CN112094349B - 靶向于白介素36r的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了靶向于白介素36R的抗体及其制备方法和应用。具体地，本发明提供了高亲和力高生物活性的IL‑36R抗体，所述抗体能够与IL‑36R高亲和力结合，并且能够阻断IL‑36R配体（α、β、γ）与IL‑36R结合，阻断IL‑36R配体激活的信号通路，从而治疗和/或预防IL‑36相关疾病。

Description

靶向于白介素36R的抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药领域，更具体地涉及靶向于白介素36R的抗体及其制备方法和应用。
背景技术
IL-1受体家族成员(IL1R)包含至少11个成员，其中包括IL1RI(IL1R1)、IL1RII(IL1R2)、IL1RAcP(IL1R3)、ST2(T1/IL1R4)、IL18Ra(IL1Rrp/IL1R5)、IL1Rrp2(IL1RL2/IL1R6/IL-36R)、IL18Rb (AcPL/IL1R7)、IL1RAPL1(TIGIRR2/ IL1R8)、和TIGIRR1(IL1R9)。IL-36R可识别3个不同的激活配体细胞因子，IL36α，IL36β，IL36γ（也被称为IL-1F6、IL-1F8、IL-1F9），引发炎症细胞因子的表达。并有2个天然拮抗剂IL-36Ra（IL-1F5）和IL-38,他们与IL-36R结合后会抑制炎症细胞因子的表达。
IL-36R在肺上皮细胞、脑血管细胞、肾、睾丸、单核细胞、皮肤衍生的角质细胞、成纤维细胞和内皮细胞上表达。IL-36R由细胞膜外配体结合结构域、跨膜螺旋和细胞内信号转导Toll/IL-1受体结构域（Toll/IL-1 receptor domain，TIR结构域）组成。IL-36α、IL-36β、IL-36γ首先与IL-36R结合，使其与IL-1RAcP形成信号转导复合体，然后募集髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88），激活由c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinases，JNK）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated proteinkinases，ERK1/2）介导的丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）和核因子Kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）途径，产生大量炎症介质，进而介导炎症反应，在适应性免疫中发挥重要作用。IL-36Ra与IL-36R的结合不会导致IL-1RAcP的募集，促炎性级联反应未开启，实现了IL-36Ra的抗炎特性。在正常人体中，IL-36α、IL-36β、IL-36γ介导的信号激活作用和IL-36Ra介导的信号抑制作用为平衡状态，当IL-36Ra发生基因突变时，会导致其抑制功能失活，打破平衡状态，发生炎症疾病。
IL-36细胞因子参与了某些严重的银屑病，包括泛发性脓疱性银屑病（GPP）和掌跖脓疱病（PPP）。GPP是一种严重的全身型类型脓疱型银屑病，具有致死性。PPP是慢性的影响手掌和脚掌的脓疱型银屑病。目前针对GPP和PPP的治疗方法包括口服类视黄醇和外用类固醇，但是治疗疗效差并有严重副作用。
因此，本领域仍需要能够与IL-36R高亲和力结合，并且能够阻断IL-36α、IL-36β、IL-36γ与IL-36R结合的抗IL-36R抗体，用于治疗GPP、PPP等IL-36相关疾病。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向于白介素36R的抗体及其制备方法和应用。
具体地，本发明的目的在于提供一种高亲和力高生物活性的IL-36R抗体及其应用，能够与IL-36R高亲和力结合，并且能够阻断IL-36α、IL-36β、IL-36γ与IL-36R结合。
本发明的另一目的在于提供一种白介素36R结合分子及其用途，特别是在治疗和/或预防、或诊断IL-36相关疾病如银屑病中的用途。
本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:3所示的CDR1，
SEQ ID NO:4所示的CDR2，和
SEQ ID NO:5所示的CDR3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留IL-36R结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:6所示的CDR1’，
SEQ ID NO:7所示的CDR2’，和
SEQ ID NO:8所示的CDR3’。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能够保留IL-36R结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO: 10、11或12所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1) 如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
(2) 如本发明第三方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述抗体与人IL-36R蛋白(优选野生型)结合的亲和力常数KD（M）为(0.5-10)×10-11，较佳地为(1-6)×10-11，更佳地为(1-2)×10-11。
在另一优选例中，所述抗体与对人IL-1 Rrp2结合的亲和力常数KD（M）为(0.5-10)×10-11，较佳地为(1-6)×10-11，更佳地为(1-2)×10-11。
在另一优选例中，所述抗体能够阻断IL-36α，IL-36β，IL-36γ与IL-36R的结合。
在另一优选例中，所述抗体能够阻断IL-36α，IL-36β，IL-36γ介导的细胞因子分泌，较佳地，所述细胞因子包括：IL-6,IL-8,GM-CSF。
在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：1或9所示；和/或
所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：2、10、11或12所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：9所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：10、11或12所示。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i) 如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；以及
(ii) 任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
