CN105209482B - 新的多肽 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及一类工程化多肽，所述工程化多肽具有对新生Fc受体(以下称为FcRn)的结合亲和力，并提供FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽包含序列EX2X3X4AX6X7EIRWLPNL X16X17X18QRX21AFIX25X26LX28X29。本公开内容还涉及这样的FcRn结合多肽作为用于修饰药代动力学和药效动力学性质的剂和作为治疗剂的用途。

Description

新的多肽
发明的技术领域
本公开内容涉及一类具有对新生Fc受体(以下称为FcRn)的结合亲和力的工程化多肽。本公开内容还涉及这样的FcRn结合多肽作为用于修饰生物分子例如药物的药代动力学和药效动力学性质的剂，和作为治疗剂的用途。
背景
新生Fc受体(FcRn)是由跨膜MHC I类样重链(FcRnα链)和β2微球蛋白轻链组成的异二聚体蛋白，后者还形成MHC I类分子的一部分(Simister和Mostov(1989)Nature 337:184-7；Burmeister等人(1994)Nature 372:379-83)。
FcRn主要位于内体并能够在pH≤6.5结合至血清白蛋白和免疫球蛋白G(IgG)，且在pH≥7.0释放它们(在Roopenian(2007)Nat Rev Immunol 7:715-25中综述)。
FcRn在哺乳动物中执行几种不同的任务(在Roopenian中综述，同上)。FcRn参与内吞的IgG和血清白蛋白的再循环，从而避免它们在溶酶体内的降解，给予它们在血液中比其他血清蛋白更长的半衰期和更高的可用性。当IgG、血清白蛋白和其他血清蛋白被与血液接触的细胞被动地胞饮时，pH在形成的内体中变得逐渐降低，其允许IgG和血清白蛋白与FcRn的结合。然后，受体连同其结合的配体，经由再循环的内体被运输回到质膜。返回到质膜之后，pH升高到7以上，此时结合的配体被释放。
FcRn还被公认其越过屏障诸如胎盘、上呼吸道上皮、血-脑屏障和小肠近端运输IgG的能力。
在哺乳动物中，使用FcRn的性质将IgG经由胎盘从母亲胞吞转运(transcytose)至胎儿，并且在小肠近端处将IgG从母亲的乳汁胞吞转运至婴儿的血流中。
FcRn的表达模式在物种之间不同。然而，FcRn由大多数物种中的血脑屏障、上呼吸道上皮、肾和血管内皮中的细胞，并且由抗原递呈细胞，以及由造血细胞起源的其他细胞广泛表达(在Roopenian(2007)中综述，同上)。
具有对FcRn(Liu等人(2007)J Immunol 179:2999-3011,Mezo等人(2008)ProcNatl Acad Sci U S A 105:2337-42)和β2-微球蛋白(Getman和Balthasar(2005)J PharmSci 94:718-29)的亲和力的抗体和肽已被开发以抑制内源性IgG和FcRn之间的结合。另一种方法是突变IgG的Fc区域，以获得对FcRn更高的亲和力(Petkova等人(2006)Int Immunol18:1759-69,Vaccaro等人(2005)Nat Biotechnol 23:1283-8)。
向Fc结构域或向白蛋白融合是增加蛋白的体内半衰期的广泛使用的策略。然而，这样的融合蛋白的大尺寸不利地影响组织穿透性，且降低对融合伴侣的特异性(Valles等人(2011)J Interferon Cytokine Res 32:178-184)。另一方面，已在施用至非人灵长类动物的抗体的Fc片段中做出突变，以延长半衰期(Hinton等人(2004)J Biol Chem 279:6213-6)。然而，该方法仅限于用于治疗性抗体，并不能外推至其他治疗性蛋白，除非有关的蛋白与Fc片段融合，其还导致大尺寸的分子。已设计出若干化学和重组方法，以改进蛋白半衰期，诸如蛋白的PEG化和与IgG或白蛋白的Fc结构域的遗传融合体(在Schellenberger等人(2009)Nat Biotechnol 21:1186-1190中综述)。蛋白的PEG化已被报道降低其效力并有助于它们的免疫反应性。
Fc融合蛋白还已被用于由FcRn介导的口服和肺部递送(Low等人，(2005)Humanreproduction Jul；20(7):1805-13)，然而，由于融合分子的尺寸，关于组织穿透性和降低的特异性的类似问题仍存在。
因此，本领域中对具有对FcRn高亲和力的分子的持续供给存在大量需求。特别是，当作为融合伴侣存在时，需要小结合分子不会不利地影响与其融合的分子的特性并且不会有助于免疫反应性。
发明概述
本公开内容的一个目的是提供用于在修饰生物分子例如药物的药代动力学和/或药效动力学性质中使用的新的FcRn结合剂。
本公开内容的又一个目的是提供单独地或作为组合治疗地自身用作治疗剂的新的FcRn结合剂。
本公开内容的一个目的是提供允许有效靶向FcRn，同时缓解当前治疗方法的以上提到的和其他缺点的分子。对于来自本公开内容领域的技术人员明显的这些和其他目的由如在所附权利要求书中要求保护的和如本文一般性公开的本发明的不同方面来满足。
因此，在本公开内容的第一方面，提供了新生Fc受体(FcRn)结合多肽，所述新生Fc受体(FcRn)结合多肽包含FcRn结合基序，BM，该基序由以下的氨基酸序列组成：
EX2X3X4AX6X7EIR WLPNLX16X17X18QR X21AFIX25X26LX28X29
其中，彼此独立地，
X2选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X3选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X4选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X6选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X7选自A、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X16选自N和T；
X17选自F、W和Y；
X18选自A、D、E和N；
X21选自A、S、V和W；
X25选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X26选自K和S；
X28选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和
X29选自D和R。
有关FcRn结合多肽的序列的种类的以上定义基于亲本支架的许多随机多肽变体的统计分析，所述亲本支架的许多随机多肽变体是在数个不同选择实验中对于它们与FcRn的相互作用而选择的。鉴定的FcRn结合基序，或“BM”，相应于亲本支架的靶结合区域，该区域构成在三螺旋束蛋白结构域内的两个α螺旋。在亲本支架中，两个BM螺旋的改变的氨基酸残基构成用于与抗体的恒定Fc部分相互作用的结合表面。在本公开内容中，变体的结合表面残基的随机变化和随后选择已将Fc相互作用能力替代为与FcRn相互作用的能力。
在所述FcRn结合多肽的一个实施方案中，BM由以下的氨基酸序列组成：
EX2X3X4AX6X7EIR WLPNLTX17X18QR X21AFIX25KLX28D
其中，彼此独立地，
X2选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X3选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X4选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X6选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X7选自A、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X17选自F、W和Y；
X18选自A、D、E和N；
X21选自A、S、V和W；
X25选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和
X28选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y。
在本公开内容的第一方面的另一个实施方案中，所述新生Fc受体(FcRn)结合多肽包含FcRn结合基序，BM，该基序由以下的氨基酸序列组成：
EX2X3X4AX6X7EIR WLPNLX16X17X18QR X21AFIX25X26LX28X29
其中，彼此独立地，
X2选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X3选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X4选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X6选自A、E、F、G、H、I、K、Q、R、S和V；
X7选自A、F、H、K、N、Q、R、S和V；
X16选自N和T；
X17选自F、W和Y；
X18选自A、D、E和N；
X21选自A、S、V和W；
X25选自D、E、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X26选自K和S；
X28选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和
X29选自D和R。
在第一方面的另一个实施方案中，提供了FcRn结合多肽，其中，彼此独立地，
X2选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X3选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X4选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X6选自A、E、F、G、H、I、K、Q、R和S；
X7选自A、F、H、K、N、Q、R、S和V；
X16选自N和T；
X17选自F和Y；
X18是D；
X21是V；
X25选自D、E、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X26选自K和S；
X28选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和W和
X29选自D和R。
在第一方面的另一个实施方案中，BM由选自以下的氨基酸序列组成：
i)EX2X3X4AX6HEIR WLPNLTX17X18QR X21AFIX25KLX28D
其中，彼此独立地，
X2选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X3选自A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；
X4选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；
X6选自A、G、K、R、S和V；
X17选自F、W和Y；
X18选自A、D、E和N；
X21选自A、S、V和W；
X25选自D、G、H、K、L、N、R、V和W；
X28选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T、W和Y；
和
ii)与所述序列具有至少96％同一性的氨基酸序列。
在所述方面的还另一个实施方案中，序列i)中的BM由选自以下的氨基酸序列组成：
EX2X3X4AX6HEIR WLPNLTX17X18QR X21AFIX25KLX28D
其中，彼此独立地，
X2选自A、D、E、F、N、Q、R、S和W；
X3选自D、E、G、H、K、M、N、Q、S和T；
X4选自A、D、E、G、N、Q、R、S、T、V和Y；
X6选自A、G、S和V；
X17选自F、W和Y；
X18选自A、D、E和N；
X21选自A、S、V和W；
X25选自D、G、H、K、L、N、R和V；和
X28选自A、E、H、L、N、Q、R、S、T、W和Y。
如本领域技术人员将认识到的，任何多肽的功能，包括本公开内容的多肽的FcRn结合能力，取决于多肽的三级结构。因此，对多肽中的氨基酸的序列作出微小变化而不影响其功能是可能的。因此，本公开内容包括FcRn结合多肽的修饰的变体，其保留了FcRn结合特性。
因此，如上所述，包含与如i)中定义的多肽具有96％或更大同一性的氨基酸序列的FcRn结合多肽也被本公开内容所包括。
在一些实施方案中，这样的变化可在如本文公开的FcRn结合多肽的序列的所有位置中作出。在其他实施方案中，这样的变化可仅在非可变位置，还称为支架的氨基酸残基中作出。在这样的情况下，在可变位置，即序列i)中用“X”表示的位置中改变不被允许。例如，属于氨基酸残基的某些功能分组(例如疏水性、亲水性、极性等)的氨基酸残基可被交换为来自同一功能分组的另一种氨基酸残基。
如在整个说明书中使用的术语“％同一性”，例如可如下计算。查询序列使用CLUSTAL W算法对齐到靶序列(Thompson等人(1994)Nucleic Acids Research 22:4673-4680)。比较在相应于最短的比对的序列的窗口上作出。在某些情况下，最短的比对的序列可以是靶序列。在其他情况下，查询序列可构成最短的比对的序列。比较在每个位置上的氨基酸残基，并且查询序列中具有靶序列中相同对应性的位置的百分比被报告为％同一性。
下面是进一步指定氨基酸残基Xn的实施方案的列表，其中n是指示所述残基在本文描述的多肽内的位置的整数。为了清楚，在其中被包含在多肽中的BM可由或给定氨基酸序列或与所述给定的氨基酸序列具有至少给定的％同一性的氨基酸序列组成的情况下，如本文使用的Xn是指在所述给定氨基酸序列中的氨基酸残基。例如，当可适用时，Xn是指在以上序列i)中的氨基酸残基。
在一个实施方案中，X2选自A、D、E、F、I、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y。
在一个实施方案中，X2选自A、D、F、I、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y。
在一个实施方案中，X2选自A、D、F、I、L、N、Q、R、S、V和W。
在一个实施方案中，X2选自A、I、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y。
在一个实施方案中，X2选自A、I、L、N、Q、S、T、V和W。
在一个实施方案中，X2选自A、I、L、N、Q、V和W。
在一个实施方案中，X2选自A、I、L、Q、V和W。
在一个实施方案中，X2选自A、I、L和Q。
在一个实施方案中，X2选自I、L和Q。
在一个实施方案中，X2选自I和Q。
在一个实施方案中，X2是I。
在一个实施方案中，X2是Q。
在一个实施方案中，X3选自A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y。
在一个实施方案中，X3选自A、D、E、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y。
在一个实施方案中，X3选自A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、R、S和T。
在一个实施方案中，X3选自A、D、E、G、H、K、M、N、Q、S和T。
在一个实施方案中，X3选自A、D、E、G、H、M、N、Q、S和T。
在一个实施方案中，X3选自A、D、E、K、N、Q、S和T。
在一个实施方案中，X3选自A、D、E、K、Q和T。
在一个实施方案中，X3选自A、D、E、Q和T。
在一个实施方案中，X3选自D、E和T。
在一个实施方案中，X3选自D和E。
在一个实施方案中，X3是D。
在一个实施方案中，X3是E。
在一个实施方案中，X4选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y。
在一个实施方案中，X4选自A、D、E、G、N、Q、R、S、T和V。
在一个实施方案中，X4选自A、D、E、F、I、K、L、N、Q、R、S、T和V。
在一个实施方案中，X4选自A、D、E、I、K、N、Q、R、S和T。
在一个实施方案中，X4选自A、D、E、I、K、Q、S和T。
在一个实施方案中，X4选自A、D、I、K、Q和S。
在一个实施方案中，X4选自A、D、E、K和S。
在一个实施方案中，X4选自A、D、K和S。
在一个实施方案中，X4选自A、D、E和K。
在一个实施方案中，X4选自A、D和K。
在一个实施方案中，X4选自A和D。
在一个实施方案中，X4选自A和E。
在一个实施方案中，X4是A。
在一个实施方案中，X4是D。
在一个实施方案中，X4是E。
在一个实施方案中，X6选自A、G、K、Q、R、S和V。
在一个实施方案中，X6选自A、G、K、R、S和V。
在一个实施方案中，X6选自A、G、K、R和S。
在一个实施方案中，X6选自A、G、K、S和V。
在一个实施方案中，X6选自A、G、K和V。
在一个实施方案中，X6选自A、G、K和S。
在一个实施方案中，X6选自A、G和K。
在一个实施方案中，X6选自A、G和V。
在一个实施方案中，X6选自A和G。
在一个实施方案中，X6是A。
在一个实施方案中，X6是G。
在一个实施方案中，X7选自A和H。
在一个实施方案中，X7是H。
在一个实施方案中，X16是T。
在一个实施方案中，X16是N。
在一个实施方案中，X17选自F和Y。
在一个实施方案中，X17是F。
在一个实施方案中，X18选自A、D和E。
在一个实施方案中，X18选自A和D。
在一个实施方案中，X18是D。
在一个实施方案中，X21选自V和W。
在一个实施方案中，X21是V。
在一个实施方案中，X25选自D、E、G、H、K、L、N、Q、R、V和W。
在一个实施方案中，X25选自D、G、H、K、L、N、R、V和W。
在一个实施方案中，X25选自D、G、H、K、L、N、R和V。
在一个实施方案中，X25选自H、L、R、V和W。
在一个实施方案中，X25选自H、R、V和W。
在一个实施方案中，X25选自H、R和V。
在一个实施方案中，X25选自H、L和R。
在一个实施方案中，X25选自H和R。
在一个实施方案中，X25选自H和V。
在一个实施方案中，X25是H。
在一个实施方案中，X26是K。
在一个实施方案中，X26是S。
在一个实施方案中，X28选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T、W和Y。
在一个实施方案中，X28选自A、D、E、K、L、N、Q、R、S、T、W和Y。
在一个实施方案中，X28选自A、D、E、L、R、S、T、W和Y。
在一个实施方案中，X28选自A、D、K、L、N、Q、R、S、T和W。
在一个实施方案中，X28选自A、D和R。
在一个实施方案中，X28选自A和R。
在一个实施方案中，X28选自D和R。
在一个实施方案中，X28是A。
在一个实施方案中，X28是R。
在一个实施方案中，X29是D。
在一个实施方案中，X29是R。
在一个实施方案中，X6X7选自AH和GH。
在一个实施方案中，X6X7是AH。
在一个实施方案中，X6X7是GH。
在一个实施方案中，X17X18选自FD和YD。
在一个实施方案中，X17X18是FD。
在限定FcRn结合多肽的子类的更具体的实施方案中，该序列满足以下六个条件Ⅰ-Ⅵ中的至少三个：
I.X6选自A、G、K和S，诸如特别是A；
II.X7是H；
III.X17选自F和Y，诸如特别是F；
IV.X18是D；
V.X21选自V和W，诸如特别是V；
VI.X25选自H和R，诸如特别是H。
在根据第一方面的FcRn结合多肽的一些实例中，所述序列满足六个条件I-VI中的至少四个。更具体地，该序列可满足六个条件I-VI中的至少五个，诸如所有六个条件I-VI。
如在以下实验部分中详细描述的，FcRn结合多肽变体的选择已导致许多单独的FcRn结合基序(BM)序列的鉴定。这些序列构成根据该方面的单独的实施方案。单独的FcRn结合基序的序列展示于图1中和为SEQ ID NO:1-353。因此，在根据该方面的FcRn结合多肽的一个实施方案中，所述序列选自由SEQ ID NO:1-353组成的组。在一个实施方案中，所述序列选自由SEQ ID NO:1-15、SEQ ID NO:17-140和SEQ ID NO:353组成的组。在一个实施方案中，所述序列选自由SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:17-140组成的组。在一个实施方案中，所述序列选自由SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:17-92、SEQ ID NO:94-103、SEQ ID NO:105-125和SEQ ID NO:127-140组成的组。在一个实施方案中，所述序列选自由SEQ ID NO:1-8、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19-20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75-77和SEQ ID NO:353组成的组。在另一个实施方案中，所述序列选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:75-77组成的组。在还另一个实施方案中，所述序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:44、SEQID NO:65、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:77。在一个实施方案中，所述序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:75。在一个实施方案中，所述序列是SEQ ID NO:1。
在本公开内容的一些实施方案中，如以上定义的BM“形成”三螺旋束蛋白结构域“的一部分”。这被理解为意指将BM的序列“插入”进原始三螺旋束结构域的序列中或“移植”在原始三螺旋束结构域的序列上，使得BM替代原始结构域中的相似结构基序。例如，不希望受理论的束缚，BM被认为构成三螺旋束的三个螺旋中的两个，并因此可替代任何三螺旋束内的这种双螺旋基序。如本领域技术人员将认识到的，三螺旋束结构域的两个螺旋被两个BM螺旋的替代必须被进行，以便不影响多肽的基本结构。即，根据本发明的该实施方案的多肽的Cα骨架的整体折叠与其形成部分的三螺旋束蛋白结构域的整体折叠基本上一致，例如以相同顺序具有二级结构的相同元件等。因此，如果根据该方面的该实施方案的多肽具有与原始结构域相同的折叠，根据本公开内容的BM“形成”三螺旋束结构域“的一部分”，意味着共享基本结构特性，例如，导致相似CD光谱的那些特性。本领域技术人员知道相关的其他参数。
因此，在具体的实施方案中，FcRn结合基序(BM)形成了三螺旋束蛋白结构域的一部分。例如，BM可基本上构成在所述三螺旋束蛋白结构域内具有互相连接的环的两个α螺旋。在具体的实施方案中，所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体蛋白的结构域。这样的结构域的非限制性实例是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的五个不同的三螺旋结构域，诸如结构域B，及其衍生物。在一些实施方案中，三螺旋束蛋白结构域是蛋白Z的变体，所述蛋白Z源自葡萄球菌蛋白A的结构域B。
在其中本发明的FcRn结合多肽形成三螺旋束蛋白结构域的一部分的实施方案中，该FcRn结合多肽可包含选自以下的氨基酸序列：
iii)K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ；
其中
[BM]是如本文定义的FcRn结合基序，条件是X29是D；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；
和
iv)与由iii)定义的序列具有至少93％同一性的氨基酸序列。
在其中本发明的FcRn结合多肽形成三螺旋束蛋白结构域的一部分的实施方案中，该FcRn结合多肽可包含选自以下的氨基酸序列：
v)K-[BM]-QPEQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ；
其中
[BM]是如本文定义的FcRn结合基序，条件是X29是R；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；
和
vi)与由v)定义的序列具有至少93％同一性的氨基酸序列。
