CN115819581A - 一种靶向人cd47的抗体、制备方法和应用 - Google Patents

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CN115819581A CN202111093722.2A CN202111093722A CN115819581A CN 115819581 A CN115819581 A CN 115819581A CN 202111093722 A CN202111093722 A CN 202111093722A CN 115819581 A CN115819581 A CN 115819581A
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赵勇
徐伟
莫世甫
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Abstract

本发明涉及一种靶向人CD47的抗体、制备方法和应用。具体地，涉及能特异性结合人CD47蛋白并阻断其与SIRPα的结合，从而因此阻断CD47对表达SIRPα的巨噬细胞的抑制作用的抗人CD47抗体及其抗原结合片段，本发明还涉及所述抗体及其抗原结合片段的制备方法和用途。

Description

一种靶向人CD47的抗体、制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及一种靶向人CD47的抗体、制备方法和应用。
背景技术
CD47是45～50kD的跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。研究发现，肿瘤细胞上高表达的CD47与巨噬细胞上的配体SIRPα结合，使得SIRPα酪氨酸磷酸化，从而发出抑制性调节信号，抑制巨噬细胞的吞噬作用。对应的，阻断该通路可以解除巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬的抑制作用，提高机体对肿瘤细胞的免疫反应，为肿瘤的免疫治疗提供一条新途径。
在以CD47-SIRPα轴为靶标的肿瘤治疗中，最主要的机制是巨噬细胞的激活，从而增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。其次，阻断CD47可能进一步将巨噬细胞募集到肿瘤组织中，以及向肿瘤组织募集额外的免疫细胞的细胞因子和趋化因子，如单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)，这些细胞因子的分泌有助于CD47阻断疗法的功效。再次，靶向CD47-SIRPα的疗法也可能改变肿瘤中巨噬细胞的极化状态。巨噬细胞按其表型和功能活性又可以分为M1(Ⅰ型)和M2(Ⅱ型)两种，M1巨噬细胞能产生大量的促炎细胞因子，并介导抵抗细胞内寄生虫和抑制肿瘤生长；M2巨噬细胞则产生较少的促炎分子，参与组织损伤修复、血管生成和促进肿瘤生长。研究发现，阻断CD47-SIRPα后可显著增加小鼠微环境中的M1巨噬细胞肿，而小鼠M2巨噬细胞则没有显著的增加。最后，其它免疫细胞也可以响应CD47阻断疗法。SIRPα在骨髓免疫细胞上高度表达，因此它可能是骨髓谱系的关键调节剂。在小鼠中，CD47通过SIRPα+树突状细胞来调节抗原摄取，使用同源免疫活性肿瘤模型发现，CD47阻断的治疗效果取决于树突状细胞。通过刺激巨噬细胞或树突细胞的抗原呈递，靶向CD47-SIRPα轴的疗法可以促进肿瘤的适应性免疫应答。
CD47广泛表达于多种细胞，特别是在新生红细胞上高表达。因此靶向CD47的治疗性抗体有可能会引起贫血。另一方面，体内游离抗人CD47抗体的浓度也会由于红细胞对抗人CD47抗体的吸附作用而大大降低。
因此，开发新的治疗性抗人CD47抗体，使得其与肿瘤细胞表面CD47蛋白的结合选择性更强，与红细胞表面CD47蛋白结合更弱，成为新型治疗性抗人CD47抗体的目标之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向人CD47的抗体、制备方法和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种抗人CD47抗体的重链可变区，所述重链可变区包括选自下组的三个互补决定区：
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIX1NLASSIYYADTVX2G(SEQ ID NO.2)
VH-CDR3：AGDYRSFX3Y(SEQ ID NO.3)；
其中，X1＝T、R或G；X2＝T或K；X3＝P或D；
其中，X1、X2和X3各自独立地不同时为T、T和P，
上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留对CD47的结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区包括选自下组的三个互补决定区：
(A1)M7
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.7)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A2)M8
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(A3)M9
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VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A4)M15
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(A6)M25
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VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.13)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)。
在本发明的第二方面，提供了一种抗人CD47抗体的重链，所述的重链具有如本发明的第一方面所述的重链可变区。
在本发明的第三方面，提供了一种抗人CD47抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)包括以下三个互补决定区CDR的轻链可变区：
VL-CDR1：SASSSVNYVN(SEQ ID NO.4)
VL-CDR2：GISNLAS(SEQ ID NO.5)
VL-CDR3：QQRSTFPP(SEQ ID NO.6)；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留对CD47的结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列，并且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与CD47结合的亲和力。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。
在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少96％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体还包括其抗原结合片段，所述的抗原结合片段选自下组：scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、dsFv2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。
在另一优选例中，所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源的，和/或所述的轻链恒定区为人源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，和/或所述轻链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的轻链恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区，且所述轻链恒定区为人源抗体轻链kappa恒定区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
在另一优选例中，所述抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