本发明的第七方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的单克隆抗体抗原结合区域的scFV段为特异性结合于IL-36R的结合区，并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的重链可变区和如本发明第三方面所述的轻链可变区。
本发明的第八方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第七方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
本发明的第九方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：
(a) 抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、或其组合；和
(b) 与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
本发明的第十方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合，所述活性成分用于(a)制备检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗IL-36相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述IL-36相关疾病是由IL-36介导的炎症疾病。
在另一优选例中，所述IL-36相关疾病是由IL-36细胞因子的过度刺激或突变引起的疾病。
在另一优选例中，所述IL-36相关疾病选自下组：炎症、自身免疫疾病、或其组合；优选地为自身免疫疾病。
在另一优选例中，所述的IL-36相关疾病选自下组：银屑病、硬皮病、慢性肾病、发炎性肠疾病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化症、炎性关节炎、哮喘、过敏、或其组合，优选地为银屑病。
在另一优选例中，所述的银屑病包括寻常型银屑病、红皮病型银屑病、关节病型银屑病、泛发性脓疱型银屑病（GPP）、掌跖脓疱型银屑病（PPP）。
在另一优选例中，所述药物用于阻断IL-36α，IL-36β，IL-36γ与IL-36R的结合。
在另一优选例中，所述药物用于阻断IL-36α，IL-36β，IL-36γ介导的细胞因子分泌。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
在另一优选例中，所述的检测试剂或试剂盒用于诊断IL-36相关疾病。
在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于检测样品中IL-36R蛋白。
在另一优选例中，所述的检测试剂为检测片。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i) 活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、如本发明第八方面所述的免疫细胞、如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii) 药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
本发明的第十二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1) 如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；或
(2) 如本发明第六方面所述的重组蛋白；
(3) 如本发明第七方面所述的CAR构建物。
本发明的第十三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第十四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第十二方面所述的多核苷酸。
本发明的第十五方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中IL-36R蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1) 在体外，将所述样品与如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、接触；
(2) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在IL-36R蛋白。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断非治疗的。
本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第九方面所述的抗体药物偶联物。
本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1) 第一容器，所述第一容器中含有如本发明第五方面所述的抗体；和/或
(2) 第二容器，所述第二容器中含有抗如本发明第五方面所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有如本发明第十六方面所述的检测板。
本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：
(a) 在适合表达的条件下，培养如本发明第十四方面所述的宿主细胞；
(b) 从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第六方面所述的重组蛋白。
本发明的第十九方面，提供了一种预防和/或治疗IL-36相关疾病的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明第五方面所述的抗体、所述抗体的抗体-药物偶联物、或表达所述抗体的CAR-T细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的方法还包括：给需要的对象施用其他药物或治疗方法进行联合治疗。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了人源化候选抗体生物活性检测-细胞因子IL-6释放结果。
图2显示了人源化候选抗体生物活性检测-细胞因子IL-8释放结果。
图3显示了人源化候选抗体生物活性检测-细胞因子GM-CSF释放结果。
图4显示了人源化候选抗体生物活性检测-NF-κB磷酸化结果。
图5显示了候选抗体和人IL-36R的细胞结合活性。
图6显示了候选抗体和猴IL-36R的细胞结合活性。
图7显示了候选抗体对huIL-36刺激因子在NCI/ADR-RES细胞的功能抑制作用。
图8显示了候选抗体对huIL-36刺激因子在HIF细胞的功能抑制作用。
图9显示了候选抗体对huIL-36刺激因子在HIF细胞的功能抑制作用。
