JP2018510842A - イオン濃度依存的抗原結合ドメインを含む抗体、Fc領域改変体、IL−8に結合する抗体、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2015年2月5日に日本国に出願された日本国優先権特許出願第2015−021371号および2015年9月18日に日本国に出願された同第2015−185254号に関連し、係る出願に対する優先権を主張する。係る出願の内容は、その全文が参照により組み込まれる。
本開示は、非排他的な一態様において、イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗体、および該抗体を含む医薬組成物に関する。該抗体をコードする核酸、および該核酸を含む宿主細胞も提供され、該抗体および該医薬組成物の使用および製造方法も同様に提供される。非排他的な別の態様において、本開示は、Fc領域改変体および該改変体を含む抗体、ならびに該Fc領域改変体および該抗体を含む医薬組成物を提供する。Fc領域改変体および抗体をコードする核酸、ならびに該核酸を含む宿主細胞も提供され、該Fc領域改変体および該抗体および該医薬組成物の使用および製造方法も同様に提供される。本開示は、非排他的な第三の態様において、抗IL−8抗体、該抗体を含む医薬組成物、該抗体をコードする核酸、および該核酸を含む宿主細胞を提供する。例えばIL−8が関連する疾患の治療におけるIL−8抗体及び医薬組成物の製造方法及び使用も提供する。
〔1〕 イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗体であって、前記抗体の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されていることで等電点(pI)が上昇している、抗体。
〔2〕 前記抗原が、可溶型抗原である、〔1〕に記載の抗体。
〔3〕 前記抗原結合ドメインが、低イオン濃度の条件下での抗原に対する結合活性よりも高イオン濃度の条件下での抗原に対する結合活性が高いドメインである、〔1〕又は〔2〕に記載の抗体。
〔4〕 前記イオン濃度が水素イオン濃度(pH)又はカルシウムイオン濃度である、〔1〕〜〔3〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔5〕 前記抗原に対するpH酸性域でのKDとpH中性域でのKDの比であるKD(酸性pH域)/KD(中性pH域)が2以上である、〔4〕に記載の抗体。
〔6〕 前記抗原結合ドメインにおいて、少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されているか、又は、少なくとも1つのヒスチジンが挿入されている、〔1〕〜〔5〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔7〕 前記改変前の抗体と比較して、血漿中からの前記抗原の消失を促進できる、〔1〕〜〔6〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔8〕 前記改変前の抗体と比較して、細胞外マトリックスへの結合活性が増大されている、〔1〕〜〔7〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔9〕 前記アミノ酸残基の改変が、アミノ酸残基の置換である、〔1〕〜〔8〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔10〕 前記アミノ酸残基の改変が、
(a)負の電荷を有するアミノ酸残基から電荷を有さないアミノ酸残基への置換;
(b)負の電荷を有するアミノ酸残基から正の電荷を有するアミノ酸残基への置換;及び、
(c)電荷を有さないアミノ酸残基から正の電荷を有するアミノ酸残基への置換
からなる群から選択される、〔1〕〜〔9〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔11〕 前記抗体が可変領域及び/又は定常領域を含み、かつ、前記アミノ酸残基の改変が、前記可変領域及び/又は定常領域におけるアミノ酸残基の改変である、〔1〕〜〔10〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔12〕 前記可変領域が、相補性決定領域(CDR)及び/又はフレームワーク領域(FR)を含む、〔11〕に記載の抗体。
〔13〕 前記可変領域が重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域を含み、かつ、少なくとも1つのアミノ酸残基が、Kabatナンバリングで表される、
(a)重鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、19位、23位、25位、26位、39位、41位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、77位、81位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、86位、105位、108位、110位、及び112位;
(b)重鎖可変領域のCDRにおいて31位、61位、62位、63位、64位、65位、及び97位;
(c)軽鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、7位、8位、9位、11位、12位、16位、17位、18位、20位、22位、37位、38位、39位、41位、42位、43位、45位、46位、49位、57位、60位、63位、65位、66位、68位、69位、70位、74位、76位、77位、79位、80位、81位、85位、100位、103位、105位、106位、107位、及び108位;及び、
(d)軽鎖可変領域のCDRにおいて24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、及び56位
からなる群から選択される、CDR又はFRにおける位置で改変されている、〔12〕に記載の抗体。
〔14〕 少なくとも1つのアミノ酸残基が、
(a)重鎖可変領域のFRにおいて8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、23位、39位、41位、43位、44位、77位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、及び105位;
(b)重鎖可変領域のCDRにおいて31位、61位、62位、63位、64位、65位、及び97位;
(c)軽鎖可変領域のFRにおいて16位、18位、37位、41位、42位、45位、65位、69位、74位、76位、77位、79位、及び107位;及び、
(d)軽鎖可変領域のCDRにおいて24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、及び56位
からなる群から選択される、CDR又はFRにおける位置で改変されている、〔13〕に記載の抗体。
〔15〕 少なくとも1つのアミノ酸残基が、EUナンバリングで表される、
196位、253位、254位、256位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、307位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、及び443位
からなる群から選択される、定常領域における位置で改変されている、〔11〕〜〔14〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔16〕 少なくとも1つのアミノ酸残基が、
254位、258位、281位、282位、285位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、418位、419位、421位、433位、434位、及び、443位
からなる群から選択される、定常領域における位置で改変されている、〔15〕に記載の抗体。
〔17〕 少なくとも1つのアミノ酸残基が、EUナンバリングで表される、
282位、309位、311位、315位、342位、343位、384位、399位、401位、402位、及び、413位
からなる群から選択される、定常領域における位置で改変されている、〔16〕に記載の抗体。
〔18〕 前記定常領域が、Fc gamma受容体(FcγR)に対する結合活性を有し、天然型IgGの定常領域を含む参照抗体と比較して、中性pH条件下でFcγRに対する結合活性が増大されている、〔1〕〜〔17〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔19〕 前記FcγRが、FcγRIIbである、〔18〕に記載の抗体。
〔20〕 前記定常領域が、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、およびFcγRIIaからなる群より選択される1つまたは複数の活性型FcγRに対する結合活性、ならびにFcγRIIbに対する結合活性を有し、天然型IgGの定常領域である定常領域を有している点のみが異なる参照抗体と比較して、前記FcγRIIbに対する結合活性が維持もしくは増大される一方で、前記活性型FcγRに対する結合活性が減少している、〔1〕〜〔17〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔21〕 前記定常領域が、FcRnに対する結合活性を有し、天然型IgGの定常領域である定常領域を有している点のみが異なる参照抗体と比較して、中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcRnに対する結合活性が増大されている、〔1〕〜〔20〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔22〕 少なくとも2種類の抗原と結合する多重特異性抗体である、〔1〕〜〔21〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔23〕 前記抗体がIgG抗体である、〔1〕〜〔22〕のいずれか1つに記載の抗体。
〔24〕 〔1〕〜〔23〕のいずれかに記載の抗体を含む医薬組成物。
〔25〕 血漿中からの抗原の消失を促進するための、〔24〕に記載の医薬組成物。
〔26〕 細胞外マトリックスへの抗体結合を増大させるための、〔24〕又は〔25〕に記載の医薬組成物。
〔27〕 〔1〕〜〔23〕のいずれか1つに記載の抗体をコードする核酸。
〔28〕 〔27〕に記載の核酸を含むベクター。
〔29〕 〔28〕に記載のベクターを含む宿主細胞。
〔30〕 イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗体の製造方法であって、〔29〕に記載の宿主細胞を培養して前記細胞の培養物から抗体を回収する工程を含む、製造方法。
〔30A〕 イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗体の製造方法であって、等電点(pI)が上昇するように抗体の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する工程を含む、製造方法。
〔30B〕 少なくとも1つのアミノ酸残基が、
(I)Kabatナンバリングで表される、
(a)重鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、19位、23位、25位、26位、39位、41位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、77位、81位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、86位、105位、108位、110位、及び112位;
(b)重鎖可変領域のCDRにおいて31位、61位、62位、63位、64位、65位、及び97位;
(c)軽鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、7位、8位、9位、11位、12位、16位、17位、18位、20位、22位、37位、38位、39位、41位、42位、43位、45位、46位、49位、57位、60位、63位、65位、66位、68位、69位、70位、74位、76位、77位、79位、80位、81位、85位、100位、103位、105位、106位、107位、及び108位;及び、
(d)軽鎖可変領域のCDRにおいて24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、及び56位
からなる群から選択される、CDR又はFRにおける位置;または
(II)EUナンバリングで表される、
196位、253位、254位、256位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、307位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、及び443位
からなる群から選択される、定常領域における位置
で改変される、〔30A〕に記載の方法。
〔31〕 前記アミノ酸残基の改変が、
(a)負の電荷を有するアミノ酸残基から電荷を有さないアミノ酸残基への置換;
(b)負の電荷を有するアミノ酸残基から正の電荷を有するアミノ酸残基への置換;
(c)電荷を有さないアミノ酸残基から正の電荷を有するアミノ酸残基への置換;及び、
(d)CDRまたはFRにおけるヒスチジンへの置換またはヒスチジンの挿入
からなる群から選択される改変を含む、〔30A〕または〔30B〕に記載の方法。
〔32〕 参照抗体と比較して、
(a)血漿中からの抗原の消失を促進できる抗体を選択する工程;
(b)細胞外マトリックスへの結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(c)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcγRに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(d)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcγRIIbに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(e)FcγRIIbに対する結合活性が維持もしくは増大される一方で、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、およびFcγRIIaからなる群から好ましくは選択される1つまたは複数の活性型FcγRに対する結合活性が減少している抗体を選択する工程;
(f)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcRnに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(g)等電点(pI)を上昇させた抗体を選択する工程;
(h)回収した抗体の等電点(pI)を確認後、等電点(pI)を上昇させた抗体を選択する工程;及び、
(i)イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化もしくは増加されている抗体を選択する工程
のいずれか1つ以上を任意にさらに含む、〔30〕または〔30A〕〜〔30C〕のいずれか1つに記載の方法。
〔A1〕 定常領域を有する抗体であって、〔15〕または〔16〕に規定される群における改変部位と同一の改変部位の群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基が前記定常領域において改変されている、抗体。
〔A2〕 さらに重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域を有し、前記可変領域はCDR及び/又はFRを有し、〔13〕または〔14〕に規定される群における改変部位と同一の改変部位の群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基が前記CDR及び/又はFRにおいて改変されている、〔A1〕に記載の抗体。
〔A3〕 定常領域を有する抗体であって、前記定常領域における、〔15〕または〔16〕に規定される群における改変部位と同一の改変部位の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基が、pIが上昇するように改変されている、抗体。
〔A4〕 さらに重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域を有し、前記可変領域はCDR及び/又はFRを有し、〔13〕または〔14〕に規定される群における改変部位と同一の改変部位の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基が、前記CDR及び/又はFRにおいて改変されている、〔A3〕に記載の抗体。
〔A5〕 イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗体であって、前記抗体は定常領域を有し、〔15〕または〔16〕に規定される群における改変部位と同一の改変部位の群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基が前記定常領域において改変されている、抗体。
〔A6〕 さらに重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域を有し、前記可変領域はCDR及び/又はFRを有し、〔13〕または〔14〕に規定される群における改変部位と同一の改変部位の群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基が、前記CDR及び/又はFRにおいて改変されている、〔A5〕に記載の抗体。
〔A7〕 血漿中からの抗原の消失の促進のための医薬の製造における、〔1〕〜〔23〕及び〔A1〕〜〔A6〕のいずれか1つに記載の抗体の使用。
〔A8〕 細胞外マトリックスへの結合を増大させるための医薬の製造における、〔1〕〜〔23〕及び〔A1〕〜〔A6〕のいずれか1つに記載の抗体の使用。
〔A9〕 〔1〕〜〔23〕及び〔A1〕〜〔A6〕のいずれか1つに記載の抗体の、血漿中から抗原を消失させるための使用。
〔A10〕 〔1〕〜〔23〕及び〔A1〕〜〔A6〕のいずれか1つに記載の抗体の、細胞外マトリックスへの結合を増大させるための使用。
〔A11〕 〔30〕、〔30A〕、〔30B〕、〔31〕、〔32〕のいずれか1つに記載の方法によって得られた抗体。
(a)
(I)Kabatナンバリングで表される、(a)重鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、19位、23位、25位、26位、39位、41位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、77位、81位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、86位、105位、108位、110位、及び112位;(b)重鎖可変領域のCDRにおいて31位、61位、62位、63位、64位、65位、及び97位;(c)軽鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、7位、8位、9位、11位、12位、16位、17位、18位、20位、22位、37位、38位、39位、41位、42位、43位、45位、46位、49位、57位、60位、63位、65位、66位、68位、69位、70位、74位、76位、77位、79位、80位、81位、85位、100位、103位、105位、106位、107位、及び108位;及び、(d)軽鎖可変領域のCDRにおいて24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、56位からなる群から選択される、CDR又はFRにおける位置で;または
(II)EUナンバリングで表される、196位、253位、254位、256位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、307位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、及び443位
からなる群から選択される、定常領域における位置で、
抗体の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する工程;
(b)得られる抗原に対する結合活性がイオン濃度条件によって変化するような様式で、抗原結合ドメインを改変する工程であって、前記(a)および(b)が同時にまたは連続して実施され得る、工程;
(c)前記改変抗体をコードする核酸が発現するように宿主細胞を培養する工程;ならびに
(d)宿主細胞培養物から改変抗体を回収する工程。
さらなる実施態様において、当該方法は、以下のいずれか1つまたは複数を任意でさらに含む:
改変前の抗体と比較して、
(e)血漿中からの抗原の消失を促進できる抗体を選択する工程;
(f)細胞外マトリックスへの結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(g)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcγRに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(h)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcγRIIbに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(i)FcγRIIbに対する結合活性が維持もしくは増大される一方で、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、およびFcγRIIaからなる群から好ましくは選択される1つまたは複数の活性型FcγRに対する結合活性が減少している抗体を選択する工程;
(j)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcRnに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(k)等電点(pI)を上昇させた抗体を選択する工程;
(l)回収した抗体の等電点(pI)を確認後、等電点(pI)を上昇させた抗体を選択する工程;及び、
(m)イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化もしくは増加されている抗体を選択する工程。
〔D1〕
(a)EUナンバリングで表される、
196位、253位、254位、256位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、307位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、及び443位
からなる群から選択される位置で、少なくとも1つのアミノ酸残基の電荷が変化するように、改変前の抗体をコードする核酸を改変する工程;
(b)前記核酸が発現するように宿主細胞を培養する工程;ならびに
(c)宿主細胞培養物から抗体を回収する工程
を含む、改変前の抗体と比較して血漿中半減期が延長または短縮された改変抗体の製造方法;あるいは、
〔D2〕
EUナンバリングで表される、
196位、253位、254位、256位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、307位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、及び443位
からなる群から選択される位置で、少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する工程
を含む、抗体の血漿中半減期を延長または短縮するための方法。
〔33〕 FcRn結合ドメインを含むFc領域改変体であって、前記FcRn結合ドメインが、EUナンバリングで表される、434位にAla;438位にGlu、Arg、Ser又はLys;及び、440位にGlu、Asp又はGlnを含む、Fc領域改変体。
〔34〕 前記FcRn結合ドメインが、EUナンバリングで表される、434位にAla;438位にArg又はLys;及び、440位にGlu又はAspを含む、〔33〕に記載のFc領域改変体。
〔35〕 前記FcRn結合ドメインが、さらに、EUナンバリングで表される、428位にIle又はLeu;及び/又は、436位にIle、Leu、Val、Thr又はPheを含む、〔33〕又は〔34〕に記載のFc領域改変体。
〔36〕 前記FcRn結合ドメインが、EUナンバリングで表される、428位にLeu;及び/又は、436位にValまたはThrを含む、〔35〕に記載のFc領域改変体。
〔37〕 前記FcRn結合ドメインが、EUナンバリングで表される、
N434A/Q438R/S440E;N434A/Q438R/S440D;
N434A/Q438K/S440E;N434A/Q438K/S440D;
N434A/Y436T/Q438R/S440E;N434A/Y436T/Q438R/S440D;N434A/Y436T/Q438K/S440E;N434A/Y436T/Q438K/S440D;N434A/Y436V/Q438R/ S440E;N434A/Y436V/Q438R/S440D;N434A/Y436V/Q438K/S440E;N434A/Y436V/Q438K/S440D;N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E;N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D;N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E;N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D;N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E;N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D;N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E;N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D;M428L/N434A/Q438R/S440E;M428L/N434A/Q438R/S440D;M428L/N434A/Q438K/S440E;M428L/N434A/Q438K/S440D;M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D;M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E;M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D;M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D;M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E;M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D;L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;及び、L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群から選択される置換されたアミノ酸の組み合わせを含む、〔33〕〜〔36〕のいずれかに記載のFc領域改変体。
〔38〕 前記FcRn結合ドメインが、EUナンバリングで表される、以下:
N434A/Q438R/S440E;N434A/Y436T/Q438R/S440E;N434A/Y436V/Q438R/S440E;M428L/N434A/Q438R/S440E;M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;及び、L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群から選択される、置換されたアミノ酸の組み合わせを含む、〔37〕に記載のFc領域改変体。
〔39〕 天然型IgGのFc領域と比較して、酸性pH条件下(例えばpH5.8)でFcRnに対する結合活性が増大されている、〔33〕〜〔38〕のいずれかに記載のFc領域改変体。
〔40〕 天然型IgGのFc領域と比較して、中性pH条件下で抗医薬品抗体(ADA)に対する結合活性が有意に増大されていない、〔33〕〜〔39〕のいずれかに記載のFc領域改変体。
〔41〕 前記抗医薬品抗体(ADA)がリウマトイド因子(RF)である、〔40〕に記載のFc領域改変体。
〔42〕 天然型IgGのFc領域と比較して、血漿中クリアランス(CL)が減少されているか、血漿中滞留時間が増大されているか、又は、血漿中半減期(t1/2)が増大されている、〔33〕〜〔41〕のいずれかに記載のFc領域改変体。
〔43〕 EUナンバリングで表される、N434Y/Y436V/Q438R/S440Eの置換されたアミノ酸の組み合わせを含む参照Fc領域改変体と比較して、血漿中滞留性が増大している、〔33〕〜〔42〕のいずれかに記載のFc領域改変体。
〔44〕 〔33〕〜〔43〕のいずれかに記載のFc領域改変体を含む抗体。
〔45〕 前記抗体がIgG抗体である、〔44〕に記載の抗体。
〔46〕 〔44〕又は〔45〕に記載の抗体を含む、医薬組成物。
〔47〕 抗体の血漿中滞留性を増大させるための、〔46〕に記載の医薬組成物。
〔48〕 〔33〕〜〔43〕のいずれかに記載のFc領域改変体、又は、〔44〕もしくは〔45〕に記載の抗体をコードする核酸。
〔49〕 〔48〕に記載の核酸を含むベクター。
〔50〕 〔49〕に記載のベクターを含む宿主細胞。
〔51〕 FcRn結合ドメインを含むFc領域改変体、又はそれを含む抗体の製造方法であって、〔50〕に記載の宿主細胞を培養して、前記細胞培養物からFc領域改変体又はそれを含む抗体を回収する工程を含む、製造方法。
〔52〕
(a)天然型IgGのFc領域と比較して、酸性pH条件下でFcRnに対する結合活性が増大されているFc領域改変体を選択する工程;
(b)天然型IgGのFc領域と比較して、中性pH条件下で抗医薬品抗体(ADA)に対する結合活性が有意に増大されていないFc領域改変体を選択する工程;
(c)天然型IgGのFc領域と比較して、血漿中の滞留性が増大しているFc領域改変体を選択する工程;及び、
(d)天然型IgGのFc領域を含む参照抗体と比較して、血漿中からの抗原の消失を促進できるFc領域改変体を含む抗体を選択する工程;
からなる群から選択されるいずれか1つ以上の工程を任意にさらに含む、〔51〕に記載の方法。
〔53〕 得られるFc領域改変体または該改変体を含む抗体が、EUナンバリングで表される、434位にAla;438位にGlu、Arg、Ser、またはLys;および440位にGlu、Asp、またはGlnを含むような様式でアミノ酸を置換する工程を含む、FcRn結合ドメインを含むFc領域改変体または該改変体を含む抗体の製造方法。
