CN105555804B - 对EGFRvIII有特异性的抗体结合位点 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了特异性结合EGFRvIII的结合蛋白和特异性结合EGFRvIII和CD3的多特异性结合蛋白。进一步描述了结合EGFRvIII和CD3的多特异性串联双抗体。进一步描述了用于募集T细胞以专门有效地杀死几种类型实体瘤癌症的高细胞毒性EGFRvIII/CD3双特异性串联双抗体。

Description

对EGFRvIII有特异性的抗体结合位点
本发明涉及特异性结合EGFRvIII的结合蛋白和特异性结合EGFRvIII和CD3的多特异性结合蛋白。本发明进一步延伸到结合EGFRvIII和CD3的多特异性串联双抗体(tandemdiabody)。特别是，本发明涉及用于募集T细胞以专门有效地杀死几种类型实体瘤癌症的高细胞毒性EGFRvIII/CD3双特异性串联双抗体
Figure GDA0002026522800000011
EGFR失调与许多癌症相关联，小分子和EGFR靶向抗体均已成功用于临床。然而，由于EGFR的广泛的正常组织表达，被批准用于临床应用的抗体以及那些处于开发中的抗体均具有严重的副作用。具有截短的胞外结构域并确保配体非依赖性固有活性的EGFR的缺失突变体(deletion variant)III(EGFRvIII)，是与致癌性转化相关的最常见的突变体形式。EGFRvIII专门在癌组织中表达，并与各种实体瘤类型相关。癌细胞上受限制的EGFRvIII表达提供了开发专门靶向癌症同时保护正常组织并充分降低与EGFR治疗相关的副作用的细胞毒性抗体的机会。
在本发明的第一个方面中，本文描述了全人的、高特异性的、高亲和力EGFRvIII结合蛋白。所描述的EGFRvIII结合蛋白具有如下优势：
它们不促进或促进来自靶向阳性分子的细胞表面的非常低的EGFRvIII内化，这有利于募集细胞毒性T-细胞或NK-细胞。图9中的结果显示，根据本发明，细胞在所有测试条件下暴露于EGFRvIII结合蛋白之后，相对于未处理的细胞，EGFRvIII受体分子仍保留在细胞表面上。这些结果表明，本发明的EGFRvIII/CD3结合蛋白令人惊讶地不显示任何内化趋势(图9)。本发明的EGFRvIII特异性结合蛋白的结合可能抑制内化，而不是诱导内化，或者可能促进EGFRvIII表达的增加，从而导致其细胞表面密度增加。
可使用亲和力成熟技术(affinity maturation technique)使这些高亲和力结合蛋白的亲和力得到进一步大幅提高以获得对EGFRvIII有特异性、KD在100pM范围或更低的结合蛋白。令人惊讶的事实是，这些结合蛋白展示了结合EGFRvIII的异常特异性，且对天然EGFR(野生型EGFR或EGFRwt)没有交叉反应性。由于来自EGFR细胞外结构域(外显子2-7)的269个氨基酸的框内(in-frame)缺失，因此相对于EGFRwt，在EGFRvIII中形成新表位(neo-epitope)，且预计该新表位相当小：其由新的氨基酸并列(novel juxtaposition of aminoacids)(氨基酸5融合于氨基酸274)和缺失位点处的一个新的GLY氨基酸组成。
亲和力成熟筛选方法的目的在于通过促进解离速率(kOFF)降低的结合蛋白的选择来提高结合亲和力。然而，令人惊讶的是，所显示的亲和力成熟的结合蛋白大大增加了结合速率(kON)，而kOFF的降低对结合蛋白的提高达100倍的结合仅有小的贡献，其中一些可变抗体结构域显示KD小于100pM。
这些独特的性质使这些本文所描述的对EGFRvIII有特异性的可变抗体结构域特别适用于开发多特异性的，例如双特异性的、多价的、免疫效应细胞参与(immune effectorcell engaging)、肿瘤靶向抗体治疗，诸如，例如EGFRvIII/CD3双特异性串联双抗体
Figure GDA0002026522800000021
在本发明的进一步方面中，提供了多价EGFRvIII结合抗体，其对EGFRvIII具有两个结合位点，或在多价双特异性抗体的情况下，除对EGFRvIII具有两个结合位点之外，还对T-细胞抗原CD3或特异性表达于天然杀伤(NK)细胞上的CD16A具有结合位点。
在一个实施例中，使用对EGFRvIII具有两个结合位点并另外包含对CD3具有两个结合位点的EGFRvIII/CD3串联双抗体，并测试了它们与重组EGFRvIII-或EGFR-Fc融合抗原的结合。在非还原条件下(由于完整的二硫键，分子结构仍部分保留)，或在还原条件下(蛋白结构完全变性)，EGFRvIII-或EGFR-Fc融合抗原通过SDS-PAGE分离，通过蛋白质印迹(Western Blotting)转移至PVDF膜，并使用不同的EGFRvIII/CD3串联双抗体抗体(diabodyantibody)或EGFR-结合IgG西妥昔单抗来评估结合以修饰(decorate)印迹(图4)。该实施例显示，包含对EGFRvIII具有两个结合位点的亲代EGFRvIII结合结构域和亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域在多价抗体形式中也保持其对EGFRvIII的选择特异性。在还原和非还原条件下，所有EGFRvIII/CD3串联双抗体均能识别EGFRvIII，但在任意的这些条件下均不能识别全长野生型EGFR。该实施例还证明，本文所描述的EGFRvIII特异性结合结构域能识别线性表位，且其反应性不需要完整的三维结构。这与EGFR-结合IgG抗体西妥昔单抗(爱必妥(Erbitux))相反，EGFR-结合IgG抗体西妥昔单抗能识别野生型EGFR和成熟的EGFRvIII，但其反应性显然需要完整二硫键与构象表位(图4)。
在另一个实施例中，使用包含与不同CD3结合结构域组合的亲代的或亲和力成熟的EGFRvIII特异性结构域和/或在串联双抗体分子中具有不同顺序单个结合结构域的EGFRvIII/CD3串联双抗体。具有结构域顺序VL CD3-VH EGFRvIII-VL EGFRvIII-VH CD3的串联双抗体在串联双抗体分子的中部含有二价EGFRvIII结合位点，而具有结构域顺序VH EGFRvIII-VL CD3-VH CD3-VL EGFRvIII的串联双抗体在外面的位置具有两个EGFRvIII结合位点且在中部具有两个CD3结合位点。在ELISA中，分析串联双抗体的不同EGFRvIII-结构域和结构域顺序突变体与EGFRvIII抗原、野生型EGFR抗原的浓度依赖性结合以及与CD3抗原的浓度依赖性结合(图6)。所有含有亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的串联双抗体均显示了与EGFRvIII结合的大幅提高，清楚地表现为相应的结合曲线向较低浓度移位大于两个数量级(图6)。没有观察到任何串联双抗体与野生型EGFR抗原的结合。
可通过噬菌体展示文库(phase display libraries)选择和鉴定抗EGFRvIII抗体，例如选择性地结合成熟的而非天然形式(native form)的EGFR的抗原-结合蛋白。T细胞是不能由天然抗体募集的有效的肿瘤杀伤效应细胞。因此，在本发明的进一步方面中，本发明提供了一组多特异性EGFRvIII/CD3抗原-结合蛋白，特别是串联双抗体，其能募集T细胞、具有宽范围的结合特性和细胞毒性特性。在一组体外试验中表征了本发明的抗原-结合蛋白的结合特性、T细胞介导的细胞毒性活性和靶标介导的T细胞活化的特征。在FACS中，本发明的抗原-结合蛋白对Biacore、ELISA和EGFRvIII-阳性细胞中的EGFRvIII抗原显示异常的特异性。在测试的全浓度范围内，没有观察到任何结合蛋白与EGFR抗原或与EGFRwt表达细胞的可检测的结合。最有效的高亲和力串联双抗体对表达EGFRvIII的F98神经胶质瘤细胞和CHO细胞显示EC50为1pM-10pM的细胞毒性；剩余的串联双抗体显示EC50高达约10000pM的细胞毒性。也试验了这些串联双抗体对作为结合至天然形式的残基的更敏感探针的EGFRwt+细胞的细胞毒性。直至最大评估的串联双抗体浓度为0.5μM时，才在EGFRwt+细胞或其他EGFRvIII-阴性细胞上观察到细胞毒性。与CD3的高亲和力结合对有效的T细胞募集是至关重要的，然而，在体外不存在EGFRvIII+靶细胞时，如由增殖缺乏测量，本发明的串联双抗体没有引起T细胞活化，这有助于良好的临床前安全性(图10)。总之，抗肿瘤细胞毒性的严格特异性和高效性由EGFRvIII/CD3串联双抗体介导。
产生了具有CD3结合KD范围为1.1nM至约500nM但相对恒定的EGFRvIII结合KD(范围为2.0nM-6.7nM)的串联双抗体，其显示了对表达EGFRvIII的细胞的CD3结合强度和细胞毒性效力的良好相关性，其EC50值范围为25pM至约10000pM(图11)。
虽然本发明的抗原-结合蛋白对EGFRvIII的亲和力已得到显著提高，但特异性没有损失。
Figure GDA0002026522800000051
是用于表示串联双抗体的Affimed Therapeutics的商标(Kipriyanovet al.,1999,J.Mol.Biol,293:41-56；Cochlovius et al.,2000,Cancer Res.,60:4336-4341；Reusch et al.,2004,Int.J.Cancer,112:509-518,Kipriyanov,2009,Methods MolBiol,562:177-93；McAleese and Eser,2012,Future Oncol.8:687-95)。在本发明的上下文中，TandAb和串联双抗体作为同义词使用。
野生型EGFR基因和蛋白的序列是已知的。EGFRvIII是野生型EGFR基因的外显子2-7(801bp)的框内缺失的结果，导致受体外部结构域的267个氨基酸缺失，并在外显子1和8的接点处产生新的甘氨酸残基。EGFR胞外结构域内的该新的氨基酸并列产生肿瘤特异性和免疫原性表位。
根据本发明的第一个方面，描述了对至少EGFRvIII具有特异性的结合蛋白，其不与野生型EGFR交叉反应。该结合蛋白优选包括选自下表1A中所描述的CDR的抗体可变重链的CDR1、CDR2、CDR3和抗体可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3。
表1A：来自特异性结合EGFRvIII的结合蛋白的人类轻链和重链CDR的氨基酸序列的序列标识号
Figure GDA0002026522800000052
Figure GDA0002026522800000061
因此，本发明的实施方案是具有至少一个EGFRvIII结合位点的EGFRvIII结合蛋白，包含抗体可变重链结构域和/或抗体可变轻链结构域；其中，所述抗体可变重链结构域包含选自SEQ ID NO：27、33、42、46、49、53的CDR1，选自SEQ ID NO：28、38、43、50、54、61、63的CDR2和SEQ ID NO：29的CDR3；所述抗体可变轻链结构域包含选自SEQ ID NO：30、34、36、39、44、47、51、56、59、64的CDR1，选自SEQ ID NO：31、40、57的CDR2和选自SEQ ID NO：32、35、37、41、45、48、52、55、58、60、62和65的CDR3。
根据进一步的实施方案，所述结合蛋白包含具有选自如表1B所示的SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和25的抗体可变重链结构域和/或选自如表1B所示的SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和26的抗体可变轻链结构域的至少一个EGFRvIII结合位点。三个可变轻链CDR和三个可变重链CDR的氨基酸序列在表1中以粗体显示且加有下划线。这些结构位点显示对EGFRvIII的亲和力提高，而特异性没有损失。这些抗原-结合蛋白不与野生型EGFR抗原交叉反应。
进一步地，本发明的这些抗原-结合蛋白在结合EGFRvIII时没有显示或仅显示最小化的EGFRvIII内化。根据本发明，在根据实施例9的测试条件下，在细胞暴露于EGFRvIII-结合抗体之后，大于80％，优选大于90％，最优选大于95％的EGFRvIII受体分子仍保留在细胞表面。本发明的EGFRvIII特异性结合蛋白的结合可能抑制内化，而不是诱导内化，或者可能促进EGFRvIII的表达增加，从而导致其细胞表面密度增加。
术语“结合蛋白”是指具有抗原结合性质的免疫球蛋白衍生物，即含有抗原结合位点的免疫球蛋白多肽或其片段。该结合蛋白包含抗体的可变结构域或其片段。每个抗原-结合结构域都由结合相同表位的抗体即免疫球蛋白、可变重链结构域(VH)和抗体可变轻链结构域(VL)形成。本发明的可变轻链结构域或可变重链结构域是包含CDR1、CDR2和CDR3的多肽。优选地，本发明的结合蛋白缺乏免疫球蛋白恒定结构域。术语“结合蛋白”也指抗体片段或衍生物，包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、单链Fv、双抗体、串联双抗体
Figure GDA0002026522800000072
