KR102589136B1 - 항-b7-h3 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

항체 의존성 세포 매개 세포 독성을 유도하는 면역 체크포인트의 면역 활성 및 B7-H3에 의해 억제된 T 세포의 활성화를 가져 암 치료제로 유용하게 사용할 수 있는 B7-H3을 특이적으로 인식하는 항-B7-H3 항체를 제공한다. 구체적으로, 면역 체크포인트의 상기 억제 활성을 가지는 상기 항체는 다른 면역 항체 치료제와 병용하여 사용할 수 있다. 또한, B7-H3에 특이적으로 결합하여 B7-H3을 발현하는 다양한 암의 검출, 및 특정 암에 대한 약물 전달 등을 포함하는 암 타겟 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

항-B7-H3 항체 및 그 용도
항-B7-H3 항체 또는 항원-결합 단편 및 이의 용도를 제공한다.
B7-H3 (CD276)은 B7 패밀리의 구성원으로, 세포 외 영역, 막횡단영역 및 세포 내 영역을 포함하는 막 관통 단백질이다. B7-H3의 2개의 세포 외 영역은 엑손 중복으로 인해 면역글로불린의 가변 영역 및 불면 영역의 단일 쌍 (2Ig B7-H3) 또는 두 개의 동일한 쌍 (4Ig B7-H3)으로 구성된다. 이 두 가지 형태의 기능적인 차이점은 확인되지 않았다. 상기 B7-H3의 세포 내 영역은 짧고 알려진 모티프가 없다 (Chapoval AI, Ni J, Lau JS, Wilcox RA, Flies DB, Liu D, et al. NatImmunol 2001;2:269-74.).
상기 B7-H3은 B7 패밀리의 다른 구성원과 20-27% 아미노산 동일성을 가진다. 인간 B7-H3은 마우스 B7-H3과 88%의 아미노산 동일성을 가진다. 그러나, 상기 마우스 B7-H3은 하나의 서브타입 (2IgB7-H3)을 가지지만, 상기 인간 B7-H3은 두 개의 서브타입 (2Ig B7-H3, 4Ig B7-H3)을 가진다. 4Ig B7-H3은 인간 조직에서 우세하게 확인된다.
마우스 B7-H3가 CD8+ T 세포의 TLT1에 결합하여, T 세포의 증식, 사이토카인의 생성 및 세포독성을 향상시킨다는 것이 발견되었고, 이로 인해 TLT2가 B7-H3 수용체로 작용할 수 있다고 제안되었다. 그러나, 그 후에, 이러한 상호작용에 대한 상기 증거들은 마우스 및 인간 모두에게서 발견되지 않았다 (M. Loos, D. M. Hedderich, and D. M. Hedderich, et al. BMC Cancer, vol. 9, article 463, 2009).
상기 B7-H3 단백질은 정상 조직에서 T 세포, 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell) 및 항원제시세포 (antigen presenting cell, APC)에서 항상 발현되는 것은 아니지만, 그 발현이 유도될 수 있다. 비록 상기 B7-1 및 B7-2의 발현이 항원제시세포와 같은 면역세포에만 국한되어 있지만, 상기 B7-H3 단백질은 골아세포 (osteoblast), 섬유아세포 (fibroblast), 섬유아세포 유사 활막 세포 (fibroblast-like synovial cell) 및 상피세포 (epithelial cell)뿐만 아니라 인간의 간, 폐, 방광, 고환, 전립선, 유방, 태반 및 림프관 기관에도 존재한다. 이러한 광범위한 발현 패턴은 특히 말초 조직에서 B7-H3에서의 면역학적 및 비-면역학적 기능을 제안한다.
최근, 상기 B7-H3 발현은 비소 세포 폐암 (non-small cell lung cancer), 신장세포암 (renal cell carcinoma), 신경아세포종 (neuroblastoma), 대장암 (colorectal cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 위암 (gastric cancer), 폐암 (lung cancer), 전립선암 (prostate cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 간세포암 (hepatocellular carcinoma), 유방암 (breast cancer), 자궁경부암 (cervical cancer), 골육종 (osteosarcoma), 구강암 (oral cancer), 방광암 (bladder cancer), 신경아교종 (glioma), 흑색종 (melanoma) 등 다양한 고형암에서 확인되며, 급성 백혈병 (acute leukemia), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 다양한 림프종 등 혈액 암에서 발현되는 것으로 보고된다 (Zhimeng Yea, Zhuojun Zhengb et al, Cell Physiol Biochem(2016),Elodie Picarda, Kim C. Ohaegbulam and Xingxing Zang, clinical cancer research(2016),Wei Zhang, Yanfang Wang, Jing Wang et al, international journal of oncology(2015)).
B7-H3은 다양한 암 종에서 과발현되지만, 상기 정상조직에서의 발현은 매우 낮다. 많은 연구에서, 대다수의 암 유형에서, B7-H3의 비정상적인 발현이 나타났고, 세포질 또는 암 세포의 핵 내부뿐만 아니라 종양 관련 혈관계에서도 발견되는 것으로 나타났다. 종양의 크기, 전이, 암 병기, 생존율 및 재발율 등과 같은 다양한 임상 병리학적 지표를 추정할 때, 상기 B7-H3의 과발현은 나쁜 진단 및 나쁜 임상 결과와 연관되어 있다. 전립선 암 환자를 대상으로 한 연구에 따르면, 상기 B7-H3 발현이 강한 상기 종양 세포 환자는 수술 당시 질병 전파 위험, 임상 암 재발 및 암 관련 사망 위험이 유의하게 높았다. 폐암에 대한 상기 B7-H3의 발현은 종양 침윤 림프구 (tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)의 감소 및 림프절 전이와 관련이 있고, 면역 회피 및 종양 생성에 B7-H3의 역할을 암시한다 (Elodie Picarda,Kim C. Ohaegbulam and Xingxing Zang,Clin Cancer Res, 2017 Jul 12;22).
B7-H3은 종양 면역을 조절하는 역할 외에도 종양 공격성을 조절하는 비면역성 기능을 가지고 있다. 이는 Jak2/Stat3/MMP-9 신호 전달 경로를 통해 다양한 암 세포의 피브로네틴 (fibronectin)으로 이동, 침입 및 요청을 조절하는 것으로 나타났다 (Elodie Picarda,Kim C. Ohaegbulam and Xingxing Zang,Clin Cancer Res, 2017 Jul 12;22). 종양 관련 항원인 B7-H3은 siRNA에 의한 하향 조절을 통해 피브로넥틴에 대한 세포 부착을 감소시켰고 흑색종 (melanoma) 및 유방암 세포에서 이동 및 침투를 70%이상 감소시켰다 (Chen YW, Tekle C, Fodstad O, Curr Cancer Drug Targets 2008 ;8). 이러한 결과들은 B7-H3이 암 치료에 유용한 타겟이 될 수 있음을 암시한다.
B7-H3은 면역 체크포인트 리간드 (immune checkpoint ligand)에 속하는 단백질이다. 상기 면역 체크포인트 단백질은 인체 내의 면역세포들이 잘못된 비정상적인 행동을 하지 못하게 조절하는 역할을 한다. 상기 면역 체크포인트 단백질이 암 세포에서 과발현할 때, 면역세포들은 상기 암 세포가 보내는 비정상적인 신호를 정상 신호로 받아들이고, 상기 암 세포를 건강한 세포로 인식한다. 면역 체크포인트 억제제는 이러한 상기 암 세포의 비정상적인 신호를 차단하여 환자 자신의 면역 기능으로 암을 치료하게 하는 항암 면역 치료제이다. 상기 면역 체크포인트 리간드의 일종인 B7-H3은 T 세포 표면의 B7-H3 수용체와 결합하고 상기 T 세포의 면역반응 억제를 유도하나, 아직까지는 B7-H3가 결합하는 수용체가 무엇인지 밝혀지지 않았다.
이러한 면역 체크포인트 리간드를 차단할 수 있는 항체는 면역 체크포인트 리간드와 면역 체크포인트 수용체의 상호 작용을 부분적으로 또는 완전히 중화시켜 면역 체크포인트를 억제시킴으로 저하되어 있던 면역세포의 활성을 재활성화 시켜 면역 항암 치료 효과를 보여준다. B7-H3과 결합하는 수용체는 아직 발견되지 않았지만, B7-H3와 결합하는 항-B7-H3 항체는 상기 면역 체크포인트 수용체 및 B7-H3간의 결합을 차단하고 이러한 면역 체크포인트를 억제시켜 상기 저하되어 있던 면역세포의 활성을 재활성화 시켜 면역 항암 치료 효과를 보여줄 수 있다. 즉, 상기 B7-H3 수용체와 결합을 차단하는 항 B7-H3 단일 클론 항체는 항암 치료 효과를 기대할 수 있다 (Elodie Picarda,Kim C. Ohaegbulam and Xingxing Zang,Clin Cancer Res, 2017 Jul 12;22). 미국 특허 8,802,091 및 9,371,395는 B7-H3에 대한 항체를 개시한다.
상기 동일한 B7-H3 항원에 대한 항체라도 각 항체의 특성 또는 용도에 따라 다양한 항암항체로 개발이 가능하므로, 이러한 B7-H3의 암 특이적 발현, 다양한 암에서의 발현 및 면역 체크포인트 리간드로의 기능을 고려하면, 기존의 항체를 보완 또는 대체할 수 있는 다양한 항체의 개발이 필요하다.
B7-H3를 특이적으로 인식할 수 있는 단백질, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 구현예는 B7-H3의 세포 외 영역 또는 그의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 및 이의 용도를 제공한다. 특히, 상기 항체는 인간 B7-H3을 특이적으로 인식할 수 있고, 원숭이와 마우스 B7-H3에 교차 반응을 나타낸다.
일 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 중쇄 상보성 결정 영역 (heavy chain complementary determining regions), 및 (ii) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 경쇄 상보성 결정 영역 (light chain complementarity determining regions)을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있고, 상기 CDRH1은 서열번호 1 내지 4로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRH2은 서열번호 5 내지 9 및 68로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRH3은 서열번호 10 내지 14로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRL1은 서열번호 15 내지 19로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRL2은 서열번호 20 내지 24 및 69로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRL3은 서열번호 25 내지 29로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있다. 상기 용어 “CDRH”는 중쇄 가변 영역 (heavy chain variable region)에 포함된 CDR을 나타내고, 상기 용어 “CDRL”은 경쇄 가변 영역 (light chain variable region)에 포함된 CDR을 나타낸다.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 상보적 결정 영역 (complementary determining regions)을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 (ii) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 상보적 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 CDRH1은 서열번호 1 내지 4로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRH2은 서열번호 5 내지 9 및 68로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRH3은 서열번호 10 내지 14로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRL1은 서열번호 15 내지 19로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRL2은 서열번호 20 내지 24 및 69로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있고; 상기 CDRL3은 서열번호 25 내지 29로부터 선택되는 어느 하나를 포함하거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 다음으로부터 선택되는 조합일 수 있다: 순서대로, 서열번호 1, 5, 및 10; 서열번호 2, 6, 및 11; 서열번호 3, 7, 및 12; 서열번호 1, 8, 및 13; 서열번호 4, 9, 및 14; 또는 서열번호 3, 68, 및 12.
다른 구현예에서, 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 다음으로부터 선택되는 조합일 수 있다: 순서대로, 서열번호 15, 20 및 25; 서열번호 16, 21 및 26; 서열번호 17, 22 및 27; 서열번호 18, 23 및 28; 서열번호 19, 24 및 29; 또는 서열번호 17, 69 및 27.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 중쇄 상보성 결정 영역 및/또는 (ii) CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있고,
상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3는 다음 조합 중 하나이고: CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 1, 5, 및 10인 조합; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 2, 6, 및 11인 조합; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 3, 7, 및 12인 조합, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 1, 8, 및 13인 조합; CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 4, 9, 및 14인 조합, 또는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 3, 68, 및 12인 조합; 및
상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3는 다음 조합 중 하나이다: CDRL1, CDRL2 및 CDRL3가 각각 서열번호 15, 20 및 25인 조합; CDRL1, CDRL2 및 CDRL3가 각각 서열번호 16, 21 및 26인 조합; CDRL1, CDRL2 및 CDRL3가 각각 서열번호 17, 22 및 27인 조합; CDRL1, CDRL2 및 CDRL3가 각각 서열번호 18, 23 및 28인 조합; CDRL1, CDRL2 및 CDRL3가 각각 서열번호 19, 24 및 29인 조합, 또는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3가 각각 서열번호 17, 69 및 27인 조합.
중쇄 가변 영역에서 유래된 CDR의 조합 중 하나 및 경쇄 가변 영역에서 유래된 CDR의 조합 중 하나를 자유롭게 조합할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3; 및 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 서열은 다음 중 어느 하나의 조합일 수 있다:
(a) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 1, 5, 및 10이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3가 각각 서열번호 15, 20, 및 25;
(b) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 2, 6, 및 11이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3가 각각 서열번호 16, 21, 및 26;
(c) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 3, 7, 및 12이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3가 각각 서열번호 17, 22, 및 27;
(d) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 1, 8, 및 13이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3가 각각 서열번호 18, 23, 및 28;
(e) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 4, 9, 및 14이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3가 각각 서열번호 19, 24, 및 29;
(f) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 3, 68, 및 12이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3가 각각 서열번호 17, 22, 및 27; 또는
(g) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3가 각각 서열번호 3, 68, 및 12이고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3가 각각 서열번호 17, 69, 및 27.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 30 내지 34, 및 70의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 35 내지 39, 및 71의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
각각의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 서로 조합할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 다음 서열의 조합일 수 있다: 서열번호 30 및 35; 서열번호 31 및 36; 서열번호 32 및 37; 서열번호 33 및 38; 서열번호 34 및 39; 서열번호 70 및 37; 또는 서열번호 70 및 71.
다른 구현예에서, 상기 항체는 IgG 타입, 예를 들어 인간, 원숭이 또는 마우스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 타입일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 60에 의해 나타나는 중쇄 불변 영역 (heavy chain constant region) 및/또는 서열번호 64에 의해 나타나는 경쇄 불변 영역 (light chain constant region)을 제공한다. 예를 들어, 상기 서열번호 60의 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄는 서열번호 40 내지 44, 및 72 중 어느 하나로 나타날 수 있다. 예를 들어, 상기 서열번호 64의 경쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄는 서열번호 45 내지 49, 및 73 중 어느 하나로 나타날 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 항체는 하기 서열로 표시되는 중쇄 및 경쇄 조합을 포함할 수 있거나 필수적으로 포함하여 이루어질 수 있다: 서열번호 40 및 45; 서열번호 41 및 46; 서열번호 42 및 47; 서열번호 43 및 48; 서열번호 44 및 49; 서열번호 72 및 47 또는 서열번호 72 및 73.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 인간화 항체, 인간 항체 (예: 완전한 인간 항체), 또는 항체 결합 단편일 수 있고, 원숭이 및 마우스의 B7-H3에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 비자연적으로 발생할 수 있고; 예를 들어 합성 또는 재조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 상기 항체는 단일 클론 항체일 수 있고, 특히 인간 단일 클론 항체일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 항체는 원숭이 B7-H3 및 마우스 B7-H3에 교차 반응성을 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 특이적으로 인간 B7-H3, 원숭이 B7-H3, 및/또는 마우스 B7-H3을 인식한다.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFab, Fv, dsFv, scFV, scFV-Fc, 미니바디 (minibody), 디아바디 (diabody), scAb, dAb, 2가 항체 (bivalent antibody) 또는 다가 항체 (multivalent antibody)를 포함하고, 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 B7-H3 면역 체크포인트를 억제하거나 차단할 수 있고, 이에 의해 B7-H3 면역 체크포인트에 의해 상기 활성이 분해되거나 억제된 T 세포를 재활성화 할 수 있다. 그러므로, 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 상기 B7-H3 면역 체크포인트에 의해 억제된 T 세포의 재활성화 및 이러한 B7-H3 면역 체크포인트 억제와 같은 것을 통해 상기 재활성화를 요구하는 다양한 질병 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 상기 개시된 바와 같이 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3를 포함하는 중쇄 CDR 및/또는 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3를 포함하는 경쇄 CDR일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 개시된 중쇄 및/또는 경쇄 가변 구역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 개시된 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
다른 측면에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 제공된다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 항체 생산을 위한 발현 벡터 또는 CAR-T 세포 (Chimeric Antigen receptor redirected T cells) 또는 CAR-NK (Natural Killer) 세포를 위한 벡터를 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 상기 벡터에 의해 형질 전환된 세포 주를 제공한다.
다른 구체예는 상기 세포 주로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는, B7-H3 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는, 분리된 항체의 제조방법을 제공한다.
다른 구체예는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물 또는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용되는 부형제를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 암과 같은 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학적 조성물이다.
다른 구체예는 본원에 개시된 항체 또는 이의 항체 결합 단편을 B7-H3 발현의 검출을 필요로 하는 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 B7-H3의 검출방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 접촉 단계 이후, 상기 항체 또는 항원 결합 단편으로 처리된 (접촉된) 생물학적 샘플에서 항원-항체 반응을 측정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 방법은 체외 또는 체내에서 수행할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 항체 결합 단편 또는 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 키트가 사용되는 특정 목적에 따라 B7-H3 검출용 키트, 암 치료용 투여용 키트 또는 암 치료용 키트로 제공할 수 있고, 특정 목적에 따라, 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역학적 분석을 위한 성분, 예를 들어, 검출 또는 진단을 위한 키트에 대한 버퍼 및 설명서, 또는 항체 투여 또는 암 치료를 위한 키트에 대한 투여장치 및 설명서를 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (1) 인간, 마우스 또는 원숭이로부터 유래된 세포 표면에 발현된 B7-H3를 특이적으로 인식하거나 B7-H3에 결합할 수 있거나 (2) 세포 표면에 존재하지 않는 B7-H3의 세포 외 영역을 특이적으로 인식하거나 세포 외 영역에 결합할 수 있다.
상기 단일 클론 항체는 항체-의존성 세포-매개 세포 독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 유도 능력 및 면역 세포 활성화 유도 능력 모두를 보여주고, 적어도 두 메커니즘을 통해 암 세포의 사멸 또는 암의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다. 그러므로, B7-H3에 특이적인 높은 ADCC를 보여주는 상기 항체를 암 세포 특이적 사멸을 통해 암의 치료에 유용하게 사용할 수 있고, 기존의 상기 항-B7-H3 항체와 비교하여, 더 높은 항체-의존성 세포-매개 세포 독성을 보여주고, 그러므로 상기 기존의 항체를 대신하여 암 세포의 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.
또한, 상기 단일 클론 항체는 면역 체크포인트 리간드인 B7-H3에 의해 활성이 저하된 T 세포를 활성화하는 면역 체크포인트 억제제로서 효과를 보여주고, 면역 세포의 활성화를 통해 암 치료에 유용하게 사용된다.
뿐만 아니라, 상기 항체를 예를 들어 특정 암 등으로 약물을 전달하거나 특이적 결합에 의한 암의 검출, 진단 및/또는 표적화에 사용할 수 있다.
또한, 상기 개시된 단일 클론 항체는 인간, 원숭이 및 마우스 B7-H3에 상기 결합 친화성을 가지는 종내 교차-반응성을 가진다. 이는 마우스 또는 원숭이 B7-H3에 상기 결합 친화성을 보여줄 수 없는 다른 인간 항체에 비해 약 등의 개발에 매우 유용하다. 예를 들어, 상기 단일 클론 항체 또는 상기 항체를 이용한 다양한 형태의 치료제는 고비용의 원숭이-기반 실험 진행 전에, 저비용의 마우스 모델에서 상기 초기 결과를 얻어서 더 경제적이고 효과적으로 약물 개발을 진행할 수 있다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 준비된 상기 항-B7-H3 항체의 B7-H3 단백질의 세포 외 영역 (extracellular domain, ECD)에 대한 상기 결합 능력을 분석 (ELISA)한 결과이다. 모든 항체가 인간 B7-H3 단백질의 상기 세포 외 영역에 농도 의존적으로 결합하는 것으로 나타났다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 준비된 상기 항-B7-H3 항체의 B7 과에 속하는 상기 다른 단백질의 ECD에 대한 상기 결합 능력 분석 (ELISA)한 결과이다. 본 발명의 일 실시예에 따라 준비된 모든 항체가 상기 다른 단백질에 결합하지 않고 B7-H3 단백질만을 특이적으로 인식하는 것으로 나타났다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 준비된 상기 항-B7-H3 항체의 종내 교차 반응성을 ELISA로 분석한 결과이다. 모든 항체가 원숭이 (cynomolgus) B7-H3 및 마우스 B7-H3에 농도 의존적으로 결합하는 것으로 나타났다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 준비된 다양한 항-B7-H3 항체의 결합 능력 정도를 ELISA로 마우스 B7-H3 단백질과 비교한 결과이다. 상기 마우스 B7-H3에 대한 항체의 결합 정도는 다양하지만, 모든 항체는 농도 의존적으로 마우스 B7-H3 단백질에 결합하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 대조군으로 사용된 84D 항체는 마우스 B7-H3 단백질에 결합하지 않았다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 준비된 상기 항-B7-H3 항체의 세포 표면 발현 B7-H3 항원에 대한 결합능력을 측정한 결과이다. MCF-7 세포 주는 B7-H3을 과발현하는 세포 주고, Jurkat은 B7-H3을 발현하지 않는 세포 주다. 항-B7-H3 항체가 B7-H3을 과발현하는 세포 주인 MCF-7에 특이적으로 결합하고, B7-H3을 발현하지 않는 세포 주인 Jurkat에는 결합하지 않는 것을 보여줬다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 준비된 상기 항-B7-H3 항체의 상기 세포 표면에 발현된 B7-H3 항원에 대한 항체 농도 변화에 대한 결합 능력을 측정 (FACS) 한 결과이다. 모든 항체가 B7-H3 발현 암 세포 주 (MCF-7, DLD-1, HCC1954, 및 HCT116)에 농도 의존적으로 결합하는 것을 보여줬다. 다른 다양한 암 세포 주에서 발현되는 B7-H3에 대한 항체의 결합 능력은 표 5에 개시되어 있다.
특정 항원에 대한 항체를 치료용 항체 등으로 체 내에서 사용하기 위해서는, 세포 표면 발현 항원에 결합하는 것이 필요하다. 일부 항체의 경우, 정제된 항원에 결합하지만, 상기 세포 표면에 발현된 항원에는 결합하지 않는다. 이 경우, 체 내에 투여된 상기 항체는 체 내 세포에 결합할 수 없으므로 체 내에서 치료용 항체로 작용할 수 없다. 그러므로, 이러한 결과는 항-B7-H3 항체가 세포 표면 B7-H3에 결합하여 체 내에서 활성을 나타낼 수 있어 치료용 항체로 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.
