ES2348263T3

ES2348263T3 - Anticuerpo monoclonal humano especifico para lipopolisacaridos (lps) de serotipo iats 011 de pseudomonas aeruginosa.

Info

Publication number: ES2348263T3
Application number: ES06706900T
Authority: ES
Inventors: Adrian Zuercher; Michael P. Horn; Alois B. Lang; Martin A. Imboden
Original assignee: Kenta Biotech AG
Current assignee: Kenta Biotech AG
Priority date: 2005-02-14
Filing date: 2006-02-13
Publication date: 2010-12-02
Anticipated expiration: 2026-02-13
Also published as: EP1848741A1; US20090068191A1; KR20130018991A; CA2597701C; JP2008530988A; IL184774A0; US8197816B2; CN101120018A; ATE480563T1; CN101120018B; CA2597701A1; JP4944799B2; KR20070107756A; IL184774A; DE602006016736D1; WO2006084758A1; EP1848741B1; EP1690875A1

Abstract

Anticuerpo monoclonal humano específico para el lipopolisacárido (LPS) del serotipo IATS 011 de P. aeruginosa que comprende una cadena ligera y una cadena pesada en donde la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, o una muteína de dicho anticuerpo capaz de unirse a dicho LPS, en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:8.

Description

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal 5 humano específico para el serotipo IATS O11 de P. aeruginosa, un hibridoma que lo produce, ácidos nucleicos que lo codifican y células huésped transfectadas con los mismos. Además, la presente invención se refiere a métodos para producir dicho anticuerpo monoclonal. Además, la presente invención se refiere 10 a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo o al menos un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo.

P. aeruginosa es una bacteria medioambiental ubicua Gram negativa que se encuentra en el agua dulce y la tierra. Es un 15 patógeno oportunista clásico que normalmente no representa una amenaza al huésped inmunocompetente, que lo elimina por medio de anticuerpos opsonizantes y fagocitosis. Sin embargo, los pacientes de fibrosis quística e individuos inmunodeprimidos – incluyendo víctimas de quemaduras, pacientes entubados en las 20 UCI, pacientes de cáncer y SIDA, así como pacientes sometidos a trasplante de órganos- tienen particularmente alto riesgo de contraer infecciones nocosomiales. Junto con S. aureus resistente a meticilina (SARM) y enterococos resistentes a vancomicina (ERV), P. aeruginosa es responsable de hasta el 34% 25 de todas las infecciones nocosomiales que han aumentado desde 7,2/1000 pacientes día en 1975 hasta 9,8/1000 pacientes día en 1995. Entre las formas de infección nocosomial observadas con mayor frecuencia están la bacteriemia y la neumonía.

Para la prevención de infecciones crónicas por P. 30 aeruginosa en pacientes de fibrosis quística, se ha establecido una vacuna octavalente conjugada que consiste en los 8 serotipos de LPS más relevantes de P. aeruginosa acoplados a toxina A detoxificada de P. aeruginosa para la inmunización activa. Los estudios a largo plazo con esta vacuna han mostrado que la 35 proporción de pacientes infectados de forma crónica cayó desde

alrededor del 72% hasta el 32% a la edad de 18 años. Sin embargo, la vacunación activa solo es posible en pacientes inmunocompetentes, así como en situaciones previsibles. De esta manera, la mayoría de las víctimas de P. aeruginosa no se pueden inmunizar activamente con la vacuna octavalente. Debido a esto y 5 debido al hecho de que la mayoría de las cepas de P. aeruginosa son multirresistentes, existe una necesidad para una herramienta terapéutica alternativa para tratar a los pacientes infectados con P. aeruginosa. Un intento es crear anticuerpos monoclonales humanos basados en la tecnología clásica de hibridomas o usando 10 clonación de repertorio por presentación en fagos.

Ambos métodos y los anticuerpos creados mediante los mismos muestran serios inconvenientes.

La tecnología clásica del hibridoma (el planteamiento de “Kohler y Milstein”) se basa en la inducción de células B 15 murinas de la especificidad deseada mediante inmunización activa con un antígeno de elección e inmortalización mediante fusión con un compañero de mieloma. Después de ello, la información genética de un clon productor de anticuerpo necesita humanizarse mediante ingeniería genética y producir el anticuerpo en un 20 sistema de expresión adecuado. Asimismo, la clonación de un repertorio de presentación en fago requiere una manipulación genética sofisticada del anticuerpo y el establecimiento de un sistema de expresión adecuado.

Se sabe que los anticuerpos monoclonales murinos dirigidos 25 contra LPS bacteriano reconocen epítopos diferentes que los anticuerpo humanos. Por lo tanto, la generación de anticuerpos monoclonales en ratones seguida por humanización no produciría necesariamente el aislamiento de anticuerpos con la especificidad de interés para su uso en seres humanos. 30

Además, los anticuerpos de isotipo IgM son los más eficaces debido a los mecanismos efectores ligados a IgM que son óptimos para la inmunidad antibacteriana. Sin embargo, hasta la fecha no se ha alcanzado la expresión recombinante de anticuerpos IgM debido a la forma pentamérica compleja de esta molécula. Por 35 consiguiente, la expresión de anticuerpos aislados mediante la

tecnología de presentación en fago está limitada a isotipos diferentes de IgM.

De forma alternativa, han existido diferentes intentos de generar anticuerpos monoclonales humanos contra grupos de LPS de P. aeruginosa. Sin embargo, bien los métodos usados para 5 producir dichos anticuerpos tenían desventajas (debido a la inestabilidad de las células linfoblastoides) o bien los anticuerpos mostraron un patrón de glicosilación no humano o se requerían cantidades muy grandes del anticuerpo. Además, muchos de los anticuerpos descritos en la técnica anterior carecen de 10 funciones efectoras y por tanto no eran protectores.

Según esto, un problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal humano específico para LPS de un serotipo particular de P. aeruginosa en donde el anticuerpo muestra gran capacidad de protección, en 15 particular in vivo.

El problema técnico se resuelve mediante los anticuerpos monoclonales humanos como se definen a continuación.

Según la presente divulgación, se proporciona un anticuerpo monoclonal humano denominado 1BO11, específico para LPS del 20 serotipo IATS O11 de P. aeruginosa en donde la región variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende al menos una de SEQ ID NO:1 en la región CDR1, SEQ ID NO:2 en la región CDR2 y SEQ ID NO:3 en la región CDR3, y en donde la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende al menos una de SEQ ID 25 NO:4 en la región CDR1, SEQ ID NO:5 en la región CDR2 y SEQ ID NO:6 en la región CDR3; o un fragmento o derivado del mismo capaz de unirse a dicho LPS.

La presente invención proporciona además un hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal y los ácidos nucleicos que 30 codifican la cadena ligera y pesada del anticuerpo, respectivamente. Además, la presente invención proporciona vectores y células huésped, que comprenden el ácido nucleico. Además, se proporcionan métodos para producir los anticuerpos monoclonales. Además, se proporcionan composiciones 35

farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo y/o al menos un ácido nucleico, y segundos usos médicos de las mismas.

Sorprendentemente, se ha determinado que los anticuerpos monoclonales humanos según la invención muestran gran capacidad de protección. En particular, se demostró que el anticuerpo 5 monoclonal humano era opsonofagocítico in vitro. Incluso más importante, los anticuerpos monoclonales según la presente invención muestran capacidad de protección in vivo determinada por la protección a bacteriemia en el modelo murino de quemaduras así como protección de infección en el aparato 10 respiratorio en un modelo de infección pulmonar aguda en ratones como se muestra en los ejemplos.

