JP7257971B2 - 抗ｃｄ４０抗体、その抗原結合フラグメント、およびその医学的使用 - Google Patents

抗ｃｄ４０抗体、その抗原結合フラグメント、およびその医学的使用 Download PDF

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Description

本出願は、２０１７年６月１日に出願された中国特許出願第ＣＮ２０１７１０４０２５５９．０号の優先権を主張する。前述の出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、抗ＣＤ４０抗体、その抗原結合フラグメント、抗ＣＤ４０抗体のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体またはヒト化抗体、ならびにヒト抗ＣＤ４０抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびに抗癌剤としてのその使用に関する。
健康の最重要課題の一つとして、癌は、長期的に人類社会が直面する重要な課題である。伝統的な手術、化学療法および放射線療法のような治療は、播種性固形腫瘍の治療においてしばしば限定された効果を有する。腫瘍免疫療法、特にＴ細胞腫瘍免疫療法は、腫瘍療法の分野におけるホットスポットである。腫瘍免疫療法は腫瘍を有する患者においてキラーＴ細胞を完全に活性化することによって腫瘍を死滅させ、これは腫瘍を処置するための最も有効かつ最も安全な方法でありうる。腫瘍免疫療法は、現在、播種性転移性腫瘍を含むいくつかの異なるタイプの癌の治療において有望な見通しを示している。
ヒト身体におけるＴ細胞の活性化は、２つのシグナル伝達経路を含む系を使用する。抗原発現細胞（ＡＰＣ）を介してＭＨＣ抗原ペプチドを発現することによってＴ細胞に第１のシグナルを提供することに加えて、一連の共刺激分子が、第２のシグナルを提供するために必要とされ、したがって、Ｔ細胞の正常な免疫応答を可能にする。この二重シグナル伝達経路系はｉｎ ｖｉｖｏでの免疫系のバランスにおいて重要な役割を果たし、これは、自己および非自己抗原に対する異なる免疫応答を活性化するために身体を厳密に調節する。共刺激分子によって提供される第２のシグナルの欠如はＴ細胞応答の失敗または持続性特異的免疫応答の喪失をもたらし、したがって免疫寛容をもたらす。したがって、第２のシグナル伝達経路は、免疫応答の全過程を調節する際に非常に重要な役割を果たす。
ＣＤ４０は、細胞表面に発現される糖タンパク質の１つである。これは、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属し、免疫系において重要な役割を果たす４８ｋＤａのＩ型膜固有糖タンパク質である。それは、Ｂ細胞、樹状細胞、単球およびマクロファージのような種々の免疫細胞において発現される。シグナル伝達がＣＤ４０によって媒介される場合、特殊化された抗原発現細胞が活性化される。ＣＤ４０の天然リガンドは、ＣＤ１５４またはＣＤ４０Ｌと呼ばれ、成熟Ｔリンパ球において主に発現されることが知られている。ＣＤ４０Ｌ媒介シグナル伝達は、免疫細胞の活性化および増殖、ならびにサイトカインおよびケモカインの産生を含む、多くの細胞生物学的事象を誘発しうる。ＣＤ４０シグナル伝達は、特に腫瘍環境の状況において、Ｔ細胞依存性免疫応答にとって極めて重要である。ＣＤ４０刺激樹状細胞は、腫瘍細胞を根絶する能力を有する腫瘍特異的エフェクターＴ細胞を活性化できる。
ＣＤ４０の発現は、種々の正常細胞およびＢリンパ球を含む腫瘍細胞において見出されている。たとえば、黒色腫はＣＤ４０を発現する腫瘍であり、一方、固形腫瘍の３０％～７０％もＣＤ４０を発現する。ＣＤ４０の活性化は、腫瘍特異的Ｔ細胞応答の免疫活性化、ＣＤ４０陽性腫瘍の直接アポトーシス、および刺激によって引き起こされるＡＤＣＣの体液性反応を含む、抗腫瘍応答を効果的に誘発しうることが現在知られている（非特許文献１）。さらに、観察された腫瘍根絶は、腫瘍特異性を有する細胞傷害性Ｔリンパ球の発生と強く関連する。一方、ＣＤ４０抗体の全身投与は一般に、ショック症候群およびサイトカイン放出症候群などの様々な副作用に関連することも無視すべきではない（非特許文献２）。
現在、多くの国際的な製薬会社が、免疫活性化を特異的に刺激し、腫瘍に対する患者自身の免疫系応答を最大化し、それによって腫瘍細胞を死滅させる目的を達成する、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を開発している。関連特許には、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、および特許文献１８などが含まれる。今日まで、Pfizer（関連製品はRocheにライセンスされている。）、Alligator、および前臨床動物モデルにおいて良好な腫瘍殺傷効果を有することが見出された他の会社、の抗ＣＤ４０抗体は、フェーズ１の臨床試験に入った。
中国特許出願公開第１１９８６４７号 中国特許出願公開第１３６９０１５号 中国特許出願公開第１５８２１６５号 中国特許出願公開第１００４３０４１９号 中国特許出願公開第１０１０１４３８６号 中国特許出願公開第１０１２３７８８２号 中国特許出願公開第１０１２８９５１０号 中国特許出願公開第１０１４９００８６号 中国特許出願公開第１０３８４２３８２号 中国特許出願公開第１０４９１８９５７号 国際公開第２００２／０２８９０４号 国際公開第２０１１／１２３４８９号 国際公開第２０１２／１４９３５６号 国際公開第２０１３／０３４９０４号 国際公開第２０１５／０９１８５３号 国際公開第２０１６／１９６３１４号 国際公開第２０１７／０４０９３２号 国際公開第２０１７／００４００６号
Tong et al, Cancer Gene Therapy, 2003, 10: 1-13 van Mierlo et al, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 5561-5566 J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968) Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136 Using Antibodies: A Laboratory Manual, Chapters 5-8 and 15, Cold Spring Harbor The Immunoglobulin FactsBook, 2001 ISBN 014441351 Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224, (4th edition) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
本発明は、高い親和性、高い選択性および高い生物学的活性を有する抗ＣＤ４０抗体、ならびにＣＤ４０およびその経路を刺激することによって免疫応答を活性化するための癌治療薬／組成物およびその方法、を提供することを目的とする。
本発明は、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５８、配列番号５９または配列番号６０からなる群から選択される少なくとも１つのＬＣＤＲを含む抗体軽鎖可変領域、および／または、
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５５、配列番号５６または配列番号５７からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＤＲを含む抗体重鎖可変領域、を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体軽鎖可変領域は、配列番号６、配列番号１４、配列番号４２、配列番号５０または配列番号５８の配列を有するＬＣＤＲ１を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体軽鎖可変領域は、配列番号７、配列番号１５、配列番号４３、配列番号５１または配列番号５９の配列を有するＬＣＤＲ２を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体軽鎖可変領域は、配列番号８、配列番号１６、配列番号４４、配列番号５２または配列番号６０の配列を有するＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体重鎖可変領域は、配列番号３、配列番号１１、配列番号３９、配列番号４７または配列番号５５の配列を有するＨＣＤＲ１を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体重鎖可変領域は、配列番号４、配列番号１２、配列番号４０、配列番号４８または配列番号５６の配列を有するＨＣＤＲ２を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体重鎖可変領域は、配列番号５、配列番号１３、配列番号４１、配列番号４９または配列番号５７の配列を有するＨＣＤＲ３を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号６、配列番号７および配列番号８の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号４７、配列番号４８の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号４９を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号５５、配列番号５６の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号５７を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、
抗体軽鎖可変領域は、
配列番号６、配列番号７および配列番号８の配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または、
配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または、
配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４の配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または、
配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２の配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または、
配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０の配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、を含み、かつ、
抗体重鎖可変領域は、
配列番号３、配列番号４および配列番号５の配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または、
配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または、
配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１の配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または、
配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９の配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または、
配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７の配列をそれぞれ有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、を含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
特に好ましい抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下からなる群から選択されうる。
