BR112013027829B1

BR112013027829B1 - Anticorpos anti-cd40 ou fragmentos de ligação aos antígenos destes, composição que compreende os ditos anticorpos e uso da dita composição para tratar ou melhorar os sintomas de câncer, doença autoimune ou doença inflamatória

Info

Publication number: BR112013027829B1
Application number: BR112013027829-3A
Authority: BR
Inventors: Yongke Zhang; Guo-Liang Yu; Weimin Zhu
Original assignee: Apexigen, Inc
Priority date: 2011-04-29
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2022-05-10
Also published as: US8957193B2; CN106928362A; US8778345B2; US20140349395A1; JP6125489B2; WO2012149356A2; CN103635488B; US20170233483A1; SG194701A1; CA2834404A1; US20120301488A1; CN113461819B; CN113461819A; US9266956B2; KR102037432B1; KR20140053893A; ES2709654T3; JP6807890B2; CN106928362B; US20220049005A1

Abstract

ANTICORPOS ANTI-CD40 E MÉTODOS DE USO A presente invenção fornece anticorpos monoclonais anti-CD40 de afinidade alta e composições relacionadas, que podem ser usados em qualquer um de uma variedade de métodos terapêuticos para o tratamento de câncer e outras doenças.

Description

Referência cruzada aos pedidos relacionados

[001]Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. No 61/622.435 depositado em 10 de Abril de 2012 e Pedido Provisório U.S. No 61/480.863 depositado em 29 de Abril de 2011, pedidos estes que são incorporados por referência aqui em sua totalidade.

Declaração com respeito à listagem de sequência

[002]A Listagem de Sequência associada com este pedido é fornecida em formato de texto em vez de uma cópia impressa, e é por meio deste incorporada por referência no relatório descritivo. O nome do arquivo de texto contendo a Listagem de Sequência é APEX-013_02US_ST25.txt. O arquivo de texto é 86 KB, foi criado em 27 de Abril de 2012, e está sendo apresentado eletronicamente via EFS-Web.

Fundamentos Campo técnico

[003]A presente invenção refere-se geralmente a anticorpos anti-CD40, composições e métodos de usar os mesmos. Tais anticorpos são úteis, por exemplo, em métodos para tratar uma variedade de doenças oncológicas.

Descrição da Técnica Relacionada

[004]A maioria das leucemias e linfomas origina-se da transformação maligna de células de linhagem B. A expressão de antígenos restritos de linhagem B na superfície celular tal como CD20 a torna um alvo atrativo para a terapia com anticorpo. A terapêutica com anticorpo mudou dramaticamente o manejo de pacientes com linfoma não Hodgkin (NHL) e leucemia linfocítica crônica (CLL). Desde a aprovação de rituximabe, o anticorpo sozinho ou em combinação com a quimioterapia tem taxas de resposta notavelmente melhoradas, resultados a longo prazo, e qualidade de vida (Chinn P, Braslawsky G, White C, et al. Antibody therapy of non-Hodgkin’s B- cell lymphoma. Cancer Immunol Immunother 2003; 52:257-280.; Rastetter W, Molina A, White CA. Rituximab: Expanding role in therapy for lymphomas and autoimmune diseases. Annu Rev Med 2004; 55:477-503). Entretanto, um número substancial de pacientes exibe resistência primária ou adquirida a rituximabe, sugerindo que métodos correntes que alvejam CD20 têm limitações em resultados clínicos, e existe uma necessidade para melhoramento desenvolvendo-se novos produtos imunoterapêuti- cos para linfoma de célula B e leucemia com mecanismos de ação distintos (Stolz C, Schuler M. Molecular mechanisms of resistance to Rituximab and pharmacologic strategies for its circumvention. Leukemia and lymphoma. 2009; 50(6):873-885; Bello C, Sotomayor IN. Monoclonal antibodies for B-cell lymphomas: Rituximabe and beyond. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007; 233-242; Dupire S, Coiffier B. Targeted treatment and new agents in diffuse large B cell lymphoma. Int J Hema- tol 2010; 18 de Junho (online)), tal como o mAb anti-CD40, APX005.

O Papel de CD40 na Regulação de Respostas Imunes

[005]A ativação total de células T requer dois sinais distintos mas sinérgicos. O primeiro sinal, liberado através do receptor de antígeno de célula T, é fornecido por antígeno e complexo de MHC em APCs e é responsável pela especificidade da resposta imune. O sinal secundário, ou coestimulador é através da interação de CD28 com B7-1 (CD80)/B7-2 (CD86), e CD40 com CD40L, que são necessários para montar uma resposta de célula T integral. Na ausência de sinais coestimuladores, células T posem sofrer apatia (anergia) ou morte celular programada (apoptose) na estimulação do antígeno.

[006]CD40, um membro da superfamília de receptor de TNF (TNFR), é expressado principalmente em células B e outras células que apresentam antígeno (APCs) tais como células dendríticas e macrófagos. O ligante de CD40 (CD40L) é expressado principalmente por células T ativadas.

[007]A interação de CD40 e CD40L serve como um sinal coestimulador para ativação de célula T. O entrosamento de CD40-CD40L em células B latentes induz a proliferação, comutação de classe de imunoglobulina, secreção de anticorpo, e também tem um papel no desenvolvimento de centros germinais e a sobrevivência de células B de memória, todos os quais são essenciais para respostas imunes humo- rais (Kehry MR. J Immunol 1996; 156: 2345-2348). A ligação de CD40L a CD40 em células dendríticas induz a maturação de DC como manifestado aumentando-se a expressão de moléculas coestimuladoras tal como família B7 (CD80, CD86) e produção de citocinas proinflamatórias tal como interleucina 12. Estas levam a respostas de célula T potentes (Stout, R. D., J. Suttles. 1996. Immunol. Today 17:487-492; Brendan O’Sullivan, Ranjeny Thomas. Critical Reviews in Immunology 2003; 23: 83107; Cella, M., D. Scheidegger, K. Palmer-Lehmann, P. Lane, A. Lanzavecchia, G. Alber. J. Exp. Med. 1996; 184:747-452).

[008]A transdução do sinal de CD40 ativa vias múltiplas incluindo NF-CapaB (Fator-CapaB Nuclear), MAPK (Proteína Cinase Ativada por Mitógeno) e STAT3 (Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcrição-3) (Pype S, et al. J Biol Chem. 16 de Junho de 2000;275(24):18586-93) que regulam a expressão de gene através da ativação de Proteínas Ativadoras, c-Jun, ATF2 (Fator de Transcrição-2 de Ativação) e fatores de transcrição Rel (Dadgostar H, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 5 de Fevereiro de 2002;99(3):1497-502). As proteínas adaptadoras de fator associado ao receptor TNFR (por exemplo, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF5, e TRAF6) interagem com este receptor e servem como mediadores da transdução de sinal. Dependendo do tipo de célula particular, o entrosamento de CD40 resulta em um padrão de expressão de gene particular. Genes ativados em resposta à sinalização de CD40 incluem numerosas citocinas e quimiocinas (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-Alfa, e Proteína-1Alfa Inflamatória de Macrófago (MIP1Alfa). Em certos tipos de células, a ativação de CD40 pode resultar na produção de radicais citotóxicos (Dadgostar et al., Supra), COX2 (Ciclooxigenase-2), e produção de NO (Óxido Nítrico).

O Papel de CD40 em Tumores

[009]CD40 não é apenas expressada por células imunes normais mas também por muitas células malignas. Em particular, CD40 é super-expressada em NHLs de linhagem B, leucemias linfocíticas crônicas (CLLs), leucemias de células pilosas (HCLs), doença de Hodgkin (Uckun FM, Gajl-Peczalska K, Myers DE, et al. Blood 1990;76:2449-2456; O’Grady JT, Stewart S, Lowrey J, et al. Am J Pathol 1994;144: 21-26), mieloma múltiplo (Pellat-Deceunynck C, Bataille R, Robillard N, Harousseau JL, Rapp MJ, Juge-Morineau N, Wijdenes J, Amiot M. Blood. 1994; 84(8):2597-603), assim como em carcinomas da bexiga, rim, ovário, cérvix, mama, pulmão, nasofarin- ge, e melanoma maligno (Young LS, Eliopoulos AG, Gallagher NJ, et al. Immunol Today 1998;19:502-6; Ziebold JL, Hixon J, Boyd A, et al. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 2000; 48: 225-33; Gladue R, Cole S, Donovan C, et al. J Clin Oncol 2006;24 (18S):103s).

[0010]A ligação de CD40 na superfície de células tumorais, que em muitos casos, medeia um efeito citotóxico direto, resulta na regressão do tumor através de apoptose e necrose (Grewal IS, Flavell RA. Annu Rev Immunol 1998;16:111-35; van Kooten C, Banchereau J. J Leukoc Biol 2000; 67(1):2-17). Embora as funções exatas de CD40 em células tumorais sejam incertas (Tong AW, Stone MJ. Cancer Gene Ther. 2003 10(1):1-13), o entrosamento de CD40 in vitro inibe o crescimento de células de tumor sólido e células de linfoma de célula B de grau alto (Magi Khalil e Robert H. Vonderheide. Update Cancer Ther 2007; 2(2): 61-65; Young LS, Eliopoulos AG, Gallagher NJ, Dawson CW. Immunol Today 1998;19(11):502-6; Funakoshi S, Longo DL, Beckwith M, et al. Blood 1994;83(10):2787-94; Hess S, Engelmann H. J Exp Med 1996;183(1):159-67; Eliopoulos AG, Dawson CW, Mosialos G, et al. Onco gene 1996;13(10):2243-54; von Leoprechting A, van der Bruggen P, Pahl HL, Aruffo A, Simon JC. Cancer Res 1999;59(6):1287-94). Estes efeitos contrastam com a proliferação induzida depois do entrosamento de CD40 em células B não neoplásicas e células dendríticas.

[0011]Além da inibição de tumor direta, a ativação da sinalização de CD40 resgata a função de células que apresentam antígeno em hospedeiros que portam tumor e desencadeia ou restaura respostas imunes ativas contra antígenos associados ao tumor. Agonistas de CD40 foram relatados superar a tolerância de célula T em camundongos que portam tumor, evocar respostas de célula T citotóxica eficazes contra antígenos associados ao tumor, e realçar a eficácia de vacinas antitumo- rais (Eliopoulos AG, Davies C, Knox PG, et al. Mol Cell Biol 2000;20(15): 5503-15; Tong AW, Papayoti MH, Netto G, et al. Clin Cancer Res 2001;7(3):691-703).

CD40 como Alvo Molecular

[0012]CD40 é super-expressada em uma faixa ampla de células malignas. Os papéis de CD40 na inibição do tumor e estimulação do sistema imune tornam CD40 um alvo atrativo para uma imunoterapia com base em anticorpo (van Mierlo GJ, den Boer AT, Medema JP, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99(8): 55615566; French RR, Chan HT, Tutt AL, Glennie MJ. Nat Med. 1999;5(5):548-553). Anticorpos anti-CD40 podem agir contra células do câncer via mecanismos múltiplos: (i) função efetora de anticorpo tal como ADCC, (ii) um efeito citotóxico direto nas células tumorais, e (iii) ativação de respostas imunes antitumorais.

Anticorpos Terapêuticos Anti-CD40 em Desenvolvimento

[0013]Vários anticorpos anti-CD40 foram relatados ter potencial como terapêutica antitumoral. CP-870.893 é um anticorpo agonista de CD40 de IgG2 completamente humano desenvolvido por Pfizer. Ele liga-se a CD40 com uma KD de 3,48 x 10-10 M, mas não bloqueia a ligação de CD40L (Veja por exemplo, Patente U.S. no 7.338.660). CP-870893 apresentou efeitos de ADCC; possivelmente devido ao seu isótipo de IgG2. Assim, este anticorpo age como um agonista de CD40 (isto é, não afeta a ligação de CD40L), induz a sinalização proapoptótica, e ativa DCs e inspeção imune. Entretanto, este anticorpo não medeia ADCC.

[0014]HCD122 é um anticorpo antagonista de CD40 de IgG1 completamente humano desenvolvido por Novartis. Ele liga-se a CD40 com uma KD de 5,1 x 10-10 M, bloqueia a ligação de CD40 a CD40L, inibe a sinalização induzida por ligante de CD40 e efeitos biológicos em células B e certas células CLL e MM primárias (Tai YT, et al. Cancer Res. 1 de Julho de 2005;65(13):5898-906; Luqman M, Klabunde S, et al: Blood 112:711-720, 2008). O principal mecanismo de ação para seu efeito anti- tumoral in vivo é ADCC (Long L, et al. 2005 IMF Oral Presentation and Abstract No 3; Blood 2004, 104(11, Parte 1): Abst 3281). Devido à sua característica antagonística, este anticorpo pode não induzir diretamente a resposta imune antitumoral mediada por CD40.

[0015]SGN-40 é um anticorpo de IgG1 humanizado desenvolvido por Seattle Genetics a partir do clone de anticorpo de camundongo S2C6, que foi gerado usando uma linhagem de célula de carcinoma de bexiga humana como o imunógeno. Ele liga-se a CD40 com uma KD de 1,0 x 10-9 M e lida com um problema realçando a interação entre CD40 e CD40L, exibindo assim um efeito agonista parcial (Francisco JA, et al., Cancer Res, 60: 3225-31, 2000). SGN-40 libera sinais inibitórios de proliferação e de apoptose a um painel de linhagens de linfoma B originadas de células linfoma não Hodgkin e MM de grau alto (Tai YT, Catley LP, Mitsiades CS, et al. Cancer Res 2004;64(8):2846-2852). Estudos in vitro e in vivo sugerem que tanto a função de sinalização apoptótica quanto efetora de anticorpo via ADCC contribuem para a atividade antitumoral de SGN-40 (Law CL, Gordon KA, Collier J, et al: Cancer Res 2005; 65:8331-8338). Um estudo recente sugeriu que a atividade antitumoral de SGN-40 significantemente depende de interações de Fc com as células efetoras e que macrófagos são os principais efetores que contribuem para suas atividades te- rapêuticas (Oflazoglu E, et al. Br J Cancer. 2009 Jan 13;100(1):113-7. Epub 9 de Dezembro de 2008). Visto que SGN-40 é um agonista parcial e requer CD40L expressada em células T, SGN-40 pode ter capacidade limitada capacidade para completamente estimular a resposta imune antitumoral.

[0016]Consequentemente, permanece uma necessidade na técnica por novos produtos imunoterapêuticos que alvejam CD40 e que agem como agonista para este alvo, ativam células dendríticas e inspeção imune e que ativam ADCC, desse modo fornecendo propriedades anticâncer melhoradas.

Breve Sumário

[0017]Um aspecto da presente divulgação fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que se liga a CD40 humana, compreendendo (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a região VHCDR1 apresentada a SEQ ID NO: 3, a região VHCDR2 apresentada na SEQ ID NO: 4, e a região VHCDR3 apresentada na SEQ ID NO: 5; e (ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a região VLCDR1 apresentada na SEQ ID NO: 6, a região VLCDR2 apresentada na SEQ ID NO: 7, e a região VLCDR3 apresentada na SEQ ID NO: 8; ou uma variante do dito anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve idênticas às regiões variáveis de cadeia pesada e leve de (i) e (ii) exceto para até 8 substituições de aminoácido nas ditas regiões CDR. Em uma modalidade dos anticorpos divulgados aqui, a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 1. Em uma outra modalidade, a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 2.

[0018]Um outro aspecto da presente divulgação fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade deste aspecto, o anticorpo isolado, ou fragmento de ligação a antígeno deste compreende uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 2. Em uma outra modalidade deste aspecto, o anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 2.

[0019]Ainda um outro aspecto da presente divulgação fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade deste aspecto, o anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com o antígeno deste compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 1.

[0020]Em certas modalidades, os anticorpos isolados como divulgado aqui são humanizados. Regiões variáveis de anticorpo humanizado ilustrativas são apresentadas na sequência de aminoácido da região VH da SEQ ID NO: 9 e na sequência de aminoácido da região VL da SEQ ID NO: 10.

[0021]Em uma modalidade, um anticorpo isolado divulgado aqui pode ser anticorpo de cadeia única, um ScFv, um anticorpo univalente que carece de uma região de dobradiça, um minicorpo, um Fab, um fragmento Fab’, ou um fragmento F(ab’)2. Em certas modalidades, os anticorpos aqui são anticorpos integrais.

[0022]Em uma outra modalidade, os anticorpos isolados como descrito aqui compreendem um domínio constante de IgG humana, tal como, mas não limitado a um domínio CH1 de IgG1 ou uma região Fc de IgG1.

[0023]Uma outra modalidade da divulgação fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que compete com os anticorpos anti- CD40 descritos aqui pela ligação a CD40 humana.

[0024]Em um aspecto desta divulgação, o anticorpo isolado, ou fragmento de ligação a antígeno deste, que se liga a CD40, liga com uma KD de 0,96 nM ou mais baixa. Em uma outra modalidade, o anticorpo isolado, ou fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40, liga com uma Kd entre 1,1 nM e 0,90 nM. Em uma outra modalidade, o anticorpo isolado, ou fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40, liga com uma Kd de cerca de 1,2, 1,1, 1,0, 0,99, 0,98, 0,97, 0,96, 0,95, 0,94, 0,93, 0,92, 0,91, 0,90, 0,85, ou cerca de 0,80 nM. Em uma outra modalidade, o anticorpo liga-se a CD40 com uma Kd de cerca de 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, ou 1,3 nM.

[0025]Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação a antígeno deste como descrito aqui, em que o anticorpo isolado, ou fragmento de ligação a antígeno deste: bloqueia a ligação de CD40 a CD40L; é um agonista de CD40; ativa células apresentadoras de antígeno; estimula a liberação de citocina das células apresentadoras de antígeno; induz apoptose de célula tumoral; inibe a proliferação de célula tumoral; mata células tumorais via indução de funções efetoras selecionadas do grupo consistindo em, citotoxicidade dependente de complemento, e fagocitose celular dependente de anticorpo; estimula respostas de célula T antitumoral; reduz os tumores estabelecidos; inibe tumores resistentes a rituximabe; ou uma combinação de qualquer um ou mais dos anteriormente mencionados.

[0026]Um outro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação com o antígeno deste, que liga-se a CD40, compreendendo: (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a VH CDR1, a VHCDR2, e VHCDR3 de qualquer uma das regiões VH mostradas na Figura 16; e (ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a VLCDR1, a VLCDR2, e a região VLCDR3 da região VL correspondente de qualquer uma das regiões VL mos- tradas na Figura 16; ou uma variante do dito anticorpo, ou um fragmento de ligação com o antígeno deste, compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve idênticas às regiões variáveis de cadeia pesada e leve de (i) e (ii) exceto para até 8 substituições de aminoácido nas ditas regiões CDR.

[0027]Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação com o antígeno deste que liga-se a CD40, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo qualquer uma das regiões VH mostradas na Figura 16. Em uma modalidade um tal anticorpo compreende ainda uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à região VL correspondente como mostrado na Figura 16. Em uma outra modalidade, um tal anticorpo ou fragmento de ligação com o antígeno deste compreende ainda a região variável de cadeia leve correspondente como mostrado na Figura 16.

[0028]Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação com o antígeno deste que liga-se a CD40, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo qualquer uma das regiões VL mostradas na Figura 16. Em uma modalidade um tal anticorpo compreende ainda uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à região VH correspondente como mostrado na Figura 16. Em uma outra modalidade, um tal anticorpo ou fragmento de ligação com o antígeno deste compreende ainda a região variável de cadeia pesada correspondente como mostrado na Figura 16.

[0029]A presente divulgação também fornece polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação a antígeno destes como divulgado aqui.

[0030]A presente divulgação também fornece composições compreendendo um veículo fisiologicamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação a antígeno deste como descrito aqui.

[0031]Um outro aspecto da presente divulgação fornece um método para tratar um paciente tendo um câncer, compreendendo administrar ao paciente uma composição compreendendo um veículo fisiologicamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação a antígeno deste como descrito aqui, desse modo tratando o câncer. Em certas modalidades, o câncer é associado com expressão de CD40 aberrante. Em outras modalidades, o câncer é selecionado do grupo consistindo em linfomas não Hodgkin, lin- foma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crônicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiplo, carcinomas do pâncreas, cólon, intestino gástrico, próstata, bexiga, rim, ovário, cérvix, mama, pulmão, nasofaringe, melanoma maligno e NHL resistente a rituximabe e leucemias.

[0032]Um outro aspecto da presente divulgação fornece um método para tratar um paciente tendo câncer e/ou doença autoimune, e/ou doença inflamatória, compreendendo administrar ao paciente uma composição compreendendo um veículo fisiologicamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação a antígeno deste como descrito aqui, desse modo tratando o paciente tendo doenças autoimunes e inflamatórias.

[0033]Um outro aspecto da presente divulgação fornece um método para melhorar os sintomas em um paciente tendo câncer, e/ou doença autoimune e/ou doença inflamatória, compreendendo administrar ao paciente uma composição compreendendo um veículo fisiologicamente aceitável e uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um anticorpo anti-CD40 ou fragmento de ligação a antígeno deste como descrito aqui, desse modo melhorando os sintomas no paciente tendo câncer, e/ou doenças autoimunes e/ou inflamatórias.

[0034]Um outro aspecto da presente divulgação fornece anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compre-endendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 11. Em uma modalidade, o anticorpo isola-do, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 11 e compreende uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 22 ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 22. Em certas modalidades, um anticorpo isolado descrito aqui compreende a cadeia leve como apresentado na SEQ ID NO: 22 e compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 11.

[0035]Um outro aspecto da presente divulgação fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 13. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 24. Em uma modalidade, a cadeia leve compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 24.

[0036]Um outro aspecto da presente divulgação fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 24. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de amino- ácido apresentada na SEQ ID NO: 24 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 13.

[0037]Em certos aspectos, o anticorpo isolado, ou fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 17. Em uma modalidade, o anticorpo isolado que liga-se a CD40 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 28. Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 28.

[0038]Um outro aspecto da divulgação fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 28. Em uma modalidade, o anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que se liga a CD40 humana, compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 28 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 17.

[0039]Um outro aspecto da divulgação fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoáci- do apresentada na SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade, o anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 30. Em uma modalidade particular, a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 30.

[0040]Ainda um outro aspecto da presente divulgação fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 30. Em uma modalidade, o anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 30 e uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 19.

[0041]Um outro aspecto da presente divulgação fornece um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, que liga-se a CD40 humana, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende região variável de cadeia pesada CDRs e uma região variável de cadeia leve que compreende região variável de cadeia leve correspondente CDRs, em que as CDRs são como mostrado na Figura 16.

Breve Descrição das Sequências

[0042]SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácido da região VH do anticorpo anti-CD40 de coelho R-8.

[0043]SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácido da região VL do anticorpo anti-CD40 de coelho R-8.

[0044]SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácido da região VHCDR1 do anticorpo anti-CD40 de coelho R-8.

[0045]SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácido da região VHCDR2 do anticorpo anti-CD40 de coelho R-8.

[0046]SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácido da região VHCDR3 do anticorpo anti-CD40 de coelho R-8.

[0047]SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácido da região VLCDR1 do anticorpo anti-CD40 de coelho R-8.

[0048]SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácido da região VLCDR2 do anticorpo anti-CD40 de coelho R-8.

[0049]SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácido da região VLCDR3 do anticorpo anti-CD40 de coelho R-8.

[0050]SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácido da região VH de APX005, a versão humanizada do anticorpo anti-CD40 de coelho R-8, sem um peptídeo de sinal.