Con los anticuerpos monoclonales humanos según la invención, se alcanza la opsonofagocitosis a dosis mucho más bajas así como una mayor protección comparada con los 15 anticuerpos monoclonales humanos descritos por Collins y col. (Collins MS et al., 1990. FEMSIM 64:263-268).

En contraste con los anticuerpos monoclonales descritos en el estado de la técnica (Harrison FJJ et al. 1997. Hybridoma 16(5):413-420; Zweerink HJ et al. 1988. Infection and Immunity 20 56(8):1873-1879), los anticuerpos monoclonales humanos según la invención se generan además a partir de sangre de individuos sanos activamente inmunizados con una vacuna conjugada. En general se sabe que los anticuerpos contra polisacáridos son de menor calidad (es decir, baja afinidad con poco potencial 25 efector) debido a la falta de ayuda de células T. Sólo mediante el uso de una vacuna conjugada se pueden generar anticuerpos valiosos que tengan gran afinidad con gran potencial efector contra dianas polisacáridos. Además, la tasa de producción de anticuerpos monoclonales humanos según la invención es mayor 30 comparada con la tasa de producción de anticuerpos monoclonales descritos en el estado de la técnica (Zweerink HJ et al. 1988. Infection and Immunity 56(8):1873-1879).

En el estado de la técnica no se ha descrito ningún anticuerpo monoclonal humano que muestre protección para 35 infección pulmonar producida por P. aeruginosa.

Según la presente invención el anticuerpo es específico para el LPS del serotipo IATS O11 de P. aeruginosa y muestra actividad opsonofagocítica a concentraciones tan bajas como 0,1 ng/ml determinadas usando bacterias conjugadas a fluorescencia. No se ha descrito ningún anticuerpo en la técnica anterior que 5 muestre actividad opsonofagocítica a esta dosis baja.

El anticuerpo monoclonal según la presente invención reconoce aislados clínicos con gran especificidad. Se identificaron 18 de 20 muestras de pacientes infectados con P. aeruginosa del serotipo IATS O11 usando este anticuerpo. Sin 10 estar unidos a ninguna teoría, se asume que el anticuerpo monoclonal es capaz de reconocer todas las cepas de P. aeruginosa del serotipo IATS O11 conocidas en la técnica anterior. Esta propiedad hace el anticuerpo particularmente útil para diagnóstico y terapia. De esta manera, el anticuerpo según 15 la presente invención muestra una fiabilidad insuperable.

El término “anticuerpo monoclonal humano” como se usa aquí abarca cualquier anticuerpo monoclonal parcial o totalmente humano independiente de la fuente de la que se obtiene el anticuerpo monoclonal. Se prefiere la producción del anticuerpo 20 monoclonal humano por un hibridoma. También se puede obtener el anticuerpo monoclonal mediante ingeniería genética y en particular por injerto de CDR de los segmentos CDR como se define en las reivindicaciones en anticuerpos monoclonales disponibles cambiando las regiones CDR del anticuerpo base con 25 los segmentos CDR específicos como se define en las reivindicaciones.

El término “región CDR” significa la región determinante de complementariedad de un anticuerpo, es decir, la región que determina la especificidad de un anticuerpo por un antígeno 30 particular. Tres regiones CDR (CDR1 a CDR3) tanto en la cadena ligera como pesada son responsables de la unión al antígeno.

Las posiciones de las regiones CDR en la cadena pesada son como sigue:

Región CDR1, aminoácidos 31 a 35 en el exón VH, 35

Región CDR2, aminoácidos 50 a 65 en el exón VH,

Región CDR3, aminoácidos 95 y aminoácidos siguientes en el exón VH.

Las posiciones de las regiones CDR son independientes de la clase de anticuerpo, es decir, IgM, IgA o IgG.

Las posiciones de las regiones CDR en la cadena ligera 5 kappa son como sigue:

Región CDR1, aminoácidos 24 a 34 en el exón Vχ,

Región CDR2, aminoácidos 50 a 56 en el exón Vχ,

Región CDR3, aminoácidos 89 y aminoácidos siguientes en el exón Vχ. 10

Las posiciones de la región CDR en la cadena ligera lambda son como sigue:

Región CDR1, aminoácidos 24 a 34 en el exón Vλ,

Región CDR2, aminoácidos 50 a 56 en el exón Vλ,

Región CDR3, aminoácidos 89 y aminoácidos siguientes en el exón 15 Vλ.

Los alineamientos de aminoácidos en los exones VH, Vχ y Vλ se pueden obtener del índice Vbase (http:www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php?menu=901).

El término “serotipo” significa cualquier serotipo conocido 20 de P. aeruginosa. Se muestra una tabla de concordancia de las diferentes nomenclaturas actualmente usadas para los diferentes serotipos de P. aeruginosa en la tabla I de la especificación.

El término “fragmento” significa cualquier fragmento del anticuerpo capaz de unirse al serotipo de LPS. El fragmento 25 tiene una longitud de al menos 10, preferiblemente 20, más preferiblemente 50 aminoácidos. Se prefiere que el fragmento comprenda la región de unión del anticuerpo. Se prefiere que el fragmento sea un fragmento Fab o F(ab’)2 o una mezcla de los mismos. 30

El término “derivado” abarca cualquier muteína del anticuerpo monoclonal humano que se diferencia por la adición, deleción y/o sustitución de al menos un aminoácido. Preferiblemente, el derivado es una muteína del anticuerpo monoclonal humano en donde la muteína lleva al menos una 35 sustitución conservada en cualquiera de las CDR en la cadena

pesada y/o la cadena ligera como se indica en las reivindicaciones. Más preferiblemente, la muteína no tiene más de 5, particularmente preferido no más de 2 sustituciones conservadas. La capacidad del fragmento o derivado del anticuerpo de unirse al serotipo particular de LPS se determina 5 mediante ELISA directo como se describe en la sección de materiales y métodos: el LPS particular se inmoviliza en la fase sólida de placas de ELISA. Los fragmentos de anticuerpo o derivados de anticuerpo se incuban con el LPS inmovilizado, y los anticuerpos o derivados de los mismos unidos se visualizan 10 mediante un anticuerpo secundario adecuado conjugado a una enzima.

Según la presente invención, el término “sustitución conservada” significa un cambio de un aminoácido que pertenece a un grupo físico-químico particular por un aminoácido que 15 pertenece al mismo grupo físico-químico. Los grupos físico-químicos se definen como sigue:

El grupo de los aminoácidos no polares comprende: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina y triptófano. El grupo de los aminoácidos que 20 tienen cadenas laterales polares sin carga comprende asparagina, glutamina, tirosina, cisteína y cistina. El grupo físico-químico de los aminoácidos que tienen una cadena lateral polar cargada positivamente comprende lisina, arginina e histidina. El grupo físico-químico de aminoácidos que tienen una cadena lateral 25 polar cargada negativamente comprende ácido aspártico y ácido glutámico, también denominados aspartato y glutamato.

Según la presente invención, se proporciona un anticuerpo específico para LPS del serotipo IATS O11 de P. aeruginosa como se ha explicado anteriormente. 30

Según una forma de realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano específico para LPS o el LPS del serotipo IATS O11 de P. aeruginosa, en donde la región variable de la cadena ligera del anticuerpo tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la región 35 variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos

de SEQ ID NO:8. También se divulgan aquí variantes de dicho anticuerpo capaces de unirse a dicho LPS en donde la región variable de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo es al menos el 85% homóloga a SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena 5 pesada del anticuerpo es al menos el 85% homóloga a SEQ ID NO:8.

El término “homología” que conoce el experto en la materia designa el grado de relación entre dos o más moléculas de polipéptidos, que se determina mediante la conformidad entre las secuencias. El porcentaje de “homología” se determina a partir 10 del porcentaje de regiones homólogas en dos o más secuencias, teniendo en cuenta las brechas u otras características de secuencia.

