CN115151572A

CN115151572A - 针对ror1的抗体及其用途

Info

Publication number: CN115151572A
Application number: CN202280001691.XA
Authority: CN
Inventors: 孝作祥; 彭佳萍; 周东文; 周炜; 缪杭斌; 王冠女
Original assignee: Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-07-23
Filing date: 2022-05-17
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2042-05-17
Also published as: CN115151572B

Abstract

本文公开了针对ROR1的单克隆抗体、针对ROR1和CD3的双特异性抗体、包含所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体以及包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。还公开了包含所述抗体的药物组合物和抗体‑药物缀合物，以及使用所述抗体的治疗方法。

Description

针对ROR1的抗体及其用途

本国际专利申请要求于2021年7月23日提交的国际专利申请号：PCT/CN2021/108155的权益，其全部内容通过引用并入以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及针对ROR1的抗体，以及此类抗体的用途，特别是它们在癌症治疗中的用途。

背景技术

ROR1(受体酪氨酸激酶样孤儿受体1)是进化上保守的I型膜蛋白，在胚胎发育和多种人类癌症中广泛表达。ROR1具有由一个酪氨酸激酶样结构域、两个富含丝氨酸/苏氨酸的结构域和一个富含脯氨酸的结构域(PRD)组成的胞质结构域；跨膜结构域；以及由Ig样结构域、frizzled结构域和kringle结构域组成的胞外结构域。

ROR1作为Wnt5a受体诱导非经典Wnt信号传导，导致增强的白血病细胞迁移和增殖。据报道，ROR1激活慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞中的RhoA以增强迁移。Wnt5a还诱导HS1(造血谱系特异性蛋白1)进行酪氨酸磷酸化并募集到ROR1的富含脯氨酸的结构域。先前的研究报道，Wnt5a还诱导ROR1/ROR2异源寡聚化以募集激活Rho GTP酶的鸟嘌呤交换因子(GEF)，从而增强白血病的趋化性和增殖。

ROR1的表达在胎儿发育过程中减弱，并且除了少数例外，在大多数产后组织中变得可以忽略不计。相比之下，ROR1由多种人类癌症表达，特别是由那些分化程度较低的癌症表达，并且与治疗后的早期复发或转移有关。使用流式细胞术的研究表明，ROR1在多种癌症的细胞表面表达，这些癌症包括B-CLL、套细胞淋巴瘤(MCL)、和B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)的亚组。ROR1的表达增强了肿瘤细胞的生长和存活，并促进了肿瘤的上皮-间质转化和转移。在三阴性乳腺癌、肺腺癌、卵巢癌以及其他类型的癌症中，高ROR1表达与较短的总生存期和无转移生存期相关。

由于ROR1的表达模式和在肿瘤进展中的功能，其已成为肿瘤治疗的有前景的靶标。本领域需要开发针对ROR1的抗原结合蛋白，特别是那些以高亲和力和抑制活性结合ROR1的蛋白。

发明概述

本公开提供了与ROR1结合的新型抗体或其抗原结合片段，其可以是单克隆抗体或双特异性抗体的形式，例如双特异性T细胞衔接器(BiTE)。本文公开的抗体能够以高亲和力结合人ROR1，尤其是人ROR1的胞外结构域，并介导效应细胞对表达ROR1的靶细胞(例如各种癌细胞)的杀伤。

在一方面，本公开提供了特异性结合ROR1的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中(i)VL包含分别具有如SEQ ID NO:2-4所示的氨基酸序列的LCDR 1-3，并且VH包含分别具有如SEQ ID NO:7-9所示的氨基酸序列的HCDR 1-3；或(ii)VL包含分别具有如SEQ ID NO:12-14所示的氨基酸序列的LCDR 1-3，并且VH包含分别具有如SEQ ID NO:17-19所示的氨基酸序列的HCDR 1-3。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，(i)VL包含与SEQ IDNO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VH包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或(ii)VL包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VH包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，该抗体包含(i)轻链和重链，该轻链包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，该重链包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或(ii)轻链和重链，该轻链包含与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，该重链包含与SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，抗体具有选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD的同种型。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，抗体具有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚型。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fd’、Fv、scFv、ds-scFv和dAb。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，抗体是进一步包含结合第二抗原的第二抗原结合区的双特异性抗体。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原是肿瘤相关抗原或免疫细胞抗原。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原是T细胞抗原。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，T细胞抗原选自T细胞受体(TCR)、CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD28、CD44、CD62L、CD69、ICOS、41-BB(CD137)和NKG2D、或其任意组合。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原是CD3，并且第二抗原结合区包含VL和VH，其中该VL包含分别具有如SEQ ID NO:22-24所示的氨基酸序列的LCDR 1-3，并且该VH包含分别具有如SEQ ID NO:27-29所示的氨基酸序列的HCDR 1-3。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原结合区包含以下的VL和VH，该VL包含与SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且该VH包含与SEQ ID NO:26具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原结合区的VL与特异性结合ROR-1的抗体的VL的C端连接，并且第二抗原结合区的VH与特异性结合ROR-1的抗体VH的C端相连。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原结合区的VL与特异性结合ROR-1的抗体的VL通过具有如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的接头连接，并且第二抗原结合区的VH与特异性结合ROR-1的抗体的VH通过具有如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的接头连接。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，该双特异性抗体包含(i)轻链和重链，该轻链包含与SEQ ID NO:25具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，该重链包含与SEQ ID NO:30具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或(ii)轻链和重链，该轻链包含与SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，该重链包含与SEQ ID NO:32具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，双特异性抗体是双特异性T细胞衔接器(BiTE)。

在另一方面，本公开提供了双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含与ROR1结合的含有VL和VH的第一抗原结合区和与CD3结合的含有VL和VH的第二抗原结合区，其中(i)第一抗原结合区的VL包含分别具有如SEQ ID NO:2-4所示的氨基酸序列的LCDR 1-3，并且第一抗原结合区的VH包含分别具有如SEQ ID NO:7-9所示的氨基酸序列的HCDR 1-3；或(ii)第一抗原结合区的VL包含分别具有如SEQ ID NO:12-14所示的氨基酸序列的LCDR 1-3，并且第一抗原结合区的VH包含分别具有如SEQ ID NO:17-19所示的氨基酸序列的HCDR 1-3；并且其中第二抗原结合区的VL包含分别具有如SEQ ID NO:22-24所示的氨基酸序列的LCDR1-3，并且第二抗原结合区的VH包含分别具有如SEQ ID NO:27-29所示的氨基酸序列的HCDR1-3。

在本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，(i)第一抗原结合区的VL包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且第一抗原结合区的VH包含与SEQ IDNO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或(ii)第一抗原结合区的VL包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％

序列同一性的氨基酸序列，并且第一抗原结合区的VH包含与SEQ ID NO:

16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％

或100％序列同一性的氨基酸序列；并且第二抗原结合区的VL包含与SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且第二抗原结合区的VH包含与SEQ ID NO:26具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原结合区的VL连接至第一抗原结合区的VL的C端，并且第二抗原结合区的VH连接至第一抗原结合区的VH的C端。

在本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原结合区的VL与第一抗原结合区的VL通过具有如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的接头连接，并且第二抗原结合区的VH与第一抗原结合区的VH通过具有如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的接头连接。

在本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，该双特异性抗体包含(i)轻链和重链，该轻链包含与SEQ ID NO:25具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，该重链包含与SEQ ID NO:30具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或(ii)轻链和重链，该轻链包含与SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，该重链包含与SEQ ID NO:32具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，双特异性抗体是双特异性T细胞衔接器(BiTE)。

在又一方面，本公开提供了核酸，其包含编码本文公开的抗体或其抗原结合片段或本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

在又一方面，本公开提供了载体，其包含本文公开的核酸。

在另一方面，本公开提供了宿主细胞，其包含本文公开的核酸或本文公开的载体。

在又一方面，本公开提供了药物组合物，其包含(i)本文公开的抗体或其抗原结合片段，或本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的载体或佐剂。

在又一方面，本公开提供了抗体-药物缀合物，其包含本文公开的抗体或其抗原结合片段，或本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段。

