ES2709654T3

ES2709654T3 - Anticuerpos anti-CD40 y métodos de uso

Info

Publication number: ES2709654T3
Application number: ES12777376T
Authority: ES
Inventors: Yongke Zhang; Guo-Liang Yu; Weimin Zhu
Original assignee: Apexigen Inc
Current assignee: Apexigen Inc
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2019-04-17
Anticipated expiration: 2032-04-27
Also published as: US20150307616A1; CN113461819A; EP2702078A2; JP6807890B2; IL229098A0; US9556278B2; KR20190122889A; CN106928362A; RU2013152960A; US8778345B2; WO2012149356A2; US20170233483A1; US20220049005A1; CN106928362B; CA2834404C; MX2013012572A; US8957193B2; AU2012249454B2; BR112013027829A2; NZ616923A

Abstract

Anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a CD40 y es un agonista de CD40, que comprende (i) una región variable de cadena pesada que comprende la región VHCDR1 expuesta en SEQ ID NO:3, la región VHCDR2 expuesta en SEQ ID NO:4 y la región VHCDR3 expuesta en SEQ ID NO:5; (ii) una región variable de cadena ligera que comprende la región VLCDR1 expuesta en SEQ ID NO:6, la región VLCDR2 expuesta en SEQ ID NO:7 y la región VLCDR3 expuesta en SEQ ID NO: 8.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos anti-CD40 y metodos de uso

Antecedentes

Campo tecnico

La presente invencion se refiere generalmente a anticuerpos anti-CD40, a composiciones y a metodos de uso de los mismos. Tales anticuerpos son utiles, por ejemplo, para su uso en un metodo de tratamiento de una variedad de enfermedades oncologicas.

Descripcion de la tecnica relacionada

La mayona de leucemias y linfomas se originan a partir de la transformacion maligna de celulas del linaje B. La expresion de antigenos restringidos al linaje B de superficie celular tales como CD20 la convierte en una diana atractiva para la terapia con anticuerpos. Los agentes terapeuticos de anticuerpos han cambiado drasticamente el manejo de pacientes con linfoma no Hodgkin (LNH) y leucemia linfodtica cronica (LLC). Desde la aprobacion de rituximab, el anticuerpo solo o en combinacion con quimioterapia ha mejorado notablemente las tasas de respuesta, los desenlaces a largo plazo y la calidad de vida (Chinn P, Braslawsky G, White C, et al. Therapie of non-Hodgkin's B-cell lymphoma. Cancer Immunol Immunother 2003; 52:257-280; Rastetter W, Molina A, White CA. Rituximab: Expanding role in therapie for lymphomas and autoinmune diseases. Annu Rev Med 2004; 55:477-503). Sin embargo, un numero sustancial de pacientes presentan o bien resistencia primaria o bien adquirida a rituximab, lo que sugiere que los enfoques actuales que seleccionan como diana CD20 tienen limitaciones en los desenlaces clmicos, y existe la necesidad de mejora desarrollando agentes inmunoterapeuticos novedosos para linfoma y leucemia de celulas B con distintos mecanismos de accion (Stolz C, Schuler M. Molecular mechanisms of resistance to Rituximab and pharmacologic strategies for its circumvencion. Leukemia and lymphoma. 2009; 50(6):873 - 885; Bello C, Sotomayor EM. Monoclonal antibodies for B-cell lymphomas: Rituximab and beyond. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007; 233-242; Dupire S, Coiffier B. Targeted treatment and new agents in diffuse large B cell lymphoma. Int J Hematol 2010; 18 de junio (en lmea)), tal como el AcM anti-CD40, APX005.

El papel de CD40 en la regulacion de respuestas inmunitarias

La activacion completa de celulas T requiere dos senales distintas pero sinergicas. La primera senal, enviada a traves del receptor de antfgeno de celulas B, la proporciona un complejo de antfgeno y CMH en las APC y es responsable de la especificidad de la respuesta inmunitaria. La senal secundaria, o coestimuladora es a traves de la interaccion de CD28 con B7-1 (CD80)/B7-2 (CD86), y CD40 con CD40L, que se requieren para montar una respuesta de celulas T a escala completa. En ausencia de senales coestimuladoras, las celulas T pueden experimentar falta de respuesta (anergia) o muerte celular programada (apoptosis) tras la estimulacion con antfgeno. CD40, un miembro de la superfamilia de receptores de TNF (TNFR), se expresa principalmente en celulas B y otras celulas presentadoras de antfgeno (APC) tales como celulas dendnticas y macrofagos. El ligando de CD40 (CD40L) lo expresan principalmente celulas T activadas.

La interaccion de CD40 y CD40L sirve como senal coestimuladora para la activacion de celulas T. El acoplamiento de CD40-CD40L en celulas B en reposo induce proliferacion, cambio de clase de inmunoglobulinas, secrecion de anticuerpos, y tambien tiene un papel en el desarrollo de centros germinales y la supervivencia de celulas B de memoria, todo lo cual es esencial para respuestas inmunitarias humorales (Kehry MR. J Immunol 1996; 156: 2345 2348). La union de CD40L a c D40 en celulas dendnticas induce maduracion de DC tal como se manifiesta aumentando la expresion de moleculas coestimuladoras tales como la familia B7 (CD80, CD86) y la produccion de citocinas proinflamatorias tales como interleucina 12. Esto conduce a potentes respuestas de celulas T (Stout, R. D., J. Suttles. 1996. Immunol. Today 17:487-492; Brendan O'Sullivan, Ranjeny Thomas. Critical Reviews in Immunology 2003; 23: 83-107; Cella, M., D. Scheidegger, K. Palmer-Lehmann, P. Lane, A. Lanzavecchia, G. Alber. J. Exp. Med.

1996; 184:747-452).

La transduccion de senales de CD40 activa multiples rutas que incluyen NF-KappaB (factor nuclear KappaB), MAPK (protema cinasa activada por mitogeno) y STAT3 (transductores de senales y activadores de la transcripcion 3) (Pype S, et al. J Biol Chem. 16 de junio de 2000; 275(24):18586-93) que regulan la expresion genica a traves de la activacion de protemas activadoras, c-Jun, ATF2 (factor de transcripcion activador 2) y factores de transcripcion Rel (Dadgostar H, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 5 de febrero de 2002; 99(3):1497-502). Las protemas adaptadoras del factor asociado al receptor TNFR (por ejemplo, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5 y TRAF6) interaccionan con este receptor y sirven como mediadoras de la transduccion de senales. Dependiendo del tipo de celula particular, el acoplamiento de CD40 da como resultado un patron de expresion genica particular. Los genes activados en respuesta a la senalizacion de CD40 incluyen un gran numero de citocinas y quimiocinas (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-alfa y protema 1 alfa inflamatoria de macrofagos (MIP1alfa). En determinados tipos de celula, la activacion de CD40 puede dar como resultado la produccion de radicales citotoxicos (Dadgostar et al., citado anteriormente), COX2 (ciclooxigenasa-2) y produccion de NO (oxido mtrico).

El papel de CD40 en tumores

CD40 no solo lo expresan celulas inmunitarias normales sinotambien muchas celulas malignas. En particular, CD40 se sobreexpresa en LNH de linaje B, leucemias linfocfticas cronicas (CLL), tricoleucemias (HCL), enfermedad de Hodgkin (Uckun FM, Gajl-Peczalska K, Myers DE, et al. Blood 1990; 76:2449-2456; O'Grady JT, Stewart S, Lowrey J, et al. Am J Pathol 1994;144: 21-26), mieloma multiple (Pellat-Deceunynck C, Bataille R, Robillard N, Harousseau JL, Rapp MJ, Juge-Morineau N, Wijdenes J, Amiot M. Blood. 1994; 84(8):2597-603), asf como en carcinomas de la vejiga, del rinon, del ovario, del cuello uterino, de la mama, del pulmon, de la nasofaringe y melanoma maligno (Young LS, Eliopoulos AG, Gallagher NJ, et al. Immunol Today 1998; 19:502-6; Ziebold JL, Hixon J, Boyd A, et al. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 2000; 48: 225-33; Gladue R, Cole S, Donovan C, et al. J Clin Oncol 2006; 24 (18S):103s).

La ligacion de CD40 sobre la superficie de celulas tumorales, que en muchos casos, media en un efecto citotoxico directo, da como resultado la regresion tumoral a traves de apoptosis y necrosis (Grewal IS, Flavell RA. Annu Rev Immunol 1998; 16:111-35; van Kooten C, Banchereau J. J Leukoc Biol 2000; 67(1):2-17). Aunque las funciones exactas de CD40 en celulas tumorales no estan claras (Tong AW, Stone MJ. Cancer Gene Ther. 200310(1):1-13), el acoplamiento de CD40 in vitro inhibe el crecimiento de celulas de tumores solidos y celulas de linfoma de celulas B de alto grado (Magi Khalil y Robert H. Vonderheide. Update Cancer Ther 2007; 2(2): 61-65; Young LS, Eliopoulos AG, Gallagher NJ, Dawson CW. Immunol Today 1998; 19(11):502-6; Funakoshi S, Longo DL, Beckwith M, et al. Blood 1994; 83(10):2787-94; Hess S, Engelmann H. J Exp Med 1996; 183(1):159-67; Eliopoulos AG, Dawson CW, Mosialos G, et al. Oncogene 1996; 13(10):2243-54; von Leoprechting A, van der Bruggen P, Pahl HL, Aruffo A, Simon JC. Cancer Res 1999; 59(6):1287-94). Estos efectos contrastan con la proliferacion inducida tras el acoplamiento de CD40 en celulas dendnticas y celulas B no neoplasicas.

Ademas para dirigir la inhibicion tumoral, la activacion de la senalizacion de CD40 rescata la funcion de celulas presentadoras de antfgeno en huespedes que llevan tumores y desencadena o restaura respuestas inmunitarias activas contra antfgenos asociados a tumores. Se han notificado agonistas de CD40 que vencen la tolerancia de celulas T en ratones que llevan tumores, provocan respuestas de celulas T citotoxicas eficaces contra antfgenos asociados a tumores y potencian la eficacia de vacunas antitumorales (Eliopoulos AG, Davies C, Knox PG, et al. Mol Cell Biol 2000; 20(15): 5503-15; Tong AW, Papayoti MH, Netto G, et al. Clin Cancer Res 2001; 7(3):691-703).

CD40 como diana molecular

CD40 se sobreexpresa en una amplia gama de celulas malignas. Los papeles de CD40 en la inhibicion tumoral y la estimulacion del sistema inmunitario hacen que CD40 sea una diana atractiva para una inmunoterapia basada en anticuerpos (van Mierlo GJ, den Boer AT, Medema JP, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99(8): 5561-5566; French Rr , Chan HT, Tutt AL, Glennie MJ. Nat Med. 1999; 5(5):548-553). Los anticuerpos anti-CD40 pueden actuar contra celulas cancerosas mediante multiples mecanismos: (i) funcion efectora de anticuerpos tal como CCDA, (ii) un efecto citotoxico directo sobre las celulas tumorales y (iii) activacion de respuestas inmunitarias antitumorales. Anticuerpos terapeuticos anti-CD40 en desarrollo

Se han notificado varios anticuerpos anti-CD40 que tienen potencial como agentes terapeuticos antitumorales. CP-870.893 es un anticuerpo agonista de CD40 de IgG2 humano completo desarrollado por Pfizer. Se une a CD40 con una Kd de 3,48 x 10‘1° M, pero no bloquea la union de CD40L (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.338.660). CP-870893 ha mostrado efectos de CCDA; posiblemente debido a su isotipo de IgG2. Por tanto, este anticuerpo actua como agonista de CD40 (es decir, no afecta a la union de CD40L), induce senalizacion proapoptotica y activa las DC y vigilancia inmunitaria. Sin embargo, este anticuerpo no media en la CCDA.

HCD122 es un anticuerpo antagonista de CD40 de IgG1 humano completo desarrollado por Novartis. Se une a CD40 con una Kd de 5,1 x 10‘1° M, bloquea la union de CD40 a CD40L, inhibe la senalizacion inducida por el ligando de CD40 y los efectos biologicos sobre celulas B y determinadas celulas de LLC y MM primarias (Tai YT, et al. Cancer Res. 1 de julio de 2005; 65(13):5898-906; Luqman M, Klabunde S, et al: Blood 112:711-720, 2008). El mecanismo de accion principal para su efecto antitumoral in vivo es la CCDA (Long L, et al. 2005 IMF presentacion oral y resumen n°. 3; Blood 2004, 104(11, parte 1): Abst 3281). Debido a sus caractensticas antagonistas, este anticuerpo no puede inducir directamente una respuesta inmunitaria antitumoral mediada por CD40.

El documento WO 2006/128103 da a conocer SGN-40, un anticuerpo de IgG1 humanizado desarrollado por Seattle Genetics a partir del clon de anticuerpo de raton S2C6, que se genero usando una lmea celular de carcinoma de vejiga humano como inmunogeno. Se une a CD40 con una K^dde 1,0 x 10‘9 M y funciona a traves de la potenciacion de la interaccion entre CD40 y CD40L, presentando por tanto un efecto agonista parcial (Francisco JA, et al., Cancer Res, 60: 3225-31, 2000). SGN-40 envfa senales inhibidoras de la proliferacion y de apoptosis a un panel de lmeas de linfoma B originadas a partir de celulas de MM y de linfoma no Hodgkin de alto grado (Tai YT, Catley LP, Mitsiades CS, et al. Cancer Res 2004; 64(8):2846-2852). Los estudios in vitro e in vivo sugieren que tanto la senalizacion apoptotica como la funcion efectora de anticuerpos a traves de CCDA contribuyen a la actividad antitumoral de ^sGⁿ-40 (Law CL, Gordon KA, Collier J, et al: Cancer Res 2005; 65:8331-8338). Un estudio reciente sugirio que la actividad antitumoral de SGN-40 depende significativamente de interacciones de Fc con las celulas efectoras y que los macrofagos son los principales efectores que contribuyen a sus actividades terapeuticas (Oflazoglu E, et al. Br J Cancer. 13 de enero de 2009; 100(1):1l3-7. Pub. elec. 9 de diciembre de 2008). Ya que SGN-40 es un agonista parcial y requiere que CD40L se exprese en celulas T, SGN-40 tambien puede tener una capacidad limitada para reforzar de manera completa la respuesta inmunitaria antitumoral.

Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad en la tecnica de agentes inmunoterapeuticos novedosos que seleccionen como diana CD40 y que actuen como agonista para esta diana, activen celulas dendnticas y la vigilancia inmunitaria y que activen la CCDA, proporcionando de ese modo propiedades anticancengenas mejoradas.

Sumario breve

Un aspecto de la presente divulgacion proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une a CD40 humano y es un agonista de CD40, que comprende (i) una region variable de cadena pesada que comprende la region VHCDR1 expuesta en SEQ ID ⁿO:3, la region VHCDR2 expuesta en SEQ ID NO:4 y la region VHCDR3 expuesta en SEQ ID NO:5; y (ii) una region variable de cadena ligera que comprende la region VLCDR1 expuesta en SEQ ID NO:6, la region VLCDR2 expuesta en SEQ ID NO:7 y la region VLCDR3 expuesta en SEQ ID NO: 8. En una realizacion de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento, la region variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:1. En una realizacion adicional, la region variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:2.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos aislados tal como se dan a conocer en el presente documento estan humanizados. Se exponen regiones variables de anticuerpos humanizados ilustrativas en la secuencia de aminoacidos de la region VH de SEQ ID NO:9 y la secuencia de aminoacidos de la region VL de SEQ ID NO:10. En determinadas realizaciones, los anticuerpos en el presente documento son anticuerpo completos.

En otra realizacion, los anticuerpos aislados tal como se describen en el presente documento comprenden un dominio constante de IgG humana, tal como, pero sin limitarse a un dominio cH l de IgG1 o una region Fc de IgG1. En un aspecto adicional, la invencion proporciona un anticuerpo aislado, o fragmento de union a antfgeno del mismo tal como se describe en el presente documento, en el que el anticuerpo aislado, o fragmento de union a antfgeno del mismo: estimula la liberacion de citocinas a partir de celulas presentadoras de antfgeno; induce la apoptosis de celulas tumorales; inhibe la proliferacion de celulas tumorales; destruye celulas tumorales a traves de la induccion de funciones efectoras seleccionadas del grupo que consiste en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, citotoxicidad dependiente de complemento y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos; estimula respuestas de celulas T antitumorales; reduce tumores establecidos; inhibe tumores resistentes a rituximab; o una combinacion de una cualquiera o mas de las mencionadas anteriormente.

La presente divulgacion tambien proporciona polinucleotidos aislados que codifican para los anticuerpos aislados, o fragmentos de union a antfgeno de los mismos tal como se da a conocer en el presente documento, un vector de expresion que comprende los nucleotidos aislados y/o una celula huesped aislada que comprende el vector que comprende los nucleotidos aislados.

La presente divulgacion tambien proporciona composiciones que comprenden un portador fisiologicamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antfgeno del mismo tal como se describe en el presente documento.

Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona una composicion que comprende un portador fisiologicamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antfgeno del mismo tal como se describe en el presente documento para su uso en un metodo para el tratamiento de un paciente que tiene un cancer, que comprende administrar al paciente una composicion que comprende un portador fisiologicamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antfgeno del mismo tal como se describe en el presente documento, tratando o mejorando de ese modo el cancer, en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocfticas cronicas, tricoleucemias, leucemias linfoblasticas agudas, mieloma multiple, carcinomas del pancreas, del colon, gastricos, del intestino, de la prostata, de la vejiga, del rinon, del ovario, del cuello uterino, de la mama, del pulmon, de la nasofaringe, melanoma maligno y leucemias y LNH resistentes a rituximab.

Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona una composicion que comprende un portador fisiologicamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antfgeno del mismo tal como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de mejora de los smtomas en un paciente que tiene enfermedad autoinmunitaria y/o enfermedad inflamatoria, que comprende administrar al paciente una composicion que comprende un portador fisiologicamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antfgeno del mismo tal como se describe en el presente documento, mejorando de ese modo los smtomas en el paciente que tiene enfermedades autoinmunitarias y/o inflamatorias.

Breve descripcion de las secuencias

SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoacidos de la region VH del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoacidos de la region VL del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

SEQ ID NO:3 es la secuencia de aminoacidos de la region VHCDR1 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoacidos de la region VHCDR2 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

SEQ ID NO:5 es la secuencia de aminoacidos de la region VHCDR3 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

SEQ ID NO:6 es la secuencia de aminoacidos de la region VLCDR1 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

SEQ ID NO:7 es la secuencia de aminoacidos de la region VLCDR2 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

SEQ ID NO:8 es la secuencia de aminoacidos de la region VLCDR3 del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8.

SEQ ID NO:9 es la secuencia de aminoacidos de la region VH de APX005, la version humanizada del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8, sin un peptido senal.

SEQ ID NO:10 es la secuencia de aminoacidos de la region VL de APX005, la version humanizada del anticuerpo anti-CD40 de conejo R-8, sin un peptido senal.

SEQ ID NO:11-21 y 33-44 son secuencias de aminoacidos de cadena pesada de candidatos a anticuerpo anti-CD40 de conejo que mostraban actividad funcional (vease la figura 16).

SEQ ID NO:22-32 y 45-56 son secuencias de aminoacidos de cadena ligera de candidatos a anticuerpo anti-CD40 de conejo que mostraban actividad funcional (vease la figura 16).

SEQ ID No:57-79 son las secuencias de aminoacidos de VHCDR1 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la figura 16.

SEQ ID No:80-102 son las secuencias de aminoacidos de VHCDR2 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la figura 16.

SEQ ID No:103-125 son las secuencias de aminoacidos de VHCDR3 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la figura 16.

SEQ ID No:126-148 son las secuencias de aminoacidos de VLCDR1 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la figura 16.

SEQ ID No:149-171 son las secuencias de aminoacidos de VLCDR2 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la figura 16.

SEQ ID No:172-194 son las secuencias de aminoacidos de VLCDR3 para los anticuerpos anti-CD40 mostrados en la figura 16.

Breve descripcion de los dibujos

Las figuras 1A-1D muestran los resultados del examen de anticuerpos agonistas midiendo la maduracion de DC y la activacion de celulas T tal como se describe en el ejemplo 1. 1A: expresion de CD83; 1B: expresion de CD80; 1C: expresion de CD86; 1D: proliferacion de celulas T en una reaccion de linfocitos mixtos.

La figura 2 es un grafico que muestra la comparacion de candidatos principales en la inhibicion de proliferacion de celulas Ramos.

La figura 3 es un grafico de barras que muestra los resultados de un ensayo de CCDA. Efector (PBMC humana): celula diana (celula Ramos) razon de 40:1.

La figura 4A y figura 4B son graficos que muestran los resultados del examen in vivo de la actividad antitumoral de candidatos anti-CD40.

La figura 5 es un grafico que muestra los resultados de un ensayo ELISA que demuestran que APX005 se une selectivamente a CD40 pero no a otros miembros de la familia de t NfR.

La figura 6 es un grafico que muestra los resultados de un ensayo ELISA que demuestran que APX005 bloquea la union de CD40L a CD40.

La figura 7 es un grafico que muestra que APX005 no se internaliza tras la union a celulas positivas para CD40.

La figura 8A y figura 8B son graficos que muestran que la CCDA mediada por APX005 de celulas tumorales Ramos (A) y Daudi (B) positivas para CD40.

La figura 9A y figura 9B son graficos que muestran la inhibicion in vitro de la proliferacion de celulas tumorales Ramos mediante APX005. Panel A: sin reticulacion de Fc; panel B: con reticulacion de Fc.

La figura 10 es un grafico de barras que muestra la induccion de activacion de DC mediante APX005.

Las figuras 11A y 11B muestra que APX005 se une a CD40 humano y de mono pero no a CD40 de raton.

La figura 12A es un grafico que muestra la inhibicion por APX005 del crecimiento tumoral en un modelo de Ramos. La figura 12B es un grafico de barras que muestras los niveles de IgG humana serica en ratones en el dfa 34, dos dfas tras la ultima dosificacion.

Las figuras 13A y 13B son graficos que muestran la inhibicion de tumores resistentes y pretratados con rituximab en un modelo de raton.

La figura 14 es un grafico que muestra la inhibicion por APX005 del crecimiento tumoral en el modelo de raton Raji. La figura 15 es un grafico que muestra la potente actividad antitumoral de APX005 contra mieloma multiple humano en el modelo de xenoinjerto de IM-9.