如以上所讨论的，与以上的氨基酸序列比较，包含不很大程度上影响三级结构及其功能的微小变化的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，序列iv)或序列vi)分别与由iii)和v)定义的序列具有至少95％，例如至少97％的同一性。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xa是A。在一个替代性实施方案中，序列iii)或v)中的Xa是S。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xb是N。在一个替代性实施方案中，序列iii)或v)中的Xb是E。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xc是A。在一个替代性实施方案中，序列iii)或v)中的Xc是S。在还另一个替代性实施方案中，序列iii)或v)中的Xc是C。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd是E。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd是N。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd是S。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe是D。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe是E。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe是S。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe选自EE、ES、SE和SS。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe是ES。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe是SE。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xf是A。在一个替代性实施方案中，序列iii)或v)中的Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是A且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是C且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是S且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是C且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是A；XdXe是ND且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是C；XdXe是ND且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是S；XdXe是ND且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是C；XdXe是ND且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是A；XdXe是SE且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是C；XdXe是SE且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是S；XdXe是SE且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是C；XdXe是SE且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是A；XdXe是ES且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是C；XdXe是ES且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是S；XdXe是ES且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是C；XdXe是ES且Xf是S。
在还另外的实施方案中，以上FcRn结合多肽的定义中的序列iii)选自由SEQ IDNO:354-706组成的组。在一个实施方案中，序列iii)选自由SEQ ID NO:354-368、SEQ IDNO:370-493和SEQ ID NO:706组成的组。在一个实施方案中，序列iii)选自由SEQ ID NO:354-355和SEQ ID NO:370-493组成的组。在一个实施方案中，序列iii)选自由SEQ ID NO:354-355、SEQ ID NO:370-445、SEQ ID NO:447-456、SEQ ID NO:458-478和SEQ ID NO:480-493组成的组。在一个实施方案中，序列iii)选自由SEQ ID NO:354-361、SEQ ID NO:366、SEQ ID NO:372-373、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:397、SEQID NO:418、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:428-430和SEQ ID NO:706组成的组。在另一个实施方案中，序列iii)选自由SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:426和SEQ ID NO:428-430组成的组。在还另一个实施方案中，序列iii)选自SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:376、SEQID NO:397、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:428和SEQ ID NO:430。在一个实施方案中，序列iii)选自SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:376和SEQ ID NO:428。在一个实施方案中，序列iii)是SEQ ID NO:354。
另外，在另外的实施方案中，提供了如以上定义的FcRn结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
vii)YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P；
其中[BM]是如以上定义的FcRn结合基序且Xc选自A、S和C；和
viii)与由vii)定义的序列具有至少94％同一性的氨基酸序列。
另外，提供了如以上定义的FcRn结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
ix)FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P；
其中[BM]是如以上定义的FcRn结合基序且Xc选自A和C；和
x)与由ix)定义的序列具有至少94％同一性的氨基酸序列。
如以上所讨论的，与以上的氨基酸序列比较，包含不很大程度上影响三级结构及其功能的微小变化的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如以上定义的FcRn结合多肽可包含与由vii)或ix)定义的序列至少96％，诸如至少98％同一的序列。
在一些实施方案中，FcRn结合基序可形成包含选自以下的氨基酸序列的多肽的一部分：
ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；和
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；
其中[BM]是如以上定义的FcRn结合基序。
在一个实施方案中，FcRn结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xi)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]是如以上定义的FcRn结合基序；和
xii)与xi)中定义的序列具有至少94％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1060-1062组成的组。
在一个实施方案中，FcRn结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xiii)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]是如以上定义的FcRn结合基序；和
xiv)与xiii)中定义的序列具有至少94％同一性的氨基酸序列。
在这样的多肽中的序列xiii)可例如选自由SEQ ID NO:707-1059组成的组。在一个实施方案中，序列xiii)选自由SEQ ID NO:707-721、SEQ ID NO:723-846和SEQ ID NO:1059组成的组。在一个实施方案中，序列xiii)选自由SEQ ID NO:707-708和SEQ ID NO:723-846组成的组。在一个实施方案中，序列xiii)选自由SEQ ID NO:707-708、SEQ ID NO:723-798、SEQ ID NO:800-809、SEQ ID NO:811-831和SEQ ID NO:833-846组成的组。在一个实施方案中，序列xiii)选自由SEQ ID NO:707-714、SEQ ID NO:719、SEQ ID NO:725-726、SEQ ID NO:729、SEQ ID NO:734、SEQ ID NO:747、SEQ ID NO:750、SEQ ID NO:771、SEQ IDNO:776、SEQ ID NO:779、SEQ ID NO:781-783和SEQ ID NO:1059组成的组。在另一个实施方案中，序列xiii)选自由SEQ ID NO:707、SEQ ID NO:729、SEQ ID NO:734、SEQ ID NO:747、SEQ ID NO:750、SEQ ID NO:771、SEQ ID NO:779和SEQ ID NO:781-783组成的组。在还另一个实施方案中，序列xiii)选自SEQ ID NO:707、SEQ ID NO:729、SEQ ID NO:750、SEQ IDNO:771、SEQ ID NO:781和SEQ ID NO:783。在一个实施方案中，序列xiii)选自SEQ ID NO:707、SEQ ID NO:729和SEQ ID NO:781。在一个实施方案中，序列xiii)是SEQ ID NO:707。
再次，与以上的氨基酸序列比较，包含不很大程度上影响三级结构及其功能的微小变化的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如以上定义的FcRn结合多肽可包含与由xi)或xiii)定义的序列至少96％，诸如至少98％同一的序列。
如在本说明书中使用的术语“FcRn结合”和“对FcRn的结合亲和力”是指可例如通过使用表面等离子体共振(SPR)技术或ELISA测试的多肽的性质。
例如，如在下面实施例中所述，FcRn结合亲和力可在以下的实验中被测试：其中FcRn或其正确折叠的片段被固定化在仪器的传感器芯片上，且待测试的包含多肽的样品在芯片穿过。可选地，将待测试的多肽固定化在仪器的传感器芯片上，且包含FcRn或其正确折叠的片段的样品在芯片上穿过。然后，本领域技术人员可解释通过这样的实验获得的结果，以建立多肽对FcRn的结合亲和力的至少定性的量度。例如，如果，期望定量量度以确定相互作用的KD值，也可使用表面等离子体共振方法。例如，可在Biacore(GE Healthcare)或ProteOn XPR 36(Bio-Rad)仪器上定义结合值。FcRn被适当地固定化在仪器的传感器芯片上，并且亲和力将要被确定的多肽的样品通过连续稀释被制备并以随机顺序被喷射。然后，KD值可使用例如由仪器制造商提供的BIAevaluation 4.1软件的1:1Langmuir结合模型，或其他合适的软件来从结果计算。
可选地，如在下面实施例中所述，FcRn结合亲和力可在以下的实验中被测试：其中多肽的样品在涂覆抗体的ELISA板上被捕获，并加入生物素化的FcRn，随后是链霉亲和素缀合的HRP。加入TMB底物，并使用多孔板读数器，诸如Victor3(Perkin Elmer)测量在450nm的吸光度。然后，本领域技术人员可解释通过这样的实验获得的结果，以建立多肽对FcRn的结合亲和力的至少定性的量度。例如，如果，期望定量量度以确定相互作用的KD值(一半最大有效浓度)，还可使用ELISA。多肽针对生物素化的FcRn的稀释系列的响应使用如以上所述的ELISA来测量。然后本领域技术人员可解释通过这样的实验获得的结果，且KD值可使用例如GraphPad Prism 5和非线性回归来从结果计算。
在一个实施方案中，提供了FcRn结合多肽，其能够在pH 6.0结合FcRn，使得相互作用的KD值是至多1x 10-6M，诸如至多1x 10-7M，诸如至多1x 10-8M，诸如至多1x 10-9M，诸如至多1x 10-10M。根据该实施方案的FcRn结合多肽将在酸性pH条件，诸如pH 6.0，例如在溶酶体中与FcRn结合，或保持结合。如果这样的多肽将要进入愈加酸性的细胞内环境，它将通过其与FcRn的相互作用被再循环至质膜，从而避免降解。
在一个实施方案中，FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值比在pH6.0的所述相互作用的KD值更高。因此，FcRn结合多肽将在pH 6.0比在pH 7.4以更高的亲和力结合FcRn。在一个实施方案中，在pH 7.4的所述相互作用的KD值比在pH 6.0的所述相互作用的KD值高至少2倍，诸如高至少5倍，诸如高至少10倍，诸如高至少50倍，诸如高至少100倍。
在一个实施方案中，FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值是至少1x 10-8M，诸如至少1x 10-7M，诸如至少1x 10-6M，诸如至少1x 10-5M。在一些实施方案中，FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的唯一标准是，在更酸性条件时已结合FcRn的任何FcRn结合多肽当pH值增加时从FcRn释放得更快。
在替代性实施方案中，提供了FcRn结合多肽，对于其在pH 7.4的所述相互作用的KD与在pH 6.0的所述相互作用的KD相同或低于在pH 6.0的所述相互作用的KD。根据该实施方案的FcRn结合多肽在酸性pH条件(即，在pH 6.0具有足够慢以避免释放的解离速率(off-rate))，例如，在溶酶体中，以及在中性或轻微碱性pH条件，例如，在质膜上将与FcRn结合或保持结合。在一个更具体的实施方案中，在pH 7.4的所述相互作用的KD值比在pH 6.0的所述相互作用的KD值低至少2倍，诸如低至少5倍，诸如低至少10倍，诸如低至少50倍，诸如低至少100倍。
在另一个实施方案中，提供了FcRn结合多肽，其能够在pH 7.4结合FcRn，使得相互作用的KD值是至多1x 10-6M，诸如至多1x 10-7M，诸如至多1x 10-8M，诸如至多1x 10-9M，诸如至多1x 10-10M。根据该实施方案的FcRn结合多肽在中性或微碱性pH条件，诸如pH 7.4，例如在质膜上将与FcRn结合，或保持结合延长的时间。术语“保持结合”应被理解为意指具有在给定条件下慢解离速率的相互作用。
通常，本领域技术人员已知，相互作用的KD值被定义为解离速率(koff)和结合速率(kon)之间的比率。因此，高的KD值可起因于高的koff、低的kon或两者，且相反地，低的KD值可起因于低的koff、高的kon或两者。
本领域技术人员将理解，可根据本文公开的任何方面对FcRn结合多肽作出各种修改和/或添加，以便使多肽适合具体的应用，而不偏离本公开内容的范围。
例如，在一个实施方案中，提供了如本文描述的FcRn结合多肽，该多肽已在C末端和/或N末端延长了一个或更多个氨基酸。这样的多肽应被理解为在多肽链的最前第一个位置和/或最后位置处具有一个或更多个另外的氨基酸残基的多肽。因此，FcRn结合多肽可包含任何合适数目的另外的氨基酸残基，例如至少一个另外的氨基酸残基。每个另外的氨基酸残基可单独或共同地被添加以便，例如，改进多肽的体内或体外的产生、纯化、稳定化，偶合或检测。这样另外的氨基酸残基可包含出于化学偶合的目的添加的一个或更多个氨基酸残基。这样的一个实例是半胱氨酸残基的添加。这样的另外的氨基酸残基还可提供用于纯化或检测多肽的“标签”，诸如His6标签或“myc”(c-myc)标签或“FLAG”标签，用于与特异于标签的抗体相互作用或在6个组氨酸标签的情况下的固定化金属亲和层析(IMAC)。
如以上讨论的另外的氨基酸可通过化学缀合(使用已知的有机化学方法)或通过任何其他方法被偶合至FcRn结合多肽，诸如表达FcRn结合多肽作为融合蛋白或以其他任何方式，直接或通过接头，例如氨基酸接头连接。
如以上讨论的另外的氨基酸可例如构成一个或更多个多肽结构域。另外的多肽结构域可提供具有另一种功能，诸如例如另一种结合功能、或酶促功能、或毒性功能或发荧光信号功能，或其组合的FcRn结合多肽。
另外的多肽结构域还可提供具有相同FcRn结合功能的另一个FcRn结合部分。因此，在另外的实施方案中，提供了呈多聚体形式的FcRn结合多肽。所述多聚体被理解为包含至少两个如本文公开的FcRn结合多肽作为单体单元，其的氨基酸序列可相同或不同。多肽的多聚体形式可包括合适数目的结构域，每个具有FcRn结合基序，并各自形成多聚体内的单体。这些结构域可具有相同的氨基酸序列，但可选地，它们可具有不同的氨基酸序列。换言之，本发明的FcRn结合多肽可形成同多聚体或异多聚体，例如同二聚体或异二聚体。在一个实施方案中，提供了FcRn结合多肽，其中所述单体单元共价偶合在一起。在另一个实施方案中，所述FcRn结合多肽单体单元被表达为融合蛋白。在一个实施方案中，提供了呈二聚体形式的FcRn结合多肽。
另外，其中本文描述的FcRn结合多肽或其多聚体构成第一结构域或第一部分，且第二和另外的部分具有除结合FcRn以外的其他功能的“异源的”融合多肽或蛋白或缀合物，还被预期，并落入本公开内容的范围内。在这样的蛋白中的融合多肽或缀合物的第二和另外的一个或更多个部分适当地具有期望的生物学活性。
因此，在本公开内容的第二方面，提供了融合蛋白或缀合物，其包含由根据第一方面的FcRn结合多肽组成的第一部分，和由具有期望的生物学活性的多肽组成的第二部分。在另一个实施方案中，所述融合蛋白或缀合物可另外包含另外的部分，所述部分包含期望的生物学活性，所述期望的生物学活性可与所述第二部分的生物学活性相同或不同。
此类异源融合多肽也可用于创建更高阶的异多聚复合物。一个实例是两个融合多肽的异二聚体复合物，每个包含以与另一部分融合的根据本公开内容的FcRn结合多肽。此类复合物可例如在体内或体外形成异二聚体，并通过非共价和/或共价相互作用保持在一起。此类复合物的具体实例是Fab片段，其中轻链和重链两者都以各自与一个FcRn结合多肽融合来产生，且其可包含结构域间二硫键。可使用FcRn结合融合蛋白作为单体单元构建本领域技术人员已知的许多生物学相关的异二聚体复合物。
在所述融合蛋白或缀合物的一个实施方案中，分子的总尺寸低于在施用至哺乳动物受试者后有效肾清除率的阈值。
在所述融合蛋白或缀合物的另一个实施方案中，分子的总尺寸高于在施用至哺乳动物受试者后有效肾清除率的阈值。
在一个实施方案中，提供了融合蛋白或缀合物，其中所述融合蛋白或缀合物的体内半衰期长于具有所期望的生物学活性的多肽本身的体内半衰期。
期望的生物学活性的非限制性实例包括治疗活性、结合活性、以及酶活性。
在一个实施方案中，所述期望的生物学活性是对选定的靶的结合活性。
此类结合活性的一个实例是增加融合蛋白或缀合物的体内半衰期的结合活性。该融合蛋白或缀合物可包含至少一个另外的部分。在一个具体的实施方案中，所述靶是与其结合增加所述融合蛋白或缀合物的体内半衰期的白蛋白。在一个实施方案中，所述白蛋白结合活性由链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域(ABD)或其衍生物提供。例如，包含至少一个另外的部分的所述融合蛋白或缀合物，可包含[FcRn结合多肽部分]-[白蛋白结合部分]-[具有对选定的靶的亲和力的部分]。应该理解，本实例中的三个部分可以以从该多肽的N-末端至C-末端的任何顺序排列。
在一个实施方案中，当靶和如本文所述的融合蛋白或缀合物之间的复合物在酸性pH，诸如pH 6.0被形成(或保持)时，该靶被拯救免受溶酶体降解。因此，靶半衰期被延长。半衰期延长意味着，靶当与所述融合蛋白或缀合物相互作用时的消除速率比靶分子在所述融合蛋白或缀合物的不存在下的消除速率更低。此外，在本实施方案中可期望，靶被融合蛋白或缀合物的结合基本上不应干扰靶的功能。
另一方面，当靶和如本文所述的融合蛋白或缀合物之间的复合物在酸性pH不被保持或不被形成时，靶被导向亚细胞溶酶体，在那里它被降解。
在一个实施方案中，提供了融合蛋白或缀合物，其中选定的、不期望的靶从受试者的消除速率增加。与靶分子本身，即在先未与融合蛋白或缀合物相互作用的靶分子的“正常”消除速率比较，不期望的靶的增加的消除意味着靶从多细胞生物体的身体的增加的消除速率。
在另一个实施方案中，选定的不希望的靶的结合可灭活靶的功能，由此在这是可期望的情况下阻断其生物学活性。例如，此类生物学活性可以是激活或阻断受体或酶活性或其他有毒的或不期望的活性。此类不期望的靶可以是内源激素、酶、细胞因子、趋化因子或具有某些其他生物学活性的靶。生物学活性通过使用灭活靶结合被阻断，直到靶在低pH值被递送用于降解和释放，且靶结合融合蛋白被回收至循环。靶结合融合蛋白的这种回收(经由它的FcRn结合部分)使得其能够“催化”选定的不期望的靶的多于一个的分子的除去。
例如，不期望的靶可以是外源蛋白和化合物，或在医疗状况后显示在血浆中提高的水平的天然表达的蛋白，且其中治疗效应可通过消除所述蛋白来实现。不期望的靶不一定均匀分布于血浆中，而是也可集中在特定区域，例如在肿瘤或炎症部位的周围。
靶的非限制性的实例是选自由以下组成的组的靶：过敏原、淀粉样蛋白、抗体、自身抗原、凝血因子、激素、肿瘤细胞、药物分子、细胞因子、趋化因子、蛋白酶、过敏性介质、促炎因子、毒素诸如细菌毒素和蛇毒；污染物、金属和抗氧化剂。
在一定条件下，诸如在某些癌症疾病中，期望除去内源性分子，例如，VEGF、PDGF、HGF和其他生长刺激激素。此类分子也可通过所述融合蛋白或缀合物中的结合功能被靶向。
在其他条件下，诸如在某些免疫性疾病中，可期望瞬时除去内源性分子，诸如选定的白细胞介素或TNF。此类分子也可通过所述融合蛋白或缀合物中的结合功能被靶向。
在一个实施方案中，具有所期望的生物学活性的第二个部分是治疗活性多肽。治疗活性多肽的非限制性实例是生物分子，诸如选自由以下组成的组的分子：酶，例如半乳糖苷酶(algasidase)α和β、葡糖脑苷脂酶、拉罗尼酶(laronidase)、芳香基硫酸酯酶、葡糖苷酶(aglucosidase)-α、天冬酰胺酶、因子VII、因子VIII、因子IX和因子Xa；激素和生长因子，例如生长激素、转化生长因子β2、促红细胞生成素、胰岛素、胰岛素样生长因子-1、肌肉生长抑制素、骨来源的生长因子和胰高血糖素样肽-1；趋化因子，例如CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL27、XCL1和CXC3CL1；和细胞因子，例如白介素(IL)-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-22、IL-27、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、肿瘤坏死因子、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞-CSF、粒细胞/巨噬细胞CSF。
如技术人员理解的，根据第一方面的FcRn结合多肽在融合蛋白中或作为任何其他部分的缀合物伴侣可以是有用的。因此，治疗活性多肽的以上列表不应该被解释为以任何方式进行限制。
还预期创造融合多肽或缀合物的其他可能性。因此，根据本发明的第一方面的FcRn结合多肽可共价偶合至第二或另外的一个或更多个部分，其除了靶结合以外或代替靶结合显示其他功能。一个实例是一种或更多种FcRn结合多肽和作为报告物或效应物部分的酶促活性多肽之间的融合。
关于掺入根据本公开内容的FcRn结合多肽的融合蛋白或缀合物的以上描述，应注意，第一、第二和另外的部分的指定是为清楚的原因而做出，以把一方面根据本公开内容的一种或更多种FcRn结合多肽和另一方面显示其他功能的部分区别开。这些指定不意图指不同结构域在融合蛋白或缀合物的多肽链中的实际顺序。因此，例如，所述第一部分可没有限制地出现在融合蛋白或缀合物的N-末端、中间、或C-末端。
在一个实施方案中，提供了FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，其与FcRn结合，使得IgG与FcRn的结合至少部分地被抑制。这种抑制可由于FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物与IgG对FcRn的相同、或至少部分地重叠的区域的结合。可选地，FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物可结合与IgG不同的FcRn的区域，但空间上阻碍IgG与FcRn的结合。因此，因为由于FcRn结合位点被根据本公开内容的FcRn结合多肽占据所以FcRn介导的IgG的再循环将完全或部分不可用，由于IgG的增加的溶酶体降解，从循环系统消除或清除IgG的速率将增加。换言之，根据本公开内容的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物或组合物的施用将起到增加循环IgG抗体的分解代谢的作用。