La homología de polipéptidos mutuamente relacionados se puede determinar por medio de procedimientos conocidos. Como 15 regla, se usan programas especiales de ordenador con algoritmos que consideran los requerimientos especiales. Los procedimientos preferidos para la determinación de la homología en primer lugar generan la mayor conformidad entre las secuencias estudiadas. Los programas informáticos para la determinación de la homología 20 entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados al paquete de programas de CGC, incluyendo GAP (Devereux J et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison (WI); BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul S et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)). 25 El programa BLAST X se puede obtener del Centro Nacional para Información en Biotecnología (NCBI) y de otras fuentes (BLAST Handbook, Altschul S et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul S et al., J. Mol. 215: 403-410 (1990)). También se puede usar el muy conocido algoritmo de Smith Waterman para la 30 determinación de homología.

Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (1970), 443-453

Matriz de comparación: BLOSUM62 de Henikoff & Henikoff, PNAS USA 35 89 (1992), 10915-10919

Penalización por brecha: 12

Penalización por longitud de brecha: 2

El programa GAP también es adecuado para su uso con los parámetros anteriores. Los parámetros anteriores son los parámetros estándar (parámetros por defecto) para comparaciones 5 de secuencias de aminoácidos, en los que las brechas en los extremos no disminuyen el valor de homología. Con secuencias muy pequeñas comparadas a la secuencia de referencia, puede ser necesario además aumentar el valor de expectativa hasta 100.000 y en algunos casos reducir la longitud de palabra (tamaño de 10 palabra) hasta 2.

Se pueden usar algoritmos modelo, penalizaciones por brecha abierta, penalizaciones por extensión de brecha y matrices de comparación adicionales incluyendo aquellos nombrados en Program Handbook, Wisconsin Package, Versión 9, Septiembre 1997. La 15 elección dependerá de la comparación a realizar y además de si la comparación se realiza entre pares de secuencias, donde se prefieren GAP o Best Fit, o entre una secuencia y una gran base de datos de secuencias, donde se prefieren FASTA o BLAST.

Una conformidad del 85% determinada con los algoritmos 20 anteriormente mencionados se describe como una homología del 85%. Lo mismo se aplica para grados de homología mayores.

En formas de realización preferidas, las muteínas tienen una homología del 85% o más, por ejemplo más del 90% o 95%.

Se prefiere además que la cadena ligera del anticuerpo 25 monoclonal humano según la presente invención sea de tipo kappa o lambda. Particularmente preferido, la cadena ligera es de tipo kappa. La cadena ligera puede ser bien una cadena natural incluyendo una cadena ligera reorganizada de forma natural, genéticamente modificada o de tipo sintético. Si el anticuerpo 30 según la presente invención que es específico para IATS O11 es de tipo kappa, entonces se prefiere que la cadena ligera derive de la línea germinal DPK18 (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php?menu=901#VKEX).

Según una forma de realización preferida adicional, la 35 cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano de la presente

invención se selecciona de todos los isotipos humanos, es decir, IgM, IgA o IgG. Preferiblemente, la cadena pesada es del tipo IgM. Si el anticuerpo es del tipo IgM, entonces muestra las propiedades ventajosas de gran avidez por LPS de P. aeruginosa, une de forma eficaz el complemento y de esta manera media la 5 muerte directa de las bacterias y/o opsoniza eficazmente bacterias para fagocitosis. Además, IgM es resistente a la degradación proteolítica por elastasa de P. aeruginosa, mientras que otros isotipos como IgG o IgA se pueden degradar. Los anticuerpos IgM son eficaces en cantidades bajas. De 1 a 4 μg 10 por ratón fueron completamente protectores en el modelo murino de septicemia por quemadura.

Se prefiere que la cadena pesada variable derive de la línea germinal DP-53 (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php?menu=901#VKEX). La cadena ligera y 15 la cadena pesada pueden estar unidas covalentemente como un anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv bivalente, scFv bifuncional y scFv biespecífico) o unidas de forma no covalente entre sí.

Según una forma de realización preferida de la presente 20 invención, el anticuerpo monoclonal humano consiste completamente en secuencia de aminoácidos humana.

“Consiste completamente en secuencia de aminoácidos humana” significa que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal humano deriva de una línea germinal humana. Esto se 25 puede obtener de diferentes modos. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humano que consiste en secuencias humanas de aminoácidos se puede obtener de un hibridoma en donde la célula B es una célula B humana. De forma alternativa, el anticuerpo monoclonal humano se puede obtener mediante injerto de CDR de 30 las regiones CDR como se indica en las reivindicaciones en anticuerpos monoclonales humanos disponibles que producen de esta manera un anticuerpo monoclonal humano específico para un serotipo de LPS de P. aeruginosa según la presente invención.

La secuencia de aminoácidos completamente humana del 35 anticuerpo monoclonal humano previene la aparición de efectos

secundarios no deseados como reacciones de rechazo o choque anafiláctico.

Adicionalmente preferido, el anticuerpo monoclonal humano muestra esencialmente reconocimiento antigénico humano. “Esencialmente reconocimiento antigénico humano” significa que 5 el reconocimiento antigénico por el anticuerpo monoclonal humano según la presente invención es esencialmente idéntico al reconocimiento de antígeno por un individuo humano sano. En particular, se requiere que las partes Fc de la cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal humano sean de tipo humano para 10 asegurar la interacción con el sistema inmune humano y para reducir el riesgo de generación de los denominados HAMA (anticuerpos humanos anti-ratón).

Según una forma de realización preferida adicional, el anticuerpo monoclonal humano de la presente invención se puede 15 obtener a partir de una célula B humana o un hibridoma obtenido mediante fusión de dicha célula B humana con una célula de mieloma o heteromieloma.

Las células B humanas se pueden obtener mediante inmunización de individuos sanos o pacientes y posterior 20 recogida de muestras de sangre de las que se pueden aislar células B de una manera conocida (Current Protocols in Immunology. Capítulo 7.1. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Publicado por Wiley & sons, Eds: JC Coligan et al.). La célula B humana se puede 25 fusionar con un mieloma o heteromieloma para producir un hibridoma según técnicas conocidas según el planteamiento clásico de Kohler y Milstein. Las células de mieloma adecuadas son derivados de P3X63 tales como P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) o SP2/0 (ATCC CRL-1646). Las células de heteromieloma adecuadas 30 son por ejemplo, F3B6 (ATCC HB-8785). El hibridoma resultante se puede seleccionar según procedimientos conocidos. Los hibridomas se cultivan en un medio de cultivo adecuado y el anticuerpo producido se recupera del sobrenadante.

Además, la presente invención proporciona ácidos nucleicos 35 que codifican la cadena pesada y la cadena ligera,

respectivamente, del anticuerpo monoclonal humano de la presente invención. El ácido nucleico puede ser un ácido nucleico natural derivado de la línea germinal o de la reorganización que se produce en células B, de forma alternativa los ácidos nucleicos pueden ser sintéticos. Los ácidos nucleicos sintéticos también 5 incluyen ácidos nucleicos que tienen modificados los enlaces internucleosídicos incluyendo fosfotioéster para aumentar la resistencia de los ácidos nucleicos a la degradación. El ácido nucleico puede estar manipulado genéticamente o producido sintéticamente por completo mediante síntesis de nucleótidos. 10

La presente invención proporciona además vectores que comprenden al menos un ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano de la presente invención y/o al menos un ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano de la presente invención. Los 15 ácidos nucleicos pueden estar presentes en el mismo vector o pueden estar presentes en forma de vectores binarios. El vector preferiblemente comprende el promotor operativamente unido al ácido nucleico para facilitar la expresión del ácido nucleico que codifica la cadena ligera y/o pesada. Preferiblemente, el 20 vector también incluye un origen para la replicación y mantenimiento en una célula huésped. El vector también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal localizada en 5’ del ácido nucleico que codifica la cadena ligera o la cadena pesada. La secuencia señal puede 25 facilitar la secreción al medio de la cadena codificada.