在另一优选例中，所述的抗体为单特异性抗体、双特异性抗体、或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述抗体具有如本发明的第二方面所述的重链；其中所述重链包含的重链可变区具有选自下组的三个互补决定区：
(A1)M7
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.7)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A2)M8
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VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A3)M9
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VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A4)M15
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VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A5)M22
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.11)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A6)M25
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.13)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；和/或
轻链，所述的轻链包含具有以下三个互补决定区CDR的轻链可变区：
VL-CDR1：SASSSVNYVN(SEQ ID NO.4)
VL-CDR2：GISNLAS(SEQ ID NO.5)
VL-CDR3：QQRSTFPP(SEQ ID NO.6)。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，和所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，和所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，和所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，和所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，和所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，和所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在本发明的第四方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在本发明的第五方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的抗原结合结构域的scFv区段特异性结合于人CD47，并且所述scFv区段具有重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区具有选自下组的三个互补决定区：
(A1)M7
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.7)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A2)M8
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIRNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.10)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A3)M9
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VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.11)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A4)M15
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.12)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A5)M22
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.11)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A6)M25
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.13)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；和/或
所述轻链可变区具有以下三个互补决定区：
VL-CDR1：SASSSVNYVN(SEQ ID NO.4)
VL-CDR2：GISNLAS(SEQ ID NO.5)
VL-CDR3：QQRSTFPP(SEQ ID NO.6)。
在本发明的第六方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明的第五方面所述的CAR构建物。
在本发明的第七方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明的第三方面所述的抗体、或如本发明的第四方面所述的重组蛋白、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、酶、或其组合。
在本发明的第八方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第三方面所述的抗体、或如本发明的第四方面所述的重组蛋白、如本发明的第五方面所述的CAR构建物、如本发明的第六方面所述的重组的免疫细胞、如本发明的第七方面所述的抗体药物偶联物、或其组合，所述活性成分用于
(a)制备检测试剂或试剂盒；
(b)制备预防和/或治疗人CD47相关疾病的药物或制剂；和/或
(c)制备预防和/或治疗人CD47相关的癌症或肿瘤的药物或制剂。
在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第三方面所述的抗体、或如本发明的第四方面所述的重组蛋白、如本发明的第五方面所述的CAR构建物、如本发明的第六方面所述的重组的免疫细胞、如本发明的第七方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在本发明的第十方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的抗体、如本发明的第四方面所述的重组蛋白、或如本发明的第五方面所述的CAR构建物。
在本发明的第十一方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明的第十方面所述的多核苷酸。
在本发明的第十二方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明的第十一方面所述的载体或基因组中整合有如本发明的第十方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，较佳地为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞，更佳地为中国仓鼠卵巢细胞。
在本发明的第十三方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中人CD47蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明的第三方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CD47蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了一种治疗人CD47相关疾病的方法，所述方法包括：
给需要的对象施用如本发明的第三方面所述的抗体、或如本发明的第四方面所述的重组蛋白、如本发明的第五方面所述的CAR构建物、如本发明的第六方面所述的重组的免疫细胞、如本发明的第七方面所述的抗体药物偶联物、或如本发明的第九方面所述的药物组合物，或其组合。
