KR20230098606A - 인터루킨 36r을 표적으로 하는 항체 및 이의 제조 방법과 용도 - Google Patents

인터루킨 36r을 표적으로 하는 항체 및 이의 제조 방법과 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인터루킨 36R을 표적으로 하는 항체 및 이의 제조 방법과 용도를 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 높은 친화도 및 높은 생체 활성을 갖는 IL-36R 항체를 제공하며, 상기 항체는 IL-36R에 높은 친화도로 결합할 수 있고, IL-36R 리간드(α, β, γ)의 IL-36R에 대한 결합을 차단할 수 있고, IL-36R 리간드에 의해 활성화된 신호 경로를 차단함에 따라, IL-36 관련 질병을 치료 및/또는 예방한다.

Description

인터루킨 36R을 표적으로 하는 항체 및 이의 제조 방법과 용도
본 발명은 생물의학 분야에 관한 것이며, 구체적으로 인터루킨 36R을 표적으로 하는 항체 및 이의 제조 방법과 용도에 관한 것이다.
IL-1 수용체 계열 구성원(IL1R)은 적어도 11개 구성원을 포함하며, 여기서 IL1RI（IL1R1）, IL1RII（IL1R2）, IL1RAcP（IL1R3）, ST2（T1/IL1R4）, IL18Ra（IL1Rrp/IL1R5）, IL1Rrp2(IL1RL2/IL1R6/IL-36R), IL18Rb （AcPL/IL1R7）, IL1RAPL1（TIGIRR2/ IL1R8）, 및 TIGIRR1(IL1R9)을 포함한다. IL-36R은 염증성 사이토카인의 발현을 유도하는 3개의 상이한 활성화 리간드 사이토카인 IL36α, IL36β, IL36γ(IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9으로도 불린다)를 인식할 수 있다. 또 IL-36R에 결합된 후 염증성 사이토카인의 발현을 억제할 수 있는 2개의 천연 길항제 IL-36Ra(IL-1F5) 및 IL-38이 있다.
IL-36R은 폐상피세포, 뇌혈관세포, 신장, 고환, 단핵세포, 피부 유래 각질세포, 섬유아세포 및 내피세포에서 발현된다. IL-36R은 세포막 외부 리간드 결합 도메인, 막횡단 나선 및 세포내 신호 전달 Toll/IL-1 수용체 도메인(Toll/IL-1 receptor domain，TIR 도메인)으로 구성된다. IL-36α, IL-36β, IL-36γ는 먼저 IL-36R에 결합하여 IL-1RAcP와 신호 전달 복합체를 형성한 후, 골수분화인자88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)를 모집하여 c-Jun 아미노 말단 키나아제(c-Jun N-terminal kinases，JNK) 및 세포외 조절 단백질 키나아제(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)에 의해 매개되는 미토겐 활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinases，MAPK) 및 핵인자 Kappa B(nuclear factor kappa B，NF-Κb) 경로를 활성화하여, 다수의 염증 매개체를 생성하고, 나아가 염증 반응을 매개하여 적응면역에서 중요한 역할을 한다. IL-36Ra의 IL-36R에 대한 결합은 IL-1RAcP의 모집으로 이어지지 않고, 전염증성 캐스케이드 반응이 개시되지 않고, IL-36Ra의 항염증성 특성이 구현된다. 정상적 인체에서, IL-36α, IL-36β, IL-36γ가 매개하는 신호 활성화 작용 및 IL-36Ra가 매개하는 신호 억제 작용은 균형 상태이며, IL-36Ra에 유전자 돌연변이가 발생하면, 이의 억제 기능이 불활성화되어 평형 상태가 깨지고, 염증성 질환이 발생한다.
IL-36 사이토카인은 전신 농포성 건선(GPP) 및 손발바닥 농포증(PPP)을 포함하는 특정 중증 건선에 관여한다. GPP는 치명적인 농포성 건선의 심각한 전신 유형이다. PPP는 손바닥과 발바닥에 영향을 미치는 만성 농포성 건선이다. 현재 GPP 및 PPP에 대한 치료법은 경구 레티노이드 및 외용 스테로이드가 포함되지만, 치료 효과가 낮고 심각한 부작용이 있다.
