CN101815723A

CN101815723A - 免疫调节肽

Info

Publication number: CN101815723A
Application number: CN200880101801A
Authority: CN
Inventors: 凯文·A·麦克唐奈; 亚当·R·梅佐
Original assignee: Syntonix Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date: 2007-08-09
Filing date: 2008-08-01
Publication date: 2010-08-25
Also published as: KR20100040951A; CA2694824A1; US8906844B2; WO2009020867A3; AU2008284047A1; TW200911289A; US20110230639A1; WO2009020867A2; MX2010001363A; ZA201001451B; BRPI0814763A2; EA201070231A1; JP2010535788A; EP2203471A2

Abstract

本发明涉及用亲水性聚合物衍生的肽，其在一些实施方案中与人类FcRn结合并抑制IgG的Fc部分与FcRn结合，由此调节血清IgG水平。在一些实施方案中，所公开的组合物和方法可被用于例如治疗自身免疫性疾病和炎性病症。在进一步的实施方案中，本发明还涉及使用和制备本发明的肽的方法。

Description

免疫调节肽

IgG在介导抗病原体的保护和介导加速对组织、粘膜和皮肤表面补充免疫系统成分的过敏性和炎性响应中起到关键作用。Junghans，Immunol.Res.16(1)：29(1997)。然而，IgG还在各种自身免疫性疾病中起到关键作用。

IgG的血清半衰期比其他血浆蛋白的血清半衰期更长。例如，IgG的血清半衰期在小鼠中是5至7天而在人类中是22至23天。Roopenian等，J.Immunol.170：3528(2003)；Junghans和Anderson，Proc.Natl.Acad.SciUSA 93：5512(1996)。血清半衰期的延长至少部分上是由于新生的Fc受体，即FcRn，其与胞饮的IgG的Fc部分结合(在成人和新生儿二者中)以阻止其被溶酶体降解。之后胞饮的IgG循环回到细胞外区室。参见例如Junghans和Anderson，Proc.Naal.Acad.Sci USA 93：5512(1996)，Roopenian等，J.Immunol.170：3528(2003)。事实上，IgG的血清半衰期在不表达编码β₂m和FcRn重链的基因的至少一部分的敲除小鼠模型中减少。参见WO02/43658以及Junghans和Anderson，Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：5512(1996)。

当IgG的浓度达到超过可获得的FcRn的水平时，未结合的IgG不能避免降解机制并且由此具有较短的血清半衰期。参见例如Brambell等，Nature 203：1352(1964)。类似地，当IgG与FcRn的结合被抑制时，IgG血清半衰期减少，由此阻止IgG循环。因此，抑制或拮抗IgG与FcRn的结合的剂可被用于调节、治疗或预防由不适当表达的IgG抗体的存在所表征的病症(例如，诸如自身免疫性和炎性疾病和病症)。例如，已经使用FcRn重链敲除小鼠系生产了能够抑制FcRn与IgG的结合的抗体(WO02/43658)。在另一个实例中，与FcRn复合体结合的肽已经被鉴定。Kolonin等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 99(20)：13055-60(2002)；美国专利第6,212,022号。进一步描述了这些肽、它们的合成和它们的用途的2007年2月16日提交的美国申请序列第11/676,148号和2006年2月17日提交的美国临时申请第60/774,853号以及2006年6月23日提交的第60/805,634号的内容通过引用全文并入本文。然而，同时需要调节、治疗或预防由免疫反应表征的病况、疾病和病症的另外的剂。

因此，公开了这样的肽，其特异性结合FcRn并抑制IgG Fc与FcRn结合，由此通过防止FcRn起到其保护IgG免受溶酶体降解的作用来防止IgG循环。在示例性的实施方案中，肽与FcRn结合并抑制IgG的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类与FcRn结合。

本发明的肽可作为单体或可选择地作为多聚体，例如诸如二聚体、三聚体或四聚体存在。在一些实施方案中，本发明的肽可以是更易受胞饮作用影响的，其使得肽的结合更迅速并且由此减少经由肾的排出。

在一些实施方案中，本发明提供了含有治疗有效量的本发明的一种或多种肽的药物组合物。

在其他实施方案中，本发明提供调节疾病状况的方法，其包括将细胞与治疗有效量的本发明的一种或多种肽的肽接触。进一步的实施方案包括调节受治疗者的血清中IgG水平的方法，其包括向所述受治疗者施用治疗有效量的含有能够与FcRn结合并抑制FcRn与IgG分子的Fc部分结合的本发明的一种或多种肽的组合物。在某些实施方案中，本发明的方法可被用于减少受治疗者的血清中可溶的IgG的半衰期。在一些实施方案中，施用本发明的组合物的结果是与施用肽之前受治疗者的血清中的IgG的半衰期相比受治疗者的血清中的可溶的IgG的半衰期减少。

在其他的实施方案中，本发明提供用于抑制人类IgG的Fc部分与FcRn结合以引起与治疗前IgG的血清浓度相比IgG血清浓度的降低的方法。降低IgG血清浓度的方法包括对受治疗者施用治疗有效量的含有能够抑制IgG分子的Fc部分与FcRn结合的本发明的一种或多种肽的组合物。在一些实施方案中，人类IgG的血清浓度的降低为至少5％，例如至少15％的降低或至少25％的人类IgG血清浓度上的降低。

本发明的一些实施方案提供治疗患有由IgG的增加的或不适当的表达所表征的疾病(例如自身免疫性疾病、炎性疾病或免疫系统癌)的受治疗者的方法，其包括对受治疗者施用治疗有效量的含有能够防止FcRn与IgG分子的Fc部分结合的本发明的一种或多种肽的组合物。在一些实施方案中，本发明的方法可被用于预防、治疗或调节对治疗性蛋白或基因治疗载体的免疫应答。

在其它的实施方案中，提供了检测FcRn的方法，其包括将本文描述的肽用至少一种可检测的标记物进行标记，所述可检测的标记物选自例如放射性同位素、酶(例如催化产生可检测的包括有颜色的、发光的或发荧光的产物的反应的酶)、荧光团、发色团、化学发光的化合物、磁性颗粒、微球体、纳米球、生物素、链霉亲和素和地高辛。

本发明的其他实施方案包括纯化FcRn的方法，其包括将本文所描述的肽固定于固相支持体，将含有FcRn的溶液与固相支持体上的固定的肽接触以及通过将所述溶液与所述固相支持体分离来纯化FcRn。

本发明的另外的实施方案、目的和优点部分地展示于之后的说明书中，并且在某种程度上从说明书中是明显的，或者可通过本发明的实行而学到。本发明的这些实施方案、目的和优点可通过在所附的权利要求中特别指出的元素和组合的方式来实现并获得。

应当理解的是，上述一般描述和下列详细描述都仅仅是示例性和解释性的，并且不限制所要求的本发明。

附图简述

图1显示如实施例12中所描述的示例性说明的N端醛肽单体的合成的概览。

图2显示作为示例性说明的实例的使用肽第270号经由如实施例12中所描述的还原性烃基化来合成肽二聚体的概览。

图3描述作为肽二聚体的合成的示例性说明的实例的通过使用含有肽和溴乙酰化的肽的二硫醇连接体来合成肽第100号。放置在肽序列上方的水平方括弧指示桥连的存在。

图4显示作为肽二聚体的合成的示例性说明的实例的使用含有肽和溴乙酰化的肽的硫醇连接体来合成肽第122号。放置在肽序列上方的水平方括弧指示桥连的存在。

图5显示使用含有连接体的二酸的肽二聚体的合成。作为示例性说明的实例显示肽第283号的合成。放置在肽序列下方的水平方括弧指示桥连的存在。

图6显示使用含有连接体的胺的肽二聚体的合成。作为示例性说明的实例显示肽第280号的合成。放置在肽序列下方的水平方括弧指示桥连的存在。

图7显示通过在4-20％Tris-Gly胶上对纯化的肽第289号的SDS-PAGE分析所得的肽第289号的分子量。第1道含有分子量标志物。第2道含有未轭合的PEG_30kDa起始物质。第3道含有粗反应混合物。第4道含有纯化的肽第289号。

图8显示TG32B小鼠中静脉内注射肽第289号之后人类IgG分解代谢的动力学。

图9显示肽第290、291、292和293号的化学结构。

图10提供了使用4-20％Tris-Gly胶的通过还原性烃基化而合成的聚乙二醇化肽的SDS-PAGE分析。向所有道加样10mg。第1道含有分子量标志物。第2道含有未轭合的PEG_30kDa起始物质醛。第3道含有纯化的肽第290号。第4道含有未轭合的PEG_20kDa起始物质醛。第5道含有纯化的肽第291号。第6道含有未轭合的PEG_5kDa起始物质醛。第7道含有纯化的肽第292号。

图11提供使用4-20％Tris-Gly胶的通过还原性烃基化合成的聚乙二醇化肽的SDS-PAGE分析。第1道含有分子量标志物。第2道含有纯化的肽第292号。第3道含有纯化的肽第291号。第4道含有纯化的肽第290号。第5道含有纯化的肽第293号。第6道含有纯化的肽第295号。第7道含有纯化的肽第296号。第8道含有分子量标志物。

图12显示在t＝0h时500mg/kg IV剂量的人类IgG以及随后在t＝24小时时的5mg/kg或25mg/kg的肽第290号的静脉注射之后TG32B小鼠中的人类IgG分解代谢的速率。将hIgG的浓度通过如实施例18中的ELISA进行确定，标准化至t＝24h的水平并且与媒介物对照组比较。

图13显示肽第295号的化学结构。

图14显示肽第296号的化学结构。

图15显示如实施例35中所描述的在t＝0h时500mg/kg IV剂量的人类IgG以及随后在t＝24小时时的25mg/kg的肽第290、291、293、295和296号的静脉注射之后TG32B小鼠中的人类IgG分解代谢的速率。将hIgG的浓变通过如实施例18中的ELISA进行确定，标准化至t＝24h的水平并且与媒介物对照组比较。

图16是使用如实施例4中描述的IgG竞争ELISA测定和实施例18的人类IgG分解代谢来比较不同的肽的体外和体内活性的表格。

图17显示具有支链PEG连接的抗FcRn肽的合成。

图18显示肽第297号的化学结构。

图19显示肽第307、308和309号的化学结构。

图20显示使用2.5mg/kg皮下剂量的如实施例18中所描述的IgG分解代谢实验中肽283、298、299、300、301的作用。

I.定义

如本文所用的，术语“氨基酸”，包括编码和非编码氨基酸。本文中标准的1和3字母缩写被用于编码的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)。

非编码氨基酸包括例如α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸和ω-氨基酸并且可以在任何手性原子处具有R或S手性。非编码氨基酸包括编码氨基酸的异构体，例如诸如立体异构体(包括例如D-氨基酸和别-氨基酸，例如诸如别-苏氨酸和别-异亮氨酸)以及编码氨基酸的结构异构体(包括例如B-丙氨酸)。本文中小写单字母编码被用于表示具有D-手性的编码氨基酸的立体异构体(例如，a＝D-丙氨酸，y＝D-酪氨酸)。非编码氨基酸还包括N-甲基化氨基酸。本文中常规的3字母缩写被用于某些常见的非编码氨基酸(例如，Aib＝氨基异丁酸，Apa＝5-氨基戊酸，Dab＝1，3-二氨基丁酸，Dap＝1，2-二氨基丙酸，Om＝鸟氨酸，Pen＝青霉胺，Sar＝肌氨酸)。通常，当没有特定构型表示α-氨基酸时，本领域技术人员将理解氨基酸为L-氨基酸。然而，在特定的实施方案中，非编码氨基酸也可以是外消旋的、非外消旋的和非对映体的混合物的形式。

非编码氨基酸是肽领域中熟知的并且包括例如N-乙酰丝氨酸、别-异亮氨酸、别-苏氨酸、β-丙氨酸(3-氨基丙酸)、α-氨基己二酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、3-氨基-1-羧甲基戊内酰胺、1-氨基环戊烷羧酸、6-氨基己酸、2-氨基庚二酸、7-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、氨甲基吡咯羧酸、8-氨基-3，6-二氧代-辛酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸、氨基四氢吡喃-4-羧酸、吖丁啶羧酸、苯并噻唑基丙氨酸、丁基甘氨酸、肉毒碱、4-氯苯丙氨酸、瓜氨酸、环己基丙氨酸、环己基抑胃酶氨酸(cyclohexylstatine)、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸、二羟基苯丙氨酸、二甲基噻唑烷羧酸、4-脒基-苯丙氨酸、高精氨酸、高瓜氨酸、高半胱氨酸、高苯丙氨酸、高脯氨酸、高丝氨酸、4-肼基苯甲酸、4-羟基脯氨酸、异哌啶甲酸、甲醇基脯氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、对氨基苯甲酸、青霉胺、苯基甘氨酸、邻-磷酸丝氨酸、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸、抑胃酶氨酸、四氢吡喃基甘氨酸、噻吩基丙氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸。

氨基酸的“类似物”是并非氨基酸但是在至少一个特性(例如大小、电荷、亲水性、疏水性、极性、氢结合能力或刚性)方面类似于氨基酸的分子。例如，乳酸可以是氨基酸类似物。相似地，二肽的类似物是并非二肽但是在至少一个特性(例如大小、电荷、亲水性、疏水性、极性、氢结合能力或刚性)方面类似于二肽的分子。进一步地，肽类似物是并非肽但是在至少一个特性(例如大小、电荷、亲水性、疏水性、极性、氢结合能力或刚性)方面类似于肽的分子。在一些实施方案中，二肽类似物或肽类似物可以因为一个或多个肽连接通过本领域中熟知的方法被选自例如-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-C(O)CH₂-、-CH(OH)CH₂-或-CH₂SO-的连接所取代而与二肽或肽不同。参见例如Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Evans等，J.Med.Chem.30：1229(1987)。二肽类似物还包括例如β-转角类似物。参见例如Friedinger，J.Med.Chem.46：5553-5566(2003)和Hanessian，Tetrahedron 53：12789-12854(1997)。

二肽类似物的非限制性的实例包括例如β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基丁酸、3-(氨甲基)苯甲酸、4-(氨甲基苯甲酸)、3-(氨基苯基)乙酸、4-(氨基苯基)乙酸以及：

(D，L-Friedinger氏内酰胺)；

(L，L-Friedinger氏内酰胺)；

-3(S)-氨基-2-氧代-1-哌啶-乙酸和3(R)-3-氨基-2-氧代-1-哌啶-乙酸；

-3(S)-氨基-2-氧代-1-氮杂

乙酸和3(R)-3-氨基-2-氧代-1-氮杂

乙酸；

-3(S)-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸和3(R)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸；以及

-3-氨基-N-1-羧甲基-2，3，4，5-四氢-1H-[1]-苯并氮杂

-2-酮。

与给定序列“大致上相同的”氨基酸序列可以是与给定序列例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的。大致上相同的序列可通过一个或多个氨基酸的平截、缺失、取代、添加或修饰，包括用一个或多个非编码氨基酸(例如诸如D-氨基酸或N-甲基化的氨基酸)或氨基酸类似物代替一个或多个氨基酸而从给定的序列变化而来。可选择地，大致上相同的序列可仅通过保守的氨基酸取代而与给定的序列不同。

保守的取代是这样的取代，其中第一个氨基酸被接近第一个氨基酸的至少一个特性例如诸如大小、电荷、亲水性、疏水性、极性、氢结合能力或刚性的第二个氨基酸代替。保守的取代涵盖编码和非编码的氨基酸二者以及氨基酸类似物。

例如，在一些实施方案中，丙氨酸可保守地被另一个疏水性氨基酸例如诸如甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸或上述提到的氨基酸中的任一个的类似物所取代。在其他的实施方案中，丙氨酸可保守地被几乎等电子排列的氨基酸例如诸如β-丙氨酸、乙基甘氨酸、α-氨基异丁酸或D-丙氨酸或上述提到的氨基酸中的任一个的类似物所取代。在一些实施方案中，半胱氨酸可保守地被其他含有硫醇的氨基酸例如诸如高半胱氨酸、D-半胱氨酸或青霉胺或上述提到的氨基酸中的任一个的类似物所取代。在其他的实施方案中，半胱氨酸可保守地被几乎等电子排列的氨基酸诸如例如丝氨酸、苏氨酸或2，3-二氨基丙酸或上述提到的氨基酸中的任一个的类似物所取代。在其他的实施方案中，苯丙氨酸可保守地被例如3-氟苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、1-萘基丙氨酸和3，3-二苯基丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸、五氟苯丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、2-吡咯烷基丙氨酸、3-哌啶基丙氨酸或4-哌啶基丙氨酸或上述提到的氨基酸中的任一个的类似物所取代。作为另一个实例，组氨酸可保守地被碱性氨基酸例如诸如赖氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸、精氨酸或脒基丙氨酸或上述提到的氨基酸中的任一个的类似物所取代。在其他的实施方案中，组氨酸可保守地被芳香族氨基酸例如诸如噻吩基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸或上述提到的氨基酸中的任一个的类似物所取代。在还有其他的实施方案中，组氨酸可保守地被碱性的芳香族氨基酸例如诸如1-甲基组氨酸、2-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-脒基苯丙氨酸、噻唑基丙氨酸和其类似物所取代。

在某些实施方案中，保守的取代可以是用具有相似亲水指数例如以诸如±0.5、±1或±2变化的值的第二个氨基酸代替第一个氨基酸。在其他的实施方案中，保守的取代可以是用具有相似亲水值例如以诸如±0.5、±1或±2变化的值的第二个氨基酸代替第一个氨基酸。

在一些实施方案中，可引入非保守的取代。非保守的取代可以是例如用中性氨基酸代替带电荷的氨基酸的取代、用酸性氨基酸代替碱性氨基酸的取代、用非极性氨基酸代替极性氨基酸的取代、用疏水性氨基酸代替亲水性氨基酸的取代、用空间上不相似的氨基酸或具有不同的氢键合能力的氨基酸代替氨基酸的取代。可在适当的时候进行非保守的取代。例如，本领域的技术人员能够鉴定可被非保守取代而肽的生物活性(例如诸如体内FcRn结合亲和力或IgG浓度的降低)或结构没有显著改变的肽的一个或多个氨基酸。参见，例如实施例7。

II.用亲水性聚合物衍生的肽

通常，本公开提供用亲水性聚合物衍生的肽。例如，实施例中公开的肽中的任一个可以是用亲水性聚合物衍生的或可被修饰(例如，如下文所描述的)以使得它们可以是用亲水性聚合物衍生的。当与本发明的肽连用时，术语“衍生的”是指含有亲水性聚合物的氨基酸或肽或者氨基酸或肽的类似物。

亲水性聚合物可选自，例如聚乙二醇，包括例如单烃基聚乙二醇；聚丙二醇；多糖，例如诸如葡聚糖和纤维素、甲基纤维素、羟基纤维素、羟甲基纤维丝、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟基烃基淀粉包括例如羟乙基淀粉；聚乙烯醇；聚(N-乙烯吡咯烷酮)和泊洛沙姆。在其他的实施方案中，亲水性聚合物可选自，例如聚乙二醇共聚物，例如诸如聚乙二醇-聚丙二醇共聚物和聚乙二醇-聚(N-乙烯吡咯烷酮)共聚物。在一些实施方案中，亲水性聚合物是非肽聚合物。在一些实施方案中，亲水性聚合物是容易水化的。在一些实施方案中，亲水性聚合物水化时具有大的流体动力学半径。在示例性说明的实施方案中，亲水性聚合物是聚乙二醇。

在一些实施方案中，本发明的肽(单体或多聚体)的每个肽单体可含有一分子的亲水性聚合物。在其他的实施方案中，本发明的肽的每个肽单体可含有多分子的亲水性聚合物。例如，本文公开的抗FcRn肽的每个肽单体可具有1、2、3、4、5、6、7、8或1-4、1-8、2-3、2-4、2-6、3-6或2-6分子的亲水性聚合物。

在一些实施方案中，亲水性聚合物可以是直链的。在其他实施方案中，亲水性聚合物可以是支链的。支链的亲水性聚合物可具有例如2、3、4、5、6、7或8条支链。在一些实施方案中，亲水性聚合物可具有例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60kDa的平均分子量或可具有在例如约10-60、10-40、10-30、20-30、20-40、20-50、30-60、15-25、25-35、35-45或45-55kDa范围内变化的平均分子量。

在一些实施方案中，本文描述的衍生的肽相对于相应的未衍生的肽表现出增强的药学特性。例如，衍生的肽可在动物中具有延长的血清半衰期。在一些实施方案中，衍生的肽可具有比人类、小鼠、大鼠和食蟹猴中的任一种中相应的未衍生的肽高至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、175、200或300％的血清半衰期。在其他的实施方案中，衍生的肽可具有比人类、小鼠、大鼠和食蟹猴中的任一种中相应的未衍生的肽高至少2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100、200、500、1,000、5,000或10,000倍的血清半衰期。血清半衰期可使用适当抗体通过例如LC-MS或ELISA测定来确定。在某些实施方案中，衍生没有导致效力上的显著降低。例如，在一些实施方案中，衍生没有导致例如结合亲和力上的显著降低。在其他的实施方案中，衍生没有导致对IgG-FcRn相互作用的抑制活性上的显著降低。例如，在一些实施方案中，衍生没有导致如通过例如实施例4中所描述的IgG-肽竞争测定、Biacore或KinExA(动力排除测定)所测量的效力上的显著降低，并且衍生的肽可具有相应的未衍生的肽的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、97、98或99％的效力。

