如具有MET扩增的胃癌、，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌或黑色素瘤。
在本申请所述的治疗方法的背景下，可以将抗EGFRvIII抗体作为单一疗法(即作为唯一的治疗剂)施用或者与一种或多种其他治疗剂(在本申请的其他部分对其示例进行了描述)联用。
根据特定的实施方式，本发明提供了用于在患者中治疗癌症、减少肿瘤生长和/或使肿瘤退化的方法。根据本发明这一方面的方法包括向患者单独施用第一抗体药物缀合物(ADC)或与第二抗EGFRvIII抗体或ADC联用。第一ADC通常包含抗体或抗体的抗原结合片段和细胞毒素，其中第一ADC的抗体或抗原结合片段与EGFRvIII特异性结合但是不与SEQ IDNO:148所示的EGFRvIII接合肽或SEQ ID NO:165所示的肽结合(即第一ADC包含构型EGFRvIII结合抗体)。在施用第二抗体或ADC的实施方式中，第二抗体或ADC通常包含抗体或抗体的抗原结合片段和毒素，其中第二抗体或抗原结合片段与EGFRvIII特异性结合并且还与SEQ ID NO:148所示的EGFRvIII接合肽和/或SEQ ID NO:165所示的肽结合(即第二抗体或ADC包含EGFRvIII接合肽结合抗体)。当在本发明这一方面的背景下使用两种单独的抗EGFRvIII ADC时，在某些实施方式中，这两种ADC可以包含相同的细胞毒剂或同类的细胞毒剂。在使用两种单独的抗EGFRvIII ADC的其他实施方式中，每种ADC可以包含不同的细胞毒剂和/或不同类型的细胞毒剂。本发明这一方面的非限制性示例性实施方式如本申请的实施例14所示。根据某些实施方式，第一ADC的抗体或抗原结合片段(即构象EGFRvIII结合抗体)包含重链和轻链互补性决定区，或者重链可变区和轻链可变区，所述重链和轻链互补性决定区包含SEQ ID NO：36、38、40、44、46和48，所述重链可变区包含SEQ ID NO:34，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:42。
联合疗法和制剂
本发明包括组合物和治疗性制剂以及治疗方法，所述组合物和治疗性制剂包含本申请所述的任意抗EGFRvIII抗体联合一种或多种其他具有治疗活性的组分，所述治疗方法包括向需要其的对象施用此类组合。
本发明的抗EGFRvIII抗体可以与一种或多种选自下组的其他具有治疗活性的组分共同制剂和/或联合施用：PRLR拮抗剂(例如抗PRLR抗体或PRLR的小分子抑制剂)、EGFR拮抗剂(例如抗EGFR抗体[例如西妥昔单抗或帕尼单抗]或EGFR的小分子抑制剂[例如吉非替尼或厄洛替尼])、另一种EGFR家族成员如Her2/ErbB2，ErbB3或ErbB4的抑制剂(例如抗ErbB2[例如曲妥珠单抗或T-DM1
Figure BDA0001146921280000281
]、抗ErbB3或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)、cMET拮抗剂(例如抗cMET抗体)、IGF1R拮抗剂(例如抗IGF1R抗体)、B-raf抑制剂(例如维罗非尼、索拉非尼、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制剂(例如抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β抑制剂(例如抗PDGFR-β抗体或小分子激酶抑制剂如甲磺酸伊马替尼或苹果酸舒尼替尼)、PDGF配体抑制剂(例如抗PDGF-A，-B，-C或-D抗体、适体、siRNA等)、VEGF拮抗剂(例如VEGF-捕获如阿柏西普，参见例如US 7,087,411(在本申请中也称为“VEGF抑制融合蛋白”)、抗VEGF抗体(例如贝伐单抗)、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼、索拉非尼和帕唑帕尼))、DLL4拮抗剂(例如US 2009/0142354中公开的抗DLL4抗体如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如US 2011/0027286中公开的抗Ang2抗体如H1H685P)、FOLH1拮抗剂(例如抗FOLH1抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如抗STEAP1抗体或抗STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如抗TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如抗MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如抗CA9抗体)、尿溶蛋白拮抗剂(例如抗尿溶蛋白[例如抗UPK3A]抗体)、MUC16拮抗剂(例如抗MUC16抗体)、Tn抗原拮抗剂(例如抗Tn抗体)、CLEC12A拮抗剂(例如抗CLEC12A抗体)、TNFRSF17拮抗剂(例如抗TNFRSF17抗体)、LGR5拮抗剂(例如抗LGR5抗体)、单价CD20拮抗剂(例如单价抗CD20抗体如利妥昔单抗)、PD-1抗体、PD-L1抗体、CD3抗体、CTLA-4抗体等。与本发明的双特异性抗原结合分子联合施用可能是有益的其他药剂包括例如他莫昔芬、芳香酶抑制剂和细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和与细胞因子如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其相应的受体结合的抗体。
本发明包括组合物和治疗性制剂，所述组合物和治疗性制剂包含本申请所述的任意抗EGFRvIII抗体联合一种或多种化疗剂。化疗剂的示例包括烷化剂类如噻替哌和环磷酰胺(癌得星TM)；烷基磺酸盐类如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；乙撑亚胺和甲基密胺类包括六甲蜜胺、三乙撑密胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶芥子气；硝基脲类如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类如阿克拉霉素、放线菌素、奥瑟霉素、偶氮丝氨酸、博莱霉素、更生霉素、刺孢毒素、卡洛比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、博替罗霉素、嘌霉素、奎拉霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、左柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如迪诺特宁、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝塔布辛；比生群；伊达曲沙；德弗法明；秋水仙胺；地吖醌；伊弗尼辛；依利醋铵；依托格鲁；石硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；洛尼达宁；米托胍腙；米托蒽醌；莫吡丹莫；尼曲伊宁；喷司他丁；蛋胺氮芥；比柔比星；足叶草酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗉；甘露莫司汀；二溴甘露糖醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；瓜西托辛；阿拉伯糖苷("Ara-C")；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(泰素TM,Bristol-MyersSquibb Oncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(泰素帝TM；Aventis Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺凡特龙；替尼泊苷；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯佩拉霉素；卡培他滨以及任意上述的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。在该定义中还包括抗激素剂，其作用为调节或抑制肿瘤上激素的作用，如抗雌激素包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛西芬、LY 117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；和抗雄激素如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任意上述的医药学上可接受的盐、酸或衍生物。
本发明的抗EGFRvIII抗体还可以与抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、皮质类固醇、类固醇、氧气、抗氧化剂、COX抑制剂、心脏保护剂、金属螯合剂、IFN-γ和/或NSAID联合施用和/或共同制剂。
可以在本发明的抗EGFRvIII抗体施用前立即、同时或施用后立即施用其他治疗性的活性成分，例如上文中所列的任意药剂或其衍生物；(对于本申请的目的而言，将此类施用方案认为是抗EGFRvIII抗体与其他治疗性的活性成分“联用”)。本发明还包括药物组合物，其中本发明的抗EGFRvIII抗体与本申请其他部分描述的一种或多种其他的治疗性活性成分共同制剂。
施用方案
根据本发明的某些实施方式，可以在一个规定的时间范围内向对象施用多剂量的抗EGFRvIII抗体(或包含抗EGFRvIII抗体与本申请提及的任意其他治疗性活性剂的组合的药物组合物)。根据本发明这一方面的方法包括顺序地向对象施用多剂量的本发明的抗EGFRvIII抗体。如本申请所使用的，“顺序地施用”指在不同的时间点向对象施用各剂量的抗EGFRvIII抗体，例如在由预定的间隔(例如小时、天、周或月)分隔的不同天。本发明包括包含顺序地向患者施用单一初始剂量的抗EGFRvIII抗体，随后一个或多个第二剂量的抗EGFRvIII抗体，以及任选地随后一个或多个第三剂量的抗EGFRvIII抗体的方法。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”指施用本发明的抗EGFRvIII抗体的时间顺序。因此，所述“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；所述“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；以及所述“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。所述初始、第二和第三剂量可以均含有相同量的抗EGFRvIII抗体，但是通常在施用频率方面其彼此之间可以是不同的。然而，在某些实施方式中，在治疗过程中，在初始、第二和/或第三剂量中所含的抗EGFRvIII抗体的量彼此之间是可以改变的(例如适当地上调或下调)。在某些实施方式中，在治疗方案开始时施用两个或多个(例如2、3、4或5)剂量作为“负荷剂量”，随后在降低频率的基础上施用后续剂量(例如“维持剂量”)。
在本发明的某些示例性实施方式中，在立即前剂量后施用各第二和/或第三剂量1至26(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多)周。如本申请所使用的，短语“立即前剂量”指在多次施用的顺序中在下一个剂量施用前向患者施用的抗EGFRvIII抗体的剂量，在所述顺序中无干预剂量。
根据本发明这一方面的方法可以包括向患者施用任意数量的第二和/或第三剂量的抗EGFRvIII抗体。例如，在某些实施方式中，仅向患者施用单一的第二剂量。在其他实施方式中，向患者施用两个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第二剂量。同样地，在某些实施方式中，仅向患者施用单一的第三剂量。在其他实施方式中，向患者施用两个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第三剂量。施用方案可以在特定对象生存期间无限制地使用，或者直至此类治疗不再有治疗性的需求或益处。
在涉及多个第二剂量的实施方式中，可以以与其他第二剂量相同的频率施用各第二剂量。例如，在立即前剂量后可以向患者施用1-2周或者1-2个月各第二剂量。类似地，在涉及多个第三剂量的实施方式中，可以以与其他第三剂量相同的频率施用各第三剂量。例如，在立即前剂量后可以向患者施用2-12周的各第三剂量。在本发明的某些实施方式中，在治疗方案的过程中向患者施用的第二和/或第三剂量的频率可以改变。在治疗过程中还可以由医师根据临床检查后各患者的需要调整施用频率。
本发明包括其中以第一频率(例如每周1次、每2周1次、每3周1次、每月1次、每2个月1次)向患者施用2-6个负载剂量，随后以更低的频次向患者施用2个或多个维持剂量的施用方案。例如，根据本发明的这一方面，如果以每月1次的频率施用负载剂量，则可以每6周1次、每2个月1次、每3个月1次向患者施用维持剂量。
抗体的诊断用途
本发明的抗EGFRvIII抗体还可以用于检测和/或测定样品中的EGFRvIII或表达EGFRvIII的细胞，例如用于诊断目的。例如，抗EGFRvIII抗体或其片段可以用于诊断特征为EGFRvIII的异常表达(例如过表达、低表达、缺乏表达等)的状况或疾病。针对EGFRvIII的示例性诊断检测可以包括例如将来自患者的样品与本发明的抗EGFRvIII抗体接触，其中所述抗EGFRvIII抗体使用可检测的标签或报告分子标记。或者，在诊断应用中可以将未标记的抗EGFRvIII抗体与其自身具有可检测标签的第二种抗体联用。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分如荧光素异硫氰酸酯或罗丹明；或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。能够用于检测或测定样品中的EGFRvIII的特异性的示例性检测包括酶联免疫吸附检测(ELISA)、放射性免疫检测(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