도 7은 상기 항-B7-H3 항체가 마우스 유래 암 세포 주 (CT26, B16F10, 및 TC-1)에 대한 결합 능력 측정 (FACS) 결과이다. 모든 B7-H3 단일 클론 항체는 마우스 유래 암 세포 주 표면에서 발현된 B7-H3도 특이적으로 인식하는 것으로 나타났다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 준비된 상기 항-B7-H3 항체의 ADCC 유도 능력을 측정한 결과이다. 본 발명의 일 실시예에서 준비된 상기 항체는 MCF-7, Calu-6, DLD-1 및 Mino를 포함하는 인간 B7-H3 양성 세포 주에서만 특이적인 ADCC 유도를 보여줬다. ADCC는 인간 B7-H3 음성 세포 주에서는 관찰되지 않았다. 이는 상기 항체가 B7-H3 발현 암 세포에만 특이적으로 결합하고 항체 의존적 세포 매개 세포 독성을 유도하기 때문에 암 세포 사멸에 효과적으로 사용될 수 있음을 보여준다. 특히, 상기 항-B7-H3 항체는 대조군 항체인 84D에 비해 EC50이 낮고 항체 의존성 세포 매개 세포 독성의 신호 강도가 더 강하기 때문에, 암 치료에 더 효과적으로 사용될 수 있음을 보여준다.
도 9a는 B7-H3 단백질에 의해 억제되는 T 세포 활성 및 결과적으로 인터페론 감마 (interferon gamma)의 생성을 억제함을 보여준다. 이는 상기 B7-H3 단백질이 농도 의존적으로 인터페론 감마의 생성을 억제했다는 것을 보여줬다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에서 준비된 상기 항-B7-H3 항체가 인터페론 감마 생성에 의해 측정된 도 9a와 같이 B7-H3 단백질에 의해 억제된 T 세포 활성을 재활성화 시킬 수 있다는 것을 보여준다. 도 9a 및 도 9b의 결과는 상기 항 B7-H3 단일 클론 항체가 B7-H3 단백질에 의한 T 세포 면역 억제를 중화 또는 차단할 수 있다는 것을 의미한다. 즉, 상기 B7-H3 항체는 활성이 억제된 T 세포를 재활성화시켜 T 세포에 의한 암세포의 사멸을 유도할 수 있고 이는 상기 B7-H3 항체가 효과적으로 암 치료에 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 준비된 상기 항-B7-H3 항체가 감마 생성에 의해 측정된 항 PD-1항체와 함께 사용될 때, 인터페론에 의한 T 세포 활성화에 미치는 영향을 보여준다. 이는 상기 항-B7-H3 항체가 단독으로 또는 상기 항암 면역 항체와 상기 T 세포를 활성화하여 인터페론 감마의 생성을 촉진하는 것을 보여줬다. 이는 상기 항체가 단독으로 또는 다른 항암 면역 항체와 결합될 때, 상기 T 세포를 활성화하여 암 치료에 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
도 11은 마우스 B7-H3 양성 암 세포 주인 CT26이 이식된 동종 종양 이식 모델에서 본 발명의 일 실시예에서 준비된 상기 항-B7-H3 항체를 항 PD-1 항체와 병용 투여한 경우, 종양 성장이 억제되고 성장률이 증가한 것을 확인한 결과이다. 항 PD-L1 항체는 면역 체크포인트 억제를 통해 작용한다. 이 결과는 상기 항-B7-H3 항체는 항 PD-1 항체와 병용 투여될 때, 암 치료에 효과적으로 사용될 수 있고, 성장률을 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다.
도 12는 마우스 B7-H3 양성 암 세포 주인 CT26이 이식된 동종 종양 이식 모델에서 본 발명의 일 실시예에 따라 준비된 상기 항-B7-H3 항체를 항 PD-a 항체와 병용 투여할 때, 종양에서 종양 침윤 림프구의 흐름을 분석한 결과이다. 이는 상기 항-B7-H3 항체와 항 PD-1 항체의 병용 투여에 의해 CD8+ T 세포의 활성이 증가하고 조절 T 세포의 증식이 억제되는 것을 보여줬다. 이는 상기 항-B7-H3 항체 및 상기 면역 체크포인트 억제제인 항 PD-1 항체의 병용 투여로 인한 상기 항암 효과가 상기 CD8+ T 세포 및 조절 T 세포의 변화를 통해 나타난다는 것을 의미한다.
본 명세서는 B7-H3의 세포 외 영역을 특이적으로 인식할 수 있는 항체의 개발을 기초로 한 것이다.
본 항목에서 사용된 제목은 명세서 기재의 편리성을 위한 것일 뿐, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에서 사용된 과학 및 기술적 용어는 본 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 대로의 의미를 가진다. 나아가, 문맥상 특별히 요구되지 않는다면, 단수는 복수를 포함하고, 복수는 단수를 포함한다.
특정 서열 번호로 표시되는 본 발명에서 개시된 모든 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 항-B7-H3 항체로서의 활동을 유지하는 한, 특정 서열번호의 서열뿐만 아니라, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 특정 서열번호의 서열과 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 필수적으로 포함하거나 또는 서열로 구성될 수 있다.
정의
본 명세서에서 “폴리뉴클레오타이드” 또는 “핵산”은 단일 또는 이중가닥의 뉴클레오타이드 폴리머를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 상기 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 이들의 변형된 형태일 수 있다.
본 명세서에서 다르게 명시하지 않으면, 상기 폴리뉴클레오타이드의 왼쪽 말단이 5’ 말단이고, 오른쪽 말단은 3’ 말단을 나타낸다.
본 명세서에서 “분리된 핵산 분자”는 그 전부 또는 일부가 자연에 존재하는 폴리뉴클레오타이드와 관련성이 없거나, 또는 자연에서 관찰되지 않는 폴리뉴클레오타이드에 연결되어 있는, 유전체 기원의 DNA 또는 RNA, 또는 합성 기원의 mRNA, cDNA 또는 이들 조합을 의미한다. 본 발명의 목적 하에서, 특정 핵산 서열을 포함하는 상기 핵산 분자는 온전한 (intact) 염색체를 포함하지 않는다. 대신, 특정 핵산 서열을 포함하는 상기 분리된 핵산 분자는 그 특정 서열에 부가하여, 적어도 수 개의 부가적인 단백질 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 상기 특정 핵산 서열의 발현을 위한 조절 서열 및/또는 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 “조절 서열”은 이에 작동 가능하게 연결되어 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 줄 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 상기 조절 서열의 특징은 숙주의 종류에 따라 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 원핵 세포에 작용할 수 있는 상기 조절 서열은 프로모터 (promoter), 경우에 따라 오퍼레이터 (operator), 리보솜 결합 부위 (ribosome-binding site) 및 전사 종결 서열 (transcription termination sequence)을 포함할 수 있다. 진핵 세포에서, 상기 조절 서열은 복수 개의 인식 부위 (multiple recognition sites)를 포함하는 프로모터 (promote), 전사 인핸서 (transcription enhancer), 폴리아데닐화 서열 (polyadenylation sequence) 및 전사 종결 서열 (transcription termination sequence)을 포함할 수 있다. 상기 조절 서열은 추가적으로 리더 서열 (reader sequence) 및/또는 융합 파트너 서열 (fusion partner sequence)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 “벡터”는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 숙주세포로 전달하는데 사용되는 예를 들면, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스를 포함하는 임의의 분자를 의미한다.
본 명세서에서 “발현 벡터”는 숙주세포의 숙주세포의 형질전환에 적합한 벡터를 의미하며, 발현 벡터에 작동가능하게 연결되어 목적하는 단백질을 코딩하는 이종 서열의 발현을 조절하는 핵산서열을 포함하는 벡터를 의미한다. 이 발현 벡터는 또한 상기 코딩 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 전사, 번역 및 인트론이 존재하는 경우 RNA 스필라이싱 (splicing) 또는 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 “작동가능하게 연결된”은 연결하고자 하는 핵산 서열이 적절한 조건에서 타겟팅 기능을 수행할 수 있도록 위치하는 것을 의미한다. 예를 들어, 만약 코딩 서열 및 조절 서열을 포함하는 벡테에서 적절한 조건 하에 상기 코딩 서열의 전사가 상기 조절 서열에 의해 영향을 받는다면, 이는 작동가능하게 연결된 것이다.
본 명세서에서 “숙주세포”는 타겟팅 핵산 서열에 의해 형질 전환되거나 형질 전환 될 표적 타겟 유전자를 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 상기 용어는 숙주세포의 정체성 및 형태와 유전적 구성에 관계없이 타겟 유전자를 발현하는 상기 숙주세포의 자손을 포함한다.
본 명세서에서 “형질도입 (transduction)”은 일반적으로 박테리오파지에 의해 한 박테리아에서 다른 박테리아로 핵산이 움직이는 것을 의미한다. 예를 들어, 복제를 할 수 없는 레트로바이러스 (retrovirus)를 이용하여 진핵 세포로의 핵산의 이동을 포함한다.
본 명세서에서 “전달이입 (transfection)”은 세포가 외래 또는 외인성 DNA를 얻는 것을 의미하고, 이 경우 DNA가 세포막을 통해 세포 내로 도입한다. 이는 당해 기술 분야에 공지된 방법으로, 예를 들어 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates를 참조할 수 있다.
본 명세서에서 “형질전환 (transformation)”은 세포가 새로운 DNA 또는 RNA를 포함하도록 변형된, 세포의 유전적 특징의 변화를 의미한다. 예를 들어, 형질도입, 전달이입, 또는 기타 기술들을 통해 새로운 유전적 물질을 도입하여, 세포의 유전적 특성이 변함에 따라 세포가 형질전환 될 수 있다. 형질도입 또는 전달이입 등을 포함하는 방법에 의해 형질전환 된 상기 DNA는 세포의 염색체에 물리적으로 통합되어 존재할 수도 있고, 복제가 없는 에피솜 형태 또는 복제 가능한 플라스미드로 일시적으로 존재할 수도 있다. 상기 형질전환 된 DNA가 숙주세포 분열과 함께 복제될 때, 안정하게 형질전환 된 것으로 간주된다.
본 명세서에서 “아미노산”은 당해 기술 분야에서 이해되는 통상의 의미를 포함한다. 20개의 자연 발생된 아미노산 및 이들의 축약형은 당업계에 통용되는 것에 따른다 (Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Green, eds., Sinauer Associates: Sunderland, Mass. 1991). 상기 아미노산은 전형적인 아미노산, 전형적인 20개 아미노산 (D-아미노산)의 입체 이성질체, 비-자연 아미노산, 예를 들면, α-,α-이치환된 아미노산 (α-,α-disubstituted amino acids), N-알킬 아미노산 (N-alkyl amino acids), 및 다른 비-전형적인 아미노산을 포함한다. 비-전형 아미노산의 예로는, 4-하이드록시프롤린 (4-hydroxyproline), γ-카복시글루타메이트 (γ-carboxyglutamate), ε-N,N,N-트리메틸라이신 (ε-N,N,N-trimethyllysine), ε-N-아세틸라이신 (ε-N-acetyllysine), O-포스포세린 (O-phosphoserine), N-아세틸세린 (N-acetylserine), N-포르밀메티오닌 (N-formylmethionine), 3-메틸히스티딘 (3-methylhistidine), 5-하이드록시라이신 (5-hydroxylysine), σ-N-메틸아르기닌 (σ-N-methylarginine) 및 다른 유사한 아미노산과 이미노산 (예를 들어, 4-하이드록시프롤린)이 포함된다. 본 명세서에서 사용된 폴리펩타이드 표기에서, 당업계에서 일반적으로 통용되는 바와 같이, 서열의 왼쪽은 아미노 말단이고 서열의 오른쪽은 카복시 말단을 나타낸다.
본 명세서에서, “폴리펩타이드” 또는 “단백질”은 아미노산 잔기의 중합체 (polymer)를 의미하고, 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 이는 또한 자연적으로 발생한 아미노산 잔기의 중합체뿐만 아니라 이의 유사체 또는 모방체의 중합체도 포함한다. 또한, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 인산화 또는 글리코실화 (glycosylation)를 위한 탄수화물의 추가 등의 변형을 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 재조합 또는 자연적으로 발견되는 세포에서 생성될 수 있다. 또한 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 야생형 서열 또는 상기 아미노산 서열의 일부가 결실, 첨가 및/또는 치환된 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 항체, 예를 들어 항-B7-H3 항체 (또는 B7-H3 항체로 칭함), B7-H3 결합 단백질, 또는 항원 결합 단편, 또는 상기 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 및/또는 치환된 서열을 포함한다. 또한, “폴리펩타이드 단편”은 아미노 말단의 아미노산 서열 결실, 카복실 말단의 아미노산 서열의 결실 및/또는 내부 결실을 가지는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 단편은 또한 전장 단백질 (full-length protein)에 비해 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 단편은 길이가 약 5 내지 900개 아미노산, 예를 들어 단편은 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 또는 850개의 아미노산 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명의 목적을 고려하면, 상기 유용한 폴리펩타이드 단편은 항원-결합 도메인을 포함하는 항체의 면역학적 기능성 단편을 포함한다. B7-H3 결합 항체의 경우, 이러한 유용한 단편은 중쇄 또는 경쇄의 1개, 2개 또는 3개를 포함하는 CDR 서열 또는 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역을 포함하는 항원 사슬의 전부 또는 일부를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, “분리된 폴리펩타이드, 항체 또는 단백질”은 이들과 통상적으로 함께 발견될 수 있는 다른 단백질이 존재하지 않고, 자연적으로 이들과 결합되어 있는 지질, 탄수화물 및 폴리뉴클레오타이드의 적어도 약 50%이상이 제거된 것이다. 일반적으로, 상기 분리된 단백질, 폴리펩타이드 또는 항체는 특정 조성물에서 적어도 약 5%이상, 적어도 약 10%이상, 적어도 약 25%이상 또는 적어도 약 50%이상을 포함한다. 이 폴레펩타이드는 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 합성 기원의 다른 RNA 또는 이들의 임의의 조합에 의해 코딩될 수 있다. 특히, 상기 분리된 단백질, 폴리펩타이드 또는 항체에는 치료, 진단 및 예방 연구 또는 다른 용도로의 적용을 방해하는 다른 단백질 또는 다른 폴리펩타이드의 오염 물질이 실질적으로 존재하지 않는다.
본 명세서에서, 예를 들어 항원 결합 단편, 단백질 또는 항체와 같은 폴리펩타이드의 “변이체 (variant)”는 다른 폴리펩타이드 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입, 결실, 부가 및/또는 치환된 폴리펩타이드이고, 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 또한, 단백질 변이체는 단백질 효소 절단, 인산화 또는 다른 후번역 변형 (posttranslational modification)에 의해 변형되었으나, 상기 개시된 항체의 생물학적 활성, 예를 들어 B7-H3에 특이적 결합 및 생물학적 활성을 유지하는 것을 포함한다. 상기 변이체는 상기 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 서열과 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 또는 80% 동일한 것일 수 있다. 퍼센트 동일성 (%) 또는 상동성은 다음 설명을 참조하여 계산할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 퍼센트 상동성 또는 동일성을 100*[(동일한 위치)/min(TGA, TGB)]로 계산할 수 있고, 상기 식에서 TGA, TGB는 비교되는 서열 A 및 B의 잔기의 수 및 내부 갭 위치의 합이다 (Russell et al., J. Mol Biol., 244: 332-350 (1994).
본 명세서에서, 상기 보존적 아미노산 치환은 폴리펩타이드의 활성 또는 항원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 치환을 의미한다. 상기 폴리펩타이드는 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 비-제한적 예시는 하기 표 3에 개시되어 있다.
상기 폴리펩타이드의 “유도체 (derivative)”는 삽입, 결실, 부가 또는 치환 변이체와는 상이한, 다른 화학적 모이어티 (chemical moiety)와의 접합을 통해 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 의미한다.
본 명세서에서, 폴리펩타이드, 핵산, 숙주세포 등과 관련하여 사용되는 상기 용어 “자연적으로 발견되는”은 자연적으로 존재하는 물질을 의미한다.
상기 개시된 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 인식되는 상기 B7-H3 (B7 Homolog 3, CD276)는 면역글로불린 (immunoglobulin, Ig) 상과 (superfamily)에 속하는 B7 과의 막 관통 단백질를 지칭할 수 있고, 세포 외 영역, 막 관통 영역 및 세포 내 영역을 포함한다. 상기 항체가 인식하는 상기 B7-H3은 세포막에 존재하거나 존재하지 않는 세포 외 영역일 수 있다. B7-H3의 상기 인간 단백질은 534개의 아미노산으로 구성되어 있고, 이는 NCBI Reference Sequence: NP_001019907.1로 개시되어 있다. 상기 사용된 문맥에서 명백하지 않는 한, 상기 B7-H3는 인간 B7-H3을 지칭하지만, 상기 항체는 원숭이 및 마우스 B7-H3에 특이적으로 결합 능력을 가진다. 상기 원숭이 B7-H3 단백질은 534개의 아미노산으로 구성되어 있고, NCBI Reference Sequence: XP_005560056.1로 개시되어 있다. 상기 마우스 B7-H3 단백질은 316개의 아미노산으로 구성되어 있고, NCBI Reference Sequence: NP_598744.1로 개시되어 있다.
본 명세서에서, “동일성” 또는 상동성은 두 개 이상의 폴리펩타이드 또는 두 개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 정렬하고 비교하여 결정되는 두 개 이상의 폴리펩타이드 또는 두 개 이상의 폴리뉴클레오타이드의 서열 유사성을 의미한다. 이런 서열 사이의 동일성은 일반적으로 “동일성 퍼센트”로 나타나고, 이는 비교할 분자간의 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 비율을 의미하고 비교할 분자 중에서 가장 작은 분자의 크기를 기준으로 측정된다. 핵산 또는 폴리펩타이드를 배열하여 많은 분자 사이의 상기 동일성을 계산하는데 사용되는 방법에 대해 다음 문서를 참조할 수 있다: Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073.
상기 동일성 퍼센트 계산 시, 비교되는 서열은 서열 사이에 최대한의 매칭을 제공하는 방식으로 정렬되고, 상기 정렬된 서열에는 갭, 매칭 및 미스-매치가 존재하고, 이는 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 알고리즘으로 처리된다. 일 구현예에서, 이 동일성 퍼센트는 Needlman and Wunsch 알고리즘을 사용하여, 비교되는 서열 사이에 상기 매치는 최대화하고 갭의 수는 최소화하는 방식으로 두 서열을 정렬하는 GAP 프로그램을 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 이용하여 결정할 수 있다 (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, USA). 상기 컴퓨터 알고리즘 GAP는 비교되는 두 개의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에서, 이들 사이에 매치는 최대화하고 갭의 수는 최소화하는 방식으로 두 서열을 정렬하여 “매칭 구간 (span)”를 결정한다. 상기 알고리즘은 또한 갭 개방 패널티 (gap opening penalty) [이는 3*평균 대각선으로 계산되고, 상기 “평균 대각선”은 사용될 비교 매트릭스 (comparison matrix)의 대각선 평균이고, 상기 “대각선”은 특정 비교 매트릭스에 의해 각각의 완전한 아미노산 매치에 할당된 스코어 또는 숫자이다] 및 갭 확장 패널티 (gap extension penalty) (이는 일반적으로, 갭 개방 페널티의 1/10배이다), 그리고 예를 들어 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스를 함께 사용한다. 일 구체예에서, 표준 비교 매트릭스 (standard comparison matrix) (Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for PAM 250 comparison matrix; refer to Henikoff et al.,1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 for BLOSUM 62 comparison matrix 참조)를 사용한다. 일 구현예에서, GAP 프로그램을 사용한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해 권장되는 파라미터는 다음과 같다: 알고리즘: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453; 비교 매트릭스: BLOSUM 62 (Henikoff et al., 1992, supra); 갭 페널티: 12 (no penalty for a terminal gap); 갭 길이 패널티 (gap length penalty): 4; 유사성 임계값 (similarity threshold): 0.
비록, 두 서열사이에 유의한 관련성이 없음에도 불구하고, 두 서열을 특정 파라미터를 사용하여 정렬할 때, 짧은 서열 영역에서 높은 동일성으로 매칭되는 결과가 나올 수 있다. 이 경우, 두 개의 서열이 최소 50개의 연속적 아미노산에 걸쳐 정렬되도록, 상기 GAP 프로그램과 같은 사용되는 알고리즘의 파라미터를 수정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 “실질적으로 순순한”은 타겟팅 분자가 우세한 종으로 존재하는 것이다. 즉, 몰 기준에서, 동일한 혼합물 내에서 임의의 다른 개별적인 종보다 농도가 더 높다는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 실질적으로 순수한 분자는 조성물에 포함된 모든 폴리머 종류의 적어도 약 50% (몰 기준), 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 99%로 포함된다. 다른 구현예에서, 상기 타겟팅 분자는 기존의 방법을 사용하여 더 이상 오염물이 검출되지 않을 정도까지 실질적으로 균질하게 정제되고, 상기 조성물은 균질한 한 종류의 폴리머 물질만을 포함한다.
한 측면에서, 본원은 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 재조합 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 이러한 측면에서, “재조합 단백질”은 재조합 기술을 사용하여, 즉 본 명세서에 기재된 바와 같이 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다. 재조합 단백질의 생산을 위한 상기 방법 및 기술은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다.
본 명세서에서, “친화성 (affinity)”은 항체 또는 그 항원 결합 단편과 항체 사이의 상호작용의 강도이며, 이는 항원의 크기, 모양 및/또는 전하와 같은 항원의 특징 및 항체 또는 항원 결합 단편의 CDR 서열에 의해 결정된다. 상기 친화성을 결정하는 상기 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 하기를 참조할 수 있다.
상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 해리 상수 (dissociation constant, KD)가 ≤10-6 M일 때, 항원과 같은 그 타겟에 “특이적으로 결합한다”라고 불린다. 상기 항체는 KD가 ≤1x 10-8 M일 때, “높은 친화성”으로 타겟에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에서, “항원 결합 영역 또는 부위”는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 단백질의 일부를 의미한다. 예를 들어, 상기 항원과 상호작용하여, 상기 항체에 항원에 대한 특이성 및 친화성을 제공하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체의 일부가 이에 해당한다. 이러한 항원 결합 영역은 전형적으로, 하나 이상의 “상보성 결정 영역 (complementary determining regions, CDR)”을 포함한다. 특정 항원 결합 영역은 또한 하나 이상의 “프레임워크”영역을 포함한다. 상기 프레임워크 영역은 이들 CDR의 적절한 형태 (conformation)를 유지하는데 도움을 주어, 상기 항원 결합 영역과 항원 사이에 결합을 촉진할 수 있다.
본 명세서에서, “항체”는 임의의 온전한 (intact) 면역글로불린의 이소타입, 또는 타겟 항원에의 결합을 위해 온전한 항체와 경쟁할 수 있는 항원 결합 단편을 의미한다. 예를 들어, 이는 키메라, 인간화, 완전한 인간 및 다중 특이적 항체 또는 이들의 항원 결합 단편을 포함한다. 상기 항체는 그 자체로 항원 결합 단백질의 일종이다. 상기 온전항 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함하지만, 낙타과 동물에서 자연적으로 발견되는 일부 경우와 같이, 상기 항체는 중쇄 만을 포함할 수도 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 오직 단일 원 (source) 또는 키메라에서 유래될 수 있다. 상기 키메라 항체는 2종류의 다른 항체로부터 유래된 부분을 포함하고, 하기 보다 상세하게 기재한다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하이브리도마, 재조합 DNA 기술 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 다른 언급이 없다면, 본 명세서에서 상기 용어 항체는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함하고, 이들의 유도체, 변이체, 단편, 및 돌연변이체를 포함하고, 이들의 예는 아래에 기재한다.