따라서, 당업계는 GPP, PPP 등의 IL-36 관련 질병의 치료를 위해, IL-36R에 고친화도로 결합할 수 있고, IL-36R에 대한 IL-36α, IL-36β, IL-36γ의 결합을 억제할 수 있는 항체가 여전히 필요하다.
본 발명의 목적은 인터루킨 36R을 표적으로 하는 항체 및 이의 제조 방법과 용도를 제공하는 데 있다.
구체적으로는, 본 발명의 목적은 IL-36R에 고친화도로 결합할 수 있고, IL-36α, IL-36β, IL-36γ의 IL-36R에 대한 결합을 차단할 수 있는, 높은 친화도 및 높은 생체 활성의 IL-36R 항체 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 특히 건선과 같은 IL-36 관련 질병의 치료 및/또는 예방, 또는 진단에 있어서 인터루킨 36R 결합분자 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 제1 측면에서, 항체의 중쇄 가변 영역을 제공하고, 상기 중쇄 가변 영역은 하기 3개의 상보성 결정 영역 CDR을 포함한다.
서열번호 3으로 표시되는 CDR1,
서열번호 4로 표시되는 CDR2, 및
서열번호 5로 표시되는 CDR3.
특정 실시 양태에서, 상기 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열은 선택적으로 하나 이상의(예를 들어 1개 내지 3개, 1개 내지 2개 일 수 있고, 1개일 수 있다) 아미노산이 추가, 결실, 변형 및/또는 치환되고 IL-36R 결합 친화성을 유지할 수 있는 유도체 서열을 더 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 중쇄 가변 영역은 인간 FR 영역 또는 뮤린 FR 영역을 더 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시 양태에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다
본 발명의 제2 측면에서, 항체의 중쇄를 제공하며, 상기 중쇄는 본 발명의 제1 측면의 상기 중쇄 가변 영역을 갖는다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체의 중쇄는 중쇄 불변 영역을 더 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간, 뮤린 또는 토끼 유래이다.
본 발명의 제3 측면에서, 항체의 경쇄 가변 영역을 제공하며, 상기 경쇄 가변 영역은 하기 3개의 상보성 결정 영역 CDR을 포함한다.
서열번호 6으로 표시되는 CDR1',
서열번호 7로 표시되는 CDR2', 및
서열번호 8로 표시되는 CDR3'.
특정 실시 양태에서, 상기 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열은 선택적으로 하나 이상의(예를 들어 1개 내지 3개, 1개 내지 2개 일 수 있고, 1개일 수 있다) 아미노산이 추가, 결실, 변형 및/또는 치환되고 IL-36R 결합 친화성을 유지할 수 있는 유도체 서열을 더 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 경쇄 가변 영역은 인간 FR 영역 또는 뮤린 FR 영역을 더 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시 양태에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 10, 11 또는 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제4 측면에서, 항체의 경쇄를 제공하며, 상기 경쇄는 본 발명의 제3 측면의 상기 경쇄 가변 영역을 갖는다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체의 경쇄는 경쇄 불변 영역을 더 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 경쇄 불변 영역은 인간, 뮤린 또는 토끼 유래이다.
본 발명의 제5 측면에서, 항체를 제공하며, 상기 항체는 하기를 포함한다.