能够用于根据本发明的EGFRvIII诊断检测的样品包括来自患者的任意组织或液体样品，在正常或病理状况下其含有可检测量的EGFRvIII蛋白或其片段。在通常情况下，将测定来自健康患者(例如未患有与异常的EGFRvIII水平或活性相关的疾病或状况的患者)的特定样品中的EGFRvIII的水平以建立初始的基线或标准EGFRvIII水平。然后将EGFRvIII的该基线水平与在来自疑似患有EGFRvIII相关疾病或状况的个体的样品中测得的EGFRvIII的水平进行比较。
实施例
阐述下述实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且其并非旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已作出努力以确保关于所使用数字的准确性，但是应对一些实验误差和偏差予以考虑。除非另外指出，分子量是平均分子量、温度是摄氏度和压力是处于或接近大气压。
实施例1：抗EGFRvIII抗体的产生
通过使用包含EGFRvIII胞外域的免疫原免疫
Figure BDA0001146921280000331
小鼠(即包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的经基因工程改造的小鼠)以获得抗EGFRvIII抗体。第一组抗体包括命名为H1H2194P、H1H2195P、H2M1863N2、H2M1911N、H2M1912N、H2M1915N、H2M1917N、H2M1918N和H3M1913N的抗体(如表1和表2中所示)。
通过EGFRvIII特异性免疫测定监测抗体的免疫应答。当产生了所需要的免疫应答时，收集脾细胞并将其与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其活力并形成杂交瘤细胞系。筛选和选择杂交瘤细胞系以鉴定产生EGFRvIII特异性抗体的细胞系。使用这种技术得到了若干抗EGFRvIII嵌合型抗体(即具有人源可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)。此外，无需与骨髓瘤细胞融合而直接从抗原阳性B细胞中分离抗EGFRvIII抗体如US 2007/0280945A1中所述。
另外，还在CHO宿主细胞系中制备岩藻糖基化减少的H1H1863N2[“H1H1863N2(Fuc-)”]，在美国专利申请号2010/0304436A1中将该细胞描述为“8088”，其全部内容通过引用特别地并入。简言之，将H1H1863N2的轻链和重链序列克隆进入表达载体。使用轻链和重链质粒以及含有编码Cre的基因的pR4004载体转染两百万个8088细胞。将使用400μg/ml潮霉素进行的筛选中存活的转染细胞进行调整以使其在无血清、无岩藻糖的培养基中悬浮生长。利用流式细胞术将表达荧光蛋白EGFP但是不表达DsRed和ECFP的细胞从转染细胞中分离。将经分选的细胞以4x 105个细胞/ml接种在摇瓶中，并在三天后，收集培养基并使用蛋白A层析纯化其中的抗体蛋白[i.e.,H1H1863N2(Fuc-)]。对所得到的H1H1863N2(Fuc-)进行质谱分析以确证相对于原始抗体H1H1863N2(Fuc+)除去了核心岩藻糖。本申请中的名称“H1H1863N2”和“H1H1863N2(Fuc+)”均表示无岩藻糖基化修饰的原始抗体。
在下述的实施例中详细描述了根据该实施例的方法产生的示例性抗EGFRvIII抗体的某些生物学性质。
实施例2：重链和轻链可变区的氨基酸和核酸序列
表1中列出了所选定的本发明的抗EGFRvIII抗体的重链和轻链可变区以及CDR的氨基酸序列标识。相应的核酸序列标识如表2中所示。
表1：氨基酸序列标识
Figure BDA0001146921280000341
表2：核酸序列标识
Figure BDA0001146921280000342
在本申请中的抗体通常根据下述命名法：Fc前缀(例如“H1H”、“H2M”、“H3M”等)，随后为数字标识(例如“2194”、“2195”、“1863”等)，随后为“P”或“N”后缀，如表1和表2中所示。因此，根据这种命名法，可以将本申请中的抗体称为例如“H1H2194N”、“H2M1911N”、“H3M1913N”等。在本申请中使用的抗体命名中的H1H、H2M和H3M前缀表示抗体同种型的特定Fc区。例如，“H1H”抗体具有人源IgG1Fc，“H2M”抗体具有小鼠IgG2Fc和“H3M”抗体具有小鼠IgG3Fc(由抗体名称中的第一个“H”表示所有可变区是全人源的)。本领域的普通技术人员将理解，可以将具有特定Fc同种型的抗体转换为具有不同Fc同种型的抗体(例如可以将具有小鼠IgG1Fc的抗体转换为具有人源IgG4的抗体等等)，但是无论如何，以表1和2中显示的数字标识表示的可变结构域(包括CDR)将是保持不变的，并且无论Fc结构域的性质如何，预计其结合性质将是相同的或基本上相似的。
在下述实施例中使用的对照构建体
在下述实验中包括对照构建体以用于比较目的：对照I：具有氨基酸序列分别对应于美国专利号7,736,644中公开的“13.1.2”抗体的SEQ ID NO：142和144的重链和轻链可变结构域的人源抗EGFRvIII抗体(IgG1)；对照II：具有氨基酸序列分别对应于美国专利号7,589,180中公开的“ch806”抗体的SEQ ID NO：11和12的重链和轻链可变结构域的嵌合的抗EGFRvIII抗体(hIgG1)；对照III：具有氨基酸序列分别对应于在美国专利申请公开号2010/0056762中公开的“hu806”抗体的SEQ ID NO：42和47的重链和轻链可变结构域的人源化的抗EGFRvIII抗体(hIgG1)；对照IV：具有氨基酸序列对应于如在US 7,060,808中所示的“C225”的结构域的重链和轻链可变结构域的嵌合的抗EGFR抗体；和对照V：具有氨基酸序列分别对应于美国专利号7,736,644B2中的“131”抗体的SEQ ID NO：2和19的重链和轻链可变结构域的人源抗EGFRvIII抗体(IgG1)。已知“13.1.2”抗体对EGFRvIII的接合肽(SEQ IDNO:148)具有特异性；并且已知“ch806”和“hu806”抗体结合扩增或过表达的EGFR(SEQ IDNO:146)的残基311-326(SEQ ID NO:165)或EGFRvIII(SEQ ID NO:147)的残基44-59。
实施例3：EGFRvIII的结合亲和性的确定