Preferiblemente, el vector deriva de adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, virus SV40, retrovirus, virus de plantas o bacteriófagos tales como derivados de lambda o M13. El vector particularmente preferido es un vector que contiene las regiones 30 constantes de las cadenas pesadas de las Ig humanas y cadenas ligeras humanas, tal como el sistema de vector integrado para expresión eucariota de inmunoglobulinas descrito por Persic y col. (Persic et al. 1997. Gene. 187(1): 9-18).

El vector puede comprender además una secuencia de 35 nucleótidos que codifica una etiqueta His que produce la

expresión de una construcción para producir un producto de fusión con una etiqueta His en el extremo N-terminal de la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo monoclonal humano que facilita la purificación de la proteína en una columna de níquel mediante formación de quelatos. 5

Además, la presente invención proporciona células huésped que comprenden el vector y/o el ácido nucleico adecuadas para la expresión del vector. En la técnica se conocen numerosos sistemas de expresión procariotas y eucariotas en donde se prefieren células huésped eucariotas tales como células de 10 levadura, células de insecto, células vegetales y células de mamífero tales como células HEK293, células PerC6, células CHO, células COS o células HELA y derivados de las mismas. Particularmente preferidas son líneas celulares de producción humana. Se prefiere que las células huésped transfectadas 15 secreten el anticuerpo producido al medio de cultivo. Si se alcanza expresión intracelular, se realiza la renaturalización según procedimientos estándar tales como por ejemplo, Benetti PH et al., Protein Expr Purif Agosto; 13:283-290, (1998).

La presente invención también proporciona métodos para 20 producir el anticuerpo monoclonal humano. En una forma de realización, el anticuerpo monoclonal humano se produce cultivando el hibridoma descrito anteriormente. El anticuerpo monoclonal producido se secreta al sobrenadante y se puede purificar a partir del mismo aplicando técnicas cromatográficas 25 convencionales.

De forma alternativa, el anticuerpo monoclonal humano es producido por la célula huésped que comprende un vector según la presente invención y cultivando la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión recombinante de la cadena de 30 anticuerpo codificada. Preferiblemente, la célula huésped comprende al menos un ácido nucleico que codifica la cadena ligera y al menos un ácido nucleico que codifica la cadena pesada y es capaz de ensamblar el anticuerpo monoclonal humano de modo que se genera una estructura tridimensional que es 35 equivalente a la estructura tridimensional de un anticuerpo

monoclonal humano producido por una célula B humana. Si la cadena ligera se produce por separado de la cadena pesada, entonces ambas cadenas se pueden purificar y posteriormente ensamblar para producir un anticuerpo monoclonal humano que tiene esencialmente la estructura tridimensional de un 5 anticuerpo monoclonal humano producido por una célula B humana.

El anticuerpo monoclonal humano también se puede obtener mediante expresión recombinante de la cadena ligera y/o pesada codificada, en donde el ácido nucleico se produce mediante el aislamiento de un ácido nucleico que codifica un anticuerpo 10 monoclonal humano de una manera conocida y el injerto de la secuencia de ácido nucleico que codifica las CDR como se define en las reivindicaciones en el ácido nucleico aislado.

Según una forma de realización preferida adicional, el anticuerpo monoclonal humano según la presente invención está 15 modificado. Las modificaciones incluyen di-, oligo- o polimerización de la forma monomérica, por ejemplo mediante entrecruzamiento usando diciclohexilcarbodiimida. Los di-, oligo- o polímeros producidos de esta manera se pueden separar entre ellos mediante filtración en gel. Las modificaciones 20 adicionales incluyen modificaciones de la cadena lateral, por ejemplo modificaciones de los residuos de ε-amino-lisina o modificaciones de los extremos amino y carboxi, respectivamente. Las modificaciones adicionales incluyen modificaciones postraduccionales, por ejemplo, glicosilación y/o 25 desglicosilación parcial o total de la proteína y formación de puentes disulfuro. El anticuerpo también se puede conjugar a un marcador, tal como un marcador enzimático, fluorescente o radioactivo.

La presente invención proporciona además composiciones 30 farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo monoclonal humano y/o al menos un ácido nucleico que codifica una cadena ligera y/o pesada del anticuerpo monoclonal humano.

La composición farmacéutica puede comprender además ingredientes farmacéuticamente aceptables conocidos en la 35 técnica.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se aplican para el tratamiento de enfermedades producidas por P. aeruginosa en infecciones tales como bacteriemia, neumonía, bronquitis crónica, infecciones locales incluyendo infecciones de heridas e infecciones invasivas de articulaciones, principalmente en 5 pacientes inmunodeprimidos y/o en pacientes con función respiratoria deteriorada. Las composiciones farmacéuticas están pensadas además para, pero no limitadas a, la profilaxis y/o tratamiento de infecciones intrahospitalarias (nocosomiales). Puesto que las víctimas principales de infecciones por P. 10 aeruginosa son pacientes de fibrosis quística, víctimas de quemaduras, pacientes entubados, pacientes en unidades quirúrgicas y/o de cuidados intensivos, pacientes de cáncer y SIDA, pacientes inmunodeprimidos, pacientes inmunosuprimidos, pacientes diabéticos, así como adictos a drogas intravenosas, 15 las composiciones farmacéuticas están pensadas en particular para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades causadas por P. aeruginosa en dicho grupo de pacientes.

La composición farmacéutica puede comprender además fármacos antibióticos, preferiblemente acoplados al nuevo 20 anticuerpo monoclonal.

Las composiciones farmacéuticas comprenden el nuevo anticuerpo monoclonal en un intervalo de concentración de 0,1-30 mg/kg de peso corporal.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de 25 cualquier forma conocida tales como administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, tópica, intranasal o como un nebulizador de inhalación.

La presente invención también proporciona un kit de prueba para el diagnóstico de infecciones por P. aeruginosa que 30 comprende al menos un anticuerpo monoclonal humano de la presente invención y opcionalmente ingredientes adecuados adicionales para llevar a cabo una prueba de diagnóstico.

El kit de prueba es adecuado para el diagnóstico fiable específico de una infección por P. aeruginosa. Un ensayo de 35 prueba se puede basar en una prueba ELISA convencional en forma

líquida o unida a membrana. La detección puede ser directa o indirecta como se conoce en la técnica en donde el anticuerpo se conjuga opcionalmente a un marcador enzimático, fluorescente o radiactivo.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no se 5 pretende que limiten el ámbito de la presente invención. Formas de realización adicionales serán evidentes para el experto en la materia al estudiar la especificación y teniendo en cuenta el conocimiento general normal.

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BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 se refiere a la secuencia de ADN y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 1BO11.

La figura 2 se refiere a la secuencia de ADN y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera kappa de 1BO11. 15

La figura 3a se refiere al patrón de reconocimiento de aislados clínicos de P. aeruginosa del serotipo IATS O11 por el anticuerpo monoclonal 1BO11. La figura 3b se refiere al patrón de reconocimiento de aislados clínicos de P. aeruginosa de otros serotipos por anticuerpo monoclonal 1BO11 en comparación con 20 anticuerpos monoclonales específicos para dichos otros serotipos. La unión de 1BO11 se determinó mediante ELISA en células enteras.

La figura 4 se refiere a la actividad opsonofagocítica del anticuerpo monoclonal 1BO11 dirigido contra P. aeruginosa del 25 serotipo IATS O11.