图10显示了候选抗体对huIL-36刺激因子在HIF细胞的功能抑制作用。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，意外地获得了高亲和力高生物活性的IL-36R抗体。实验表明，本发明的IL-36R抗体能够与IL-36R高亲和力结合，并且能够阻断IL-36R配体（α、β、γ）与IL-36R结合，阻断IL-36R配体激活的信号通路，从而治疗和/或预防IL-36相关疾病。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括IL-36R抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种IL-36R抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
抗体
如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的不同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。IgG代表免疫球蛋白中最重要的一类，由于化学结构和生物功能差异，它又可以分为4个子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的FR区(FR)。4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区，即轻链高变区(LCDR),指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区，即重链高变区(HCDR),指HCDR1、HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。天然重链和轻链可变区中的四个FR区大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染宿主细胞表达的抗体分子。既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，又使其人源Fc段能有效介导生物学效应功能。
如本文所用，术语“人源化抗体”，是本发明鼠抗的一种可变区改造形式，具有源自(或基本上源自)非人类抗体(优选小鼠单克隆抗体)的CDR区，和基本源自人源抗体序列的FR区和恒定区；即将鼠抗的CDR区序列嫁接到不同类型的人种系抗体构架序列上。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体性质的重组抗体。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表 A
Figure DEST_PATH_IMAGE001
抗IL-36R抗体
如本文所用，术语“IL-36R”一般是指天然的或重组的人IL-36R，以及人IL-36R的非人同源物。除非另有指示，否则使用IL-36R的同源二聚体的分子量计算IL-36R的摩尔浓度。
本发明提供一种针对IL-36R的高特异性和高亲和力的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
优选地，重链可变区(VH)的CDR选自下组：
SEQ ID NO:3所示的CDR1，
SEQ ID NO:4所示的CDR2，和
SEQ ID NO:5所示的CDR3；和/或
轻链可变区(VL)的CDR选自下组：
SEQ ID NO:6所示的CDR1’，
SEQ ID NO:7所示的CDR2’，和
SEQ ID NO:8所示的CDR3’。
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-5、1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸的具有IL-36R结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80%，较佳地至少85%，更佳地至少为90%，最佳地至少95%的氨基酸序列。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向人IL-36R的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO：3、4和5中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有IL-36R结合亲和力的序列，位于重链可变区(VH)的CDR区。
在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO：6、7和8中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有IL-36R结合亲和力的序列，位于轻链可变区(VL)的CDR区。
在本发明的一种更优选实施例中，VH CDR1、CDR2、CDR3分别独立地选自SEQ IDNO：3、4和5中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有IL-36R结合亲和力的序列；VL CDR1、CDR2、CDR3分别独立地选自SEQ ID NO：6、7和8中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有IL-36R结合亲和力的序列。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40%，更优选为不超过35%，更优选为1-33%，更优选为5-30%，更优选为10-25%，更优选为15-20%。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
抗体的制备
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的抗IL-36R抗体。例如，可以用连接或天然存在的IL-36R同源二聚体或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。
任何合适形式的IL-36R都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对IL-36R特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。激发免疫原可以是全长的成熟人IL-36R，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体、质料和非病毒载体。
生产本发明的抗人IL-36R抗体的示例性方法描述于实施例1。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明中，抗体是IgG抗体，使用IgG1亚型。通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体易于实现必需恒定结构域序列的最优化，以产生所需生物学活性。
同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。