在一个实施方案中，FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物和FcRn之间的相互作用的KD值低于IgG和FcRn之间的相互作用的KD。这种关系可在pH 6.0和pH 7.4两者或在仅pH 6.0为真。
此外，以上方面包括这样的多肽，其中根据第一方面的FcRn结合多肽，或如包括在根据第二方面的融合蛋白或缀合物中的FcRn结合多肽，还包含标签，诸如选自由以下组成的组的标签：荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素和颗粒。此类标签可例如用于检测多肽。
在其他实施方案中，标记的FcRn结合多肽作为融合蛋白或缀合物中的部分存在，所述融合蛋白或缀合物还包含具有期望的生物学活性的第二部分和/或包含如以上所述的结合功能。标签可在某些情况下被偶合至仅FcRn结合多肽，且在某些情况下被偶合至FcRn结合多肽和缀合物或融合蛋白的第二部分两者。此外，标签可被偶合至仅第二部分而不偶合至FcRn结合部分也是可能的。因此，在又另一个实施方案中，提供了FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽包含第二部分，其中所述标签被偶合至仅所述第二部分。
当提及标记的多肽时，这应该理解为提及如本文描述的多肽的所有方面，包括包含FcRn结合多肽和第二部分及任选地另外的部分的融合蛋白和缀合物。因此，标记的多肽可包含仅所述FcRn结合多肽和例如可被螯合或共价偶合至所述FcRn结合多肽的治疗性放射性核素，或包含所述FcRn结合多肽、治疗性放射性核素和第二部分诸如具有期望的生物学活性，例如产生治疗效力的小分子。
在其中FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物是放射性标记的实施方案中，此类放射性标记的多肽可包含放射性核素。大多数放射性核素具有金属的性质，以离子形式被使用，并且通常不能与蛋白和肽中展示的元素形成稳定的共价键。出于这个原因，放射性金属对蛋白和肽的标记借助于螯合剂，即与金属离子形成称为螯合物的非共价化合物的多齿配体来进行。在所述FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物的一个实施方案中，放射性核素的掺入通过提供螯合环境来使得可行，通过该螯合环境该放射性核素可被配位、螯合或络合至所述多肽。
螯合剂的一个实例是聚氨基聚羧酸(polyaminopolycarboxylate)类型的螯合剂。两类这样的聚氨基聚羧酸螯合剂可被区分：大环螯合剂和无环螯合剂。
在一个实施方案中，所述FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物包括由经由半胱氨酸残基的硫醇基或赖氨酸残基的ε胺基缀合至所述FcRn结合多肽的聚氨基聚羧酸螯合剂提供的螯合环境。
用于铟、镓、钇、铋、放射性锕系元素(radioactinides)和放射性镧系元素(radiolanthanides)的放射性同位素的最常用的大环螯合剂是DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)的不同衍生物。在一个实施方案中，所述FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物的螯合环境由DOTA或其衍生物提供。更具体地，在一个实施方案中，由本公开内容所包括的螯合多肽通过使DOTA衍生物1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三-乙酸-10-马来酰亚胺乙基乙酰胺(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-tris-acetic acid-10-maleimidoethylacetamide)(马来酰亚胺单酰胺-DOTA(maleimidomonoamide-DOTA))与所述多肽反应来获得。
另外，1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)及其衍生物可用作螯合剂。因此，在一个实施方案中，提供了FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述聚氨基聚羧酸螯合剂是1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸或其衍生物。
最常用的非环状聚氨基聚羧酸螯合剂是DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)的不同衍生物。因此，具有由二亚乙基三胺五乙酸或其衍生物提供的螯合环境的多肽也被本公开内容所包括。
在另外的实施方案中，通过多核苷酸的表达重组产生或合成产生的FcRn结合多肽被缀合至一个或更多个合成的聚合物，以例如增加其流体动力学半径。聚乙二醇(PEG)通常用于此目的，但其他聚合物也已在本领域中被使用。此类“PEG化”可用于将本文所述任何类型的FcRn结合多肽的尺寸增加至高于有效肾排泄的阈值的尺寸。
在一个实施方案中，将合成聚合物缀合至一个或更多个化学合成的单体FcRn结合多肽。其他官能性也可被缀合至相同的合成聚合物。如果FcRn结合多肽和其他组分是化学合成的，这些组分没有一个将必须由生物系统制造，如果这不是期望的。
在一个优选的实施方案中，一种或更多种合成或生物学上制成的FcRn结合多肽被缀合至合成的聚合物，以实现超过与有效肾清除相关的尺寸并用于阻断IgG对FcRn的结合的尺寸。每个FcRn结合多肽中的独特的半胱氨酸可用于位点特异性缀合，例如为此目的引入的位于C末端的半胱氨酸。关于支链的合成聚合物，两个以上的FcRn结合部分可缀合至相同的聚合物，以增强亲合力，并因此增强阻断效力。
在本公开内容的第三方面，提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码如本文所述的FcRn结合多肽或融合蛋白。本公开内容还包括了，产生如以上描述的多肽或融合蛋白的方法，所述方法包括表达多核苷酸；表达载体，所述表达载体包含所述多核苷酸；和宿主细胞，所述宿主细胞包含该表达载体。
还包括了，产生多肽的方法，所述方法包括在容许所述多肽由其表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞，和分离所述多肽。
本公开内容的FcRn结合多肽可替代地使用具有保护的反应性侧链的氨基酸和/或氨基酸衍生物通过非生物肽合成来制备，所述非生物的肽合成包括
-将所述氨基酸和/或所述氨基酸衍生物逐步偶合以形成具有保护的反应性侧链的根据所述第一方面的多肽，
-从所述多肽的反应性侧链除去所述保护基团，和
-在水溶液中折叠所述多肽。
在本公开内容的第四方面，提供了组合物，所述组合物包含如本文所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。在其一个实施方案中，所述组合物还包含至少一种另外的活性剂，诸如至少两种另外的活性剂，诸如至少三种另外的活性剂。可证明在此类组合中有用的另外的活性剂的非限制性实例是免疫抑制剂、抗炎剂、抗微生物剂和酶。
在该方面的一个实施方案中，所述组合物适用于通过选自由以下组成的组的途径施用：口服施用、鼻内施用、肺部施用、阴道施用、直肠施用、静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射和皮内注射。
如本文所用，术语“全身施用”是指，施用此类感兴趣的物质进入循环系统使得整个身体受到影响的途径。本领域技术人员知道，全身施用可通过肠道施用(药物通过胃肠道吸收)或非肠道施用(通常注射、输注或植入)发生。
在一个实施方案中，所述组合物适于全身或局部施用。在某些实施方案中，可使用所述化合物的全身施用。在另一个实施方案中，所述组合物适于通过局部途径施用。例如，局部施用可以以软膏、糊剂、泡沫或霜剂是局部的。在另一个实施方案中，所述组合物适于跨内皮层或上皮层施用。这里，该组合物可跨越所述层胞吞转运。
在一个实施方案中，包含如本文所述的融合蛋白或缀合物的组合物的吸收速率高于相应于第二或另外的部分的多肽本身的吸收速率。在一个实施方案中，吸收速率比第二或另外的部分本身的吸收速率高至少2倍，诸如高至少5倍、诸如高至少10倍、诸如高至少25倍。
从以上公开内容应该理解，如本文所述的所述FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物或组合物，例如，可作为治疗剂，和/或作为用于延长融合伴侣的体内半衰期的手段，和/或作为用于增加不期望的靶的消除速率的手段是有用的。
因此，在本公开内容的第五方面，提供了如本文公开的FcRn结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，所述FcRn结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物用于作为药物的用途。
在本公开内容的相关的第六方面，提供了治疗需要其的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如本文公开的FcRn结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的步骤。
在这些后两个方面的任何一个的一个实施方案中，所述药物或方法意图用于其中利用所述FcRn结合多肽至少部分阻断IgG对FcRn的结合的能力的治疗，即其中IgG抗体的增加的分解代谢是期望的治疗。在一个实施方案中，其中此类治疗可被指示的状况是自身免疫性状况。作为指示的状况的非限制性实例，提到重症肌无力、格林-巴利综合征、自身免疫性边缘叶脑炎(autoimmune limbic encephalitis)、链球菌感染相关的儿童自身免疫性神经精神紊乱(PANDAS)、神经性肌强直(艾萨克氏综合征)、莫旺综合征(morvan syndrome)、多发性硬化、寻常天疱疮、落叶型天疱疮(foliaceus)、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、妊娠性类天疱疮、粘膜类天疱疮、硬化性苔藓、抗磷脂综合征、复发性多软骨炎、自身免疫性贫血、特发性血小板减少性紫癜(idiopathic trombocytic purpura)、自身免疫性格雷夫斯病(autoimmune Grave’s disease)、扩张型心肌病、血管炎、肺出血肾炎综合征、特发性膜性肾病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
在另一个实施方案中，提供了如本文所述的FcRn结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，所述FcRn结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物用于从循环阻断或除去不期望的靶的用途。在一个实施方案中，所述不期望的靶选自包含以下的组：过敏原、淀粉样蛋白、抗体、自身抗原、凝血因子、激素、肿瘤细胞、药物分子、细胞因子、趋化因子、过敏介质、促炎因子、毒素诸如细菌毒素和蛇毒、污染物、金属和抗氧化剂。
尽管本发明已关于各种示例性方面和实施方案被描述，但本领域技术人员将理解，可做出各种改变，且等同物可代替其要素而不偏离本发明的范围。另外，可对本发明的教导做出许多修改以适应特定的情况或分子而不偏离其实质范围。因此，意图是，本发明不限于涵盖的任何特定的实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求书的范围内的所有实施方案。
附图简述
图1是以下的氨基酸序列的列表：本发明的FcRn结合多肽中包含的FcRn结合基序的实例(SEQ ID NO:1-353)、根据本公开内容的49-mer FcRn结合多肽的实例(SEQ ID NO:354-706)、根据本公开内容的58-mer FcRn结合多肽的实例(SEQ ID NO:707-1062)以及白蛋白结合多肽变体PP013的氨基酸序列(SEQ ID NO:1063)、Taq聚合酶结合Z变体Z03638(SEQ ID NO:1064)、人αFcRn(SEQ ID NO:1065)、鼠αFcRn(SEQ ID NO:1070)、人β2-微球蛋白(SEQ ID NO:1066)、鼠β2-微球蛋白(SEQ ID NO:1067)、当在人FcRn-eGFP中时的人αFcRn(SEQ ID NO:1068)、当在鼠FcRn-eGFP中时的鼠αFcRn(SEQ ID NO:1069)。
图2A-2E示出了如实施例3中所述，对于His6-标记的Z变体和对于IgG在pH 6.0对人FcRn的结合，以及在pH 6.0和7.4的解离。示出了对于(A)Z07918(SEQ ID NO:707)、(B)Z07960(SEQ ID NO:710)、(C)Z10109(SEQ ID NO:709)、(D)Z10193(SEQ ID NO:708)和(E)IgG的表示在pH 6.0注射随后在pH 6.0解离(实线)以及在pH 6.0注射随后在pH 7.4解离(虚线)的从Biacore仪器获得的传感图的叠置。
图3示出了如实施例4中所述，来自FcRn结合Z变体对人(上图)和小鼠(下图)FcRn-eGFP HeLa细胞的结合的流式细胞术分析的点状图。由于FcRn-eGFP被HeLa细胞的异源表达，根据FcRn-eGFP表达水平对细胞进行门控。门控H中的细胞被认为是FcRn-eGFP阴性的，且门控I中的细胞认为是阳性的。与Alexa647标记的Z变体孵育导致对于Alexa647和eGFP两者阳性的群体，而与缓冲液(缓冲液对照)孵育则没有。该图示出了，三种变体Z07960(SEQID NO:710)、Z07930(SEQ ID NO:712)和Z07918(SEQ ID NO:707)结合人FcRn和小鼠FcRn。y-轴示出Alexa647强度，且x-轴示出eGFP活性。
图4示出了，在实施例4中所述的细胞结合测定中测量的Alexa647标记的Z07960(SEQ ID NO:710)、Z07930(SEQ ID NO:712)和Z07918(SEQ ID NO:707)的平均荧光强度(MFI)值。图(A)示出了来自用人FcRn-eGFP转导的HeLa细胞的MFI，且图(B)示出了来自用小鼠FcRn-eGFP转导的HeLa细胞的MFI。
图5示出了如实施例5中所述，来自人或小鼠IgG Alexa647结合人(上图)和小鼠(下图)FcRn-eGFP HeLa细胞的流式细胞术分析的点状图。由于FcRn-eGFP被HeLa细胞的异源表达，根据在该细胞表面上的FcRn-eGFP的丰度对细胞进行门控。门控M中的细胞被认为是FcRn-eGFP阴性的，且门控N中的细胞被认为是阳性的。100nM人或小鼠IgG-Alexa647对FcRn转导的HeLa细胞的结合在左图中示出(0nM)。该图示出了，IgG结合被His6-标记的Z07918(SEQ ID NO:707)以剂量依赖的方式(1nM、10nM、100nM和1000nM)阻断。y-轴示出Alexa647强度，且x-轴示出eGFP活性。
图6示出了如实施例5中所述，在(A)人FcRn-eGFP转导的HeLa细胞和(B)小鼠FcRn-eGFP转导的HeLa细胞上在不同浓度的His6-标记的Z07918(SEQ ID NO:707)的存在下IgGAlexa647的FcRn结合产生的平均荧光强度(MFI)值。该图示出了IgG-FcRn结合由Z变体的剂量依赖性阻断。
图7A-7C示出了如实施例6中所述，使用Biacore仪器，三种Z变体在pH 6.0对人FcRn的结合的动力学。浓度系列的分别与白蛋白结合多肽PP013(SEQ ID NO:1063)融合的(A)Z11948(SEQ ID NO:1060)、(B)Z11946(SEQ ID NO:1061)和(C)Z11947(SEQ ID NO:1062)和对照Z变体分子Z03638(SEQ ID NO:1064；非特异于FcRn)的传感图被示出。来自640nM(短划线)、160nM(点划线)和40nM(灰色实线)的曲线使用Langmuir 1:1结合模型经历动力学分析。动力学参数和亲和力从拟合曲线(黑色实线)来计算并在表5中示出。
图8示出了，如实施例6中所述获得的与白蛋白结合多肽PP013融合的三种FcRn结合Z变体的药代动力学谱。Z变体Z11947(SEQ ID NO:1062，空心正方形)、Z11946(SEQID NO:1061，空心三角形)和Z11948(SEQID NO:1060，空心菱形)与阴性对照PP013-Z03638(空心圆形)比较都显示延长的半衰期。
图9示出了，如实施例10中所述测定的分别由His6-Z07918(SEQ ID NO:707；实心圆)、IVIg(灰色正方形)和SCIg(灰色三角形)对人IgG与人FcRn的阻断。
图10示出了，小鼠中以FcRn特异性Z变体阻断IgG-FcRn相互作用导致IgG的水平降低。如实施例11中进一步所述，小鼠用媒介物(+)、ABD融合的Z变体Z07918-PP013(空心正方形)和Z11948(SEQ ID NO:1060；实心圆)的每日注射五次来处理。内源性IgG的浓度通过ELISA来测量。在单独的小鼠中在24h、72h、120h和168h时的IgG浓度与在0h时的水平相关，并且结果因此表示为在0h时的IgG的百分比。
实施例
概述
以下实施例公开了靶向新生Fc受体(FcRn)的新颖Z变体分子的开发。Z变体使用噬菌体展示技术来获得。将编码本文所述的FcRn结合多肽的基因测序，并且将相应氨基酸序列在图1中列出，并由标识符SEQ ID NO:707-1059所示。另外，这些选定的结合变体的推导的结合基序在图1中以序列标识符SEQ ID NO:1-353列出。
实施例1
人αFcRn和人β2微球蛋白(B2M)的产生
在该实施例中，人αFcRn的胞外域(ECD)(SEQ ID NO:1065)与人β2-微球蛋白(SEQID NO:1066)复合体(复合体表示为FcRn)，和以非复合的形式的人β2微球蛋白(表示为B2M)被产生作为可溶性蛋白。在本实施例中产生的人FcRn和B2M用于实施例2和3中的噬菌体选择、ELISA和Biacore测定。
材料和方法
用于共表达使用的包含人αFcRn和人β2-微球蛋白的基因的质粒的构建：编码人αFcRn(Genbank BC008734.2)和人β2-微球蛋白(B2M)(Genbank BC032589.1)的基因从OpenBiosystems获得。使用PCR重叠延伸，编码人αFcRn(αFcRnECD)(SEQ ID NO:1065)的氨基酸24-290的基因片段被扩增至由attB1-位点/Kozak序列随后是编码以下的基因组成的构建体：Igκ链前导序列、hFcRnECD、GS-接头和flag标签，随后是attB2位点。制备包含编码人B2M(SEQ ID NO:1066)的氨基酸21-119的基因片段的相似构建体，不同之处是His6标签代替flag标签。根据制造商的推荐将构建体使用Gateway系统(Invitrogen，目录号11789020,
Figure GDA0000971267280000351
BP
Figure GDA0000971267280000352
II酶混合物)通过重组插入质粒pDONOR221(Invitrogen，目录号12536-017)。验证正确的序列后，将人αFcRnECD构建体连同包含启动子的质粒pENTR-CMV(Tai等人(2012)PLoS One 7(9):e46269)使用多位点gateway克隆一起插入2K7bsd(Suter等人(2006)Stem Cells 24:615–623)，产生载体2K7bsd-CMV-hFcRnECD。将人B2M基因构建体类似地插入2K7neo(Suter等人，同上)，产生载体2K7neo-CMV-hB2M。
细胞培养、重组慢病毒载体的制备和基因插入进SKOV-3细胞系：HEK293T和SKOV-3细胞系从ATCC获得。细胞在5％CO2的存在下在37℃下生长在加湿培养箱中。用于HEK293T细胞系的完全培养基是补充有10％胎牛血清(FBS)、1％抗生素抗真菌溶液(AA)和1％MEM非必需氨基酸溶液(NEAA)的Dulbeccos修改的eagle培养基(DMEM)。用于SKOV-3细胞系的完全培养基是补充有10％FBS和1％AA的McCoy’s 5A培养基。
将质粒2K7bsd-CMV-hFcRnECD和2K7neo-CMV-hB2M使用氯化钙转染分别地连同VSV-G包膜和gag/pol包装质粒一起共转染进HEK293T细胞(Zufferey等人(1997)Nat Biotechnol15(9):871-5；Jakobsson等人(2006)J Neurosci Res 84:58-67)。包含分别与人αFcRnECD和人B2M转基因形成的慢病毒颗粒的HEK293培养物上清液通过离心和过滤从细胞碎片澄清。该两种类型的慢病毒颗粒被用于顺序转导SKOV-3细胞。通过将杀稻瘟菌素(Invitrogen)和G418硫酸盐(Invitrogen)加入至培养基同时将细胞传代两周，选择包含人αFcRnECD和B2M基因两者的成功双重整合体。所得的稳定转导的SKOV-3细胞系表示为SKOV-3hFcRnECD/hB2M。
重组人FcRn的表达：将共表达人αFcRnECD和B2M，产生人FcRn的SKOV-3细胞增殖，并且在HYPERFlask(Corning)中将1.5x 107个细胞接种在560ml完全生长培养基中。五天后，当细胞已贴壁并繁殖时，将培养基更换为无FBS的完全生长培养基。五天后，将培养终止，并收集上清液，通过45μm过滤器，并冷冻于-80℃。
使用人IgG色谱纯化重组人FcRn：蛋白纯化在
Figure GDA0000971267280000361
Explorer系统(GEHealthcare)中进行。1ml人IgG(Pharmacia)以在0.2M NaHCO3、0.5M NaCl pH 8.3中10mg/ml的浓度根据制造商的说明被偶合至1ml HiTrap NHS-激活的HP柱(GE Healthcare)。将来自SKOV-3细胞的包含重组人FcRn的上清液解冻，并且将pH用HCl调整至5.8。上清液随后以100ml的分批装载到预先用20mM的Bis-Tris pH 5.8平衡的柱子上。该柱用20ml的20mM的Bis-Tris pH 5.8洗涤，并使用50mM Tris，pH 8.1以1ml的级分洗脱。缓冲液更换为PBS(磷酸盐缓冲的盐水，10mM磷酸盐、137mM NaCl、2.68mM KCl，pH 7.4)使用透析来进行。
SDS-PAGE和蛋白印迹：从蛋白纯化洗脱的级分的纯度通过SDS-PAGE和GelCode蓝染色试剂(Pierce)和
Figure GDA0000971267280000371
银染试剂盒(Invitrogen)染色进行分析。蛋白印迹使用Amersham HybondTM-C Extra硝酸纤维素膜(GE Healthcare)来进行。将膜用TBS+T(50mMTrizma碱、150mM NaCl、0.05％吐温-20,pH 8)中5％脱脂奶粉(Semper)封闭1小时，然后用TBS+T中以0.15μg/ml的浓度的兔抗FCGRT多克隆抗体(Atlas Antibodies)和以0.23μg/ml的浓度的兔抗B2M多克隆抗体(Atlas Antibodies)的混合物来探测。该膜随后与以1:10,000稀释于TBS+T的缀合了辣根过氧化物酶的稳定的山羊抗兔抗体(Pierce)孵育。加入TMB底物(Pierce)后，膜的图像在Amersham Hyperfilm ECL(GE Healthcare)上获得。使用GBX显影剂和GBX定影剂(Sigma-Aldrich)处理该Hyperfilm。
人B2M的非络合的形式的产生：人B2M在大肠杆菌(E.coli)中产生。表达和纯化基本上如以下所述来进行：Sandalova等人(2005)Acta Chryst F61:1090-1093和
Figure GDA0000971267280000372
等人(2001)J Immunol 166:7327-7334。使尿素中的由人B2M的氨基酸21-119组成的纯化的蛋白经历精氨酸重折叠如下；将0.5mg的B2M迅速加入至2ml重折叠缓冲液(20ml 1M Tris-HCl pH 8.0、16.87g L-精氨酸(用HCl缓冲的)、0.8ml 0.5M EDTA、61mgGSSG、307mg GSH和milli-Q水至200ml的终体积，pH 8.0，并补充有蛋白酶抑制剂(Roche，目录号11 873 580 001))。重折叠过程在4℃下在4小时期间进行。使用PD-10柱(GEHealthcare)将重折叠的B2M蛋白缓冲液更换为PBS。
结果
用于共表达使用的包含人αFcRn和人β2-微球蛋白的基因的质粒的构建：将编码人FcRn的α-链的胞外域(αFcRnECD)和人B2M的基因分别插入慢病毒转移质粒2K7bsd和2K7neo中。在这两种情况下，该被插入的基因是在CMV启动子的控制下。该基因被延长，使所得的蛋白将具有在N-末端的Igκ链前导序列，以靶向蛋白用于通过内质网输出至培养基(信号序列在分泌后被切割)。另外，αFcRnECD具有C-末端间隔区序列、随后是用于电位检测的FLAG标签。人B2M具有C-末端间隔区序列、随后是用于电位检测的His6标签。将间隔区序列加入以增强标签的可及性。慢病毒转移质粒还包含两种不同的抗生素抗性基因，以允许选择其中两种构建体已被插入的细胞。