(1) 본 발명의 제1 측면의 상기 중쇄 가변 영역, 및/또는
(2) 본 발명의 제3 측면의 상기 경쇄 가변 영역,
또는, 상기 항체는, 본 발명의 제2 측면의 상기 중쇄, 및/또는 본 발명의 제4 측면의 상기 경쇄를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 인간 IL-36R 단백질(예를 들어 야생형일 수 있다)에 결합하는 상기 항체의 친화도 상수 KD（M）는 （0.5-10）Х10-11이며, （1-6）Х10-11일 수 있고, （1-2）Х10-11일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 인간 IL-1 Rrp2에 결합하는 상기 항체의 친화도 상수 KD（M）는（0.5-10）Х10-11이며, （1-6）Х10-11일 수 있고, （1-2）Х10-11일 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체는 IL-36α, IL-36β, IL-36γ의 IL-36R에 대한 결합을 차단할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체는 IL-36α, IL-36β, IL-36γ에 의해 매개되는 사이토카인의 분비를 차단할 수 있고, 상기 사이토카인은 IL-6, IL-8, GM-CSF를 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체는 동물 유래 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체는 이중사슬 항체, 또는 단일사슬 항체이다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체는 부분적으로 또는 완전히 인간화된 단일클론 항체이다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 1 또는 9로 표시된다, 및/또는
상기 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 2, 10, 11 또는 12로 표시된다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 1로 표시되며, 상기 항체의 경체 가변 영역 서열은 서열번호 2로 표시된다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 9로 표시되며, 상기 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 10, 11 또는 12로 표시된다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체는 약물 접합체 형태이다.
본 발명의 제6 측면에서, 재조합 단백질을 제공하며, 상기 재조합 단백질은 하기를 포함한다.
(i) 본 발명의 제1 측면의 상기 중쇄 가변 영역, 본 발명의 제2 측면의 상기 중쇄, 본 발명의 제3 측면의 상기 경쇄 가변 영역, 본 발명의 제4 측면의 상기 경쇄, 또는 본 발명의 제5 측면의 상기 항체, 및
(ii) 발현 및/또는 정제를 돕기 위한 선택적 태그 서열.
특정 실시 양태에서, 상기 태그 서열은 6His 태그를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 재조합 단백질(또는 폴리펩티드)은 융합 단백질을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 재조합 단백질은 단량체, 이량체, 또는 다량체이다.
본 발명의 제7 측면에서, CAR 작제물을 제공하며, 상기 CAR 작제물의 단일클론 항체 항원 결합 영역의 scFV 세그먼트는 IL-36R에 특이적으로 결합하는 결합 영역이고, 상기 scFv는 본 발명의 제1 측면의 상기 중쇄 가변 영역 및 본 발명의 제3 측면의 상기 경쇄 가변 영역을 갖는다.
본 발명의 제8 측면에서, 재조합 면역 세포를 제공하며, 상기 면역 세포는 본 발명의 제7 측면의 상기 외인성 CAR 작제물을 발현한다.
특정 실시 양태에서, 상기 면역 세포는 NK 세포, T 세포로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시 양태에서, 상기 면역 세포는 인간 또는 비인간 포유동물(예를 들어 마우스)로부터 유래된다.
본 발명의 제9 측면에서, 항체-약물 접합체를 제공하며, 상기 항체-약물 접합체는 하기를 포함한다.
(a) 본 발명의 제1 측면의 상기 중쇄 가변 영역, 본 발명의 제2 측면의 상기 중쇄, 본 발명의 제3 측면의 상기 경쇄 가변 영역, 본 발명의 제4 측면의 상기 경쇄, 또는 본 발명의 제5 측면의 상기 항체, 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 항체 모이어티, 및
(b) 검출 가능한 표지, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소, 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 상기 항체 모이어티와 접합되는 접합 모이어티.
특정 실시 양태에서, 상기 항체 모이어티는 화학 결합 또는 링커를 통해 상기 접합 모이어티에 접합된다.