人源化本发明的抗人IL-36R抗体的示例性方法描述于实施例2。
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、CHO-K1、HEK-293细胞。
本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)。
典型地，所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子，所述抗体与所述效应分子偶联，并优选为化学偶联。其中，所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外，所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连，其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团)，诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素)，稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物，检测试剂，稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地，ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解，例如在目标位点处接头发生降解，从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括，例如酶降解的接头，其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头，或者糖接头例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括，例如二肽，例如缬氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括，例如，pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头，例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
连接到抗体之前，接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团，连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的，并包括：例如马来酰亚胺类化合物，卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；卤代酯(例如碘、溴或氯代的)；卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环，而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根；和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括，例如，通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
药物可以是任何细胞毒性，抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中，接头连接抗体和药物，而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如，药物可以具有可以和连接物成键的氨基，羧基，巯基，羟基，或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下，药物在连接到抗体之前，具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括，例如，抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。在本发明中，药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中，双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如，半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应，并且在随后的步骤中，接头上的功能性基团与药物反应，从而形成ADC。
通常，选择接头上功能性基团，以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子，基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成，从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括，例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应)，膦(适合与叠氮反应)；异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应)；和活化的酯类，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略，例如在《生物偶联技术》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解，对于药物部分和接头的选择性反应，当选择了一个互补对的反应活性功能基团时，该互补对的每一个成员既可以用于接头，也可以用于药物。
本发明还提供了制备ADC的方法，可进一步地包括：将抗体与药物-接头化合物，在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
在某些实施方式中，本发明方法包括：在足以形成抗体-接头偶联物的条件下，将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中，本发明方法还进一步地包括：在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下，将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
在一些实施方式中，抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：
Figure 951565DEST_PATH_IMAGE002
其中：
Ab是抗体，
LU是接头；
D是药物；
而且下标p是选自1到8的值。
应用