在另一方面，本公开提供了治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段、本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物、或本文公开的抗体-药物缀合物。

在本文公开的方法的一些实施方案中，癌症选自乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、食道癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠直肠癌、子宫癌、宫颈癌、脑癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、软骨肉瘤、肾癌、甲状腺癌、皮肤癌、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病，优选选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、人食管鳞状细胞癌、结肠腺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、肝癌和卵巢癌。

在本文公开的方法的一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二治疗剂。

在本文公开的方法的一些实施方案中，第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。

在本文公开的方法的一些实施方案中，第二治疗剂选自布鲁顿(Bruton’s)酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、PD-1/PD-L1抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。

附图说明

可通过参考描述了利用本发明原理的示例性实施方案的以下详细描述和附图来获得对本发明的特征和优点的理解，在附图中：

图1显示了2H3 Fab和3A3 Fab对重组人ROR1的结合。

图2A显示了通过ELISA测量的抗ROR1单克隆抗体2H3(2H3 mAb)对重组人ROR1的完整胞外结构域或单独的胞外Ig样结构域、frizzled结构域和kringle结构域的结合。

图2B显示了通过ELISA测量的抗ROR1单克隆抗体3A3(3A3 mAb)对重组人ROR1的完整胞外结构域或单独的胞外Ig样结构域、frizzled结构域和kringle结构域的结合。

图3A显示了通过流式细胞术测量的2H3 mAb和3A3 mAb与癌细胞系MDAMB231、H1975、JEKO-1、KYSE30、PANC-1和H460中细胞表面结合的ROR1的结合。颜色代码，紫色：阴性对照；绿色：2H3 mAb；红色：3A3 mAb。用于测定的抗体浓度为10μg/ml。

图3B显示了通过流式细胞术测量的2H3 mAb和3A3 mAb与癌细胞系BJAB、COLO205和LS174T中细胞表面结合的ROR1的结合。颜色代码，紫色：阴性对照；绿色：2H3 mAb；红色：3A3 mAb。用于测定的抗体浓度为10μg/ml。

图4A显示了通过ELISA测量的靶向ROR1和CD3的双特异性抗体(2H3 HBiTE和3A3HBiTE)对重组人CD3的结合。

图4B显示了通过ELISA测量的2H3 HBiTE和3A3 HBiTE对重组人ROR1的结合。

图5A显示了通过流式细胞术测量的2H3 HBiTE(ROR1-2H3-HB)与ROR1阳性细胞系JEKO-1和CD3阳性细胞系Jurkat的结合。

图5B显示了通过流式细胞术测量的3A3 HBiTE(ROR1-3A3-HB)与ROR1阳性细胞系JEKO-1和CD3阳性细胞系Jurkat的结合。

图6显示了在人PBMC存在下，2H3和3A3双特异性抗体对JEKO-1细胞的杀伤活性。以靶细胞(JEKO-1)与效应细胞(PBMC)1:5的比例加入PBMC细胞。

图7显示了在人PBMC存在下，2H3和3A3双特异性抗体对MDA-MB-231细胞的杀伤活性。靶细胞(MDA-MB-231)与效应细胞(PBMC)的比例为1:5。

图8显示了在人PBMC存在下，2H3和3A3双特异性抗体对SK-HEP-1细胞的杀伤活性。靶细胞(SK-HEP-1)与效应细胞(PBMC)的比例为1:5。

图9显示了在人PBMC存在下，2H3和3A3双特异性抗体对PANC-1细胞的杀伤活性。靶细胞(PANC-1)与效应细胞(PBMC)的比例为1：5。

图10A显示了在NK细胞存在下，2H3 Mab和3A3 Mab对HT29细胞的ADCC杀伤。

图10B显示了在NK细胞存在下，2H3 Mab和3A3 Mab对HT29细胞的ADCC杀伤图像。

图11A显示了小鼠模型中2H3双特异性抗体对肿瘤体积的抑制。生理盐水用作阴性对照。

图11B显示了小鼠模型中2H3双特异性抗体对肿瘤重量的抑制。生理盐水用作阴性对照。

图12A显示了小鼠模型中3A3双特异性抗体对肿瘤体积的抑制。生理盐水用作阴性对照。

图12B显示了小鼠模型中3A3双特异性抗体对肿瘤重量的抑制。生理盐水用作阴性对照。

发明详述

通过结合附图和以下实施方案的详细描述，本发明的上述特征和优点及其附加特征和优点将在下文中得到更清楚的理解。

此处参照附图描述的实施方案是解释性的、说明性的，并用于普遍理解本发明。实施方案不应解释为限制本发明的范围。相同或相似的要素和具有相同或相似功能的要素在整个说明书中使用相同的附图标记表示。

除非另有说明或定义，否则所使用的所有术语具有技术人员所清楚的本领域通常的含义。例如参考标准手册，例如Leuenberger,HGW,Nagel,B.和Klbl,H.编辑，“Amultilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”，Helvetica Chimica Acta(1995)，CH-4010 Basel，瑞士；Sambrook等人，“MolecularCloning:A Laboratory Manual”(第2版)，卷1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；F.Ausubel等人编辑，“Current protocols in molecular biology”，GreenPublishing and Wiley InterScience，纽约(1987)；Roitt等人，“Immunology”(第6版)，Mosby/Elsevier，爱丁堡(2001)；和Janeway等人“，Immunology”(第6版)，Garland SciencePublishing/Churchill Livingstone，纽约(2005)，以及上文引用的通常背景技术。

如本文所用，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确表示。因此，例如，提及“一种抗体”包括多种抗体以及在一些实施方案中提及“一个抗体”包括多个抗体，诸如此类。

除非另有说明或定义，否则术语“包含”及其变体诸如“包括”和“含有”应理解为意味着包含所述的元素或步骤或元素组或步骤组，但不排除任何其他元素或步骤或元素或步骤的组。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其具有特异性结合特定抗原的能力。抗体通常在每条重链和轻链中包含可变区和恒定区。抗体重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的成分如C1q(补体激活经典途径中的第一组分)。因此，大多数抗体具有共同形成与抗原结合的抗体部分的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

“轻链可变区(VL)”或“重链可变区(VH)”由间插三个“互补决定区”或“CDR”的“框架”区组成。框架区用于调整CDR，以特异性结合抗原表位。CDR包括抗体中主要负责抗原结合的氨基酸残基。VL结构域和VH结构域从氨基端到羧基端都包含以下框架区(FR)和CDR区：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。VL结构域的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3；VH结构域的CDR1、CDR2和CDR3在本文中也分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。

每个VL结构域和VH结构域的氨基酸排列与CDR的任何常规定义一致。常规定义包括Kabat定义(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1987和1991))、Chothia定义(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917,1987；Chothia等人,Nature 342:878-883,1989)；ChothiaKabat CDR的复合，其中CDR-H1是Chothia CDR和Kabat CDR的复合；Oxford Molecular的抗体建模软件所使用的AbM定义；以及Martin等人的CONTACT定义(万维网bioinfo.org.uk/abs)。Kabat提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号系统)，其中不同重链之间或不同轻链之间的对应残基被赋予相同的编号。本公开可以使用根据这些编号系统中的任一项定义的CDR，但是优选的实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。

当CDR序列根据Kabat编号系统定义时，本文公开的抗体的VL包含分别具有如SEQID NO:2(RASQSVSSYLA)、SEQ ID NO:3(DASNRAT)和SEQ ID NO:4(QQRSNWPLT)所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且本文公开的抗体的VH包含分别具有如SEQ ID NO:7(GYTFTYR)、SEQ ID NO:8(TPFNGN)和SEQ ID NO:9(SGPRGDYVLDY)所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者

本文公开的抗体的VL包含分别具有如SEQ ID NO:12(RSSQSLLQSNGYNYVE)、SEQ IDNO:13(LGSYRAS)和SEQ ID NO:14(MQGTHWPLFT)所示的氨基酸序列的LCDRl、LCDR2和LCDR3，并且本文公开的抗体的VH包含分别具有如SEQ ID NO:17(GFTFSSY)、SEQ ID NO:18(SYDGSN)和SEQ ID NO:19(DLDYSLWFDP)所示的氨基酸序列的HCDRl、HCDR2和HCDR3。