（１）抗体軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３、配列番号４および配列番号５の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
（２）抗体軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
（３）抗体軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
（４）抗体軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
（５）抗体軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
好ましい実施形態において、抗体軽鎖可変領域は、配列番号２または配列番号１０の配列を有し、抗体重鎖可変領域は、配列番号１または配列番号９の配列を有する。
上記抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体またはキメラ抗体でありうる。
好ましくは、マウス抗体またはキメラ抗体の、
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１で示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２で示され、または、
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号９で示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０で示され、または、
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のアミノ酸配列は、配列番号３８で示され、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）のアミノ酸配列は、配列番号３７で示され、または、
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のアミノ酸配列は、配列番号４６で示され、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）のアミノ酸配列は、配列番号４５で示され、または、
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のアミノ酸配列は、配列番号５４で示され、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）のアミノ酸配列は、配列番号５３で示される。
本発明の好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体またはその抗原結合フラグメントがマウス抗体またはそのフラグメントである抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上記のようなマウス抗体またはそのフラグメントが提供され、ここで、抗体軽鎖可変領域は、マウスのκ鎖、λ鎖、またはその変異体の軽鎖ＦＲ領域をさらに含む。
本発明の好ましい実施形態において、マウスのκ鎖、λ鎖、またはその変異体の軽鎖定常領域をさらに含む上記のマウス抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上記のようなマウス抗体またはそのフラグメントが提供され、ここで、抗体重鎖可変領域は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖ＦＲ領域をさらに含む。
本発明の好ましい実施形態において、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖定常領域をさらに含む上記のマウス抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態では、キメラ抗体またはそのフラグメントでありうる上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、軽鎖可変領域の配列が配列番号２または配列番号１０で示される上記の抗ＣＤ４０キメラ抗体またはそのフラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、重鎖可変領域の配列が配列番号１または配列番号９で示される上記の抗ＣＤ４０キメラ抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、ヒトκ鎖、λ鎖、またはその変異体の軽鎖定常領域をさらに含む上記の抗ＣＤ４０キメラ抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖定常領域をさらに含む上記の抗ＣＤ４０キメラ抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、ヒト抗体またはそのフラグメントである上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態では、ヒト化抗体またはそのフラグメントである上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上記のような抗ＣＤ４０ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、ヒト抗体は、配列番号１８または配列番号２０またはその変異体の配列を有し、好ましくは、変異体が軽鎖中にアミノ酸の０～１０個の変異を有し、より好ましくは、変異が２位および３位で生じ、かつ変異したアミノ酸の両方は、好ましくはＩ、ＶまたはＬである。
本発明の好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、ここで、ヒト抗体は、配列番号１７または配列番号１９またはその変異体の配列を有し、好ましくは、変異体が軽鎖中にアミノ酸の０～１０個の変異体を有し、より好ましくは、変異体が６位および８位で生じ、かつ変異したアミノ酸の両方は、好ましくはＩ、ＡまたはＬである。
本発明の好ましい実施形態において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の定常領域をさらに含む上記の抗ＣＤ４０ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、ヒトκ鎖、λ鎖またはその変異体の軽鎖ＦＲ領域をさらに含む上記の抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖可変領域上の軽鎖ＦＲ領域の配列は、配列番号２２に示されるヒト生殖系列の軽鎖ＩＧｋＶ１－３３配列に由来するか、または配列番号２４に示されるヒト生殖系列の軽鎖ＩＧｋＶ２－２８配列に由来する上記の抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、ヒト化抗体軽鎖の配列は、配列番号３３もしくは配列番号３４に示される配列、またはその変異体である上記の抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、ヒト化抗体軽鎖の配列は、配列番号１８もしくは配列番号２０に示される配列、またはその変異体である上記の抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態ではヒト化抗体の軽鎖可変領域の変異体は、好ましくは、軽鎖中にアミノ酸の０～１０個の突然変異を有し、より好ましくは、突然変異が２位および３位に起こり、突然変異したアミノ酸の両方が、好ましくは、Ｉ、ＶまたはＬである上記のような抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、ヒトκ鎖、λ鎖またはその変異体の軽鎖定常領域をさらに含む上記の抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖ＦＲ領域をさらに含む上記の抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントが提供される。
好ましい実施形態において、重鎖可変領域の重鎖ＦＲ領域は、配列番号２１に示されるヒト生殖系列の重鎖ＩＧＨＶ１－６９配列に由来するか、または配列番号２３に示されるヒト生殖系列の重鎖ＩＧＨＶ１－２配列に由来する上記のような抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントが提供される。
好ましい実施形態では、ヒト化抗体の重鎖配列は、配列番号２６もしくは配列番号３０、またはその変異体で示される上記の抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上記の抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントが提供され、ここで、ヒト化抗体の重鎖配列は、配列番号１７または配列番号１９、またはその変異体として示され、好ましくは、変異体が重鎖可変領域においてアミノ酸の０～１０個の変異を有し、より好ましくは、変異が６位および８位に生じ、そして変異したアミノ酸は、好ましくはＩ、Ａ、またはＬである。
本発明の好ましい実施形態において、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖定常領域、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖ＦＲ領域、より好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖ＦＲ領域をさらに含む上記の抗ＣＤ４０ヒト化抗体またはそのフラグメントが提供される。
本発明の好ましい実施態様において、提供されるのは上記のような抗ＣＤ４０抗体または抗原結合フラグメントであり、ここで、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、直鎖抗体、単鎖抗体、ナノボディ、ドメイン抗体または多重特異抗体である。
本発明はさらに、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体、または上記の単鎖抗体をコードするＤＮＡ配列を提供する。
本発明はさらに、上記ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、上記の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、宿主細胞が細菌、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）である上記の宿主細胞が提供される。
本発明の好ましい実施形態において、上記の宿主細胞は、酵母、好ましくはピキア酵母（Pichia pastoris）である。
本発明の好ましい実施形態において、上記の宿主細胞は、哺乳類細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞である。
本発明はさらに、上記のような抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む単鎖抗体を提供する。
本発明はさらに、上記のような抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む多重特異性抗体を提供する。
本発明はさらに、上記の抗ＣＤ４０抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む抗体－薬物結合体を提供する。抗体－薬物結合体は当技術分野で周知であり、抗体－リンカー－薬物（毒素）の相互接続によって形成され、公知のリンカーには切断可能なリンカー、下位切断可能なリンカー（たとえば、リンカー（ＳＭＣＣ、ＳＰＤＰなどを含むが、これらに限定されない））が含まれる。ＤＭ１、ＤＭ４、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦなどの毒素も当技術分野で周知である。