本发明提供了本发明抗体的用途，例如用于制备诊断制剂、或制备用于预防和/或治疗IL-36相关疾病的药物。所述IL-36相关疾病包括炎症疾病、自身免疫疾病等，包括但不限于银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化症，炎性肠病(如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎等)、骨关节炎、类风湿性关节炎(RA)、风湿性关节炎或骨质疏松症、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化和硬化)、哮喘(包括变应性哮喘)、变态反应以及癌症。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明的药物组合物可直接用于结合IL-36R蛋白分子，因而可用于预防和治疗IL-36相关疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%，更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
本发明的主要优点包括：
(a) 本发明抗体具有优异的生物活性和特异性。
(b) 与鼠源抗体和嵌合抗体相比，本发明人源化抗体在保留与IL-36R相当的亲合力的同时，具有更低的免疫原性。
(c) 本发明抗体对IL-36R的阻断可以显著抑制患者炎症因子表达通路。
(d) 本发明抗体与某些非人哺乳动物(如猴)的IL-36R有与人IL-36R相当的亲和力，便于在动物模型中进行测试和进行质控检测。
(e) 本发明抗体通过与IL-36R结合阻断IL-36α、IL-36β、IL-36γ与IL-36R结合的激活信号通路，减少炎症细胞因子（如IL-6、IL-8、GM-CSF）
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1 产生鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备
制备鼠源单克隆抗体的方法采用Kohler和Milstein 1975年发明的杂交瘤制备技术(Nature，1975，256：495-497)。首先将人IL-36R带有鼠Fc标签蛋白(ACRO，#IL2-H5254)与弗氏佐剂乳化，然后对多个品系小鼠进行免疫。四轮免疫后取血清用ELISA法检测效价，挑选最佳小鼠取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。经过HAT筛选杂交瘤多克隆细胞，对多克隆培养上清进行人IL-36R、猴IL-36R、人IL1R1的结合活性检测，以及多克隆抗体对IL-36刺激因子的功能抑制作用检测。挑选最佳多克隆进行单克隆化，同样对单克隆进行结合活性以及功能活性的筛选，并通过Biacore方法检测亲和力，最终将挑选出的最佳杂交瘤单克隆细胞株进行序列分析。
表1. 杂交瘤筛选部分数据
Figure DEST_PATH_IMAGE003
如表1所示，经过大量杂交瘤筛选，杂交瘤6(1)-B8，111(1)-E5抗体表达上清在细胞结合水平与人IL-36R、猴IL-36R蛋白均有很高的结合活性，与人IL1R1蛋白无特异性结合，并对IL-36刺激因子（IL-36α，IL-36β，IL-36γ）的刺激产生的细胞因子有明显的功能阻断作用。
实施例2 抗IL-36R抗体可变区基因序列克隆以及人源化
2.1 杂交瘤细胞中抗体的可变区基因克隆
基于TAKARA的5’RACE技术原理，克隆出由杂交瘤细胞株表达的小鼠抗体可变区的cDNA序列。简言之，用SMARTer 5’RACE合成试剂盒(TAKARA，货号634859)按说明书合成重链和轻链的可变区基因特异性cDNA。用PCR引物修饰cDNA序列的5’和3’端，所述引物设计成为分别在重链和轻链可变区cDNA上增加合适的前导序列，使所得PCR产物能够通过无缝克隆的方法克隆到现有重组抗体表达的重链载体pHB-Fc和轻链载体pHB-Cκ上。pHB-Fc表达载体上含有人IgG1重链恒定区基因序列，其中CH2上带有抗体ADCC效应弱化的L234A和L235A（Eunumbering）突变；pHB-Cκ载体上含有人κ轻链恒定区基因序列。将重链和轻链可变区PCR扩增产物通过In-fusion克隆试剂（TAKARA,货号639650）克隆到表达载体上，获得人鼠嵌合抗体表达载体，并转化到E.coli DH5α大肠杆菌感受态细胞(益生生技，货号 FYE607-80VL)中。通过挑选单克隆菌落进行Sanger测序，经分析获得抗体可变区序列。
结果获得抗IL-36R嵌合抗体（华博编号900497），其轻链来源于实施例1中的杂交瘤6（1）-B8，重链来源于实施例1中的杂交瘤111（1）-E5，其可变区序列如下所示：
900497 HCVR SEQ ID NO：1
QVQLQQTGSVLVRPGTSVKLSCKASGYTFTSSWMHWAKQRPGQGLEWIGEIHPNSAKTNYNEKFKGKATLTVDTFSSTAYVDLSSLASEDSAVYYCARVDYGKPWFAYWGQGTLVTVSA
900497 LCVR SEQ ID NO：2
QIVLTQSPTIMSASPGERVTMTCSASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTINSMEAEDAATYYCQQFQSSPLTFGAGTKLGLK
其中，下划线区为CDRs(IMGT定义，单列如下)：
表2 鼠源抗IL-36R抗体CDR序列
Figure 603126DEST_PATH_IMAGE004
2.2 嵌合抗体的表达
2.1中所得表达载体经过大肠杆菌扩增，用去内毒素质粒抽提试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，货号DP117）制备足量质粒，用于瞬时转染表达嵌合抗体。表达所用的宿主细胞为CHO-S细胞(赛默飞，货号R80007)。通过将制备所得的两种重链载体分别和轻链载体一起，与聚醚酰亚胺(PEI，Polysciences，货号24765-1)混合形成脂质体复合物后，转染CHO-S细胞，放入二氧化碳摇床中培养5-7天。离心收集细胞培养液上清，通过Protein A亲和层析柱纯化得到人鼠嵌合抗体。
2.3 鼠源抗人IL-36R抗体的人源化——人源化抗体的制备方法
抗体的人源化采用以下方法：将嵌合抗体（华博编号900497）的可变区序列与NCBIIgBlast数据库中的可用序列比较，通过鉴定和分析，最终确定了适合在其上构建CDR移植重链和轻链的人源构架区（FR区）。
改造时，根据人抗体FR区保守的氨基酸残基以及抗体FR区中重要的氨基酸残基，设计改造位点，对嵌合抗体的重轻链的可变区分别进行人源化突变设计，利用PCR技术扩增并构建人源化点突变抗体表达质粒。将人源化点突变抗体表达质粒分别经CHO-S细胞表达，纯化后得到人源化抗体蛋白。利用Biacore和细胞生物活性等检测方法，对人源化抗体的亲和力，激活细胞因子释放等指标进行筛选，获得了三个性能优异的人源化抗IL-36R抗体。所获得人源化抗IL-36R抗体的编号为900513、900527和900534，其VH和VL序列下所示：
900513、900527和900534 HCVR SEQ ID NO：9
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSSWMHWAKQAPGQGLEWIGEIHPNSAKTNYNQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARVDYGKPWFAYWGQGTLVTVSS