弹性抗体(flexibody,WO03/025018)、串联单链Fv((scFv)2)。
表1B：所有抗-EGFRvIII可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)的氨基酸序列(CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列以粗体显示且加有下划线)
Figure GDA0002026522800000071
Figure GDA0002026522800000081
Figure GDA0002026522800000091
在优选的实施方案中，赋予对EGFRvIII具有特异性的结合蛋白包含来自表1所示的可变重链结构域和可变轻链结构域的以下组合之一的抗原结合位点：
(i)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，
(ii)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，
(iii)SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，
(iv)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，
(v)SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，
(vi)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，
(vii)SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，
(viii)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，
(ix)SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，
(x)SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，
(xi)SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或
(xii)SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26。
本发明还提供不仅对EGFRvIII具有特异性，而且还具有至少一个其他功能结构域的结合蛋白。在进一步的实施方案中，所述至少一个其他功能结构域是效应子结构域(effector domain)。“效应子结构域”是对效应细胞有特异性的结合位点，其可刺激或触发细胞毒性、吞噬、抗原呈递、细胞因子释放。这样的效应细胞是，例如但不限于，T-细胞或NK-细胞。特别是，所述其他效应子结构域包含形成CD3优选人类CD3的抗原结合位点的至少一个抗体可变重链结构域和至少一个可变轻链结构域。
因此，本发明的EGFRvIII结合蛋白可以是多特异性的。本文所用的术语“多特异性的”意思是指本发明的结合蛋白对不同的表位具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个用于EGFRvIII。例如，结合蛋白可以是三特异性的，并且对肿瘤细胞上的两个不同的表位和/或抗原具有结合位点且对效应细胞诸如例如CD3上的表位或抗原具有至少一个结合位点。结合蛋白对相同抗原的不同表位和/或不同抗原的表位可具有结合位点。这样的多特异性结合蛋白包括单链双抗体、(scFv)2、串联双抗体
Figure GDA0002026522800000102
和弹性抗体(参见Le Gallet al.,1999FEBS Letts 453:164-168和WO 03/025018)。在本发明的具体实施方案中，结合蛋白是对EGFRvIII和CD3双特异性的。
本发明的多特异性结合蛋白的CD3结合位点可由如下组成：如表2所示的可变重链结构域(SEQ ID NO：23)和可变轻链结构域(SEQ ID NO：24)，或与CDR序列仅两个氨基酸不同的该序列的密切同源物(close homolog)，或对CD3(称为CD3)有特异性的任何其他全人的、人源化的或非人可变抗体结构域，诸如，例如，对CD3，特别是CD3ε有特异性的可变抗体结构域或任何其他全人的、人源化的或非人可变抗体结构域，诸如，例如UCHT1或OKT3的可变抗体结构域。
表2：全人抗-CD3可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)的氨基酸序列(CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列以粗体显示且加有下划线)
Figure GDA0002026522800000101
此外，本发明的EGFRvIII结合蛋白可以是多价的。本文所用的术语“多价的”意思是指，本发明的结合蛋白包含至少两个抗原结合位点。抗原结合位点可具有相同或不同的特异性。在本发明的实施方案中，结合蛋白以至少两个结合位点即二价方式结合相同表位。二价的结合蛋白的实例是双抗体，至少四价的结合蛋白的实例是串联双抗体。
在本发明进一步的方面中，所述的EGFRvIII结合蛋白以及双特异性EGFRvIII和CD3结合位点是人源化的或全人的，即人源的。在本发明进一步的方面中，EGFRvIII结合蛋白或多特异性EGFRvIII和CD3结合蛋白是二聚体，即包含两个具有EGFRvIII和CD3抗原结合位点的多肽。
根据本发明，以串联双抗体
Figure GDA0002026522800000113
的形式提供二聚双特异性EGFRvIII和CD3结合蛋白。这样的串联双抗体通过连接能够同源二聚的四个抗体可变结合结构域(单基因构建体中的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)(参见McAleese and Eser,2012,Future Oncol.8:687-95))来构建。在这样的串联双抗体中，接头(linker)长度是其防止可变结构域的分子间配对以致分子不能折叠回其本身上来形成单链双抗体，而是被迫与另一条链的互补结构域(complementary domain)配对。对这些结构域还可以这样排列，即使得相应的VH和VL结构域在二聚期间配对。由单个基因构建表达后，两条同样的多肽链头尾折叠形成约110kDa的功能性非共价同源二聚体(McAleese and Eser,2012,Future Oncol.8:687-95)。尽管不存在分子内共价键，同源二聚体一旦形成即是高度稳定的，保持完整并且不恢复为单体形式。
在多特异性串联双抗体的一个实施方案中，提供了人源化的双特异性四价抗体
Figure GDA0002026522800000111
其对CD3和EGFRvIII各具有两个结合位点(EGFRvIII/CD3RECRUIT-
Figure GDA0002026522800000112
)，以利用T细胞的细胞毒性能力治疗成胶质细胞瘤(GB)、前列腺癌、头颈癌以及其他表皮生长因子受体突变体vIII阳性(EGFRvIII+)癌。
相对于传统单克隆抗体，串联双抗体具有提供优势的大量性质，还具有较小的多特异性分子。串联双抗体在不存在糖基化时是全功能性的。串联双抗体可仅含有抗体可变结构域，并因此可没有可与Fc部分相关的任何副作用。因为双特异性串联双抗体允许二价结合至EGFRvIII和CD3中的每一个，因此，其亲合力(avidity)与IgG的亲合力相同。串联双抗体的大小约为110kDa，小于IgG，这可增强肿瘤渗透。然而，与基于抗体-结合结构域或非抗体支架的较小的双特异性形式相比，该大小远高于首过清除(first-pass clearance)的肾阈，这提供了药代动力学优势。例如Kipriyanov SM:Methods Mol.Biol.2009；562:177-93、Kipriyanov SM:Methods Mol.Biol.2003；207:323-33或McAleese and Eser,2012,Future Oncol.8:687-95中描述了这样的串联双抗体的产生和制备。
串联双抗体在CHO细胞中良好表达。可以使有效的上游和下游制造工艺落实到位。
将本发明的EGFRvIII和CD3双特异性串联双抗体设计为通过募集细胞毒性T细胞特异性靶向EGFRvIII+肿瘤细胞。抗体不能直接募集细胞毒性T细胞。相反，通过雇用(engage)在这些细胞上特异性表达的CD3分子，串联双抗体可使细胞毒性T细胞与EGFRvIII+肿瘤细胞以高度特异性的方式交联，从而显著增加这些分子的细胞毒作用。串联双抗体显示强的、特异性的和有效的细胞毒性。显著的证据是T细胞能在控制肿瘤生长中起作用。例如，大肠肿瘤以及来自NHL患者的淋巴结中细胞毒性T细胞的存在显示与更好的临床结果相互关联。此外，对于黑色素瘤疫苗，以及针对CTLA-4即T-细胞活化的负调节剂的抗体，已证明了经设计诱导T-细胞应答的疗法的潜力。本发明的串联双抗体通过结合表面表达的CD3、优选CD3ε雇用细胞毒性T细胞，CD3ε形成T-细胞受体的一部分。该串联双抗体与在特定肿瘤细胞表面上表达的CD3和EGFRvIII的同时结合引起T-细胞活化并调节随后的肿瘤细胞裂解。
“二聚体”是指两个多肽的复合体。优选地，所述两个多肽彼此非共价相关，特别是在两个多肽之间没有共价键的条件下。优选地，双特异性二聚体是同源二聚体，即包含两个相同多肽。然而，三特异性或其他多特异性二聚体可以是异源二聚体并包含两个不同的多肽，例如可变轻链结构域的至少一个结合位点位于一个多肽上且可变重链结构域位于其他结构域上。术语“多肽”是指由酰胺键连接的氨基酸残基的聚合物。优选地，多肽是未分枝的单链融合蛋白。在该多肽中，可变抗体结构域相继连接。除可变结构域N-端和/或C-端之外，该多肽还可具有连续的(contiguous)氨基酸残基。例如，这样连续的氨基酸残基可包括可有益于多肽纯化的Tag序列，优选在C-端。
双特异性串联双抗体的每个多肽都包含至少四个可变结构域，即CD3结合蛋白的可变轻链(VL)和可变重链(VH)以及EGFRvIII结合蛋白的可变轻链(VL)和可变重链(VH)。四个结合结构域由肽接头L1、L2和L3连接，并可从N-端至C-端进行如下排列：
(i)VL(CD3)-L1-VH(EGFRvIII)-L2-VL(EGFRvIII)-L3-VH(CD3)；或
(ii)VH(CD3)-L1-VL(EGFRvIII)-L2-VH(EGFRvIII)-L3-VL(CD3)；或
(iii)VL(EGFRvIII)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(EGFRvIII)；或
(iv)VH(EGFRvIII)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(EGFRvIII)。
在本发明的实施方案中，四个可变结构域按VL(CD3)-L1-VH(EGFRvIII)-L2-VL(EGFRvIII)-L3-VH(CD3)排列。具有结构域顺序VL CD3-VH EGFRvIII-VL EGFRvIII-VH CD3并含有不同EGFRvIII结合序列的串联双抗体，尽管对EGFRvIII具有不同亲和力，所有都显示出对第二特异性CD3非常相似的结合，如CD3γε抗原上通过ELISA所示(图5A)。在含有外面位置的EGFRvIII结合结构域和中部的两个CD3结合位点的其他串联双抗体结构域顺序(VH EGFRvIII-VL CD3-VH CD3-VL EGFRvIII)中，EGFRvIII与亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的结合的显著提高同样是明显的，而串联双抗体中部结构域与CD3的结合稍弱，且在单个串联双抗体之间比第一结构域顺序变化更多(图5B)。当用不同CD3结构域(SEQ ID NO：23和24)构建含有不同EGFRvIII-结合结构域的串联双抗体时，进行了相似的观察(图5C)。
接头的长度影响抗原-结合串联双抗体的柔韧性(flexibility)。例如，Todorovska et al.,2001Journal of Immunological Methods 248:47-66；Perisic etal.,1994Structure 2:11217-1226；Le Gall et al.,2004,Protein Engineering 17:357-366和WO94/13804中描述了接头长度对形成二聚抗原-结合蛋白的影响。
根据本发明，优选肽接头L1、L2和L3的长度是可使一个多肽的结构域与另一个多肽的结构域分子间结合以形成二聚抗原-结合串联双抗体。这样的接头是“短的”，即由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基组成。因此，所述接头由约12个或更少的氨基酸残基组成。在0个氨基酸残基的情况中，所述接头是肽键。这样的短接头通过在不同多肽的抗体可变轻链结构域和抗体可变重链结构域之间结合和形成正确的抗原-结合位点有利于两个多肽的分子间二聚。约12个或更少氨基酸残基的短接头通常防止同一多肽链的相邻结构域彼此分子间相互作用。在本发明的一个实施方案中，这些接头由约3个至约10个，例如4个、5个或6个连续氨基酸残基组成。