〔B1〕 血漿中の滞留性を増大させるための医薬の製造における、〔33〕〜〔43〕のいずれか1つに記載のFc領域改変体、又は、〔44〕もしくは〔45〕に記載の抗体の使用。
〔B2〕 天然型IgGのFc領域と比較して、中性pH条件下で抗医薬品抗体(ADA)に対する結合活性を有意に増大させないための医薬の製造における、〔33〕〜〔43〕のいずれか1つに記載のFc領域改変体、又は、〔44〕もしくは〔45〕に記載の抗体の使用。
〔B3〕 〔33〕〜〔43〕のいずれか1つに記載のFc領域改変体、又は、〔44〕もしくは〔45〕に記載の抗体の、血漿中の滞留性を増大させるための使用。
〔B4〕 〔33〕〜〔43〕のいずれか1つに記載のFc領域改変体、又は、〔44〕もしくは〔45〕に記載の抗体の、天然型IgGのFc領域と比較して、中性pH条件下で抗医薬品抗体(ADA)に対する結合活性を有意に増大させないための使用。
〔B5〕 〔51〕、〔52〕、および〔53〕のいずれか1つに記載の方法により得られるFc領域改変体又は該改変体を含む抗体。
(a)EUナンバリングで表される、434位にAla;438位にGlu、Arg、Ser、またはLys;および440位にGlu、Asp、またはGln;
(b)EUナンバリングで表される、434位にAla;438位にArgまたはLys;および440位にGluまたはAsp;
(c)EUナンバリングで表される、428位にIleまたはLeu;434位にAla;436位にIle、Leu、Val、Thr、またはPhe;438位にGlu、Arg、Ser、またはLys;および440位にGlu、Asp、またはGln;
(d)EUナンバリングで表される、428位にIleまたはLeu;434位にAla;436位にIle、Leu、Val、Thr、またはPhe;438位にArgまたはLys;および440位にGluまたはAsp;
(e)EUナンバリングで表される、428位にLeu;434位にAla;436位にValまたはThr;438位にGlu、Arg、Ser、またはLys;および440位にGlu、Asp、またはGln;または
(f)EUナンバリングで表される、428位にLeu;434位にAla;436位にValまたはThr;438位にArgまたはLys;および440位にGluまたはAsp。
〔54〕 ヒトIL-8に結合する単離された抗IL-8抗体であって、以下(a)から(f)の少なくとも一つにおいて、少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、pH依存的にIL-8に結合する、抗IL-8抗体:
(a)配列番号:67のアミノ酸配列を含むHVR-H1、
(b)配列番号:68のアミノ酸配列を含むHVR-H2、
(c)配列番号:69のアミノ酸配列を含むHVR-H3、
(d)配列番号:70のアミノ酸配列を含むHVR-L1、
(e)配列番号:71のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および
(f)配列番号:72のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
〔55〕 配列番号:68のアミノ酸配列の9位のチロシン、配列番号:68のアミノ酸配列の11位のアルギニン、および配列番号:69のアミノ酸配列の3位のチロシンのアミノ酸置換を含む、〔54〕に記載の抗IL-8抗体。
〔56〕 更に、配列番号:68のアミノ酸配列の6位のアラニンおよび配列番号:68のアミノ酸配列の8位のグリシンのアミノ酸置換を含む、〔54〕又は〔55〕に記載の抗IL-8抗体。
〔57〕 配列番号:71のアミノ酸配列の1位のアスパラギン、配列番号:71のアミノ酸配列の5位のロイシン、および配列番号:72のアミノ酸配列の1位のグルタミンのアミノ酸置換を含む、〔54〕から〔56〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体。
〔58〕 (a)配列番号:67のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号:73のアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(c)配列番号:74のアミノ酸配列を含むHVR-H3、を含む、〔54〕から〔57〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体。
〔59〕 (a)配列番号:70のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(b)配列番号:75のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(c)配列番号:76のアミノ酸配列を含むHVR-L3、を含む、〔54〕から〔58〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体。
〔60〕 配列番号:78の重鎖可変領域及び配列番号:79の軽鎖可変領域を含む、〔54〕から〔59〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体。
〔61〕 以下の(a)から(f)の性質から選択される少なくとも一つの性質を有するFc領域を含む、〔54〕から〔60〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体:
(a)酸性pHでの、当該Fc領域のFcRnに対する結合親和性が、天然型のFc領域のFcRnに対する結合親和性よりも増大している、
(b)既存のADAに対する当該Fc領域の結合親和性が、天然型のFc領域の既存のADAに対する結合親和性よりも低下している、
(c)当該Fc領域の血漿中半減期が、天然型のFc領域の血漿中半減期よりも増大している、
(d)当該Fc領域の血漿中クリアランスが、天然型のFc領域の血漿中クリアランスよりも減少している、および
(e)エフェクター受容体に対する当該Fc領域の結合親和性が、天然型のFc領域のエフェクター受容体に対する結合親和性よりも低下している、および
(f)細胞外マトリックスとの結合が増大している。
〔62〕 Fc領域が、EUナンバリングで表される235位、236位、239位、327位、330位、331位、428位、434位、436位、438位、及び440位からなる群から選択される一以上の位置にアミノ酸置換を含む、〔61〕に記載の抗IL-8抗体。
〔63〕 L235R、G236R、S239K、A327G、A330S、P331S、M428L、N434A、Y436T、Q438R、及びS440Eからなる群から選択されるアミノ酸置換を一つ以上含むFc領域を含む、〔62〕に記載の抗IL-8抗体。
〔64〕 Fc領域が、L235R、G236R、S239K、M428L、N434A、Y436T、Q438R、及びS440Eのアミノ酸置換を含む、〔63〕に記載の抗IL-8抗体。
〔65〕 Fc領域が、L235R、G236R、A327G、A330S、P331S、M428L、N434A、Y436T、Q438R、及びS440Eのアミノ酸置換を含む、〔63〕に記載の抗IL-8抗体。
〔66〕 配列番号:81に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号:82に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗IL-8抗体。
〔67〕 配列番号:80に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号:82に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗IL-8抗体。
〔68〕 〔54〕から〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体をコードする単離した核酸。
〔69〕 〔68〕の核酸を含むベクター。
〔70〕 〔69〕のベクターを含む宿主細胞。
〔71〕 〔70〕に記載の宿主を培養する工程を含む、抗IL-8抗体の製造方法。
〔72〕 抗体を培養上清から単離する工程を含む、〔71〕に記載の抗IL-8抗体の製造方法。
〔73〕 〔54〕から〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
〔74〕 医薬組成物に使用するための、〔54〕から〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体。
〔75〕 IL-8が過剰に存在する疾患の治療に用いるための、〔54〕から〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体。
〔76〕 IL-8が過剰に存在する疾患のための医薬組成物の製造における、〔54〕から〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体の使用。
〔77〕 〔54〕から〔67〕のいずれか1つに記載された抗IL-8抗体を個体に投与する工程を含む、IL-8が過剰に存在する疾患を有する患者を治療する方法。
〔78〕 〔54〕から〔67〕のいずれか1つに記載された抗IL-8抗体を個体に投与する工程を含む、当該個体からのIL-8の消失を促進する方法。
〔79〕 〔54〕から〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を含み、該抗体がIL-8と結合して細胞外マトリックスと結合する、医薬組成物。
〔80〕 IL-8への結合活性がpH依存的である可変領域を含む抗IL-8抗体の製造方法であって、
(a)抗IL-8抗体と細胞外マトリックスとの結合を評価する工程、
(b)細胞外マトリックスとの結合が高い抗IL-8抗体を選択する工程、
(c)当該抗体をコードする核酸を含むベクターを含む宿主を培養する工程、および
(d)培養液から当該抗体を単離する工程、
を含む、抗IL-8抗体の製造方法。
〔C1〕 生物学的活性を有するIL-8の蓄積を抑制するための医薬組成物の製造における、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体の使用。
〔C2〕 生物学的活性を有するIL-8の蓄積の抑制における、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体の使用。
〔C3〕 血管新生阻害のための医薬組成物の製造における、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体の使用。
〔C4〕 血管新生阻害における、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体の使用。
〔C5〕 好中球遊走促進を阻害するための医薬組成物の製造における、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体の使用。
〔C6〕 好中球遊走促進の阻害における、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体の使用。
〔C7〕 生物学的活性を有するIL-8の蓄積の抑制における使用のための、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体。
〔C8〕 〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を個体に投与する工程を含む、生物学的活性を有するIL-8の蓄積を抑制する方法。
〔C9〕 〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を含む、生物学的活性を有するIL-8の蓄積を抑制するための医薬組成物。
〔C10〕 血管新生阻害における使用のための、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体。
〔C11〕 〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を個体に投与する工程を含む、個体における血管新生阻害方法。
〔C12〕 〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を含む、血管新生阻害のための医薬組成物。
〔C13〕 好中球遊走促進の阻害における使用のための、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体。
〔C14〕 〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を個体に投与する工程を含む、個体における好中球遊走促進を阻害する方法。
〔C15〕 〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を含む、好中球遊走促進を阻害するための医薬組成物。
〔C16〕 IL-8が過剰に存在する疾患の治療における使用のための、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体。
〔C17〕 IL-8が過剰に存在する疾患を治療するための医薬組成物の製造における、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体の使用。
〔C18〕 IL-8が過剰に存在する疾患の治療における、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体の使用。
〔C19〕 〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を個体に投与する工程を含む、個体におけるIL-8が過剰に存在する疾患の治療方法。
〔C20〕 〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を含む、IL-8が過剰に存在する疾患を治療するための医薬組成物。
〔C21〕 IL-8の消失の促進における使用のための、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体。
〔C22〕 IL-8の消失を促進させるための医薬組成物の製造における、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体の使用。
〔C23〕 IL-8の消失の促進における、〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体の使用。
〔C24〕 〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を個体に投与する工程を含む、個体におけるIL-8の消失を促進する方法。
〔C25〕 〔54〕〜〔67〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を含む、IL-8の消失を促進するための医薬組成物。
〔C26〕 EUナンバリングで表される235位、236位、239位、327位、330位、331位、428位、434位、436位、438位、および440位からなる群から選択される一以上の位置にアミノ酸置換を含むFc領域を含む、抗IL-8抗体。
〔C27〕 以下の(a)から(f)の性質から選択される少なくとも一つの性質を有するFc領域を含む、〔C26〕に記載の抗IL-8抗体:
(a)酸性pHでの、当該Fc領域のFcRnに対する結合親和性が、天然型のFc領域のFcRnに対する結合親和性よりも増大している、
(b)既存のADAに対する当該Fc領域の結合親和性が、天然型のFc領域の既存のADAに対する結合親和性よりも低下している、
(c)当該Fc領域の血漿中半減期が、天然型のFc領域の血漿中半減期よりも増大している、
(d)当該Fc領域の血漿中クリアランスが、天然型のFc領域の血漿中クリアランスよりも減少している、
(e)エフェクター受容体に対する当該Fc領域の結合親和性が、天然型のFc領域のエフェクター受容体に対する結合親和性よりも低下している、および
(f)細胞外マトリックスとの結合が増大している。
〔C28〕 EUナンバリングで表されるL235R、G236R、S239K、A327G、A330S、P331S、M428L、N434A、Y436T、Q438R、及びS440Eからなる群から選択されるアミノ酸置換を一つ以上含むFc領域を含む、〔C26〕または〔C27〕に記載の抗IL-8抗体。
〔C29〕 EUナンバリングで表される、(a)L235R、G236R、S239K、M428L、N434A、Y436T、Q438R、及びS440E;または(b)L235R、G236R、A327G、A330S、P331S、M428L、N434A、Y436T、Q438R、及びS440Eからなる群から選択されるアミノ酸置換を一つ以上含むFc領域を含む、〔C28〕に記載の抗IL-8抗体。
〔C30〕 配列番号:81に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号:82に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、〔C26〕に記載の抗IL-8抗体。
〔C31〕 配列番号:80に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号:82に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、〔C26〕に記載の抗IL-8抗体。
〔C32〕 〔C26〕から〔C31〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体をコードする単離した核酸。
〔C33〕 〔C32〕に記載の核酸を含むベクター。
〔C34〕 〔C33〕に記載のベクターを含む宿主細胞。
〔C35〕 〔C34〕に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、抗IL-8抗体の製造方法。
〔C36〕 〔C26〕から〔C31〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を宿主細胞培養物から単離する工程をさらに含む、該抗体の製造方法。
〔C37〕 〔C26〕から〔C31〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
〔C38〕 〔C26〕から〔C31〕のいずれか1つに記載の抗IL-8抗体を個体に投与する工程を含む、IL-8が過剰に存在する疾患を有する患者を治療する方法。
〔C39〕 〔C26〕から〔C31〕のいずれか1つに記載された抗IL-8抗体を個体に投与する工程を含む、当該個体からのIL-8の消失を促進する方法。
以下に、開示A、B、またはCの非限定的な実施態様を説明する。後述する本実施例に記載されるあらゆる実施態様は、本特許出願の特許権利化を意図する国における、本実施例に記載の内容を限定的に解釈しようとし得るいかなる特許実務、慣習、法令等の制限に縛られることなく、「詳細な説明」の項においても記載されていると当然にみなされることを意図して記載される。
いくつかの実施態様において、開示Aは、イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗体であって、前記抗体の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されていることで等電点(pI)が上昇した抗体(開示Aの範囲において、「pIを上昇させたイオン濃度依存的抗体」とも称し、また、当該抗体における抗原結合ドメインを、「pIを上昇させたイオン濃度依存的抗原結合ドメイン」とも称する。)に関する。かかる発明は、イオン濃度依存的抗体において、当該抗体の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されて等電点(pI)が上昇していると、(例えば、抗体をインビボ投与した場合に、)血漿中からの抗原の消失を促進できる;さらに、pIを上昇させたイオン濃度依存的抗体が、抗体の細胞外マトリックスへの結合性を増大できる、という本発明者らの驚くべき発見に、部分的に基づく。かかる発明は、イオン濃度依存的抗原結合ドメイン又はイオン濃度依存的抗体というコンセプトと、表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されていることでpIが上昇した抗体(開示Aの範囲において、「pIを上昇させた抗体」ともいう;なお、開示Aの範囲において、逆に、表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されていることでpIが低下した抗体は、「pIを低下させた抗体」という)というコンセプトとの全く異なる2つのコンセプトを組み合わせたことが、この有利な効果をもたらすという本発明者らの驚くべき発見にもまた部分的に基づくものである。したがって、かかる発明は、開示Aが属する分野(例えば医療分野)において顕著な技術的革新をもたらし得る、パイオニア発明の一類型に分類される。
(a)シート構造、もしくは、らせん構造の領域におけるポリペプチドの背骨構造;
(b)標的部位における電荷もしくは疎水性、または
(c)側鎖の大きさ。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性、親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の配向に影響する残基:Gly、Pro;及び
(6)芳香族性:Trp、Tyr、Phe。
(a)低カルシウムイオン濃度の条件における抗原結合ドメインまたは抗体の抗原に対する結合活性を決定する工程、
(b)高カルシウムイオン濃度の条件における抗原結合ドメインまたは抗体の抗原に対する結合活性を決定する工程、及び、
(c)低カルシウムイオン濃度の条件における抗原に対する結合活性が高カルシウムイオン濃度の条件における抗原に対する結合活性より低い抗原結合ドメインまたは抗体を選択する工程
を含む方法であってもよい。
(a)高カルシウムイオン濃度の条件で抗原結合ドメインもしくは抗体又はそれらのライブラリを抗原に接触させる工程、
(b)工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗体を低カルシウムイオン濃度の条件下においてインキュベートする工程、及び、
(c)工程(b)で解離した抗原結合ドメインまたは抗体を単離する工程
を含む方法であってもよい。
(a)低カルシウムイオン濃度の条件で抗原結合ドメインもしくは抗体またはそれらのライブラリを抗原に接触させる工程、
(b)工程(a)で抗原に結合しないかまたは抗原への結合能が低い抗原結合ドメインまたは抗体を選択する工程、
(c)工程(b)で選択された抗原結合ドメイン又は抗体を高カルシウムイオン濃度の条件で抗原に結合させる工程、及び、
(d)工程(c)で抗原に結合した抗原結合ドメイン又は抗体を単離する工程
を含む方法であってもよい。
(a)抗原を固定したカラムに高カルシウムイオン濃度の条件で抗原結合ドメインもしくは抗体またはそれらのライブラリを接触させる工程、
(b)工程(a)でカラムに結合した抗原結合ドメイン又は抗体を低カルシウムイオン濃度の条件でカラムから溶出させる工程、及び、
(c)工程(b)で溶出された抗原結合ドメイン又は抗体を単離する工程
を含む方法であってもよい。
(a)抗原を固定したカラムに低カルシウムイオン濃度の条件で抗原結合ドメインもしくは抗体またはそれらのライブラリを通過させて、当該カラムに結合せずに溶出した抗原結合ドメイン又は抗体を回収する工程、
(b)工程(a)で回収された抗原結合ドメイン又は抗体を高カルシウムイオン濃度の条件で抗原に結合させる工程、及び、
(c)工程(b)で抗原に結合した抗原結合ドメイン又は抗体を単離する工程
を含む方法であってもよい。
(a)高カルシウムイオン濃度の条件で抗原結合ドメインもしくは抗体またはそれらのライブラリを抗原に接触させる工程、
(b)工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメイン又は抗体を取得する工程、
(c)工程(b)で取得した抗原結合ドメイン又は抗体を低カルシウムイオン濃度でインキュベートする工程、及び、
(d)工程(c)の抗原に対する結合活性が工程(b)で選択した基準より弱い抗原結合ドメイン又は抗体を単離する工程
を含む方法であってもよい。
(a)酸性pH条件における抗原結合ドメインまたは抗体の抗原に対する結合活性を決定する工程、
(b)中性pH条件における抗原結合ドメインまたは抗体の抗原に対する結合活性を決定する工程、及び、
(c)酸性pH条件における抗原に対する結合活性が中性pH条件における抗原に対する結合活性よりも低い抗原結合ドメインまたは抗体を選択する工程
を含む方法であってもよい。
(a)中性pH条件で抗原結合ドメインもしくは抗体又はそれらのライブラリを抗原に接触させる工程、
(b)工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗体を酸性pH条件でインキュベートする工程、及び、
(c)工程(b)で解離した抗原結合ドメインまたは抗体を単離する工程
を含む方法であってもよい。
(a)酸性pH条件で抗原結合ドメインもしくは抗体またはそれらのライブラリを抗原に接触させる工程、
(b)工程(a)で抗原に結合しないかもしくは抗原への結合能が低い抗原結合ドメイン又は抗体を選択する工程、
(c)工程(b)で選択された抗原結合ドメイン又は抗体を中性pH条件で抗原に結合させる工程、及び、
(d)工程(c)で抗原に結合した抗原結合ドメイン又は抗体を単離する工程
を含む方法であってもよい。
(a)抗原を固定したカラムに中性pH条件で抗原結合ドメインもしくは抗体またはそれらのライブラリを接触させる工程、
(b)工程(a)でカラムに結合した抗原結合ドメイン又は抗体を酸性pH条件でカラムから溶出させる工程、及び、
(c)工程(b)で溶出された抗原結合ドメイン又は抗体を単離する工程
を含む方法であってもよい。
(a)抗原を固定したカラムに酸性pH条件で抗原結合ドメインもしくは抗体またはそれらのライブラリを通過させて、当該カラムに結合せずに溶出した抗原結合ドメイン又は抗体を回収する工程、
(b)工程(a)で回収された抗原結合ドメイン又は抗体を中性pH条件で抗原に結合させる工程、及び、
(c)工程(b)で抗原に結合した抗原結合ドメイン又は抗体を単離する工程
を含む方法であってもよい。
(a)中性pH条件で抗原結合ドメインもしくは抗体またはそれらのライブラリを抗原に接触させる工程、
(b)工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメイン又は抗体を取得する工程、
(c)工程(b)で取得した抗原結合ドメイン又は抗体を酸性pH条件でインキュベートする工程、及び、
(d)工程(c)の抗原に対する結合活性が工程(b)で選択した基準より弱い抗原結合ドメイン又は抗体を単離する工程
を含む方法であってもよい。
(a)抗体のpIが上昇するように、当該抗体の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基の電荷が改変されるように、当該アミノ酸残基を含む抗体をコードする核酸を改変する工程、
(b)宿主細胞を当該核酸が発現するように培養する工程、及び、
(c)宿主細胞培養物から抗体を回収する工程
を含む、方法であってもよい。
(a')抗体の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基の電荷が改変されるように、当該アミノ酸残基を含む抗体をコードする核酸を改変する工程、
(b')宿主細胞を当該核酸が発現するように培養する工程、
(c')宿主細胞培養物から抗体を回収する工程、及び、
(d')改変前の抗体と比較してpIを上昇させた抗体を(任意で、確認してまたは測定して)選択する工程
を含む、方法であってもよい。ここで、出発材料としての抗体又は改変前の抗体又は参照抗体は、例えば、イオン濃度依存的抗体であってもよい。あるいは、アミノ酸残基の改変時に、イオン濃度依存的抗原結合ドメインの結合活性を変化させるアミノ酸を配列中に含めてもよい。
第1のポリペプチド及び第2のポリペプチド、並びに、任意で、第3のポリペプチド及び第4のポリペプチドを含む多重特異性抗体の製造方法であって、
(A)第1のポリペプチド及び/又は第2のポリペプチド、並びに、任意で、第3のポリペプチド及び/又は第4のポリペプチドをコードする核酸を改変する工程であって、当該ポリペプチドのいずれか一つまたは複数が、抗体のpIが上昇するように、当該ポリペプチドの表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基の電荷が改変されるように、当該アミノ酸残基を含む、工程;
(B)宿主細胞を当該核酸が発現するように培養する工程;及び、
(C)宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収する工程
を含む、方法であってもよい。
(A')第1のポリペプチド及び/又は第2のポリペプチド、並びに、任意で、第3のポリペプチド及び/又は第4のポリペプチドをコードする核酸を改変する工程であって、当該ポリペプチドのいずれか一つまたは複数が、ポリペプチドの表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基の電荷が改変されるように、当該アミノ酸残基を含む、工程;
(B')宿主細胞を当該核酸が発現するように培養する工程
(C')宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収する工程;及び、
(D')改変前の抗体と比較してpIが上昇した抗体を(任意で、確認して)選択する工程
を含んでもよい。
血漿中半減期が短縮されたヒト化抗体またはヒト抗体の製造方法であって、
ヒト由来のCDR、ヒト以外の動物由来のCDR、及び合成CDRからなる群より選択されるCDR;ヒト由来のFR;ならびにヒト定常領域を含む抗体において、
(I)抗体のpIが上昇するように、当該CDR、当該FR及び当該定常領域からなる群より選択される少なくとも1つの領域の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基を、改変前の対応する位置に存在するアミノ酸残基とは異なる電荷を有するアミノ酸残基に改変する工程
を含む、方法であってもよい。
(I')当該CDR、当該FR及び当該定常領域からなる群より選択される少なくとも1つの領域の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基を、改変前の対応する位置に存在するアミノ酸残基とは異なる電荷を有するアミノ酸残基に改変する工程;及び、
(II')改変前の抗体と比較してpIが上昇した抗体を(任意で、確認して)選択する工程
を含む、方法であってもよい。
側鎖に負の電荷を有するアミノ酸が、Glu (E)又はAsp (D)であり、
側鎖に電荷を有さないアミノ酸が、Ala (A)、Asn (N)、Cys (C)、Gln (Q)、Gly (G)、His (H)、Ile (I)、Leu (L)、Met (M)、Phe (F)、Pro (P)、Ser (S)、Thr (T)、Trp (W)、Tyr (Y)、又はVal (V)であり、