본 발명의 제10 측면에서, 활성 성분의 용도를 제공하며, 상기 활성 성분은, 본 발명의 제1 측면의 상기 중쇄 가변 영역, 본 발명의 제2 측면의 상기 중쇄, 본 발명의 제3 측면의 상기 경쇄 가변 영역, 본 발명의 제4 측면의 상기 경쇄, 또는 본 발명의 제5 측면의 상기 항체, 본 발명의 제6 측면의 상기 재조합 단백질, 본 발명의 제8 측면의 상기 면역 세포, 본 발명의 제9 측면의 상기 항체-약물 접합체, 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되며, 상기 활성 성분은 (a) 검출 제제 또는 키트의 제조, 및/또는 (b) IL-36 관련 질병을 예방 및/또는 치료하는 약제의 제조에 사용된다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-36 관련 질병은 IL-36에 의해 매개되는 염증성 질병이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-36 관련 질병은 IL-36 사이토카인의 과도한 자극 또는 돌연변이에 의해 발생하는 질병이다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-36 관련 질병은, 염증, 자가면역 질환, 또는 예를 들어 자가면역 질환일 수 있는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시 양태에서, 상기 IL-36 관련 질병은 건선, 경피증, 만성 신장 질환, 염증성 장 질환, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 염증성 관절염, 천식, 알레르기, 또는 예를 들어 건선일 수 있는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시 양태에서, 상기 건선은 심상성 건선, 홍피성 건선, 관절성 건선, 전신 농포성 건선(GPP), 손발바닥 농포성 건선(PPP)을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 약제는 IL-36α, IL-36β, IL-36γ의 IL-36R에 대한 결합을 차단하는 데 사용된다.
특정 실시 양태에서, 상기 약제는 IL-36α, IL-36β, IL-36γ에 의해 매개되는 사이토카인의 분비를 차단하는 데 사용된다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체는 약물 접합체(ADC) 형태이다.
특정 실시 양태에서, 상기 검출 제제 또는 키트는 IL-36 관련 질병을 진단하는 데 사용된다.
특정 실시 양태에서, 상기 검출 제제 또는 키트는 샘플에서 IL-36 단백질을 검출하는 데 사용된다.
특정 실시 양태에서, 상기 검출 제제는 검출 시트이다.
본 발명의 제11 측면에서, 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은 하기를 포함한다.
(i) 본 발명의 제1 측면의 상기 중쇄 가변 영역, 본 발명의 제2 측면의 상기 중쇄, 본 발명의 제3 측면의 상기 경쇄 가변 영역, 본 발명의 제4 측면의 상기 경쇄, 또는 본 발명의 제5 측면의 상기 항체, 본 발명의 제6 측면의 상기 재조합 단백질, 본 발명의 제8 측면의 상기 면역 세포, 본 발명의 제9 측면의 상기 항체-약물 접합체, 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 활성 성분, 및
(ii) 제약상 허용되는 벡터.
특정 실시 양태에서, 상기 약학적 조성물은 액체 제제이다.
특정 실시 양태에서, 상기 약학적 조성물은 주사제이다.
본 발명의 제12 측면에서, 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 코딩한다.
(1) 본 발명의 제1 측면의 상기 중쇄 가변 영역, 본 발명의 제2 측면의 상기 중쇄, 본 발명의 제3 측면의 상기 경쇄 가변 영역, 본 발명의 제4 측면의 상기 경쇄, 또는 본 발명의 제5 측면의 상기 항체, 또는
(2) 본 발명의 제6 측면의 상기 재조합 단백질,
(3) 본 발명의 제7 측면의 상기 CAR 작제물.
본 발명의 제13 측면에서, 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 본 발명의 제12 측면의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 벡터는 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스와 같은 포유동물 세포 바이러스, 또는 기타 벡터를 포함한다.
본 발명의 제14 측면에서, 유전자 조작된 숙주 세포를 제공하며, 상기 숙주 세포는 본 발명의 제13 측면의 상기 벡터 또는 게놈에 통합된 본 발명의 제12 측면의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 제15 측면에서, 샘플에서 IL-36R 단백질을 체외 검출(진단성 또는 비진단성 포함)하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다.
(1) 체외에서, 상기 샘플을 본 발명의 제 5 측면의 상기 항체 또는 본 발명의 제9 측면의 상기 항체-약물 접합체와 접촉시키는 단계,
(2) 항원-항체 복합체 형성 여부를 검출하는 단계, 여기서 복합체의 형성은 샘플에 IL-36R 단백질이 존재함을 의미한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은 비진단 및 비치료적이다.