La figura 5 se refiere a la farmacodinámica del anticuerpo monoclonal 1BO11 en ratones. Se evaluó la capacidad protectora in vivo de 1BO11 en un modelo murino de septicemia por quemadura. Se administraron diferentes dosis de 1BO11 por vía 30 i.p. o i.v. a ratones NMRI. Se muestran los índices de supervivencia tres días después del desafío.

La figura 6 se refiere a la farmacodinámica del anticuerpo monoclonal 1BO11 en ratones. Se evaluó la capacidad de 1BO11 de mediar el aclaramiento de P. aeruginosa de pulmón y bazo después 35 de una infección pulmonar en un modelo de infección pulmonar

aguda en ratones. Se administró 1BO11 por vía i.v. antes de la infección pulmonar con P. aeruginosa. Se evaluó la carga bacteriana en pulmón y bazo 6, 12, 24 y 48 horas después de la infección.

La figura 7 se refiere a la activación del complemento del 5 anticuerpo monoclonal 1BO11. Se muestran los resultados de un ensayo in vitro que mide la generación del componente del complemento C4d tras mezclar 1BO11 con suero humano normal. El C4d generado se detecto mediante ELISA. Se probaron dos lotes de 1BO11 a dos concentraciones diferentes, 100 μg/ml y 10 μg/ml en 10 suero. El control de suero solo se indica como 0 μg/ml.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los siguientes materiales y métodos se han usados en los ejemplos: 15

Determinación de la especificidad de LPS y cuantificación de IgM en el sobrenadante celular

Para el cribado y análisis de anticuerpos en sobrenadantes de cultivos celulares, se realizó un ELISA como se ha descrito 20 en otra parte (Cryz, S.J. et al., 1987. J. Clin. Invest. 80(1):51-56) con algunos cambios. Brevemente, se prepararon soluciones madre de LPS, lipopolisacárido de P. aeruginosa (producido internamente) a una concentración de 2 mg/ml en trietilamina 36 mM. Para el recubrimiento, la solución se diluyó 25 a 10 μg/ml en PBS que contenía azida sódica al 0,02% (PBS-Az). Esta solución se mezcló con un volumen igual de seroalbúmina humana metilada a 10 μg/ml (HSA; producida internamente como sigue: se disolvieron 2 g de HSA liofilizada en 200 ml de metanol absoluto. Después de añadir 1,68 ml de HCl al 37%, la 30 solución se almacenó durante al menos 3 días a temperatura ambiente en la oscuridad con agitación ocasional. El precipitado se recoge mediante una centrifugación de 10 minutos (4500 rpm, rotor GS1), y se lava dos veces con metanol absoluto y dos veces con éter anhídrido resuspendiendo el precipitado en el 35 disolvente. El precipitado se seca durante 2 horas en un

desecador y el precipitado seco se resuspende en H2O y se almacena en alícuotas a -20ºC. La concentración de proteína fue de 0,85 mg/ml en PBS-Az agitando suavemente durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se recubrieron placas de ELISA de NUNC® con la solución LPS-HSA 100 μl/pocillo durante la noche a 5 temperatura ambiente. Después de lavar las placas 3 veces con 300 μl de PBS a pH 7,4 (producido internamente) que contenía Tween20 al 0,05% (#93773; Fluka Chemie AG, Suiza) (PBS-T), se incubaron los sobrenadantes de cultivos celulares diluidos 1:2 en PBS durante 2 horas a 37ºC. Después de lavar las placas 3 10 veces con PBS-T, los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo de cabra anti-IgM humano conjugado a peroxidasa de rábano (# 074-1003; KPL; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD) diluido 1:2000 en PBS que contenía SFT al 5% (v/v). Las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC y se 15 lavaron 3 veces con PBS-T. La unión del anticuerpo se visualizó añadiendo 100 μl/pocillo de OPD (ortofenildiamina 0,4 mg/ml en ácido cítrico 24 mM e hidrogenofosfato de disodio 52 mM que contenía solución sustrato de H2O2 al 0,0012% (V/V)). La reacción de color se paró después de 2-3 minutos mediante la adición de 20 50 μl/pocillo de HCl 1 M. La densidad óptica se leyó en un lector de ELISA a 490 nm usando el software Softmax Pro®.

Para la cuantificación de IgM en los sobrenadantes de cultivos celulares, las placas de ELISA se recubrieron con anticuerpo de cabra anti-IgM humano sin conjugar a 1 μg/ml en 25 PBS durante la noche a 4ºC. Las placas se lavaron 3 veces con PBS-T y se incubaron los sobrenadantes celulares y los estándares en diluciones de dos veces. Como estándar se usó suero humano estándar (Behring) empezando a una concentración de 0,5 μg/ml. Todas las diluciones se hicieron en PBS-T. Las placas 30 se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en una mesa oscilante. Después de lavar las placas 3 veces con PBS-T, los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo de cabra anti-IgM humano conjugado a peroxidasa de rábano (KPL) diluido 1:2000 en PBS que contenía SFT al 5% (v/v). Las placas se incubaron 35 durante 1 hora a temperatura ambiente en una mesa oscilante y se

lavaron 3 veces con PBS-T. La unión de anticuerpo se visualizó añadiendo 150 μl/pocillo de solución sustrato OPD. La reacción de color se paró después de 1 minuto mediante adición de 50 μl/pocillo de HCl 1 M. La densidad óptica se leyó en un lector de ELISA a 490 nm usando el software Softmax Pro®. 5

Análisis de secuencias

Se aisló ARN de células de hibridoma usando el kit RNeasy de Qiagen. Se sintetizó el ADNc con la tecnología SMART (Becton Dickenson). Para la PCR de la segunda hebra se usaron los 10 siguientes cebadores (Tabla III): (1) IgM constante inverso (con μ): 5’-GCC ACG CTG CTC GTA TCC GAC G-3’ (SEQ ID NO:11); (2) kappa constante inverso (con κ): 5’-AGC AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CC-3’ (SEQ ID NO:12). Los cebadores directos estaban incluidos en el kit SMART. Para la secuenciación se han usado 15 los siguientes cebadores: (3) secuencia IgM (seq μ): 5’-GCT GCT CGT ATC CGA CGG-3’ (SEQ ID NO:13) y (4) secuencia kappa (seq κ): 5'-CAC AAC AGA GGC AGT TCC-3' (SEQ ID NO:14). La secuenciación se realizó en Microsynth AG (Balgach, Suiza) y las secuencias se compararon con las secuencias de línea germinal existentes 20 usando el software V-Base DNAplot (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/DNAPLOT.php?menu=901).