重组人FcRn的表达和纯化：将编码αFcRnECD和B2M的基因通过慢病毒插入SKOV-3的基因组，并且所得的FcRn蛋白被分泌进培养基中。为了仅捕获具有保留的pH依赖型IgG结合的FcRn，使用固定化的IgG的亲和层析被使用，其中受体在pH 5.8被捕获且在pH 8.1被洗脱。以三种级分洗脱捕获的蛋白。
SDS-PAGE和蛋白印迹：为了研究所产生的FcRn蛋白的两条肽链(αFcRnECD和B2M)的存在，并且为了分析洗脱的材料的纯度，对所洗脱的级分进行SDS-PAGE分析。对于用GelCode蓝染料染色的凝胶，检测分别具有12kDa和36kDa的分子量的两个条带。这约相应于B2M的12kDa和αFcRnECD的31kDa的非糖基化的肽链的理论分子量。该蛋白的αFcRnECD部分包含一个糖基化位点，并因此，预期其分子质量将高于31kDa。凝胶还被银染色以提高灵敏度，并可能检测杂质。约66kDa的条带在第一洗脱级分中被检测到，其可相应于起源于细胞附着的BSA(牛血清白蛋白)。在级分2和3中回收的蛋白的总量相应于1.4mg/l培养基。对混合的材料进行蛋白印迹分析，其基本仅显示两条主要的条带和另外可相应于降解产物的低于12kDa的非常弱的条带。
实施例2
FcRn结合Z变体的选择和ELISA结合
在该实施例中，使用人FcRn作为在使用Z变体的噬菌体文库的噬菌体展示选择中的靶。选定的克隆被DNA测序，在大肠杆菌周质级分中产生并针对FcRn在ELISA(酶联免疫吸附测定)中测定。
材料和方法
靶蛋白FcRn和B2M的生物素化：如实施例1中所述产生的人FcRn和人B2M，根据制造商的推荐使用无重量EZ-连接磺酸基-NHS-LC-生物素(No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)(Pierce，目录号21327)分别以31x(FcRn)和10x(B2M)摩尔过量来生物素化。该反应在室温(RT)进行30min。随后缓冲液更换为PBS根据制造商的说明，使用Slide-a-lyzer透析盒(FcRn；Pierce，目录号66380,10,000 MWCO和B2M；Pierce，目录号66333,3,500 MWCO)来进行。
FcRn结合Z变体的噬菌体展示选择：基本如
Figure GDA0000971267280000392
等人(2007)J Biotechnol,128:162-183所述，构建在噬菌粒pAY02592中，展示在噬菌体上的蛋白Z的随机变体的文库，被用于选择FcRn结合Z变体。在该文库中，使用白蛋白结合域(ABD，来自链球菌(Streptococcus)菌株G148的G蛋白的GA3)作为该Z变体的融合伴侣。该文库被表示为Zlib006Naive.II并具有1.5x 1010个文库成员(Z变体)的大小。将来自包含噬菌粒文库Zlib006Naive.II的甘油储备液的大肠杆菌RRIΔM15细胞(Rüther等人，(1982)NucleicAcids Res 10:5765-5772)，接种在20l的补充有100μg/ml氨苄青霉素的限定的不含脯氨酸的培养基[磷酸氢二钾7g/l、柠檬酸三钠二水合物1g/l、尿嘧啶0.02g/l、YNB(DifcoTM酵母氮源基础w/o氨基酸，Becton Dickinson)6.7g/l、水合葡萄糖5.5g/l、L-丙氨酸0.3g/l、L-精氨酸单盐酸盐0.24g/l、L-天冬酰胺一水合物0.11g/l、L-半胱氨酸0.1g/l、L-谷氨酸0.3g/l、L-谷氨酰胺0.1g/l、甘氨酸0.2g/l、L-组氨酸0.05g/l、L-异亮氨酸0.1g/l、L-亮氨酸0.1g/l、L-赖氨酸单盐酸盐0.25g/l、L-甲硫氨酸0.1g/l、L-苯丙氨酸0.2g/l、L-丝氨酸0.3g/l、L-苏氨酸0.2g/l、L-色氨酸0.1g/l、L-酪氨酸0.05g/l、L-缬氨酸0.1g/l]。该培养物在发酵罐(Belach Bioteknik,BR20)中在37℃生长。当细胞达到0.75的600nm(OD600)处的光密度时，约2.6l的培养物使用10x摩尔过量的M13K07辅助噬菌体(New England Biolabs，目录号N0315S)来感染。将细胞孵育30分钟，届时发酵罐用补充有100μM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)用于诱导表达和25μg/ml卡那霉素和12.5μg/ml羧苄青霉素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉汤-酵母提取物；30g/l TSB、5g/l酵母提取物)填充至20l并在30℃生长22h。将培养中的细胞通过以15,900g离心来沉淀。该噬菌体颗粒从上清以PEG/NaCl(聚乙二醇/氯化钠)沉淀两次，过滤并溶解在PBS和甘油中，如
Figure GDA0000971267280000391
等人，同上中所述。将噬菌体储备液在使用前储存于-80℃。
针对生物素化的人FcRn的选择在四个循环中分成两个不同的轨道(track)来进行。噬菌体储备液制备和选择程序基本如WO2009/077175中对另一种生物素化的靶的选择所述的来进行。选择循环之间的噬菌体的扩增通过以噬菌体感染大肠杆菌RRIΔM15，然后在溶液中进行如下培养来进行。洗脱的噬菌体和与细菌比较10×过量的M13K07辅助噬菌体被允许在37℃同时感染对数生长期的细菌30min而无旋转，随后是30min伴随缓慢旋转。在感染前，细菌在以上所述限定的不含脯氨酸的培养基中生长至对数生长期。感染的细菌通过以4,300g离心10min来沉淀，并重悬于200ml补充有0.1mM IPTG、25μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB+YE培养基中，并且在30℃培养过夜用于噬菌体产生。
选择缓冲液由100mM磷酸钠和150mM氯化钠组成，用盐酸调整至pH 5.5，并补充有0.1％明胶和0.1％吐温-20。选择时，将人血清白蛋白(HSA,Albucult,Novozymes)加入选择缓冲液至1.5μM的终浓度。为了减少背景结合物(binders)的量，预选择通过将噬菌体储备液与
Figure GDA0000971267280000401
M-280链霉亲和素(SA-beads,Dynal，目录号112.06)在RT孵育1小时来进行。第二预选择在免疫管(Nunc，目录号444474)中在RT针对人B2M固定化30min期间来进行。碳酸盐缓冲液(Sigma，目录号068K8214)中5μg/ml的人B2M在7℃在管中固定化>1h。用自来水洗涤两次后，将管用PBS+0.5％酪蛋白(Sigma，目录号C8654)在RT封闭30min，然后使用。选择中使用的所有管和珠以PBS+0.1％明胶来预封闭。选择在RT在溶液中进行，随后在SA-珠上捕获靶-噬菌体复合物，其中每2.9μg生物素化的FcRn使用1mg珠。在这些选择的循环1中，使用100nM生物素化的FcRn，并且各自两分钟的两次洗涤使用选择缓冲液来进行。增加的严格性，使用降低的靶浓度和增加的洗涤次数，在随后的循环中来应用：50nM/5次洗涤、25nM/8次洗涤和10nM/12次洗涤分别在循环2、3和4中应用。在洗涤后，结合的噬菌体从两个选择轨道使用以下两种不同程序来洗脱；1)500μl 0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.2，随后立即用50μl 1M Tris-HCl，pH 8.0，和450μl PBS中和，或；2)500μl的100mM磷酸钠和150mM氯化钠，pH 8.0并用500μl PBS中和。
测序：PCR片段从单菌落使用标准PCR程序和以下引物来扩增：AFFI-21(5’-tgcttccggctcgtatgttgtgtg(SEQ ID NO:1071))和AFFI-22(5’-cggaaccagagccaccaccgg(SEQ ID NO:1072))。扩增的片段的测序使用生物素化的寡核苷酸AFFI-72(5’-生物素-cggaaccagagccaccaccgg(SEQ ID NO:1073))和根据制造商的方案使用的
Figure GDA0000971267280000411
Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)来进行。该测序反应物通过使用Magnatrix 8000(Magnetic Biosolution)结合至磁性链霉亲和素包覆的珠(DetachStreptavidin Beads，Nordiag,目录号2012-01)来纯化，并在ABI
Figure GDA0000971267280000412
3130xl遗传分析仪(PE Applied Biosystems)上进行分析。
用于ELISA的Z变体的产生：测序的Z变体通过将来自选择的单菌落接种进10ml补充有100μg/ml氨苄青霉素和0.1mM IPTG的TSB-YE培养基中，并在37℃孵育24h来产生。将细胞通过离心沉淀，重悬于2ml的PBST(补充有0.05％吐温-20的PBS)中，冷冻在-80℃并在水浴中解冻，以释放细胞的周质级分。冻融过程重复七次并且细胞然后通过离心沉淀。周质提取物的上清液包含作为与ABD的融合的Z变体，表示为AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG(
Figure GDA0000971267280000413
等人，同上)。Z#####是指单独的58个氨基酸残基Z变体。
Z变体的ELISA KD分析：Z变体与FcRn的结合以ELISA测定来分析。半区96孔ELISA板在4℃用2μg/ml以涂覆缓冲液(50mM碳酸钠，pH 9.6)稀释的抗ABD山羊抗体(内部产生的)涂覆过夜。将抗体溶液倾出，并且孔用100μl的PBSC(补充有0.5％酪蛋白的PBS)在RT封闭1.5h。将封闭溶液弃去并且将以1:4稀释的50μl周质溶液加入至孔中，并在RT在缓慢震摇下孵育1.5h。将溶液倾出并且将孔用0.05％PCT缓冲液,pH 6.0(补充有0.05％吐温-20的McIlvaines磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0)或0.05％PCT缓冲液，pH 7.4(补充有0.05％吐温-20的McIlvaines磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 7.4)洗涤四次。将靶蛋白生物素化的人FcRn以分别在PCC缓冲液，pH 6.0或pH 7.4，(补充有0.5％酪蛋白的McIlvaines磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0或pH 7.4)中稀释的1:3稀释的从2μg/ml(45nM)至0.3ng/ml(6.9pM)的浓度系列加入至孔中。将板在RT孵育1.5h，随后是如以上所述的洗涤。链霉亲和素缀合的HRP(Thermo Scientific，目录号N100)分别以PCC缓冲液，pH 6.0或pH 7.4，1:30 000稀释，并加入至孔，随后孵育45min。如以上所述洗涤后，将50μl ImmunoPure TMB底物(ThermoScientific，目录号34021)加入至孔中，并将板根据制造商的推荐进行处理。吸光度使用多孔板阅读器Victor3(Perkin Elmer)在450nm处来测量。使用结合无关蛋白的Z变体作为阴性对照，且空白物通过省略周质步骤来创建。使用在预实验中与FcRn结合的Z变体(Z07918，SEQ ID NO:707)作为阳性对照。测量的值使用GraphPad Prism 5(GraphPad软件，LaJolla,CA,USA)和非线性回归来分析，以便确定相互作用的亲和力(KD)。
Z变体的ELISA特异性分析：在另一个ELISA实验中，Z变体的特异性通过分别针对2μg/ml生物素化的人蛋白B2M、PSMA(在内部产生的)和IgG(多克隆的，Pharmacia，Sweden)和针对PCC缓冲液pH 6.0或pH 7.4测定它们来测试。测定分别在pH 6.0和pH 7.4如以上所述来进行。将生物素化的蛋白或缓冲液加入至孔代替在靶蛋白步骤中的FcRn。
结果
FcRn结合Z变体的噬菌体展示选择：单独的克隆在针对生物素化的人FcRn的四个循环的噬菌体展示选择后获得。
测序：对从第四轮选择随机挑选的克隆进行测序。每个Z变体被赋予了唯一的标识号#####且单独的变体被称为Z#####。58个氨基酸残基长Z变体的氨基酸序列在图1中作为SEQ ID NO:707-722和SEQ ID NO:1059列出。
这些Z变体的推导的FcRn结合基序在图1中作为SEQ ID NO:1-16和SEQ ID NO:353列出。预测构成这些Z变体的每个内的完整三螺旋束的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列在图1中作为SEQ ID NO:354-369和SEQ ID NO:706列出。
Z变体的ELISA测定：十六种克隆被产生作为在大肠杆菌中的ABD融合蛋白。在针对人FcRn的稀释系列的ELISA中使用周质级分。这些克隆是：Z07909(SEQ ID NO:719)、Z07918(SEQ ID NO:707)、Z07930(SEQ ID NO:712)、Z07960(SEQ ID NO:710)、Z10109(SEQ ID NO:709)、Z10111(SEQ ID NO:714)、Z10127(SEQ ID NO:718)、Z10129(SEQ ID NO:715)、Z10140(SEQ ID NO:711)、Z10141(SEQ ID NO:716)、Z10145(SEQ ID NO:721)、Z10152(SEQ ID NO:720)、Z10156(SEQ ID NO:717)、Z10161(SEQ ID NO:722)、Z10183(SEQ ID NO:713)和Z10193(SEQ ID NO:708)。对于所有变体在pH 6.0且在pH 7.4对于三种变体确定KD值(表1)。对于十三种变体，未获得关于在pH 7.4的KD分析的数据。当针对人B2M、IgG或PSMA测定时，十六种变体没有一种显示非特异性结合。
表1.大肠杆菌周质级分中Z-ABD变体的ELISA KD分析。
Figure GDA0000971267280000431
n.d.＝无法确定
实施例3
FcRn结合Z变体的产生和表征
在该实施例中，十七种Z变体在大肠杆菌中产生，纯化并在Biacore中针对人FcRn进行测定。所述变体的子集还针对小鼠FcRn进行测定。对Z变体的子集进行圆二色性(CD)光谱用于研究它们的二级结构。
材料和方法
Z变体的亚克隆：十七种FcRn结合Z变体的DNA(SEQ ID NO:707-722和SEQ ID NO:1059)从文库载体pAY02592来扩增。用于构建具有N-末端His6标签的单体Z变体分子的亚克隆策略使用标准分子生物学技术(基本如WO2009/077175中对结合另一种靶的Z变体详细描述的)进行应用。将Z基因片段亚克隆进表达载体pAY01448，产生编码的序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD。
另外，FcRn结合变体Z07918(SEQ ID NO:707)，但以氨基酸AE代替VD开始，并表示为Z11948(SEQ ID NO:1060)，被克隆作为具有Z变体之间的两种不同的接头并随后是C-末端His6标签的同二聚体构建体。这使用常规的分子生物学方法，包括DNA扩增，用合适的限制性内切酶的限制性内切和DNA的连接来进行。两个接头从Thermo Fisher Scientific获得。将Z基因片段亚克隆进表达载体(pET-26起源，Novagen)，分别产生编码的序列[Z#####]-GT-(G4S)-PR-[Z#####]-LEHHHHHH和[Z#####]-GT-(G4S)3-[Z#####]-LEHHHHHH。
培养和纯化：大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)用包含每个各自FcRn结合Z变体的基因片段的质粒来转化，并在37℃在800ml或1000ml补充有50μg/ml卡那霉素的TSB-YE培养基中来培养。在OD600＝2时，将IPTG以0.17mM或0.2mM的终浓度加入以诱导表达，并且该培养物在37℃孵育另外的5h。将细胞通过离心收获。
将约2-5g的每种细胞沉淀重悬于10-25ml补充有15U/ml的浓度的
Figure GDA0000971267280000441
(Merck，目录号1.01654.0001)和0.5mg/ml的浓度的溶菌酶(Sigma，目录号L-7651)的结合缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、20mM咪唑，pH 7.4)中。通过三个冻融循环或超声处理的细胞破碎后，细胞碎片通过离心除去，并且将每种上清液应用于1ml His GraviTrap IMAC柱(GE Healthcare，目录号11-0033-99)。污染物通过用洗涤缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、20mM或60mM咪唑，pH 7.4)来洗涤，且FcRn结合Z变体随后用洗脱缓冲液1(20mM磷酸钠、0.5M氯化钠，250mM咪唑，pH 7.4)，或洗脱缓冲液2(0.1M乙酸、0.5M氯化钠，pH 4.5)来洗脱。纯化的Z变体根据制造商的方案使用PD-10柱(GE Healthcare)以PBS进行缓冲液更换。蛋白浓度使用
Figure GDA0000971267280000451
ND-1000分光光度计通过测量在280nm处的吸光度，并使用各自蛋白的消光系数来确定。FcRn结合Z变体的纯度通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE来分析。每种纯化的FcRn结合Z变体的身份使用LC/MS分析来证实。
CD分析：将纯化的His6标记的Z变体以PBS稀释至0.5mg/ml。对于每种稀释的Z变体，在250-195nm或250-190nm处的CD光谱在20℃来获得。另外，进行可变温度测量(VTM)，以确定解链温度(Tm)。在VTM中，在221nm处测量吸光度，同时温度以5℃/min的温度斜率从20提高至90℃。新CD光谱在加热程序后在20℃获得，以研究Z变体的重折叠能力。CD测量使用具有1mm的光路长度的小室在Jasco J-810分光偏振计(Jasco Scandinavia AB)上来进行。
Biacore结合与动力学分析：FcRn结合His6-标记的Z变体与人FcRn的相互作用在Biacore 2000仪器(GE Healthcare)中来分析。人FcRn在流通池中被固定在CM5芯片表面(GE Healthcare)上的羧化的葡聚糖层上。固定根据制造商的方案使用胺偶合化学，并使用HBS-EP(GE Healthcare)作为运行缓冲液来进行。在分析物注射期间芯片上一个流通池被激活并失活用于用作空白。在下列提出的两个结合实验中，使用补充有0.005％吐温-20的McIlvaines磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH 6.0(0.005％PCT)作为运行缓冲液。在所有实验中，使用50μl/min的流速。
在一个实验中，将在pH 6.0解离与在pH 7.4解离进行比较。His6-标记的Z变体和人单克隆IgG1以运行缓冲液分别稀释至250nM或2.5nM的终浓度，并且使用共注射程序来注射在FcRn芯片上持续1分钟。代表相互作用的解离阶段的共注射程序的第二注射包含运行缓冲液(pH 6.0)或0.005％PCT pH 7.4。允许Z变体解离1分钟，除了Z07918和Z10193以外，其允许解离4分钟，然后在运行缓冲液中表面平衡5分钟期间。允许IgG解离4分钟，然后平衡。缓冲液注射以相似的方式来进行；缓冲液pH 6.0随后是pH 6.0的共注射，或缓冲液pH6.0随后是pH 7.4的共注射。结果以BiaEvaluation软件4.1(GE Healthcare)来分析。从配体表面的曲线减去空白表面的曲线。另外，从Z变体曲线和从IgG曲线减去缓冲液注射的曲线，以对缓冲液效应调整。
在另一个实验中，对His6标记的Z变体的子集确定近似动力学常数(kon和koff)和亲和力(KD)被。三种浓度的Z变体被注射1分钟，随后在运行缓冲液中解离1分钟。表面用运行缓冲液平衡7.5分钟期间，然后开始下一个循环。注射的浓度是675nM、225nM和75nM(Z10140、Z10156和Z10183)或225nM、75nM和25nM(Z07918和Z10193)。动力学常数使用BiaEvaluation软件4.1(GE Healthcare)的Langmuir 1:1模型从传感图来计算。
在单独的实验中，Z变体分别与hFcRn(SEQ ID NO:1065)和mFcRn(SEQ ID NO:1070)的相互作用的亲和力在pH 6.0和pH 7.4两者在Biacore 3000仪器(GE Healthcare)上来测量。hFcRn和mFcRn基本如实施例1中所述来产生，但使用小鼠3T3细胞代替人SKOV-3细胞用于产生mFcRn，并固定化在pH 4.65的乙酸盐缓冲液中的CM5芯片上的单独的流通池上。对于两种受体，固定化水平为约1000RU。参考流通池通过激活和失活来创建。使用0.005％PCT pH 6.0或7.4作为运行缓冲液并用于稀释分析物。在25℃进行所有分析。His6-标记的Z变体Z07918(SEQ ID NO:707)、Z07960(SEQ ID NO:710)和Z10193(SEQ ID NO:708)的亲和常数通过注射从1024nM至0.5nM(pH 6.0)或从10240nM至5nM(pH 7.4)的稀释系列来确定。亲和力使用GraphPad Prism 5软件，使用单点结合饱和模型来推导。
AlphaLISA阻断测定：Z变体抑制IgG与FcRn的结合的潜力用EnSpire多板阅读器2300(Perkin Elmer)在AlphaLISA测定中来分析。将人IgG(Roactemra)根据制造商的推荐固定化在AlphaLISA受体珠(Perkin Elmer，目录号6772002)上。1:3逐步系列稀释His标记的Z变体至250nM至38pM的终浓度在384孔板(Perkin Elmer，目录号G6005350)中进行，并与10nM生物素化的人FcRn(Biorbyt，目录号orb84388；基本如实施例2中所述进行生物素化)在使用HCl调整至pH 6.0的AlphaLISA缓冲液(Perkin Elmer，目录号AL000F)中孵育45min。将IgG包覆的受体珠以10μM的终浓度加入，并孵育45min。最后，将链霉亲和素包覆的供体珠(Perkin Elmer，目录号6772002)以40μg/ml的终浓度加入，并孵育30min。所有孵育在RT在黑暗中进行。该板在EnSpire仪器中进行分析，并且IC50值使用GraphPad Prism 5来计算。
结果
培养和纯化：十七种构建为带有N-末端His6标签的FcRn结合Z变体(SEQ ID NO:707-722和SEQ ID NO:1059)，在大肠杆菌中产生。来自约2-5g细菌沉淀的IMAC-纯化的蛋白的量，通过以分光光度计测量在280nm处的吸光度来确定，对于不同的FcRn结合Z变体范围从约10mg至20mg。每种最终蛋白制备物的SDS-PAGE分析显示，这些主要包含FcRn结合Z变体。每种FcRn结合Z变体的正确身份和分子量通过HPLC-MS分析来证实。
CD分析：对六种Z变体确定的CD光谱表明，每种在20℃具有α螺旋结构。该结果还以可变温度测量来证实，其中解链温度(Tm)被确定(表2)。对于六种Z变体，当重叠在加热至90℃前和后测量的光谱时，观察到可逆折叠。
表2.用于选择Z变体的解链温度。
Figure GDA0000971267280000471
Biacore结合与动力学分析：十七种Z变体与人FcRn在不同pH的结合和解离通过在包含FcRn的芯片表面上连续注射在pH 6.0和缓冲液pH 6.0或pH 7.4的Z变体的每种在Biacore仪器中来测试。表面的配体固定化水平是1668RU人FcRn。十七种Z变体显示在pH6.0结合FcRn，且与pH 6.0比较，对于所有变体在pH 7.4观察到更快的解离速率。对IgG的结果相似，在pH 7.4显示更快的解离速率。变体Z07918和Z10193显示最慢的解离曲线。对于变体和IgG的子集的传感图显示在图2A-E中。
表3.在pH 6.0对于hFcRn结合的Biacore动力学常数和亲和力。
Figure GDA0000971267280000481
五种Z变体在pH 6.0与FcRn相互作用的动力学常数被确定(见表3)。表面的固定化水平是2015RU人FcRn。对于每种Z变体，动力学常数使用三种注射的浓度的曲线组来计算。
还对His6-标记的Z变体Z07918(SEQ ID NO:707)、Z07960(SEQ ID NO:710)和Z10193(SEQ ID NO:708)与人FcRn和小鼠FcRn在pH 6.0和pH 7.4的相互作用确定亲和力(KD)常数(表4)。对于所有三种变体，与pH 7.4比较，KD值在pH 6.0更低。