如本文所用，术语“抗体”应以其最广泛的含义理解，并且包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段和含有至少两个不同抗原结合区的多特异性抗体(例如双特异性抗体)。抗体可含有另外的修饰，例如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白、以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体显示出期望的生物活性即可。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”是指两种分子之间例如抗体和其靶抗原之间的非随机结合反应。在某些实施方案中，与某种抗原特异性结合的抗体是指以对应于小于约10^-5M，例如小于约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的KD的亲和力结合抗原的抗体。如本文所用，“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。KD越小，抗体与抗原间的结合亲和力越高。

如本文所用，术语“表位”是指抗原上与抗体结合的位点。表位可以由连续的氨基酸或由一种或多种蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在暴露于变性溶剂后保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在变性溶剂的处理中丢失。表位通常包括处于独特的空间构象中的至少3个，更通常地至少5个或8-10个氨基酸。表位限定了抗体的最小结合位点，因此是抗体或其抗原结合片段的特异性靶标。

本文中“序列同一性”的百分比(％)是指两个序列(氨基酸)在对齐中的相同位置具有相同残基的程度。例如，"氨基酸序列与SEQ ID NO:Y X％相同"是指该氨基酸序列与SEQ ID NO:Y的同一性百分比，并被阐述为该氨基酸序列中X％的残基与SEQ ID NO:Y中公开的序列的残基相同。通常，使用计算机程序进行此类计算。比较和对齐序列对的示例性程序包括ALIGN(Myers和Miller,1988)、FASTA(Pearson和Lipman,1988；Pearson,1990)以及gapped BLAST(Altschul等人,1997)、BLASTP、BLASTN、或者GCG(Devereux等人,1984)。

基于抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白分子可以分为五类(同种型)：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并可进一步分为不同的亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等等。基于轻链的氨基酸序列，抗体的轻链可以分为lambda(λ)链和kappa(κ)链。本文公开的抗体可以是上述任何类别或亚型。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，抗体具有选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD的同种型。在一些实施方案中，抗体具有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚型。

如本文所用，术语“抗原结合片段”包括但不限于：Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；Fab’片段，其在Fab片段的CH1结构域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基；Fd片段，其具有VH和CH1结构域；Fd’片段，其具有VH和CH1结构域以及在CH1结构域C端的一个或多个半胱氨酸残基；Fv片段和scFv，其在抗体的单臂中具有VL和VH结构域；dAb片段，其由VH结构域或VL结构域组成；分离的CDR区；F(ab’)₂片段，其为包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab’片段的二价片段；“线性抗体”，其包含与互补轻链多肽共同形成抗原结合区的一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)；和任何上述片段保留了抗原结合活性的修饰形式。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本同质的抗体群体中获得的抗体。也就是说，除了可能天然存在的少量突变，构成群体的每个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的并且针对单一抗原。本文中的术语“单克隆抗体”并不限于通过杂交瘤技术产生的抗体，也不应被解释为要求通过任何特定的方法产生的抗体。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是进一步包含与第二抗原结合的第二抗原结合区的双特异性抗体。

本领域已经鉴定了许多与特定癌症相关的肿瘤相关抗原。如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”是指与正常细胞相比在癌细胞中差异表达的抗原，因此可用于靶向癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是可能激发明显的肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，但不一定由正常细胞表达。这些抗原可以表征为通常在正常细胞中沉默(即不表达)的抗原、仅在某些分化阶段表达的抗原、以及随时间表达的抗原例如胚胎抗原和胎儿抗原。其他癌细胞抗原由突变细胞基因例如致癌基因(例如活化的Ras癌基因)、抑制基因(例如P53突变体)以及由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白编码。其他癌症抗原可以通过病毒基因例如RNA和DNA肿瘤病毒携带的基因编码。许多其他肿瘤相关抗原和针对其的抗体是已知的和/或可商用的，也可以由本领域技术人员制备。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原是T细胞抗原。在一些实施方案中，T细胞抗原选自T细胞受体(TCR)、CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD28、CD44、CD62L、CD69、ICOS、41-BB(CD137)和NKG2D、或其任何组合。在一些实施方案中，T细胞抗原是CD3，并且第二抗原结合区与CD3γ链、δ链、ε链、ζ链和η链中的任一个结合。

在一些实施方案中，CDR序列根据Kabat编号系统定义。当使用Kabat定义的CDR序列时，本文公开的第二抗原结合区的VL包含分别具有如SEQ ID NO:22(RSSTGAVTTSNYAN)、SEQ ID NO:23(GANKRAP)和SEQ ID NO:24(ALWYSNLWV)所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，本文公开的第二抗原结合区的VH包含分别具有如SEQ ID NO:27(GFTFNTY)、SEQ IDNO:28(RSKYNNYA)和SEQ ID NO:29(HGNFGSSYVSYFAY)所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原结合区的VL与特异性结合ROR-1的抗体的VL的C端连接，并且第二抗原结合区的VH与特异性结合ROR-1的抗体VH的C端连接。

在本文公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原结合区的VL与特异性结合ROR-1的抗体的VL通过具有如SEQ ID NO:33(GGGGSGGGGSGGGGS)所示的氨基酸序列的接头连接，第二抗原结合区的VH与特异性结合ROR-1的抗体的VH通过具有如SEQ IDNO:34(GGGSSGGGGSGGGGS)所示的氨基酸序列的接头连接。

如本文所用，术语“双特异性T细胞衔接器”或“BiTE”是指具有两个抗原结合结构域的单多肽链分子，其中一个抗原结合结构域结合T细胞抗原且其中第二个抗原结合结构域结合靶标表面存在的抗原(参见，PCT申请WO 05/061547；Baeuerle等人,2008,Drugs ofthe Future 33:137-147；Bargou等人,2008,Science 321:974-977,其全部内容通过引用并入本发明)。因此，本公开的BiTE具有结合ROR1的抗原结合区和直接靶向T细胞抗原的第二抗原结合区。

在本发明公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，双特异性抗体是HBiTE的形式，如PCT申请号PCT/US2018/016524(其全部内容通过引用并入本发明)中所述。在HBiTE中，轻链从N端到C端包含抗靶标VL结构域、抗CD3VL-CL和单体人IgG1Fc(例如，mFc7.2)；重链从N端到C端包含抗靶标VH结构域、抗CD3 VH-CH1和单体人IgG1Fc(例如，mFc7.2)。单体Fc7.2含有两个能够降低Fc同源二聚化的氨基酸突变(T366L和Y407H)。

在本发明公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，(i)第一抗原结合区的VL包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且第一抗原结合区的VH包含与SEQ IDNO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或(ii)第一抗原结合区的VL包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且第一抗原结合区的VH包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；并且第二抗原结合区的VL包含与SEQID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且第二抗原结合区的VH包含与SEQ ID NO:26具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，第二抗原结合区的VL与第一抗原结合区的VL通过具有如SEQ ID NO:33(GGGGSGGGGSGGGGS)所示的氨基酸序列的接头连接，并且第二抗原结合区的VH与第一抗原结合区的VH通过具有如SEQ ID NO:34(GGGSSGGGGSGGGGS)所示的氨基酸序列的接头连接。

在又一方面，本公开提供了载体，其包含本文公开的核酸。

如本文所用，术语“载体”是指能够运输其所连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指可以连接额外的DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。在一些实施方案中，载体包括但不限于：(1)质粒；(2)噬菌粒；(3)粘粒；(4)人工染色体，如酵母人工染色体、细菌人工染色体或来源于P1的人工染色体；(5)噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；(6)动物病毒，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、孢子囊病毒、痘病毒、杆状病毒。

在另一方面，本公开提供了宿主细胞，其包含本发明公开的核酸或本发明公开的载体。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指已引入表达载体的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括例如CHO细胞，如CHOS细胞和CHO-K1细胞，或HEK293细胞，如HEK293A、HEK293T和HEK293F。