側鎖に正の電荷を有するアミノ酸が、His (H)、Lys (K)又はArg (R)である。
EUナンバリングで表される255、292、301、344、355、および416番のアルギニン、ならびに
EUナンバリングで表される121、133、147、205、210、213、214、218、222、246、248、274、288、290、317、320、322、326、334、338、340、360、370、392、409、414、および439番のリジン
が挙げられる。これらの正電荷を有するアミノ酸に立体構造的に近接した位置で、正電荷を有するアミノ酸を用いた置換を行うことにより、立体構造的に近接した部位に複数の正電荷を持たせることが可能である。
(a)重鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、19位、23位、25位、26位、39位、41位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、77位、81位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、86位、105位、108位、110位、および112位;
(b)重鎖可変領域のCDRにおいて31位、61位、62位、63位、64位、65位、および97位;
(c)軽鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、7位、8位、9位、11位、12位、16位、17位、18位、20位、22位、37位、38位、39位、41位、42位、43位、45位、46位、49位、57位、60位、63位、65位、66位、68位、69位、70位、74位、76位、77位、79位、80位、81位、85位、100位、103位、105位、106位、107位、および108位;ならびに、
(d)軽鎖可変領域のCDRにおいて24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、および56位
からなる群から選択され得、改変後の各位置でのアミノ酸は、限定されないが、Lys (K)、Arg (R)、Gln (Q)、Gly (G)、Ser (S)、またはAsn (N)などの、側鎖の電荷の観点から上述したアミノ酸の任意のものより選択することができる。いくつかの実施態様において、上述のアミノ酸位置のうち、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10箇所、または10を超える箇所が改変される。いくつかの実施態様において、上述のアミノ酸位置のうち、1〜20箇所、1〜15箇所、1〜10箇所、または1〜5箇所が改変される。
(a)重鎖可変領域のFRにおいて8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、23位、39位、41位、43位、44位、77位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、および105位;
(b)重鎖可変領域のCDRにおいて31位、61位、62位、63位、64位、65位、および97位;
(c)軽鎖可変領域のFRにおいて16位、18位、37位、41位、42位、45位、65位、69位、74位、76位、77位、79位、および107位;ならびに、
(d)軽鎖可変領域のCDRにおいて24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、および56位
からなる群から選択され得る。いくつかの実施態様において、上述のアミノ酸位置のうち、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10箇所、または10を超える箇所が改変される。いくつかの実施態様において、上述のアミノ酸位置のうち、1〜20箇所、1〜15箇所、1〜10箇所、および1〜5箇所が改変される。
(a)8位では、8K、8R、8Q、8G、8S、又は8N;
(b)13位では、13K、13R、13Q、13G、13S、又は13N;
(c)15位では、15K、15R、15Q、15G、15S、又は15N;
(d)16位では、16K、16R、16Q、16G、16S、又は16N;
(e)18位では、18K、18R、18Q、18G、18S、又は18N;
(f)39位では、39K、39R、39Q、39G、39S、又は39N;
(g)41位では、41K、41R、41Q、41G、41S、又は41N;
(h)43位では、43K、43R、43Q、43G、43S、又は43N;
(i)44位では、44K、44R、44Q、44G、44S、又は44N;
(j)63位では、63K、63R、63Q、63G、63S、又は63N;
(k)64位では、64K、64R、64Q、64G、64S、又は64N;
(l)77位では、77K、77R、77Q、77G、77S、又は77N;
(m)82位では、82K、82R、82Q、82G、82S、又は82N;
(n)82a位では、82aK、82aR、82aQ、82aG、82aS、又は82aN;
(o)82b位では、82bK、82bR、82bQ、82bG、82bS、又は82bN;
(p)83位では、83K、83R、83Q、83G、83S、又は83N;
(q)84位では、84K、84R、84Q、84G、84S、又は84N;
(r)85位では、85K、85R、85Q、85G、85S、又は85N;あるいは
(s)105位では、105K、105R、105Q、105G、105S、又は105N
である。いくつかの実施態様において、上述のアミノ酸位置のうち少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10箇所、または10を超える箇所の任意の組み合わせが改変される。いくつかの実施態様において、上述のアミノ酸位置のうち、1〜20箇所、1〜15箇所、1〜10箇所、又は1〜5箇所の任意の組み合わせが改変される。
16位、43位、64位、及び105位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
77位、82a位、及び82b位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
77位及び85位;
41位及び44位;
82a位及び82b位;
82位及び82b位;
82b位及び83位;または
63位及び64位
であり、改変後の各位置でのアミノ酸は、限定はされないが、側鎖の電荷の観点から、上述したアミノ酸の任意のもの、例えばLys (K)、Arg (R)、Gln (Q)、Gly (G)、Ser (S)、またはAsn (N)から選択することができる。
(a)16位では、16K、16R、16Q、16G、16S、又は16N;
(b)18位では、18K、18R、18Q、18G、18S、又は18N;
(c)24位では、24K、24R、24Q、24G、24S、又は24N;
(d)25位では、25K、25R、25Q、25G、25S、又は25N;
(e)26位では、26K、26R、26Q、26G、26S、又は26N;
(f)27位では、27K、27R、27Q、27G、27S、又は27N;
(g)37位では、37K、37R、37Q、37G、37S、又は37N;
(h)41位では、41K、41R、41Q、41G、41S、又は41N;
(i)42位では、42K、42R、42Q、42G、42S、又は42N;
(j)45位では、45K、45R、45Q、45G、45S、又は45N;
(k)52位では、52K、52R、52Q、52G、52S、又は52N;
(l)53位では、53K、53R、53Q、53G、53S、又は53N;
(m)54位では、54K、54R、54Q、54G、54S、又は54N;
(n)55位では、55K、55R、55Q、55G、55S、又は55N;
(o)56位では、56K、56R、56Q、56G、56S、又は56N;
(p)65位では、65K、65R、65Q、65G、65S、又は65N;
(q)69位では、69K、69R、69Q、69G、69S、又は69N;
(r)74位では、74K、74R、74Q、74G、74S、又は74N;
(s)76位では、76K、76R、76Q、76G、76S、又は76N;
(t)77位では、77K、77R、77Q、77G、77S、又は77N;
(u)79位では、79K、79R、79Q、79G、79S、又は79N;および
(v)107位では、107K、107R、107Q、107G、107S、又は107N
である。いくつかの実施態様において、上述のアミノ酸位置のうち、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10箇所、または10を超える箇所の任意の組み合わせが改変される。いくつかの実施態様において、上述のアミノ酸位置の組み合わせのうち、1〜20箇所、1〜15箇所、1〜10箇所、又は1〜5箇所の任意の組み合わせが改変される。
24位及び27位;
25位及び26位;
41位及び42位;
42位及び76位;
52位及び56位;
65位及び79位;
74位及び77位;
76位及び79位;
16位、24位、及び27位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、及び37位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
25位、26位、及び37位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
27位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
41位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
41位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、41位、及び42位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、52位、及び56位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、65位、及び69位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
25位、26位、52位、及び56位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
25位、26位、65位、及び69位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
25位、26位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
27位、41位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
27位、41位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
52位、56位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
52位、56位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
65位、69位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
65位、69位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
18位、24位、45位、79位、及び107位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
27位、52位、56位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
27位、52位、56位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
27位、65位、69位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
27位、65位、69位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
41位、52位、56位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
41位、52位、56位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
41位、65位、69位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
41位、65位、69位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、41位、42位、65位、及び69位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、52位、56位、65位、及び69位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、65位、69位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、65位、69位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、41位、42位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、52位、56位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、41位、42位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、52位、56位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
24位、27位、74位、76位、77位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上;
52位、56位、65位、69位、74位、及び77位からなる群より選択される任意の2箇所以上;または
52位、56位、65位、69位、76位、及び79位からなる群より選択される任意の2箇所以上
であり、改変後の各位置でのアミノ酸は、限定はされないが、側鎖の電荷の観点から、上述したアミノ酸の任意のもの、例えばLys (K)、Arg (R)、Gln (Q)、Gly (G)、Ser (S)、またはAsn (N)から選択することができる。
254位では、254K、254R、254Q、又は254N;
258位では、258K、258R、258Q、又は258N;
281位では、281K、281R、281Q、又は281N;
282位では、282K、282R、282Q、又は282N;
285位では、285K、285R、285Q、又は285N;
309位では、309K、309R、309Q、又は309N;
311位では、311K、311R、311Q、又は311N;
315位では、315K、315R、315Q、又は315N;
327位では、327K、327R、327Q、又は327N;
330位では、330K、330R、330Q、又は330N;
342位では、342K、342R、342Q、又は342N;
311位では、343K、343R、343Q、又は343N;
345位では、345K、345R、345Q、又は345N;
356位では、356K、356R、356Q、又は356N;
358位では、358K、358R、358Q、又は358N;
359位では、359K、359R、359Q、又は359N;
361位では、361K、361R、361Q、又は361N;
362位では、362K、362R、362Q、又は362N;
384位では、384K、384R、384Q、又は384N;
385位では、385K、385R、385Q、又は385N;
386位では、386K、386R、386Q、又は386N;
387位では、387K、387R、387Q、又は387N;
389位では、389K、389R、389Q、又は389N;
399位では、399K、399R、399Q、又は399N;
400位では、400K、400R、400Q、又は400N;
401位では、401K、401R、401Q、又は401N;
402位では、402K、402R、402Q、又は402N;
413位では、413K、413R、413Q、又は413N;
418位では、418K、418R、418Q、又は418N;
419位では、419K、419R、419Q、又は419N;
421位では、421K、421R、421Q、又は421N;
433位では、433K、433R、433Q、又は433N;
434位では、434K、434R、434Q、又は434N;および
443位では、443K、443R、443Q、又は443N
であり得る。
Fab領域の一方を切断すると、余分な配列を含む形で抗体が発現することとなり、また、HingeよりもC末側の部位(例えばCH2)でFab領域の一方を切断すると、Fc領域が不完全な形になる。したがって、限定はされないが、抗体分子の安定性の観点から、IgG型抗体の2つのFab領域のうちの一方が有するヒンジ領域(Hinge)で切断して片腕抗体を作製するのが好ましい。切断後の重鎖が、切断されていない重鎖と分子内ジスルフィド結合を介して連結されていることがより好ましい。このような片腕抗体は、Fab分子と比較して安定性が増大していることがWO2005/063816で報告されている。このような片腕抗体を作製することで、pIが上昇又は低下した抗体を作製することもできる。さらに、片腕抗体であるpIを上昇させた抗体にイオン濃度依存的抗原結合ドメインを組み入れた場合は、イオン濃度依存的抗原結合ドメインを有さないpIを上昇させた抗体と比較して、抗体の血漿中半減期をさらに短縮させることができ、あるいは、抗体の細胞内への取り込みをさらに促進させることができ、あるいは、血漿中からの抗原の消失をさらに促進させることができ、あるいは、抗体の細胞外マトリックスへの親和性をさらに増大させることができる。
FcγRIのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれNM_000566.3及びNP_000557.1に記載の配列であってもよく、
FcγRIIAのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC020823.1及びAAH20823.1に記載の配列であってもよく、
FcγRIIBのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC146678.1及びAAI46679.1に記載の配列であってもよく、
FcγRIIIAのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC033678.1及びAAH33678.1に記載の配列であってもよく、
FcγRIIIBのポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、それぞれBC128562.1及びAAI28563.1に記載の配列であってもよい(RefSeqアクセッション番号を示す。)。
221位のアミノ酸をLysまたはTyrのいずれかに;
222位のアミノ酸をPhe、Trp、Glu、およびTyrのいずれかに;
223位のアミノ酸をPhe、Trp、Glu、およびLysのいずれかに;
224位のアミノ酸をPhe、Trp、Glu、およびTyrのいずれかに;
225位のアミノ酸をGlu、Lys、およびTrpのいずれかに;
227位のアミノ酸をGlu、Gly、Lys、およびTyrのいずれかに;
228位のアミノ酸をGlu、Gly、Lys、およびTyrのいずれかに;
230位のアミノ酸をAla、Glu、Gly、およびTyrのいずれかに;
231位のアミノ酸をGlu、Gly、Lys、Pro、およびTyrのいずれかに;
232位のアミノ酸をGlu、Gly、Lys、およびTyrのいずれかに;
233位のアミノ酸をAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
234位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
235位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
236位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
237位のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
238位のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
239位のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
240位のアミノ酸をAla、Ile、Met、およびThrのいずれかに;
241位のアミノ酸をAsp、Glu、Leu、Arg、Trp、およびTyrのいずれかに;
243位のアミノ酸をGlu、Leu、Gln、Arg、Trp、およびTyrのいずれかに;
244位のアミノ酸をHisに;
245位のアミノ酸をAlaに;
246位のアミノ酸をAsp、Glu、His、およびTyrのいずれかに;
247位のアミノ酸をAla、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val、およびTyrのいずれかに;
249位のアミノ酸をGlu、His、Gln、およびTyrのいずれかに;
250位のアミノ酸をGluまたはGlnのいずれかに;
251位のアミノ酸をPheに;
254位のアミノ酸をPhe、Met、およびTyrのいずれかに;
255位のアミノ酸をGlu、Leu、およびTyrのいずれかに;
256位のアミノ酸をAla、Met、およびProのいずれかに;
258位のアミノ酸をAsp、Glu、His、Ser、およびTyrのいずれかに;
260位のアミノ酸をAsp、Glu、His、およびTyrのいずれかに;
262位のアミノ酸をAla、Glu、Phe、Ile、およびThrのいずれかに;
263位のアミノ酸をAla、Ile、Met、およびThrのいずれかに;
264位のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、およびTyrのいずれかに;
265位のアミノ酸をAla、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
266位のアミノ酸をAla、Ile、Met、およびThrのいずれかに;
267位のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
268位のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、およびTrpのいずれかに;
269位のアミノ酸をPhe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
270位のアミノ酸をGlu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp、およびTyrのいずれかに;
271位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
272位のアミノ酸をAsp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
273位のアミノ酸をPheまたはIleのいずれかに;
274位のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
275位のアミノ酸をLeuまたはTrpのいずれかに;
276位のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
278位のアミノ酸をAsp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、およびTrpのいずれかに;
279位のアミノ酸をAlaに;
280位のアミノ酸をAla、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp、およびTyrのいずれかに;
281位のアミノ酸をAsp、Lys、Pro、およびTyrのいずれかに;
282位のアミノ酸をGlu、Gly、Lys、Pro、およびTyrのいずれかに;
283位のアミノ酸をAla、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、およびTyrのいずれかに;
284位のアミノ酸をAsp、Glu、Leu、Asn、Thr、およびTyrのいずれかに;
285位のアミノ酸をAsp、Glu、Lys、Gln、Trp、およびTyrのいずれかに;
286位のアミノ酸をGlu、Gly、Pro、およびTyrのいずれかに;
288位のアミノ酸をAsn、Asp、Glu、およびTyrのいずれかに;
290位のアミノ酸をAsp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp、およびTyrのいずれかに;
291位のアミノ酸をAsp、Glu、Gly、His、Ile、Gln、およびThrのいずれかに;
292位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Pro、Thr、およびTyrのいずれかに;
293位のアミノ酸をPhe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
294位のアミノ酸をPhe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
295位のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
296位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、およびValのいずれかに;
297位のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
298位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
299位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
300位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、およびTrpのいずれかに;
301位のアミノ酸をAsp、Glu、His、およびTyrのいずれかに;
302位のアミノ酸をIleに;
303位のアミノ酸をAsp、Gly、およびTyrのいずれかに;
304位のアミノ酸をAsp、His、Leu、Asn、およびThrのいずれかに;
305位のアミノ酸をGlu、Ile、Thr、およびTyrのいずれかに;
311位のアミノ酸をAla、Asp、Asn、Thr、Val、およびTyrのいずれかに;
313位のアミノ酸をPheに;
315位のアミノ酸をLeuに;
317位のアミノ酸をGluまたはGlnのいずれかに;
318位のアミノ酸をHis、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、およびTyrのいずれかに;
320位のアミノ酸をAsp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
322位のアミノ酸をAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
323位のアミノ酸をIleに;
324位のアミノ酸をAsp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
325位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
326位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
327位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
328位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
329位のアミノ酸をAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
330位のアミノ酸をCys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
331位のアミノ酸をAsp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
332位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
333位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val、およびTyrのいずれかに;
334位のアミノ酸をAla、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro、およびThrのいずれかに;
335位のアミノ酸をAsp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
336位のアミノ酸をGlu、Lys、およびTyrのいずれかに;
337位のアミノ酸をGlu、His、およびAsnのいずれかに;
339位のアミノ酸をAsp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、およびThrのいずれかに;
376位のアミノ酸をAlaまたはValのいずれかに;
377位のアミノ酸をGlyまたはLysのいずれかに;
378位のアミノ酸をAspに;
379位のアミノ酸をAsnに;
380位のアミノ酸をAla、Asn、およびSerのいずれかに;
382位のアミノ酸をAlaまたはIleのいずれかに;
385位のアミノ酸をGluに;
392位のアミノ酸をThrに;
396位のアミノ酸をLeuに;
421位のアミノ酸をLysに;
427位のアミノ酸をAsnに;
428位のアミノ酸をPheまたはLeuのいずれかに;
429位のアミノ酸をMetに;
434位のアミノ酸をTrpに;
436位のアミノ酸をIleに;ならびに
440位のアミノ酸をGly、His、Ile、Leu、およびTyrのいずれかに
からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基の改変が挙げられている。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、一箇所のみのアミノ酸が改変され得るし、二箇所以上のアミノ酸が改変され得る。二箇所以上のアミノ酸の改変の組合せとしては、WO2013/047752の表5に記載されている。開示Aの抗体においても、適宜、これらのアミノ酸残基の改変を組み入れてもよい。
〔式1〕 FcγR選択性指数=活性型FcγRに対するKD値/抑制型FcγRに対するKD値