본 명세서에서, “경쇄”는 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 제공하기 충분한 가변 영역 서열을 가지는 전장 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 상기 전장 경쇄는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함한다. 상기 경쇄의 가변 영역 도메인은 경쇄 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재한다. 상기 경쇄의 종류는 카파 (kappa) 및 람다 (lamda) 사슬을 포함한다.
본 명세서에서, “중쇄”는 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 제공하기 충분한 가변 영역 서열을 가지는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 상기 전장 중쇄는 가변 영역 도메인 VH와 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 상기 VH 도메인은 중쇄 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하고, 상기 CH 도메인은 카복시 말단에 존재하고, 상기 CH3 도메인은 카복시 말단에 가장 가깝게 위치한다. 상기 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입 포함), IgA (IgA1 및 IgA2 서브타입 포함), 및 IgM과 IgE의 이소타입을 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 항체 또는 면역글로불린 사슬 (중쇄 또는 경쇄)의 “항원 결합 단편”은 전장 사슬과 비교하여 일부 아미노산이 부족하지만, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 일부를 포함한다. 이 단편은 타겟 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 또는 다른 항체 또는 항원 결합 단편과 특정 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있다는 측면에서, 생물학적 활성이 있다고 할 수 있다. 한 측면에서, 이 단편은 전장 경쇄 또는 중쇄 내에 적어도 하나의 CDR을 포함하고, 일부 구현예에서, 단쇄 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 일부를 포함한다. 이러한 생물학적 활성 단편을 재조합 DNA 기술에 의해 생성하거나, 또는 예를 들면 온전한 항체를 효소적 또는 화학적으로 절단하여 생성할 수 있다. 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편은 Fab, Fab’, F(ab’)2, scFab, dsFv, Fv, scFV, scFV-Fc, 디아바디 (diabody), 미니바디 (minibody), scAb, and dAb을 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 인간, 마우스, 랫트, 카멜리드 또는 토끼를 포함하는 임의의 포유동물에서 유래될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에 기재된 하나 이상의 CDR과 같은 상기 항체의 기능적인 부분은 제2의 단백질 또는 저분자 화합물과 공유결합에 의해 연결되어 있고, 특정 타겟에 대한 타겟 치료제로 사용될 수 있다.
본 명세서에서, “Fc” 영역은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 이 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디설파이트 결합 및 CH3 도멘인의 소수성 상호작용에 의해 서로 결합된다.
본 명세서에서, “Fab 단편”은 1개의 경쇄와 CH1 및 가변 영역만을 포함하는 1개의 중쇄로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 없다.
본 명세서에서, “Fab’ 단편”은 Fab 단편에 추가적으로 중쇄의 CH1 및 CH2 도메인 사이의 영역을 포함하고, 이는 두 분자의 Fab’ 단편의 두 개의 중쇄 사이에서 사슬간 다이설파이드 결합을 형성하고, F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
본 명세서에서, “F(ab')2 단편”은 앞서 기재한 바와 같이, 두 개의 경쇄를 포함하고, 가변 영역, CH1 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변영역의 일부를 포함하는 두 개의 중쇄를 포함하고, 2개의 중쇄 사이에서 사슬간 다이설파이드 결합이 형성된다. 따라서, 상기 F(ab')2 단편은 두 개의 Fab' 단편으로 구성되고, 상기 두 개의 Fab'2 단편은 이들 간의 다이설파이드 결합에 의해 서로 만난다.
본 명세서에서, “Fv 영역”은 중쇄와 경쇄의 가변 영역 각각을 포함하지만, 불변 영역은 포함하지 않는 항체이다. scFc는 Fv가 유연한 링커에 연결된 것이다. scFv-Fc는 Fc가 scFV에 연결된 것이다. 상기 미니바디 (minibody)는 CH3가 scFV에 연결된 것이다. 상기 디아바디 (diabody)는 scFV의 두 분자를 포함한다.
본 명세서에서, “단쇄 항체 (scAb)”는 중쇄의 하나의 가변 영역 또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 유연한 링커에 의해 연결된 경쇄 불변영역을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬이다. 상기 단쇄 항체는 예를 들면, 미국 특허 제 5,260,203 호를 참조할 수 있으며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 개시된다.
본 명세서에서, “도메인 항체 (dAb)”는 중쇄의 가변영역 또는 경쇄의 가변 영역 만을 포함하는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다. 일 구현예에서, 둘 이상의 VH 영역은 펩타이드 링커에 의해 공유결합으로 연결되고, 2가 (bivalent) 도메인 항체를 형성한다. 이러한 2가 도메인 항체의 두 개의 VH 영역은 동일한 또는 상이한 항원을 타겟팅할 수 있다.
본 명세서에서, “2가 항원-결합 단백질” 또는 “2가 항체”는 두 개의 항원-결합 부위를 포함한다. 상기 2가 항체에 포함된 두 개의 항원-결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖거나, 각각 상이한 항원에 결합하는 이중-특이적인 항체를 가질 수 있다.
본 명세서에서, “다중-특이적 항원-결합 단백질” 또는 “다중-특이적 항체”는 2이상의 항원 또는 에피토프를 타겟팅한다.
본 명세서에서, “이특이적”, “이중-특이적”항원-결합 단백질 또는 항체는 2개의 다른 항원-결합 부위를 가지는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이러한 이특이적 항체는 다중-특이적 항원-결합 단백질 또는 다중-특이적 항체의 일종으로, 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 하이브리도마 융합 또는 Fab’ 단편 연결에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553, 등을 참조할 수 있다. 상기 이특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 두 개의 항원 결합 부위가 결합하는 두 개의 서로 상이한 에피토프는 동일 또는 상이한 단백질 타겟에 위치할 수 있다.
본 명세서에서, “항원” 또는 “면역원”은 예를 들어 항원 결합 단백질 (예: 항체 또는 이의 면역학적으로 기능적 항원 결합 단편)이 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 의미하고, 동물에서 항원에 결합할 수 있는 항체의 생성에 사용될 수 있다. 상기 항원은 다른 항체 또는 이의 단편과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 항원은 B7-H3 단백질의 세포 외 도메인이다. 다른 구현예에서, 상기 항체는 세포 표면에 존재하지 않은 B7-H3 또는 세포막에 존재하는 형태의 B7-H3의 모든 세포 외 도메인을 인식할 수 있다.
본 명세서에서, “에피토프”는 항원 결합 단백질 또는 항체에 의해 결합되거나 이들이 인식하는 분자의 부분이고, 예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체와 같은 항원 결합 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자를 포함한다. 상기 에피토프는 연속적 또는 비연속적일 수 있고, 예를 들어, 폴리펩타이드 서열에서는 서로 연속적이지는 않지만 분자의 측면에서는 구조적 (conformational) 에피토프와 같이, 하나의 항원 결합 단백질에 의해 결합되지만, 연속적이지 않고 서로 떨어진 위치에 있는 아미노산 잔기일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 에피토프는 항체 생성에 사용되는 항원과 유사한 3차원적 구조를 포함하지만, 상기 에피토프에서 발견되는 잔기를 포함하지 않거나 일부 잔기만을 포함할 수 있다는 측면에서, 모방체 (mimetic)일 수 있다. 공통적으로, 상기 에피톱은 단백질이지만, 핵산과 같은 다른 종류의 물질일 수 있다. 상기 에피토프 결정 인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기, 또는 설포닐기와 같은 분자에 의해 표면에 형성된 화학적 활성화 그룹일 수 있거나, 특정한 3차원적 구조 특징 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 공통적으로, 특정 타겟 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 폴리머의 복합체 내에 존재하는 타겟 항원의 에피토프를 인식한다.
본 명세서에서, “치료제”는 목적하는 치료 효과를 위해 피험자에 투여되는 분자를 의미한다. 상기 피험자는 인간이 아닌 포유류, 예를 들어, 영장류 또는 인간을 포함한다. 상기 치료제의 예는 펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하는 단백질, 핵산, 항체 또는 저분자 화합물을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 치료제는 항체 또는 항체에 결합하여 암과 같은 관련 질병의 치료제로 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 상기 용어 “치료”는 부상, 질환, 또는 질환 또는 병적 상태 증상의 완화 또는 치료를 의미하고, 이는 맞춤 (reduction), 경감 (relief), 부상, 질병 또는 질병 또는 상태 증상의 완화, 환자가 부상, 질환, 또는 질환 또는 병적 상태의 증상을 더 잘 견딜 수 있게 만드는 것, 부상, 질환 또는 부상 또는 병적 상태 증상을 악화를 늦추는 것, 또는 환자의 정신적 또는 육체적인 삶의 질을 향상시키는 것을 포함하는 임의의 객관적인 또는 주관적인 파라미터를 포함한다. 이러한 부상, 질환 또는 부상 또는 병적 상태 증상의 치료 또는 개선을 신체 검사 결과, 질병과 관련된 다양한 지표 검사 및 영상 검사를 기반으로 판단할 수 있다.
본 명세서에서, “유효량”은 일반적으로 질환, 특히 B7-H3과 관련된 질환으로 인한 증상의 심각성 및/또는 발생 빈도의 감소, 질환, 특히 B7-H3과 관련된 질환으로 인한 증상 및/또는 질환 발생의 근본 원인 제거, 또는 질환, 특히 B7-H3과 관련된 질환으로 인한 증상 및/또는 근본 원인 발생의 예방 및/또는 질환, 특히 B7-H3과 관련된 질환으로 인한 손상을 개선 또는 교정하기에 충분한 양을 의미한다. 일 구현예에서, 상기 유효량은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량이다. 상기 “치료적 유효량”은 질환, 특히 B7-H3과 관련된 증상 또는 상태를 치료하거나, 질환, 특히 B7-H3과 관련된 증상 또는 상태의 예방, 지체 또는 그 진행을 역전시킬 만큼 충분한 양이다. 상기 “예방적 유효량”은 질환, 특히 B7-H3과 관련된 질환의 발병 또는 재발, 또는 질환, 특히 B7-H3과 관련된 질환 또는 관련된 증상을 예방 또는 지연시키고, 그 발생 가능성을 감소시키는 양이다. 상기 완전한 치료적 또는 예방적 효과는 복용량의 1회 투여에 의해 발생하기보다는 복용량의 수회 투여에 의해 발생할 수 있다. 따라서, 치료적 또는 예방적 유효량은 1회 이상의 투여에 의해 전달될 수 있다.
항체 또는 항원 결합 단편
본원은 B7-H3 단백질의 세포 외 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개시한다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 마우스 및 원숭이 B7-H3 단백질의 세포 외 영역에 교차반응성을 가진다.
본 명세서에 따른 상기 항체는 본 명세서에 개시된 바와 같이, 하나 이상의 상보적 결정 영역 또는 부위 (CDR)를 포함하는 폴리펩타이드이다.
일부 구현예에서, CDR은 “프레임워크 (framework)”영역에 포함되며, 상기 프레임워크는 이러한 CDR(들)이 적절한 항원 결합 특성을 가질 수 있도록 CDR(들)을 지향하게 한다.
상기 항체는 특이적으로 인간, 원숭이 및 마우스 유래의 B7-H3 세포 외 영역에 특이적으로 결합하고, 분리된 형태의 세포 외 영역 또는 세포 표면에 발현되는 B7-H3의 세포 내 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 항체는 단일 클론 항체 (monoclonal antibody), 이중dual-특이적 항체 (specific antibody), 이중 항체 (double antibody), 다중 특이적 항체 (multi-specific antibody), 다중 항체 (multiple antibody), 미니바디 (minibody), 도메인 항체 (domain antibody), 항체 모방체 (antibody mimetic) (또는 합성 항체 (synthetic antibody)), 키메라 항체 (chimeric antibody), 인간화 항체 (humanized antibody) 또는 항체 융합 (antibody fusion) (또는 항체 접합체 (antibody conjugate)) 및 이의 단편을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니고, 본 명세서에 개시된 다양한 형태의 항체를 포함한다.
일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 상기 항체의 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFab, Fv, dsFv, scFV, scFV-Fc, 미니바디 (minibody), 디아바디 (diabody), scab, 또는 dAb 일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 상기 항체는 표 2a 및 표 2b에 개시된 가변 영역을 포함하는 경쇄 또는 중쇄만으로 구성된 폴리펩타이드로 구성될 수 있다.
본 명세서에 개시된 한 항체는 본 명세서에 개시된 다른 항체와 특정 영역 또는 서열을 공유한다. 일 구현예에서, 이는 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 불변 영역을 공유할 수 있다. 다른 구현예에서, 이는 Fc 영역을 공유할 수 있다. 다른 구현예에서, 이는 가변 영역의 프레임을 공유할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 항체는 자연에서 발견되는 항체의 전형적인 구조를 가진다. 낙타과 동물은 단일 중쇄로 구성된 항체를 생성하지만, 상기 항체의 구조 단위는 일반적으로 4량체 폴리펩타이드를 포함하고 상기 4량체는 상이한 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 한 쌍의 폴리펩타이드 사슬 몸체 중 두 개를 포함한다. 전형적인 항체에서, 상기 폴리펩타이드 사슬 모체 중 하나는 하나의 전장 경쇄 (약 25kDa) 및 하나의 전장 중쇄 (약 50 내지 70kDa)를 포함한다. 각 사슬은 특징적인 접힘 패턴을 나타내며, 약 90 내지 110개의 아미노산으로 구성된 여러 면역글로불린 도메인으로 구성된다. 이 도메인은 항체 폴리펩타이드를 구성하는 기본 단위체이다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 전형적으로 항원을 인식하는 부위인 가변 영역 또는 V 영역으로 지칭되는 부분을 포함한다. 상기 카복시-말단 부위는 아미노-말단 부위보다 진화적으로 더 많이 보존되며, 불변 영역 또는 C 영역으로 지칭되는 부분을 포함한다. 상기 인간 경쇄는 공통적으로 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄로서 분류되고, 이들 각각은 하나의 가변 영역 및 하나의 불변 영역을 포함한다. 상기 중쇄는 전형적으로 뮤 (μ), 델타 (δ), 감마 (γ), 알파 (α) 또는 입실론 (ε) 사슬로서 분류되고, 이들은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE 이소타입으로 정의된다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나, 이에 제한되지 않은 다수의 서브타입을 가진다. IgM 서브타입은 IgM 및 IgM2를 포함한다. IgA 서브타입은 IgA1 및 IgA2를 포함한다. 인간에서, IgA 및 IgD 이소타입은 4개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 포함하고; IgG 및 IgE 이소타입은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고, IgM 이소타입은 5개의 중쇄 및 5개의 경쇄를 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 전형적으로 효과기 (effector) 기능을 나타내지만, 하나 이상의 도메인을 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역 도메인의 숫자는 이소타입에 따라 달라진다. IgG 중쇄는, 예를 들어, 각각 CH1, CH2 및 CH3로 공지된 3 C 영역 도메인을 포함한다. 본 명세서에 개시된 상기 항체는 이러한 이소타입 및 서브타입 중의 임의의 하나일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 항체는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 서브타입이다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 본원의 항체는 IgG1- 또는 IgG2- 형이다. 추가적인 일 구현예에서, 상기 본원의 항체는 IgG1-형이다.
상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 상기 불변영역의 선택은 부분적으로 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 항체 의존성 세포 식균작용 (antibody-dependent cell phagocytosis), 및/또는 보체 의존성 세포 독성 (complement-dependent cytotoxicity)이 요구되는지에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 인간 이소타입 IgG1 및 IgG3은 보체 의존성 세포독성을 가지고 있고, 인간 이소타입 IgG2 및 IgG4는 이러한 세포독성을 갖지 않는다. 또한, 인간 IgG1 및 IgG3은 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포 매게 효과기 (effector) 기능을 유도한다. 상기 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 의해 생성된 상기 항체는 인간 항체일 수 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1-, IgG2- IgG3- 또는 IgG4-형 일 수 있다. 다른 구현예에서, 본원의 상기 항체는 IgG1- 또는 IgG2-형이다.
다른 구현예에서, 본원에 의해 생성된 상기 항체는 인간 항체이고, 마우스 및 원숭이에 대해 교차반응성을 가진다.
전장 경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산 길이인 “J” 영역에 의해 결합되고, 상기 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 “D” 영역을 포함한다. 예를 들어, Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press를 참조할 수 있다. 전형적으로, 항체의 중쇄/경쇄 쌍의 가변영역이 항체 결합 부위를 형성한다.
면역글로불린 사슬의 가변 영역은 일반적으로 동일한 전체적인 구조를 가지고, “상보적 결정 부위 또는 영역 또는 도메인 (complementary determining site or region or domain)” 또는 CDR (Complementary Determining Region)로 지칭되는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역 (framework region, FR)을 포함한다. 상기 중쇄/경쇄 쌍을 구성하는 각 사슬 유래의 가변 영역의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 타겟 단백질의 특정 에피토프에 특이적으로 결합하는 구조를 형성한다. 자연적으로 발생한 경쇄 및 중쇄 영역의 이러한 요소는 N-말단으로부터 C-말단까지 전형적으로 다음 순서대로 포함된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 상기 가변 영역에서 이들 각각에 해당하는 아미노산 서열의 위치는 Kabat (Kabat et al., (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”), Chothia (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) 또는 OPAL 라이브러리와 관련된 방법 (Hye Young Yang et. al., 2009 Mol. Cells 27: 225)에 의해 결정될 수 있다. 상기 각 정의에 의해 결정된 CDR은 서로 비교하면, 중첩되거나 하나가 다른 하나를 포함하는 서브세트일 수 있다. 그러나 본원에는 상기 각 방법에 의해 정의되는 모든 CDR이 본 발명의 범위에 포함된다. 당업자라면 항체의 가변영역 서열이 주어지면, 여기에서 상기 각 정의에 의한 CDR 서열을 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
본원의 일 구현예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 포함될 수 잇는 CDR 서열은 각각 표 1a 내지 1f에 개시한다.
[표 1a]
CDRH1
서열 서열번호
DYAMS 1
GYYMS 2
SYSMS 3
SYGMS 4
[표 1b]
CDRH2
서열 서열번호
SISSGSGSIYYADSVKG 5
LISPSSGSIYYADSVKG 6
GIYSDGSNTYYADSVKG 7
GISPGGSNTYYADSVKG 8
GIYSGGSSKYYADSVKG 9
GIYSDASNTYYADSVKG 68
[표 1c]
CDRH3
서열 서열번호
NLIPLDY 10
GLTKFDY 11
MLHRFDY 12
DAWIARLLLFDY 13
NRLRFDY 14
[표 1d]
CDRL1
서열 서열번호
SGSSSNIGSNAVS 15
TGSSSNIGSNDVS 16
SGSSSNIGSNSVT 17
SGSSSNIGSNAVT 18
TGSSSNIGSNSVT 19
[표 1e]
CDRL2
서열 서열번호
YNSHRPS 20
ANSHRPS 21
ADSQRPS 22
YNNKRPS 23
SDSHRPS 24
ADVQRPS 69
[표 1f]
CDRL3
서열 서열번호
GSWDASLNAYV 25
GSWDDSLSGYV 26
GTWDSSLNAYV 27
GTWDDSLSGYV 28
GTWDASLNAYV 29
GSWDASLNAYV 25
일 구현예에서, 상기 경쇄 및 중쇄 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 각각 하기 표 2a 및 표 2b로 개시한다.
[표 2a]
중쇄 가변 영역 (VH) 서열 서열번호
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGSGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNLIPLDYWGQGTLVTVSS 30
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYYMSWVRQAPGKGLEWVSLISPSSGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGLTKFDYWGQGTLVTVSS 31
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVSGIYSDGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMLHRFDYWGQGTLVTVSS 32
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISPGGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAWIARLLLFDYWGQGTLVTVSS 33
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVSGIYSGGSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNRLRFDYWGQGTLVTVSS 34
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVSGIYSDASNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMLHRFDYWGQGTLVTVSS 70
[표 2b]
경쇄 가변 영역 (VL) 서열 서열번호
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDASLNAYVFGGGTKLTVLG 35
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNDVSWYQQLPGTAPKLLIYANSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDDSLSGYVFGGGTKLTVLG 36
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNSVTWYQQLPGTAPKLLIYADSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDSSLNAYVFGGGTKLTVLG 37
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVTWYQQLPGTAPKLLIYYNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDDSLSGYVFGGGTKLTVLG 38
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNSVTWYQQLPGTAPKLLIYSDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDASLNAYVFGGGTKLTVLG 39
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNSVTWYQQLPGTAPKLLIYADVQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDSSLNAYVFGGGTKLTVLG 71
일 구현예에서, 상기 표 1a 내지 1f에 개시된 경쇄의 각 가변영역의 CDR과 중쇄의 각 가변영역의 CDR은 자유롭게 조합될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 표 2a 및 표 2b에 개시된 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 다양한 형태의 항체의 준비를 위해 자유롭게 조합될 수 있고, 예를 들어, scFV와 같은 단쇄 항체, 또는 도메인 항체를 형성할 수 있다.
본 명세서에 개시된 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 온전한 항체의 각각 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위해 목적하는 다양한 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 결합할 수 있다. 또한, 이와 같이 불변 영역에 결합된 각각의 중쇄 및 경쇄 서열은 또한 온전한 항체 구조를 형성하기 위해 조합될 수 있다.
상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 임의의 가변 영역은 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 상기 불변 영역은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 항체 의존성 세포성 포식작용 (antibody-dependent cell phagocytosis) 및/또는 보체 의존성 세포 독성 (complement-dependent cytotoxicity) 등이 필요한지에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 인간 이소타입 IgG1 및 IgG3은 보체 의존성 세포독성을 가지고, 인간 이소타입 IgG2 및 IgG4는 상기 독성을 가지지 않는다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 강한 세포 매개 효과기 기능을 유도한다. 예를 들어, 상기 중쇄 가변 영역은 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgG4와 같은 IgG의 불변 영역에 결합할 수 있고, 상기 경쇄 가변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역에 결합할 수 있다. 상기 불변 영역은, 목적하는 바에 따라 적절한 것이 사용될 수 있고, 예를 들어, 인간 또는 마우스 유래의 것이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 인간 중쇄 불변 영역 IgG1이 사용되고, 이는 서열번호 60의 서열로 나타낼 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 경쇄 불변 영역처럼, 인간 람다 영역이 사용되고, 이는 서열번호 64로 나타낼 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 가변 영역은 불변 영역에 결합되어, 중쇄 및 경쇄 서열을 형성할 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 상기 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1 불변 영역에 결합되어, 서열번호 40 내지 44 및 72로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 필수적으로 포함하는 중쇄 (전장)를 형성할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 본 명세서에 개시된 경쇄 가변 영역은 인간 람다 불변 영역에 결합되어, 서열번호 45 내지 49 및 73으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 필수적으로 포함하는 경쇄 (전장)을 형성할 수 있다. 상기 경쇄 및 중쇄는 다양한 조합으로 조합되어, 두 개의 경쇄 및 두 개의 중쇄로 구성되는 온전한 항체를 형성할 수 있다.
그러나, 본 명세서에 개시된 상기 가변 영역에 결합과 조합할 수 있는 이러한 불변 영역 서열은 예시적인 것이고, 해당 분야의 통상의 기술자는 IgG1 중쇄 불변 영역, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역, 임의의 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역, 안정성, 발현, 제조 가능성 또는 다른 목적하는 특징 등을 위해 변형된 불변 영역을 포함하는 다른 불변 영역이 사용될 수 있다는 것을 알 것이다.