Las figuras 16A-16L son una alineacion de secuencias de secuencias de anticuerpos de cadena pesada (16A-16F) y de cadena ligera (16G-16L) anti-CD40 de conejo. Las CDR1-3 de cadena ligera y pesada estan subrayadas. Las SEQ ID NO son las siguientes: Cadena pesada: R-3 y R- 6: SEQ ID NO:11, 12; R-8: SEQ ID NO:1; R-9, -16, -18, -24, -33, -36, 19-21, -45, -59: SEQ ID NO:13-21, respectivamente; R-2, R-5, R-7, R-10, R-12, R-20, R-26, R-30, R-35, 19-35, 19-41, 19-57: SEQ ID No:33-44, respectivamente. Cadena ligera: R-3 y R-6: SEQ ID NO:22 y 23; R-8: SEQ ID NO:2; R-9, -16, -18, -24, -33, -36, 19-21, -45, - 59: SEQ ID NO:24-32, respectivamente; R-2, R-5, R-7, R-10, R-12, R-20, R-26, R-30, R-35, 19-35, 19-41, 19-57: SEQ ID No:45-56, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos incluyen el peptido senal de VH y VL. Las secuencias de aminoacidos de VHCDR y VLCDR de R-8 se exponen en SEQ ID No:3-8. Las secuencias de aminoacidos de VHCDR y las secuencias de aminoacidos de VLCDR para los anticuerpos restantes se exponen en SEQ ID No:57-125 y SEQ ID No:126-194, respectivamente. Las figuras 17A y 17B muestran la inhibicion del crecimiento tumoral en el modelo de Ramos mediante APX005 en comparacion con SGN-40 y rituximab.

Las figuras 18A y 18B muestran la inhibicion mediante APX005 del crecimiento tumoral en modelo de xenoinjerto de linfoma de Namalwa humano resistente a rituximab.

Descripcion detallada

El alcance de la invencion se define mediante las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgacion se refiere a anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno de los mismos se unen espedficamente a CD40 en particular anticuerpos que tienen propiedades funcionales y especificidad epitopica espedfica. Una realizacion de la invencion abarca anticuerpos humanizados espedficos y fragmentos de los mismos que pueden unirse a CD40 y funcionar como agonista de CD40 induciendo/potenciando senalizacion celular aguas abajo mediada por CD40 y efectos biologicos. En realizaciones mas espedficas de la invencion, los anticuerpos descritos en el presente documento se unen espedficamente a CD40 con afinidad muy alta, tal como una afinidad de al menos entre 980 y 950 picomolar, al menos entre 970 y 950 picomolar, y en determinadas realizaciones con una afinidad de 960 picomolar. Los anticuerpos descritos en el presente documento, entre otros atributos, inducen senalizacion de CD40 en celulas tumorales, activan celulas dendnticas y vigilancia inmunitaria, activan citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) contra celulas tumorales, bloquean la union de CD40 a CD40L; tienen actividad agonista de CD40; activan celulas presentadoras de antfgeno; estimulan la liberacion de citocinas a partir celulas presentadoras de antfgeno; induce la apoptosis de celulas tumorales; inhiben la proliferacion de celulas tumorales; destruyen celulas tumorales a traves de la induccion de funciones efectoras que incluyen, pero no se limitan a, CCDA, CDC y ADCP; estimulan respuestas de celulas T antitumorales; reducen tumores establecidos; e inhiben tumores resistentes a rituximab. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden tener o inducir una combinacion de uno cualquiera o mas de estos atributos o actividades.

Realizaciones de la invencion se refieren al uso de anticuerpos anti-CD40 o fragmento de union a antfgenos de los mismos para el diagnostico, la evaluacion y el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CD40 o la expresion aberrante del mismo. Los anticuerpos objeto se usan en el tratamiento o la prevencion de canceres que incluyen, pero no se limitan a, linfomas no Hodgkins, linfoma de Hodgkin, leucemias linfodticas cronicas, tricoleucemias, leucemias linfoblasticas agudas, mieloma multiple, carcinomas de la vejiga, del rinon, del ovario, del cuello uterino, de la mama, del pulmon, de la nasofaringe, melanoma maligno y leucemias y LNH resistentes a rituximab, enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias entre otras enfermedades.

La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique espedficamente lo contrario, metodos convencionales de virologfa, inmunologfa, microbiolog^a, biologfa molecular y tecnicas de ADN recombinante dentro del conocimiento de la tecnica, muchos de los cuales se describen a continuacion con el fin de ilustracion. Tales tecnicas se explican de manera completa en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology o Current Protocols in Inmunology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edicion, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) y otras referencias similares. Tal como se usan en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un,” “una” y “el/la” incluyen las referencias en plural a menos que el contenido dicte claramente lo contrario.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos el contexto requiera lo contrario, la palabra “comprender”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se entendera que implican la inclusion de un elemento establecido o numero entero o grupo de elementos o numeros enteros pero no la exclusion de cualquier otro elemento o numero entero o grupo de elementos o numeros enteros.

Cada realizacion en esta memoria descriptiva ha de aplicarse cambiando lo que se deba cambiar a todas las otras realizaciones a menos que se declare expresamente lo contrario.

Pueden usarse tecnicas convencionales para ADN recombinante, smtesis de oligonucleotidos y transformacion y cultivo de tejidos (por ejemplo, electroporacion, lipofeccion). Pueden realizarse reacciones enzimaticas y tecnicas de purificacion segun las especificaciones del fabricante o como se consigue normalmente en la tecnica o tal como se describe en el presente documento. Estos procedimientos y tecnicas y relacionados pueden realizarse generalmente segun metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y tal como se describe en diversas referencias generales y mas espedficas que se citan y se comentan a lo largo de la presente memoria descriptiva. A menos que se proporcionen definiciones espedficas, la nomenclatura utilizada en relacion con, y las tecnicas y procedimientos de laboratorio de, biologfa molecular, qrnmica analttica, qrnmica organica de smtesis y qrnmica farmaceutica y medica descritos en el presente documento son aquellos bien conocidos y normalmente usados en la tecnica. Pueden usarse tecnicas convencionales para tecnologfa recombinante, biologfa molecular, microbiologfa, smtesis qrnmica, analisis qrnmicos, preparacion, formulacion y administracion farmaceuticas y tratamiento de pacientes. Las realizaciones de la presente invencion se refieren a anticuerpos que se unen a CD40. En particular, los anticuerpos descritos en el presente documento se unen espedficamente a CD40 con una afinidad inesperadamente alta, potencian la actividad de senalizacion de CD40, activan el sistema inmunitario, activan la CCDA y tienen utilidad terapeutica para el tratamiento de enfermedades asociadas con expresion de CD40 aberrante.

Se exponen secuencias de anticuerpos ilustrativos, o fragmentos de union a antfgeno, o regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los mismos, en SEQ ID NO:1-194.

Tal como se conoce bien en la tecnica, un anticuerpo es una molecula de inmunoglobulina que puede unirse de manera espedfica a una diana, tal como un hidrato de carbono, polinucleotido, lfpido, polipeptido, etc., a traves de al menos un sitio de reconocimiento de epttopo, situado en la region variable de la molecula de inmunoglobulina. Tal como se usa en el presente documento, el termino abarca no solo anticuerpos monoclonales o policlonales intactos sino, tambien fragmentos de los mismos (tales como dAb, Fab, Fab', F(ab')², Fv), cadena sencilla (ScFv), variantes sinteticas de los mismos, variantes que se producen de manera natural, protemas de fusion que comprenden una parte de anticuerpo con un fragmento de union a antfgeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos, y cualquier otra configuracion modificada de la molecula de inmunoglobulina que comprende un fragmento o sitio de union a antfgeno (sitio de reconocimiento de epttopo) de la especificidad requerida. Los “diacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespedficos construidos mediante fusion genica (documento WO94/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444-6448, 1993) son tambien una forma particular de anticuerpo contemplado en el presente documento. Los minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 tambien se incluyen en el presente documento (S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996). Veanse por ejemplo, Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989); Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS EE.UU., 85, 5879-5883, 1988); documento PCT/US92/09965; documento WO94/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444-6448, 1993; Y. Reiter et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996; S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996.

El termino “fragmento de union a antigeno” tal como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento de polipeptido que contiene al menos una CDR de una cadena ligera y/o pesada de inmunoglobulina que se une al antfgeno de interes, en particular a CD40. A este respecto, un fragmento de union a antfgeno de los anticuerpos descritos en el presente documento puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o las 6 CDR de una secuencia de VH y VL expuesta en el presente documento a partir de anticuerpos que se unen a CD40. Un fragmento de union a antfgeno de los anticuerpos espedficos de CD40 descritos en el presente documento puede unirse a CD40. En determinadas realizaciones, un fragmento de union a antfgeno o un anticuerpo que comprende un fragmento de union a antfgeno, impide o inhibe la union de CD40L al CD40. En determinadas realizaciones, el fragmento de union a antigeno se une espedficamente a y/o potencia o modula la actividad biologica de CD40 humano. Tal actividad biologica incluye, pero no se limita a, senalizacion celular, activacion de celulas dendrfticas.

El termino “antigeno” se refiere a una molecula o una parte de una molecula a la que puede unirse un agente de union selectiva, tal como un anticuerpo, y adicionalmente que puede usarse en un animal para producir anticuerpos que pueden unirse a un epftopo de este antigeno. Un antigeno puede tener uno o mas epftopos.

El termino “epftopo” incluye cualquier determinante, preferiblemente un determinante polipeptfdico, que puede unirse espedficamente a un receptor de celulas T o inmunoglobulina. Un epftopo es una region de un antigeno a la que se une un anticuerpo. En determinadas realizaciones, los determinantes de epftopo incluyen agrupaciones de superficie qmmicamente activas de moleculas tales como aminoacidos, cadenas laterales de azucares, fosforilo o sulfonilo, y pueden tener en determinadas realizaciones caractensticas estructurales tridimensionales espedficas, y/o caractensticas de carga espedficas. En determinadas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une espedficamente a un antfgeno cuando reconoce preferiblemente su antfgeno diana en una mezcla compleja de protemas y/o macromoleculas. Se dice que un anticuerpo se une espedficamente a un antfgeno cuando la constante de disociacion de equilibrio es <10-7 o 10-8 M. En algunas realizaciones, la constante de disociacion de equilibrio puede ser <10-9 M o <10-10 M.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno de los mismos tal como se describe en el presente documento incluyen un conjunto de CDR de cadena ligera y cadena pesada, interpuestas respectivamente entre un conjunto de region de marco de cadena ligera y uno de cadena pesada (FR) que proporcionan soporte a las CDR y definen la relacion espacial de las CDR unas en relacion con las otras. Tal como se usa en el presente documento, el termino “conjunto de CDR” se refiere a las tres regiones hipervariables de una region V de cadena ligera o pesada. Avanzando desde el extremo N-terminal de una cadena ligera o pesada, estas regiones se indican como “CDR1,” “CDR2” y “CDR3” respectivamente. Un sitio de union a antfgeno, por tanto, incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada una de una region V de cadena pesada y una de ligera. Un polipeptido que comprende una unica CDR, (por ejemplo, un CDR1, CDR2 o CDR3) se denomina en el presente documento “unidad de reconocimiento molecular” El analisis cristalografico de varios complejos antfgenoanticuerpo ha demostrado que los residuos de aminoacido de CDR forman un contacto extenso con antfgeno unido, en donde el contacto mas extenso con el antfgeno es con la CDR3 de cadena pesada. Por tanto, las unidades de reconocimiento moleculares son principalmente responsables de la especificidad de un sitio de union a antfgeno. Tal como se usa en el presente documento, el termino “conjunto de FR” se refiere a las cuatro secuencias de aminoacidos flanqueantes que enmarcan a las CDR de un conjunto de CDR de una region V de cadena ligera o pesada. Algunos residuos de FR pueden entrar en contacto con el antfgeno unido; sin embargo, las FR son principalmente responsables de plegar la region V en el sitio de union a antfgeno, particularmente los residuos de FR directamente adyacentes a las CDR. Dentro de las FR, determinados residuos de amino y determinadas caractensticas estructurales estan muy bien conservados. A este respecto, todas la secuencias de region V contienen un bucle de disulfuro interno de aproximadamente 90 residuos de aminoacido. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de union, los CDR se despliegan como motivos de bucle salientes que forman una superficie de union a antfgeno. Se reconoce generalmente que hay regiones estructurales conservadas de FR que influyen en la forma plegada de los bucles de CDR en determinadas estructuras “canonicas” independientemente de la secuencia de aminoacidos de CDR concreta. Ademas, se sabe que determinados residuos de FR participan en contactos entre dominios no covalentes que estabilizan la interaccion de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo.

Las estructuras y ubicaciones de dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse en referencia a Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a edicion. US Department of Health and Human Services. 1987, y actualizaciones del mismo, ahora disponibles en internet (immuno.bme.nwu.edu).

Un “anticuerpo monoclonal” se refiere a una poblacion de anticuerpos homogenea en la que el anticuerpo monoclonal se compone de aminoacidos (que se producen de manera natural y que no se producen de manera natural) que estan implicados en la union selectiva de un epftopo. Los anticuerpos monoclonales son altamente espedficos, estando dirigidos contra un unico epftopo. El termino “anticuerpo monoclonal” no abarca solamente anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino tambien fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadena sencilla (ScFv), variantes de los mismos, protemas de fusion que comprenden una parte de union a antfgeno, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quimericos, y cualquier otra configuracion modificada de la molecula de inmunoglobulina que comprende un fragmento de union a antfgeno (sitio de reconocimiento de epftopo) con la especificidad y capacidad requeridas para unirse a un epftopo. No se pretende limitarse en cuanto a la fuente del anticuerpo o a la manera en que se elabora (por ejemplo, mediante hibridoma, seleccion de fagos, expresion recombinante, animales transgenicos, etc.). El termino incluye inmunoglobulinas completas asf como los fragmentos etc. descritos anteriormente en la definicion de “anticuerpo”.

La enzima proteolftica papama escinde de manera preferente las moleculas de IgG para producir varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos F(ab)) comprenden cada uno un heterodfmero covalente que incluye un sitio de union a antfgeno intacto. La enzima pepsina puede escindir las moleculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, que incluyen el fragmento F(ab')2 que comprende ambos sitios de union a antfgeno. Un fragmento Fv para su uso segun determinadas realizaciones de la presente invencion puede producirse mediante escision proteolftica preferente de una IgM, y en raras ocasiones de una molecula de inmunoglobulina IgG o IgA. Los fragmentos Fv se derivan, sin embargo, mas habitualmente usando tecnicas recombinantes conocidas en la tecnica. El fragmento Fv incluye un heterodfmero V^h::V^lno covalente que incluye un sitio de union a antfgeno que conserva muchas de las capacidades de union a y reconocimiento de antfgenos de la molecula de anticuerpo nativa. Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706-2710; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096.

En determinadas realizaciones, se contemplan anticuerpos Fv o scFV de cadena sencilla. Por ejemplo, pueden prepararse cuerpos Kappa (III et al., Prot. Eng. 10: 949-57 (1997); minicuerpos (Martin et al., EMBO J 13: 5305-9 (1994); diacuerpos (Holliger et al., PNAS 90: 6444-8 (1993); o janusinas (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-59 (1991) y Traunecker et al., Int. J. Cancer Suppl. 7: 51-52 (1992), usando tecnicas de biologfa molecular convencionales siguiendo las ensenanzas de la presente solicitud con respecto a la seleccion de anticuerpos que tienen la especificidad deseada. En aun otras realizaciones, pueden elaborarse anticuerpos quimericos o biespedficos para abarcan los ligandos de la presente divulgacion. Por ejemplo, un anticuerpo quimerico puede comprender regiones de marco y CDR de diferentes anticuerpos, mientras que pueden generarse anticuerpos biespedficos para que se unan espedficamente a CD40 a traves de un dominio de union y a una segunda molecula a traves de un segundo dominio de union. Estos anticuerpos pueden producirse a traves de tecnicas de biologfa molecular recombinantes o pueden conjugarse ffsicamente entre sf.

Un polipeptido de cadena sencilla Fv (sFv) es un heterodfmero Vh::Vl unido de manera covalente que se expresa a partir de una fusion genica que incluye genes que codifican para Vh y Vl unidos mediante un ligador que codifica para peptido. Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883. Se han descrito varios metodos para diferenciar estructuras qmmicas para convertir las cadenas de polipeptido pesadas y ligeras agregadas de manera natural (pero separadas qmmicamente) a partir de una region V de anticuerpo en una molecula de sFv que se plegara para dar una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de union a antfgeno. Veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.091.513 y 5.132.405, concedidas a Huston et al.; y la patente estadounidense n°. 4.946.778, concedida a Ladner et al.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo de union a CD40 tal como se describe en el presente documento esta en la forma de un diacuerpo. Los diacuerpos son multimeros de polipeptidos, comprendiendo cada polipeptido un primer dominio que comprende una region de union de una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo dominio que comprende una region de union de una cadena pesada de inmunoglobulina, estando unidos los dos dominios (por ejemplo mediante un ligador peptfdico) pero incapaces de asociarse entre sf para formar un sitio de union a antfgeno: los sitios de union a antfgeno se forman mediante la asociacion del primer dominio de un polipeptido dentro del multimero con el segundo dominio de otro polipeptido dentro del multfmero (documento WO94/13804).

Un fragmento dAb de un anticuerpo consiste en un dominio VH (Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)).

Cuando van a usarse anticuerpos biespedficos, estos pueden ser anticuerpos biespedficos convencionales, que pueden fabricarse de diferentes formas (Holliger, P. y Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por ejemplo prepararse qmmicamente o a partir de hibridomas hteridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpo bispedfico mencionados anteriormente. Pueden construirse diacuerpos y scFv sin una region Fc, usando solo dominios variables, lo que reduce posiblemente los efectos de una reaccion antiidiotfpica.

Los diacuerpos biespedficos, en contraposicion a anticuerpos biespedficos completos, pueden ser particularmente utiles porque pueden construirse de manera facil y expresarse en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipeptidos tales como fragmentos de anticuerpo) de especificidades de union adecuadas pueden seleccionarse de manera facil usando presentacion en fagos (documento WO94/13804) de bibliotecas. Si una brazo del diacuerpo va a mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antfgeno X, entonces puede elaborarse una biblioteca donde se vana el otro brazo y se selecciona un anticuerpo de especificidad adecuada. Pueden elaborarse anticuerpos biespedficos completos mediante ingeniena de “boton en ojal” (J. B. B. Ridgeway et al., Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden proporcionarse en forma de un UniBody®. Un UniBody® es un anticuerpo IgG4 con la region bisagra eliminada (vease GenMab Utrecht, Pafses Bajos; vease tambien, por ejemplo, el documento US20090226421). Esta tecnologfa de anticuerpos patentada crea un formato de anticuerpo mas pequeno, estable con una ventana terapeutica anticipada mas extensa que los formatos de anticuerpo pequeno actuales. Los anticuerpos IgG4 se consideran inertes y por tanto no interaccionan con el sistema inmunitario. Pueden modificarse anticuerpos IgG4 humanos completos eliminando la region bisagra del anticuerpo para obtener fragmentos de media molecula que tienen propiedades de estabilidad diferentes en relacion con la correspondiente IgG4 intacta (GenMab, Utrecht). Al dividir por la mitad la molecula de IgG4, queda solo un area en el UniBody® que puede unirse a antfgenos analogos (por ejemplo, dianas de enfermedades) y el UniBody® por tanto se une de forma univalente a un unico sitio en celulas diana. Para ciertos antfgenos de superficie de celulas cancerosas, esta union univalente puede no estimular a las celulas cancerosas para que crezcan tal como puede observarse usando anticuerpos bivalentes que tienen la misma especificidad de antigeno, y por lo tanto la tecnologfa UniBody® puede proporcionar opciones de tratamiento para algunos tipos de cancer que pueden ser resistentes al tratamiento con anticuerpos convencionales. El pequeno tamano del UniBody® puede ser un gran beneficio cuando se tratan algunas formas de cancer, permitiendo una mejor distribucion de la molecula sobre tumores solidos mas grandes y aumentando posiblemente la eficacia.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgacion pueden adoptar la forma de un nanobody. Los nanobodies se codifican mediante genes individuales y se producen eficazmente en la mayona de huespedes eucariotas y procariotas, por ejemplo E. coli (vease por ejemplo la patente estadounidense numero 6.765.087), mohos (por ejemplo Aspergillus o Trichoderma) y levadura (por ejemplo Saccharomyces, Kluyvermyces, Hansenula o Pichia (vease por ejemplo la patente estadounidense numero 6.838.254). El procedimiento de produccion puede aumentarse a escala y se han producido cantidades de multiples kilogramos de nanobodies. Pueden formularse nanobodies como una disolucion lista para su uso que tiene una vida util de almacenamiento prolongada. El metodo Nanoclone (vease, por ejemplo, el documento WO 06/079372) es un metodo patentado para generar nanobodies contra una diana deseada, basandose en la seleccion de alto rendimiento automatizada de celulas B.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 o fragmentos de union a antfgeno de los mismos tal como se dan a conocer en el presente documento estan humanizados. Esto se refiere a una molecula quimerica, generalmente preparada usando tecnicas recombinantes, que tienen un sitio de union a antfgeno derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana y la estructura de inmunoglobulina restante de la molecula basada en la estructura y/o la secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de union a antfgeno puede comprender o bien dominios variable completos fusionados a dominios constantes o bien solamente las CDR injertadas en regiones de marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de union a epftopo pueden ser silvestres o modificados por una o mas sustituciones de aminoacido. Esto elimina la region constante como inmunogeno en individuos humanos, pero permanece la posibilidad de una respuesta inmunitaria frente a la region variable foranea (LoBuglio, A. F. et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:4220-4224; Queen et al., PNAS (1988) 86:10029-10033; Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327). Los metodos ilustrativos para la humanizacion de los anticuerpos anti-CD40 dados a conocer en el presente documento incluyen los metodos descritos en la patente estadounidense numero 7.462.697. Los anticuerpos humanizados ilustrativos segun determinadas realizaciones de la presente invencion comprenden las secuencias humanizadas proporcionadas en SEQ ID NO:9 y 10.