本発明はさらに、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体、または単鎖抗体、および上記のような薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ媒介疾患または状態の治療または予防のための医薬の製造における、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体、一本鎖抗体、抗体－薬物結合体、または医薬組成物の使用を提供し、ここで、当該疾患は、好ましくは癌であり、当該癌は、最も好ましくはリンパ腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、食道癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、胆嚢癌、神経膠芽腫および黒色腫である。
本発明はさらに、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ媒介疾患または状態を治療および予防するための方法を提供し、該方法は治療有効量の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体、一本鎖抗体、抗体－薬物結合体、または上記の医薬組成物を対象に投与することを含み、当該疾患は好ましくは癌であり、当該癌は、最も好ましくはリンパ腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、食道癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、胆嚢癌、神経膠芽腫および黒色腫である。
本発明はさらに、自己免疫疾患を有する患者の症状を改善するための医薬の製造における、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体、単鎖抗体、抗体－薬物結合体、または医薬組成物の使用を提供する。
本発明はさらに、炎症性疾患を有する患者の症状を改善するための医薬の製造における、上記の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、多重特異性抗体、一本鎖抗体、抗体－薬物結合体、または医薬組成物の使用を提供する。
ＣＤ８０活性化分子に基づくＤＣ細胞に対するマウス抗ヒトＣＤ４０抗体の活性化を示す図 ＣＤ８６活性化分子に基づくＤＣ細胞に対するマウス抗ヒトＣＤ４０抗体の活性化を示す図 ヒトＰＢＭＣおよびＤＣ細胞を同時にグラフトしたＲａｊｉグラフトリンパ腫の腫瘍増殖曲線を示すグラフ ヒトＰＢＭＣおよびＤＣ細胞を同時にグラフトしたＲａｊｉグラフトリンパ腫をグラフトしたＮＯＧマウスの体重変化を示すグラフ
１．定義
当業者が本発明を理解しやすくするために、特定の技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本明細書の他の箇所で明らかに明確に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。
本実施形態で用いられるアミノ酸３文字コードおよび一文字コードは、非特許文献３に記載されている。
本発明において使用される「抗体」という用語は、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖を鎖間ジスルフィド結合によって連結することによって形成されるテトラペプチド鎖構造である免疫グロブリンを指す。免疫グロブリンの重鎖定常領域は、アミノ酸の組成および順序が異なるので、異なる免疫グロブリンの抗原性は異なる。したがって、免疫グロブリンは５つのクラスに分類されうるか、または免疫グロブリンのアイソタイプ（すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ）と呼ばれうる。そして、その対応する重鎖は、それぞれ、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖およびε鎖である。同じタイプのＩｇは、ヒンジ領域のアミノ酸組成、ならびに重鎖ジスルフィド結合の数および位置の差異に従って、異なるサブクラスに分けることができる。たとえば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分類できる。軽鎖は、定常領域の違いによってκ鎖またはλ鎖に分類できる。Ｉｇの５つのクラスの各々は、κ鎖またはλ鎖を有しうる。
本発明において、本発明の抗体軽鎖は、ヒトまたはマウスκ鎖、λ鎖またはそれらの変異体を含む軽鎖定常領域をさらに含むことができる。
本発明において、本発明の抗体重鎖は、ヒトまたはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体を含む重鎖定常領域をさらに含むことができる。
可変領域（Ｖ領域）は、抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端に近い約１１０アミノ酸から構成され、そのアミノ酸配列がかなり異なる。抗体のＣ末端に近い残りのアミノ酸配列から構成される定常領域（Ｃ領域）は、比較的安定である。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）および４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）の各々は、３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域からなり、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配列される。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指す。本発明の抗体または抗原結合フラグメントのＶＬおよびＶＨ領域のＣＤＲアミノ酸残基の数および位置は、公知のＩＭＧＴ採番基準に従う。
用語「抗原発現細胞」または「ＡＰＣ」は、その表面上にＭＨＣと複合体化した外来抗原を発現する細胞である。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してこの複合体を認識する。ＡＰＣの例としては、樹状細胞（ＤＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単球、Ｂリンパ芽球、および単球由来樹状細胞（ＤＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。用語「抗原発現」はＡＰＣが抗原を捕捉し、それらがＴ細胞によって、たとえばＭＨＣ－Ｉ／ＭＨＣ－ＩＩ結合体の成分として認識されることを可能にするプロセスをいう。
用語「ＣＤ４０」は、ＴＮＦＲＳＦ５としても知られるＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである細胞表面受容体を指す。ＣＤ４０は、樹状細胞、Ｂ細胞およびマクロファージの表面に遍在的に発現され、Ｔ細胞免疫の産生および維持に必要な分子である。用語「ＣＤ４０」は、細胞によって天然に発現されるＣＤ４０の任意の変異体またはアイソフォームを含む。本発明の抗体は、非ヒト種由来のＣＤ４０と交差反応性でありうる。あるいは、抗体はヒトＣＤ４０特異的であってもよく、他の種との交差反応性を示さなくてもよい。ＣＤ４０、またはその任意の変異体もしくはアイソフォームはそれらが天然に発現される細胞または組織から単離されうるか、または当技術分野において一般的であり、そして本明細書中に記載される技術を使用する組換え技術によって産生されうる。好ましくは、抗ＣＤ４０抗体が正常なグリコシル化パターンを有するヒトＣＤ４０を標的とする。
用語「組換えヒト抗体」は組換え方法によって調製され、発現され、構築され、または単離されるヒト抗体を含み、関連する技術および方法は、（１）免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックトランスクロモソーム動物（たとえば、マウス）から単離された抗体、またはそれらから調製されたハイブリドーマ、（２）トランスフェクトマなどの抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、（３）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（４）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることによって調製され、発現され、構築され、または単離された抗体、などが当技術分野で周知である。このような組換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によってコードされる特異的ヒト生殖系列免疫グロブリン配列のみならず、抗体成熟の間に生じるようなその後の再編成および変異も利用する可変領域および定常領域を含む。
本発明における「マウス抗体」という用語は、当技術分野の知識および技能に従って調製されたヒトＣＤ４０に対するモノクローナル抗体である。調製時に被験体にＣＤ４０抗原を注射し、所望の配列または機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。本発明の好ましい実施形態において、マウスＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ鎖、λ鎖またはその変異体の軽鎖定常領域をさらに含みうるか、またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはその変異体をさらに含みうる。
用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の可変領域および定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）によってコードされないアミノ酸残基を含みうる。しかし、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体（すなわち、「ヒト化抗体」）を含まない。
「ヒト化抗体」という用語は、ＣＤＲグラフト抗体としても知られており、マウスのＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域のフレームワークにグラフトすることによって産生される抗体を指す。これは、大量のマウスタンパク質成分を保有するキメラ抗体によって誘導される強力な免疫応答を克服できる。免疫原性を低下させることによって引き起こされる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域は、活性を維持するために最小限の復帰突然変異に供されうる。
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによって形成される抗体であり、マウス抗体によって誘導される免疫応答を軽減できる。キメラ抗体を構築するために、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に構築し、選択し、次いで、可変領域遺伝子をマウスハイブリドーマ細胞からクローニングする。続いて、必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングする。マウス可変領域遺伝子およびヒト定常領域遺伝子は、キメラ遺伝子に連結され、次いでヒトベクターに挿入され、そして最後に、キメラ抗体分子は、真核生物または原核生物工業システムにおいて発現される。ヒト抗体の定常領域はヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはその変形の重鎖定常領域から選択することができ、望ましくはヒトＩｇＧｌまたはＩｇＧ２の重鎖定常領域からなる。