术语“药学上可接受”是指载体或佐剂与组合物的其他成分相容并且对其接受者没有大量毒害，和/或此类载体或佐剂被批准或可用于包含在对人肠胃外施用的药物组合物中。

在一些实施方案中，与本文公开的组合物一起使用的载体或佐剂包括但不限于马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、碳酸氢钠、磷酸钠、组氨酸、甘氨酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、水、葡萄糖、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、N,N-二甲基乙酰胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甘醇单乙醚和表面活性剂聚氧乙烯-山梨糖醇酐单油酸酯。

在又一方面，本公开提供了抗体-药物缀合物，其包含本文公开的抗体或其抗原结合片段，或本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，药物是毒性化疗药物，例如美登素、格尔德霉素、微管蛋白抑制剂例如微管蛋白结合剂(例如奥瑞他汀)，或小沟结合剂例如加利车霉素。

如本文所用，术语“治疗”、“处理”等，指施用药剂或进行程序以便获得效果。这些效果可以是就完全或部分地预防疾病或其症状而言是预防性的，和/或就影响疾病和/或疾病症状的部分或完全治愈而言是治疗性的。如本文所用，“治疗”可包括在哺乳动物中，特别是在人中治疗疾病或病症(例如癌症)，包括：(a)在对疾病易感而尚未被诊断患病的受试者中预防疾病或疾病症状的发生(例如，包括可能与原发疾病相关或由其引起的疾病)；(b)抑制疾病，即阻止其发展；(c)缓解疾病，即导致疾病的消退。治疗可指在癌症的治疗或改善或预防方面取得成功的任何指标，包括任何客观或主观参数，例如消除；缓解；减少症状或使疾病病症对患者而言更容易忍受；减慢恶化或衰退速度；或使恶化的终点衰弱减少。症状的治疗或改善基于一个或多个客观或主观参数；包括医生检查的结果。因此，术语“治疗”包括本文公开的抗体或组合物或缀合物的施用，以预防或延迟、缓解、或阻止或抑制与疾病(例如癌症)相关的症状或病症的发展。术语“治疗效果”是指受试者中疾病、疾病症状或疾病副作用的减少、消除或预防。

如本文所用，术语“有效量”是指施用于受试者以治疗疾病时足以实现这种疾病的治疗的量。

如本文所用，术语“受试者”是指期望诊断、医治或治疗的任何哺乳动物受试者。用于治疗目的的“哺乳动物”是指被归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及实验室动物、动物园动物、运动动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等。在一些实施方案中，哺乳动物是人。

在本文公开的方法的一些实施方案中，癌症是与ROR1的表达相关的癌症。在一些实施方案中，癌症选自乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、食道癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠直肠癌、子宫癌、宫颈癌、脑癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、软骨肉瘤、肾癌、甲状腺癌、皮肤癌、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病，优选选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、人食管鳞状细胞癌、结肠腺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、肝癌和卵巢癌。

在本文公开的方法的一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。

在一些实施方案中，治疗剂是化学治疗剂。化学治疗剂可以包括例如细胞毒剂、抗代谢剂(例如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物等)、拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱衍生物、蒽醌、蒽环类、表鬼臼毒素、喹啉生物碱等)、抗微管剂(例如紫杉烷、长春花生物碱)、蛋白质合成抑制剂(例如三尖杉碱、喜树碱衍生物、喹啉生物碱)、烷化剂(例如烷基磺酸盐、氮丙环、氮芥、亚硝基脲、铂衍生物、三氮烯等)、生物碱、萜类化合物和激酶抑制剂。

在另一方面，本公开提供了本文公开的抗体或其抗原结合片段、本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物或本文公开的抗体-药物缀合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，癌症是与ROR1的表达相关的癌症，优选选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、人食管鳞状细胞癌、结肠腺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、肝癌和卵巢癌。

在又一方面，本公开提供了用于治疗受试者的癌症的本文公开的抗体或其抗原结合片段、本文公开的双特异性抗体或其抗原结合片段、本文公开的药物组合物、或本文公开的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，癌症是与ROR1的表达相关的癌症，优选选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、人食管鳞状细胞癌、结肠腺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、肝癌和卵巢癌。

实施例

为了说明本发明的各项实施方案，给出以下实施例，并不意味着以任何方式限制本发明。本实施例以及本文描述的方法当前代表优选实施方案，是示例性的，并非旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到包含在由权利要求的范围限定的本发明的精神内的变化和其他用途。

HT29细胞(人结直肠癌细胞系)和BJAB细胞(人伯基特样淋巴瘤细胞系)购自ATCC。MDA-MB-231癌细胞(人乳腺癌细胞系)由浙江大学第二附属医院(医学院)癌症研究所捐赠。其他细胞包括COLO205(人结直肠癌细胞系)、H460(人非小细胞肺癌细胞系)、KYSE30(人食管鳞状细胞癌细胞系)、LS174T(人结肠腺癌细胞系)、H1975(人非小细胞肺癌细胞系)、PANC-1(人胰腺癌细胞系)、JEKO-1(人套细胞淋巴瘤细胞系)、RPMIH8226(人多发性骨髓瘤细胞系)、5637(人膀胱癌细胞系)和Jurkat癌细胞(T细胞急性淋巴细胞白血病细胞系)购自国家认证细胞培养物保藏中心。

生物素化人ROR1蛋白、人ROR1蛋白、人ROR1(165-305，Frizzled结构域)蛋白、人ROR1(39-151，Ig样结构域)蛋白、人/食蟹猴/恒河猴ROR1(308-395，Kringle结构域)蛋白和人ROR2/NTRKR2蛋白购自ACROBiosystems。小鼠ROR1蛋白购自Sino Biological。

抗人IgG(γ-链特异性)-R-PE抗体、抗人IgG(Fc特异性)-过氧化物酶抗体和单克隆抗-

M2-过氧化物酶购自Sigma。M13KO7辅助噬菌体购自New England Biolabs。Dynabeads^TM Myone^TM链霉亲和素T1购自Thermofisher Scientific。PE抗-His标签抗体购自BioLegend。M13噬菌体抗体(HRP)购自Sino Biological。

实施例1.淘选和筛选噬菌体展示的天然人Fab文库以鉴定ROR1抗体

如前所述(Zhu等人,J Virol 2006,80:891-899)(对其稍作修改，在第一轮、第二轮、第三轮和第四轮淘选中分别使用5、1、0.2和0.2mg抗原)，使用含有来自约30个健康个体的外周血B细胞的大型(大小，10¹¹)噬菌体展示的天然人Fab文库来选择与磁珠(Dynabeads^TM Myone^TM链霉亲和素T1；ThermoFisher Scientific)缀合的针对重组人ROR1的抗体。通过使用单克隆噬菌体ELISA，从第4轮生物淘选中鉴定出与抗原结合的克隆。随后将第4轮噬菌体用于特异性结合鉴定。通过基于可溶性表达的单克隆酶联免疫吸附测定(SemELISA)和测序分析，鉴定出命名为2H3和3A3的两种特异性Fab克隆。2H3和3A3 Fab都具有κ轻链。3A3轻链具有由Kabat系统的16个氨基酸残基组成的稍长的CDR1。

六组氨酸标记的Fab 2H3和3A3在大肠杆菌菌株HB2151中表达，并通过使用Ni-NTA树脂从周质的可溶性部分中纯化。然后使用标准方案进行ELISA以测量对重组人ROR1(全长胞外域)的结合亲和力。简而言之，将重组人ROR1(ACROBiosystems)以50ng每孔包被在Corning EIA/RIA高结合的96孔板(Corning公司)上，在4℃下过夜，并用在PBS(pH7.4)中的3％脱脂牛奶封闭。加入五倍连续稀释的抗体并在室温下孵育2小时。使用含有0.05％吐温20的PBS洗涤板。通过HRP缀合的抗FLAG标签抗体(Sino Biological)检测结合的抗体。该测定在室温下用TMB底物(Solarbio)进行显影，并用酶标仪在450nm处测量OD值。结果显示Fab克隆2H3和3A3具有高亲和力，其EC50分别为约16nM和36nM(图1)。这表明两种Fab克隆都对人ROR1具有高亲和力，从而能够开发治疗性抗体。