[0051]SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácido da região VL de APX005, a versão humanizada do anticorpo anti-CD40 de coelho R-8, sem um pep- tídeo de sinal.

[0052]SEQ ID NOs: 11 a 21 e 33 a 44 são sequências de aminoácido de cadeia pesada de candidatos de anticorpo anti-CD40 de coelho que mostraram atividade funcional (Veja a Figura 16).

[0053]SEQ ID NOs: 22 a 32 e 45 a 56 são sequências de aminoácido de cadeia leve de candidatos de anticorpo anti-CD40 de coelho que mostraram atividade funcional (Veja a Figura 16).

[0054]SEQ ID NOs: 57 a 79 são as sequências de aminoácido de VHCDR1 para os anticorpos anti-CD40 mostrados na Figura 16.

[0055]SEQ ID NOs: 80 a 102 são as sequências de aminoácido de VHCDR2 para os anticorpos anti-CD40 mostrados na Figura 16.

[0056]SEQ ID NOs: 103 a 125 são as sequências de aminoácido de VHCDR3 para os anticorpos anti-CD40 mostrados na Figura 16.

[0057]SEQ ID NOs: 126 a 148 são as sequências de aminoácido de VLCDR1 para os anticorpos anti-CD40 mostrados na Figura 16.

[0058]SEQ ID NOs: 149 a 171 são as sequências de aminoácido de VLCDR2 para os anticorpos anti-CD40 mostrados na Figura 16.

[0059]SEQ ID NOs: 172 a 194 são as sequências de aminoácido de VLCDR3 para os anticorpos anti-CD40 mostrados na Figura 16.

Breve Descrição dos Desenhos

[0060]As Figuras 1A a 1D mostram os resultados da triagem de anticorpos agonistas medindo-se a maturação de DC e ativação de célula T como descrito no Exemplo 1. 1A: expressão de CD83; 1B: expressão de CD80; 1C: expressão de CD86; 1D: proliferação de célula T em uma reação linfocítica mista.

[0061]A Figura 2 é um gráfico que mostra a comparação de candidatos principais na inibição de proliferação de célula de Ramos.

[0062]A Figura 3 é um gráfico de barras que mostra os resultados de um ensaio de ADCC. Razão de efetor (PBMC humana):célula alvo (célula de Ramos) de 40:1.

[0063]A Figura 4A e Figura 4B são gráficos que mostram os resultados da triagem in vivo da atividade antitumoral de candidatos anti-CD40.

[0064]A Figura 5 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio ELISA demonstrando que APX005 seletivamente liga-se a CD40 mas não a outros membros da família de TNFR.

[0065]A Figura 6 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio ELISA demonstrando que APX005 bloqueia a ligação de CD40L a CD40.

[0066]A Figura 7 é um gráfico que mostra que APX005 não é incorporado na ligação a células positivas de CD40.

[0067]A Figura 8A e Figura 8B são gráficos que mostram ADCC mediada por APX005 de células tumorais de Ramos (A) e Daudi (B) positivas de CD40.

[0068]A Figura 9A e Figura 9B são gráficos que mostram a inibição in vitro da proliferação de célula tumoral de Ramos por APX005. Painel A: sem reticulação de Fc; Painel B: com reticulação de Fc.

[0069]A Figura 10 é um gráfico de barras que mostra a indução da ativação de DC por APX005.

[0070]As Figuras 11A e 11B mostram que APX005 liga-se a CD40 humana e de macaco, mas não a CD40 de camundongo.

[0071]A Figura 12A é um gráfico que mostra a inibição de APX005 do crescimento de tumor em um modelo de Ramos. A Figura 12B é um gráfico de barras que mostra níveis de IgG humana sérica em camundongos no dia 34, dois dias depois da última dosagem.

[0072]A Figura 13A e 13B são gráficos que mostram a inibição de tumores pré-tratados e resistentes a Rituximabe em um modelo de camundongo.

[0073]A Figura 14 é um gráfico que mostra a inibição de APX005 do crescimento de tumor no modelo de camundongo de Raji.

[0074]A Figura 15 é um gráfico que mostra atividade antitumoral potente de APX005 contra mieloma múltiplo humano no modelo de xenoenxerto de IM-9.

[0075]As Figuras 16A a 16L são um alinhamento de sequência de sequências de anticorpo de cadeia pesada (16A-16F) e leve (16G-16L) anti-CD40 de coelho. CDRs1-3 de cadeia pesada e leve são sublinhadas. As SEQ ID NOs são como segue: Cadeia pesada: R-3 e R-6: SEQ ID NOs: 11, 12; R-8: SEQ ID NO: 1; R-9, - 16, -18, -24, -33, -36, 19-21, -45, -59: SEQ ID NOs: 13 a 21, respectivamente; R-2, R-5, R-7, R-10, R-12, R-20, R-26, R-30, R-35, 19-35, 19-41, 19-57: SEQ ID NOs: 33 a 44, respectivamente. Cadeia leve: R-3 e R-6: SEQ ID NOs: 22 e 23; R-8: SEQ ID NO: 2; R-9, -16, -18, -24, -33, -36, 19-21, -45, -59: SEQ ID NOs: 24 a 32, respectivamente; R-2, R-5, R-7, R-10, R-12, R-20, R-26, R-30, R-35, 19-35, 19-41, 19-57: SEQ ID NOs: 45 a 56, respectivamente. As sequências de aminoácido incluem o peptídeo de sinal de VH e VL. As sequências de aminoácido de VHCDR e VLCDR de R-8 são apresentadas nas SEQ ID NOs: 3 a 8. As sequências de aminoácido de VHCDR e as sequências de aminoácido de VLCDR para os anticorpos remanescentes são apresentadas nas SEQ ID NOs: 57 a 125 e SEQ ID NOs: 126 a 194, respectivamente.

[0076]As Figuras 17A e 17B mostram a inibição do crescimento de tumor no modelo de ramos por APX005 quando comparado com SGN-40 e Rituximabe.

[0077]As Figuras 18A e 18B mostram a inibição por APX005 do crescimento de tumor em modelo de xenoenxerto de linfoma de Namalwa humano resistente a rituximabe.

Descrição Detalhada

[0078]A presente divulgação refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno destes que especificamente ligam-se a CD40 em particular anticorpos tendo especificidade epitópica específica e propriedades funcionais. Uma modalidade da invenção abrange anticorpos humanizados específicos e fragmentos destes capazes de ligar-se a CD40 e funcionam como um agonista de CD40 induzindo- se/realçando-se sinalização de célula a jusante mediada por CD40 e efeitos biológicos. Em modalidades mais específicas da invenção, os anticorpos descritos aqui especificamente ligam-se a CD40 com afinidade muito alta, tal como uma afinidade de pelo menos entre 980 e 950 picomolar, pelo menos entre 970 e 950 picomolar, e em certas modalidades com uma afinidade de 960 picomolar. Os anticorpos descritos aqui, entre outros atributos, induzem a sinalização de CD40 em células tumorais, ativam células dendríticas e inspeção imune, ativam a citotoxicidade celular depen- dente de anticorpo (ADCC) contra células tumorais, bloqueiam a ligação de CD40 a CD40L; têm atividade agonística de CD40; ativam células apresentadoras de antí- geno; estimulam a liberação de citocina de células apresentadoras de antígeno; induzem a apoptose de célula tumoral; inibem a proliferação de célula tumoral; matam células tumorais via indução de funções efetoras incluindo mas não limitadas a ADCC, CDC e ADCP; estimulam respostas de célula T antitumoral; reduzem tumores estabelecidos; e inibem tumores resistentes a rituximabe. Os anticorpos descritos aqui podem ter ou induzem uma combinação de qualquer um ou mais destes atributos ou atividades.

[0079]Modalidades da invenção pertencem ao uso de anticorpos anti-CD40 ou fragmentos de ligação a antígeno destes para a diagnose, avaliação e tratamento de doenças e transtornos associados com CD40 ou expressão aberrante destes. Os anticorpos de assunto são usados no tratamento ou prevenção de cânceres incluindo, mas não limitados a, linfomas não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfo- cíticas crônicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mi- eloma múltiplo, carcinomas da bexiga, rim ovário, cérvix, mama, pulmão, nasofarin- ge, melanoma maligno e NHL resistente a rituximabe e leucemias, doenças autoi- munes e doenças inflamatórias entre outras doenças.

[0080]A prática da presente invenção utilizará, a menos que indicado especificamente ao contrário, métodos convencionais de virologia, imunologia, microbiolo- gia, biologia molecular e técnicas de DNA recombinante dentro da habilidade da técnica, muitos dos quais são descritos abaixo para o propósito de ilustração. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Veja, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology ou Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.Y.(2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a Edição, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Method, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) e outras referências semelhantes.

[0081]Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um,” “uma” e “o”, “a” incluem referências no plural a menos que o conteúdo claramente dite de outro modo.

[0082]Por todo este relatório descritivo, a menos que o contexto requeira de outro modo, a palavra “compreendem”, ou variações tais como “compreende” ou “compreendendo”, será entendida a implicar a inclusão de um elemento ou número inteiro ou grupo estabelecido de elementos ou números inteiros mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros.

[0083]Cada modalidade neste relatório descritivo deve ser aplicada por analogia a cada outra modalidade a menos que expressamente estabelecido de outro modo.

[0084]Técnicas padrão podem ser usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, e cultura de tecido e transformação (por exemplo, eletropora- ção, lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com especificações do fabricante ou como comumente realizado na técnica ou como descrito aqui. Estas e técnicas e procedimentos relacionados podem ser geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e debatidas por todo o presente relatório descritivo. A menos que definições específicas sejam fornecidas, a nomenclatura utilizada em relação a, e os pro-cedimentos e técnicas laboratoriais de, biologia molecular, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descritos aqui são aqueles bem conhecidos e comumente usados na técnica. Técnicas padrão podem ser usadas para tecnologia recombinante, biologia molecular, microbiologia, sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, e liberação, e tratamento de pacientes.

[0085]Modalidades da presente invenção referem-se a anticorpos que ligam- se a CD40. Em particular, os anticorpos descritos aqui especificamente ligam-se a CD40 com afinidade inesperadamente alta, realçam a atividade de sinalização de CD40, ativam o sistema imune, ativam ADCC e têm utilidade terapêutica para o tratamento de doenças associadas com CD40 de expressão aberrante.

[0086]Sequências de anticorpos ilustrativos, ou fragmentos de ligação a an- tígeno, ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs) destes, são apresentados nas SEQ ID NOs: 1 a 194.

[0087]Como é bem conhecido na técnica, um anticorpo é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, tal como um carboidrato, po- linucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um sitio de reconhecimento de epítopo, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Como usado aqui, o termo abrange não apenas anticorpos policlonais ou monoclo- nais intactos, mas também fragmentos destes (tais como dAb, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadeia única (ScFv), variantes sintéticas destes, variantes que ocorrem naturalmente, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo com um fragmento de ligação a antígeno da especificidade necessária, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de ligação a antígeno ou fragmento (sitio de reconhecimento de epítopo) da especificidade necessária. “Diacorpos”, fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão genética (WO94/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993) são também uma forma particular de anticorpo considerado aqui. Minicorpos compreendendo um scFv unido a um domínio de CH3 são também incluídos aqui (S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996). Ver por exemplo, Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989); Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA, 85, 58795883, 1988); PCT/US92/09965; WO94/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993; Y. Reiter et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996; S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996.

[0088]O termo “fragmento de ligação a antígeno” como usado aqui refere-se a um fragmento de polipeptídeo que contém pelo menos uma CDR de uma cadeia leve e/ou pesada de imunoglobulina que liga-se ao antígeno de interesse, em particular a CD40. Sob esse aspecto, um fragmento de ligação a antígeno dos anticorpos aqui descritos pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, ou todas as 6 CDRs de uma sequência de VH e VL apresentada aqui de anticorpos que ligam CD40. Um fragmento de ligação a antígeno dos anticorpos específicos de CD40 descritos aqui é capaz de ligar-se a CD40. Em certas modalidades, um fragmento de ligação a antígeno ou um anticorpo compreendendo um fragmento de ligação a antígeno, impede ou inibe a ligação de CD40L a CD40. Em certas modalidades, o fragmento de ligação a antí- geno liga-se especificamente a e/ou realça ou modula a atividade biológica de CD40 humana. Tal atividade biológica inclui, mas é não limitada a, sinalização de célula, ativação de células dendríticas,

[0089]O termo “antígeno” refere-se a uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um agente de ligação seletivo, tal como um anticorpo, e adicionalmente capaz de ser usada em um animal para produzir anticorpos capazes de ligar-se a um epítopo deste antígeno. Um antígeno pode ter um ou mais epítopos.

[0090]O termo “epítopo” inclui qualquer determinante, preferivelmente um determinante de polipeptídeo, capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Em certas modalidades, determinantes de epítopo incluem agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforila ou sulfonila, e podem em certas modalidades ter características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específicas. Em certas modalidades, um anticorpo é dito especificamente ligar-se a um an- tígeno quando ele preferencialmente reconhece seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Um anticorpo é dito especificamente ligar-se a um antígeno quando a constante de dissociação no equilíbrio é < 10-7 ou 10-8 M. Em algumas modalidades, a constante de dissociação no equilíbrio pode ser < 10-9 M ou <10-10 M.

[0091]Em certas modalidades, anticorpos e fragmentos de ligação a antíge- no destes como descrito aqui incluem um conjunto de CDR de cadeia pesada e um de cadeia leve, respectivamente interpostos entre um conjunto de região de estrutura (FR) de cadeia pesada e um de cadeia leve que fornecer suporte às CDRs e define o relacionamento espacial das CDRs em relação uma a outra. Como usado aqui, o termo “conjunto de CDR” refere-se às três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve. Prosseguindo do término N de uma cadeia pesada ou leve, estas regiões são denotadas como “CDR1,” “CDR2,” e “CDR3” respectivamente. Um sítio de ligação a antígeno, portanto, inclui seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada uma de uma região V de cadeia pesada e uma de cadeia leve. Um polipeptídeo compreendendo uma CDR única, (por exemplo, uma CDR1, CDR2 ou CDR3) é referido aqui como uma “unidade de reconhecimento molecular.” A análise cristalográfica de vários complexos de antígeno-anticorpo demonstrou que os resíduos de aminoácido de CDRs formam contato extensivo com o antígeno ligado, em que o contato de antígeno mais extensivo é com a CDR3 de cadeia pesada. Assim, as unidades de reconhecimento molecular são principalmente responsáveis pela especificidade de um sítio de ligação a antígeno.

[0092]Como usado aqui, o termo “conjunto de FR” refere-se às quatro sequências de aminoácido de flanqueamento que formam as CDRs de um conjunto de CDR de uma região V de cadeia pesada ou leve. Alguns resíduos de FR podem contatar o antígeno ligado; entretanto, FRs são principalmente responsáveis por dobrar a região V no sítio de ligação a antígeno, particularmente os resíduos de FR diretamente adjacentes às CDRs. Dentro das FRs, certos resíduos de amino e certas características estruturais são muito altamente conservados. Sob esse aspecto, todas as sequências de região V contêm um circuito de dissulfeto interno em torno de 90 resíduos de aminoácido. Quando as regiões V dobram em um sítio de ligação, as CDRs são exibidas como motivos de circuito projetados que formam uma superfície de ligação de antígeno. Geralmente é reconhecido que existem regiões estruturais conservadas de FRs que influenciam a forma dobrada dos circuitos de CDR em certas estruturas “canônicas” — apesar da sequência de aminoácido de CDR precisa. Além disso, certos resíduos de FR são conhecidos participar em contatos de inter- domínio não covalentes que estabilizam a interação das cadeias pesadas e leves de anticorpo.

[0093]As estruturas e locais de domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinados por referência a Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a Edição. US Department of Health and Human Services. 1987, e atualizações destes, agora disponíveis na Internet (immuno.bme.nwu.edu).

[0094]Um “anticorpo monoclonal” refere-se a uma população de anticorpo homogênea em que o anticorpo monoclonal é compreendido de aminoácidos (que ocorrem naturalmente e que não ocorrem naturalmente) que estão envolvidos na ligação seletiva de um epítopo. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único epítopo. O termo “anticorpo monoclonal” abrange não apenas anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais de tamanho natural, mas também fragmentos destes (tais como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadeia única (ScFv), variantes destes, proteínas de fusão compreendendo uma porção de ligação de antígeno, anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos monoclonais quiméricos, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobuli- na que compreende um fragmento de ligação a antígeno (sitio de reconhecimento de epítopo) da especificidade necessária e a capacidade para ligar-se a um epítopo. Ele não é intencionado a ser limitado quanto à fonte do anticorpo ou à maneira em que ele é feito (por exemplo, por hibridoma, seleção de fago, expressão recombinan- te, animais transgênicos, etc.). O termo inclui imunoglobulinas integrais assim como os fragmentos etc. descritos acima sob a definição de “anticorpo”.

[0095]A enzima proteolítica papaína preferencialmente cliva moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, dois dos quais (os fragmentos F(ab)) compreendem um heterodímero covalente que inclui um sítio de ligação a antígeno intacto. A enzima pepsina é capaz de clivar moléculas de IgG para fornecer vários fragmentos, incluindo o fragmento F(ab’)2 que compreende ambos os sítios de ligação a an- tígeno. Um fragmento Fv para o uso de acordo com certas modalidades da presente invenção pode ser produzido por clivagem proteolítica preferencial de uma IgM, e em ocasiões raras de uma molécula de imunoglobulina IgG ou IgA. Fragmentos Fv são, entretanto, mais comumente derivados usando técnicas recombinantes conhecidas na técnica. O fragmento Fv inclui um heterodímero de VH::VL não covalente incluindo um sítio de ligação a antígeno que retém muito das capacidades de reco-nhecimento e ligação de antígeno da molécula de anticorpo nativa. Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706-2710; e Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096.

[0096]Em certas modalidades, anticorpos de Fv ou scFV de cadeia única são considerados. Por exemplo, corpos capa (Ill et al., Prot. Eng. 10: 949-57 (1997); minicorpos (Martin et al., EMBO J 13: 5305-9 (1994); diacorpos (Holliger et al., PNAS 90: 6444-8 (1993); ou Janusins (Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-59 (1991) e Traunecker et al., Int. J. Cancer Suppl. 7: 51-52 (1992), podem ser preparados usando técnicas de biologia molecular padrão seguindo os ensinamentos do presente pedido com referência a seleção de anticorpos tendo a especificidade desejada. Ainda em outras modalidades, anticorpos biespecíficos ou quiméricos podem ser fabricados que abrangem os ligantes da presente divulgação. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode compreender CDRs e regiões de estrutura de diferentes anticorpos, enquanto anticorpos biespecíficos podem ser gerados que ligam-se especificamente a CD40 através de um domínio de ligação e a uma segunda molécula através de um segundo domínio de ligação. Estes anticorpos podem ser produzidos através de técnicas de biologia molecular recombinantes ou podem ser fisicamente conjugados entre si.

[0097]Um polipeptídeo de Fv de cadeia única (sFv) é um heterodímero de VH::VL covalentemente ligado que é expressado de uma fusão de gene incluindo genes que codificam VH e VL ligados por um ligador de codificação de peptídeo. Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883. Vários métodos foram descritos para discernir estruturas químicas para converter as cadeias de polipeptí- deo leves e pesadas naturalmente agregadas — mas quimicamente separadas de uma região V de anticorpo em uma molécula de sFv que dobrará em uma estrutura tridimensional substancialmente similar à estrutura de um sítio de ligação a antígeno. Veja, por exemplo, as Pat. U.S. Nos 5.091.513 e 5.132.405, de Huston et al.; e Pat. U.S. No 4.946.778, de Ladner et al.

[0098]Em certas modalidades, um anticorpo de ligação de CD40 como descrito aqui está na forma de um diacorpo. Diacorpos são multímeros de polipeptídeos, cada polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia leve de imunoglobulina e um segundo domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia pesada de imunoglobulina, os dois do mínios sendo ligados (por exemplo, por um ligador de peptídeo) mas incapaz de associar entre si para formar um sítio de ligação de antígeno: sítios de ligação de antí- geno são formados pela associação do primeiro domínio de um polipeptídeo dentro do multímero com o segundo domínio de um outro polipeptídeo dentro do multímero (WO94/13804).

[0099]Um fragmento dAb de um anticorpo consiste em um domínio de VH (Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)).

[00100]Onde anticorpos biespecíficos devem ser usados, estes podem ser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser fabricados em uma variedade de modos (Holliger, P. e Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por exemplo, preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos, ou podem ser qualquer um dos fragmentos de anticorpo biespecíficos mencionados acima. Diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, usando apenas domínios variáveis, potencialmente reduzindo os efeitos da reação anti-idiotípica.

[00101]Diacorpos biespecíficos, em oposição a anticorpos biespecíficos integrais, também podem ser particularmente úteis porque eles podem ser facilmente construídos e expressados em Diacorpos de E. coli. (e muitos outros polipeptídeos tais como fragmentos de anticorpo) de especificidades de ligação apropriadas podem ser facilmente selecionadas usando exibição de fago (WO94/13804) das bibliotecas. Se um braço do diacorpo deve ser mantido constante, por exemplo, com uma especificidade dirigida contra antígeno X, então uma biblioteca pode ser fabricada onde o outro braço é variado e um anticorpo de especificidade apropriada selecionado. Anticorpos biespecíficos integrais podem ser fabricados por engenharia de knobs-into-holes (J. B. B. Ridgeway et al., Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

[00102]Em certas modalidades, os anticorpos descritos aqui podem ser fornecidos na forma de um UniBody®. Um UniBody® é um anticorpo de IgG4 com a região de dobradiça removida (Veja GenMab Utrecht, The Netherlands; ver também, por exemplo, US20090226421). Esta tecnologia de anticorpo proprietária cria um formato de anticorpo menor, estável com uma janela terapêutica mais longa antecipada do que formatos de anticorpo pequenos correntes. Anticorpos de IgG4 são considerados inertes e assim não interagem com o sistema imune. Anticorpos de IgG4 completamente humanos podem ser modificados eliminando-se a região de dobradiça do anticorpo para obter fragmentos de meia molécula tendo propriedades de estabilidade distintas em relação à IgG4 intacta correspondente (GenMab, Utrecht). A metade da molécula de IgG4 deixa apenas uma área no UniBody® que pode ligar-se a antígenos cognatos (por exemplo, alvos de doença) e o UniBody® portanto liga-se univalentemente a apenas um sítio em células alvos. Para certos antíge- nos da superfície de célula do câncer, esta ligação univalente pode não estimular as células do câncer a crescer como pode ser observado usando anticorpos bivalentes tendo a mesma especificidade de antígeno, e consequentemente a tecnologia de UniBody® pode fornecer opções de tratamento para alguns tipos de câncer que podem ser refratários para o tratamento com anticorpos convencionais. O tamanho pequeno do UniBody® pode ser um grande benefício quando do tratamento de algumas formas de câncer, considerando a melhor distribuição da molécula sobre tumores sólidos maiores e eficácia potencialmente crescente.

[00103]Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação podem tomar a forma de um nanocorpo. Nanocorpos são codificados por genes únicos e são eficientemente produzidos em quase todos os hospedeiros procarióticos e euca- rióticos por exemplo, E. coli (Veja por exemplo, Pat. U.S. No 6.765.087), bolores (por exemplo Aspergillus ou Trichoderma) e levedura (por exemplo Saccharomyces, Kluyvermyces, Hansenula ou Pichia (Veja por exemplo, Pat. U.S. No 6.838.254). O processo de produção é escalonável e quantidades de multi-quilograma de nanocor- pos foram produzidas. Nanocorpos podem ser formulados como uma solução pronta para o uso tendo uma vida de prateleira longa. O método de Nanoclone (Veja, por exemplo, WO 06/079372) é um método proprietário para gerar Nanocorpos contra um alvo desejado, com base em seleção de alto rendimento automatizada de células B.