본 발명의 제16 측면에서, 검출 플레이트를 제공하며, 상기 검출 플레이트는 기판(지지판) 및 테스트 스트립을 포함하고, 상기 테스트 스트립은 본 발명의 제5 측면의 상기 항체 또는 본 발명의 제9 측면의 상기 항체-약물 접합체를 포함한다.
본 발명의 제17 측면에서, 키트를 제공하며, 상기 키트는 하기를 포함한다.
(1) 본 발명의 제5 측면의 상기 항체를 포함하는 제1 용기, 및/또는
(2) 본 발명의 제5 측면의 상기 항체에 대한 2차 항체를 포함하는 제2 용기,
또는, 상기 키트는 본 발명의 제16 측면의 상기 검출 플레이트를 포함한다.
본 발명의 제18 측면에서, 재조합 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다.
(a) 발현에 적합한 조건 하에서, 본 발명의 제14 측면의 상기 숙주 세포를 배양하는 단계,
(b) 배양물로부터 재조합 폴리펩티드를 분리하는 단계, 상기 재조합 폴리펩티드는 본 발명의 제5 측면의 상기 항체 또는 본 발명의 제6 측면의 상기 재조합 단백질이다.
본 발명의 제19 측면에서, IL-36 관련 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, 필요한 대상체에게 본 발명의 제5 측면의 상기 항체, 상기 항체의 항체-약물 접합체, 또는 상기 항체를 발현하는 CAR-T 세포, 또는 이의 조합을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 방법은, 병용 요법을 위해 필요한 대상체에게 기타 약제 또는 치료 방법을 투여하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 전술한 각 기술적 특징 및 하기 명세서(예를 들어 실시 예) 중 구체적으로 설명되는 각 기술적 특징 사이는 상호 조합되어 새로운 기술 방안을 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 공간의 제한으로 인해 여기서는 반복 설명하지 않는다.
본 발명과 관련된 구체적 특징은 청구 범위에 설명된 바와 같다. 하기의 상세한 예시적 실시 양태 및 도면을 통해 본 발명과 관련된 특징 및 이점을 보다 잘 이해할 수 있다. 도면에 대한 간략한 설명은 하기와 같다.
도 1은 인간화 후보 항체 생체 활성 검출-사이토카인 IL-6 방출 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 인간화 후보 항체 생체 활성 검출-사이토카인 IL-8 방출 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 인간화 후보 항체 생체 활성 검출-사이토카인 GM-CSF 방출 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 인간화 후보 항체 생체 활성 검출-NF-κB 인산화 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 후보 항체와 인간 IL-36R의 세포 결합 활성를 나타낸 것이다.
도 6은 후보 항체와 원숭이 IL-36R의 세포 결합 활성를 나타낸 것이다.
도 7은 NCI/ADR-RES 세포에서 huIL-36 자극인자에 대한 후보 항체의 기능 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 HIF 세포에서 huIL-36 자극인자에 대한 후보 항체의 기능 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 HIF 세포에서 huIL-36 자극인자에 대한 후보 항체의 기능 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 HIF 세포에서 huIL-36 자극인자에 대한 후보 항체의 기능 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 이미퀴모드에 의해 유도된 건선 사이노몰구스 원숭이 임상 점수(PASI)에 대한 후보 항체의 효과를 나타낸 것이다.
도 12는 이미퀴모드에 의해 유도된 건선 사이노몰구스 원숭이 피부 조직 HE 염색 병리학적 점수에 대한 후보 항체의 효과를 나타낸 것이다.
본 발명의 실시 양태는 특정한 구체적 실시 예를 통해 하기에서 설명되며, 통상의 지식을 가진 자라면 본 명세서의 상기 내용을 통해 본 발명의 기타 이점 및 효과를 쉽게 이해할 수 있다.
용어 정의
본 발명자는 광범위하고 심층적인 연구를 거쳐 뜻밖에 높은 친화도와 높은 생체 활성을 갖는 IL-36R 항체를 수득하였다. 실험에 따르면, 본 발명의 IL-36R 항체는 IL-36R에 높은 친화도로 결합할 수 있고, IL-36R 리간드(α, β, γ)의 IL-36R에 대한 결합을 차단할 수 있고, IL-36R 리간드에 의해 활성화된 신호 경로를 차단함에 따라, IL-36 관련 질병을 치료 및/또는 예방하는 것으로 나타났다. 이를 바탕으로 본 명세서가 작성된다.