用語「抗原結合フラグメント」は、抗体および抗体類似体の抗原結合フラグメントを指し、典型的には、親抗体の抗原結合領域または可変領域（たとえば、１つ以上のＣＤＲ）の少なくとも一部を含む。抗体フラグメントは、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持する。一般に、抗体フラグメントは、モルベースで示される場合、親結合活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは、抗体フラグメントが標的に対する親抗体の結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％以上を保持する。抗原結合フラグメントの例としては限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、直鎖抗体、単鎖抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、および多特異的抗体が挙げられる。操作された抗体変異体は非特許文献４で概説されている。
「Ｆａｂフラグメント」は、軽鎖、ならびにＣＨ１および重鎖の可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖フラグメントを含む。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に保持される。
「Ｆａｂ’フラグメント」は、軽鎖と、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域を含む重鎖の一部と、を含む。したがって、鎖間ジスルフィド結合は２本の重鎖の間で形成され、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成できる。
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、ＣＨ１ドメインと、ＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含む２つの軽鎖と２つの重鎖と、を含み、それによって２つの重鎖の間にジスルフィド結合を形成する。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは２本の重鎖間のジスルフィド結合によって結合した２本のＦａｂ’フラグメントからなる。
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠く。
用語「多重特異性抗体」は、その最も広い意味で使用され、多重エピトープ特異性を有する抗体を包含する。これらの多重特異性抗体には重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）（ここで、ＶＨ－ＶＬユニットは多重エピトープ特異性を有する。）を含む抗体、２つ以上のＶＬおよびＶＨ領域を有し、各ＶＨ－ＶＬユニットは同じ標的の異なる標的または異なるエピトープに結合する抗体、２つ以上の単一可変領域を有し、各単一可変領域は同じ標的の異なる標的または異なるエピトープに結合する抗体、全長抗体、抗体フラグメント、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディおよびトリアボディ、共有結合または非共有結合された抗体フラグメント、などが含まれるが、これらに限定されない。
用語「抗体－薬物結合体」（ＡＤＣ）は、１つ以上の異種化学合成分子に結合された抗体または抗体フラグメントをいい、細胞傷害性物質に結合された抗体または抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「単鎖抗体」は、完全な抗原結合部位を有する最小の抗体フラグメントであるリンカーペプチドを介して抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を連結することによって形成される単鎖組換えタンパク質である。
用語「ドメイン抗体フラグメント」は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域鎖のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。いくつかの場合において、２つ以上のＶＨ領域は、ペプチドリンカーに共有結合して、二価ドメイン抗体フラグメントを形成する。二価ドメイン抗体フラグメントの２つのＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的とすることができる。
本明細書で使用される「ＣＤ４０への結合」という用語は、ヒトＣＤ４０と相互作用する能力を指す。本発明で使用される「抗原結合部位」という用語は、抗原上で別個であり、本発明の抗体または抗原結合フラグメントによって認識される三次元空間部位を指す。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体に特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは隣接するアミノ酸によって形成されうるものであり、隣接しないアミノ酸はタンパク質の三次フォールディングによって並置される。隣接するアミノ酸によって形成されるエピトープは典型的には変性溶媒への暴露後に維持され、一方、三次フォールディングによって形成されるエピトープは典型的には変性溶媒での処理後に失われる。エピトープは、典型的には固有の空間的コンホメーションにおいて少なくとも３～１５アミノ酸を含む。どのエピトープが所与の抗体によって結合されるかを決定するための方法は、免疫ブロッティングおよび免疫沈降アッセイなどを含む、当技術分野で周知である。エピトープの空間的コンホメーションを決定するための方法は、当技術分野の技術および本明細書に記載される技術（たとえば、Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴）を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「特異的に結合する」または「選択的に結合する」は、所定の抗原上のエピトープへの抗体の結合をいう。典型的には組換えヒトＣＤ４０を被検体として用い、抗体をリガンドとして用いると、機器内で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により測定した場合、約１０－７Ｍ未満またはさらに少ない平衡解離定数（ＫＤ）を有する所定の抗原に抗体が結合し、所定の抗原への結合に対するその親和性は所定の抗原または密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（ＢＳＡ等）への結合に対するその親和性の少なくとも２倍である。「抗原を認識する抗体」という用語は、ここでは「抗体に特異的に結合する」という用語と同じ意味で使用できる。
用語「交差反応」は、異なる種からのＣＤ４０に結合する本発明の抗体の能力をいう。たとえば、ヒトＣＤ４０に結合する本発明の抗体はまた、別の種のＣＤ４０に結合しうる。交差反応性は結合アッセイ（たとえば、ＳＰＲおよびＥＬＩＳＡ）における精製抗原との抗体の特異的反応性、またはＣＤ４０を生理学的に発現する細胞との抗体の結合または機能的相互作用を検出することによって測定される。交差反応性を決定するための方法は本明細書中に記載されるような標準的な結合アッセイ（たとえば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、またはフローサイトメトリー）を含む。
用語「阻害する（inhibit）」、「阻害（inhibition）」、「遮断（blockade）」または「遮断する（block）」は、互換的に使用され、部分的および完全な阻害／遮断の両方を包含する。リガンドの阻害／遮断は、好ましくはリガンド結合が阻害または遮断なしに生じる場合に生じる活性の正常なレベルまたはタイプを減少または変化させる。阻害および遮断はまた、抗ＣＤ４０抗体と接触しないリガンドと比較して、抗ＣＤ４０抗体と接触した場合のリガンド結合親和性の任意の測定可能な減少を含むことが意図される。
用語「増殖の阻害」（たとえば、細胞を含む）は、細胞増殖における任意の測定可能な減少を含むことが意図される。
用語「免疫応答を誘導する」および「免疫応答を増強する」は互換的に使用され、特定の抗原に対する免疫応答の刺激（すなわち、受動的または適応的）をいう。ＣＤＣまたはＡＤＣＣを誘導するのに特異的な「誘導する」という用語は、特異的な直接細胞殺傷メカニズムを刺激することを指す。
本発明において記載される「ＡＤＣＣ」、すなわち抗体依存性細胞傷害性とは、Ｆｃ受容体を発現する細胞が抗体のＦｃ部分を認識することによって、抗体でコーティングされた標的細胞を直接的に死滅させることを意味する。抗体のＡＤＣＣエフェクター機能は、ＩｇＧ上のＦｃセグメントの修飾によって低減または排除できる。修飾は抗体の重鎖定常領域における突然変異、たとえば、ＩｇＧ１のＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；ＩｇＧ２／４キメラ、ＩｇＧ４のＦ２３５Ｅ、およびＬ２３４Ａ／Ｅ２３５Ａ突然変異からなる群より選択される突然変異を指す。
抗体および抗原結合フラグメントを産生および精製するための方法は周知であり、そして先行技術（たとえば、非特許文献５）において見出されうる。たとえば、マウスをヒトＣＤ４０またはそのフラグメントで免疫化することができ、得られた抗体を再生し、精製し、従来の方法によりアミノ酸配列決定に供することができる。抗原結合フラグメントはまた、従来の方法によって調製されうる。本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、１つ以上のヒトＦＲ領域を非ヒトＣＤＲ領域に導入するように遺伝子操作される。ヒト生殖系列ＦＲ配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のウェブサイト（http://IMGT.cines.fr）または非特許文献６から入手可能である。
本発明の操作された抗体または抗原結合フラグメントは、従来の方法によって調製および精製されうる。対応する抗体のｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに組換えることができる。ＣＨＯ細胞は、組換え免疫グロブリン発現ベクターによって安定にトランスフェクトされうる。当該分野で周知のより推奨される方法として、哺乳類発現系は、特にＦＣ領域の高度に保存されたＮ末端において、抗体のグリコシル化を生じる。安定なクローンは、ヒト抗原に特異的に結合する抗体を発現させることによって得られる。陽性クローンを、バイオリアクター中の無血清培地中で増殖させて、抗体を産生した。抗体が分泌される培養培地は、従来の技術によって精製および収集されうる。抗体は、従来の方法で濾過によって濃縮できる。可溶性混合物および多量体は、モレキュラーシーブ、イオン交換などの従来の方法によっても除去できる。得られた生成物は、（たとえば－７０℃で）直ちに凍結するか、または凍結乾燥する必要がある。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体を指す。本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、単一クローン細胞系から得られる抗体を指し、細胞系は、真核細胞系、原核細胞系、またはファージクローン細胞系に限定されない。モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、たとえば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（たとえば、ＣＤＲグラフト）、または他の先行技術を使用して、組換え的に得られ得る。
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に適用する場合、「投与」および「治療」は、外因性薬物、治療薬、診断薬または組成物を動物、ヒト、対象物、細胞、組織、器官または生物学的流体と接触させることを指す。「投与」および「治療」はたとえば、治療、薬物動態、診断、研究、および実験方法を指すことができる。細胞の処理は試薬を細胞と接触させること、ならびに試薬を流体と接触させることを含み、流体は細胞と接触している。「投与」および「処置」はまた、たとえば、試薬、診断薬、結合組成物によって、または別の細胞によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで細胞を処置することを意味する。「治療」は、ヒト、動物または研究対象に適用される場合、研究および診断用途に対する治療的処置、予防または予防手段を指す。