(a)237位のGlyをTrpに置換する改変;
(b)237位のGlyをPheに置換する改変;
(c)238位のProをPheに置換する改変;
(d)325位のAsnをMetに置換する改変;
(e)267位のSerをIleに置換する改変;
(f)328位のLeuをAspに置換する改変;
(g)267位のSerをValに置換する改変;
(h)328位のLeuをTrpに置換する改変;
(i)267位のSerをGlnに置換する改変;
(j)267位のSerをMetに置換する改変;
(k)236位のGlyをAspに置換する改変;
(l)327位のAlaをAsnに置換する改変;
(m)325位のAsnをSerに置換する改変;
(n)235位のLeuをTyrに置換する改変;
(o)266位のValをMetに置換する改変;
(p)328位のLeuをTyrに置換する改変;
(q)235位のLeuをTrpに置換する改変;
(r)235位のLeuをPheに置換する改変;
(s)239位のSerをGlyに置換する改変;
(t)327位のAlaをGluに置換する改変;
(u)327位のAlaをGlyに置換する改変;
(v)238位のProをLeuに置換する改変;
(w)239位のSerをLeuに置換する改変;
(x)328位のLeuをThrに置換する改変;
(y)328位のLeuをSerに置換する改変;
(z)328位のLeuをMetに置換する改変;
(aa)331位のProをTrpに置換する改変;
(ab)331位のProをTyrに置換する改変;
(ac)331位のProをPheに置換する改変;
(ad)327位のAlaをAspに置換する改変;
(ae)328位のLeuをPheに置換する改変;
(af)271位のProをLeuに置換する改変;
(ag)267位のSerをGluに置換する改変;
(ah)328位のLeuをAlaに置換する改変;
(ai)328位のLeuをIleに置換する改変;
(aj)328位のLeuをGlnに置換する改変;
(ak)328位のLeuをValに置換する改変;
(al)326位のLysをTrpに置換する改変;
(am)334位のLysをArgに置換する改変;
(an)268位のHisをGlyに置換する改変;
(ao)268位のHisをAsnに置換する改変;
(ap)324位のSerをValに置換する改変;
(aq)266位のValをLeuに置換する改変;
(ar)271位のProをGlyに置換する改変;
(as)332位のIleをPheに置換する改変;
(at)324位のSerをIleに置換する改変;
(au)333位のGluをProに置換する改変;
(av)300位のTyrをAspに置換する改変;
(aw)337位のSerをAspに置換する改変;
(ax)300位のTyrをGlnに置換する改変;
(ay)335位のThrをAspに置換する改変;
(az)239位のSerをAsnに置換する改変;
(ba)326位のLysをLeuに置換する改変;
(bb)326位のLysをIleに置換する改変;
(bc)239位のSerをGluに置換する改変;
(bd)326位のLysをPheに置換する改変;
(be)326位のLysをValに置換する改変;
(bf)326位のLysをTyrに置換する改変;
(bg)267位のSerをAspに置換する改変;
(bh)326位のLysをProに置換する改変;
(bi)326位のLysをHisに置換する改変;
(bj)334位のLysをAlaに置換する改変;
(bk)334位のLysをTrpに置換する改変;
(bl)268位のHisをGlnに置換する改変;
(bm)326位のLysをGlnに置換する改変;
(bn)326位のLysをGluに置換する改変;
(bo)326位のLysをMetに置換する改変;
(bp)266位のValをIleに置換する改変;
(bq)334位のLysをGluに置換する改変;
(br)300位のTyrをGluに置換する改変;
(bs)334位のLysをMetに置換する改変;
(bt)334位のLysをValに置換する改変;
(bu)334位のLysをThrに置換する改変;
(bv)334位のLysをSerに置換する改変;
(bw)334位のLysをHisに置換する改変;
(bx)334位のLysをPheに置換する改変;
(by)334位のLysをGlnに置換する改変;
(bz)334位のLysをProに置換する改変;
(ca)334位のLysをTyrに置換する改変;
(cb)334位のLysをIleに置換する改変;
(cc)295位のGlnをLeuに置換する改変;
(cd)334位のLysをLeuに置換する改変;
(ce)334位のLysをAsnに置換する改変;
(cf)268位のHisをAlaに置換する改変;
(cg)239位のSerをAspに置換する改変;
(ch)267位のSerをAlaに置換する改変;
(ci)234位のLeuをTrpに置換する改変;
(cj)234位のLeuをTyrに置換する改変;
(ck)237位のGlyをAlaに置換する改変;
(cl)237位のGlyをAspに置換する改変;
(cm)237位のGlyをGluに置換する改変;
(cn)237位のGlyをLeuに置換する改変;
(co)237位のGlyをMetに置換する改変;
(cp)237位のGlyをTyrに置換する改変;
(cq)330位のAlaをLysに置換する改変;
(cr)330位のAlaをArgに置換する改変;
(cs)233位のGluをAspに置換する改変;
(ct)268位のHisをAspに置換する改変;
(cu)268位のHisをGluに置換する改変;
(cv)326位のLysをAspに置換する改変;
(cw)326位のLysをSerに置換する改変;
(cx)326位のLysをThrに置換する改変;
(cy)323位のValをIleに置換する改変;
(cz)323位のValをLeuに置換する改変;
(da)323位のValをMetに置換する改変;
(db)296位のTyrをAspに置換する改変;
(dc)326位のLysをAlaに置換する改変;
(dd)326位のLysをAsnに置換する改変;
(de)330位のAlaをMetに置換する改変
であり得る。
233位のAsp、
234位のTyr、
237位のAsp、
264位のIle、
265位のGlu、
266位のPhe、Met、またはLeuのいずれか、
267位のAla、Glu、Gly、またはGlnのいずれか、
268位のAsp、またはGluのいずれか、
269位のAsp、
272位の、Asp、Phe、Ile、Met、Asn、またはGlnのいずれか、
296位のAsp、
326位のAla、またはAspのいずれか、
327位のGly、
330位のLys、またはArgのいずれか、
331位のSer、
332位のThr、
333位のThr、Lys、またはArgのいずれか、および
396位のAsp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、またはTyrのいずれか
の1つ以上を含むヒト定常領域またはヒトFc領域の改変体が挙げられるがこれらに限定されない。
(a)237位のアミノ酸をMetに;
(b)238位のアミノ酸をAlaに;
(c)239位のアミノ酸をLysに;
(d)248位のアミノ酸をIleに;
(e)250位のアミノ酸をAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
(f)252位のアミノ酸をPhe、Trp、およびTyrのいずれかに;
(g)254位のアミノ酸をThrに;
(h)255位のアミノ酸をGluに;
(i)256位のアミノ酸をAsp、Glu、およびGlnのいずれかに;
(j)257位のアミノ酸をAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、およびValのいずれかに;
(k)258位のアミノ酸をHisに;
(l)265位のアミノ酸をAlaに;
(m)270位のアミノ酸をPheに;
(n)286位のアミノ酸をAlaまたはGluのいずれかに;
(o)289位のアミノ酸をHisに;
(p)297位のアミノ酸をAlaに;
(q)298位のアミノ酸をGlyに;
(r)303位のアミノ酸をAlaに;
(s)305位のアミノ酸をAlaに;
(t)307位のアミノ酸をAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
(u)308位のアミノ酸をAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、およびThrのいずれかに;
(v)309位のアミノ酸をAla、Asp、Glu、Pro、およびArgのいずれかに;
(w)311位のアミノ酸をAla、His、およびIleのいずれかに;
(x)312位のアミノ酸をAlaまたはHisのいずれかに;
(y)314位のアミノ酸をLysまたはArgのいずれかに;
(z)315位のアミノ酸をAlaまたはHisのいずれかに;
(aa)317位のアミノ酸をAlaに;
(ab)325位のアミノ酸をGlyに;
(ac)332位のアミノ酸をValに;
(ad)334位のアミノ酸をLeuに;
(ae)360位のアミノ酸をHisに;
(af)376位のアミノ酸をAlaに;
(ag)380位のアミノ酸をAlaに;
(ah)382位のアミノ酸をAlaに;
(ai)384位のアミノ酸をAlaに;
(aj)385位のアミノ酸をAspまたはHisのいずれかに;
(ak)386位のアミノ酸をProに;
(al)387位のアミノ酸をGluに;
(am)389位のアミノ酸をAlaまたはSerのいずれかに;
(an)424位のアミノ酸をAlaに;
(ao)428位のアミノ酸をAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrのいずれかに;
(ap)433位のアミノ酸をLysに;
(aq)434位のアミノ酸をAla、Phe、His、Ser、Trp、およびTyrに;ならびに
(ar)436位のアミノ酸をHisに
からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基の改変が挙げられている。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、一箇所のみの位置が改変され得るし、二箇所以上の位置が改変され得る。二箇所以上のアミノ酸の改変の組合せとしては、例えばWO2013/046722の表2に記載されている。開示AおよびBの抗体に、適宜、これらのアミノ酸残基の改変を組み入れてもよい。
参照抗体と比較して、
(a)血漿中からの抗原の消失を促進できる抗体を選択する工程;
(b)細胞外マトリックスへの結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(c)中性pHの条件下でFcγR結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(d)中性pHの条件下でFcγRIIb結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(e)FcγRIIb結合活性が維持もしくは増大されている一方で、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、およびFcγRIIaからなる群より選択される一つ以上の活性型FcγRに対する結合活性が減少している抗体を選択する工程;
(f)中性pHの条件下でFcRn結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(g)pIを有する抗体を選択する工程;
(h)回収した抗体のpIを確認後、pIを上昇させた抗体を選択する工程;及び、
(i)イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化もしくは増加している抗体を選択する工程
からなる群から選択されるいずれか1つ以上の工程を任意に含む、製造方法に関する。
(a)負電荷を有するアミノ酸残基を、電荷を有さないアミノ酸残基に置換;
(b)負電荷を有するアミノ酸残基を、正電荷を有するアミノ酸残基に置換;および
(c)電荷を有さないアミノ酸残基を、正電荷を有するアミノ酸残基に置換
からなる群より選択される改変を含む。いくつかの実施態様において、少なくとも一つの改変アミノ酸残基は、ヒスチジンで置換されている。さらなる実施態様において、抗体は可変領域、および/または定常領域を含み、アミノ酸残基は、この可変領域、および/または定常領域において改変される。さらなる実施態様において、前記方法によって改変された少なくとも一つのアミノ酸残基は、Kabatナンバリングで表される、以下:
(a)重鎖可変領域のFRにおける、1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、19位、23位、25位、26位、39位、41位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、77位、81位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、86位、105位、108位、110位、および112位;
(b)重鎖可変領域のCDRにおける、31位、61位、62位、63位、64位、65位、および97;
(c)軽鎖可変領域のFRにおける、1位、3位、7位、8位、9位、11位、12位、16位、17位、18位、20位、22位、37位、38位、39位、41位、42位、43位、45位、46位、49位、57位、60位、63位、65位、66位、68位、69位、70位、74位、76位、77位、79位、80位、81位、85位、100位、103位、105位、106位、107位、および108位;ならびに
(d)軽鎖可変領域のCDRにおける、24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、および56位
からなる群より選択される、CDRまたはFR内の位置にある。なおさらなる実施態様において、前記方法によって改変された少なくとも一つのアミノ酸残基は、Kabatナンバリングで表される、以下:
(a)重鎖可変領域のFRにおける、8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、23位、39位、41位、43位、44位、77位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、および105位;
(b)重鎖可変領域のCDRにおける、31位、61位、62位、63位、64位、65位、および 97位;
(c)軽鎖可変領域のFRにおける、16位、18位、37位、41位、42位、45位、65位、69位、74位、76位、77位、79位、および107位;ならびに
(d)軽鎖可変領域のCDRにおける、24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、および56位
からなる群より選択される、CDRまたはFR内の位置にある。いくつかの実施態様において、抗原は可溶性抗原である。いくつかの実施態様において、前記方法は、酸性pH(例えばpH5.8)および中性pH(例えばpH7.4)において、その対応する抗原と、前記方法によって産生された抗体のKDを比較する工程をさらに含む。さらなる実施態様において、前記方法は、抗原に関するKD(pH酸性域(例えばpH5.8))/KD(pH中性域(例えばpH7.4))が2またはそれより高い抗体を選択する工程を含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、高イオン濃度(例えば水素イオンまたはカルシウムイオン濃度)条件下および低イオン濃度条件下で前記方法によって産生された抗体の抗原結合活性を比較する工程をさらに含む。さらなる実施態様において、前記方法は、低イオン濃度下よりも高イオン濃度下でより高い(例えば2倍)抗原結合活性を有する抗体を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施態様では、イオン濃度はカルシウムイオン濃度であり、高カルシウムイオン濃度は、100μM〜10mMの間、200μM〜5mMの間、400μM〜3mMの間、200μM〜2mMの間、または400μM〜1mMの間で選択され得る。インビボでの血漿(血液)中のカルシウムイオン濃度に近い、500μM〜2.5mMの間で選択された濃度がまた好ましい場合もある。いくつかの実施態様において、低カルシウムイオン濃度は、0.1μM〜30μMの間、0.2μM〜20μMの間、0.5μM〜10μMの間、または1μM〜5μMの間、または2μM〜4μMの間で選択され得る。インビボでの初期エンドソームのカルシウムイオン濃度に近い、1μM〜5μMの間で選択された濃度がまた好ましい場合もある。いくつかの実施態様では、KD(低カルシウムイオン濃度条件)/KD(高カルシウムイオン濃度条件)(例えば、KD(3μMのCa)/KD(2mMのCa))値の下限は、2以上、10以上、または40以上であり、その上限は、400以下、1000以下、または10000以下である。代替的ないくつかの実施態様において、kd(低カルシウムイオン濃度条件)/kd(高カルシウムイオン濃度条件)(例えば、kd(3μMのCa)/kd(2mMのCa))値の下限は、2以上、5以上、10以上、または30以上であり、その上限は、50以下、100以下、または200以下である。いくつかの実施態様において、イオン濃度は水素イオン濃度であり、低水素イオン濃度(pH中性域)は、pH6.7〜pH10.0、pH6.7〜pH9.5、pH7.0〜pH9.0、またはpH7.0〜pH8.0から選択され得る。低水素イオン濃度は、インビボでの血漿(血液)中のpHに近い、pH7.4が好ましい場合があるものの、測定の簡便さのために、例えば、pH7.0が使用されてもよい。いくつかの実施態様において、高水素イオン濃度(pH酸性域)が、pH4.0〜pH6.5、pH4.5〜pH6.5、pH5.0〜pH6.5、またはpH5.5〜pH6.5から選択されてもよい。pH酸性域は、インビボでの初期エンドソームの水素イオン濃度に近い、pH5.8が好ましい場合があるものの、測定の簡便さのために、例えばpH6.0が使用されてもよい。いくつかの実施態様において、KD(pH酸性域)/KD(pH中性域)(例えば、KD(pH5.8)/KD(pH7.4))の下限は、2以上、10以上、または40以上であり、その上限は400以下、1000以下、または10000以下である。いくつかの実施態様において、前記方法は、前記方法で導入された改変を含まないという点のみが異なる参照抗体と比較した場合の、前記方法で産生した抗体の投与後の、血漿からの抗原の消失を比較する工程をさらに含む。さらなる実施態様において、前記方法は、前記方法で導入された改変を含まない抗体と比較した場合の、前記方法で産生した、血漿からの抗原の消失を促進する(例えば2倍)抗体を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、前記方法で導入された改変を含まないという点のみが異なる抗体と比較した場合の、前記方法で産生した抗体の細胞外マトリックス結合を比較する工程をさらに含む。さらなる実施態様において、前記方法は、前記方法で導入された改変を含まないという点のみが異なる抗体と比較した場合の、増加した細胞外マトリックス結合(例えば、抗原に結合した場合、2倍)を有する、前記方法で産生した抗体を選択する工程をさらに含む。さらなる実施態様において、pIを上昇させるために少なくとも一つのアミノ酸残基を修飾または改変する前の抗体(天然型抗体(例えば、天然型Ig抗体、好ましくは天然型IgG抗体))、または参照抗体(例えば、抗体改変前の抗体、またはライブラリ構築前もしくは構築中の抗体)と比較した場合に、前記方法で産生した抗体は、抗原に対する結合活性を(実質的に)維持している。この場合、「抗原に対する結合活性を(実質的に)維持している」とは、修飾または改変前の抗体の結合活性と比較して、50%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは70%もしくは75%以上、なおより好ましくは80%、85%、90%、もしくは95%以上の活性を有することを意味し得る。
(a)負電荷を有するアミノ酸残基を、電荷を有さないアミノ酸残基に置換;
(b)負電荷を有するアミノ酸残基を、正電荷を有するアミノ酸残基に置換;および
(c)電荷を有さないアミノ酸残基を、正電荷を有するアミノ酸残基に置換
からなる群より選択される改変を含む。いくつかの実施態様において、少なくとも一つの改変アミノ酸残基は、ヒスチジンで置換される。さらなる実施態様において、抗体は可変領域、および/または定常領域を含み、アミノ酸残基は、この可変領域、および/または定常領域において改変される。さらなる実施態様において、前記方法によって改変された少なくとも一つのアミノ酸残基は、EUナンバリングで表される、以下:
196位、253位、254位、256位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、307位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、および443位からなる群より選択される定常領域中の位置にある。さらなる実施態様において、前記方法によって改変された少なくとも一つのアミノ酸残基は、EUナンバリングで表される、以下:
254位、258位、281位、282位、285位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、418位、419位、421位、433位、434位、および443位からなる群より選択される定常領域中の位置にある。なおさらなる実施態様において、前記方法によって改変された少なくとも一つのアミノ酸残基は、EUナンバリングで表される、以下:
282位、309位、311位、315位、342位、343位、384位、399位、401位、402位、および413位からなる群より選択される定常領域中の位置にある。いくつかの実施態様において、前記方法は、高イオン濃度(例えば水素イオンまたはカルシウムイオン濃度)条件下および低イオン濃度条件下で前記方法によって産生された抗体の抗原結合活性を比較する工程をさらに含む。さらなる実施態様において、前記方法は、低イオン濃度下よりも高イオン濃度下でより高い抗原結合活性を有する抗体を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、前記方法で導入された改変を含まないという点のみが異なる参照抗体と比較した場合の、前記方法で産生した抗体の投与後の、血漿からの抗原の消失を比較する工程をさらに含む。さらなる実施態様において、前記方法は、前記方法で導入された改変を含まない抗体と比較した場合の、前記方法で産生した、血漿からの抗原の消失を促進する(例えば2倍)抗体を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、前記方法で導入された改変を含まないという点のみが異なる抗体と比較した場合の、前記方法で産生した抗体の細胞外マトリックス結合を比較する工程を含む。さらなる実施態様において、前記方法は、前記方法で導入された改変を含まないという点のみが異なる参照抗体と比較した場合の、増加した細胞外マトリックス結合(例えば、抗原に結合した場合、2倍)を有する、前記方法で産生した抗体を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、前記方法で産生した抗体の、中性pH(例えば、pH7.4)下でのFcγ受容体(FcγR)結合活性を、天然型IgGの定常領域を含む参照抗体の結合活性と比較する工程を含む。さらなる実施態様において、前記方法は、天然型IgGの定常領域を含む参照抗体と比較した場合に、中性pH(例えばpH7.4)下で増加したFcγR結合活性を有する、前記方法で産生した抗体を選択する工程を含む。いくつかの実施態様において、前記方法で産生した、選択された抗体は、中性pH下で、増加したFcγRIIb結合活性を有する。いくつかの実施態様において、前記方法で産生した、選択された抗体は、定常領域が天然型IgGのものである点においてのみ異なる参照抗体と比較した場合に、好ましくはFcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、およびFcγRIIaからなる群より選択される一つ以上の活性型FcγRに対する、ならびにFcγRIIbに対する結合活性を有し、任意で、FcγRIIb結合活性が維持されるかまたは増加され、かつ活性型FcγRへの結合活性が低下している。いくつかの実施態様において、前記方法は、定常領域が天然型IgGのものである点においてのみ異なる参照抗体と比較した場合に、前記方法で産生した抗体の中性pH条件下でのFcRn結合活性を比較する工程をさらに含む。さらなる実施態様において、前記方法は、定常領域が天然型IgGのものである点においてのみ異なる参照抗体と比較した場合に、前記方法で産生した、中性pH条件下で増加したFcRn結合活性(例えば、2倍)を有する抗体を選択する工程をさらに含む。いくつかの実施態様において、pIを上昇させるために少なくとも一つのアミノ酸残基を修飾または改変する前の抗体(天然型抗体(例えば、天然型Ig抗体、好ましくは天然型IgG抗体))、または参照抗体(例えば、抗体改変前の抗体、またはライブラリ構築前もしくは構築中の抗体)と比較した場合に、前記方法で産生した抗体は、抗原に対する結合活性を(実質的に)維持している。この場合、「抗原に対する結合活性を(実質的に)維持している」とは、修飾または改変前の抗体の結合活性と比較して、少なくとも50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%もしくは75%以上、なおより好ましくは80%、85%、90%、もしくは95%以上の活性を有することを意味し得る。
(a)EUナンバリングで表される、以下の位置:
196位、253位、254位、256位、257位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、306位、307位、308位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、388位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、および443位
からなる群より選択される位置に位置する少なくとも一つのアミノ酸残基の電荷を変化させるための改変を行う前の抗体をコードする核酸を、改変する工程;
(b)改変された核酸を発現させ、抗体を産生するために、宿主細胞を培養する工程;ならびに
(c)産生された抗体を、宿主細胞培養物から回収する工程。
196位、253位、254位、256位、257位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、306位、307位、308位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、388位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、および443位
からなる群より選択される位置に位置する少なくとも一つのアミノ酸残基を改変する工程を含む。
(a)Glu (E)およびAsp (D);ならびに
(b)Lys (K)、Arg (R)、およびHis (H)
からなる群より選択され得るが、これに限定されない。
非限定的な実施態様において、開示Bは、Fc領域改変体、それらの使用および製造方法等に関する。
F8M-F1847mv [重鎖としてF8M-F1847mv1(配列番号:323)およびF8M-F1847mv2(配列番号:324)、ならびに軽鎖としてF8ML(配列番号:325)];
F8M-F1868mv [重鎖としてF8M-F1868mv1(配列番号:326)およびF8M-F1868mv2(配列番号:327)、ならびに軽鎖としてF8ML(配列番号:325)];および
F8M-F1927mv [重鎖としてF8M-F1927mv1(配列番号:328)およびF8M-F1927mv2(配列番号:329)および軽鎖としてF8ML(配列番号:325)])
を用いて産生することができる。
(a)N434A/Q438R/S440E;
(b)N434A/Q438R/S440D;
(c)N434A/Q438K/S440E;
(d)N434A/Q438K/S440D;
(e)N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(f)N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(g)N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(h)N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(i)N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(j)N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(k)N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(l)N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(m)N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E;
(n)N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D;
(o)N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E;
(p)N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D;
(q)N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E;
(r)N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D;
(s)N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E;
(t)N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D;
(u)M428L/N434A/Q438R/S440E;
(v)M428L/N434A/Q438R/S440D;
(w)M428L/N434A/Q438K/S440E;
(x)M428L/N434A/Q438K/S440D;
(y)M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(z)M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(aa)M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(ab)M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(ac)M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(ad)M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(ae)M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(af)M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(ag)L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;および