용어
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "투여" 및 "처치"는 외인성 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물을 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용하는 것을 의미한다. "투여" 및 "처치"는 치료, 약동학, 진단, 연구 및 실험 방법을 의미할 수 있다. 세포의 처치는 제제와 세포의 접촉, 및 제제와 체액의 접촉, 체액과 세포의 접촉이 포함된다. "투여" 및 "처치"는 또한 제제, 진단, 결합 조성물을 통하거나 또는 다른 세포에 의한 시험관내 및 생체외 처치를 의미한다. "처치"가 인간, 동물 또는 연구 대상체에 적용될 때, 치료적 처치, 예방 또는 예방적 조치, 연구 및 진단을 의미하며, IL-36R 항체의 인간 또는 동물, 대상체, 세포, 조직, 생리학적 구획 또는 생리적 유체에 대한 접촉을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 본 발명의 어느 하나의 IL-36R 항체 및 이의 조성물을 포함하는 내용 또는 외용 치료제를 환자에게 투여하는 것을 의미하며, 상기 환자는 하나 이상의 질병 증상을 가지고 있고, 상기 치료제는 이러한 증상에 치료 효과가 있는 것으로 알려진 것이다. 통상적으로, 하나 이상의 증상을 효과적으로 완화하는 치료제의 양(치료 유효량)으로 환자에게 투여된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "임의로" 또는 "선택적으로"는 후술하는 사건이나 상황이 발생할 수 있지만 반드시 발생할 필요는 없음을 의미한다. 예를 들어, "선택적으로 1개 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함한다"는 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 1개, 2개 또는 3개를 가질 수 있지만 반드시 가질 필요는 없음을 의미한다.
항체
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 두 개의 상동한 중쇄와 두 개의 상동한 경쇄가 사슬간 이황화 결합을 통해 연결된 테트라펩티드 사슬 구조인 면역글로불린을 의미한다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 아미노산 조성과 배열 서열이 다르기 때문에, 이의 항원성도 다르다. 따라서, 면역글로불린은 면역글로불린의 다른 유형으로도 불리는 5가지 범주, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 구분될 수 있으며, 서로 다른 종류의 면역글로불린에 해당되는 중쇄 불변 영역을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다. IgG는 면역글로불린의 가장 중요한 유형을 나타내며, 화학적 구조와 생물학적 기능의 차이로 인해 4개의 하위 클래스 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나눌 수 있다. 경쇄는 불변 영역의 차이를 통해 κ 또는 λ 사슬로 분류된다. 상이한 유형의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 당업자에게 널리 알려진 것이다.
N-말단 근처의 항체 중쇄 및 경쇄 약 110개 아미노산 서열 변화가 큰 부위는 가변 영역(V 영역)이고, C-말단 근처의 나머지 아미노산 서열이 상대적으로 안정된 부위는 불변 영역(C 영역)이다. 가변 영역은 3개의 고변이 영역(HVR) 및 4개의 상대적으로 보존적인 FR 영역(FR)을 포함한다. 4개 FR의 아미노산 서열은 상대적으로 비교적 보존적으로 결합 반응에 직접 관여하지 않는다. 3개의 고변이 영역은 항체의 특이성을 결정하므로, 상보성 결정 영역(CDR)으로도 불린다. 각 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 중쇄 가변 영역(HCVR)은 3개의 CDR 영역 및 4개의 FR 영역으로 구성됨에 따라, 아미노 말단부터 카르복실 말단까지 순차적인 배열 순서는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4이다. 경쇄의 3개 CDR 영역, 즉 경쇄 고변이 영역(LCDR)은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 의미하고, 중쇄의 3개 CDR 영역, 즉 중쇄 고변이 영역(HCDR)은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 의미한다. 본 발명의 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 LCVR 및 HCVR 영역의 CDR 아미노산 잔기는 수량 및 위치에서 이미 공개된 Kabat 넘버링 시스템(LCDR1-3，HCDR2-3)을 준수하거나, 또는 kabat 및 chothia의 넘버링 시스템(HCDR1)을 준수한다. 