关于这些接头的氨基酸组成，选择不干扰两个多肽二聚化的肽。例如，包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头通常提供蛋白酶抗性。接头的氨基酸序列，例如，可通过噬菌体展示法(phage-display method)来优化，以提高抗原结合和抗原-结合多肽二聚体的产率。适于本发明的串联双抗体的肽接头的实例是GGSGGS(SEQ ID NO：66)、GGSG(SEQ ID NO：67)或GGSGG(SEQ ID NO：68)。
本文所述的EGFRvIII结合蛋白和多特异性串联双抗体可通过表达编码串联双抗体多肽的多核苷酸产生，所述串联双抗体的多肽与另一个相同多肽结合以形成抗原-结合串联双抗体。因此，本发明进一步的实施方案是编码本文所述的抗原-结合串联双抗体多肽的多核苷酸，例如DNA或RNA。
多核苷酸可通过本领域技术人员已知的方法构建，例如，通过将编码由编码肽接头的序列隔开的或由肽键直接连接的至少四个抗体可变结构域的基因组合到单基因构建体中，并在细菌或其他适当的表达系统诸如例如CHO细胞中表达，所述单基因构建体与合适的启动子、可选地用于检测和纯化的蛋白标签，以及合适的转录终止子可操作地连接。根据所使用的载体系统和宿主，可使用任何数量的包括构成和诱导启动子的合适的转录和翻译元件。选择启动子以使其驱动多核苷酸在各自宿主细胞中的表达。
作为本发明进一步的实施方案，可将多核苷酸插入到载体中，优选表达载体中。该重组载体可根据本领域技术人员已知的方法构建。
各种表达载体/宿主系统可用于包含或表达编码本发明多肽的多核苷酸。用于在大肠杆菌(E.coli)中表达的表达载体的实例是pSKK(Le Gall et al.,J ImmunolMethods.(2004)285(1):111-27)或用于在哺乳动物细胞中表达的pcDNA5(Invitrogen(英杰公司))。
因此，本文所述的抗原-结合串联双抗体可通过将编码上文所述多肽的载体引入到宿主细胞并在所述多肽链表达、可从所述培养基分离以及任选地此后纯化的条件下培养所述细胞。
在进一步的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含EGFRvIII结合蛋白，抗原-结合串联双抗体，包含编码抗原结合串联双抗体的多肽的多核苷酸的载体或由该载体转化的宿主细胞，以及至少一种药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”的意思是指包括不干扰成分生物活性的效力并且对所施用的患者没有毒性的任何载体。合适的药学上的载体实例是本领域已知的，包括生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、水、乳化液例如油/水乳化液、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。这样的载体可通过传统方法配制，并以合适的剂量施用于个体。优选地，该组合物是无菌的。这些组合物也可包含佐剂，例如防腐剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保预防微生物的作用。
通过使用本领域已知的成熟技术和标准方法，技术人员会没有过度负担地容易构建并获得抗原-结合蛋白如本文所述的串联双抗体，参见，例如Sambrook,MolecularCloning A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y,；The Protein Protocols Handbook(蛋白质实验指南手册),John M.Walker编辑,Humana Press Inc.(2002)；或Antibody engineering:methods and protocols(抗体工程：方法和方案)/Benny K.C.Lo编辑；Benny K.C.II Series:Methods in molecularbiology(分子生物学方法)(Totowa,N.J.)。
附图说明
图1说明亲和力成熟后衍生的EGFRvIII特异性高亲和力结合结构域中可变序列的位置。不同于亲代序列的重链和轻链可变区的CDR位置用星号标出，各自的氨基酸用灰色高亮显示。具有有益突变的位置用深灰色高亮显示。
图2显示Biacore T200中，多循环动力学测量不同scFv抗体结合至重组EGFRvIII-Fc抗原或野生型EGFR-Fc抗原的结果。Sensogram显示在4个不同scFv抗体浓度水平(86nM，17.2nM，3.4nM，0.69nM)下随时间测量的表面等离子体共振(SPR)响应单元(RU)的动力学。测量结合180秒，此后测量解离。使用1:1结合模型分析数据。
图3显示流式细胞仪测量scFv抗体结合至(A)过表达EGFRvIII的F98大鼠神经胶质瘤细胞(F98EGFRvIII)、(B)过表达天然EGFR的F98细胞(F98EGFR)、(C)未转染的F98细胞(F98)的结果，以及相似的scFv抗体结合至(D)过表达EGFRvIII的CHO细胞(CHOEGFRvIII)、(E)过表达天然EGFR的CHO细胞(CHOEGFRvIII)和(F)未转染的CHO细胞(CHO)的结果。
图4说明含有不同EGFRvIII结合结构域的串联双抗体与由SDA-PAGE分离并通过蛋白质印迹转移至PDVF膜的纯化的EGFRvIII-或天然EGFR-Fc融合抗原(非还原蛋白或用DTT还原的蛋白)的结合。Fc融合蛋白通过二硫键在Fc部分二聚，但用DTT还原后是单体。EGFRvIII-特异性抗体以还原或非还原的构象结合至EGFRvIII-融合蛋白，但不与天然EGFR结合。该抗-EGFR抗体西妥昔单抗用作对照，并识别非还原性EGFRvIII-Fc和非还原性EGFR-Fc抗原，但不识别DTT-处理的抗原。
图5显示了ELISA中分析的不同EGFRvIII/CD3特异性串联双抗体与EGFRvIII-Fc、EGFR-Fc和CD3γε重组抗原的浓度依赖性结合。(A)显示了具有结构域顺序VL CD3-VH EGFRvIII-VL EGFRvIII-VH CD3的EGFRvIII/CD3特异性串联双抗体的结合信号，(B)显示了具有结构域顺序VH EGFRvIII-VL CD3-VH CD3-VL EGFRvIII的EGFRvIII/CD3特异性串联双抗体的结合信号，以及(C)显示了含有SEQ ID NO：23、24的CD3结构域并具有结构域顺序VL CD3-VH EGFRvIII-VL EGFRvIII-VH CD3的EGFRvIII/CD3特异性串联双抗体的结合信号。含有亲和力成熟的EGFRvIII-结合结构域的串联双抗体与EGFRvIII的结合的提高是明显可检测到的，在所有形式/结构域顺序中作为各自结合曲线向较低浓度的移位。
图6显示Biacore T200中，多循环动力学测量含有结构域顺序为VL CD3-VH EGFRvIII-VL EGFRvIII-VH CD3的不同二价EGFRvIII结合结构域的EGFRvIII/CD3特异性串联双抗体结合至重组EGFRvIII-Fc抗原的结果。Sensogram显示在不同串联双抗体浓度水平下随时间测量的表面等离子体共振(SPR)响应单元(RU)的动力学。测量结合180秒，此后测量解离。使用1:1结合模型分析数据。
图7显示来自(A)三个个体头颈(H&N)癌患者、(B)三个个体成胶质细胞瘤患者的组织切片的免疫组织化学(IHC)染色结果，以及(C)来自前列腺癌、乳腺癌(Her2neg)和非小细胞肺癌(NSCLC)的代表性结果。切片用2种不同浓度的二价构象的含有EGFRvIII-特异性结合结构域Li3G30的EGFRvIII-特异性双抗体进行染色，所述二价构象类似于EGFRvIII靶向串联双抗体抗体(例如，(VL CD3-)VH EGFRvIII-VL EGFRvIII(-VH CD3))的排列但缺少CD3结合部分。作为对照，切片用识别EGFR(存在于健康组织以及癌组织上)以及EGFRvIII的EGFR-特异性IgG抗体西妥昔单抗进行染色。染色的特异性由在不含EGFR-或EGFRvIII-特异性初级抗体的二级试剂中孵育的对照切片证实。
图8说明在EGFRvIII阳性细胞上，与含有亲和力成熟之前的亲代EGFRvIII结合结构域(Li3G30)的EGFRvIII和CD3各自的串联双抗体相比，含有不同亲和力成熟的EGFRvIII-特异性结合结构域的EGFRvIII/CD3串联双抗体的细胞毒性能力、有效性和靶标依赖性特异性的提高：(A)含有EGFRvIII/CD3串联双抗体的ABC 470，(B)含有EGFRvIII/CD3串联双抗体的ABC 471，(C)含有EGFRvIII/CD3串联双抗体的ABC 472。在使用表达EGFRvIII的CHO细胞(CHOEGFRvIII)、表达EGFRvIII阴性EGFR的CHO细胞(CHOEGFR)或未转染的CHO细胞作为靶细胞并且使用人类PBMC作为效应细胞，在基于流式细胞术的分析中，测量抗体浓度依赖性细胞毒性。在各图版(A-C)中，含有单个EGFRvIII结合结构域和CD3结构域v64、顺序为VL CD3-VH EGFRvIII-VL EGFRvIII-VH CD3的串联双抗体示于左侧，含有与不同CD3结构域组合的单个EGFRvIII结合结构域、顺序为VH EGFRvIII-VL CD3-VH CD3-VL EGFRvIII的串联双抗体示于右侧。
图9显示结合EGFRvIII-特异性抗体时，评估EGFRvIII受体从细胞表面内化的结果。在37℃下用不同浓度的三种不同的具有结构域顺序VL CD3-VH EGFRvIII-VL EGFRvIII-VH CD3(i)或VH EGFRvIII-VL CD3-VH CD3-VL EGFRvIII(iv)，和/或含有不同CD3-结合结构域的EGFRvIII/CD3串联双抗体抗体将表达EGFRvIII的细胞孵育24小时。调整之后，用10μg/ml饱和浓度的各自的串联双抗体抗体染色细胞表面所有剩余的EGFRvIII受体分子。
图10显示在EGFRvIII/CD3(或EGFRvIII/CD16A)串联双抗体抗体的存在下，评估人类PBMC培养物中细胞增殖(BrdU incoporation)的结果。PBMC用作阳性对照，其在CD3结合抗体OKT3或植物凝集素(plant lectin phytohemagglutinin)(PHA)的存在下增殖。在不存在EGFRvIII-阳性靶细胞的情况下，用不同的EGFRvIII/CD3串联双抗体孵育PBMC不诱导PBMC的活化和增殖。
图11说明EGFRvIII/CD3串联双抗体的CD3-结合亲和性与其细胞毒性能力正相关。关于CD3+-Jurkat细胞上的CD3-结合、CHOEGFRvIII细胞上的EGFRvIII-结合以及细胞毒性能力，对以结构域顺序VL CD3-VH EGFRvIII-VL EGFRvIII-VH CD3与对CD3具有不同亲和力的不同CD3-结合结构域组合的全部含有相同EGFRvIII结合结构域(Li3G30)的多于20个的EGFRvIII/CD3串联双抗体进行分析。CD3-结合KD值的范围是1nM至约500nM。对于每个所分析的串联双抗体而言，相对于CD3-结合KD值，对EGFRvIII-结合KD值和细胞毒性EC50值作图。虽然TandAb显示EGFRvIII-结合KD值仅有小的变化，但随着串联双抗体的CD3-结合KD值升高，细胞毒性EC50显示几乎线性升高。
图12显示概念研究(concept study)的体内验证结果。对含有相同EGFRvIII-结合结构域(Li3G30)但不同CD3结合结构域或结构域顺序的两个EGFRvIII/CD3串联双抗体分析了皮下F98EGFRvIII移植瘤生长的剂量依赖性抑制效果，并与以高得多的浓度水平给药的西妥昔单抗的效果进行比较。(A)由具有结构域顺序VL CD3-VH EGFRvIII-VL EGFRvIII-VH CD3的EGFRvIII/CD3v6串联双抗体引起的剂量依赖性肿瘤生长抑制；(B)由含有不同高亲和力CD3-结合结构域并具有结构域顺序VH EGFRvIII-VL CD3-VH CD3-VL EGFRvIII的EGFRvIII/CD3串联双抗体引起的剂量依赖性肿瘤生长抑制。
通过以下实施例进一步说明本发明，但本发明不限于此。
实施例1：EGFRvIII特异性结合蛋白的发现和亲和力成熟：
Li3G30的发现：
对基于IgM来源的人scFv序列的噬菌体展示文库进行两至三轮淘选(panning)以富集对EGFRvIII有特异性的结合物(binders)。在每轮淘选前，将所述文库用EGFR-Fc预孵育以耗尽(deplete)野生型形式EGFR的结合物或融合蛋白Fc部分的结合物。在EGFRvIII包被的固相上和在溶液中平行进行选择(selection)。两轮和三轮淘选后，挑选出单克隆，诱导可溶性scFv表达并筛选与EGFRvIII-Fc和EGFR-Fc结合的提取物。