(ah)L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群から選択される、置換されたアミノ酸位置の組み合わせを含んでよい。
(a)N434A/Q438R/S440E;
(b)N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(c)N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(d)M428L/N434A/Q438R/S440E;
(e)M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(f)M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(g)L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;および
(h)L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群から選択される、置換されたアミノ酸の組み合わせを含んでよい。
A値は、各時点での抗原のモル濃度であり、
B値は、各時点での抗体のモル濃度であり、および
C値は、各時点での抗体のモル濃度あたりの抗原のモル濃度(抗原/抗体モル比)である。
(a)天然型IgGのFc領域のものと比較して、酸性pHの条件下でFcRnに対する増大した結合活性を有するFc領域改変体を選択する工程;
(b)天然型IgGのFc領域と比較して、中性pHの条件下で(既存の)ADAに対する結合活性が有意に増大されていないFc領域改変体を選択する工程;
(c)天然型IgGのFc領域と比較して、向上した血漿中の滞留性を有するFc領域改変体を選択する工程;及び、
(d)天然型IgGのFc領域を含む参照抗体と比較して、血漿中からの抗原の消失を促進できるFc領域改変体を含む抗体を選択する工程
のうちいずれか1つ以上を任意にさらに含む、製造方法を含んでもよい。
(a)参照抗体と比較して、酸性pHにおけるFcRnに対する結合活性が増大された、Fc領域(改変体)を含む抗体を提供する工程、ならびに
(b)当該Fc領域において、EUナンバリングで表される、
(i)434位のAlaによるアミノ酸置換;
(ii)438位のGlu、Arg、Ser又はLysによるアミノ酸置換;及び、
(iii)440位のGlu、Asp又はGlnによるアミノ酸置換、
(iv)場合により、428位のIle又はLeuによるアミノ酸置換;及び/又は、
(v)場合により、436位のIle、Leu、Val、Thr又はPheによるアミノ酸置換
を導入する工程。
(a)N434A/Q438R/S440E;
(b)N434A/Q438R/S440D;
(c)N434A/Q438K/S440E;
(d)N434A/Q438K/S440D;
(e)N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(f)N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(g)N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(h)N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(i)N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(j)N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(k)N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(l)N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(m)N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E;
(n)N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D;
(o)N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E;
(p)N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D;
(q)N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E;
(r)N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D;
(s)N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E;
(t)N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D;
(u)M428L/N434A/Q438R/S440E;
(v)M428L/N434A/Q438R/S440D;
(w)M428L/N434A/Q438K/S440E;
(x)M428L/N434A/Q438K/S440D;
(y)M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(z)M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D;
(aa)M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(ab)M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(ac)M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(ad)M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(ae)M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(af)M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(ag)L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E; および
(ah)L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群から選択される、置換されたアミノ酸の組み合わせを含む。
(c)作製されたFc領域改変体を含む抗体の(既存の)ADAに対する結合活性が、前記参照抗体の結合活性と比較して低下していることを確認する工程
をさらに含んでもよい。
開示Cは、以下に詳述する抗IL-8抗体、当該抗体をコードする核酸、当該抗体を含む医薬組成物、当該抗体の製造方法、及びIL-8が関連する疾患の治療における当該抗体の使用に関する。なお、以下に記載の用語の意味は、当業者公知の実施態様に加えて、当明細書中の開示Cについて説明される記載のすべてが、当業者の技術常識に反することなく準用されてよい。
当明細書中の開示Cを記載している範囲において「酸性pH」とは、例えばpH4.0からpH6.5までで選択され得るpHを指す。一実施態様では、酸性pHは、pH4.0、pH4.1、pH4.2、pH4.3、pH4.4、pH4.5、pH4.6、pH4.7、pH4.8、pH4.9、pH5.0、pH5.1、pH5.2、pH5.3、pH5.4、pH5.5、pH5.6、pH5.7、pH5.8、pH5.9、pH6.0、pH6.1、pH6.2、pH6.3、pH6.4、又はpH6.5を指すがこれらに限定されない。特定の実施態様において、酸性pHとの用語は、pH5.8を指す。
(a)アミノ酸残基が26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及び96-101 (H3)である高頻度可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b)アミノ酸残基が24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、及び95-102 (H3)であるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c)アミノ酸残基が27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及び93-101 (H3)である抗原接触 (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに
(d)HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、及び94-102 (H3) を含む、(a)、(b)、及び/または(c)との組合せ。
一実施態様において、開示Cは、IL-8に対するpH依存的な親和性を有する抗IL-8抗体が医薬組成物として利用可能であることに基づく。開示Cの抗体は、例えば、IL-8が過剰に存在する疾患の診断や治療に有益である。
一実施態様において、開示Cは、IL-8に対してpH依存的な親和性を有する抗IL-8抗体を提供する。
(a)配列番号:67のアミノ酸配列を含むHVR-H1、
(b)配列番号:68のアミノ酸配列を含むHVR-H2、
(c)配列番号:69のアミノ酸配列を含むHVR-H3、
(d)配列番号:70のアミノ酸配列を含むHVR-L1、
(e)配列番号:71のアミノ酸配列を含むHVR-L2、
(f)配列番号:72のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
(a)配列番号:67のアミノ酸配列を含むHVR-H1、
(b)配列番号:68のアミノ酸配列を含むHVR-H2、
(c)配列番号:69のアミノ酸配列を含むHVR-H3、
(d)配列番号:70のアミノ酸配列を含むHVR-L1、
(e)配列番号:71のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および
(f)配列番号:72のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
(a)配列番号:67の配列の1位のアスパラギン酸、
(b)配列番号:67の配列の2位のチロシン、
(c)配列番号:67の配列の3位のチロシン、
(d)配列番号:67の配列の4位のロイシン、
(e)配列番号:67の配列の5位のセリン、
(f)配列番号:68の配列の1位のロイシン、
(g)配列番号:68の配列の2位のイソロイシン、
(h)配列番号:68の配列の3位のアルギニン、
(i)配列番号:68の配列の4位のアスパラギン、
(j)配列番号:68の配列の5位のリジン、
(k)配列番号:68の配列の6位のアラニン、
(l)配列番号:68の配列の7位のアスパラギン、
(m)配列番号:68の配列の8位のグリシン、
(n)配列番号:68の配列の9位のチロシン、
(o)配列番号:68の配列の10位のスレオニン、
(p)配列番号:68の配列の11位のアルギニン、
(q)配列番号:68の配列の12位のグルタミン酸、
(r)配列番号:68の配列の13位のチロシン、
(s)配列番号:68の配列の14位のセリン、
(t)配列番号:68の配列の15位のアラニン、
(u)配列番号:68の配列の16位のセリン、
(v)配列番号:68の配列の17位のバリン、
(w)配列番号:68の配列の18位のリジン、
(x)配列番号:68の配列の19位のグリシン、
(y)配列番号:69の配列の1位のグルタミン酸、
(z)配列番号:69の配列の2位のアスパラギン、
(aa)配列番号:69の配列の3位のチロシン、
(ab)配列番号:69の配列の4位のアルギニン、
(ac)配列番号:69の配列の5位のチロシン、
(ad)配列番号:69の配列の6位のアスパラギン酸、
(ae)配列番号:69の配列の7位のバリン、
(af)配列番号:69の配列の8位のグルタミン酸、
(ag)配列番号:69の配列の9位のロイシン、
(ah)配列番号:69の配列の10位のアラニン、
(ai)配列番号:69の配列の11位のチロシン、
(aj)配列番号:70の配列の1位のアルギニン、
(ak)配列番号:70の配列の2位のアラニン、
(al)配列番号:70の配列の3位のセリン、
(am)配列番号:70の配列の4位のグルタミン酸、
(an)配列番号:70の配列の5位のイソロイシン、
(ao)配列番号:70の配列の6位のイソロイシン、
(ap)配列番号:70の配列の7位のチロシン、
(aq)配列番号:70の配列の8位のセリン、
(ar)配列番号:70の配列の9位のチロシン、
(as)配列番号:70の配列の10位のロイシン、
(at)配列番号:70の配列の11位のアラニン、
(au)配列番号:71の配列の1位のアスパラギン、
(av)配列番号:71の配列の2位のアラニン、
(aw)配列番号:71の配列の3位のリジン、
(ax)配列番号:71の配列の4位のスレオニン、
(ay)配列番号:71の配列の5位のロイシン、
(az)配列番号:71の配列の6位のアラニン、
(ba)配列番号:71の配列の7位のアスパラギン酸、
(bb)配列番号:72の配列の1位のグルタミン、
(bc)配列番号:72の配列の2位のヒスチジン、
(bd)配列番号:72の配列の3位のヒスチジン、
(be)配列番号:72の配列の4位のフェニルアラニン、
(bf)配列番号:72の配列の5位のグリシン、
(bg)配列番号:72の配列の6位のフェニルアラニン、
(bh)配列番号:72の配列の7位のプロリン、
(bi)配列番号:72の配列の8位のアルギニン、および
(bj)配列番号:72の配列の9位のスレオニン。
(a)配列番号:68の配列の6位のアラニン、
(b)配列番号:68の配列の8位のグリシン、
(c)配列番号:68の配列の9位のチロシン、
(d)配列番号:68の配列の11位のアルギニン、及び
(e)配列番号:69の配列の3位のチロシン。
(a)配列番号:68の配列の6位のアラニン、
(b)配列番号:68の配列の8位のグリシン、
(c)配列番号:68の配列の9位のチロシン、
(d)配列番号:68の配列の11位のアルギニン、及び、
(e)配列番号:69の配列の3位のチロシン。
(a)配列番号:68の配列の9位のチロシン、
(b)配列番号:68の配列の11位のアルギニン、及び、
(c)配列番号:69の配列の3位のチロシン
の位置のアミノ酸の置換を含む。
(a)配列番号:68の配列の6位のアラニン、
(b)配列番号:68の配列の8位のグリシン、
(d)配列番号:68の配列の9位のチロシン、
(e)配列番号:68の配列の11位のアルギニン、及び、
(f)配列番号:69の配列の3位のチロシン
の位置のアミノ酸の置換を含む。
(a)配列番号:68の配列の6位のアラニンのアスパラギン酸への置換と、
(b)配列番号:68の配列の11位のアルギニンのプロリンへの置換と、
(c)配列番号:69の配列の3位のチロシンのヒスチジンへの置換
を含む。
(a)配列番号:68の配列の8位のグリシンのチロシンへの置換と、
(b)配列番号:68の配列の9位のチロシンのヒスチジンへの置換
を含む。
(a)配列番号:68の配列の6位のアラニンのアスパラギン酸への置換と、
(b)配列番号:68の配列の8位のグリシンのチロシンへの置換と、
(c)配列番号:68の配列の9位のチロシンのヒスチジンへの置換と、
(d)配列番号:68の配列の11位のアルギニンのプロリンへの置換と、
(e)配列番号:69の配列の3位のチロシンのヒスチジンへの置換
を含む。
(a)配列番号:70の配列の8位のセリン、
(b)配列番号:71の配列の1位のアスパラギン、
(c)配列番号:71の配列の5位のロイシン、及び
(d)配列番号:72の配列の1位のグルタミン。さらなる実施態様では、抗IL-8抗体は、これらの置換のうち、任意の2つ、3つ、または4つ全ての組み合わせを含む。
(a)配列番号:70の配列の8位のセリン、
(b)配列番号:71の配列の1位のアスパラギン、
(c)配列番号:71の配列の5位のロイシン、及び
(d)配列番号:72の配列の1位のグルタミン。さらなる実施態様では、抗IL-8抗体は、これらの置換のうち、任意の2つ、3つ、または4つ全ての組み合わせを含む。
(a)配列番号:71の配列の1位のアスパラギン、
(b)配列番号:71の配列の5位のロイシン、及び
(c)配列番号:72の配列の1位のグルタミン
の位置のアミノ酸の置換を含む。
(a)配列番号:70の配列の8位のセリン、
(b)配列番号:71の配列の1位のアスパラギン、
(c)配列番号:71の配列の5位のロイシン、及び
(d)配列番号:72の配列の1位のグルタミン
の位置のアミノ酸の置換を含む。
(a)配列番号:71の配列の1位のアスパラギンのリジンへの置換と、
(b)配列番号:71の配列の5位のロイシンのヒスチジンへの置換と、及び
(c)配列番号:72の配列の1位のグルタミンのリジンへの置換
を含む。
(a)配列番号:70の配列の8位のセリンのグルタミン酸への置換と、
(b)配列番号:71の配列の1位のアスパラギンのリジンへの置換と、
(c)配列番号:71の配列の5位のロイシンのヒスチジンへの置換と、及び
(c)配列番号:72の配列の1位のグルタミンのリジンへの置換
を含む。
(a)配列番号:77の配列の55位のアラニン、
(b)配列番号:77の配列の57位のグリシン、
(c)配列番号:77の配列の58位のチロシン、
(d)配列番号:77の配列の60位のアルギニン、
(e)配列番号:77の配列の84位のグルタミン、
(f)配列番号:77の配列の87位のセリン、及び
(g)配列番号:77の配列の103位のチロシン
の位置のアミノ酸の置換を含む。
(a)配列番号:77の配列の55位のアラニンのアスパラギン酸への置換と、
(b)配列番号:77の配列の57位のグリシンのチロシンへの置換と、
(c)配列番号:77の配列の58位のチロシンのヒスチジンへの置換と、
(d)配列番号:77の配列の60位のアルギニンのプロリンへの置換と、
(e)配列番号:77の配列の84位のグルタミンのスレオニンへの置換と、
(f)配列番号:77の配列の87位のセリンのアスパラギン酸への置換と、及び
(g)配列番号:77の配列の103位のチロシンのヒスチジンへの置換
を含む。
(a)配列番号:102のアミノ酸配列を含むHVR-H1、
(b)配列番号:103のアミノ酸配列を含むHVR-H2、
(c)配列番号:104のアミノ酸配列を含むHVR-H3、
(d)配列番号:105のアミノ酸配列を含むHVR-L1、
(e)配列番号:106のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および
(f)配列番号:107のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
(a)配列番号:108のアミノ酸配列を含むHVR-H1、
(b)配列番号:109のアミノ酸配列を含むHVR-H2、
(c)配列番号:110のアミノ酸配列を含むHVR-H3、
(d)配列番号:111のアミノ酸配列を含むHVR-L1、
(e)配列番号:112のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および
(f)配列番号:113のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
(a)配列番号:114のアミノ酸配列を含むHVR-H1、
(b)配列番号:115のアミノ酸配列を含むHVR-H2、
(c)配列番号:116のアミノ酸配列を含むHVR-H3、
(d)配列番号:117のアミノ酸配列を含むHVR-L1、
(e)配列番号:118のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および
(f)配列番号:119のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
(a)配列番号:120のアミノ酸配列を含むHVR-H1、
(b)配列番号:121のアミノ酸配列を含むHVR-H2、
(c)配列番号:122のアミノ酸配列を含むHVR-H3、
(d)配列番号:123のアミノ酸配列を含むHVR-L1、
(e)配列番号:124のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および
(f)配列番号:125のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
(a)配列番号:126のアミノ酸配列を含むHVR-H1、
(b)配列番号:127のアミノ酸配列を含むHVR-H2、
(c)配列番号:128のアミノ酸配列を含むHVR-H3、
(d)配列番号:129のアミノ酸配列を含むHVR-L1、
(e)配列番号:130のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および
(f)配列番号:131のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
(a)配列番号:132のアミノ酸配列を含むHVR-H1、
(b)配列番号:133のアミノ酸配列を含むHVR-H2、
(c)配列番号:134のアミノ酸配列を含むHVR-H3、
(d)配列番号:135のアミノ酸配列を含むHVR-L1、
(e)配列番号:136のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および
(f)配列番号:137のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
(a)配列番号:138のアミノ酸配列を含むHVR-H1、
(b)配列番号:139のアミノ酸配列を含むHVR-H2、
(c)配列番号:140のアミノ酸配列を含むHVR-H3、
(d)配列番号:141のアミノ酸配列を含むHVR-L1、
(e)配列番号:142のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および
(f)配列番号:143のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
ある実施態様では、開示Cで提供される抗体はキメラ抗体であってもよい。あるキメラ抗体は、例えば米国特許第4,816,567号や Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)などに記載されている。ある例では、キメラ抗体は非ヒト可変領域(例えば、サルのような非ヒト霊長類、またはマウス、ラット、ハムスター、ウサギに由来する可変領域)とヒトの定常領域を含んでもよい。
ある実施態様では、開示Cとして提供される抗体は抗体断片であってもよい。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、およびscFv断片、そして以下に述べるその他の断片を含む。ある抗体断片のレビューについては Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。scFv断片のレビューについては、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)や、WO 93/16185、米国特許第5,571,894号、米国特許第5,587,458号を参照のこと。
ある実施態様では、開示Cで提供される抗体は、ヒト抗体であってもよい。ヒト抗体は、当技術分野で既知の様々な技術によって作製することができる。ヒト抗体は一般的に、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) や Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト抗体は、ヒト可変領域を有する未加工の抗体或は未加工のヒト抗体を抗原に応答して産生するように改変されたトランスジェニック動物へ免疫原を投与することで、調製され得る。このような動物は典型的には全部あるいは一部のヒト免疫グロブリン遺伝子座を含み、これは、動物(非ヒト)の免疫グロブリン遺伝子座と置き換わるか、染色体外に存在するか、あるいは動物の染色体内に無作為に取り込まれる。このようなトランスジェニックマウスにおいて、動物(非ヒト)の免疫グロブリン遺伝子座は、通常不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を取得する方法のレビューについては、以下を参照のこと:Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。XENOMOUSE(商標)技術については、米国特許第6,075,181号、同第6,150,584号を参照。HUMAB(商標)技術については、米国特許第5,770,429号を参照。K-M MOUSE(商標)技術については、米国特許第7,041,870号を参照。VELOCIMOUSE(商標)技術については、米国特許出願公開US 2007/0061900を参照。
開示Cの抗体は、一つ又は複数の望ましい活性を持つ抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることで単離できる。例えば、ファージディスプレイライブラリを作製するためおよび、望ましい結合特性を保有する抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための、いろいろな方法が知られている。このような方法は、Hoogenboom et al., Meth. Mol. Biol. 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)、更には例えばMcCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Meth. Mol. Biol. 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);およびLee et al., J. Immunol. Meth. 284(1-2): 119-132(2004)などでレビューされている。
ある実施態様では、開示Cにより提供される抗体は、例えば二重特異性抗体のような、多重特異性抗体であってもよい。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なった部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。
抗体のアミノ酸配列改変体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することや、ペプチドを合成することで調製し得る。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列における残基の欠失及び/または挿入及び/または置換を含む。欠失、挿入、および置換のいかなる組合せも、最終構成物(final constract)が、開示Cの文脈に記載された望ましい特徴を有した抗体である限り、当該最終構成物に到達するために用いることができる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;及び
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
一実施態様では、開示Cで提供される抗体は、グリコシル化されていてもよい。グリコシル化部位の抗体への追加或は抗体からの削除は、グリコシル化の部位を作製するか取り除くかするようにアミノ酸配列を変更することで達成可能である。
一実施態様では、一つ以上のアミノ酸改変が開示Cで提供される抗体のFc領域に導入され、その結果Fc領域改変体が生じる。Fc領域改変体は、一つ、二つ、または三つ以上のアミノ酸の改変(例えば置換)を含む天然型ヒトFc領域配列(例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域)を有するものを含む。
(a)酸性pHでの、天然型Fc領域のFcRnに対する結合親和性よりも増大した、当該Fc領域のFcRnに対する結合親和性;
(b)天然型Fc領域の既存のADAに対する結合親和性よりも低下した、既存のADAに対する当該Fc領域の結合親和性;
(c)天然型Fc領域の血漿中半減期よりも延長された、当該Fc領域の血漿中半減期;
(d)天然型Fc領域の血漿中クリアランスよりも減少した、当該Fc領域の血漿中クリアランス;および
(e)天然型Fc領域のエフェクター受容体に対する結合親和性よりも低下した、エフェクター受容体に対する当該Fc領域の結合親和性。いくつかの実施態様では、Fc領域は上述の性質のうち2つ、3つまたは4つを有する。一実施態様では、Fc領域改変体は、酸性pHにおいて、FcRnに対する結合親和性が増大しているFc領域改変体を含む。FcRnに対する結合親和性が増大しているFc領域改変体とは、天然型IgGのFc領域を含む抗体と比較して、FcRnに対する結合親和性が最大で2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、50倍、または100倍に増大しているFc領域改変体を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様では、開示Cにおいて提供される抗体は、先行技術として知られていて容易に利用可能な非タンパク質性部分を追加的に含めるために更に改変されていてもよい。抗体派生物を作製するのに適切な当該部分は、これに限らないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの例としては、これに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコールやプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーおよびランダムコポリマー)、ポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリルプロピレンオキサイド/エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物がある。
開示Cにおける抗IL-8抗体は、例えば米国特許第4,816,567号に記載された、組換え法や組成物を用いて作製することができる。一実施態様では、開示Cとして提示された抗IL-8抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/または抗体のVHを含むアミノ酸配列(例えば抗体の軽鎖及び/または重鎖)をコードしていてもよい。さらなる実施態様では、このような核酸を含む一つ以上のベクター(例えば発現ベクター)が提供される。一実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、(1)抗体のVL及び/またはVHをコードする核酸を含むベクター、あるいは(2)抗体のVLをコードする核酸を含む第一のベクターと抗体のVHをコードする核酸を含む第二のベクターを含む(例えば、これらベクターで形質転換されている)。