利用表面等离子体共振在37℃下确定人源单克隆抗EGFRvIII抗体的结合亲和性和动力学常数。在T100BIACORETM仪器上进行检测。将以人源IgG1Fc表示的抗体(即名称为“H1H”)捕获于抗人源Fc传感器表面上(mAb捕获形式)，并且将可溶性单体[EGFR-mmh(SEQID NO:154)和EGFRvIII-mmh(SEQ ID NO:152)]或二聚体[EGFR-mFc(SEQ ID NO:155)和EGFRvIII-mFc(SEQ ID NO:153)]蛋白注射至该表面上。在受体捕获形式中，将EGFRvIII-mFc或EGFR-mFc捕获于BIACORETM芯片上并且使其各自的抗体流过所述受体捕获形式。通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将数据加工和拟合为1:1结合模型确定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。根据动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：KD(M)＝kd/ka和t1/2(min)＝[ln2/(60*kd)]。
结果如表3和表4所示。NB＝在检测条件下未结合；NT＝未检测。
表3(人Fc抗体的结合动力学)
Figure BDA0001146921280000361
Figure BDA0001146921280000371
表4(人Fc抗体的结合动力学)
Figure BDA0001146921280000372
Figure BDA0001146921280000381
如表3和表4中所示，若干抗体显示出对EGFRvIII的选择性并且在mAb捕获形式中不与野生型EGFR结合。在受体捕获形式中(表4)，H1H863N2、H1H1915N和对照I显示出最高的选择性。
实验4：利用ELISA确定的抗体的特异性
为了对抗hEGFRvIII mAb进行进一步表征，利用ELISA对其结合特异性进行了考察。使用下述中的一个包被板：EGFR-mmh(SEQ ID NO:154)；EGFRvIII-mmh(SEQ ID NO:152)和接合肽(J-肽)(SEQ ID NO:148)。对于通过接头在C-末端(SEQ ID NO:149)或N-末端(SEQID NO:150)与生物素连接的接合肽而言，使用抗生物素蛋白预包被板。而且，使用在其N-末端具有或不具有生物素的无关肽(对照肽)包被板。将抗EGFRvIII抗体以及同种型对照抗体加入经包被的板中并且使其在25℃下孵育1小时。然后洗板并使用与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗人源Fc抗体检测结合的抗EGFRvIII mAb。使用四甲基联苯胺(TMB)底物溶液对板进行显色以产生比色反应并且在VICTORTM X5酶标仪上在450nm处测定吸光度前使用硫酸中和。使用PRISMTM软件中的S型剂量效应模型对数据进行分析。将计算得到的EC50值作为结合效能的指示，将EC50值定义为出现最大应答所需的50％的抗体浓度。结果如表5中所示。NT：未检测。对照I-III：如上所述。
表5
Figure BDA0001146921280000391
抗体H1H1863N2、H1H1915和对照I显示出与EGFRvIII较强的结合，但是其不与野生型EGFR结合(>10nM)。除了对照I(具有与来源于使用接合肽免疫的小鼠的“13.1.2”抗体的重链和轻链序列(美国专利号7,736,644)相应的序列)以外，没有抗体显示出与接合肽的结合。
实施例5：使用抗EGFRvIII抗体的EGFR和EGFRvIII的Western印迹
在还原和非还原条件下使用western印迹检测一个抗体H1H1863N2的结合特性。将EGFR-mmh(SEQ ID NO:154)或EGFRvIII-mmh(SEQ ID NO:152)上样于Tris-甘氨酸SDS PAGE凝胶上，进行电泳，然后转移至硝酸纤维素膜上。封闭后，将膜切成两半并且使用抗EGFRvIII抗体或抗His抗体作为探针。对照I和II如上文所述。
如图1a所示，H1H1862N2(Fuc-)不与还原或非还原条件下的EGFRvIII-mmh或EGFR-mmh结合，因此其针对EGFRvIII具有构型表位。而相反的是，在还原和非还原条件下对照II结合野生型和变体III EGFR，而对照I是接合肽的结合物，其对EGFRvIII具有特异性。与H1H1863N2不同的是，对照I和II具有线形结合表位。图1b显示了其他EGFRvIII抗体，其在Western印迹上显示出混合的性质。
实施例6：EGFR/EGFRvIII肽结合和抗体竞争测定
使用肽结合和抗体竞争测定对H1H1863N2(Fuc-)的结合特性进行检测。对于肽结合实验而言，在
Figure BDA0001146921280000402
RED仪器上使用经链霉亲和素包被的
Figure BDA0001146921280000403
尖端将通过接头在其C-末端使用生物素标记的[即LEEKKGNYVVTDHGGGGSK(SEQ ID NO:149)-生物素]EGFRvIII接合肽(SEQ ID NO:148)或通过接头在其C-末端使用生物素标记的[即CGADSYEMEEDGVRKCGGGGSK(SEQ ID NO:151)-生物素]由EGFR的残基311-326组成的肽(“EGFR 311-326-肽”；SEQ ID NO:165)捕获至～0.4nM的厚度。捕获肽后，将包被的尖端置于1μM抗体溶液中并记录结合应答(见图2)。对照I-III与上文中所描述的那些相同。
正如所预期的那样，对照I结合具有C-末端生物素的接合肽，对照II和III结合具有C-末端生物素的EGFR 311-326肽。H1H1863N2(Fuc-)与这两种肽均不结合。
对于抗体交叉竞争而言，在包被了高密度、抗五组氨酸多克隆抗体(目录号#34660,QUIAGEN)的BIACORETM表面上捕获～200个共振单位(RU)的hEGFRvIII-mmh(SEQ IDNO:152)。使用共注射方法，通过注射5分钟500nM的第一mAb随后立即再注射5分钟第二mAb(500nM)饱和所捕获的hEGFRvIII-mmh，第二mAb中添加了500nM的第一mAb。将以RU表示的第二mAb的显著结合解释为其不与第一mAb竞争性结合。对于对照实验而言，将同种型匹配的mAb作为第一mAb或第二mAb使用。结果如表6中所示。
表6
Figure BDA0001146921280000401
Figure BDA0001146921280000411
H1H1863N2(Fuc-)不与对照抗体I-III中的任意一个竞争性地与hEGFRvIII-mmh捕获表面结合。与预期结果一致，对照II和III彼此之间竞争性地与EGFRvIII-mmh捕获表面的结合，对照II和III均已知与EGFR的残基311-326结合。
实施例7：抗EGFRvIII抗体的细胞结合选择性
为了确定抗EGFRvIII mAb对HEK293、表达EGFRvIII的HEK293细胞(HEK293/EGFRvIII)和A431细胞的特异性，进行了荧光活化细胞分选(FACS)分析。通过使用LIPOFECTAMINETM 2000转染试剂(InvitrogenTM)利用组成型表达全长hEGFRvIII(SEQ IDNO:147)的具有新霉素抗性的DNA载体转染HEK292细胞制备HEK293/EGFRvIII细胞。转染2天后，将细胞置于G418选择之下约2周。通过荧光活化细胞分选(FACS)分离阳性表达EGFRvIII的群。在实验中使用每个细胞表达～3x 106个EGFRvIII拷贝的HEK293细胞。简言之，将10μg/ml的抗EGFRvIII抗体与细胞在室温下孵育30分钟、洗涤、与二抗即藻红蛋白(PE)标记的山羊F(ab')2抗人IgG(目录号#109-116-170,Jackson ImmunoResearch Laboratories)孵育、随后在进行FACS分析前进行一次最终的洗涤。在另一组实验中，通过其赖氨酸残基将抗EGFRvIII抗体直接与荧光染料Alexa