900513 LCVR SEQ ID NO：10
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLWIYSTSNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFATYYCQQFQSSPLTFGQGTKLEIK
900527 LCVR SEQ ID NO：11
QIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLWIYSTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFATYYCQQFQSSPLTFGQGTKLEIK
900534 LCVR SEQ ID NO：12
QIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFATYYCQQFQSSPLTFGQGTKLEIK
其中，下划线区为CDRs(IMGT定义)，900513，900527和900534分别为三个人源化抗体蛋白编号。人源化抗体900513，900527和900534的CDR区与嵌合抗体900497的CDR区相同,人源化抗体的FR区在嵌合900497的基础上进行了突变。
实施例3 抗人IL-36R人源化抗体生物活性检测
3.1 Biacore（SPR）检测抗体亲和力
试验材料与仪器如下：
His标记的人IL-1 Rrp2/IL-1 R6蛋白（Human IL-1 Rrp2/IL-1 R6 Protein, HisTag），ACRO Biosystems，IL2-H52H6
HBS-EP+（10X），GE，BR-1006-69
Series S Sensor Chip CM5，GE，29-1275-56
His Capture Kit，GE，28995056
BIACORE，GE，Biacore 8K
pH1.5 甘氨酸溶液，GE,BR100354
试验方法如下：
Sereis S Sensor Chip CM5芯片室温平衡20-30min，将芯片装入仪器。按照HisCapture Kit说明书固定anti-His抗体到Series S Sensor Chip CM5芯片上。HBS-EP+（10X）溶液超纯水稀释10倍作为运行缓冲液(Running Buffer)。利用运行缓冲液将抗原(His标记的人IL-1 Rrp2/IL-1 R6蛋白)稀释至1μg/ml，10μL/min，注入15秒，捕获抗原50RU左右。利用平衡缓冲液将抗体样品稀释至30nM，15nM，7.5nM，3.75nM，1.875nM，0.9375nM，0.46875nM；运行缓冲液作为零浓度；30μL/min，结合120s，解离900s；pH1.5 甘氨酸溶液再生芯片。采用捕获法单循环动力学程序分析样品，选用对应的分析程序对数据分析，确认无明显参考结合(reference binding)，选用Kinetics，1:1结合型(binding modle)，拟合分析，获得样品的动力学参数。
表3 候选抗人IL-36R人源化抗体的亲和力测定
Figure 117284DEST_PATH_IMAGE005
注：900389为BI研发的抗人IL-36R抗体，由华博根据专利（WO2013/074569A1）中记载的序列合成可变区基因，自主表达而得。具体地，900389的重链可变区为WO2013/074569A1中SEQ ID NO: 89所示的81B4vH33_90vH，900389的轻链可变区为WO2013/074569A1中SEQ ID NO: 77所示的81B4vK32_105vK，81B4vH33_90vH和81B4vK32_105vK均是在鼠源抗体81B4基础上进行人源化改造获得的；900389的恒定区与本申请候选抗体相同。
各人源化抗体与人IL-1 Rrp2结合的亲和力常数（KD（M））如表3所示。结果显示，本发明人源化单克隆抗体的亲和力接近10-11数量级，具有极强的亲和力。
3.2 抗人IL-36R抗体对huIL-36刺激因子的功能抑制作用检测
将人卵巢癌细胞系NCI/ADR-RES以每孔100μL(每孔细胞数4.5×104个)加入96孔细胞培养板，37℃，5% CO2孵育过夜，待测样品系列稀释后50μL/孔加入，37℃，5% CO2孵育15min，分别将配体huIL-36α（1μg/mL）、huIL-36β（80ng/mL）、huIL-36γ（120ng/mL）以50μL/孔加入，充分混匀后，37℃，5% CO2培养18-24h。离心取细胞培养上清，用Biolegend ELISA试剂盒检测：huIL-6（1:100稀释，货号430503）、huIL-8（1:5稀释，货号431503）和huGM-CSF（1:2稀释，货号432003）。检测huIL-36β刺激作用下，NCI/ADR-RES细胞内NF-κB的激活作用：将配体huIL-36β稀释至240ng/mL，加入与待测抗体预孵过的细胞中，37℃，5% CO2孵育30min。离心取出上清，将细胞裂解后取裂解液用试剂盒（Cisbio，货号64NFBPEG）进行NF-κB磷酸化检测。
表4 人源化候选抗体生物活性检测结果
Figure 512493DEST_PATH_IMAGE006
结果如图1-图4和表4所示，人源化抗体900513,900527,900534对人的刺激因子IL-36α，IL-36β，IL-36γ的功能具有显著的阻断作用，能够显著阻断细胞因子IL-6、IL-8、GM-CSF的分泌和NF-κB的磷酸化。
实施例4
嵌合抗体和人源化抗体的非特异性结合实验(SPR)
本试验使用SPR方法测定抗体与非靶标分子的非特异吸附效应，试验中使用的仪器设备和试剂材料如表5和表6所示。
表5 仪器设备
名称 厂家 型号 编号
Biacore GE Biacore 8K 1305
表6 试剂材料：
名称 厂家/来源 货号 批号
Series S Sensor Chip CM5 GE BR-1005-30 10253038
来自鸡蛋的溶菌酶溶液 Sigma L3790 SLBM3565V
来自大豆的胰蛋白酶抑制剂1-S型 Sigma T-2327 SLBJ6832V
多克隆兔抗溶菌酶 ABcam Ab391 GR215714-19
抗胰蛋白酶抑制剂抗体 LifeSpan Biosciences LS-C76609 26978
将Series S Sensor Chip CM5(GE，#BR-1005-30)芯片置于室温平衡20～30min，装入Biacore 8K(GE)仪器。采用氨基偶联试剂盒(GE，#BR-1000-50)将来自鸡蛋的溶菌酶溶液(Sigma，#L3790)和来自大豆的胰蛋白酶抑制剂1-S型 (Sigma，#T-2327)分别固定到CM5芯片。进样缓冲液为HBS-EP(1X)(GE，#BR-1006-69)，设置4个平衡循环。用平衡缓冲液分别将多克隆兔抗溶菌酶(ABcam，Ab391)，抗胰蛋白酶抑制剂抗体(Anti-trypsin inhibitorantibody, LifeSpan Biosciences，#LS-C76609)，嵌合抗体和人源化抗体稀释至1000nM，设置流速5μL/min，进样通道1，2和3，Flow Cell 1和2。结合时间10min，解离时间15min。再生流速50μL/min，先用0.85%磷酸溶液(ProteOn，176-2260)再生60s，再用50mM氢氧化钠溶液再生30s。