表4.hFcRn和mFcRn在pH 6.0和pH 7.4的Biacore亲和力。
Figure GDA0000971267280000482
表5:由AlphaLISA阻断测定计算的IC50值。
Figure GDA0000971267280000483
AlphaLISA阻断测定：十七种His6-标记的单体Z变体(SEQ ID NO:707-722和SEQID NO:1059)和两种二聚体变体Z11948-G4S-Z11948和Z11948-(G4S)3-Z11948抑制IgG结合FcRn的能力在AlphaLISA阻断测定中来测试。Z变体的系列稀释液与生物素化的人FcRn孵育，且每种各自变体的阻断能力在加入IgG包覆的受体珠随后是链霉亲和素包覆的供体珠后来测量。抑制可被测量为对阳性Z变体的AlphaLISA计数的减少。在该测定中显示阻断IgG结合FcRn的十种单体变体和两种二聚体变体的计算的IC50值在表5中示出。
实施例4
FcRn结合Z变体与人FcRn/eGFP或小鼠FcRn/eGFP转染的HeLa细胞的结合
在该实施例中，研究了FcRn结合Z变体的结合能力。描述了表达人FcRn-eGFP和鼠FcRn-eGFP基因转基因的HeLa细胞的产生和这些细胞用于以Alexa647标记的Z变体的流式细胞术分析的用途。
材料和方法
FcRn-eGFP和B2M病毒载体的克隆：编码鼠FcRn(mFcRn,Genbank BC003786.1,OpenBiosystems)和鼠B2M(mB2M,Genbank BC085164.1,OpenBiosystems)的基因以如实施例1中对人FcRn和人B2M的基因描述的相似方式来扩增。人和鼠FcRn和B2M基因被如下扩增：对于hFcRn，编码氨基酸1-365(SEQ ID NO:1068)的序列被扩增；对于hB2M，编码氨基酸21-119(SEQ ID NO:1066)的序列被扩增；对于mFcRn，编码氨基酸1-369(SEQ ID NO:1069)的序列被扩增；和对于mB2M，编码氨基酸21-119(SEQ ID NO:1067)的序列被扩增。载体pHR-cPPT-CMV-EGFP(Jakobsson等人(2003)J Neurosci Res 73:876-85)和FcRn PCR扩增子(人和鼠)使用限制性内切酶BamHI(人)或BclI(鼠)和MluI(New England Biolabs，目录号分别为R0136M、R0160L和R0198L)来切割，并使用T4DNA连接酶(New England Biolabs，目录号M0202M)来连接。将连接混合物化学转化进大肠杆菌RRIΔM15中并涂布在氨苄青霉素平板上。菌落被挑选并用合适的引物对来筛选。编码原始信号肽在胞质尾区的人或鼠FcRn和eGFP的构建体通过测序来验证并分别表示为pHR-cPPT-CMV-hFcRn-eGFP和pHR-cPPT-CMV-mFcRn-eGFP。
将人和鼠B2M PCR扩增子根据制造商的推荐使用Gateway系统(Invitrogen，目录号11789020,
Figure GDA0000971267280000501
BP
Figure GDA0000971267280000502
II酶混合物)通过重组插入质粒pDONOR221(Invitrogen，目录号12536-017)。验证正确的序列后，将人或鼠B2M连同包含启动子的质粒pENTR-CMV(Tai等人同上)使用多位点gateway克隆系统(Invitrogen，目录号11791020,
Figure GDA0000971267280000503
LR
Figure GDA0000971267280000504
II酶混合物)一起插入p2k7_gtc(Suter等人，同上)，分别产生载体2k7neo-CMV-hB2M和2k7neo-CMV-mB2M。
HeLa细胞的慢病毒转导：将载体对2k7neo-CMV-hB2M和pHR-cPPT-CMV-hFcRn-eGFP或2k7neo-CMV-mB2M和pHR-cPPT-CMV-mFcRn-eGFP使用氯化钙转染与VSV-G包膜和gag/pol包装质粒一起共转染进HEK293T细胞(Zufferey等人(1997)同上；Jakobsson等人同上)。使用包含分别与FcRn和B2M转基因形成的慢病毒颗粒的HEK293T培养物上清液，顺序地转导低传代数的HeLa宫颈腺癌细胞(Cell Line Service)。所得的两种稳定转导的HeLa细胞系在以下表示为hFcRn-eGFP(用人FcRn-eGFP和hB2M基因转导的)和mFcRn-eGFP(用小鼠FcRn-eGFP和mB2M基因转导的)。
FcRn结合Z变体的Alexa647标记：三种His6-标记的Z变体Z07918、Z07930和Z07960用Alexa
Figure GDA0000971267280000505
647羧酸琥珀酰亚胺酯(Invitrogen目录号A20106)来标记。标记之前，将缓冲液使用以10,000g旋转的Vivaspin500离心过滤器单元(10kDa MWCO，Vivaproducts目录号512-2838)交换为0.2M碳酸盐缓冲液，pH 8.3。标记在Vivaspin500中进行，并且将1μl的Alexa647琥珀酰亚胺酯染料(在DMSO中40μg/μl，相应于1.3x摩尔过量)加入至200μg/25μl Z变体。该混合物在RT在黑暗中以扭动旋转搅拌器(wiggling rota mixer)孵育40分钟。将反应混合物随后放置在冰上3.5小时，并且游离染料通过用15x 100μl PBS在Vivaspin500中洗涤来除去。
具有FcRn结合Z变体的人和小鼠FcRn-eGFP转染的HeLa细胞的免疫荧光染色：hFcRn-eGFP和mFcRn-eGFP HeLa细胞通过胰蛋白酶处理来收获，并以PBS在pH 6.0洗涤两次，然后计数。v-形底96孔板(Nunc，目录号277143)的每个孔用移液器吸取100,000个细胞，并且板中的细胞随后在4℃以1,700rpm沉淀4min。将上清液除去，并且细胞在RT与PBS中的50μl的2％甲醛(Sigma Aldrich，目录号F8775)在pH 6.0固定10min。细胞此后用2x 100μlPBS pH 6.0洗涤，用酪蛋白(PBSC)饱和，并重悬于加上0.1％皂素(AppliChem，目录号A4518.0100)的包含620nM的Alexa647标记的His6-标记的Z变体；Z07960、Z07930和Z07918的PBSC中。与单独的缓冲液孵育的转导的Hela细胞，作为对照。细胞在黑暗中在振动器上在8℃孵育1h，用2x 100μl PBSC洗涤，并重悬于加上1％BSA(级分V，Merck，目录号1.12018.0100)的180μl的PBS pH 6.0中。10,000个细胞/孔在Gallios流式细胞仪(BeckmanCoulter)中进行分析，并且数据使用Kaluza软件(Beckman Coulter)进行分析。
结果
流式细胞术分析用于确定FcRn结合Z变体是否可结合人或小鼠FcRn/eGFP转导的Hela细胞上的人类和/或小鼠FcRn。实验在pH 6.0用Alexa647标记的Z07960、Z07930和Z07918(分别为SEQ ID NO:710、712和707)来进行。点状图分析(y-轴：Alexa647，x-轴：eGFP)显示了，转导的细胞群可被分为FcRn-eGFP阴性群和阳性群(图3，分别为门控H和I)，表明FcRn-eGFP融合蛋白由HeLa细胞的异源表达(图3)。因此，将门控I中Alexa647的平均荧光强度(MFI)值减去门控H中Alexa647的背景MFI值。计算的MFI值在图4中示出。结果表明，Z07960、Z07930和Z07918能够结合展示人(图4A)或鼠(图4B)FcRn-eGFP的HeLa细胞。
实施例5
用FcRn结合Z变体Z07918阻断IgG结合FcRn
在该实施例中，FcRn结合Z变体与IgG对于结合FcRn的潜在竞争在基于细胞的测定中来研究。此类结合将导致阻断IgG-FcRn相互作用。
材料和方法
IgG-FcRn免疫荧光染色的阻断：人或鼠FcRn-eGFP转导的Hela细胞如实施例4中所述来制备。将固定的细胞重悬于50μl的100nM Alexa647缀合的人或小鼠IgG(Jacksonlaboratories，目录号分别为009-600-003和015-600-003)和以PBS酪蛋白pH 6.0加上0.1％皂素(AppliChem)稀释的1000nM、100nM、10nM、1nM或0(缓冲液对照)nM His6-标记的Z07918的混合物中。细胞在黑暗中在37℃在振动器上孵育1h，用2x 100μl PBS-酪蛋白pH6.0洗涤，并重悬于180μl的加上1％BSA的PBS pH 6.0中。来自10,000个细胞/孔(除了对于小鼠100nM mIgG-Alexa647的稍微较少的细胞)的数据使用Gallios流式细胞仪(BeckmanCoulter)来获得，并且数据使用Kaluza软件(Beckman Coulter)来分析。
结果
进行实验以确定FcRn结合Z变体Z07918(SEQ ID NO:707)是否阻断IgG-FcRn相互作用。将人或鼠FcRn-eGFP转导的HeLa细胞与人或小鼠Alexa647-缀合的IgG孵育。结合用未标记的Z07918以不同浓度来阻断。由于FcRn由转导的HeLa细胞的异源表达(如实施例4中所述)，将每种样品的门控N中的Alexa647的MFI值减去了门控M中相应的MFI值(图5)。IgGAlexa647结合百分比通过将不同的MFI值除以空白对照的MFI来计算。结果显示，Z07918以剂量依赖性方式有效阻断hIgG结合hFcRn(图6A)。此外，尽管与hIgG-结合比较较不有效，Z07918还阻断mIgG结合mFcRn(图6B)。
实施例6
三种FcRn结合Z变体的药代动力学研究：
在该实施例中，FcRn结合Z变体延长非特异性Z变体的血清半衰期的能力通过在小鼠中进行的药代动力学研究来研究。
材料和方法
Z变体的亚克隆：对Z变体的子集(Z07918、Z07960和Z10193)进行第二亚克隆。使用来自实施例3中的亚克隆的His6-标记的变体的DNA作为模板。首先，PCR扩增使用合适的引物对来进行以创建编码以氨基酸AE代替VD开始的Z变体的基因。突变的Z变体在图1中列出，并且表示为Z11948(SEQ ID NO:1060)、Z11946(SEQ ID NO:1061)和Z11947(SEQ ID NO:1062)，分别相应于突变的Z07918、Z07960和Z10193。编码新的Z变体的基因被限制性切割，并被连接进携带编码白蛋白结合变体PP013(SEQ ID NO:1063)和Z03638(SEQ ID NO:1064)与间隔区序列的载体中，产生编码[Z#####]-GAP(G4S)4TS-[PP013]-GT(G4S)4PR-[Z03638](还表示为“Z#####-PP013-Z03638”或“与PP013-Z03638融合的Z变体”)的基因融合体。阴性对照分子[Z03638]-GAP(G4S)4TS-[PP013]通过将Z03638连接进包含(G4S)4接头和PP013的序列的载体来以相似的方式亚克隆。用于载体转化进大肠杆菌的随后步骤如实施例3中来进行。
培养和纯化：与PP013-Z03638融合的Z变体在大肠杆菌中如实施例3中所述产生。将约3g的每种细胞沉淀重悬于30ml补充有
Figure GDA0000971267280000531
(Merck)的TST-缓冲液(25mMTris-HCl、1mM EDTA、200mM NaCl、0.05％吐温20,pH 8.0)中。通过超声处理破碎细胞和通过离心澄清后，每种上清液应用至以带有固定化有抗ABD配体(在内部产生的)的5ml琼脂糖的重力流柱上。用TST-缓冲液和5mM NH4Ac缓冲液，pH 5.5洗涤后，Z变体用0.1M HAc来洗脱。将乙腈(ACN)以10％的终浓度加入至来自抗ABD琼脂糖亲和层析纯化步骤的洗脱的级分，并且将样品装载在3ml预先用RPC溶剂A(0.1％三氟乙酸(TFA)、10％ACN、90％水)平衡的Resource 15RPC柱(GE Healthcare)上。柱用RPC溶剂A洗涤后，结合的蛋白用线性梯度0-50％RPC溶剂B(0.1％TFA、80％ACN、20％水)在60ml中来洗脱。包含纯的Z变体的级分通过SDS-PAGE分析来鉴定并汇集。RPC纯化后，池的缓冲液使用HiPrep 26/10脱盐柱(GEHealthcare)更换为PBS。最后，Z变体在1ml EndoTrap红柱(Hyglos，目录号321063)上纯化以确保低内毒素含量。
每种纯化的Z变体的蛋白浓度、纯度和身份如实施例3中所述来分析。
Biacore分析：表达和纯化的与PP013-Z03638融合的Z变体在pH 6.0针对人FcRn基本如实施例3中对动力学分析所述的来测定。Z变体和阴性对照Z03638-PP013以40nM、160nM和640nM在1分钟期间来注射随后解离2.5分钟并平衡1分钟。使用BiaEvaluation软件确定Z变体的动力学常数和亲和力。
药代动力学研究：与PP013-Z03638融合的Z11947、Z11946和Z11948以92nmol/kg体重的剂量通过静脉(i.v.)施用至雄性NMRI小鼠(Charles River,Germany)。来自三只小鼠的组的血清在0.08小时、6小时、18小时、78小时、120小时、168小时和240小时来获得。各自Z变体的浓度通过ELISA来确定。
ELISA：半区96孔ELISA板在4℃用50μl/孔的以涂覆缓冲液(50mM碳酸钠，pH 9.6)稀释至4μg/ml的Z特异性山羊抗体(内部产生的)涂覆过夜。将抗体溶液倾出，并且孔用100μl的PBSC在RT封闭1.5h。血清以加上1％小鼠血清的PBSC(基质)在稀释板中以两倍稀释系列从1:100稀释至1:51,200。用于以基质稀释的各自Z变体和四个质量对照(很低、低度、中度和高度对照)的标准滴定包括在每个板上。将每孔50μl的稀释液转移，并且ELISA板在RT孵育1.5h。该板用PBST洗涤四次。结合的Z变体用50μl/孔的以PBSC稀释至4μg/ml的兔抗PP013Ig(在内部产生的)来检测。将板随后在RT孵育1.5h随后是如以上所述的洗涤。从Jackson laboratories获得的以PBSC 1:20,000稀释的HRP缀合的驴抗兔HRP(目录号711-035-152)加入，并且该板孵育1小时。如以上所述洗涤后，将50μl ImmunoPure TMB底物加入至孔中，并将板根据制造商的推荐进行显影。显影15分钟后，在450nm处使用多孔板阅读器(Victor3)测量吸光度。吸光度值使用GraphPad Prism 5来分析以确定浓度(三次样条曲线拟合)和曲线下面积(AUC)。浓度然后绘制为它们针对时间的自然对数。所得曲线遵循二室模型且终末半衰期计算为ln2除以基于最后三个时间点的斜率。
结果
培养和纯化：三种构建为Z#####-PP013-Z03638的FcRn结合Z变体Z11947、Z11946和Z11948(SEQ ID NO:1062、1061和1060)，和阴性对照Z03638-PP013在大肠杆菌中产生。来自约3g细菌沉淀的纯化的蛋白的量，通过以分光光度计测量在280nm处的吸光度来确定，对于不同的FcRn结合Z变体范围从约10mg至25mg。每种最终蛋白制备物的SDS-PAGE分析显示，它们主要包含各自的FcRn结合Z变体。每种FcRn结合Z变体的正确分子量通过LC/MS分析来证实。
表6.作为与PP013-Z03638融合产生的Z变体在pH 6.0对FcRn的动力学常数和亲和力。
Figure GDA0000971267280000551
Biacore分析：分析三种PP013-Z03638融合的Z变体与FcRn的结合。表面的固定化水平是548RU的人FcRn。将在pH 6.0的靶结合的所得的粗略动力学常数和亲和力在表6中示出。拟合曲线在图7A-C中示出。阴性对照Z03638-PP013针对FcRn是阴性的。
药代动力学研究：在小鼠药代动力学研究中比较以上提及的与PP013-Z03638融合的Z变体的构建体与阴性对照Z03638-PP013的药代动力学谱。在先研究工作中，例如如PCT申请WO2009/016043中所述，已表明，由于ABD结合血清白蛋白，ABD融合蛋白在血清中具有长半衰期。根据在先结果，ABD-融合的Z变体分子(Z03638-PP013)的终末半衰期为约43小时，其可比得上小鼠白蛋白的半衰期(35小时)。包含FcRn结合Z变体分子加上ABD的构建体的终末半衰期是长两倍至三倍(图8)。计算的终末半衰期是99小时(Z11947)、69小时(Z11946)和58小时(Z11948)，表明了Z变体的FcRn结合有助于延长的半衰期。
实施例7
FcRn结合Z变体的成熟文库的设计和构建
在该实施例中，构建了成熟的文库。使用该文库选择FcRn结合Z变体。来自成熟的文库的选择通常被预期产生具有增强的亲和力的结合物(Orlova等人，(2006)Cancer Res66(8):4339-48)。在本研究中，使用裂池合成(split-pool synthesis)来生成随机化的单链接头，使得能够将定义的密码子掺入合成中期望的位置。
材料和方法
文库设计：文库是基于表1和实施例2-6中进一步描述的人FcRn结合Z变体的十六个序列。在新的文库中，根据主要基于SEQ ID NO:707-722中定义的Z变体的结合基序的策略，将Z分子支架中13个可变位置向某些氨基酸残基偏置。包含以下氨基酸序列的147bp部分随机化的螺旋1和2的DNA接头使用裂池合成：5’-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAATAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC NNN NNN TTA CCT AAC TTA ACCNNN NNN CAA NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCATTA TTT A -3’(SEQ ID NO:1074；随机化的密码子示为NNN)，两侧是限制性位点XhoI和SacI，从DNA 2.0(Menlo Park,CA,USA)订购。氨基酸残基在新的文库中的理论分布，包括Z分子支架中的八个可变氨基酸位置(9、10、11、13、14、24、32和35)和五个恒定氨基酸位置(17、18、25、27和28)，在表7中示出。所得的理论文库尺寸是5.3x 108个变体。
表7:用于成熟的文库的设计
Figure GDA0000971267280000561
文库构建：文库根据供应商的推荐使用AmpliTaq Gold聚合酶(AppliedBiosystems，目录号4311816)在12个循环的PCR期间来扩增，且混合的产物根据供应商的推荐用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，目录号28106)来纯化。随机化文库片段的纯化的池用限制性内切酶XhoI和SacI-HF(New England Biolabs，目录号R0146L，和目录号R3156M)来消化，并且使用PCR纯化试剂盒来浓缩。随后，将产物经历制备性2.5％琼脂糖(NuisieveGTC琼脂糖，Cambrex，Invitrogen)凝胶电泳并根据供应商的推荐使用QIAGEN凝胶提取试剂盒(QIAGEN，目录号28706)来纯化。
噬菌粒载体pAY02592(基本如
Figure GDA0000971267280000571
等人，同上中所述的pAffi1)用相同酶限制性内切，使用苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀来纯化。限制性内切片段和限制性内切载体以5:1的摩尔比用T4DNA连接酶(Fermentas，目录号EL0011)在RT连接2小时，随后在4℃孵育过夜。连接的DNA通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀来回收，然后溶解在10mM Tris-HCl，pH 8.5中。因此，所得的在载体pAY02592中的文库编码Z变体，每个融合至源自链球菌G蛋白的白蛋白结合域(ABD)。
连接反应(约160ng DNA/转化)被电穿孔进电感受态大肠杆菌ER2738细胞(50μl，Lucigen，Middleton，WI，USA)。紧接在电穿孔之后，加入约1ml的恢复培养基(以ER2738细胞供给)。将转化的细胞在37℃孵育60min。采取样品用于滴定并确定转化子的数目。细胞此后汇集并在37℃在1l的补充有2％葡萄糖、10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB-YE培养基中培养过夜。将细胞以4,000g沉淀7min，并重悬于PBS/甘油溶液(约40％甘油)中。将细胞等分并储存在-80℃。对来自Z变体的文库克隆进行测序，以验证内含物，并评价所构建文库与该文库设计相比的结果。如实施例1中所述进行测序，和验证氨基酸分布。
噬菌体储备液的制备：包含噬菌粒文库的噬菌体储备液在20l发酵罐(BelachBioteknik)中来制备。将来自包含该噬菌粒文库的甘油储备液的细胞接种于10l的补充有1g/l葡萄糖、100mg/l氨苄青霉素和10mg/l四环素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉汤-酵母提取物；30g/l TSB、5g/l酵母提取物)中。当细胞达到0.6的600nm(OD600)处的光密度时，约1.5l的培养物使用5x摩尔过量的M13K07辅助噬菌体来感染。将细胞孵育30min，随后将发酵罐用复合发酵培养基[2.5g/l(NH4)2SO4；5.0g/l酵母提取物；30g/l胰蛋白胨、2g/l K2HPO4；3g/lKH2PO4、1.25g/l；Na3C6H5O7·2H2O；Breox FMT30消泡剂0.1ml/l]填充至10l。将以下组分加入：10ml 25mg/ml羧苄青霉素；5ml 50mg/ml卡那霉素；1ml 1M异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)；17.5ml/l的300g/l MgSO4，和5ml的微量元素溶液[35g/l FeCl3·6H2O；10.56g/lZnSO4·7H2O；2.64g/l CuSO4·5H2O；13.2g/l MnSO4·H2O；13.84g/l溶解于1.2M HCl的CaCl2·2H2O]。开始葡萄糖有限分批补料培养，其中600g/l葡萄糖溶液送入反应器(在开始时3.5g/h，20h后37.5g/h，并直至培养结束)。pH通过自动加入25％NH4OH控制在pH 7，补充空气(5l/min)，并以500rpm设定搅拌器。补料分批培养24h后，OD600为33.2。培养中的细胞通过以15,900g离心来沉淀。噬菌体颗粒从上清液以PEG/NaCl沉淀两次，如实施例2中过滤并溶解于PBS和甘油中。噬菌体储备液储存于-80℃，直到在选择中使用。
结果
文库构建：新文库基于一组16种具有证实的结合性质(实施例2-6)的FcRn结合Z变体来设计。设计的文库的理论尺寸为5.3×108种Z变体。转化大肠杆菌ER2738细胞后通过滴定确定的文库的实际尺寸为4.5×109个转化子。
文库质量通过测序96种转化子和通过将它们的实际序列与理论设计比较来测试。与设计的文库比较，实际文库的内容物被证明是令人满意的。因此成功构建了FcRn的潜在结合物的成熟的文库。
实施例8
从成熟的文库选择和筛选Z变体
材料和方法
成熟的FcRn结合Z变体的噬菌体展示选择：靶蛋白人FcRn(Biorbyt，目录号orb84388)和鼠FcRn(Biorbyt，目录号orb99076)基本如实施例2中所述使用10x摩尔过量的生物素来生物素化。噬菌体展示选择，使用实施例7中所述的Z变体分子的新的文库，在基本如实施例2中所述但有以下例外的针对人FcRn或鼠FcRn的四个循环中来进行。选择缓冲液分别是0.1％PCTG缓冲液pH 5.5(补充有0.1％吐温-20和0.1％明胶的McIlvaines磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 5.5)或0.1％PCTG缓冲液，pH 7.4(补充有0.1％吐温-20和0.1％明胶的McIlvaines磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 7.4)。选择之前，将HSA以1.5μM的终浓度加入至选择缓冲液。在选择中使用的所有管和珠用两种不同选择缓冲液的任一种来预封闭。预选择步骤，在循环1中通过噬菌体储备液与SA-珠孵育45min来进行。为捕获噬菌体-靶复合物，每1.1μg生物素化的人FcRn或1.6μg生物素化的鼠FcRn使用1mg珠。洗涤用0.1％PCT缓冲液pH 5.5或pH 7.4来进行，除了轨道2-1-2-1和2-1-2-2，其中分别补充有25nM IgG
Figure GDA0000971267280000592
或10nM IgG的0.1％PCT如表7中概述来使用。
循环1中的五个轨道(1-5)被划分在第二至第四个循环，导致在循环2中共七个轨道(1-1至5-1)，在循环3中十一个轨道(1-1-1至5-1-1)，和在循环4中十四个轨道(1-1-1-1至5-1-1-1)。如实施例2中所述洗脱结合的噬菌体颗粒。
选择策略的以下概述在表8中示出：描述在随后的循环中增加的严格性，使用降低的靶浓度和增加的洗涤数目。