「治療」は、治療剤が治療効果を有することが知られている疾病の１つ以上の症状を有する患者に対して、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物のような、内用または外用の治療剤を投与することを意味する。一般に、治療剤は、治療される対象または集団における１つ以上の疾患の症状を、そのような症状の変性を誘導するか、またはそのような症状の進行を任意の臨床的に測定不可能な程度まで阻害するかにかかわらず、効果的に軽減する量で投与される。任意の特定の疾患の症状を軽減するのに有効な治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる。）は、疾患状態、患者の年齢および体重、ならびに患者において所望の効果を引き出す薬物の能力などの様々な要因に応じて変動しうる。疾患の症状が軽減されたかどうかは、病状の重症度または進行を評価するために医師または他の医療専門家によって一般的に使用される任意の臨床試験方法によって評価できる。本発明の実施形態（たとえば、治療方法または調製物）は各患者に共通する標的疾患の症状を改善するのに有効ではないかもしれないが、スチューデントｔ検定、カイ二乗検定、MannおよびWhitneyに基づくＵ検定、Kruskal-Wallis検定（Ｈ検定）、Jonckheere-Terpstra検定、およびWilcoxon検定などの当技術分野で公知の任意の統計学的試験方法に従って、標的疾患の症状を統計学的に有意な数の患者において軽減すべきであることが決定される。
「保存的修飾」または「保存的置換または置換」はタンパク質中のアミノ酸を、タンパク質の生物学的活性を変化させることなく頻繁に変化させることができるように、類似の特徴（たとえば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格コンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸で置換することを指す。通常、ポリぺプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に変化させないことが、当業者によって公知である（たとえば、非特許文献７を参照のこと）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊しそうにない。アミノ酸の一般的な保存的置換は以下の通りである。
Figure 0007257971000001
用語「から本質的になる」またはその変形は、明細書および特許請求の範囲を通して使用されるように、すべてのそのような要素または要素の群を含み、任意選択で、前記要素に性質が類似または異なる他の要素を含み、他の要素は、所与の投薬計画、方法または組成物の本質的または新規な特性を有意に変更しない。非限定的な例として、列挙されたアミノ酸配列から本質的になる結合化合物はまた、結合化合物の特性に有意に影響しない１つ以上のアミノ酸を含みうる。
本発明による物体に適用される「天然に存在する」という用語は、物体が天然に見出されうるという事実を指す。たとえば、天然の供給源から単離されうる。そして、実験室において意図的に人工的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は天然に存在する。
「有効量」は、医学的状態の症状または徴候を改善または予防するのに十分な量を含む。有効量はまた、診断を可能にするかまたは容易にするのに充分な量を意味する。特定の患者または獣医学的被験体についての有効量は、処置されるべき状態、患者の全体的な健康、投与方法の経路および投薬量、ならびに副作用の重篤度のような因子に依存して変化しうる。有効量は、有意な副作用または毒性効果を回避する最大用量または投薬レジメンでありうる。
「外因性」とは、バックグラウンドに従って、生体、細胞、または人体の外部で産生される物質をいう。「内因性」とは、バックグラウンドに従って、細胞、生物またはヒトの体内で産生される物質をいう。
「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の配列類似性を指す。両方の比較配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有される場合、たとえば、２つのＤＮＡ分子の各位置がアデニンによって占有される場合、その分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性のパーセンテージは、２つの配列によって共有される一致するまたは相同な位置の数を比較された位置の数で割って１００％を乗じた関数である。たとえば、配列が最適にアラインメントされる場合、２つの配列中の１０個の位置のうちの６個が一致するか、または相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一般に、比較は、相同性の最大パーセンテージが２つの配列をアラインメントさせることによって得られる場合に行われる。
本明細書で使用される「細胞」、「細胞系」および「細胞培養物」という表現は互換的に使用することができ、そのような名称はすべて、それらの子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、移入の数にかかわらず、初代試験細胞およびそれに由来する培養物を含む。また、すべての子孫は意図的または意図的でない突然変異のために、ＤＮＡ含量に関して正確に同一ではないことがあることも理解されるべきである。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。異なる名前が意味される場合、それらは文脈から明確に区別可能である。
「任意の（optional）」または「任意に（optionally）」は、イベントまたは環境がどこで発生するか、または発生しないかを含めて、後述するイベントまたは環境が発生してもよいが、必ずしも発生しなくてもよいことを意味する。たとえば、「任意に１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」は特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在しうることを意味するが、必ずしも存在する必要はない。
「医薬組成物」は、本明細書に記載の化合物の１つ以上、またはその生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、および他の化学成分、ならびに生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤などの他の成分を含む混合物を意味する。医薬組成物の目的は活性成分の吸収を促進し、それによって生物学的活性を発揮する生物の投与を促進することである。
以下の実施例は本発明をさらに説明するものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明の実施形態において特定の条件を示さない実験方法は通常、従来の条件（たとえば、非特許文献８および非特許文献９）に従って、または原料もしくは商品の製造業者によって推奨される条件に従って実施される。特定の供給源のない試薬は、市場から購入される常用試薬である。
〔実施例１ 免疫抗原、スクリーニングされた抗原の配列およびその調製〕
Ｈｉｓ標識ヒトＣＤ４０（ｈ－ＣＤ４０－ｈｉｓ）組換えタンパク質、Ｆｃ標識ヒトＣＤ４０（ｈ－ＣＤ４０－Ｆｃ）組換えタンパク質、Ｈｉｓ標識マウスＣＤ４０（ｍ－ＣＤ４０－ｈｉｓ）組換えタンパク質およびＨｉｓ標識アカゲザルＣＤ４０（アカゲザル－ＣＤ４０－ｈｉｓ）組換えタンパク質（＃ＣＤ０－Ｃ５２Ｈ７）は、Acrobiosystemsから購入した精製市販タンパク質であった。それぞれの配列を下表に示す。これらのタンパク質は、以下の実施例の実験において使用されうる。
Figure 0007257971000002
〔実施例２ 抗体ハイブリドーマの調製〕
抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体は、実験的Ｃ５７ＢＬ／６マウス、雌、６～８週齢（Zhao Yan (Suzhou) New Drug Research Center Co., Ltd.、動物生産ライセンス番号 201503259）であるマウスを免疫することによって産生した。給餌環境はＳＰＦレベルとした。マウスを購入し、２０～２５℃の温度および４０～６０％の湿度で１２／１２時間の明／暗サイクル調整を伴う実験室環境で１週間飼料を与えた。環境に適応したマウスを２つのケージに分け、各ケージに５匹のマウスを入れた。
免疫抗原は、Ｆｃタグ化ヒト修飾ＣＤ４０組換えタンパク質（ｈ－ＣＤ４０－Ｆｃ、濃度１μｇ／μｌまでリン酸緩衝液中に製剤化）であった。フロイントアジュバント（Sigma、ロット番号：F5881/F5506）を乳化に使用し、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）を一次免疫に使用し、核酸アジュバント（ＣｐＧ、Sangon Biotech）および注射用アルミニウム（Imject Alum、Thermo、ロット番号：PH203866）を残りの追加免疫に使用した。免疫化は、０日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、および７０日目に行った。血液検査は２１、３５、４９、６３、７７日目に採血し、ＥＬＩＳＡによりマウス血清を検出し、マウス血清中の抗体価を測定した。
４回目の免疫時に、脾臓細胞融合を、抗体力価が高く、血清中で安定する傾向があるマウスにおいて行った。融合の３日前に追加免疫を行い、リン酸緩衝液を配合した抗原溶液１０μｇを各マウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。脾臓リンパ球を、最適化されたＰＥＧ媒介融合工程を使用して骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８２８７ＴＭ）と融合させて、ハイブリドーマ細胞を得、そして良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有する５つのモノクローナルハイブリドーマ細胞株を選択した。
〔実施例３ ＥＬＩＳＡ結合アッセイ〕
抗ＣＤ４０抗体の結合特性をＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。ｈｉｓタグを有するＣＤ４０組換えタンパク質をコーティングに直接使用し、抗体を添加した後、二次抗体（ＨＲＰ結合抗抗体Ｆｃ抗体）およびＨＲＰ基質ＴＭＢを添加することによって、抗原に対する抗体の結合活性を検出した。
９６ウェルマイクロタイタープレートを、１００μｌ／ウェルのヒトまたはアカゲザルＣＤ４０－ｈｉｓタンパク質で０．５μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液、ウェルあたり２５０μｌで３回洗浄した。各すすぎにおいてプレートを１０秒間振とうして、十分な洗浄を確実にした。２００μｌのブロッキング溶液を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。次に、プレートをウェル当たり２５０μｌで３回洗浄した。各すすぎにおいてプレートを１０秒間振とうして、十分な洗浄を確実にした。試験対象の抗ＣＤ４０抗体１００μｌを希釈した希釈液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、次いで、ウェル当たり２５０μｌのすすぎ緩衝液でプレートを３回すすいだ。希釈剤で１：２００００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体１００μｌを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをウェル当たり２５０μｌで３回洗浄した。ＴＭＢ１００μｌを各ウェルに添加し、暗所で１５分間反応させた。ウェルあたり５０μｌの０．１６Ｍ硫酸を添加した。４５０ｎｍにおけるＯＤ値をＴｈｅｒｍｏ ＭμｌｔｉＳｋａｎＦｃプレートリーダーにより測定し、ＣＤ４に対するＣＤ４０抗体の結合ＥＣ５０値を計算した。
異なる生殖系列ＣＤ４０に対するマウスハイブリドーマ抗体のＥＬＩＳＡ結合
Figure 0007257971000003
〔実施例４ 抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの結合を遮断する〕