在一些实施方案中，单体肽例如诸如肽第227、235和239号可被衍生或可被修饰(例如通过保守或非保守的取代)以使得它们可以被衍生。在其他的实施方案中，多聚体肽例如诸如肽第119、247、278、285、286、287号可被衍生或可被修饰以使得它们可以被衍生。

本发明的衍生的肽可选自例如肽第290、291、292、293、294、295和296号。在示例性说明的实施方案中，衍生的抗FcRn的肽可以是肽第285号，其被实施例24、27-29和31中所描述的直链PEG链或实施例33-34中所描述的支链PEG链聚乙二醇化。在一些实施方案中，支链的PEG链可比直链PEG提供更有利的体外和体内特性。在示例性说明的实施方案中，支链的聚乙二醇化的肽可以是肽第285号与20kDa两条支链的PEG或两条支链40kDa的PEG的还原性烃基化产物。

衍生的肽可以是单体的或多聚体的(包括例如诸如二聚体、三聚体或四聚体的肽)。在多聚体肽的情况下，组成多聚体的单独的肽单体中的每一个可与多聚体中任何其他的肽单体相同或不同。在一些实施方案中，肽多聚体可通过将单独的肽单体与多价连接体反应来合成。参见例如Rose，J.Am.Chem.Soc.116：30(1994)。例如，肽多聚体可通过将单独的肽单体在树脂上与多价连接体反应来合成。在其他的实施方案中，肽多聚体可如例如Posnett等，J.Biol.Chem.263：1719(1988)中在肽序列合成前通过引入支链的连接体基团来合成。

可使用本领域技术人员已知的任何适合的连接体。通常，选择不干扰与FcRn的结合的连接体。例如，连接体可以是例如实施例、美国专利第4,671,958、4,867,973、5,691,154、5,846,728、6,472,506、6,541,669、7,141,676、7，176,185和7,232,805号以及美国专利申请公开第2006/0228348号中所公开的连接体中的一种。

通常，连接体可具有适当的长度以便其避免多聚体的肽单体之间的空间位阻并且不干扰肽单体与FcRn的结合。在一些实施方案中，连接体可以是共价键。在其他的实施方案中，连接体可含有1-100、1-60、5-60、5-40、2-50、2-20、5-10或5-20个直链原子，其中连接体通过例如酯、酰胺、腙、肟、缩氨基脲、醚、硫醚、硫代磷酸、磷酸酯、硫酯和/或二硫键方式与肽单体连接。连接体中其余的直链原子优选地选自由碳、氧、氮和硫组成的组，其中任一种原子可任选地包含在碳环、杂环、芳基或杂芳基环中。连接体中的直链碳原子可任选地由选自由卤代、羟基、硝基、卤代烃基、烃基、烃芳基、芳基、芳烃基、烃氧基、芳氧基、氨基、酰氨基、烃基氨基甲酰、芳基氨基甲酰、氨基烃基、烃氧基羰基、羧基、羟基烃基、烃磺酰基、芳烃磺酰基、烃基磺酰氨基、芳烃磺酰氨基、芳烃基磺酰氨基、烃基羰基、酸基、氰基和脲基组成的组的取代基所取代。连接体中的直链氮原子可任选地由酰基、磺酰基、烃基、烃芳基、芳基、芳烃基、烃氧羰基所取代。连接体中的直链硫原子可任选地被氧化。在某些实施方案中，连接体是可断开的，如例如美国专利申请公开第2006/0228348号和美国专利第4,867,973、7,176,185、7,232,805号中所公开的。

在一些实施方案中，衍生的肽可包括进一步的修饰，例如诸如糖基化、乙酰化、磷酸化或脂化。

衍生的肽，在某些实施方案中，具有对FcRn的一定的亲和性。例如，在一些实施方案中，肽-FcRn相互作用的K_D可在50fM至1mM的范围内。在其他实施方案中，K_D可在50fM至100μM、50fM至1nM或1pM至1nM的范围内。

在一些实施方案中，肽抑制IgG的Fc部分与FcRn的结合。例如，在某些实施方案中，肽能以例如50fM至100μM、50fM至1μM、1pM至100nM或10pM至10nM的IC₅₀来抑制IgG的Fc部分与FcRn的结合。

A.示例性的衍生的肽

在一些实施方案中，本公开提供下列示例性的衍生的肽。

示例性实施方案1：衍生的肽，其具有下列序列：

(I)A-X₀-X₁-X₂-X₃-X₄-Gly-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-B，

其中：

-A，如果存在，含有亲水性聚合物或者是氢、酰基或氨基保护基团；

-B，如果存在，含有亲水性聚合物或者是Q、氨基基团、羟基或羧基保护基团；

-Q，如果存在，含有胺基团(其可以是中性的或带正电的)，其中所述胺基团通过亚烃基基团连接于肽，其中所述亚烃基基团包括但不限于乙烯、正丙烯、正丁烯、正戊烯和正己烯；或通过亚烃基基团和亚烃氧基(alkylene oxide)亚单元的组合连接于肽，其中亚烃氧基亚单元包括但不限于-(CH₂-CH₂-O)_P-，其中p是1、2、3、4或5。Q的非限制性实例包括

-CH₂-CH₂-NH₂，

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂，

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂，

-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-NH₂，

-(CH₂-CH₂-O)₂-CH₂-CH₂-NH₂，和

-(CH₂-CH₂-O)₃-CH₂-CH₂-NH₂；

-X₀，如果存在，是任选地衍生的氨基酸或其类似物或是含2-15个氨基酸的任选地衍生的肽或其类似物；

-X₁，如果存在，是任选地衍生的氨基酸或其类似物；

-X₂，如果存在，是氨基酸或其类似物；

-X₃是能够与X₁₀、X₁₂或X₁₃形成桥连的氨基酸或其类似物；

-X₄是任选地衍生的氨基酸或其类似物或是含2或4个氨基酸的任选地衍生的肽或其类似物；

-X₆是碱性氨基酸或其类似物、芳香族氨基酸或其类似物或碱性芳香族氨基酸或其类似物；

-X₇是苯丙氨酸或其类似物；

-X₈和X₉各自独立地选自甘氨酸或其类似物、肌氨酸或其类似物、天冬氨酸或其类似物、D-氨基酸或其类似物和α-氨基异丁酸或其类似物，或者

-X₈，当与X₉合在一起时，形成二肽类似物；

-X₁₀是氨基酸或其类似物，或者

-X₁₀，当与X₉合在一起时，形成二肽类似物；

-X₁₁是酪氨酸或其类似物；

-X₁₂是任选地衍生的氨基酸或其类似物；

-X₁₃，如果存在，是氨基酸或其类似物；

-X₁₄，如果存在，是任选地衍生的氨基酸或其类似物或是含2-15个氨基酸的任选地衍生的肽或其类似物；

-Y含有亲水性聚合物；

-Z是连接体，其连接每一个肽单体，通过

-A；

-B；

-X₀的氨基末端或侧链，如果X₀存在；至X₁的氨基末端或侧链，如果X₀不存在；至X₂的氨基末端或侧链，如果X₀和X₁都不存在；或至X₃的氨基末端或侧链，如果X₀、X₁和X₂都不存在；或

-X₁₄的羧基末端或侧链，如果X₁₄存在；至X₁₃的羧基末端或侧链，如果X₁₄不存在；或至X₁₂的羧基末端或侧链，如果X₁₃和X₁₄都不存在；

-m是选自1、2和3的整数；并且

-n是选自1、2和3的整数；

其中：

-独立地选择每个A、B、X₀、X₁、X₂、X₃、X₄、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃和X₁₄；并且

-肽的每个单体长度上在10至50个氨基酸的范围内。

技术人员将理解的是，如果Z通过X₀的侧链与肽连接，那么A必然存在。相似地，如果Z连接至X₁₄的侧链，那么B必然存在。

在一些实施方案中，A含有亲水性聚合物。例如，A可含有亲水性聚合物和将亲水性聚合物与X₀(或X₁，如果X₀不存在；或X₂，如果X₀和X₁不存在；或X₃，如果X₀、X₁和X₂不存在)相连的连接体(例如诸如本文描述的任何连接体)。在其他实施方案中，A是氢、酰基或氨基保护基团。在一些实施方案中，B含有亲水性聚合物。例如，B可含有亲水性聚合物和将亲水性聚合物与X₁₄(或X₁₃，如果X₁₄不存在；或X₁₂，如果X₁₃和X₁₄不存在)相连的连接体(例如诸如本文描述的任何连接体，包括例如在图18中找到的连接体)。在其他实施方案中，B是氨基基团、羟基基团或羧基保护基团。

取决于环境，可电离的基团例如氨基基团或羧基基团的电荷可以是带电荷的或中性的。

示例性实施方案2：实施方案1的肽，其具有序列：

其中：

-X₁是未衍生的氨基酸或其类似物；

-X₄是未衍生的氨基酸或其类似物或含2或4个氨基酸的未衍生的肽或其类似物；而且

-X₁₂是未衍生的氨基酸或其类似物。

示例性实施方案3：实施方案1的肽，其中X₀不存在。

示例性实施方案4：实施方案1的肽，其中X₁是精氨酸或其类似物。

示例性实施方案5：实施方案1的肽，其中X₂是芳香族氨基酸或其类似物。

示例性实施方案6：实施方案5的肽，其中X₂是苯丙氨酸或其类似物、酪氨酸或其类似物或者色氨酸或其类似物。

示例性实施方案7：实施方案6的肽，其中X₂是苯丙氨酸或其类似物。

示例性实施方案8：实施方案1的肽，其中肽是未桥连的。

示例性实施方案9：实施方案1的肽，其中X₁₀、X₁₂或X₁₃中的至少一个是能够与X₃形成桥连的氨基酸或其类似物。

示例性实施方案10：实施方案9的肽，其中X₃与X₁₀、X₁₂或X₁₃形成桥连。X₃和X₁₀、X₁₂或X₁₃之间的桥连可以是侧链与侧链的桥连或侧链与羧基末端的桥连(例如在其中X₁₃位于肽的羧基末端的实施方案中)。桥连可包括或可来自于一个或多个官能团例如诸如二硫化物(参见例如实施例7)、醚、硫醚、烯烃或酰胺(参见例如实施例10)的形成，在这些实例中桥连可被称为例如二硫桥、醚桥、硫醚桥、烯烃桥或酰胺桥。

示例性实施方案11：实施方案10的肽，其中X₃与X₁₃形成桥连。

示例性实施方案12：实施方案11的肽，其中桥连是侧链与侧链的桥连。

示例性实施方案13：实施方案12的肽，其中侧链与侧链的桥连是二硫桥、醚桥、硫醚桥、烯烃桥或酰胺桥。

示例性实施方案14：实施方案13的肽，其中侧链与侧链的桥连是下列氨基酸之间的二硫桥：

-半胱氨酸和半胱氨酸；

-半胱氨酸和高半胱氨酸；

-半胱氨酸和青霉胺；

-高半胱氨酸和高半胱氨酸；

-高半胱氨酸和青霉胺；或

-青霉胺和青霉胺。

示例性实施方案15：实施方案13的肽，其中侧链与侧链的桥连是下列氨基酸之间的酰胺桥：

-天冬氨酸和赖氨酸；

-天冬氨酸和鸟氨酸；

-天冬氨酸和2，4-二氨基丁酸；

-天冬氨酸和2，3-二氨基丙酸；

-谷氨酸和赖氨酸；

-谷氨酸和鸟氨酸；

-谷氨酸和2，4-二氨基丁酸；或

-谷氨酸和2，3-二氨基丙酸。

示例性实施方案16：实施方案1的肽，其中肽含有至少一个半胱氨酸。

示例性实施方案17：实施方案1的肽，其中肽含有至少一个半胱氨酸类似物，其选自：

-高半胱氨酸；

-D-半胱氨酸；和

-青霉胺。

示例性实施方案18：实施方案1的肽，其中X₄是苏氨酸或其类似物。

示例性实施方案19：实施方案1的肽，其中X₆是碱性氨基酸或其类似物，其选自：

-赖氨酸或其类似物；

-鸟氨酸或其类似物；

-2，4-二氨基丁酸或其类似物；

-2，3-二氨基丙酸或其类似物；

-精氨酸或其类似物；以及

-脒基丙氨酸或其类似物。

示例性实施方案20：实施方案1的肽，其中X₆是芳香族氨基酸或其类似物，其选自：

-酪氨酸或其类似物；

-色氨酸或其类似物；以及

-苯丙氨酸或其类似物。

示例性实施方案21：实施方案1的肽，其中X₆是碱性芳香族氨基酸或其类似物，其选自：

-组氨酸或其类似物；

-1-甲基组氨酸或其类似物；

-2-吡啶基丙氨酸或其类似物；

-3-吡啶基丙氨酸或其类似物；

-4-吡啶基丙氨酸或其类似物；

-4-氨基苯丙氨酸或其类似物；

-4-脒基苯丙氨酸或其类似物；以及

-噻唑基丙氨酸或其类似物。

示例性实施方案22：实施方案21的肽，其中X₆是组氨酸或其类似物、3-吡啶基丙氨酸或其类似物、4-吡啶基丙氨酸或其类似物或者4-脒基苯丙氨酸或其类似物。

示例性实施方案23：实施方案22的肽，其中X₆是4-脒基苯丙氨酸或其类似物。

示例性实施方案24：实施方案22的肽，其中X₆是组氨酸或其类似物。

示例性实施方案25：实施方案1的肽，其中X₇是苯丙氨酸。

示例性实施方案26：实施方案1的肽，其中X₈和X₉中的至少一个选自：

-甘氨酸；

-D-氨基酸；

-α-氨基异丁酸；以及

-肌氨酸。

示例性实施方案27：实施方案1的肽，其中X₈与X₉合在一起时形成二肽类似物，其选自：

-β-丙氨酸；

-4-氨基丁酸；

-5-氨基戊酸；

-3-(氨甲基)苯甲酸；

-4-(氨甲基)苯甲酸；

-3-(氨基苯基)乙酸；

-4-(氨基苯基)乙酸；

-3-氨基-2-氧代-1-哌啶-乙酸；

-3(R)-3-氨基-2-氧代-1-哌啶-乙酸；

-3(R)-3-氨基-2-氧代-1-氮杂

乙酸；

-3(R)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸；以及

-3-氨基-N-1-羧甲基-2，3，4，5-四氢-1H-[1]-苯并氮杂

-2-酮。

示例性实施方案28：实施方案1的肽，其中肽含有苯丙氨酸类似物，其选自：

-色氨酸；

-酪氨酸；

-2-氨基苯丙氨酸；

-3-氨基苯丙氨酸；

-4-氨基苯丙氨酸；

-五氟苯丙氨酸；

-2-吡啶基丙氨酸；

-3-吡啶基丙氨酸；

-4-硝基苯丙氨酸；

-1-萘基丙氨酸；

-高苯丙氨酸；

-苯基甘氨酸；

-2-甲基苯丙氨酸；

-3-甲基苯丙氨酸；

-4-甲基苯丙氨酸；

-2-氯苯丙氨酸；

-3-氯苯丙氨酸；

-4-氯苯丙氨酸；

-3，3-二苯基丙氨酸；

-4，4′-联苯丙氨酸；

-4-叔-丁基苯丙氨酸；

-环己基丙氨酸；

-(4-氨基乙酰基)苯丙氨酸；

-L-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸；

-D-β-甲基苯丙氨酸；以及

-L-β-甲基苯丙氨酸。

示例性实施方案29：实施方案1的肽，其中肽含有至少一个酪氨酸类似物，其选自：

-苯丙氨酸；

-4-氨基苯丙氨酸；

-4-甲氧苯丙氨酸；

-五氟苯丙氨酸；

-2-吡啶基丙氨酸；

-3-吡啶基丙氨酸；

-4-吡啶基丙氨酸；

-4-硝基苯丙氨酸；

-2-硝基酪氨酸；以及

-4-氟苯丙氨酸。

示例性实施方案30：实施方案1的肽，其中X₉和X₁₀合在一起时，形成二肽类似物，其选自：

-D，L-Friedinger氏内酰胺以及

-L，L-Friedinger氏内酰胺

示例性实施方案31：实施方案1的肽，其中肽含有至少一个组氨酸类似物，其选自：

-2，4-二氨基丁酸；

-噻唑基丙氨酸；

-2，3-二氨基丙酸；

-脒基丙氨酸；

-2-吡啶基丙氨酸；

-3-吡啶基丙氨酸；

-4-吡啶基丙氨酸；

-噻吩基丙氨酸；

-鸟氨酸；

-赖氨酸；

-精氨酸；

-4-脒基苯丙氨酸；

-1-甲基组氨酸；

-3-甲基组氨酸；

-1，3-二甲基组氨酸；

-4-氨基苯丙氨酸；

-2-吡咯烷基丙氨酸；

-3-哌啶基丙氨酸；以及

-4-哌啶基丙氨酸。

示例性实施方案32：实施方案1的肽，其中X₁₀选自中性疏水性氨基酸和其类似物。在其他的实施方案中，X₁₀是中性氨基酸或其类似物。在还有其他的实施方案中，X₁₀是疏水性氨基酸或其类似物。在进一步的实施方案中，X₁₀是N-甲基化疏水性氨基酸或其类似物。

示例性实施方案33：实施方案1的肽，其中X₁₁是酪氨酸或其类似物。

示例性实施方案34：实施方案1的肽，其中X₁₂是脯氨酸或其类似物。

示例性实施方案35：实施方案1的肽，其中X₁₃是酪氨酸或其类似物。

示例性实施方案36：实施方案1的肽，其中X₁₄不存在。

示例性实施方案37：实施方案1的肽，其中X₁₅是氨基基团。

示例性实施方案38：实施方案1的肽，其中肽是式II、III和IV中的任一个的肽并且n是1。

示例性实施方案39：实施方案1的肽，其中肽是式II、III和IV中的任一个的肽并且n是2。

示例性实施方案40：实施方案1的肽，其中肽具有序列：

(V)A-X₀-X₁-Phe-X₃-X₄-Gly-His-Phe-Gly-Sar-NMeLeu-Tyr-X₁₂-X₁₃-X₁₄-B，

示例性实施方案41：实施方案40的肽，其中X₀不存在。

示例性实施方案42：实施方案40的肽，其中X₁、X₄和/或X₁₂是衍生的氨基酸或其类似物。

示例性实施方案43：实施方案40的肽，其中肽具有序列：

其中水平方括弧指示桥连的存在。技术人员将理解的是，在式XI中，当C端半胱氨酸残基(X₁₃)的侧链与青霉胺(X₃)形成桥连时，Z通过羧基末端连接每个肽单体。相似地，技术人员将理解的是，在式XII中，当C端半胱氨酸残基(X₁₃)的侧链与青霉胺(X₃)形成桥连时，Z通过羧基末端连接一个肽单体，并且Z通过X₁的氨基末端或侧链与其他肽单体连接。

示例性实施方案44：实施方案1的肽，其中亲水性聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、葡聚糖；纤维素、甲基纤维素、羟基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟基烃基淀粉、聚乙烯醇、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、泊洛沙姆和聚乙二醇共聚物。