在另一优选例中，所述人CD47相关疾病为CD47高表达的肿瘤，较佳地为淋巴瘤，更佳地为急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A显示了Elisa检测的突变抗体(M7,M9,C4)与人CD47蛋白的结合活性。
图1B显示了Elisa检测的突变抗体(M15,C4)与人CD47蛋白的结合活性。
图1C显示了Elisa检测的突变抗体(M7,M9,M22,M25,C4)与人CD47蛋白的结合活性。
图2显示了流式细胞仪检测A549细胞是CD47阳性细胞。
图3显示了抗体抑制A549细胞的CD47与SIRPα的结合。
图4显示了抗体导致的红细胞凝集实验。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现，对CD47抗体的重链CDR的若干突变可以提升抗体与抗原的结合能力。本发明提供的CD47抗体能特异性结合人CD47蛋白并阻断其与SIRPα的结合，但对红细胞没有凝集作用，具有高亲和力和高安全性。在此基础上完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗CD47抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种抗CD47抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。
抗体
如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的不同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。IgG代表免疫球蛋白中最重要的一类，由于化学结构和生物功能差异，它又可以分为4个子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的FR区(FR)。4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区(框架区)组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区，即轻链高变区(LCDR)，指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区，即重链高变区(HCDR),指HCDR1、HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。天然重链和轻链可变区中的四个FR区大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab'片段，F(ab')2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
如本文所用，抗体的“Fv”段指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区和一条重链的可变区组成。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。"纳米抗体"是指一种抗体片段，其由一个来自重链抗体的VH域和两个恒定区CH2和CH3组成。
“双功能抗体(diabody)”包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中该片段含有在同一条多肽链上相连的VH域和VL域。两个域之间衔接物很短，使同一条链上的两个域不能互相配对，从而迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗体结合位点。这两个抗体结合位点可靶向结合相同或不同的抗原(或抗原表位)。
“域抗体”是指仅含有一条重链可变区或一条轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或多个VH域由一个多肽衔接物共价结合并形成双价域抗体。双价域抗体的两个VH域可靶向作用于相同或不同的抗原。
在某些实施方式中，“(dsFv)2”含有三条肽链：两个VH基因间通过一条多肽衔接物相连，并通过二硫键与两个VL基团结合。
在某些实施方式中“双特异性ds双功能抗体”含有VL1-VH2(由一个多肽衔接物相连)和VH1-VL2(也是由一个多肽衔接物相连)，两者在VH1和VLl间通过二硫键结合。
“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv”含有三条多肽链：VH1-VH2基团，其中两者的重链通过多肽衔接物(如：长的弹性衔接物)相连，并通过二硫键分别与VL1和VL2基团结合，每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。
在某些实施方式中，“scFv二聚体”是双价双功能抗体或双价单链抗体(BsFv)，含有二聚化的两个VH-VL(由多肽衔接物连接)基团，其中二个基团的VH与另一个基团的VL协作形成两个结合位点，这两个结合位点可靶向结合相同抗原(或抗原表位)或不同抗原(或抗原表位)。在另一些实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，含有相互连接的VL1-VH2(由多肽衔接物连接)和VH1-VL2(由多肽衔接物连接)，其中VH1和VL1协作，VH2和VL2协作，且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染宿主细胞表达的抗体分子。既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，又使其人源Fc段能有效介导生物学效应功能。
如本文所用，术语“人源化抗体”，是本发明鼠抗的一种可变区改造形式，具有源自(或基本上源自)非人类抗体(优选小鼠单克隆抗体)的CDR区，和基本源自人源抗体序列的FR区和恒定区；即将鼠抗的CDR区序列嫁接到不同类型的人种系抗体构架序列上。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体性质的重组抗体。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A.
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
抗CD47抗体
如本文所用，术语“CD47”是指与SIRPα结合的配体。其它的命名为IAP、MER6或OA3等。它具有35.2kDa的分子量，并且存储在SwissProt中，登记号为Q08722。
本发明提供一种针对CD47的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
在另一优选例中，所述抗体还包括其抗原结合片段，所述的抗原结合片段选自下组：scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、dsFv2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。
在本发明的一个优选实施例中，在亲本CD47抗体(中国专利CN202010240238.7)的基础上，设计了含多个突变组合的CD47抗体，其中突变抗体的重链可变区中的某些位点可以明显提升抗体与CD47蛋白的结合活性。其中，对抗体重链的52位的T(H-T52)进行氨基酸替换，例如将其分别替换为S、L、I、H、A、G、N或Q。优选地，将其替换为G(H-T52G，抗体M15)。
在上述发现的活性增强型突变的基础上，发明人进一步设计了含多个突变组合的抗体M22(H-T64K/H-P101D)和M25(H-T64K/H-P101D/H-T52G)。
优选地，重链可变区(VH)的CDR选自下组：
(A1)M7
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.7)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A2)M8
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIRNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.10)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A3)M9
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.11)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A4)M15