当明細書中の開示Cを記載している範囲で提供される抗IL-8抗体は、当技術分野で既知のいろいろな方法によって、物理的/化学的特性及び/または生物学的活性に関して同定され、スクリーニングされ、または特徴付けられる。
一態様では、開示Cの抗体は、例えば、ELISAやウェスタンブロット、結合平衡除外法(Kinetic Exclusion Assay;KinExA(商標))、およびBIACORE(GE Healthcare)などの装置を用いた表面プラズモン共鳴法のような既知の方法で、抗原に対する結合活性を調べることができる。
一態様では、アッセイは、生物学的活性を有する抗IL-8抗体を同定するために提供される。前記生物学的活性には、例えば、IL-8を中和する活性、およびIL-8のシグナルを遮断する活性が含まれる。開示Cにはまた、インビボ及び/またはエキソビボでそのような生物学的活性を有する抗体も提供される。
当明細書中の開示Cを記載している範囲において記載されている抗IL-8抗体を含む薬学的製剤は、望ましい程度の純度を有する抗IL-8抗体と、一つ以上の任意の薬学的に許容される担体(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)を参照)とを混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液製剤の形態で調製され得る。
いくつかの実施態様において、開示Cで提供される抗IL-8抗体は治療方法に用いられる。
開示Cのもう一つの態様として、本開示では、上記に記載の疾患の治療、予防、及び/または診断に有用な物質を含む製品が提供される。そのような製品は、容器と、当該容器に付随するラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器には、例えば、ビン、バイアル、および静脈注射用溶液バッグなどが含まれる。容器はガラスやプラスチックなど、種々の物質から形成されていてもよい。そのような容器は、状態を診断、予防、および治療するためにそれ自体が有効である組成物、或は状態を診断、予防、および治療するために有効な他の組成物と組み合わされた組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有していてもよい(例えば、容器は静脈注射用溶液バッグでもよいし、皮下注射針で突き刺せるストッパーを有するバイアルであってもよい)。組成物の中で、少なくとも一つの活性成分は、開示Cの抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態を治療するのに使用されることを示している。
本明細書において引用された全ての技術背景文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
WO2009/125825に開示されているFv4-IgG1は、pH依存的にヒトIL-6受容体に結合する抗体であり、重鎖としてVH3-IgG1(配列番号:24)および軽鎖としてVL3-CK(配列番号:32)を含む。Fv4-IgG1のpIを上昇させるために、Fv4-IgG1の可変領域に対して、負電荷を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)の数を減らす一方で、正電荷を有するアミノ酸(例えば、アルギニン、リジン)を増やすためのアミノ酸置換の導入を行った。具体的には、重鎖であるVH3-IgG1のうち、Kabatナンバリングで表される、16位のグルタミン酸をグルタミンに、43位のグルタミン酸をアルギニンに、64位のグルタミンをリジンに、及び105位のグルタミン酸をグルタミンに置換することにより、pIを上昇させた重鎖としてVH3(High_pI)-IgG1(配列番号:25)を作製した。同様に、軽鎖であるVL3-CKのうち、Kabatナンバリングで表される、18位のセリンをアルギニンに、24位のグルタミンをアルギニンに、45位のグルタミン酸をリジンに、79位のグルタミン酸をグルタミンに、及び107位のグルタミン酸をリジンに置換することにより、pIを上昇させた軽鎖としてVL3(High_pI)-CK(配列番号:33)を作製した。なお、VL3-CKの79位の置換を導入する際に、pIを上昇する目的ではないが、80位のアラニンをプロリンに、83位のアラニンをイソロイシンに置換する改変が同時に導入された。
(a)重鎖としてVH3-IgG1および軽鎖としてVL3-CKを含む、Low_pI-IgG1;
(b)重鎖としてVH3-IgG1および軽鎖としてVL3(High_pI)-CKを含む、Middle_pI-IgG1;及び
(c)重鎖としてVH3(High_pI)-IgG1および軽鎖としてVL3(High_pI)-CKを含む、High_pI-IgG1。
(1)重鎖としてVH3-IgG1-F939および軽鎖としてVL3-CKを含むLow_pI-F939、
(2)重鎖としてVH3(High_pI)-F939および軽鎖としてVL3-CKを含むMiddle_pI-F939、
(3)重鎖としてVH3(High_pI)-F939および軽鎖としてVL3(High_pI)-CKを含むHigh_pI-F939、
(4)重鎖としてVH3-IgG1-F1180および軽鎖としてVL3-CKを含むLow_pI-F1180、
(5)重鎖としてVH3-IgG1-F1180および軽鎖としてVL3(High_pI)-CKを含むMiddle_pI-F1180、
(6)重鎖としてVH3(High_pI)-F1180および軽鎖としてVL3(High_pI)-CKを含むHigh_pI-F1180、
(7)重鎖としてVH3-IgG1-F11および軽鎖としてVL3-CKを含むLow_pI-F11、および
(8)重鎖としてVH3(High_pI)-F11および軽鎖としてVL3(High_pI)-CKを含むHigh_pI-F11。
(2−1)pIを調節したpH依存的ヒトIL-6受容体結合抗体のインビボアッセイ
実施例1で作製された、各種のpH依存的ヒトIL-6受容体結合抗体であるLow_pI-IgG1、High_pI-IgG1、Low_pI-F939、Middle_pI-F939、High_pI-F939、Low_pI-F1180、Middle_pI-F1180およびHigh_pI-F1180を用いたインビボアッセイが、以下のように実施された。
マウスの血漿中可溶型ヒトIL-6受容体濃度は電気化学発光法にて測定された。250、125、62.5、31.25、15.61、7.81、または3.90 pg/mLの濃度に調製された可溶型ヒトIL-6受容体検量線試料および50倍以上希釈されたマウス血漿アッセイ試料をそれぞれ、SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)でルテニウム化したMonoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)、Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D)、およびヒトIL-6受容体結合抗体であるTocilizumab(CAS number:375823-41-9)と混合した後、37℃で1晩反応させた。Tocilizumabの終濃度は333μg/mLとなるように調製された。その後、反応液がStreptavidin Gold Multi-ARRAY Plate(Meso Scale Discovery)に分注された。さらに室温で1時間反応させた反応液を洗浄後、Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)が分注された。その後ただちにSECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery)で測定が行われた。可溶型ヒトIL-6受容体濃度は検量線のレスポンスに基づいて解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。
実施例1で作製された、各種のpH依存的ヒトIL-6受容体結合抗体であるLow_pI-IgG1、High_pI-IgG1、Low_pI-F11、およびHigh_pI-F11を用いたインビボアッセイが、以下のように実施された。
マウスの血漿中hsIL-6R濃度は電気化学発光法にて測定された。250、125、62.5、31.25、15.61、7.81、または3.90 pg/mLに調製されたhsIL-6R検量線試料および50倍以上希釈されたマウス血漿アッセイ試料を、SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)でルテニウム化したMonoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)、Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D)およびTocilizumabと混合した後、37℃で1晩反応させた。Tocilizumabの終濃度は333μg/mLとなるように調製された。その後、反応液がStreptavidin Gold Multi-ARRAY Plate (Meso Scale Discovery)に分注された。さらに室温で1時間反応させた反応液を洗浄後、Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)がプレートに分注された。その後ただちにSECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery)で測定が行われた。hsIL-6R濃度は検量線のレスポンスに基づいて解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。
(3−1)細胞外マトリックスへの結合能の評価
抗体に対して、pH依存的に抗原に結合する性質を付与し、更にpIを変化させることにより、細胞外マトリックスへの結合能にどのような影響を与えるかを評価するために、以下のような実験を行った。
TBS(Takara)を用いて、細胞外マトリックス(BDマトリゲル基底膜マトリックス/ BD社製)を2 mg/mLに希釈した。希釈した細胞外マトリックスをMULTI-ARRAY 96well Plate, High bind, Bare (Meso Scale Discovery: MSD社製) に1wellあたり5μL分注し、4℃で一晩固相化した。その後、150mM NaCl、0.05% Tween20、0.5% BSA、及び0.01% NaN3を含む20mM ACES buffer, pH7.4を分注し、ブロッキングした。評価に供する抗体は、150mM NaCl、0.05% Tween20、及び0.01% NaN3を含む20mM ACES buffer, pH7.4 (ACES-T buffer)を用いて30、10、3μg/mLに希釈した後、150mM NaCl、0.01% Tween20、0.1% BSA、0.01% NaN3を含む20mM ACES buffer, pH7.4(Dilution buffer)を用いてさらに希釈し、最終濃度をそれぞれ10、3.3、1μg/mLとした。ブロッキング溶液を除去したプレートに、希釈した抗体溶液を添加し、室温で1時間振盪した。抗体溶液を除去し、0.25% グルタルアルデヒドを含むACES-T bufferを添加して10分間静置した後、0.05% Tween20を含むDPBS (和光純薬工業社製) でプレートを洗浄した。ECL検出用の抗体は、Goat anti-human IgG (gamma) (Zymed Laboratories社製) をSulfo-Tag NHS Ester (MSD社製) を用いてSulfo-Tag化し調製した。検出用抗体を1μg/mLとなるようにDilution bufferで希釈してプレートに添加し、遮光下、室温で1時間振盪した。検出用抗体を除去し、MSD Read Buffer T(4x)(MSD社製)を超純水で2倍希釈した溶液を添加した後、SECTOR Imager 2400 (MSD社製)にて発光量を測定した。
pH依存的に抗原に結合する抗体に対して、該抗体の可変領域にアミノ酸置換を導入することにより該抗体のpIを上昇させる方法について記載してきた。さらに、抗体のpIを上昇させる方法は、抗体定常領域において、一アミノ酸程度の少なさの置換を行うことによっても実施可能である。
(a)EUナンバリングで表される、255位、292位、301位、344位、355位、または416位のアルギニン、および
(b)EUナンバリングで表される、121位、133位、147位、205位、210位、213位、214位、218位、222位、246位、248位、274位、288位、290位、317位、320位、322位、326位、334位、338位、340位、360位、370位、392位、409位、414位、または439位のリジン
が挙げられる。これらの正電荷を有するアミノ酸に立体構造的に近接した位置において、正電荷を有するアミノ酸への置換を行うことにより、立体構造的に近接した位置に複数の正電荷を付与することが可能である。
pH依存的抗ヒトIgE抗体として、以下の3種類の抗体を、参考実施例2の方法により作製した。
(1)重鎖としてAb1H(配列番号:38)および軽鎖としてAb1L(配列番号:39)を含む、通常型の抗体であるAb1、
(2)重鎖としてAb2H(配列番号:40)および軽鎖としてAb2L(配列番号:41)を含む、通常型の抗体であるAb2、ならびに
(3)重鎖としてAb3H(配列番号:42)および軽鎖としてAb3L(配列番号:43)を含む、通常型の抗体であるAb3。
Ab1のpH7.4およびpH5.8におけるヒトIgEに対する親和性を、以下のように評価した。BIACORE T100(GE Healthcare)を用いて、ヒトIgEとAb1との速度論的解析を行った。ランニングバッファーとして以下の2種を用いて測定を行った。
(1)1.2 mM CaCl2 /0.05% tween20, 20 mM ACES, 150 mM NaCl, pH7.4;および
(2)1.2 mM CaCl2 /0.05% tween20, 20 mM ACES, 150 mM NaCl, pH5.8。
(1)1.2 mM CaCl2 /0.05% tween20, 20 mM ACES, 150 mM NaCl, pH7.4;および
(2)1.2 mM CaCl2 /0.05% tween20, 20 mM ACES, 150 mM NaCl, pH5.8。
実施例(4−1)において作製されたAb1は、定常領域としてヒト天然型IgG1を有する抗体である。ここで、Ab1の重鎖であるAb1HのFc領域において、EUナンバリングで表される238位のプロリンをアスパラギン酸に置換し、EUナンバリングで表される298位のセリンをアラニンに置換することで、Ab1H-P600を作製した。さらに、Ab1H-P600のFc領域に表7−1および表7−2に示す各種の単一アミノ酸置換を導入することで、各種Fc改変体を、参考実施例2の方法でそれぞれ作製した。なお、いずれのFc改変体も、軽鎖としてはAb1L(配列番号:39)を使用した。hFcγRII2bに対するこれらの抗体の親和性は、P600改変体と同等であった(データ示さず)。
BIACORE(登録商標) T200(GE Healthcare)を用いて、可溶型ヒトFcγRIIb(別名「hFcγRIIb」)と抗原-抗体複合体との、Fc領域改変体を含む抗体の結合アッセイを行った。可溶型hFcγRIIbは、当業者に公知の方法を用いてHisタグを付与した分子形として作製した。センサーチップCM5(GE Healthcare)上にHis capture kit(GE Healthcare)を用いてアミンカップリング法で抗His抗体を適当量固定し、そこへhFcγRIIbを捕捉させた。次に、抗体-抗原複合体とランニングバッファー(参照溶液として)をインジェクトし、センサーチップ上に捕捉させたhFcγRIIbと相互作用させた。ランニングバッファーには20 mM N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2, 0.05% (w/v) Tween20、pH7.4を用い、可溶型hFcγRIIbの希釈にもそれぞれの緩衝液が使用された。センサーチップの再生には10 mMグリシン-HCl, pH1.5が用いられた。測定は全て25℃で実施された。測定で得られたセンサーグラムから算出されたbinding(RU)に基づいて解析を行い、P600での結合量を1.00とした際の相対値で表す。パラメーターの算出にはBIACORE(登録商標)T100 Evaluation Software(GE Healthcare)が用いられた。結果を表7−1および表7−2(表中、「BIACORE」の列を参照)および図6に示す。いくつかのFc改変体において、BIACORE(登録商標)のセンサーチップ上に固定されたhFcγRIIbに対する親和性が増大していることが示された。
作製された新規Fc領域改変体を含む抗体を用いて、hFcγRIIb発現細胞株への細胞内取り込み速度を評価するために、以下のようなアッセイを実施した。
細胞内に取り込まれたIgG抗体は、エンドソーム内の酸性pHの条件下において、FcRnに結合することにより血漿中に戻されることが知られている。そのため、IgG抗体は一般的に、FcRnに結合しないタンパク質に比べて、長い血漿中半減期を有している。その性質を利用し、抗体のFc領域にアミノ酸改変を導入することで、酸性pH条件におけるFcRnへの親和性を増大し、抗体の血漿中滞留性を増大させる方法は知られている。具体的には、M252Y/S254T/T256E (YTE) 改変 (Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281:23514-23524 (2006))や、M428L/N434S (LS) 改変 (Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28:157-159 (2010))、およびN434H改変(Zheng et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics 89(2):283-290 (2011))などのアミノ酸改変により、酸性pH条件におけるFcRnへの親和性を増大し、抗体の血漿中滞留性を向上させる方法が知られている。
公知の改変であるYTE、LS、またはN434Hを含むものなどの酸性pH条件におけるFcRnへの親和性を増大させたFc改変体と、いくつかの新規Fc改変体(F1847m、F1848m、F1886m、F1889m、F1927m、F1168m)とを、以下に示すように作製した。
(a)重鎖としてVH3-IgG1m(配列番号:46)および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-IgG1、
(b)重鎖としてVH3-YTE(配列番号:47)および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-YTE、
(c)重鎖としてVH3-LS(配列番号:48)および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-LS、
(d)重鎖としてVH3-N434H(配列番号:49)および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-N434H、
(e)重鎖としてVH3-F1847m(配列番号:50)および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-F1847m、
(f)重鎖としてVH3-F1848m(配列番号:51)および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-F1848m、
(g)重鎖としてVH3-F1886m(配列番号:52)および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-F1886m、
(h)重鎖としてVH3-F1889m(配列番号:53)および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-F1889m、
(i)重鎖としてVH3-F1927m(配列番号:54)および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-F1927m、および
(j)重鎖としてVH3-F1168m(配列番号:55)および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-F1168m。
重鎖としてVH3-IgG1mあるいは上記の改変体を含み、かつ軽鎖としてL(WT)(配列番号:37)を含む抗体が参考実施例2に示した方法で作製され、下記のようにヒトFcRnに対する結合活性が評価された。
抗医薬品抗体(ADA)は治療用抗体の効果および薬物動態に影響を及ぼし、時に重篤な副作用をもたらすことがあるため、臨床における治療用抗体の有用性と薬効はADAの産生によって制限され得る。治療用抗体の免疫原性には、多くの要因が影響を及ぼすが、エフェクターT細胞エピトープの存在がその要因の1つである。加えて、治療用抗体の投与前から患者が有しているADA(「既存のADA」ともいう)の存在も、同様に問題があると考えられる。特に、関節リウマチ(RA)などの自己免疫疾患の患者に対する治療用抗体の場合、ヒトIgGに対する自己抗体であるリウマトイド因子(RF)が「既存のADA」の問題を引き起こし得る。最近、N434H(Asn434His)変異を有するヒト化抗CD4 IgG1抗体が顕著なリウマトイド因子結合を誘発することが報告された(Zheng et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics 89(2):283-290 (2011))。詳細な研究により、ヒトIgG1におけるN434H変異が、親ヒトIgG1のものと比較して抗体のFc領域に対するリウマトイド因子の結合を増大することが確認された。
リウマトイド因子に対する結合アッセイは、30名のRA患者の個々の血清(Proteogenex)を用いて、pH 7.4における電気化学発光(ECL)により行った。50倍希釈した血清試料、ビオチン標識した試験抗体(1μg/mL)、およびSULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)標識した試験抗体(1μg/mL)をそれぞれ混合し、室温で3時間インキュベートした。その後、混合物をStreptavidinでコーティングされたMULTI-ARRAY 96ウェルプレート(Meso Scale Discovery)に加え、プレートを室温で2時間インキュベートし、その後洗浄した。Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)を各ウェルに加えた後、直ちにプレートをSECTOR imager 2400 Reader(Meso Scale Discovery)にセットし、化学発光を測定した。
実施例7において、リウマトイド因子への結合が抑制されていることが確認された、当明細書で提供される新規Fc領域改変体を含む抗体を用いて、カニクイザルにおける血漿中滞留性の改善効果を以下の方法で評価した。
以下の抗ヒトIgE抗体を作製した。
(a)重鎖としてOHBH-IgG1(配列番号:56)および軽鎖としてOHBL-CK(配列番号:57)を含むOHB-IgG1、
(b)重鎖としてOHBH-LS(配列番号:58)および軽鎖としてOHBL-CKを含むOHB-LS、
(c)重鎖としてOHBH-N434A(配列番号:59)および軽鎖としてOHBL-CKを含むOHB-N434A
(d)重鎖としてOHBH-F1847m(配列番号:60)および軽鎖としてOHBL-CKを含むOHB-F1847m、
(e)重鎖としてOHBH-F1848m(配列番号:61)および軽鎖としてOHBL-CKを含むOHB-F1848m、
(f)重鎖としてOHBH-F1886m(配列番号:62)および軽鎖としてOHBL-CKを含むOHB-F1886m、
(g)重鎖としてOHBH-F1889m(配列番号:63)および軽鎖としてOHBL-CKを含むOHB-F1889m、および
(h)重鎖としてOHBH-F1927m(配列番号:64)および軽鎖としてOHBL-CKを含むOHB-F1927m。
カニクイザルに抗ヒトIgE抗体を投与した後の、血漿中抗ヒトIgE抗体のインビボ動態を評価した。抗ヒトIgE抗体の溶液を2mg/kgで単回静脈内投与した。投与後5分、(2時間)、7時間、1日、2日、3日、(4日)、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、および56日で採血を行った。採取した血液はただちに4℃、15,000 rpmで5分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで、-80℃以下に設定された冷凍庫に保存した。抗ヒトIgE抗体としては、OHB-IgG1、OHB-LS、OHB-N434A、OHB-F1847m、OHB-F1848m、OHB-F1886m、OHB-F1889m、およびOHB-F1927mの8種類を使用した。
カニクイザル血漿中の抗ヒトIgE抗体濃度はELISA法にて測定した。まず抗ヒトIgG κ鎖抗体(Antibody Solution)をNunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge nunc International)に分注し、4℃で1晩静置し抗ヒトIgG κ鎖抗体固定化プレートを作製した。血漿中濃度として640、320、160、80、40、20、または10 ng/mLの検量線試料と100倍以上希釈したカニクイザル血漿測定試料を調製した。これら検量線試料および血漿測定試料にはカニクイザルIgE (社内調製品)が1 μg/mlの濃度で添加されるように作製された。その後、抗ヒトIgG κ鎖抗体固定化プレートに試料を分注し室温で2時間静置した。その後HRP-抗ヒトIgG γ鎖抗体(Southern Biotech)を分注し室温で1時間静置した。その後、TMB Chromogen Solution (Life Technologies)を基質として用いて発色反応を行い、1N-Sulfuric acid(Wako)で反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450 nmの吸光度を測定した。サル血漿中抗ヒトIgE抗体濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。測定したサル血漿中抗ヒトIgE抗体の濃度推移を図19に示す。測定したサル血漿中抗ヒトIgE抗体の濃度推移から、Phoenix WinNonlin Ver.6.2(Pharsight Corporation)を用いてモーメント解析により消失クリアランスを算出した。算出した薬物動態学的パラメーターを表9に示す。血漿中の投与試料に対する抗体が陽性であった個体からの試料はサル血漿中の抗ヒトIgE抗体の濃度推移及びクリアランスの算出から除外した。
投与試料に対するサル血漿中抗体は電気化学発光法にて測定した。SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)でルテニウム標識した投与試料、EZ-Link Micro Sulfo-NHS-Biotinylation Kit(Pierce)でビオチン化した投与試料、及びカニクイザル血漿測定試料を等量混合し、4℃で1晩静置した。MULTI-ARRAY 96-well Streptavidin Gold Plate (Meso Scale Discovery)に試料を添加後に室温で2時間反応させ、洗浄した。その後、Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)を分注し、ただちにSECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)で測定を行った。
酸性pHにおけるFcRn結合増大のためのFc改変体として、WO2013/046704に記載のFc改変体であるF1718と、今回新規に見出されたFc改変体であるF1848mを比較するために、以下のような実験を実施した。
(a)重鎖としてVH3-IgG1および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-IgG1、
(b)重鎖としてVH3-F1718(配列番号:65)および軽鎖としてVL3-CKを含むFv4-F1718。
マウス血漿中の抗ヒトIL-6受容体抗体の濃度はELISAにて測定された。まず、Anti-Human IgG(gamma-chain specific)F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)をNunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge nunc International)に分注し、4℃で1晩静置することによってAnti-Human IgG固定化プレートが作製された。血漿中濃度として0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、または0.0125μg/mLの抗ヒトIL-6受容体抗体を含む検量線試料と、100倍以上希釈されたマウス血漿測定試料がそれぞれ調製された。これらの検量線試料または血漿測定試料100μLに20 ng/mLの可溶型ヒトIL-6受容体が200μL加えられた混合液を、室温で1時間静置させた。その後、当該混合液が各ウェルに分注されたAnti-Human IgG固定化プレートを室温で1時間静置させた。その後、Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)を加えて室温で1時間反応させ、さらにStreptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)を加えて室温で1時間反応させた反応液の発色反応が、TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)を基質として用いて行われた。1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)を添加することによって反応が停止された各ウェルの反応液の450 nmの吸光度が、マイクロプレートリーダーにて測定された。マウス血漿中の抗体濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出された。
抗医薬品抗体(ADA)の産生は、治療用抗体の効果および薬物動態に影響を及ぼし、時に重篤な副作用をもたらすことがあるため、臨床における治療用抗体の有用性や薬効は、ADAの産生によって制限され得る。治療用抗体の免疫原性は、多くの要因に影響を受けることが知られているが、特に治療用抗体が有するエフェクターT細胞エピトープの重要性が特に多数報告されている。
(8−1)ヒト化抗ヒトIL-8抗体hWS-4の作製