根据本发明，描述了与EGFRvIII结合的全人的高特异性可变抗体结构域，EGFRvIII是EGFR的缺失突变体，其以突变的形式专门在肿瘤中而非在健康组织上表达。本文描述的全人EGFRvIII特异性结构域最初在使用基于IgM来源的全人scFv文库的噬菌体展示筛选中发现。令人惊讶的是，尽管对野生型EGFR抗原使用耗尽步骤(depletionprocedure)进行了两或三轮淘选，这应富集对EGFRvIII有特异性的结合物，但是在ELISA中大多数所得的scFv对两种蛋白(EGFRvIII和野生型EGFR)都结合。鉴定了一条高EGFRvIII特异性的序列，命名为Li3G30。除了在VH和VL的N末端有很小的差异，重链和轻链的框架区以及CDR1和CDR2分别与种系编码的序列VH5-51和VL3-25完全相同。Li3G30从第三轮液相淘选中鉴定出来。
亲和力成熟：
抗体框架对VH5-51/VL3-25的文库用从DistributedBio订购的算法来设计。鉴定Li3G30的特异性决定残基并将其包含在文库设计中。该设计包括52个随机化的CDR位点，每个CDR位点都有单独定义的氨基酸分布。将三种不同的环长度构建到VL CDR3中。编码VH和VL的随机化位点的基因片段订购自Geneart/Lifetechnologies，并通过TRIM-技术合成。将所述片段克隆至噬菌体展示载体pEXHAM(Schwarz et al.2004)中，达到3.7E+8个转化的大肠杆菌细胞的最终文库大小。将该文库包装到噬菌体颗粒中，并经过淘选和筛选步骤以分离具有提高的亲和力并保留对EGFRvIII有特异性的变体。用固定在蛋白结合塑料表面上的EGFRvIII-Fc抗原进行淘选。通过实施以下步骤将淘选步骤设计为有利于具有低解离速率(kOFF)的EGFRvIII结合的scFv：洗涤步骤，包括持续长达30分钟的若干个洗涤缓冲液孵育步骤，以有利于选择缓慢解离的scFv。另一个步骤基于与可溶性EGFRvIII的过夜竞争。为了确保在亲和力成熟的过程中不会选出EGFR-EGFRvIII交叉反应抗体或结合Fc的抗体，在第一个淘选步骤之前，通过对野生型EGFR-Fc的预孵育使文库耗尽可能的野生型EGFR结合物。而且，由于在对固定的EGFRvIII进行淘选步骤的过程中可溶性EGFR的存在，筛选方案不利于交叉反应结合物。
在流式细胞仪中，进一步测试唯一的EGFRvIII特异性scFv对表达EGFRvIII的转染的CHO和F98细胞的结合。将显示结合表达野生型EGFR的细胞和/或未转染的细胞的ScFv排除在下一步分析之外。用Biacore X100中的初始KD排名鉴定与初始克隆Li3G30相比对EGFRvIII具有提高的亲和力的scFv。最好的变体在详细的SPR测量和基于荧光的稳定性试验中进行了表征。
对于VL CDR3，用于亲和力成熟的初始文库包括三种不同的环长度，已知所有长度与VH5-51/VL3-25框架兼容。令人惊讶的是，在选择过程中，中间的环长度明显被偏爱。因此，与亲代抗EGFRvIII抗体相比，所有亲和力成熟的变体的VL CDR3都缩短了一个氨基酸(表1，图1)。将所选择的scFv的序列与输入文库作比较，该分析表明了VL CDR3中的3个有益突变。亲代抗EGFRvIII抗体的重链和轻链的CDR1和CDR2与种系序列VH5-51和VL3-25各自编码的序列相同。在75％的位点中，各个种系编码的残基被重构(reconstituted)或者明显被偏爱。表明了一个有益的突变在VH CDR1中，一个在VL CDR1中(图1)。剩余的随机化位点中的氨基酸分布非常接近于进行选择之前文库中的分布。
实施例2：在Biacore中测量scFV对EGFRvIII和野生型EGFR的结合：
制备抗hu Fc IgG CM5-芯片：
根据制造商的说明书，通过使用胺偶联试剂盒(Amine-Coupling-Kit)(GE)进行共价胺偶联来制备抗hu Fc IgG CM5-芯片。将IgG在提供的固定缓冲液(10mM乙酸钠，pH 5.0)中稀释至浓度为25μg/ml。对于偶联步骤，应用Biacore T200控制软件的预定义方法“胺(Amine)”。实现所有4个流通池中5000-10000RU的靶水平。在注入重组蛋白溶液前，用EDC/NHS活化芯片的表面。用乙醇胺封闭表面上空余的结合位点。选择1×HBS-P+作为整个偶联步骤的运行缓冲液。
SPR测量中使用的单链Fv’s(scFv)的浓度范围：
在SPR测量之前，使用Nandrop通过A280测定检查ScFv浓度。储备液的浓度(c)根据以下等式计算：
c[mg/ml]＝(A280)/(2.25[cm2/mg]×1[cm])
用“Expasy Protparam”预测工具(http://web.expasy.org/protparam/)计算不同的消光系数。为了计算His标签的scFv抗体的摩尔浓度，假定分子量为约28kD。通过在l×HBS-P+缓冲液中进行连续稀释将scFv调整至下面提到的终浓度。制备以下浓度：430nM、86nM、17.2nM、3.44nM、0.688nM和0nM。
ScFv的测量条件：
将EGFRvIII-Fc和野生型EGFR-Fc融合蛋白在l×HBS-P+中稀释至浓度为6.25nM。以10μl/min的流速注入两种抗原，EGFRvIII-Fc：75秒，野生型EGFR-Fc：90秒。将EGFRvIII-Fc注入流通池2，野生型EGFR-Fc注入流通池4。流通池1和3为空白。
将1×HBS-P+用作整个程序的运行缓冲液。将scFv抗体以30μL/min的流速注入所有四个流通池，持续180秒。将在未捕获抗原的流通池1中测量的信号从流通池2中的信号中减去以校正结合曲线的背景结合。将在未捕获抗原的流通池3中测量的信号从流通池4的信号中减去以校正结合曲线的背景结合。在540秒的解离时间后，如下所述重新生成芯片。
抗hu Fc IgG芯片通过注入高盐缓冲液3.0M MgCl2(30秒，10μL/min)重新生成。每次测量前，在没有scFv的情况下，执行4个“启动(start-up)循环”。从最低至最高浓度测量ScFv溶液。包括无运行缓冲液(0μΜ)的一个循环。
在MCK(Multi Cycle Kinetic)测量中测定scFv抗体的动力学。为了估算表观结合亲和力，用Biacore评估软件中包含的“动力学(Kinetic)”方法评估结合曲线。通过这个方法，使用“Langmuir 1:1相互作用模型”用所述软件全部拟合结合曲线。结果示于表3中。
所应用的亲和力成熟筛选步骤旨在通过使具有降低的解离速率(kOFF)的结合物的选择更容易来提高EGFRvIII特异性结合结构域的EGFRvIII结合亲和力。然而，令人惊讶的是，所得的亲和力成熟的结合物(表3)展示出大幅增加的结合速率(kON)，而kOFF的降低对于scFv的提高达100倍的结合仅作出较小的贡献，同时一些结合物显示出低于100pM的KD(表3)。尤其让人惊讶的是，虽然筛选步骤有利于选择kOFF降低的scFv，但是实现KD的降低主要是由于kON的提高。这也是令人惊讶的，因为抗体的亲和力成熟通常与kOFF的降低有关(Schier et al.,1996,Pini et al.,1998,Boder et al.,2000)。
表3：对scFv结合亲和力的总结(“VH”是scFv的可变重链结构域，“VL”是scFv的可变轻链结构域)。在Biacore(SPR)1:1结合模型中测量的scFv形式的不同EGFRvIII结合结构域对重组EGFRvIII-Fc抗原的KD值、结合速率(kON)和解离速率(kOFF)；“提高系数”是指相对于亲代scFv，即Li3G30(VH SEQ ID NO:25和VL SEQ ID NO:26)的倍数变化。
Figure GDA0002026522800000241
11个亲和力成熟的scFv中有8个显示出与亲代scFv相比kON至少5倍的提高；它们中的三个具有20倍高的kON。与kON的提高相比，亲和力成熟对kOFF的影响相当小。只有3个亲和力成熟的scFv显示出4-5倍提高的kOFF。有趣的是，它们中有两个从竞争性选择方法中分离出来，该方法与延长在洗涤缓冲液中的孵育相比可能是选择kOFF降低的scFv的更有效的方法。
通过差示扫描荧光测定法(DSF)测定的所选择的亲和力成熟的候选者的解链温度的平均值为62.2℃，范围为53℃-67.2℃。
在亲和力成熟的过程中维持相对于野生型EGFR的对EGFRvIII的高特异性
通常亲和力成熟常常伴有结合表位的小变化，该小变化可影响特异性/交叉反应性(Barbas et al,1994,Parsons et al.,1996,Winkler et al.,2000)。由于野生型EGFR胞外结构域(外显子2-7)的269个氨基酸的框内缺失形成了相对于野生型EGFR的EGFRvIII新表位，并且预测其是相当小的：它由新的氨基酸并列(氨基酸5融合至氨基酸274)和在缺失位点处的一个新的GLY氨基酸组成。预期在这种情况下即使结合表位的小变化也会快速破坏对EGFRvIII的异常特异性并可得到也能识别天然EGFR的交叉反应结合物。
令人惊讶的是，本文描述的亲和力成熟导致对抗EGFRvIII抗体提高达100倍的结合而不损失对EGFRvIII的专门特异性(表3，图2)。
在选择亲和力成熟的结合物期间，在流式细胞仪中检测了唯一的EGFRvIII特异性scFv对表达EGFRvIII的CHO细胞(CHOEGFRvIII)和F98细胞(F98EGFRvIII)的结合以及对表达人野生型EGFR的CHO细胞(CHOEGFR)和F98细胞(F98EGFR)及未转染的CHO和F98细胞的结合。
更详细地表征了没有任何可测量的与野生型EGFR阳性细胞(CHOEGFR)或未转染的CHO细胞的背景结合的11个高特异性抗EGFRvIII scFv。在最好的情况下，测量到了对EGFRvIII抗原的80pM的亲和力，对应于与亲代scFv相比的100倍的提高系数(表3)。同时，所检测的抗EGFRvIII scFv都没有显示出与野生型EGFR抗原的任何交叉反应性(图2)。
据我们所知，之前从未观察到与对EGFRvIII的排他性特异性结合的人抗体结构域对EGFRvIII的如此高的亲和力，并且没有可测量的与野生型EGFR的交叉反应性。Safdari和同事最近描述了人源化鼠EGFRvIII结合抗体结构域MR1的结果(Safdari et al.,2014)，以其鼠(murine)形式的MR1最先由Lorimer和同事描述(Lorimer et al.,1996,Beers etal.,2000,Kuan et al.,2000)。在人源化方法中，他们实现了humMR1的亲和力提高，达到了于此报导的相似的皮摩尔KD值，然而，与本发明相反，他们没有完全消除所述抗体结构域与野生型EGFR的交叉反应性，这可以在他们的出版物(Safdari et al.,2014)的图4中清楚地看出。因此，在SDS PAGE和蛋白质印迹后，humMR1不只对EGFRvIII(145KD)有特异性,也识别EGFR(170KD)(Safdari et al.,2014)。在亲和力成熟前后，申请人广泛地检测了本申请EGFRvIII结合结构域的特异性和交叉反应性，并惊讶地发现在Biacore(图2)，或在SDSPAGE和蛋白质印迹(图4)或在ELISA(图5)的分析中都没有发现与野生型EGFR，或与纯化的重组野生型EGFR抗原的交叉反应性的信号。本申请的EGFRvIII结合结构域同样没有展示出与转染的CHO细胞(CHOEGF)或F98神经胶质瘤细胞(F98EGFR)的细胞表面上过表达的野生型EGFR的任何交叉反应性(图3)。
实施例3：通过流式细胞术评估EGFRvIII特异性scFv抗体对过表达EGFRvIII的F98大鼠神经胶质瘤细胞(F98EGFRvIII)或稳定转染的过表达EGFRvIII的CHO细胞(CHOEGFRvIII)的高特异性和高亲和力；没有与过表达天然EGFR的F98细胞(F98EGFR)或未转染的F98细胞(F98)的结合，以及没有与过表达天然EGFR的CHO细胞(CHOEGFR)或未转染的CHO细胞(CHO)的结合。
材料(培养基、缓冲液和试剂)：
抗His IgG 13/45/31(Dianova)、FCS(Invitrogen)、Ficoll Paque PLUS(GEHealthcare)、FITC缀合的山羊抗人IgG(Dianova)、FITC缀合的山羊抗小鼠IgG、min X(Dianova)、L谷氨酰胺(Invitrogen)、NaN3(Carl Roth)、PBS(Invitrogen)、青霉素/链霉素(Invitrogen)、碘化丙啶(Propidium iodide)(Sigma)、RPMI-1640(Invitrogen)。
细胞和细胞系：
F98大鼠神经胶质瘤细胞、过表达EGFR的F98细胞(F98EGFR)以及过表达EGFRvIII的F98细胞(F98EGFRvIII)购自美国典型培养物收藏中心(American type culture collection(ATCC))并根据所推荐的方案进行培养。
F98(ATCC CRL-2397)
F98EGFR(ATCC CRL-2948)
F98npEGFRvIII(ATCC CRL-2949)
稳定转染的表达重组EGFR或EGFRvIII的CHO细胞根据以下方案在Affimed生成：