Otro enfoque se centra no solo en proporcionar regiones constantes derivadas de ser humano, sino tambien en modificar las regiones variables asf como reorganizarlas tan proximas como sea posible a una forma humana. Se sabe que las regiones variables de cadenas ligeras como pesadas contienen tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que vanan en respuesta a los epttopos en cuestion y determinan la capacidad de union, flanqueadas por cuatro regiones de marco (FR) que se conservan relativamente en una especie dada y que supuestamente proporcionan un andamiaje para las CDR. Cuando se preparan anticuerpos no humanos con respecto a un epftopo particular, las regiones variables pueden “reorganizarse” o “humanizarse” injertando CDR derivadas de anticuerpo no humano en las FR presentes en el anticuerpo humano que va a modificarse. La aplicacion de este enfoque a diversos anticuerpos se ha notificado por Sato, K., et al., (1993) Cancer Res 53:851 856. Riechmann, L., et al., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen, M., et al., (1988) Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A., et al., (1991) Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H., et al., (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D., et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185; Tempest, P. R., et al., (1991) Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S., et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Carter, P., et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289; y Co, M. S. et al., (1992) J Immunol 148:1149-1154. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de raton humanizado que contiene las seis CDR de los anticuerpos de raton). En otras realizaciones, los anticuerpos humanizados tienen una o mas CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que se alteran con respecto al anticuerpo original, que se denominan tambien una o mas CDR “derivadas de” una o mas CDR del anticuerpo original.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgacion pueden ser anticuerpos quimericos. A este respecto, un anticuerpo quimerico esta compuesto por un fragmento de union a antfgeno de un anticuerpo anti-CD40 operativamente unido o fusionado de otra manera a una parte de Fc heterologa de un anticuerpo diferente. En determinadas realizaciones, el dominio de Fc heterologo es de origen humano. En otras realizaciones, el dominio de Fc heterologo puede ser de una clase de Ig diferente del anticuerpo original, incluyendo IgA (que incluye las subclases IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (incluyendo las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) e IgM. En realizaciones adicionales, el dominio de Fc heterologo puede estar compuesto por los dominios CH2 y CH3 de una o mas de las diferentes clases de Ig. Tal como se indico anteriormente con respecto a anticuerpos humanizados, el fragmento de union a antfgeno anti-CD40 de un anticuerpo quimerico puede comprender solo uno o mas de las CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento), o puede comprender un dominio variable entero (VL, VH o ambos).

En determinadas realizaciones, un anticuerpo que se une a CD40 comprende una o mas de las CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento. A este respecto, se ha demostrado en algunos casos que la transferencia de solamente la VHCDR3 de un anticuerpo puede realizarse mientras que aun conserva la union espedfica deseada (Barbas et al., PNAS (1995) 92: 2529-2533). Vease tambien, McLane et al., PNAS (1995) 92:5214-5218, Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:2161-2162.

Marks et al (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) describen metodos de produccion de repertorios de dominios variables de anticuerpo en los que se usan cebadores de consenso dirigidos a o adyacentes al extremo 5' del area de dominio variable junto con cebadores de consenso para la tercera region de marco de genes de VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una CDR3. Marks et al describen adicionalmente como este repertorio puede combinarse con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando tecnicas analogas, las secuencias derivadas de CDR3 de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden intercambiarse con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una CDR3, y los dominios VH o VL completos intercambiados pueden combinarse con un dominio VL o VH analogo para proporcionar un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que se une a CD40. El repertorio puede presentarse entonces en un sistema de huesped adecuado tal como el sistema de presentacion en fagos del documento WO92/01047 de manera que pueden seleccionarse anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos adecuados. Un repertorio puede consistir en al menos de aproximadamente 104 miembros individuales y hacia arriba varios ordenes de magnitud, por ejemplo, hasta aproximadamente desde 106 hasta 108 o 1010 o mas miembros. Se dan a conocer tambien tecnicas combinatorias o de intercambio analogas por Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), quien describe la tecnica en relacion a un gen de p-lactamasa pero observa que el enfoque puede usarse para la generacion de anticuerpos.

Una alternativa adicional es generar regiones VH o VL novedosas que portan una o mas secuencias derivadas de CDR de las realizaciones de la invencion descrita en el presente documento usando mutagenesis aleatoria de uno o mas genes de VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones dentro del dominio variable entero. Una tecnica de este tipo se describe por Gram et al (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580), quienes usaron PCR propensa a error. Otro metodo que puede usarse es dirigir la mutagenesis a regiones CDR de genes de VH o VL. Tecnicas de este tipo se dan a conocer por Barbas et al., (1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) y Schier et al (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).

En determinadas realizaciones, una VH y/o VL espedfica de los anticuerpos descritos en el presente documento puede usarse para examinar una biblioteca del dominio variable complementario para identificar anticuerpos con propiedades deseadas, tales como afinidad aumentada por CD40. Metodos de este tipo se describen, por ejemplo, en Portolano et al., J. Immunol. (1993) 150:880-887; Clarkson et al., Nature (1991) 352:624-628.

Pueden usarse tambien otros metodos para mezclar y aparear las CDR para identificar anticuerpos que tienen la actividad de union deseada, tal como union a CD40. Por ejemplo: Klimka et al., British Journal of Cancer (2000) 83: 252-260, describen un procedimiento de examen usando una biblioteca de VH humana y de VL de raton con CDR3 y FR4 conservadas a partir de la VH de raton. Tras obtener anticuerpos, la VH se examino frente a una biblioteca de VL humana para obtener anticuerpos que se uman al antfgeno. Beiboer et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:833-849 describen un procedimiento de examen usando una biblioteca de cadena ligera humana y cadena pesada de raton completa. Tras obtener anticuerpos, se combino una VL con una biblioteca de VH humana con la CDR3 del raton conservada. Se obtuvieron anticuerpos capaces de unirse a antfgeno. Rader et al., PNAS (1998) 95:8910-8915 describen un procedimiento similar al anterior de Beiboer et al.

Las tecnicas que acaban de describirse se conocen, en sf mismas, tal cual en la tecnica. El experto en la tecnica podra, sin embargo, usar tales tecnicas para obtener anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos segun varias realizaciones de la invencion descrita en el presente documento, usando metodologfa de rutina en la tecnica.

Tambien se da a conocer en el presente documento un metodo para obtener un dominio de union a antfgeno del anticuerpo espedfico para el antfgeno CD40, comprendiendo el metodo proporcionar por medio de adicion, delecion, sustitucion o insercion de uno o mas aminoacidos en la secuencia de aminoacidos de un dominio VH expuesto en el presente documento, un dominio VH que es una variante de la secuencia de aminoacidos del dominio VH, combinar opcionalmente el dominio VH asf proporcionado con uno o mas dominios VL y someter a prueba el dominio VH o combinacion o combinaciones de VH/VL para identificar un miembro de union espedfica o un dominio de union a antfgeno del anticuerpo espedfico para CD40 y opcionalmente con una o mas propiedades deseadas. Los dominios VL pueden tener una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente tal como se expone en el presente documento. Puede emplearse un metodo analogo en el que una o mas variantes de secuencia de un dominio VL dadas a conocer en el presente se combinan con uno o mas dominios VH.

Un epftopo que “se une espedficamente” o “se une preferentemente” (usados de manera intercambiable en el presente documento) a un anticuerpo o un polipeptido es un termino bien entendido en la tecnica, y metodos para determinar tal union espedfica o preferente tambien se conocen bien en la tecnica. Una molecula se dice que presenta “union espedfica” o “union preferente” si reacciona o se asocia de manera mas frecuente, mas facil, con mayor duracion y/o con mayor afinidad con una celula o sustancia particular que cuando lo hace con celulas o sustancias alternativas. Un anticuerpo “se une espedficamente” o “se une preferentemente” a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, de manera mas facil y/o con mayor duracion que cuando se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une espedfica o preferentemente a un epftopo de CD40 es un anticuerpo que se une a un epftopo de CD40 mayor afinidad, avidez, de manera mas facil y/o con mayor duracion que cuando se une a otros epftopos de CD40 o epftopos distintos de CD40. Se entiende tambien leyendo esta definicion que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epftopo) que se une espedfica o preferentemente a una primera diana puede unirse o no espedfica o preferentemente a una segunda diana. Como tal, “union espedfica” o “union preferente” no requiere de manera necesaria (aunque puede incluir) union exclusiva. Generalmente, pero no de manera necesaria, la referencia a union significa union preferente.

Union inmunologica se refiere generalmente a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molecula de inmunoglobulina y un antigeno para el que la inmunoglobulina es espedfica, por ejemplo a modo de ilustracion y no de limitacion, como resultado de atracciones o repulsion electroestaticas, ionicas, hidrofilas y/o hidrofobas, fuerzas estericas, puentes de hidrogeno, fuerzas de van der Waals y otras interacciones. La fuerza, o afinidad de interacciones de union inmunologica puede expresarse en terminos de la constante de disociacion (Kd) de la interaccion, en la que una Kd mas pequena representa una mayor afinidad. Las propiedades de union inmunologica de polipeptidos seleccionados puede cuantificarse usando metodos bien conocidos en la tecnica. Un metodo de este tipo implica medir las velocidades de formacion y disociacion del complejo de antigeno/sitio de union a antigeno, en el que esas velocidades dependen de las concentraciones de las parejas del complejo, la afinidad de la interaccion y de parametros geometricos que influyen igualmente en la velocidad en ambas direcciones. Por tanto, tanto la “constante de velocidad de asociacion” (Kon) como la “constante de velocidad de disociacion” (Koff) pueden determinarse mediante el calculo de las concentraciones y de las velocidades reales de asociacion y disociacion. La razon de Koff/Kon permite la cancelacion de todos los parametros no relacionados con la afinidad, y es por tanto igual a la constante de disociacion Kd. Vease, generalmente, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento tienen una afinidad de aproximadamente 100, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 o 199 picomolar, y en algunas realizaciones, los anticuerpos pueden tener incluso mayor afinidad por CD40.

El termino “inmunologicamente activo”, con referencia a un epftopo que es o “sigue siendo inmunologicamente activo”, se refiere a la capacidad de un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo anti-CD40) para unirse al epftopo en condiciones diferentes, por ejemplo, tras haberse sometido al epftopo a condiciones de reduccion y desnaturalizacion.

Un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo segun determinadas realizaciones preferidas de la presente solicitud puede ser uno que compite por la union a CD40 con cualquier anticuerpo descrito en el presente documento que tanto (i) se une espedficamente al antfgeno como (ii) comprende un dominio de VH y/o VL dado a conocer en el presente documento, o comprende una CDR3 de VH dada a conocer en el presente documento, o una variante de cualquiera de estos. La competicion entre los anticuerpos puede someterse a ensayo facilmente in vitro, por ejemplo usando ELISA y/o etiquetando con una molecula indicadora espedfica a un anticuerpo que puede detectarse en presencia de otros anticuerpos no etiquetados, para permitir la identificacion de anticuerpos espedficos que se unen al mismo epftopo o un epftopo solapante. Por tanto, se proporciona en el presente documento un anticuerpo espedfico o fragmento de union a antfgeno del mismo, que comprende un sitio de union a antfgeno de anticuerpo humano que compite con un anticuerpo descrito en el presente documento que se une a CD40.

En este sentido, tal como se usa en el presente documento, los terminos “compite con”, “inhibe la union” y “bloquea la union” (por ejemplo, en referencia a inhibicion/bloqueo de la union de CD40L a CD40 o en referencia a inhibicion/bloqueo de la union de un anticuerpo anti-CD40 a CD40) se usan indistintamente y abarcan inhibicion/bloqueo tanto parcial como completo. Tambien se pretende que la inhibicion y el bloqueo incluyan cualquier disminucion medible en la union de CD40L a CD40 cuando esta en contacto con un anticuerpo anti-CD40 tal como se da a conocer en el presente documento en comparacion con el ligando que no esta en contacto con un anticuerpo anti-CD40, por ejemplo, el bloqueo de CD40L a CD40 en al menos aproximadamente el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100%.

Las regiones constantes de las inmunoglobulinas muestran menos diversidad de secuencia que las regiones variables, y son responsables de la union de varias protemas naturales para provocar importantes acontecimientos bioqmmicos. En seres humanos, hay cinco clases diferentes de anticuerpos incluyendo IgA (que incluye las subclases IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (que incluye las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) e IgM. Las caractensticas distintivas entre estas clases de anticuerpos son sus regiones constantes, aunque pueden existir diferencias mas sutiles en la region V.

La region Fc de un anticuerpo interacciona con varios receptores y ligandos de Fc, confiriendo una serie de importantes capacidades funcionales denominadas funciones efectoras. Para IgG, la region Fc comprende los dominios de Ig CH2 y CH3 y la bisagra N-terminal que conduce a CH2. Una importante familia de receptores de Fc para la clase de IgG son los receptores de Fc gamma (FcyR). Estos receptores median en la comunicacion entre anticuerpos y el brazo celular del sistema inmunitario (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). En seres humanos, esta familia de protemas incluye FcyRI (CD64), que incluye las isoformas FcyRIa, FcyRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32), que incluye las isoformas FcyRlla (incluyendo los alotipos H131 y R131), FcyRIIb (que incluye FcyRIIb-1 y FcyRIIb-2) y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16), que incluye las isoformas FcyRIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158) y FcyRIIIb (incluyendo los alotipos FcyRIIIb-NA1 y FcyRIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Estos receptores tienen normalmente un dominio extracelular que media en la union a Fc, una region que abarca la membrana y un dominio intracelular que puede mediar en algun acontecimiento de senalizacion dentro de la celula. Estos receptores se expresan en una variedad de celulas inmunitarias incluyendo monocitos, macrofagos, neutrofilos, celulas dendnticas, eosinofilos, mastocitos, plaquetas, celulas B, linfocitos granulares grandes, celulas de Langerhans, celulas citolfticas naturales (NK) y celulas T. La formacion del complejo Fc/FcyR recluta estas celulas efectoras a sitios de antigeno unido, dando como resultado normalmente acontecimientos de senalizacion dentro de las celulas e importantes respuestas inmunitarias posteriores tales como liberacion de mediadores de inflamacion, activacion de celulas B, endocitosis, fagocitosis y ataque citotoxico.

La capacidad para mediar en funciones efectoras citotoxicas y fagodticas es un posible mecanismo mediante el cual los anticuerpos destruyen celulas seleccionadas como diana. La reaccion mediada por celulas en la que celulas citotoxicas inespedficas que expresan FcyR reconocen anticuerpo unido en una celula diana y posteriormente provocan la lisis de la celula diana se denomina citotoxicidad celular mediada por celulas dependiente de anticuerpos (CCDA) (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 20O0, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). La reaccion mediada por celulas en la que celulas citotoxicas inespedficas que expresan FcyR reconocen anticuerpo unido en una celula diana y posteriormente provocan la fagocitosis de la celula diana se denomina fagocitosis mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCP). Todos los FcyR se unen a la misma region en Fc, en el extremo N-terminal del dominio Cg2 (CH2) y la bisagra anterior. Esta interaccion esta bien caracterizada estructuralmente (Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749), y se han resuelto varias estructuras de la Fc humana unida al dominio extracelular de FcyRIIIb humano (codigo de registro de pdb 1E4K) (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273). (Codigos de registro de pdb 1IIS y 1IIX) (Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477).

Las diferentes subclases de IgG tienen diferentes afinidades por los FcyR, uniendose normalmente IgG1 e IgG3 sustancialmente mejor a los receptores que IgG2 e IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Todos los FcyR se unen a la misma region en Fc de IgG, aunque con diferentes afinidades: el agente de union de alta afinidad FcyRI tiene una Kd para IgG1 de 10'8 M-1, mientras que los receptores de baja afinidad FcyRII y FcyRIII se unen generalmente a 10'6 y 10'5 respectivamente. Los dominios extracelulares de FcyRIIIa y FcyRIIIb son identicos al 96%, sin embargo FcyRIIIb no tiene un dominio de senalizacion intracelular. Ademas, mientras que FcyRI, FcyRIIa/c, y FcyRIIIa son reguladores positivos de la activacion desencadenada por complejos inmunitarios, caracterizados por tener un dominio intracelular que tiene un motivo de activacion basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM), FcyRIIb tiene un motivo de inhibicion basado en tirosina inmunorreceptora (ITIM) y, es por tanto, inhibidor. Por tanto, los primeros se denominan receptores de activacion, y FcyRIIb se denomina receptor inhibidor. Los receptores tambien difieren en el patron de expresion y los niveles en diferentes celulas inmunitarias. Aun otro nivel de complejidad es la existencia de varios polimorfismos de FcyR en el proteoma humano. Un polimorfismo particularmente relevante con significacion clmica es V158/F158 FcyRIIIa. IgG1 humana se une con mayor afinidad al alotipo V158 que al alotipo F158. Esta diferencia de afinidad, y presumiblemente su efecto sobre CCDA y/o ADCP, se ha mostrado que es un determinante significativo de la eficacia del anticuerpo anti-CD20 rituximab (Rituxan®, una marca comercial registrada de IDEC Pharmaceuticals Corporation). Pacientes con el alotipo V158 responden favorablemente al tratamiento con rituximab; sin embargo, pacientes con el alotipo F158 de afinidad inferior responden mal (Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758). Aproximadamente el 10-20% de los seres humanos son homocigotos V158/V158, el 45% son heterocigotos V158/F158 y el 35-45% de los seres humanos son homocigotos F158/F158 (Lehrnbecher et al., 1999, Blood 94:4220-4232; Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758). Por tanto el 80-90% de los seres humanos responden mal, es decir tienen al menos un alelo del F158 FcyRIIIa.

La region Fc esta tambien implicada en la activacion de la cascada del complemento. En la ruta clasica del complemento, C1 se une con sus subunidades C1q a fragmentos de Fc de IgG o IgM, que ha formado un complejo con antfgeno(s). En determinadas realizaciones de la invencion, modificaciones en la region Fc comprenden modificaciones que alteran (o bien potencian o bien disminuyen) la capacidad de un anticuerpo espedfico de CD40 tal como se describe en el presente documento para activar el sistema del complemento (vease, por ejemplo, la patente estadounidense 7.740.847). Para evaluar la activacion del complemento, puede realizarse un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (vease, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)).

Por tanto, en determinadas realizaciones, la presente invencion proporciona anticuerpos anti-CD40 que tienen una region Fc modificada con propiedades funcionales alteradas, tales como actividad de CDC, CCDA o ADCP reducida o potenciada, o afinidad de union potenciada para un FcyR espedfico o semivida en suero aumentada. Otras regiones Fc modificadas contempladas en el presente documento se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses concedidas 7.317.091; 7.657.380; 7.662.925; 6.538.124; 6.528.624; 7.297.775; 7.364.731; las solicitudes estadounidenses publicadas US2009092599; US20080131435; US20080138344; y las solicitudes internacionales publicadas WO2006/105338; WO2004/063351; WO2006/088494; WO2007/024249.

Por tanto, en determinadas realizaciones, se fusionan dominios variables de anticuerpo con las especificidades de union deseadas a secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina. En determinadas realizaciones, la fusion es con un dominio constante de cadena pesada de Ig, que comprende al menos parte de la bisagra, las regiones C^h2 y C^h3. Se prefiere que tenga la primera region constante de cadena pesada (C^h1) que contiene el sitio necesario para la union a la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Se insertan ADN que codifican para la las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, en vectores de expresion separados, y se transfectan conjuntamente en una celula huesped adecuada. Esto proporciona mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipeptido en realizaciones cuando razones desiguales de las tres cadenas polipeptfdicas usadas en la construccion proporcionan el rendimiento optimo del anticuerpo biespedfico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptfdicas en un unico vector de expresion cuando la expresion de al menos dos cadenas polipeptfdicas en razones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las razones no tienen un efecto significativo sobre el rendimiento de la combinacion de cadenas deseada.

Tambien pueden modificarse anticuerpos de la presente invencion (y fragmentos de union a antfgeno y variantes de los mismos) para que incluyan un marcador o etiqueta de epftopo, por ejemplo, para su uso en aplicaciones de purificacion o diagnostico. Hay muchos grupos de union conocidos en la tecnica para preparar conjugados de anticuerpos, incluyendo, por ejemplo, los dados a conocer en la patente estadounidense n.° 5.208.020 o la patente EP 0 425 235 B1, y Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992). Los grupos de union incluyen grupos disulfuro, grupos tioeter, grupos acido labil, grupos fotolabiles, grupos labiles a peptidasas o grupos labiles a esterasas, tal como se da a conocer en las patentes identificadas anteriormente, prefiriendose grupos disulfuro y tioeter.

En otra realizacion contemplada, un anticuerpo espedfico de CD40 tal como se describe en el presente documento puede conjugarse o unirse operativamente con otro compuesto terapeutico, denominado en el presente documento conjugado. El conjugado puede ser un agente citotoxico, un agente quimioterapico, una citocina, un agente antiangiogenico, un inhibidor de tirosina cinasa, una toxina, un radioisotopo u otro agente terapeuticamente activo. Se han descrito anteriormente agentes quimioterapicos, citocinas, agentes antiangiogenicos, inhibidores de tirosina cinasa y otros agentes terapeuticos, y todos estos agentes terapeuticos mencionados anteriormente pueden encontrar uso como conjugados de anticuerpo.

En una realizacion alternativa, el anticuerpo se conjuga o se une operativamente a una toxina, incluyendo pero sin limitarse a toxinas de molecula pequena y toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. Las toxinas de molecula pequena incluyen pero no se limitan a saporina (Kuroda K, et al., The Prostate 70:1286-1294 (2010); Lip, WL. et al., 2007 Molecular Pharmaceutics 4:241-251; Quadros EV., et al., 2010 Mol Cancer Ther; 9(11); 3033-40; Polito L., et al. 2009 British Journal of Haematology, 147, 710-718), caliqueamicina, maitansina (patente estadounidense n.° 5.208.020), tricoteno y CC1065. Las toxinas incluyen pero no se limitan a ARNasa, gelonina, enediinas, ricina, abrina, toxina difterica, toxina del colera, gelonina, endotoxina de Pseudomonas (PE40), toxina de Shigella, toxina de Clostridium perfringens y protema antiviral de fitolaca.

En una realizacion, un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo de la divulgacion se conjuga con una o mas moleculas de maitansinoide. Los maitansinoides son inhibidores mitoticos que actuan inhibiendo la polimerizacion de la tubulina. La maitansina se aislo por primera vez del arbusto del este de Africa Maytenus serrata (patente estadounidense n.° 3.896.111). Posteriormente, se descubrio que determinados microbios tambien producen maitansinoides, tales como maitansinol y esteres de maitansinol C-3 (patente estadounidense n.° 4.151.042). Se dan a conocer maitansinol sintetico y derivados y analogos del mismo, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533. Se dan a conocer inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapeutico, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea Ep 0425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cancer colorrectal humano. Se encontro que el conjugado era altamente citotoxico hacia celulas de cancer de colon cultivadas, y mostro actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo.

Se preparan conjugados de anticuerpo-maitansinoide uniendo qmmicamente un anticuerpo a una molecula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biologica de la molecula de o bien anticuerpo o bien maitansinoide. Un promedio de 3-4 moleculas de maitansinoide conjugadas por molecula de anticuerpo ha mostrado eficacia en la potenciacion de la citotoxicidad de celulas diana sin afectar negativamente a la funcion o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperana que incluso una molecula de toxina/anticuerpo potenciada la citotoxicidad con respecto al uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides se conocen bien en la tecnica y pueden sintetizarse mediante tecnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se dan a conocer maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.208.020 y en las otras patentes y publicaciones no de patente a las que se hizo referencia anteriormente en el presente documento. Maitansinoides preferidos son maitansinol y analogos de maitansinol modificados en el anillo aromatico o en otras posiciones de la molecula de maitansinol, tales como diversos esteres de maitansinol.