米国特許第6,245,894号の中で開示されているヒト化抗IL-8抗体は、ヒトIL-8(hIL-8)と結合することにより、その生理作用を遮断する。改変されたヒト化抗IL-8抗体は、米国特許第6,245,894号に開示されている重鎖および軽鎖の可変領域配列と、実質的に任意の様々な公知のヒト抗体の定常領域配列を組み合わせて作製可能である。したがって、これらの改変された抗体のヒト抗体定常領域配列としては、特に限定はされないが、重鎖定常領域として天然型ヒトIgG1配列または天然型ヒトIgG4配列を、軽鎖定常領域配列として天然型ヒトκ配列を用いることができる。
hWS-4で使用されているFRとは異なるヒトコンセンサスフレームワーク配列を用いて、新たなヒト化抗体を作製した。
hWS-4及びHr9のヒトIL-8への結合親和性を、BIACORE T200(GE Healthcare)を用いて以下の通り測定した。
(9−1)pH依存性付与のためのHr9改変抗体の作製
実施例8で得られたHr9抗体に対してpH依存的IL-8親和性を付与することを目的として、試験を行った。
実施例9−1で作製された抗体のヒトIL-8結合親和性を、BIACORE T200(GE Healthcare)を用いて以下の通り測定した。ランニングバッファーは以下の2種を用いた。
(1)0.05% tween20, 20 mM ACES, 150 mM NaCl, pH 7.4;および
(2)0.05% tween20, 20 mM ACES, 150 mM NaCl, pH 5.8。
9−2で見出された有望な改変の組み合わせと新たなアミノ酸変異の評価を行い、その結果、以下の組み合わせが見出された。
抗体による、ヒトIL-8の消失速度への効果をマウスにおいて確認する方法としては、特に限定はされない。一例において、本方法は、抗体をヒトIL-8と混合した状態でマウスに投与すること、および続いて、マウス血漿中からのヒトIL-8の消失速度を比較することを含む。
(11−1)H89/L118を用いたマウスPKアッセイ
実施例9で作製したH89/L118と、実施例10で作製したH998/L63を用いて、インビボでのヒトIL-8消失速度の評価を実施した。
マウス血漿中のヒトIL-8濃度は電気化学発光法にて測定された。まず、マウスIgGの定常領域を含む抗ヒトIL-8抗体(社内調製品)を、MULTI-ARRAY 96-well Plate(Meso Scale Discovery)に分注し、室温で1時間静置した後に、5%BSA(w/v)を含むPBS-Tween溶液を用いて室温で2時間ブロッキングすることによって抗ヒトIL-8抗体固定化プレートが作製された。血漿中濃度として275、91.7、30.6、10.2、3.40、1.13、または0.377 ng/mLのヒトIL-8を含む検量線試料と、25倍以上に希釈されたマウス血漿測定試料が調製された。試料をhWS-4と混合して37℃で1晩反応させた。その後、この混合液を抗ヒトIL-8抗体固定化プレートの各ウェルに50 μLずつ分注してから、室温で1時間撹拌させた。hWS-4の終濃度は25 μg/mLとなるよう調製された。その後、Biotin Mouse Anti-Human Igκ Light Chain (BD Pharmingen)を室温で1時間反応させ、さらにSULFO-TAG Labeled Streptavidin(Meso Scale Discovery)を室温で1時間反応させた後、Read Buffer T(×1)(Meso Scale Discovery)を分注し、ただちにSECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)で測定を行った。ヒトIL-8濃度は検量線のレスポンスに基づいて解析ソフトウェアSOFT Max PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。
次に、H89/L118の投与量を変化させた場合の影響を検証する実験を、以下のように実施した。マウス(C57BL/6J、Charles river)に、ヒトIL-8と、H89/L118(2 mg/kgあるいは8 mg/kg)を同時に投与した後のヒトIL-8の体内動態を評価した。ヒトIL-8(2.5 μg/mL)と、抗ヒトIL-8抗体(200 μg/mLまたは800 μg/mL)の混合溶液を尾静脈に10 mL/kgで単回投与した。このとき、ヒトIL-8に対して抗ヒトIL-8抗体は十分量過剰に存在することから、ヒトIL-8はほぼ全て抗体に結合していると考えられる。投与5分後、7時間後、1日後、2日後、3日後、7日後、14日後、21日後、および28日後に血液を採取した。採取した血液は直ちに4℃、15,000 rpmで15分遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存した。
[エンドソーム内における遊離型ヒトIL-8の割合(%)]=[エンドソーム内の遊離型ヒトIL-8濃度]÷[エンドソーム内の全ヒトIL-8濃度]×100
(12−1)pH依存的IL-8結合能を有する抗体H553/L118の作製
そこで、本発明者らは、H89/L118よりもさらに、酸性pH条件下におけるヒトIL-8結合親和性を弱め、および/または解離速度を速めた抗体の作製を試みた。
H553/L118を用いて、マウスにおけるヒトIL-8消失速度の評価を、実施例11−2と同様の方法で実施した。結果として得られた、血漿中ヒトIL-8濃度のデータを図24に、またマウス血漿中からのヒトIL-8クリアランス(CL)の数値を表18に示す。
H553/L118は、マウスにおいて顕著にH89/L118よりもヒトIL-8の消失を早めることが可能な抗体であることが示された。一方で、この抗体がインビボで長期間にわたってヒトIL-8の阻害効果を持続するためには、投与された抗体がインビボ(例えば血漿中)に存在している期間中、IL-8中和活性が安定に保たれること(当該抗体のIL-8中和活性における安定性)もまた重要である。そこで、以下に示す方法で、これらの抗体のマウス血漿中における当該安定性を評価した。
(13−1)各種IL-8結合抗体の免疫原性予測スコア
抗医薬品抗体(ADA)の産生は、治療用抗体の効果および薬物動態に影響を及ぼし、時に重篤な副作用をもたらすことがあるため、臨床における治療用抗体の有用性や薬効は、ADAの産生によって制限され得る。治療用抗体の免疫原性は、多くの要因に影響を受けることが知られているが、治療用抗体中のエフェクターT細胞エピトープの重要性を説明する多数の報告がある。
上記の通り、H89/L118、H496/L118、およびH553/L118の免疫原性スコアは、hWS-4と比較して低下していたが、表19から明らかなように、重鎖の免疫原性スコアは軽鎖に比べると高く、特に重鎖のアミノ酸配列は、免疫原性の観点でまだ改善の余地があることを示唆している。そこで、H496の重鎖可変領域から、免疫原性スコアを低下させることが可能なアミノ酸改変の探索を行った。鋭意探索を行った結果、Kabatナンバリングで表される52c位のアラニンをアスパラギン酸に置換されたH496v1、81位のグルタミンをスレオニンに置換されたH496v2、および82b位のセリンをアスパラギン酸に置換されたH496v3の3種類の改変体が見出された。また、これら3種の改変を全て含むH1004が作製された。
重鎖としてH1004-IgG1m(配列番号:91)および軽鎖としてL395-k0MT(配列番号:82)を含む抗体であるH1004/L395を作製した。H1004/L395のヒトIL-8への結合親和性を、BIACORE T200(GE Healthcare)を用いて以下の通り測定した。
(1)0.05% tween20、40 mM ACES、150 mM NaCl、pH 7.4、40℃;および
(2)0.05% tween20、40 mM ACES、150 mM NaCl、pH 5.8、37℃。
(14−1)各種pH依存的IL-8結合抗体の作製
実施例13に示した検討により、pH依存的IL-8結合能を有しかつ低減された免疫原性スコアも有するH1004/L395が取得された。次に、これらの好ましい性質と、マウス血漿中における安定性とを両立した改変体の創製を目指して、鋭意検討を行った。
次に、実施例12−3の方法と同様に、H1009/L395のIL-8中和活性が、マウス血漿中において安定に保たれるかどうかを評価した。ここでは、後に実施例19において、その詳細が記述されるH1009/L395-F1886sを用いた。この抗体は、H1009/L395と同じ可変領域を有し、定常領域は、天然型ヒトIgG1に比べて、酸性pH条件下におけるFcRn結合を増強する改変と、FcγRに対する結合を低減するための改変を有する。H1009/L395のヒトIL-8に対する結合およびIL-8の中和活性は、この抗体の可変領域、とりわけHVRを中心とした領域が担っており、定常領域に導入された改変が影響を与えることはないと考えられる。
H1009/H395のマウスにおけるヒトIL-8消失速度を、次に示す方法で評価した。抗体としてはH1009/L395、H553/L118およびH998/L63を用いた。マウスへの投与及び採血、マウス血漿中のヒトIL-8濃度測定は実施例11に示した方法で実施した。
実施例14で示された、H1009/L395の30倍もの優れたヒトIL-8消失効果は、驚くべき効果であった。pH依存的抗原結合抗体を投与した際の抗原消失速度は、抗体と抗原の複合体が細胞内に取り込まれる速度に依存することが知られている。つまり、抗原-抗体の複合体が形成されたときに、複合体が形成されないときと比較して細胞内にpH依存的抗原結合抗体が取り込まれる速度が増大すれば、pH依存的抗体による抗原消失効果が増加し得る。細胞内に抗体が取り込まれる速度を増強させる方法には、中性pH条件でのFcRn結合能を抗体に付与する方法(WO 2011/122011)や抗体のFcγRへの結合能を増強する方法(WO 2013/047752)、多価の抗体と多価の抗原を含む複合体の形成の促進を利用した方法(WO 2013/081143)が含まれる。
TBS(Takara, T903)を用いて、細胞外マトリックス(BDマトリゲル基底膜マトリックス/ BD社製)を2 mg/mLに希釈した。希釈した細胞外マトリックスをMULTI-ARRAY 96well Plate, High bind, Bare (Meso Scale Discovery: MSD社製) に1wellあたり5 μL分注し、4℃で一晩固相化した。その後、ブロッキングは、150 mM NaCl、0.05% Tween20、0.5% BSA、および0.01% NaN3を含む20 mM ACES buffer, pH7.4を用いて行った。
マウスにおいて、pH依存的IL-8結合抗体がヒトIL-8との複合体を形成して、その複合体の細胞内への取り込みが増加するかどうかを、以下に示す方法を用いて確認した。
次に、H1009/L395について、実施例13−1と同様の方法で、免疫原性スコアおよびADA発生頻度の予測を行った。その結果を表25および図32に示す。なお、図32において、H1009/L395は、「H1009L395」と表記されている。
これまでの実施例に記載の通り、pH依存的IL-8結合抗体H1009/L395は、天然型IgG1を定常領域として有する場合において、非常に優れた性質を有する抗体である。しかしながら、アミノ酸置換を定常領域に含む抗体、例えば実施例5で例示された、酸性pHにおけるFcRn結合を増強させたFc領域を含む抗体としても利用可能である。そこで、酸性pHにおけるFcRn結合を増強させたFc領域がpH依存的IL-8結合抗体においても機能することを、H89/L118を用いて確認した。
H89/L118のFc領域に対して、実施例5-1に記載の、各種FcRn結合増強改変を導入した。具体的には、H89-IgG1のFc領域に対して、F1847m、F1848m、F1886m、F1889m、F1927m、およびF1168mに用いられている改変を導入して、以下の改変体を作製した。
(a)重鎖としてH89-IgG1m(配列番号:94)および軽鎖としてL118-K0MTを含むH89/L118-IgG1、
(b)重鎖としてH89-F1168m(配列番号:95)および軽鎖としてL118-K0MTを含むH89/L118-F1168m、
(c)重鎖としてH89-F1847m(配列番号:96)および軽鎖としてL118-K0MTを含むH89/L118-F1847m、
(d)重鎖としてH89-F1848m(配列番号:97)および軽鎖としてL118-K0MTを含むH89/L118-F1848m、
(e)重鎖としてH89-F1886m(配列番号:98)および軽鎖としてL118-K0MTを含むH89/L118-F1886m、
(f)重鎖としてH89-F1889m(配列番号:99)および軽鎖としてL118-K0MTを含むH89/L118-F1889m、および
(g)重鎖としてH89-F1927m(配列番号:100)および軽鎖としてL118-K0MTを含むH89/L118-F1927m。
これらの抗体を用いたカニクイザルPKアッセイを、次に示す方法で実施した。
カニクイザルに、抗ヒトIL-8抗体を投与した後の抗ヒトIL-8抗体の体内動態を評価した。抗ヒトIL-8抗体溶液を2 mg/kgで単回静脈内投与した。投与5分後、4時間後、1日後、2日後、3日後、7日後、10日後、14日後、21日後、28日後、35日後、42日後、49日後、および56日後に血液を採取した。採取した血液は直ちに4℃、15,000 rpmで10分遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで-60℃以下に設定された冷凍庫に保存した。
天然型ヒトIgG1は、そのFc領域が各種の免疫系細胞上のFcγ受容体(以下、FcγRと表記する)と結合して、対象とする細胞に対してADCCやADCPといったエフェクター機能を示すことが知られている。
各種のヒトおよびカニクイザルFcγRに対する結合能を低下させることを目的として、H1009/L395-F1886mのFc領域に対して更にアミノ酸改変を導入した。具体的には、重鎖であるH1009-F1886mに対して、EUナンバリングで表される235位のLをRに、236位のGをRに、および239位のSをKに、それぞれ置換を行ってH1009-F1886s(配列番号:81)を作製した。同様に、H1009-F1886mに対して、EUナンバリングで表される235位のLをRに、および236位のGをRに置換し、さらにEUナンバリングで表される327位から331位までの領域をヒト天然型IgG4配列のものと置換して、H1009-F1974m(配列番号:80)を作製した。これらの重鎖と、軽鎖としてL395-k0MTを有する抗体として、H1009/L395-F1886sおよびH1009/L395-F1974mを作製した。
次に、H1009/L395-F1886sまたはH1009/L395-F1974mの、ヒトまたはカニクイザルの可溶型FcγRIaまたはFcγRIIIaに対する親和性を、次に示す方法で確認した。
次に、H1009/L395-F1886sおよびH1009/L395-F1974mについて、マウスにおけるヒトIL-8消失速度および抗体の血漿中滞留性を、以下に示す実験で確認した。なお、ここでは、H1009/L395-F1886sの抗体投与量を増加させることによる影響も含めて評価するために、H1009/L395-F1886sに関しては投与量を2 mg/kg、5 mg/kg、および10 mg/kgの3点を用いて評価を行った。
次に、H1009/L395-F1886sまたはH1009/L395-F1974mを用いて、カニクイザルにおける抗体の血漿中滞留性を以下に示す方法で検証した。
WO2012/067176に開示されたヒト化抗第IXa/X因子二重特異性抗体は、ヒト第IXa因子および第X因子に結合し、血液の共凝集活性を誘導する。本実施例においては、WO2012/067176に記載されたヒト化抗第IXa/X因子二重特異性抗体であるF8M(Q499-z121/J327-z119/L404-k: H鎖(配列番号:330)/H鎖(配列番号:331)共通のL鎖(配列番号:332))を利用し、F8Mは2本の異なるH鎖と2本の同一の共通するL鎖を含む。F8Mは、WO2012/067176の実施例に記載された方法によって作製した。
F8Mに基づく抗第IXa/X因子二重特異性抗体として、以下の3種類の抗体を、参照実施例2の方法によって作製した。
(a)重鎖としてF8M-F1847mv1(配列番号:323)およびF8M-F1847mv2(配列番号:324)ならびに軽鎖としてF8ML(配列番号:325)を含む、通常型の抗体であるF8M-F1847mv;
(b)重鎖としてF8M-F1868mv1(配列番号:326)およびF8M-F1868mv2(配列番号:327)ならびに軽鎖としてF8ML(配列番号:325)を含む、通常型の抗体であるF8M-F1868mv;ならびに
(c)重鎖としてF8M-F1927mv1(配列番号:328)およびF8M-F1927mv2(配列番号:329)ならびに軽鎖としてF8ML(配列番号:325)を含む、通常型の抗体であるF8M-F1927mv。
雄のカニクイザルへの用量0.6 mg/kgの単回静脈内ボーラス投与を行った後、モノクローナル抗体F8M-F1847mv、F8M-F1868mv、およびF8M-F1927mvの薬物動態をそれぞれ評価した。F8M-F1847mv、F8M-F1868mv、およびF8M-F1927mvの血漿濃度を、サンドイッチELISAにより決定した。薬物動態パラメーターは、WinNonlin ver 6.4ソフトウェアを用いて算出した。表30に示されるように、F8M-F1847mv、F8M-F1868mv、およびF8M-F1927mvの半減期は、それぞれ29.3日、54.5日、および35.0日であった。別の日に、カニクイザルを用いて用量6 mg/kgでF8MのPK試験を行い、半減期が19.4日であることを見出した。F8M-F1847mv、F8M-F1868mv、およびF8M-F1927mvの半減期はF8Mよりも長いことが明らかになった。これにより、上述の実施例5で言及されたのと同じFc領域配列改変によって抗第IXa/X因子二重特異性抗体の半減期を延長できたことが示唆される。
ヒトIgEのクリアランスを増大させるため、本実施例においては、pH依存的抗原結合抗体を用いて抗体のFab部分におけるpI上昇置換を評価した。抗体可変領域にアミノ酸置換を加えてpIを上昇させる方法は特に限定されないが、例えば、WO2007/114319またはWO2009/041643に記載の方法により実施可能である。可変領域に導入するアミノ酸置換としては、負電荷を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸)の数を減らす一方で、正電荷を有するアミノ酸(例えば、アルギニンおよびリジン)を増やすものが好ましい。また、アミノ酸置換は、抗体可変領域のいかなる位置に導入されてもよい。特に限定されないが、アミノ酸置換の導入部位としては、抗体分子の表面にアミノ酸側鎖が露出し得る位置が好ましい。
試験した抗体は、表32および33にまとめられている。
作製されたFc領域改変体を含む抗体に関して、BIACORE T200(GE Healthcare)を用いて、可溶型ヒトFcγRIIbと抗原-抗体複合体との結合アッセイを行った。可溶型ヒトFcγRIIb(NCBI accession NM_004001.3)は、当技術分野で公知の方法でHisタグを付与した分子形として作製した。センサーチップCM5(GE Healthcare)上にHis capture kit(GE Healthcare)を用いてアミンカップリング法で抗His抗体を適当量固定し、ヒトFcγRIIbを捕捉した。次に、抗体-抗原複合体とランニングバッファー(参照溶液として)をインジェクトし、センサーチップ上に捕捉されたヒトFcγRIIbと相互作用させた。ランニングバッファーには20 mM N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、および0.05% (w/v) Tween20、pH7.4を用い、可溶型ヒトFcγRIIbの希釈にもそれぞれの緩衝液が使用された。センサーチップの再生には10 mMグリシン-HCl, pH1.5が用いられた。測定は全て25℃で実施された。測定で得られたセンサーグラムから算出されたbinding(RU)に基づいて解析を行い、Ab1H/Ab1L(元のAb1)の結合量を1.00とした場合の相対値で示す。パラメーターの算出には BIACORE T100 Evaluation Software(GE Healthcare)が用いられた。
作製されたFab領域改変体を含む抗体を用いて、hFcγRIIb発現細胞株への細胞内取り込み速度を評価するために、上記(4−5)と同様のアッセイを実施し、ただし、取り込まれた抗原量はAb1H/Ab1L(元のAb1)の値を1.00とした際の相対値で表した。
いくつかのpH依存的抗原結合抗IgE抗体(元のAb1、Ab1H/Ab1L013、Ab1H/Ab1L014、Ab1H/Ab1L007)をマウス同時投与モデルにおいて試験し、それらが血漿からのIgEのクリアランスを早める能力を評価した。同時投与モデルにおいては、C57BL6Jマウス(Jackson Laboratories)に、抗IgE抗体と予め混合したIgEを単回静脈内投与によってそれぞれ投与した。全ての群に、1.0 mg/kg の抗IgE抗体を含む0.2 mg/kgのIgEを投与した。血漿中のIgE濃度の合計は、抗IgE ELISAによって決定した。まず、抗ヒトIgE(クローン107、MABTECH)をマイクロウェルプレート(Nalge nunc International)に分注し、室温で2時間または4℃で1晩静置して、抗ヒトIgE抗体固定化プレートが作製された。検量線試料および試料を過剰量の抗IgE抗体(社内で調製)と混合して、均一な構造の免疫複合体を形成させた。これらの試料を抗ヒトIgE抗体固定化プレートに添加し、4℃で1晩静置した。次に、これらの試料をヒトGPC3コアタンパク質(社内で調製)、ビオチン化抗GPC3抗体(社内で調製)、Streptavidin Poly HRP80 Conjugate(Stereospecific Detection Technologies)と、1時間にわたり順番に反応させた。その後、SuperSignal(登録商標)ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)を添加した。SpectraMax M2(Molecular Devices)を用いて化学発光を読み取った。ヒトIgEの濃度を、SOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて算出した。図37は、C57BL6Jマウスにおける血漿中IgE濃度の時間プロファイルを記載している。
ヒトIgEのクリアランスを増大させるため、本実施例においては、pH依存的抗原結合抗体を用いて抗体のFab部分におけるpI上昇置換を評価した。
組換えヒトC5(NCBI GenBankアクセッション番号:NP_001726.2、配列番号:207)を、FreeStyle293-F細胞系(Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA)を用いて一過的に発現させた。ヒトC5を発現する馴化培地を等量のミリQ水で希釈した後、Q-sepharose FFまたはQ-sepharose HP陰イオン交換カラム(GE healthcare, Uppsala, Sweden)にアプライし、続いてNaCl勾配による溶出を行った。ヒトC5を含む画分をプールした後、塩濃度およびpHをそれぞれ80mM NaClおよびpH6.4に調整した。得られた試料を、SP-sepharose HP陽イオン交換カラム(GE healthcare, Uppsala, Sweden)に適用し、NaCl勾配により溶出させた。ヒトC5を含む画分をプールし、CHT ceramic Hydroxyapatiteカラム(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)に供した。次にヒトC5溶出液をSuperdex 200ゲル濾過カラム(GE healthcare, Uppsala, Sweden)にアプライした。ヒトC5を含む画分をプールし、-150℃で保存した。試験には、社内調製した組換えヒトC5または血漿由来のヒトC5(CALBIOCHEM, Cat#204888)のいずれかを用いた。
合成ヒト重鎖ライブラリとして使用した抗体重鎖可変領域の遺伝子ライブラリは、10種の重鎖ライブラリからなるものであった。生殖細胞系フレームワークであるVH1-2、VH1-69、VH3-23、VH3-66、VH3-72、VH4-59、VH4-61、VH4-b、VH5-51、およびVH6-1が、このライブラリのために、ヒトB細胞のレパートリーにおける生殖細胞系列頻度およびV遺伝子ファミリーの生物物理学的特性に基づいて選択された。合成ヒト重鎖ライブラリはヒトB細胞の抗体レパートリーを模倣して抗体結合部位に多様性を持たせている。
BSAおよびCaCl2をそれぞれ終濃度4%および1.2 mM含むTBSで、ファージディスプレイライブラリを希釈した。パニング法として、一般的なプロトコールを参照し従来の磁気ビーズ選択を適用した(Junutula et al., J. Immunol. Methods 332(1-2):41-52 (2008)、D'Mello et al., J. Immunol. Methods 247 (1-2):191-203 (2001) 、Yeung et al., Biotechnol. Prog. 18(2):212-220 (2002) 、Jensen et al., Mol. Cell Proteomics 2(2):61-69 (2003))。磁気ビーズとしてはNeutrAvidinでコーティングされたビーズ(NeutrAvidinでコーティングされたSera-Mag SpeedBeads)またはStreptavidin でコーティングされたビーズ(Dynabeads M-280 Streptavidin)を適用した。ヒトC5(CALBIOCHEM, Cat#204888)を、EZ-Link NHS-PEG4-Biotin(PIERCE, Cat No. 21329)で標識した。
実施例B-3で単離されたクローンから、pHまたはカルシウム依存的抗C5抗体クローン9個をさらなる解析のために選抜した(CFP0008、0011、0015、0016、0017、0018、0019、0020、0021)。抗体の物理化学的特性などの性質を改善するために、当業者に周知の方法によって、CFP0016重鎖可変領域にいくつかのアミノ酸置換を導入した。CFP0016の代わりに、CFP0016のこの改変体CFP0016H019をさらなる解析に用いた。これら9個の抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列を、表34に示す。この表において、括弧内に記載された名称は略称を表す。
C5の2種類の異なるエピトープを認識する二重特異性抗体は、CFP0020とCFP0018の組み合わせによって作製された。二重特異性抗体は、抗体の各結合部位にFabの異なる2種類のクローンを有するIgG形式として調製され、当業者に周知の方法を用いて調製される。この二重特異性IgG抗体において、2種類の重鎖は、該2種類の重鎖のヘテロ二量体が効率的に形成されるように、互いに異なる重鎖定常領域(G1dP1、配列番号:227およびG1dN1、配列番号:228)を含む。抗C5 MAb「X」と抗C5 MAb「Y」の結合部位を含む抗C5二重特異性抗体を、「X//Y」と表す。
試験した抗体は、表36および37にまとめられている。
作製されたFc領域改変体を含む抗体に関して、BIACORE T200(GE Healthcare)を用いて、可溶型hFcγRIIbと抗原-抗体複合体との結合アッセイを行った。可溶型hFcγRIIbは、当技術分野で公知の方法でHisタグを付与した分子形として作製した。センサーチップCM5(GE Healthcare)上にHis capture kit(GE Healthcare)を用いてアミンカップリング法で抗His抗体を適当量固定し、hFcγRIIbを捕捉した。次に、抗体-抗原複合体とランニングバッファー(参照溶液として)をインジェクトし、センサーチップ上に捕捉されたhFcγRIIbと相互作用させた。ランニングバッファーには20 mM N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、および0.05% (w/v) Tween20、pH7.4を用い、可溶型hFcγRIIbの希釈にもそれぞれの緩衝液が使用された。センサーチップの再生には10 mMグリシン-HCl, pH1.5が用いられた。測定は全て25℃で実施された。測定で得られたセンサーグラムから算出されたbinding(RU)に基づいて解析を行い、CFP0020H0261-G1dP1/CFP0018H0012-G1dN1/CFP0020L233-k0(元のAb2)の結合量を1.00とした場合の相対値で示す。パラメーターの算出には BIACORE T100 Evaluation Software(GE Healthcare)が用いられた。
作製されたFab領域改変体を含む抗体を用いて、hFcγRIIb発現細胞株への細胞内取り込み速度を評価するために、以下のアッセイを実施した。
いくつかの抗C5二重特異性抗体(元のAb2、20L233-005、20L233-006、および20L233-009)をマウス同時投与モデルにおいて試験し、それらが血漿からのC5のクリアランスを早める能力を評価した。同時投与モデルにおいては、C57BL6Jマウス(Jackson Laboratories)に、抗C5二重特異性抗体と予め混合したC5を単回静脈内投与によってそれぞれ投与した。全ての群に、1.0 mg/kg の抗C5二重特異性抗体を伴う0.1 mg/kgのC5を投与した。血漿中のC5濃度の合計は、抗C5 ECLIAによって決定した。まず、抗ヒトC5マウスIgGをECLプレートに分注し、5℃で1晩静置して、抗ヒトC5マウスIgG固定化プレートが作製された。検量線試料および試料を抗ヒトC5ウサギIgGと混合した。これらの試料を抗ヒトC5マウスIgG固定化プレートに添加し、室温で1時間静置した。次に、これらの試料を、HRPをコンジュゲートさせた抗ウサギIgG(Jackson Immuno Research)と反応させた。プレートを室温で1時間インキュベートした後、スルホタグをコンジュゲートさせた抗HRPを添加した。Sector Imager 2400(Meso Scale discovery)を用いてECLシグナルを読み取った。ヒトC5の濃度を、SOFTmax PRO(Molecular Devices)を用いて検量線におけるECLシグナルから算出した。図39は、C57BL6Jマウスにおける血漿中C5濃度の時間プロファイルを記載している。
ヒトIgEまたはヒトC5のクリアランスを増大させるため、pH依存的抗体を用いて抗体のFc部分におけるpI上昇置換を評価した。pIを上昇させるために抗体定常領域にアミノ酸置換を付加する方法は特に限定されないが、例えば、WO2014/145159に記載の方法によって実施することができる。
試験した抗体は、表38にまとめられている。pIを上昇させる置換Q311KをAb1Hに導入することにより、重鎖Ab1H-P1394m(配列番号:307)を調製した。表38に示した各置換を、参照実施例1に示す方法に従ってAb1Hに導入することにより、他の重鎖改変体も調製した。全ての重鎖改変体は、軽鎖としてAb1Lと共に発現させた。