实施例2.抗ROR1单克隆抗体的构建和初步表征

对人ROR1具有高亲和力的Fab克隆2H3和3A3用于构建完整的单克隆抗体2H3和3A3。简而言之，将Fab克隆2H3和3A3的重链Fd片段分别与人IgG1Fc片段的N-端融合。轻链和重链均构建到本发明人为表达单克隆抗体而修饰的载体pDin1中，该载体包含两个分子克隆位点。两种抗ROR1单克隆抗体的构建和初步表征如下进行。

ROR1单克隆抗体的克隆

为了生成抗ROR1单克隆抗体的构建体，使用了以下引物：

ROR1-2H3-LC-FP,5’AGATGCCAGATGTGAAATTGTGTTGAC 3’(正义)；

ROR1-2H3-LC-RP,5’ATTTTGAGCTCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT CTTTGTGACGGGCGAGGACAGGCCCTGATGGGT 3’(反义)；

ROR1-2H3-HC-FP,5’ACTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTA 3’(正义)；

ROR1-2H3-CH1-RP,5’ACAAGATTTGGGCTCAACTTTCTTGT 3’(反义)；

ROR1-2H3-FC-FP,5’AGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA3’(正义)；

ROR1-2H3-FC-RP,5’ACGCGGATCCTTATTTACCCGGGGACAGGGA 3’(反义)；

ROR1-3A3-LC-FP,5’AGATGCCAGATGTGATGTTGTGATGAC 3’(正义)；

ROR1-3A3-HC-FP,5’ACTACAGGTGTCCACTCCGAGGTGCAGCTGGTGGA3’(正义)；

bnIgG20L1,5’GTGTAAGCTTACCATGGGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGT3’(正义)；

bnIgG20H1,5’GTGTTCTAGAGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTC3’(正义)。

对于2H3 mAb的生成，分别使用引物对ROR1-2H3-LC-FP/ROR1-2H3-LC-RP、ROR1-2H3-HC-FP/ROR1-2H3-CH1-RP和ROR1-2H3-FC-FP/ROR1-2H3-FC-RP从抗ROR1 2H3 Fab扩增VL+CL、VH+CH1和Fc结构域的基因片段。分别使用引物对bnIgG20H1/ROR1-2H3-CH1-RP和bnIgG20L1/ROR1-2H3-LC-RP，通过重叠PCR将PCR产物融合到H前导序列和L前导序列的3’端。对于全长重链，使用引物对bnIgG20H1/ROR1-2H3-FC-RP通过重叠PCR将PCR产物与Fc结构域融合。用XbaI和BamHI消化重链基因片段并克隆到pDin1载体中。然后通过HindIII和SacI限制性位点将轻链基因片段进一步克隆到含有重链插入物的构建体中。

3A3 mAb通过使用类似的方案生成。分别使用引物对ROR1-3A3-LC-FP/ROR1-2H3-LC-RP、ROR1-3A3-HC-FP/ROR1-2H3-CH1-RP和ROR1-2H3-FC-FP/ROR1-2H3-FC-RP从抗ROR13A3 Fab扩增VL+CL、VH+CH1和Fc结构域的基因片段。分别使用引物对bnIgG20H1/ROR1-2H3-CH1-RP和bnIgG20L1/ROR1-3A3-LC-RP，通过重叠PCR将PCR产物融合到H前导序列和L前导序列的3’端。对于全长重链，使用引物对bnIgG20H1/ROR1-3A3-FC-RP通过重叠PCR将PCR产物与Fc结构域融合。用XbaI和BamHI消化重链基因片段并克隆到pDin1载体中。然后通过HindIII和SacI限制性位点将轻链基因片段进一步克隆到含有重链插入物的构建体中。

蛋白质表达、纯化和初步表征

2H3和3A3单克隆抗体在293FS或CHO-S细胞中表达。将质粒和转染剂PEI以1:3的比例混合，然后加入293FS或CHO-S细胞培养物中。转染后细胞继续生长5到7天。在8000rpm下离心20分钟，收获细胞培养物。将含有靶蛋白的培养上清液加载到Protein A Sepharose 4Fast Flow色谱柱(GE Healthcare)上，并根据制造商的说明进行纯化。

对纯化的蛋白质进行SDS-PAGE。在非还原性SDS-PAGE上，两种mAb均显示出约150kDa的表观分子量(aMW)。在还原性SDS-PAGE上，重链和轻链分别具有约55kDa和30kDa的表观分子量(数据未显示)。2H3和3A3单克隆抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)氨基酸序列如表1所示。根据Kabat系统的抗体的CDR序列显示于表2中。抗体的完整重链和轻链序列显示于表3中。

表1. 2H3和3A3单克隆抗体的VL和VH序列

表2. 2H3和3A3单克隆抗体的CDR序列

	2H3 mAb	3A3 mAb
			LCDR1	RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:2)	RSSQSLLQSNGYNYVE(SEQ ID NO:12)
LCDR2	DASNRAT(SEQ ID NO:3)	LGSYRAS(SEQ ID NO:13)
			LCDR3	QQRSNWPLT(SEQ ID NO:4)	MQGTHWPLFT(SEQ ID NO:14)
HCDR1	GYTFTYR(SEQ ID NO:7)	GFTFSSY(SEQ ID NO:17)
			HCDR2	TPFNGN(SEQ ID NO:8)	SYDGSN(SEQ ID NO:18)
HCDR3	SGPRGDYVLDY(SEQ ID NO:9)	DLDYSLWFDP(SEQ ID NO:19)

表3. 2H3和3A3单克隆抗体的重链和轻链序列

实施例3.抗ROR1双特异性抗体的构建和初步表征

双特异性T细胞衔接器(BiTE)是一种双特异性抗体形式，其通过同时结合肿瘤抗原和T细胞抗原(例如T细胞表面的CD3分子)来引导细胞毒性T细胞杀死癌细胞。如PCT申请号PCT/US2018/016524(其全部内容通过引用并入本发明)中所述的HBiTE是BiTE的一种特定形式，其中轻链从N端到C端包含抗靶标VL结构域、抗CD3 VL-CL和单体人IgG1Fc(例如，mFc7.2)。重链从N端到C端包含抗靶标VH结构域、抗CD3 VH-CH1和单体人IgG1 Fc(例如，mFc7.2)。单体Fc7.2含有两个能够降低Fc同源二聚化的氨基酸突变(T366L和Y407H)。为产生ROR1×CD3 HBiTE，将上述抗ROR1抗体的VL和VH结构域分别通过(G4S)3接头融合到抗CD3Fab的VL结构域和VH结构域的N端。抗CD3 Fab进一步与mFc7.2的N端融合。将轻链和重链构建到载体pDin1中用于哺乳动物细胞的表达。两种靶向ROR1和CD3的双特异性抗体的构建和初步表征如下进行。

靶向ROR1和CD3的双特异性抗体的克隆

为了生成ROR1双特异性抗体的构建体，使用了以下引物：

bnIgG20L1,5’GTGTAAGCTTACCATGGGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGT3’(正义)；

ROR1-3A3 VL-正向,5’ACTACAGGTGTCCACTCCGATGTTGTGATGACTC 3’(正义)；

ROR1-3A3 VL-反向,5’GGGGGATCCTTTGATATCCACTTTGGTC 3’(反义)；

bnIgG20H1,5’GTGTTCTAGAGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTC3’(正义)；