示例性实施方案45：实施方案44的肽，其中亲水性聚合物是聚乙二醇(PEG)。

示例性实施方案46：实施方案45的肽，其中PEG是直链PEG。

示例性实施方案47：实施方案45的肽，其中PEG是支链PEG。

示例性实施方案48：实施方案45的肽，其中PEG具有10-60kDa范围内的平均分子量。

示例性实施方案49：实施方案45的肽，其中PEG具有10-40kDa范围内的平均分子量。

示例性实施方案50：实施方案45的肽，其中PEG具有约20kDa的分子量。

示例性实施方案51：实施方案45的肽，其中PEG具有约30kDa的分子量。

示例性实施方案52：实施方案1的肽，其中肽特异性结合人类FcRn。

示例性实施方案53：实施方案52的肽，其中肽对人类FcRn的亲和力在50fM至1mM范围内。

示例性实施方案54：实施方案53的肽，其中肽对人类FcRn的亲和力在500fM至100μM范围内。

示例性实施方案55：实施方案54的肽，其中肽对人类FcRn的亲和力在5pM至1μM范围内。

示例性实施方案56：实施方案52的肽，其中肽抑制人类FcRn与人类IgG的结合并且具有从50fM至1mM范围内的IC₅₀。

示例性实施方案57：实施方案56的肽，其中肽具有从1pM至100nM范围内的IC₅₀。

示例性实施方案58：实施方案56的肽，其中肽具有从10pM至10nM范围内的IC₅₀。

示例性实施方案59：实施方案1的肽，其中肽具有序列：

示例性实施方案60：实施方案59的肽，其中肽具有序列：

其中水平方括弧指示桥连的存在。

示例性实施方案61：实施方案60的肽，其中肽具有序列：

示例性实施方案62：实施方案59的肽，其中肽具有序列：

示例性实施方案63：实施方案1的肽，其中B是Q。

示例性实施方案64：实施方案63的肽，其中B是-(W)_m-(CH₂)_n-NH₂，

其中W，如果存在，是-(CH₂)_p、-(CH₂-CH₂)_p、-(CH₂-O)_p-或

并且m是1、2、3、4或5，n是1、2或3并且p是1、2、3、4、5。

示例性实施方案65：实施方案64的肽，其中X₃与X₁₃形成桥连。

示例性实施方案66：实施方案65的肽，其中桥连是侧链与侧链桥连。

示例性实施方案67：实施方案64的肽，其中X₆是组氨酸或其类似物。

示例性实施方案68：实施方案64的肽，其中X₈和X₉中的至少一个选自：

-甘氨酸；

-D-氨基酸；

-α-氨基异丁酸；以及

-肌氨酸。

示例性实施方案69：实施方案64的肽，其中X₁₄不存在。

示例性实施方案70：实施方案64的肽，其中n是1。

示例性实施方案71：实施方案64的肽，其中肽具有序列：

示例性实施方案72：实施方案71的肽，其中肽具有序列：

其中水平方括弧指示桥连的存在。

示例性实施方案73：实施方案64的肽，其中肽具有序列：

示例性实施方案74：实施方案73的肽，其中肽具有序列：

其中水平方括弧指示桥连的存在。

示例性实施方案75：实施方案74的肽，其中肽具有序列：

其中B是-(W)_m-(CH₂)_r-NH₂，其中W，如果存在，是-(CH₂)_p、-(CH₂-CH₂)_p、-(CH₂-O)_p-或

，并且其中m是1、2、3、4或5，r是1、2或3并且p是1、2、3、4、5。

B.衍生的肽的合成

衍生的肽可根据本领域中已知的任何方法来制备。制备用聚乙二醇衍生的肽(“聚乙二醇化的”肽)的示例性方法在下文描述。可与本文描述的聚合物的任一种一起来使用这些方法。因此，本领域的技术人员将理解的是，整个公开中任何使用术语“聚乙二醇化(pegylate)”、“聚乙二醇化(pegylation)”和“聚乙二醇化的(pegylated)”的时候，任何亲水性聚合物可代替聚乙二醇而容易地被取代。

(1)未聚乙二醇化肽的聚乙二醇化

在一些实施方案中，本文描述的肽可被合成为相应的未聚乙二醇化的肽并且随后被聚乙二醇化。

a.未聚乙二醇化肽的合成

可按照实施例中展示的程序或通过其他已知的合成方法例如固相肽合成法来合成本发明的肽。参见例如Abelson等，编辑，Methods inEnzymology(酶学方法)，第289卷：Sollid-Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)(1997)；Chan和White，编辑，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：APracticalApproach(Fmoc固相肽合成：实用方法)Oxford，UniversityPress Inc.，New York(2000)；Benoiton，Chemistry of Peptide Synthesis(肽合成化学)，CRC(2005)；Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis(肽合成法则)，第2版，Springer-Verlag，New York(1993)；Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，第2版，Pieroe Chemical Co.，Rockford，Ill.(1984)。

全部由编码氨基酸组成的本发明的肽可使用本领域熟知的技术在细胞中重组合成。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning A LaboratoryManual(分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编)，Greene Publishing Associates和Wiley Interscience，N.Y.(1989)。

可选择地，可使用合成和重组方法的组合来合成本发明的肽。

b.聚乙二醇化

可根据本领域中已知的聚乙二醇化反应中的任一种进行聚乙二醇化。制备聚乙二醇化的蛋白产物的方法通常包括(a)将多肽与含有第一活性基团(例如诸如活性酯、醛、胺、氨氧、肼、酰肼、othiol、马来酰亚胺和α-卤代酰基如碘代乙酰基)的PEG在一定条件下进行反应，借由所述条件，通常含有至少一个第二活性基团的本发明的肽与一个或多个PEG基团相连；以及(b)获得反应产物。反应条件可选自聚乙二醇化领域中已知的那些或随后开发的那些条件中的任一种。通常地，选择不会降解本发明的抗FcRn肽的反应条件(包括例如温度、溶剂和pH)。

在其中有待聚乙二醇化的肽含有不止一个可被聚乙二醇化的第二活性基团的实施方案中，可通过在聚乙二醇化反应期间使用适当的PEG化学计量而将这些基团中的一些或全部聚乙二醇化。在含有两个C-端胺的肽二聚体的示例性说明的实例中，取决于所使用的PEG化学计量，两个胺都可被聚乙二醇化或仅一个胺可被聚乙二醇化。

酰化作用。如本文所用的，酰化作用预期非限制性地包括下列类型的本发明的肽和PEG之间的连接：酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸乙酯以及诸如此类。参见例如Chamow，Bioconjugate Chem.，5：133-140(1994)。

在第一个实例中，含有胺的肽(其中胺基团是例如侧链胺基团或N-端胺基团)可选择性地与具有活性酯基团的PEG试剂(包括例如PEG琥珀酰亚胺酯和PEG对硝基苯基酯如NOF Corp.(日本)产品目录第Sunbright MEGC-30TS和Sunbright MENP-30T号)反应以产生酰胺键。可选择地，肽可含有氨氧、肼或酰肼基团。

在第二个实例中，肽羧酸基团(包括例如侧链和C-端羧酸基团)可被各种试剂(包括例如1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺+EDC)活化。活化的肽之后可与含有胺的PEG试剂(包括例如NOF Corp.(日本)产品目录第Sunbright MEPA-30T号)偶联。

烃基化和还原性烃基化。肽-PEG轭合物可通过将胺(或氨氧、肼或酰肼)和醛进行反应的烃基化来制备。在包括例如氨氧、肼或酰肼反应的一些实施方案中，烃基化产物没有被还原。在其他的实施方案中，肽-PEG轭合物可通过将胺(或氨氧、肼或酰肼)和醛在适当的还原剂存在的条件下反应或通过将胺(或氨氧、肼或酰肼)和醛反应然后用适当的还原剂还原以产生稳定的碳-氮单键的还原性烃基化来制备，例如，如实施例12、14、16、27-29和31-34中所描述的。

在第一个实例中，含有侧链或自由N-端胺基团的肽可与含有醛基团的PEG偶联。PEG醛是可商业获得的(包括，例如NOF Corp.(日本)产品目录第Sunbright ME-300AL号)。另一种示例性PEG醛是水稳定的聚乙二醇丙醛或其单C₁-C₁₀烃氧或芳氧衍生物。参见例如美国专利第5,252,714号。通常地，含有醛基团的PEG可具有单一的活性醛基团。

在第二个实例中，含有羟基胺、肼或酰肼基团的肽可容易地与PEG醛反应。(含有氨氧、肼或酰肼基团的肽可通过本领域技术人员已知的标准方法来制备，例如实施例39中描述的那些)。在一些实施方案中，所得到的产物被还原。在其他的实施方案中，所得的产物没有被还原。

在第三个实例中，肽醛与含有胺的PEG试剂(例如诸如NOF Corp.(日本)产品目录第MEPA 30T号)反应。肽醛可容易地例如如本文实施例12中所描述的或通过引入含有醛的氨基酸来产生。

硫代烃基化。含有游离的硫醇官能团(例如来自半胱氨酸氨基酸残基)的肽可容易地与用亲电子试剂例如诸如马来酰亚胺(例如诸如NOF Corp.(日本)产品目录第ME-300MA号)或α-卤代酰基(包括含有碘代乙酰基的卤代乙酰基)官能化的PEG进行反应以形成硫醚键。可选择地，含有亲电子官能团(包括例如马来酰亚胺，其可通过本领域技术人员已知的标准方法制备)的肽可与含有硫醇的PEG基团(例如诸如NOF Corp.(日本)产品目录第ME-300SH号)反应。适合的亲电子官能团是本领域技术人员已知的。

其他轭合化学。有许多本领域技术人员可得的PEG连接方法并且被描述于例如EP 0401384；Malik等，Exp.HematoL，20：1028-1035(1992)；Francis，Focus on Growth Factors，3(2)：4-10(1992)；EP 0 154 316；EP 0401384；WO 92/16221和WO 95/34326中。对于PEG-肽轭合来说其他可能的方法包括例如叠氮化合物-炔化学的使用(例如，如J.Am.Chem.Soc.125：3192-3193(2003)中描述的)。在某些实施方案中，PEG硫酯可与具有N-端半胱氨酸残基的肽反应，例如如Dawson和Kent，Anna.Rev.Viochem.69：923(2000)中所描述的。

(2)聚乙二醇化位点

如下文所描述的，本文描述的抗FcRn肽可在肽的任何适合的位置被聚乙二醇化。在一些实施方案中，抗FcRn肽可在多个位置被聚乙二醇化。

N-端。在N-端具有胺基团的肽可在N-端被聚乙二醇化，例如通过如上所述的任何适合的轭合方法。

N-端活性基团的加成。在一些实施方案中，可将一个或多个活性基团加至本发明的抗FcRn肽的N-端。在一些实施方案中，活性基团将是氨基酸侧链。例如，乙酰基加帽的赖氨酸残基可被加至N-端，产生可被聚乙二醇化的侧链胺基团。在其他的实施方案中，通过将具有含有胺的侧链的氨基酸加至N-端可引入多个聚乙二醇化位点。例如，赖氨酸残基可被加至肽第285号的游离胺以产生用于聚乙二醇化的两个可得的胺位点(赖氨酸α-和ε-氨基基团)。如图18中所示例性说明的，含有赖氨酸的产物与适当地活化的PEG(例如，下文所描述的含醛PEG)的反应可提供每个肽具有2个PEG部分的PEG-肽轭合物。

N-端连接体。可用含有例如实施例12、13和15中所描述的活性基团的N-端连接体将单体的肽多聚化。例如，肽第100、119、120、121、160、199和200号具有含可以被聚乙二醇化的羧酸基团的N-端连接体而肽第285和286号具有含可被聚乙二醇化的胺基团的N-端连接体。

C-端。在C-端具有羧酸基团的肽可在C-端被聚乙二醇化，例如通过如上所述的任何适合的轭合方法。

在其他的实施方案中，肽可在含有胺的树脂(例如诸如1，2-二氨基乙烷三苯甲基PS，Novabiochem产品目录第01-64-0081号)上合成以产生C-端胺基团。

C-端活性基团的加成。在一些实施方案中，可将用于聚乙二醇化的一个或多个活性基团加至本发明的抗FcRn肽的C-端。在一些实施方案中，活性基团将是氨基酸侧链。例如，具有C-端酰胺基团的赖氨酸残基可被加至C-端，产生可被聚乙二醇化的侧链胺基团。在其他的实施方案中，通过将具有含胺的侧链的氨基酸加至C-端可引入多个聚乙二醇化位点。例如，谷氨酸残基可被加至C-端以产生用于聚乙二醇化的两个可得的羧酸位点(谷氨酸α-和γ-羧基基团)。基于如实施例7中所描述的肽平截研究，将活性基团加至C-端预计大致上不会阻碍抗FcRn肽的活性。

C-端连接体。可用含有例如实施例12中所描述的活性基团的C-端连接体将单体的肽多聚化。例如，肽第278号具有含有可以被聚乙二醇化的胺基团的C-端连接体。

侧链。在一些实施方案中，活性基团可被定位在例如氨基酸侧链(包括例如，含有侧链胺的氨基酸，诸如例如2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、鸟氨酸和赖氨酸；含有侧链羧酸的氨基酸，诸如例如天冬氨酸和谷氨酸；以及含有侧链硫醇基团的氨基酸，诸如例如半胱氨酸和青霉胺)中。

在某些实施方案中，本文描述的肽含有可被聚乙二醇化的氨基酸侧链。

在其他的实施方案中，适合的聚乙二醇化位点可通过用含有所期望的活性基团的氨基酸代替给定序列的一个或多个氨基酸来获得。例如，因为实施例7中描述的肽丙氨酸扫描研究显示肽第501号的精氨酸-2、苏氨酸-5和脯氨酸-13残基可被丙氨酸取代而没有体外效力上的显著损失，因此可能那些氨基酸中的1个、2个或所有也可被含有期望的活性基团的氨基酸所代替而没有体外效力上的显著损失。在一些实施方案中，肽第1号的精氨酸-2、苏氨酸-5和脯氨酸-13残基可被例如含有侧链胺的氨基酸诸如例如2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、鸟氨酸和赖氨酸；含有侧链羧酸的氨基酸诸如例如天冬氨酸和谷氨酸；以及含有侧链硫醇基团的氨基酸诸如例如半胱氨酸)所代替。在一些实施方案中，这种取代可产生与原始肽相比在体外效力上没有损失的或具有通过例如如实施例4中所描述的IgG-肽竞争、Biacore或KinExA(动力排除测定)所测量的原始肽的体外效力的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、97、98或99％的肽。

(3)聚乙二醇化结构单元的引入

在其他的实施方案中，本文描述的肽可通过引入含有PEG部分的氨基酸结构单元来合成。

C.肽轭合物

在一些实施方案中，本发明的肽作为包括例如共价和非共价轭合物的轭合物而被提供，其包括肽和可以是例如蛋白、肽、小分子、聚合物或核酸的第二分子。在一些实施方案中，第二分子可赋予本文所描述的肽所期望的特性例如诸如延长的半衰期、稳定性和/或增强的运输。在一些实施方案中，如通过例如实施例4中所示的IgG竞争ELISA所测量的，第二分子可增强本发明的肽的效力。在一些实施方案中，如通过例如在食蟹猴中血清IgG水平的整体降低或通过对比获得特定治疗效果所需的施用轭合的肽的频率所测量的，与未轭合的肽相比，第二分子可增强本发明的肽的效力。在进一步的实施方案中，例如，第二分子可产生肽对特定细胞、器官和/或组织的靶向。

在一些实施方案中，轭合物可具有增强的阻断IgG-FcRn的能力。在其他的实施方案中，轭合物可防止肽降解并因此增强肽的体内效力。在一些实施方案中，轭合物可具有增加的循环半衰期。在进一步的实施方案中，这种轭合物在结合并中和其他分子上比本发明的肽更有效。在其他的实施方案中，轭合物可有助于纯化。

在一些实施方案中，本发明的轭合的肽的第二分子可以是IgG的Fc结构域或其片段。IgG可以是例如人类IgG，例如人类IgG1、IgG2或IgG4。在一些实施方案中，IgG是变化的或突变的IgG，例如诸如Pro331Ser Fc_γ2变体、Leu235Ala Fc_γ4变体、Leu234Val Fc_γ1变体、Leu235Ala Fc_γ1变体或Pro331Ser Fc_γ1变体。在一些实施方案中，第二分子可以是含有例如铰链、CH2和/或CH3结构域的IgG片段。

在一些实施方案中，本发明的轭合的肽的第二分子可以是白蛋白、白蛋白片段或结合白蛋白的分子(例如诸如肽、蛋白和分子，其包括例如与白蛋白非共价结合的长的烃基链)。这种轭合物可具有较长的体内半衰期并且因此可能需要较少的肽剂量以达到所期望的治疗作用。参见例如Chuang等，Pharm.Res.19：569(2002)；美国专利第6,685,179号。

具有蛋白、肽、小分子、聚合物或核酸的本发明的肽的轭合物可根据本领域已知的或本文描述的轭合化学中的任一种来制备。例如，在一些实施方案中，如例如Zobel等，Bioorg.Med.Chem.Lett.13：1513(2003)，可通过与白蛋白非共价结合的疏水性芳香族加帽试剂将肽加帽。在其他的实施方案中，如例如Kim等，Diabetes 52：751(2003)，被硫醇活性基团修饰的肽可用于与游离的半胱氨酸残基的共价轭合。在进一步的实施方案中，含有醛的本发明的肽可通过如例如Kinstler，Adv.Drug Del.Rev.54：471(2002)中的还原性烃基化反应而与第二分子反应。可选择地，当第二分子是具有N-端半胱氨酸的蛋白或肽时，如例如Dawson和Kent，Anna.Rev.Biochem.69：923(2000)中所描述，肽硫醚可与第二分子反应以形成共价轭合物。在所有的氨基酸都是编码氨基酸的某些实施方案中，肽-蛋白和肽-肽轭合物还可通过在适当的宿主细胞中表达来制备。

D.示例性肽轭合物

示例性实施方案76：含有实施方案1至75中的任一个的肽和第二分子的轭合物。

示例性实施方案77：实施方案76的轭合物，其中第二分子选自白蛋白、转铁蛋白和免疫球蛋白的Fc部分。

示例性实施方案78：实施方案77的轭合物，其中第二分子是免疫球蛋白的Fc部分。

示例性实施方案79：实施方案78的轭合物，其中免疫球蛋白选自IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。

III.其它肽

在一些实施方案中，本发明的肽没有被衍生。这些肽的示例性的实施方案展示于下文。

示例性实施方案A：具有下列序列的肽：

其中：

-A，如果存在，是氢、酰基或氨基保护基团；

-B，如果存在，含有Q或者是氨基基团、羟基基团或羧基保护基团；

-Q，如果存在，是胺基团(其可以是中性的或带正电的)，其中胺基团通过亚烃基基团连接于肽，其中亚烃基基团包括但不限于乙烯、正丙烯、正丁烯、正戊烯和正己烯；或通过亚烃基基团和亚烃氧基亚单元的组合连接于肽，其中亚烃氧基亚单元包括但不限于-(CH₂-CH₂-O)_p-，其中p是1、2、3、4或5。Q的非限制性实例包括

-CH₂-CH₂-NH₂，

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂，

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂，

-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-NH₂，

-(CH₂-CH₂-O)₂-CH₂-CH₂-NH₂，和

-(CH₂-CH₂-O)₃-CH₂-CH₂-NH₂；

-X₀，如果存在，是氨基酸或其类似物或是含2-15个氨基酸的任选地衍生的肽或其类似物；

-X₁，如果存在，是氨基酸或其类似物；

-X₂，如果存在，是氨基酸或其类似物；

-X₄是氨基酸或其类似物或是含2或4个氨基酸的任选地衍生的肽或其类似物；

-X₇是苯丙氨酸或其类似物；

-X₈，当与X₉合在一起时，形成二肽类似物；

-X₁₀是氨基酸或其类似物，或者

-X₁₀，当与X₉合在一起时，形成二肽类似物；

-X₁₁是酪氨酸或其类似物；

-X₁₂是氨基酸或其类似物；

-X₁₃，如果存在，是氨基酸或其类似物；

-X₁₄，如果存在，是氨基酸或其类似物或者是含2-15个氨基酸的肽或其类似物；

-Z是连接体，其连接每一个肽单体，通过

-A；

-B；

-m是选自1、2和3的整数；并且

-n是选自1、2和3的整数；

其中：

-肽的每个单体长度上在从10至50个氨基酸的范围内。

示例性实施方案B：实施方案A的肽，其中B是Q。

示例性实施方案C：实施方案B的肽，其中B是-(W)_m-(CH₂)_r-NH₂，其中W，如果存在，是-(CH₂)_p、-(CH₂-CH₂)_p、-(CH₂-O)_p-或

并且其中m是1、2、3、4或5，r是1、2或3并且p是1、2、3、4、5。

示例性实施方案D：实施方案C的肽，其中X₃与X₁₃形成桥连。

示例性实施方案E：实施方案D的肽，其中桥连是侧链与侧链桥连。

示例性实施方案F：实施方案B的肽，其中X₆是组氨酸或其类似物。

示例性实施方案G：实施方案B的肽，其中X₈和X₉中的至少一个选自：

-甘氨酸；

-D-氨基酸；

-α-氨基异丁酸；以及

-肌氨酸。

示例性实施方案H：实施方案B的肽，其中X₁₄不存在。

示例性实施方案I：实施方案B的肽，其中n是1。

示例性实施方案J：实施方案B的肽，其中肽具有序列：

示例性实施方案K：实施方案J的肽，其中肽具有序列：

其中水平方括弧指示桥连的存在。

示例性实施方案L：实施方案B的肽，其中肽具有序列：

示例性实施方案M：实施方案L的肽，其中肽具有序列：

其中水平方括弧指示桥连的存在。

示例性实施方案N：实施方案M的肽，其中肽具有序列：

其中B是-W-CH₂-CH₂-NH₂，其中W，如果存在，是-(CH₂)_p、-(CH₂-CH₂)_p、-(CH₂-O)_p-或

其中p是1、2、3、4、5。

示例性实施方案O：实施方案M的肽，其中W不存在。

示例性实施方案P：实施方案M的肽，其中W是-(CH₂-CH₂)-。

示例性实施方案Q：实施方案M的肽，其中W是-(CH₂-CH₂-O)_p-并且p是1。

示例性实施方案R：实施方案M的肽，其中W是-(CH₂-CH₂-O)_p-并且p是2。

IV.用于筛选和发现结合FcRn并阻断FcRn-IgG相互作用的肽的方法

可使用噬菌体展示文库鉴定与FcRn结合的肽。噬菌体展示文库可如Smith和Petrenko，Chem.Rev.87：391(1997)中所描述容易地产生。可选择地，噬菌体展示文库可获得自商业来源，例如诸如Dyax Corp.(Cambridge，MA)。取决于筛选的条件，可用各种不同的特性来鉴定噬菌体。为了鉴定与FcRn结合(并由此与IgG竞争FcRn结合)的肽，可以为与FcRn的结合并且通过与IgG的竞争来筛选噬菌体文库。任选地，可通过将噬菌体文库与一种或多种可选的受体孵育而从文库中排除与可选的受体结合的肽。因此，结合可选的受体的噬菌体可从所期望的噬菌体库中减除。通过将可与FcRn结合的噬菌体克隆的DNA测序，可鉴定能够与FcRn结合并抑制IgG-FcRn结合的肽。