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.12)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A5)M22
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.11)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A6)M25
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.13)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；和/或
轻链可变区(VL)的CDR选自下组：
VL-CDR1：SASSSVNYVN(SEQ ID NO.4)
VL-CDR2：GISNLAS(SEQ ID NO.5)
VL-CDR3：QQRSTFPP(SEQ ID NO.6)；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-5、1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸的具有CD47结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有CD47结合亲和力的序列，位于重链可变区(VH)的CDR区。
在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有CD47结合亲和力的序列，位于轻链可变区(VL)的CDR区。
在本发明的一种更优选实施例中，VH-CDR1选自SEQ ID NO.1，和/或
VH-CDR2分别独立地选自SEQ ID NO.7、10、11、12、13，和/或
VH-CDR3分别独立地选自SEQ ID NO.8、9中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有CD47结合亲和力的序列；VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3分别独立地选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有CD47结合亲和力的序列。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向人CD47的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
本发明抗体含有重链可变区和轻链可变区，较佳地，所述重链可变区和轻链可变区的序列选自下组：
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，和所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，和所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，和所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，和所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；和
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，和所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
抗体的制备
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的CD47抗体。例如，可以用连接或天然存在的CD47蛋白或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。
任何合适形式的CD47都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对CD47特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、杆状病毒载体、质粒和非病毒载体。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。
制备本发明CD47抗体的示例性方法描述于实施例1。
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
术语“载体”是指能够运输己与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物或动物细胞(如哺乳动物细胞)。
本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
抗体制剂
抗体在不同的制剂缓冲液中具有不同的稳定性，表现为电荷异质性的变化、抗体分子的降解、聚合等，这些质量性质的变化与抗体本身的理化性质相关，因此，在抗体药物开发过程，需根据不同抗体的理化性质筛选适合其自身的制剂缓冲液。目前常用的抗体制剂缓冲体系有磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、组氨酸缓冲液等，同时根据抗体性质会添加不同浓度的盐离子或山梨醇、海藻糖、蔗糖等赋形剂，以及适量的吐温20或吐温80等表面活性剂，以维持抗体的稳定性。
本发明的抗体药物组合制剂可有效抑制本发明人源化抗体的聚集沉淀、水解、氧化及脱酰胺等副反应，同时能有效提高产品在加压(高温、强光照射及冻融等)、加速及长期冷藏条件下的稳定性。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明的药物组合物可直接用于结合CD47蛋白分子，因而可用于预防和治疗CD47相关的疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
本发明的主要优点包括
(1)与现有技术相比，本发明的抗人CD47抗体与肿瘤细胞表面CD47蛋白的结合选择性更强，并且对红细胞没有凝集作用，更具安全性。
(2)本发明提供的CD47抗体能特异性结合人CD47蛋白并更高效的阻断其与SIRPα的结合，从而因此阻断CD47对表达SIRPα的巨噬细胞的抑制作用。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明要保护的CDR序列(见表1)：
表1.汇总的CDR(kabat定义)表
Figure BDA0003268530360000231
注：X1/X2/X3的组合不同时为T/T/P。
表2.本发明抗体的VH-CDR的SEQ ID NO.序列编号
Figure BDA0003268530360000232
Figure BDA0003268530360000241
实施例中涉及的抗体序列见表3，其中母本序列中绿色标示的是的CDR序列(kabat定义)。突变抗体序列中红色标注的为突变位点(Kabat定义)。
表3实施例抗体序列
Figure BDA0003268530360000242
实施例1：CD47单克隆抗体CDR氨基酸的突变和抗体表达
根据中国专利(CN202010240238.7)公开的CD47单抗(参见表2的C4序列，即母本抗体)，选择该抗体的CDR部分氨基酸位点进行随机突变。
将编码母本和突变型CD47抗体的重链和轻链cDNA序列连接在编码信号肽的序列之后，分别克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.4上。将重链表达质粒和轻链表达质粒按2：1的摩尔比用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)转染入HEK293细胞，并在37℃、5％二氧化碳条件下培养7天。收集培养液上清，并用Protein A亲和层析法提纯上清中的抗体。纯化后的抗体经PBS溶液透析和冷冻干燥浓缩后，保存于-20℃。
实施例2：抗体与CD47蛋白的结合ELISA实验
将浓度为1μg/mL的人CD47蛋白溶液以100μL/孔包被96孔高亲和力板，4℃，振荡过夜。第二天先以300μL PBST(Tween20：0.5‰)洗涤3次，之后用100μL/孔的5％BSA/PBS封闭2小时，室温振荡。300μL PBST洗涤3次。用PBS配制抗体样品的梯度稀释溶液。以100μL/孔加入96孔板，室温振荡1小时。300μLPBST洗涤3次。配制二抗羊抗鼠(goat anti-mouse)IgGHRP或羊抗人(goat anti-human)IgG HRP溶液，以100μL/孔加入96孔板，室温振荡1小时。300μLPBST洗涤4次。加入100μL/孔TMB，显色20min。加入100μL/孔0.6N H2SO4，终止显色，检测OD450 nm。