[00104]Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD40 ou fragmentos de ligação a antígeno destes como divulgado aqui são humanizados. Isto refere-se a uma molécula quimérica, geralmente preparada usando técnicas recombinantes, tendo um sítio de ligação a antígeno derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana e a estrutura da molécula de imunoglobulina remanescente com base na estrutura e/ou sequência de um imunoglobulina humana. O sítio de ligação a antígeno pode compreender domínios variáveis completos fundidos sobre domínios constantes ou apenas as CDRs enxertadas sobre regiões de estrutura apropriadas nos domínios variáveis. Sítios de ligação de epítopo podem ser do tipo selvagem ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácido. Isto elimina a região constante como um imunógeno em indivíduos humanos, mas a possibilidade de uma resposta imune à região variável estranha permanece (LoBuglio, A. F. et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:4220-4224; Queen et al., PNAS (1988) 86:1002910033; Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327). Métodos ilustrativos para humanização dos anticorpos anti-CD40 divulgados aqui incluem os métodos descritos na Patente U.S. no 7.462.697. Anticorpos humanizados ilustrativos de acordo com certas modalidades da presente invenção compreendem as sequências humanizadas fornecidas nas SEQ ID NOs: 9 e 10.

[00105]Um outro método foca não apenas em fornecer regiões constantes derivadas de ser humano, mas modificar as regiões variáveis igualmente de modo a reforma-las tão rigorosamente quanto possível à forma humana. É conhecido que as regiões variáveis tanto das cadeias pesadas quanto leves contêm três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que variam em resposta aos epítopos em questão e determinam a capacidade de ligação, flanqueadas por quatro regiões de estrutura (FRs) que são relativamente conservadas em uma espécie dada e que supostamente fornecem um andaime para as CDRs. Quando anticorpos não humanos são preparados com respeito a um epítopo particular, as regiões variáveis podem ser “reformadas” ou “humanizadas” por CDRs de enxerto derivadas de anticorpo não humano nas FRs presentes no anticorpo humano a ser modificado. A aplicação deste método a vários anticorpos foi relatada por Sato, K., et al., (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L., et al., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen, M., et al., (1988) Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A., et al., (1991) Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H., et al., (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124134; Gorman, S. D., et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4181-4185; Tempest, P. R., et al., (1991) Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S., et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Carter, P., et al., (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-4289; e Co, M. S. et al., (1992) J Immunol 148:1149-1154. Em algumas modalidades, anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado que contém todas as seis CDRs dos anticorpos de camundongo). Em outras modalidades, anticorpos humanizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco, seis) que são alteradas com respeito ao anticorpo original, que também são denominadas uma ou mais CDRs “derivadas de” uma ou mais CDRs do anticorpo original.

[00106]Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação podem ser anticorpos quiméricos. Sob esse aspecto, um anticorpo quimérico é compreendido de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo anti-CD40 operavelmen- te ligado ou de outro modo fundido a uma porção de Fc heteróloga de um anticorpo diferente. Em certas modalidades, o domínio de Fc heterólogo é de origem humana. Em outras modalidades, o domínio de Fc heterólogo pode ser de uma classe de Ig diferente do anticorpo precursor, incluindo IgA (incluindo as subclasses IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (incluindo as subclasses IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), e IgM. Em outras modalidades, o domínio de Fc heterólogo pode ser compreendido de domínios CH2 e CH3 de uma ou mais das classes de Ig diferentes. Como observado acima com referência aos anticorpos humanizados, o fragmento de ligação a antígeno anti- CD40 de um anticorpo quimérico pode compreender apenas uma ou mais das CDRs dos anticorpos descritos aqui (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 CDRs dos anticorpos descritos aqui), ou pode compreender um domínio variável inteiro (VL, VH ou ambos).

[00107]Em certas modalidades, um anticorpo de ligação a CD40 compreende uma ou mais das CDRs dos anticorpos descritos aqui. Sob esse aspecto, foi mostrado em alguns casos que a transferência da única VHCDR3 de um anticorpo pode ser realizada enquanto mantendo ainda a ligação específica desejada (Barbas et al., PNAS (1995) 92: 2529-2533). Ver também, McLane et al., PNAS (1995) 92:5214-5218, Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:2161-2162.

[00108]Marks et al (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) descrevem métodos de produzir repertórios de domínios variáveis de anticorpo em que iniciadores de consenso dirigidos a ou adjacentes à extremidade 5’ da área de domínio variável são usados em combinação com iniciadores de consenso para a terceira região de estrutura de genes de VH humanos para fornecer um repertório de domínios variáveis de VH que carecem de uma CDR3. Marks et al descrevem ainda como este repertório pode ser combinado com uma CDR3 de um anticorpo particular. Usando técnicas análogas, as sequências derivadas de CDR3 dos anticorpos presentemente descritos podem ser misturadas com repertórios de domínios de VH ou VL que carecem de uma CDR3, e os domínios de VH ou VL completos misturados combinados com um domínio de VL ou VH cognato para fornecer um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste que liga-se a CD40. O repertório depois pode ser exibido em um sistema de hospedeiro adequado tal como o sistema de exibição de fago da WO92/01047 de modo que anticorpos adequados ou fragmentos de ligação a antí- geno destes podem ser selecionados. Um repertório pode consistir em pelo menos de cerca de 104 membros individuais e acima por várias ordens de magnitude, por exemplo, até cerca de 106 a 108 ou 1010 ou mais membros. Técnicas de mistura ou combinatórias análogas são também divulgadas por Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), que descreve a técnica em relação a um gene de β-lactamase mas observa que o método pode ser usado para a geração de anticorpos.

[00109]Uma outra alternativa é gerar novas regiões de VH ou VL que carregam uma ou mais sequências derivadas de CDR das modalidades da invenção aqui descrita usando mutagênese aleatória de um ou mais genes de VH e/ou VL selecionados para gerar mutações dentro do domínio variável inteiro. Uma tal técnica é descrita por Gram et al (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580), que usaram PCR propensa a erro. Um outro método que pode ser usado é direcionar a mu- tagênese a regiões CDR de genes de VH ou VL. Tais técnicas são divulgadas por Barbas et al., (1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) e Schier et al (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).

[00110]Em certas modalidades, uma VH e/ou VL específica dos anticorpos descritos aqui pode ser usada para triar uma biblioteca do domínio variável complementar para identificar anticorpos com propriedades desejáveis, tais como afinidade aumentada por CD40. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Portolano et al., J. Immunol. (1993) 150:880-887; Clarkson et al., Nature (1991) 352:624-628.

[00111]Outros métodos também podem ser usados para misturar e combinar CDRs para identificar anticorpos tendo atividade de ligação desejada, tal como ligação a CD40. Por exemplo: Klimka et al., British Journal of Cancer (2000) 83: 252260, descrevem um processo de triagem usando uma biblioteca de VL de camundongo e uma de VH humana com CDR3 e FR4 retidas da VH de camundongo. Depois de obter anticorpos, a VH foi triada contra uma biblioteca de VL humana para obter anticorpos que ligaram-se ao antígeno. Beiboer et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:833-849 descrevem um processo de triagem usando uma biblioteca de cadeia pesada de camundongo e uma de cadeia leve humana inteira. Depois de obter os anticorpos, uma VL foi combinada com uma biblioteca de VH humana com a CDR3 do camundongo retida. Anticorpos capazes de ligar-se ao antígeno foram obtidos. Rader et al., PNAS (1998) 95:8910-8915 descrevem um processo similar a Beiboer et al acima.

[00112]Estas técnicas já descritas são, em e a si mesmas, conhecidas como tais na técnica. A pessoa habilitada, entretanto, será capaz de usar tais técnicas para obter anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno destes de acordo com várias modalidades da invenção descrita aqui, usando metodologia de rotina na técnica.

[00113]Também divulgado aqui é um método para obter um domínio de ligação a antígeno de anticorpo específico para o antígeno de CD40, o método compreendendo fornecer por via de adição, supressão, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácido de um domínio de VH apresentado aqui um domínio de VH que é uma variante de sequência de aminoácido do domínio de VH, opcionalmente combinando o domínio de VH assim fornecido com um ou mais domínios de VL, e tesando o domínio de VH ou combinação ou combinações de VH/VL para identificar um membro de ligação específica ou um domínio de ligação a antígeno de anticorpo específico para CD40 e opcionalmente com uma ou mais propriedades desejadas. Os domínios de VL podem ter uma sequência de aminoácido que é substancialmente como apresentado aqui. Um método análogo pode ser utilizado em que uma ou mais variantes de sequência de um domínio de VL divulgado aqui são combinadas com um ou mais domínios de VH.

[00114]Um epítopo que “especificamente liga-se” ou “preferencialmente ligase” (usado permutavelmente aqui) a um anticorpo ou um polipeptídeo é um termo bem entendido na técnica, e métodos para determinar tal ligação específica ou pre- ferencial são também bem conhecidos na técnica. Uma molécula é dito exibir “ligação específica” ou “ligação preferencial” se ela reage ou associa mais frequentemente, mais rapidamente, com duração maior e/ou com afinidade maior com uma célula ou substância particulares do que ela faz com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo “especificamente liga-se” ou “preferencialmente liga-se” a um alvo se ele liga-se com afinidade maior, avidez, mais facilmente, e/ou com duração maior do que ele liga-se a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que especificamente ou preferencialmente liga-se a um epítopo de CD40 é um anticorpo que liga-se a um epítopo de CD40 com afinidade maior, avidez, mais facilmente, e/ou com duração maior do que ele liga-se a outros epítopos de CD40 ou epítopos que não de CD40. Também é entendido lendo-se esta definição que, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epítopo) que especificamente ou preferencialmente liga-se a um pri-meiro alvo pode especificamente ou preferencialmente ligar-se ou não a um segundo alvo. Como tal, “ligação específica” ou “ligação preferencial” não necessariamente requer (embora ela possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, referência à ligação significa ligação preferencial.

[00115]Ligação imunológica geralmente refere-se às interações não covalentes do tipo que ocorrem entre uma molécula de imunoglobulina e um antígeno para os quais a imunoglobulina é específica, por exemplo por via de ilustração e não limitação, como um resultado de atrações eletrostáticas, iônicas, hidrofílicas e/ou hidro- fóbicas ou repulsão, forças estéricas, união de hidrogênio, forças de van der Waals, e outras interações. As interações imunológicas de força, ou afinidade de ligação podem ser expressadas em termos da constante de dissociação (Kd) da interação, em que uma Kd menor representa uma afinidade maior. Propriedades de ligação imunológica de polipeptídeos selecionados podem ser quantificadas usando métodos bem conhecidos na técnica. Um tal método requer medir as taxas de formação e dissociação de complexo de sítio de ligação a antígeno/antígeno, em que estas ta- xas dependem das concentrações dos parceiros de complexo, da afinidade da interação, e de parâmetros geométricos que igualmente influenciam a taxa em ambas as direções. Assim, tanto a “constante de taxa de associação” (Kon) quanto a “constante de taxa de dissociação” (Koff) podem ser determinadas pelo cálculo das concentrações e pelas taxas reais de associação e dissociação. A razão de Koff/Kon permite o cancelamento de todos os parâmetros não relacionados à afinidade, e é assim igual à constante de dissociação Kd. Veja, em geral, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473.

[00116]Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD40 descritos aqui têm uma afinidade de cerca de 100, 150, 155, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 ou 199 picomolar, e em algumas modalidades, os anticorpos podem ter afinidade ainda mais alta por CD40.

[00117]O termo “imunologicamente ativo”, com referência a um epítopo sendo ou “permanecendo imunologicamente ativo”, refere-se à capacidade de um anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-CD40) de ligar-se ao epítopo sob condições diferentes, por exemplo, depois que o epítopo foi submetido a condições de redução e desnaturação.

[00118]Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste de acordo com certas modalidades preferidas do presente pedido pode ser um que compete pela ligação a CD40 com qualquer anticorpo descrito aqui que tanto (i) especificamente liga-se ao antígeno quanto (ii) compreende um domínio de VH e/ou VL divulgado aqui, ou compreende uma CDR3 de VH divulgada aqui, ou uma variante de qualquer um destes. A competição entre anticorpos pode ser avaliada facilmente in vitro, por exemplo usando ELISA e/ou unindo-se uma molécula repórter específica a um anticorpo que pode ser detectado na presença de outros anticorpos não ligados, para permitir a identificação de anticorpos específicos que ligam-se ao mesmo epí- topo ou um epítopo sobreposto. Assim, é fornecido aqui um anticorpo específico ou fragmento de ligação a antígeno deste, compreendendo um sítio de ligação a antí- geno de anticorpo humano que compete com um anticorpo descrito aqui que liga-se a CD40.

[00119]Sob esse aspecto, como usado aqui, os termos “compete com”, “inibe a ligação” e “bloqueia a ligação” (por exemplo, referindo-se à inibição/bloqueio da ligação de CD40L a CD40 ou referindo-se à inibição/bloqueio da ligação de um anticorpo anti-CD40 a CD40) são usados permutavelmente e abrangem tanto inibi- ção/bloqueio parciais quanto completos. A inibição e bloqueio são também intencionados a incluir qualquer diminuição mensurável na ligação de CD40L a CD40 quando em contato com um anticorpo anti-CD40 como divulgado aqui quando comparado ao ligante não em contato com um anticorpo anti-CD40, por exemplo, o bloqueio de CD40L a CD40 em pelo menos cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 %.

[00120]As regiões constantes de imunoglobulinas mostram menos diversidade de sequência do que as regiões variáveis, e são responsáveis por ligar várias proteínas naturais para evocar eventos bioquímicos importantes. Em seres humanos existem cinco classes diferentes de anticorpos incluindo IgA (que inclui as subclasses IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (que inclui as subclasses IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), e IgM. As características distintivas entre estas classes de anticorpo são suas regiões constantes, embora diferenças sutis possam existir na região V.

[00121]A região Fc de um anticorpo interage com vários receptores e ligan- tes de Fc, comunicando um arranjo de capacidades funcionais importantes referidas como funções efetoras. Para IgG a região Fc compreende domínios de Ig CH2 e CH3 e a dobradiça N-terminal levando em CH2. Uma família importante de receptores de Fc para a classe de IgG são os receptores gama de Fc (FCYRS). Estes receptores medeiam a comunicação entre anticorpos e o braço celular do sistema imune (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). Em seres humanos esta família de proteína inclui FCYRI (CD64), incluindo as isoformas FcYRIa, FcYRIb, e FCYRIC; FCYRII (CD32), incluindo as isoformas FcYRIIa (incluindo os alótipos H131 e R131), FcYRIIb (incluindo FcYRIIb-1 e FcYRIIb-2), e FCYRIIC; e FCYRIII (CD16), incluindo as isoformas FcYRIIIa (incluindo os alótipos V158 e F158) e FcYRIIIb (incluindo os alótipos FcYRIIIb-NA1 e FcYRIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Estes receptores tipicamente têm um domínio extracelular que medeia a ligação a Fc, uma região abrangente de membrana, e um domínio intracelular que pode mediar algum evento de sinalização dentro da célula. Estes receptores são expressados em uma variedade de células imunes incluindo monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastócitos, plaquetas, células B, linfócitos granulares grandes, células de Langerhans, células exterminadoras naturais (NK), e células T. A formação do complexo de FC/FCYR recruta estas células efetoras aos sítios de antígeno ligado, tipicamente resultando em eventos de sinalização dentro das células e respostas imunes subsequentes importantes tais como a liberação de mediadores de inflamação, ativação de célula B, endocitose, fagocitose, e ataque citotóxico.

[00122]A capacidade para mediar funções efetoras citotóxicas e fagocíticas é um mecanismo potencial pelo qual os anticorpos destroem as células alvejadas. A reação mediada por célula em que células citotóxico não específicas que expressam FCYRS reconhecem o anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo é referida como citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). A reação mediada por célula em que células citotóxicas não específicas que expressam FcyRs reconhecem o anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente causam fagocitose da célula alvo é referida como fago- citose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP). Todos os FCYRS ligam- se à mesma região em Fc, na extremidade N-terminal do domínio de Cg2 (CH2) e na dobradiça precedente. Esta interação é bem caracterizada estruturalmente (Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749), e várias estruturas do Fc humano ligado ao domínio extracelular de FcYRIIIb humana foram resolvidas (código de acesso de pdb 1E4K) (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273.) (códigos de acesso de pdb 1IIS e 1IIX) (Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477.)

[00123]As diferentes subclasses de IgG têm diferentes afinidades pelos FCYRS, com IgG1 e IgG3 tipicamente ligando-se substancialmente melhor aos receptores do que IgG2 e IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Todos os FCYRS ligam-se à mesma região em IgG Fc, ainda com afinidades diferentes: o aglutinante de afinidade alta FCYRI tem uma Kd para IgG1 de 10-8 M-1, ao passo que os receptores de afinidade baixa FCYRII e FCYRIII geralmente ligam-se em 10-6 e 10-5 respectivamente. Os domínios extracelulares de FcYRIIIa e FcYRIIIb são 96 % idênticos, entretanto FcYRIIIb não tem um domínio de sinalização intracelular. Além disso, ao passo que FcYRI, FcYRIIa/c, e FcYRIIIa são reguladores positivos da ativação provocada por complexo imune, caracterizados por terem um domínio intracelular que tem um motivo de ativação de imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM), FcYRIIb tem um motivo de inibição com base em tirosina do imunorreceptor (ITIM) e é portanto inibitório. Assim os primeiros são referidos como receptores de ativação, e FcYRIIb é referido como um receptor inibitório. Os receptores também diferem em padrão e níveis de expressão em células imunes diferentes. Ainda um outro nível de complexidade é a existência de vários polimorfismos de FcYR no proteoma humano. Um polimorfismo particularmente relevante com significância clínica é V158/F158 FcYRIIIa. IgG1 humana liga-se com afinidade maior ao alótipo de V158 do que ao alótipo de F158. Esta diferença em afinidade, e presumivelmente seu efeito sobre ADCC e/ou ADCP, mostrou ser um determinante significante da eficácia do anticor- po anti-CD20 rituximabe (Rituxan®, uma marca registrada da IDEC Pharmaceuticals Corporation). Pacientes com o alótipo de V158 respondem favoravelmente ao tratamento com rituximabe; entretanto, pacientes com o alótipo de F158 de afinidade mais baixa respondem deficientemente (Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758). Aproximadamente 10 a 20 % de seres humanos são homozigotos de V158/V158, 45 % são heterozigotos de V158/F158, e 35 a 45 % de seres humanos são homozigo- tos de F158/F158 (Lehrnbecher et al., 1999, Blood 94:4220-4232; Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758). Assim 80 a 90 % dos seres humanos são responsores deficientes, isto é, eles têm pelo menos um alelo para o FcYRIIIa de F158.

[00124]A região Fc também está envolvida na ativação da cascata de complemento. Na via de complemento clássica, C1 liga-se com suas subunidades de C1q aos fragmentos Fc de IgG ou IgM, que formaram um complexo com o(s) antíge- no(s). Em certas modalidades da invenção, modificações à região Fc compreendem modificações que alteram (aumentam ou diminuem) a capacidade de um anticorpo específico de CD40 como descrito aqui para ativar o sistema de complemento (Veja por exemplo, Patente U.S. 7.740.847). Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) pode ser realizado (Veja, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)).

[00125]Assim em certas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos anti-CD40 tendo uma região Fc modificada com propriedades funcionais alteradas, tais como atividade de CDC, ADCC, ou ADCP reduzida ou aumentada, ou afinidade de ligação aumentada para um FCYR específico ou meia-vida sérica aumentada. Outras regiões Fc modificadas consideradas aqui são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. publicadas 7.317.091; 7.657.380; 7.662.925; 6.538.124; 6.528.624; 7.297.775; 7.364.731; Pedidos U.S. Publicados US2009092599; US20080131435; US20080138344; e Pedidos Internacionais Publicados WO2006/105338; WO2004/063351; WO2006/088494; WO2007/024249.

[00126]Assim, em certas modalidades, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas são fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. Em certas modalidades, a fusão é com um domínio constante de cadeia pesada de Ig, compreendendo pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2, e CH3. É preferido ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para união de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglo- bulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são cotransfectados em uma célula hospedeira adequada. Isto leva em consideração maior flexibilidade em ajustar as proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo nas modalidades quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção fornecem o rendimento ideal do anticorpo biespecífico desejado. Entretanto, é possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeo em um único vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em razões iguais resulta em rendimentos mais altos ou quando as razões não têm nenhum efeito significante sobre o rendimento da combinação de cadeia desejada.

[00127]Os anticorpos da presente invenção (e fragmentos de ligação a antí- geno e variantes destes) também podem ser modificados para incluir uma etiqueta ou rótulo de epítopo, por exemplo, para o uso em aplicações de purificação ou diagnósticas. Existem muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para fabricar conjugados de anticorpo, incluindo, por exemplo, aqueles divulgados na Pat. U.S. No 5.208.020 ou Patente EP 0 425 235 B1, e Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992). Os grupos de ligação incluem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos lábeis em ácido, grupos fotolábeis, grupos lábeis em peptidase, ou grupos lábeis em esterase, como divulgado nas patentes identificadas acima, os grupos dissulfeto e tioéter sendo preferidos.

[00128]Em uma outra modalidade considerada, um anticorpo específico de CD40 como descrito aqui pode ser conjugado ou operavelmente ligado a um outro composto terapêutico, referido aqui como um conjugado. O conjugado pode ser um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico, uma citocina, um agente anti- angiogênico, um inibidor de tirosina cinase, uma toxina, um radioisótopo, ou outro agente terapeuticamente ativo. Agentes quimioterapêuticos, citocinas, agentes anti- angiogênicos, inibidores de tirosina cinase, e outros agentes terapêuticos foram descritos acima, e todos estes agentes terapêuticos anteriormente mencionados podem encontrar uso como conjugados de anticorpo.

[00129]Em uma modalidade alternada, o anticorpo é conjugado ou opera- velmente ligado a uma toxina, incluindo mas não limitada a toxinas de molécula pequena e toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destes. Toxinas de molécula pequena incluem mas não são limitadas a saporina (Kuroda K, et al., The Prostate 70:12861294 (2010); Lip, WL. et al., 2007 Molecular Pharmaceutics 4:241-251; Quadros EV., et al., 2010 Mol Cancer Ther; 9(11); 3033-40; Polito L., et al. 2009 British Journal of Haematology, 147, 710-718), caliqueamicina, maitansina (Pat. U.S. No 5.208.020), tricoteno, e CC1065. Toxinas incluem mas não são limitadas a RNase, gelonina, enediinas, ricina, abrina, toxina da difteria, toxina do cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas (PE40), toxina de Shigella, toxina de Clostridium perfringens, e proteína antiviral da erva-dos-cancros.