表38に記載した抗体の使用によって形成された抗原-抗体複合体のFcRγRIIb結合に対する荷電効果を評価するために、実施例21(21−2)に記載されたのと同様にFcRγRIIb結合アッセイを実施した。アッセイ結果を表38に示す。ここで、元のAb1のhFcγRIIbへの結合と比較して改変体のhFcγRIIbへの結合が約1.2倍以上であれば、センサーチップ上のhFcγRIIbへの抗体の結合に対して強い荷電効果を有するとみなされた。
表38に記載した抗体によって形成された抗原-抗体複合体の細胞内取り込みを評価するために、実施例21(21−3)に記載されたのと同様に細胞イメージングアッセイを実施した。アッセイ結果を表38に示す。ここで、元のAb1の蛍光強度と比較して改変体の細胞内に取り込まれた抗原の蛍光強度が約1.5倍以上であれば、細胞内に取り込まれた抗原に対して強い荷電効果を有するとみなされた。
いくつかのpH依存的抗原結合抗IgE抗体(元のAb1、P1466m、P1469m、P1470m、P1480m、P1482m、P1512m、P1653m)をマウス同時投与モデルにおいて試験し、それらが血漿からのIgEのクリアランスを早める能力を評価した。アッセイは、実施例21(21−4)に記載されたのと同様に実施した。図40は、C57BL6Jマウスにおける血漿中濃度の時間プロファイルを記載している。
QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて、添付説明書記載の方法で作製された変異体を含むプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入することによって、目的のH鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターが作製された。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者に公知の方法で決定された。
抗体の発現は以下の方法を用いて行われた。ヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株(Invitrogen)を10 % Fetal Bovine Serum(Invitrogen)を含むDMEM培地(Invitrogen)へ懸濁し、5〜6 × 105細胞/mLの細胞密度で接着細胞用ディッシュ(直径10 cm, CORNING)の各ディッシュへ10 mLずつ蒔き、CO2インキュベーター(37℃、5 % CO2)内で一昼夜培養した後に、培地を吸引除去し、CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培地6.9 mLを添加した。調製したプラスミドをリポフェクション法により細胞へ導入した。得られた培養上清を回収した後、遠心分離(約2000 g、5分間、室温)して細胞を除去し、さらに0.22μmフィルターMILLEX(登録商標)-GV(Millipore)を通して滅菌し、培養上清を得た。得られた培養上清から抗体をrProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当技術分野で公知の方法で精製した。精製抗体の濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定した。得られた値からPace et al., Protein Science 4 : 2411-2423 (1995) に記された方法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した。
抗原である組換え可溶性ヒトIL-6受容体は以下のように調製された。Mullberg et al., J. Immunol. 152: 4958-4968 (1994) で報告されているN末端側1番目から357番目のアミノ酸配列からなる可溶型ヒトIL-6受容体を定常的に発現するCHO細胞株が当業者に公知の方法で構築された。当該CHO株を培養することによって、可溶型ヒトIL-6受容体を発現させた。得られた当該CHO株の培養上清から、Blue Sepharose 6 FFカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの二工程によって可溶型ヒトIL-6受容体が精製された。最終工程においてメインピークとして溶出された画分が最終精製品として用いられた。
Claims (41)
- イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗体であって、前記抗体の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基が改変されていることで等電点(pI)が上昇している、抗体。
- 前記抗原が、可溶型抗原である、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗原結合ドメインが、低イオン濃度の条件下での抗原に対する結合活性よりも高イオン濃度の条件下での抗原に対する結合活性が高いドメインである、請求項1又は2に記載の抗体。
- 前記イオン濃度が水素イオン濃度(pH)又はカルシウムイオン濃度である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗原に対するpH酸性域でのKDとpH中性域でのKDの比であるKD(酸性pH域)/KD(中性pH域)が2以上である、請求項4に記載の抗体。
- 改変前の抗体と比較して、血漿中からの前記抗原の消失を促進できるか、又は改変前の抗体と比較して、前記抗体の細胞外マトリックスへの結合活性が増大されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記アミノ酸残基の改変が、
(a)アミノ酸残基の置換;
(b)前記抗原結合ドメインにおけるヒスチジンの置換もしくは挿入;又は
(c)(i)負の電荷を有するアミノ酸残基から電荷を有さないアミノ酸残基への置換、
(ii)負の電荷を有するアミノ酸残基から正の電荷を有するアミノ酸残基への置換、及び、
(iii)電荷を有さないアミノ酸残基から正の電荷を有するアミノ酸残基への置換
からなる群から選択されるメンバー
である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が可変領域及び/又は定常領域を含み、かつ、前記アミノ酸残基の改変が、前記可変領域及び/又は定常領域におけるアミノ酸残基の改変である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記可変領域が、相補性決定領域(CDR)及び/又はフレームワーク領域(FR)を含む、請求項8に記載の抗体。
- 前記可変領域が重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域を含み、かつ、少なくとも1つのアミノ酸残基が、Kabatナンバリングで表される、
(a)重鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、19位、23位、25位、26位、39位、41位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、77位、81位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、86位、105位、108位、110位、及び112位;
(b)重鎖可変領域のCDRにおいて31位、61位、62位、63位、64位、65位、及び97位;
(c)軽鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、7位、8位、9位、11位、12位、16位、17位、18位、20位、22位、37位、38位、39位、41位、42位、43位、45位、46位、49位、57位、60位、63位、65位、66位、68位、69位、70位、74位、76位、77位、79位、80位、81位、85位、100位、103位、105位、106位、107位、及び108位;及び、
(d)軽鎖可変領域のCDRにおいて24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、及び56位
からなる群から選択されるCDR又はFRにおける位置で改変されている、請求項9に記載の抗体。 - 少なくとも1つのアミノ酸残基が、
(a)重鎖可変領域のFRにおいて8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、23位、39位、41位、43位、44位、77位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、及び105位;
(b)重鎖可変領域のCDRにおいて31位、61位、62位、63位、64位、65位、及び97位;
(c)軽鎖可変領域のFRにおいて16位、18位、37位、41位、42位、45位、65位、69位、74位、76位、77位、79位、及び107位;及び、
(d)軽鎖可変領域のCDRにおいて24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、及び56位
からなる群から選択されるCDR及び/又はFRにおける位置で改変されている、請求項10に記載の抗体。 - 少なくとも1つのアミノ酸残基が、
(a)EUナンバリングで表される、196位、253位、254位、256位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、307位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、及び443位;
(b)EUナンバリングで表される、254位、258位、281位、282位、285位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、418位、419位、421位、433位、434位、及び、443位;又は
(c)EUナンバリングで表される、282位、309位、311位、315位、342位、343位、384位、399位、401位、402位、及び、413位
からなる群から選択される定常領域における位置で改変されている、請求項9〜11のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記定常領域が、Fc gamma受容体(FcγR)に対する結合活性を有し、天然型IgGの定常領域を含む参照抗体と比較して、中性pH条件下でFcγRに対する結合活性が増大されており、任意で前記FcγRがFcγRIIbである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記定常領域が、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、及びFcγRIIaからなる群より選択される1つまたは複数の活性型FcγRに対する結合活性、ならびにFcγRIIbに対する結合活性を有し、天然型IgGの定常領域である定常領域を有している点のみが異なる参照抗体と比較して、前記FcγRIIbに対する結合活性が維持もしくは増大される一方で、前記活性型FcγRに対する結合活性が減少している、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記定常領域が、FcRnに対する結合活性を有し、前記定常領域のFcRnに対する結合活性が、天然型IgGの定常領域である定常領域を有している点のみが異なる参照抗体と比較して、中性pH条件下で増大されている、請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗体。
- IgG抗体であるか、又は少なくとも2種類の抗原と結合する多重特異性抗体である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
- 血漿中からの抗原の消失を促進するための、又は細胞外マトリックスへの結合を増大させるための、請求項17に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
- 請求項19に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項20に記載のベクターを含む宿主細胞。
- イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗体の製造方法であって、請求項21に記載の宿主細胞を培養して前記細胞の培養物から抗体を回収する工程を含む、製造方法。
- 参照抗体と比較して、
(a)血漿中からの抗原の消失を促進できる抗体を選択する工程;
(b)細胞外マトリックスへの結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(c)中性pH条件下でFcγRに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(d)中性pH条件下でFcγRIIbに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(e)FcγRIIbに対する結合活性が維持もしくは増大される一方で、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、及びFcγRIIaからなる群から好ましくは選択される1つまたは複数の活性型FcγRに対する結合活性が減少している抗体を選択する工程;
(f)中性pH条件下でFcRnに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(g)等電点(pI)を上昇させた抗体を選択する工程;
(h)回収した抗体の等電点(pI)を確認後、等電点(pI)を上昇させた抗体を選択する工程;及び、
(i)イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化もしくは増加されている抗体を選択する工程
のいずれか1つ以上を任意にさらに含む、請求項22に記載の方法。 - イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化する抗原結合ドメインを含む抗体の製造方法であって、等電点(pI)が上昇するように抗体の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する工程を含む、製造方法。
- FcRn結合ドメインを含むFc領域改変体であって、前記FcRn結合ドメインが、
(a)EUナンバリングで表される、434位にAla;438位にGlu、Arg、Ser又はLys;及び、440位にGlu、Asp又はGln
(b)EUナンバリングで表される、434位にAla;438位にArg又はLys;及び、440位にGlu又はAsp;
(c)EUナンバリングで表される、428位にIle又はLeu;434位にAla;436位にIle、Leu、Val、Thr、又はPhe;438位にGlu、Arg、Ser、又はLys;及び、440位にGlu、Asp、又はGln;
(d)EUナンバリングで表される、428位にIle又はLeu;434位にAla;436位にIle、Leu、Val、Thr、又はPhe;438位にArg又はLys;及び、440位にGlu又はAsp;
(e)EUナンバリングで表される、428位にLeu;434位にAla;436位にVal又はThr;438位にGlu、Arg、Ser、又はLys;及び、440位にGlu、Asp、又はGln;あるいは
(f)EUナンバリングで表される、428位にLeu;434位にAla;436位にVal又はThr;438位にArg又はLys;及び、440位にGlu又はAsp
を含む、Fc領域改変体。 - 前記FcRn結合ドメインが、
(I)EUナンバリングで表される、
(a)N434A/Q438R/S440E;(b)N434A/Q438R/S440D;(c)N434A/Q438K/S440E;
(d)N434A/Q438K/S440D;(e)N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(f)N434A/Y436T/Q438R/S440D;(g)N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(h)N434A/Y436T/Q438K/S440D;(i)N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(j)N434A/Y436V/Q438R/S440D;(k)N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(l)N434A/Y436V/Q438K/S440D;(m)N434A/R435H/F436T/Q438R/S440E;
(n)N434A/R435H/F436T/Q438R/S440D;(o)N434A/R435H/F436T/Q438K/S440E;
(p)N434A/R435H/F436T/Q438K/S440D;(q)N434A/R435H/F436V/Q438R/S440E;
(r)N434A/R435H/F436V/Q438R/S440D;(s)N434A/R435H/F436V/Q438K/S440E;
(t)N434A/R435H/F436V/Q438K/S440D;(u)M428L/N434A/Q438R/S440E;
(v)M428L/N434A/Q438R/S440D;(w)M428L/N434A/Q438K/S440E;
(x)M428L/N434A/Q438K/S440D;(y)M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(z)M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440D;(aa)M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440E;
(ab)M428L/N434A/Y436T/Q438K/S440D;
(ac)M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(ad)M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440D;
(ae)M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440E;
(af)M428L/N434A/Y436V/Q438K/S440D;
(ag)L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(ah)L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;又は
(II)EUナンバリングで表される、
(a)N434A/Q438R/S440E;(b)N434A/Y436T/Q438R/S440E;
(c)N434A/Y436V/Q438R/S440E;(d)M428L/N434A/Q438R/S440E;
(e)M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;(f)M428L/N434A/Y436V/Q438R/S440E;
(g)L235R/G236R/S239K/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E;及び、
(h)L235R/G236R/A327G/A330S/P331S/M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E
からなる群から選択される置換されたアミノ酸の組み合わせを含む、請求項25に記載のFc領域改変体。 - 以下の特徴:
(a)天然型IgGのFc領域と比較して、酸性pH条件下でFcRnに対する結合活性が増大されている;
(b)天然型IgGのFc領域と比較して、中性pH条件下で抗医薬品抗体(ADA)に対する結合活性が有意に増大されておらず、ADAが任意でリウマトイド因子(RF)である;
(c)天然型IgGのFc領域と比較して、血漿中クリアランス(CL)が減少されているか、血漿中滞留時間が増大されているか、又は、血漿中半減期(t1/2)が増大されている;又は
(d)EUナンバリングで表される、N434Y/Y436V/Q438R/S440Eの置換されたアミノ酸の組み合わせを含む参照Fc領域改変体と比較して、血漿中滞留性が増大している
のいずれか1つ以上を有する、請求項25又は26に記載のFc領域改変体。 - 請求項25〜27のいずれか一項に記載のFc領域改変体を含み、任意でIgG抗体である、抗体。
- 請求項28に記載の抗体を含み、任意で、前記抗体の血漿中滞留性を増大させるための、医薬組成物。
- 請求項25〜27のいずれか一項に記載のFc領域改変体又は請求項28に記載の抗体をコードする、核酸。
- 請求項30に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項31に記載のベクターを含む宿主細胞。
- FcRn結合ドメインを含むFc領域改変体又は該改変体を含む抗体の製造方法であって、請求項32に記載の宿主細胞を培養して、細胞培養物からFc領域改変体又は該改変体を含む抗体を回収する工程を含む、製造方法。
- (a)天然型IgGのFc領域と比較して、酸性pH条件下でFcRnに対する結合活性が増大されているFc領域改変体を選択する工程;
(b)天然型IgGのFc領域と比較して、中性pH条件下で抗医薬品抗体(ADA)に対する結合活性が有意に増大されていないFc領域改変体を選択する工程;
(c)天然型IgGのFc領域と比較して、血漿中の滞留性が増大しているFc領域改変体を選択する工程;及び、
(d)天然型IgGのFc領域を含む参照抗体と比較して、血漿中からの抗原の消失を促進できるFc領域改変体を含む抗体を選択する工程
のいずれか1つ以上を任意にさらに含む、請求項33に記載の方法。 - 得られるFc領域改変体又は該改変体を含む抗体が、EUナンバリングで表される、434位にAla;438位にGlu、Arg、Ser、又はLys;及び440位にGlu、Asp、又はGlnを含むような様式でアミノ酸を置換する工程を含む、FcRn結合ドメインを含むFc領域改変体又は該改変体を含む抗体の製造方法。
- (a)EUナンバリングで表される、
196位、253位、254位、256位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、307位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、及び443位
からなる群から選択される位置で少なくとも1つのアミノ酸残基の電荷が変化するように、改変前の抗体をコードする核酸を改変する工程;
(b)前記核酸が発現するように宿主細胞を培養する工程;ならびに
(c)宿主細胞培養物から抗体を回収する工程
を含む、改変前の抗体と比較して血漿中半減期が延長又は短縮された改変抗体の製造方法。 - EUナンバリングで表される、
196位、253位、254位、256位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、307位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、及び443位
からなる群から選択される位置で、少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する工程
を含む、抗体の血漿中半減期を延長又は短縮するための方法。 - 少なくとも1つのアミノ酸残基が、
(I)Kabatナンバリングで表される、
(a)重鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、19位、23位、25位、26位、39位、41位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、77位、81位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、86位、105位、108位、110位、及び112位;
(b)重鎖可変領域のCDRにおいて31位、61位、62位、63位、64位、65位、及び97位;
(c)軽鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、7位、8位、9位、11位、12位、16位、17位、18位、20位、22位、37位、38位、39位、41位、42位、43位、45位、46位、49位、57位、60位、63位、65位、66位、68位、69位、70位、74位、76位、77位、79位、80位、81位、85位、100位、103位、105位、106位、107位、及び108位;及び、
(d)軽鎖可変領域のCDRにおいて24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、及び56位
からなる群から選択されるCDR又はFRにおける位置;又は
(II)EUナンバリングで表される、
196位、253位、254位、256位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、307位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、及び443位
からなる群から選択される定常領域における位置
で改変される、請求項24に記載の方法。 - 参照抗体と比較して、
(a)血漿中からの抗原の消失を促進できる抗体を選択する工程;
(b)細胞外マトリックスへの結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(c)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcγRに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(d)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcγRIIbに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(e)FcγRIIbに対する結合活性が維持もしくは増大される一方で、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、及びFcγRIIaからなる群から好ましくは選択される1つまたは複数の活性型FcγRに対する結合活性が減少している抗体を選択する工程;
(f)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcRnに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(g)等電点(pI)を上昇させた抗体を選択する工程;
(h)回収した抗体の等電点(pI)を確認後、等電点(pI)を上昇させた抗体を選択する工程;及び、
(i)イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化もしくは増加されている抗体を選択する工程
のいずれか1つ以上を任意にさらに含む、請求項24または38に記載の方法。 - 以下を含む、改変前の抗体と比較して血漿中からの抗原の消失を促進する抗原結合ドメインを含む改変抗体の製造方法:
(a)
(I)Kabatナンバリングで表される、(a)重鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、5位、8位、10位、12位、13位、15位、16位、18位、19位、23位、25位、26位、39位、41位、42位、43位、44位、46位、68位、71位、72位、73位、75位、76位、77位、81位、82位、82a位、82b位、83位、84位、85位、86位、105位、108位、110位、及び112位;(b)重鎖可変領域のCDRにおいて31位、61位、62位、63位、64位、65位、及び97位;(c)軽鎖可変領域のFRにおいて1位、3位、7位、8位、9位、11位、12位、16位、17位、18位、20位、22位、37位、38位、39位、41位、42位、43位、45位、46位、49位、57位、60位、63位、65位、66位、68位、69位、70位、74位、76位、77位、79位、80位、81位、85位、100位、103位、105位、106位、107位、及び108位;及び、(d)軽鎖可変領域のCDRにおいて24位、25位、26位、27位、52位、53位、54位、55位、及び56位からなる群から選択されるCDR又はFRにおける位置で;又は
(II)EUナンバリングで表される、196位、253位、254位、256位、258位、278位、280位、281位、282位、285位、286位、307位、309位、311位、315位、327位、330位、342位、343位、345位、356位、358位、359位、361位、362位、373位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、399位、400位、401位、402位、413位、415位、418位、419位、421位、424位、430位、433位、434位、及び443位
からなる群から選択される定常領域における位置で、
抗体の表面に露出し得る少なくとも1つのアミノ酸残基を改変する工程;
(b)得られる抗原に対する結合活性がイオン濃度条件によって変化するような様式で、抗原結合ドメインを改変する工程であって、前記(a)及び(b)が同時に又は連続して実施され得る、工程;
(c)前記改変抗体をコードする核酸が発現するように宿主細胞を培養する工程;ならびに
(d)宿主細胞培養物から改変抗体を回収する工程。 - 以下のいずれか1つまたは複数をさらに含む、請求項40に記載の方法:
改変前の抗体と比較して、
(e)血漿中からの抗原の消失を促進できる抗体を選択する工程;
(f)細胞外マトリックスへの結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(g)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcγRに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(h)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcγRIIbに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(i)FcγRIIbに対する結合活性が維持もしくは増大される一方で、FcγRIa、FcγRIb、FcγRIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb、及びFcγRIIaからなる群から好ましくは選択される1つまたは複数の活性型FcγRに対する結合活性が減少している抗体を選択する工程;
(j)中性pH条件下(例えばpH 7.4)でFcRnに対する結合活性が増大されている抗体を選択する工程;
(k)等電点(pI)を上昇させた抗体を選択する工程;
(l)回収した抗体の等電点(pI)を確認後、等電点(pI)を上昇させた抗体を選択する工程;及び、
(m)イオン濃度の条件によって抗原に対する結合活性が変化もしくは増加されている抗体を選択する工程。
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