鉴定结合FcRn的肽的其他方法的实例包括：mRNA展示(Roberts和Szostak，Proc.Nat.Acad.Sci USA 94：12297(1997))，基于细胞的展示(Boder和Wittrup，Nat.Biotechnol.15：553(1997))以及合成肽文库(Lam，Nature354：82(1991)；Houghten等，Nature 354：84(1991))。

V.用于测定与FcRn结合并阻断IgG:FcRn相互作用的肽的方法

许多方法可被用于评估肽或肽拟物结合FcRn并阻断FcRn:IgG相互作用的能力。例如，表面等离子体共振(SRP)是本领域中熟知的评估结合事件的方法(Biacore AB，Uppsala，瑞典)。使用这一方法，结合配偶体中的一种(FcRn或IgG)被固定在SPR感应芯片上并且同时其他的结合配偶体通过芯片，监测所述芯片的所得的信号。在相同的实验中，作为IgG和FcRn之间的相互作用的竞争剂的有待被评估的肽通过芯片。信号的任何下降可被解释为肽阻碍FcRn和IgG之间相互作用的能力的量度。

用于测定IgG:FcRn相互作用的可能的肽抑制剂的其他方法也是本领域中熟知的。一个这样的方法是在96孔板中的IgG竞争测定。在这一实例测定中，96孔板上的可溶的人类FcRn被暴露于IgG和测试肽。残留的结合的IgG，如由抗IgG抗体和标准ELISA可视化试剂所检测的，提供了肽阻断FcRn-IgG相互作用的能力的量度。

肽阻断IgG-FcRn结合的能力还可在用编码人类FcRn的DNA转染的细胞上进行以开发出能够在它的细胞表面表达人类FcRn的细胞系。当IgG-FcRn结合的肽抑制剂与荧光标记的IgG分子竞争时，可应用结合竞争测定。可使用例如标准的荧光活化细胞分选器(FACS)来测量与细胞结合的残留的IgG的水平。

VI.免疫调节肽的制药用途

本发明的肽结合FcRn并且与没有本发明的肽的情况下IgG的分解代谢相比，抑制IgG恒定区的Fc部分与FcRn的结合以产生增加的IgG分解代谢。在示例性的实施方案中，IgG恒定区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。

A.药物组合物的制备

本发明的肽可被用于治疗其中升高的IgG的分解代谢是所期望的任何疾病或病况的药物(药物组合物)的制造。因此，本发明提供药物组合物，其包括本发明的至少一种肽。这些组合物通常将包括药学上可接受的运载体(carrier)或赋形剂。适合的药物运载体的实例描述于E.W.Martin的Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿药学)中。赋形剂的实例可包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇和类似物。组合物还可含有pH缓冲试剂和润湿剂或乳化剂。

可配制本发明的药物组合物以通过任何合理的施用途径施用于对其有需要的患者，所述施用途径包括例如静脉内地、皮下地、肌肉内地、口服地、舌下地、经颊地、舌下地、经鼻地、经直肠地、经阴道地或通过吸入。在一些实施方案中，肽可被埋入或连接至允许肽的缓慢释放的生物聚合物固相支持体中。

对于口服施用来说，药物组合物可采用由常规方法制备的药片或胶囊的形式。组合物还可被制备为液体，例如为糖浆或悬浮液。液体可包括悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食用的脂肪)、乳化剂(卵磷脂或阿拉伯树胶)、非水媒介物(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏的蔬菜油)以及防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或者山梨酸)。制剂还可包括调味剂、染色剂和甜味剂。可选择地，组合物可以作为用水或另一种适合的媒介物构成的干燥产物而存在。

对于经颊和舌下施用来说，组合物可采用根据常规流程的药片或锭剂的形式。

对于经由吸入的施用来说，根据本发明使用的化合物以来自具有适当的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他适合的气体)的加压包或喷雾器(例如在PBS中)的气溶胶喷雾的形式被方便地递送。在加压的气溶胶的情况下，可通过提供一个递送测定的量的阀门来确定剂量单位。可配制在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(例如明胶的)，其含有化合物和适当的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

为了经由推注的胃肠外的施用(包括例如静脉内或肌肉内施用)可配制药物组合物。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在具有添加的防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可采用油或水媒介物中的悬浮液、溶液或乳液这样的形式并含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地，活性成分可以是粉末形式的以便用适当的媒介物例如诸如无热原的水构成。

药物组合物还可为直肠施用而配制为栓剂或保留灌肠剂，例如含有传统栓剂基质诸如可可脂或其他甘油酯。

B.示例性药物组合物

示例性实施方案80：一种药物组合物，其含有治疗有效量的实施方案1至75或A至R中的任一种的肽或治疗有效量的实施方案76至79中的任一种的轭合物。

示例性实施方案81：实施方案80的组合物，其中治疗有效量的肽与用肽治疗之前的人类IgG的血清浓度相比能够降低人类IgG的血清浓度。

示例性实施方案82：实施方案81的组合物，其中人类IgG血清浓度上的降低为至少5％。

示例性实施方案83：实施方案82的组合物，其中人类IgG血清浓度上的降低为至少15％。

示例性实施方案84：实施方案83的组合物，其中人类IgG血清浓度上的降低为至少25％。

C.治疗方法

本发明的药物组合物对治疗其中增加的IgG分解代谢是所期望的任何疾病和病况是有用的。因此，本发明提供治疗由不适当地表达的IgG抗体或IgG的不期望的量或水平所表征的疾病的方法，其包括向对其有需要的患者施用治疗有效量的本发明的肽。在一些实施方案中，本发明提供通过用本发明的肽调节IgG的血清浓度来治疗疾病的方法。术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和治疗(treating)”是指(1)疾病或病况的严重度或持续时间上的减少，(2)与疾病或病况相关的一种或多种症状的消除而不必须治愈疾病或病况，或者(3)疾病或病况的预防。

在某些实施方案中，本发明的方法可被用于治疗、预防或调节自身免疫性疾病，其包括但不限于局限性脱发、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫阿狄森病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性血小板减少性紫癜、贝切特病、大疱性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、疤痕类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、德戈斯病、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型关节炎、扁平苔癣、狼疮、梅尼尔病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮(包括例如寻常天疱疮)、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿，性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、肉状瘤病、硬皮病、斯耶格伦综合征、强直人综合征、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、移植排斥、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。

在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自大疱性类天疱疮、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、重症肌无力(MG)、天疱疮(包括例如寻常天疱疮)和移植排斥。

在某些实施方案中，含有本发明的肽的组合物可与类固醇组合用于免疫抑制。

本发明的肽可被用于治疗炎性病症，包括但不限于哮喘，溃疡性结肠炎和炎性肠综合征，过敏(包括过敏性鼻炎/鼻窦炎、皮肤过敏(包括例如风疹(即荨麻疹)、血管性水肿、特应性皮炎)、食物过敏、药物过敏、昆虫过敏)，肥大细胞增生病，关节炎(包括骨性关节炎、类风湿性关节炎和脊椎关节病)。在一些实施方案中，本发明提供治疗具有基于炎症病因的心血管疾病(例如动脉硬化)、移植排斥和/或移植物抗宿主病(GVHD)的方法。

本发明的其他实施方案包括通过施用本发明的肽来治疗癌的方法。本发明的方法可用于治疗或帮助调节涉及IgG的过量产生的癌，例如浆细胞癌，其包括多发性骨髓瘤。

经常地，在需要施用治疗性蛋白的疾病或病况中，受治疗者将产生针对治疗性蛋白的抗体，其反过来阻止治疗性蛋白的可得的预期的治疗目的。因此，本发明的蛋白可与治疗性蛋白组合使用以通过减少IgG的水平来增强治疗性蛋白的益处，其中IgG抗体是治疗性蛋白的生物利用率降低的原因。因此，本发明的一些实施方案提供了调节、治疗或预防由对凝固因子的免疫应答所导致的病况、疾病或病症的方法，其包括将细胞与治疗有效量的本文公开的肽中的任一种接触，其中凝固因子选自纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII或冯维勒布兰德因子。这一方法可被用于调节或治疗或预防患有例如血友病A或血友病B的患者中对凝固因子的免疫应答。在一些实施方案中，本发明的肽阻断因子VIII抑制剂。在其他的实施方案中，本方法可被用于调节或治疗或预防对例如患有单纯红细胞再生障碍(PRCA)的患者中治疗性促红细胞生成素的免疫应答。本发明进一步提供了调节、治疗或预防对溶酶体水解酶的免疫反应的方法，溶酶体水解酶的缺乏导致溶酶体贮存紊乱，溶酶体水解酶例如诸如α-半乳糖苷酶A、酸性神经酰胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、酸性β-葡萄糖苷酶(葡糖脑苷脂酶)、酸性β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、半乳糖脑苷脂酶、酸性α-甘露糖苷酶、酸性β-甘露糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、酸性β-半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、酸性α-葡萄糖苷酶、β-己糖胺酶B、类肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰辅酶A：α-氨基葡萄糖苷、N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、α-N-乙酰基半乳糖胺酶、唾液酸酶、β-葡萄糖醛酸苷酶和β-己糖胺酶A。

在其他的实施方案中，本发明的方法可被用于治疗、预防或调节对基因治疗载体的免疫反应。对用于疾病或病况的基因治疗的成功完成的障碍还包括对由转基因编码的治疗性蛋白以及可能对用于递送转基因的载体有特异性的抗体的发展。因此，在一些实施方案中，本文描述的肽可与基因治疗组合施用以通过减少IgG的水平增加编码的治疗性蛋白的益处。这些方法在其中IgG抗体是基因治疗载体或编码的治疗性蛋白的生物利用率减少的原因的情况中尤其有用。基因治疗载体可以是例如，病毒载体诸如腺病毒和腺伴随病毒。可使用基因疗法来治疗的疾病包括但不限于囊性纤维化病、血友病、PRCA、肌肉萎缩症或溶酶体贮存疾病诸如例如高歇病和法布里病。

在本发明的方法中，本文描述的组合物可经由任何适合的途径例如诸如静脉内地、皮下地、肌肉内地、口服地、舌下地、经颊地、舌下地、经鼻地、经直肠地、经阴道地或通过吸入施用。通常地，本文描述的组合物的适当的剂量将取决于有待治疗的疾病或病况，疾病或病况的严重度，受治疗者包括受治疗者的性别、年龄和体重，期望的结果和所用的施用的特定途径而变化。例如，剂量可在从0.1μg/kg至100,000μg/kg体重的范围内。在一些实施方案中，剂量可在1-10,000μg/kg的范围内。在其他的实施方案中，剂量范围可以是10-1,000μg/kg。在又进一步的实施方案中，剂量范围是100-500μg/kg。

本发明的组合物可被连续地或以特定的时间间隔施用。体外测定可被用于确定施用的最佳的剂量范围和/或时间方案。其他有效的剂量可由本领域普通技术人员通过建立剂量响应曲线的常规试验而容易地确定，例如增加或减少IgG水平所必需的本发明的肽的量可从体内实验计算。技术人员将容易地理解，剂量水平可随特定化合物的功能、症状的严重度和受治疗者对副作用的易感性而变化，并且对于给定化合物来说优选的剂量是可由本领域技术人员通过各种方法容易地确定的。例如，取决于所使用的特定的剂，本领域技术人员可使用有关获得所期望的作用所必需的量的随时可得的信息来计算适当的剂量。

D.治疗实施方案的示例性方法

示例性实施方案85：治疗由不适当表达的IgG抗体或过量的IgG所表征的疾病的方法，其包括向对其有需要的患者施用实施方案80至84中任一个的组合物。

示例性实施方案86：实施方案85的方法，其中疾病是对治疗性蛋白的免疫反应，治疗性蛋白选自促红细胞生成素、其缺乏导致溶酶体贮存病症的溶酶体水解酶和凝固因子。

示例性实施方案87：实施方案86的方法，其中溶酶体水解酶选自由α-半乳糖苷酶A、酸性神经酰胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、酸性β-葡萄糖苷酶(葡糖脑苷脂酶)、酸性β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、半乳糖脑苷脂酶、酸性α-甘露糖苷酶、酸性β-甘露糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、酸性β-半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、酸性α-葡萄糖苷酶、β-己糖胺酶B、类肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰辅酶A：α-氨基葡萄糖苷、N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、α-N-乙酰基半乳糖胺酶、唾液酸酶、β-葡萄糖醛酸苷酶和β-己糖胺酶A所组成的组。

示例性实施方案88：实施方案86的方法，其中凝固因子选自纤维蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII或冯维勒布兰德因子。

示例性实施方案89：实施方案85的方法，其中IgG对基因治疗载体是特异性的。

示例性实施方案90：实施方案89的方法，其中疾病选自炎性疾病、自身免疫性疾病和癌。

示例性实施方案91：实施方案90的方法，其中自身免疫性疾病选自局限性脱发、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫阿狄森病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性血小板减少性紫癜、贝切特病、大疱性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、疤痕类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、德戈斯病、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型关节炎、扁平苔癣、狼疮、梅尼尔病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺现象、莱特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、肉状瘤病、硬皮病、斯耶格伦综合征、强直人综合征、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、移植排斥、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。

示例性实施方案92：实施方案91的方法，其中自身免疫性疾病选自大疱性类天疱疮、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、天疱疮和移植排斥。

示例性实施方案93：实施方案92的方法，其中天疱疮是寻常天疱疮。

示例性实施方案94：实施方案91的方法，其中疾病是炎性疾病。

示例性实施方案95：实施方案94的方法，其中炎性疾病选自哮喘，溃疡性结肠炎和炎性肠综合征，过敏(包括过敏性鼻炎/鼻窦炎、皮肤过敏、食物过敏、药物过敏、昆虫过敏)，肥大细胞增生病，关节炎(包括骨性关节炎、类风湿性关节炎和脊椎关节病)。

示例性实施方案96：实施方案95的方法，其中皮肤过敏选自风疹、血管性水肿、特应性皮炎。

VII.FcRn的体内成像和检测

本发明的肽可被用于检测FcRn的测定。在一些实施方案中，测定是检测本发明的肽与FcRn的结合的结合测定。在一些实施方案中，FcRn可被固定并且可将本文描述的一种或多种肽通过固定的FcRn。在可选择的实施方案中，一种或多种肽可被固定并且可将FcRn通过固定的肽。FcRn或本发明的肽可被可检测地标记。适合的标记物包括放射性同位素，其包括但不限于⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、¹¹¹In、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹³⁷Cs、¹⁸⁶Re、²¹¹At、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²⁴¹Am、²⁴⁴Cm和^99mTc-MDP；具有可检测的产物的酶(例如荧光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和类似物)；荧光团(包括例如荧光素(其可作为例如异硫氰酸荧光素被连接)、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻青蛋白、邻苯二醛和荧光胺)；通过金属螯合基团例如EDTA与本发明的肽连接的发射荧光金属，例如¹⁵²Eu或其他的镧系元素；化学发光化合物，例如鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯(theromaticacridinium ester)、吖啶盐、咪唑和草酸酯(oxalate esteror)；以及生物发光化合物，例如荧光素或水母发光蛋白(绿色荧光蛋白)，特异性结合的分子例如磁性颗粒、微球体、纳米球、冷光量子点纳米晶体以及类似物。

可选择地，特异性结合对可被用于检测FcRn的测定，包括例如被可检测地标记的并且可放大信号的第二阶段抗体或试剂。例如，本发明的肽可与生物素轭合，并加入作为第二阶段试剂的辣根过氧化物酶轭合的链霉亲和素。地高辛和抗地高辛提供另一种适合的结合对。在其他的实施方案中，第二阶段抗体可与和在过氧化物酶存在的情况下发生颜色改变的底物组合的酶例如过氧化物酶轭合。本发明的肽和FcRn之间的结合不存在或存在可通过不同的方法来测定，其包括分离的细胞的流式细胞术、显微术、放射线照相术、荧光测定法、显色检测、磷光显影、胶片上化学发光的检测和闪烁记数。这种试剂和使用它们的方法是本领域中熟知的。

对于体内诊断应用，可至少部分地由FcRn的表达所表征的特定的组织或者甚至特异性细胞疾病可通过施用足量的被标记的本发明的肽来成像。

适用于体内组织成像的各种各样的金属离子已经被测试并被临床使用。对于使用放射性同位素的成像来说，下列表征通常是所期望的：(a)对患者的低放射剂量；(b)高光子产量，其允许有待在短时间段内进行的核医疗程序；(c)被足量生产的能力；(d)可接受的花费；(e)对于施用来说简单的制备；以及(f)之后不需要隔离患者。这些表征通常被转化为下列：(a)对最关键的器官的放射暴露小于5rad；(b)在注入后几小时内可获得单独的图像；(c)放射性同位素不会通过粒子的发射而衰减；(d)同位素可以是容易检测的；以及(e)半衰期小于四天(Lamb和Kramer，“Commercial Production of Radioisotopes for Nuclear Medicine，(用于核医疗的放射性同位素的商业生产)”在Radiotracers For Medical Applications(医学应用的放射性示踪剂)中，第1卷，Rayudu(编辑)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，pp.17-62)。在一些实施方案中，金属是锝-99m(^99mTc)。

因此，本发明提供用于获得受治疗者内部区域图像的方法，其包括向受治疗者施用有效量的组合物并且记录获得自放射性金属的衰减的闪烁图像，所述组合物包括含有金属的本发明的肽中的至少一种，其中所述金属是放射性的。相似地，本发明提供用于增强受治疗者内部区域磁共振(MR)图像的方法，其包括向受治疗者施用有效量的组合物并且记录受治疗者内部区域的MR成像，所述组合物包括含有金属的本发明的肽中的至少一种，其中所述金属是顺磁的。

在一些实施方案中，本文提供的其他方法包括增强受治疗者内部区域超声图像的方法，其包括对受治疗者施用有效量的组合物并且记录受治疗者内部区域的超声图像，所述组合物包括含有金属的本发明的肽中的至少一种。通常，金属可以是任何无毒的重金属离子。在某些实施方案中，也提供了增强受治疗者内部区域X-射线图像的方法，其包括对受治疗者施用含有金属的肽组合物并记录受治疗者内部区域的X-射线图像。通常可使用放射性的、无毒的重金属离子。

本发明的肽可被连接至螯合剂，例如诸如美国专利第5,326,856号中所描述的那些。肽-螯合剂复合物之后可被放射标记以产生用于诊断或治疗涉及IgG水平的调节的疾病或病况的成像剂。本发明的肽还可被用于美国专利第5,449,761号中公开的用于产生成像或放射治疗中使用的放射标记的肽的方法中。

A.检测FcRn的示例性方法

示例性实施方案97：检测FcRn的方法，其包括：

用可检测的标记物标记实施方案1至75中任一个的肽或实施方案76至79中任一个的轭合物，所述可检测的标记物选自放射性同位素、具有可检测的产物的酶、荧光团、化学发光化合物、磁性颗粒、微球体、纳米球、生物素、链霉亲和素和地高辛。

示例性实施方案98：实施方案97的方法，其中用可检测的标记物标记的肽或轭合物包含于诊断试剂盒中。

VIII.FcRn的纯化

本发明的肽也可被用来纯化FcRn。在一些实施方案中，肽被共价连接至适合的层析基质以形成有效的FcRn分离介质。之后将含有FcRn的溶液通过层析基质而产生FcRn与固定的结合配偶体的非共价结合。含有FcRn的溶液可来自生物样品例如体液、组织或细胞样品、细胞培养上清液。通过用适当的溶液冲洗固定的肽：FcRn复合物以去除杂质并且之后用适当的洗脱液从层析基质释放FcRn来纯化FcRn。

可使用本领域技术人员熟知的多种化学方法将本发明的肽连接至适当的层析基质。例如，本发明的肽可被连接至含有适当的活性基团例如硫醇、胺、羧酸、醇、醛、烃基卤化物、N-烃基马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧化物、氨氧和酰肼的基质。

在其他的实施方案中，本发明的肽可被修饰以含有与适当的层析基质非共价结合的化学部分或肽序列。例如，可用生物素部分来修饰肽并且可将其与含有抗生物素蛋白的层析基质非共价结合。可选择地，可用FcRn溶液孵育修饰的肽并且将所得的混合物通过适当的层析基质以分离FcRn：肽复合物。