ROR1-3A3 VH-正向,5’GGCTTACAGATGCCAGATGTGAGGTGCAGCTGGTG3’(正义)；

ROR1-3A3 VH-反向,5’GATAGAGCTCCCTCCACCTGAGGAGACGGTGAC 3’(反义)；

ROR1-2H3 VL-正向,5’ACTACAGGTGTCCACTCCGAAATTGTGTTGAC 3’(正义)；

ROR1-2H3 VL-反向,5’GGGGGATCCTTTGATCTCCACCTTG 3’(反义)；

ROR1-2H3 VH-正向,5’GGCTTACAGATGCCAGATGTCAGGTGCAGCTGGTAC 3’(正义)；

ROR1-2H3 VH-反向,5’GATAGAGCTCCCTCCACCTGAAGAGACGGTGACCAG 3’(反义)。

对于2H3 HBiTE的生成，分别使用引物对ROR1-2H3 VL-正向/ROR1-2H3 VL-反向和ROR1-2H3 VH-正向/ROR1-2H3 VH-反向从抗ROR1 2H3 Fab扩增VL结构域和VH结构域的基因片段。分别使用引物对bnIgG20H1/ROR1-2H3 VL-反向和bnIgG20L1/ROR1-2H3 VH-反向，通过重叠PCR将PCR产物融合到H前导序列和L前导序列的3’端。H前导序列-VL基因片段用XbaI和BamHI消化并克隆到修饰的pDin1载体中用于表达HBiTE，该载体包含抗CD3 hSP34 Fab和完整的Fc片段。然后通过HindIII和SacI限制位点将L前导序列-VH基因片段进一步克隆到含有H前导序列-VL插入物的构建体中。

3A3 HBiTE通过使用与2H3 HBiTE类似的方案生成。分别使用引物对ROR1-3A3 VL-正向/ROR1-3A3 VL-反向和ROR1-3A3 VH-正向/ROR1-3A3 VH-反向从抗ROR1 3A3 Fab扩增VL结构域和VH结构域的基因片段。分别使用引物对bnIgG20H1/ROR1-3A3 VL-反向和bnIgG20L1/ROR1-3A3 VH-反向，通过重叠PCR将PCR产物融合到H前导序列和L前导序列的3’端。H前导序列-VL基因片段用XbaI和BamHI消化，并克隆到含有抗CD3 hSP34 Fab和完整Fc片段的HBiTE衍生pDin1载体中。然后通过HindIII和SacI限制位点将L前导序列-VH基因片段进一步克隆到含有H前导序列-VL插入物的构建体中。

蛋白质表达、纯化和初步表征

双特异性抗体在293FS或CHO-S细胞中表达。将质粒和转染剂PEI以1:3的比例混合，然后加入293FS或CHO-S细胞培养物中。转染后细胞继续生长5至7天。在8000rpm下离心20分钟，收获细胞培养物。将含有靶蛋白的培养上清液加载到Protein A Sepharose 4Fast Flow色谱柱(GE Healthcare)上，并根据制造商的说明进行纯化。

对纯化的蛋白质进行SDS-PAGE。在非还原性SDS-PAGE上，两种HBiTE均显示出约120kDa的表观分子量(aMW)。在还原性SDS-PAGE上，重链和轻链彼此接近，具有约62kDa的表观分子量(数据未显示)。2H3和3A3双特异性抗体(HBiTE)的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)氨基酸序列显示于表4中。根据Kabat系统的抗体的CDR序列显示于表5中。抗体的重链和轻链序列显示于表6中。

表4. 2H3和3A3双特异性抗体的VL和VH序列

表5. 2H3和3A3双特异性抗体的CDR序列

表6. 2H3和3A3双特异性抗体的重链和轻链序列

实施例4.抗ROR1单克隆抗体对ROR1的结合亲和力

根据标准方案进行ELISA，以确定抗ROR1 mAB 2H3和3A3对人ROR1的完整胞外结构域和单独的胞外Ig样结构域、frizzled结构域和kringle结构域的结合亲和力。简而言之，将重组人ROR1(ACROBiosystems)以50ng每孔包被在Corning EIA/RIA高结合的96孔板(Corning公司)上，在4℃下过夜，并用在PBS(pH7.4)中的3％脱脂牛奶封闭。加入五倍连续稀释的生物素化抗体并在室温下孵育2小时。使用含有0.05％吐温20的PBS洗涤板。通过HRP缀合的链霉亲和素(Sino Biological)检测结合的抗体。该测定在室温下用TMB底物(Solarbio)进行显影，并用酶标仪在450nm处检测。通过将数据拟合到Langmuir吸附等温线来计算半数最大结合(EC₅₀)。结果显示于图2中。

结果表明2H3 mAb可分别以0.2nM和1.2nM的EC50结合完整的胞外结构域和kringle结构域，表明2H3 mAb的结合表位位于ROR1的kringle结构域(图2A)；而3A3 mAb可分别以0.18nM和3.1nM的EC50结合完整的胞外结构域和Ig样结构域，表明3A3 mAb对ROR1的Ig样结构域具有高结合亲和力(图2B)。

实施例5.抗ROR1单克隆抗体对各种癌细胞系中细胞表面结合的ROR1的结合试验

为了测量抗ROR1 mAb 2H3和3A3对细胞表面结合的ROR1的结合能力，对多种癌细胞系进行了流式细胞术，这些癌细胞系包括MDA-MB-231、H1975、JEKO-1、KYSE-30、PANC-1、H460、BJAB、COLO205和LS174T。将约5×10⁵个细胞与抗体(10μg/ml)在冰上孵育1小时。将细胞用含有0.1％牛血清白蛋白的PBS(PBSA)洗涤一次，并重悬于100μl PBSA中。然后加入1μL抗人IgG(Fc特异性)-FITC缀合物(Sigma)并孵育30分钟。用PBSA洗涤细胞一次，然后用于流式细胞术分析。结果显示于图3中。

结果表明，mAb 2H3和3A3对这些细胞系具有高度相似的结合能力。两种mAb都可以很好地结合MDA-MB-231、H1975、JEKO-1、KYSE-30、PANC-1、H460细胞系(图3A)，而对细胞系BJAB、COLO205和LS174T没有显示结合(图3B)。这表明2H3和3A3 mAb对ROR1阳性癌细胞系具有优异的结合能力，可用于杀伤多种表达ROR1的癌细胞。

实施例6.靶向ROR1和CD3的双特异性抗体对ROR1和CD3的结合亲和力

为了确定2H3和3A3双特异性抗体对人ROR1和CD3的结合亲和力，如实施例5中所述进行ELISA。结果显示于图4中。结果表明，2H3和3A3双特异性抗体分别以4.9nM和10nM的EC50结合人重组CD3(图4A)，分别以47nM和51nM的EC50结合ROR1(图4B)。

实施例7.靶向ROR1和CD3的双特异性抗体对癌细胞系的结合亲和力

为了确定双特异性抗体2H3和3A3对癌细胞系的结合亲和力，如实施例6中所述，对表达ROR1的细胞系JEKO-1和CD3阳性Jurkat细胞系进行流式细胞术。结果如图5所示。

结果表明，2H3双特异性抗体以86.5nM的EC50结合表达ROR1的MCL细胞系并以154.9nM的EC50结合表达CD3的Jurkat细胞系(图5A)，而3A3双特异性抗体以71.4nM的EC50结合表达ROR1的MCL细胞系并以251.8nM的EC50结合表达CD3的Jurkat细胞系(图5B)。

实施例8.靶向ROR1和CD3的双特异性抗体介导的人癌细胞系的杀伤

双特异性T细胞衔接器可以同时结合特定的肿瘤抗原和T细胞抗原(例如T细胞表面的CD3分子)，从而引起T细胞的聚集和活化，并最终导致肿瘤细胞的杀伤。为了评估HBiTE形式的靶向ROR1和CD3的双特异性抗体的杀伤效率，使用包括JEKO-1、MDA-MB-231、SK-HEP-1和PANC-1的四种ROR1表达细胞系作为靶细胞。

对于悬浮细胞系(JEKO-1)，进行流式细胞术以检测CFSE标记的JEKO-1的活性。将JEKO-1的单细胞悬液收集到50ml离心管中。用PBS洗涤细胞两次以去除任何血清，并用PBS以5x10⁶/ml的密度重悬。CFSE以0.5μM的终浓度添加到细胞悬液中。室温避光孵育10分钟后，加入4-5倍体积的冷完全培养基(含≥10％血清)以停止标记。使用完全培养基洗涤细胞3次。对于每个孔，将2x10⁴个靶细胞接种在100μl RPMI 1640完全培养基中。同一天，将50μlRPMI 1640完全培养基中的10⁵PBMC添加到每个孔中(靶细胞与效应细胞的比例＝1:5)。然后，将从1μg/ml连续稀释5倍的50μl抗体加入每个孔中。孵育后48小时，按照流式细胞术测量的标准方案处理细胞。结果显示于图6中。