其中，样品900389为BI研发的抗人IL-36R人源化抗体，由华博根据专利合成可变区基因，自主表达而得。样品900497为华博杂交瘤筛选构建的抗IL-36R嵌合抗体。
结果表明如表7所示，900389与来自鸡蛋的溶菌酶溶液的结合信号大于20RU，因而认为有非特异性的静电和疏水结合作用。900497与来自鸡蛋的溶菌酶溶液和来自大豆的胰蛋白酶抑制剂1-S型的结合信号均小于20，因此可以认为无非特异性的静电和疏水结合作用。
表7 样品非特异性结合量比较
Name 溶菌酶 (RU) 胰蛋白酶抑制剂 (RU) 去活化羧甲基葡聚糖 (RU) 羧甲基葡聚糖(RU)
缓冲液 24.0 12.9 16.2 14.0
多克隆兔抗溶菌酶 9316.9 32.2 34.3 27.7
抗胰蛋白酶抑制剂抗体 65.1 6259.1 36.8 22.5
900389 55.0 27.5 16.3 14.2
900497 24.3 16.7 16.4 14.4
注：一般认为扣除Buffer的影响后，响应值在20RU以下相互作用较弱，可以忽略；超过20RU即认为有明显的相互作用；100RU以上则是很强的相互作用。
实施例5
稳定细胞株抗体的细胞结合和功能实验
将BI对照序列900389，华博筛选的人源化序列900527,TNP IgG1（ATCC KO）900543分别插入华博GS载体，构建重组表达质粒并分别转染CHO-K1细胞进行稳定细胞株的构建。华博900527构建的稳定细胞株蛋白编号为HB0034，筛选的单克隆细胞株经过上游工艺优化后表达量超过4g/L。将稳转细胞株表达的抗体纯化后进行流式细胞结合实验和功能实验检测。样品900543为TNP IgG1（ATCC KO）阴性对照抗体。
稳定细胞株抗体的流式细胞结合实验
将稳定细胞株抗体进行人IL-36R、猴IL-36R的结合活性检测，流式检测细胞株为华博内部构建的表达人IL-36R、猴IL-36R的CHO-K1细胞株。
检测结果如表8和图5、图6所示。
表8 抗体和人IL-36R、猴IL-36R的结合活性检测
Figure DEST_PATH_IMAGE007
结果显示，华博单克隆抗体HB0034和人IL-36R,猴IL-36R均有很高的结合活性。相较于阳性对照900389抗体，本发明抗体的EC50值更低，具有与人IL-36R更强的结合活性。
稳定细胞株抗体对huIL-36刺激因子的功能抑制作用检测实验
5.2.1抗体对huIL-36刺激因子在NCI/ADR-RES细胞的功能抑制作用
将人卵巢癌细胞系NCI/ADR-RES以每孔100μL(每孔细胞数4.5×104个)加入96孔细胞培养板，37℃，5% CO2孵育过夜，待测样品系列稀释后50μL/孔加入，37℃，5% CO2孵育15min，将配体huIL-36β（40ng/mL）以50μL/孔加入，充分混匀后，37℃，5% CO2培养18-24h。离心取细胞培养上清，用HTRF试剂盒(Cat#62HIL06PEG，CISBIO)检测huIL-6。
结果如表9和图7所示。
表9 抗体对huIL-36刺激因子在NCI/ADR-RES细胞的功能抑制作用
Figure 61286DEST_PATH_IMAGE008
结果显示，稳定细胞株人源化抗体HB0034对人的刺激因子IL-36β的功能具有显著的阻断作用，能够显著阻断细胞因子IL-6的分泌。相较于阳性对照900389抗体，本发明抗体的IC50值更低，具有更强的阻断作用。
5.2.2抗体对huIL-36刺激因子在HIF细胞的功能抑制作用
将HIF（Human Intestinal Fibroblasts）细胞用Serum Starvd 培养基将细胞制备成4.5E5/ml 细胞悬液，每孔100ul（45000个细胞）加入96wp,孵育过夜。抗体系列稀释后加入50ul/孔，37℃孵育15min。IL-36α稀至1000ng/ml,每孔加50ul，充分混合。37℃，5%CO2培养4h，离心收集上清，检测人IL-6的含量。IL-36β稀至80ng/m,每孔加50ul，充分混合。37℃，5%CO2培养4h，离心收集上清，检测人IL-6的含量。IL-36β稀至40ng/m,每孔加50ul，充分混合。37℃，5%CO2培养20min，利用试剂盒检测pNFκB的含量。
结果如表10和图8，表11和图9，表12和图10。
表10 抗体对huIL-36刺激因子在HIF细胞的功能抑制作用
Figure 618170DEST_PATH_IMAGE009
表11 抗体对huIL-36刺激因子在HIF细胞的功能抑制作用
Figure 885203DEST_PATH_IMAGE010
表12 抗体对huIL-36刺激因子在HIF细胞的功能抑制作用
Figure 818524DEST_PATH_IMAGE011
结果显示，稳定细胞株人源化抗体HB0034对人的刺激因子IL-36α，IL-36β的功能具有显著的阻断作用，能够显著阻断细胞因子IL-6的分泌和NF-κB的磷酸化。相较于阳性对照900389抗体，本发明抗体的IC50值更低，具有更强的阻断作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海华奥泰生物药业股份有限公司
华博生物医药技术（上海）有限公司
<120> 靶向于白介素36R的抗体及其制备方法和应用
<130> P2020-1203
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Thr Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asn Ser Ala Lys Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Phe Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Asp Tyr Gly Lys Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gln Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Gly Leu Lys
100 105
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile His Pro Asn Ser Ala Lys Thr
1 5
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Arg Val Asp Tyr Gly Lys Pro Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Thr Ser