用于亲和纯化的肽的类似用途的实例可在Kelley等，“Developmentand Validation of an Affinity Chromatography Step Using a Peptide Ligand forcGMP Production ofFactor VIII(使用肽配体的用于因子VIII的cGMP生产的亲和层析步骤的开发和确认)”，Biotechnology and Bioengineering(生物技术和生物工程)，第87卷，第3期，Wiley InterScience，2004，第400-412页以及美国专利第6,197,526号中找到。

A.纯化FcRn的示例性方法

示例性实施方案99：纯化FcRn的方法，其包括：

(a)将实施方案1至75或A至R中的任一个的肽或实施方案76至79中的任一个的轭合物固定至固相支持体，

(b)将含有FcRn的溶液与固相支持体上的固定的肽或轭合物接触；以及

(c)通过将溶液与所述固相支持体分离来纯化FcRn。

实施例

意为本发明的纯示例性的并且因此不应当被认为以任何方式限制本发明的实施例也描述和详述了上文讨论的本发明的方面和实施方案。实施例并不意为表示下文的实验是所进行的所有或唯一的实验。已经做出努力以确保所使用的数字(例如，量、温度等)的精确性，但是应当考虑到一些实验性误差和偏差。除非以其他方式指出，份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度并且压力是或近于大气压。

实施例1.可溶的人类FcRn(shFcRn)的表达

如文献中所描述的在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中使用谷氨酰胺合成酶表达系统克隆、表达并纯化可溶的人类FcRn cDNA。参见例如美国专利第5,623,053号。终止密码子被放置在人类FcRn的蛋白序列中氨基酸位置274之后以便除去跨膜区。

实施例2.用人类FcRn转染HEK 293细胞

根据制造商建议的流程使用SuperFect转染试剂(Qiagen，Valencia，CA)转染人类胚胎肾(HEK)293细胞(ATCC，Manassas，VA)。起初将全长的FcRn cDNA构建体(Story等，J.Exp.Med.180：2377-2381(1994)，Simister等，Eur.J.Immunol.26：1527-1531(1996))克隆至作为质粒载体的pcDNA6(Invitrogen，Carlsbad，CA)中以便产生FcRn表达载体FcRn：pCDNA6。起初将人类β₂m cDNA构建体克隆至作为质粒载体的pcDNA3(Invitrogen)中以产生人类β₂m表达载体β₂m：pcDNA3(Gussow等人，J.Immunol.139：3132-3138(1987))。

转染前一天，将HEK293细胞以每只100mm盘0.5-2.5×10⁶个细胞接种并在cDMEM中于37℃和5％CO₂孵育16小时。cDMEM的组合物含有：1L DMEM(Invitrogen#11995-065)；10ml的1M HEPES，pH 7.55；10ml

MEM氨基酸溶液(Invitrogen#11130-051)；10ml MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen#11140-050)；10ml的100mM丙酮酸钠(Invitrogen#11360-070)；10ml的青霉素链霉素液(Invitrogen#15140-148)；10ml的L-谷氨酰胺溶液(Invitrogen#25030-081)；溶于55mM Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中的1ml的2-巯基乙醇溶液(Invitrogen#21985-023)；100ml热灭活的胎牛血清(FBS)(Invitrogen)。在转染当天，向290μL的DMEM(Invitrogen)加入5μg的FcRn：pCDNA6构建体和5μg的β₂m：pCDNA3DNA。溶液被混合几秒钟之后离心。之后将60μL的SuperFect转染试剂(Qiagen)加至DNA溶液并涡旋10秒钟。DNA/SuperFect溶液于室温孵育5至10分钟，其间来自含有细胞的盘的培养基被吸走并且用4ml的PBS冲洗细胞一次。DNA/SuperFect孵育5至10分钟后，向DNA/SuperFect溶液加入3ml完全生长培养基(cDMEM)；混合溶液并立即加至100mm盘中的细胞。

将细胞与DNA/SuperFect溶液于37℃和5％CO₂孵育2至3小时。从细胞除去含有DNA/SuperFect溶液的培养基并且用PBS清洗细胞3次并且向细胞加入新鲜的cDMEM。孵育48小时后，通过免疫印迹分析来检测培养基以确定FcRn/β₂m复合物的瞬时表达是否已经发生。此外，细胞以1∶4的比例被传代至含有作为抗生素的250μg/L遗传霉素(Invitrogen)和5μg/L杀稻瘟素的cDMEM中以筛选杀稻瘟素抗性的稳定的转染子。抗生素选择4周后，存活的细胞被以每孔1个细胞的密度接种至96孔组织培养板。最终筛选了12个克隆并且将每个延伸并通过免疫印迹分析来检查FcRn和β₂m的表达。被鉴定为具有最高表达水平的表达FcRn和β₂m的293之后被用于随后的测定。

实施例3.FcRn-IgG抑制剂的噬菌体文库筛选

通过筛选得到Dyax Corp.(Cambridge，MA)许可的丝状噬菌体展示文库来鉴定能够抑制IgG的Fc部分与FcRn结合的肽。更特别地，文库TN-9-IV、TN10-X、TN-11-I和TN-12-I被组合用于筛选。每个文库中含有的单独的活的噬菌体的总数由如Dyax流程所描述的文库在大肠杆菌中表达并以克隆的稀释液铺板时为每个文库建立的转化株的数目所反映。TN-9-IV、TN10-X、TN-11-I和TN-12-I的转化株的数目分别是3.2×10⁹、2×10⁹、2.7×10⁹和1.4×10⁹。在给定的体积中活的噬菌体的绝对数目可以以每单位体积空斑形成单位(pfu)来报道。

A.噬菌体筛选中所用的缓冲液

下列缓冲液被用于结合FcRn的肽的筛选。

1.NZCYM肉汤：10g NZ胺-A；5g氯化钠；5g细菌培养用酵母提取物(Difco)；1g酪蛋白氨基酸；1g硫酸镁无水粉末：组分溶解在800ml水中，用1N氢氧化钠调节至pH 7.5并且之后用水加至总体积1L并且高压蒸汽灭菌20分钟。

2.结合缓冲液(BB)：PBS，pH 6加上10mM EDTA.C.NZCYM-T：NZCYM肉汤加上12.5μg/ml四环素。

3.HBSS-E：Hank平衡盐溶液(Invitrogen)加上10mM EDTA(Invitrogen)。

4.Min A盐：溶于1L水中的10.5g K₂HPO₄(磷酸氢二钾)；4.5gKH₂PO₄(磷酸二氢钾)；1.0g(NH₄)₂SO₄(硫酸铵)和0.5g柠檬酸钠。

5.LB肉汤：10g细菌用胰蛋白胨；5g细菌用酵母提取物；10g氯化钠溶于1L水中并且高压蒸汽灭菌20分钟。

6.CBS pH 2：50mM柠檬酸钠；150mM氯化钠：用HCl将缓冲液调至pH 2并过滤灭菌。

7.LB琼脂：30g细菌用胰蛋白胨；15g细菌用酵母提取物；30g氯化钠溶于3L水中并且高压蒸汽灭菌20分钟。

8.LB软琼脂：20g细菌用胰蛋白胨；10g细菌用酵母提取物；20g氯化钠；14g细菌用琼脂溶于2L水中，使用文火而不沸腾。

9.TE缓冲液：10mM Tris，1mM EDTA，pH 7。

B.筛选流程：第1轮

根据它们的效价，集中了每个文库的大约100个随机文库等价物，其意指将24μL的TN9-IV(1.3×10¹⁰-pfu/μL)、12.5μL的TN10-X(1.6×10¹⁰pfu/μL)、225μL的TN11-I(1.2×10⁹pfu//μL)和48.7μL的TN12-I(2.9×10⁹pfu/μL)与189μLPBS、75μL的冰冷的17％聚乙二醇(PEG)(平均分子量：8000Da，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)以及75μL的3M氯化钠混合并在冰上孵育30分钟。将一只T75瓶的293克隆11细胞(实施例2)用HBSS-E以1∶3的比例分开。将细胞转移至1ml的微量离心管，用冷的结合缓冲液冲洗一次并且除去上清液。将细胞与噬菌体于4℃在旋转器上孵育1.5小时。孵育之后，将细胞用1ml的冰冷BB冲洗五次，每次之后以1400rpm离心2分钟。通过加入66μM已经被透析至BB中的人类IgG(Calbiochem， San Diego，CA)来洗脱强结合的噬菌体。将噬菌体-IgG混合物与细胞于4℃孵育1小时。离心步骤之后(1400rpm旋转2分钟)，将细胞团首先用200μL的66μMIgG冲洗，离心(1400rpm旋转2分钟)并用100μl IgG冲洗最后一次。将IgG冲洗液与IgG洗脱液混合为500μl的终体积。将洗脱液中的噬菌体滴定并如下文所描述的来扩增。

C.噬菌体滴定

将噬菌体溶液以100倍的步骤稀释。通常将2μl的噬菌体溶液以连续的方式加至198μL的NZCYM肉汤以实现多达10^-10的稀释。当XL1Blue

MRF′大肠杆菌细胞正以对数期生长并且在A600(600nm处的UV吸收)处达到0.5的光学密度时，将稀释的噬菌体加至XL1Blue MRF′大肠杆菌细胞的培养物中。将培养物于室温孵育10分钟。之后，将0.5ml的受感染细胞加至约55℃的3.5ml熔化的顶层琼脂(LB肉汤和LB琼脂的50/50混合物)并且涂在标准的琼脂平板上并于37度孵育过夜。从含有30至300个斑的平板计算效价。对于以10^-8的噬菌体稀释铺板的含有50个斑的平板，计算将如下进行：50斑/500μL受感染细胞×感染期间的10倍稀释×10⁸的噬菌体稀释＝每μL10⁸个形成斑的单位。

当必需随后的噬菌体ELISA和测序分析时，用高压蒸汽灭菌的Pasteur移液管挖出含有噬菌体斑的单独的琼脂块。将块放在96孔无菌的圆底组织培养板(Greiner)中，向其加入每孔100μL的TE。于37℃从斑中洗提噬菌体2小时或于4℃过夜。

D.噬菌体扩增

将XL1Blue MRF′大肠杆菌细胞的培养物在NZCYM肉汤-T中生长，从1/100稀释的饱和过夜培养物直到培养物达到A600处0.5的光学密度。通过以3500rpm离心15分钟将细胞浓缩，之后重悬在Min A盐中至初始体积的1/20。一轮筛选之后从细胞洗脱的噬菌体在Min A盐中被稀释至1ml的终体积并且被加至1ml的浓缩的细菌培养物中。于37℃水浴孵育15分钟后，噬菌体-细胞混合物被加至2ml的2X NZCYM肉汤并涂在具有NZCYM加50μg/ml氨苄青霉素的大NUNC平板上直到干燥。将平板于37℃孵育14至18小时。在20ml的PBS存在的情况下，过夜形成的克隆被轻轻地用涂布棒刮下。含有细菌和噬菌体的PBS被收集在离心管中。在10ml的PBS存在的情况下，再次刮下留在平板上的细菌并收集。对平板使用最后10ml的PBS漂洗并将其与所有刮下的物质集中在一起。通过离心(3500rpm，15分钟)使细菌细胞成团并且将澄清的上清液倾倒在另一个离心管中，再次澄清并且最后再次倾倒。之后0.15mL体积的17％PEG+3M NaCl被加至上清液，其被混合并于4℃贮存过夜。通过离心(8500xg，30分钟)收集沉淀的噬菌体，之后丢弃上清液。将噬菌体团重悬在小体积的PBS中，用短暂的旋转将其澄清并且再次用0.15体积的17％PEG+3M NaCl沉淀。最终的噬菌体团被重悬在PBS中并在准备下一轮筛选中被滴定。

E.第2轮

扩增的噬菌体文库被稀释以便将仅仅10个随机的文库等价物稀释成1ml的结合缓冲液。将T75瓶中未转染的293细胞的三分之一用冷的结合缓冲液冲洗一次。通过将噬菌体与未转染的细胞孵育15分钟进行两次扣除步骤，所述步骤被包括进来以便从文库除去这样的噬菌体，其表达能够与不表达FcRn的细胞结合的肽。回收上清液。之后将T75瓶中293克隆11细胞的三分之一用冷的结合缓冲液冲洗一次并与噬菌体于4℃在旋转器中孵育1.5小时。将细胞用1ml的冷的结合缓冲液冲洗并离心(1400rpm旋转2分钟)五次并且通过将噬菌体-细胞-IgG混合物于4℃孵育1小时来用200μL的66μM人类IgG(用结合缓冲液透析的)洗脱强结合的噬菌体。离心(1400rpm旋转2分钟)后，收集上清液并且用200μL的66μM IgG冲洗团块沉淀，之后用100μL的66uM IgG冲洗。将洗脱液中的噬菌体滴定并且如下文标记了噬菌体滴定和噬菌体扩增的章节中所描述的来扩增。

F.第3轮

如上文对第2轮所描述的进行这一轮。在第3轮完成时，将洗脱液中的噬菌体滴定并使用噬菌体ELISA测定IgG-FcRn抑制剂。

G.噬菌体ELISA

进行下列步骤以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来鉴定编码能够结合FcRn的肽的噬菌体。首先，配制下列溶液：

缓冲液A：PBS+0.1％吐温+0.5％BSA。

缓中液B：100mM MES，pH 5.5+150mM NaCl+0.1％吐温。

缓冲液C：50mM MES，pH 6.0+150mM NaCl+0.1％吐温。

将显示了结合FcRn的能力的噬菌体的繁殖所用的XL1Blue MRF′大肠杆菌培养物从过夜培养物的1∶100的稀释物培养至具有A600处0.5的光密度。之后，将如上所述制备的每个噬菌斑洗脱液10μl加至96孔板的孔中的30μl的XL1Blue MRF′大肠杆菌细胞上并于室温孵育15分钟。之后，将含有50μg/ml氨苄青霉素的130μl的NZCYM肉汤加至每个孔并且将板于37℃孵育过夜。

通过将其用每孔200μl的缓冲液A漂洗并于4℃用溶于缓冲液A的1mg/ml的生物素化的可溶的人类FcRn(实施例4，章节A)包被过夜来制备包被链霉亲和素的、BSA封闭的微量滴定板(Pierce)。除去含有FcRn的缓冲液并将板用缓冲液C漂洗两次。之后向板的每个孔加入70μl的缓冲液B，之后加入30μl的含有噬菌体的细菌培养物。在室温下1小时后，将板用200ul的缓冲液C冲洗五次。之后将含有1∶10000稀释的轭合HRP的抗M13的抗体(Amersham Pharmacia)的100μl的缓冲液C加至每个孔。将板于室温孵育一小时。之后将板用缓冲液C冲洗9次，用1步的TMB(KPL)显影，5-15分钟之后用2M的硫酸终止并用Spectra Max Plus平板读数器(Molecular Devices)于450nm读数。

H.噬菌体DNA的PCR扩增

溶于TE的从斑洗脱的噬菌体被扩增以便使用PCR Core System II试剂盒依照制造商的说明书(Promega)测序。之后将5ml的洗脱的噬菌体加入含有200μM的每种dNTP、500nM的引物3PCRUP(5′-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3′)、500nM的引物3PCRDN(5′-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3′)、1x Taq DNA聚合酶缓冲液(10x：500mM KCl、100mM Tris-HCl pH 9.0于25℃、1％Triton X-100、15mM MgCl₂)和1.25个单位的Taq DNA聚合酶的反应混合物。使反应物在MJ Research PCT-200热循环仪上经历下列程序：在94℃下5分钟；由在94℃下15秒、在55℃下30秒和在72℃下60秒所组成的30个循环；之后是在72℃下7分钟。使用QiaQuick PCR Prep试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明书将所得的产物纯化，由A260处的吸光度进行定量并使用引物3SEQ-80(5′-GATAAACCGATACAATTAAAGGCTCC-3′)测序。

3轮的筛选之后扩增的噬菌体的测序揭示了编码全长人类FcRn和人类β-2微球蛋白1的氨基酸序列的DNA序列。这些“噬菌体匹配”被共同使用以鉴定由氨基酸序列G-H-F-G-G-X-Y所定义的共有肽序列。

实施例4.肽-IgG竞争ELISA

为了确定衍生自丝状噬菌体展示文库的筛选的本发明的肽是否也能够阻断IgG与FcRn的结合，设计并进行下列ELISA测定。

A.shFcRn的生物素化

将溶于Tris缓冲液的可溶性人类FcRn(shFcRn)的溶液透析两次，每次在2升pH 8.0的PBS中3小时。通过在280nm处测量吸光度来确定回收的shFcRn的量。通过将吸光度读数乘以shFcRn的消光系数来获得shFcRn的浓度，消光系数为：ε＝85880M^-1 cm^-1。通过用2倍摩尔过量的磺基-NHS-LC-生物素(Invitrogen，Carlsbad，CA)于4℃将透析的shFcRn处理2小时来完成shFcRn的生物素化。之后将shFcRn-磺基-NHS-LC-生物素反应混合物在2L的冷PBS中透析两次，之后进行另一次吸光度读数以确定剩余蛋白的浓度。用0.1％叠氮化钠将生物素化的shFcRn贮存于4℃直到需要时。

B.肽-IgG竞争ELISA测定

将用BSA(Pierce，Rockford，IL)封闭的、ReactiBind中性链亲和素涂布的96孔板用200μl/孔的缓冲液A(缓冲液A：PBS pH 7.4(Gibco，14040)、0.5％的无IgG的BSA、0.05％吐温-20)冲洗两次。将孔用100μl/孔的溶于缓冲液A的1μg/ml的生物素化的shFcRn涂布。将板密封并于37℃孵育2小时。之后将板用200μl/孔的缓冲液B(缓冲液B：100mM MES pH 6、150mM NaCl、0.5％的无IgG的BSA(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)、0.05％吐温-20)冲洗。之后加入50μl/孔的溶于缓冲液B的6nM人类IgG(Calbiochem，San Diego，CA)以及50μl/孔的各种肽竞争剂(于各种浓度)以使孔中IgG的终浓度为3nM。为了使其混合，将板震动2分钟，密封并于37℃孵育2小时。孵育后，将液体从板吸走并且加入溶于缓冲液B的100μg/孔的1∶10000稀释的轭合过氧化物酶的山羊抗人IgG F(ab′)片段特异性的F(ab′)₂片段(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。盖住板，于室温孵育30分钟并用200μl/孔的冰冷缓冲液B冲洗4次。加入SureBlue TMB底物溶液(100μl/孔，KPL，Gaithersburg，MD)并且使板于室温孵育直到显色，其历时5至10分钟。一旦显色，加入100μl/孔的TMB终止液(KPL，Gaithersburg，MD)并且于450nm处测量吸光度。将数据绘制为吸光度对肽浓度以获得抑制浓度50％(IC₅₀)的值。

实施例5.肽-IgG竞争FACS测定

除了使用实施例4中描述的ELISA方法确定来自丝状噬菌体展示文库的筛选的本发明的肽是否也能够阻断IgG与细胞上FcRn的结合之外，设计并进行下列荧光激活细胞分选(FACS)测定。

A.用Alexa-Fluor-488标记Synagis

将人源化的IgG1(Synagis，Medlmmune，Gaithersburg，MD)用AlexaFluor 488蛋白标记试剂盒(Molecular Probes/Invitrogen，Carlsbad，CA)根据制造商建议的流程来标记。简言之，将50μl的1M碳酸氢钠pH 9.0加至溶于PBS的500μl的2mg/ml的IgG溶液。此蛋白溶液被加至AlexaFluor 488琥珀酰亚胺酯(干粉)并于室温孵育1小时。通过使用试剂盒组件柱(Bio-Rad BioGel P-30精细尺寸排阻纯化树脂)的尺寸排阻层析法来纯化蛋白。将样品加载至柱上并用PBS洗脱。第一条颜色带含有标记的蛋白。标记的程度是通过于280nm和494nm测量洗脱的IgG的吸光度来确定的。使用下列公式确定蛋白摩尔浓度：蛋白浓度(M)＝[A₂₈₀-(A₄₉₄×0.11)×稀释因子]/203,000。此外，用于获得每摩尔蛋白的染料的摩尔数的公式是：＝A₄₉₄×稀释因子/71,000×蛋白浓度(M)。通常，每摩尔的IgG结合4-7摩尔的Alexa-Fluor 488。

B.使用293克隆11细胞的IgG-肽竞争FACS测定

在测定的准备中，将含有5μg/ml杀稻瘟素和250μg/ml G418(Gibco，Carlsbad，CA)的完全DMEM培养基(Gibco，Carlsbad，CA)中的HEK293克隆11细胞(实施例2)旋转沉淀并以3×10⁶细胞/ml的浓度重悬于缓冲液C(缓冲液C：含有10mM EDTA(Gibco)的Dulbecco氏PBS(Gibco，Carlsbad，CA))中。将细胞(0.1ml)用移液器移至96孔测定板的每个孔中并且使用Sorvall RT7台式离心机将板于2600RPM离心5分钟。将上清液轻柔地倒出并且将板在纸巾上吸干。将以不同浓度溶于缓冲液C的肽竞争剂(90μl)加至板并用多道移液器混合。10μl的Alexa 488标记的Synagis被加至板上的每个孔，以使Alexa 488标记的Synagis