对于贴壁细胞系(DA-MB-231、SK-HEP-1和PANC-1)，将10⁴个靶细胞接种在100μlRPMI 1640完全培养基中过夜。同时，将冷冻的PBMC复苏并接种在30mL RPMI 1640完全培养基中过夜。第二天，加入50μl RPMI1640完全培养基中的10⁵PBMC(由于靶细胞过夜复制，实际靶细胞：效应细胞比例＝1:5)。然后，将从1μg/ml连续稀释5倍的50μl抗体加入每个孔中。孵育后48小时，从靶细胞去除培养基，加入100μl含有10％CCK8的RPMI1640完全培养基，在CO₂培养箱中孵育30分钟。根据制造商的说明，使用酶标仪测量细胞杀伤活性。结果显示于图7-9中。

从图6可以看出，对于人套细胞淋巴瘤细胞系JEKO-1，2H3和3A3双特异性抗体在PBMC存在下显示出对超过80％的肿瘤细胞的有效杀伤能力。2H3和3A3双特异性抗体的EC50值分别为0.083ng/ml和1.098ng/ml。

从图7可以看出，对于人乳腺癌细胞系MDA-MB-23，2H3和3A3双特异性抗体在PBMC存在下也显示出对超过60％的肿瘤细胞的有效杀伤效率。2H3和3A3双特异性抗体的EC50值分别为3.312ng/ml和13.99ng/ml。

从图8可以看出，对于人肝腺癌细胞系SK-HEP-1，2H3和3A3双特异性抗体均显示出对约40％的肿瘤细胞的杀伤效力，EC50值分别为0.144ng/ml和0.805ng/ml。

从图9可以看出，对于人胰腺癌细胞系PANC-1，2H3和3A3双特异性抗体显示出对约40％的肿瘤细胞的杀伤效力。

综上所述，2H3和3A3双特异性抗体均显示出对多种癌细胞系的有效杀伤活性，表明它们在治疗各种表达ROR1的癌症方面具有良好的潜力。

实施例9.抗ROR1单克隆抗体介导的对人癌细胞系的ADCC

复苏冷冻的NK细胞，并在含有20％FBS、1％青霉素/链霉素和50IU IL-2的RPMI1640完全培养基中在37℃和5％CO₂下培养过夜。以人结直肠癌细胞系HT29细胞为靶细胞，用完全培养基将其稀释至1.5×10⁵个细胞/mL的浓度，以100μL/孔加入96孔板，37℃培养过夜。用RPMI1640培养基分别制备浓度为400μg/mL、40μg/mL和4μg/mL的抗ROR1单克隆抗体2H3 Mab和3A3 Mab，IgG同种型抗体用作阴性对照。将制备的抗体溶液以50μL/孔加入含有靶细胞的96孔板中。通过离心收集NK细胞并用完全培养基将其稀释至6×10⁵个细胞/mL。将50μLNK细胞加入到96孔板中。抗体的最终浓度分别为100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL。将所有培养板在37℃下孵育72小时。然后，去除原始培养基并用含有10％CCK-8的新鲜培养基以100μL/孔替换。将板在37℃下孵育约30分钟，并在450nm(参考波长为630nm)处使用酶标仪测量OD值。

杀伤效率使用如下公式计算：

细胞毒性％＝(OD_{肿瘤+NK+0μg/mL mab}-OD_{肿瘤+NK+xμg/mL mab})/OD_{肿瘤+NK+0μg/mL mab}×100％，

其中x表示1、10或100。

2H3 Mab和3A3 Mab对HT29细胞的ADCC杀伤显示于图10A-10B中。结果表明，与对照组相比，2H3 Mab和3A3 Mab介导了显著增强的对HT29细胞的ADCC杀伤，并且杀伤效率呈剂量依赖性。这表明2H3 Mab和3A3 Mab对表达ROR1的癌细胞系具有强效的杀伤效率。

实施例10.双特异性抗体介导的小鼠中肿瘤生长的抑制

为了验证2H3双特异性抗体的体内抗肿瘤作用，将过表达人ROR1的结肠癌细胞LS174T-ROR1(1×10⁶个细胞/小鼠)和效应细胞人PBMC(1.5×10⁶个细胞/小鼠)混合，并皮下接种至B-NDG小鼠的右侧腋下。接种后第12天，肿瘤体积达到约100mm³，对小鼠进行分组并给药。在实验组中，小鼠每周三次瘤内注射10μg/kg的2H3双特异性抗体(ROR1-2H3-HB)。生理盐水用作阴性对照。处理一周后，在接种后第12、15、17和19天测量肿瘤体积。在接种后第19天，处死小鼠并测量肿瘤重量。

为了验证3A3双特异性抗体的体内抗肿瘤作用，将过表达人ROR1的结肠癌细胞LS174T-ROR1(2×10⁶个细胞/小鼠)和效应细胞人PBMC(2×10⁶个细胞/小鼠)混合，并皮下接种至B-NDG小鼠的右侧腋下。接种后第6天，肿瘤体积达到约100mm³，对小鼠进行分组并给药。在实验组中，小鼠每周三次瘤内注射10μg/kg的3A3双特异性抗体(ROR1-3A3-HB)。生理盐水用作阴性对照。处理一周后，在接种后第6、8、12和15天测量肿瘤体积。在接种后第15天，处死小鼠并测量肿瘤重量。

通过使用以下公式计算针对肿瘤体积的肿瘤生长抑制(TGI)率：

(对照组平均肿瘤体积-实验组平均肿瘤体积)/对照组平均肿瘤体积。

通过使用以下公式计算针对肿瘤重量的肿瘤生长抑制(TGI)率：

(对照组的平均肿瘤重量-实验组的平均肿瘤重量)/对照组的平均肿瘤重量。

2H3和3A3双特异性抗体的结果分别显示于图11A-11B和图12A-12B中。

结果表明，2H3双特异性抗体在小鼠模型中显著抑制肿瘤生长，其中肿瘤体积抑制率为72.2％(图11A)，肿瘤重量抑制率为65.3％(图11B)；3A3双特异性抗体在小鼠模型中显著抑制肿瘤生长，其中肿瘤体积抑制率为60.7％(图12A)，肿瘤重量抑制率为58.6％(图12B)。

总而言之，结果表明，2H3和3A3双特异性抗体可以有效抑制表达ROR1的肿瘤细胞的生长，表明其具有治疗ROR1阳性癌症的潜力。

尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员而言，这些实施方案仅作为示例提供是显而易见的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将想到许多变体、变化和替换。应当理解，可以采用本文描述的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

序列表

<110> 浙江时迈药业有限公司

<120> 针对ROR1的抗体及其用途

<130> C22W1823

<150> PCT/CN2021/108155

<151> 2021-07-23

<160> 34

<170> PatentIn 版本 3.5

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<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 2H3 mAb LCDR2

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2H3 mAb轻链

<400> 5

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

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Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2H3 mAb重链

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Arg

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Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met

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Gly Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

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Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln Ser

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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 21

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对CD3的VL

<400> 21

Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr

20 25 30

Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

35 40 45

Gly Leu Ile Gly Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser

65 70 75 80

Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser

85 90 95

Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对CD3的LCDR1

<400> 22

Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对CD3的LCDR2

<400> 23

Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对CD3的LCDR3

<400> 24

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 25

<211> 560

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2H3 HBiTE轻链

<400> 25

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Val Thr Gln

115 120 125

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser

130 135 140

Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp

145 150 155 160

Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Ala

165 170 175

Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ser

180 185 190

Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe

195 200 205

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly

210 215 220

Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

245 250 255

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

260 265 270

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

275 280 285

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

290 295 300

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

305 310 315 320

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

325 330 335

Gly Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

340 345 350

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

355 360 365

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

370 375 380

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

385 390 395 400

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

405 410 415

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

420 425 430

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

435 440 445

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

450 455 460

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys

465 470 475 480

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

485 490 495

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

500 505 510

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

515 520 525

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

530 535 540

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

545 550 555 560

<210> 26

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对CD3的VH

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对CD3的HCDR1

<400> 27

Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对CD3的HCDR2

<400> 28

Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala

1 5

<210> 29

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对CD3的HCDR3

<400> 29

His Gly Asn Phe Gly Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 30

<211> 584

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2H3 HBiTE重链

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Arg

20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Pro Arg Gly Asp Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