Otro conjugado de interes comprende un anticuerpo conjugado con una o mas moleculas de caliqueamicina. La familia de caliqueamicina de antibioticos puede producir roturas en ADN bicatenario a concentraciones subpicomolares. Tambien pueden usarse analogos estructurales de caliqueamicina (Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58:2925-2928) (patente estadounidense n.° 5.714.586; patente estadounidense n.° 5.712.374; patente estadounidense n.° 5.264.586; patente estadounidense n.° 5.773.001). Analogos de dolastatina 10 tales como auristatina E (AE) y monometilauristatina E (MMAE) pueden encontrar uso como conjugados para los anticuerpos dados a conocer en el presente documento, o variantes de los mismos (Doronina et al., 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84; Francisco et al., 2003 Blood 102(4):1458-65). Las toxinas enzimaticamente activas utiles incluyen, pero no se limitan a cadena de difteria A, fragmentos activos que no se unen de toxina difterica, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, protemas de Aleurites fordii, protemas diantina, protemas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Vease, por ejemplo, el documento PCT WO 93/21232. La presente divulgacion contempla ademas realizaciones en las que se forma un conjugado o una fusion entre un anticuerpo espedfico de CD40 tal como se describe en el presente documento y un compuesto con actividad nucleolttica, por ejemplo una ribonucleasa o ADN endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa (ADNasa).

En una realizacion alternativa, un anticuerpo dado a conocer en el presente documento puede conjugarse o unirse operativamente con un radioisotopo para formar un radioconjugado. Estan disponibles una variedad de isotopos radiactivos para la produccion de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi.

Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden conjugarse en otras determinadas realizaciones con un resto terapeutico tal como una citotoxina (por ejemplo, un agente citostatico o citocida), un agente terapeutico o un elemento radiactivo (por ejemplo, emisores alfa, emisores gamma, etc.). Las citotoxinas o agentes citotoxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las celulas. Los ejemplos incluyen paclitaxel/paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procama, tetracama, lidocama, propranolol y puromicina y analogos u homologos de los mismos. Una citotoxina a modo de ejemplo preferida es saporina (disponible de Advanced Targeting Systems, San Diego, CA). Los agentes terapeuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracildecarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC), y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Ademas, un anticuerpo espedfico de CD40 (incluyendo un fragmento funcional del mismo tal como se proporciona en el presente documento tal como un fragmento de union a antfgeno) puede en determinadas realizaciones conjugarse con restos terapeuticos tales como materiales radiactivos o quelantes macrodclicos utiles para conjugar iones de radiometales. En determinadas realizaciones, el quelante macrodclico es acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N”,N”'-tetraacetico (DOTA) que puede unirse al anticuerpo por medio de una molecula de ligador. Tales moleculas de ligador se conocen comunmente en la tecnica y se describen en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; y Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50.

En aun otra realizacion, un anticuerpo puede conjugarse con un “receptor” (tal como estreptavidina) para su utilizacion en la seleccion como diana previa de tumores en la que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la eliminacion del conjugado no unido de la circulacion usando un agente de aclaramiento y luego la administracion de un “ligando” (por ejemplo avidina) que se conjuga con un agente citotoxico (por ejemplo un radionucleotido). En una realizacion alternativa, el anticuerpo se conjuga o se une operativamente con una enzima con el fin de emplear terapia de profarmaco mediada por enzimas dependiente de anticuerpo (ADEPT). Puede usarse ADEPT conjugando o uniendo operativamente el anticuerpo a una enzima activadora de profarmaco que convierte un profarmaco (por ejemplo un agente quimioterapico de peptidilo, vease el documento PCT WO 81/01145) en un farmaco anticancengeno activo. Veanse, por ejemplo, el documento PCT WO 88/07378 y la patente estadounidense n.° 4.975.278. El componente enzimatico del inmunoconjugado util para ADEPT incluye cualquier enzima que pueda actuar sobre un profarmaco de un modo tal como para convertirlo en su forma mas activa, citotoxica. Las enzimas que son utiles en el metodo de estas realizaciones y relacionadas incluyen pero no se limitan a fosfatasa alcalina util para convertir profarmacos que contienen fosfato en farmacos libres; arilsulfatasa util para convertir profarmacos que contienen sulfato en farmacos libres; citosina desaminasa util para convertir 5-fluorocitosina no toxica en el farmaco anticancengeno, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son utiles para convertir profarmacos que contienen peptidos en farmacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, utiles para convertir profarmacos que contienen sustituyentes de D-aminoacido; enzimas de escision de hidratos de carbono tales como □-galactosidasa y neuramimidasa utiles para convertir profarmacos glicosilados en farmacos libres; beta-lactamasa util para convertir farmacos derivatizados con □-lactamas en farmacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, utiles para convertir farmacos derivatizados en sus nitrogenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en farmacos libres. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos con actividad enzimatica, tambien conocidos en la tecnica como “abzimas”, para convertir profarmacos en farmacos activos libres (vease, por ejemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Pueden prepararse conjugados de anticuerpo-abzima para la administracion de la abzima a una poblacion de celulas tumorales.

Pueden prepararse inmunoconjugados usando una variedad de agentes de acoplamiento de protemas bifuncionales tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehfdos (tal como glutaraldetndo), compuestos de bisazido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particulares incluyen 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) y 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP) para proporcionar una union disulfuro. El ligador puede ser un “ligador escindible” que facilita la liberacion de uno o mas componentes escindibles. Por ejemplo, puede usarse un ligador labil a acido (Cancer Research 52: 127 131 (1992); patente estadounidense n.° 5.208.020).

Otras modificaciones de los anticuerpos (y polipeptidos) de la invencion tambien se contemplan en el presente documento. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a una variedad de polfmeros no protemicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolfmeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo tambien puede atraparse en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsulas de gelatina y microcapsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente), en sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartmulas y nanocapsulas), o en macroemulsiones. Tales tecnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edicion, Oslo, A., Ed., (1980).

Los “portadores” tal como se usa en el presente documento incluyen portadores, excipientes o estabilizadores farmaceuticamente aceptables que no son toxicos para la celula o mamffero que se expone a los mismos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. A menudo el portador fisiologicamente aceptable es una disolucion acuosa de pH tamponado. Los ejemplos de portadores fisiologicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico; polipeptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); protemas, tales como albumina serica, gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azucar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o tensioactivos no ionicos tales como polisorbato 20 (TWEEN™), polietilenglicol (PEG) y poloxameros (PLu Ro NICS™), y similares.

Tal como se indica en otra parte en el presente documento, los anticuerpos de la presente divulgacion inducen senalizacion de CD40 en celulas tumorales, activan celulas dendnticas y la vigilancia inmunitaria, activan la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) contra celulas tumorales, bloquean la union de CD40 a CD40L; tienen actividad agonista de CD40; activan celulas presentadoras de antfgeno; estimulan la liberacion de citocinas de celulas presentadoras de antfgeno; inducen apoptosis de celulas tumorales; inhiben la proliferacion de celulas tumorales; destruyen celulas tumorales por medio de la induccion de funciones efectoras incluyendo pero sin limitarse a CCDA, CDC y ADCP; estimulan respuestas de celulas T antitumorales; reducen tumores establecidos; e inhiben tumores resistentes a rituximab. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden tener o inducir una combinacion de uno cualquiera o mas de estos atributos o actividades. Las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-CD40 pueden evaluarse usando una variedad de metodos conocidos por el experto, tales ensayos de afinidad/union (por ejemplo, resonancia de plasmon superficial, ensayos de inhibicion por competicion); ensayos de citotoxicidad, ensayos de viabilidad celular, ensayos de proliferacion, activacion o diferenciacion celular, ensayos de CCDA y CDC, otra actividad celular que resulta de acontecimientos de senalizacion celular de CD40 (por ejemplo, fosforilacion de STAT3, produccion de citocinas incluyendo IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-alfa y MlP1alfa), e inhibicion del crecimiento tumoral y/o de celulas cancerosas usando modelos in vitro o in vivo. Otros ensayos pueden someter a prueba la capacidad de los anticuerpos descritos en el presente documento para bloquear la union normal de CD40L a CD40 o respuestas mediadas por CD40, tales como senalizacion celular, activacion celular (por ejemplo, activacion, proliferacion de celulas inmunitarias; activacion de celulas presentadoras de antfgeno (por ejemplo, celulas dendnticas, celulas B, macrofagos) y ensayos de maduracion), respuestas inmunitarias (incluyendo respuestas humoral y mediada por celulas), etc. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden someterse a prueba tambien para determinar efectos sobre la internalizacion de CD40, eficacia in vitro e in vivo, etc. Tales ensayos pueden realizarse usando protocolos bien establecidos conocidos por el experto (veanse, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology (editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Etan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); o kits comercialmente disponibles.

La presente invencion proporciona ademas en determinadas realizaciones un acido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, un acido nucleico que codifica para una CDR o un dominio VH o VL tal como se describe en el presente documento. Los acidos nucleicos incluyen ADN y ARN. Estas realizaciones y relacionadas pueden incluir polinucleotidos que codifican para anticuerpos que se unen a CD40 tal como se describe en el presente documento.

El termino “polinucleotido aislado” tal como se usa en el presente documento significara un polinucleotido de origen genomico, de ADNc o sintetico o alguna combinacion de los mismos, que en virtud de su origen el polinucleotido aislado (1) no esta asociado con todo o una porcion de un polinucleotido en el que el polinucleotido aislado se encuentra en la naturaleza, (2) esta unido a un polinucleotido al que no esta unido en la naturaleza o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia mas grande.

El termino “operativamente unido” significa que los componentes a los que se aplica el termino estan en una relacion que les permite llevar a cabo sus funciones inherentes en condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control de la transcripcion “operativamente unida” a una secuencia codificante de protema esta ligada a la misma de modo que la expresion de la secuencia codificante de protema se logra en condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias de control.

El termino “secuencia de control” tal como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de polinucleotido pueden afectar a la expresion, el procesamiento o la localizacion intracelular de secuencias codificantes a las que estan ligadas u operativamente unidas. La naturaleza de tales secuencias de control puede depender del organismo huesped. En realizaciones particulares, las secuencias de control de la transcripcion para procariotas pueden incluir un promotor, un sitio de union al ribosoma y una secuencia de terminacion de la transcripcion. En otras realizaciones particulares, las secuencias de control de la transcripcion para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripcion, secuencias potenciadoras de la transcripcion, secuencias de terminacion de la transcripcion y secuencias de poliadenilacion. En determinadas realizaciones, las “secuencias de control” pueden incluir secuencias lfder y/o secuencias de pareja de fusion.

El termino “polinucleotido” tal como se le hace referencia en el presente documento significa polfmeros de acido nucleico monocatenarios o bicatenarios. En determinadas realizaciones, los nucleotidos que comprenden el polinucleotido pueden ser ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleotido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de bases tales como bromouridina, modificaciones de ribosa tales como arabinosido y 2',3'-didesoxirribosa y modificaciones de las uniones entre nucleotidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato. El termino “polinucleotido” incluye espedficamente formas mono y bicatenarias de ADN.

El termino “nucleotidos que se producen de manera natural” incluye desoxirribonucleotidos y ribonucleotidos. El termino “nucleotidos modificados” incluye nucleotidos con grupos azucar modificados o sustituidos y similares. El termino “uniones de oligonucleotidos” incluye uniones de oligonucleotidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforoamidato, y similares. Veanse, por ejemplo, LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Zon et al., 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pags. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford, Inglaterra; Stec et al., patente estadounidense n.° 5.151.510; Uhlmann y Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543. Un oligonucleotido puede incluir un marcador detectable para permitir la deteccion del oligonucleotido o la hibridacion del mismo.

El termino “vector” se usa para referirse a cualquier molecula (por ejemplo, acido nucleico, plasmido o virus) usado para transferir informacion de codificacion a una celula huesped. El termino “vector de expresion” se refiere a un vector que es adecuado para la transformacion de una celula huesped y contiene secuencias de acido nucleico que dirigen y/o controlan la expresion de secuencias de acido nucleico heterologas insertadas. La expresion incluye, pero no se limita a, procesos tales como transcripcion, traduccion y corte y empalme del ARN, si estan presentes intrones.

Tal como entenderan los expertos en la tecnica, los polinucleotidos pueden incluir secuencias genomicas, secuencias extragenomicas y codificadas por plasmido y segmentos genicos disenados por ingeniena genetica mas pequenos que expresan, o pueden adaptarse para que expresen, protemas, polipeptidos, peptidos y similares. Tales segmentos pueden aislarse de manera natural, o modificarse de manera sintetica por el experto.

Tal como tambien reconocera el experto en la tecnica, los polinucleotidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moleculas de ADN (genomico, ADNc o sintetico) o de ARN. Las moleculas de ARN pueden incluir moleculas de ARNhn, que contienen intrones y corresponden a una molecula de ADN de una manera uno a uno, y moleculas de ARNm, que no contienen intrones. Pueden estar presentes, pero no es necesario, moleculas codificantes o no codificantes adicionales dentro de un polinucleotido segun la presente divulgacion, y un polinucleotido puede estar unido, pero no es necesario, a otras moleculas y/o materiales de soporte. Los polinucleotidos pueden comprender una secuencia nativa o pueden comprender una secuencia que codifica para una variante o un derivado de una secuencia de este tipo.

Por tanto, segun estas realizaciones y relacionadas, la presente divulgacion tambien proporciona polinucleotidos que codifican para los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, se proporcionan polinucleotidos que comprenden parte de o toda una secuencia de polinucleotido que codifica para un anticuerpo tal como se describe en el presente documento y complementos de tales polinucleotidos.

En otras realizaciones relacionadas, las variantes de polinucleotido pueden tener una identidad sustancial con una secuencia de polinucleotido que codifica para un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento. Por ejemplo, un polinucleotido puede ser un polinucleotido que comprende una identidad de secuencia de al menos el 70%, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% o mas, en comparacion con una secuencia de polinucleotido de referencia tal como una secuencia que codifica para un anticuerpo descrito en el presente documento, usando los metodos descritos en el presente documento, (por ejemplo, analisis de BLAST usando parametros convencionales, tal como se describe mas adelante). Un experto en esta tecnica reconocera que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad de protemas correspondiente codificadas por dos secuencias de nucleotidos teniendo en cuenta la degeneracion de codones, la similitud de aminoacidos, la situacion del marco de lectura y similares.

Normalmente, las variantes de polinucleotido contendran una o mas sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, preferiblemente de manera que la afinidad de union del anticuerpo codificado por el polinucleotido variante no disminuye sustancialmente en relacion con un anticuerpo codificado por una secuencia de polinucleotido espedficamente expuesta en el presente documento.

En otras determinadas realizaciones relacionadas, los fragmentos de polinucleotido pueden comprender o consistir esencialmente en diversas longitudes de tramos contiguos de secuencia identica a o complementaria a una secuencia que codifica para un anticuerpo tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se proporcionan polinucleotidos que comprenden o consisten esencialmente en al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500 o 1000 o mas nucleotidos contiguos de una secuencia que codifica para un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, dado a conocer en el presente documento asf como longitudes intermedias entre ellos. Se entendera facilmente que “longitudes intermedias”, en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores indicados, tales como 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos los numeros enteros entre 200-500; 500-1.000, y similares. Una secuencia de polinucleotido tal como se describe en el presente documento puede extenderse en uno o ambos extremos mediante nucleotidos adicionales no encontrados en la secuencia nativa. Esta secuencia adicional puede consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleotidos en cualquier extremo de un polinucleotido que codifica para un anticuerpo descrito en el presente documento o en ambos extremos de un polinucleotido que codifica para un anticuerpo descrito en el presente documento.

En otra realizacion, se proporcionan polinucleotidos que pueden hibridarse en condiciones de rigurosidad moderada a alta con una secuencia de polinucleotido que codifica para un anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, proporcionado en el presente documento, o un fragmento del mismo, o una secuencia complementaria del mismo. En la tecnica de biologfa molecular se conocen bien tecnicas de hibridacion. Para fines de ilustracion, condiciones de rigurosidad moderadamente rigurosas para someter a prueba la hibridacion de un polinucleotido tal como se proporcionan en el presente documento con otros polinucleotidos incluyen lavar previamente en una disolucion de 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridar a 50°C-60°C, 5 X SSC, durante la noche; seguido por lavar dos veces a 65°C durante 20 minutos con cada uno de 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contienen SDS al 0,1%. Un experto en la tecnica entendera que la rigurosidad de la hibridacion puede manipularse facilmente, tal como alterando el contenido en sal de la disolucion de hibridacion y/o la temperatura a la que se realiza la hibridacion. Por ejemplo, en otra realizacion, las condiciones de hibridacion altamente rigurosas incluyen las descritas anteriormente, con la excepcion de que la temperatura de hibridacion se aumenta, por ejemplo, hasta 60°C-65°C o 65°C-70°C.

En determinadas realizaciones, los polinucleotidos descritos anteriormente, por ejemplo, variantes de polinucleotido, fragmentos y secuencias de hibridacion, codifican para anticuerpos que se unen a CD40, o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. En otras realizaciones, tales polinucleotidos codifican para anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno, o CDR de los mismos, que se unen a CD40 al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 70% y en determinadas realizaciones, al menos aproximadamente el 90% asf como una secuencia de anticuerpo expuesta espedficamente en el presente documento. En realizaciones adicionales, tales polinucleotidos codifican para anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno, o CDR de los mismos, que se unen a CD40 con mayor afinidad que los anticuerpos expuestos en el presente documento, por ejemplo, que se unen cuantitativamente al menos aproximadamente el 105%, el 106%, el 107%, el 108%, el 109% o el 110% asf como una secuencia de anticuerpo expuesta espedficamente en el presente documento.

Tal como se describe en otra parte en el presente documento, la determinacion de las estructuras tridimensionales de polipeptidos representativos (por ejemplo, anticuerpos espedficos de CD40 variantes tal como se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, una protema de anticuerpo que tiene un fragmento de union a antfgeno tal como se proporciona en el presente documento) puede hacerse a traves de metodologfas de rutina de manera que la sustitucion, adicion, delecion o insercion de uno o mas aminoacidos con aminoacidos naturales o no naturales seleccionados puede modelarse practicamente para fines de determinar si una variante estructural asf derivada conserva las propiedades de relleno de espacios de las especies dadas a conocer en el presente documento. El experto en la tecnica conoce una variedad de programas informaticos para determinar sustituciones de aminoacidos apropiadas (o polinucleotidos apropiados que codifican para la secuencia de aminoacidos) dentro de un anticuerpo de manera que, por ejemplo, se mantenga la afinidad o se logre una afinidad mejor.

Los polinucleotidos descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, senales de poliadenilacion, sitios de enzimas de restriccion adicionales, sitios de clonacion multiple, otros segmentos codificantes, y similares, de manera que su longitud global puede variar considerablemente. Por tanto, se contempla que pueda emplearse un fragmento de acido nucleico de casi cualquier longitud, estando limitada la longitud total preferiblemente por la facilidad de preparacion y uso en el protocolo de ADN recombinante previsto. Por ejemplo, se contempla que segmentos de polinucleotido ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10.000, aproximadamente 5000, aproximadamente 3000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50 pares de bases de longitud, y similares (incluyendo todas las longitudes intermedias) sean utiles.

Cuando se comparan secuencias de polinucleotido, se dice que dos secuencias son “identicas” si la secuencia de nucleotidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para lograr una correspondencia maxima, tal como se describe a continuacion. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan normalmente comparando las secuencias a lo largo de una ventana de comparacion para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparacion” tal como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, de habitualmente 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas tras alinearse de manera optima las dos secuencias.

La alineacion optima de secuencias para comparacion puede realizarse usando el programa Megalign en el paquete Lasergene de software de bioinformatica (DNASTAR, Inc., Madison, WI), usando parametros por defecto. Este programa realiza varios esquemas de alineacion descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC vol. 5, supl. 3, pags.

345-358; Hein J., Unified Approach to Alignment and Philogenes, pags. 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol.

183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. y Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor 11:105 (1971); Santou, N. Nes, M., Mol. Biol. Evol.

4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730 (1983).

Alternativamente, la alineacion optima de secuencias para comparacion puede realizarse mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman, Add. APL. Math 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineacion de identidad de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante los metodos de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspeccion.

Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nucl. Acids Res.

25:3389-3402 (1977), y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 pueden usarse, por ejemplo con los parametros descritos en el presente documento, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre dos o mas de los polinucleotidos. El software para realizar los analisis de BLAST esta disponible publicamente a traves del National Center for Biotechnology Information. En un ejemplo ilustrativo, pueden calcularse puntuaciones acumuladas usando, para secuencias de nucleotidos, los parametros M (puntuacion de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuacion de penalizacion para residuos no coincidentes; siempre<0). La extension de los aciertos de palabra en cada direccion se detiene cuando: la puntuacion de alineacion acumulada desciende en la cantidad X con respecto a su valor logrado maximo; la puntuacion acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulacion de una o mas alineaciones de residuos de puntuacion negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parametros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineacion. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)), alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparacion de ambas hebras.

En determinadas realizaciones, el “porcentaje de identidad de secuencia” se determina comparando dos secuencias alineadas de manera optima a lo largo de una ventana de comparacion de al menos 20 posiciones, en la que la porcion de la secuencia de polinucleotido en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos, habitualmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparacion con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para la alineacion optima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el numero de posiciones en las que aparecen bases de acido nucleico identicas en ambas secuencias para producir el numero de posiciones coincidentes, dividiendo el numero de posiciones coincidentes entre el numero total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamano de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

Los expertos habituales en la tecnica apreciaran que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, hay muchas secuencias de nucleotidos que codifican para un anticuerpo tal como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleotidos soportan una identidad de secuencia minima con la secuencia de nucleotidos de la secuencia de polinucleotido original o nativa que codifica para anticuerpos que se unen a CD40. No obstante, la presente divulgacion contempla expresamente polinucleotidos que vanan debido a diferencias en el uso de codones. En determinadas realizaciones, se contemplan espedficamente secuencias que tienen codones optimizados para su expresion en mairnferos.