천연 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중 4개의 FR 영역은 대략적으로 β-병풍 구조이고, 연결 루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결되며, 특정 경우에서 일부 β 병풍 구조를 형성할 수 있다. 각 사슬 중의 CDR은 FR 영역을 통해 밀착되어 또 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. 동일 유형 항체의 아미노산 서열을 비교하여 FR 또는 CDR 영역을 구성하는 아미노산을 결정할 수 있다. 불변 영역은 항체의 항원에 대한 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체의 항체 의존성 세포 독성에 관여하는 것과 같이 상이한 이펙터 기능을 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결합 단편"은 항원 결합 활성을 갖는 Fab 단편, Fab' 단편, F（ab'）2 단편, 또는 단일 Fv 단편을 의미한다. Fv 항체는 항체 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 없고, 모든 항원 결합 부위의 가장 작은 항체 단편을 갖는다. 일반적으로, Fv 항체는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 더 포함하고, 항원 결합에 필요한 구조를 형성할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결정기"는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 인식되는 항원 상의 불연속되는 3차원 공간 부위를 의미한다.
본 발명은 완전한 항체를 포함하고, 또한 면역학적 활성 항체의 단편 또는 항체 및 기타 서열에 의해 형성된 융합 단백질을 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 항체의 단편, 유도체 및 유사체를 더 포함한다.
본 발명에서, 항체는 당업자에게 알려진 기술을 사용해 제조된 뮤린, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체를 포함한다. 인간 및 비인간 부분을 포함하는 키메라 및 인간화 단일클론 항체와 같은 재조합 항체는 당업계에 널리 알려진 DNA 재조합 기술을 사용해 제조할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 단일 세포 유래 클론으로부터 분비된 항체를 의미한다. 단일클론 항체는 단일 항원 에피토프에 대해 매우 특이적이다. 상기 세포는 진핵, 원핵 또는 박테리오파지의 클론 세포주일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 뮤린 유래 항체의 V 영역 유전자와 인간 항체의 C 영역 유전자를 키메라 유전자로 스플라이싱한 후, 벡터에 삽입하여 숙주 세포에 의해 발현되는 항체 분자를 형질감염시킨 것이다. 부모 뮤린 항체의 높은 특이성과 친화도를 유지하고, 또 이의 인간 Fc 세그먼트가 생물학적 이펙터 기능을 효과적으로 매개할 수 있게 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는, 비인간 항체(예를 들어 마우스 단일클론 항체일 수 있다)로부터 유래된(또는 실질적으로 유래된) CDR 영역, 및 기본적으로 인간 항체 서열로부터 유래된 FR 영역 및 불변 영역을 갖는 본 발명의 뮤린 항체의 가변 영역의 조작 형태, 즉 뮤린 항체 CDR 영역 서열을 상이한 유형의 인간 생식계열 항체 프레임워크 서열에 이식한 것이다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 발현 벡터의 구성을 통해 특정 자연 발생 항체 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명에서, 항체는 단일 특이성, 이중 특이성, 삼중 특이성, 또는 그 이상의 다중 특이성일 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 항체는 이의 보존적인 변이체를 더 포함하며, 이는 본 발명의 항체의 아미노산 서열과 비교해 최대 10개이고, 최대 8개일 수 있고, 최대 5개일 수 있고, 최대 3개의 아미노산이 특성이 유사하거나 비슷한 아미노산으로 치환되어 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 이러한 보존적 변이 폴리펩티드는 바람직하게는 표 A에 따라 아미노산 치환에 의해 생성된다.
Figure pct00001
항-IL-36R 항체
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "IL-36R"은 일반적으로 천연 또는 재조합 인간 IL-36R, 및 인간 IL-36R의 비인간 상동체를 의미한다. 별도로 명시되지 않는 한, IL-36R의 동종이량체의 분자량을 사용하여 IL-36R의 몰 농도를 계산한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 IL-36R에 대한 고특이성 및 고친화성 항체를 제공하며, 상기 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함한다.