Tabla I 25

Serotipos IATS de cepas de referencia de P. aeruginosa

Serotipo IATS: Especificación

O1 O2 O3 O4 O6 O7 O10 O11 O16: PA53 (IT4) E576 (IT3) 6510 (Habs3) 6511 (Habs4) PA220 (IT1) Fisher 6 (IT6) Fisher 5 (IT5) Fisher 2 (IT2) Fisher 7 (IT7)

Tabla II

Aislados clínicos de serotipo IATS O11 de P. aeruginosa

# de aislado: fuente del aislado

2309.36 2309.38 2309.58 2309.60 2309.61 2309.65 2310.49 2310.55 2311.58 2312.25 V02 610 VA 1014 VA 26939 VA 28/1 VA 2813 VA 3348 VA 3805 VA 4156/1 VA 695 VA 843: orina oído sangre orina orina secreción traqueal orina sangre secreción traqueal secreción traqueal vesícula biliar oído pulmón (BAL) herida herida pulmón (BAL) ojo herida herida secreción traqueal

FT-2: Cepa de referencia

ELISA en células enteras

Se hicieron crecer bacterias de diferentes aislados 5 clínicos (véase la tabla II) en medio de Luria a 37ºC hasta una densidad óptica a 600 nm de 1, y se fijaron en formalina al 37% (concentración final de formalina: 0,5%) durante la noche a 37ºC. Las bacterias fijadas se diluyeron 1:50 en PBS y se inmovilizaron en placas de ELISA. Después de bloquear las placas 10 con PBS que contenía suero fetal de ternera al 5% (v/v), se incubó el anticuerpo monoclonal 1BO11 con las bacterias fijadas durante 2 horas a 37ºC. De forma alternativa, se hicieron crecer aislados de otros serotipos como se describe anteriormente y se incubaron con el anticuerpo monoclonal 1BO11 o, como controles 15 positivos, con anticuerpos monoclonales específicos para los

respectivos serotipos (figura 3b, anticuerpos monoclonales específicos de serotipo controles positivos llamados colectivamente “control positivo”). Después de lavar las placas 3 veces con PBS-T, los anticuerpos unidos se detectaron con anticuerpo de cabra anti-IgM humano conjugado a peroxidasa de 5 rábano (# 074-1003; KPL; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD) diluido 1:2000 en PBS que contenía SFT al 5% (v/v). Las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC y se lavaron 3 veces con PBS-T. La unión de anticuerpo se visualizó añadiendo 100 μl/pocillo de OPD (ortofenildiamina 0,4 mg/ml en 10 ácido cítrico 24 mM e hidrogenofosfato de disodio 52 mM que contenía solución sustrato de H2O2 al 0,0012% (V/V). La reacción de color se paró después de 2-3 minutos mediante la adición de 50 μl/pocillo de HCl 1 M. La densidad óptica se leyó en un lector de ELISA a 490 nm usando el software Softmax Pro®. 15

Ensayo de opsonofagocitosis

Para determinar la actividad biológica, se ensayó la actividad opsonofagocítica del anticuerpo monoclonal 1BO11. Para este fin, se hicieron crecer bacterias de P. aeruginosa del 20 serotipo IATS O11, según la tabla 1, en medio TSBG (medio tríptico de soja 30 g/l que contenía glucosa al 1% (peso/volumen)) durante la noche. Después de lavar dos veces las bacterias con PBS frio, el precipitado bacteriano se resuspendió en 5 ml de tampón bicarbonato 0,1 M, pH 8,0. Se añadieron 50 μl 25 de éster succinimidílico de 5-(y -6)-carboxifluoresceína (5(6)-FAM, SE; Molecular Probes, Eugene, OR; 10 mg/ml en dimetilsulfóxido), y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Las bacterias se fijaron mediante adición de 100 μl de formaldehído al 37% e incubación durante la noche a 37ºC. Para eliminar el 30 colorante no conjugado, las bacterias se lavaron 6 veces mediante centrifugación y resuspensión en 20 ml de PBS estéril frio. Las bacterias marcadas se almacenaron a 4ºC hasta su uso. Para el ensayo, se diluyó una alícuota de las bacterias hasta una densidad óptica a 550 nm de 1, seguido por una dilución 1:50 35 en HBSS-BSA (solución equilibrada de sales de Hanks que contenía

BSA al 0,1%). Se mezclaron 20 μl de las bacterias con 10 μl de diferentes diluciones de sobrenadante de cultivo celular de hibridoma que contenían el anticuerpo monoclonal 1BO11, o un anticuerpo monoclonal control no específico, respectivamente (datos no mostrados). Después de 30 minutos de incubación a 5 37ºC, se añadieron 10 μl de suero de gazapo (Charles River Laboratories, Alemania) como fuente de complemento, y se incubaron las sondas durante otros 30 minutos a 37ºC. Se añadieron 40 μl de células HL-60 diferenciadas (la línea celular promielocítica HL-60 se diferenció a células granulocíticas 10 incubando las células durante 3 días en medio de Dulbecco modificado por Iscoves (IMDM; Sigma) suplementado con suero fetal de ternera al 10% (v/v) y dimetilformamida 100 mM) a las bacterias opsonizadas para obtener una concentración final de 1,25 x 106 células/ml. Después de incubar durante 90 minutos a 15 37ºC en un agitador, las células se recogieron transfiriéndolas a 2 ml de tampón de lavado de células (PBS con azida al 0,02% (v/v); Becton Dickenson). Después de centrifugar durante 5 minutos a 250 x g, el precipitado celular se resuspendió en 150 μl de tampón de lavado celular y se analizó mediante citometría 20 de flujo. Se determinó la actividad opsonofagocítica positiva analizando la fluorescencia verde de las células HL-60 en comparación con la tinción de fondo. La tinción de fondo se determinó incubando las bacterias conjugadas con fluoresceína en presencia de complemento con células HL-60. 25

Protección in vivo de ratones infectados con P. aeruginosa

Modelo murino de quemadura

Se determinó la capacidad protectora in vivo 1BO11 en el 30 modelo murino de septicemia por quemaduras. Los ratones NMRI (18-20 g; Charles River Laboratories) recibieron de 0,16 a 10 μg (que corresponde a aproximadamente 0,4 a 0,006 mg/kg de peso corporal) en un volumen de 0,1 ml del anticuerpo monoclonal 1BO11 por vía intravenosa 4 horas antes del desafío. Como 35 control, se inyectaron 0,1 ml de sobrenadante de anticuerpo

inespecífico. Para el desafío, se anestesiaron grupos de 10 ratones hembra en una atmósfera de 3-cloro-1,1,2-trifluoroetil-difluorometil-éter (Ethrane, Abbott Lab., Chicago, IL). Los ratones se sometieron a 10 segundos de abrasión con etanol en un área de 2 cm2 del lomo. Se inyectaron inmediatamente 2x107 5 ufc/ratón de los organismos de desafío (P. aeruginosa IATS O11; aislado clínico 2310.55; véase la tabla 2) resuspendidos en 0,5 ml de PBS por vía subcutánea en la zona quemada. Los animales se observaron durante 7 días. Como medida de protección se muestra el índice de supervivencia 3 días después del desafío. 10

Modelo de infección pulmonar aguda

Para evaluar la capacidad protectora de 1BO11 contra la infección pulmonar con P. aeruginosa, se usó un modelo de infección pulmonar aguda. Se inyectaron 10 μg (0,4 mg/kg) de 15 1BO11 por vía i.v. a ratones BALB/c. Después de ello, se aplicaron 40 μl de una solución de 4,0x107/ml de la cepa 2310.55 (tabla 2) (que corresponden a 1,6x106 por ratón) por vía intratraqueal en el bronquio inferior izquierdo usando un aguja curvada con la punta en forma de bola con anestesia profunda. Se 20 eligió esta dosis ya que producía sólo mortalidad limitada. Después de 6, 12, 24 y 48 horas los ratones se sacrificaron y los pulmones y bazos se retiraron asépticamente. Los órganos se suspendieron en 3 ml de PBS y se homogenizaron durante 45 segundos con un homogenizador en hielo. Se plaquearon diluciones 25 en serie de los homogenados de los órganos (0,1 ml) en agar Conradi Drigalki modificado para determinar las UFC/pulmón o UFC/bazo.

Determinación de la activación de la vía clásica del complemento 30 por anticuerpos monoclonales

Para determinar el desencadenamiento espontáneo final de la vía clásica del complemento por los agregados de IgM formados durante el procesamiento posterior, se incubó anticuerpo 1BO11 de una concentración definida en suero de un donante sano 35 durante 30 minutos a 37ºC. La reacción se paró luego en EDTA 10

mM y se detectó el fragmento de activación del complemento C4d mediante ELISA comercial (Quidel Corp, San Diego). Como controles positivos, se usaron complejos IgM-antígeno que consistían en anticuerpo 1BO11 y su antígeno LPS afín.