Por tanto, en otra realizacion de la invencion, puede emplearse un enfoque de mutagenesis, tal como mutagenesis espedfica de sitio, para la preparacion de variantes y/o derivados de los anticuerpos descritos en el presente documento. Mediante este enfoque, pueden hacerse modificaciones espedficas en una secuencia de polipeptido a traves de mutagenesis de los polinucleotidos subyacentes que la codifican. Estas tecnicas proporcionan un enfoque sencillo para preparar y someter a prueba variantes de secuencia, por ejemplo, que incorporan una o mas de las consideraciones anteriores, introduciendo uno o mas cambios en la secuencia de nucleotidos en el polinucleotido. La mutagenesis espedfica de sitio permite la produccion de mutantes a traves del uso de secuencias de oligonucleotido espedficas que codifican para la secuencia de ADN de la mutacion deseada, asf como un numero suficiente de nucleotidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador de tamano y complejidad de secuencia suficientes para formar un duplex estable en ambos lados de la union de delecion que esta atravesandose. Pueden emplearse mutaciones en una secuencia de polinucleotido seleccionada para mejorar, alterar, disminuir, modificar o cambiar de otra forma las propiedades del propio polinucleotido, y/o alterar las propiedades, actividad, composicion, estabilidad o secuencia primaria del polipeptido codificado.

En determinadas realizaciones, los inventores contemplan la mutagenesis de las secuencias de polinucleotido que codifican para un anticuerpo dado a conocer en el presente documento, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, para alterar una o mas propiedades del polipeptido codificado, tal como la afinidad de union del anticuerpo o el fragmento de union a antfgeno del mismo, o la funcion de una region Fc particular, o la afinidad de la region Fc por un FcyR particular. Las tecnicas de mutagenesis espedfica de sitio se conocen bien en la tecnica, y se usan ampliamente para crear variantes de tanto polipeptidos como polinucleotidos. Por ejemplo, se usa a menudo mutagenesis espedfica de sitio para alterar una porcion espedfica de una molecula de ADN. En tales realizaciones, se emplea un cebador que comprende normalmente de aproximadamente 14 a aproximadamente 25 nucleotidos o asf de longitud, alterandose de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 residuos en ambos lados de la union de la secuencia.

Tal como apreciaran los expertos en la tecnica, las tecnicas de mutagenesis espedfica de sitio han empleado a menudo un vector de fago que existe en forma tanto monocatenaria como bicatenaria. Los vectores tfpicos utiles en mutagenesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos estan facilmente disponibles comercialmente y su uso lo conocen bien generalmente los expertos en la tecnica. Tambien se emplean de manera rutinaria plasmidos bicatenarios en mutagenesis dirigida al sitio que eliminan la etapa de transferir el gen de interes de un plasmido a un fago.

En general, la mutagenesis dirigida al sitio segun el presente documento se realiza obteniendo en primer lugar un vector monocatenario o separando por fusion las dos hebras de un vector bicatenario que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica para el peptido deseado. Se prepara un cebador de oligonucleotido que lleva la secuencia mutada deseada, generalmente de manera sintetica. Este cebador se aparea entonces con el vector monocatenario y se somete a enzimas que polimerizan el ADN tales como fragmento Klenow de polimerasa I de E. coli, con el fin de completar la smtesis de la hebra que lleva la mutacion. Por tanto, se forma un heteroduplex en el que una hebra codifica para la secuencia no mutada original y la segunda hebra lleva la mutacion deseada. Este vector de heteroduplex se usa entonces para transformar celulas apropiadas, tales como celulas de E. coli, y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que llevan la disposicion de secuencia mutada.

La preparacion de variantes de secuencia de los segmentos de ADN que codifican para peptidos seleccionados usando mutagenesis dirigida al sitio proporciona medios de produccion de especies potencialmente utiles y no se pretende que sea limitativo puesto que hay otros modos en los que pueden obtenerse variantes de secuencia de peptidos y las secuencias de ADN que codifican para los mismos. Por ejemplo, pueden tratarse vectores recombinantes que codifican para la secuencia de peptidos deseada con agentes mutagenicos, tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia. Se encuentran detalles espedficos respecto a estos metodos y protocolos en las ensenanzas de Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop y Bajpai, 1991; Kuby, 1994; y Maniatis et al., 1982.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “procedimiento de mutagenesis dirigida a oligonucleotidos” se refiere a procesos dependientes del molde y propagacion mediada por vector que dan como resultado un aumento en la concentracion de una molecula de acido nucleico espedfica en relacion con su concentracion inicial, o en un aumento en la concentracion de una senal detectable, tal como amplificacion. Tal como se usa en el presente documento, el termino “procedimiento de mutagenesis dirigida a oligonucleotidos” se pretende que se refiera a un proceso que implica la extension dependiente del molde de una molecula cebadora. El termino proceso dependiente del molde se refiere a smtesis de acidos nucleicos de una molecula de ARN o ADN en la que la secuencia de la hebra recien sintetizada de acido nucleico esta dictada por las normas bien conocidas de apareamiento de bases complementaria (vease, por ejemplo, Watson, 1987). Normalmente, las metodolog^as mediadas por vector implican la introduccion del fragmento de acido nucleico en un vector de ADN o ARN, la amplificacion clonal del vector, y la recuperacion del fragmento amplificado de acido nucleico. Se proporcionan ejemplos de tales metodologfas en la patente estadounidense n.° 4.237.224.

En otro enfoque para la produccion de variantes de polipeptido, puede emplearse recombinacion de secuencia recurrente, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 5.837.458. En este enfoque, se realizan ciclos iterativos de recombinacion y cribado o seleccion para “desarrollar” variantes de polinucleotido individuales que tienen, por ejemplo, afinidad de union aumentada. Determinadas realizaciones tambien proporcionan constructos en forma de plasmidos, vectores, casetes de expresion o transcripcion que comprenden al menos un polinucleotido tal como se describe en el presente documento.

En muchas realizaciones, los acidos nucleicos que codifican para un anticuerpo monoclonal objeto se introducen directamente en una celula huesped, y la celula incubada en condiciones suficientes para inducir expresion del anticuerpo codificado. Los anticuerpos de esta divulgacion se preparan usando tecnicas convencionales bien conocidas para los expertos en la tecnica en combinacion con las secuencias de acido nucleico y de polipeptido proporcionadas en el presente documento. Las secuencias de polipeptido pueden usarse para determinar secuencias de acido nucleico apropiadas que codifican para el anticuerpo particular dadas a conocer de ese modo. La secuencia de acido nucleico puede optimizarse para reflejar “preferencias” de codon particulares para diversos sistemas de expresion segun metodos convencionales bien conocidos para los expertos en la tecnica.

Segun determinadas realizaciones relacionadas, se proporciona una celula huesped recombinante que comprende uno o mas constructos tal como se describe en el presente documento; un acido nucleico que codifica para cualquier anticuerpo, CDR, dominio VH o VL, o fragmento de union a antigeno del mismo; y un metodo de produccion del producto codificado, metodo que comprende por tanto expresion de acido nucleico codificante. La expresion puede lograrse de manera conveniente cultivando en condiciones apropiadas celulas huesped recombinantes que contienen el acido nucleico. Tras la produccion mediante expresion, puede aislarse un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, y/o purificarse usando cualquier tecnica adecuada, y entonces se usan segun se deseen.

Pueden aislarse y/o purificarse anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos tal como se proporciona en el presente documento, y moleculas y vectores de acidos nucleicos codificantes, por ejemplo a partir de su medio natural, en forma sustancialmente pura u homogenea, o, en el caso de acido nucleico, libre o sustancialmente libre de acido nucleico o genes de origen distinto a la secuencia que codifica para un polipeptido con la funcion deseada. Acido nucleico puede comprender ADN o ARN y puede ser completa o parcialmente sintetico. La referencia a una secuencia de nucleotidos tal como se expone en el presente documento abarca una molecula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molecula de ARN con la secuencia especificada en la que U se sustituye por T, a menos que el contexto requiera lo contrario.

Se conocen bien sistemas para la clonacion y expresion de un polipeptido en una variedad de diferentes celulas huesped. Las celulas huesped adecuadas incluyen bacterias, celulas de mairnfero, levadura y sistemas de baculovirus. Las lmeas de celulas de marnffero disponibles en la tecnica para la expresion de un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino, celulas HeLa, celulas de rinon de hamster bebe, celulas de melanoma de raton NSO y muchas otras. Un huesped bacteriano preferido comun es E. coli.

La expresion de anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno en celulas procariotas tales como E. coli esta bien establecida en la tecnica. Para una revision, vease, por ejemplo Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). La expresion en celulas eucariotas en cultivo tambien esta disponible para los expertos en la tecnica como una opcion para la produccion de anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, veanse revisiones recientes, por ejemplo Ref, M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J. J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560. Tambien pueden escogerse o construirse vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilacion, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias segun sea apropiado. Los vectores pueden ser plasmidos, virales por ejemplo fago, o fagemido, segun sea apropiado. Para detalles adicionales vease, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edicion, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas tecnicas y protocolos conocidos para la manipulacion de acido nucleico, por ejemplo en la preparacion de constructos de acido nucleico, mutagenesis, secuenciamiento, introduccion de ADN en celulas y expresion genica, y analisis de protemas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, segunda edicion, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992, o posteriores actualizaciones de los mismos.

El termino “celula huesped” se usa para referirse a una celula en la que se ha introducido, o que puede haberse introducido en, una secuencia de acido nucleico que codifica para uno o mas de los anticuerpos descritos en el presente documento, y que expresa adicionalmente o puede expresar un gen seleccionado de interes, tal como un gen que codificara para cualquier anticuerpo descrito en el presente documento. El termino incluye la progenie de la celula original, ya sea o no la progenie identica en morfologfa o en maquillaje genetico al progenitor original, siempre que este presente el gen seleccionado. Por consiguiente, tambien se contempla un metodo que comprende introducir tal acido nucleico en una celula huesped. La introduccion puede emplear cualquier tecnica disponible. Para celulas eucariotas, las tecnicas adecuadas pueden incluir transfeccion de fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporacion, transfeccion mediada por liposomas y transduccion usando retrovirus u otros virus, por ejemplo vaccinia o, para celulas de insecto, baculovirus. Para celulas bacterianas, las tecnicas adecuadas pueden incluir transformacion de cloruro de calcio, electroporacion y transfeccion usando bateriofago. La introduccion puede continuarse provocando o permitiendo la expresion del acido nucleico, por ejemplo, cultivando celulas huesped en condiciones para la expresion del gen. En una realizacion, el acido nucleico se integra en el genoma (por ejemplo cromosoma) de la celula huesped. Puede promoverse la integracion mediante inclusion de secuencias que promueven la recombinacion con el genoma, segun tecnicas convencionales.

La presente invencion tambien proporciona, en determinadas realizaciones, un metodo que comprende usar un constructo tal como se indico anteriormente en un sistema de expresion con el fin de expresar un polipeptido particular tal como un anticuerpo espedfico de CD40 tal como se describe en el presente documento. El termino “transduccion” se usa para referirse a la transferencia de genes de una bacteria a otra, habitualmente mediante un fago. “Transduccion” tambien se refiere a la adquisicion y transferencia de secuencias celulares eucariotas mediante retrovirus. El termino “transfeccion” se usa para referirse a la captacion de ADN foraneo o exogeno por una celula, y una celula se ha “transfectado” cuando el ADN exogeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Varias tecnicas de transfeccion se conocen bien en la tecnica y se dan a conocer en el presente documento. Vease, por ejemplo, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; y Chu et al., 1981, Gene 13:197. Tales tecnicas pueden usarse para introduce uno o mas restos de ADN exogeno en celulas huesped adecuadas.

El termino “transformacion” tal como se usa en el presente documento se refiere a un cambio en las caractensticas geneticas de una celula, y una celula se ha transformado cuando se ha modificado para contener un ADN nuevo. Por ejemplo, una celula se transforma cuando se modifica geneticamente a partir de su estado nativo. Tras la transfeccion o transduccion, el ADN transformante puede recombinarse con el de la celula integrandose ffsicamente en un cromosoma de la celula, o puede mantenerse de manera transitoria como elemento episomal sin replicarse, o puede replicarse independientemente como un plasmido. Una celula se considera que se ha transformado de manera estable cuando el ADN se replica con la division de la celula. El termino “que se produce de manera natural” o “nativo” cuando se usa en relacion con materiales biologicos tales como moleculas de acido nucleico, polipeptidos, celulas huesped, y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza y no son manipulados por un ser humano. De manera similar, “que no se produce de manera natural” o “no nativo” tal como se usa en el presente documento se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado o sintetizado estructuralmente por un ser humano.

Los terminos “polipeptido” “protema” y “peptido” y “glicoprotema” se usan de manera intercambiable y significan un polfmero de aminoacidos no limitados a ninguna longitud particular. El termino no excluye modificaciones tales como miristilacion, sulfacion, glicosilacion, fosforilacion y adicion o delecion de secuencias senal. Los terminos “polipeptido” o “protema” significan una o mas cadenas de aminoacidos, en las que cada cadena comprende aminoacidos unidos de manera covalente mediante enlaces peptfdicos, y en las que dicho polipeptido o protema puede comprender una pluralidad de cadenas unidas de manera covalente o no covalente mediante enlaces peptfdicos, que tienen la secuencia de protemas nativas, es decir, protemas producidas por celulas que se producen de manera natural y espedficamente no recombinantes, o celulas modificadas por ingeniena genetica o recombinantes, y comprenden moleculas que tienen la secuencia de aminoacidos de la protema nativa, o moleculas que tienen deleciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o mas aminoacidos de la secuencia nativa. Los terminos “polipeptido” y “protema” abarcan espedficamente los anticuerpos que se unen a CD40 de la presente divulgacion, o secuencias que tienen deleciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o mas aminoacido de un anticuerpo anti-CD40. Por tanto, un “polipeptido” o una “protema” puede comprender una (denominado “un monomero”) o una pluralidad (denominado “un multfmero”) de cadenas de aminoacido.

El termino “protema aislada” al que se hace referencia en el presente documento significa que una protema objeto (1) esta libre de al menos algunas otras protemas con las que se encontrana normalmente en la naturaleza, (2) esta esencialmente libre de otras protemas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa una celula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de polinucleotidos, lfpidos, hidratos de carbono, u otros materiales con los que se asocia en la naturaleza, (5) no se asocia (mediante interaccion covalente o no covalente) con porciones de una protema con la que la “protema aislada” se asocia en la naturaleza, (6) se asocia operativamente (mediante interaccion covalente o no covalente) con un polipeptido con el que no se asocia en la naturaleza, o (7) no se produce en la naturaleza. Una protema aislada de este tipo puede codificarse por ADN, ADNc, ARNm u otro ARN genomico, de quizas origen sintetico, o cualquier combinacion de los mismos. En determinadas realizaciones, la protema aislada esta sustancialmente libre de protemas o polipeptidos u otros contaminantes que se encuentran en su medio natural que interferinan con su uso (terapeutico, diagnostico, profilactico, de investigacion u otro).

El termino “fragmento de polipeptido” se refiere a un polipeptido, que puede ser monomerico o multimerico, que tiene una delecion amino terminal, una delecion carboxilo terminal, y/o una delecion o sustitucion interna de un polipeptido que se produce de manera natural o producido de manera recombinante. En determinadas realizaciones, un fragmento de polipeptido puede comprender una cadena de aminoacidos de al menos 5 a aproximadamente 500 aminoacidos de longitud. Se apreciara que en determinadas realizaciones, los fragmentos son de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoacidos de longitud. Los fragmentos particularmente utiles de polipeptido incluyen dominios funcionales, incluyendo dominios de union a antigeno o fragmentos de anticuerpos. En el caso de un anticuerpo anti-CD40, los fragmentos utiles incluyen, pero no se limitan a: una region CDR, especialmente una region CDR3 de la cadena pesada o ligera; una region variable de una cadena pesada o ligera; una porcion de una cadena de anticuerpo o solo su region variable incluyendo dos CDR; y similares.

Los polipeptidos pueden comprender una secuencia senal (o ftder) en el extremo N-terminal de la protema, que dirige de manera cotraduccional o postraduccional la transferencia de la protema. Cualquier secuencia de polipeptido de aminoacidos proporcionada en el presente documento que incluye un peptido senal se contempla tambien para cualquier uso descrito en el presente documento sin un peptido senal o ftder. Tal como reconocena el experto, el peptido senal se escinde habitualmente durante el procesamiento y no esta incluido en la protema de anticuerpo activo. El polipeptido tambien puede fusionarse en marco o conjugarse con un ligador u otra secuencia para facilidad de smtesis, purificacion o identificacion del polipeptido (por ejemplo, poli-His), o para potenciar la union del polipeptido a un soporte solido.

Tambien puede emplearse una secuencia ligadora/espaciadora de peptidos para separar multiples componentes de polipeptido por una distancia suficiente para garantizar que cada polipeptido se repliega en sus estructuras secundarias y/o terciarias, si se desea. Puede incorporarse una secuencia ligadora de peptidos en un polipeptido de fusion usando tecnicas convencionales bien conocidas en la tecnica.

Determinadas secuencias espaciadoras de peptidos pueden escogerse, por ejemplo, basandose en: (1) su capacidad para adoptar una conformacion ampliada flexible; (2) su incapacidad de adoptar una estructura secundaria que podna interactuar con epftopos funcionales en los polipeptidos primero y segundo; y/o (3) la carencia de residuos hidrofobos o cargados que podnan reaccionar con los epftopos funcionales de polipeptido.

En una realizacion ilustrativa, las secuencias espaciadoras de peptidos contienen, por ejemplo, residuos de Gly, Asn y Ser. Tambien pueden incluir otros aminoacidos neutros proximos, tales como Thr y Ala, en la secuencia espaciadora.

Otras secuencias de aminoacidos que pueden emplearse de manera util como espaciadores incluyen las dadas a conocer en Maratea et al., Gene 40:39 46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986); patente estadounidense n.° 4.935.233 y la patente estadounidense n.° 4.751.180.

Otros espaciadores ilustrativos pueden incluir, por ejemplo, Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp (Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070) y Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp (Bird et al., 1988, Science 242:423-426).

En algunas realizaciones, no se requieren secuencias espaciadoras cuando los polipeptidos primero y segundo tienen regiones de aminoacido N-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y evitar interferencia esterica. Pueden fusionarse dos secuencias codificantes directamente sin ningun espaciador o usando un poliligador flexible que se compone, por ejemplo, del pentamero Gly-Gly-Gly-Gly-Ser repetido de 1 a 3 veces. Un espaciador de este tipo se ha usado en la construccion de anticuerpos de cadenas sencillas (scFv) mediante insercion entre VH y VL (Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5979-5883).

Un espaciador pepftdico, en determinadas realizaciones, esta disenado para permitir la correcta interaccion entre dos laminas beta que forman la region variable del anticuerpo de cadenas sencillas.

En determinadas realizaciones ilustrativas, un espaciador pepftdico esta entre 1 y 5 aminoacidos, entre 5 y 10 aminoacidos, entre 5 y 25 aminoacidos, entre 5 y 50 aminoacidos, entre 10 y 25 aminoacidos, entre 10 y 50 aminoacidos, entre 10 y 100 aminoacidos, o cualquier intervalo intermedio de aminoacidos.

En otras realizaciones ilustrativas, un espaciador peptfdico comprende de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas aminoacidos de longitud.

Se contempla(n) modificacion/modificaciones de la secuencia de aminoacidos de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del anticuerpo. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de la secuencia de aminoacidos de un anticuerpo introduciendo cambios de nucleotido apropiados en un polinucleotido que codifica para el anticuerpo, o una cadena de los mismos, o mediante smtesis de peptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoacidos del anticuerpo. Cualquier combinacion de delecion, insercion y sustitucion puede realizarse para llegar al anticuerpo final, siempre que el constructo final presente las caractensticas deseadas (por ejemplo, union de alta afinidad a CD40). Los cambios de aminoacido tambien pueden alterar procesos postraduccionales del anticuerpo, tal como cambiando el numero o la posicion de sitios de glicosilacion. Cualquiera de las variaciones y modificaciones descritas anteriormente para los polipeptidos de la presente invencion pueden incluirse en anticuerpos de la presente invencion.

La presente divulgacion proporciona variantes de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento. En determinadas realizaciones, tales anticuerpos variantes o fragmentos de union a antigeno, o CDR de los mismos, se unen a CD40 al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 70%, y en determinadas realizaciones, al menos aproximadamente el 90% asf como una secuencia de anticuerpo espedficamente expuesta en el presente documento. En realizaciones adicionales, tales anticuerpos variantes o fragmentos de union a antfgeno, o CDR de los mismos, se unen a CD40 con mayor afinidad que los anticuerpos expuestos en el presente documento, por ejemplo, que se unen de manera cuantitativa al menos aproximadamente el 105%, el 106%, el 107%, el 108%, el 109%, o el 110% asf como una secuencia de anticuerpo espedficamente expuesta en el presente documento.

En realizaciones particulares, un anticuerpo objeto puede tener: a) una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos el 80% identica, al menos el 95% identica, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 98% o el 99% identica, a la region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento; y b) una region variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos el 80% identica, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 98% o el 99% identica, a la region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento. La secuencia de aminoacidos de regiones de cadena pesada y ligera ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 1-56.

En realizaciones particulares, el anticuerpo puede comprender: a) una region variable de cadena pesada que comprende: i. una region CDR1 que es identica en secuencia de aminoacidos a la region CDR1 de cadena pesada de un anticuerpo seleccionado descrito en el presente documento; ii. una region CDR2 que es identica en secuencia de aminoacidos a la region CDR2 de cadena pesada del anticuerpo seleccionado; y iii. una region CDR3 que es identica en secuencia de aminoacidos a la region de cadena pesada CDR3 del anticuerpo seleccionado; y b) un dominio variable de cadena ligera que comprende: i. una region CDR1 que es identica en secuencia de aminoacidos a la region CDR1 de cadena ligera del anticuerpo seleccionado; ii. una region CDR2 que es identica en secuencia de aminoacidos a la region CDR2 de cadena ligera del anticuerpo seleccionado; y iii. una region CDR3 que es identica en secuencia de aminoacidos a la region CDR3 de cadena ligera del anticuerpo seleccionado; en el que el anticuerpo se une espedficamente a una diana seleccionada (por ejemplo, CD40). En una realizacion adicional, el anticuerpo, o fragmento de union a antfgeno del mismo, es un anticuerpo variante en el que la variante comprende una cadena pesada y ligera identica al anticuerpo seleccionado excepto por hasta 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o mas sustituciones de aminoacido en las regiones de CDR de las regiones VH y VL. En este aspecto, puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o en determinadas realizaciones, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 mas sustituciones de aminoacido en las regiones de CDR del anticuerpo seleccionado. Las sustituciones pueden ser en CDR o bien en las regiones VH y/o bien VL. (Vease, por ejemplo, Muller, 1998, Structure 6:1153-1167).