본원은 하나 이상의 본 명세서에 개시된 하나 이상의 아미노산과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 실질적 동일성이란 서열 변이가 존재하는 본 명세서에 개시된 효과를 유지하는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 이는 표 2a에 개시된 상기 중쇄 가변 영역과 약 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가진다. 다른 구현예에서, 표 2b에 개시된 상기 경쇄 가변 영역과 약 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가진다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 상기 항체 또는 항원 결합 단편과 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 나타내는 변이체의 경우, 임의의 변이는 CDR 보다는 가변 영역의 골격에서 발생한다.
본 명세서에서는 본 명세서에 개시된 상기 항체 또는 그 일부를 코딩하는 핵산을 개시한다. 상기 핵산은 항체 각 사슬, 또는 상기 항체의 단편, 그 돌연변이, 유도체, 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 또는 오직 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 혼성화 프로브로서 사용하기에 충분한 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭, 규명, 분석 또는 돌연변이 유발에 사용하는 PCR 또는 염기 서열 분석 프라이머를 포함한다. 이들은, 예를 들어, 길이가 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 2000, 또는 2500개 이상의 폴리뉴클레오타이드일 수 있고/있거나, 하나 이상의 추가적인 서열, 예를 들어, 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나 보다 큰 핵산, 예를 들어, 벡터의 일부일 수 있다. 상기 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, RNA 및/또는 DNA 폴리뉴클레오타이드, 및 이의 인공 변이체 (예: 펩타이드 핵산)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 상기 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 상기 핵산은 본 명세서에 개시된 CDR, 상기 CDR을 포함하는 가변 영역, 상기 가변 영역 및 불변영역을 포함하는 전장 항체를 코딩하는 핵산이다. 상기 아미노산 서열이 결정되면, 상기 핵산 서열은 공지된 역전사 프로그램 및 코돈 사용 빈도 (codon usage) 등을 고려하여, 용이하게 결정될 수 있다. 인간 IgG1을 코딩하는 상기 중쇄 불변 영역의 예시적인 핵산 서열은 서열번호 61 내지 63으로 나타낼 수 있다. 인간 람다를 코딩하는 상기 경쇄 불변 영역의 예시적인 핵산 서열은 서열번호 65 내지 67로 나타낼 수 있다. 상기 불변 영역의 상기 아미노산 서열을 포함하는 상기 전장 중쇄의 예시적인 핵산 서열은 서열번호 50 내지 54 및 74 (인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 중쇄)로부터 선택될 수 있고, 상기 예시적인 핵산 서열은 서열 번호 60 내지 57 및 75 (인간 람다 불변 영역을 포함하는 경쇄)에서 선택될 수 있다.
또한, 표 1a 내지 표 1f의 CDR 서열, 및 표 2a 및 표 2b의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열이 포함된다. 이러한 핵산서열은 상기 개시된 전장 항체를 코딩하는 핵산 서열에 포함되기 때문에, 별도로 기재하지 않으며, 상기 분야에 통상의 기술자라면 본 명세서에 개시된 CDR 및 가변 영역의 단백질 서열을 기초로, 이를 코딩하는 핵산 서열을 상기 핵산 서열번호 50 내지 59로부터 용이하게 확인할 것이다.
본원은 또한 본 명세서에 개시된 하나 이상의 핵산 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 상기 실질적 동일성이란 핵산의 변이가 아미노산 치환을 수반하지 않는 보존적 치환 또는 아미노산 변이를 유발하는 경우에도 핵산에 의해 코딩된 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 본 명세서에 개시된 효과를 유지하는 것을 의미한다.
항체의 항원에 대한 특이성 및 친화도
상기 항체 또는 항원 결합 단편은 특히 B7-H3 항원에 대한 특이성 및 항체 치료제/진단제로서 사용되기에 적절한 친화도를 가진다. 일 구현예에서, 표 5에 따르면, 상기 응집체에 대한 친화도는 KD <1.0x10-9 M이고; 다른 구현예에서는 KD ≤1.0x10-10 M이다. 상기 친화도를 가지는 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 낮은 친화도를 가지는 항체, 예를 들어, 10-7 M이상의 친화도를 갖는 항체에 비해, 투여량이 적다는 장점이 있다. 이는, 예를 들어, 항체를 제한하는 것은 아니지만, 피하 주사와 같은 더 간단한 방식으로 투여함에도 불구하고, 출분한 효능을 얻을 수 있기 때문에, 임상적으로 큰 이점이 있다.
항체의 가변 영역
본원은 상기 표 2a 및 표 2b에 나타낸 바와 같은 상기 항체 경쇄 가변 영역 또는 항체 중쇄 가변 영역 및 면역 기능성 단편, 유도체, 돌연변이 단백질 및 상기 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 변이체를 포함하는 항체 (및 이와 상응하는 핵산 서열)와 관한 것이다. 중쇄 및 경쇄의 상기 가변영역이 다양하게 결합된 상기 항체는 "VHx/VLy"로 나타낼 수 있고, 상기 “x”는 중쇄 가변 영역 서열번호, “y”는 경쇄 가변 영역 서열번호에 해당한다. 일 구현예에서, 상기 가변 영역은 하기 조합을 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다: VH30/VL35, VH30/VL36, VH30/VL37, VH30/VL38, VH30/VL39, VH30/VL71, VH31/VL35, VH31/VL36, VH31/VL37, VH31/VL38, VH31/VL39, VH31/VL71, VH32/VL35, VH32/VL36, VH32/VL37, VH32/VL38, VH32/VL39, VH32/VL71, VH33/VL35, VH33/VL36, VH33/VL37, VH33/VL38, VH33/VL39, VH33/VL71, VH34/VL35, VH34/VL36, VH34/VL37, VH34/VL38, VH34/VL39, VH34/VL71, VH70/VL35, VH70/VL36, VH70/VL37, VH70/VL38, VH70/VL39, 또는 VH70/VL71.
앞서 언급된 바와 같은 상기 다양한 가변 영역의 다양한 조합은 온전한 항체 및 scFV 등을 포함하는 다양한 형태의 항체로 사용될 수 있다.
CDR
본 명세서에 개시된 상기 항체는 하나 이상의 CDR이 그래프트, 삽입 및/또는 연결된 폴리펩타이드이다. 일 구현예에서, 상기 항체는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 가질 수 있다. 따라서, 상기 항체는 예를 들어, 하나의 중쇄 CDR1 ("CDRH1"), 및/또는 하나의 중쇄 CDR2 ("CDRH2"), 및/또는 하나의 중쇄 CDR3 ("CDRH3"), 및/또는 하나의 경쇄 CDR1 ("CDRL1"), 및/또는 하나의 경쇄 CDR2 ("CDRL2"), 및/또는 하나의 경쇄 CDR3 ("CDRL3")을 가질 수 있다.
가변 영역에서 항체의 상보적 결정 영역 (complementary determining region, CDR) 및 프레임 영역 (frame region, FR)에 해당하는 상기 아미노산 서열의 위치는 Kabat (Kabat et al., (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”), Chothia (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) 또는 OPAL 라이브러리와 관련된 방식 (Hye Young Yang et. al., 2009 Mol. Cells 27: 225) 에 의해 결정될 수 있다. 각 정의에 의해 결정된 상기 CDR은 서로 비교하면, 중첩되거나 하나가 다른 하나를 포함하는 서브세트일 수 있다. 그러나, 본 명세서에는, 상기 각 방법에 의해 정의되는 모든 CDR이 본원의 범위에 포함된다. 상기 분야의 통상의 기술자라면 항체의 가변영역 서열이 주어지면, 여기에서 상기 각 정의에 의한 CDR 서열을 용이하게 선택할 것이다.
일 구현예에서, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄에 포함될 수 있는 CDR은 표 1a 내지 표 1f에 개시되어 있다 (또는 중쇄 CDRH1은 서열번호 1 내지 4에서 선택된 어느 하나로 나타내고, CDRH2는 서열번호 5 내지 9 및 68에서 선택된 어느 하나로 나타내고, CDRH3은 서열번호 10 내지 14에서 선택된 어느 하나로 나타내고, CDRL1은 서열번호 15 내지 19에서 선택된 어느 하나로 나타내고, CDRL2는 서열번호 20 내지 24 및 69에서 선택된 어느 하나로 나타내고, CDRL3은 서열번호 25 내지 29에서 선택된 어느 하나로 나타낸다).
일 구현예는 또한 표 1a 내지 표 1f에 개시된 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열과 실질적인 서열 동일성을 가지는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 실질적인 동일성은 서열 변이가 존재하는 본 명세서에 개시된 효과를 유지하는 것을 의미한다.
상기 자연적으로 또는 비자연적으로 생기는 항체의 CDR의 구조 및 특징은 앞서 언급한 바와 같다. 간단하게, 전형적인 항체에서, 상기 CDR은 항원 결합 및 인식에 관여하는 영역으로 구성된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크로 구성된다. 상기 가변 영역은 프레임워크 내에 3개의 중쇄 CDR 및/또는 3개의 경쇄를 포함한다. 상기 CDR은 결정될 수 있고 상기 아미노산 잔기는 Kabat 정의 (Kabat et al., (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"), Chothia (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) 또는 OPAL 라이브러리와 관련된 방식 (Hye Young Yang et. al., 2009 Mol. Cells 27: 225)에 따라 중쇄 및 경쇄 또는 그들의 가변 영역에서 번호가 매겨질 수 있다. 그러나, 본 명세서에 개시된 상기 CDR은 항체 결합 도메인의 전형적인 항체 구조를 정의하기 위해 사용되고, 또한, 본 명세서에 개시된 바와 같이, 다른 다양한 폴리펩타이드 구조에 포함되어 사용될 수 있다.
상기 분야의 통상의 기술자라면 항체가 본 명세서에 개시된 하나 이상의 CDR을 포함하는 경우, 개시된 각각의 CDR은 서로 독립적으로 선택되고 조합될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 항체는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 독립적으로 선택된 CDR을 갖는다. 또한, 상기 분야의 통상의 기술자라면 조합을 위해 상기 CDR이 선택될 때, 같은 종류의 CDR이 반복적으로 사용되지 않으며, 예를 들어, 상기 항체는 일반적으로 두 개의 CDRH2 영역을 포함하여 제조되지 않는다는 것을 알 수 있을 것이다.
단일 클론 항체
본 명세서에 개시된 상기 항체는 B7-H3에 결합하는 단일 클론 항체를 포함한다. 특히, B7-H3 세포 외 영역을 특이적으로 인식하는 인간 단일 클론 항체를 포함하며, 마우스 및 원숭이 B7-H3에 대한 교차반응성을 나타낸다.
상기 단일 클론 항체는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 항원에 대해 다양한 친화도를 가지는 다양한 항체와 같이 다른 특성을 가지고 있는 항체 제조 기술이 공지되어 있다. 이 기술은, 예를 들어, 파지 디스플레이 (phage display)라고 하는 필라멘트 박테리오파지의 표면에 면역 글로불린 가변 영역 유전자 레퍼토리를 표시하여 수행하는 체인 셔플링 (chain shuffling)이다. 예를 들어, 본 명세서 실시예에 개시된 것을 참고하거나, 추가적인 기술은, Marks et al. 1991, J.Mol.Bio. 222:581-597; Marks et al., 1992, BioTechnology 10:779-783에 기재된 것을 참조할 수 있다.
또한, 상기 단일 클론 항체를 상기 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 형질전환 동물로부터 수집된 비장세포 (splenocyte)를 불멸화시켜 (immortalizing)시켜 생산할 수 있다. 상기 비장세포는 상기 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여, 예를 들어, 이를 골수종 세포 (myeloma cell)와 융합시켜 하이브리도마를 생성하여 불멸화될 수 있다. 상기 하이브리도마-생산 융합 과정에 사용하기 위한 상기 골수종 세포는 바람직하게는 비-항체-생산성이고, 높은 융합 효율을 가지고, 특정 효소가 결여되어 이들이 목적하는 융합 세포 (하이브리도마)만의 성장을 지원하는 특정의 선택 배지 중에서 성장을 할 수 없게 한다. 마우스 융합에 사용되는 적절한 세포주의 예는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XXO Bul를 포함하고, 랫트 융합에 사용되는 세포주의 예는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210를 포함한다. 세포 융합을 위해 사용되는 다른 세포주에는 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6를 포함할 수 있다. 몇몇의 경우에는, 하이브리도마 세포주는 동물 (예를 들어, 인간 면역글로불린 서열을 가지는 형질전환 동물, B7-H3 면역원에 의해 면역화된 동물)로부터 비장 세포를 수집하여 생성되고; 수집된 비장 세포를 골수종 세포에 융합하여 하이브리도마를 생성하고; 하이브로도마 세포로부터 하이브리도마 세포주를 확립하고, B7-H3에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인한다. 하이브리도마 세포주에 의해 분비된 상기 단일 클론 항체는 상기 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 정제할 수 있다.
키메라 항체
상기 항체는 다양한 목적을 위해 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 키메라 항체는 상이한 항체로부터 유래된 폴리펩타이드 단편들이 공유결합으로 연결되어 면역학적으로 기능적인 경쇄, 중쇄 또는 그 단편을 형성하는 항체이다. 일반적으로, 상기 키메라 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부분은 특정 종 또는 특정 강 또는 서브타입에 속하는 서열이고, 나머지 서열은 다른 종 또는 다른 강 또는 서브타입에 속한다. 키메라 항체의 제조방법에 대하여, 예를 들어, U.S. patent 제 4,816,567 호; 및 Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855를 참조할 수 있다. CDR 이식 (grafting)은, 예를 들어, U.S. patent 제 6,180,370 호, 제 5,693,762 호, 제 5,693,761 호, 제 5,585,089 호 및 제 5,530,101 호를 참조할 수 있다.
일반적으로, 키메라 항체를 제조하는 목적은 항체가 사용되는 생물체에서 발견되는 아미노산의 수를 최대화하는 것이다. 일 예는 “CDR-이식 (CDR-grafted)” 항체인데, 상기 항체는 특정 한 종 또는 특정 강 또는 서브타입 유래의 하나 이상의 CDR을 포함하며, 나머지 부분은 다른 종, 또는 다른 강 또는 서브타입 항체에서 유래된다. 예를 들어, 인간에 사용하기 위해, 설치류 항체의 가변 영역 또는 CDR을 대체하게 대체하게 되거나 또는 그 반대일 수 있다.
또한, 일 구현예에서, 인간 이외의 종으로부터 유래한 불변 영역은 인간 유래의 가변 영역과 조합된 하이브리드 항체가 사용될 수 있다.
완전 인간 항체
완전 인간 항체 또한 개시된다. 특정 항원에 특이적인 완전 인간 항체는 인간을 항원에 노출시키지 않고 제조할 수 있다.
상기 완전 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리 (phage-display library)로부터 유래될 수 있다 (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). 상기 파지 디스플레이 기술은 필라멘트 (filamentous) 박테이로파지의 표면에서 항체 레퍼토리를 표시하고 그로부터 타겟 항원 (targeting antigen)에 결합하는 파지를 분류하는 일종의 면역 선택을 모방한 방법이다. 이러한 기술은 본 명세서의 실시예 또는 PCT 공개공보 제 WO 99/10494 호를 참조할 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서의 상기 완전 인간 B7-H3 항체는 상기 파지 디스플레이 방법을 통해 선별된다. 이 기술은 본 명세서의 실시예 또는 PCT 공개공보 제 WO 2005/012359 호를 참조할 수 있다.
완전 인간 항체를 제조하는 다른 방법은 마우스 체액성 면역계를 “인간화 (humanizing)”하는 것이다. 내인성 Ig 유전자는 활성화되지 않은 마우스에 인간 면역글로불린 (Ig) 유전자 좌위 (loci)를 도입하여, 상기 마우스에서 완전 인간 단일 클론 항체 (mAb)를 생성할 수 있다. 만약, 상기 완전 인간 항체를 사용하면, 마우스 또는 마우스에서 유래된 mAb를 인간에 투여하여 유발될 수 있는 면역원성 반응 및 알레르기 반응을 최소화할 수 있다. 이러한 완전 인간 항체는 내인성 면역글로불린 생성이 결핍되어 인간 항체를 생성할 수 있는 형질전환 동물 (통상적으로, 마우스)을 면역화시켜 생성될 수 있다. 이러한 목적을 위한 항원은 전형적으로, 6개 또는 그 이상의 연속적인 아미노산을 갖고, 임의로 담체, 예를 들어, 합텐 (hapten)에 접합된다. 예를 들어, 다음을 참조할 수 있다; Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; 및 Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. 일 예로, 이러한 방법에서, 상기 형질전환 동물은 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬을 코딩하는 내인성 마우스 면역 글로불린 유전자 좌위를 무력화시키고 인간 중쇄 및 경쇄 단백질을 코딩하는 인간 게놈 DNA를 포함하는 자위 단편을 삽입하여 생성된다. 부분적으로 인간 면역 글로불린 유전자 좌위를 포함하는 부분적으로 변형된 마우스를 교차 결합시켜, 완전 인간 면역 글로불린 유전자가 도입된 마우스가 생성된다. 상기 동물에 면역원 (immunogen)이 투여되면, 상기 면역원에 면역 특이적이지만 가변 영역을 포함한 항체가 뮤린 (murine)이 아닌 인간 아미노산 서열을 가진다. 이러한 방법은 예를 들어, WO96/33735 및 WO94/02602를 참조한다. 인간 항체를 제조하기 위한 형질전환 마우스에 관련된 방법은 미국 특허 제 5,545,807 호; 제 6,713,610 호; 제 6,673,986 호; 제 6,162,963 호; 제 5,545,807 호; 제 6,300,129 호; 제 6,255,458 호; 제 5,877,397 호; 제 5,874,299 호 및 제 5,545,806 호; 제 WO91/10741 호, 제 WO90/04036 호, 및 EP 제 546073B1 호를 참조할 수 있다.
이어서, 하이브리도마 기술을 사용하여, 목적하는 특이성을 갖는 항원-특이성 인간 mAb가 유전자도입 마우스, 예를 들어, 앞서 기술된 것들로부터 생성되고 선택될 수 있다. 이러한 항체는 적절한 벡터 및 숙주세포를 사용하여 클로닝되고 발현되거나, 또는 상기 항체는 배양된 하이브리도마 세포로부터 수집될 수 있다.
항체의 다양한 형태
본 명세서에 개시된 상기 항체는 또한 본 명세서에 개시된 상기 항체의 변이체이다. 예를 들어, 항원의 일부는 상기 개시된 중쇄 또는 경쇄, 가변 영역 또는 CDR 서열의 잔기 중 하나 이상에 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 상기 보존적 아미노산 치환은 폴리펩타이드 또는 항원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 치환을 의미한다. 일 구현예에서, 상기 보존적 아미노산 치환은 하기 아미노산 분류 중 동일한 분류에 속하는 다른 잔기로의 치환을 지칭한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 다음과 같은 측쇄 특성의 공통 특성에 따라 분류될 수 있다: 1) 소수성: 노르류신 (norleucine), 메티오닌 (Met), 알라닌 (Ala), 발린 (Val), 류신 (Leu), 이소류신 (Ile); 2) 중성, 친수성: 시스테인 (Cys), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 아스파라긴 (Asn), 글루타민 (Gln); 3) 산성: 아스파르산 (Asp), 글루탐산 (Glu); 4) 기본: 히스티딘 (His), 라이신 (Lys), 아르기닌 (Arg); 5) 사슬 방향에 영향을 미치는 잔기: 글라이신 (Gly), 프롤린 (Pro); 및 6) 방향족성: 트립토판 (Trp), 타이로신 (Tyr), 페닐알라닌 (Phe).
상기 보존적 아미노산 치환은 상기 분류에서 동일한 분류에 속하는 다른 잔기로의 치환을 의미한다. 상기 보존적 아미노산 치환은 또한 펩타이드 모방체와 같은 비-자연적-발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 이 잔기는 일반적으로 세포가 아닌 화학적 합성에 의해 도입된다.
보존적 아미노산 치환의 제한 없는 예시는 표 3에 나타내었다.
보존적 아미노산 치환
원래 잔기 예시적 치환
알라닌 (Ala) 세린 (Ser)
아르기닌 (Arg) 라이신 (Lys)
아스파라긴 (Asn) 글루타민 (Gln), 히스티딘 (His)
아스파르산 (Asp) 글루탐산 (Glu)
시스테인 (Cys) 세린 (Ser)
글루타민 (Gln) 아스파라긴 (Asn)
글루탐산 (Glu) 아스파르산 (Asp)
글라이신 (Gly) 프롤린 (Pro)
히스티딘 (His) 아스파라긴 (Asn), 글루타민 (Gln)
이소류신 (Ile) 류신 (Leu), 발린 (Val)
류신 (Leu) 이소류신 (Ile), 발린 (Val)
라이신 (Lys) 아르기닌 (Arg), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu)
메티오닌 (Met) 류신 (Leu), 이소류신 (Ile)
페닐알라닌 (Phe) 메티오닌 (Met), 류신 (Leu), 타이로신 (Tyr)
세린 (Ser) 트레오닌 (Thr)
트레오닌 (Thr) 세린 (Ser)
트립토판 (Trp) 타이로신 (Tyr)
타이로신 (Tyr) 트립토판 (Trp), 페닐알라닌 (Phe)
발린 (Val) 이소류신 (Ile), 류신 (Leu)
비 보존적 치환은 상기 분류 중 다른 분류에 속하는 잔기로의 치환을 포함한다. 이러한 치환은 인간 항체와 상동성인 항체 영역 또는 비상동성 영역에 도입될 수 있다.이러한 치환을 도입하기 위해, 일 구현예에서, 아미노산의 소수성 또는 친수성을 나타내는 지수 (친수성 지수)를 고려할 수 있다. 단백질의 상기 지수 프로필 (수치 요법 프로필)은 각 아미노산의 지수를 지정한 다음, 이러한 값을 반복적으로 평균하여 계산한다. 상기 각 아미노산의 지수는 하기와 같이 소수성과 전하 특성을 기준으로 지정된다: 이소류신 (isoleucine) (+4.5); 발린 (valine) (+4.2); 류신 (leucine) (+3.8); 페닐알라닌 (phenylalanine) (+2.8); 시스테인/시스틴 (cysteine/cystine) (+2.5); 메티오닌 (methionine) (+1.9); 알라닌 (alanine) (+1.8); 글라이신 (glycine) (-0.4); 트레오닌 (threonine) (-0.7); 세린 (serine) (-0.8); 트립토판 (tryptophan) (-0.9); 타이로신 (tyrosine) (-1.3); 프롤린 (proline) (-1.6); 히스티딘 (histidine) (-3.2); 글루탐산 (glutamate) (-3.5); 글루타민 (glutamine) (-3.5); 아스파르산 (aspartate) (-3.5); 아스파라긴 (asparagine) (-3.5); 라이신 (lysine) (-3.9); 및 아르기닌 (arginine) (-4.5). 단백질에 상호 작용적인 생물학적 기능을 부여하기 위해 지수 프로필의 중요성은 상기 기술 분야에 공지되어 있다 (Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). 특정 아미노산이 유사한 수치 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 상기 유사한 생물학적 활성이 유지될 수 있다는 것이 알려져있다. 일 구현예에서, 상기 지수를 기반으로 변경을 수행하기 위해, 지수가 ±2, in ±1, 또는 ±0.5에 있는 치환을 포함한다.