表8.成熟选择数据的概述。
Figure GDA0000971267280000591
Figure GDA0000971267280000601
噬菌体颗粒的扩增：选择循环1和2之间的噬菌体颗粒的扩增基本如实施例2中所述来进行，具有以下例外。使用大肠杆菌ER2738用于噬菌体扩增，且以5x过量使用M13K07辅助噬菌体。选择循环2和4之间的噬菌体颗粒的扩增通过在溶液中进行细菌感染来如下完成。用噬菌体颗粒感染对数生长期大肠杆菌ER2738后，加入补充有2％葡萄糖、10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB，随后在37℃伴随旋转孵育30min。此后，将细菌用M13K07辅助噬菌体以5x过量来感染。被感染的细菌通过离心沉淀，重悬于补充有100μM IPTG、25μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB-YE培养基，并在30℃生长过夜。过夜培养物以离心机沉淀，并且上清液中的噬菌体颗粒用PEG/NaCl缓冲液沉淀两次。最后，将噬菌体颗粒重悬于选择缓冲液，然后进入下一个选择循环。
在最后的选择循环中，将对数生长期细菌用洗脱物感染，并稀释，然后涂布在补充有0.2g/l氨苄青霉素的TBAB平板(30g/l胰蛋白胨血琼脂基，Oxoid目录号CMO233B)上以形成待在ELISA筛选中使用的单菌落。
潜在结合物的测序：来自不同的选择轨道的单克隆被挑选用于测序。对ELISA筛选中运行的所有克隆进行测序。基本如实施例2中所述进行基因片段的扩增和基因片段的序列分析。
Z变体的ELISA筛选：包含Z变体(如实施例2中所述表达为Z变体ABD融合蛋白)的单菌落随机从FcRn的成熟的文库的所选克隆来挑取，并基本如实施例2中所述生长在1ml培养基中。周质上清液的制备如实施例2中以八个冻融循环来进行，并且在ELISA筛选中未稀释地使用周质级分。ELISA筛选基本如实施例2中所述使用以每个孔中2nM浓度的生物素化的人FcRn在pH 6.0和pH 7.4两者来进行。使用主要FcRn结合物Z10193(SEQ ID NO:708；在以上实验中测定的)的周质级分作为阳性对照。使用包含仅ABD部分的周质作为阴性对照。
FcRn结合Z变体的ELISA KD分析：如以上所述使用ELISA在pH 6.0和pH 7.4两者对一组FcRn结合物进行针对稀释系列的生物素化的人FcRn的应答的分析。以30nM的浓度加入生物素化的人FcRn，并且以1:3逐步稀释直到14pM。作为背景对照，还测定所有Z变体而不加入靶蛋白。包含主要FcRn结合物Z07918(SEQ ID.NO:707)的周质样品被包括和分析作为阳性对照。使用包含仅ABD部分的周质作为阴性对照。使用GraphPad Prism 5和非线性回归分析数据并且计算KD值(半最大有效浓度)。
结果
成熟的FcRn结合Z变体的噬菌体展示选择：选择在各包含四个循环的共14个平行轨道中进行。不同的选择轨道在靶浓度、靶类型(人FcRn或鼠FcRn)、选择时间和洗涤条件方面存在不同。
潜在结合物的测序：对随机挑选的克隆进行测序。每个单独的Z变体如实施例2中所述提供识别号码Z#####。总计445种新的独特的Z变体分子被鉴定。
58个氨基酸残基长Z变体的氨基酸序列在图1中和序列表中作为SEQ ID NO:723-1058列出。这些Z变体的推导的FcRn结合基序在图1中和序列表中作为SEQ ID NO:17-352列出。预测组成这些Z变体的每个内的完整三螺旋束的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列在图1中和序列表中作为SEQ ID NO:370-705列出。
Z变体的ELISA筛选：在四个选择循环后获得的克隆，在96孔板中产生并使用ELISA筛选FcRn结合活性。所有随机挑选的克隆进行分析。在pH 6.0，445种独特的Z变体中的333种被发现以2nM的浓度产生针对人FcRn的0.3AU或更高的应答(相应于至少3x阴性对照)。在pH 7.4，445种独特的Z变体中的278种被发现以2nM的浓度产生针对人FcRn的0.3AU或更高的应答(相应于至少3x阴性对照)。除了1-1-1-1，在所有轨道(包括具有鼠靶的那些)中发现具有针对人FcRn的阳性信号的克隆。阴性对照分别具有0.070-0.096AU(pH 6.0)和0.060-0.112AU(pH 7.4)的吸光度。空白对照的平均应答为0.070AU(pH 6.0)和0.062(pH 7.4)。
FcRn结合Z变体的ELISA KD分析：Z变体的子集，基于以上所述的ELISA实验中的结果来选择(在pH 6.0和/或pH 7.4的最高ELISA值)，并以ELISA格式经历靶滴定。周质样品与系列稀释的生物素化的人FcRn进行孵育。还测定具有主要结合物Z07918(SEQ ID NO:707)的周质样品作为阳性对照。分析获得的值并计算它们的各自KD值(表9)。
表9:从来自成熟的Z-ABD变体的ELISA滴定分析的计算的KD值。
Figure GDA0000971267280000621
Figure GDA0000971267280000631
Figure GDA0000971267280000641
实施例9
来自成熟的文库的Z变体的产生和表征
在该实施例中，十二种Z变体在大肠杆菌中产生，纯化并测定与FcRn的结合以及IgG结合FcRn的抑制。
材料和方法
将Z变体亚克隆进表达载体：十二种FcRn结合Z变体的DNA(Z13577(SEQ ID NO:725)、Z13578(SEQ ID NO:726)、Z13583(SEQ ID NO:729)、Z13592(SEQ ID NO:734)、Z13616(SEQ ID NO:747)、Z13621(SEQ ID NO:750)、Z13654(SEQ ID NO:771)、Z13663(SEQ ID NO:776)、Z13669(SEQ ID NO:779)、Z13674(SEQ ID NO:781)、Z13675(SEQ ID NO:782)和Z13676(SEQ ID NO:783))从文库载体pAY02592进行扩增。如实施例3中所述进行亚克隆。将Z基因片段亚克隆进表达载体pAY01448，产生编码的序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD。
Z变体的产生：His6-标记的Z变体的培养和纯化基本如实施例3中所述来进行。
Biacore结合与动力学分析：FcRn结合His6-标记的Z变体与人FcRn的相互作用基本如实施例3中所述在Biacore 2000仪器中来分析。使用购自Biorbyt的人FcRn(目录号orb84388)作为靶蛋白。分析物在2分钟期间以30μl/min来注射。解离阶段为4分钟且分析物注射之间的平衡时间为30分钟。
在一个实验中，Z变体在pH 6.0使用共注射程序来注射，随后分别在pH 6.0或pH7.4的溶液中解离。Z变体的浓度是100nM。
在另一个实验中，对Z变体的子集确定近似动力学常数(kon和koff)和亲和力(KD)。注射的浓度是540nM、180nM、60nM、20nM和6.7nM。
AlphaLISA阻断测定：Z变体抑制IgG与FcRn的结合的潜力如在实施例3中所述在AlphaLISA测定中来分析。
结果
Z变体的产生：构建为带有N-末端His6标签的十二种FcRn结合Z变体在大肠杆菌中产生。每种最终蛋白制备物的SDS-PAGE分析显示，这些主要包含FcRn结合Z变体。每种FcRn结合Z变体的正确身份和分子量通过HPLC-MS分析来证实。
Biacore结合与动力学分析：十二种Z变体与人FcRn在不同pH的结合和解离通过在包含FcRn的芯片表面上连续注射Z变体在pH 6.0的每种和缓冲液pH 6.0或pH 7.4在Biacore仪器中来测试。表面的配体固定化水平是890RU人FcRn。十二种Z变体显示在pH 6.0结合FcRn，且与pH 6.0比较，对于所有变体在pH 7.4观察到更快的解离速率。
Z变体Z13577(SEQ ID NO:725)和Z13621(SEQ ID NO:750)与FcRn在pH 6.0的相互作用的动力学常数被确定(见表10)。分别使用Z13577和Z13621的两个或四个注射的浓度的曲线集计算动力学常数。
表10.在pH 6.0的FcRn结合的Biacore动力学常数和亲和力。
Figure GDA0000971267280000651
AlphaLISA阻断分析：十二种成熟的His6-标记的单体Z变体抑制IgG对FcRn的结合的能力在AlphaLISA阻断测定中进行测试。将Z变体的系列稀释液与生物素化的人FcRn孵育，且每种各自变体的阻断能力在加入IgG包覆的受体珠随后是链霉亲和素包覆的供体珠后来测量。抑制可被测量为对阳性Z变体的AlphaLISA计数的减少。所有十二种测试的Z显示阻断IgG对FcRn的结合，并且计算的IC50值在表11中示出。
表11:由AlphaLISA阻断测定计算的IC50值。
Figure GDA0000971267280000661
实施例10
IgG对FcRn的结合的阻断能力的比较
在该实施例中，比较FcRn结合Z变体His6-Z07918(SEQ ID NO:707)与目前在治疗一些自身免疫性紊乱中使用的静脉内注射免疫球蛋白(IVIg)和皮下注射免疫球蛋白(SCIg)的IgG阻断能力。
材料和方法
IgG-FcRn免疫荧光染色的阻断：人或鼠FcRn-eGFP转导的Hela细胞如实施例4中所述来制备。将固定的细胞分别重悬于50μl的50nM Alexa647-缀合的人IgG(Jacksonlaboratories，目录号009-600-003)和His6-标记的Z07918,IVIg(
Figure GDA0000971267280000662
Octapharma)或SCIg(
Figure GDA0000971267280000663
Octapharma)的混合物中，在McIlvanes，pH 6.0，加上2.5％FCS(超低IgG，Life technologies)和0.1％皂素(AppliChem)中以1000nM、100nM、10nM、1nM、0.1nM或0nM(缓冲液对照)的浓度进行稀释。细胞在37℃在黑暗中孵育1h，用2x 100μlMcIlvanes，pH 6.0，加上2.5％FCS(超低IgG)pH6.0洗涤并重悬于180μl的加上1％BSA的McIlvanes，pH 6.0中。来自10,000个GFP/FcRn阳性细胞的数据使用FACS Calibur(BeckmanCoulter)来获得，并且数据使用Flowing软件2.5.0(Turku University)来分析。
结果
进行实验以确定FcRn结合Z变体His6-Z07918(SEQ ID NO:707)是否阻断IgG-FcRn相互作用，并与IVIg和SCIg比较阻断效应。将人或鼠FcRn-eGFP转导的HeLa细胞与人Alexa647-缀合的IgG孵育。结合用未标记的His6-Z07918、IVIg或SCIg以不同的浓度来阻断。结果显示His6-Z07918以与IVIg或SCIg相似的程度有效阻断hIgG结合hFcRn(图9)。
实施例11
在小鼠中通过FcRn结合Z变体增加的IgG分解代谢
FcRn结合Z变体Z07918体外阻断IgG结合FcRn的能力在实施例10中示出。在该实施例中，评估了相同Z变体的体内阻断能力。IgG-FcRn体内相互作用的阻断将导致增加的IgG分解代谢和伴随的IgG水平减少(Mezo 2008，同上)。
材料和方法
动物研究：FcRn结合Z变体Z11948(SEQ ID NO:1060)和Z07918-PP013(Z07918(SEQID NO:707)，与Z11948相同但具有以氨基酸VD代替AE开始的N-末端，与ABD变体PP013(SEQID NO:1063)融合)或媒介物(PBS缓冲液)，以16.3μmol/kg的剂量被施用至雄鼠NMRI(Charles River)。小鼠在0h、24h、48h、72h和96h给予五次静脉内注射来处理。血清样品在0h、72h、120h和168h(研究结束)采集并储存于-20℃。血清中的小鼠IgG浓度通过ELISA来定量。
小鼠IgG ELISA：小鼠IgG在小鼠血清样品中的浓度通过小鼠IgG ELISA试剂盒(Mabtech 3825-1AD-6)来分析和如制造商所述进行。mIgG的浓度由提供的标准曲线和GraphPad prism5使用非线性回归公式来计算。IgG在单独的小鼠中在24h、72h、120h和168h时的浓度与在0h时的水平相关，并且结果因此表示为IgG(0h)的百分比。
结果
结果显示小鼠IgG浓度在用FcRn-特异性Z变体处理的小鼠中减少。Z11948和ABD融合的变体Z07918-PP013两者降低内源性IgG在小鼠体内的浓度。最显著的效应以ABD融合的变体并在120小时之后得到。因此，结果表明，FcRn特异性Z变体阻断IgG的回收，导致小鼠中增加的IgG分解代谢和IgG的随后较低水平。
实施例12
FcRn结合Z变体的体外转胞吞作用
在该实施例中，对FcRn结合Z变体测试其被运输通过上皮细胞或内皮细胞或通过FcRn体外回收的能力。包含具有转胞吞作用的能力的Z变体的药物将在例如口服施用或肺部施用后促进药物吸收。
材料和方法
带有或不带有FcRn的内源性或重组表达的细胞，例如T84、MDCK、HeLa、CACO2、CaLu-1和/或CaLu-3细胞，在transwell中膜上的各自生长培养基中生长，以形成单层。单层的完整性可通过测量电阻或加入不能穿透细胞单层或在细胞单层上主动运输的探针进行评价。细胞的定义的单层从顶端侧面或基底外侧面用配体诸如FcRn结合Z变体、HSA或IgG在缓冲液诸如HBSS(Hanks平衡盐溶液，SigmaAldrich，目录号H9269)或生长培养基中在合适的pH和温度脉冲，并用缓冲液诸如HBSS或生长培养基在合适的pH和温度在相对侧面追捕。
在该测定的一个变化形式中，配体可用缓冲液诸如HBSS或生长培养基在合适的pH和温度在与施用相同的侧面上被追捕以还测量回收的配体。这可在Transwell或在细胞培养皿中来完成。将细胞接种进transwell或细胞培养皿中，并用配体诸如FcRn结合Z变体、HSA或IgG来脉冲。胞吞的配体将结合FcRn并返回至与它们被装载的相同或相对侧面的细胞表面上。脉冲后，游离配体通过用冷的缓冲液洗涤细胞来除去。为了追捕配体，将温的缓冲液或培养基加入至细胞，并且在范围从10分钟至数小时的时期后，将缓冲液或培养基除去并测定配体的存在。
在该测定的一个变化形式中，配体诸如FcRn结合Z变体、HSA或IgG通过同时或顺序地施用它们至细胞，可用于阻断配体诸如其他FcRn结合Z变体、HSA或IgG对FcRn的结合。
配体的量可通过方法诸如ELISA、HPLC-MS、荧光染料或放射性标记来定量。
预计以上所述实验的结果显示，FcRn特异性Z变体可被体外转胞吞和/或回收。
逐项的实施方案列表
1.FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽包含FcRn结合基序BM，所述基序由以下的氨基酸序列组成：
EX2X3X4AX6X7EIR WLPNLX16X17X18QR X21AFIX25X26LX28X29
其中，彼此独立地，
X2选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X3选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X4选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X6选自A、E、F、G、H、I、K、Q、R、S和V；
X7选自A、F、H、K、N、Q、R、S和V；
X16选自N和T；
X17选自F、W和Y；
X18选自A、D、E和N；
X21选自A、S、V和W；
X25选自D、E、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X26选自K和S；
X28选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；和
X29选自D和R。
2.根据项目1所述的FcRn结合多肽，其中彼此独立地，
X2选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X3选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X4选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X6选自A、E、F、G、H、I、K、Q、R和S；
X7选自A、F、H、K、N、Q、R、S和V；
X16选自N和T；
X17选自F和Y；
X18是D；
X21是V；
X25选自D、E、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X26选自K和S；
X28选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和W；和
X29选自D和R。
3.根据项目1所述的FcRn结合多肽，其中所述BM由选自以下的氨基酸序列组成：
i)EX2X3X4AX6HEIR WLPNLTX17X18QR X21AFIX25KLX28D
其中，彼此独立地，
X2选自A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y；
X3选自A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；
X4选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；
X6选自A、G、K、R、S和V；
X17选自F、W和Y；
X18选自A、D、E和N；
X21选自A、S、V和W；
X25选自D、G、H、K、L、N、R、V和W；
X28选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T、W和Y；
和
ii)与由i)定义的序列具有至少96％同一性的氨基酸序列。
4.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，其中X2选自A、D、E、F、I、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y。
5.根据项目4所述的FcRn结合多肽，其中X2选自A、D、F、I、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y。
6.根据项目5所述的FcRn结合多肽，其中X2选自A、D、F、I、L、N、Q、R、S、V和W。
7.根据项目5所述的FcRn结合多肽，其中X2选自A、I、L、N、Q、R、S、T、V、W和Y。
8.根据项目7所述的FcRn结合多肽，其中X2选自A、I、L、N、Q、S、T、V和W。
9.根据项目6或8所述的FcRn结合多肽，其中X2选自A、I、L、N、Q、V和W。
10.根据项目9所述的FcRn结合多肽，其中X2选自A、I、L、Q、V和W。
11.根据项目10所述的FcRn结合多肽，其中X2选自A、I、L和Q。
12.根据项目11所述的FcRn结合多肽，其中X2选自I、L和Q。
13.根据项目12所述的FcRn结合多肽，其中X2选自I和Q。
14.根据项目13所述的FcRn结合多肽，其中X2是I。
15.根据项目13所述的FcRn结合多肽，其中X2是Q。
16.根据项目1和3-15的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X3选自A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y。
17.根据项目2或16所述的FcRn结合多肽，其中X3选自A、D、E、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y。
18.根据项目16所述的FcRn结合多肽，其中X3选自A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、R、S和T。
19.根据项目18所述的FcRn结合多肽，其中X3选自A、D、E、G、H、K、M、N、Q、S和T。
20.根据项目19所述的FcRn结合多肽，其中X3选自A、D、E、G、H、M、N、Q、S和T。
21.根据项目19所述的FcRn结合多肽，其中X3选自A、D、E、K、N、Q、S和T。
22.根据项目21所述的FcRn结合多肽，其中X3选自A、D、E、K、Q和T。
23.根据项目22所述的FcRn结合多肽，其中X3选自A、D、E、Q和T。
24.根据项目23所述的FcRn结合多肽，其中X3选自D、E和T。
25.根据项目24所述的FcRn结合多肽，其中X3选自D和E。
26.根据项目25所述的FcRn结合多肽，其中X3是D。
27.根据项目25所述的FcRn结合多肽，其中X3是E。
28.根据项目1和3-27的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y。
29.根据项目28所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A、D、E、G、N、Q、R、S、T和V。
30.根据项目2或28所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A、D、E、F、I、K、L、N、Q、R、S、T和V。
31.根据项目30所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A、D、E、I、K、N、Q、R、S和T。
32.根据项目31所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A、D、E、I、K、Q、S和T。
33.根据项目32所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A、D、I、K、Q和S。
34.根据项目32所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A、D、E、K和S。
35.根据项目33或34所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A、D、K和S。
36.根据项目34所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A、D、E和K。
37.根据项目35或36所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A、D和K。
38.根据项目37所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A和D。
39.根据项目36所述的FcRn结合多肽，其中X4选自A和E。
40.根据项目38或39所述的FcRn结合多肽，其中X4是A。
41.根据项目38所述的FcRn结合多肽，其中X4是D。
42.根据项目39所述的FcRn结合多肽，其中X4是E。
43.根据项目1和4-42的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X6选自A、G、K、Q、R、S和V。
44.根据项目3或43所述的FcRn结合多肽，其中X6选自A、G、K、R、S和V。
45.根据项目2或44所述的FcRn结合多肽，其中X6选自A、G、K、R和S。
46.根据项目44所述的FcRn结合多肽，其中X6选自A、G、K、S和V。
47.根据项目46所述的FcRn结合多肽，其中X6选自A、G、K和V。
48.根据项目45或46所述的FcRn结合多肽，其中X6选自A、G、K和S。
49.根据项目47或48所述的FcRn结合多肽，其中X6选自A、G和K。
50.根据项目47所述的FcRn结合多肽，其中X6选自A、G和V。
51.根据项目49或50所述的FcRn结合多肽，其中X6选自A和G。
52.根据项目51所述的FcRn结合多肽，其中X6是A。
53.根据项目51所述的FcRn结合多肽，其中X6是G。
54.根据项目1、2和4-53的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X7选自A和H。
55.根据项目54所述的FcRn结合多肽，其中X7是H。
56.根据项目1、2和4-55的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X16是T。
57.根据项目1、2和4-55的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X16是N。
58.根据项目1和3-57的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X17选自F和Y。
59.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，其中X17是F。
60.根据项目1和3-59的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X18选自A、D和E。
61.根据项目60所述的FcRn结合多肽，其中X18选自A和D。
62.根据项目61所述的FcRn结合多肽，其中X18是D。