编码野生型EGFR或缺失突变体EGFRvIII的基因由Life Technologies/GeneArt(雷根斯堡，德国)合成，并亚克隆至哺乳动物表达载体pcDNA5/FRT中。表达重组野生型EGFR或EGFRvIII的稳定的CHO细胞系基于先前适应悬浮生长的宿主细胞系Flp-In CHO(LifeTechnologies)生成。在转染前一天，将Flp-In CHO细胞在补充有L-谷氨酰胺、HT补充剂和青霉素/链霉素的HyClone CDM4CHO中进行传代培养(没有博来霉素(Zeocin))。稳定的表达细胞系通过使用聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂，用基于pcDNA5/FRT的产物表达和整合质粒和Flp重组酶表达质粒pOG44(Life Technologies)共转染Flp-In CHO细胞系来生成。将2.5μg总DNA稀释于50μL OptiMEMI培养基中并与稀释于50μL OptiMEMI培养基中的7.5μg PEI合并。将混合物孵育10分钟，然后加入到悬浮在1mL CHO-S-SFMII培养基的2×106个Flp-InCHO细胞中。在转染后一天，将细胞在补充有500μg/mL潮霉素B的CHO-S-SFMII培养基中稀释至密度为l×l05个活细胞/mL，并在T75培养瓶中接种。Flp重组酶通过位点特异性的DNA重组介导Flp-In表达构建体在整合的FRT位点插入到基因组中。在选择阶段，一周一次或两次测量活细胞密度，将细胞离心并以l×l05个活细胞/mL的最大密度重悬于新鲜的选择培养基中。在使用500μg/mL潮霉素B选择约2-3周后，回收表达EGFR或EGFRvIII的稳定的细胞，然后将所述细胞转移至HyClone CDM4 CHO悬浮培养基中。将稳定的表达野生型EGFR或EGFRvIII的细胞冷冻保存于含50％ProFreeze(Lonza)和7.5％DMSO的培养基中。
为了测定稳定转染细胞系上野生型EGFR或EGFRvIII细胞表面抗原的密度，根据制造商的说明书使用流式细胞间接免疫荧光测定(QIFIKIT，Dako)，并证明了CHOEGFR稳定转染细胞上野生型EGFR的密度与CHOEGFRvIII稳定转染细胞上EGFRvIII的密度近似相等，而在未转染CHO细胞上没有检测到野生型EGFR或EGFRvIII结合位点。
通过流式细胞术测定抗体结合和亲和力：
将细胞与所指示的scFv抗体从100μg/mL(约3300nM)开始在FACS缓冲液中的100μL连续稀释液在冰上孵育45min(分钟)。用FACS缓冲液洗涤3次后，将细胞在同一缓冲液中与0.1mL 10μg/mL小鼠单克隆抗His抗体克隆13/45/31在冰上孵育45min。在第二个洗涤循环之后，在与前相同的条件下，将细胞与0.1mL 15μg/mL FITC缀合的山羊抗小鼠IgG抗体孵育。作为对照，在没有scFv的情况下，将细胞与抗His IgG 13/45/31孵育，然后与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG抗体孵育。然后将细胞再次洗涤并重悬于含2μg/mL碘化丙啶的0.2mLFACS缓冲液中以排除死细胞。使用用MXP软件的Beckman-Coulter FC500 MPL流式细胞仪(Beckman-Coulter，克雷菲尔德，德国)或用Incyte软件的Millipore Guava EasyCyte流式细胞仪(Merck Millipore，施瓦尔巴赫，德国)测量l×l04个活细胞的荧光。细胞样品的平均荧光强度用CXP软件(Beckman-Coulter，克雷费尔德，德国)或Incyte软件(MerckMillipore，施瓦尔巴赫，德国)计算。
如果用Beckman-Coulter FC500 MPL流式细胞仪进行分析，使用0.5×l06个细胞/染色，如果用Millipore Guava EasyCyte流式细胞仪，仅使用0.25×l06个细胞/染色。
在减去单独用二级和三级试剂染色的细胞的荧光强度值后，采用GraphPad Prism软件(用于Windows的GraphPad Prism 6.00版，GraphPad Software，加利福尼亚拉荷亚，美国)的单位点结合的等式(双曲线)计算KD值。
结果示于图3。
实施例4：SDS PAGE和蛋白质印迹分析结合EGFRvIII的抗体的结合特异性。
为了检测含有不同结合结构域的EGFRvIII/CD3串联双抗体对EGFRvIII抗原的结合特异性以及为了证明不存在与野生型EGFR抗原的结合，实施了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析。
通过重组DNA技术将编码野生型EGFR或截短型EGFRvIII的胞外结构域的序列融合至人IgG抗体的Fc部分。将DNA构建体转染至将作为可溶性蛋白的重组的野生型EGFR-Fc或EGFRvIII-Fc分泌至细胞培养上清液中的CHO细胞中，使用蛋白A层析法从所述细胞培养上清液中纯化所述重组的野生型EGFR-Fc或EGFRvIII-Fc。通过Fc部分中分子内二硫键的形成，野生型EGFR-Fc(或EGFRvIII-Fc)融合抗原形成有两条相同的链的二聚体。由于EGFRvIII-特异性267个氨基酸缺失，EGFRvIII-Fc比EGFR-Fc小约25kD，导致二聚体形式的Fc融合蛋白有约50kD的大小差异。
将等量的纯化的野生型EGFR-Fc(和EGFRvIII-Fc)与非还原性2×SDS PAGE样品缓冲液或含二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂的还原性2×SDS PAGE样品缓冲液混合。将含DTT的样品在95℃加热5分钟，然后加载到4-20％标准TGX预制SDS PAGE凝胶(Biorad)上。每个泳道使用1μg的蛋白样品。为了在凝胶中分离蛋白，SDS-PAGE在300V下，在l×Tris/甘氨酸/SDS缓冲液(Biorad)中运行约25min。使用标准无染色分子成像系统(Biorad)使总蛋白在凝胶中可视化。将Page Ruler未染色蛋白梯带(Thermo Scientific)用作分子量标记物。然后用BioRad的半干快速印迹(Semi-dry blotting Fastblot)系统将凝胶印迹在PVDF膜上。在室温下将膜在溶于l×TBS的3％(w/v)脱脂奶粉中封闭30min。将膜切成小块，每一块含有所印迹的相似的蛋白样品。将不同的串联双抗体在溶于l×TBS的3％(w/v)脱脂奶粉中稀释至浓度为2μg/ml，并在摇动平台上与单独的膜块孵育1小时。将10μg/ml浓度的抗EGFR抗体西妥昔单抗用作对照。将膜用TBST(TBS+0.1％(v/v)吐温20)洗涤3次，每次10分钟，用TBS洗涤一次，然后与在溶于TBS的3％脱脂奶粉中以1:5000稀释的HRP缀合的二级检测抗体PentaHIS-HRP(QIAGEN)(用于检测串联双抗体)或蛋白L-HRP(Thermo Scientific)(用于检测西妥昔单抗)在摇动平台上孵育1小时。将膜用TBST(TBS+0.1％(v/v)吐温20)洗涤3次，每次10分钟，用TBS洗涤一次。通过加入溶于TBS的0.06％DAB+0.02％CoCl2+0.015％H2O2而启动膜上HRP介导的显色。通过添加水终止反应。将膜干燥并扫描。
结果示于图4。
实施例5：通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析含有不同EGFRvIII结合结构域的EGFRvIII/CD3串联双抗体对EGFRvIII抗原的结合和对CD3的结合，以及在不结合野生型EGFR抗原情况下它们对EGFRvIII的结合的特异性。
ELISA步骤：
将96孔ELISA板(Immuno MaxiSorp；Nunc)在4℃下用在100mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中的EGFRvIII-Fc、野生型EGFR-Fc或CD3γε重组抗原包被过夜。为了获得接近相同的抗原摩尔包被密度，EGFRvIII-Fc以4μg/ml的浓度包被，EGFR-Fc以6μg/ml的浓度包被，CD3γε抗原以1.5μg/ml的浓度包被。在使用溶于PBS的3％(w/v)脱脂奶粉(Merck)进行封闭步骤后，将溶于含0.3％(w/v)脱脂奶粉(Merck)的PBS中的范围为200ng/μl-6.5×l0-6ng/μl的不同EGFRvIH/CD3串联双抗体的11个连续稀释液在25℃下在板上孵育1.5h。孵育后，将板用300μl/孔的含0.1％(v/v)吐温20(Serva)的PBS洗涤3次。加入50ng/ml的蛋白L-HRP并在25℃下在板上孵育1h。用300μl/孔的含0.1％(v/v)吐温20的PBS洗涤3次后，加入四甲基联苯胺(TMB)底物(Seramun)进行检测。在约2分钟后通过加入100μl/孔的0.5M H2SO4终止反应。用多孔板读取器(Victor,Perkin Elmer)在450nm下测量孔的吸光度。
使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，加州圣地亚哥，加拿大)将吸光值在图中绘制成线。
结果示于图5中。
实施例6：通过SPR测量串联双抗体与EGFRvIII的结合：
制备抗hu Fc IgG CM5-芯片
如上所述(实施例2)制备抗hu Fc IgG CM5-芯片。
SPR测量中使用的串联双抗体的浓度范围：
在SPR测量之前，使用Nandrop通过A280测定检查串联双抗体浓度。储备液的浓度(c)根据以下等式计算：
c[mg/ml]＝(A280)/(2.25[cm2/mg]×1[cm])
用“Expasy Protparam”预测工具(http://web.expasy.org/protparam/)计算不同的消光系数。为了计算摩尔浓度，假定所有串联双抗体的分子量为105kD。通过在l×HBS-P+缓冲液中进行连续稀释将串联双抗体调整至下面提到的终浓度。制备以下浓度：150nM、30nM、6nM、1.2nM、0.24nM、0.048nM和0nM；或90nM、30nM、10nM、3.33nM、1.11nM、0.37nM、0.123nM、0.041nM和0nM，或所指示的浓度。
串联双抗体KD测量的结合测定条件
将EGFRvIII-Fc融合蛋白在l×HBS-P+中稀释至浓度为6.25nM。对于EGFRvIII-Fc，以10μl/min的流速注入抗原溶液持续40秒。将抗原注入流通池2。流通池1为参考池。
将1×HBS-P+用作整个程序的运行缓冲液。将串联双抗体稀释液以30μL/min的流速注入所有四个流通池持续180秒。将在未捕获抗原的流通池1中测量的信号从流通池2的信号中减去以校正结合曲线的背景结合。在540秒的解离时间后，如下所述重新生成芯片。
抗hu Fc IgG芯片通过注入高盐缓冲液3.0M MgCl2(3×15秒，10μL/min)重新生成。每次测量前，在没有串联双抗体的情况下，执行3个“启动循环”。从最低至最高浓度测量串联双抗体溶液。包括无运行缓冲液(0μΜ)的一个循环。
在MCK(Multi Cycle Kinetic)测量中测定串联双抗体的结合参数。为了估算表观结合亲和力，用Biacore X100评估软件中包含的“动力学(Kinetic)”方法评估结合曲线。通过这个方法，使用“Langmuir 1:1相互作用模型”用所述软件全部或部分地拟合结合曲线。
串联双抗体的结合参数
为了分析将两个EGFRvIII结合结构域组合至二价或多价或多特异性分子如EGFRvIII/CD3串联双抗体中的效果，应用BiacoreX100通过SPR测量EGFRvIII/CD3串联双抗体对EGFRvIII抗原的表观亲和力(图6)。
对于所有检测的分子，EGFRvIII/串联双抗体中EGFRvIII特异性结合结构域的表观亲和力提高，最好的结合串联双抗体实现了11pM的KD。相对于对应的含有亲代EGFRvIII结合结构域的串联双抗体，含有亲和力成熟的结构域的串联双抗体的KD降低高达25倍。相对于单价结合scFv的测量的KD，KD的提高也高达25倍。有趣的是，与通过主要由提高的kON驱动的亲和力成熟实现的提高相反，在二价串联双抗体形式中结合亲和力的进一步提高很大程度上通过更慢的kofOFF实现(表4)。
因此，串联双抗体形式提供了一种在维持抗体结合结构域的特异性的同时进一步增强结合亲和力的方法。
表4：在SPR 1:1结合模型中对含有二价亲代的或亲和力成熟的EGFRvIII特异性结合结构域的结构域顺序为VL CD3-VH EGFRvIII-VL EGFRVIII-VH CD3的不同EGFRvIII/CD3串联双抗体与重组EGFRvIII-Fc抗原的结合所测量的KD、结合速率(kON)和解离速率(kOFF)的总结。
Figure GDA0002026522800000331
Figure GDA0002026522800000341
实施例7：用抗EGFRvIII双特异性双抗体或西妥昔单抗进行实体瘤组织切片的免疫组化(IHC)染色
与在健康组织上广泛表达的野生型EGFR相比，突变受体EGFRvIII的表达是高度肿瘤特异性的。然而，神经胶质瘤细胞中EGFRvIII的高频表达与文献中描述的一致，EGFRvIII的表达广泛度和它在其它肿瘤中表达的同质性仍是有争议的。