또한, 유사 아미노산 간의 치환, 특히, 치환에 의해 생성된 단백질이 본 명세서에 기재된 바와 같은 면역학적 활성을 갖는 단백질인 경우, 친수성을 기준으로 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 가까운 아미노산의 친수성에 의해 결정되는 단백질의 최대 국소 평균 천수성 값은 면역원성 및 항원 결합 특성과 같은 단백질의 생물학적 특성과 관련된다.
아미노산 잔기의 친수성 값은 하기와 같다: 아르기닌 (arginine) (+3.0); 라이신 (lysine) (+3.0); 아스파르산 (aspartate) (+3.0±1); 글루탐산 (glutamate) (+3.0±1); 세린 (serine) (+0.3); 아스파라긴 (asparagine) (+0.2); 글루타민 (glutamine) (+0.2); 글라이신 (glycine) (0); 트레오닌 (threonine) (-0.4); 프롤린 (proline) (-0.5±1); 알라닌 (alanine) (-0.5); 히스티딘 (histidine) (-0.5); 시스테인 (cysteine) (-1.0); 메티오닌 (methionine) (-1.3); 발린 (valine) (-1.5); 류신 (leucine) (-1.8); 이소류신 (isoleucine) (-1.8); 타이로신 (tyrosine) (-2.3); 페닐알라닌 (phenylalanine) (-2.5) 및 트립토판 (tryptophan) (-3.4). 유사한 친수성 값을 근거로 치환을 하는 경우, 일 구현예에서, 친수성 값이 ±2 내, ±1 내, 또는 ±0.5 내에 있는 아미노산 치환이 포함된다. 또한, 친수성에 기초하여 상기 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 식별할 수도 있다. 또한, 이들 영역은 “에피토프 코어 영역”으로 지칭된다.
상기 기술분야의 통상의 기술자라면 공지된 기술을 사용하여 본 명세서에 개시된 상기 폴리펩타이드의 적절한 변이체를 결정할 것이다. 상기 기술분야의 통상의 기술자라면 상기 폴리펩타이드에서 활성에 중요한 것으로 생각되지 않는 영역을 변이체의 타겟팅하여, 활성을 파괴하지 않으면서도 단백질을 변화시킬 수 있는 부위를 찾아낼 것이다. 상기 기술분야의 통상의 기술자라면 또한 유사한 폴리펩타이드 사이에서 보존되는 잔기 또는 부분을 식별할 것이다. 또한, 다른 구현예에서, 생물학적 활성 또는 구조에 중요한 것으로 생각되는 부분에 대해, 상기 보존적 아미노산 치환이 생물학적 활성을 파괴하거나 폴리펩타이드 구조에 부정적인 영향을 주지 않고 수행될 수 있다.
나아가, 상기 기술분야의 통상의 기술자라면 유사한 폴리펩타이드에서 활성 또는 구조에 중요한 잔기를 식별하기 위해 구조-기능적인 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석을 통해, 이와 유사한 단백질의 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 잔기를 찾아, 목적하는 단백질에서 중요한 아미노산 잔기를 예측할 수 있다. 상기 기술분야의 통상의 기술자는 이렇게 예측된 중요한 아미노산 잔기를 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환할 수 있다.
상기 기술분야의 통상의 기술자는 또한, 상기 유사한 폴리펩타이드의 3차원 구조 및 이와 관련된 아미노산 서열 분석을 기반으로 항체의 3차원 구조와 관련된 아미노산 잔기를 예측할 수 있다. 상기 기술분야의 통상의 기술자는 단백질 표면에 존재하는 것으로 예측되는 상기 아미노산 잔기가 다른 분자와 중요한 상호작용에 관여할 수 있기 때문에 급격한 변화를 도입하지 않는다. 게다가, 상기 기술분야의 통상의 기술자는 각각의 목적하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 포함하는 시험 변이체를 생성할 수 있다. 이들 변이체는 이후, 항원에 대한 결합력을 이용하여 스크리닝되어, 어떤 아미노산 치환이 목적에 부합되는지에 대한 정보를 얻을 수 있다. 이러한 정보를 이용하여, 상기 기술분야의 통상의 기술자는 치환이 될 수 있는 위치, 회피되어야 할 위치를 용이하게 결정할 수 있다.
또한, 단백질의 2차 구조를 근거로 치환되는 위치를 결정할 수 있다. 예를 들어, 2차 구조를 예측하는 한 가지 방법은 상동성 모델링 (homology modeling)에 기초한다. 예를 들어, 30% 초과의 서열 동일성 또는 40& 초과의 유사성을 갖는 2개의 폴리펩타이드 또는 단백질은 유사한 구조적 위상을 가질 수 있다 (Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247). 2차 구조를 예측 하는 추가적인 방법에는 "트레딩 (threading)" (Jones, 1977, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "프로필 분석 (profile analysis)" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), 및 "진화적 연쇄 (evolutionary linkage)" (Holm, 1999, ibid; and Brenner, 1997, ibid) 가 포함된다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 민감성 감소, (2) 산화에 대한 민감성 감소, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도 변경, (4) 항원 결합 친화도 변경 및/또는, (5) 단백질에 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하도록 변경을 수행한다. 예를 들어, 보존적 치환을 포함하는 단일 또는 복수개의 아미노산 치환은 항체에서, 분자간 접촉에 관여하는 도메인이 아닌, 그 외의 부분에서 치환을 수행할 수 있다. 이러한 구현예에서, 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는 상기 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 항체의 2차 구조를 변화시키지 않는 하나 이상의 아미노산으로의 치환이 사용될 수 있다. 상기 기술 분야에 공지된 폴리펩타이드 2차 및 3차 구조의 예는 Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; 및 Thornton et al., 1991, Nature 354:105)를 참조할 수 있다.
추가의 바람직한 항체 변이체는, 모 서열 내에서 하나 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나 상기 시스테인 잔기가 세린과 같은 다른 아미노산으로 치환된 변이체가 포함된다. 상기 시스테인 변이체는, 특히, 항체가 생물학적 활성을 갖는 구조로 다시 폴딩 (folding)되어야 할 때 유용하다. 상기 시스테인 변이체는 모 항체와 비교하여 적은 수의 시스테인 잔기를 가질 수 있고, 짝이 없는 시스테인으로 인한 상호작용을 최소화시키기 위해 일반적으로 짝수로 포함된다.
본 명세서에 개시된 상기 중쇄 및 경쇄, 가변 영역 도메인 및 CDR은 B7-H3에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 표 4에 개시된 CDR 중의 하나 이상은 폴리펩타이드와 같은 분자에 비공유 또는 공유 결합되어, 면역 접착 분자 (immunogenic adhesion molecule)로 사용될 수 있다. 이러한 면역 접착 분자는 CDR이 큰 폴리머 내에 통합된 것이나, CDR이 다른 폴리펩타이드에 연결된 것일 수 있다. 이러한 면역 접착 분자는 이에 연결된 폴리펩타이드 또는 기타 물질을 목적하는 항원, 예를 들어, B7-H3 또는 에피토프에 특이적 결합을 가능하게 한다.
본 명세서에 개시된 가변 영역 및 CDR에 기초한 펩타이드 모방체가 또한 제공된다. 이러한 모방체는 펩타이드, 비-펩타이드, 또는 펩타이드 및 비-펩타이드의 조합일 수 있고, 하기를 참조할 수 있다: Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; 및 Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229. 하나의 유용한 폴리펩타이드와 구조적으로 유사한 펩타이드 모방체는 상기 원래의 폴리펩타이드와 유사한 효과를 가진다. 이러한 화합물은 컴퓨터 분자 모델링 (computerized molecular modeling)을 이용하여 개발될 수 있다. 일반적으로, 상기 펩타이드 모방체는 본 명세서의 B7-H3에 특이적으로 결합하는 능력을 나타내는 항체와 구조적으로 유사하지만, 하나 이상의 펩타이드 결합은 사기 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH- (cis 및 trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 CH2SO-으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합으로 대체될 수 있다. 더 안정적인 단백질의 생산을 위해, 하나 이상의 보존 서열의 잔기를 동일한 유형의 D-아미노산 (예를 들어, L-라이신 대신 D-라이신)으로 치환될 수 있다. 또한, 펩타이드를 고리화할 수 있는 분자는 내부에 가교 (crosslink) 형성 시스테인 잔기를 도입하여 보존 서열에 구조적으로 제한을 가하는 펩타이드를 생성할 수 있다 (Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387).
본원은 또한 본 명세서에 개시된 상기 항체의 유도체를 제공한다. 상기 유도화된 항체는 상기 항체 또는 그 단편에 목적하는 특성, 예를 들어, 특정 용도에서 증가된 반감기를 제공하는 임의의 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 상기 유도화된 항체는 검출 가능한 (또는 표지) 잔기 (예: 방사성, 비색계, 항원성 또는 효소 분자에 결합하는 분자, 검출 가능한 비드 (예: 자기 비드 또는 전자 밀도 (예: 금) 비드)), 또는 다른 분자 (예: 바이오틴 (biotin) 또는 스트렙타비딘 (streptavidin)), 치료적 또는 진단적 잔기 (예: 방사성, 세포독성, 또는 약학적 활성 잔기), 또는 특별 용도에 대한 항체의 적합성을 증가시키는 분자 (예를 들어, 피험자에게 투여, 예를 들어, 인간 피험자, 또는 기타 생체 내 시험관 내 사용)를 포함할 수 있다. 항체를 유도화시키는데 사용되는 분자의 예에는, 알부민 (예: 인간 세럼 (serum) 알부민) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다. 상기 항체의 알부민 결합 및 페길화된 (pegylated) 유도체는 상기 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 일 구현예에서, 페길화된 단쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 항체는 트랜스타이레틴 (transthyretin, TTR) 또는 TTR 변이체에 접합되거나 연결될 수 있다. 상기 TTR 또는 TTR 변이체는, 예를 들어, 덱스트란 (dextran), 폴리(n-비닐 피롤리돈) (poly(n-vinyl pyrrolidone)), 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol), 프로필렌 글리콜 단독중합체 (propropylene glycol homopolymer), 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체 (polypropylene oxide/ethylene oxide copolymer), 폴리옥시에틸화 폴리올 (polyoxyethylated polyol) 및 폴리비닐 알코올 (polyvinyl alcohol)로 이루어진 군에서 선택된 화학물질로 화학적으로 변형될 수 있다.
다른 유도체는, 예를 들어, B7-H3 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 이종 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 융합 단백질의 발현에 의해 제조될 있는 B7-H3 결합 단백질 및 다른 단백질 또는 폴리펩타이드의 공유 또는 응집 접합체를 포함한다. 예를 들어, 상기 접합된 펩타이드는 이종 신호 (또는 리더) 폴리펩타이드, 예를 들어, 효모 알파-인자 리더, 또는 펩타이드, 예를 들어, 에피토프 태그일 수 있다. 상기 B7-H3 항체-포함 융합 단백질은 B7-H3 결합 단백질 (예: 폴리-His)의 정제 또는 식별을 용이하게 하기 위해 추가된 펩타이드를 포함할 수 있다. B7-h3 결합 단백질은 또한 Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204; 및 미국 특허 제 5,011,912 호에 개시된 바와 같은 FLAG 펩타이드에 연결될 수 있다. 상기 FLAG 펩타이드는 항원성 (antigenicity)이 뛰어나, 특정 단일 클론 항체 (mAb)에 의해 가역적으로 결합될 수 있는 에피토프로 작용하여, 재조합 단백질의 신속한 확인 및 용이한 정제를 가능하게 한다.
일 구현예에서, 이는 상기 B7-H3 결합 단백질에 융합된 펩타이드 잔기 사이의 공유 또는 비공유 상호 작용을 통해 결합되는 다수 B7-H3-결합 폴리펩타이드를 포함하는 올리고머 (oligomer)에 관한 것이다. 이 결합되는 펩타이드는 펩타이드 링커 (스페이서) 또는 올리고머화를 촉진하는 성질을 갖는 류신 지퍼와 같은 펩타이드일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 올리고머는 2개 또는 4개의 B7-H3 결합 단백질을 포함한다. 상기 올리고머의 상기 B7-H3 결합 단백질 잔기는 상기 언급한 바와 같은 임의의 형태, 예를 들어, 변형체 또는 단편일 수 있다. 바람직하게는, 상기 올리고머는 B7-H3 결합 활성을 갖는 B7-H3 결합 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 올리고머는 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩타이드를 사용하여 제조된다. 항체 유래 폴리펩타이드의 다양한 부위 (Fc 도메인을 포함)에 융합된 이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 제조는, 예를 들어, Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; 및 Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11를 참조할 수 있다. 다른 구현예는 상기 B7-H3 결합 단백질이 항체의 Fc 영역에 융합된 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체에 관한 것이다. 상기 이량체는 융합 단백질을 코딩하는 유전자 융합을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주세포에서 유전자 융합을 발현하고, 발현된 융합 단백질이 항체 분자와 유사하게 결합되도록 하여 제조될 수 있고, 이와 관련하여, 사슬 사이의 이황화 (disulfide) 결합은 Fc 잔기 사이에 형성되어 상기 이량체를 얻는다.
본 명세서에서 사용되는 상기 용어 “Fc 폴리펩타이드”는 항체의 Fc 영역으로부터 유래된 폴리펩타이드로 야생형 또는 돌연변이 형태를 포함한다. 이량체화를 촉진하는 힌지 (hinge) 영역을 포함하는 절단된 형태의 폴리펩타이드도 포함된다. Fc 잔기 또는 그로부터 형성된 올리고머를 포함하는 상기 융합 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피로 쉽게 분리할 수 있다는 장점이 있다.
적절한 Fc 폴리펩타이드의 예로는, 미국 특허 제 5,426,048 호 및 제 5,262,522 호, 제 5,457,035 호 및 Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001에 기재된 것을 들 수 있다. 이러한 돌연변이 단백질의 상기 아미노산 서열에서, 상기 야생형 아미노산 19번 잔기가 Leu에서 Ala로 치환되고, 아미노산 20번 잔기가 Leu에서 Glu로 치환되고, 아미노산 22번 잔기가 Gly에서 Ala로 치환된다. 상기 돌연변이 단백질에서, Fc 수용체에 대한 친화도가 감소된다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 B7-H3 결합 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄의 상기 가변 영역은 다른 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역으로 치환되어 들어갈 수 있다.
표지 및 효과기 그룹
일부 구현예에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 표지 (label)을 포함할 수 있다. “표지”는 임의의 검출가능한 물질을 의미한다. 적절한 표지 그룹의 예는 방사선 동위원소 또는 방사선 핵종 (예: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광성 그룹 (예: FITC, 로다민 (rhodamine), 란탄족 형광체 (lanthanoid fluorescent substance)), 효소 그룹 (예: 호스래디쉬퍼옥시데이즈 (horse radish peroxidase), β-갈락토시데이즈 (β-galactosidase), 루시퍼레이즈 (luciferase), 알칼리성 포스파테이즈 (alkaline phosphatase)), 화학발광성 그룹, 바이오티닐 그룹, 또는 2차 리포터에 의해 인식되는 특정 폴리펩타이드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열 (leucine zipper pair sequence), 2차 항체 결합 부위 (secondary antibody binding site), 금속 결합 도메인 (metal binding domain), 에피토프 태그 (epitope tag))를 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 표지화 그룹은 잠재적인 입체화 그룹은 잠재적인 입체 장애 (steric hinderance)를 감소시키기 위하여 다양한 길이의 스페이스 암 (space arm)을 통해 항체에 커플링된다. 단백질을 표지화하기 위한 다양한 방법은 상기 기술분야에 공지되어 있고, 상기 기술 분야의 통상의 기술자라면 특정 목적을 위해 적절한 표지 및 적절한 방법을 선택할 것이다.
상기 용어 “효과기 그룹”은 항체 또는 합성 물질에 결합되거나 접합되는 물질이다. 일 구현예에서, 상기 합성 물질은 치료용으로 기능하는 임의의 물질을 의미한다. 일 구현예에서, 적절한 치료용 물질의 예는 방사선 동위원소 또는 방사선 핵종 (예: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)과 같은 치료용 방사선 물질을 포함한다. 다른 적절한 예는 세포독성제 또는 항암제를 포함하고, 예를 들어, 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel), 아우리스타틴 (auristatin), 젤다나마이신 (geldanamycin), 아우리스타틴 (auristatin), 젤다나마이신 (geldanamycin), 메이탄신 (maytansine), 안트라사이클린 (anthracycline) 유도체, 칼리키아마이신 (Calicheamicin), 듀오카마이신 (Duocarmycin), 캄토테신 (Camptothecin), 아마니틴 (amanitin), 피롤로벤조다이아제핀 (pyrrolobenzodiazepines, PBD) 이량체, 1-(클로로메틸)-2,3-다이하이드로-1H-벤조[e]인돌 (1-(Chloromethyl)-2,3-dihydro-1H-benzo[e]indole, CBI) 이량체 및 CBI-PBD 이종이량체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 상기 효과기 그룹은 잠재적인 입체장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암을 통해 항체에 커플링된다.
일반적으로, 표지는 검출 방법에 따라 분류될 수 있다: a) 방사성 또는 동위원소 표지; b) 자기 표지 (예: 자기 입자); c) 산화-환원 활성 잔기; d) 광학 염료; 효소 그룹 (예를 들어, 호스래디쉬퍼옥시데이즈, β-갈락토시데이즈, 루시퍼레이즈, 알칼리성 포스파테이즈); e) 바이오티닐 그룹; 및 f) 2차 리포터에 의해 인식되는 특정 폴리펩타이드 에피토프 (예: 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체를 위한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등). 일부 구현예에서, 상기 표지화 그룹은 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암을 통해 항체에 커플링된다. 단백질을 표지화하기 위한 다양한 방법이 상기 기술분야에 공지되어 있다.
일 구현예에서, 상기 표지는 발색단 (chromophore), 형광체 (phosphor) 및 형광물질 (fluorescent substance)을 포함하는 광학 염료를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 형광체는 저분자 형광물질 또는 단백질성 형광물질일 수 있다.
“형광 표지 (fluorescent label)”는 물질이 가지는 형광 특성을 통해 검출될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 형광 표지의 예로는, 플루오레세인 (fluorescein), 로다민 (rhodamine), 테트라메틸로다민 (tetramethylrhodamine), 에오신 (eosin), 에리스로신 (erythrosine), 쿠마린 (coumarin), 메틸-쿠마린 (methyl-coumarin), 피렌 (pyrene), 말라카이트 그린 (malachite green), 스틸벤 (stilbene), 루시퍼 옐로우 (lucifer yellow), 케스케이드 블루 J (cascade blue J), 텍사스 레드 (texas red), IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC 레드 640, Cy 5, Cy 5.5, LC 레드 705, 오레곤 그린 (oregon green), 알렉사-플루오르 염료 (alexa-fluor dye) (알렉사 플루오르 350 (alexa-fluor 350), 알렉사-플루오르 430 (alexa-fluor 430), 알렉사-플루오르 488 (alexa-fluor 488), 알렉사-플루오르 546 (alexa-fluor 546), 알렉사-플루오르 568 (alexa-fluor 568), 알렉사-플루오르 594 (alexa-fluor 594), 알렉사-플루오르 633 (alexa-fluor 633), 알렉사-플루오르 647 (alexa-fluor 647), 알렉사-플루오르 660 (alexa-fluor 660), 알렉사-플루오르 680 (alexa-fluor 680)), 케스케이드 블루 (cascade blue), 케스케이드 옐로우 (cascade yellow) 및 R-피코에리쓰린 (R-phycoerythrin, PE), FITC,), Cy5, Cy5.5, 및 Cy7 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다양한 광학적 염료는 Molecular Probes Handbook, Richard P. Haugland를 참조할 수 있다.
상기 단백질 형광 표지 물질은 레닐라 (Renilla), 프틸로사르쿠스 (Ptilosarcus) 또는 에쿼리아 (Aequorea) 종의 GFP를 포함하는 녹색 형광 물질 (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP(Clontech Labs., Inc., Genbank Accession Number U55762), 청색 형광 단백질 (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canada; Stauber, 1998 Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), 향상된 노란 형광 단백질 (EYFP, Clontech Labs., Inc.), 루시퍼레이즈 (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β 갈락토시데이즈 (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
핵산
한 측면에서, 본원은 특정 혼상화 조건에서 본 명세서에 개시된 핵산에 혼동되는 핵산에 관한 것이다. 상기 핵산의 혼성화 방법은 상기 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6를 참조할 수 있다. 본 명세서에서, 엄격한 혼성화 조건은 5x 염화나트륨/구연산나트륨 (sodium chloride/sodium citrate, SSC)을 포함하는 전세척 용액, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0); 약 50% 포름아미드의 혼성화 완충제, 6x SSC, 및 55℃의 혼성화 온도 (또는 다른 유사한 혼성화 용액, 예를 들어, 50% 포름아미드를 포함하는 용액, 42℃의 혼성화 온도), 및 0.5x SSC, 0.1% SDS에서 60℃의 세척 조건을 사용한다. 상기 엄격한 혼성화 조건은 45℃에서 6x SSC, 그 이후에 68℃에서 0.1x SSC, 그리고 0.2% SDS에서 1회 이상의 세척에 의해 혼성화된다. 나아가, 상기 기술분야의 통상의 기술자는 서열 간에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 전형적으로 서로 혼성화된 상태를 유지하는데 필요한 적절한 혼성화 조건을 선택할 것이다.
혼성화 조건의 선택에 영향을 주는 기본 파라미터 및 적절한 조건은, 예를 들어, Sambrook, Fritsch, and Maniatis, (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 상기; 및 Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., section 2.10 및 6.3-6.4.를 참조할 수 있다. 이러한 조건은, 예를 들어, 핵산의 길이 및/또는 염기 조성 (A, G, C 및 T (U)의 구성) 등에 기초하여, 상기 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에 개시된 상기 핵산은 또한 돌연변이 변이체를 포함한다. 상기 핵산이 코딩하는 폴리펩타이드 (항체 또는 항체 유도체)의 아미노산 서열의 변화를 핵산의 돌연변이에 의해 유도할 수 있다. 상기 돌연변이는 상기 기술분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 도입될 수 있다. 예를 들어, 부위-지시된 돌연변이 유발 (site-directed mutagenesis) 방법, 무작위 돌연변이 유발 (random mutagenesis) 방법이 사용될 수 있다. 이렇게 제조된 상기 핵산 돌연변이는 목적하는 특징을 가지는 폴리펩타이드에 대하여 선별된다.
상기 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 현저하게 변화시키지 않으면서, 상기 돌연변이는 상기 핵산 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 비-필수 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유발하는 뉴클레오타이드 치환을 수행할 수 있다. 대안적으로, 상기 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 선택적으로 변화시키는 하나 이상의 돌연변이가 상기 핵산으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 상기 돌연변이는 생물학적 활성을 정량적으로 또는 정성적으로 변화시킬 수 있다. 상기 정량적인 변화의 예는 활성의 증가, 감소 또는 제거를 포함한다. 상기 정성적인 변화의 예는 항체의 항원에 대한 특이성 변화를 포함한다.