[00130]Em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento de ligação a antí- geno deste da divulgação é conjugado a uma ou mais moléculas maitansinoides. Maitansinoides são inibidores mitotóticos que agem inibindo-se a polimerização de tubulina. Maitansina foi primeiro isolada do arbusto da África Oriental Maytenus ser- rata (Pat. U.S. No 3.896.111). Subsequentemente, foi descoberto que certos micróbios também produzem maitansinoides, tais como maitansinol e ésteres de maitan- sinol C-3 (Pat. U.S. No 4.151.042). Maitansinol sintético e derivados e análogos deste são divulgados, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533. Imunoconjugados contendo maitansi- noides e seu uso terapêutico são divulgados, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos 5.208.020, 5.416.064 e Patente Europeia EP 0 425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) descreveram imunoconjugados compreendendo um maitansinoide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido contra o câncer colorretal humano. O conjugado foi descoberto ser altamente citotó- xico para células de câncer de cólon cultivadas, e mostrou atividade antitumoral em um ensaio de crescimento de tumor in vivo.

[00131]Conjugados de anticorpo-maitansinoide são preparados ligando-se quimicamente um anticorpo a uma molécula de maitansinoide sem diminuir signifi- cantemente a atividade biológica do anticorpo ou da molécula de maitansinoide. Uma média de 3 a 4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticorpo mostrou eficácia em realçar a citotoxicidade de células alvos sem afetar negativamente a função ou solubilidade do anticorpo, embora ainda uma molécula de to- xina/anticorpo seria esperada realçar a citotoxicidade durante o uso do anticorpo nu. Maitansinoides são bem conhecidos na técnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados de fontes naturais. Maitansinoides adequados são divulgados, por exemplo, na Pat. U.S. No 5.208.020 e nas outras patentes e publicações que não de patente referidas aqui acima. Maitansinoides preferidos são maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tais como vários ésteres de maitansinol.

[00132]Um outro conjugado de interesse compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir rupturas de DNA de filamento duplo em concentrações subpicomolares. Análogos estruturais de caliqueamicina que também podem ser usados (Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58:2925-2928) (Pat. U.S. No 5.714.586; Pat. U.S. No 5.712.374; Pat. U.S. No 5.264.586; Pat. U.S. No 5.773.001). Análogos de Dolastatina 10 tais como auristatina E (AE) e monometilauristatina E (MMAE) podem encontrar uso como conjugados para os anticorpos presentemente divulgados, ou variantes destes (Doronina et al., 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84; Francisco et al., 2003 Blood 102(4):1458-65). Toxinas enzimaticamente ativas úteis incluem mas não são limitadas a cadeia de difteria A, fragmentos ativos que não de ligação de toxina da difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restritocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja, por exemplo, PCT WO 93/21232. A presente divulgação considera ainda modalidades em que um conjugado ou fusão são formados entre um anticorpo específico de CD40 como descrito aqui e um composto com atividade nucleolítica, por exemplo uma ribonuclease ou DNA endonuclease tal como uma desoxirribonuclease (DNase).

[00133]Em uma modalidade alternada, um anticorpo aqui divulgado pode ser conjugado ou operavelmente ligado a um radioisótopo para formar um radioconjuga- do. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem, mas não são limitados a 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At, e 212Bi.

[00134]Os anticorpos descritos aqui em certas outras modalidades podem ser conjugados a uma porção terapêutica tal como uma citotoxina (por exemplo, um agente citostático ou citocida), um agente terapêutico ou um elemento radioativo (por exemplo, emissores alfa, emissores gama, etc.). Citotoxinas ou agentes citotó- xicos incluem qualquer agente que é prejudicial às células. Exemplos incluem pacli- taxel/paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomici- na, etoposido, tenoposido, vincristina, vimblastina, colchicina, doxorrubicina, daunor- rubicina, diidróxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos destes. Uma citotoxina exemplar preferida é saporina (disponível da Advanced Targeting Systems, San Diego, CA). Agentes terapêuticos incluem, mas não são limitado a, antimetabólitos (por exemplo, metotre- xato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil dacarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estrepto- zotocina, mitomicina C, e cisdiclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitrami- cina, e antramicina (AMC), e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vim- blastina).

[00135]Além disso, um anticorpo específico de CD40 (incluindo um fragmento funcional deste como fornecido aqui tal como um fragmento de ligação a antíge- no) pode em certas modalidades ser conjugado a porções terapêuticas tais como materiais radioativos ou queladores macrocíclicos úteis para conjugar íons radiome- tálicos. Em certas modalidades, o quelador macricíclico é ácido 1,4,7,10- tetraazaciclododecano-N,N’,N’’,N’’’-tetraacético (DOTA) que pode ser ligado ao anticorpo via uma molécula ligadora. Tais moléculas ligadoras são comumente conhecidas na técnica e descritas em Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; e Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50.

[00136]Ainda em uma outra modalidade, um anticorpo pode ser conjugado a um “receptor” (tal como estreptavidina) para utilização no pré-alvejamento do tumor em que o conjugado de anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguido pela remoção do conjugado não ligado da circulação usando um agente de compensação e depois a administração de um “ligante” (por exemplo, avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo). Em uma modalidade alternada, o anticorpo é conjugado ou operavelmente ligado a uma enzima de modo a utilizar Terapia de Pró-medicamento Mediada por Enzima Dependente de Anticorpo (ADEPT). ADEPT pode ser usada conjugando-se ou operavelmente ligando-se o anticorpo a uma enzima de ativação de pró-medicamento que converte um pró- medicamento (por exemplo, um agente quimioterapêutico de peptidila, ver PCT WO 81/01145) a um medicamento anticâncer ativo. Veja, por exemplo, PCT WO 88/07378 e Pat. U.S. No 4.975.278. O componente enzimático do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de agir em um pró-medicamento em um tal modo de modo a convertê-lo em sua forma citotóxica, mais ativa. Enzimas que são úteis no método destas e modalidades relacionadas incluem mas não são limitadas a fosfatase alcalina útil para converter pró-medicamentos contendo fosfato em medicamentos livres; arilsulfatase útil para converter pró-medicamentos contendo sulfato em medicamentos livres; citosina desaminase útil para converter 5- fluorocitosina não tóxica no medicamento anticâncer, 5-fluorouracila; proteases, tais como serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para converter pró-medicamentos contendo peptídeo em medicamentos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter pró-medicamentos que contêm substituintes de D-aminoácido; enzimas de clivagem de carboidrato tais como D-galactosidase e neuramimidase úteis para converter pró- medicamentos glicosilados em medicamentos livres; beta-lactamase útil para converter medicamentos derivados com D-lactamas em medicamentos livres; e penicili- na amidases, tais como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis para converter medicamentos derivados em seus nitrogênios de amina com grupos feno- xiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em medicamentos livres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como “abzi- mas”, podem ser usados para converter pró-medicamentos em medicamentos ativos livres (Veja, por exemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Conjugados de anti- corpo-abzima podem ser preparados para a liberação da abzima a uma população de célula tumoral.

[00137]Imunoconjugados podem ser fabricados usando uma variedade de agentes de ligação de proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)cicloexano-1- carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adi- pimidato de dimetila HCL), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tal como bis (p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p- diazoniumbenzoil)-etilenodiamino), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato tolueno), e compostos de flúor bis-ativos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Agentes de ligação particulares incluem N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) e N-succinimidil-4-(2- piridiltio)pentanoato (SPP) para levar em consideração uma ligação de dissulfeto. O ligador pode ser um “ligador clivável” que facilita a liberação de um ou mais componentes cliváveis. Por exemplo, um ligador lábil em ácido pode ser usado (Cancer Research 52: 127-131 (1992); Pat. U.S. No 5.208.020).

[00138]Outras modificações dos anticorpos (e polipeptídeos) da invenção são também consideradas aqui. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietilenoglicol, poli- propileno glicol, polioxialquilenos, ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropileno glicol. O anticorpo também pode ser capturado em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacilato), respectivamente), em sistemas de liberação de medicamento co- loidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano- partículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A., Ed., (1980).

[00139]“Veículos” como usado aqui incluem veículos, excipientes, ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos à célula ou mamífero que são expostos a estes nas dosagens e concentrações utilizadas. Frequentemente o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de pH aquosa. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; poli- peptídeo de peso molecular baixo (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, ma- nose, ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contra-íons de formação de sal tais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos tais como polisorbato 20 (TWEEN™) polietilenoglicol (PEG), e poloxâ- meros (PLURONICS™), e semelhantes.

[00140]Como observado em outra parte aqui, os anticorpos da presente divulgação induzem a sinalização de CD40 em células tumorais, ativam células den- dríticas e inspeção imune, ativam a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) contra células tumorais, bloqueiam a ligação de CD40 a CD40L; têm atividade agonística de CD40; ativam células apresentadoras de antígeno; estimulam a liberação de citocina de células apresentadoras de antígeno; induzem a apoptose de célula tumoral; inibem a proliferação de célula tumoral; matam células tumorais via indução de funções efetoras incluindo mas não limitadas a ADCC, CDC e ADCP; estimulam respostas de célula T antitumoral; reduzem tumores estabelecidos; e inibem tumores resistentes a rituximabe. Os anticorpos descritos aqui podem ter ou induzem uma combinação de qualquer um ou mais destes atributos ou atividades. As propriedades funcionais desejadas de anticorpos anti-CD40 podem ser avaliadas usando uma variedade de métodos conhecidos à pessoa habilitada, tais como ensaios de afinidade/ligação (por exemplo, ressonância plasmônica de superfície, ensaios de inibição competitivos); ensaios de citotoxicidade, ensaios de viabilidade celular, ensaios de proliferação, ativação ou diferenciação celulares, ensaios de ADCC e CDC, outra atividade celular que resulta de eventos de sinalização de célula de CD40 (por exemplo, fosforilação de STAT3, produção de citocinas incluindo IL-1, IL- 6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-Alfa, e MIP1Alfa), e inibição de célula do câncer e/ou crescimento do tumor usando modelos in vitro ou in vivo. Outros ensaios podem testar a capacidade de anticorpos descritos aqui para bloquear a ligação de CD40L normal a CD40 ou respostas mediadas por CD40, tais como sinalização de célula, ativação celular (por exemplo, ativação de célula imune, proliferação; ativação de célula que apresenta antígeno (por exemplo, células dendríticas, células B, macrófagos) e ensaios de maturação), respostas imunes (incluindo respostas mediadas por célula e humorais), etc. Os anticorpos descritos aqui também podem ser testados quanto aos efeitos sobre a internalização de CD40, eficácia in vitro e in vivo, etc. Tais ensaios podem ser realizados usando protocolos bem estabelecidos conhecidos à pessoa habilitada (Veja por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology (Editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. She- vach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); ou kits comercialmente disponíveis.

[00141]A presente invenção fornece ainda em certas modalidades um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste como descrito aqui, por exemplo, um ácido nucleico que codifica um domínio de CDR ou VH ou VL como descrito aqui. Ácidos nucleicos incluem DNA e RNA. Estas e modalidades relacionadas podem incluir polinucleotídeos que codificam anticorpos que ligam-se a CD40 como descrito aqui. O termo “polinucleotídeo isolado” como usado aqui deve significar um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA, ou sintética ou alguma combinação destes, que em virtude de sua origem o polinucleotídeo isolado (1) não é associado com todo ou uma porção de um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, (2) é ligado a um polinucleotídeo ao qual ele não é ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

[00142]O termo “operavelmente ligado” significa que os componentes aos quais o termo é aplicado estão em um relacionamento que permite que eles realizem suas funções inerentes sob condições adequadas. Por exemplo, uma sequência de controle de transcrição “operavelmente ligada” a uma sequência de codificação de proteína é ligada à esta de modo que a expressão da sequência de codificação de proteína seja obtida sob condições compatíveis com a atividade transcricional das sequências de controle.

[00143]O termo “sequência de controle” como usado aqui refere-se a sequências de polinucleotídeo que podem afetar a expressão, processamento ou localização intracelular de sequências de codificação às quais elas são ligadas ou ope- ravelmente ligadas. A natureza de tais sequências de controle pode depender do organismo hospedeiro. Em modalidades particulares, sequências de controle de transcrição para procariotas podem incluir um promotor, sítio de ligação ribossômico, e sequência de terminação da transcrição. Em outras modalidades particulares, sequências de controle de transcrição para eucariotas podem incluir promotores com- preendendo um ou uma pluralidade de sítios de reconhecimento para fatores de transcrição, sequências realçadoras de transcrição, sequências de terminação da transcrição e sequências de poliadenilação. Em certas modalidades, “sequências de controle” podem incluir sequências líderes e/ou sequências parceiras de fusão.

[00144]O termo “polinucleotídeo” como referido aqui significa polímeros de ácido nucleico de filamento único ou de filamento duplo. Em certas modalidades, os nucleotídeos compreendendo o polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou de- soxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. As ditas modificações incluem modificações de base tais como bromouridina, modificações de ribose tais como arabinosídeo e 2’,3’-didesoxirribose e modificações de ligação internucleotídeo tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fos- forodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato e fosforoamidato. O termo “poli- nucleotídeo” especificamente inclui formas de filamento único e duplo de DNA.

[00145]O termo “nucleotídeos que ocorrem naturalmente” inclui desoxirribo- nucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo “nucleotídeos modificados” inclui nucleotí- deos com grupos açúcar modificados ou substituídos e semelhantes. O termo “ligações de oligonucleotídeo” inclui ligações de oligonucleotídeo tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilada- to, fosforoamidato, e semelhantes. Veja, por exemplo, LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon et al., 1991, Anti-cancer Drug Design, 6:539; Zon et al., 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL MEHTOD, páginas 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford Inglaterra; Stec et al., Pat. U.S. No 5.151.510; Uhlmann e Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543, as divulgações dos quais são por meio desta incorporadas por referência para qualquer propósito. Um oligonucleotídeo pode incluir um rótulo detectável para permitir a detecção do oligonucleotídeo ou hibridização deste.

[00146]O termo “vetor” é usado para referir-se a qualquer molécula (por exemplo, ácido nucleico, plasmídeo, ou vírus) usada para transferir informação de codificação a uma célula hospedeira. O termo “vetor de expressão” refere-se a um vetor que é adequado para a transformação de uma célula hospedeira e contém sequências de ácido nucleico que dirigem e/ou controlam a expressão de sequências de ácido nucleico heterólogas inseridas. Expressão inclui, mas é não limitada a, processos tais como transcrição, tradução, e emenda de RNA, se íntrons estão presentes.

[00147]Como será entendido por aqueles habilitados na técnica, polinucleo- tídeos podem incluir sequências genômicas, sequências extra-genômicas e codificadas por plasmídeo e segmentos de gene engendrados menores que expressam, ou podem ser adaptados para expressar, proteínas, polipeptídeos, peptídeos e semelhantes. Tais segmentos podem ser naturalmente isolados, ou modificados sinteticamente pela pessoa habilitada.

[00148]Como será também reconhecido pelo técnico habilitado, polinucleotí- deos podem ser de filamento único (de codificação ou anti-sentido) ou de filamento duplo, e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou RNA. Moléculas de RNA podem incluir moléculas de HnRNA, que contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA em uma maneira individualizada, e moléculas de mRNA, que não contêm íntrons. Sequências de codificação ou que não de codificação adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleo- tídeo de acordo com a presente divulgação, e um polinucleotídeo pode, mas não precisa, ser ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte. Polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa ou podem compreender uma sequência que codifica uma variante ou derivado de uma tal sequência.

[00149]Portanto, de acordo com estas e modalidades relacionadas, a presente divulgação também fornece polinucleotídeos que codificam os anticorpos anti- CD40 descritos aqui. Em certas modalidades, polinucleotídeos são fornecidos que compreendem alguma ou todo de uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo como descrito aqui e complementos de tais polinucleotídeos.

[00150]Em outras modalidades relacionadas, variantes de polinucleotídeo podem ter identidade substancial a uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo anti-CD40 descrito aqui. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 70 % de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % ou mais alto, de identidade de sequência comparado a uma sequência de polinucle- otídeo de referência tal como uma sequência que codifica um anticorpo descrito aqui, usando os métodos descritos aqui, (por exemplo, análise BLAST usando parâmetros padrão, como descrito abaixo). Uma pessoa habilitada nesta técnica reconhecerá que estes valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade correspondente de proteínas codificadas por duas sequências de nucleo- tídeo tomando-se em consideração a degeneração de códon, similaridade de ami- noácido, posicionamento da estrutura de leitura e semelhantes.

[00151]Tipicamente, variantes de polinucleotídeo conterão uma ou mais substituições, adições, supressões e/ou inserções, preferivelmente tal que a afinidade de ligação do anticorpo codificado pela variante polinucleotídeo não é substancialmente diminuída em relação a um anticorpo codificado por uma sequência de poli- nucleotídeo especificamente apresentada aqui.

[00152]Em certas outras modalidades relacionadas, fragmentos de polinu- cleotídeo podem compreender ou consistir essencialmente em vários comprimentos de trechos contíguos de sequência idêntica a ou complementar a uma sequência que codifica um anticorpo como descrito aqui. Por exemplo, polinucleotídeos são fornecidos que compreendem ou consistem essencialmente em pelo menos cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500 ou 1000 ou mais nucleotí- deos contíguos de uma sequência que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno deste, divulgado aqui assim como todos os comprimentos intermediários entre eles. Será facilmente entendido que “comprimentos intermediários”, neste contexto, significa qualquer comprimento entre os valores cotados, tais como 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluindo todos os números inteiros de 200 a 500; 500 a 1.000, e semelhantes. Uma sequência de poli- nucleotídeo como descrito aqui pode ser estendida em uma ou ambas as extremidades por nucleotídeos adicionais não encontrados na sequência nativa. Esta sequência adicional pode consistir em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 nucleotídeos em qualquer extremidade de um polinucleotídeo que codifica um anticorpo descrito aqui ou em ambas as extremidades de um polinucleotí- deo que codifica um anticorpo descrito aqui.

[00153]Em uma outra modalidade, polinucleotídeos são fornecidos que são capazes de hibridizar sob condições de severidade moderada a alta a uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno deste, fornecido aqui, ou um fragmento deste, ou uma sequência complementar deste. Técnicas de hibridização são bem conhecidas na técnica de biologia molecular. Para propósitos de ilustração, condições moderadamente severas adequadas para testar a hibridização de um polinucleotídeo como fornecido aqui com outros polinu- cleotídeos incluem pré-lavar em uma solução de 5 X SSC, 0,5 % de SDS, 1,0 mM de EDTA (pH 8,0); hibridizar a 50 °C a 60 °C, 5 X SSC, durante a noite; seguido por lavagem duas vezes a 65 °C por 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X SSC contendo 0,1 % de SDS. Uma pessoa habilitada na técnica entenderá que a severi-dade da hibridização pode ser facilmente manipulada, tal como alterando-se o teor de sal da solução de hibridização e/ou a temperatura na qual a hibridização é reali- zada. Por exemplo, em uma outra modalidade, condições de hibridização altamente severas adequadas incluem aquelas descritas acima, com a exceção de que a temperatura da hibridização é aumentada, por exemplo, até 60 °C a 65 °C ou 65 °C a 70 °C.

[00154]Em certas modalidades, os polinucleotídeos descritos acima, por exemplo, variantes de polinucleotídeo, fragmentos e sequências de hibridização, codificam anticorpos que ligam-se a CD40, ou fragmentos de ligação a antígeno destes. Em outras modalidades, tais polinucleotídeos codificam anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, ou CDRs destes, que ligam-se a CD40 pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 70 %, e em certas modalidades, pelo menos cerca de 90 % assim como uma sequência de anticorpo especificamente apresentada aqui. Em outras modalidades, tais polinucleotídeos codificam anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, ou CDRs destes, que ligam-se a CD40 com afinidade maior do que os anticorpos apresentados aqui, por exemplo, que ligam-se quantitati-vamente pelo menos cerca de 105 %, 106 %, 107 %, 108 %, 109 %, ou 110 % assim como uma sequência de anticorpo especificamente apresentada aqui.

[00155]Como descrito em outra parte aqui, a determinação das estruturas tridimensionais de polipeptídeos representativos (por exemplo, anticorpos específicos de CD40 variantes como fornecido aqui, por exemplo, uma proteína de anticorpo tendo um fragmento de ligação a antígeno como fornecido aqui) pode ser feita através de metodologias de rotina tal que substituição, adição, supressão ou inserção de um ou mais aminoácidos com aminoácidos naturais ou não naturais selecionados podem ser virtualmente moldadas para propósitos de determinar se uma variante estrutural assim derivada retém as propriedades de preenchimento de espaço de espécies presentemente divulgadas. Uma variedade de programas de computador é conhecida ao técnico habilitado para determinar as substituições de aminoácido apropriadas (ou polinucleotídeos apropriados que codificam a sequência de aminoá- cido) dentro de um anticorpo tal que, por exemplo, a afinidade é mantida ou melhor a afinidade é obtida.

[00156]Os polinucleotídeos descritos aqui, ou fragmentos destes, apesar do comprimento da sequência de codificação propriamente dita, podem ser combinados com outras sequências de DNA, tais como promotores, sinais de poliadenilação, sítios de enzima de restrição adicionais, sítios de clonagem múltiplos, outros segmentos de codificação, e semelhantes, tal que seu comprimento global pode variar consideravelmente. Portanto é considerado que um fragmento de ácido nucleico de quase qualquer comprimento pode ser utilizado, com o comprimento total preferivelmente sendo limitado pela facilidade de preparação e uso no protocolo de DNA recombinante intencionado. Por exemplo, segmentos de polinucleotídeo ilustrativos com comprimentos totais de cerca de 10.000, cerca de 5000, cerca de 3000, cerca de 2.000, cerca de 1.000, cerca de 500, cerca de 200, cerca de 100, cerca de 50 pares de base em comprimento, e semelhantes, (incluindo todos os comprimentos intermediários) são considerados úteis.

[00157]Quando da comparação de sequências de polinucleotídeo, duas sequências são ditas serem “idênticas” se a sequência de nucleotídeos nas duas sequências é a mesma quando alinhada para correspondência máxima, como descrito abaixo. Comparações entre duas sequências são tipicamente realizadas comparando-se as sequências em uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma “janela de comparação” como usado aqui, refere-se a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, usualmente 30 a cerca de 75, 40 a cerca de 50, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas sequências são idealmente alinhadas.

[00158]O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido usando o programa Megalign no software Lasergene suite of bioinformatics (DNASTAR, Inc., Madison, WI), usando parâmetros padrão. Este programa incorpora vários esquemas de alinhamento descritos nas referências seguintes: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships. Em Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, páginas 345-358; Hein J., Unified Method to Alignment and Phylogenes, páginas 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. e Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. e Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor 11:105 (1971); Santou, N. Nes, M., Mol. Biol. Evol. 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. e Sokal, R.R., Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, São Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. e Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730 (1983).

[00159]Alternativamente, o alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de identidade local de Smith e Waterman, Add. APL. Math 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de identidade of Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa por métodos de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção.

[00160]Um exemplo preferido de algoritmos que são adequados para determinar a porcentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977), e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 podem ser usados, por exemplo com os parâmetros descritos aqui, para determinar a porcentagem de identidade de sequência entre dois ou mais dos polinucleotídeos. O software para realizar as análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Em um exemplo ilustrativo, contagens cumulativas podem ser calculadas usando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (contagem de recompensa para um par de resíduos de combinação; sempre > 0) e N (contagem de penalidade para resíduos de má combinação; sempre < 0). A extensão de acessos de palavra em cada direção é parada quando: a contagem de alinhamento cumulativo diminui pela quantidade X de seu valor máximo obtido; a contagem cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de contagem negativa; ou a extremidade de qualquer sequência é atingida. Os parâmetros de al-goritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, e expectativa (E) de 10, e a matriz de contagem de BLOSUM62 (Veja Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alinhamentos, (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambos os filamentos.