对实施例1中设计并表达的C4和突变型CD47抗体进行检测，结果发现，突变H-P101D(抗体M7)和H-T64K(抗体M9)可以明显提升抗体与CD47蛋白的结合活性，同时发现突变H-T52R(抗体M8)使得抗体与CD47蛋白结合活性明显弱于C4抗体(图1A)。据此，对H-T52位点进行的进一步的氨基酸替换尝试，将其分别替换为S、L、I、H、A、G、N或Q，结果发现，H-T52G(抗体M15)突变亦可以明显提升抗体与CD47蛋白的结合能力(图1B)。
进一步的，在上述发现的活性增强型突变的基础上，发明人进一步设计了含多个突变组合的抗体M22(H-T64K/H-P101D)和M25(H-T64K/H-P101D/H-T52G)，用实施例1中所述方法表达提纯。经检测，结果发现抗体M22和M25亦较对照的野生型抗体C4的活性有所提高。
实施例3：抗体抑制A549细胞与SIRPα蛋白的结合
A549是高表达CD47的人源肺癌肿瘤细胞。首先，本申请发明人使用流式细胞术验证了A549细胞上的CD47表达。用PBS配制抗人CD47检测抗体(eBioscience，17-0479-42)和APC isotype(eBioscience，17-4714-41)，anti-huIgG 633(life technologies，A21091)的浓度梯度溶液，配制成终浓度的2×工作液。收集A549细胞，PBS洗涤一遍后分别计数，稀释成4*106/ml细胞悬液；分别取50μL抗体工作液加入50μL细胞悬液中，4℃避光孵育30min；PBS洗两遍后加入对应的荧光标记二抗(anti-huIgG 633)，4℃避光孵育30min，PBS洗涤两次后，以400μL FACS buffer悬起，以流式细胞仪检测抗体与细胞的结合情况。结果显示A549细胞均为CD47阳性的细胞(图2)
当把A549细胞与SIRPa蛋白共孵育，SIRPa可以与A549上表达的CD47蛋白结合，而加入CD47抗体有可能抑制这种结合作用。为检测抗体对CD47-SIRPα的结合阻断作用，用PBS配制抗体的浓度梯度溶液，配制成终浓度的2×工作液。收集A549细胞，离心后重悬于培养基中，调整密度至4*106/ml，取50μL抗体工作液加入50μL细胞悬液中，4℃避光孵育30min；PBS洗两遍后加入100μL 4μg/ml SIRPα-mFc(AcroBiosystems)或PBS，4℃孵育30min；PBS洗两遍后加入对应的荧光标记二抗，4℃避光孵育30min，PBS洗涤两次后，以400μL FACSbuffer悬起，以流式细胞仪检测抗体与细胞的结合情况。
如图3所示，本发明的抗体可以有效抑制CD47-SIRPα的结合。其中，M7、M9和M22的抑制IC50数值明显小于C4。且在高浓度时M7、M9、M22和M25对A549细胞上的CD47-SIRPα结合的抑制程度，较C4更为显著(表4)。
表4抗体抑制A549细胞CD47-SIRPα结合的FACS数据(MFI)
Figure BDA0003268530360000261
Figure BDA0003268530360000271
实施例4：抗体对人红细胞的凝集作用
本申请发明人检测了C4和各突变型抗体以及阳性对照抗体Hu5F9(美国专利US9017675B2及文献PLoS ONE 2015,10(9):e0137345)与人红细胞的结合以及对人红细胞的凝集作用。
首先从志愿者外周血中分离红细胞，用生理盐水悬成2％浓度红细胞悬液。用PBS配制抗体的浓度梯度溶液，配制成终浓度的2×工作液。取50μL抗体工作液加入50μL红细胞悬液中，置于96孔圆底板，室温静置2h后观察拍照，结果如图4所示。
结果显示，Hu5F9抗体和M25抗体有很强的红细胞凝集效应，而在检测覆盖的在0-150nM浓度范围内，其它受试抗体(M7、M9和M22)均仅有极轻微的红细胞凝集效应。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 优迈生物科技（连云港）有限公司
<120> 一种靶向人CD47的抗体、制备方法和应用
<130> P2021-2286
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Tyr Gly Met Ala
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Thr或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa=Thr或Lys
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)..(3)
<223> The 'Xaa' at location 3 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (16)..(16)
<223> The 'Xaa' at location 16 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 2
Phe Ile Xaa Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa=P或D
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 3
Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Xaa Tyr
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Val Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Arg Ser Thr Phe Pro Pro
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Phe Ile Thr Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Asp Tyr
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Phe Ile Arg Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Phe Ile Thr Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Phe Ile Gly Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Phe Ile Gly Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Thr Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Val
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ile Leu Ile Tyr
35 40 45
Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Phe Pro Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Thr Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Thr Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Gly Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 20
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Thr Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Phe Ile Gly Asn Leu Ala Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Asp Tyr Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115

Claims (10)

1.一种抗人CD47抗体的重链可变区，其特征在于，所述重链可变区包括选自下组的三个互补决定区：
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIX1NLASSIYYADTVX2G(SEQ ID NO.2)
VH-CDR3：AGDYRSFX3Y(SEQ ID NO.3)；
其中，X1＝T、R或G；X2＝T或K；X3＝P或D；
其中，X1、X2和X3各自独立地不同时为T、T和P，