63.根据项目1和3-62的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X21选自V和W。
64.根据项目63所述的FcRn结合多肽，其中X21是V。
65.根据项目1和4-64的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X25选自D、E、G、H、K、L、N、Q、R、V和W。
66.根据项目65所述的FcRn结合多肽，其中X25选自D、G、H、K、L、N、R、V和W。
67.根据项目2、3和66的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X25选自H、L、R、V和W。
68.根据项目67所述的FcRn结合多肽，其中X25选自H、R、V和W。
69.根据项目68所述的FcRn结合多肽，其中X25选自H、R和V。
70.根据项目67所述的FcRn结合多肽，其中X25选自H、L和R。
71.根据项目69或70所述的FcRn结合多肽，其中X25选自H和R。
72.根据项目69所述的FcRn结合多肽，其中X25选自H和V。
73.根据项目71或72所述的FcRn结合多肽，其中X25是H。
74.根据项目1、2和4-73的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X26是K。
75.根据项目1、2和4-73的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X26是S。
76.根据项目1和3-75的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X28选自A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T、W和Y。
77.根据项目76所述的FcRn结合多肽，其中X28选自A、D、E、K、L、N、Q、R、S、T、W和Y。
78.根据项目77所述的FcRn结合多肽，其中X28选自A、D、E、L、R、S、T、W和Y。
79.根据项目2或77所述的FcRn结合多肽，其中X28选自A、D、K、L、N、Q、R、S、T和W。
80.根据项目78或79所述的FcRn结合多肽，其中X28选自A、D和R。
81.根据项目80所述的FcRn结合多肽，其中X28选自A和R。
82.根据项目80所述的FcRn结合多肽，其中X28选自D和R。
83.根据项目81所述的FcRn结合多肽，其中X28是A。
84.根据项目81或82所述的FcRn结合多肽，其中X28是R。
85.根据项目82所述的FcRn结合多肽，其中X28是D。
86.根据项目1、2和4-85的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X29是D。
87.根据项目1、2和4-85的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X29是R。
88.根据项目1、2和4-87的任一项所述的FcRn结合多肽，其中X6X7选自AH和GH。
89.根据项目88所述的FcRn结合多肽，其中X6X7是AH。
90.根据项目88所述的FcRn结合多肽，其中X6X7是GH。
91.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，其中X17X18选自FD和YD。
92.根据项目91所述的FcRn结合多肽，其中X17X18是FD。
93.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，其中所述序列满足六个条件I-VI中的至少三个：
I.X6选自A、G、K和S，诸如特别是A；
II.X7是H；
III.X17选自F和Y，诸如特别是F；
IV.X18是D；
V.X21选自V和W，诸如特别是V；
VI.X25选自H和R，诸如特别是H。
94.根据项目93所述的FcRn结合多肽，其中所述序列满足所述六个条件I-VI中的至少四个。
95.根据项目94所述的FcRn结合多肽，其中所述序列满足所述六个条件I-VI中的至少五个。
96.根据项目95所述的FcRn结合多肽，其中所述序列满足所述六个条件I-VI中的全部。
97.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1-353组成的组。
98.根据项目97所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1-15、SEQID NO:17-140和SEQ ID NO:353组成的组。
99.根据项目98所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1-2和SEQID NO:17-140组成的组。
100.根据项目99所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1-2、SEQID NO:17-92、SEQ ID NO:94-103、SEQ ID NO:105-125和SEQ ID NO:127-140组成的组。
101.根据项目98所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1-8、SEQID NO:13、SEQ ID NO:19-20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75-77和SEQ ID NO:353组成的组。
102.根据项目100或101所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:75-77组成的组。
103.根据项目102所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1、SEQID NO:23、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:77组成的组。
104.根据项目103所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1、SEQID NO:23和SEQ ID NO:75组成的组。
105.根据项目104所述的FcRn结合多肽，其中所述序列是SEQ ID NO:1。
106.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，其中所述FcRn结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。
107.根据项目106所述的FcRn结合多肽，其中所述FcRn结合基序基本形成在所述三螺旋束蛋白结构域内具有互相连接的环的两个螺旋的一部分。
108.根据项目107所述的FcRn结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体结构域。
109.根据项目108所述的FcRn结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的结构域或其衍生物。
110.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
iii)K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ；
其中
[BM]是如本文定义的FcRn结合基序，条件是X29是D；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；
和
iv)与由iii)定义的序列具有至少93％同一性的氨基酸序列。
111.根据项目1-109的任一项所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
v)K-[BM]-QPEQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ；
其中
[BM]是如本文定义的FcRn结合基序，条件是X29是R；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；
和
vi)与由v)定义的序列具有至少93％同一性的氨基酸序列。
112.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xa是A。
113.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xa是S。
114.根据项目110-113的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xb是N。
115.根据项目110-113的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xb是E。
116.根据项目110-115的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xc是A。
117.根据项目110-115的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xc是S。
118.根据项目110-115的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xc是C。
119.根据项目110-118的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xd是E。
120.根据项目110-118的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xd是N。
121.根据项目110-118的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xd是S。
122.根据项目110-121的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xe是D。
123.根据项目110-121的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xe是E。
124.根据项目110-121的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xe是S。
125.根据项目110-119、121、123和124的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的XdXe选自EE、ES、SE和SS。
126.根据项目125所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的XdXe是ES。
127.根据项目125所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的XdXe是SE。
128.根据项目110-127的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xf是A。
129.根据项目110-127的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xf是S。
130.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是A且Xf是A。
131.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是C且Xf是A。
132.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是S且Xf是S。
133.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是C且Xf是S。
134.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是A；XdXe是ND且Xf是A。
135.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是C；XdXe是ND且Xf是A。
136.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是S；XdXe是ND且Xf是S。
137.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是C；XdXe是ND且Xf是S。
138.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是A；XdXe是SE且Xf是A。
139.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是C；XdXe是SE且Xf是A。
140.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是S；XdXe是SE且Xf是S。
141.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是C；XdXe是SE且Xf是S。
142.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是A；XdXe是ES且Xf是A。
143.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是A；Xb是N；Xc是C；XdXe是ES且Xf是A。
144.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是S；XdXe是ES且Xf是S。
145.根据项目110或111所述的FcRn结合多肽，其中在序列iii)或v)中，Xa是S；Xb是E；Xc是C；XdXe是ES且Xf是S。
146.根据项目110和112-145的任一项所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由以下组成的组：SEQ ID NO:354-706。
147.根据项目146所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由以下组成的组：SEQID NO:354-368、SEQ ID NO:370-493和SEQ ID NO:706。
148.根据项目147所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由以下组成的组：SEQID NO:354-355和SEQ ID NO:370-493。
149.根据项目148所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由以下组成的组：SEQID NO:354-355、SEQ ID NO:370-445、SEQ ID NO:447-456、SEQ ID NO:458-478和SEQ IDNO:480-493。
150.根据项目147所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由以下组成的组：SEQID NO:354-361、SEQ ID NO:366、SEQ ID NO:372-373、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:381、SEQID NO:394、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:428-430和SEQ ID NO:706。
151.根据项目149或150所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由以下组成的组：SEQ ID NO:354、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:397、SEQID NO:418、SEQ ID NO:426和SEQ ID NO:428-430。
152.根据项目151所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由以下组成的组：SEQID NO:354、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:428和SEQ ID NO:430。
153.根据项目152所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由以下组成的组：SEQID NO:354、SEQ ID NO:376和SEQ ID NO:428。
154.根据项目153所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)是SEQ ID NO:354。
155.根据项目1-109的任一项所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
vii)YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P；
其中[BM]是如项目1-105的任一项定义的FcRn结合基序且Xc选自A、S和C；和
viii)与由vii)定义的序列具有至少94％同一性的氨基酸序列。
156.根据项目1-109的任一项所述的FcRn结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
ix)FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P；
其中[BM]是如项目1-105的任一项定义的FcRn结合基序且Xc选自A和C；和
x)与由ix)定义的序列具有至少94％同一性的氨基酸序列。
157.根据项目109所述的FcRn结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；和
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；
其中[BM]是如项目1-105的任一项中定义的FcRn结合基序。
158.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
xi)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]是如项目1-105的任一项中定义的FcRn结合基序；和
xii)与xi)中定义的序列具有至少94％同一性的氨基酸序列。
159.根据项目158所述的FcRn结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1060-1062组成的组。
160.根据任一项前述项目，所述FcRn结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xiii)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]是如项目1-105的任一项中定义的FcRn结合基序；和
xiv)与xiii)中定义的序列具有至少94％同一性的氨基酸序列。
161.根据项目160所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由以下组成的组：SEQID NO:707-1059。
162.根据项目161所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由以下组成的组：SEQID NO:707-721、SEQ ID NO:723-846和SEQ ID NO:1059。
163.根据项目162所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由以下组成的组：SEQID NO:707-708和SEQ ID NO:723-846。
164.根据项目163所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由以下组成的组：SEQID NO:707-708、SEQ ID NO:723-798、SEQ ID NO:800-809、SEQ ID NO:811-831和SEQ IDNO:833-846。
165.根据项目162所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由以下组成的组：SEQID NO:707-714、SEQ ID NO:719、SEQ ID NO:725-726、SEQ ID NO:729、SEQ ID NO:734、SEQID NO:747、SEQ ID NO:750、SEQ ID NO:771、SEQ ID NO:776、SEQ ID NO:779、SEQ ID NO:781-783和SEQ ID NO:1059。
166.根据项目163或165所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由以下组成的组：SEQ ID NO:707、SEQ ID NO:729、SEQ ID NO:734、SEQ ID NO:747、SEQ ID NO:750、SEQID NO:771、SEQ ID NO:779和SEQ ID NO:781-783。
167.根据项目166所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由以下组成的组：SEQID NO:707、SEQ ID NO:729、SEQ ID NO:750、SEQ ID NO:771、SEQ ID NO:781和SEQ ID NO:783。
168.根据项目167所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由以下组成的组：SEQID NO:707、SEQ ID NO:729和SEQ ID NO:781。
169.根据项目168所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)是SEQ ID NO:707。
170.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，其能够在pH 6.0结合FcRn，使得相互作用的KD值是至多1x 10-6M，诸如至多1x 10-7M，诸如至多1x 10-8M，诸如至多1x 10-9M，诸如至多1x 10-10M。
171.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值高于在pH 6.0的所述相互作用的KD值，比在pH 6.0的所述相互作用的KD值诸如高至少2倍，诸如高至少5倍，诸如高至少10倍，诸如高至少50倍，诸如高至少100倍。
172.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，其中在pH 7.4的所述相互作用的KD值是至少1x 10-8M，诸如至少1x 10-7M，诸如至少1x10-6M，诸如至少1x 10-5M。
173.根据项目1-170的任一项所述的FcRn结合多肽，其中在pH 7.4的所述相互作用的KD与在pH 6.0的所述相互作用的KD相同或低于在pH6.0的所述相互作用的KD。
174.根据项目1-170的任一项所述的FcRn结合多肽，其中在pH 7.4的所述相互作用的KD值是至多1x 10-6M，诸如至多1x 10-7M，诸如至多1x 10-8M，诸如至多1x 10-9M，诸如至多1x 10-10M。
175.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽在C-末端和/或N-末端包含至少一个另外的氨基酸。
176.根据项目175所述的FcRn结合多肽，其中所述至少一个另外的氨基酸延伸改进所述多肽的产生、纯化、体内或体外的稳定、偶合或检测。
177.根据任一项前述项目所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽以多聚体形式包含至少两个FcRn结合多肽单体单元，所述至少两个FcRn结合多肽单体单元的氨基酸序列可相同或不同。
178.根据项目177所述的FcRn结合多肽，其中所述FcRn结合多肽单体单元被共价地偶合在一起。
179.根据项目177所述的FcRn结合多肽，其中所述FcRn结合多肽单体单元被表达为融合蛋白。
180.根据项目177-179的任一项所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽呈二聚体形式。
181.融合蛋白或缀合物，其包含
-第一部分，所述第一部分由根据任一项前述项目的FcRn结合多肽组成；和
-第二部分，所述第二部分由具有期望的生物学活性的多肽组成。
182.根据项目181所述的融合蛋白或缀合物，其中所述融合蛋白或缀合物的体内半衰期长于具有期望的生物学活性的多肽本身的体内半衰期。