La determinacion de las estructuras tridimensionales de polipeptidos representativos (por ejemplo, anticuerpos espedficos de CD40 variantes tal como se proporciona en el presente documento, por ejemplo, una protema de anticuerpo que tiene un fragmento de union a antfgeno tal como se proporciona en el presente documento) puede realizarse mediante metodologfas de rutina tales como sustitucion, adicion, delecion o insercion de uno o mas aminoacidos con aminoacidos naturales o no naturales seleccionados puede modelarse practicamente con fines de determinar si una variante estructural derivada retiene las propiedades de llenado del espacio de las especies dadas a conocer por la presente. Vease, por ejemplo, Donate et al., 1994 Prot. Sci. 3:2378; Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005); Dietz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1244 (2006); Dodson et al., Nature 450:176 (2007); Qian et al., Nature 450:259 (2007); Raman et al. Science 327:1014 1018 (2010). Algunos ejemplos adicionales no limitativos de algoritmos informaticos que pueden usarse para estas y realizaciones relacionadas, tales como para diseno racional de anticuerpos espedficos de CD40, dominios de union a antfgeno de los mismos tal como se proporciona en el presente documento, incluyen VMD que es un programa de visualizacion molecular para presentar, animar y analizar grandes sistemas biomoleculares usando graficos en 3-D y encriptacion incorporada (vease la pagina web para el Theoretical and Computational Biophysics Group, Universidad de Illinois en Urbana-Champagne, en ks.uiuc.edu/Research/vmd/. Se conocen muchos otros programas informaticos en la tecnica y estan disponibles para el experto, y que permiten determinar dimensiones atomicas a partir de modelos de relleno de espacios (radios de van der Waals) de conformaciones de energfa minimizada; GRID, que busca determinar regiones de alta afinidad para diferentes grupos qmmicos, potenciando de ese modo la union, busquedas de Monte Carlo, que calculan el alineamiento matematico, y CHARMm (Brooks et al. (1983) J. Comput. Chem. 4:187-217) y AMBER (Weiner et al (1981) J. Comput. Chem. 106: 765), que valora los calculos de campo de fuerza, y analisis (vease tambien, Eisenfield et al. (1991) Am. J. Physiol. 261:C376-386; Lybrand (1991) J. Pharm. Belg. 46:49-54; Froimowitz (1990) Biotechniques 8:640-644; Burbam et al. (1990) Proteins 7:99-111; Pedersen (1985) Environ. Health Perspect. 61:185-190; y Kini et al. (1991) J. Biomol. Struct. Dyn. 9:475-488). Una variedad de programas informaticos computacionales apropiados tambien estan comercialmente disponibles, tal como de Schrodinger (Munich, Alemania).

En otra realizacion de invencion, los anticuerpos anti-CD40 y versiones humanizadas de los mismos se derivan de anticuerpos monoclonales de conejo, y en particular se generan usando tecnologfa RabMAb®. Estos anticuerpos son ventajosos puesto que requieren mmimas modificaciones de secuencia, facilitando de ese modo la retencion de propiedades funcionales tras la humanizacion usando tecnolog^a de humanizacion guiada por linaje mutacional (MLG) (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.462.697). Por tanto, los metodos ilustrativos para elaborar los anticuerpos anti-CD4o de la presente divulgacion incluyen la tecnologfa de anticuerpo monoclonal de conejo RabMab® descrita, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5.675.063 y 7.429.487. En este aspecto, en determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 de la divulgacion se producen en conejos. En realizaciones particulares, se usa un linfocito B inmortal derivado de conejo que puede fusionarse con un esplenocito de conejo para producir una celula hubrida que produce un anticuerpo. El linfocito B inmortal no expresa de manera detectable cadena pesada de inmunoglobulina endogena y puede contener, en determinadas realizaciones, un gen que codifica para la cadena pesada de inmunoglobulina alterado.

Composiciones y metodos de uso

La presente divulgacion proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos espedficos de CD40, fragmentos de union a antfgeno de los mismos y administracion de tal composicion en una variedad de entornos terapeuticos.

La administracion de los anticuerpos espedficos de CD40 descrita en el presente documento, en forma pura o en una composicion farmaceutica apropiada, puede llevarse a cabo por medio de cualquiera de los modos aceptados de administracion de agentes para servir utilidades similares. Las composiciones farmaceuticas pueden prepararse combinando un anticuerpo o composicion que contiene anticuerpo con un portador, diluyente o excipiente fisiologicamente aceptable apropiado, y puede formularse en preparaciones en formas solidas, semisolidas, lfquidas o gaseosas, tales como comprimidos, capsulas, polvos, granulos, pomadas, disoluciones, supositorios, inyecciones, inhalatorios, geles, microesferas y aerosoles. Ademas, otros principios farmaceuticamente activos (incluyendo otros agentes anticancerosos tal como se describe en cualquier otra parte en el presente documento) y/o excipientes adecuados tales como sales, tampones y estabilizadores pueden, pero no necesariamente, estar presentes dentro de la composicion. La administracion puede lograrse mediante una variedad de diferentes vfas, incluyendo oral, parenteral, nasal, intravenosa, intradermica, subcutanea o topica. Los modos preferidos de administracion dependen de la naturaleza del estado que va a tratarse o prevenirse. Una cantidad que, tras la administracion, reduce, inhibe, previene o retrasa el avance y/o metastasis de un cancer se considera eficaz.

En determinadas realizaciones, la cantidad administrada es suficiente para dar como resultado remision tumoral, tal como se indica mediante una disminucion estadfsticamente significativa en la cantidad de tumor viable, por ejemplo, al menos un 50% de disminucion en la masa tumoral, o mediante dimensiones de barrido alteradas (por ejemplo, disminuidas con significacion estadfstica). En otras realizaciones, la cantidad administrada es suficiente para dar como resultado una reduccion clmicamente relevante de los smtomas de un indicio de enfermedad particular conocido para el medico experto.

La dosificacion y duracion de tratamiento precisas es una funcion de la enfermedad que esta tratandose y puede determinarse empmcamente usando protocolos de pruebas conocidos o sometiendo a prueba las composiciones en sistemas de modelo conocidos en la tecnica y extrapolarlos de aid. Tambien pueden realizarse ensayos clmicos controlados. Las dosificaciones tambien pueden variar con la gravedad del estado que va a aliviarse. Una composicion farmaceutica se formula generalmente y se administra para ejercer un efecto terapeuticamente util mientras se minimizan efectos secundarios no deseables. La composicion puede administrarse una vez, o puede dividirse en un numero de dosis mas pequenas que van a administrarse a intervalos de tiempo. Para cualquier sujeto particular, pueden ajustarse pautas posologicas espedficas a lo largo del tiempo segun la necesidad individual. Las composiciones que contienen anticuerpo espedfico de CD40 pueden administrarse solas o en combinacion con otros tratamientos contra el cancer conocidos, tales como radioterapia, quimioterapia, trasplante, inmunoterapia, terapia hormonal, terapia fotodinamica, etc. Las composiciones tambien pueden administrarse en combinacion con antibioticos.

Por tanto, las vfas tfpicas de administracion de estas y composiciones farmaceuticas relacionadas incluyen, sin limitacion, oral, topica, transdermica, inhalacion, parenteral, sublingual, bucal, rectal, vaginal e intranasal. El termino parenteral tal como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutaneas, inyeccion intravenosa, intramuscular, intraesternal o tecnicas de infusion. Composiciones farmaceuticas segun determinadas realizaciones de la presente invencion se formulan para permitir que los principios activos contenidos en las mismas esten biodisponibles tras administracion de la composicion a un paciente. Las composiciones que se administraran a un sujeto o paciente pueden tomar la forma de una o mas unidades de dosificacion, donde por ejemplo, un comprimido puede ser una unidad de dosificacion individual, y un recipiente de un anticuerpo espedfico de CD40 descrito en el presente documento en forma de aerosol puede mantener una pluralidad de unidades de dosificacion. Los metodos reales de preparacion de tales formas de dosificacion los conocen, o seran evidentes, para los expertos en esta tecnica; por ejemplo, vease Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edicion (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). La composicion que va a administrarse contendra, en cualquier caso, una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo de la presente divulgacion, para el tratamiento de una enfermedad o estado de interes segun las ensenanzas en el presente documento.

Una composicion farmaceutica puede estar en forma de un solido o Kquido. En una realizacion, el/los portador(es) esta(n) particulado(s), de modo que las composiciones estan, por ejemplo, en forma de comprimido o polvo. El/los portador(es) puede(n) ser lfquido(s), siendo las composiciones, por ejemplo, un aceite oral, lfquido inyectable o un aerosol, que es util en, por ejemplo, la administracion inhaladora. Cuando se pretende para administracion oral, la composicion farmaceutica esta preferiblemente o bien en forma solida o bien lfquida, donde se incluyen formas semisolidas, semilfquidas, de suspension y gel dentro de las formas consideradas en el presente documento como o bien solidas o bien lfquidas.

Como composicion solida para administracion oral, la composicion farmaceutica puede formularse en un polvo, granulo, comprimido, pfldora, capsula, chicle, oblea o similares. Una composicion solida de este tipo contendra normalmente uno o mas diluyentes inertes o portadores comestibles. Ademas, pueden estar presentes uno o mas de los siguientes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; excipientes tales como almidon, lactosa o dextrinas, agentes disgregantes tales como acido algmico, alginato de sodio, Primogel, almidon de mafz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; deslizantes tales como dioxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; un agente saborizante tal como menta piperita, salicilato de metilo o sabor a naranja; y un agente colorante. Cuando la composicion farmaceutica esta en forma de una capsula, por ejemplo, una capsula de gelatina, puede contener, ademas de los materiales del tipo anterior, un portador lfquido tal como polietilenglicol o aceite.

La composicion farmaceutica puede estar en forma de un lfquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, disolucion, emulsion o suspension. El lfquido puede ser para administracion oral o para administracion mediante inyeccion, como dos ejemplos. Cuando se pretende para administracion oral, la composicion preferida contiene, ademas de los compuestos presentes, uno o mas de un agente edulcorante, conservantes, tinte/colorante y potenciador del sabor. En una composicion destinada a administrarse mediante inyeccion, pueden incluirse uno o mas de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente de dispersion, agente de suspension, tampon, estabilizador y agente isotonico.

Las composiciones farmaceuticas lfquidas, ya sean disoluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir uno o mas de los siguientes adyuvantes: diluyentes esteriles tales como agua para inyeccion, disolucion salina, preferiblemente solucion salina fisiologica, disolucion de Ringer, cloruro de sodio isotonico, aceites fijos tales como mono o digliceridos sinteticos que pueden servir como medio de disolvente o suspension, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bendlico o metilparabeno; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como acido etilendiaminotetraacetico; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. La preparacion parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o multiples viales de dosis hechos de vidrio o plastico. La solucion salina fisiologica es un adyuvante preferido. Una composicion farmaceutica inyectable es preferiblemente esteril.

Una composicion farmaceutica lfquida destinada para o bien administracion parenteral o bien oral debe contener una cantidad de un anticuerpo espedfico de CD40 como se da a conocer en el presente documento de modo que se obtendra una dosificacion adecuada. Normalmente, esta cantidad es al menos el 0,01% del anticuerpo en la composicion. Cuando se destina para administracion oral, esta cantidad puede variarse para ser de entre el 0,1 y aproximadamente el 70% del peso de la composicion. Determinadas composiciones farmaceuticas orales contienen entre aproximadamente el 4% y aproximadamente el 75% del anticuerpo. En determinadas realizaciones, se preparan composiciones farmaceuticas y preparaciones segun la presente invencion de modo que una unidad de dosificacion parenteral contiene entre el 0,0l y el 10% en peso del anticuerpo antes de dilucion.

La composicion farmaceutica puede destinarse para administracion topica, en cuyo caso el portador puede comprender adecuadamente una disolucion, emulsion, pomada o base de gel. La base, por ejemplo, puede comprender uno o mas de los siguientes: petrolato, lanolina, polietilenglicoles, cera de abeja, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol, y emulsionantes y estabilizadores. Pueden estar presentes agentes espesantes en una composicion farmaceutica para administracion topica. Si se destina para administracion transdermica, la composicion puede incluir un parche transdermico o dispositivo de iontoforesis. La composicion farmaceutica puede destinarse para administracion rectal, en forma, por ejemplo, de un supositorio, que se fundira en el recto y liberara el farmaco. La composicion para administracion rectal puede contener una base oleaginosa como excipiente no irritante adecuado. Tales bases incluyen, sin limitacion, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol.

La composicion farmaceutica puede incluir diversos materiales, que modifican la forma ffsica de una unidad de dosificacion solida o lfquida. Por ejemplo, la composicion puede incluir materiales que forman una vaina de recubrimiento alrededor de los principios activos. Los materiales que forman la vaina de recubrimiento son normalmente inertes, y pueden seleccionarse de, por ejemplo, azucar, goma laca, y otros agentes de recubrimiento enterico. Alternativamente, los principios activos pueden atraparse en una capsula de gelatina. La composicion farmaceutica en forma solida o lfquida puede incluir un agente que se une al anticuerpo de la invencion y de ese modo, ayuda en la administracion del compuesto. Los agentes adecuados que pueden actuar en esta capacidad incluyen otros anticuerpos monoclonales o policlonales, una o mas proternas o un liposoma. La composicion farmaceutica puede consistir esencialmente en unidades de dosificacion que pueden administrate como aerosol. El termino aerosol se usa para denotar una variedad de sistemas que vanan entre aquellos de naturaleza y sistemas que consisten en paquetes presurizados. La administracion puede ser mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bomba adecuado que dispensa los principios activos. Los aerosoles pueden administrarse en sistemas de una fase, bifasicos o trifasicos con el fin de administrar el/los principio(s) activo(s). La administracion del aerosol incluye el recipiente, activadores, valvulas, subrrecipientes y similares necesarios, que juntos pueden formar un kit. Un experto habitual en la tecnica, sin experimentacion indebida, puede determinar aerosoles preferidos.

Las composiciones farmaceuticas pueden prepararse mediante metodologfa bien conocida en la tecnica farmaceutica. Por ejemplo, una composicion farmaceutica destinada a administrarse por inyeccion puede preparase combinando una composicion que comprende un anticuerpo espedfico de CD40 tal como se describe en el presente documento y opcionalmente, una o mas de sales, tampones y/o estabilizadores, con agua destilada, esteril para formar una disolucion. Puede anadirse un tensioactivo para facilitar la formacion de una disolucion o suspension homogenea. Los tensioactivos son compuestos que interaction de manera no covalente con la composicion de anticuerpo para facilitar la disolucion o suspension homogenea del anticuerpo en el sistema de administracion acuoso.

Las composiciones pueden administrarse en una cantidad terapeuticamente eficaz, que variara segun una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto espedfico (por ejemplo, anticuerpo espedfico de CD40) empleado; la estabilidad metabolica y la duracion de accion del compuesto; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el tiempo de administracion; la tasa de excrecion; la combinacion de farmaco; la gravedad del trastorno o estado particular; y que el sujeto se someta a terapia. Generalmente, una dosis diaria terapeuticamente eficaz es (para un mamffero de 70 kg) de desde aproximadamente 0,001 mg/kg (es decir, 0,07 mg) hasta aproximadamente 100 mg/kg (es decir, 7,0 g); preferiblemente una dosis terapeuticamente eficaz es (para un marnffero de 70 kg) de desde aproximadamente 0,01 mg/kg (es decir, 0,7 mg) hasta aproximadamente 50 mg/kg (es decir, 3,5 g); mas preferiblemente una dosis terapeuticamente eficaz es (para un marnffero de 70 kg) de desde aproximadamente 1 mg/kg (es decir, 70 mg) hasta aproximadamente 25 mg/kg (es decir, 1,75 g).

Las composiciones que comprenden los anticuerpos espedficos de CD40 de la presente divulgacion tambien pueden administrarse simultaneamente con, antes de, o tras la administracion de uno o mas de otros agentes terapeuticos. Tal terapia de combinacion puede incluir administracion de una formulacion de dosificacion farmaceutica individual que contiene un compuesto de la invencion y uno o mas agentes activos adicionales, asf como la administracion de composiciones que comprenden anticuerpos de la invencion y cada agente activo en su propia formulacion de dosificacion farmaceutica separada. Por ejemplo, un anticuerpo tal como se describe en el presente documento y el otro agente activo pueden administrarse al paciente juntos en una composicion de dosificacion oral individual tal como un comprimido o capsula, o administrarse cada agente en formulaciones de dosificacion oral separadas. De manera similar, un anticuerpo tal como se describe en el presente documento y el otro agente activo pueden administrarse al paciente juntos en una composicion de dosificacion parenteral individual tal como en una disolucion salina u otra disolucion fisiologicamente aceptable, o administrarse cada agente en formulaciones de dosificacion parenteral separadas. Cuando se usan formulaciones de dosificacion separadas, las composiciones que comprenden anticuerpos y uno o mas agentes activos adicionales pueden administrarse esencialmente al mismo tiempo, es decir, simultaneamente, o en tiempos escalonados por separado, es decir, secuencialmente y en cualquier orden; se entiende que la terapia de combinacion incluye todos estos regfmenes.

Por tanto, en determinadas realizaciones, tambien se contempla la administracion de composiciones de anticuerpo anti-CD40 de esta divulgacion en combinacion con uno o mas de otros agentes terapeuticos. Tales agentes terapeuticos pueden aceptarse en la tecnica como tratamiento convencional para un estado patologi

como se describe en el presente documento, tal como artritis reumatoide, inflamacion o cancer. Los agentes terapeuticos a modo de ejemplo contemplados incluyen citocinas, factores de crecimiento, esteroides, AINE, DMARD, antiinflamatorios, quimioterapicos, radioterapicos, u otros agentes activos y auxiliares.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 dados a conocer en el presente documento pueden administrarse junto con cualquier numero de agentes quimioterapicos. Los ejemplos de agentes quimioterapicos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrogeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibioticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, authramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti metabolites tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos de acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de acido folico tal como acido frolmico; aceglatona; aldofosfamida glicosido; acido aminolevulmico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; acido podofilmico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK.RTM.; razoxana; sizofirano; espirogermanio; acido tenuazonico; triaziquona; 2, 2',2”-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; analogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-l6); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados de acido retinoico tales como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™ (alitretinoma); ONTAK™ (denileukin diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmaceuticamente aceptables. Tambien se incluyen en esta definicion agentes anti-hormonales que actuan para regular o inhibir la accion hormonal en tumores tales como anti-estrogenos incluyendo por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inhiben aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y anti-androgenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolido, y goserelina; y sales, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmaceuticamente aceptables.

Puede usarse una variedad de otros agentes terapeuticos junto con los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento. En una realizacion, el anticuerpo se administra con un agente antiinflamatorio. Los agentes antiinflamatorios o farmacos incluyen, pero no se limitan a, esteroides y glucocorticoides (incluyendo betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) incluyendo aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicaciones anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato.

Los AINE a modo de ejemplo se escogen del grupo que consiste en ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sodico, inhibidores de la Cox-2 tales como VIOXX® (rofecoxib) y CELEBREX® (celecoxib), y sialilatos. Los analgesicos a modo de ejemplo se escogen del grupo que consiste en acetaminofeno, oxicodona, tramadol de clorhidrato de proporxifeno. Se escogen glucocorticoides a modo de ejemplo del grupo que consiste en cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los modificadores de la respuesta biologica a modo de ejemplo incluyen moleculas dirigidas contra marcadores de la superficie celular (por ejemplo, CD4, CD5, etc.), inhibidores de citocina, tales como los antagonistas de TNF (por ejemplo, etanorcept (ENBREL®), adalimumab (HUMIRA®) e infliximab (REMICADE®)), inhibidores de la quimiocina e inhibidores de molecula de adhesion. Los modificadores de la respuesta biologica incluyen anticuerpos monoclonales asf como formas recombinantes de moleculas. Los DMARD a modo de ejemplo incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, oro (oral (auranofina) e intramuscular) y minociclina.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento se administran junto con una citocina. Por “citocina” tal como se usa en el presente documento se pretende un termino generico para protemas liberadas por una poblacion celular que actua en otra celula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas de polipeptido tradicionales. Se incluyen entre las citocinas hormonas de crecimiento tales como hormona del crecimiento humano, hormona del crecimiento humano de N-metionilo y hormona del crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glicoprotemas tales como hormona de estimulacion folicular (FSH), hormona de estimulacion tiroidea (TSH), y hormona leutinizante (LH); factor de crecimiento hepatico; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactogeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia de inhibicion mulleriana; peptido asociado con gonadotropina de raton; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGF), tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferon alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF) tales como macrofagos-CSF (M-CSF); granulocito-macrofago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptfdicos incluyendo LIF y ligando kit (KL). Tal como se usa en el presente documento, el termino citocina incluye protemas de fuentes naturales o de cultivos de celulas recombinantes y equivalentes biologicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

Las composiciones que comprenden los anticuerpos espedficos de CD40 descritos en el presente documento pueden administrarse a un individuo afectado por una enfermedad tal como se describe en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfodticas cronicas, leucemias de tricoleucocitos, leucemias linfoblasticas agudas, mieloma multiple, carcinomas del pancreas, colon, gastrico, intestino, prostata, vejiga, rinon, ovario, cuello uterino, mama, pulmon, nasofaringe, melanoma y leucemias y LNH resistentes a rituximab, enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reactiva), lupus eritematoso sistemico (SLE), psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), encefalomielitis, uveftis, miastenia grave, esclerosis multiple, diabetes dependiente de insulina, enfermedad de Addison, celiaqma, smdrome de fatiga cronica, hepatitis autoinmunitaria, alopecia autoinmunitaria, espondilitis anquilosante, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, fibromialgia, penfigo vulgar, smdrome de Sjogren, enfermedad de Kawasaki, hipertiroidismo/enfermedad de Graves, hipotiroidismo/enfermedad de Hashimoto, endometriosis, escleroderma, anemia perniciosa, smdrome de Goodpasture, smdrome de Guillain-Barre, enfermedad de Wegener, glomerulonefritis, anemia aplasica (incluyendo pacientes con anemia aplasica con transfusion multiple), hemoglobinuria paroxfstica nocturna, smdrome mielodisplasico, purpura trombocitopenica idiopatica, anemia hemolftica autoinmunitaria, smdrome de Evan, smdrome de inhibidor del factor VIII, vasculitis sistemica, dermatomiositis, polimiositis y fiebre reumatica, smdrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS), penfigoide ampolloso autoinmunitario, enfermedad de Parkinson, sarcoidosis, vitiligo, cirrosis biliar primaria y miocarditis autoinmunitaria.