上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留对CD47的结合亲和力的衍生序列。
2.如权利要求1所述的重链可变区，其特征在于，所述重链可变区包括选自下组的三个互补决定区：
(A1)M7
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.7)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A2)M8
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIRNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.10)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A3)M9
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.11)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A4)M15
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.12)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A5)M22
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.11)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A6)M25
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.13)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)。
3.一种抗人CD47抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
4.一种抗人CD47抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)包括以下三个互补决定区CDR的轻链可变区：
VL-CDR1：SASSSVNYVN(SEQ ID NO.4)
VL-CDR2：GISNLAS(SEQ ID NO.5)
VL-CDR3：QQRSTFPP(SEQ ID NO.6)；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留对CD47的结合亲和力的衍生序列。
5.如权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述抗体具有如权利要求3所述的重链；其中所述重链包含的重链可变区具有选自下组的三个互补决定区：
(A1)M7
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.7)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A2)M8
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIRNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.10)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A3)M9
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.11)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A4)M15
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.12)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A5)M22
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.11)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A6)M25
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.13)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；和/或
轻链，所述的轻链包含具有以下三个互补决定区CDR的轻链可变区：
VL-CDR1：SASSSVNYVN(SEQ ID NO.4)
VL-CDR2：GISNLAS(SEQ ID NO.5)
VL-CDR3：QQRSTFPP(SEQ ID NO.6)。
6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1或2所述的重链可变区、如权利要求3所述的重链、如权利要求4或5所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种CAR构建物，其特征在于，所述的CAR构建物的抗原结合结构域的scFv区段特异性结合于人CD47，并且所述scFv区段具有重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区具有选自下组的三个互补决定区：
(A1)M7
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.7)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A2)M8
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIRNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.10)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A3)M9
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.11)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A4)M15
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVTG(SEQ ID NO.12)
VH-CDR3：AGDYRSFPY(SEQ ID NO.8)；
(A5)M22
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FITNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.11)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；
(A6)M25
VH-CDR1：DYGMA(SEQ ID NO.1)
VH-CDR2：FIGNLASSIYYADTVKG(SEQ ID NO.13)
VH-CDR3：AGDYRSFDY(SEQ ID NO.9)；和/或
所述轻链可变区具有以下三个互补决定区：
VL-CDR1：SASSSVNYVN(SEQ ID NO.4)
VL-CDR2：GISNLAS(SEQ ID NO.5)
VL-CDR3：QQRSTFPP(SEQ ID NO.6)。
8.一种重组的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求7所述的CAR构建物。
9.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求4所述的抗体、或如权利要求6所述的重组蛋白、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、酶、或其组合。
10.一种活性成分的用途，其特征在于，所述活性成分选自下组：如权利要求4所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白、如权利要求7所述的CAR构建物、如权利要求8所述的重组的免疫细胞、如权利要求9所述的抗体药物偶联物、或其组合，其特征在于，所述活性成分用于
(a)制备检测试剂或试剂盒；
(b)制备预防和/或治疗人CD47相关疾病的药物或制剂；和/或
(c)制备预防和/或治疗人CD47相关的癌症或肿瘤的药物或制剂。
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