的终浓度为100nM。将板裹在铝箔中，放置在冰上一小时并且之后于2600rpm在Sorvall RT7台式离心机中离心5分钟，之后用100μl的缓冲液C冲洗一次并且进行第二次离心步骤。将细胞重悬在200μl的缓冲液C中并且在Beckman Coulter EPICS XL流式细胞仪上分析。

实施例6.使用表面等离子共振(SPR)确定对肽的平衡结合常数(K_D)的方法

进行下列步骤以通过胺偶联反应将可溶的人类或食蟹猴FcRn与CM5感应芯片(Biacore AB，Uppsala，瑞典)的葡聚糖表面交联，其中所述胺偶联反应包括如Biacore(BIA应用手册，AB版，第4.2节，Biacore AB，Uppsala，Sweden)所建议的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)(Biacore AB，Uppsala，瑞典)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(BiacoreAB，Uppsala，瑞典)。将FcRn蛋白在50mM的pH 4.5醋酸钠(BiacoreAB，Uppsala，瑞典)中稀释至10μg/ml至30μg/ml的浓度并且用来包被感应芯片上的一个流动槽。用1M的pH 8.5乙醇胺盐酸盐(Biacore AB，Uppsala，瑞典)封闭FcRn流动槽上的残余位点。用乙醇胺封闭对照流动槽以便扣除参考。对于单体肽的分析，将FcRn包被至4000-5000响应单位(RU)的终密度。对于肽二聚体的分析，将FcRn包被至2000-2500RU的密度。使用BIACORE 3000仪器(Biacore AB Uppsala，瑞典)进行所有的SPR测量。对于在pH 6或pH 7.4完成的测量，在50mM磷酸盐、100mM氯化钠、0.01％表面活性剂P20(Biacore AB，Uppsala，瑞典)中进行实验。

A.用于确定单体肽的结合常数的代表性步骤

将十份2倍稀释的肽以20μl/min的速率注入FcRn-CM5芯片2分钟。用缓冲液将肽从芯片离解2.5分钟。以30μl/min的速率将HBS-P缓冲液(Biacore AB，Uppsala，瑞典)注射30秒以便从芯片除去任何残留的肽。产生感应谱并用BiaEval软件3.1版(Biacore AB，Uppsala，瑞典)分析。将每次注射所观察到的平衡态RU对浓度作图。使用BiaEval软件中包括的稳定态亲和力模型通过对图的分析获得平衡态K_D值。

B.用于确定二聚体肽的结合常数的代表性步骤

将十份2倍稀释的肽以30μl/min的速率注入FcRn-CM5芯片10分钟。用缓冲液将肽从芯片离解10分钟。以100μl/min的速率将含有50mM Tris-盐酸、100mM NaCl、0.01％表面活性剂P20的溶液(pH 9.0)注射两次60秒以便从芯片除去任何残留的肽。

产生感应谱并用BiaEval软件3.1版(Biacore AB，Uppsala，瑞典)分析。将每次注射所观察到的平衡态RU对浓度作图。使用BiaEval软件中包括的稳定态亲和力模型通过对图的分析获得平衡态K_D值。

实施例7.含有二硫键的单体肽的合成

使用固相肽合成通过烧结的圆底烧瓶手动地或者通过AdvancedChemtech 396-ω合成仪(Advanced Chemtech，Louisville，KY)进行单体肽的合成。使用标准的Fmoc/tBu流程(W.C.Chan和P.D.White，编辑，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach(Fmoc固相肽合成：实用方法)Oxford，University Press Inc.，New York(2000))，与Rink酰胺树脂(Novabiochem，San Diego，CA)或PAL-PEG-PS(AppliedBiosystems，Foster City，CA)组合以在裂解时产生C-端酰胺。偶联试剂是2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和N-羟基苯并三唑(HOBt)(Novabiochem，San Diego，CA)。碱是二异丙基乙胺(DIEA)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)而N，N-二甲基甲酰胺(DMF)是溶剂(EMScience，Kansas City，MO)。经典的合成循环包括使用溶于DMF的20％哌啶的2×10分钟的去保护步骤、使用HOBt/HBTU的2×30分钟的氨基酸偶联以及使用醋酸酐/HOBt的10分钟的加帽步骤。通过用95％的三氟乙酸、2.5％的乙烷二硫醇、1.5％的三异丙基硅烷和1％的水处理2小时将肽从树脂上切下并且用冰冷的醚沉淀、离心并用醚研磨三次。

通过将肽在4∶1的乙酸和水的混合物(EM Science，Kansas City，MO)中溶解至1mg/ml的浓度而将粗制的含有半胱氨酸的肽氧化为它们相应的二硫化物。十摩尔当量的碘(溶于水的1M溶液，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)被加至溶液并且将反应混合物于室温混合一小时。通过逐渐加入1M硫代硫酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)终止反应直到获得澄清的溶液。将反应混合物在真空中浓缩并且之后用装备了250mm×21.2mm的Phenomenex(Torrence CA)C 18柱的Waters Prep600反相HPLC系统(Millford，MA)纯化。为HPLC纯化步骤所选择的洗脱液是梯度的含有0.1％(重量/体积)TFA的乙腈水溶液。将适当级分收集，集中并且冷冻干燥。通过与偶联了电喷雾质谱(Mariner ES-MS)(Applied Biosystems，FosterCity，CA)的250mm×2mm柱(Phenomenex，Torrence，CA)组合的反相分析型HPLC确认了肽的身份和纯度。

表2提供了来自肽表达文库筛选的原始噬菌体肽序列的列表，其中所述文库被用于鉴定具有对人类FcRn的高亲和力和阻断IgG-FcRn相互作用的能力的肽。在表2和随后的表中，第1栏含有肽标志符。第2栏含有肽的氨基酸序列。第3栏含有实施例4中概述的IgG竞争ELISA所确定的每种肽的IC₅₀。第4和5栏分别含有通过实施例6中概述的Biacore分析在pH 6和pH 7.4所确定的每种肽的K_D。

表2.原始噬菌体肽序列

表3提供了肽第506号的平截的列表并显示了平截对于这些肽与人类FcRn的结合参数的影响。第1栏含有肽标志符。第2栏含有肽的氨基酸序列。第3栏含有实施例4中概述的IgG竞争ELISA所确定的每种肽的IC₅₀。第4和5栏分别含有通过实施例6中概述的Biacore分析在pH 6和pH 7.4确定的每种肽的K_D。

表3.肽第506号的平截

表4提供了衍生自肽第501号的肽和肽类似物的列表，其中单个的氨基酸已经被丙氨酸取代(丙氨酸扫描)。表4显示取代对这些肽与人类FcRn的结合参数的影响。

表4.肽第501号的丙氨酸扫描

表5提供衍生自肽第501号的肽和肽类似物的列表，其中已经进行了用半胱氨酸类似物对半胱氨酸的取代。表5显示取代对这些肽与人类FcRn的结合参数的影响。

表5.肽第501号的半胱氨酸类似物

*“Pen”＝L-青霉胺；“hC”＝L-高半胱氨酸

表6提供衍生自肽第501号和肽第32号的肽的列表，其中已经进行N-甲基氨基酸对单个氨基酸的取代。表6显示取代对这些肽与人类FcRn的结合参数的影响。

表6.肽第501号和肽第32号的N-甲基扫描

*“Pen”＝L-青霉胺；Sar＝肌氨酸(N-甲基甘氨酸)；“NMe”前缀代表N-甲基氨基酸

表7提供衍生自肽第32号的肽类似物平截的列表。表7显示平截对这些肽与人类FcRn的结合参数的影响。

表7.肽第32号的平截

*“Pen”＝L-青霉胺；

表8提供衍生自肽第32号的肽和肽类似物的列表，其中在通常具有序列Gly-Gly-Leu之处已经产生用各种氨基酸和氨基酸类似物的取代。

表8.在Gly-Gly-Leu处修饰的肽第32号的类似物

*“Pen”＝L-青霉胺；“NMeLeu”＝N-甲基亮氨酸；“Sar”＝肌氨酸；“Aib”＝氨基异丁酸

表9提供衍生自肽第32号的肽和肽类似物的列表，其中在通常具有序列Arg-Phe-青霉胺之处已经产生用各种氨基酸和氨基酸类似物的取代。

表9.在Arg-Phe-青霉胺处修饰的肽第32号的类似物

表10提供衍生自肽第32号的肽和肽类似物的列表，其中已经在通常具有序列青霉胺-Thr-Gly之处产生用各种氨基酸和氨基酸类似物的取代。

表10.在Pen-Thr-Gly处修饰的肽第32号的类似物

*“Pen”＝L-青霉胺；“NMeAla”＝N-甲基丙氨酸

表11提供衍生自肽第187号的肽和肽类似物的列表，其中已经在通常具有序列Phe-Gly-肌氨酸之处产生用各种氨基酸和氨基酸类似物的取代。

表11.在Phe-Gly-Sar处修饰的肽第187号的类似物

*“Pen”＝L-青霉胺；“Sar”＝肌氨酸；“NMeLeu”＝N-甲基亮氨酸

表12提供衍生自肽第32号的肽和肽类似物的列表，其中已经在通常具有序列His-Phe-Gly之处产生用各种氨基酸和氨基酸类似物的取代。

表12.在His-Phe-Gly处修饰的肽第32号的类似物

各种氨基酸和氨基酸类似物对酪氨酸的取代。

表13.酪氨酸取代

*“Pen”＝L-青霉胺

表14提供衍生自肽第32号的肽和肽类似物的列表，其中已经在通常具有序列Gly-Leu之处产生用各种氨基酸和氨基酸类似物的取代。

表14.在Gly-Leu处修饰的肽第32号的类似物

*“Pen”＝L-青霉胺；“Sar”＝肌氨酸

表15提供衍生自肽第32号的肽和肽类似物的列表，其在通常具有序列Gly-Leu之处将甘氨酸和亮氨酸一起取代为二肽拟物。

表15.在Gly-Leu处修饰的肽第32号的拟肽类似物

*“Pen”＝L-青霉胺

实施例8.含有组氨酸类似物的肽的合成

如实施例7中对于单体肽二硫化物的合成的描述来合成修饰的组氨酸类似物(表16)，例外的是下列修饰的组氨酸类似物。通过将含有与肽第99号类似的完全保护的肽的树脂在无水甲基碘中悬浮15小时来合成肽第259号。用二氯甲烷冲洗树脂并如上所述将肽从树脂切下、氧化并通过HPLC纯化以产生单甲基化组氨酸肽，即肽第259号。

通过将含有与肽第99号类似的完全保护的肽的树脂在无水甲基碘中悬浮72小时来合成肽第260号。用二氯甲烷冲洗树脂并如上所述将肽从树脂切下、氧化并通过HPLC纯化以产生二甲基化组氨酸肽，即肽第260号。

通过将含有与肽第248号类似的完全保护的肽的树脂于氮气下在二氯甲烷中悬浮来合成肽第269号。向悬浮液加入十摩尔当量的2，4，6-三叔丁基吡啶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，之后加入五摩尔当量的甲基-三氟甲烷-磺酸盐(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。振荡下使反应进行4小时并用二氯甲烷首先漂洗，之后用二甲基甲酰胺漂洗并且最后再次用二氯甲烷漂洗。如上所述将肽从树脂切下、氧化并通过HPLC纯化以产生N-甲基-噻唑肽，即肽第269号。

通过用溶于含有33％乙醇、10％乙腈、10％N，N-二甲基甲酰胺的pH 7.5的100mM磷酸钠缓冲溶液中的30当量的硫酸铜、30当量的抗坏血酸和10当量的叠氮化钠处理所述肽，即肽第261号，来合成肽第271号。使反应进行2小时并且如上所述通过HPLC纯化混合物以产生含有1，2，3-三唑侧链的肽，即肽第271号。

表16提供了与相同肽或肽类似物相比组氨酸被单个氨基酸或氨基酸类似物所取代的各种肽和肽类似物的列表。还提供了取代对这些肽与人类FcRn的结合参数的影响。

表16.组氨酸取代

实施例9.含有Gly-Gly的拟肽类似物的肽的合成

所有的Gly-Gly氨基酸拟物(表17)都作为它们的Fmoc-氨基保护的氨基酸被结合并且除非另外指出，是商业上可得的(Chem-Impex，WoodDale，IL)。根据Freidinger等，J.Org.Chem.47：104-109(1982)描述的流程，通过将3(R)-3-氨基-2-氧代-1-哌啶-乙酸的N-Fmoc衍生物结合至肽第227号以合成含有3(R)-3-氨基-2-氧代-1-哌啶-乙酸的肽。根据Freidinger等，J.Org.Chem.47：104-109(1982)描述的流程，通过将3(R)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸的N-Fmoc衍生物结合至肽第214号以合成含有3(R)-3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸的肽。根据Subasinghe等，J.Med.Chem.36：2356-2361(1993)描述的流程，通过将5，5-环二肽拟物结合至肽第197号或肽第198号以合成含有5，5-二环二肽拟物的肽，例外的是使用所有的D-氨基酸。根据Etzkom等，J.Am.Chem.Soc.116：10412(1994)描述的流程，通过将6，5-二环二肽拟物结合至肽第204号以合成含有6，5-二环二肽拟物的肽，例外的是使用所有的D-氨基酸。根据Freidinger等，J.Org.Chem.47：104-109(1982)描述的流程，通过将(D，L)-Freidinger氏内酰胺结合至肽第216号以合成含有(D，L)-Freidinger氏内酰胺的肽，例外的是使用L-甲硫氨酸替代D-甲硫氨酸。

表17提供衍生自肽第501号的肽和肽类似物的列表，其中已经在通常具有两个相邻的甘氨酸(Gly-Gly)之处产生用各种氨基酸和氨基酸类似物的取代。

表17.Gly-Gly处修饰的肽第501号类似物

*“β-Ala”＝β-丙氨酸；“Apa”＝5-氨基戊酸

表18提供衍生自肽第99号的肽和肽类似物的列表，其在通常具有序列Gly-Gly之处将两个甘氨酸一起取代为拟肽类似物。

表18.Gly-Gly处修饰的肽第99号的拟肽类似物

*“Pen”＝L-青霉胺；“NMeLeu”＝N-甲基亮氨酸；“NMeAla”＝N-甲基丙氨酸

实施例10.经由内酰胺桥环化的肽的合成

通过上文实施例7中概述的固相肽合成来合成内酰胺环化的肽(表19)，例外的是下列氨基酸被用作各半胱氨酸的取代物：Fmoc-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-Orn(Aloc)-OH、Fmoc-Dab(Aloc)-OH 和Fmoc-Dap(Aloc)-OH、Fmoc-Glu(0烯丙基)-OH和Fmoc-Asp(O烯丙基)-OH(Bachem，Torrance，CA)。在树脂上产生完全保护的肽的过程完成后，将树脂在二氯甲烷中溶胀，用氮气吹扫并且用0.1摩尔当量的四-(三苯基膦)钯(0)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和30摩尔当量的苯硅烷(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)处理并且使反应进行三小时。首先用二氯甲烷冲洗树脂，之后用DMF冲洗并且最后用溶于DMF的1％(体积/体积)三乙胺和1％(重量/体积)二乙基二硫代氨基甲酸溶液冲洗另外五次。使用DMF的另外的清洗步骤之后用六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷基磷(PyBOP)(Novabiochem，San Diego CA)和DIEA处理树脂16小时。如上文实施例7中所描述将肽从树脂切下并纯化。

表19提供含有氨基酸取代的本发明各种肽的列表，所述氨基酸取代是半胱氨酸残基对允许各个肽经由内酰胺桥环化的氨基酸和氨基酸类似物的取代。还提供了取代对这些肽与人类FcRn的结合参数的影响。

表19.内酰胺环化的肽

*下划线的氨基酸的侧链之间有酰胺键；Dab＝1，3-二氨基丁酸；Dap＝1，2-二氨基丙酸；Orn＝鸟氨酸

实施例11.直链肽类似物的合成

如上文实施例7中所述合成未桥连的(“直链的”)肽类似物，例外的是如表20和21中所示形成二硫化物的氨基酸被取代。

表20提供肽第501号衍生的本发明的直链肽和肽类似物的列表。表20还提供这些肽与人类FcRn的结合参数。

表20.肽笫501号的直链类似物

*“Sar”＝肌氨酸；“NMeLeu”＝N-甲基亮氨酸

表21提供肽第236号衍生的肽和肽类似物的列表，其中各种拟肽类似物已经在通常具有甘氨酸-肌氨酸序列(Gly-Sar)之处被取代。

表21.具有Gly-Gly拟肽的肽第236号的直链类似物

*“Sar”＝肌氨酸；“NMeLeu”＝N-甲基亮氨酸

实施例12.经由还原性烃基化的肽二聚体的合成

通过肽醛和肽氨基(N)或羧基(C)端的胺的还原性烃基化来产生肽二聚体(表22)。

如上文实施例7中对单体肽二硫化物的合成所述来合成肽N-端胺。

也如上文实施例7中对单体肽二硫化物的合成所述来合成肽C-端胺，例外的是1，2-乙二胺树脂(Novabiochem，San Diego，CA)被用于合成步骤中。从而，从树脂切下而产生C-端乙胺。

通过将N-端氨基酸的未保护的胺与5当量的琥珀酸酐(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在溶于DMF的DIEA存在的条件下反应2小时来合成肽N-端醛(图1)。随后与2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷甲胺(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在PyBOP和DIEA存在的条件下反应2小时产生保护的二醇树脂。之后将粗制肽从树脂切下，之后如上文实施例7中对单体肽二硫化物合成所述进行半胱氨酸氧化和纯化，以产生肽二醇。将二醇溶于33％乙酸之后加入2当量的高碘酸钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)并使反应进行5分钟。将反应混合物用20当量(对二醇而言)的乙二醇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)淬火，并且十分钟后，将粗制反应混合物用水稀释3倍并在C18Sep-Pak柱(Waters Corp.，Milford，MA)上用含有0.1％TFA的逐渐升高的梯度的乙腈水溶液纯化。如实施例7中所述将肽醛冷冻干燥并在液相层析(Applied Biosystems，Foster City，CA)之后经受质谱(Mariner ES-MS)分析。

如上文实施例7中对单体肽二硫化物的合成所述来合成肽C-端胺，例外的是Fmoc-1-氨基-2，3-丙二醇-2′-氯三苯甲基树脂(Novabiochem，SanDiego，CA)被用来代替Rink酰胺树脂。因此，所得的肽树脂含有掩蔽的C-端二醇。如上文对N-端醛所述，当从树脂切下时，二醇被氧化为醛。

为合成内酰胺环化的肽例如肽第275号，根据上文实施例10所描述的方法合成肽单体，其中所述实施例10显示通过借以在从树脂切下之前在树脂上进行Asp-Lys环化的内酰胺桥环化的肽的合成。

通过将一当量的肽醛与以40mg/ml的浓度溶于含有2％乙酸的DMF的一当量的含有胺的肽反应来合成肽二聚体(图2)。60分钟之后，加入2当量的氰基硼氢化钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)并使反应振荡1小时。将反应混合物用水稀释10倍并如实施例7中所述通过HPLC纯化并在液相层析(Applied Biosystems，Foster City，CA)之后通过质谱(MarinerES-MS)分析。

表22提供了通过还原性烃基化合成的本发明的二聚体肽的列表。在表22和之后的表中，第1栏含有肽标志符。第2栏含有肽的氨基酸序列。第3栏含有通过实施例4中概述的IgG竞争ELISA所确定的每种肽的IC₅₀。第4和5栏分别含有通过实施例6中概述的Biacore分析于pH 6和pH 7.4所确定的每种肽的K_D。第6栏含有通过实施例5中概述的竞争性IgG结合FACS分析所确定的每种肽的IC₅₀。

表22.通过还原性烃基化合成的二聚体和三聚体

*X＝3(r)-3-氨基-1-羧甲基-戊内酰胺；肽序列上方或下方的水平方括弧指示桥连的存在

实施例13.通过硫醇连接体和溴乙酰化的肽合成肽二聚体

还通过将溴乙酰化的肽与硫醇连接体反应来合成肽二聚体(表23)。通过将受保护的肽树脂的游离的α-氨基基团与溶于DMF的4当量的溴乙酰溴(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和8当量的DIEA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)反应来合成溴乙酰化的肽(图3)。1小时后，如上文实施例7中所述，用DMF冲洗树脂，之后用DCM冲洗并且从树脂上切下。在使用双硫醇连接体将内酰胺环化的肽实施二聚化的情况下，在溴乙酰化步骤之前进行在树脂上环化的步骤。在使用双硫醇连接体将含有二硫化物的肽实施二聚化的情况下，如上文实施例7中所述在切下之后进行碘氧化步骤。