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Gln Phe Gln Ser Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Ala Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His Pro Asn Ser Ala Lys Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Asp Tyr Gly Lys Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gln Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gln Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gln Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (18)

1.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1) 重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:3所示的CDR1，
SEQ ID NO:4所示的CDR2，和
SEQ ID NO:5所示的CDR3；和
(2) 轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:6所示的CDR1’，
SEQ ID NO:7所示的CDR2’，和
SEQ ID NO:8所示的CDR3’。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，且所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示；或者
所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：9所示，且所述抗体的轻链可变区序列如SEQID NO：10、11或12所示。
4.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i) 如权利要求1所述的抗体；以及
(ii) 任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
5.一种CAR构建物，其特征在于，所述的CAR构建物的单克隆抗体抗原结合区域的scFv段为特异性结合于IL-36R的结合区，
并且，所述scFv的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:3所示的CDR1，
SEQ ID NO:4所示的CDR2，和
SEQ ID NO:5所示的CDR3；和
所述scFv的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:6所示的CDR1’，
SEQ ID NO:7所示的CDR2’，和
SEQ ID NO:8所示的CDR3’。
6.一种重组的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求5所述的CAR构建物。
7.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：
(a) 抗体部分，所述抗体部分为如权利要求1所述的抗体；和
(b) 与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、酶、或其组合。
8.如权利要求7所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的可检测标记物包括放射性核素。
9.一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求4所述的重组蛋白、如权利要求5所述的CAR构建物、如权利要求6所述的免疫细胞、如权利要求7所述的抗体药物偶联物、或其组合，其特征在于，所述活性成分用于(a)制备检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗IL-36相关疾病的药物，
其中，所述的IL-36相关疾病为自身免疫疾病，
并且，所述的IL-36相关疾病选自下组：银屑病、硬皮病、慢性肾病、发炎性肠疾病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化症、炎性关节炎、哮喘、过敏、肺纤维化和硬化、或其组合。
10.如权利要求9所述用途，其特征在于，所述的发炎性肠疾病包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：
(i) 活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求4所述的重组蛋白、如权利要求5所述的CAR构建物、如权利要求6所述的免疫细胞、如权利要求7所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii) 药学上可接受的载体。
12.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码如权利要求1所述的抗体、如权利要求4所述的重组蛋白、或如权利要求5所述的CAR构建物。
13.一种载体，其特征在于，所述的载体含有如权利要求12所述的多核苷酸。
14.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求13所述的载体或基因组中整合有如权利要求12所述的多核苷酸。
15.一种非诊断性体外检测样品中IL-36R蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1) 在体外，将所述样品与如权利要求1所述的抗体或如权利要求7所述的抗体药物偶联物、接触；
(2) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在IL-36R蛋白。
16.一种检测板，其特征在于，所述的检测板包括：基片和测试条，所述的测试条含有如权利要求1所述的抗体或如权利要求7所述的抗体药物偶联物。
17.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1) 第一容器，所述第一容器中含有如权利要求1所述的抗体；和
(2) 第二容器，所述第二容器中含有针对如权利要求1所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有如权利要求16所述的检测板。
18.一种重组多肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(a) 在适合表达的条件下，培养如权利要求14所述的宿主细胞；
(b) 从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如权利要求1所述的抗体或如权利要求4所述的重组蛋白。
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