[00161]Em certas modalidades, a “porcentagem de identidade de sequência” é determinada comparando-se duas sequências idealmente alinhadas em uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou supressões (isto é, intervalos) de 20 por cento ou menos, usualmente 5 a 15 por cento, ou 10 a 12 por cento, quando comparado às sequências de referência (que não compreendem adições ou supressões) para o alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições em que as bases de ácido nucleico idênticas ocorrem em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na sequência de referência (isto é, o tamanho da janela) e multipli- cando os resultados por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência.

[00162]Será avaliado por aqueles de habilidade comum na técnica que, como um resultado da degeneração do código genético, existem muitas sequências de nucleotídeo que codificam um anticorpo como descrito aqui. Alguns destes polinu- cleotídeos portam identidade de sequência mínima à sequência de nucleotídeo da sequência de polinucleotídeo nativa ou original que codifica anticorpos que ligam-se a CD40. Não obstante, polinucleotídeos que variam devido a diferenças no uso do códon são expressamente considerados pela presente divulgação. Em certas modalidades, sequências que foram otimizadas de códon para a expressão em mamíferos são especificamente consideradas.

[00163]Portanto, em uma outra modalidade da invenção, um método de mu- tagênese, tal como mutagênese específica de sítio, pode ser utilizado para a preparação de variantes e/ou derivados dos anticorpos descritos aqui. Por este método, modificações específicas em uma sequência de polipeptídeo podem ser feitas através de mutagênese dos polinucleotídeos subjacentes que as codificam. Estas técnicas fornecem um método direto para preparar e testar variantes de sequência, por exemplo, incorporando uma ou mais das considerações precedentes, introduzindo- se uma ou mais mudanças de sequência de nucleotídeo no polinucleotídeo.

[00164]A mutagênese específica de sítio permite a produção de mutantes através do uso de sequências de oligonucleotídeo específicas que codificam a sequência de DNA da mutação desejada, assim como um número suficiente de nu- cleotídeos adjacentes, para fornecer uma sequência iniciadora de tamanho suficiente e complexidade de sequência para formar um dúplex estável em ambos os lados da junção de supressão que é atravessada. Mutações podem ser utilizadas em uma sequência de polinucleotídeo selecionada para melhorar, alterar, diminuir, modificar, ou de outro modo mudar as propriedades do polinucleotídeo propriamente dito, e/ou alterar as propriedades, atividade, composição, estabilidade, ou sequência primária do polipeptídeo codificado.

[00165]Em certas modalidades, os inventores consideram a mutagênese das sequências de polinucleotídeo que codificam um anticorpo divulgado aqui, ou um fragmento de ligação a antígeno deste, para alterar uma ou mais propriedades do polipeptídeo codificado, tal como a afinidade de ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação a antígeno deste, ou a função de uma região Fc particular, ou a afinidade da região Fc por um FCYR particular. As técnicas de mutagênese específica de sítio são bem conhecidas na técnica, e são amplamente usadas para criar variantes tanto de polipeptídeos quanto de polinucleotídeos. Por exemplo, a mutagênese específica de sítio é frequentemente usada para alterar uma porção específica de uma molécula de DNA. Em tais modalidades, um iniciador compreendendo tipicamente cerca de 14 a cerca de 25 nucleotídeos aproximadamente em comprimento é utilizado, com cerca de 5 a cerca de 10 resíduos em ambos os lados da junção da sequência sendo alterada.

[00166]Como será avaliado por aqueles de habilidade na técnica, técnicas de mutagênese específica de sítio têm frequentemente utilizado um vetor de fago que existe tanto em uma forma de filamento único quanto de filamento duplo. Vetores típicos úteis em mutagênese dirigida por sítio incluem vetores tal como o fago M13. Estes fagos estão facilmente comercialmente disponíveis e seu uso é geralmente bem conhecido àqueles habilitados na técnica. Plasmídeos de filamento duplo são também rotineiramente utilizados em mutagênese dirigida por sítio que elimina a etapa de transferir o gene de interesse de um plasmídeo a um fago.

[00167]Em geral, a mutagênese dirigida por sítio de acordo com esta é realizada primeiro obtendo-se um vetor de filamento único ou fundindo-se separadamente dois filamentos de um vetor de filamento duplo que inclui dentro de sua sequência uma sequência de DNA que codifica o peptídeo desejado. Um iniciador de oligonu- cleotídeo que porta a sequência mutada desejada é preparado, geralmente sinteticamente. Este iniciador é depois recozido com o vetor de filamento único, e submetido a enzimas de polimerização de DNA tais como fragmento de Klenow de polime- rase I de E. coli, de modo a completar a síntese do filamento que porta mutação. Assim, um heteroduplex é formado em que um filamento codifica a sequência não mutada original e o segundo filamento porta a mutação desejada. Este vetor de heteroduplex é depois usado para transformar células apropriadas, tais como células de E. coli, e clones são selecionados que incluem vetores recombinantes que portam o arranjo de sequência mutado.

[00168]A preparação de variantes de sequência dos segmentos de DNA que codificam peptídeo selecionados usando mutagênese dirigida por sítio fornece um meio de produzir espécies potencialmente úteis e não é significado a ser limitante visto que existem outros modos em que as variantes de sequência de peptídeos e as sequências de DNA que as codificam podem ser obtidas. Por exemplo, vetores recombinantes que codificam a sequência de peptídeo desejada podem ser tratados com agentes mutagênicos, tais como hidroxilamina, para obter variantes de sequência. Detalhes específicos com respeito a estes métodos e protocolos são encontrados nos ensinamentos de Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop e Bajpai, 1991; Kuby, 1994; e Maniatis et al., 1982, todos incorporados aqui por referência, para este propósito.

[00169]Como usado aqui, o termo “procedimento de mutagênese dirigida por oligonucleotídeo” refere-se a processos dependentes de padrão e propagação mediada por vetor que resultam em um aumento na concentração de uma molécula de ácido nucleico específica em relação à sua concentração inicial, ou em um aumento na concentração de um sinal detectável, tal como amplificação. Como usado aqui, o termo “procedimento de mutagênese dirigida por oligonucleotídeo” é intencionado a referir-se a um processo que envolve a extensão dependente de padrão de uma mo- lécula iniciadora. O termo processo dependente de padrão refere-se à síntese de ácido nucleico de uma molécula de RNA ou uma de DNA em que a sequência do filamento recentemente sintetizado de ácido nucleico é ditada pelas regras bem conhecidas de pareamento de base complementar (Veja, por exemplo, Watson, 1987). Tipicamente, metodologias mediadas por vetor envolvem a introdução do fragmento de ácido nucleico em um vetor de DNA ou RNA, a amplificação clonal do vetor, e a recuperação do fragmento de ácido nucleico amplificado. Exemplos de tais metodologias são fornecidos pela Patente U.S. No 4.237.224, especificamente incorporada aqui por referência em sua totalidade.

[00170]Em um outro método para a produção de variantes de polipeptídeo, recombinação de sequência recursiva, como descrito na Patente U.S. No 5.837.458, pode ser utilizada. Neste método, ciclos iterativos de recombinação e triagem ou seleção são realizados para “desenvolver” variantes de polinucleotídeo individuais tendo, por exemplo, afinidade de ligação aumentada. Certas modalidades também fornecem construções na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo como descrito aqui.

[00171]Em muitas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam um anticorpo monoclonal do assunto são introduzidos diretamente em uma célula hospedeira, e a célula incubada sob condições suficientes para induzir a expressão do anticorpo codificado. Os anticorpos desta divulgação são preparados usando técnicas padrão bem conhecidas àqueles de habilidade na técnica em combinação com as sequências de polipeptídeo e ácido nucleico fornecidas aqui. As sequências de poli- peptídeo podem ser usadas para determinar sequências de ácido nucleico apropriadas que codificam o anticorpo particular divulgado desse modo. A sequência de ácido nucleico pode ser otimizada para refletir “preferências” de códon particulares para vários sistemas de expressão de acordo com métodos padrão bem conhecidos àqueles de habilidade na técnica.

[00172]De acordo com certas modalidades relacionadas é fornecida uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções como descrito aqui; um ácido nucleico que codifica qualquer anticorpo, domínio de CDR, VH ou VL, ou fragmento de ligação a antígeno deste; e um método de produção do produto codificado, método este que compreende a expressão do ácido nucleico de codificação para tal. A expressão pode ser convenientemente obtida cultivando-se sob condições apropriadas células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nuclei- co. A seguir da produção por expressão, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste, podem ser isolados e/ou purificados usando qualquer técnica adequada, e depois usados conforme desejado.

[00173]Anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno destes como fornecido aqui, e moléculas e vetores de ácido nucleico de codificação, podem ser isolados e/ou purificados, por exemplo, de seu ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogênea, ou, no caso de ácido nucleico, livre ou substancialmente livre de ácido nucleico ou genes de origem exceto a sequência que codifica um poli- peptídeo com a função desejada. O ácido nucleico pode compreender DNA ou RNA e pode ser completa ou parcialmente sintético. Referência a uma sequência de nu- cleotídeo como apresentado aqui abrange uma molécula de DNA com a sequência específica, e abrange uma molécula de RNA com a sequência específica em que U é substituído no lugar de T, a menos que contexto requeira de outro modo.

[00174]Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo em uma variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células mamíferas, levedura e sistemas de bacu- lovírus. Linhagens de célula mamífera disponíveis na técnica para a expressão de um polipeptídeo heterólogico incluem células do ovário de hamster chinês, células HeLa, células do rim de hamster neonato, células de melanoma de camundongo NSO e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano preferido, comum é E. coli.

[00175]A expressão de anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno em células procarióticas tais como E. coli é bem estabelecida na técnica. Para um revisão, ver por exemplo Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucarióticas em cultura também está disponível àqueles habilitados na técnica como uma opção para a produção de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno destes, ver revisões recentes, por exemplo Ref, M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J. J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.

[00176]Vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências realçadoras, genes marcadores e outras sequências conforme apropriado. Vetores podem ser plasmídeos, virais por exemplo, fago, ou fagomídeo, conforme apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas conhecidas e protocolos para a manipulação de ácido nucleico, por exemplo na preparação de construções de ácido nucleico, mutagênese, sequenciamento, introdução de DNA em células e expressão de gene, e análise de proteínas, são descritas em detalhe em Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992, ou atualizações subsequentes a estas.

[00177]O termo “célula hospedeira” é usado para referir-se a uma célula em que foi introduzida, ou que é capaz de ter introduzida nela, uma sequência de ácido nucleico que codifica um ou mais dos anticorpos aqui descritos, e que expressa ainda ou é capaz de expressar um gene de interesse selecionado, tal como um gene que codifica qualquer anticorpo aqui descrito. O termo inclui a progênie da célula precursora, se ou não a progênie é idêntica em morfologia ou em composição genética ao precursor original, contanto que o gene selecionado esteja presente. Consequentemente também é considerado um método compreendendo introduzir tal ácido nucleico em uma célula hospedeira. A introdução pode utilizar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, técnicas adequadas podem incluir transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-Dextrano, eletroporação, transfecção mediada por liposso- ma e transdução usando retrovírus ou outro vírus, por exemplo, vaccinia ou, para células de inseto, baculovírus. Para células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando bacte- riófago. A introdução pode ser seguida causando-se ou permitindo-se a expressão do ácido nucleico, por exemplo, cultivando-se células hospedeiras sob condições para a expressão do gene. Em uma modalidade, o ácido nucleico é integrado no ge- noma (por exemplo, cromossomo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão.

[00178]A presente invenção também fornece, em certas modalidades, um método que compreende usar uma construção como estabelecido acima em um sistema de expressão de modo a expressar um polipeptídeo particular tal como um anticorpo específico de CD40 como descrito aqui. O termo “transdução” é usado para referir-se à transferência de genes de uma bactéria a uma outra, usualmente por um fago. “Transdução” também refere-se à aquisição e transferência de sequências celulares eucarióticas por retrovírus. O termo “transfecção” é usado para referir-se à captação de DNA estranho ou exógeno por uma célula, e uma célula foi “transfecta- da” quando o DNA exógeno foi introduzido dentro da membrana celular. Várias técnicas de transfecção são bem conhecidas na técnica e são divulgadas aqui. Veja, por exemplo, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; e Chu et al., 1981, Gene 13:197. Tais técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais porções de DNA exógeno em células hospedeiras adequadas.

[00179]O termo “transformação” como usado aqui refere-se a uma mudança nas características genéticas de uma célula, e uma célula foi transformada quando ela foi modificada para conter um novo DNA. Por exemplo, uma célula é transformada onde ela é geneticamente modificada de seu estado nativo. A seguir da transfec- ção ou transdução, o DNA transformante pode recombinar com aquele da célula integrando-se fisicamente em um cromossomo da célula, ou pode ser mantido transitoriamente como um elemento epissômico sem ser replicado, ou pode replicar independentemente como um plasmídeo. Uma célula é considerada ter sido estavelmen- te transformada quando o DNA é replicado com a divisão da célula. O termo “que ocorre naturalmente” ou “nativo” quando usado em relação a materiais biológicos tais como moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos, células hospedeiras, e seme-lhantes, refere-se a materiais que são encontrados na natureza e não são manipulados por um ser humano. Similarmente, “que não ocorre naturalmente” ou “não nativo” como usado aqui refere-se a um material que não é encontrado na natureza ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado por um ser humano.

[00180]Os termos “polipeptídeo” “proteína” e “peptídeo” e “glicoproteína” são usados permutavelmente e significam um polímero de aminoácidos não limitado a qualquer comprimento particular. O termo não exclui modificações tais como miristi- lação, sulfatização, glicosilação, fosforilação e adição ou supressão de sequências de sinal. Os termos “polipeptídeo” ou “proteína” significam uma ou mais cadeias de aminoácidos, em que cada cadeia compreende aminoácidos covalentemente ligados por ligações peptídicas, e em que o dito polipeptídeo ou proteína pode compreender uma pluralidade de cadeias não covalentemente e/ou covalentemente ligadas entre si por ligações peptídicas, tendo a sequência de proteínas nativas, isto é, proteínas produzidas por células que ocorrem naturalmente e especificamente não recombi- nantes, ou células geneticamente engendradas ou recombinantes, e compreendem moléculas tendo a sequência de aminoácido da proteína nativa, ou moléculas tendo supressões de, adições a, e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da sequência nativa. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” especificamente abrangem os anticorpos que ligam-se a CD40 da presente divulgação, ou sequências que têm supressões de, adições a, e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de um anticorpo anti-CD40. Assim, um “polipeptídeo” ou uma “proteína” pode compreender uma (denominado “um monômero”) ou uma pluralidade (denominado “um multíme- ro”) de cadeias de aminoácido.

[00181]O termo “proteína isolada” referido aqui significa que uma proteína do assunto (1) é livre de pelo menos algumas outras proteínas com as quais ela tipicamente seria encontrada na natureza, (2) é essencialmente livre de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expressada por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separada de pelo menos cerca de 50 por cento de polinucleotídeos, lipídeos, carboidratos, ou outros materiais com os quais é associada na natureza, (5) é não associada (por interação covalente ou não covalente) com porções de uma proteína com as quais a “proteína isolada” é associada na natureza, (6) é operavelmente associada (por interação covalente ou não covalente) com um polipeptídeo com o qual ela não é associada na natureza, ou (7) não ocorre na natureza. Uma tal proteína isolada pode ser codificada por DNA genômico, cDNA, mRNA ou outro RNA, ou pode ser de origem sintética, ou qualquer combinação destes. Em certas modalidades, a proteína isolada é substancialmente livre de proteínas ou po- lipeptídeos ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que interferiria com seu uso (terapêutico, diagnóstico, profilático, pesquisa ou diferente).

[00182]O termo “fragmento de polipeptídeo” refere-se a um polipeptídeo, que pode ser monomérico ou multimérico, que tem uma supressão amino-terminal, um supressão carboxil-terminal, e/ou uma supressão ou substituição interna de um poli- peptídeo que ocorre naturalmente ou recombinantemente produzido. Em certas mo- dalidades, um fragmento de polipeptídeo pode compreender uma cadeia de aminoá- cido de pelo menos 5 a cerca de 500 aminoácidos em comprimento. Será avaliado que em certas modalidades, fragmentos são de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80,85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ou 450 aminoácidos em comprimento. Fragmentos de polipeptídeo particularmente úteis incluem domínios funcionais, incluindo domínios de ligação de antígeno ou fragmentos de anticorpos. No caso de um anticorpo anti-CD40, fragmentos úteis incluem, mas não são limitados a: uma região CDR, especialmente uma região CDR3 da cadeia pesada ou leve; uma região variável de uma cadeia pesada ou leve; uma porção de uma cadeia de anticorpo ou somente sua região variável incluindo duas CDRs; e semelhantes.

[00183]Polipeptídeos podem compreender uma sequência de sinal (ou líder) na extremidade N-terminal da proteína, que cotraducionalmente ou pós- traducionalmente dirige a transferência da proteína. Quaisquer sequências de poli- peptídeo de aminoácido fornecidas aqui que incluem um peptídeo de sinal são também consideradas para qualquer uso descrito aqui sem um tal peptídeo de sinal ou líder. Como seria reconhecido pela pessoa habilitada, o peptídeo de sinal é usualmente clivado durante o processamento e não é incluído na proteína de anticorpo ativa. O polipeptídeo também pode ser fundido em estrutura ou conjugado a um li- gador ou outra sequência para facilidade de síntese, purificação ou identificação do polipeptídeo (por exemplo, poli-His), ou para realçar a ligação do polipeptídeo a um suporte sólido.

[00184]Um ligador de peptídeo/sequência espaçadora também podem ser utilizados para separar componentes de polipeptídeo múltiplos por uma distância suficiente para garantir que cada polipeptídeo dobre em suas estruturas secundárias e/ou terciárias, se desejado. Um tal ligador de sequência de peptídeo pode ser in- corporado em um polipeptídeo de fusão usando técnicas padrão bem conhecidas na técnica.

[00185]Certas sequências espaçadoras de peptídeo podem ser escolhidas, por exemplo, com base em: (1) sua capacidade para adotar uma conformação estendida flexível; (2) sua incapacidade para adotar uma estrutura secundária que pode interagir com epítopos funcionais no primeiro e segundo polipeptídeos; e/ou (3) a carência de resíduos hidrofóbicos ou carregados que poderiam reagir com os epíto- pos funcionais em polipeptídeo.

[00186]Em uma modalidade ilustrativa, sequências espaçadoras de peptídeo contêm, por exemplo, resíduos de Gly, Asn e Ser. Outros aminoácidos neutros contíguos, tais como Thr e Ala, também podem ser incluídos na sequência espaçadora.

[00187]Outras sequências de aminoácido que podem ser utilmente utilizadas como espaçadores incluem aquelas divulgadas em Maratea et al., Gene 40:39 46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986); Pat. U.S. No 4.935.233 e Pat. U.S. No 4.751.180.

[00188]Outros espaçadores ilustrativos podem incluir, por exemplo, Glu-Gly- Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp (Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070) e Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln- Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp (Bird et al., 1988, Science 242:423-426).

[00189]Em algumas modalidades, sequências espaçadoras não são requeridas quando o primeiro e segundo polipeptídeos têm regiões de aminoácido N- terminais não essenciais que podem ser usadas para separar os domínios funcionais e impedir a interferência estérica. Duas sequências de codificação podem ser fundidas diretamente sem qualquer espaçador ou usando-se um poliligador flexível composto, por exemplo, do pentâmero Gly-Gly-Gly-Gly-Ser repetido 1 a 3 vezes. Um tal espaçador foi usado em na construção de anticorpos de cadeia única (scFv) por ser inserido entre VH e VL (Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5979-5883).

[00190]Um espaçador de peptídeo, em certas modalidades, é designado para permitir a interação correta entre duas folhas beta que formam a região variável do anticorpo de cadeia única.

[00191]Em certas modalidades ilustrativas, um espaçador de peptídeo é entre 1 a 5 aminoácidos, entre 5 a 10 aminoácidos, entre 5 a 25 aminoácidos, entre 5 a 50 aminoácidos, entre 10 a 25 aminoácidos, entre 10 a 50 aminoácidos, entre 10 a 100 aminoácidos, ou qualquer faixa de intervenção de aminoácidos.

[00192]Em outras modalidades ilustrativas, um espaçador de peptídeo compreende cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais aminoácidos em comprimento.

[00193]Modificação(ões) de sequência de aminoácido dos anticorpos descritos aqui são consideradas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Por exemplo, variantes da sequência de aminoácido de um anticorpo podem ser preparadas introduzindo-se mudanças de nucleotídeo apropriadas em um polinucleotídeo que codifica o anticorpo, ou uma cadeia deste, ou por síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, supressões de, e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos dentro das sequências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de supressão, inserção, e substituição pode ser feita para surgir no anticorpo final, contanto que a construção final possui as características desejadas (por exemplo, ligação a CD40 com afinidade alta). As mudanças de aminoácido também podem alterar processos pós-traducionais do anticorpo, tal como mudando o número ou posição dos sítios de glicosilação. Qualquer uma das variações e modificações descritas acima para poli- peptídeos da presente invenção pode ser incluída em anticorpos da presente invenção.

[00194]A presente divulgação fornece variantes dos anticorpos divulgados aqui. Em certas modalidades, tais anticorpos variantes ou fragmentos de ligação a antígeno, ou CDRs destes, ligam-se a CD40 pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 70 %, e em certas modalidades, pelo menos cerca de 90 % assim como uma sequência de anticorpo especificamente apresentada aqui. Em outras modalidades, tais anticorpos variantes ou fragmentos de ligação a antígeno, ou CDRs destes, ligam-se a CD40 com afinidade maior do que os anticorpos apresentados aqui, por exemplo, que ligam-se quantitativamente pelo menos cerca de 105 %, 106 %, 107 %, 108 %, 109 %, ou 110 % assim como uma sequência de anticorpo especificamente apresentada aqui.

[00195]Em modalidades particulares, um anticorpo de assunto pode ter: a) uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica, pelo menos 95 % idêntica, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % ou 99 % idêntica, à região variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-CD40 descrito aqui; e b) uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % ou 99 % idêntica, à região variável de cadeia leve de um anticorpo anti-CD40 descrito aqui. A sequência de aminoácido de regiões de cadeia pesada e leve ilustrativas é apresentada nas SEQ ID NOs: 1-56.

[00196]Em modalidades particulares, o anticorpo pode compreender: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: i. Uma região CDR1 que é idêntica em sequência de aminoácido à região CDR1 de cadeia pesada de um anticorpo selecionado descrito aqui; ii. Uma região CDR2 que é idêntica em sequência de aminoácido à região CDR2 de cadeia pesada do anticorpo selecionado; e iii. Uma região CDR3 que é idêntica em sequência de aminoácido à região CDR3 de cadeia pesada do anticorpo selecionado; e b) um domínio varável de cadeia leve compreendendo: i. Uma região CDR1 que é idêntica em sequência de aminoácido à região CDR1 de cadeia leve do anticorpo selecionado; ii. Uma região CDR2 que é idêntica em sequência de aminoácido à região CDR2 de cadeia leve do anticorpo selecionado; e iii. Uma região CDR3 que é idêntica em sequência de aminoácido à região CDR3 de cadeia leve do anticorpo selecionado; em que o anticorpo especificamente liga-se a um alvo selecionado (por exemplo, CD40). Em uma outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno deste, é um anticorpo variante em que a variante compreende uma cadeia pesada e leve idêntica ao anticorpo selecionado exceto para até 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou mais substituições de aminoácido nas regiões CDR das regiões VH e VL. Sob esse aspecto, pode haver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou em certas modalidades, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 mais substituições de amino- ácido nas regiões CDR do anticorpo selecionado. As substituições podem estar em CDRs nas regiões VH e/ou VL. (Veja por exemplo, Muller, 1998, Structure 6:11531167).