또한, 상기 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서, 예를 들어, 세포 내 발현을 위한 코돈 최적화를 위한 변이는 상기 핵산 내로 도입될 수 있다. 이 경우, 코돈의 중첩성 (degeneracy)으로 인해 상기 동일한 폴리펩타이드를 코딩하는 다수의 핵산이 제조될 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 상기 핵산은 상기 기술반야에 널리 공지된 분자 생물학 기술을 사용하여 아미노산 서열이 변경되도록 돌연변이화 될 수 있다.
다른 측면에서, 또한, 본원은 본 명세서세 개시된 상기 핵산 서열의 검출을 위한 프라이머 또는 혼성화 프로브로 사용하기에 적합한 핵산분자에 관한 것이다. 이러한 핵산은 전장 핵산 서열의 일부, 예를 들어, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 전장 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 단편, 또는 폴리펩타이드의 활성 부분 (B7-H3 결합 부분)을 코딩하는 단편 핵산을 포함할 수 있다.
상기 핵산 서열 기반으로 제조된 상기 프라미어 및 프로브는 본 명세서에 개시된 상기 핵산 또는 유사한 핵산, 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 전사체 (transcriptome)를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 이 프로브는 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 식별하는데 사용할 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 방사선 동위원소, 형광성 화합물, 효소 또는 효소 보조인자와 같은 표지물질에 의해 표지될 수 있다.
다른 측면에서, 또한, 본원은 상기 폴리펩타이드 또는 이의 일부분 (예를 들어, 하나 이상의 CDR 또는 하나 이상의 가변 영역 도메인을 포함하는 단편)을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 비-에피솜 포유동물 벡터 및 (재조합) 발현 벡터, CAR-T 세포 또는 CAR-NK 세포 치료제에 사용되는 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태의 핵산을 포함할 수 있다. 상기 재조합 발현 벡터는 발현에 사용되는 숙주세포 기반의 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 이러한 조절 서열은 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 상기 조절서열에는, 많은 종류의 숙주세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절할 수 있는, 예를 들어, SV40 초기 유전자 인핸서 (enhancer), 라우스 (Rous) 육종 바이러스 프로모터 (promoter) 및 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) 프로모터와 같은 프로모터; 또는 예를 들어, 특정 숙주세포 내에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는, 조직-특이적 조절 서열 (Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237), 및 특별한 처리 또는 조건에 반응하여 뉴클레오타이드 서열의 유도성 발현을 지시하는, 포유동물 세포에서 작용하는 메탈로티오닌 (metallothionein) 프로모터, 및 원핵생물 및 진핵생물 시스템 둘 다에서 작용하는 tet-반응성 및/또는 스트렙토마이신 반응성 프로모터를 포함한다. 상기 기술분야의 통상의 기술자라면 형질 전환 될 숙주세포의 종류, 타겟 단백질의 발현 정도와 같은 요인을 고려하여, 적절한 벡터 및 조절 서열을 선택할 것이다. 상기 선택된 발현 벡터는 숙주세포에서 전달될 수 있고, 본 명세서에 개시된 상기 핵산에 의해 코딩된 단백질의 생산에 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 본원은 재조합 벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 임의의 원핵생물 (예를 들어, E. coli) 또는 진핵생물 (예를 들어, 효모, 곤충, 또는 포유동물 세포)일 수 있다. 상기 벡터 DNA는 공지된 형질전환 또는 형질감염 (transfection) 기술을 통해 원핵생물 또는 진핵생물에 도입될 수 있다. 포유동물 세포에서 안정적인 형질감염의 경우 사용되는 발현 벡터의 종류 및 형질전환 기법에 따라 소수의 세포만이 형질감염에 의해 전달된 DNA를 그 게놈에 통합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 형질감염된 세포를 식별하고 선택하기 위하여, 일반적으로 항생제 내성 마커와 같은 선택 마커를 코딩하는 유전자가 목적하는 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 바람직한 선택 마커의 경우에는, 예를 들어, G418, 하이그로마이신 (hygromycin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate)에 대한 내성을 제공하는 약물이 포함된다. 목적하는 핵산이 안정적으로 도입된 상기 세포의 선별은 약물 처리를 통해 생존하는 세포만을 선택하여 달성될 수 있다.
치료 방법, 약학적 제형
항체를 사용한 치료방법도 제공된다. 일 구현예에서, 상기 항체는 환자에게 제공된다. 상기 항체는, 일 구현예에서, 암 세포 표면, 암 혈관 신생 혈관 또는 항원 제시 세포 (antigen presenting cell)에서 발현되는 인간 B7-H3에 결합하여 T 세포의 면역 체크 포인트를 억제하여, T 세포를 활성화시킨다. 상기 항체는 암세포 표면 또는 암 혈관 신생 혈관에서 발현되는 인간 B7-H3에 결합하여 암세포의 성장을 억제한다. 일 구현예에서, 상기 항체는 CAR-T 또는 CAR-NK 등과 같은 세포 치료제의 표면에서 발현되고, 상기 항체는 인간 B7-H3에 결합하여 상기 세포 치료제를 상기 암세포에 특이적으로 전달하여, 상기 암세포의 죽음을 유도한다. 일 구현예에서, 상기 항체는 항암 면역 항체와 조합하여 사용될 수 있고, 이로써 상기 T 세포의 활성을 통해 암을 억제할 수 있다.
치료적 유효량의 상기 항체 및 제약적으로 허용되는 희석제 (diluent), 담체 (carrier), 가용화제 (solubilizer), 유화제 (emulsifier), 보존제 (preservative) 및/또는 보충제 (supplement)를 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 또한, 예를 들어, 이러한 약학적 조성물을 투여하여 암 환자를 치료하는 방법을 포함한다. 본 명세서에서, 상기 피험자 또는 환자는 인간 환자를 포함한다.
허용되는 제형 물질은 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 독성이 없다. 특정 일 구현예에서, 치료적 유효량의 인간 B7-H3 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1: 항체의 제조
실시예 1-1: 항원의 제조
항-B7-H3 항체 제조를 위한 파지 디스플레이 (phage display) 수행에 사용되는 항원을 구매하여 사용하였다. 인간 B7-H3의 경우, NP_001019907.1의 아미노산 서열 1번 내지 461번을 포함하고 C 말단에 히스티딘-태그 (His tag)가 결합되어 있는 재조합 B7-H3 단백질 (2318-B3/CF, R&D Systems)을 사용하였다.
하기 실시예의 ELISA 분석, SPR 분석 또는 T 세포 활성 분석에 사용되는 항원을 하기와 같이 구매하여 사용하였다. 인간 B7-H3의 경우, NP_001019907.1의 아미노산 서열 1번 내지 451번을 포함하고, C 말단에 히스티딘-태그 (His-tag)가 결합되어 있는 재조합 B7-H3 단백질 (Sino Biological, 11188-H02H)과 C 말단에 인간 IgG1의 Fc 부분이 결합되어 있는 단백질 (Sino Biological, 11188-H02H)을 사용하였다.
실시예 1-2: 파지 라이브러리 (phage library) 스크리닝을 통한 항체 선별 제조
라이브러리 파지의 제조
다양한 항원에 대한 결합 가능성을 가지고 있는 인간 유래 scFv (단쇄 가변 단편) 라이브러리 (Mol. Cells OT, 225-235, February 28, 2009) 유전자를 가진 대장균 (E. coli)을 2X YT (Amresco, J902-500G), 암피실린 (ampicillin)이 100μg/ml, 2%의 글루코스 (sigma, G7021)를 포함하는 배지에 2x1010개를 접종하여 37℃에서 2시간 내지 3시간동안 배양하여 OD600 값이 0.5 내지 0.7이 되도록 하였다. 배양된 대장균에 헬러 파지 (helper phage)를 감염시킨 후, 2X YT [2X YT, 암피실린 100 μg/ml, 1 mM IPTG (Duchefa, I1401)] 배지에 30℃에서 16시간 배양하여 파지 포장 (phage packaging)을 유도하였다. 이어서, 배양된 세포를 4℃, 4500rpm 조건에서 20분동안 원심분리 한 후, 4% PEG 8000 (sigma, P2139)과 3% NaCl (Samchun, S2097)을 상층액에 넣고 잘 녹인 후, 얼음 위에서 1시간동안 반응시켰다. 다시 4℃, 8000rpm 조건에서 원심분리 한 후, PBS (Phosphate buffered saline, Gibco 10010-023)를 펠릿에 첨가하여 현탁시켰다. 상기 현탁액을 4℃, 1200rpm 조건으로 10분간 원심분리 시킨 후, 상기 상등액을 새 튜브로 옮겨 사용시까지 4℃에서 보관하였다.
파지 디스플레이 (phage display)를 통한 패닝 (panning)
인간 B7-H3 단백질과 결합하는 항체를 선별하기 위해, 실시예 101의 히스티딘-태그 (His-tag)가 결합되어 있는 상기 재조합 B7-H3 단백질을 사용하여, 하기와 같이 패닝을 총 3회 진행하였다.
구체적으로, 면역시험관 (immunotube, maxisorp 444202)에 2μg/ml 농도의 재조합 인간 B7-H3 단백질을 1ml 첨가하여 37℃, 200rpm 조건에서 1시간 반응시켜 시험관 표면에 단백질을 흡착시켰다. 이후, 상등액을 제거하고, 3% 탈지유를 포함하는 용액을 시험관에 첨가하고 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 그러나, 상기 재조합 인간 B7-H3 단백질이 흡착되지 않은 상기 면역관 표면에 탈지유가 흡착되어, 비특이적 결합을 차단하였다. 상기 상등액을 제거한 후, 실시예 1-2에서 제조된 파지 라이브러리의 1012 CFU를 탈지유 3%를 포함하는 용액에 혼합하여, 면역검사에 투입하고, 37℃, 150rpm 조건에서 1시간동안 반응시켰고, 인간 B7-H3 단백질에 특이적인 파지가 항원에 결합하도록 하였다.
이이서, 비특이적으로 결합된 파지를 PBS-T (Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20) 용액으로 세척하여 제거하고, 상기 남아있는 항원 특이적 파지 항체를 100Mm 트리에틸아민 용액을 1ml 첨가하여 얻었다. 트리에틸아민 용액의 pH가 낮기 때문에 1M Tris 완충 용액 (pH 7.4)으로 중화시킨 후, OD600에서 0.8~1로 성장한 ER2537 대장균에 37℃, 120rpm 조건으로 1시간 30분동안 감염시켰다. 상기 배양액을 4℃, 4500rpm의 조건에서 15분간 원심분리 한 후 상기 상층액을 제거하고, 암피실린을 포함하는 2X YT 한천 배지에 감염된 대장균을 도말하여 37℃에서 16시간 이상 가라 앉힌 세포를 배양하였다. 다음 날, 상기 배양된 대장균을 모두 긁어내어 5ml의 2X YT 암피실린 배양액에 현탁하고, 50% 글리세롤을 첨가하여 일부는 -80℃에 보관하고, 나머지는 다음 실험을 위한 파지를 제조하는데 사용하였다. 암피실린을 포함하는 2X TB에 배양된 대장균 20μl를 접종하여 성장시킨 후, 헬퍼 파지를 감염시키고 실시예 2-1 및 2-2를 2회 더 반복하여, 인간 B7-H3 단백질 특이적 파지 풀 (phage pool)을 증폭 및 농축하였다.
단일 클론 스크리닝
상기 패닝을 통해 얻은 상기 파지 풀로부터 인간 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체를 선별하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 농축된 풀로부터 단일 클론을 분리하기 위해, LB-암피실린 한천 배지에 상기 파지 풀을 도말한 후 배양하여, 단일 콜로니를 얻었다. 이어서, 단일 클론을 웰당 200μl 슈퍼 브로스 (super broth, SB) 배지가 들어간 96-딥 웰 플레이트에 접종하고 밤새 배양하여, 일부를 다른 플레이트로 옮겨 세포 스톡을 만들었다. 남은 세포 배양액에 1Mm IPTG를 넣고, 30℃에서 16시간 배양하여 scFv 생성을 유도하였다. 상기 배양된 배양액을 4℃, 6000rpm 조건에서 원심분리 한 후, 상기 상등액을 버리고 세포만을 얻은 다음, TES 용액을 사용하여 세포를 용해시킨 후 다시 원심분리하여, 상등액만 얻어 사용하였다.
이어서, B7-H3-His 항원에 결합하는 가용성 단일 클론 scFv (2318-B3/CF, R&D Systems)를 발현하는 클론을 하기와 같은 ELISA 방법을 사용하여 선택하였다 (Steinberger. Rader and Barbas III. 2000. Phage display vectors. In: Phage Display Laboratory Manual. 1sted. ColdSpringHarborLaboratoryPress. NY. USA. pp.11.9-11.12). 구체적으로, 96-웰 플레이트 (96-well plate, Nunc-Immuno Plates, NUNC, Rochester, NY, USA)에 실시예 1에서 제조된 재조합 인간 B7-H3-his 단백질을 올려 놓고 4℃에서 밤새 흡착시켰다. 다음 날, PBST (Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20)로 상기 단백질을 세척한 후, 비특이적 결합을 방지하기 위해, 웰 당 200μl의 3% BSA를 포함하는 PBS 완충액을 넣고 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 이후, PBST로 다시 세착한 후, 미리 원심분리하여 준비한 파지가 포함된 상등액을 각 웰당 100μl를 넣고 37℃에서 약 1시간 동안 반응시켰다. 이후, PBST로 세척한 후, 인간 B7-H3에 결합된 파지를 검출하기 위해 상기 항-HA HRP (Horseradish peroxidase) 결합 항체 (Roche, 12 013 819 001)를 1% BSA를 포함하는 PBS에 1:5000으로 희석하여 웰당 100μl를 넣고 37℃에서 약 1시간동안 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 후, TMB (Tetramethylbenzidine, Thermo, 34028) 100μl를 넣어 발색시켰다. RT에서 5~10분간 반응시킨 후, 1N H2SO4 50ml를 넣어 반응을 종결시켰다. 450nm에서의 흡광도를 측정하여 값이 1.0 이상인 클론을 분류하였다.
이로부터, 상기 재조합 인간 B7-H3 단백질에 결합하는 7개 항체 클론 (B5, C41, D8G, F6V, 10F11, D8G M1 and D8G M3)을 선별하였고, 상기 각 항체의 중쇄 가변 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 CDR 서열은 하기 표와 같다.
클론 중쇄 가변 (Heavy Chain Variable, VH)의 CDR 서열 VH
CDRH1 CDRH2 CDRH3
서열 서열번호 서열 서열번호 서열 서열번호 서열번호
B5 DYAMS 1 SISSGSGSIYYADSVKG 5 NLIPLDY 10 30
C4I GYYMS 2 LISPSSGSIYYADSVKG 6 GLTKFDY 11 31
D8G SYSMS 3 GIYSDGSNTYYADSVKG 7 MLHRFDY 12 32
F6V DYAMS 1 GISPGGSNTYYADSVKG 8 DAWIARLLLFDY 13 33
10F11 SYGMS 4 GIYSGGSSKYYADSVKG 9 NRLRFDY 14 34
D8G M1 SYSMS 3 GIYSDASNTYYADSVKG 68 MLHRFDY 12 70
D8G M3 SYSMS 3 GIYSDASNTYYADSVKG 68 MLHRFDY 12 70
클론 경쇄 가변 (Light Chain Variable, VL)의 CDR 서열 VL
CDRL1 CDRL2 CDRL3
서열 서열번호 서열 서열번호 서열 서열번호 서열번호
B5 SGSSSNIGSNAVS 15 YNSHRPS 20 GSWDASLNAYV 25 35
C4I TGSSSNIGSNDVS 16 ANSHRPS 21 GSWDDSLSGYV 26 36
D8G SGSSSNIGSNSVT 17 ADSQRPS 22 GTWDSSLNAYV 27 37
F6V SGSSSNIGSNAVT 18 YNNKRPS 23 GTWDDSLSGYV 28 38
10F11 TGSSSNIGSNSVT 19 SDSHRPS 24 GTWDASLNAYV 29 39
D8G M1 SGSSSNIGSNSVT 17 ADSQRPS 22 GTWDSSLNAYV 27 37
D8G M3 SGSSSNIGSNSVT 17 ADVQRPS 69 GTWDSSLNAYV 27 71
상기 가변 영역 및 CDR 서열을 코딩하는 상기 핵산 서열은 B5, C41, D8G, F6V, 10F11, D8G M1, 및 D8G M3의 순서로 하기의 전장 핵산 서열로 구성되어 있다: 서열번호: 50 (중쇄) 및 55 (경쇄); 서열번호: 51 (중쇄) 및 56 (경쇄); 서열번호: 52 (중쇄) 및 57 (경쇄); 서열번호: 53 (중쇄) 및 58 (경쇄); 서열번호: 54 (중쇄) 및 59 (경쇄); 서열번호: 74 (중쇄) 및 57 (경쇄); 및 서열번호: 74 (중쇄) 및 75 (경쇄). 상기 핵산 서열 중 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 61 내지 63 (중쇄), 및 서열번호 65 내지 67 (경쇄)이었다.
실시예 2: 항 B7-H3 scFv의 전체 IgG 형태로 변환 및 이의 생산
실시예 2-1: 항 B7-H3 scFv의 전체 IgG 형태로의 클로닝
실시예 1에서 확보한 각각의 인간 B7-H3 특이적 단일 클론 항체 파지 항체를 전체 IgG 형태로 변환하기 위해, 실시예 1에서 확보한 각 클론의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 합성하였다 (Genotech, Korea). 중쇄 및 경쇄 불변 영역 (각각 서열번호: 60 and 64) 단백질의 인간 IgG1 서브타입을 코딩하는 유전자 (중쇄 불변 영역 서열 번호: 61(C41, D8G, 10F11, D8G M1, D8G M3 클론), 62(B5 클론), 63(F6V 클론) 및 경쇄 가변 영역 65(C41, D8G, 10F11, D8G M1, D8G M3 클론), 66(B5 클론) 및 67(F6V 클론))을 합성하여 상기 각 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산과 연결하였다. 각 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 상기 핵산을 각각 pcDNA 3.1 기반 발현 벡터에 클로닝하고, CHO-S 등의 포유동물 세포주에서 핵산 항체를 코딩하는 벡터를 얻었다. 또한, 기존의 항-B7-H3 항체인 Enoblituzumab을 비교군 항체로 사용하기 위해, 상기 항체의 가변 영역 서열을 특허 (US 8,802,091))로부터 얻고 상기 유전자를 확보하여, 상술한 방법과 동일하게 클로닝하여 84D로 명명하여 사용하였다.
IgG 형태의 항체는 B5, C41, D8G, F6V, 10F11, D8G M1, 및 D8G M3의 순서대로 하기 중쇄 및 경쇄 전장 서열로 개시되었다: 서열번호: 50 (중쇄) 및 55 (경쇄); 서열번호: 51 (중쇄) 및 56 (경쇄); 서열번호: 52 (중쇄) 및 57 (경쇄); 서열번호: 53 (중쇄) 및 58 (경쇄); 서열번호: 54 (중쇄) 및 59 (경쇄); 서열번호: 74 (중쇄) 및 57 (경쇄); 및 서열번호: 74 (중쇄) 및 75 (경쇄).
실시예 2-2: 항-B7-H3 항체의 발현
상기 항-B7-H3 항체의 발현은 Theremo 사에서 개발한 ExpiCHO-S™ (Thermo Fisher, A29127) 세포를 사용하고, ExpiCHO™ Expression System Kit (Thermo Fisher, A29133)의 프로토콜에 준수하여 상기 항체의 발현을 수행하였다.
제조방법을 간략히 설명하면, ExpiCHO-S 세포는 8% CO2, 37℃ 조건의 진탕 배양기 (shaking incubator)에서 120rpm의 조건에서 배양되었다. 형질 감염 당일, ExpiCHO-S 세포를 6*106 세포/ml의 세포 농도로 ExpiCHO™ 발현 배지 (Thermo Fisher, A2910001)를 첨가하여 희석하고 제조하였다.
이어서, 실시예 2-1의 상기 중쇄 및 경쇄를 발현하는 각 벡터를 각각 배지 ml당 1㎍씩 OptiPRO™ SFM 배지 (Thermo Fisher, 12309050)에 희석하고, ExpiFectamine™ 발현 시스템에 포함되어 있는 ExpiFectamine™CHO를 ml당 3.2㎍를 OptiPRO™ SFM 배지에 희석시켰다. 상기 벡터 및 ExpiFectamine™CHO 혼합물을 혼합하여 상온에서 5분간 반응시킨 후, 상기 준비된 세포에 혼합물을 넣어 8% CO2, 37℃, 120rpm 조건으로 20시간 배양하였다. 20시간동안, 2.2 μl/ml 및 240 μl /ml의 Enhencer1을 첨가한 후, ExpiCHO™ 발현 시스템 키트 (Thermo Fisher, A29133)에 포함된 ExpiCHO™ Feed를 각각 세포에 첨가하고, 8% CO2, 37℃, 120rpm의 조건에서 7일 내지 10일동안 배양하였다.
배양 후, 상기 세포 배양액을 4℃, 6000rpm의 조건에서 30분간 원심분리 한 후, 상기 상층액을 분리하여 냉장보관하였다.
실시예 2-3: 항-B7-H3 항체의 분리 및 정제
평형 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM NaCl)을 Mab 선택기 (GE healthcare, 5 ml)에 통과시켜 평형화 시킨 후, 실시예 2-2의 상기 배양액을 컬럼 (Mab selectsure (GE healthcare, 5 ml))에 통과시켜 발현된 항체가 컬럼에 결합하도록 하였다. 이 후, 50mM Na-citrate (pH 3.4), 100mM NaCl 용액으로 용출시킨 후, 1M Tris-HCl (pH 9.0)을 이용하여 중화시켜 최종 pH가 7.2가 되게 하였다. 완충액을 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 교환하였다.
실시예 3: 항-B7-H3 항체의 B7-H3에 대한 결합 특이성 분석
실시예 3-1: 항 B7-H3 IgG 항체의 재조합 B7-H3 항원에 대한 결합 특이성 분석 (ELISA)
실시예 1 및 2에서 선별하여 제조한 항 B7-H3 IgG 항체의 B7-H3 항원에 대한 특이적 결합 능력을 확인하기 위해 ELISA 기반 용액 결합 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 재조합 인간 B7-H3 단백질을 1 μg/ml의 농도로 희석하여 96 웰 플레이트 (Nunc-Immuno Plates, NUNC)에 웰당 100μl을 넣고 4℃에서 16시간동안 반응하여 코팅하였다. 실시예 1에서 사용한 상기 재조합 인간 B7-H3 단백질을 사용하였다.
그 후, 상기 단백질을 제거하고 PBST로 세척한 후 1% BSA (bovine serum albumin)를 포함하는 PBS 버퍼를 웰당 200μl씩 넣고 37℃에서 2시간동안 반응시켜 비특이적 결합을 차단시켰다. 그 후, 실시예 2에서 제조한 항-B7-H3 항체를 96 웰 플레이트에 10μl/ml의 농도로 희석한 후, 100μl를 각 웰에 넣고 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그 후 PBST로 세척하였다. 인간 B7-H3에 결합된 항체를 검출하기 위해, HRP-연결 항 인간 IgG F(ab')2 항체 (Goat anti-Human IgG F(ab')2 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Pierce, 31414)를 1% 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함하는 PBS에 1:10,000으로 희석하고 웰당 100 μl를 넣고 37℃에서 약 1시간동안 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 후, TMB (Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 μl를 넣어 발색시켰다. 실온에서 5~10분간 반응시킨 후, 1N H2SO4 50 μl 를 넣어 반응을 종료시키고, 마이크로 플레이트 리더 (분자 소자)를 이용하여 450nm 및 650nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 결과는 도 1a 및 1b에 기재되어 있다. ELISA 방법을 사용하여 결합 능력을 측정한 결과, 항-B7-H3 항체가 인간 B7-H3의 세포 외 영역에 농도 의존적으로 결합한다는 것을 확인했다.