Figure BDA0001146921280000412
488染料(InvitrogenTM)偶联，从而省去使用二抗的步骤。使用直接标记的抗EGFRvIII抗体从HEK293细胞和HEK293/EGFRvIII细胞中得到的结果如表7中所示，使用二抗PE-标记的抗-Fc(人或小鼠)得到的相应结果如表8中所示。使用抗EGFRvIII抗体从A431细胞中得到的结果如表9中所示，使用二抗PE-标记的抗-Fc(人或小鼠)得到的相应结果如表10中所示。对照I、II、III、IV和V如上所述。MFI：平均荧光强度。
表7
Figure BDA0001146921280000421
表8
Figure BDA0001146921280000422
表9
Figure BDA0001146921280000423
Figure BDA0001146921280000431
表10
抗体 A431MFI 相对于背景的倍数
未染色 1314 0.9
PE抗人IgG 1428 1.0
H1H1863N2(Fuc-) 3385 2.4
H1H1911N 3140 2.2
H1H2194P 2291 1.6
H1H2195P 2227 1.6
对照I 1448 1.0
对照II 5576 3.9
对照IV 395000 276.6
对照V 4240 3.0
当使用直接标记的抗EGFRvIII抗体(表7)或第二PE标记的抗人IgG(表8)时，若干抗EGFRvIII抗体显示出对于HEK293/EGFRVIII细胞系与母体HEK293细胞相比不同的结合偏好。当与A431细胞孵育时(4℃下30分钟)，除了对照III和IV抗体以外，大部分抗体显示出极少结合至无结合(表9和表10)。
实施例8：抗EGFRvIII mAb被HEK293/EGFRvIII细胞的内化
将抗EGFRvIII mAb(10ug/ml)与HEK293/EGFRVIII(见实施例7，如上所述)细胞在冰上孵育2小时，随后使用PBS洗涤两次。然后将细胞与第二与DylightTM 488偶联的抗人IgGFab片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories)在冰上孵育30min，随后再用PBS洗涤两次。将抗体在内化缓冲液(PBS+FBS)中在37℃下或仍在4℃下内化1h。在4％的甲醛中固定细胞，并使用
Figure BDA0001146921280000432
DNA染料(Cell Signaling Technology,Inc.)对核染色。在ImagexpressTM high content system(Molecular Devices)上在40x下采集图像并使用Columbus软件(Perkin Elmer)对内化的囊泡进行定量。结果如表11和图3中所示。
表11
Figure BDA0001146921280000441
针对H1H1863N2、对照II和对照IV，在37℃下出现较强的内化。针对H1H1911N、H1H1912N和对照I也观察到了内化。
实施例9：抗EGFRvIII抗体与U87/EGFRvIII肿瘤移植物的结合
为了进一步确定H1H1863N2的特异性，根据实施例7中对于HEK293/EGFRvIII细胞的描述制备表达EGFRvIII的人胶质母细胞瘤细胞系U87。在实验中使用每个细胞表达～1.5x 105个EGFRvIII拷贝的U87细胞(U87/EGFRvIII)。将U87/EGFRvIII细胞(3x 106个细胞)移植在重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠上并且使肿瘤生长直至获得200-300mm3的中位尺寸。然后通过尾静脉向小鼠注射H1H1863N2(Fuc-)或同种型对照。在抗体注射后10分钟、4小时和24小时，处死小鼠并且取出肿瘤并置于PBS中。将肿瘤立即解离并使用与别藻蓝蛋白(APC)偶联的抗人Fc(hFc-APC)抗体染色。使用含有2％胎牛血清和0.1％叠氮钠的流动PBS洗涤已染色的细胞3次。将10min和4小时时间点的肿瘤固定过夜，然后使用流式细胞仪进行检测。对24小时时间点收集的肿瘤进行检测，无需对其进行固定。在
Figure BDA0001146921280000442
C6
Figure BDA0001146921280000443
(Accuri Cytometers,Inc.)上收集所有的样品并确定平均荧光强度(MFI)。结果如表12中所示。MFI值为2-3个生物学重复的平均值±平均值的标准误差(SEM)。
表12
Figure BDA0001146921280000444
Figure BDA0001146921280000451
与同种型对照相比，H1H1863N2(Fuc-)抗体以时间依赖性的方式有效地与U87/EGFRvIII肿瘤细胞结合。
实施例10：抗EGFRvIII抗体与B16F10.9/EGFRvIII肿瘤移植物的结合
在SCID小鼠中植入5万个小鼠黑色素瘤细胞B16F10.9或过表达EGFRvIII的B16F10.9(B16F10.9/EGFRvIII)。根据实施例7中对于HEK293/EGFRvIII细胞的描述制备B16F10.9/EGFRvIII细胞。在本实验中使用每个细胞表达～1.5x105个EGFRvIII拷贝的B16F10.9细胞。使肿瘤生长约14天，直至获得200-300mm3的中位尺寸。然后通过其尾静脉向小鼠注射H1H1863N2(Fuc-)或同种型对照。在抗体注射后10分钟、4小时和24小时，处死小鼠并且取出肿瘤并置于PBS中。将肿瘤立即解离并使用与别藻蓝蛋白(APC)偶联的抗人Fc(hFc-APC)抗体染色。采用标准方法，使用流动的PBS(1xPBS，2％胎牛血清，0.1％叠氮钠)洗涤3次经染色的细胞、固定和穿透。使用流式细胞术检测细胞表面上结合的H1H1863N2(Fuc-)并使用FlowJo软件(Tree Star,Inc.)进行分析。结果见表13和图4a中所示。为了检测细胞表面结合的和细胞内结合的抗体，在固定和穿透步骤后使用相同的抗人Fc(hFc-APC)抗体对细胞进行二次染色。这使得能够检测到细胞内的抗体。结果见表14和图4b中所示。在
Figure BDA0001146921280000452
C6
Figure BDA0001146921280000453
上收集所有的样品并确定平均荧光强度(MFI)。在扣除未染色对照的MFI后，报告各样品的MFI。MFI值为两个生物学重复的平均值(N＝2)±平均值的标准误差(SEM)。*对于这个时间点N＝1。
表13
Figure BDA0001146921280000454