开始了一项小的免疫组化(IHC)研究，分析了来自各3例患有成胶质细胞瘤(GB)、头颈(H&N)癌、前列腺癌、Her2-阴性乳腺癌以及非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者的组织切片与根据本发明的二价双抗体形式的EGFRvIII特异性结合结构域的反应性(图7)。
实施所述免疫组化研究以评估在不同肿瘤中EGFRvIII的表达以及EGFRvIII结合抗体的肿瘤特异性。以含有以VH EGFRvIII-VL EGFRvIII排列的EGFRvIII结合结构域Li3G30的二价双抗体形式，检测了EGFRvIII特异性可变结构域的EGFRvIII结合。二级检测通过双抗体蛋白上的His标签实施。作为对照，使用了对天然EGFR有特异性的IgG抗体西妥昔单抗(爱必妥(Erbitux))。
所有的人组织切片购自BioChain Institute,Inc.，并根据供应商的说明书处理切片。使组织切片适应于室温并与DAKO过氧化物酶阻断剂孵育，然后用10％山羊血清封闭。将EGFRvIII特异性双抗体以0.5μg/ml和0.1μg/ml的两个浓度水平孵育1小时，然后与抗His抗体(Dianova)孵育并通过Envision+HRP-DAB系统检测小鼠抗体(DAKO)。根据制造商的说明书，使用Klear人HRP-聚合物DAB检测系统(GBI Labs)，以10g/ml的浓度实施用对照项爱必妥(Merck KGaA)进行的组织切片染色。
最终，将切片用苏木精染色并用封固介质(mountant medium)(Shandon ConsulMountTM，Thermo Scientific)封片。
结果示于图7。
三个成胶质细胞瘤样品中有两个显示出与EGFRvIII特异性双抗体的明显且特异性的反应性。令人惊讶的是，所有三个头颈癌样品都显示出强且明显的EGFRvIII阳性，并且同样地对于前列腺癌、乳腺癌和NSCLC，用本文描述的EGFRvIII特异性抗体获得了肿瘤组织的特异性染色(图7)。
基于这些特性，在此描述的EGFRvIII结合结构域，诸如，例如，EGFRvIII/CD3双特异性串联双抗体，极好地适用于开发多特异性的、多价的、免疫效应细胞参与，肿瘤靶向抗体疗法。
实施例8：在基于FACS的细胞毒性测定中评估由EGFRvIII/CD3串联双抗体介导的细胞毒活性
在基于细胞的细胞毒性测定中，分析了EGFRvIII/CD3串联双抗体抗体，其含有与不同CD3结合结构域结合的亲代的或亲和力成熟的EGFRvIII特异性结构域和/或在所述串联双抗体分子中具有不同的顺序的各个结合结构域(图8)。通过将表达EGFRvIII的CHO细胞(CHOEGFRvIII)、表达野生型EGFR的CHO细胞(CHOEGFR)和未转染CHO细胞用作靶细胞来分析靶介导的依赖性、串联双抗体的特异性和T细胞介导的杀伤性。
材料(培养基、缓冲液和试剂)：
DMSO(Sigma)、EasySepTM人T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies(干细胞技术公司))、EasySepTM人CD4+T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)、EasySepTM人CD8+T细胞富集试剂盒(Stem Cell Technologies)、The Big Easy EasySepTM磁极(Stem CellTechnologies)、FCS(Invitrogen)、Lymphoprep(Stem Cell)、L-谷氨酰胺(Invitrogen)、mlgGl FITC(ADG)、CD16-FITC(MEM-154)(Thermo Fisher Scientific)、mlgGl-FITC/mlgGl-PE/mlgGl-ECD(Beckman Coulter)、mlgGl-PE(Beckman Coulter)、mIgGl-PC5(Beckman Coulter)、mIgGl-PC7(Beckman Coulter)、CD8-FITC/CD4-PE/CD3-ECD(BeckmanCoulter)、CD16-PC5(Beckman Coulter)、CD19-PC7(Beckman Coulter)、CD16-FITC/CD56-PE/CD3-ECD(Beckman Coulter)、CD14-PC7(Beckman Coulter)、CD33-PE(MACS MiltenyiBiotech)、NaN3(Roth)、PBS(Invitrogen)、青霉素/链霉素(Invitrogen)、PKH67绿色荧光细胞标记(Linker)Midi试剂盒(Sigma)、Gammanorm人IgG(Octapharma)、碘化丙啶(Sigma)、RPMI-1640(Invitrogen)
从血沉棕黄色层(buffy coat)分离PBMC并富集T细胞：
在抽血当天从Deutsches Rotes Kreuz,DRK-Blutspendedienst Baden-Wurttemberg-Hessen(曼海姆，德国)购买血沉棕黄色层；血沉棕黄色层制备物在室温下保存过夜，然后通过密度梯度离心分离PBMC。将血沉棕黄色层样品用两到三倍体积的PBS稀释，在Lymphoprep垫层(cushion)上分层并在室温w/o制动(brake)下以800×g离心25min。收集位于界面处的PBMC，并用PBS洗涤3次，然后将它们用于富集T细胞或流式细胞分析。根据制造商的说明书使用EasySepTM人T细胞富集试剂盒(用于免疫磁性分离未接触的人T细胞)和Big Easy EasySepTM磁铁从PBMC群富集T细胞。
通过流式细胞分析表征效应细胞：
为了评估PBMC亚群的分布和富集的PBMC或T细胞子群(subset)的纯度，实施PBMC染色。
对于流式细胞分析，将分离的PBMC或富集的PBMC亚群重悬于补充有2％热灭活的FCS和0.1％叠氮化钠(被称为FACS缓冲液)及1mg/mL多克隆人IgG的PBS中，至密度为0.5-2×l06/mL。然后根据制造商所推荐的以下方案将0.5ml细胞悬浮液的等份试样在黑暗中与抗体孵育15min。
表5：通过流式细胞术表征PBMC和分级的PBMC的移液方案
Figure GDA0002026522800000371
孵育后，在MXP采集软件(Beckman-Coulter)中，使用为PBMC和多色染色(FITC PEECD PC5 PC7；FITC PE ECD；FITC PE PC5PC7)制定的方案在Beckman-Coulter FC500 MPL流式细胞仪(Beckman-Coulter，克雷费尔德，德国)上以3、4、5、6、1、2的顺序测量样品。对于分析和数据绘图，使用了CXP分析软件(Beckman-Coulter)。
细胞毒性测定：
如前所述，通过流式细胞术表征用作效应细胞的T细胞。细胞毒性测定中使用的靶细胞是稳定转染以过表达EGFRvIII的CHO细胞(CHOEGFRv111)，稳定转染以表达野生型EGFR的CHO细胞(CHOEGFR)或未转染的CHO细胞(CHO)。如先前所述生成细胞系，并如前所述在标准条件下培养。对于细胞毒性测定，将靶细胞收集起来，用不含FCS的RPMI 1640培养基洗涤两次并重悬于PKH67绿色荧光细胞标记Midi试剂盒所提供的稀释液C中至密度为2×l07/mL。然后根据制造商的说明书，将细胞悬液与等体积的双倍浓缩的PKH67-标记溶液(例如，1μLPKH在250μL稀释液C中)混合，并在室温孵育2-5min，并定期混合。染色反应通过加入等体积的FCS并孵育1min来终止。用完全RPMI培养基洗涤标记的靶细胞后，进行细胞计数并将细胞在完全RPMI培养基中重悬至密度为2×l05/mL。
然后将2×l04个靶细胞与T细胞以5:1的E:T比例和所指示的抗体一起接种在圆底96孔微板的各孔中，总体积为200μL/孔。通常检测9个从30μg/mL开始的连续1:5稀释液。在每个平板上至少一式三份测定没有抗体的情况下自然的细胞死亡和效应子(effectors)引起的靶杀伤。串联双抗体介导的杀伤通常一式两份地测定。
在室温下以200g离心2min后，将测定板在37℃，含5％CO2的加湿空气中，孵育40h-48h。孵育后，将培养物用FACS缓冲液洗涤一次，然后重悬于补充有2μg/mL PI的150μL FACS缓冲液中。特征为阳性绿色PKH67染色但PI染色为阴性的活的靶细胞的绝对数量用Millipore Guava EasyCyte流式细胞仪(Merck Millipore)来测量。
基于所测量的剩余的活的靶细胞，根据以下公式计算特异性细胞裂解的百分比：[1-(活的靶细胞数目(样品))/(活的靶细胞数目(自然的))]×100％。使用GraphPad Prism软件(用于Windows的GraphPad Prism 6.00版，GraphPad Software，加利福尼亚拉荷亚，美国)通过非线性回归/4参数逻辑拟合来计算Sigmoidal剂量响应曲线和EC50值。
数据分析：
对于给定的抗体浓度所获得的裂解值一式两份地测定，使用Prism软件(用于Windows的GraphPad Prism 6.00版，GraphPad Software，加利福尼亚拉荷亚，美国)通过Sigmoidal剂量响应/4参数逻辑拟合分析来进行分析，并用于计算EC50平均值和裂解百分比的重复的SD。
结果示于图8和表6。
所有检测的串联双抗体均显示出对表达EGFRvIII的细胞的浓度依赖性、高度的特异性、细胞毒性和高效能，而EGFRvIII阴性细胞的存活并不受损害。在用表达EGFRwt-的细胞或未转染的细胞检测的任何串联双抗体的全部浓度范围内，没有观察到可检测的细胞毒性。因此，EGFRvIII/CD3串联双抗体介导的细胞毒性是严格地靶向依赖性的。在细胞毒性测定中，含有亲和力成熟之前的亲代EGFRvIII结合结构域且结构域顺序为VL CD3-VH EGFRVIII-VL EGFRVIII-VH CD3的串联双抗体的EC50为25pM(图8)。对应的串联双抗体以相同的结构域顺序(VL CD3-VH EGFRVIII-VL EGFRVIII-VH CD3)含有亲和力提高的EGFRvIII结合结构域，同样表现出增强的细胞毒性效力，在最好的情况下，达到1.5pM的EC50(表6)。细胞毒活性的相对提高在具有位于外部位置中的EGFRvIII特异性结构域的串联双抗体(结构域顺序VH EGFRVIII-VL CD3-VH CD3-VL EGFRvIII)中更加明显(表6)。在这些串联双抗体中，高达70倍提高的细胞毒性效力可通过在这些串联双抗体中用亲和力提高的结构域替换低亲和力EGFRvIII结合结构域Li3G30来实现(图8，表6)。
表6：对细胞毒性测定中用不同的EGFRvIII/CD3串联双抗体测量的EC50值的总结，所述不同的EGFRvIII/CD3串联双抗体以两种不同的结构域顺序含有亲和力成熟的EGFRvIII特异性结合结构域。示出了相对于对应的含有亲代EGFRvIII结合结构域的串联双抗体的提高系数。
Figure GDA0002026522800000401
Choi et al.(Proc Natl Acad Sci USA.2013 Jan 2；1 10(l):270-5；WO2013/7185010)描述了t EGFRvIII/CD3的comparator，即EGFRvIII/CD3双特异性T-细胞衔接器(bispecific T-cell engager)(BiTE)，其具有一个EGFRvIII结合位点(基于鼠MR1结构域)和一个CD3结合位点(基于抗CD3的抗体OKT3)。在基于细胞的细胞毒性测定中，该抗体在约10-2μg/ml的浓度下实现了50％的最大地获得的特异性裂解，其对应于52kD BiTE的约200pM的摩尔EC50浓度(Choi et al.,2013的图4C)。比较显示本文描述的含有亲代的而非亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的串联双抗体的细胞毒性甚至比EGFRvIII/CD3BiTE的高约10倍。而且本发明的含有亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的串联双抗体甚至展示出相对于EGFRvIII/CD3BiTE的高100倍的细胞毒性。
实施例9：在表达重组EGFRvIII的CHO细胞(CHOEGFRvIII)或表达重组EGFRvIII的F98细胞(F98EGFRvIII)上由EGFRvIII/CD3串联双抗体引起的EGFRvIII受体内化
为了评估由EGFRvIII/CD3串联双抗体引起的EGFRvIII调控，将表达重组EGFRvIII的CHO细胞(CHOEGFRvIII)或表达重组EGFRvIII的F98细胞(F98EGFRvIII)以2.5×105个细胞的等份试样在圆底96孔微板各单孔中，在补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素G钠盐、100μg/mL硫酸链霉素、100μg/mL丙酮酸钠(本文中称为完全RPMI培养基；所有组分购自英杰公司)的RPMI 1640培养基中与浓度渐增的EGFRvIII/CD3串联双抗体在37℃，5％CO2下，在加湿孵育器中孵育24小时。在没有抗体的情况下培养若干等份的细胞，用作检测最高EGFRvIII细胞表面水平的对照样品和单独用二级试剂用作进行的染色的阴性对照。