Las enfermedades inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Crohn, colitis, dermatitis, psoriasis, diverticulitis, hepatitis, smdrome de intestino irritable (IBS), lupus eritematoso, nefritis, enfermedad de Parkinson, colitis ulcerosa, esclerosis multiple (EM), enfermedad de Alzheimer, artritis, artritis reumatoide, asma y diversas enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis y vasculitis. En determinadas realizaciones, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, diabetes, gota, smdrome periodico asociado con criopirina y trastorno pulmonar obstructivo cronico. En este aspecto, una realizacion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antigeno del mismo tal como se describe en el presente documento para su uso en un metodo para tratar, reducir la gravedad de o prevenir la inflamacion o una enfermedad inflamatoria administrando a un paciente que lo necesita una cantidad terapeuticamente eficaz de composiciones dadas a conocer en el presente documento que comprenden anticuerpos anti-CD40.

Para el uso in vivo para el tratamiento de una enfermedad humana, los anticuerpos descritos en el presente documento se incorporan generalmente en una composicion farmaceutica antes de la administracion. Una composicion farmaceutica comprende uno o mas de los anticuerpos descritos en el presente documento en combinacion con un portador o excipiente fisiologicamente aceptable tal como se describe en cualquier otra parte en el presente documento. Para preparar una composicion farmaceutica, se mezcla una cantidad eficaz de uno o mas de los compuestos con cualquier portador o excipiente farmaceutico conocido para los expertos en la tecnica que es adecuado para el modo particular de administracion. Un portador farmaceutico puede ser lfquido, semisolido o solido. Las disoluciones o suspensiones usadas para aplicacion parenteral, intradermica, subcutanea o topica pueden incluir, por ejemplo, un diluyente esteril (tal como agua), disolucion salina, aceite fijo, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol u otro disolvente sintetico; agentes antimicrobianos (tales como alcohol bendlico y metilparabenos); antioxidantes (tal como acido ascorbico y bisulfito de sodio) y agentes quelantes (tales como acido etilendiaminotetraacetico (EDTA)); tampones (tal como acetatos, citratos y fosfatos). Si se administran por via intravenosa, los portadores adecuados incluyen solucion salina fisiologica o solucion salina tamponada con fosfato (PBS), y disoluciones que contiene agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol, polipropilenglicol y mezclas de los mismos.

Las composiciones que comprenden anticuerpos espedficos de CD40 tal como se describe en el presente documento, pueden prepararse con portadores que protegen al anticuerpo contra la eliminacion rapida del cuerpo, tales como formulaciones o recubrimientos de liberacion prolongada. Tales portadores incluyen formulaciones de liberacion controlada, tales como, pero no limitados a, implantes y sistemas de administracion microencapsulados, y polfmeros biocompatibles y biodegradables, tales como acetato de etileno-vinilo, polianhtidridos, acido poliglicolico, PEG, poliortoesteres, acido polilactico y otros conocidos por los expertos en la tecnica.

Se proporcionan en el presente documento composiciones que comprenden un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antigeno del mismo tal como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de tratamiento usando los anticuerpos que se unen a CD40. En una realizacion, un anticuerpo de la presente invencion se administra a un paciente que tiene una enfermedad que implica expresion inapropiada de CD40, que se pretende en el contexto de la presente divulgacion que incluya enfermedades y trastornos caracterizados por expresion o actividad de CD40 aberrante, debido por ejemplo, a alteraciones (por ejemplo, aumentos o disminuciones estadfsticamente significativos) en la cantidad de una protema presente, o la presencia de una protema mutante, o ambas. Una abundancia en exceso puede deberse a cualquier causa, incluyendo pero sin limitarse a sobreexpresion al nivel molecular, aparicion prolongada o acumulada en el sitio de accion, o actividad aumentada (por ejemplo, de manera estadfsticamente significativa) de CD40 en relacion con la que es normalmente detectable. Una abundancia en exceso de este tipo de CD40 puede medirse en relacion con los acontecimientos de senalizacion expresion normal, aparicion o actividad de CD40 normales, y dicha medicion puede desempenar un papel importante en el desarrollo y/o pruebas clmicas de los anticuerpos descritos en el presente documento.

Los presentes anticuerpos son utiles para el tratamiento de una variedad de canceres. En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento ejercen actividad antitumoral activando respuestas inmunitarias antitumorales. En determinadas realizaciones, los presentes anticuerpos son utiles para el tratamiento de una variedad de canceres asociados con la expresion aberrante de CD40. En una realizacion de la invencion se proporciona una composicion que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antigeno del mismo tal como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de tratamiento de un cancer que incluye, pero no se limita a, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocfticas cronicas, leucemias de tricoleucocitos, leucemias linfoblasticas agudas, mieloma multiple, carcinomas del pancreas, colon, gastrico, intestino, prostata, vejiga, rinon, ovario, cuello uterino, mama, pulmon, nasofaringe, melanoma y leucemias y LNH resistentes a rituximab, administrando a un paciente con cancer una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo espedfico de CD40 dado a conocer en el presente documento. Una cantidad que, tras la administracion, inhibe, previene o retarda el avance y/o metastasis de un cancer de manera estadfsticamente significativa (es decir, en relacion con un control apropiado tal como conoceran los expertos en la tecnica) se considera eficaz.

Otra realizacion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antigeno del mismo tal como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de prevencion de metastasis de un cancer que incluye, pero no se limita a, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocfticas cronicas, leucemias de tricoleucocitos, leucemias linfoblasticas agudas, mieloma multiple, carcinomas del pancreas, colon, gastrico, intestino, prostata, vejiga, rinon, ovario, cuello uterino, mama, pulmon, nasofaringe, melanoma y leucemias y LNH resistentes a rituximab, administrando a un paciente con cancer una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo espedfico de CD40 dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, una cantidad que, tras la administracion, inhibe, previene o retarda metastasis de un cancer de manera estadfsticamente significativa, es decir, en relacion con un control apropiado tal como conoceran los expertos en la tecnica).

Otra realizacion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antigeno del mismo tal como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de prevencion de un cancer que incluye, pero no se limita a, linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocfticas cronicas, leucemias de tricoleucocitos, leucemias linfoblasticas agudas, mieloma multiple, carcinomas del pancreas, colon, gastrico, intestino, prostata, vejiga, rinon, ovario, cuello uterino, mama, pulmon, nasofaringe, melanoma y leucemias y LNH resistentes a rituximab, administrando a un paciente con cancer una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo espedfico de CD40 dado a conocer en el presente documento.

Otra realizacion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antigeno del mismo tal como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de tratamiento, mejora de los smtomas de, inhibicion del avance de o prevencion de linfomas no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocfticas cronicas, leucemias de tricoleucocitos, leucemias linfoblasticas agudas, mieloma multiple, carcinomas del pancreas, colon, gastrico, intestino, prostata, vejiga, rinon, ovario, cuello uterino, mama, pulmon, nasofaringe, melanoma y leucemias y LNH resistentes a rituximab administrando a un paciente que padece una o mas de estas enfermedades una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo espedfico de CD40 dado a conocer en el presente documento.

Otra realizacion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antigeno del mismo tal como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de tratamiento, mejora de los smtomas de, inhibicion del avance de o prevencion de una enfermedad autoinmunitaria administrando a un paciente que padece una o mas de estas enfermedades una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 dado a conocer en el presente documento. En este aspecto, las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reactiva), lupus eritematoso sistemico (SLE), psoriasis y enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), encefalomielitis, uveftis, miastenia grave, esclerosis multiple, diabetes dependiente de insulina, enfermedad de Addison, celiaqrna, smdrome de fatiga cronica, hepatitis autoinmunitaria, alopecia autoinmunitaria, espondilitis anquilosante, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, fibromialgia, penfigo vulgar, smdrome de Sjogren, enfermedad de Kawasaki, hipertiroidismo/enfermedad de Graves, hipotiroidismo/enfermedad de Hashimoto, endometriosis, escleroderma, anemia perniciosa, smdrome de Goodpasture, smdrome de Guillain-Barre, enfermedad de Wegener, glomerulonefritis, anemia aplasica (incluyendo pacientes con anemia aplasica con transfusion multiple), hemoglobinuria paroxfstica nocturna, smdrome mielodisplasico, purpura trombocitopenica idiopatica, anemia hemolftica autoinmunitaria, smdrome de Evan, smdrome de inhibidor del factor VIII, vasculitis sistemica, dermatomiositis, polimiositis y fiebre reumatica, smdrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS), penfigoide ampolloso autoinmunitario, enfermedad de Parkinson, sarcoidosis, vitiligo, cirrosis biliar primaria y miocarditis autoinmunitaria.

Otra realizacion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo anti-CD40 o fragmento de union a antigeno del mismo tal como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de tratamiento, mejora de los smtomas de, inhibicion del avance de o prevencion de una enfermedad inflamatoria administrando a un paciente que padece una o mas de estas enfermedades una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD40 dado a conocer en el presente documento. Las enfermedades inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Crohn, colitis, dermatitis, psoriasis, diverticulitis, hepatitis, smdrome de intestino irritable (IBS), lupus eritematoso, nefritis, enfermedad de Parkinson, colitis ulcerosa, esclerosis multiple (EM), enfermedad de Alzheimer, artritis, artritis reumatoide, asma, y diversas enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis y vasculitis. En determinadas realizaciones, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, diabetes, gota, smdrome periodico asociado con criopirina y trastorno pulmonar obstructivo cronico. En otra realizacion, se usan anticuerpos anti-CD40 de la presente invencion para determinar la estructura de antigeno unido, por ejemplo, epftopos conformacionales, cuya estructura puede entonces usarse para desarrollar compuestos que tienen o que imitan esta estructura, por ejemplo, a traves de metodo de modelado qmmico y SAR. Otras diversas realizaciones de la presente invencion se refieren, en parte, a aplicaciones de diagnostico para detectar la presencia de celulas o tejidos que expresan CD40. Por tanto, la presente divulgacion proporciona metodos de detectar CD40 en una muestra, tal como deteccion de celulas o tejidos que expresan CD40. Tales metodos pueden aplicarse en una variedad de formatos de deteccion conocidos, incluyendo, pero sin limitarse a inmunohistoqmmica (IHC), inmunocitoqmmica (ICC), hibridacion in situ (ISH), hibridacion de montaje completo in situ (WISH), hibridacion de ADN fluorescente in situ (FISH), citometna de flujo, inmunoensayo de enzimas (EIA) e inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA).

ISH es un tipo de hibridacion que usa una hebra de ADN o ARN complementaria marcada (es decir, agente de union primario) para localizar una secuencia de ADN o ARN espedfica en una porcion o seccion de una celula o tejido (in situ), o si el tejido es lo suficientemente pequeno, todo el tejido (ISH de montaje completo). Un experto en la tecnica apreciana que esto es distinto de inmunohistoqmmica, que localiza protemas en secciones tisulares usando un anticuerpo como agente de union primario. Puede usarse ISH de ADN en ADN genomico para determinar la estructura de cromosomas. Puede usarse ISH de ADN fluorescente (FISH), por ejemplo, en diagnostico medico para evaluar la integridad cromosomica. Se usa ISH de ARN (histoqmmica de hibridacion) para medir y localizar ARNm y otros transcritos dentro de secciones tisulares o montajes completos.

En diversas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento se conjugan con un marcador detectable que puede detectarse directa o indirectamente. En este aspecto, un “conjugado” de anticuerpo se refiere a un anticuerpo anti-CD40 que se une de manera covalente a un marcador detectable. En la presente invencion, sondas de ADN, sondas de ARN, anticuerpos monoclonales, fragmentos de union a antfgeno de los mismos, y derivados de anticuerpo de los mismos, tal como un anticuerpo de fragmento variable de cadenas sencillas o un anticuerpo marcado con epftopo, pueden unirse todos de manera covalente a un marcador detectable. En “deteccion directa”, solo se usa un anticuerpo detectable, es decir, un anticuerpo detectable primario. Por tanto, deteccion directa significa que el anticuerpo que se conjuga con un marcador detectable puede detectarse, per se, sin la necesidad de adicion de un segundo anticuerpo (anticuerpo secundario).

Un “marcador detectable” es una molecula o material que puede producir una senal detectable (tal como visual, electronica u otra) que indica la presencia y/o concentracion del marcador en una muestra. Cuando se conjuga con un anticuerpo, el marcador detectable puede usarse para localizar y/o cuantificar la diana a la que se dirige el anticuerpo espedfico. De ese modo, la presencia y/o concentracion de la diana en una muestra puede detectarse detectando la senal producida mediante el marcador detectable. Un marcador detectable puede detectarse directa o indirectamente, y pueden usarse varios marcadores detectables diferentes conjugados con diferentes anticuerpos espedficos en combinacion para detectar una o mas dianas.

Los ejemplos de marcadores detectables, que pueden detectarse directamente, incluyen colorantes fluorescentes y sustancias radiactivas y partfculas de metal. En cambio, deteccion indirecta requiere la aplicacion de uno o mas anticuerpos adicionales, es decir, anticuerpos secundarios, tras la aplicacion del anticuerpo primario. Por tanto, se realiza la deteccion mediante la deteccion de la union del anticuerpo secundario o agente de union al anticuerpo detectable primario. Los ejemplos de agentes de union detectables primarios o anticuerpos que requieren adicion de un agente o anticuerpo de union secundario incluyen agentes de union detectables enzimaticos y agentes de union o anticuerpos detectables de haptenos.

En algunas realizaciones, el marcador detectable se conjuga con un polfmero de acido nucleico que comprende el primer agente de union (por ejemplo, en un proceso ISH, WISH o FISH). En otras realizaciones, el marcador detectable se conjuga con un anticuerpo que comprende el primer agente de union (por ejemplo, en un proceso IHC).

Los ejemplos de marcadores detectables que pueden conjugarse con los anticuerpos usados en los metodos de la presente divulgacion incluyen marcadores fluorescentes, marcadores enzimaticos, radioisotopos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores electroquimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, polfmeros, partfculas de polfmero, partfculas de metal, haptenos y tintes.

Los ejemplos de marcadores fluorescentes incluyen 5-(y 6)-carboxifluorescema, 5- o 6-carboxifluorescema, acido hexanoico de 6-(fluorescema)-5-(y 6)-carboxamido, isotiocianato de fluorescema, rodamina, tetrametilrodamina, y colorantes tales como Cy2, Cy3, y Cy5, cumarina opcionalmente sustituida incluyendo AMCA, PerCP, ficobiliprotemas incluyendo R-ficoeritrina (RPE) y aloficoeritrina (APC), rojo Texas, rojo Princeton, protema fluorescente verde (GFP) y analogos de los mismos, y conjugados de R-ficoeritrina o aloficoeritrina, marcadores fluorescentes inorganicos tales como partfculas basadas en material semiconductor como nanocristalitos de CdSe recubiertos.

Los ejemplos de marcadores de partfculas de polfmero incluyen micropartfculas o partfculas de latex de poliestireno, PMMA o sflice, que pueden incrustarse con tintes fluorescentes, o micelas o capsulas de poKmero que contienen tintes, enzimas o sustratos.

Los ejemplos de marcadores de partfculas de metal incluyen partfculas de oro y partfculas de oro recubiertas, que pueden convertirse por tinciones argenticas. Los ejemplos de haptenos incluyen DNP, isotiocianato de fluorescema (FITC), biotina y digoxigenina. Los ejemplos de marcadores enzimaticos incluyen peroxidasa del rabano (HRP), fosfatasa alcalina (ALP o AP), p-galactosidasa (GAL), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, p-N-acetilglucosamimidasa, P-glucuronidasa, invertasa, xantina oxidasa, luciferasa de luciernaga y glucosa oxidasa (GO). Los ejemplos de sustratos comunmente usados para peroxidasa del rabano incluyen 3,3'-diaminobencidina (DAB), diaminobencidina con potenciamiento con mquel, 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), diclorhidrato de bencidina (BDHC), reactivo Hanker-Yates (HYR), azul de indofano (IB), tetrametilbencidina (TMB), 4-cloro-1-naftol (CN), .alfa.-naftol pironin (.alfa.-NP), o-dianisidina (OD), 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP), nitro azul de tetrazolio (NBT), cloruro de 2-(p-yodofenil)-3-p-nitrofenil-5-fenilo de tetrazolio (INT), azul tetranitro de tetrazolio (TNBT), 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-galactosido/ferro-ferricianuro (BCIG/FF).

Los ejemplos de sustratos comunmente usados para fosfatasa alcalina incluyen naftol-AS-B 1-fosfato/TR rojo rapido (NABP/FR), naftol-AS-MX-fosfato/TR rojo rapido (NAMP/FR), naftol-AS-B1-fosfato/-TR rojo rapido (NABP/FR), naftol-AS-Mx-fosfato/TR rojo rapido (N^{a m}P/FR), naftol-AS-BI-fosfato/nuevo fuschin (NABP/NF), fosfato de bromocloroindolilo/nitro azul de tetrazolio (BCIP/NBT), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b--d-galactopiranosido (BCIG). Los ejemplos de marcadores luminiscentes incluyen luminol, isoluminol, esteres de acridinio, 1,2-dioxetanos y piridopiridazinas. Los ejemplos de marcadores electroquimioluminiscentes incluyen derivados de rutenio. Los ejemplos de marcadores radiactivos incluyen isotopos radiactivos de yodo, cobalto, selenio, tritio, carbono, azufre y fosforo.

Los marcadores detectables pueden unirse a los anticuerpos descritos en el presente documento o a cualquier otra molecula que se une espedficamente con un marcador biologico de interes, por ejemplo, un anticuerpo, una sonda de acido nucleico o un polfmero. Ademas, un experto habitual en la tecnica apreciana que tambien pueden conjugarse marcadores detectables con agentes de union o anticuerpos segundo, y/o tercero, y/o cuarto, y/o quinto, etc. Ademas, el experto en la tecnica apreciana que cada agente de union o anticuerpo adicional usado para caracterizar un marcador biologico de interes puede servir como etapa de amplificacion de senales. El marcador biologico puede detectarse visualmente usando, por ejemplo, microscopfa optica, microscopfa fluorescente, microscopfa electronica donde la sustancia detectable es, por ejemplo, un tinte, una partfcula de oro coloidal, un reactivo luminiscente. Tambien pueden detectarse sustancias visualmente unidas a un marcador biologico usando un espectrofotometro. Cuando la sustancia detectable es un isotopo radiactivo, la deteccion puede ser visualmente mediante autorradiograffa, o no visualmente usando un contador de centelleo. Vease, por ejemplo, Larsson, 1988, Immnuocytochemistry: Theory and Practice, (CRC Press, Boca Raton, Fla.); Methods in Molecular Biology, vol. 80 1998, John D. Pound (ed.) (Humana Press, Totowa, N.J.).

La divulgacion proporciona ademas kits para detectar CD40 o celulas o tejidos que expresan CD40 en una muestra, en donde los kits contienen al menos un anticuerpo, polipeptido, polinucleotido, vector o celula huesped tal como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, un kit puede comprender tampones, enzimas, marcadores, sustratos, perlas u otras superficies a las que se unen los anticuerpos de la invencion, y similares, e instrucciones para su uso.

Ejemplos

Ejemplo 1

Produccion y humanizacion de anticuerpos anti-CD40

Se inmunizaron cuatro conejos blancos de Nueva Zelanda con Fc-hCD40 de conejo recombinante. Se escogio el conejo con los mayores tttulos sericos de union espedfica a CD40 humano para fusion celular. Se identifico un total de 172 hibridomas como agentes de union positivos para Fc-hCD40 soluble, de los cuales se encontro que 44 clones eran agentes de union positivos para CD40 de superficie celular. Despues del ensayo de agrupamiento de epftopos, se seleccionaron 24 hibridomas representativos para expresion recombinante y caracterizacion adicional. Se llevo a cabo cribado funcional secundario tal como se describe adicionalmente a continuacion e incluyo: 1) induccion de maduracion de CD tal como se mide mediante regulacion por incremento de CD80, CD83, CD86 (actividad agonista); 2) induccion de inhibicion de crecimiento tumoral directa (actividad agonista); y 3) funcion efectora de anticuerpo CCDA. Se seleccionaron candidatos basandose en examenes funcionales duales que incluyeron dos grupos: 1) afinidad de union, internalizacion de anticuerpos, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP); y 2) funcion de activacion/maduracion de CD agonista, interaccion receptor-ligando, reaccion de linfocitos mixta (MLR), proliferacion y apoptosis celular.

Cribado de anticuerpos agonistas por medio de maduracion de celulas dendriticas

Para aclarar adicionalmente el efecto agonista o antagonista del panel inicial de anticuerpos anti-CD40, se uso un ensayo de maduracion CD como indicador para cribar anticuerpos funcionales. Se anadieron anticuerpos anti-CD40 o de control a disolucion en cultivo de CD derivadas de monocitos humanos durante 2 d^as. Se midio la regulacion por incremento de CD83, uno de los marcadores de maduracion mejor conocidos para celulas dendnticas humanas, para cribar anticuerpos agonistas. Se uso 5C11, un anticuerpo monoclonal de raton que induce maduracion de celulas dendnticas como control positivo. Los anticuerpos R-3, R-6, R-8, R-9, R-16, R-18, R-24, R-33, R-36, 19-21, 19-45 y 19-59 aumentaron mas del 50% de la expresion de CD83 en comparacion con control de Ig (figura 1A). Se determino ademas la maduracion de CD midiendo la regulacion por incremento inducida por anticuerpos de las moleculas coestimuladoras CD80 y CD86 para los anticuerpos seleccionados. Tal como se muestra en la figura 1B y la figura 1C, los anticuerpos R-3, R-8, R-9, R-33 y 19-21 regularon por incremento tanto CD80 como CD86, mientras que los otros anticuerpos solo tuvieron efectos modestos. Estos resultados son coherentes con los efectos de modulacion de CD83 por estos anticuerpos. De manera interesante, entre los anticuerpos que pueden inducir maturacion de CD, solo el clon 19-21 mostro fuerte actividad para potenciar la proliferacion de celulas T en una reaccion de linfocitos mixta (figura 1D).

Cribado para inhibicidn directa de crecimiento tumoral

Se evaluo adicionalmente el panel de anticuerpos anti-CD40 agonistas para determinar la capacidad de inducir la inhibicion de crecimiento tumoral de celulas tumorales que expresan CD40. Todos los anticuerpos anti-CD40 sometidos a prueba inhibieron la proliferacion de celulas tumorales. El anticuerpo 19-21 demostro la potencia mas alta. (Figura 2).

Cribado para actividad de CCDA

Ademas de induccion de la activacion de APC y la inhibicion del crecimiento tumoral, se uso la funcion efectora de anticuerpo, CCDA, como criterio importante para cribar y clasificar los candidatos a anticuerpo. Con el fin de realizar el ensayo de CCDA usando PBMC humanas, todos los anticuerpos seleccionados se convirtieron de Acm de conejo a Acm quimerico con Fab de conejo e IgG1 humana. Tal como se muestra en la figura 3, todos los candidatos seleccionados mostraron actividad de CCDA significativa en comparacion con control de IgG1. Basandose en la actividad de CCDA maxima, los Acm lfderes pueden clasificarse cR-8 > cR-3 > cR-33 > c19-21> c R-9 > c19-59. Se seleccionaron cuatro candidatos (c19-21, cR-8, cR-3, cR-33) basandose en cribado funcional in vitro. Sus caracterizaciones in vitro se resumen en la tabla 1. El anticuerpo c19-21 potencia fuertemente la activacion de CD y la inhibicion del crecimiento tumoral, mientras que los anticuerpos cR-8 y cR-3 mostraron una actividad de CCDA mas potente.