5

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Secuencias de ADN y aminoácidos de 1BO11

La especificidad del anticuerpo se determina mediante la secuencia de ADN y aminoácidos, respectivamente. Se determinaron 10 las secuencias de ADN de los fragmentos variables de las cadenas pesada y ligera. Brevemente, se aisló el ARN total de las células de hibridoma, y se sometió a transcripción inversa para dar ADNc completo usando la tecnología SMART (Becton Dickinson). Mediante este planteamiento, se añadió un cebador universal al 15 extremo 5’ del ADNc. Usando este cebador y los cebadores específicos Cκ y Cμ representados en la tabla III, se amplificaron mediante PCR las regiones variables y parte de las regiones constantes de IgM y kappa. Los fragmentos de PCR se purificaron después mediante escisión de geles de agarosa y se 20 usaron como moldes para secuenciación con los cebadores representados en la tabla III.

Tabla III

Cebadores usados para amplificación por PCR y secuenciación de 25 las regiones variables de las cadenas pesadas de IgM y las cadenas ligeras kappa de 1BO11

Cebador: Secuencia Aplicación

Con μ: 5’-GCC ACG CTG CTC GTA TCC GAC G-3’ (SEQ ID NO: 11) PCR

Con κ: 5’-AGC AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CC-3’ (SEQ ID NO: 12) PCR

Seq μ: 5’-GCT GCT CGT ATC CGA CGG-3’ (SEQ ID NO:13) Secuenciación

Seq κ: 5’-CAC AAC AGA GGC AGT TCC-3’ (SEQ ID NO:14) Secuenciación

Las secuencias de las regiones variables se compararon posteriormente con el índice Vbase. Los resultados de la 30 comparación con las secuencias de la línea germinal se expresan

como número de mutaciones de “reemplazo y silenciosas” (R:S), como se representa en la tabla IV. Las secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos se representan en las figuras 1 y 2.

Tabla IV 5

Relación de mutaciones de reemplazo frente a silenciosas de secuencias de línea germinal

: Cadena pesada Cadena ligera

Línea germinal: R:S Línea germinal R:S

1BO11: DP-53 17:3 DPK-18 0:2

Ejemplo 2: Reconocimiento de aislados clínicos de P. aeruginosa de serotipo IATS O11 por el anticuerpo monoclonal 1BO11 10

Se ha generado 1BO11 mediante la inmunización de un voluntario sano con un vacuna octavalente O-PS-toxina A. La vacuna contiene la cepa de referencia de IATS O11 FT-2. Para investigar si el 1BO11 producido contra el LPS de esta cepa también reconoce otros aislados del serotipo IATS O11, se 15 recogió a un amplia gama de aislados clínicos de diferentes hospitales (véase la tabla 2). El serotipo de todos los aislados se determinó usando un kit de aglutinación de serotipo comercialmente disponible. Los serotipos se confirmaron mediante PCR. Se probó después la unión diferentes aislados clínicos de 20 serotipo IATS O11 (figura 3a) así como otros serotipos (figura 3b) a 1BO11 mediante ELISA de células enteras.

1BO11 reaccionó fuertemente con todos los aislados IATS O11 probados, con la excepción de dos reacciones débiles que fue debido a la baja expresión de LPS en la superficie de estos 25 aislados. Además, la unión se observó exclusivamente con aislados del serotipo IATS O11 y no se produjo unión con varios aislados de serotipos O1, O2, O3, O6 u O10. Se garantizó la integridad de estos aislados usando otros anticuerpos monoclonales contra el serotipo respectivo como controles 30 positivos.

Ejemplo 3: Actividad in vitro de 1BO11: actividad opsonofagocítica

Se evaluó la actividad biológica de 1BO11 in vitro usando un ensayo opsonofagocítico basado en citometría de flujo. Se incubó P. aeruginosa de serotipo IATS O11 conjugada a FITC con 5 1BO11 diluido en serie en presencia de suero normal de conejo como fuente de complemento. Las bacterias opsonizadas se incubaron con células HL-60 diferenciadas (una línea celular promielocítica, ATTC: CCL-240; la diferenciación a monocitos se alcanzó mediante la adición de dimetilformamida 0,1 M durante 3 10 días). La opsonofagocitosis se analizó mediante FACS. Se determinó la actividad opsonofagocítica positiva analizando la fluorescencia verde de las células HL-60 en comparación con la tinción de fondo (bacterias conjugadas con FITC con células HL-60 en ausencia de suero pero en presencia de complemento). Los 15 resultados se muestran en la figura 4.

1BO11 medió la fagocitosis de P. aeruginosa de serotipo IATS O11 de una manera dependiente de la dosis (círculos rellenos). No se observó fagocitosis si se usaba complemento inactivado por calor (círculos vacíos). La actividad 20 opsonofagocítica (AO50) de 1BO11, definida como la concentración resultante en el porcentaje a mitad del máximo de células HL-60 positivas para FITC, fue de 0,1 ng/ml. La actividad a dosis tan bajas indica gran potencial efector de 1BO11.

25

Ejemplo 4: Capacidad protectora in vivo del anticuerpo monoclonal 1BO11

Se evaluó la capacidad protectora in vivo de 1BO11 en un modelo murino de septicemia por quemadura. Se administraron diferentes dosis de 1BO11 por vía i.p o i.v. a ratones NMRI. 30 Después de tres horas, se infligió una quemadura de 2x2 cm y se inyectaron 2x107 UFC de P. aeruginosa de la cepa 2310.55 (O11) por vía s.c. bajo el área de la piel quemada. Los ratones recibieron analgésicos durante el periodo experimental completo. Se controló la supervivencia tres veces al día. Los índices de 35 supervivencia tres días después del desafío se muestran en la

figura 5. Se incluyen los datos agrupados de 4 experimentos individuales (marcados A-D).

Dosis ≥ 0,2 mg/kg de peso corporal confirieron el 70-100% de protección del desafío sistémico con Pseudomonas. La administración de dosis decrecientes produjo menores índices de 5 supervivencia. La muerte fue una causa directa de la infección de Pseudomonas ya que los ratones con quemaduras pero sin infección de Pseudomonas tenían un índice de supervivencia de 100%. Estos datos demuestran la eficacia in vivo de 1BO11 contra infección sistémica con P. aeruginosa. 10

Ejemplo 5: Aclaramiento o eliminación bacteriana aumentada de pulmón y bazo después de desafío respiratorio agudo

Para evaluar si 1BO11 podría ser capaz de depurar la infección respiratoria de Pseudomonas se usó un modelo de 15 infección pulmonar aguda en ratones. Para este fin, se administró 1BO11 (0,4 mg/kg de peso corporal) por vía i.v. antes del desafío pulmonar intratraqueal con la cepa 2310.55 de P. aeruginosa. Se eligió la dosis de desafío para que produjera sólo mortalidad mínima. Por tanto, se eligió el aclaramiento de 20 bacterias del pulmón como parámetro de evaluación.