孵育后，将细胞用冰冷的补充有2％热灭活的FCS(Invitrogen)和0.1％叠氮化钠(Roth，卡尔斯鲁厄，德国)的磷酸盐缓冲盐水(PBS，Invitrogen)(在本文中称为FACS缓冲液)洗涤2次，然后用饱和浓度(10μg/mL)的抗体(该抗体和在调整培养期间与细胞孵育的抗体是相同的)染色以评估对应于细胞表面上剩余EGFRvIII抗原的最大的抗体结合。将在没有抗体的情况下培养的细胞的等份试样用饱和浓度的同一抗体染色，以测定对应于细胞表面上的最大可测量的EGFRvIII水平的最大抗体结合能力。用FACS缓冲液洗涤3次后，用串联双抗体处理细胞并用10μg/mL抗His mAb(Dia910，Dianova)染色，然后用15μg/mL FITC缀合的山羊抗小鼠IgG(Dianova)染色。用FACS缓冲液反复洗涤后，将细胞重悬于含2μg/mL碘化丙啶(Sigma)的FACS缓冲液中以排除死细胞。使用MXP软件和FC500 MPL流式细胞仪(Beckman-Coulter，克雷费尔德，德国)分析来自每个样品的约5×l03个碘化丙啶阴性细胞，用CXP软件(Beckman-Coulter)测定所测量的样品的平均荧光强度(MFI)或者使用Incyte软件(Merck Millipore，施瓦尔巴赫，德国)用Millipore Guava EasyCyte流式细胞仪分析细胞。
在减去获自单独用二级试剂进行的细胞染色的信号之后，使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，加州圣地亚哥，加拿大)将所测量样品的平均荧光强度在图中绘制成线，并使用通过在没有EGFRvIII/CD3串联双抗体的情况下在37℃下对未处理的细胞样品进行染色而获得的荧光信号(其被设置为代表100％的细胞表面EGFRvIII)来计算细胞表面上剩余EGFRvIII的相对量。
结果示于图9。
若干文献报告描述了与天然EGFR相比缺失突变体EGFRvIII显示出受损的内化(Fenstermaker et al.2000,Han et al.2006,Grandal et al.2007,Gan et al.2009)。尽管如此，关于EGFRvIII特异性抗体或针对也结合EGFRvIII的野生型EGFR的抗体(例如西妥昔单抗)的若干公开的报告，描述了在结合各自的抗体之后表达EGFRvIII的细胞中EGFRvIII的快速内化和降解(Reist et al.1995,Foulon et al.2000,Kuan et al.2000,Patel et al.2007,Jutten et al.2009,Dreier et al.2012)。
对于内化测定，使用过表达EGFRvIII的转染CHOEGFRvIII细胞。将这些表达EGFRvIII的细胞与不同浓度的EGFRvIII/CD3串联双抗体在37℃下孵育24小时，描述了其它EGFRvIII结合抗体的上下文中的条件以诱导强的内化。在本调整(期间抗体-受体复合体可以内化或不内化)之后，用各抗体以10μg/ml的饱和浓度给细胞表面上所有剩余的EGFRvIII受体分子染色(图9)。图9呈现的结果表明，在将细胞暴露于EGFRvIII-结合串联双抗体之后，在所有检测条件下未处理细胞上存在的多于80％且高达140％的EGFRvIII受体分子仍是可用的(140％或更多的>100％的一般值是指与细胞表面上受体的数目减少(细胞内化)相反，用串联双抗体处理的细胞显示出细胞表面上受体的增加。内化至100％来自与未处理的细胞的对比)。这些结果表明，本发明的EGFRvIII/CD3串联双抗体令人惊讶地没有显示出任何内化趋势(图9)。本发明的EGFRvIII特异性结构域的结合，没有诱导内化，而是甚至可能抑制内化并导致细胞表面上EGFRvIII受体水平增加。图9呈现的结果表明，相对于未处理的细胞，在所有检测条件下，在将细胞暴露于EGFRvIII-结合抗体之后，至少多于80％仍保留在细胞表面上。这些结果表明，本发明的EGFRvIII/CD3抗体，尤其是EGFRvIII/CD3串联双抗体，令人惊讶地没有显示出任何内化趋势(图9)。本发明的EGFRvIII特异性结构域的结合，没有诱导内化，而是可能抑制内化或促进EGFRvIII表达增加，导致其细胞表面密度增加。
实施例10：评估在EGFRvIII/CD3(或EGFRvIII/CD16A)串联双抗体的存在下PBMC培养物中的细胞增殖
为了评估在不存在EGFRvIII+靶细胞的情况下EGFRvIII/CD3(或EGFRvIII/CD16A)串联双抗体是否诱导T细胞的激活和后续的增殖，在浓度渐增的EGFRvIII/CD3串联双抗体的存在下培养人PBMC。孵育5天后，在溴脱氧尿苷掺入试验(BrdU incorporation assay)中评估增殖。
材料(培养基、缓冲液和试剂)
FCS(Invitrogen)、人血清(Sigma)、Lymphoprep(Stemcell Technologies)、L-谷氨酰胺(Invitrogen)、OKT3(Biolegend)、PBS(Invitrogen)、β-巯基乙醇(Invitrogen)、青霉素/链霉素(Invitrogen)、RPMI-1640(Invitrogen)、丙酮酸钠(Invitrogen)、BrdU细胞增殖ELISA(Roche)。
细胞：
在抽血当天从Deutsches Rotes Kreuz,DRK-Blutspendedienst Baden-Wurttemberg-Hessen(曼海姆，德国)购买血沉棕黄色层；在分离PBMC之前，将血沉棕黄色层制备物在室温下保存过夜。
从血沉棕黄色层分离PBMC并富集T细胞：
通过密度梯度离心从血沉棕黄色层分离PBMC。将血沉棕黄色层样品用两到三倍体积的PBS稀释，在Lymphoprep垫层上分层并在室温w/o制动下以800×g离心25min。收集位于界面处的PBMC，并用PBS洗涤3次，然后将它们用于增殖试验。
增殖试验
将所有测定板在室温下用补充有10％热灭活的人血清、4mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素G钠盐、100μg/mL硫酸链霉素、1mM丙酮酸钠、0.05mMβ-巯基乙醇的RPMI1640培养基(本文中称为完全RPMI培养基)封闭2小时以防止抗体与塑料表面的非特异性结合。在除去封闭培养基后，将4×l05个PBMC与所指示浓度的检测项和对照项一起接种在平底96孔微板的每个孔中的完全RPMI培养基中，总体积为200μL/孔，每个样品测定三次。将IgG抗CD3的克隆OKT3用作阳性对照。为了评估自发增殖，在6个重复中，在没有抗体的情况下培养细胞。然后将板在37℃和5％CO2下，在加湿的空气中孵育4天。在孵育终止前18小时，将细胞培养物用100μΜBrdU脉冲处理(pulsed)。根据制造商的说明书，用BrdU增殖ELISA试剂盒对掺入的BrdU定量。通过加入100mM H2SO4终止显色后，用多标签酶标仪(plate reader)(Victor 3,Perkin Elmer)在450nm下测量吸光值。分析吸光度值并使用GraphPad Prism软件(用于Windows的GraphPad Prism 6.00版，GraphPad Software，加利福尼亚拉荷亚，美国)将平均值和SD绘制成线。
结果示于图10。
实施例11：EGFRvIII/CD3的串联双抗体CD3结合亲和力与细胞毒性效力的相关性
构建并表达了含有相同EGFRvIII结合结构域(Li3G30)和不同CD3结合结构域(其对CD3T细胞抗原具有一些亲和力)的EGFRvIII/CD3串联双抗体并测定了与CD3+Jurkat细胞和EGFRvIII+CHOEGFRvIII细胞的结合；此外，实施了将CHOEGFRvIII细胞用作靶细胞和将PBMC细胞用作效应细胞的细胞毒性测定。在本实施例中检测的所有检测的串联双抗体的各VH和VL(重链和轻链)结构域的顺序都相同：VL CD3-VH EGFRVIII-VL EGFRVIII-VH CD3。
如先前实施例中所述，对结合EGFRvIII+CHOEGFRvIII细胞的抗体和由EGFRvIII/CD3串联双抗体介导的细胞毒活性进行流式细胞术评估。
用渐增浓度的串联双抗体对CD3+Jurkat细胞染色后，通过流式细胞仪测定EGFRvIII/CD3串联双抗体对CD3+细胞的表观亲和力。使用通过流式细胞术测定的各串联双抗体浓度的平均荧光值，通过非线性回归/双曲线计算KD值。
材料(培养基、缓冲液和试剂)：
抗His IgG 13/45/31(Dianova)、FCS(Invitrogen)、FITC缀合的山羊抗小鼠IgGmin X(Dianova)、L-谷氨酰胺(Invitrogen)、NaN3(Carl Roth)、PBS(Invitrogen)、青霉素/链霉素(Invitrogen)、碘化丙啶(Sigma)、RPMI-1640(Invitrogen)
细胞：
将Jurkat细胞(由G.Moldenhauer博士(DKFZ,海德尔堡，德国)惠赠)培养在补充有2mM L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠盐和100μg/mL硫酸链霉素的RPMI 1640培养基中(所有组分均来自Invitrogen，本文中称为完全RPMI 1640培养基)。
通过流式细胞术测定对CD3+细胞的抗体亲和力：
将细胞与所指示的抗体在补充有2％热灭活的FCS和0.1％叠氮化钠的冰冷PBS(称为FACS缓冲液)中从100μg/mL(约1000nM)开始的100μL连续稀释液在冰上孵育45min。用FACS缓冲液洗涤3次后，将细胞在同一缓冲液中与0.1mL 10μg/mL小鼠单克隆抗His抗体克隆13/45/31在冰上一起孵育45min。在第二个洗涤循环之后，在与前相同的条件下，将细胞与0.1mL 15μg/mL FITC缀合的山羊抗小鼠IgG抗体一起孵育。作为对照，在没有一抗的情况下，将细胞与抗His IgG 13/45/31孵育，然后与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG抗体孵育。然后将细胞再次洗涤，并重悬于含2μg/mL碘化丙啶的0.2mL FACS缓冲液中以排除死细胞。使用用MXP软件的Beckman-Coulter FC500 MPL流式细胞仪(Beckman-Coulter,克雷菲尔德，德国)或用Incyte软件的Millipore Guava EasyCyte流式细胞仪(Merck Millipore，施瓦尔巴赫，德国)测量l×l04个活细胞的荧光。细胞样品的平均荧光强度用CXP软件(Beckman-Coulter，克雷费尔德，德国)或Incyte软件(Merck Millipore，施瓦尔巴赫，德国)计算。如果用Beckman-Coulter FC500 MPL流式细胞仪进行分析，使用0.5×l06个细胞/染色，如果用Millipore Guava EasyCyte流式细胞仪，仅使用0.25×l06个细胞/染色。
在减去单独用二级和三级试剂染色的细胞的荧光强度值后，将荧光强度值和GraphPad Prism软件(用于Windows的GraphPad Prism 6.00版，GraphPad Software，加利福尼亚拉荷亚，美国)的单位点结合的等式(双曲线)用于计算KD值。
对于每个分析的串联双抗体，将结合EGFRvIII的KD值和细胞毒性的EC50绘制成结合CD3的KD值的函数。当串联双抗体的结合EGFRvIII的KD值仅显示出很小的可变性时，EC50细胞毒性值显示出了伴随着串联双抗体渐增的CD3结合KD值几乎成线性增加(图11)。
实施例12：由EGFRvIII/CD3引起的F98EGFRvIII异种移植瘤抑制(体内概念验证)
在第0天(d0)，通过皮下(s.c.)注射与来自健康供体的l×107个纯化的人PBMC混合的4×l06个F98npEGFRvIII细胞的悬浮液，对9个实验组的免疫缺陷NOD/scid小鼠(NOD/MrkBomTac-Prkdcscid，Taconic Denmark)进行异种移植。为了解释PBMC可能的供体可变性，将每个实验组再分成两队(cohorts)，每队仅接受一个个体供体的PBMC。在肿瘤细胞接种后2h，随后是24h、48h、72h和96h，将100μg、10μg或1μg的各串联双抗体测试项通过尾静脉(i.v.)对动物进行给药。对照组仅接受载体。从d0开始，一周两次用1mg西妥昔单抗(爱必妥)对另一对照进行给药(i.p.)。表6总结了剂量组和供体分配。从第3天至第52天一周3次通过用卡尺测量肿瘤的大直径和小直径来监控肿瘤体积。根据以下公式用直径计算肿瘤体积：体积＝(小直径)2×大直径×0.5。
表7：动物的剂量组
Figure GDA0002026522800000471
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Figure IDA0000924369120000011
Figure IDA0000924369120000021
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Figure IDA0000924369120000211