この実験では、スクリーニングされた抗ヒトＣＤ４０抗体を検出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏブロッキングアッセイによりヒトＣＤ４０およびヒトＣＤ４０Ｌの結合を遮断する。具体的には、Ｆｃタグ付きＣＤ４０組換えタンパク質（ｈ－ＣＤ４０－Ｆｃ）を９６ウェルマイクロタイタープレート上にコーティングした。抗ＣＤ４０抗体を添加してエピトープに完全に結合し、エピトープを占めた後、ｈｉｓタグ付きＣＤ４０Ｌを添加した。ｈｉｓタグを検出することにより、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合量を計算し、次いでＣＤ４０活性部位を遮断するＣＤ４０抗体のＩＣ５０値を計算した。
９６ウェルマイクロタイタープレートを、１００μｌ／ウェルのヒトまたはアカゲザルＣＤ４０－Ｆｃタンパク質で１μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液、２５０μｌ／ウェルで３回洗浄した。各すすぎにおいてプレートを１０秒間振とうして、十分な洗浄を確実にした。２００μｌのブロッキング溶液を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。次に、プレートをウェル当たり２５０μｌで３回洗浄した。各すすぎにおいてプレートを１０秒間振とうして、十分な洗浄を確実にした。試験対象の抗ＣＤ４０抗体１００μｌを希釈した希釈液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、次いで、１ウェルあたり２５０μｌのすすぎ緩衝液でプレートを３回すすいだ。希釈剤で１：２０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体１００μｌを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをウェル当たり２５０μｌで３回洗浄した。ＴＭＢ１００μｌを各ウェルに添加し、暗所で１５分間反応させた。ウェル当たり５０μｌの０．１６Ｍ硫酸を添加した。４５０ｎｍにおけるＯＤ値をＴｈｅｒｍｏ ＭμｌｔｉＳｋａｎＦｃプレートリーダーによって測定し、ＣＤ４０ＬへのＣＤ４０結合を遮断するＣＤ４０抗体のＩＣ５０値を計算した。
ヒトｈＣＤ４０／ｈＣＤ４０ＬのＥＬＩＳＡブロッキング結果
Figure 0007257971000004
〔実施例５ Ｂｉａｃｏｒｅ親和性測定〕
ヒト抗体捕捉抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ機器（Biacore X100、GE）のＣＭ５バイオセンサーチップに、ヒト抗体捕捉キット（Cat.BR-1008-39、GE）の記載に記載の方法に従って共有結合させ、それによって、親和性に基づいて試験される特定量のキメラまたはヒト化抗体を捕捉した。次いで、一連の濃度勾配ＣＤ４０抗原（Acrobiosystemsから購入）をチップの表面に流し、Biacore X100（GE）を用いてリアルタイムで反応シグナルを検出し、結合および解離曲線を得た。解離の各サイクルの完了後、バイオチップをすすぎ、ヒト抗体捕捉キットによって提供される再生溶液で再生した。Amine Coupping Kits（Cat.BR-1000-50、GE）をGEから購入し、HBS-EP+10X緩衝液（Cat.BR-1006-69、GE）を脱イオン水により希釈してHBS-EP+1X緩衝液（ｐＨ７．４）を得た。実験データを、BiacoreX100 Evaluation Software 2.0（GEソフトウェア）によって（１：１）結合モデルに適合させ、表１１および１２に示す親和性値を得た。
〔実施例６ レポーター遺伝子に基づく抗ＣＤ４０抗体の細胞活性試験〕
ヒトｃｄ４０遺伝子およびＮＦ－κＢ媒介ＳＥＡＰゲノムで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌ細胞（Cat#hkb-CD40）を、Invitrogenから購入した。したがって、ＣＤ４０シグナル伝達経路の活性化レベルは、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（ＳＥＡＰの基質）によって上清中の分泌ＳＥＡＰを検出することによって特徴付けることができる。この実験では、ＣＤ４０抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存率を、細胞ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌの活性化を検出することによってＥＣ５０値に従って評価した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌ細胞を、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌゼオシンおよび３０μｇ／ｍｌブラスチシジンを含有するＤＭＥＭ培地中で培養し、週２～３回継代し、継代比は１：５または１：１０であった。細胞を継代培養するとき、培地をピペッティングによって除去し、細胞層を５ｍｌの０．２５％トリプシンですすいだ。次いで、トリプシンをピペッティングによって除去し、細胞をインキュベーター中で３～５分間消化し、続いて新鮮な培地で細胞を懸濁した。１００μＬの細胞懸濁液を５×１０５セル／ｍｌの密度で９６ウェル細胞培養プレートに加え、培地は１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのゼオシンおよび３０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを含んだＤＭＥＭであった。一方、９６ウェルプレートの周囲には、滅菌水１００μｌのみを添加した。プレートをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で２４時間インキュベートした。細胞が壁に付着した後、試験される勾配希釈抗体１００μｌを各ウェルに添加した。プレートをインキュベーター中で２０～２４時間インキュベートした（３７℃、５％ ＣＯ ２）。次に、４０μｌの細胞上清を各ウェルから新しい９６ウェル平底プレートに取り、１６０μｌのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ基質溶液を添加し、プレートをインキュベーター中で暗所で１～３時間インキュベートした。６２０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ ＭμｌｔｉＳｋａｎＦｃ）で測定し、ＥＣ５０値を計算してＣＤ４０抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存率を評価した。
レポーター遺伝子に基づく抗ＣＤ４０抗体の細胞活性
Figure 0007257971000005
〔実施例７ 抗ｃｄ４０抗体のアッセイを活性化するＤＣ細胞〕
ＰＢＭＣを正常ヒト末梢血から単離し、次いで単球をＣＤ１４ ＭＡＣＳビーズで選別した。１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ４および１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含有するＲＰＭＩ １６４０培地を細胞に添加し、６日間培養し、それによってＭｏＤＣ細胞（単球由来の樹状細胞）の誘導培養を行った。６日後、細胞を採取し、１×１０５細胞を採取し、ＣＤ２０９－ＰＥ、ＣＤ１ａ－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５およびＣＤ１４－ＰＥ／Ｃｙ７で染色し、ＦＡＣＳを用いて、ＭｏＤＣが成功裏に誘導されたかどうかを分析した（上記の操作は、当技術分野では全て従来の操作である）。成功裏に誘導されたＤＣを収集し、そして試験されるべき種々の抗体および対応する勾配濃度を有する参照抗体をそれぞれ添加した（抗体の勾配濃度については図１を参照のこと）。培養の４８時間後、細胞を回収し、その後ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ－ＤＲで染色し、データをＦＡＣＳアッセイによって収集した。一次ＤＣ細胞活性化アッセイからのデータによれば、５つのマウス抗体はすべて、有意な活性を示し、ＤＣ表面上の活性化分子ＣＤ８０およびＣＤ８６を用量依存的効果で活性化した。５つの抗体の全体的な効果は、２つの参照抗体（PfizerのCP-870、893およびAlligator BioscienceのADC-1013）の効果に匹敵するか、またはそれよりわずかに良好である。図１および図２を参照されたい。
〔実施例８ 抗ＣＤ４０抗体のクローニングおよび配列決定〕
上記でスクリーニングおよび同定された５つの抗体のハイブリドーマサブクローンを選択し、対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集した。ＲＮＡを、キットの指示に従ってトリゾール（Invitrogen、15596-018）を用いて抽出し、逆転写した（PrimeScriptTM Reverse Transcriptase、Takara、cat #2680A）。次いで、得られたｃＤＮＡを、マウスＩｇ－プライマーセット（Novagen、TB326 Rev.B 0503）を使用するＰＣＲによって増幅し、配列決定のために配列決定会社に送った。５つのマウス抗体の配列を最終的に得た。
マウスｍＡｂ ２Ｈ６の重鎖および軽鎖可変領域配列は以下の通りである。
２Ｈ６ ＨＣＶＲ
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＤＹＬＩＥＷＡＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＩＫＤＲＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＧＧＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
（配列番号１）
２Ｈ６ ＬＣＶＲ
ＥＩＱＬＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＩＫＬＬＬＮＦＡＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＦＬＴＩＳＮＬＥＱＤＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＳＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
（配列番号２）
ｍＡｂ ２Ｈ６のＣＤＲ配列を下表に示す。
Figure 0007257971000006
マウス９Ｅ５の重鎖および軽鎖可変領域配列は以下の通りである。
９Ｅ５ ＨＣＶＲ
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＤＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＩＬＴＴＹＷＩＴＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＨＰＧＳＧＳＴＫＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＴＲＬＳＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
（配列番号９）
９Ｅ５ ＬＣＶＲ
ＤＶＬＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＮＳＱＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＥＳＰＫＬＬＩＹＫＶＴＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＡＳＬＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
（配列番号１０）
９Ｅ５のＣＤＲ配列を下表に示す。
Figure 0007257971000007
１Ｄ９の重鎖および軽鎖可変領域配列は以下の通りである。
１Ｄ９ ＨＣＶＲ
ＱＶＲＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＭＲＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＬＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＩＬＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＮＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＩＲＧＳＰＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
（配列番号３７）
１Ｄ９ ＬＣＶＲ
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＮＩＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＳＴＳＧＬＨＳＧＶＰＳＲＦＮＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＹＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
（配列番号３８）
１Ｄ９のＣＤＲ配列を下表に示す。
Figure 0007257971000008
１４Ｃ１０の重鎖および軽鎖可変領域配列は以下の通りである。
１４Ｃ１０ ＨＣＶＲ
ＱＶＱＶＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＴＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＮＰＥＦＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＧＧＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
（配列番号４５）
１４Ｃ１０ ＬＣＶＲ
ＨＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＳＨＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＳＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
（配列番号４６）
１４Ｃ１０のＣＤＲ配列を下表に示す。
Figure 0007257971000009
３８Ｂ４の重鎖および軽鎖可変領域配列は以下の通りである。
３８Ｂ４ ＨＣＶＲ
ＱＶＲＬＫＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＩＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＡＧＩＹＰＧＴＧＮＴＹＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＥＲＳＳＳＴＡＹＭＱＬＴＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＴＲＲＧＬＰＳＬＣＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
（配列番号５３）
３８Ｂ４ ＬＣＶＲ
ＤＦＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＳＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＳＫＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
（配列番号５４）
３８Ｂ４のＣＤＲ配列を下表に示す。
Figure 0007257971000010
これらの中で、２つの最適抗体２Ｈ６および９Ｅ５をその後の開発に供した。得られた可変領域配列をヒト抗体ＩｇＧ１の定常領域配列にそれぞれライゲーションし、ヒト－マウスキメラ抗体配列を得、分子クローニング技術によりキメラ抗体の配列をｐＣＰ発現ベクター（MabSpace biology Co、Ltd.より購入）に挿入した。これらの配列は、ＰＣＲによる増幅後に配列決定および同定され（分子クローニングなどの分子生物学的操作方法が従来の操作条件に従って実施される。非特許文献９参照。）、ＨＥＫ２９３細胞発現系を使用して、ヒト－マウスキメラ抗体２Ｈ６－Ｃおよび９Ｅ５－Ｃを得ることができる。MabSelect SuRe（GE Lifesciences）アフィニティークロマトグラフィーによって精製されたキメラ抗体を特徴付けるために、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性アッセイを行った。データを下表に示す。
キメラ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
Figure 0007257971000011
〔実施例９ マウス抗体ヒト化実験〕
得られたマウス抗体２Ｈ６および９Ｅ５の典型的なＶＨ／ＶＬＣＤＲ構造に基づいて、重鎖および軽鎖可変領域配列を抗体生殖系列データベースと比較して、高い相同性を有するヒト生殖系列テンプレートを得た。ここで、ヒト生殖系列軽鎖フレームワーク領域はヒトκ軽鎖遺伝子に由来し、本発明の抗体の軽鎖フレームワーク領域は、好ましくはヒト生殖系列軽鎖テンプレートＶｋ１－３３／ＪＫ４（２Ｈ６）またはＶｋ２－２８／ＪＫ４（９Ｅ５）である。ヒト生殖細胞系重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖に由来し、本発明の抗体の重鎖フレームワーク領域は以下に示すように、好ましくはヒト生殖細胞系重鎖テンプレートＶＨ１－６９／ＪＨ６（２Ｈ６）またはＶＨ１－２／ＪＨ６（９Ｅ５）である。
２Ｈ６の重鎖骨格部位は、好ましくはヒト生殖系列重鎖テンプレートＩＧＨＶ１－６９（配列番号２１）である。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
２Ｈ６の軽鎖骨格部位は、好ましくはヒト生殖系列軽鎖テンプレートＩＧｋＶ１－３３（配列番号２２）である。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰ
９Ｅ５の重鎖骨格部位は、好ましくはヒト生殖系列重鎖テンプレートＩＧＨＶ１－２（配列番号２３）である。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
９Ｅ５の軽鎖骨格部位は、好ましくはヒト生殖系列軽鎖テンプレートＩＧｋＶ２－２８（配列番号２４）である：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰ
マウス抗体のＣＤＲ領域を、選択されたヒト化テンプレート上にグラフトして、ヒト化可変領域を置換し、次いで、対応するヒトＩｇＧ定常領域（好ましくは、重鎖はＩｇＧ１であり、軽鎖はκである）と組換えた。次いで、マウス抗体の三次元構造に基づいて、埋め込まれた残基、ＣＤＲと直接相互作用する残基、およびＶＬおよびＶＨのコンホメーションに重要な影響を有する残基を復帰突然変異させ、ＣＤＲ領域の化学的に不安定なアミノ酸残基を最適化して、最終的なヒト化分子を得る。その重鎖可変領域配列を配列番号２５～３０に示し、軽鎖可変領域配列を配列番号３１～３６に示す。
ｈｕ２Ｈ６－Ｈ１ａ（配列番号２５）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＤＹＬＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＩＫＤＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＧＧＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ｈｕ２Ｈ６－Ｈ１ｂ（配列番号２６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＤＹＬＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＩＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＧＧＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ｈｕ２Ｈ６－Ｈ１ｃ（配列番号２７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＤＹＬＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＩＫＤＲＡＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＧＧＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ｈｕ９Ｅ５－Ｈ１ａ（配列番号２８）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＷＩＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＨＰＧＳＧＳＴＫＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ｈｕ９Ｅ５－Ｈ１ｂ（配列番号２９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＷＩＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＨＰＧＳＧＳＴＫＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＬＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ｈｕ９Ｅ５－Ｈ１ｃ（配列番号３０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＬＴＴＹＷＩＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＨＰＧＳＧＳＴＫＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＬＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ｈｕ２Ｈ６－Ｌ１ａ（配列番号３１）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＬＮＦＡＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＳＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ｈｕ２Ｈ６－Ｌ１ｂ（配列番号３２）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＬＮＦＡＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＳＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ｈｕ２Ｈ６－Ｌ１ｃ（配列番号３３）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＴＩＫＬＬＬＮＦＡＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＳＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ｈｕ９Ｅ５－Ｌ１ａ（配列番号３４）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＮＳＱＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＴＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＡＳＬＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ｈｕ９Ｅ５－Ｌ１ｂ（配列番号３５）