La aplicación de 1BO11 produjo un aclaramiento rápido de P. aeruginosa del pulmón (figura 6). Este descubrimiento es sorprendente ya que los anticuerpos IgM normalmente no penetran en el tejido pulmonar. Después de 48 horas las bacterias se 25 habían eliminado por completo mientras que a este tiempo en animales no tratados la infección aún seguía. Similar al curso de neumonía por P. aeruginosa en seres humanos, la infección bacteriana se puede volver sistémica, reflejado en este experimento por la aparición de P. aeruginosa en bazo. La 30 resolución completa de la infección sistémica estaba mediada por 1BO11 mientras las bacterias estaban aún presentes en ratones no tratados (figura 6). Estos descubrimientos indican el potencial de 1BO11 para el tratamiento de infecciones respiratorias de P. aeruginosa, tal como neumonía nocosomial. 35

Ejemplo 6: Reactividad cruzada del anticuerpo monoclonal 1BO11 con tejidos humanos

Para excluir unión no específica indeseada de 1BO11 a tejidos humanos, se probó la reactividad cruzada de 1BO11 según “Puntos de la FDA a considerar en la fabricación y prueba de 5 productos de anticuerpos monoclonales para uso humano (1997)” y “Las reglas que dirigen los productos médicos en la Comunidad Europea Vol. 3a (1994). Los tejidos empleados se enumeran en la siguiente tabla. Cada uno de los tejidos se obtuvo de tres donantes no relacionados para minimizar las posibilidades de 10 factores específicos de donante que afecten a la unión del anticuerpo.

Tabla V

Tejidos humanos usados para probar el potencial de reactividad 15 cruzada de 1BO11

Suprarrenal: Vejiga Células sanguíneas Vasos sanguíneos (endotelio)

Médula ósea: Mama Cerebelo Corteza cerebral

Colon: Ojo Trompa de Falopio Corazón

Íleon (aparato digestivo): Riñón (glomérulo, túbulo) Hígado Pulmón

Ganglio linfático: Ovario Páncreas Paratiroides

Parótida: Nervio periférico Pituitaria Placenta

Próstata: Piel Médula espinal Bazo

Estómago: Músculo estriado Testículo Timo*

Tiroides: Amígdala Uretra Útero (cuello, endometrio)

* Tejido disponible sólo de un donante para su uso.

No se observó reactividad cruzada a ninguno de estos tejidos (datos no mostrados). Basado en estos resultados parece probable que no se produzca unión no específica a tejidos in 20 vivo, produciendo así efectos secundarios inflamatorios limitados.

Ejemplo 7: Activación del complemento por el anticuerpo monoclonal 1BO11 25

Los anticuerpos humanos administrados in vivo pueden producir reacciones adversas por la activación espontánea del complemento. Tal activación de la vía clásica del complemento se puede probar mediante un ensayo in vitro midiendo la generación del componente del complemento C4d tras mezclar 1BO11 con suero 5 humano normal y la detección de C4d mediante ELISA comercial (Quidel Corp., San Diego). Se probaron dos lotes de 1BO11 producidos en condiciones GMP (denominados “lote 1” y “lote 2”) a dos concentraciones diferentes, 100 μg/ml y 10 μg/ml, en suero. El control de suero solo se indica como 0 μg/ml. Los 10 resultados se muestran en la figura 7.

No hubo generación espontánea de C4d desencadenada por 1BO11 en el suero (barras blancas), mientras que se generaron niveles altos de C4d en presencia de 10 μg/ml de LPS de P. aeruginosa de serotipo IATS O11 (barras negras). Los resultados 15 indican que 1BO11 mostrará una cantidad mínima de efectos secundarios inflamatorios espontáneos cuando se use en seres humanos.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Berna Biotech AG

<120> Anticuerpo monoclonal humano 1BO11, específico para 5

lipopolisacáridos (LPS) de serotipo IATS O11 de Pseudomonas

aeruginosa

<130> EP33644HV017pau

10

<160> 14

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 15

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 20

<221> característica miscelánea

<223> CDR1 de la cadena ligera

<400> 1

25

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30

<220>

<221> característica miscelánea

<223> CDR2 de la cadena ligera

35

<400> 2

<210> 3

<211> 9 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica miscelánea 45

<223> CDR3 de la cadena ligera

<400> 3

<210> 4

<211> 5

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica miscelánea

<223> CDR1 de la cadena pesada 10

<400> 4

<210> 5 15

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 20

<221> característica miscelánea

<223> CDR2 de la cadena pesada

<400> 5

25

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30

<220>

<221> característica miscelánea

<223> CDR3 de la cadena pesada

35

<400> 6

<210> 7

<211> 112 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica miscelánea 45

<223> región variable de la cadena ligera

<400> 7

<210> 8 5

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 10

<221> característica miscelánea

<223> región variable de la cadena pesada

<400> 8

15

<210> 9

<211> 336 5

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica miscelánea 10

<223> región variable de la cadena ligera

<400> 9

15

<210> 10

<211> 348

<212> ADN

<213> Homo sapiens

20

<220>

<221> característica miscelánea

<223> región variable de la cadena pesada

<400> 10 25

<210> 11

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR 5

<220>

<221> característica miscelánea

<223> descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR

10

<400> 11

<210> 12

<211> 26 15

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR 20

<400> 12

<210> 13 25

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 30

<223> descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación

<400> 13

35

<210> 14

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

40

<220>

<223> descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación

<400> 14

45

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo monoclonal humano específico para el lipopolisacárido (LPS) del serotipo IATS 011 de P. aeruginosa que comprende una cadena ligera y una cadena 5 pesada en donde la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, o una muteína de dicho anticuerpo capaz de unirse a dicho LPS, en donde la 10 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:8. 15
2. Anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 1 en donde la cadena ligera es de tipo kappa.
3. Anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 1 en donde 20 la cadena ligera es de tipo lambda.
4. Anticuerpo monoclonal humano de las reivindicaciones 1 a 3 en donde la cadena pesada es del tipo IgM, IgA o IgG.

25
5. Anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 4 en donde la cadena pesada es del tipo IgM.
6. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde el anticuerpo consiste 30 completamente en secuencia de aminoácidos humana.
7. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde el anticuerpo muestra reconocimiento antigénico humano. 35
8. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde el anticuerpo está modificado en el N-terminal, internamente y/o en el C-terminal, en donde la modificación se selecciona de al menos una de oligo, di- o polimerización, modificaciones de las 5 cadenas laterales, modificaciones postraduccionales y conjugación a un fármaco y/o un marcador.
9. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 obtenible de una célula B humana o un 10 hibridoma obtenido mediante fusión de dicha célula B humana con una célula de mieloma o heteromieloma.
10. Hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 9. 15
11. Ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano y la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 9. 20
12. Vector que comprende el ácido nucleico que codifica la cadena ligera y la cadena pesada de la reivindicación 11.
13. Vector según la reivindicación 12, en donde el vector 25 también comprende un promotor operativamente unido al ácido nucleico para facilitar la expresión del mismo.
14. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 12 y/o el ácido nucleico de la reivindicación 11. 30
15. Un método para producir el anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 9 que comprende cultivar el hibridoma de la reivindicación 10 bajo condiciones que permiten la secreción de un anticuerpo o 35 cultivar la célula huésped de la reivindicación 14 en

condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo monoclonal humano y, opcionalmente, purificar el anticuerpo del sobrenadante del cultivo.
16. Composición farmacéutica que comprende al menos un 5 anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o al menos un ácido nucleico de la reivindicación 11 y, opcionalmente, ingredientes farmacéuticamente aceptables.

10
17. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o el ácido nucleico de la reivindicación 11 para uso en la profilaxis y/o tratamiento de una infección de P. aeruginosa en un paciente humano.

15
18. Uso del anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o del ácido nucleico de la reivindicación 11 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de una infección por P. aeruginosa en un paciente humano. 20
19. Anticuerpo monoclonal humano y/o el ácido nucleico para el uso según la reivindicación 17 o el uso según la reivindicación 18 en donde la infección por P. aeruginosa es una infección intrahospitalaria. 25
20. Kit de prueba para el diagnóstico de una infección por P. aeruginosa en una muestra que comprende al menos un anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o al menos un ácido nucleico de la 30 reivindicación 11, y opcionalmente, ingredientes adecuados adicionales para llevar a cabo la prueba de diagnóstico.