183.根据项目181-182的任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物学活性是治疗活性。
184.根据项目181-182的任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物学活性是对选定的靶的结合活性。
185.根据项目184所述的融合蛋白或缀合物，其中所述选定的靶是白蛋白。
186.根据项目185所述的融合蛋白或缀合物，其中所述白蛋白结合活性由链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域域或其衍生物来提供。
187.根据项目185-189的任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中所述白蛋白结合活性增加所述融合蛋白或缀合物的体内半衰期。
188.根据项目181-182的任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物学活性是酶活性。
189.根据项目181-183的任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中具有期望的生物学活性的第二部分是治疗活性多肽。
190.根据项目181-183和188-189的任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中具有期望的生物学活性的第二部分选自由酶、激素、生长因子、趋化因子和细胞因子组成的组。
191.根据任何前述项目所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，其抑制IgG对FcRn的结合。
192.根据项目191所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物与FcRn之间的相互作用的KD值低于IgG与FcRn之间的相互作用的KD。
193.根据任何前述项目所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，其还包含标签。
194.根据项目193所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述标签选自由荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素和颗粒组成的组。
195.根据任何前述项目所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，所述FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物包括由经由半胱氨酸残基的硫醇基或赖氨酸残基的胺基缀合至所述FcRn结合多肽的聚氨基聚羧酸螯合剂提供的螯合环境。
196.根据项目195所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述聚氨基聚羧酸螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸或其衍生物。
197.根据项目196所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸衍生物是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸-10-马来酰亚胺乙基乙酰胺。
198.根据项目195所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述聚氨基聚羧酸螯合剂是1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸或其衍生物。
199.根据项目195所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述聚氨基聚羧酸螯合剂是二亚乙基三胺五乙酸或其衍生物。
200.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据项目1-192的任一项的多肽。
201.表达载体，所述表达载体包含根据项目200的多核苷酸。
202.宿主细胞，所述宿主细胞包含根据项目201的表达载体。
203.产生根据项目1-192的任一项的多肽的方法，所述方法包括
-在容许所述多肽由所述表达载体表达的条件下培养根据项目202的宿主细胞，和
-分离所述多肽。
204.组合物，所述组合物包含根据项目1-199的任一项的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
205.根据项目204所述的组合物，所述组合物还包含至少一种另外的活性剂。
206.根据项目204-205的任一项所述的组合物，所述组合物适用于通过选自由以下组成的组的途径施用：口服施用、鼻内施用、肺部施用、阴道施用、直肠施用、静脉内注射、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射和皮内注射。
207.根据项目1-199的任一项的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目204-206的任一项的组合物，所述FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物或组合物用于作为药物的用途。
208.根据项目207的用于所述用途的FcRn结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述药物目的是用于治疗自身免疫性状况。
209.根据项目207或208的用于所述用途的FcRn结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述药物目的是用于治疗选自由以下组成的组的状况：重症肌无力、格林-巴利综合征、自身免疫性边缘叶脑炎、链球菌感染相关的儿童自身免疫性神经精神紊乱(PANDAS)、神经性肌强直(艾萨克氏综合征)、莫旺综合征、多发性硬化、寻常天疱疮、落叶型天疱疮(foliaceus)、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、妊娠性类天疱疮、粘膜类天疱疮、硬化性苔藓、抗磷脂综合征、复发性多软骨炎、自身免疫性贫血、特发性血小板减少性紫癜(idiopathic trombocytic purpura)、自身免疫性格雷夫斯病(autoimmune Grave’s disease)、扩张型心肌病、血管炎、肺出血肾炎综合征、特发性膜性肾病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
210.治疗需要其的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据项目1-199的任一项的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目204-206的任一项的组合物。
211.根据项目210所述的方法，所述方法用于治疗自身免疫性状况。
212.根据项目210或211所述的方法，其中所述受试者患有选自由以下组成的组的状况：重症肌无力、格林-巴利综合征、自身免疫性边缘叶脑炎、链球菌感染相关的儿童自身免疫性神经精神紊乱(PANDAS)、神经性肌强直(艾萨克氏综合征)、莫旺综合征、多发性硬化、寻常天疱疮、落叶型天疱疮(foliaceus)、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、妊娠性类天疱疮、粘膜类天疱疮、硬化性苔藓、抗磷脂综合征、复发性多软骨炎、自身免疫性贫血、特发性血小板减少性紫癜(idiopathic trombocytic purpura)、自身免疫性格雷夫斯病(autoimmune Grave’s disease)、扩张型心肌病、血管炎、肺出血肾炎综合征、特发性膜性肾病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
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Claims (60)

1.FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽包含FcRn结合基序BM，所述基序由以下的氨基酸序列组成：
EX2 X3 X4 AX6 X7 EIR WLPNLX16X17 X18 QR X21 AFIX25 X26LX28 X29
其中，所述FcRn结合基序BM的序列选自由SEQ ID NO:1-353组成的组。
2.根据权利要求1所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1-160、SEQID NO:162-166、SEQ ID NO:168-241、SEQ ID NO:243-280、SEQ ID NO:282-286、SEQ IDNO:288-305、SEQ ID NO:307-333和SEQ ID NO:335-353组成的组。
3.根据权利要求1所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1-15、SEQ IDNO:17-140和SEQ ID NO:353组成的组。
4.根据权利要求1所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1-2和SEQ IDNO:17-140组成的组。
5.根据权利要求1所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1-2、SEQ IDNO:17-92、SEQ ID NO:94-103、SEQ ID NO:105-125和SEQ ID NO:127-140组成的组。
6.根据权利要求1所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1-8、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:19-20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:44、SEQID NO:65、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75-77和SEQ ID NO:353组成的组。
7.根据权利要求1所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:73和SEQID NO:75-77组成的组。
8.根据权利要求1所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:77组成的组。
9.根据权利要求1所述的FcRn结合多肽，其中所述序列选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:75组成的组。
10.根据权利要求1所述的FcRn结合多肽，其中所述序列是SEQ ID NO:1。
11.根据前述权利要求1-10中任一项所述的FcRn结合多肽，其中所述FcRn结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。
12.根据前述权利要求1-10中任一项所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
iii)K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ；
其中
[BM]是如权利要求1-10的任一项中定义的FcRn结合基序；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S。
13.根据权利要求12所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由SEQ ID NO:354-513、SEQ ID NO:515-519、SEQ ID NO:521-594、SEQ ID NO:596-633、SEQ ID NO:635-639、SEQID NO:641-658、SEQ ID NO:660-686和SEQ ID NO:688-706组成的组。
14.根据权利要求12所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由SEQ ID NO:354-368、SEQ ID NO:370-493和SEQ ID NO:706组成的组。
15.根据权利要求12所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由SEQ ID NO:354-355和SEQ ID NO:370-493组成的组。
16.根据权利要求12所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由SEQ ID NO:354-355、SEQ ID NO:370-445、SEQ ID NO:447-456、SEQ ID NO:458-478和SEQ ID NO:480-493组成的组。
17.根据权利要求12所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由SEQ ID NO:354-361、SEQ ID NO:366、SEQ ID NO:372-373、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:394、SEQID NO:397、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:428-430和SEQ IDNO:706组成的组。
18.根据权利要求12所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由SEQ ID NO:354、SEQID NO:376、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:426和SEQ ID NO:428-430组成的组。
19.根据权利要求12所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由SEQ ID NO:354、SEQID NO:376、SEQ ID NO:397、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:428和SEQ ID NO:430组成的组。
20.根据权利要求12所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)选自由SEQ ID NO:354、SEQID NO:376和SEQ ID NO:428组成的组。
21.根据权利要求12所述的FcRn结合多肽，其中序列iii)是SEQ ID NO:354。
22.根据前述权利要求1-10中任一项所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xi)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]是如权利要求1-10的任一项中定义的FcRn结合基序。
23.根据权利要求22所述的FcRn结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1060-1062组成的组。
24.根据前述权利要求1-10中任一项所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xiii)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]是如权利要求1-10的任一项中定义的FcRn结合基序。
25.根据权利要求24所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由SEQ ID NO:707-866、SEQ ID NO:868-872、SEQ ID NO:874-947、SEQ ID NO:949-986、SEQ ID NO:988-992、SEQID NO:994-1011、SEQ ID NO:1013-1039和SEQ ID NO:1041-1059组成的组。
26.根据权利要求24所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由SEQ ID NO:707-721、SEQ ID NO:723-846和SEQ ID NO:1059组成的组。
27.根据权利要求24所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由SEQ ID NO:707-708和SEQ ID NO:723-846组成的组。
28.根据权利要求24所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由SEQ ID NO:707-708、SEQ ID NO:723-798、SEQ ID NO:800-809、SEQ ID NO:811-831和SEQ ID NO:833-846组成的组。
29.根据权利要求24所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由SEQ ID NO:707-714、SEQ ID NO:719、SEQ ID NO:725-726、SEQ ID NO:729、SEQ ID NO:734、SEQ ID NO:747、SEQID NO:750、SEQ ID NO:771、SEQ ID NO:776、SEQ ID NO:779、SEQ ID NO:781-783和SEQ IDNO:1059组成的组。
30.根据权利要求24所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由SEQ ID NO:707、SEQID NO:729、SEQ ID NO:734、SEQ ID NO:747、SEQ ID NO:750、SEQ ID NO:771、SEQ ID NO:779和SEQ ID NO:781-783组成的组。
31.根据权利要求24所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由SEQ ID NO:707、SEQID NO:729、SEQ ID NO:750、SEQ ID NO:771、SEQ ID NO:781和SEQ ID NO:783组成的组。
32.根据权利要求24所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)选自由SEQ ID NO:707、SEQID NO:729和SEQ ID NO:781组成的组。
33.根据权利要求24所述的FcRn结合多肽，其中序列xiii)是SEQ ID NO:707。
34.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽能够在pH 6.0结合FcRn，使得相互作用的KD值是至多1x10-6M。
35.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽能够在pH 6.0结合FcRn，使得相互作用的KD值是至多1x10-7M。
36.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽能够在pH 6.0结合FcRn，使得相互作用的KD值是至多1x10-8M。
37.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽能够在pH 6.0结合FcRn，使得相互作用的KD值是至多1x10-9M。
38.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，所述FcRn结合多肽能够在pH 6.0结合FcRn，使得相互作用的KD值是至多1x10-10M。
39.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值高于在pH 6.0的所述相互作用的KD值。
40.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值比在pH 6.0的所述相互作用的KD值高至少2倍。
41.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值比在pH 6.0的所述相互作用的KD值高至少5倍。
42.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值比在pH 6.0的所述相互作用的KD值高至少10倍。
43.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值比在pH 6.0的所述相互作用的KD值高至少50倍。
44.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值比在pH 6.0的所述相互作用的KD值高至少100倍。
45.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值是至少1x10-8M。
46.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值是至少1x10-7M。
47.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值是至少1x10-6M。
48.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值是至少1x10-5M。
49.根据权利要求1-38的任一项所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值是至多1x10-6M。
50.根据权利要求1-38的任一项所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值是至多1x10-7M。
51.根据权利要求1-38的任一项所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值是至多1x10-8M。
52.根据权利要求1-38的任一项所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值是至多1x10-9M。
53.根据权利要求1-38的任一项所述的FcRn结合多肽，其中FcRn结合多肽和FcRn之间在pH 7.4的相互作用的KD值是至多1x10-10M。
54.融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包含
-第一部分，所述第一部分由根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽组成；和
-第二部分，所述第二部分由具有期望的生物学活性的多肽组成。
55.根据任一项前述权利要求所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物，所述FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物抑制IgG与FcRn的结合。
56.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1-55的任一项所述的多肽。
57.组合物，所述组合物包含根据权利要求1-55的任一项所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
58.根据权利要求1-55的任一项所述的FcRn结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据权利要求57所述的组合物在制备药物中的用途。
59.根据权利要求58所述的用途，其中所述药物预期用于治疗自身免疫性状况。
60.根据权利要求58或59所述的用途，其中所述药物预期用于治疗选自由以下组成的组的状况：重症肌无力、格林-巴利综合征、自身免疫性边缘叶脑炎、链球菌感染相关的儿童自身免疫性神经精神紊乱(PANDAS)、神经性肌强直(艾萨克氏综合征)、莫旺综合征、多发性硬化、寻常天疱疮、落叶型天疱疮、大疱性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症、妊娠性类天疱疮、粘膜类天疱疮、硬化性苔藓、抗磷脂综合征、复发性多软骨炎、自身免疫性贫血、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性格雷夫斯病、扩张型心肌病、血管炎、肺出血肾炎综合征、特发性膜性肾病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
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