Figure BDA0001146921280000461
表14
Figure BDA0001146921280000462
H1H1863N2(Fuc-)以时间依赖的方式与表达EGFRvIII的B16F10.9细胞的表面有效地结合，而同种型对照的结合是极少的。与其仅与细胞表面的结合相比H1H1863N2(Fuc-)的总结合(即细胞表面的结合加内部结合)增加，这表明利用细胞表面结合的抗体被B16F10.0细胞有效地内化。
实施例11：抗EGFRvIII抗体在小鼠中的药代动力学
为了确定抗EGFRvIII抗体在体内的选择性，使用天然表达小鼠EGFR的野生型小鼠(“WT小鼠”)和表达人EGFR的人源化EGFR小鼠(“hEGFR小鼠”)进行了一项药代动力学研究。小鼠来自具有包含C57BL6(75％)和129Sv(25％)背景的杂交系。每个队列中有5只WT或hEGFR小鼠。以0.2mg/kg的剂量皮下注射所有抗体。在给药后0小时、6小时、1天、2天、3天、4天、7天、10天、14天、21天和30天收集血液。利用ELISA确定人抗体的血清水平。简言之，使用山羊的多克隆抗人IgG(Fc特异性)抗体(Jackson ImmunoResearch)以1μg/ml的浓度包被96孔板并在4℃下孵育过夜。在使用BSA封闭后，将以6个剂量系列稀释的血清样品和12个剂量系列稀释的各抗体的对照标准品加入板中并在室温下孵育1小时。洗涤以除去未结合的抗体后，使用与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的相同的山羊多克隆抗人IgG(Fc特异性)抗体(Jackson ImmunoResearch)检测捕获的人抗体并且根据生产厂商的推荐使用标准比色四甲基联苯胺(TMB)底物显色。在450nm处在酶标仪上记录吸光度并使用在样品板上产生的对照标准曲线计算血清样品中hIgG的浓度。使用标准方法测定小鼠抗人抗体(MAHA)并且其在通常情况下是较少的。
图5a-5d显示了四个所检测抗体的抗体浓度对时间的曲线。对照IV(“Mab C225”)已知与人EGFR结合但不与其小鼠同源物结合。与预期一致，这种抗体在hEGFR小鼠中显示出迅速清除并且在WT小鼠中显示出缓慢清除(即无靶向介导的清除)(图5a)。对照I(“Mab13.1.2”)已知与在人和小鼠EGFR中不存在的EGFRvIII接合肽“LEEKKGNYVVTDH”结合。该抗体在体内不与人或小鼠EGFR结合。与预期一致，这种抗体在这两种类型的小鼠中显示出同样较慢的药代动力学清除速率(图5b)并且未观察到靶向介导的清除。对照III抗体(“Mabhu806”)在hEGFR小鼠中与WT小鼠相比显示出增加的清除(图5c)。这一发现与由Biacore(见实施例3，表4)和FACS(实施例7，表9)确定的在体外其能够与hEGFR结合一致。图5d显示了H1H1863N2(Fuc+)的清除。这种抗体与对照I类似在这两种类型的小鼠中显示出了同样较慢的清除速率。因此，H1H1863N2在体内不与人或小鼠EGFR结合。
实施例12：在体内EGFRvIII阳性乳腺癌同种异体移植瘤模型中抗EGFRvIII抗体药物缀合物抑制肿瘤生长
在这个实施例中，针对其在体内抑制肿瘤生长的能力，对示例性抗EGFRvIII抗体H1H1863N2两种不同的抗体药物缀合物进行了测试。第一种ADC由将H1H1863N2通过不可裂解的MCC接头与美登素毒素DM1缀合(参见例如US 5,208,020和US申请2010/0129314)生产，以获得“H1H1863N2-MCC-DM1”。第二种ADC由将H1H1863N2与称为“M0026”(在WO2014/145090中也将其称为“化合物7”，其公开的全部内容通过引用并入本申请)的新型可裂解接头连接的DM1经修饰的版本缀合生产，以获得“H1H1863N2-M0026”。当在体外针对MMT/EGFRvIII细胞检测细胞毒性时，基于药物等效物，H1H1863N2-MCC-DM1显示出的IC50为12nM，而H1H1863N2-7显示出的IC50值为0.8nM。
为了对与DM1和M0026缀合的抗EGFRvIII抗体在体内的效能进行比较，在携带EGFRvIII阳性乳腺癌移植瘤的免疫缺陷小鼠中进行了研究。
简言之，将0.5x106个MMT/EGFRvIII细胞皮下植入雌性CB17SCID小鼠(Taconic,Hudson,NY)的左肋部建立肿瘤移植瘤。一旦肿瘤的平均体积达到140mm3(～第8天)，将小鼠随机分成7组并使用DCC-DM1或M0026接头-药物形式给予抗EGFRvIII ADC。还对对照试剂包括使用MCC-DM1或M0026接头-药物形式的非结合ADC和PBS溶剂进行了评估。在1周内以1和5mg/kg的剂量给予3次ADC，随后进行监测直至仅给予溶剂组的平均肿瘤尺寸达到约2000mm3。在该时间上，根据下文所述计算肿瘤生长抑制情况。
按照如下所述计算与溶剂组相比的平均肿瘤尺寸：使用游标卡尺每周测量肿瘤两次直至溶剂组的平均尺寸达到1000mm3；使用公式(长x宽2)/2计算肿瘤尺寸。根据下述公式计算肿瘤生长抑制：(1-((T最终-T初始)/(C最终-C初始)))*100，其中T(治疗组)和C(对照组)代表在溶剂组达到1000mm3之日的平均肿瘤重量。结果汇总于表15中。
表15
Figure BDA0001146921280000481
如在表15中汇总的，在给予5mg/kg H1H1863N2-M0026的小鼠中观察到了最大肿瘤抑制，在其中观察到了初始肿瘤的消退。使用5mg/kg H1H1863N2-M0026治疗的肿瘤生长抑制为102％，其显著高于在使用5mg/kg H1H1862N2-MCC-DM1治疗肿瘤后所观察到的结果(83％)。在1mg/kg的剂量下也保持了与H1H1863N2-mcc-DM1相比由H1H1863N2-M0026诱导肿瘤生长抑制的优效性。在使用MCC-DM1或M0026的对照ADC治疗组中未观察到抗肿瘤作用。
因此，本实施例显示了本发明的抗EGFRvIII抗体当以抗体药物缀合物形式施用时在抑制肿瘤生长方面具有较高的效能。本实施例还支持了本发明的ADC实际上具有促进肿瘤消退的作用，特别是在本发明的抗EGFRvIII抗体(例如H1H1863N2)与新型接头/药物分子M0026缀合的背景下。
本发明不限于本申请所述的特定实施方式的范围。事实上，除了本申请所描述的那些以外的不同修订是本领域技术人员从前述描述和附图中显而易见的。此类修订旨在落入所附权利要求的范围内。
实施例13：抗EGFRvIII-DM1抗体对表达EGFRvIII的细胞显示出特异性并显示出高效的细胞杀伤活性
在这个实施例中，使用基于体外细胞的测定确定了与美登素毒素DM1缀合的抗人EGFRvIII抗体降低细胞活力的能力。
将全长人EGFRvIII(SEQ ID NO:147)或野生型人EGFR(SEQ ID NO:146)稳定地引入HEK293(293/hEGFRvIII，293/hEGFRwt)、U251(U251/hEGFRvIII)和MMT060562(MMT/hEGFRvIII)细胞系。所有细胞通过基于lipofectamine 2000的方法学产生并且在存在G418的完全培养基中培养。