[00197]A determinação das estruturas tridimensionais de polipeptídeos re-presentativos (por exemplo, anticorpos específicos de CD40 variantes como fornecido aqui, por exemplo, uma proteína de anticorpo tendo um fragmento de ligação a antígeno como fornecido aqui) pode ser feita através de metodologias de rotina tal que substituição, adição, supressão ou inserção de um ou mais aminoácidos com aminoácidos naturais ou não naturais selecionados podem ser virtualmente moldadas para propósitos de determinar se uma variante estrutural assim derivada retém as propriedades de preenchimento de espaço de espécies presentemente divulgadas. Veja, por exemplo, Donate et al., 1994 Prot. Sci. 3:2378; Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005); Dietz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1244 (2006); Dodson et al., Nature 450:176 (2007); Qian et al., Nature 450:259 (2007); Raman et al. Science 327:1014-1018 (2010). Alguns exemplos não limitantes adicionais de algoritmos de computador que podem ser usados para estas e modalidades relacionadas, tais como para o projeto racional de domínios de ligação de antígeno de anticorpos específicos de CD40 destes como fornecido aqui, incluem VMD que é um programa de visualização molecular para exibir, estimular, e analisar sistemas biomolecular grandes usando gráficos 3-D e extensão embutida (Veja o website para o Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champagne, em ks.uiuc.edu/Research/vmd/. Muitos outros programas de computador são conhecidos na técnica e estão disponíveis à pessoa habilitada e que levam em consideração determinar dimensões atômicas de modelos de preenchimento de espaço (raios de van der Waals) de conformações minimizadas de energia; GRID, que busca determinar regiões de afinidade alta para diferentes grupos químicos, desse modo realçando a ligação, pesquisas de Monte Carlo, que calculam o alinhamento matemático, e CHARMM (Brooks et al. (1983) J. Comput. Chem. 4:187-217) e AMBER (Weiner et al (1981) J. Comput. Chem. 106: 765), que avaliam os cálculos de campo de força, e análise (Veja também, Eisenfield et al. (1991) Am. J. Physiol. 261:C376-386; Lybrand (1991) J. Pharm. Belg. 46:49-54; Froimowitz (1990) Biotechniques 8:640-644; Burbam et al. (1990) Proteins 7:99-111; Pedersen (1985) Environ. Health Perspect. 61:185-190; e Kini et al. (1991) J. Biomol. Struct. Dyn. 9:475-488). Uma variedade de programas de computador computacionais apropriados está também comercialmente disponível, tal como da Schrodinger (Munich, Alemanha).

[00198]Em uma outra modalidade da invenção, os anticorpos anti-CD40 e versões humanizadas destes são derivados de anticorpos monoclonais de coelho, e em particular são gerados usando tecnologia RabMAb®. Estes anticorpos são vantajosos visto que eles requerem modificações de sequência mínimas, desse modo facilitando a retenção de propriedades funcionais depois da humanização usando tecnologia de humanização guiada por linhagem mutacional (MLG) (Veja por exemplo, Patente U.S. No 7.462.697). Assim, métodos ilustrativos para fabricar os anticorpos anti-CD40 da presente divulgação incluem a tecnologia de anticorpo monoclonal de coelho RabMab® descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.675.063 e 7.429.487. Sob esse aspecto, em certas modalidades, os anticorpos anti-CD40 da divulgação são produzidos em coelhos. Em modalidades particulares, um linfócito B imortal derivado de coelho capaz de fusão com um esplenócito de coelho é usado para produzir uma célula híbrida que produz um anticorpo. O linfócito B imortal não expressa detectavelmente cadeia pesada de imunoglobulina endógena e pode conter, em certas modalidades, um gene que codifica cadeia pesada de imunoglobulina alterado.

Composições e Métodos de Uso

[00199]A presente divulgação fornece composições compreendendo os anticorpos específicos de CD40, fragmentos de ligação a antígeno deste e administração de tal composição em uma variedade de cenários terapêuticos.

[00200]A administração dos anticorpos específicos de CD40 descritos aqui, na forma pura ou em uma composição farmacêutica apropriada, pode ser realizada via qualquer um dos modos aceitos de administração de agentes para servir utilidades similares. As composições farmacêuticas podem ser preparadas combinando-se um anticorpo ou composição contendo anticorpo com um veículo, diluente ou excipi- ente fisiologicamente aceitável apropriado, e podem ser formuladas em preparações nas formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas, tais como tabletes, cápsulas, pós, grânulos, unguentos, soluções, supositórios, injeções, medicamentos para inalação, géis, microesferas, e aerossóis. Além disso, outros ingredientes farmaceuti- camente ativos (incluindo outros agentes anticâncer como descrito em outra parte aqui) e/ou excipientes adequados tais como sais, tampões e estabilizadores podem, mas não precisam, estar presentes dentro da composição. A administração pode ser obtida por uma variedade de vias diferentes, incluindo oral, parenteral, nasal, intravenosa, intradérmica, subcutânea ou tópica. Os modos preferidos de administração dependem da natureza da condição a ser tratada ou prevenida. Uma quantidade que, a seguir da administração, reduz, inibe, previne ou retarda a progressão e/ou metástase de um câncer é considerada eficaz.

[00201]Em certas modalidades, a quantidade administrada é suficiente para resultar na regressão do tumor, como indicado por uma diminuição estatisticamente significante na quantidade de tumor viável, por exemplo, pelo menos um aumento de 50 % na massa do tumor, ou por dimensões de varredura alteradas (por exemplo, diminuídas com significância estatística). Em outras modalidades, a quantidade administrada é suficiente para resultar na redução clinicamente relevante nos sintomas de uma indicação de doença particular conhecida ao clínico habilitado.

[00202]A dosagem precisa e duração do tratamento é uma função da doença sendo tratada e pode ser determinada empiricamente usando protocolos de teste conhecidos ou testando-se as composições em sistemas modelos conhecidos na técnica e extrapolando-se a partir destes. Experiências clínicas controladas também podem ser realizadas. Dosagens também podem variar com a severidade da condição a ser aliviada. Uma composição farmacêutica é geralmente formulada e administrada para exercer um efeito terapeuticamente útil enquanto minimizando efeitos colaterais indesejáveis. A composição pode ser administrada uma vez, ou pode ser dividida em várias doses menores para ser administrada em intervalos de tempo. Para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos podem ser ajus-tados com o passar do tempo de acordo com a necessidade individual.

[00203]As composições contendo anticorpo específico de CD40 podem ser administradas sozinhas ou em combinação com outros tratamentos de câncer conhecidos, tais como terapia de radiação, quimioterapia, transplante, imunoterapia, terapia hormonal, terapia fotodinâmica, etc. As composições também podem ser administradas em combinação com antibióticos.

[00204]Vias típicas de administrar estas e composições farmacêuticas relacionadas assim incluem, sem limitação, oral, tópica, transdérmica, por inalação, parenteral, sublingual, bucal, retal, vaginal, e intranasal. O termo parenteral como usa- do aqui inclui injeções subcutâneas, injeção intravenosa, intramuscular, intraesternal ou técnicas de infusão. As composições farmacêuticas de acordo com certas modalidades da presente invenção são formuladas de modo a permitir que os ingredientes ativos contidos nestas estejam biodisponíveis na administração da composição a um paciente. Composições que serão administradas a um indivíduo ou paciente podem tomar a forma de uma ou mais unidades de dosagem, onde por exemplo, um tablete pode ser uma unidade de dosagem única, e um recipiente de um anticorpo específico de CD40 aqui descrito na forma de aerossol pode conter uma pluralidade de unidades de dosagem. Métodos reais de preparar tais formas de dosagem são conhecidos, ou estarão evidentes, àqueles habilitados nesta técnica; por exemplo, ver Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edição (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). A composição a ser administrada, em qualquer evento, conterá uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da presente divulgação, para o tratamento de uma doença ou condição de interesse de acordo com os ensinamentos aqui.

[00205]Uma composição farmacêutica pode estar na forma de um sólido ou líquido. Em uma modalidade, o(s) veículo(s) são particulados, de modo que as composições estão, por exemplo, na forma de tablete ou pó. O(s) veículo(s) podem ser líquidos, com as composições sendo, por exemplo, um óleo oral, líquido injetável ou um aerossol, que é útil, por exemplo, na administração inalatória. Quando intencionada para administração oral, a composição farmacêutica está preferivelmente na forma sólida ou líquida, onde formas semissólidas, semilíquidas, de suspensão e gel são incluídas dentro das formas consideradas aqui como sólidas ou líquidas.

[00206]Como uma composição sólida para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada em um pó, grânulo, tablete comprimido, pílula, cápsula, goma de mascar, hóstia ou semelhantes. Uma tal composição sólida tipicamente conterá um ou mais diluentes inertes ou veículos comestíveis. Além disso, um ou mais dos seguintes podem ser presentes: aglutinantes tais como carboxime- tilcelulose, etil celulose, celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; exci- pientes tais como amido, lactose ou dextrinas, agentes desintegrantes tais como ácido algínico, alginato de sódio, Primogel, amido de milho e semelhantes; lubrificantes tais como estearato de magnésio ou Sterotex; deslizantes tais como dióxido de silício coloidal; agentes adoçantes tais como sacarose ou sacarina; um agente flavo- rizante tal como hortelã-pimenta, salicilato de metila ou flavorizante de laranja; e um agente corante. Quando a composição farmacêutica está na forma de uma cápsula, por exemplo, uma cápsula de gelatina, ela pode conter, além de materiais do tipo acima, um portador líquido tal como polietilenoglicol ou óleo.

[00207]A composição farmacêutica pode estar na forma de um líquido, por exemplo, um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão. O líquido pode ser para administração oral ou para liberação por injeção, como dois exemplos. Quando intencionada para administração oral, a composição preferida contêm, além dos presentes compostos, um ou mais de um agente adoçante, conservantes, tintu- ra/corante e realçador de sabor. Em uma composição intencionada para ser administrada por injeção, um ou mais de um tensoativo, conservante, agente umectante, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizador e agente isotônico podem ser incluídos.

[00208]As composições farmacêuticas líquidas sejam elas soluções, suspensões ou outra forma semelhante, podem incluir um ou mais dos adjuvantes seguintes: diluentes estéreis tais como água para injeção, solução salina, preferivelmente solução salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos tais como mono ou diglicerídeos sintéticos que podem servir como o solvente ou meio de suspensão, polietilenoglicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxi- dantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminatetraacético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parenteral pode ser incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas fabricados de vidro ou plástico. A solução salina fisiológica é um adjuvante preferido. Uma composição farmacêutica injetável é preferivelmente estéril.

[00209]Uma composição farmacêutica líquida intencionada para administração parenteral ou oral deve conter uma quantidade de um anticorpo específico de CD40 como aqui divulgado tal que uma dosagem adequada será obtida. Tipicamente, esta quantidade é pelo menos 0,01 % do anticorpo na composição. Quando intencionada para administração oral, esta quantidade pode ser variada para estar entre 0,1 e cerca de 70 % do peso da composição. Certas composições farmacêuticas orais contêm entre cerca de 4 % e cerca de 75 % do anticorpo. Em certas modalidades, composições farmacêuticas e preparações de acordo com a presente invenção são preparadas de modo que uma unidade de dosagem parenteral contenha entre 0,01 a 10 % em peso do anticorpo antes da diluição.

[00210]A composição farmacêutica pode ser intencionada para administração tópica, caso este em que o veículo pode compreender adequadamente uma base de solução, emulsão, unguento ou gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais dos seguintes: petrolato, lanolina, polietilenoglicóis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes tais como água e álcool, e emulsificadores e estabilizadores. Agentes espessantes podem estar presentes em uma composição farmacêutica para administração tópica. Se intencionada para administração transdérmica, a composição pode incluir um emplastro transdérmico ou dispositivo de iontoforese. A composição farmacêutica pode ser intencionada para administração retal, na forma, por exemplo, de um supositório, que dissolverá no reto e liberará o medicamento. A composição para administração retal pode conter uma base oleaginosa como um excipiente não irritante adequado. Tais bases incluem, sem limitação, lanolina, man- teiga de cacau e polietilenoglicol.

[00211]A composição farmacêutica pode incluir vários materiais, que modificam a forma física de uma unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam uma casca de revestimento em torno dos ingredientes ativos. Os materiais que formam a casca de revestimento são tipicamente inertes, e podem ser selecionados de, por exemplo, açúcar, goma-laca, e outros agentes de revestimento entéricos. Alternativamente, os ingredientes ativos podem ser envolvidos em uma cápsula de gelatina. A composição farmacêutica na forma sólida ou líquida pode incluir um agente que liga-se ao anticorpo da invenção e desse modo auxilia na liberação do composto. Agentes adequados que podem agir nesta capacidade incluem outros anticorpos monoclonais ou policlonais, uma ou mais proteínas ou um lipossoma. A composição farmacêutica pode consistir essencialmente em unidades de dosagem que podem ser administradas como um aerossol. O termo aerossol é usado para denotar uma variedade de sistemas variando daqueles de natureza coloidal a sistemas consistindo em embalagens pressurizadas. A liberação pode ser por um gás liquefeito ou comprimido ou por um sistema de bomba adequado que dispensa os ingredientes ativos. Aerossóis podem ser liberados em sistemas de fase única, bifásicos, ou trifásicos de modo a liberar o(s) ingre- diente(s) ativo(s). A liberação do aerossol inclui o recipiente, ativadores, válvulas, subrecipientes necessários, e semelhantes, que juntos podem formar um kit. Uma pessoa de habilidade comum na técnica, sem experimentação inadequada pode determinar os aerossóis preferido.

[00212]As composições farmacêuticas podem ser preparadas por metodologia bem conhecida na técnica farmacêutica. Por exemplo, uma composição farmacêutica intencionada a ser administrada por injeção pode ser preparada combinando-se uma composição que compreende um anticorpo específico de CD40 como descrito aqui e opcionalmente, um ou mais de sais, tampões e/ou estabilizadores, com água destilada, estéril de modo a formar uma solução. Um tensoativo pode ser adicionado para facilitar a formação de uma solução ou suspensão homogêneas. Tensoativos são compostos que não interagem covalentemente com a composição de anticorpo de modo a facilitar a dissolução ou suspensão homogênea do anticorpo no sistema de liberação aquosa.

[00213]As composições podem ser administradas em uma quantidade tera- peuticamente eficaz, que variará dependendo de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto específico (por exemplo, anticorpo específico de CD40) utilizado; da estabilidade do metabólico e duração da ação do composto; da idade, peso corpóreo, saúde geral, sexo, e dieta do paciente; do modo e tempo de administração; da taxa de excreção; da combinação de medicamento; da severidade do transtorno ou condição particulares; e da terapia suportada pelo indivíduo. Geralmente, uma dose diária terapeuticamente eficaz é (para um mamífero de 70 kg) de cerca de 0,001 mg/kg (isto é, 0,07 mg) a cerca de 100 mg/kg (isto é, 7,0 g); preferivelmente uma dose terapeuticamente eficaz é (para um mamífero de 70 kg) de cerca de 0,01 mg/kg (isto é, 0,7 mg) a cerca de 50 mg/kg (isto é, 3,5 g); mais preferivelmente uma dose terapeuticamente eficaz é (para um mamífero de 70 kg mamífero) de cerca de 1 mg/kg (isto é, 70 mg) a cerca de 25 mg/kg (isto é, 1,75 g).

[00214]Composições compreendendo os anticorpos específicos de CD40 da presente divulgação também podem ser administradas simultaneamente com, antes, ou depois da administração de um ou mais outros agentes terapêuticos. Tal terapia de combinação pode incluir a administração de uma única formulação de dosagem farmacêutica que contém um composto da invenção e um ou mais agentes ativos adicionais, assim como administração de composições compreendendo anticorpos da invenção e cada agente ativo em sua própria formulação de dosagem farmacêutica separada. Por exemplo, um anticorpo como descrito aqui e o outro agente ativo podem ser administrados ao paciente juntos em uma composição de dosagem oral única tal como um tablete ou cápsula, ou cada agente administrado em formulações de dosagem oral separadas. Similarmente, um anticorpo como descrito aqui e o outro agente ativo podem ser administrados ao paciente juntos em uma única composição de dosagem parenteral tal como em uma solução salina ou outra solução fisio- logicamente aceitável, ou cada agente administrado em formulações de dosagem parenteral separadas. Onde formulações de dosagem separadas são usadas, as composições compreendendo anticorpos e um ou mais agentes ativos adicionais podem ser administradas essencialmente ao mesmo tempo, isto é, concorrentemente, ou em tempos separadamente escalonados, isto é, sequencialmente e em qualquer ordem; terapia de combinação é entendida a incluir todos estes regimes.

[00215]Assim, em certas modalidades, também considerada é a administração de composições de anticorpo anti-CD40 desta divulgação em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos. Tais agentes terapêuticos podem ser aceitos na técnica como um tratamento padrão para um estado de doença particular como descrito aqui, tal como artrite reumatoide, inflamação ou câncer. Agentes terapêuticos exemplares considerados incluem citocinas, fatores de crescimento, este- roides, NSAIDs, DMARDs, anti-inflamatórios, produtos quimioterapêuticos, produtos radioterapêuticos, ou outros agentes ativos e ancilares.

[00216]Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD40 divulgados aqui podem ser administrados em combinação com qualquer número de agentes quimiote- rapêuticos. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXANTM); sulfonatos de alquila tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carbo- quona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretami- na, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolome- lamina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridreto do óxido de mecloretamina, mel- falano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzi- nofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromi- cina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tuber- cidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocita- bina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tais como calusterona, propionato de dromosta- nolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglute- timida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tais como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; ansacrina; bestra- bucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidamina; mi- toguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; PSK.RTM.; razoxano; sizofiran; espi- rogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; uretano; vin- desina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) e doxetaxel (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gencitabina; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vimblastina; platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mito- xantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados do ácido retinoico tais como Targretin™ (be- xaroteno), Panretin™ (alitretinoína); ONTAK™ (denileucin diftitox); esperamicinas; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um do acima. Também incluídos nesta definição são agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação do hormônio em tumores tais como anti- estrógenos incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazois inibidores de aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, e toremifeno (Fareston); e anti-andrógenos tais como flutamida, nilutamida, bicaluta- mida, leuprolida, e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um do acima.

[00217]Uma variedade de outros agentes terapêuticos pode ser usada em combinação com os anticorpos anti-CD40 descritos aqui. Em uma modalidade, o anticorpo é administrado com um agente anti-inflamatório. Agentes ou medicamentos anti-inflamatórios incluem, mas não são limitados a, esteroides e glucocorticóides (incluindo betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, trianci- nolona), medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDS) incluindo aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicações anti- TNF, ciclofosfamida e micofenolato.

[00218]NSAIDs exemplares são escolhidos do grupo consistindo em ibupro- feno, naproxeno, naproxeno sódico, inibidores de Cox-2 tais como VIOXX® (rofeco- xib) e CELEBREX® (celecoxib), e sialilatos. Analgésicos exemplares são escolhidos do grupo consistindo em acetaminofeno, oxicodona, tramadol ou cloridreto de pro- porxifeno. Glucocorticóides exemplares são escolhidos do grupo consistindo em cor- tisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, ou predniso- na. Modificadores de resposta biológica exemplares incluem moléculas dirigidas contra marcadores de superfície celular (por exemplo, CD4, CD5, etc.), inibidores de citocina, tais como os antagonistas de TNF (por exemplo, etanercept (ENBREL®), adalimumabe (HUMIRA®) e infliximab (REMICADE®)), inibidores de quimiocina e inibidores de molécula de adesão. Os modificadores de resposta biológica incluem anticorpos monoclonais assim como formas recombinantes de moléculas. DMARDs exemplares incluem azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicila- mina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, Ouro (oral (auranofina) e intramuscular) e minociclina.

[00219]Em certas modalidades, os anticorpos descritos aqui são administrados em combinação com uma citocina. Por “citocina” como usado aqui é significado um termo genérico para proteínas liberadas por uma população de células que age em uma outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas, e hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão hormônios de crescimento tais como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano de N-metionila, e hormônio de crescimento bovino; hormônio da paratireoide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormônios de glicoproteína tais como hormônio estimulante folicular (FSH), hormônio estimulante da tireoide (TSH), e hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; fator- alfa e -beta de necrose tumoral; substância de inibição mulleriana; peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento nervoso tal como NGF-beta; fator de crescimento de plaqueta; fatores de crescimento transformantes (TGFs) tais como TGF-alfa e TGF-beta; fator de crescimento I e II semelhante à insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons tais como interferon- alfa, beta, e -gama; fatores estimulantes de colônia (CSFs) tais como macrófago- CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, um fator de necrose tumoral tal como TNF-alfa ou TNF- beta; e outros fatores de polipeptídeo incluindo LIF e ligante de kit (KL). Como usado aqui, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de célula re- combinante, e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequência nativa.

[00220]As composições compreendendo aqui os anticorpos específicos de CD40 descritos podem ser administradas a um indivíduo afligido com uma doença como descrito aqui, incluindo, mas não limitada a linfomas não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crônicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiplo, carcinomas do pâncreas, cólon, intestino gástrico, próstata, bexiga, rim, ovário, cérvix, mama, pulmão, nasofaringe, melanoma maligno e NHL resistente a rituximabe e leucemias, doenças autoimunes e inflamatórias. Doenças autoimunes incluem mas não são limitadas a, artrite (incluindo artrite reumatoide, artrite reativa), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), psoríase e doença inflamatória intestinal (IBD), encefalomielite, uveíte, miastenia grave, esclerose múl-tipla, diabete insulino-dependente, doença de Addison, doença celíaca, síndrome da fadiga crônica, hepatite autoimune, alopecia autoimune, espondilite anquilosante, colite ulcerativa, doença de Crohn, fibromialgia, pênfigo vulgar, síndrome de Sjogren, doença de Kawasaki, hipertireoidismo/doença de Graves, hipotireoidismo/doença de Hashimoto, endometriose, esclerodermia, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barré, doença de Wegener, glomerulonefrite, anemia aplásica (incluindo pacientes com anemia aplásica politransfundidos), hemoglobinú- ria paroxística noturna, síndrome mielodisplásica, púrpura trombocitopênica idiopáti- ca, anemia hemolítica autoimune, síndrome de Evan, síndrome inibitória do Fator VIII, vasculite sistêmica, dermatomiosite, polimiosite e febre reumática, síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS), penfigoide bolhoso autoimune, doença de Parkinson, sarcoidose, vitiligo, cirrose biliar primária, e miocardite autoimune.

[00221]Doenças inflamatórias incluem, mas não são limitadas a, doença de Crohn, colite, dermatite, psoríase, diverticulite, hepatite, síndrome do intestino irritável (IBS), lúpus eritematoso, nefrite, doença de Parkinson, colite ulcerativa, esclerose múltipla (MS), doença de Alzheimer, artrite, artrite reumatoide, asma, e várias doenças cardiovasculares tais como aterosclerose e vasculite. Em certas modalidades, a doença inflamatória é selecionada do grupo consistindo em artrite reumatoide, diabete, gota, síndrome periódica associada a criopirina, e transtorno pulmonar obstrutivo crônico. Sob esse aspecto, uma modalidade fornece um método de tratar, reduzir a severidade de ou prevenir a inflamação ou uma doença inflamatória administrando-se a um paciente em necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição aqui divulgada compreendendo anticorpos anti-CD40.