실시예 3-2: 항-B7-H3 항체의 B7 패밀리의 다른 단백질에 대한 결합 능력 분석
B7 패밀리 단백질은 서로 20~40%의 아미노산 동일성을 공유하고, 면역글로불린 도메인의 반복성과 같은 구조적 관련성을 가진다. 그래서, 본 명세서의 항-B7-H3 항체가 다른 B7 패밀리 단백질이 아닌 B7-H3 단백질에 특이적으로 결합하는지 여부를 하기와 같이 분석하였다.
면역 특이적 결합 능력을 확인하기 위해, 구조적 유사성을 가지는 B7 패밀리 구성 단백질: B7-1(Sino Biological, Cat #: 10698-H08H), B7-2(Sino Biological, Cat #: 10699-H08H), B7-DC(Sino Biological, Cat #: 10292-H08H), B7-H1(Sino Biological, Cat #: 10084-H08H), B7-H2(Sino Biological, Cat #: 11559-H08H), B7-H4(Sino Biological, Cat #: 10738-H08H), B7-H5(Sino Biological, Cat #: 13482-H08H), B7-H6(Sino Biological, Cat #: 16140-H08H), B7-H7(Sino Biological, Cat #: 16139-H02H)을 구매하여 사용하였다.
구체적으로, 상기 재조합 인간 B7 패밀리 단백질을 1 μg/ml 농도로 희석하여 96 웰 플레이트 (Nunc-Immuno Plates, NUNC)에 웰당 100 μl 넣고, 4℃에서 16시간동안 반응하여 코팅하였다. 상기 실시예 1에서 사용한 재조합 단백질을 사용하였다.
그 후, 단백질을 제거하고, PBST로 세척한 후, 웰당 1% BSA (bovine serum albumin)를 포함하는 PBS 버퍼 200 μl를 넣고 37℃에서 2시간동안 반응시켜 비특이적 결합을 차단시켰다. 이 후, 실시예 2에서 제조된 항-B7-H3 항체를 96 웰 플레이트 상에서 10 μg/ml로 희석한 후, 각 웰에 100 μl씩 넣고 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그 후, PBST로 세척하였다. 항원에 결합된 항체를 검출하기 위해, HRP가 연결된 항 인간 IgG F(ab')2 항체 (Goat anti-Human IgG F(ab')2 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Pierce, 31414)를 1%의 소 혈청 알부민 (BSA)이 포함된 PBS에 1:10,000으로 희석하여 웰당 100 μl씩 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 후, TMB (Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100 μl를 넣어 발색시켰다. 실온에서 5~10분간 반응시킨 후, 50 μl의 H2SO4를 투입하여 반응을 종료시키고, 마이크로 플레이트 리더 (분자 소자)를 이용하여 450nm 및 650nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 결과는 도 2에 기재되어 있다. ELISA 법을 이용하여 상기 결합 능력을 측정한 결과, 상기 항-B7-H3 항체는 B7-H3에만 특이적으로 결합하고, 상기 다른 B7 패밀리 단백질에는 결합하지 않는다는 것을 확인했다.
실시예 3-3: 항-B7-H3 항체의 인간, 원숭이 및 마우스 B7-H3 항원에 대한 종간 교차 반응성 분석
인간으로 임상을 진행하기 전에 상기 항-B7-H3 항체의 항체 효능 및 면역 조절 활성을 추정하려면 설치류 또는 영장류 모델의 추정이 중요하다. 인간 B7-H3의 서열은 원숭이 및 마우스와 90%이상의 동일성을 공유한다. 실시예 2에서 제조된 본원의 항-B7-H3 항체의 마우스 또는 원숭이 B7-H3에 대한 교차 반응성은 하기와 같은 ELISA 분석법으로 분석하였다.
상기 특이적 교차 반응을 확인하기 위해, 히스티딘 태그 (histidine tag, His tag)가 C 말단 (Sino Biological, Cat #: 50973-M08H)에 연결된 재조합 마우스 B7-H3 단백질과 C 말단에 인간 IgG1의 Fc 부분이 결합되어 있는 재조합 원숭이 B7-H3 단백질 (Sino Biological, Cat #: 90806-C02H) 항원을 구매하여 사용하였다.
상기 재조합 인간 B7-H3, 마우스 B7-H3 및 원숭이 B7-H3 단백질을 1 μg/ml의 농도로 희석하고, 96 웰 플레이트 (Nunc-Immuno Plates, NUNC)에 웰당 100 μl로 넣은 후, 4℃에서 16시간동안 반응시켜 코팅하였다. 상기 사용한 재조합 단백질은, 실시예 1에서 분석을 위해 구입한 제품을 사용하였다.
이 후, 단백질을 제거하고 PBST로 세척한 후, 웰 당 1%의 BSA (bovine serum albumin)을 포함하는 200 μl의 PBS 버퍼를 넣고 37℃에서 2시간동안 반응시켜 비특이적 결합을 차단하였다. 이 후, 실시예 2에서 제조한 상기 항-B7-H3 항체를 96 웰 플레이트에 10 μg/ml부터 일정 비율로 희석한 후, 각 웰에 100 μl 넣고 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이어서, PBST로 세척하고, 인간 B7-H3, 마우스 B7-H3 및 원숭이 B7-H3에 결합한 항체, HRP 연결 항 인간 IgG F(ab')2 항체 (Goat anti-Human IgG F(ab')2 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP, Pierce, 31414) 를 1& 소 혈청 알부민 (BSA)이 포함된 PBS에 1:10,000으로 희석하여, 웰 당 100μl를 넣고 37℃에서 약 1시간 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 후, TMB (Tetramethylbenzidine, Sigma, T0440) 100μl를 넣어 발색시켰다. 실온에서 5~10분간 반응시킨 후, H2SO4 50μl를 투입하여 반응을 종료시키고, 마이크로 플레이트 리더 (분자 소자)를 이용하여 450nm 및 650nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 결과는 도 3 및 4에 기재하였다. ELISA 법을 이용하여 결합 능력을 측정한 결과, 항-B7-H3 항체가 인간, 원숭이 및 마우스 B7-H3에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 인간 및 원숭이 B7-H3에 대한 본원의 한 B7-H3 항체의 결합정도는 유사한 것으로 나타났으나, 마우스 B7-H3에 대한 결합정도는 상대적으로 낮았다 (도 3). 마우스 B7-H3에 대한 항-B7-H3 항체의 결합정도는 클론마다 다르고, 비교 항체로 사용된 84D 항체는 마우스 B7-H3 단백질에 결합하지 않는 것으로 관찰됐다 (도 4).
실시예 3-4: 항-B7-H3 항체의 세포표면 발현 B7-H3 항원에 대한 결합 능력 측정
이 후, FACS 분석을 통해, 실시예 2에서 제조된 본원의 항-B7-H3 항체가 세포 표면에 발현된 인간 B7-H3에 결합하는 능력을 측정하였다.
상기 실험을 위해, 인간 B7-H3, MCF-7 (인간 유방암 세포주, Human breast adenocarcinoma cell line, ATCC　HTB-22™), DLD1 (결장 직장선암 세포주, colorectal adenocarcinoma cell lines, ATCC CCL-221™), HCC1954 (TNM stage IIA, grade 3, ductal carcinoma, ATCC　CRL-2338™), 및 HCT116 (결장암 세포, colon cancer cell, ATCC　CCL-247™)를 발현하는 암 세포 및 인간 B7-H3을 발현하지 않는 암 세포주인 Jurkat(acute T cell leukemia, ATCC　TIB-152™)을 사용하였다.
구체적으로, 각 세포주를 해리하고 PBS 완충액으로 세척한 후, 세포수를 세어 웰당 2*105개의 세포로 조정하고, 200 μl PBS를 넣어 준비하였다. 실시예 2의 항-B7-H3 항체 및 비교군 항체 (84D)는 각각 1%DML BSA를 포함하는 PBS에서 일정 농도 10 μg/ml이상으로 희석하여 미리 준비한 세포와 4℃에서 1시간동안 반응시켰다. PBS 버퍼를 이용하여 2회 세척한 후, FITC 표지된 항 인간 Fc FITC (Goat anti-human IgG FITC conjugate, Fc specific, Sigma, F9512, 농도: 2.0 mg/ml)를 1:500으로 희석하여 웰당 100μl 처리하고, 4℃에서 1시간동안 반응시켰다. 상기 음성 대조군은 FITC 표지된 항 인간 Fc FITC로만 처리하였다. 다시 PBS 버퍼를 사용하여 2회 세척하고, FACSCalibur 장치를 사용하여 항 BCMA IgG의 결합 정도를 측정하였다.
각 B7-H3 단일 클론 항체를 처리한 실험군에서 인간 B7-H3 단일 클론 항체-FITC 결합에 대한 피크 이동 결과를 음성 대조군과 비교하였다. 상기 결과는 B7-H3 단일 클론 항체를 처리한 실험군의 피크 시프트 값을 음성대조군의 피크 시프트 값 (평균 형관 강도 비율, Mean Fluorescence Intensity Ratio)으로 나눈 값을 나타내었고, 도 5 및 6에 기재하였다. FACS 방법을 이용하여 결합 능력을 측정한 결과, 항-B7-H3 항체가 세포 표면에 발현된 인간 B7-H3에 농도 의존적으로 특이적으로 결합한다는 것을 확인했다.
실시예 3-5: 다양한 암종에서 항 B7-H3 IgG 항체의 세포 표면 발현 B7-H3 항원에 대한 결합 능력 측정
이 후, FACS 분석을 통해, 본원의 항-B7-H3 항체가 다양한 암세포 주에서 세포 표면 발현 B7-H3에 결합하는지 여부를 확인했다.
다양한 종류의 암 세포 A2780 (인간 난소 암, human ovarian cancer, ECACC,93112519), SKOV-3 (인간 난소 선암, human ovarian adenocarcinoma, ATCC® HTB-77™), OVCAR-3 (인간 난소 선암, human ovarian adenocarcinoma, ATCC® HTB-161™), HCT116 (결장암 세포, colon cancer cell, ThermoFIshcer Sci), HT29 (대장 직장 선암, olorectal adenocarcinoma, ATCC®　 HTB-38™), DLD-1 (결장 직장 선암 세포주, colorectal adenocarcinoma cell lines, ATCC® CCL-221™), Calu-6 (비소 세포성 폐암, Non-small-cell lung carcinoma, ATCC® HTB-56™), HCC1954 (TNM stage IIA, grade 3, ductal carcinoma, ATCC® CRL-2338™), HCC1187 (TNM stage IIA,ATCC® CLC-2322™), renal cancer cell line 786-0 (신장 암 세포주, renal cell adenocarcinoma, ATCC® CRL-1932™), A498 (신장 암, kidney carcinoma, ATCC® HTB-44™), Panc-1 (췌장 상피 암, pancreas epithelioid carcinoma, TCC　 CRL-1469™), NCI-N87 (위암, gastric carcinoma, TCC　 CRL-5822™), HeLa (자궁 경부 암, cervix adenocarcinoma, ATCC® CCL-2™), JeKo-1 (림프종, Lymphoma, ATCC® CRL-3006™) 및 FACSCalibur (BD Biosciences) 기기를 사용하여, 항-B7-H3 항체와 B7-H3의 결합된 정도를 하기와 같이 측정하였다.
각 세포주를 해리하고 PBS 완충액으로 세척한 후 세포수를 세어 2*105개의 세포/200μl PBS로 조정한 후, 실시예 2에서 제조된 10μg/ml의 B7-H3 단일 클론 항체로 처리하였다. 반응은 4℃에서 1시간 진행하였다. 상기 반응된 세포를 PBS로 세척한 후, 상기 FITC 표지된 불변영역 (Fc)-특이적 항체 (Goat anti-human IgG FITC conjugate, Fc specific, Sigma, F9512, 농도: 2.0 mg/ml))를 1:500으로 희석하고 웰당 100μl를 첨가하고, 4℃에서 1시간동안 반응시켰다. 상기 반응 후, 세포를 PBS로 세척하고 상기 FACSCalibur 장치를 사용하여 분석하였다. 상기 음성 대조군은 FITC-표지된 불변영역 (Fc) 특이적 항체로만 처리하였다. 암세포 주별 B7-H3의 발현정도를 비교하기 위해 각 B7-H3 단일 클론 항체를 처리한 시험군의 피크 시프트 값을 음성대조군에서 피크 시프트 값으로 나눈 값 (MFI Ratio, Mean Fluorescence Intensity Ratio)을 나타냈다. 상기 결과는 표 6에 기재하였다.
암 세포주 MFI 비율
B5 C4I D8G F6V 10F11 84D
난소암 A2780 26.6 18.3 21.6 25.2 25.5 13.1
SKOV-3 29.5 20.4 23.3 27.7 28.5 11.9
OVCAR-3 33.1 22.4 26.7 33.1 35.6 13.7
대장암 HCT116 11.9 6.8 7.9 10.8 12 5.9
HT29 17.6 12.7 11.9 15.9 18.7 8.9
DLD-1 24.9 14.9 18.5 25.6 24.6 10.7
NSCLC Calu-6 47.9 45.5 43.2 N/D 47.8 23.2
TNBC MDA-MB-231 11.4 6.2 8.5 11.3 12.4 5.4
MDA-MB-468 16.2 9.7 11.4 17.6 17.2 8.6
유방암 MCF-7 154 109 136 151 152 78
HCC1954 29 21 25 30 35 14
HCC1187 21.8 11.2 13.3 18.4 22 14.9
신장암 786-0 32 24 22 33 34 20
A-498 35 26 25 37 35 24
췌장암 Panc-1 18 12 12 19 18 9
위암 NCI-N87 27.3 17.6 21.5 33.4 31.7 12.8
자궁경부암 Hela 38.7 26.1 30.2 42.7 40.6 23.5
MCL JeKo-1 1.5 7.9 3.1 N/D 1.7 2.9
(MFI 비율: 항 B7-H3의 MFI/2nd Ab의 MFI)(N/D: 결정되지 않은 상태)
FACS 방법을 사용하여 결합 능력을 측정한 결과, 본원의 항-B7-H3 항체가 난소암, 결장 직장암, 비소 세포 폐암, 유방암, 신장암, 췌장암, 위암, 자궁 경부암 및 림프종 유래의 다양한 암세포주에 결합한다는 것을 확인했다. 또한, 본 명세서의 상기 항-B7-H3 항체는 동일한 농도에서 비교군 84D에 비해 더 높은 결합 능력을 나타내어, 세포 표면 발현 B7-H3에 대한 결합능력이 더 우수하다는 것을 확인하였다.
실시예 3-6: 항-B7-H3 항체의 마우스 유래 암세포의 마우스 B7-H3 항원에 대한 결합능력 측정 (FACS)
이 후, FACS 분석을 통해, 본 명세서의 항 B7-H3의 세포 표면 발현 마우스 B7-H3에 대한 결합 능력을 측정하였다. 실시예 3-3에서 항-B7-H3 항체가 인간 B7-H3 및 마우스 B7-H3 재조합 단백질 모두에 결합되어 있다는 것을 ELISA 방법을 통해 확인하였다. It was confirmed that the anti-B7-H3 antibody bound to human B7-H3 and mouse B7-H3 recombinant proteins both through ELISA method in Example 3-3. 본 명세서의 상기 항-B7-H3 항체가 마우스 암세포주의 세포 표면에 발현하는 마우스 B7-H3에 결합하는지 여부를 확인하기 위해, 마우스 유래 암세포주인 CT26 (Mus mesculus colon carcinoma, ATCC® CRL-2638™), B16F10(Mus musculus skin melanoma, ATCC® CRL-6475™), TC-1(Mus musulus Lung tumor, ATCC® CRL-2493™) 세포주를 사용하였다.
각 세포주에 대해, 세포를 분리하고 PBS 완충액으로 세척하였다. 세포의 수를 세고, 웰당 2*105 세포수로 조정하여 200μl PBS 넣어 준비하였다. 상기 세포는 1% BSA 함유 PBS에서 10μg/ml이상의 농도로 준비하였다. 상기 실시예 2에서 제조된 항-B7-H3 항체와 비교 항체 (84D)를 각각 4℃에서 1시간동안 반응시켰다.
PBS 완충액을 사용하여 세포를 세척한 후, FITC 표지된 항 인간 Fc FITC (Sigma, F9512)를 1:500으로 희석하여 웰당 100μl씩 첨가하고, 4℃에서 1시간동안 반응시켰다. 상기 대조군은, FITC 표지 항 인간 Fc FITC만 처리하였다. 다시 PBS 완충액을 사용하여 2회 세척하고, FACSCalibur 장치를 사용하여 항 B7-H3 IgG 항체의 결합 정도를 측정하였다.
상기 B7-H3 단일 클론 항체를 처리한 실험군의 피크 시프트 값을 음성 대조군의 피크 시프트 값과 비교하였다. 그 결과는 도 7에 기재하였다. FACS 방법을 사용한 측정 결과, 본 명세서의 항-B7-H3 항체가 세포 표면에 발현된 마우스 B7-H3에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 4: 항-B7-H3 항체의 B7-H3에 대한 친화도 측정
항원 B7-H3 및 항-B7-H3 항체의 결합 친화도는 SPR 방법으로 측정하였다. 먼저, 1X HBS-EP 완충액으로 희석된 항-B7-H3 항체를 60초의 접촉시간, 60초의 안정화 시간 및 유속 30μl/min으로 Protein A 칩 (GE healthcare, Cat. No. 29127556)에 50RU가 되도록 캡처하였다. 1X HBS-EP 버퍼를 사용하여, 상기 항원 B7-H3 (R&D systems, 2318-B3-050/CF)를 100nM부터 3.125nM까지 2배씩 단계 희석하여 준비하였다. 이 때, 블랭크 (blank)로 1X HBS-EP 버퍼를 추가하여 준비하였다. 상기 항-B7-H3 항체를 캡처한 칩 위에 준비한 항원 B7-H3을 유속 30μl/min으로 association 시간 60초, dissociation 시간 180초간 흘려주었다. 재생은 10 mM 글라이신-HCl pH1.5 (GE healthcare, Cat. No. BR100354)를 유속 30μl/min으로 contact 시간 30초로 하였다. 상기 결과는 표 7에 기재하였다.
항-B7-H3 항체의 B7-H3에 대한 친화도 측정
Ab Ka (1/Ms,X10 5 ) Kd (1/s, X10 -3 ) K D (M, X10 -9 ) R max (RU) Chi 2
10F11 3.57 3.70 10.36 12.25 0.02
B5 3.72 1.12 3.02 20.39 0.03
C4I 4.44 3.41 7.69 14.59 0.07
D8G 2.06 3.81 18.46 10.46 0.02
F6V 1.10 0.88 8.03 11.64 0.01
실시예 5: 항-B7-H3 항체의 항체 의존적 세포 독성 측정
상기 항-B7-H3 항체의 항체 의존성 세포 매게 세포독성 능력은 ADCC Reporter Bioassay (Promega, G7018) 키트를 사용하여 확인했다. 상기 실험방법을 상기 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
항체 의존성 세포 독성 능력 분석을 위해 B7-H3의 발현 정도가 상대적으로 높은 세포주로 MCF-7 유방암 세포주, Calu-6 폐암 세포주 및 DLD-1 대장암 세포주를, B7-H3의 발현정도가 상대적으로 낮은 세포주로는 Mino mantle 세포 림프종 세포주를 사용하였다. B7-H3 발현이 없는 음성 대조군으로는 Jurkat 성인 T 세포 백혈병 세포주를 사용하였다. 구체적으로, 부착 배양 세포주인 MCF-7, Calu-6 및 DLD-1 세포주는 실험 전날 해리시킨 후, 4℃, 1200rpm 조건으로 5분간 원심분리한 후, 세포를 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 포함된 RPMI 1640 배지에 현탁시키고 웰당 5*103 또는 1*104 개의 세포를 접종하여 배양하였다. 실험 당일 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 4%의 Low IgG Serum (Promega, AX20A)이 첨가된 RPMI 1640 배지를 25μl 첨가하여 제조하였다. 현탁 배양 세포주인 Mino 및 Jurkat 세포주는 4℃, 1200rpm 조건으로 5분간 원심분리한 후, RPMI 1640 (4% Low IgG Serum) 배지에 현탁하여 96 웰 플레이트에 웰당 5*103 또는 1*104 /25μl 세포를 접종하였다.
실시예 2에서 제조한 본 명세서의 상기 항-B7-H3 항체 및 비교 항체 (84D)를 각각 10μg/ml 또는 15μg/ml 또는 18μg/ml의 농도부터 일정 비율로 RPMI 1640 (4% Low IgG Serum) 배지에 희석하여 제조한 후, 웰당 25μl씩 첨가하였다. 이어서, ADCC reporter Bioassay에 포함된 Jurkat/NFAT-FcγRIIIa 세포를 37℃ 워터배스에 넣어 녹인 후, RPMI 1640 medium (4% Low IgG Serum)를 3.6mL 첨가하여 혼합시켰다. 각 웰당 Jurkat/NFAT-FcγRIIIa 세포를 25μl씩 첨가한 후, 37℃에서 6시간동안 반응시켰다. 이어서, Bio-Glo luciferase assay (Promega, G7941)에 들어있는 기질을 용해하고, 웰당 75μl를 첨가하여 5분 내지 10분동안 반응시킨 후, 형광을 측정하였다.
상기 항-B7-H3 항체의 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 효과를 도 8에 기재하였다. B7-H3를 발현하지 않는 음성 대조군인 Jurkat 세포주에서는 항체 의존성 세포 매개 세포 독성이 관찰되지 않았으나, B7-H3를 발현하는 MCF-7, Calu-6, DLD-1 및 Mino 세포주에서 항-B7-H3 항체 특이적으로 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 이는 항체가 B7-H3을 발현하는 암 세포에 특이적으로 결합하여 항체 의존성 세포 매개 세포 독성을 유도하기 때문에, 암세포 사멸에 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 특히, 본 명세서의 항-B7-H3 항체는 비교 항체인 84D와 비교하였을 ‹š, 반수영향농도 (EC50)가 낮고 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 신호의 세기는 강력하여, 보다 효과적으로 암 치료에 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 6: 항-B7-H3 항체의 T 세포 활성의 유도 능력 측정
실시예 6-1. 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 B7-H3 단백질에 의한 T 세포 활성 억제 효과 측정
B7-H3은 면역 체크 포인트 리간드에 속하는 단백질로, T 세포 표면의 B7-H3 수용체와 결합하여, T 세포의 면역 반응을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 미리 활성화된 T 세포에 의한 사이토카인 (인터페론 감마)의 방출이 B7-H3 단백질에 의해 억제되는지 확인하기 위해 PBMC에 B7-H3 단백질 처리 후, 인간 T 세포의 사이토카인 분비량을 측정하였다.