145 150 155 160

Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro

165 170 175

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn

180 185 190

Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

210 215 220

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly

225 230 235 240

Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

260 265 270

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

275 280 285

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

290 295 300

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

305 310 315 320

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

325 330 335

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

340 345 350

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala

355 360 365

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

370 375 380

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

385 390 395 400

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

405 410 415

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

420 425 430

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

435 440 445

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

450 455 460

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

465 470 475 480

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

485 490 495

Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

500 505 510

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

515 520 525

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His

530 535 540

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

545 550 555 560

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

565 570 575

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

580

<210> 31

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3A3 HBiTE轻链

<400> 31

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Val Glu Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Thr His Trp Pro Leu Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile

100 105 110

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

130 135 140

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr

145 150 155 160

Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg

165 170 175

Gly Leu Ile Gly Gly Ala Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Leu Ser Gly Asp Glu Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser

195 200 205

Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser

210 215 220

Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

225 230 235 240

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

245 250 255

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

260 265 270

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

275 280 285

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

290 295 300

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

305 310 315 320

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

325 330 335

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

340 345 350

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

355 360 365

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

370 375 380

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

385 390 395 400

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

405 410 415

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

420 425 430

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

435 440 445

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

450 455 460

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

465 470 475 480

Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

485 490 495

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

500 505 510

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser Lys

515 520 525

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

530 535 540

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

545 550 555 560

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

565

<210> 32

<211> 583

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3A3 HBiTE重链

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Leu Asp Tyr Ser Leu Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

145 150 155 160

Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

165 170 175

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr

180 185 190

Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

195 200 205

Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

210 215 220

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Ser

225 230 235 240

Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

245 250 255

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

260 265 270

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

275 280 285

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

290 295 300

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

305 310 315 320

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

325 330 335

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

340 345 350

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

355 360 365

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

370 375 380

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

385 390 395 400

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

405 410 415

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

420 425 430

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

435 440 445

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

450 455 460

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

465 470 475 480

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

485 490 495

Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

500 505 510

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

515 520 525

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu His Ser

530 535 540

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

545 550 555 560

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

565 570 575

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

580

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 33

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 34

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Claims

1.特异性结合ROR1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中

(i)所述VL包含分别具有如SEQ ID NO:2-4所示的氨基酸序列的LCDR 1-3，并且所述VH包含分别具有如SEQ ID NO:7-9所示的氨基酸序列的HCDR 1-3；或者

(ii)所述VL包含分别具有如SEQ ID NO:12-14所示的氨基酸序列的LCDR 1-3，并且所述VH包含分别具有如SEQ ID NO:17-19所示的氨基酸序列的HCDR 1-3。

2.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中

(i)所述VL包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VH包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或者

(ii)所述VL包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VH包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含

(i)轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含与SEQID NO:10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或者

(ii)轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO:15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含与SEQID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD的同种型。

5.根据权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚型。

6.根据权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fd、Fd’、Fv、scFv、ds-scFv和dAb。

7.根据权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为单克隆抗体。

8.根据权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。

9.根据权利要求8的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为进一步包含与第二抗原结合的第二抗原结合区的双特异性抗体。

10.根据权利要求9的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原为肿瘤相关抗原或免疫细胞抗原。

11.根据权利要求9的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原为T细胞抗原。

12.根据权利要求11的抗体或其抗原结合片段，其中所述T细胞抗原选自T细胞受体(TCR)、CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD28、CD44、CD62L、CD69、ICOS、41-BB(CD137)和NKG2D、或其任意组合。

13.根据权利要求9的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原为CD3，并且所述第二抗原结合区包含VL和VH，其中所述VL包含分别具有如SEQ ID NO:22-24所示的氨基酸序列的LCDR 1-3，并且所述VH包含分别具有如SEQ ID NO:27-29所示的氨基酸序列的HCDR 1-3。

14.根据权利要求13的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合区包含以下的VL和VH，所述VL包含与SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述VH包含与SEQ ID NO:26具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

15.根据权利要求13或14的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合区的VL与所述特异性结合ROR-1的抗体的VL的C端连接，并且所述第二抗原结合区的VH与所述特异性结合ROR-1的抗体的VH的C端连接。

16.根据权利要求15的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合区的VL与所述特异性结合ROR-1的抗体的VL通过具有如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的接头连接，并且所述第二抗原结合区的VH与所述特异性结合ROR-1的抗体的VH通过具有如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的接头连接。

17.根据权利要求13-16中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体包含

(i)轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO:25具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含与SEQID NO:30具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或者

(ii)轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO:31具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述重链包含与SEQID NO:32具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

18.根据权利要求9-17中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体为双特异性T细胞衔接器(BiTE)。

19.双特异性抗体或其抗原结合片段，所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含与RORl结合的包含VL和VH的第一抗原结合区和与CD3结合的包含VL和VH的第二抗原结合区，

其中：

(i)所述第一抗原结合区的VL包含分别具有如SEQ ID NO:2-4所示的氨基酸序列的LCDR 1-3，且所述第一抗原结合区的VH包含分别具有如SEQ ID NO:7-9所示的氨基酸序列的HCDR 1-3；或

(ii)所述第一抗原结合区的VL包含分别具有如SEQ ID NO:12-14所示的氨基酸序列的LCDR 1-3，且所述第一抗原结合区的VH包含分别具有如SEQ ID NO:17-19所示的氨基酸序列的HCDR 1-3；

并且其中所述第二抗原结合区的VL包含分别具有如SEQ ID NO:22-24所示的氨基酸序列的LCDR 1-3，且所述第二抗原结合区的VH包含分别具有如SEQ ID NO:27-29所示的氨基酸序列的HCDR 1-3。

20.根据权利要求19的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中

(i)所述第一抗原结合区的VL包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且所述第一抗原结合区的VH包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或者

(ii)所述第一抗原结合区的VL包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且所述第一抗原结合区的VH包含与SEQ ID NO:16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；

并且其中所述第二抗原结合区的VL包含与SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且所述第二抗原结合区的VH包含与SEQ ID NO:26具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

21.根据权利要求19或20的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合区的VL与所述第一抗原结合区的VL的C端连接，并且所述第二抗原结合区的VH与所述第一抗原结合区的VH的C端连接。

22.根据权利要求21的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗原结合区的VL与所述第一抗原结合区的VL通过具有如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的接头连接，并且所述第二抗原结合区的VH与所述第一抗原结合区的VH通过具有如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的接头连接。

23.根据权利要求19-22中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体包含

24.根据权利要求19-23中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体为双特异性T细胞衔接器(BiTE)。

25.核酸，其包含编码根据权利要求1-18中任一项的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求19-24中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。

26.载体，其包含根据权利要求25的核酸。

27.宿主细胞，其包含根据权利要求25的核酸或根据权利要求26的载体。

28.药物组合物，其包含(i)根据权利要求1-18中任一项的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求19-24中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的载体或佐剂。

29.抗体-药物缀合物，其包含根据权利要求1-18中任一项的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求19-24中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段。

30.治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-18中任一项的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求19-24中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求28的药物组合物、或根据权利要求29的抗体-药物缀合物。

31.根据权利要求30的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、食道癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、结直肠癌、子宫癌、宫颈癌、脑癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、软骨肉瘤、肾癌、甲状腺癌、皮肤癌、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病，优选选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肺腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、人食管鳞状细胞癌、结肠腺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、肝癌和卵巢癌。

32.根据权利要求30或31的方法，其进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。

33.权利要求32的方法，其中所述第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。

34.权利要求32或33中的方法，其中所述第二治疗剂选自布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、PD-1/PD-L1抑制剂、LAG3抑制剂和糖皮质激素。