[00222]Para o uso in vivo para o tratamento de doença humana, os anticorpos descritos aqui são geralmente incorporados em uma composição farmacêutica antes da administração. Uma composição farmacêutica compreende um ou mais dos anticorpos descritos aqui em combinação com um veículo ou excipiente fisiolo- gicamente aceitáveis como descrito em outra parte aqui. Para preparar uma composição farmacêutica, uma quantidade eficaz de um ou mais dos compostos é misturada com qualquer veículo ou excipiente farmacêuticos conhecidos àqueles habilitados na técnica a serem adequados para o modo de administração particulares. Um veículo farmacêutico pode ser líquido, semilíquido ou sólido. Soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intradérmica, subcutânea ou tópica podem incluir, por exemplo, um diluente estéril (tal como água), solução salina, óleo fixo, polietile- noglicol, glicerina, propileno glicol ou outro solvente sintético; agentes antimicrobia- nos (tais como álcool benzílico e metil parabenos); antioxidantes (tais como ácido ascórbico e bissulfito de sódio) e agentes quelantes (tais como ácido etilenodiamina- tetraacético (EDTA)); tampões (tais como acetatos, citratos e fosfatos). Se administrados intravenosamente, veículos adequados incluem solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), e soluções contendo agentes espes- santes e solubilizantes, tais como glicose, polietilenoglicol, polipropileno glicol e misturas destes.

[00223]As composições compreendendo anticorpos específicos de CD40 como descrito aqui podem ser preparadas com veículos que protegem o anticorpo contra a eliminação rápida do corpo, tais como formulações de liberação por tempo ou revestimentos. Tais veículos incluem formulações de liberação controlada, tais como, mas não limitadas a, implantes e sistemas de liberação microencapsulados, e polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como etileno acetato de vinila, polia- nidretos, ácido poliglicólico, PEGs, poliortoésteres, ácido poliláctico e outros conhecidos àqueles de habilidade comum na técnica.

[00224]Fornecidos aqui são métodos de tratamento usando os anticorpos que ligam-se a CD40. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção é administrado a um paciente tendo uma doença envolvendo a expressão inapropria- da de CD40, que é significada no contexto da presente divulgação a incluir doenças e transtornos caracterizados por expressão ou atividade de CD40 aberrante devido, por exemplo, a alterações (por exemplo, aumentos ou diminuições estatisticamente significantes) na quantidade de uma proteína presente, ou na presença de uma proteína mutante, ou ambas. Uma superabundância pode ser devido a qualquer causa, incluindo mas não limitada à superexpressão no nível molecular, aparecimento prolongado ou acumulado no sítio de ação, ou atividade aumentada (por exemplo, em uma maneira estatisticamente significante) de CD40 em relação àquela que é nor-malmente detectável. Uma tal superabundância de CD40 pode ser medida em relação a expressão, aparecimento, ou atividade normais de eventos de sinalização de CD40, e a dita medição pode desempenhar um papel importante no desenvolvimen- to e/ou teste clínico dos anticorpos descritos aqui.

[00225]Os presentes anticorpos são úteis para o tratamento de uma variedade de canceres. Em certas modalidades, os anticorpos descritos aqui exercem atividade antitumoral ativando-se respostas imunes antitumorais. Em certas modalidades, os presentes anticorpos são úteis para o tratamento de uma variedade de canceres associados com a expressão aberrante de CD40. Em uma modalidade da invenção fornece um método para o tratamento de um câncer incluindo, mas não limitado a, linfomas não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crônicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiplo, carcinomas do pâncreas, cólon, intestino gástrico, próstata, bexiga, rim ovário, cér- vix, mama, pulmão, nasofaringe, melanoma maligno e NHL resistente a rituximabe e leucemias, administrando-se a um paciente com câncer uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um anticorpo específico de CD40 aqui divulgado. Uma quantidade que, a seguir da administração, inibe, previne ou retarda a progressão e/ou me- tástase de um câncer em uma maneira estatisticamente significante (isto é, em relação a um controle apropriado como será conhecido àqueles habilitados na técnica) é considerada eficaz.

[00226]Uma outra modalidade fornece um método para prevenir a metástase de um câncer incluindo, mas não limitado a, linfomas não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crônicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfo- blásticas agudas, mieloma múltiplo, carcinomas do pâncreas, cólon, intestino gástrico, próstata, bexiga, rim ovário, cérvix, mama, pulmão, nasofaringe, melanoma maligno e NHL resistente a rituximabe e leucemias, administrando-se a um paciente com câncer uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo específico de CD40 aqui divulgado (por exemplo, uma quantidade que, a seguir da administração, inibe, previne ou retarda a metástase de um câncer em uma maneira estatisticamente significante, isto é, em relação a um controle apropriado como será conhecido àqueles habilitados na técnica).

[00227]Uma outra modalidade fornece um método para prevenir um câncer incluindo, mas não limitado a, linfomas não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crônicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiplo, carcinomas do pâncreas, cólon, intestino gástrico, próstata, bexiga, rim ovário, cérvix, mama, pulmão, nasofaringe, melanoma maligno e NHL resistente a rituximabe e leucemias, administrando-se a um paciente com câncer uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo específico de CD40 aqui divulgado.

[00228]Uma outra modalidade fornece um método para tratar, melhorar os sintomas de, inibir a progressão de ou prevenção de linfomas não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crônicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiplo, carcinomas do pâncreas, cólon, intestino gástrico, próstata, bexiga, rim ovário, cérvix, mama, pulmão, nasofaringe, melanoma maligno e NHL resistente a rituximabe e leucemias administrando-se a um paciente afligido por uma ou mais destas doenças uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo específico de CD40 aqui divulgado.

[00229]Uma outra modalidade fornece um método para tratar, melhorar os sintomas de, inibir a progressão de ou prevenção de uma doença autoimune administrando-se a um paciente afligido por uma ou mais destas doenças uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40 aqui divulgado. Sob esse aspecto, doenças autoimunes incluem, mas não são limitadas a, artrite (incluindo artrite reumatoide, artrite reativa), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), psoríase e doença inflamatória intestinal (IBD), encefalomielite, uveíte, miastenia grave, esclerose múltipla, diabete insulino-dependente, doença de Addison, doença celíaca, síndrome da fadiga crônica, hepatite autoimune, alopecia autoimune, espondilite anquilosante, colite ulcerativa, doença de Crohn, fibromialgia, pênfigo vulgar, síndrome de Sjogren, doença de Kawasaki, hipertireoidismo/doença de Graves, hipotireoidismo/doença de Hashimoto, endometriose, esclerodermia, anemia perniciosa, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barré, doença de Wegener, glomerulonefrite, anemia aplásica (incluindo pacientes com anemia aplásica politransfundidos), hemoglobinú- ria paroxística noturna, síndrome mielodisplásica, púrpura trombocitopênica idiopáti- ca, anemia hemolítica autoimune, síndrome de Evan, síndrome inibitória do Fator VIII, vasculite sistêmica, dermatomiosite, polimiosite e febre reumática, síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS), penfigoide bolhoso autoimune, doença de Parkinson, sarcoidose, vitiligo, cirrose biliar primária, e miocardite autoimune.

[00230]Uma outra modalidade fornece um método para tratar, melhorar os sintomas de, inibir a progressão de ou prevenção de uma doença inflamatória administrando-se a um paciente afligido por uma ou mais destas doenças uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40 aqui divulgado. Doenças inflamatórias incluem, mas não são limitadas a, doença de Crohn, colite, dermatite, psoríase, diverticulite, hepatite, síndrome do intestino irritável (IBS), lúpus eritemato- so, nefrite, doença de Parkinson, colite ulcerativa, esclerose múltipla (MS), doença de Alzheimer, artrite, artrite reumatoide, asma, e várias doenças cardiovasculares tais como aterosclerose e vasculite. Em certas modalidades, a doença inflamatória é selecionada do grupo consistindo em artrite reumatoide, diabete, gota, síndrome periódica associada a criopirina, e transtorno pulmonar obstrutivo crônico.

[00231]Em uma outra modalidade, anticorpos anti-CD40 da presente invenção são usados para determinar a estrutura do antígeno ligado, por exemplo, epíto- pos conformacionais, estrutura esta que depois pode ser usada para desenvolver compostos tendo ou imitando esta estrutura, por exemplo, através de métodos de moldagem química e SAR.

[00232]Várias outras modalidades da presente invenção referem-se, em parte, a aplicações diagnósticas para detectar a presença de células ou tecidos que ex- pressam CD40. Assim, a presente divulgação fornece métodos de detectar CD40 em uma amostra, tal como detecção de células ou tecidos que expressam CD40. Tais métodos podem ser aplicados em uma variedade de formados de detecção conhecidos, incluindo, mas não limitados a imunoistoquímica (IHC), imunocitoquímica (ICC), hibridização in situ (ISH), hibridização in situ com embriões inteiros (WISH), hibridização in situ com DNA fluorescente (FISH), citometria de fluxo, imunoensaio enzimático (EIA), e imunoensaio ligado à enzima (ELISA).

[00233]ISH é um tipo de hibridização que usa um filamento de DNA ou RNA complementar rotulado (isto é, agente de ligação primário) para localizar uma sequência de DNA ou RNA específica em uma porção ou seção de uma célula ou tecido (in situ), ou se o tecido for pequeno o bastante, o tecido inteiro (ISH com embriões inteiros). Uma pessoa tendo habilidade comum na técnica avaliará que esta é distinta da imunoistoquímica, que localiza proteínas em seções de tecido usando um anticorpo como um agente de ligação primário. ISH de DNA pode ser usada em DNA genômico para determinar a estrutura dos cromossomos. ISH de DNA fluorescente (FISH) pode, por exemplo, ser usada em diagnósticos médicos para avaliar a integridade cromossômica. ISH de RNA (histoquímica de hibridização) é usada para medir e localizar mRNAs e outros transcritos dentro de seções de tecido ou com embriões inteiros.

[00234]Em várias modalidades, os anticorpos descritos aqui são conjugados a um rótulo detectável que pode ser detectado direta ou indiretamente. Sob esse aspecto, um “conjugado” de anticorpo refere-se a um anticorpo anti-CD40 que é co- valentemente ligado a um rótulo detectável. Na presente invenção, sondas de DNA, sondas de RNA, anticorpos monoclonais, fragmentos de ligação a antígeno destes, e derivados de anticorpo destes, tal como um anticorpo de fragmento variável de cadeia única ou um anticorpo marcado com epítopo, podem todos ser covalente- mente ligados a um rótulo detectável. Na “detecção direta”, apenas um anticorpo detectável é usado, isto é, um anticorpo detectável primário. Assim, detecção direta significa que o anticorpo que é conjugado a um rótulo detectável pode ser detectado, por si, sem a necessidade para a adição de um segundo anticorpo (anticorpo secundário).

[00235]Um “rótulo detectável” é uma molécula ou material que podem produzir um sinal detectável (tal como visualmente, eletronicamente ou diferente) que indica a presença e/ou concentração do rótulo em uma amostra. Quando conjugado a um anticorpo, o rótulo detectável pode ser usado para alocar e/ou quantificar o alvo ao qual o anticorpo específico é dirigido. Desse modo, a presença e/ou concentração do alvo em uma amostra pode ser detectada detectando-se o sinal produzido pelo rótulo detectável. Um rótulo detectável pode ser detectado direta ou indiretamente, e vários rótulos detectáveis diferentes conjugados a anticorpos específicos diferentes podem ser usados em combinação para detectar um ou mais alvos.

[00236]Exemplos de rótulos detectáveis, que podem ser detectados diretamente, incluem corantes fluorescentes e substâncias radioativas e partículas metálicas. Ao contrário, detecção indireta requer a aplicação de um ou mais anticorpos adicionais, isto é, anticorpos secundários, depois da aplicação do anticorpo primário. Assim, a detecção é realizada pela detecção da ligação do anticorpo secundário ou agente de ligação ao anticorpo detectável primário. Exemplos de agentes de ligação ou anticorpos detectáveis primários que requerem a adição de um agente de ligação ou anticorpo secundários incluem agentes de ligação detectáveis enzimáticos e agentes de ligação ou anticorpos detectáveis por hapteno.

[00237]Em algumas modalidades, o rótulo detectável é conjugado a um polímero de ácido nucleico que compreende o primeiro agente de ligação (por exemplo, em um processo de ISH, WISH, ou FISH). Em outras modalidades, o rótulo de- tectável é conjugado a um anticorpo que compreende o primeiro agente de ligação (por exemplo, em um processo de IHC).

[00238]Exemplos de rótulos detectáveis que podem ser conjugados a anticorpos usados nos métodos da presente divulgação incluem rótulos fluorescentes, rótulos enzimáticos, radioisótopos, rótulos quimiluminescentes, rótulos eletroquimi- luminescentes, rótulos bioluminescentes, polímeros, partículas poliméricas, partículas metálicas, haptenos, e corantes.

[00239]Exemplos de rótulos fluorescentes incluem 5-(e 6)-carboxifluoresceína, 5- ou 6-carboxifluoresceína, ácido 6-(fluoresceína)-5-(e 6)- carboxamido hexanoico, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, e corantes tais como Cy2, Cy3, e Cy5, cumarina opcionalmente substituída incluindo AMCA, PerCP, ficobiliproteínas incluindo R-ficoeritrina (RPE) e aloficoeritrina (APC), Texas Red, Princeton Red, proteína fluorescente verde (GFP) e análogos destes, e conjugados de R-ficoeritrina ou aloficoeritrina, rótulos fluorescentes inorgânicos tais como partículas com base em material semicondutor como nanocristalitos de CdSe revestidos.

[00240]Exemplos de rótulos de partícula polimérica incluem micropartículas ou partículas de látex de poliestireno, PMMA ou sílica, que podem ser embutidas com corantes fluorescentes, ou micelas ou cápsulas de polímero que contêm corantes, enzimas ou substratos.

[00241]Exemplos de rótulos de partícula metálica incluem partículas de ouro e partículas de ouro revestidas, que podem ser convertidas por manchas de cor prata. Exemplos de haptenos incluem DNP, isotiocianato de fluoresceína (FITC), biotina, e digoxigenina. Exemplos de rótulos enzimáticos incluem peroxidase de raiz forte (HRP), fosfatase alcalina (ALP ou AP), β-galactosidase (GAL), glicose-6-fosfato de- sidrogenase, β-N-acetilglucosamimidase, β-glucuronidase, invertase, Xantina Oxidase, luciferase de vagalume e glicose oxidase (GO). Exemplos de substratos comu- mente usados para peroxidase de raiz forte incluem 3,3’-diaminobenzidina (DAB), diaminobenzidina com realce com níquel, 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), dicloridreto de Benzidina (BDHC), reagente de Hanker-Yates (HYR), azul de indofenol (IB), te- trametilbenzidina (TMB), 4-cloro-1-naftol (CN), alfa-naftol pironina (alfa-NP), o- dianisidina (OD), 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP), azul de nitro tetrazólio (NBT), cloreto de 2-(p-iodofenil)-3-p-nitrofenil-5-fenil tetrazólio (INT), azul de tetranitro tetrazólio (TNBT), 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-galactosídeo/ferricianeto de ferro (BCIG/FF).

[00242]Exemplos de substratos comumente usados para fosfatase alcalina incluem Naftol-AS-B1-fosfato/fast red TR (NABP/FR), Naftol-AS-MX-fosfato/fast red TR (NAMP/FR), Naftol-AS-B1-fosfato/fast red TR (NABP/FR), Naftol-AS-MX- fosfato/fast red TR (NAMP/FR), Naftol-AS-B1-fosfato/nova fucsina (NABP/NF), bro- mocloroindolil fosfato/nitroazul de tetrazólio (BCIP/NBT), 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-b- -d-galactopiranosídeo (BCIG).

[00243]Exemplos de rótulos luminescentes incluem luminol, isoluminol, ésteres de acridínio, 1,2-dioxetanos e piridopiridazinas. Exemplos de rótulos eletroquimi- luminescentes incluem derivados de rutênio. Exemplos de rótulos radioativos incluem isótopos radioativos de iodeto, cobalto, selênio, trítio, carbono, enxofre e fósforo.

[00244]Rótulos detectáveis podem ser ligados aos anticorpos descritos aqui ou a qualquer outra molécula que especificamente liga-se a um marcador biológico de interesse, por exemplo, um anticorpo, uma sonda de ácido nucleico, ou um polímero. Além disso, uma pessoa de habilidade comum na técnica avaliará que rótulos detectáveis também podem ser conjugados ao segundo, e/ou terceiro, e/ou quarto, e/ou quinto agentes de ligação ou anticorpos, etc. Além disso, o técnico habilitado avaliaria que cada agente de ligação ou anticorpo adicionais usados para caracterizar um marcador biológico de interesse pode servir como uma etapa de amplificação de sinal. O marcador biológico pode ser detectado visualmente usando, por exemplo, microscopia óptica, microscopia fluorescente, microscopia eletrônica onde a substância detectável é, por exemplo, um corante, uma partícula de ouro coloidal, um reagente luminescente. Substâncias visualmente detectáveis ligadas a um marcador biológico também podem ser detectadas usando um espectrofotômetro. Onde a substância detectável é um isótopo radioativo a detecção pode ser visualmente por autorradiografia, ou não visualmente usando um contador de cintilação. Veja, por exemplo, Larsson, 1988, Immunocytochemistry: Theory and Practice, (CRC Press, Boca Raton, Fla.); Methods in Molecular Biology, vol. 80 1998, John D. Pound (ed.) (Humana Press, Totowa, N.J.).

[00245]A invenção fornece ainda kits para detectar CD40 ou células ou tecidos que expressam CD40 em uma amostra, em que os kits contêm pelo menos um anticorpo, polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor ou célula hospedeira como descrito aqui. Em certas modalidades, um kit pode compreender tampões, enzimas, rótulos, substratos, pérolas ou outras superfícies às quais os anticorpos da invenção são ligados, e semelhantes, e instruções para o uso.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Produção e Humanização de Anticorpos anti-CD40

[00246]Quatro coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados com Fc- hCD40 de coelho recombinante. O coelho com os títulos séricos mais altos de ligação específica a CD40 humana foi escolhido para a fusão celular. Um total de 172 hibridomas foram identificados como aglutinantes positivos para Fc-hCD40 solúvel, dos quais 44 clones foram descobertos ser aglutinantes positivos para superfície celular CD40. Depois do ensaio de agrupamento de epítopo, 24 hibridomas representativos foram selecionados para a expressão recombinante e caracterização adicional. A triagem funcional secundária foi realizada como descrito mais abaixo e incluiu: 1) indução da maturação de DC como medido pela suprarregulação de CD80, CD83, CD86 (atividade agonística); 2) indução da inibição do crescimento do tumor direta (atividade agonística); e 3) função efetora de anticorpo de ADCC. Os candida- tos foram selecionados com base em triagens funcionais duplas que incluíram dois braços: 1) afinidade de ligação, internalização de anticorpo, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento (CDC), e fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP); e 2) função agonística de ativação/maturação de DC, interação de receptor-ligante, reação linfocítica mista (MLR), proliferação celular e apoptose.

Triagem de Anticorpos Agonistas Via Maturação de Célula Dendrítica

[00247]Para esclarecer ainda mais o efeito agonístico ou antagonístico do painel inicial de anticorpos anti-CD40, um ensaio de maturação de DC foi usado como um indicador para triar quanto aos anticorpos funcionais. Anticorpos anti-CD40 ou de controle foram adicionados à solução de cultura de DC derivada de monócito humano por 2 dias. A suprarregulação de CD83, um dos marcadores de maturação mais bem conhecidos para células dendríticas humanas, foi medida para triar quanto aos anticorpos agonistas. 5C11, um anticorpo monoclonal de camundongo que induz a maturação de célula dendrítica foi usado como controle positivo. Os anticorpos R-3, R-6, R-8, R-9, R-16, R-18, R-24, R-33, R-36, 19-21, 19-45 e 19-59 aumentaram mais que 50 % da expressão de CD83 quando comparado com controle de Ig (Figura 1A). A maturação de DC foi determinada ainda medindo-se a superregulação induzida por anticorpo de moléculas coestimuladoras CD80 e CD86 para os anticorpos selecionados. Como mostrado na Figura 1B e Figura 1C, os anticorpos R-3, R-8, R-9, R-33 e 19-21 superregularam tanto CD80 quanto CD86, enquanto os outros anticorpos tiveram apenas efeitos modestos. Estes resultados foram compatíveis com os efeitos de modulação de CD83 por estes anticorpos. Interessantemente, entre os anticorpos capazes de induzir a maturação de DC, apenas o clone 19-21 mostrou atividade forte para realçar a proliferação de células T em uma reação linfocítica mista (Figura 1D).

Triagem quanto à Inibição Direta do Crescimento do Tumor

[00248]O painel de anticorpos agonistas anti-CD40 foi avaliado ainda quanto à capacidade para induzir a inibição do crescimento do tumor de células tumorais que expressam CD40. Todos os anticorpos anti-CD40 testados inibiram a proliferação de célula tumoral. O anticorpo 19-21 demonstrou a potência mais alta. (Figura 2).

Triagem quanto à Atividade de ADCC

[00249]Além da indução da ativação de APC e inibição do crescimento do tumor, função efetora de anticorpo, ADCC, foi usado como um critério importante para triar e classificar os candidatos a anticorpos. De modo a conduzir o ensaio de ADCC usando PBMC humana, todos os anticorpos selecionados foram convertidos de mAb de coelho a mAb quimérico com Fab de coelho e IgG1 humana. Como mostrado na Figura 3, todos os candidatos selecionados mostraram atividade de ADCC significante quando comparado ao controle de IgG1. Com base na atividade de ADCC máxima, os mAbs principais podem ser classificados como cR-8 > cR-3 > cR- 33 > c19-21> c R-9 > c19-59.

[00250]Quatro candidatos (c19-21, cR-8, cR-3, cR-33) foram selecionados com base na triagem funcional in vitro. Suas caracterizações in vitro são resumidas na tabela 1. O anticorpo c19-21 realça fortemente a ativação de DC e inibição do crescimento do tumor, enquanto os anticorpos cR-8 e cR-3 mostraram atividade de ADCC mais potente.Tabela 1. Características de 4 anticorpos anti-CD40 candidatos:

Triagem da Atividade Antitumoral In vivo

[00251]Visto que os 4 candidatos de topo mostraram potências diferentes em ensaios in vitro diferentes, nós conduzimos estudos in vivo para avaliar e comparar sua atividade antitumoral para a seleção principal. O modelo de xenoenxerto de tumor de Ramos foi usado. Camundongos portando tumor foram tratados i.p. com 5 mg/kg de anticorpos quiméricos cR-3, cR-8, cR-33 ou c19-21 3 vezes por semana para um total de 9 doses (oito animais por grupo). A atividade antitumoral de rituxi- mabe com o mesmo regime foi usada como uma referência. Como mostrado na Figura 4A, cR-8 e cR-3 mostraram o efeito antitumoral mais forte. Ao contrário, 19-21 exibiu atividade antitumoral mais baixa com ressalto de tumor mais rápido depois do término da dosagem. O efeito antitumoral de cR-33 foi intermediário, mas ainda exibiu melhor eficácia in vivo do que rituximabe. A potência in vivo de anticorpos cR-3 e cR-8 foi avaliada ainda em um estudo de resposta de dose. Como mostrado na Figura 4B, cR-8 mostrou eficácia antitumoral mais potente do que cR-3, e assim foi identificado como o anticorpo anti-CD40 principal.