通过FACS分析对EGFR wt或EGFRvIII在细胞表面的表达情况进行检测。简言之，将1x106个细胞与10μg/ml抗EGFRvIII抗体H1H1863N2、抗EGFRwt对照mAb(对照IV)或同种型对照在抗体稀释缓冲液中在冰上孵育30min。使用抗体稀释缓冲液洗涤两次后，将细胞与10μg/ml同PE缀合的抗人二抗在冰上孵育30min。再洗涤两次后，将样品在Accuri C6(BD)或Hypercyt(Intellicyt)细胞仪上检测并使用FlowJo软件对数据进行分析。结果汇总于表16中。n.d.＝未确定。
表16：在EGFRwt和EGFRvIII工程改造的细胞系中的细胞表面表达
Figure BDA0001146921280000491
这些结果表明EGFRvIII的表面表达在HEK293/hEGFRvIII和MMT/hEGFRvIII细胞系中相当，但是在U251/EGFRvIII中的表达水平约为在HEK293/hEGFRvIII和MMT/hEGFRvIII细胞系中的约二十分之一。在母体细胞系中检测不到通过H1H1863N2的EGFRvIII结合。而相反的是，抗EGFRwt对照抗体(对照IV)与HEK293母体细胞的结合是同种型对照的49倍。将EGFRwt表达载体稳定掺入HEK293细胞使表达是背景的332倍并且与在HEK293/hEGFRvIII和MMT/hEGFRvIII细胞中的EGFRvIII表达相当。
使用HEK293母体、HEK293/hEGFRwt、HEK293/hEGFRvIII和A431细胞系通过FACS对抗EGFRvIII抗体H1H1863N2与EGFRvIII的选择性结合进行了评估。结果如表17中所示。
表17：抗EGFRvIII抗体与表达EGFRvIII的细胞系的结合特异性
Figure BDA0001146921280000501
如表17中所示，与同种型对照相比H1H1863N2和抗EGFRwt对照抗体(对照IV)两者与HEK293/EGFRvIII细胞显示出较强的结合(是背景的>650倍)。而相反的是，H1H1863N2与wt-EGFR HEK293细胞系(是背景的3倍)和内源性表达EGFR的细胞系A431(是对照的13倍)的结合较弱。抗EGFR-wt对照抗体与表达wt EGFR的细胞具有较强的结合，这确证了H1H1863N2对于EGFRvIII与野生型EGFR相比具有选择性。
接下来，使用基于体外细胞的测定确定了与美登素毒素DM1缀合的抗人EGFRvIII抗体降低细胞活力的能力。以在完全生长培养基中250–2000个细胞每孔的密度将细胞接种于PDL包被的96孔板中并使其生长过夜。对于细胞活力曲线而言，将ADC或游离药物(DM1-SMe)以范围从500nM至5pM的终浓度加入细胞中并孵育3天。最后将细胞与CCK8(Dojindo)孵育1-3h并且在Flexstation3(MolecularDevices)上确定450nm处的吸光度(OD450)。从所有孔中扣除经地高辛(40nM)处理细胞的背景OD450水平并将活力表示为未处理对照的百分率。从10点应答曲线的四参数对数方程确定IC50值(GraphPad Prism)。结果如表18A和表18B中所示。IC50值以nM表示并且用特定药物/抗体比值(DAR)进行归一化。
表18A：抗EGFRvIII-DM1抗体药物缀合物的细胞杀伤效力
Figure BDA0001146921280000511
表18B：抗EGFRvIII-DM1抗体药物缀合物的细胞杀伤效力
Figure BDA0001146921280000512
如表18A和表18B所示，H1H1863N2-MCC-DM1以IC50范围从1.0至4.0nM降低HEK293/hEGFRvIII、U251/hEGFRvIII和MMT/hEGFRvIII细胞系的活力。而相反的是，与DM1缀合的同种型对照以IC50大于100nM降低293/EGFRvIII和MMT/hEGFRvIII细胞的活力以及以IC50为35nM降低U251/hEGFRvIII细胞的活力。H1H1863N2-MCC-DM1对表达野生型EGFR的HEK293细胞(293/hEGFRwt)或对照母体细胞系没有影响，这表明其对表达EGFRvIII的细胞具有特异性。
因此，本实施例表明EGFRvIII抗体H1H1863N2对表达EGFRvIII的细胞系具有特异性并且表明当与DM1毒素缀合时其具有特异性的细胞杀伤能力。
实施例14：当与EGFRvIII构象结合的抗体药物缀合物同与EGFRvIII接合肽结合的抗体药物缀合物联用时产生了改善的细胞杀伤效力
在这个实施例中，确定了通过将两种不同类型的抗EGFRvIII抗体药物缀合物共同给药增强了细胞杀伤能力。对于这个实施例，所测试的组合由两种不同的抗EGFRvIII抗体组成：(1)不识别EGFRvIII接合肽ADC的抗EGFRvIII特异性抗体(在本申请中称为“构象结合物”)；和(2)识别EGFRvIII接合肽的抗EGFRvIII特异性抗体(在本申请中称为“肽结合物”)。如在实施例6中所示，抗EGFRvIII抗体H1H1863N2不与EGFRvIII接合肽或人EGFR的残基311-326结合，因此将其称为“构象结合物”。
在体外的交叉竞争
首先，通过结合竞争测定确定了H1H1863N2与同EGFRvIII接合肽结合的抗体交叉竞争的能力。在本实施例中使用的与抗EGFRvIII抗体结合的接合肽是对照V。
在Octet HTX生物传感器(ForteBio Corp.,A Division of Pall LifeSciences)上使用实时、无标签的生物层干涉法(BLI)测定确定交叉竞争。整个实验在25℃下使用振荡速度为1000rpm的板在含有0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20、1.0mg/mL BSA(Octet HBST buffer)的缓冲液中进行。为了确定两种抗体是否交叉竞争地与重组的人EGFRvIII(hEGFRvIII.mmh；SEQ ID:152)结合，将约0.35nmhEGFRvIII.mmh捕获于抗五His包被的Octet生物传感器上。然后通过浸入含有50μg/mLmAb-1溶液的孔5分钟使用第一抗EGFRvIII单克隆抗体(后文中称为mAb-1)饱和捕获了抗原的生物传感器。随后将生物传感器再浸入含有50μg/mL第二抗EGFRvIII单克隆抗体溶液(后文中称为mAb-2)中3分钟。在实验的各步骤之间在Octet HBST缓冲液中洗涤所有的生物传感器。在实验过程中监测实时结合应答并记录每个步骤结束时的结合应答。对与hEGFRvIII结合的mAb-2与预先同mAb-1复合的应答进行比较并确定不同抗EGFRvIII单克隆抗体的竞争性/非竞争性行为。
使用这种实验性的交叉竞争形式，H1H1863N2未显示出与所检测的EGFRvIII接合肽结合物的交叉竞争，其也不与对照II或对照IV交叉竞争与EGFRvIII的结合。因此，这项交叉竞争测定的结果表明H1H1863N2与EGFRvIII接合肽结合物以及对照II和IV相比具有独特的结合表位。
单独的抗EGFRvIII抗体药物缀合物的细胞杀伤活性