Figure IDA0000924369120000221
Figure IDA0000924369120000231
Figure IDA0000924369120000241

Claims (20)

1.一种具有至少一个EGFRvIII结合位点的EGFRvIII结合蛋白，其包含抗体可变重链结构域和抗体可变轻链结构域，其中
(a)
(a1)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：27，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：28，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：30，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：31，所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：32；
(a2)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：33，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：28，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：34，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：31，所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：35；
(a3)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：33，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：28，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：36，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：31，所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：37；
(a4)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：33，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：38，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：39，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：40，所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：41；
(a5)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：42，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：43，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：44，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：40，所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：45；
(a6)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：48，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：28，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：47，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：40，所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：48；
(a7)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：49，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：50，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：51，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：40，所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：52；
(a8)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：53，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：54，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：44，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：40，所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：55；
(a9)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：53，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：28，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：56，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：57，所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：58；
(a10)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：46，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：28，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：59，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：40，所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：60；
(a11)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：33，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：61，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：44，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：40，所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：62；
(a12)所述抗体可变重链结构域CDR1为SEQ ID NO：46，所述抗体可变重链结构域CDR2为SEQ ID NO：63，所述抗体可变重链结构域CDR3为SEQ ID NO：29；所述抗体可变轻链结构域CDR1为SEQ ID NO：64，所述抗体可变轻链结构域CDR2为SEQ ID NO：31和所述抗体可变轻链结构域CDR3为SEQ ID NO：65；
或者
(b)所述抗体可变重链结构域选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：25；所述抗体可变轻链结构域选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：26。
2.根据权利要求1所述的EGFRvIII结合蛋白，其包含选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：25的可变重链结构域或选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：26的可变轻链结构域。
3.根据权利要求1或2所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，细胞在37℃、所述EGFRvIII结合蛋白的饱和状态下暴露于所述EGFRvIII结合蛋白24小时之后，至少80％的存在于未处理细胞上的EGFRvIII受体分子仍是可用的。
4.根据权利要求1或2所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述EGFRvIII结合蛋白包括至少一个其他功能结构域。
5.根据权利要求4所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述其他功能结构域是效应子结构域。
6.根据权利要求5所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述效应子结构域是T细胞或NK细胞特异性的。
7.根据权利要求6所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述效应子结构域是包含能够形成CD3抗原结合位点的至少一个抗体可变重链结构域和至少一个可变轻链结构域的CD3结合位点。
8.根据权利要求7所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述CD3结合位点包含氨基酸序列为SEQ ID NO：23的可变重链结构域和氨基酸序列为SEQ ID NO：24的可变轻链结构域。
9.根据权利要求1所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述EGFRvIII结合蛋白是人源化的或全人的。
10.根据权利要求4所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述EGFRvIII结合蛋白是多特异性的。
11.根据权利要求10所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述EGFRvIII结合蛋白是三特异性的。
12.根据权利要求10所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述EGFRvIII结合蛋白是双特异性的。
13.根据权利要求12所述的EGFRvIII结合蛋白，其中所述双特异性的结合蛋白是对EGFRvIII和CD3具有特异性的串联双抗体或对EGFRvIII和CD16A具有特异性的串联双抗体。
14.根据权利要求13所述的EGFRvIII结合蛋白，其中在串联双抗体的每个多肽中，四个可变链结构域按以下顺序通过肽接头L1、L2和L3彼此融合：
(i)VL(CD3)-L1-VH(EGFRvIII)-L2-VL(EGFRvIII)-L3-VH(CD3)；或
(ii)VH(CD3)-L1-VL(EGFRvIII)-L2-VH(EGFRvIII)-L3-VL(CD3)；或
(iii)VL(EGFRvIII)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(EGFRvIII)；或
(iv)VH(EGFRvIII)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(EGFRvIII)。
15.根据权利要求14所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，肽接头L1、L2和L3由12个或更少个氨基酸残基组成。
16.根据权利要求15所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，肽接头是GGSGGS。
17.一种编码权利要求1或14所述的EGFRvIII结合蛋白的多核苷酸。
18.一种包含权利要求17所述的多核苷酸的载体。
19.一种用权利要求18所述的载体转化或转染的宿主细胞。
20.一种药物组合物，其包含：(i)权利要求13所述的EGFRvIII结合蛋白，以及(ii)药学上可接受的载体。
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