구체적으로, 인간 T 세포를 활성화시키기 위해 항-CD3 항체 (UCHT1, Biolegend)를 5μg/ml가 되도록 PBS에 희석하여 준비하였고, B7-H3 단백질 (Sino Biological, 11188-H08H) 또는 음성 대조군인 IgG1 (BioXCell, BP0297, IgG1 또는 Cont. Ab로 표지)을 5μg/ml로 희석한 항 CD3 항체에 첨가하여, 40μg/ml에서 4배 연속 희석하여 제조하였다. 상기 항 CD3 항체 및 B7-H3 단백질 또는 희석하여 준비한 항 CD3 항체와 음성 대조군을 96 웰 세포 배양 플레이트 (Corning)에 50μl/well로 분주하고 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후, PBS로 1회 세척하였다. 구매하여 제조한 인간 말초 혈액 단핵 세포 (CTL)를 10% FBS (fetal bovine serum)가 포함된 RPMI 1640 배양액에 현탁하고, 항 CD3 항체와 B7-H3 단백질 또는 항 CD3 항체와 음성대조군을 처리하여 코팅한 플레이트에 1*106 cells/well로 분주하여 배양하였다. 배양 3일 후, 배양 상층액을 사용하여 분석 제조사의 지침에 따라 ELISA 분석기 (R&D system)로 인간 T 세포의 인터페론 감마 방출량 분석 실험을 진행하였다. 상기 결과는 도 9a에 기재하였다. 인간 T 세포의 인터페론 감마 분비량을 측정한 결과, T 세포의 활성이 B7-H3 단백질에 의해 억제되어 인터페론 감마 생성이 감소한다는 것을 확인하였다.
실시예 6-2. 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 항-B7-H3 항체에 의한 T 세포 활성화 유도 능력 측정
이어 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 사용하여 B7-H3 단백질에 의해 억제된 T 세포의 활성을, 본 명세서에 따른 항-B7-H3 항체가 다시 활성화시킬 수 있는지 조사하기 위해 실험을 수행하였다. B7-H3 단백질과 T 세포 표면의 B7-H3 수용체간의 결합을 차단할 수 있는 항-B7-H3 항체는 B7-H3에 의해 억제된 T 세포의 면역반응을 재활성화 시킬 수 있다. 이는 상기와 같이 활성화된 T 세포가 면역 항암 치료 효과를 나타낼 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 제조된 항-B7-H3 항체가 활성화된 T 세포에 의한 사이토카인 (인터페론 감마) 방출에 대한 B7-H3의 억제를 차단할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
상기 B7-H3 단백질이 코팅된 플레이트에 PBMC를 넣은 후, 본 명세서의 항-B7-H3 항체를 처리하였다. 인간 T 세포의 사이토카인 방출량을 측정하였다.
인간 T 세포를 활성화하기 위해, 항 CD3 항체 (UCHT1, Biolegend)를 5μg/ml이 되도록 PBS에 희석하여 준비하였고, 상기 B7-H3 단백질에 의한 T 세포 활성화를 억제시키기 위해, 상기 제조한 항 CD3 항체에 10μg/ml 농도의 B7-H3 단백질을 첨가하였다. 상기 제조된 B7-H3 단백질을 96 웰 세포 배양 플레이트 (Corning)에 웰당 50μl씩 분주하고, 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후, PBS로 1회 세척하였다. 상기 항-B7-H3 항체와 음성 대조군인 IgG1 (BioXCell, BP0297, IgG1 or Cont. Ab로 표지됨)을 RPMI-1640 배양액 (Invitrogen)에 10% FBS (fetal bovine serum)와 함께 첨가하였고, 16μg/ml로부터 4배 연속 희석을 진행하여 제조하였다.
구매하여 준비한 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC, CTL)를 10% FBS (소 태아 혈청, fetal bovine serum)가 포함된 RPMI 1640 배양액에 현탁하고, 항 CD3 항체 및 B7-H3 단백질이 코팅된 플레이트에 1*106 cells/well의 양으로 첨가하였다.
PBMC가 놓인 플레이트에 항-B7-H3 항체 및 연속 4배 희석으로 제조된 음성 대조군 IgG1을 첨가하였다 (50μl/well). 이어, 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배양액을 웰당 100μl씩 분자하여, 상기 항체가 세포에 처리되는 최고 농도의 최종 농도가 4μg/ml (27nM)이 되도록 실험하였다. 항-B7-H3 항체를 단일 농도로 처리한 실험의 경우, 항체의 최종 농도가 10μg/ml였다. 배양 3일 후, 상기 배양 상층액을 사용하여 분석기 제조사 지침에 따라 ELISA 분석기 (R&D system)로 인간 T 세포의 인터페론 감마 분비량 분석 실험을 진행하였다.
상기 결과는 도 9b에 기재하였다. 인간 T 세포의 인터페론 감마 방출량을 측정한 결과, 본 명세서에서 제조된 항-B7-H3 항체가 B7-H3 단백질에 의해 억제된 T 세포를 재활성화하여 인터페론 감마의 생성이 촉진되는 것을 확인하였다. 상기 분석결과는 본 명세서의 항-B7-H3 항체가 면역 체크포인트 억제제로 개발될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 6-3: 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)에서 항-B7-H3 항체와 면역 항암 치료제의 병용처리 효과 분석
상기 항-B7-H3 항체와 면역 항암 피료제를 병용하여 T 세포에 의한 사이토카인 (인터페론 감마) 방출이 증가하는지 여부를 조사하였다. 항 PD-1 항체는 WO2008-156712에 개시된 서열을 기반으로 Merck 사의 Pembrolizumab을 유전적으로 합성 및 생산하여 사용하였다.
구체적으로, 항 CD3 항체 (UCHT1, Biolegend)를 PBS에 5μg/ml로 희석하고, 제조된 항 CD3 항체에 B7-H3 단백질을 첨가하였다. 상기 제조된 B7-H3 단백질을 항 CD3 항체에 첨가하여 96 웰 세포 배양 플레이트 (Corning)에 웰당 50μl씩 넣고 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후, PBS로 1번 세척하였다.
본 명세서의 항-B7-H3 항체와 음성 대조군인 IgG1 (BioXCell, BP0297, IgG1 또는 Cont. Ab로 표지) 그리고 상기 제조된 항 PD-1 항체를 10% FBS (fetal bovine serum, Invitrogen)가 있는 RPMI-1640 배양액 (Invitrogen)을 추가하여, 연속 4배 희석하여 제조하였다.
구입하여 준비한 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (CTL)를 10% FBS (fetal bovine serum, 소 태아 혈청)가 포함된 RPMI 1640 배양액에 현탁하고, 항 CD3 항체와 B7-H3 단백질이 코팅된 플레이트에 웰당 1X106 개의 세포를 넣었다.
PBMC가 놓여진 플레이트에, 상기 항-B7-H3 항체와 연속 4배 희석으로 제조된 음성 대조군 IgG1을 첨가하였다 (50 μl/well). 이어서, 10%의 FBS가 포함된 RPMI 1640 배양 용액을 웰당 100μl씩 첨가하였다.
상기 항-B7-H3 항체를 단일 농도로 처리한 경우, 항체의 최종 농도는 10μg/ml였다. 상기 항-B7-H3 항체를 다양한 농도로 처리한 경우, 최고 농도인 20nM에서 시작하여 최종 농도로 연속 4배 희석된 농도로 처리하였다. 배양 3일 후, 배양 상등액을 사용하여 분석기 제조사의 지시에 따라 ELISA 분석기 (R&D system)로 인간 T 세포의 인터페론 감마 방출량 분석을 진행하였다.
상기 결과는 도 10에 기재하였다. 인간 T 세포의 인터페론 감마 방출량을 측정한 결과, 항-B7-H3 항체를 항 PD-1 항체와 공동 처리 하였을 때 각 항체를 단일 처리하였을 때보다 T 세포를 강하게 활성화시켜 인터페론 감마 생성이 더욱 촉진되는 것을 확인하였다.
실시예 7: 마우스 동종성 종양 이식 모델에서 항-B7-H3 항체와 항 PD-1 항체의 병용 투여에 의한 항암 효과 분석
동물 모델에서 항체의 면역 체크포인트 억제 효과를 확인하기 위해, 항체가 인간과 마우스 사이에 특이적 교차 반응성을 갖는 경우 마우스 동종성 종양 이식 모델을 사용할 수 있다.
실시예 3-3 및 3-6에서 확인한 바와 같이, 본 명세서의 항-B7-H3 항체는 마우스 B7-H3 항원에 대한 특이적 종간 교차 반응성이 있다. 본 명세서의 항-B7-H3 항체의 종양 증식 억제 효과를 확인하기 위해 마우스 동종성 종양 모델에 항 마우스 PD-1 항체인 RMP1-14 (BioXCell, BE0146)와 함께 병용투여하여 종양의 증식 억제 효능을 하기와 같이 확인하였다.
CT26은 마우스 (BALB/c) 및 마우스 B7-H3을 과발현하는 세포주에서 유래한 결장암이다. 실시예 2에서 제조된 항-B7-H3 항체가 실시예 3-6에서 CT26 마우스 암 세포주 표면에 발현된 마우스 B7-H3에 결합하는 것을 확인하였다 (도 7).
실험방법을 구체적으로 설명하면 CT26 (BALB/c origin) 세포주를 해리시키고 PBS 버퍼로 세척한 후, 세포수를 세어 웰당 5x105 cells로 조정하였다. 제조된 세포는 마우스 (BALB/c, 6주령, Samtako)에 피하주사로 투여하였고, 종양의 크기가 50~100 mm3일 때, 각각 해당하는 항체를 200㎍씩 총 1mg을 3일 간격으로 5회에 걸쳐 처리하였다. 대조군과 항 PD-1 (RMP1-14) 항체 단일 치료군, 항 PD-1 항체 및 항 B7-H3 병용 치료군의 종양 크기를 칼리퍼를 이용하여 종양의 가장 긴 직경 (D1)과 그에 수직인 직경 (D2)을 측정하여 (0.5*D1*D22)와 같이 계산하여 부피를 구했다 (도 11).
종양 관찰 중 종양의 크기가 2000mm3 보다 크거나 궤양이 생길 경우 해당 마우스의 경우 안락사시켰다. 모든 항체 처리가 끝난 후, 총 30일 동안 관찰하여 생존률 및 종양의 크기를 측정하였다.
상기 결과를 도 11에 나타내었다. 그 결과, 항 PD-1 (RMP1-14) 항체를 단독으로 처리한 군과 비교하여 항 PD-1과 항-B7-H3 항체를 병용 투여한 군에서 종양 증식 억제 효과 및 생존률의 향상을 확인하였다. 상기 결과는 본 명세서의 항-B7-H3 항체가 면역 체크 포인트 억제 효과를 보이고 항 PD-1 항체가 다른 면역 억제제와 다른 기전을 통해 면역 세포를 활성화시키면, 항암 치료 효과가 강화되었다는 것을 의미한다. 실시예 3-3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 명세서의 항-B7-H3 항체의 마우스 B7-H3에 대한 결합 능력은 인간 B7-H3에 비해 상대적으로 낮다. 낮은 마우스 B7-H3에 대한 결합력에도 불구하고 본 명세서의 항-B7-H3 항체는 동종 종양 이식 모델에서 항 PD-1 항체와 병용투여에서 항 PD-1 항체의 단독 투여 대비 뚜렷한 암 성장 억제 효과 및 생존률 향상을 나타냈다. 본 명세서의 항-B7-H3 항체는 인간 B7-H3에 보다 강력하게 결합하여, 마우스 동종성 종양 이식 모델보다 더 강한 인간 면역 체크 포인트 억제 효과를 기대할 수 있다.
실시예 8: 마우스 동종성 종양 이식 모델에서 항-B7-H3 항체와 항 PD-1 항체의 병용투여에 의한 종양 침윤 림프구 (TIL) 변화 분석
종양 침윤 림프구 (TIL)는 혈류를 떠난 종양으로 이동하는 백혈구를 말한다. 종양 침윤 림프구는 T 세포와 B 세포를 포함할 수 있고, 단핵 및 다형성 핵 면역세포를 포함하고, 종양의 유형 및 단계에 따라 다양하며, 질병 예후와 관련이 있다. 특히, 면역 항암 항체의 작용 메커니즘은 종양 침윤 림프구의 분석을 통해 확인이 가능하다.
항-B7-H3 항체 (F6V)와 항 PD-1 항체 (RMP-14-1)의 병용투여 (combi로 기재)에 의한 항암 효과 메커니즘을 분석하기 위해 종양 침윤 림프구를 분석하였다. 실험은 실시예 8과 동일한 방법으로 수행하였다. 각 항체의 3회 투여가 완료된 후 마우스로부터 종양을 분리하여 종양 침윤 림프구를 얻었다.
수확한 종양 침윤 세포를 PMA 50ng/ml 및 로노마이신 1μM으로 재자극하고, 면역세포의 변화를 분석하였다 (도 12). 항암 면역 반응의 주요 역할을 하는 대표적인 면역세포는 세포 독성 T 세포 (cytotoxic T cell)와 조절 T 세포 (regulatory T cell)이다. 실험결과, 본 명세서의 항-B7-H3 항체와 항 PD-1 항체를 병용 투여한 마우스에서 분리한 종양 침윤 림프구에서 명확한 세포 독성 T 세포의 활성화와 조절 T 세포의 증식 억제를 관찰하였다.
본 명세서의 항-B7-H3 항체와 항 PD-1 항체를 병용 투여한 마우스에서 분리한 종양 침윤 림프구에서는 CD8+ T 세포 중 IFNγ+Granzyme B+의 수준이 현저하게 증가하였고, CD8+ T 세포 사이에서 Granzyme B의 방출 증가를 관찰하였다.
본 명세서의 항-B7-H3 항체와 항 PD-1 항체를 병용 투여한 마우스에서 분리한 종양 침윤 림프구에서 조절 T 세포의 빈도와 세포수는 항 Foxp3 항체 (eBioscience, FJK-16s) 및 항 Ki67 (BD, B56) 항체를 사용하여 조절 T 세포의 증식 능력을 확인하였다.
상기 결과는 도 12에 기재하였다. 실험 결과, 항-B7-H3 항체와 항 PD-1을 병용 투여한 군에서 조절 T 세포의 수가 감소할 뿐만 아니라 조절 T 세포의 증식 능력을 나타내는 Ki67+도 감소함을 확인하였다. 이러한 결과는 항-B7-H3 항체와 항 PD-1 항체의 병용투여가 세포 독성 T 세포의 활성 증가와 조절 T 세포의 억제를 동시에 유도하여 면역 활성화를 통해 항암 효과를 나타내는 것을 의미한다.
전술한 설명은 예시를 위한 것이며, 상기 기술분야의 통상의 기술자라면 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다.
<110> ABL Bio Inc. <120> ANTI-B7-H3 ANTIBODY AND USE THEREOF <130> OPP20191634KR <150> KR 10-2018-0059257 <151> 2018-05-24 <150> PCT/KR2018/005968 <151> 2018-05-25 <160> 75 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy cahin CDR1 <400> 1 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy cahin CDR1 <400> 2 Gly Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy cahin CDR1 <400> 3 Ser Tyr Ser Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy cahin CDR1 <400> 4 Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy cahin CDR2 <400> 5 Ser Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy cahin CDR2 <400> 6 Leu Ile Ser Pro Ser Ser Gly 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ggaacctcag gtgtacaccc tgcctccatc tcgggaagag 720 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctcgtgaagg gattctaccc ttccgatatc 780 gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 840 ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtctcggtgg 900 cagcagggca acgtgttctc ctgttctgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960 cagaagtccc tgtctctgtc ccctggcaaa 990 <210> 64 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Light chain constant region <400> 64 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 65 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Light chain constant region coding gene <400> 65 cagcccaagg ccgccccctc cgtgaccctg ttccccccct cctccgagga gctgcaggcc 60 aacaaggcca ccctggtgtg cctgatctcc gacttctacc ccggcgccgt gaccgtggcc 120 tggaaggccg actcctcccc cgtgaaggcc ggcgtggaga ccaccacccc ctccaagcag 180 tccaacaaca agtacgccgc ctcctcctac ctgtccctga cccccgagca gtggaagtcc 240 caccggtcct actcctgcca ggtgacccac gagggctcca ccgtggagaa gaccgtggcc 300 cccgccgagt gctcc 315 <210> 66 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Light chain constant region coding gene <400> 66 caacctaagg ccgctcctag cgtgaccctg tttcctccat cttctgagga actgcaggcc 60 aacaaggcta ccctcgtgtg cctgatctct gacttttacc ctggcgctgt gaccgtggcc 120 tggaaggctg atagttctcc tgtgaaggcc ggcgtggaaa ccaccacacc ttccaagcag 180 tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac ctgtctctga cccctgaaca gtggaagtcc 240 caccggtcct actcttgcca agtgacccat gagggctcca ccgtggaaaa gacagtggcc 300 cctgctgagt gctct 315 <210> 67 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Light chain constant region coding gene <400> 67 cagcctaagg ccgctccttc tgtgaccctg tttcctccat cctctgagga actgcaggcc 60 aacaaggcta ccctcgtgtg cctgatctct gacttttatc ctggcgccgt gaccgtggcc 120 tggaaggctg atagttctcc tgtgaaggcc ggcgtggaaa ccaccacacc ttccaagcag 180 tccaacaaca aatacgccgc ctcctcctac ctgtctctga cccctgaaca gtggaagtcc 240 caccggtcct actcttgcca agtgacccat gagggctcca ccgtggaaaa gacagtggcc 300 cctgctgagt gctct 315 <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain CDR2 <400> 68 Gly Ile Tyr Ser Asp Ala Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Light chain CDR2 <400> 69 Ala Asp Val Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 70 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain variable region <400> 70 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Ser Asp Ala Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Met Leu His Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Light chain variable region <400> 71 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ser Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Val Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 72 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain <400> 72 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Ser Asp Ala Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Met Leu His Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 73 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Light chain <400> 73 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ser Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Val Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 210 215 <210> 74 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Heavy chain coding gene <400> 74 gaggtccagc tcctggagag cggaggagga ttggttcaac ccggaggatc actccgtttg 60 agttgcgcag ccagtggatt cactttttct agttattcaa tgtcctgggt tcgtcaggcc 120 cccggcaagg gattggagtg ggtcagcggg atatatagcg atgcttcaaa tacctattat 180 gctgatagcg tgaaagggcg atttactata tcacgggaca attccaagaa tacattgtac 240 cttcagatga actcccttag ggccgaagac actgccgtgt actattgtgc aaagatgctt 300 catcgttttg attattgggg gcaaggaact ctggtgactg tctcaagcgc ctccaccaag 360 ggcccctccg tgttccccct ggccccctcc tccaagtcca cctccggcgg caccgccgcc 420 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaactccggc 480 gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 540 ctgtcctccg tcgtgaccgt gccctcctcc tccctgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gtcctgcgac 660 aagacccaca cctgccctcc ctgccccgcc cccgagctgc tgggcggccc ctccgtgttc 720 ctgttccctc ctaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga ggtgacttgc 780 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggacccc gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc cgggaggagc agtacaactc cacctaccgg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 960 aaggtgtcca acaaggccct gcccgccccc atcgagaaga ccatctccaa ggccaagggc 1020 cagccccggg agccccaggt gtacaccctg cccccctccc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagtccaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccgtgct ggactccgac 1200 ggctccttct tcctgtactc caagctgacc gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1260 gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320 tccctgtccc ccggcaag 1338 <210> 75 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Light chain coding gene <400> 75 caatctgtgc tgacccaacc acccagtgct tcaggcacac ccggacagag ggtgactata 60 agttgcagcg ggtcaagttc aaatatcgga agcaattccg tgacctggta ccaacagctc 120 cccggtactg caccaaagct ccttatctat gctgatgtgc agcggcctag tggagtgcct 180 gatcggttca gcggttcaaa gtccggtacc tccgcttctt tggcaataag tggattgcgc 240 tccgaggatg aggcagatta ttattgcggg acatgggata gcagtcttaa tgcctacgta 300 ttcggcggtg gtaccaaact tacagttctc ggccagccca aggccgcccc ctccgtgacc 360 ctgttccccc cctcctccga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420 tccgacttct accccggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgactcctc ccccgtgaag 480 gccggcgtgg agaccaccac cccctccaag cagtccaaca acaagtacgc cgcctcctcc 540 tacctgtccc tgacccccga gcagtggaag tcccaccggt cctactcctg ccaggtgacc 600 cacgagggct ccaccgtgga gaagaccgtg gcccccgccg agtgctcc 648

Claims (21)

  1. B7-H3을 특이적으로 인식하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편으로,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 중쇄 상보적 결정 영역 (complementarity determining regions), 및 (ii) CDRL1, CDRL2 및 CDRL3의 경쇄 상보적 결정 영역을 포함하며,
    상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3; 및 상기 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 다음 중 어느 하나의 조합인, 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편:
    (a) 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 5, 및 10이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 15, 20 및 25;
    (b) 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 2, 6, 및 11이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 16, 21 및 26;
    (c) 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 7, 및 12이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 22 및 27;
    (d) 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 1, 8, 및 13이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 18, 23 및 28;
    (e) 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 4, 9, 및 14이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 19, 24 및 29
    (f) 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 68, 및 12이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 22, 및 27; 또는
    (g) 상기 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 각각 서열번호 3, 68, 및 12이고, 상기 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 각각 서열번호 17, 69, 및 27.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    하기 서열 조합 중 어느 하나로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, B7-H3을 특이적으로 인식하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편:
    서열번호 30 및 35; 서열번호 31 및 36; 서열번호 32 및 37; 서열번호 33 및 38; 서열번호 34 및 39; 서열번호 70 및 37; 또는 서열번호 70 및 71.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편이 단일 클론 항체인, B7-H3을 특이적으로 인식하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 단일 클론 항체가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 타입인, B7-H3을 특이적으로 인식하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 B7-H3은 인간, 마우스 또는 원숭이의 B7-H3인, B7-H3을 특이적으로 인식하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, scFab, Fv, dsFv, scFV, scFV-Fc, 미니바디 (minibody), 디아바디 (diabody), scAb, dAb, 2가 항체 (bivalent antibody) 또는 다가 항체 (multivalent antibody)인, B7-H3을 특이적으로 인식하는 분리된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 코딩하는, 폴리뉴클레오타이드.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제1항 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 제15항에 있어서, 상기 암은 B7-H3의 과발현과 관련된 것인, 약학적 조성물.
  18. 제1항 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, 생물학적 샘플에서 B7-H3의 검출용 조성물.
  19. 제1항 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계, 및
    B7-H3이 존재하거나 상기 B7-H3의 농도가 상기 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편과 접촉한 대조군에 비해 증가한 경우, 상기 생물학적 샘플 또는 상기 생물학적 샘플을 가지고 있는 환자가 B7-H3의 과발현과 관련된 질병을 가지고 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는,
    B7-H3의 과발현과 관련된 질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 B7-H3의 과발현과 관련된 질환은 암인, 방법.
  20. 제1항 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, B7-H3의 과발현과 관련된 질환의 진단용 조성물로서, 상기 B7-H3의 과발현과 관련된 질환은 암인, 조성물.
  21. 제15항에 있어서, B7-H3 면역 체크포인트에 의해 억제된 T 세포의 활성을 재활성화시키는, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
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