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＮＳＱＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＴＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＡＳＬＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ｈｕ９Ｅ５－Ｌ１ｃ（配列番号３６）：
ＤＶＬＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＮＳＱＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＴＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＡＳＬＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
最終的なヒト化ｈｕ２Ｈ６（Ｈ１ｂ重鎖およびＬ１ｃ軽鎖を含む）およびｈｕ９Ｅ５抗体分子（Ｈ１ｃ重鎖およびＬ１ａ軽鎖を含む）を、上記の発現試験および軽鎖および重鎖の組み合わせの復帰突然変異の数の比較、ならびにその完全な軽鎖および重鎖配列をそれぞれ配列番号１７～２０に示すことによって選択した。
ｈｕ２Ｈ６ ＨＣ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＤＹＬＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＩＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＧＧＦＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
（配列番号１７）
ｈｕ２Ｈ６ ＬＣ
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＴＩＫＬＬＬＮＦＡＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＳＴＬＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
（配列番号１８）
ｈｕ９Ｅ５ ＨＣ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＬＴＴＹＷＩＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＨＰＧＳＧＳＴＫＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＬＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
（配列番号１９）
ｈｕ９Ｅ５ ＬＣ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＮＩＶＮＳＱＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＴＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＡＳＬＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
（配列番号２０）
〔実施例１０ ヒト化抗体試験データ〕
ヒト、アカゲザルＣＤ４０に対する本発明のヒト化抗体ｈｕ２Ｈ６、ｈｕ９Ｅ５の結合活性、ブロッキング活性等を下表に示す。結果は、本発明のヒト化抗ヒトＣＤ４０抗体のＥＬＩＳＡ結合およびブロッキング活性が陽性抗体PfizerおよびAlligatorのそれに匹敵することを示した。特に、ヒトＣＤ４０に対するｈｕ９Ｅ５のＢｉａｃｏｒｅ測定親和性は陽性抗体対照品（Alligator）の９倍であり、対照品（Pfizer）の３倍であった。
ヒト化ｈｕ２Ｈ６およびｈｕ９Ｅ５抗体のＩｎ ｖｉｔｒｏ活性
Figure 0007257971000012
〔実施例１１ マウスにおける腫瘍増殖に対する抗ＣＤ４０抗体の阻害〕
正常なヒト末梢血を採取し、健康なヒトＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって単離した。ＣＤ１４＋マイクロビーズキットを用いて単球を選別し、キットに付属するプロトコールに従ってＣＤ１４＋単球を単離した。すなわち、１０７細胞ごとに２０μｌの抗ＣＤ１４マイクロビーズを加え、４℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を磁気カラムに添加し、３回すすいだ。磁気柱内の細胞、すなわちＣＤ１４＋単球を採取した。１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ４および１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ １６４０培地をＣＤ１４＋単球に添加し、それによって単球を６日間培養し（培養法は当技術分野で一般的な方法である）、ＭｏＤＣ細胞の誘発培養を実施した。残りの細胞にＩＬ－２を含むＲＰＭＩ １６４０を添加し、培養後に懸濁細胞を回収した（培養方法および細胞回収方法はいずれも当該技術分野における従来の方法である）。ＣＤ３＋マイクロビーズキットを用いてＴ細胞を選別した。６日後、ＭｏＤＣ細胞およびＣＤ３＋ Ｔ細胞を回収し、それぞれ１：５：２０の比率でＲａｊｉ細胞（上海バイオテクノロジーセルバンク研究所、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養）と混合し、それぞれのＮＯＧマウス（Nanjing Galaxy Biopharma、５日間の適応給餌）に皮下接種した。実験動物を、一定の温度および湿度を有する独立した換気ボックス中に保持した。繁殖室の温度は１８．０～２６．０℃、湿度は４０～７０％、換気は１０～２０回／時、昼夜は１２時間／１２時間で切り替えた。
実験群には、ヒトＩｇＧ１抗体対照群、ｈｕ２Ｈ６、ｈｕ９Ｅ５および参照抗体Ｇ１２が含まれ、各群の用量は３ｍｇ／ｋｇであった。各群の５匹のマウスに、週１回、６週間、３回の連続投与を行った。全実験中、ベニヤーノギスを用いて週２回腫瘍の長軸径と広軸径を測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長軸径×腫瘍広軸径２）を算出した。相対腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は、ＴＧＩ％＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％により算出した。Ｔ／Ｃ（％）は相対腫瘍増殖速度、すなわち、ある時点での処置群および対照群の相対腫瘍体積または腫瘍重量のパーセンテージである。ＴおよびＣは、それぞれ、特定の時点における処置群およびＩｇＧ１対照群の腫瘍体積（ＴＶ）または腫瘍重量（ＴＷ）である。
結果は、ヒト化抗ＣＤ４０抗体ｈｕ２Ｈ６およびｈｕ９Ｅ５がＩｇＧ１対照と比較して非常に有意な抗腫瘍効果を有し、腫瘍が２１日間の投与後にほぼ完全に排除されたことを示した；ｈｕ２Ｈ６およびｈｕ９Ｅ５の抗腫瘍効果は図３および図４に示されるように、参照抗体Ｇ１２と概して同等またはわずかに良好であった。
以上、本発明の具体的な実施形態について説明したが、当業者であれば、これらは単なる例示であり、本発明の原理および精神から逸脱することなく、本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの均等な形態も、本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。

Claims (15)

  1. 抗体軽鎖可変領域と抗体重鎖可変領域とを含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号９で示され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０で示される、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 抗体軽鎖可変領域と抗体重鎖可変領域とを含む抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    前記抗体軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記抗体重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３０で示され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３４で示される、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. ヒト化抗体の重鎖配列は、配列番号１９に示す配列であり、軽鎖配列は、配列番号２０に示す配列である、請求項２に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む多重特異性抗体。
  5. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む単鎖抗体。
  6. その抗体が、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域および重鎖可変領域、請求項４に記載の多重特異性抗体、若しくは、請求項５に記載の単鎖抗体を含む、抗体－薬物結合体。
  7. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項４に記載の多重特異性抗体、または請求項５に記載の単鎖抗体をコードする単離核酸分子。
  8. 請求項７に記載の単離核酸分子を含む発現ベクター。
  9. 請求項８に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  10. 請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項４に記載の多重特異性抗体、請求項５に記載の単鎖抗体、または請求項６に記載の抗体－薬物結合体、および薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物。
  11. ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌが媒介する疾患または状態を治療または予防するための薬剤の製造における、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項４に記載の多重特異性抗体、請求項５に記載の単鎖抗体、請求項６に記載の抗体－薬物結合体、または、請求項１０に記載の医薬組成物の使用。
  12. 前記疾患は、癌である、請求項１１に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
  13. 前記癌は、リンパ腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、食道癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、胆嚢癌、膠芽腫および黒色腫である、請求項１２に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
  14. 自己免疫疾患を有する患者の症状を改善するための薬剤の製造における、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項４に記載の多重特異性抗体、請求項５に記載の単鎖抗体、請求項６に記載の抗体－薬物結合体、または請求項１０に記載の医薬組成物、の使用。
  15. 炎症性疾患を有する患者の症状を改善するための薬剤の製造における、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項４に記載の多重特異性抗体、請求項５に記載の単鎖抗体、請求項６に記載の抗体－薬物結合体、または請求項１０に記載の医薬組成物、の使用。
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