[00252]A sequência de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do clone R-8 é apresentada nas SEQ ID NOs: 1 e 2. As sequências de aminoácido das CDRs do VH e VL são apresentadas nas SEQ ID NOs: 3 a 5 e 6 a 8, respectivamente. A sequência de aminoácido das sequências de cadeia pesada e leve de vários dos outros candidatos a anticorpos que mostraram atividade funcional é apresentada nas SEQ ID NOs: 11 a 56. Sequências de aminoácido de VHCDR e VLCDR para estes anticorpos são fornecidas nas SEQ ID NOs: 57 a 194. A Figura 16 mostra um alinhamento destas sequências, incluindo o clone R-8, com as CDRs sublinhadas.

[00253]R-8 foi humanizado usando uma tecnologia de humanização guiada por linhagem mutacional proprietária (MLG) (Veja por exemplo, a Patente U.S. No 7.462.697). A estrutura de cadeia leve e pesada do R-8 humanizado (APX005) é 95 % idêntica às sequências de linhagem germinativa humana. A sequência de amino- ácido das regiões VH e VL humanizadas é apresentada nas SEQ ID NOs: 9 e 10, respectivamente. A ligação de APX005 a CD40 foi descoberta ser similar ao seu clone precursor R-8.

EXEMPLO 2 Caracterização In vitro do Anticorpo anti-CD40 Humanizado APX005

[00254]Numerosos experimentos in vitro foram conduzidos para caracterizar o anticorpo humanizado APX005.

APX005 Seletivamente Liga-se a CD40

[00255]A seletividade de ligação de APX005 foi avaliada por ELISA direto a um painel de proteínas da família de TNFR. Um total de 1 μg/ml de fusão proteína de Fc de coelho e CD40, RANK, TweakR, OX40, DR5 e 4-1BB foi revestido em placas de ELISA. APX005 ligado foi detectado usando IgG conjugada a HRP antihumana de cabra. Como mostrado na Figura 5, APX005 seletivamente liga-se a CD40 humana mas não a outras proteínas da família de TNFR testadas.

APX005 Bloqueia a Ligação de CD40L a CD40

[00256]Um ELISA foi conduzido para avaliar o efeito de APX005 sobre a ligação de CD40L a CD40. Em particular, CD40L (concentração final de 4 μg/ml) foi usada para ligar-se à CD40 humana imobilizada sobre uma placa de ELISA, e mudanças na quantidade de ligação de CD40L a CD40 foram medidas depois de pré- incubar CD40 imobilizada com APX005. A ligação de CD40L a CD40 imobilizada foi detectada por um anticorpo monoclonal anti-CD40L camundongo. Como mostrado na Figura 6, APX005 bloqueia a ligação de CD40L a CD40. Ao contrário, SGN-40 aumenta a ligação.

Complexo de APX005/CD40 Não é Incorporado

[00257]De modo a avaliar a internalização mediada por alvo de APX005 para avaliar seu impacto sobre a atividade de ADCC, células de Ramos foram incubadas com APX005 por 4 h a 37 °C, uma temperatura permissiva para internalização, ou a 4 °C por 30 minutos, uma temperatura em que a internalização é minimizada. As células foram lavadas com tampão de manchamento, seguido por incubação com IgG anti-humana de cabra rotulada com Alexa 488 por um adicional de 30 minutos a 4 °C. A análise de FACS foi realizada para examinar o nível de APX005 na superfície celular. Como mostrado na Figura 7, não houve nenhuma redução (leve aumento) do nível de APX005 na superfície celular depois da incubação a 37 °C. Os dados sugerem que na ligação a CD40 o complexo de APX005/CD40 não foi incorporado por células tumorais, fornecendo assim condições ideais para recrutar as células efetoras para ADCC.

APX005 Medeia ADCC

[00258]De modo a avaliar a atividade de ADCC de APX005 em células tu- morais que expressam CD40, Ramos e Daudi que expressam CD40 foram usadas como células alvos e célula mononuclear de sangue periférico humana fresca (PBMC) foi usada como as células efetoras. ADCC foi medida por um ensaio de liberação de calceína-AM. Células alvos foram rotuladas com calceína-AM (15 uM/106 células), lavadas, e plaqueadas em triplicata em 5 x 103 por reservatório em placas de 96 reservatórios de fundo redondo. Concentrações crescentes (0,0001 a 10 μg/mL) de APX005 ou anticorpos de controle foram pré-incubadas a 4 °C por 30 minutos, depois de que células efetoras PBMC de doadores humanos saudáveis foram adicionadas com uma razão de célula efetora:alvo final de 40:1 em um volume final de 200 uL por reservatório. Experimentos foram realizados usando PBMC de pelo menos três doadores diferentes. Depois de uma incubação de 4 horas, 100 μL de sobrenadantes de cultura foram transferidos para uma placa Black View Plate-96 e unidades fluorescentes arbitrárias (AFU) foram lidas em um leitor de placa Victor II (485 nm de excitação/535 nm de emissão). Porcentagem de lise específica = (liberação experimental média de AFU-liberação espontânea média de AFU)/(liberação máxima média de AFU-AFU liberação espontânea média). Como mostrado na Figura 8, APX005 induziu ADCC em uma forma dependente de dose. Um efeito similar foi observado para SGN-40. A sensibilidade diferente de células de Ramos e Daudi à ADCC pode ser devida ao nível de expressão de CD40 diferente (Cancer Res 2005; 65: 8331-8338).

APX005 Inibe a Proliferação de Célula Tumoral

[00259]Para avaliar a capacidade de APX005 de inibir a proliferação de célula tumoral, células de Ramos foram semeadas em placas de fundo plano de 96 reservatórios a 50.000 células/reservatório em 200 μL de RPMI 1640 suplementado com 10 % de FBS contendo concentrações variadas de APX005, SGN-40 ou uma IgG humana de controle. Para reticulação, APX005, SGN-40 ou IgG de controle foram pré-incubados com fragmentos F(ab’)2 de um anticorpo específico de fragmento Fc de IgG anti-humana de cabra no meio por 30 minutos na temperatura ambiente antes de serem adicionados às células. As células foram tratadas por um total de 72 horas. Depois AlamarBlue® a 10 % (Serotec, Oxford, UK) foi adicionado a cada re-servatório e incubado por um adicional de 24 horas. A viabilidade celular foi medida por um leitor de fluorescência CytoFluor com um comprimento de onda de excitação de 530 nm e comprimento de onda de emissão de 590 nm. Todos os estudos foram conduzidos duas vezes e em triplicatas para cada concentração da amostra. Como mostrado na Figura 9, o monômero APX005 inibiu a proliferação de células de Ramos (Figura 9A). Quando APX005 foi reticulado por um anticorpo secundário, ele liberou um efeito inibitório de proliferação aumentado e dependente de dose (Figura 9B). A reticulação de APX005 pode ser obtida in vivo por células que expressão receptor de Fc.

APX005 Induz a Ativação de DC

[00260]De modo a avaliar a capacidade de APX005 de estimular a maturação de células DC, PBMC foram preparadas por centrifugação de gradiente de densidade usando solução de isolamento de linfócito. Monócitos aderentes foram colhidos depois de incubar por 2 horas a 37 °C. Monócitos isolados foram cultivados com 100 ng/ml de GM-CSF humano recombinante e 100 ng/ml de IL-4 humana recombi- nante em meio RPMI1640 suplementado com 10 % de FCS em uma placa de 24 reservatórios. Metade do meio foi mudada depois de 3 dias. No dia 5 de cultura, 1,3 nM de anticorpos anti-CD40, CD40L ou o anticorpo de controle foram adicionados às células DC, e cultivados por 48 h em uma placa de 24 reservatórios. Para mancha- mento de marcador de ativação de DC, anti-CD83, anticorpo anti-CD86 e anticorpo anti-CD80 conjugados a PE foram usados. A análise foi realizada usando FACS. Os dados são de um estudo representativo. Como mostrado na Figura 10, APX005 induziu a maturação de DC marcada e seu efeito parece mais potente do que SGN-40 e CD40L. A ativação aumentada de DC pode levar a respostas de célula T antitumo- rais mais potentes.

APX005 é Reativo Cruzado com CD40 de Macaco mas não com CD40 de Camundongo

[00261]A reatividade cruzada foi avaliada por ELISA direto. Um total de 1 μg/ml de CD40 humana, CD40 de macaco ou CD40 de camundongo foi revestido em placas de ELISA seguido por incubação com 1 μg/ml de APX005 ou IgG1 de controle. Os anticorpos ligados a CD40 foram detectados usando IgG anti-humana de cabra conjugada com HRP. APX005 claramente reage cruzado com CD40 de macaco mas não com CD40 de camundongo. (Figura 11A)

[00262]A reatividade cruzada de APX005 com camundongo CD40 foi determinada ainda por ligação de FACS a uma linhagem de célula A20 de camundongo que expressa CD40 de camundongo. Uma alíquota de 0,5 x 106 células A20 foi adicionada a placas de 96 reservatórios e incubada com 100 μl de anticorpo de CD40 anti-camundongo de rato diluído conjugado com os anticorpos de controle de PE, APX005 ou IgG1. Depois da lavagem, 100 μl de IgG anti-humana de cabra (H+L) conjugada com R-PE (Southern Biotech CAT#2040-09) foram adicionados em diluição a 1:200 em PBS à amostra e incubados para a detecção de APX005 e IgG1 humana de controle. Um anticorpo de CD40 anti-camundongo de rato conjugado com PE foi usado como o controle positivo. As amostras foram recolocadas em suspensão com 0,5 ml de PBS e analisadas por FACS. Os dados de FACS mostraram que APX005 não reage cruzado com CD40 de camundongo (Figura 11B).

[00263]Em resumo, os experimentos neste Exemplo mostraram que APX005 é um anticorpo de IgG1 humanizado que liga-se a CD40. APX005 especificamente liga-se a CD40 com uma Kd de 9,6 x 10-10 M e bloqueia a ligação de CD40L a CD40. Isto é ao contrário do anticorpo anti-CD40 de SGN40 que realça a interação de CD40-CD40L. Isto sugere que estes dois anticorpos ligam-se a epítopos distintos. In vitro, APX005 mostrou atividade de ADCC potente a células de linfoma positivas de CD40 (Ramos e Daudi) assim como a capacidade de inibir diretamente a proliferação de célula tumoral (Ramos) na reticulação. APX005 também estimulou a maturação de células dendríticas para realçar a resposta imune celular. Adicionalmente, APX005 mostrou reagir cruzado com CD40 de macaco.

EXEMPLO 3 Caracterização In vivo do Anticorpo anti-CD40 Humanizado APX005

[00264]Numerosos experimentos in vivo foram conduzidos para caracterizar ainda o anticorpo humanizado APX005.

Inibição de APX005 do Crescimento do Tumor no Modelo de Ramos

[00265]De modo a avaliar o efeito de APX005 sobre o modelo de xenoenxer- to de linfoma de célula B humano, camundongos BALB/c nu/nu fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram usados para a inoculação de célula tumoral. Xenoenxertos foram estabelecidos por inoculação subcutânea de 1 x 107 células tumo- rais/camundongo nos flancos dorsais. Quando os tumores atingiram um volume médio de cerca de 100 mm3 (50 ~ 200 mm3), os animais foram randomizados nos grupos. Os anticorpos foram administrados intraperitonealmente em 3 mg/kg começando no dia 13 (Veja a Figura 12). A dosagem foi administrada 3 vezes por semana para um total de 9 doses (oito animais por grupo). Dimensões perpendiculares do tumor foram medidas usando um calibrador de escala de Vernier. Os volumes do tumor foram calculados usando a fórmula: Volume = (comprimento x largura2)/2. Como mostrado na Figura 12A, APX005 demonstrou atividade antitumoral potente e duradoura. O soro foi retirado no dia 34, dois dias depois da última dosagem, para determinar níveis de medicamento in vivo medindo-se concentrações de IgG humana (Veja a Figura 12B). A eficácia antitumoral mediada por APX005 foi maior do que aquela de SGN-40 e persistiu muito tempo depois do período de dosagem. A análise de PK de ponto único mostrou que a atividade antitumoral superior de APX005 não foi devido à diferença de PK.

Inibição por APX005 de Tumores Pré-Tratados e Resistentes a Rituximabe

[00266]O propósito deste experimento foi avaliar o efeito de APX005 sobre linfoma de célula B pré-tratado e resistente a rituximabe. Camundongos nus que portam tumores de Ramos estabelecidos foram primeiro tratados com rituximabe a 3 mg/kg para 5 doses. O crescimento do tumor foi parcialmente inibido por rituximabe (Figura 13A). Quando estes tumores atingiram o tamanho de cerca de 700 mm3, eles foram randomizados em 4 grupos (7 animais por grupo) e retratados i.p. com APX005, rituximabe, análogo de SGN40 a 3 mg/kg ou controle com solução salina por 3 semanas (Figura 13B). Como mostrado na Figura 13, tumores pré-tratados com rituximabe falhariam a responder ao retratamento com rituximabe, sugerindo que estes tumores são resistentes a rituximabe (Figura 13B). APX005 exibiu a capacidade de inibir o crescimento de tumores resistentes a rituximabe.

Inibição por APX005 do Crescimento do Tumor no Modelo de Raji

[00267]O propósito deste experimento foi determinar o relacionamento entre dose e eficácia de APX005 in vivo. Camundongos nus que portam tumores de Raji positivos de CD40 estabelecidos foram tratados com APX005 começando no dia 15. Doses de APX005 variando de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg foram administradas i.p. 3 ve- zes/semana por 2 semanas (oito animais por grupo) (Veja a Figura 14). Solução salina foi usada como tratamento de controle. Volumes do tumor foram medidos em cada dia de dosagem. Níveis séricos de APX005 em cada grupo também foram medidos 3 dias depois da última dosagem para determinar a correlação da eficácia in vivo com os níveis de APX005 na circulação. Atividade antitumoral dependente de dose clara foi observada (Veja a Figura 14). As diferenças nos volumes de tumor foram significantes (P < 0,05) entre o grupo de controle e grupos de tratamento com anticorpo com níveis de dose > 1 mg/kg nos dias 29 a 33. A dose eficaz mínima foi determinada como 1 mg/kg, que correspondeu a uma concentração sérica mediana de 0,49 μg/ml no dia 36. As diferenças nos volumes de tumor entre os grupos de dose de 3, 5 e 10 mg/kg não foram estatisticamente significantes. Assim, a atividade antitumoral máxima foi obtida em doses > 3 mg/kg com uma concentração sérica mediana > 1,6 μg/ml.

Inibição do Crescimento do tumor em Modelo de IM-9 de MM Humano por APX005

[00268]De modo a avaliar a atividade antitumoral de APX005 em modelo de mieloma múltiplo humano, camundongos nus que portam tumores de IM-9 de mi- eloma múltiplo positivos de CD40 estabelecidos foram tratados i.p. com APX005 ou SGN40 começando no dia 15. APX005 foi dado a 3 mg/kg, 3 vezes/semana por 3 semanas (5 animais por grupo). Os volumes de tumor foram medidos em cada dia de dosagem.

[00269]APX005 demonstrou atividade antitumoral potente contra mieloma múltiplo humano no modelo de xenoenxerto de IM-9 (Veja a Figura 15). A eficácia antitumor mediada por APX005 foi significantemente maior do que aquela de SGN- 40 (P < 0,05).

Inibição do Crescimento do Tumor no Modelo de Ramos por APX005 quando comparado com SGN-40 e Rituximabe

[00270]O propósito deste experimento foi comparar a atividade antitumoral de APX005, rituximabe e SGN-40 em um modelo de xenoenxerto de Ramos de lin- foma de célula B humano. Os xenoenxertos foram estabelecidos por inoculação subcutânea de células de Ramos nos flancos dorsais de camundongos SCID C.B-17 fêmeas. Quando os tumores atingiram um volume médio de cerca de 200 a 300 mm3, os animais foram randomizados em 6 grupos. Os anticorpos foram administrados intraperitonealmente em doses como indicado na Figura 17. A dosagem foi ad-ministrada 3 vezes por semana para um total de 9 doses (10 animais por grupo). Dimensões perpendiculares do tumor foram medidas usando um calibrador de escala de Vernier. Os volumes de tumor foram calculados usando a fórmula: Volume = (comprimento x largura2)/2. A sobrevivência dos camundongos foi também determinada e registrada.

[00271]APX005 demonstrou atividade antitumor dependente de dose. O tratamento com a dose alta de APX005 (10 mg/kg) resultou na regressão completa do tumor, enquanto rituximabe na mesma dose (10 mg/kg) apenas retardou o crescimento do tumor, sugerindo que APX005 é mais eficaz do que rituximabe neste modelo. APX005 é também mais potente do que SGN-40 (Figura 17A). APX005 não apenas inibiu o crescimento do tumor mas também melhorou a sobrevivência dos animais que portam tumor (Figura 17B).

Inibição do Crescimento do Tumor em um modelo de xenoenxerto de linfoma de Namalwa humano resistente a rituximabe

[00272]O propósito deste experimento foi comparar a atividade antitumoral de APX005, rituximabe e SGN-40 no modelo de linfoma de Namalwa humano resis- tente a rituximabe. Xenoenxertos foram estabelecidos por inoculação subcutânea de células de Namalwa nos flancos dorsais de camundongos SCID C.B-17 fêmeas. Quando os tumores atingiram um volume médio de cerca de 200 a 300 mm3, os animais foram randomizados em 6 grupos. Os anticorpos foram administrados i.p. nas doses indicadas na Figura 18. A dosagem foi administrada 3 vezes por semana para um total de 9 doses (10 animais por grupo). Dimensões perpendiculares do tumor foram medidas usando um calibrador de escala de Vernier. Volumes de tumor foram calculados usando a fórmula: Volume = (comprimento x largura2)/2. A sobrevivência dos camundongos foi também determinada e registrada.

[00273]APX005 demonstrou atividade antitumoral potente no modelo de lin- foma de Namalwa resistente a rituximabe (Figura 18A). APX005 também melhorou a sobrevivência de camundongos que portam tumores resistentes a rituximabe (Figura 18B).

[00274]Em resumo, os experimentos neste Exemplo mostraram que a eficácia de APX005 foi examinada em modelos de tumor de xenoenxerto múltiplo. APX005 inibiu acentuadamente o crescimento do tumor no modelo de Ramos. Interessantemente, o efeito terapêutico persistiu muito além do período de dosagem. O tratamento com APX005 resultou na inibição de tumores pré-tratados e resistentes a rituximabe. Um estudo de descoberta de faixa de dose foi realizado no modelo de Raji e descobriu que a dose eficaz mínima foi determinada como 1 mg/kg, e a atividade antitumoral máxima foi observada em doses > 3 mg/kg. Além do linfoma de célula B, APX005 também exibiu atividade antitumoral potente significante no modelo de IM-9 de mieloma múltiplo humano.

[00275]Assim, os Exemplos acima demonstram que APX005 pode ser usado para melhorar o tratamento de pacientes com NHL, CLL, mieloma múltiplo e certos tumores sólidos que expressam o alvo de CD40. Na ligação a CD40, APX005 recruta células citotóxicas para matar células tumorais via ADCC. APX005 também pode inibir diretamente a proliferação de célula tumoral e ativar APC via sua atividade agonística. In vivo, APX005 inibiu acentuadamente o crescimento de xenoenxertos de tumor humano que expressam CD40 múltiplos e mostrou efeitos antitumorais duradouros. APX005 é também capaz de inibir o mieloma múltiplo humano e tumores pré-tratados e resistentes a rituximabe.

[00276]As várias modalidades descritas acima podem ser combinadas para fornecer outras modalidades. Todas as patentes U.S., publicações de pedido de patente U.S., pedidos de patente U.S., patentes estrangeiras, pedidos de patente estrangeiros e publicações que não de patente referidos neste relatório descritivo e/ou listados na Folha de Dados do Pedido são incorporados aqui por referência, em sua totalidade. Os aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário para utilizar conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para fornecer ainda outras modalidades.

[00277]Estas e outras mudanças podem ser feitas às modalidades à luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações seguintes, os termos usados não devem ser interpretados para limitar as reivindicações às modalidades específicas divulgadas no relatório descritivo e nas reivindicações, mas devem ser interpretados para incluir todas as modalidades possíveis junto com o escopo completo de equivalentes aos quais tais reivindicações são intituladas. Consequentemente, as reivindicações não são limitadas pela divulgação.

Claims

1. Anticorpo recombinante, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, CARACTERIZADO pelo fato de que se liga à CD40 e é um agonista de CD40, e que compreende (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a região VHCDR1 apresentada na SEQ ID NO: 3, a região VHCDR2 apresentada na SEQ ID NO: 4, e a região VHCDR3 apresentada na SEQ ID NO: 5; e (ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo a região VLCDR1 apresentada na SEQ ID NO: 6, a região VLCDR2 apresentada na SEQ ID NO: 7, e a região VLCDR3 apresentada na SEQ ID NO: 8.

2. Anticorpo recombinante, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoá- cidos apresentada na SEQ ID NO: 1; ou (b) a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoáci- dos apresentada na SEQ ID NO: 2.

3. Anticorpo recombinante, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, CARACTERIZADO pelo fato de que se liga à CD40 e é um agonista de CD40, e que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a região VLCDR1 apresentada na SEQ ID NO: 6, a região VLCDR2 apresentada na SEQ ID NO: 7 e a região VLCDR3 apresentada na SEQ ID NO: 8.

4. Anticorpo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) o anticorpo é humanizado; (b) o anticorpo é humanizado, em que a região VH compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9; (c) o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo de cadeia única, um ScFv, um anticorpo univalente que carece de uma região de dobradiça, e um minicorpo; (d) o anticorpo é um Fab ou um fragmento Fab’; (e) o anticorpo é um fragmento F(ab’)2; (f) o anticorpo é um anticorpo integral; ou (g) o anticorpo recombinante compreende um domínio constante de IgG humana, em que, opcionalmente, o domínio constante de IgG compreende um domínio CH1 de IgG1 ou uma região Fc de IgG1.

5. Anticorpo recombinante, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que se liga à CD40 com uma KD de 0,96 nM ou mais baixa.

6. Anticorpo recombinante, ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo recombinante, ou um fragmento de ligação a antígeno deste: (a) bloqueia a ligação de CD40 à CD40L; (b) ativa as células apresentadoras de antígeno; (c) estimula a liberação de citocinas a partir de células apresentadoras de antígeno; (d) induz a apoptose de células tumorais; (e) inibe a proliferação de células tumorais; (f) mata células tumorais através da indução de funções efetoras selecionadas do grupo que consiste em citotoxicidade celular dependente de anticorpo, citoto- xicidade dependente do complemento, e fagocitose celular dependente de anticorpo; (g) estimula respostas de células T antitumorais; (h) reduz tumores estabelecidos; (i) inibe tumores resistentes a rituximabe; ou (j) uma combinação de qualquer um ou mais de (a)-(i).

7. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um veículo fisiologicamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo recombinante ou do fragmento de ligação ao antígeno deste, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Uso da composição como definida na reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para: (a) tratar ou melhorar os sintomas em um paciente tendo um câncer, em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em linfomas não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias linfocíticas crônicas, leucemias de células pilosas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiplo, carcinomas do cólon, intestino gástrico, próstata, bexiga, rim, ovário, cérvix, mama, pulmão, nasofaringe, melanoma maligno e NHL e leucemias resistentes a rituximabe; (b) melhorar os sintomas em um paciente tendo uma doença autoimune; ou (c) melhorar os sintomas em um paciente tendo uma doença inflamatória.