Tabla 1. Caracteristicas de 4 anticuerpos anti-CD40 candidatos:

Cribado de actividad antitumoral in vivo

Como los 4 candidatos superiores mostraron diferentes potencias en diferentes ensayos in vitro, se realizaron estudios in vivo para evaluar y comparar su actividad antitumoral para seleccion lfder. Se uso el modelo de xenoinjerto tumoral de Ramos. Se trataron ratones que teman tumores i.p. con 5mg/kg de anticuerpos quimericos cR-3, cR-8, cR-33 o c19-21 3 veces a la semana durante un total de 9 dosis (ocho animales por grupo). Se uso la actividad antitumoral de rituximab con el mismo regimen como referencia. Tal como se muestra en la figura 4A, cR-8 y cR-3 mostraron el efecto antitumoral mas fuerte. En cambio, 19-21 presento menor actividad antitumoral con rebote tumoral mas rapido tras terminacion de la dosificacion. El efecto antitumoral de cR-33 estuvo entre medias, pero aun presento mejor eficacia in vivo que rituximab. La potencia in vivo de anticuerpos cR-3 y cR-8 se evaluo adicionalmente en un estudio de respuesta a la dosis. Tal como se muestra en la figura 4B, cR-8 mostro una eficacia antitumoral mas potente que cR-3, y por tanto se identifico como el anticuerpo anti-CD40 lfder.

Las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera del clon R-8 se exponen en SEQ ID NO: 1 y 2. Las secuencias de aminoacidos de las CDR de la VH y VL se exponen en SEQ ID NO: 3-5 y 6-8, respectivamente. La secuencia de aminoacidos de las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de varios de los otros candidatos a anticuerpo que mostraron actividad funcional se exponen en SEQ ID NO: 11-56. Se proporcionan secuencias de aminoacidos de VHCDR y VLCDR para estos anticuerpos en SEQ ID NO: 57-194. La figura 16 muestra una alineacion de estas secuencias, incluyendo el clon R-8, con c Dr subrayadas.

Se humanizo R-8 usando una tecnologfa de humanizacion guiada por linaje mutacional (MLG) propia (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.462.697). La region de marco de cadena ligera y pesada del R-8 humanizado (APX005) es el 95% identica a las secuencias de lmea germinal humanas. La secuencia de aminoacidos de las regiones VH y VL humanizadas se exponen en SEQ ID NO: 9 y 10, respectivamente. Se encontro que la union de APX005 a CD40 era similar a su clon R-8 parental.

Ejemplo 2

Caracterizacion in vitro del anticuerpo anti-CD40 humanizado APX005

Se realizaron numerosos experimentos in vitro para caracterizar adicionalmente el anticuerpo humanizado APX005. APX005 se une selectivamente a CD40

Se evaluo la selectividad de union de APX005 mediante ELISA directo a un panel de protemas de la familia TNFR. Se recubrio un total de 1 |ig/ml de protema de fusion de Fc de conejo y CD40, RANK, TweakR, OX40, DR5 y 4-1BB sobre placas de ELISA. Se detecto APX005 unido usando IgG conjugada anti-HRP humano de cabra. Tal como se muestra en la figura 5, APX005 se une selectivamente a CD40 humano pero no a otras protemas de la familia TNFR sometidas a prueba.

APX005 bloquea la union de CD40L a CD40

Se realizo un ELISA para evaluar el efecto de APX005 sobre la union de CD40L a CD40. En particular, se uso CD40L (concentracion final 4 |ig/ml) para unir el CD40 humano inmovilizado sobre una placa de ELISA, y se midieron cambios en la cantidad de union de CD40L a CD40 tras preincubar CD40 inmovilizado con APX005. Se detecto union de CD40L a CD40 inmovilizado mediante un anticuerpo monoclonal anti-CD40L de raton. Tal como se muestra en la figura 6, APX005 bloquea la union de CD40L a CD40. En cambio, SGN-40 aumenta la union.

El complejo APX005/CD40 no esta internalizado

Con el fin de valorar la internalizacion mediada por diana de APX005 para evaluar su impacto sobre la actividad de CCDA, se incubaron celulas Ramos con APX005 durante 4 h a 37°C, una temperatura que permite la internalizacion, o a 4°C durante 30 minutos, una temperatura a la que se minimiza la internalizacion. Se lavaron las celulas con tampon de tincion, seguido por incubacion con anti-IgG humana de cabra marcada con Alexa 488 durante unos 30 minutos adicionales a 4°C. Se realizo analisis de FACS para examinar el nivel de APX005 sobre la superficie celular. Tal como se muestra en la figura 7, no hubo reduccion (ligero aumento) del nivel de APX005 sobre la superficie celular tras incubacion a 37°C. Los datos sugieren que tras la union a CD40, el complejo APX005/CD40 no se internalizo por celulas tumorales proporcionando, por tanto, proporcionando condiciones optimas para reclutar las celulas efectoras para CCDA.

APX005 media CCDA

Con el fin de valorar la actividad de CCDA de APX005 en celulas tumorales que expresan CD40, se usaron Ramos y Daudi que expresaban CD40 como celulas diana y se usaron celulas mononucleares de sangre periferica humana nuevas (PBMC) como celulas efectoras. Se midio la CCDA mediante un ensayo de liberacion de calcema-AM. Se marcaron celulas diana con calcema-AM (15 uM/106 celulas), se lavaron y se sembraron en placa por triplicado a 5x103 por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Se preincubaron concentraciones crecientes (0,0001 10 |ig/ml) de o bien anticuerpos APX005 o bien de control a 4°C durante 30 minutos, tras lo cual se anadieron celulas efectoras PBMC de donantes humanos sanos con una razon celula efectora:diana final de 40:1 en un volumen final de 200 ul por pocillo. Se realizaron experimentos usando PBMC de al menos tres donantes diferentes. Tras una incubacion de 4 horas, se transfirieron 100 |il de sobrenadantes de cultivo a una placa de 96 placas Black View y se leyeron unidades fluorescentes arbitrarias (UFA) en un lector de placas Victor II (485 nm de excitacion/535 nm de emision). Porcentaje de lisis espedfica = (liberacion experimental media de UFA - liberacion espontanea media de UFA)/(liberacion maxima media de UFA - liberacion espontanea media de UFA). Tal como se muestra en la figura 8, APX005 indujo CCDA de manera dependiente de la dosis. Se observo un efecto similar para SGN-40. La diferente sensibilidad de celulas Ramos y Daudi a la CCDA puede deberse a diferente nivel de expresion de CD40 (Cancer Res 2005; 65: 8331-8338).

APX005 inhibe la proliferacion de celulas tumorales

Para valorar la capacidad de APX005 de inhibir la proliferacion de celulas tumorales, se sembraron celulas Ramos en placas de fondo plano de 96 pocillos a 50.000 celulas/pocillo en 200 |il de RPMI 1640 complementado con FBS al 10% que contiene concentraciones variables de APX005, SGN-40 o una IgG humana de control. Para reticular, se preincubaron APX005, SGN-40 o IgG de control con fragmentos F(ab')2 de un anticuerpo espedfico del fragmento Fc anti-IgG humana de cabra en el medio durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de anadirse a las celulas. Se trataron las celulas durante un total de 72 horas. Entonces se anadio AlamarBlue® al 10% (Serotec, Oxford, R.U.) a cada pocillo y se incubo durante unas 24 horas adicionales. Se midio la viabilidad celular mediante un lector de fluorescencia CytoFluor con una longitud de onda de excitacion de 530 nm y longitud de onda de emision de 590 nm. Todos los estudios se realizaron dos veces y por triplicado para cada concentracion de muestra. Tal como se muestra en la figura 9, el monomero APX005 inhibio la proliferacion de celulas Ramos (figura 9A). Cuando se reticulo APX005 mediante un anticuerpo secundario, suministro un efecto inhibidor de la proliferacion dependiente de la dosis y aumentado (figura 9B). La reticulacion de APX005 puede lograrse in vivo mediante celulas que expresan el receptor Fc.

APX005 induce activacion de CD

Con el fin de valorar la capacidad de APX005 de estimular la maduracion de celulas CD, se prepararon PBMC mediante centrifugacion de densidad en gradiente usando disolucion de aislamiento de linfocitos. Se recogieron monocitos adherentes tras incubar durante 2 horas a 37°C. Se cultivaron monocitos aislados con 100 ng/ml de GM-CSF humano recombinante y 100 ng/ml de IL-4 humana recombinante en medios RPMI1640 complementados con FCS al 10% en una placa de 24 pocillos. Se cambio la mitad del medio tras 3 dfas. El dfa 5 de cultivo, se anadieron 1,3 nM de anticuerpos anti-CD40, CD40L o el anticuerpo de control a las celulas CD, y se cultivaron adicionalmente durante 48 h en una placa de 24 pocillos. Para tincion de marcador para activacion de CD, se usaron anticuerpo anti-CD83, anticuerpo anti-CD86 y anticuerpo anti-CD80 conjugados con PE. Se realizo analisis usando FACS. Los datos son de un estudio representativo. Tal como se muestra en la figura 10, APX005 indujo maduracion de CD marcada y su efecto parece mas potente que SGN-40 y CD40L. Una activacion aumentada de CD puede conducir a respuestas de celulas T antitumorales mas potentes.

APX005 tiene reactividad cruzada con CD40 de mono pero no CD40 de raton

Se evaluo la reactividad cruzada mediante ELISA directo. Se recubrio un total de 1 |ig/ml de CD40 humano, CD40 de mono o CD40 de raton sobre placas de ELISA seguido por incubacion con 1 |ig/ml de APX005 o IgG1 de control. Se detectaron anticuerpos unidos a CD40 usando anti-IgG humana de cabra conjugado con HRP. APX005 reacciona de manera cruzada claramente con CD40 de mono pero no CD40 de raton. (Figura 11A)

Se determino adicionalmente la reactividad cruzada de APX005 con CD40 de raton mediante union de FACS a una lmea celular de raton A20 que expresa CD40 de raton. Se anadio una alfcuota de 0,5x106 celulas A20 a placas de 96 pocillos y se incubo con 100 |il de anticuerpo anti-CD40 de raton diluido de rata conjugado con anticuerpos de control PE, APX005 o IgG1. Tras lavar, se anadieron 100 |il de anti-IgG de cabra (H+L) conjugado con R-PE (Southern Biotech, n.° de CAT 2040-09) a dilucion 1:200 en PBS a la muestra y se incubaron para la deteccion de APX005 e IgG1 de control humana. Se uso un anticuerpo anti-CD40 de raton de rata conjugado con PE como control positivo. Se resuspendieron muestras con 0,5 ml de PBS y se analizaron mediante FACS. Los datos de FACS mostraron que APX005 no reacciona de manera cruzada con CD40 de raton (figura 11B).

En resumen, los experimentos en este ejemplo mostraron que APX005 es un anticuerpo IgG1 humanizado que se une a CD40. APX005 se une espedficamente a CD40 con una Kd de 9,6 x10‘10 M y bloquea la union de CD40L a CD40. Esto contrasta con el anticuerpo anti-CD40 SGN40 que potencia la interaccion CD40-CD40L. Esto sugiere que estos dos anticuerpos se unen a distintos epftopos. In vitro, APX005 mostro una actividad potente de CCDA frente a celulas de linfoma positivas CD40 (Ramos y Daudi) asf como la capacidad de inhibir directamente la proliferacion de celulas tumorales (Ramos) tras reticulacion. APX005 tambien estimulo la maduracion de celulas dendnticas para potenciar la respuesta inmunitaria celular. Ademas, se demostro que APX005 reaccionaba de manera cruzada con CD40 de mono.

Ejemplo 3

Caracterizacion in vivo del anticuerpo anti-CD40 humanizado APX005

Se realizaron numerosos experimentos in vivo para caracterizar adicionalmente el anticuerpo humanizado APX005. Inhibicion de APX005 del crecimiento tumoral en el modelo Ramos

Con el fin de evaluar el efecto de APX005 en el modelo de xenoinjerto de linfoma de celulas B humanas, se usaron ratones BALB/c nu/nu hembra de 6-8 semanas de edad para inoculacion de celulas tumorales. Se establecieron xenoinjertos mediante inoculacion subcutanea de 1x107 celulas tumorales/raton en los flancos dorsales. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de aproximadamente 100 mm3 (50-200 mm3), se aleatorizaron los animales en grupos. Se administraron anticuerpos por via intraperitoneal a 3 mg/kg empezando el dfa 13 (vease la figura 12). Se administro la dosificacion 3 veces a la semana durante un total de 9 dosis (ocho animales por grupo). Se midieron dimensiones perpendiculares del tumor usando un compas de escala Vernier. Se calcularon los volumenes tumorales usando la formula: Volumen = (longitud x ancho2)/2. Tal como se muestra en la figura 12A, APX005 demostro una actividad antitumoral potente y de larga duracion. Se tomo suero el dfa 34, dos dfas despues de la ultima dosificacion, para determinar niveles de farmaco in vivo midiendo concentraciones de IgG humana (vease la figura 12B). La eficacia antitumoral mediada por APX005 fue mayor que la de SGN-40 y persistio mucho despues del ultimo periodo de dosificacion. El analisis de PK de unico punto mostro que la actividad antitumoral superior de APX005 no se debfa la diferencia de PK.

Inhibicidn de APX005 de tumores pretratados con y resistentes a rituximab

El fin de este experimento era evaluar el efecto de APX005 sobre linfoma de celulas B pretratado con y resistente a rituximab. En primer lugar se trataron ratones desnudos que portaban tumores Ramos establecidos con rituximab a 3 mg/kg para 5 dosis. Se inhibio parcialmente el crecimiento mediante rituximab (figura 13A). Cuando estos tumores alcanzaron un tamano de aproximadamente 700 mm3, se aleatorizaron en 4 grupos (7 animales por grupo) y volvieron a tratarse i.p. con APX005, rituximab, analogo de SGN40 3 mg/kg o control salino durante 3 semanas (figura 13B). Tal como se muestra en la figura 13, los tumores pretratados con rituximab no respondieron al nuevo tratamiento con rituximab, lo que sugiere que estos tumores son resistentes a rituximab (figura 13B). APX005 presento la capacidad de inhibir el crecimiento de tumores resistentes a rituximab.

Inhibicidn de APX005 de crecimiento tumoral en el modelo Raji

El fin de este experimento era determinar la relacion de dosis y eficacia de APX005 in vivo. Se trataron ratones desnudos que portaban tumores Raji positivos para CD40 establecidos con APX005 empezando el dfa 15. Se administraron i.p. dosis de APX005 que oscilaban entre 0,1 mg/kg - 10 mg/kg 3 veces/semana durante 2 semanas (ocho animales por grupo) (vease la figura 14). Se uso solucion salina como tratamiento de control. Se midieron volumenes tumorales en cada dfa de dosificacion. Tambien se midieron los niveles sericos de APX005 en cada grupo 3 dfas despues de la ultima dosificacion para determinar la correlacion de la eficacia in vivo con los niveles de APX005 en la circulacion. Se observo una actividad antitumoral dependiente de la dosis evidente (vease la figura 14). La diferencias en volumenes tumorales fueron significativas (P < 0,05) entre el grupo de control y los grupos de tratamiento con anticuerpo con niveles de dosis > 1mg/kg los dfas 29 a 33. Se determino la dosis eficaz minima como 1 mg/kg, que se corresponde con una concentracion serica mediana de 0,49 |ig/ml el dfa 36. Las diferencias en volumenes tumorales entre los grupos de dosis de 3, 5 y 10 mg/kg no fueron estadfsticamente significativas. Por tanto, se logro la actividad antitumoral maxima a dosis > 3 mg/kg con una concentracion serica mediana > 1,6 |ig/ml. Inhibicidn de crecimiento tumoral en modelo MM IM-9 humano mediante APX005

Con el fin de evaluar la actividad antitumoral de APX005 en modelo de mieloma multiple humano, se trataron i.p. ratones desnudos que portaban tumores IM-9 de mieloma multiple positivos para CD40 establecidos con APX005 o SGN40 empezando el dfa 15. APX005 se proporciono a 3 mg/kg, 3 veces/semana durante 3 semanas (5 animales por grupo). Se midieron los volumenes tumorales en cada dfa de dosificacion.

APX005 demostro una potente actividad antitumoral contra mieloma multiple humano en el modelo de xenoinjerto IM-9 (vease la figura 15). La eficacia antitumoral mediada por APX005 fue significativamente mayor que la de SGN-40 (P < 0,05).

Inhibicidn de crecimiento tumoral en el modelo Ramos mediante APX005 en comparacidn con SGN-40 y rituximab El fin de este experimento era comparar la actividad antitumoral de APX005, rituximab y SGN-40 en un modelo de xenoinjerto Ramos de linfoma de celulas B humano. Se establecieron xenoinjertos mediante inoculacion subcutanea de celulas Ramos en los flancos dorsales de ratones SCID C.B-17 hembra. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de aproximadamente 200-300 mm3, se aleatorizaron los animales en 6 grupos. Se administraron anticuerpos por via intraperitoneal en dosis tal como se indico en la figura 17. Se administro la dosificacion 3 veces a la semana durante un total de 9 dosis (10 animales por grupo). Se midieron dimensiones perpendiculares del tumor usando un compas de escala Vernier. Se calcularon los volumenes tumorales usando la formula: Volumen = (longitud x ancho2)/2. Tambien se determino y se registro la supervivencia de los ratones.

APX005 demostro actividad antitumoral dependiente de la dosis. El tratamiento con la dosis alta de APX005 (10 mg/kg) dio como resultado remision tumoral completa, mientras que rituximab a la misma dosis (10 mg/kg) solo retraso el crecimiento tumoral, lo que sugiere que APX005 es mas eficaz que rituximab en este modelo. APX005 tambien es mas potente que SGN-40 (figura 17A). APX005 no solo inhibio el crecimiento tumoral sino que tambien mejoro la supervivencia de los animales que portan tumores (figura 17B).

Inhibicidn de crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de linfoma Namalwa humano resistente a rituximab El fin de este experimento era comparar la actividad antitumoral de APX005, rituximab y SGN-40 en el modelo de linfoma Namalwa humano resistente a rituximab. Se establecieron xenoinjertos mediante inoculacion subcutanea de celulas Namalwa en los flancos dorsales de ratones SCID C.B -17 hembra. Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de aproximadamente 200-300 mm3, se aleatorizaron los animales en 6 grupos. Se administraron anticuerpos i.p. a las dosis indicadas en la figura 18. Se administro la dosificacion 3 veces a la semana durante un total de 9 dosis (10 animales por grupo). Se midieron dimensiones perpendiculares del tumor usando un compas de escala Vernier. Se calcularon volumenes tumorales usando la formula: Volumen = (longitud x ancho2)/2. Tambien se determino y se registro la supervivencia de los ratones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo aislado, o fragmento de union a antfgeno del mismo, que se une a CD40 y es un agonista de CD40, que comprende (i) una region variable de cadena pesada que comprende la region VHCDR1 expuesta en S^eQ ID NO:3, la region VHCDR2 expuesta en ^sE^qID NO:4 y la region VHCDR3 expuesta en SEQ ID NO:5; (ii) una region variable de cadena ligera que comprende la region VLCDR1 expuesta en SEQ ID NO:6, la region VLCDR2 expuesta en SEQ ID NO:7 y la region VLCDR3 expuesta en SEQ ID NO: 8.

2. Anticuerpo aislado, o fragmento de union a antigeno del mismo, segun la reivindicacion 1, en el que (a) la region variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:1; o

(b) la region variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:2.

3. Anticuerpo aislado segun la reivindicacion 1, en el que

(a) el anticuerpo esta humanizado;

(b) el anticuerpo esta humanizado, en el que la region VH comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:9 y la region VL comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:10;

(c) el anticuerpo es un anticuerpo completo; o

(d) el anticuerpo aislado comprende un dominio constante de IgG humana, en el que opcionalmente el dominio constante de IgG comprende un dominio CH1 de IgG1 o una region Fc de IgG1.

4. Anticuerpo aislado, o fragmento de union a antfgeno del mismo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que el anticuerpo aislado, o fragmento de union a antfgeno del mismo:

a. activa celulas presentadoras de antfgeno;

b. estimula la liberacion de citocinas a partir de celulas presentadoras de antfgeno;

c. induce la apoptosis de celulas tumorales;

d. inhibe la proliferacion de celulas tumorales;

e. destruye celulas tumorales a traves de la induccion de funciones efectoras seleccionadas del grupo que consiste en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, citotoxicidad dependiente de complemento y fagocitosis celular dependiente de anticuerpos;

f. estimula respuestas de celulas T antitumorales;

g. reduce tumores establecidos;

h. inhibe tumores resistentes a rituximab; o

i. una combinacion de una cualquiera o mas de a. - h.

5. Polinucleotido aislado que codifica para el anticuerpo aislado, o fragmento de union a antfgeno del mismo, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3b y 4.

6. Vector de expresion que comprende el polinucleotido aislado segun la reivindicacion 5.

7. Celula huesped aislada que comprende el vector segun la reivindicacion 6.

8. Composicion que comprende un portador fisiologicamente aceptable y una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo aislado o fragmento de union a antfgeno del mismo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3b y 4.

9. Composicion segun la reivindicacion 8 para su uso en

(a) un metodo para tratar o mejorar los smtomas en un paciente que tiene un cancer, que comprende administrar al paciente la composicion segun la reivindicacion 8, tratando o mejorando de ese modo los smtomas en el paciente que tiene el cancer, en el que opcionalmente el cancer se selecciona del grupo que consiste en linfomas no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocfticas cronicas, tricoleucemias, leucemias linfoblasticas agudas, mieloma multiple, carcinomas de vejiga, rinon, ovario, cuello uterino, mama, pulmon, nasofaringe, melanoma maligno y leucemias y LNH resistentes a rituximab;

(b) un metodo para mejorar smtomas en un paciente que tiene una enfermedad autoinmunitaria que comprende administrar al paciente la composicion segun la reivindicacion 8, mejorando de ese modo los smtomas en el paciente que tiene la enfermedad autoinmunitaria; o

(c) un metodo para mejorar smtomas en un paciente que tiene una enfermedad inflamatoria que comprende administrar al paciente la composicion segun la reivindicacion 8, mejorando de ese modo los smtomas en el paciente que tiene la enfermedad inflamatoria.