通过将NH₂-Gly-2-氯三苯甲基树脂(Novabiochem，San Diego，CA)与2当量的N，N-双(N’-Fmoc-3-氨基丙基)甘氨酸半硫酸钾(Chem-Impex，Wood Dale，IL)在溶于DMF的2当量的PyBOP(Novabiochem，San Diego，CA)和DIEA存在的情况下反应18小时来合成双硫醇连接体(图3)。用溶于DMF的20％的哌啶的两个10分钟的处理来除去Fmoc保护基团。对于一些连接体化合物来说，β-丙氨酸还作为间隔单元而被并入。如上文用PyBOP和DIEA将Fmoc-β-Ala-OH(Novabiochem)偶联至树脂。在用溶于DMF的20％的哌啶除去Fmoc保护基团后，并入另一个β-丙氨酸间隔单元或者通过将自由的N-端胺树脂与2当量的N-琥珀亚酰胺基-S-乙酰硫代丙酸酯(SATP；Pierce，Rockford，IL)和4当量的DIEA反应18小时来将双硫醇连接体并入。

随后，通过将0.05mmol的肽树脂与含有1ml的DMF和0.4ml的缓冲液A(缓冲液A：1M盐酸羟胺(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、40mM磷酸钠pH 7.5、50mM EDTA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))的脱气的溶液反应18小时来完成S-乙酰基保护基团的去除。将树脂用DMF冲洗，之后用DCM冲洗，并用溶于具有2％的三异丙基硅烷的DCM中的50％的TFA溶液从树脂切下。如上文实施例7中所述加工并纯化粗制的连接体。

使用双硫醇连接体通过将一当量的纯化的双硫醇连接体与溶于具有10％水和50％100mM磷酸钠(pH 7.5)的DMF的二当量的溴乙酰化的N-端肽反应而产生肽二聚体(图3)。18小时之后，如上文实施例7中所述通过反相HPLC柱纯化粗制的反应混合物。

通过将溴乙酰化的肽与用SATP衍生的肽反应来合成肽第122号(图4)。简单地说，将具有游离的N-端胺的粗制肽树脂与溶于DMF的2当量的SATP反应2小时。如上文所述将S-乙酰基保护基团除去，之后如上文所述从树脂切下并随后纯化。

表23提供了通过硫醇连接体合成的本发明的二聚体肽的列表。

表23.使用硫醇连接体合成的二聚体

*Pen＝青霉胺；Sar＝肌氨酸；p＝D-脯氨酸；NMeLeu＝N-甲基亮氨酸；肽序列上方或下方的水平方括弧指示桥连的存在

实施例14.经由还原性烃基化的肽三聚体的合成：肽第247号

通过肽醛和肽氨基N-端胺的还原性烃基化来产生肽三聚体(表22)。

如上文实施例7中对于单体肽二硫化物的合成所述来合成肽N-端胺，例外的是用双官能的胺连接体例如双氨基丙基甘氨酸(BAPG；用作双-Fmoc-BAPG，其购买自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)将N-端加帽，之后偶联肌氨酸。如实施例12中所述来合成肽N-端醛(图1)。通过将二当量的肽醛与以40mg/ml的浓度溶于含有2％乙酸的DMF中的一当量的含有胺的肽反应来合成肽三聚体(如图2)。60分钟后，加入4当量的氰基硼氢化钠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)并且将反应振荡1小时。将反应混合物用水稀释10倍并如实施例7中所述通过HPLC纯化并在液相层析(Applied Biosystems，Foster City，CA)之后通过质谱(Mariner ES-MS)分析。

实施例15.使用二酸和胺连接体合成肽二聚体

通过将树脂上的两个肽单体的N-端与双官能的酸连接体反应或通过进行树脂上含有双官能的胺连接体的肽的合成，从而连接树脂上两个肽单体的C-端来产生连接酰胺的肽二聚体(表24)。

如上文实施例7中对于单体肽二硫化物的合成所述来合成N-端连接的肽二聚体，例外的是：在将肽从树脂切下之前，用双官能酸连接体将两个肽单体的N-端连接。例如，通过将含有类似于肽第235号的肽序列的具有未保护的N-端的肽树脂与0.5当量的琥珀酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在1当量的PyBOP和2当量的DIEA存在的条件下反应来合成肽第283号。这产生树脂上经由它们的N-端通过酰胺键共价连接的相邻的肽。

如实施例7中所述将所得到的肽二聚体从树脂切下并且纯化，例外的是HPLC纯化之前肽二硫化物没有被氧化。将纯化的还原的肽在含有20％DMSO的10mM的磷酸钠(pH 7.5)中溶解至大约0.1mg/mL并且于室温混合3天。这一氧化步骤使得在二聚体的一个肽单体中而不是在二聚体的两个单体之间形成二硫键。将反应混合物用水稀释至0.05mg/mL的肽浓度并且在C18Sep-Pak柱(Waters Corp.，Milford，MA)上用含有0.1％TFA的逐渐升高的梯度的乙腈水溶液进行纯化。如实施例7中所述将肽二聚体冷冻干燥并在液相层析(Applied Biosystems，Foster City，CA)之后经受质谱(Mariner ES-MS)分析。(参见图5)。在肽第283号的实例中，通过用胰蛋白酶将肽消化30分钟，之后通过LCMS分析所得的肽来确认二硫化物连接模式。已经知道胰蛋白酶在精氨酸和赖氨酸残基之后切割，并且在精氨酸-苯丙氨酸键之处切割肽第283号。肽第283号的LCMS的主要产物是NH₂-[Phe-Phe-Pen-Thr-Gly-His-Phe-Gly-Sar-NMeLeu-Tyr-Pro-Cys]-CONH₂(二硫化物)(LCMS：M+H＝1355.6Da)，其表示肽第283号的二硫键是在每个含13个氨基酸的肽单体中于分子内形成的。

如肽第283号一样合成肽第201号，例外的是肽序列类似于肽第32号，所用的二酸连接体是乙二醇-双(琥珀酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)并且没有将PyBOP用于偶联反应。

如肽第283号一样合成肽第279号，例外的是所用的二酸连接体是双-dPEG6-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Quanta Biodesigns Ltd.)并且没有将PyBOP用于偶联反应。

如肽第283号一样合成肽第281号，例外的是用大大过量的琥珀酸酐(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)处理肽树脂，其导致树脂上所有的肽含有琥珀酸酯加帽的N-端。将该树脂用0.5当量的N，N’-二甲基乙基-烯二胺(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在1当量的PyBOP和2当量的DIEA存在的条件下处理。如对肽第283号一样进行随后的切下、纯化和氧化步骤。

如肽第283号一样合成肽第282号，例外的是所用的二酸连接体是N-甲基-亚氨二乙酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。

如肽第283号一样合成肽第284号，例外的是所用的二酸连接体是3，3-二甲基戊二酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。

如肽第283号一样合成肽第285号，例外的是所用的二酸连接体是Boc-Asp(OH)-OH(Novabiochem，San Diego，CA)。

如肽第283号一样合成肽第286号，例外的是所用的二酸连接体是Boc-Glu(OH)-OH(Novabiochem，San Diego，CA)。

如上文实施例7中对于单体肽二硫化物的合成所述来合成C-端连接的肽二聚体，例外的是在肽合成前将双官能胺连接体偶联至树脂。这产生具有通过酰胺键共价连接的它们的C-端的肽二聚体。例如，通过首先将Lys(Fmoc)-OH(Novabiochem，San Diego，CA)偶联至树脂，之后将氨基酸偶联以产生与肽第235号类似的序列来合成肽第280号。这产生两个肽链的共价连接，如将它们在树脂上合成一样。如上文对N-端连接的二聚体所述将所得的肽二聚体从树脂切下、纯化并氧化(参见图6)。

如同肽第280号一样合成肽第287号，例外的是甘氨酸残基(Gly)被插入到肽第235号序列和分支的赖氨酸连接体之间。

如同肽第280号一样合成肽第288号，例外的是两个甘氨酸残基(Gly-Gly)被插入到肽第235号序列和分支的赖氨酸连接体之间。

表24提供含有酰胺键的本发明的二聚体肽的列表。

表24.具有酰胺连接体的二聚体

*Pen＝青霉胺；Sar＝肌氨酸；NMeLeu＝N-甲基亮氨酸

实施例16.经由还原性烃基化的肽-Fc融合物的合成

如实施例12所述合成肽N-端醛肽第252号、肽第229号和肽第232号(表25)。使用相同的流程产生所有三个肽-Fc融合物：将CysFc(具有N-端半胱氨酸的Fc结构域)和4.5当量的肽醛于冰上在80mM醋酸钠(pH5.5)中孵育1小时。加入氰基硼氢化钠至20mM的终浓度并且将反应于4℃孵育16小时。通过SDS-PAGE分析反应混合物以确保主要由单个肽向Fc-蛋白加成。将蛋白混合物用PBS透析两次并且测定其体外阻断活性(表25)。在肽第252-Fc的实例中，还将肽在TG32B小鼠IgG分解代谢模型中评估。CysFc的生产可如美国专利申请公开第US 2005/0027109号中所述进行，其中CysFc的生产的公开内容通过引用并入本文。

表25提供使用CysFc和醛-肽合成的本发明的肽-Fc融合物蛋白的列表。

表25.肽-Fc融合物

*Pen＝青霉胺；Sar＝肌氨酸；NMeLeu＝N-甲基亮氨酸

实施例17.转基因小鼠

从Bar Harbor，ME的Jackson实验室的Roopenian博士之处获得转基因小鼠。通过经由同源重组的外源多核苷酸序列的插入将内源小鼠FcRn和β₂m基因失活并且通过转基因用人类FcRn和人类β₂m基因代替(muFcRn(-/-)、muβ₂m(-/-)、+huFcRn、+huβ₂m)。这些小鼠也被称作品系名TG32B。

实施例18.TG32B小鼠中使用5mg/kg和10mg/kg肽第270号对人类IgG分解代谢的影响

在t＝0小时(T₀)用500mg/kg的人类IgG(MP Biomedicals，Irvine，CA)对成年TG32B小鼠静脉内注射。在24、48、72、96和120小时，用5mg/kg或10mg/kg的肽第270号对小鼠静脉内注射。在每个时间点用含有15mM醋酸钠(pH 5)的媒介物PBS进行对照注射。在所有时间点以及在168小时于注射前采集血液样品。制备血清并贮存于-20℃直到进行ELISA。

IgG Fc结构域特异性ELISA被用来在每个时间点测定血清中人类IgG的水平。简言之，将30μl的10μg/ml的山羊抗人IgG(Pierce，Rockford，IL)贮存液用6ml的0.05M碳酸氢钠(pH 9.6)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)稀释。用50μl/孔的这一溶液涂布96孔板并于37℃孵育1小时。除去涂布液并用PBST(含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水)冲洗一次。之后加入溶于PBS的200μl/孔的2％的牛血清白蛋白(BSA)贮存液并且将板于37℃孵育1小时。用PBST将孔冲洗三次并通过进行从50ng/ml的hIgG1开始的2.5倍的稀释一式三份生成标准曲线。之后将100μl的标准或样品溶液加至孔中并且将板于37℃孵育1小时。再进行三次PBST冲洗，之后加入100μl的溶于含有2％BSA的PBS的山羊抗人IgG[Fc]-HRP轭合物(Pierce，Rockford，IL)的1∶10,000稀释液。将板于37℃孵育1小时，之后用PBST冲洗并向每个孔加入100μl的TMB单组份底物(BioFX，Owings Mills，MD)。5分钟后通过向每个孔加入100μl的0.25M硫酸以终止显色。于450nm测量每个孔的UV吸光度并且将标准曲线用来获得实验的血清IgG浓度对时间的图。

实施例19.TG32B小鼠中肽第231号、肽第274号和肽第252-Fc号对人类IgG分解代谢的影响

在t＝0小时(T₀)用500mg/kg的人类IgG(MP Biomedicals，Irvine，CA)对成年TG32B小鼠静脉内注射。在24、48和72小时，用1mg/kg的肽第231号、1mg/kg的肽第274号或20mg/kg的肽第252号-Fc对小鼠静脉内注射。在每个时间点用15mM醋酸钠(pH 5)进行对照注射，并将其作为所有注射的媒介物。在所有时间点以及在30、96和144小时于注射前采集血液样品。制备血清并贮存于-20℃直到进行ELISA。

如上文实施例18中所述来确定每个时间点的血清中人类IgG的浓度。

实施例20.食蟹猴中肽第270号对人类IgG分解代谢以及内源IgG、IgM和白蛋白的影响

在0小时用5mg/kg的生物素化的人类IgG(MP Biomedicals，Irvine，CA)的静脉内剂量对具有4.8kg平均重量的三只成年食蟹猴静脉内注射。在24、48、72和96小时，用10mg/kg的肽第270号或等体积的媒介物(30mM醋酸钠，pH 5)以1ml/min的速率对动物静脉内注射。在120小时，用10mg/kg的肽第270号的第五剂处理动物CO6215。在所有注射前以及120、168、192和244小时和30天时采集血液样品。制备血浆并贮存于-20℃直到进行ELISA。

使用链霉亲和素-Fc特异性ELISA检测生物素-hIgG示踪剂。将涂布了链霉亲和素的板(Pierce，Rockford，IL，产品目录#15121)用PBST(磷酸盐缓冲盐水+0.05％吐温-20)冲洗三次。血清样品和标准品用PBSB(PBS+2％BSA)稀释。用1.56ng/ml至200ng/ml的范围建立标准曲线。每孔加入稀释的样品(100μl)或标准品并且于室温孵育两小时。之后将孔用PBST(300μl/孔)冲洗三次。将山羊抗人Fc-HRP(Pierce，Rockford，IL，产品目录#31416)用PBSB以1∶25,000稀释并且加入100μl/孔并将板于室温孵育30分钟。将板用PBST(300μl/孔)冲洗三次并用100μl/孔的BioFx超敏TMB底物(BioFX，Owing Mills，MD)于室温显色大约五分钟。反应的进行通过加入100μl/孔的0.25M硫酸来终止并且以450nm的波长测量每孔的吸光度。

使用下列ELISA流程检测内源食蟹猴IgG。首先，将兔抗猴IgG在涂布缓冲液(涂布缓冲液＝1个碳酸盐-碳酸氢盐胶囊，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO产品目录#C-3041，溶于100mL水)中稀释至2μg/ml。接下来，用100μl/孔的2μg/ml兔抗猴IgG(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)涂布96孔板(Costar/Corning)并于37℃孵育一小时。将板用PBST(含有0.05％吐温-20的PBS)冲洗四次并且用200μl/孔的PBSB(溶于PBS的1％BSA；从溶于PBS的10％BSA贮存液稀释；KPL)于37℃封闭一小时。将板用PBST再冲洗四次。将血清样品和标准品用PBSB稀释。用2000ng/ml至1.9ng/ml范围的猴IgG(Antibodies Incorporated，Davis，CA)建立标准曲线。之后将100μl/孔的每种样品于37℃孵育一小时。将板用PBST清洗三次，加入100μl/孔的溶于PBSB的兔抗猴IgG-HRP(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的1∶30,000稀释液并于37℃孵育一小时。将板用PBST冲洗三次并用100μl/孔的SureBlue TMB底物(KPL，Gaithersburg，MD)于室温显色大约五分钟。使用100μl/孔的TMP终止液(KPL，Gaithersburg，MD)来终止显色反应并且于450nm的波长测量每孔的吸光度。

使用下列ELISA流程检测内源食蟹猴血清白蛋白。首先，将兔抗猴血清白蛋白在涂布缓冲液(涂布缓冲液＝1个碳酸盐-碳酸氢盐胶囊，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO产品目录#C-3041，溶于100mL水)中稀释至5μg/ml。接下来，用100μl/孔的5μg/ml兔抗猴血清白蛋白(NordicImmunology，荷兰，产品目录#RAMon/Alb)涂布96孔板(Costar/Coming)并于37℃孵育一小时。将板用PBST(含有0.05％吐温-20的PBS)冲洗四次并且用300μl/孔的溶于PBS的5％的鱼明胶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO产品目录#G-7765)贮存液于37℃封闭一小时。将板用PBST再冲洗四次。将血清样品和标准品用PBSB稀释。用200ng/ml至0.39ng/ml范围的猴血清白蛋白(Nordic Immunology，荷兰，产品目录#MonAlb批#6082)建立标准曲线。之后将100μl/孔的每种样品于37℃孵育一小时。将板用PBST冲洗六次。加入100μl/孔的溶于PBSB的山羊抗人白蛋白-HRP轭合物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的1∶30,000稀释液并于37℃孵育一小时。将板用PBST冲洗六次并用100μl/孔的SureBlue TMB底物(KPL，Gaithersburg，MD)于室温显色大约五分钟。使用100μl/孔的TMP终止液(KPL，Gaithersburg，MD)来终止显色反应并且于450nm的波长测量每孔的吸光度。

使用下列ELISA流程检测内源食蟹猴IgM。首先，将山羊抗猴IgM抗体在涂布缓冲液(涂布缓冲液＝1个碳酸盐-碳酸氢盐胶囊，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO产品目录#C-3041，溶于100mL水)中稀释至5μg/ml。接下来，用100μl/孔的5μg/ml山羊抗猴IgM(KPL，Gaithersburg，MD，产品目录#071-11-031)涂布96孔板(Costar/Coming)并于37℃孵育一小时。将板用PBST(具有0.05％吐温-20的PBS)冲洗四次并且用200μl/孔的PBSB(溶于PBS的1％BSA；从溶于PBS的10％BSA贮存液稀释；KPL)于37℃封闭一小时。将板用PBST再冲洗四次。将血清样品和标准品用PBSB稀释。用2000ng/ml至15.6ng/ml范围的猴IgM(Alpha DiagnosticInternational，San Antonio，TX，产品目录#2001301)建立标准曲线。之后将100μl/孔的每种样品于37℃孵育一小时。将板用PBST冲洗四次。加入100μl/孔的溶于PBSB的山羊抗猴IgM-HRP轭合物(RDI，Concord，MA，cat#617103007)的1∶10,000稀释液并于37℃孵育一小时。将板用PBST冲洗四次并用100μl/孔的SureBlue TMB底物(KPL，Gaithersburg，MD)于室温显色大约五分钟。使用100μl/孔的TMP终止液(KPL，Gaithersburg，MD)来终止显色反应并且于450nm的波长测量每孔的吸光度。

实施例21.TG32B小鼠中使用不同的给药方案的肽第270号对人类IgG分解代谢的影响

在t＝0小时(T₀)用5mg/kg的人类IgG(MP Biomedicals，Irvine，CA)对成年TG32B小鼠静脉内注射。在t＝24小时用5mg/kg的肽第270号(第一组)；在t＝24和72小时用5mg/kg的肽第270号(第二组)；并在t＝24、48、72、96小时用2.5mg/kg的肽第270号(第三组)对四只小鼠的组进行静脉内注射。在每个时间点用具有15mM醋酸钠(pH 5)的载体PBS使用另外一组小鼠进行对照注射。在所有时间点以及在168小时于注射前采集血液样品。制备血浆并贮存于-20℃直到进行如实施例18中的ELISA。

实施例22.另外的TG32B小鼠实验

在TG32B小鼠中用肽第270号进行另外的实验。使用如实施例18中描述的相同的实验设计，发现使用皮下(SC)和腹膜内(IP)途径施用肽第270号对加速IgG分解代谢的速率有效。发现肽第270号的皮下(SC)和腹膜内(IP)注射之后在24小时开始的五次5mg/kg的日剂量的肽第270号将IgG的半衰期减少至56小时。这些半衰期显著小于表现出80至100小时的IgG半衰期的典型的对照组。此外，与对照组相比，使用肽第270号后168小时，hIgG的浓度被减少56％(SC)和66％(IP)。

也在TG32B小鼠中用实施例18中描述的实验流程测试了肽第230号。静脉内注射人类IgG后二十四小时，5mg/kg的肽第230号的每日静脉内(IV)注射被施用总共五天。与92小时的对照组半衰期相比，hIgG的半衰期减少至39小时。此外，与对照组相比，168小时后hIgG的浓度被减少76％。

还在两个被设计为用来评估与三次肽的每日剂量相比单次肽剂量的作用的实验中检测肽第230号。使用实施例18中描述的实验流程，静脉内注射人类IgG后24小时，用5mg/kg肽第230号的单次静脉内剂量处理一个动物组，而第二个动物组接受5mg/kg肽第230号的三次连续的静脉内每日剂量。120小时后，单次剂量的肽第230号将小鼠中的hIgG浓度减少41％。在接受三次每日剂量的肽第230号的小鼠的组中，120小时后hIgG的浓度减少61％。

实施例23.TG32B小鼠中肽第283号对人类IgG分解代谢的影响

在t＝0小时(T₀)用500mg/kg的人类IgG(MP Biomedicals，Irvine，CA)对成年TG32B小鼠静脉内注射。在24、48、72和96小时，用0.5、1、2.5、5或10mg/kg的肽第283号对小鼠静脉内注射。在每个时间点用15mM醋酸钠(pH 5)进行对照注射并将其作为所有注射的媒介物。在所有时间点、120小时和168小时以及30天时于注射前采集血液样品。制备血浆并贮存于-20℃直到进行ELISA。