接下来，评估了当联合施用时H1H1863N2-MCC-DM1和抗EGFRvIII肽结合ADC降低细胞活力的能力。使用如实施例13所述的基于体外细胞的测定确定了当与SMCC-DM1(即对照V-MCC-DM1)缀合时对照V诱导细胞杀伤的能力。结果汇总于表19中。
表19：抗EGFRvIII-DM1抗体药物缀合物的细胞杀伤效力
Figure BDA0001146921280000531
如表19中所汇总的，抗EGFRvIII ADC以范围从0.25nM至3.25nM的IC50值降低各种EGFRvIII过表达细胞系的细胞活力。
抗EGFRvIII抗体药物缀合物配对组合的细胞杀伤活性
接下来，在EGFRvIII过表达细胞系中测试了以1:1比例配对的H1H1863N2-MCC-DM1和抗EGFRvIII肽结合ADC的细胞杀伤效力。结果如表20中所示。
表20：抗EGFRvIII-DM1ADC配对组合的细胞杀伤效力
Figure BDA0001146921280000532
如表20中所汇总的，H1H1863N2-MCC-DM1(构象表位结合物)与对照V-MCC-DM1(接合肽结合物)的组合使得细胞杀伤效力至少与单一的ADC疗法是等效的或者在某些例子中与单一ADC疗法相比是增强的。两种类型的抗体之间不存在干扰表明能够有效使用具有不同细胞毒素或作用机制不同的不同类型细胞毒素的两种非竞争性抗体。
综上所述，本实施例表明H1H1863N2不与对照EGFRvIII肽结合抗体交叉竞争。这种独特的表位使得其能够与EGFRvIII肽结合ADC联用以改善细胞杀伤效力。这种新型的EGFRvIII ADC联用能够使其具有更好的治疗效果。
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Claims (17)

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段与人EGFRvIII特异性结合，其中所述抗体或其片段包括氨基酸序列为SEQ ID NO:36的重链互补决定区1(HCDR1)、氨基酸序列为SEQ ID NO:38的HCDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO:40的HCDR3、氨基酸序列为SEQ ID NO:44的轻链互补决定区1(LCDR1)、氨基酸序列为SEQ ID NO:46的LCDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO:48的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)，所述HCVR具有SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)，所述LCVR具有SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：34所示氨基酸序列的HCVR和具有SEQ ID NO：42所示氨基酸序列的LCVR。
5.一种缀合物，所述缀合物包含根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段和细胞毒素。
6.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述细胞毒素选自下组：生物毒素、化疗剂和放射性同位素。
7.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述细胞毒素选自下组：美登素类(maytansinoids)、阿里他汀(auristatins)、茅屋霉素(tomaymycins)、倍癌霉素(duocarmycins)、225Ac、和227Th。
8.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，所述药物组合物还包含一种或多种选自下组的附加治疗剂：化疗剂、抗炎剂和镇痛剂。
10.权利要求5所述的缀合物在制备用于治疗表达EGFRvIII的癌症的药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述癌症选自下组：胶质母细胞瘤、导管或导管内乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌以及头颈部鳞状细胞癌。
12.权利要求5所述的缀合物在制备用于治疗表达EGFRvIII的肿瘤的药物中的用途。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于在患者中治疗表达EGFRvIII的癌症、减少肿瘤生长和/或促使肿瘤消退的药物组合物中的用途，其中所述肿瘤表达EGFRvIII，所述组合物包括第一抗体药物缀合物(ADC)，所述第一抗体药物缀合物包含所述抗体或其抗原结合片段和细胞毒素。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述组合物还包括第二ADC。
15.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述细胞毒素选自下组：1-(2氯乙基)-1,2-二甲磺酰肼、1,8-二羟基-双环[7.3.1]十三烷基-4,9-二烯-2,6-二炔-13-酮、1-脱氢睾酮、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、9-氨基喜树碱、放线菌素D、鹅膏蕈碱、氨基蝶呤、蛇形菌素、蒽环类、氨茴霉素(AMC)、阿里司汀、博莱霉素、白消安、丁酸、刺孢霉素、喜树碱、洋红霉素、卡莫司汀、西马多丁、顺铂、秋水仙碱、考布他汀、环磷酰胺、阿糖胞苷、细胞松弛素B、更生霉素、柔红霉素、达卡巴嗪、二乙酰氧基苯基多柔比星、二溴甘露醇、二羟基炭疽菌二酮、地索拉唑、多拉司他汀、多柔比星、倍癌霉素、棘霉素、艾榴素、吐根碱、埃坡霉素、埃斯波霉素、雌莫司汀、溴化乙锭、依托泊苷、氟尿嘧啶、格尔德霉素、短杆菌肽D、糖皮质激素、依立替康、细霉素、环氧长春碱、利多卡因、洛莫司汀(CCNU)、美登素、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲基叶酸、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌，N8乙酰亚精胺、鬼臼毒素、普鲁卡因、普萘洛尔、蝶啶、嘌呤霉素、吡咯并苯二氮
Figure FDA0002682449610000031
类(PDBS)、利索新、链脲霉素、他利霉素、紫杉醇、替尼泊苷(tenoposide)、丁卡因、苯丁酸氮芥、茅屋霉素、托泊替康、微管溶素、长春碱、长春新碱、长春地辛、和长春瑞滨。
16.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述细胞毒素是美登素。
17.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述细胞毒素是DM1。
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