实施例24.聚乙二醇化的肽第289号的合成

将肽第285号溶解于10nM pH 7.4的缓冲液中并用一当量的PEG_30kDa-琥珀酰亚胺酯(NOF Corp.(Japan)产品目录第Sunbright MEGC-30TS号)处理18小时。将粗制的反应混合物如实施例7中所述在C4柱(Jupiter，Phenomenex)上纯化、冷冻干燥并用阳离子交换层析(Fractoprep SO₃ ^-，产品目录第1.17972号，EMD Chemicals Inc，Gibbstown，NJ)再次纯化，由此将肽结合至10mM醋酸钠(pH 5)中的树脂上，将树脂用10mM醋酸钠(pH 5)冲洗并且将肽用溶于10mM醋酸钠(pH 5)的100mM氯化钠洗脱。将肽溶液对1％醋酸透析并冷冻干燥。分析纯化的肽，其通过SDS-PAGE在～50kDa处显示肽染色带并且通过HPLC证明没有剩余的游离肽。(图7)

表26.肽第289号，即肽第285号的聚乙二醇化的类似物

实施例25.TG32B小鼠中肽第289号对人类IgG分解代谢的影响

在t＝0小时(T₀)用500mg/kg的人类IgG(MP Biomedicals，Irvine，CA)对成年TG32B小鼠静脉内注射。在24小时，用25mg/kg的肽第289号对小鼠静脉内注射。在24、48、72、96、120和168小时采集血液样品。制备血清并贮存于-20℃直到进行ELISA。如实施例18所述来确定每个时间点血清中人类IgG的浓度。结果示于图8中。

实施例26.食蟹猴中肽第283号对hIgG分解代谢和内源IgG、IgM和白蛋白浓度的影响

将十八只食蟹猴分为每三只动物一组的六组并且在t＝-3天时用5mg/kg生物素化的人类IgG(MP Biomedical)处理。于t＝0时开始，依照下列给药方案用肽第283号处理动物四周：1)1mg/kg，3x/周，静脉内；2)1mg/kg，1x/周，皮下；3)1mg/kg，3x/周，皮下；4)5mg/kg，3x/周，静脉内；5)5mg/kg，1x/周，皮下；6)5mg/kg，3x/周，皮下。注意组4的最后的肽剂量是在第16天。在第-3天、-15分钟、1天、2天、3天、4天、5天、7天、9天、11天、14天、16天、18天、21天、23天、25天、28天、30天、32天、35天、42天、49天、77天采集血清样品。如实施例20中所述来确定生物素化的人类IgG、内源IgG和白蛋白的浓度。

实施例27.使用还原性烃基化的30kDa聚乙二醇化的肽第290号的合成

将肽第285号和1.25当量的直链30kDa PEG-醛(NOF Corp.(Japan)产品目录第Sunbright ME-300-AL号)以10mg/mL的PEG浓度溶解于100mM醋酸钠(pH 5.5)并且于4℃孵育30分钟。加入氰基硼氢化钠以使其终浓度为20mM。将反应于4℃振荡18小时，之后如实施例7中所述将其在反相C4柱(Jupiter，Phenomenex)上纯化以除去游离肽并且冷冻干燥。之后如实施例24中所述将所述物质通过阳离子交换层析进行纯化以除去游离的PEG。如实施例24中的透析后，通过SDS-PAGE分析肽溶液，其显示～50kDa的带，并且通过反相HPLC证明没有剩余的游离肽。参见图9、10和11。

实施例28.使用还原性烃基化的20kDa聚乙二醇化的肽第291号的合成

将肽第285号和1.25当量的直链20kDa PEG-醛(NOF Corp.(日本)产品目录第Sunbright ME-200-AL号)以10mg/mL的PEG浓度溶解于100mM醋酸钠(pH 5.5)并且于4℃孵育30分钟。加入氰基硼氢化钠以使其终浓度为20mM。将反应于4℃振荡18小时，之后如实施例7中所述将其在反相C4柱(Jupiter，Phenomenex)上纯化以除去游离肽并且冷冻干燥。之后将所述物质如实施例24中所述通过阳离子交换层析纯化以除去游离的PEG。将含有100-300mM醋酸钠的合并的洗脱组分通过C18 Sep-Pak(Waters Corp，Milford MA)以除去醋酸盐，之后从1％的醋酸冷冻干燥。通过SDS-PAGE分析所述肽，其显示～35kDa的带，并且通过反相HPLC证明没有剩余的游离肽。参见图9、10和11。

实施例29.使用还原性烃基化的5kDa聚乙二醇化的肽第292号的合成

将肽第285号和1.25当量的直链5kDa PEG-醛(NOF Corp.(日本)产品目录第Sunbright ME-50-AL号)以10mg/mL的PEG浓度溶解于100mM醋酸钠(pH 5.5)并且于4℃孵育30分钟。加入氰基硼氢化钠以使其终浓度为20mM。将反应于4℃振荡18小时，之后如实施例7中所述将其在反相C4柱(Jupiter，Phenomenex)上纯化以除去游离肽并且冷冻干燥。之后将所述物质如实施例24中所述通过阳离子交换层析纯化以除去游离的PEG。将含有100-300mM醋酸钠的合并的洗脱组分通过C18Sep-Pak(Waters Corp，Milford MA)以除去醋酸盐，之后从1％的醋酸冷冻干燥。通过SDS-PAGE分析所述肽，其显示～8kDa的带，并且通过反相HPLC证明没有剩余的游离肽。参见图9、10和11。

实施例30.TG32B小鼠中肽第290号对人类IgG分解代谢的影响

在t＝0小时(T₀)用500mg/kg的人类IgG(MP Biomedicals，Irvine，CA)对成年TG32B小鼠静脉内注射。在24小时，用5mg/kg或25mg/kg的肽第290号对小鼠静脉内注射。在24、48、72、96、120和168小时采集血液样品。制备血浆并贮存于-20℃直到进行ELISA。如实施例18所述来确定每个时间点血清中人类IgG的浓度(图12)。

实施例31.使用还原性烃基化的40kDa聚乙二醇化的肽第293号的合成

将肽第285号和1.25当量的直链40kDa PEG-醛(Dow Pharma，产品目录#008-005)以10mg/mL的PEG浓度溶解于100mM醋酸钠(pH 5.5)并且于4℃孵育30分钟。加入氰基硼氢化钠以使其终浓度为20mM。将反应于4℃振荡18小时，之后透析通过10kDa截留的膜至10mM醋酸钠(pH5)中。之后将所述物质如实施例24中所述通过阳离子交换层析纯化以除去游离的PEG。透析至1％醋酸中后，通过SDS-PAGE分析肽溶液，其显示～65kDa的带(图11)，并且通过反相HPLC(TSK苯基1000A柱)证明没有剩余的游离肽。

实施例32.使用还原性烃基化的10kDa聚乙二醇化的肽第294号的合成

将肽第285号和1.25当量的直链10kDa PEG-醛(NOF Corp，日本，Sunbright ME-100-AL)以10mg/mL的PEG浓度溶解于100mM醋酸钠(pH5.5)并且于4℃孵育30分钟。加入氰基硼氢化钠以使其终浓度为20mM。将反应于4℃振荡18小时，之后如实施例7中所述将其在反相C4柱(Jupiter，Phenomenex)上纯化以除去游离肽并且之后将液体冷冻干燥。如实施例24中所述将所述物质通过阳离子交换层析纯化以除去游离的PEG。将含有100-300mM醋酸钠的合并的洗脱组分通过C18Sep-Pak(Waters Corp，Milford MA)以除去醋酸盐，之后从1％醋酸冷冻干燥。通过SDS-PAGE分析所述肽以确认轭合反应是成功的，并且通过反相HPLC证明终产物中没有剩余的游离肽。

实施例33.20kDa 2-臂聚乙二醇化的肽第295号的合成

将肽第285号和1.25当量的20kDa支链PEG-醛(NOF Corp，(日本)产品目录第Sunbright GL3-200AL020U号)以10mg/mL的PEG浓度溶解于100mM醋酸钠(pH 5.5)，并且于4℃孵育30分钟。加入氰基硼氢化钠以使其终浓度为20mM。将反应于4℃振荡18小时，之后透析通过10k Da截留的膜至10mM醋酸钠(pH 5)中。之后如实施例24中所述将所述物质通过阳离子交换层析纯化以除去游离的PEG。透析至1％醋酸中后，通过SDS-PAGE分析肽溶液，其显示～44kDa的带(图12)，并且通过反相HPLC(TSK苯基1000A柱)证明没有剩余的游离肽。肽第295号的结构示于图13中。

实施例34.40kDa 2-臂聚乙二醇化的肽第296号的合成

将肽第285号和1.25当量的40kDa支链PEG-醛(NOF Corp，(日本)产品目录第Sunbright GL3-400AL2号)以10mg/mL的PEG浓度溶解于100mM醋酸钠(pH 5.5)并且于4℃孵育30分钟。加入氰基硼氢化钠以使其终浓度为20mM。将反应于4℃振荡18小时，之后透析通过10kDa截留的膜至10mM醋酸钠(pH5)中。之后如实施例24中所述将所述物质通过阳离子交换层析纯化以除去游离的PEG。透析至1％醋酸中后，通过SDS-PAGE分析肽溶液，其显示～75kDa的带(图12)，并且通过反相HPLC(TSK苯基1000A柱)证明没有剩余的游离肽。肽第296号的结构示于图14中。

实施例35.TG32B小鼠中肽第290、292、291、296、295和293号对人类IgG分解代谢的影响

在t＝0小时(T₀)用500mg/kg的人类IgG(MP Biomedicals，Irvine，CA)对成年TG32B小鼠静脉内注射。在24小时，用25mg/kg的聚乙二醇化的肽对小鼠静脉内注射。于24、48、72、96、120和168小时采集血液样品。制备血浆并贮存于-20℃直到进行ELISA。如上面实施例18所述来确定每个时间点血清中人类IgG的浓度。结果示于图15中。

实施例36.聚乙二醇化的肽的体外活性

使用如实施例4中所述的IgG竞争ELISA测定来测定各种聚乙二醇化的肽的体外活性。结果示于图16中。

实施例37.具有支链PEG连接的抗FcRn肽的合成

双胺连接体，例如赖氨酸，可与肽第285号的游离胺偶联以产生两个用于聚乙二醇化的可得的胺位点。这种化合物与直链PEG(例如醛-PEG)的反应可获得支链的PEG-肽轭合物，例如图17中所示的轭合物。

实施例38.使用还原性烃基化的30kDa聚乙二醇化的肽第297号的合成

如实施例15中所述合成具有C-端乙胺连接体的肽第297号(参见图18)，例外的是所述肽是在1，2-乙二胺三苯甲基树脂(Novabiochem，产品目录#01-64-0081)上合成的。将肽第297号和0.75当量的直链30kDa PEG-醛(NOF Corp，(日本)产品目录第Sunbright ME-300-AL号)以10mg/mL的PEG浓度溶解于100mM醋酸钠(pH 5.5)并且于4℃孵育30分钟。加入氰基硼氢化钠以使其终浓度为20mM。将反应于4℃振荡18小时，之后透析通过10kDa截留的膜至10mM醋酸钠(pH 5)中。之后如实施例24中所述将所述物质通过阳离子交换层析纯化以除去游离的PEG。透析至1％醋酸中之后，通过反相HPLC(TSK苯基1000A柱)分析肽溶液，其证明没有剩余的游离肽。将含有100-300mM醋酸钠的合并的洗脱组分透析至1％醋酸并冷冻干燥。如实施例4中所述的IgG竞争ELISA测定来评估肽第297号的活性。该测定的结果示于图19中。

实施例39.使用二酸和胺连接体的另外的肽二聚体的合成

如实施例15中所述来合成另外的酰胺连接的肽二聚体(表27)，除了下列：肽第298号是在1，2-乙二胺三苯甲基树脂(Novabiochem，产品目录#01-64-0081)上合成的；肽第299号是在1，4-丁二胺三苯甲基树脂(Novabiochem，产品目录#01-64-0082)上合成的；肽第300号是在邻双(2-氨乙基)乙二醇三苯甲基树脂(Novabiochem产品目录#01-64-0235)上合成的；并且肽第301号是在双-(2-氨乙基)-醚三苯甲基树脂(Novabiochem产品目录#01-64-0141)上合成的。

表27.肽第298、299、300、301号

如实施例18中所述在t＝0h时500mg/kg静脉内剂量的人类IgG，以及之后在t＝24h、48h、72h和96h时2.5mg/kg的肽第299、300和301号的皮下注射之后，TG32B小鼠中人类IgG分解代谢的速率示于图20中。如实施例18由ELISA来确定hIgG的浓度，其被标准化至t＝24h的水平并与媒介物对照组比较。

实施例40.使用还原性烃基化的30kDa聚乙二醇化的肽第307、308和309号的合成

聚乙二醇化的肽第307、308和309号的肽部分分别是肽第304、305和306号。如实施例15中肽第283号一样合成肽第304、305和306号，例外的是在304中用Lys代替了Arg2，在305中用Lys代替了Thr4并且在306中用Lys代替了Pro12。这为每个二聚体肽提供两个Lys残基。进行聚乙二醇化以在每个二聚体肽产生一个PEG部分。

将肽第304、305或306号和2当量的30kDa直链PEG-醛(NOF Corp，(日本)产品目录第Sunbright ME-300-AL号)以10mg/mL的PEG浓度溶解于100mM醋酸钠(pH 5.5)并且于4℃孵育30分钟。加入氰基硼氢化钠以使其终浓度为20mM。将反应于4℃振荡18小时，之后对10mM醋酸钠(pH 5)透析以除去游离肽。之后如实施例24中所述将透析的反应物通过阳离子交换层析纯化以除去游离的PEG。将纯化的物质对1％醋酸透析并冷冻干燥。这些肽的结构示于图19中。之后如实施例4和18中所述来检测这些肽的体外和体内活性(图16)。

实施例41：30kDa聚乙二醇化的肽303的合成

如上文所述在树脂上合成肽第302号，例外的是在二聚化反应中使用Fmoc-Asp(OH)-OH而非使用Boc-Asp(OH)-OH。在树脂上的肽与Fmoc-Asp(OH)-OH反应以生成树脂上的二聚体之后，将树脂用20％哌啶/DMF处理(2×10min)，用DMF冲洗并且用溶于DMF的4当量的双Boc-氨氧乙酸、4当量的PyBOP和8当量的DIEA处理并混合1小时。将肽从树脂上切下并如实施例15中所述将其氧化以产生肽第302号。

肽第302号

将肽第302号用溶于含有0.1％(体积/体积)TFA的水的1.1当量的30kDa PEG-醛(NOF Corp.，日本，产品目录#Sunbright ME-300-AL)处理。将反应混合物孵育30分钟并如实施例24一样纯化以产生肽第303号。如实施例4和18中所述检测此肽的体外和体内活性并且将结果提供于图16中。

肽第303号

按照本说明书中所引用的文献的教导来最彻底地理解本说明书。本说明书中的实施方案提供本发明的实施方案的示例性说明并且不应被理解为限制本发明的范围。技术人员容易认可本发明包括许多其他的实施方案。此公开内容中引用的所有出版物和专利通过引用全文并入。如果通过引用所并入的材料与本说明书矛盾或不一致，本说明书将撤换任何这种材料。本文任何文献的引用都并非承认这些文献是本发明的现有技术。

除非以其他方式说明，本说明书包括权利要求中使用的表示成分的量、反应条件等等的所有数字将被理解为在所有情况下都由术语“约”来修饰。因此，除非以其他方式相反地说明，数字参数是近似值并且可根据本发明所寻求获得的期望特性而变化。至少，并且在不尝试限制等同于权利要求的范围的原则的应用的情况下，每个数字参数应按照有效数位的数字和通常的舍入方式来理解。

除非以其他方式说明，在一系列元素之前的术语“至少”将被理解为是指该系列中的每一个元素。本领域技术人员将认可或仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的特定实施方案的许多等价的实施方案。这些等价的实施方案旨在被下列权利要求所包括。

Claims

1.一种肽，其具有序列：

其中：

-B，如果存在，含有亲水性聚合物或者是氨基基团、羟基基团或羧基保护基团；

-X₀，如果存在，是任选地衍生的氨基酸或其类似物或者是含2-15个氨基酸的任选地衍生的肽或其类似物；

-X₁，如果存在，是任选地衍生的氨基酸或其类似物；

-X₂，如果存在，是氨基酸或其类似物；

-X₄是任选地衍生的氨基酸或其类似物或者是含2或4个氨基酸的任选地衍生的肽或其类似物；

-X₆是碱性氨基酸或其类似物、芳香族氨基酸或其类似物或者碱性芳香族氨基酸或其类似物；

-X₇是苯丙氨酸或其类似物；

-X₈，当与X₉合在一起时，形成二肽类似物；

-X₁₀是氨基酸或其类似物，或者

-X₁₀，当与X₉合在一起时，形成二肽类似物；

-X₁₁是酪氨酸或其类似物；

-X₁₂是任选地衍生的氨基酸或其类似物；

-X₁₃，如果存在，是氨基酸或其类似物；

-X₁₄，如果存在，是任选地衍生的氨基酸或其类似物或者是含2-15个氨基酸的任选地衍生的肽或其类似物；

-Y含有亲水性聚合物；

-Z是连接体，其连接每一个肽单体，通过

-A；

-B；

-m是选自1、2和3的整数；并且

-n是选自1、2和3的整数；

其中：

-肽的每个单体长度上在10至50个氨基酸的范围内。

2.如权利要求1所述的肽，其具有序列：

其中：

-X₁是未衍生的氨基酸或其类似物；

-X₄是未衍生的氨基酸或其类似物或者含2或4个氨基酸的未衍生的肽或其类似物；以及

-X₁₂是未衍生的氨基酸或其类似物。

3.如权利要求1所述的肽，其中所述肽是未桥连的。

4.如权利要求1所述的肽，其中X₃与X₁₃形成桥连。

5.如权利要求4所述的肽，其中所述桥连是侧链与侧链的桥连。

6.如权利要求1所述的肽，其中X₆是组氨酸或其类似物。

7.如权利要求1所述的肽，其中X₈和X₉中至少一个选自：

-甘氨酸；

-D-氨基酸；

-α-氨基异丁酸；以及

-肌氨酸。

8.如权利要求1所述的肽，其中X₁₄不存在。

9.如权利要求1所述的肽，其中所述肽是式II、III和IV中任一个的肽并且n是1。

10.如权利要求1所述的肽，其中所述肽是式II、III和IV中任一个的肽并且n是2。

11.如权利要求1所述的肽，其中所述肽具有序列：

12.如权利要求11所述的肽，其中所述肽具有序列：

其中水平方括弧指示桥连的存在。

13.如权利要求1所述的肽，其中所述亲水性聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、葡聚糖、纤维素、甲基纤维素、羟基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟基烃基淀粉、聚乙烯醇、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、泊洛沙姆和聚乙二醇共聚物。

14.如权利要求13所述的肽，其中所述亲水性聚合物是聚乙二醇(PEG)。

15.如权利要求14所述的肽，其中所述PEG是直链PEG。

16.如权利要求14所述的肽，其中所述PEG是支链PEG。

17.如权利要求14所述的肽，其中所述PEG具有10-60kDa范围内的平均分子量。

18.如权利要求1所述的肽，其中所述肽与人类FcRn特异性结合。

19.如权利要求18所述的肽，其中所述肽对人类FcRn的亲和力在50fM至1mM的范围内。

20.如权利要求18所述的肽，其中所述肽抑制人类FcRn与人类IgG的结合并且具有50fM至1mM的范围内的IC₅₀。

21.如权利要求1所述的肽，其中所述肽具有序列：

22.如权利要求21所述的肽，其中所述肽具有序列：

其中水平方括弧指示桥连的存在。

23.如权利要求22所述的肽，其中所述肽具有序列：

24.一种轭合物，其含有如权利要求1至23中任一项所述的肽和第二分子。

25.一种药物组合物，其含有治疗有效量的如权利要求1至23中任一项所述的肽或治疗有效量的如权利要求46所述的轭合物。

26.一种用于治疗由不适当地表达的IgG抗体或过量的IgG所表征的疾病的方法，其包括向对其有需要的患者施用如权利要求47所述的组合物。

27.一种检测FcRn的方法，其包括：

用可检测的标记物标记如权利要求1至23中任一项所述的肽或如权利要求24所述的轭合物，所述可检测的标记物选自放射性同位素、具有可检测的产物的酶、荧光团、化学发光化合物、磁性颗粒、微球体、纳米球、生物素、链霉亲和素和地高辛。

28.一种纯化FcRn的方法，其包括：

(a)将如权利要求1至23中任一项所述的肽或如权利要求24所述的轭合物固定至固相支持体，

(c)通过将所述溶液与所述固相支持体分离来纯化FcRn。