예를 들어, 중쇄 가변 영역(VH)의 CDR은,
서열번호 3으로 표시되는 CDR1,
서열번호 4로 표시되는 CDR2, 및
서열번호 5로 표시되는 CDR3으로 구성된 군에서 선택된다, 및/또는
경쇄 가변 영역(VL)의 CDR은,
서열번호 6으로 표시되는 CDR1',
서열번호 7로 표시되는 CDR2', 및
서열번호 8로 표시되는 CDR3'으로 구성된 군에서 선택된다.
여기서, 상기 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열은 하나 이상의(예를 들어 1개 내지 5개, 1개 내지 3개, 1개 내지 2개 일 수 있고, 1개일 수 있다) 아미노산이 추가, 결실, 변형 및/또는 치환된 IL-36R 결합 친화성을 유지할 수 있는 유도체 서열을 더 포함한다.
특정 실시 양태에서, 추가, 결실, 변형 및/또는 치환된 상기 하나 이상의 아미노산 서열에 의해 형성되는 서열 상동성은 적어도 80%일 수 있고, 적어도 85%일 수 있고, 적어도 90%일 수 있고, 적어도 95%의 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명의 항체는 이중사슬 또는 단일사슬 항체일 수 있고, 동물 유래 항체, 키메라 항체, 인간화 항체로부터 선택될 수 있으며, 인간화 항체, 인간-동물 키메라 항체일 수 있고, 완전 인간화 항체일 수 있다.
본 발명의 상기 항체 유도체는 단일사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', （Fab'）2 또는 당업계에 알려진 기타 항체 유도체 등과 같은 항체 단편, 및 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체 또는 기타 서브타입 항체 중 어느 하나 이상일 수 있다.
여기서, 상기 동물은 마우스와 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 항체는 인간 IL-36R을 표적으로 하는 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, CDR 이식 및/또는 변형된 항체일 수 있다.
특정 경우에서, 상기 서열번호 3, 4 및 5 중 어느 하나 이상의 서열, 또는 하나 이상의 아미노산이 추가, 결실, 변형 및/또는 치환된 IL-36R 결합 친화성을 갖는 이들의 서열은 중쇄 가변 영역(VH)의 CDR 영역에 위치한다.
특정 경우에서, 상기 서열번호 6, 7 및 8 중 어느 하나 이상의 서열, 또는 하나 이상의 아미노산이 추가, 결실, 변형 및/또는 치환된 IL-36R 결합 친화성을 갖는 이들의 서열은 경쇄 가변 영역(VL)의 CDR 영역에 위치한다.
특정 경우에서, VH CDR1, CDR2, CDR3은 각각 독립적으로 서열번호 3, 4 및 5 중 어느 하나 이상의 서열, 또는 하나 이상의 아미노산이 추가, 결실, 변형 및/또는 치환된 IL-36 결합 친화성을 갖는 이들의 서열로부터 선택된다. VL CDR1, CDR2, CDR3은 각각 독립적으로 서열번호 6, 7, 및 8 중 어느 하나의 서열, 또는 하나 이상의 아미노산이 추가, 결실, 변형 및/또는 치환된 IL-36R 결합 친화성을 갖는 서열로부터 선택된다.
본 발명의 상기 내용에서, 상기 추가, 결실, 변형 및/또는 치환된 아미노산 수량은, 예를 들어 초기 아미노산 서열 전체 아미노산 수량의 40% 이하일 수 있고, 35% 이하일 수 있고, 1% 내지 33%일 수 있고, 5% 내지 30%일 수 있고, 10% 내지 25%일 수 있고, 15% 내지 20%일 수 있다.
본 발명에서, 상기 추가, 결실, 변형 및/또는 치환된 아미노산 수량은 통상적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개이고, 1개 내지 3개일 수 있고, 1개 내지 2개일 수 있고, 1개일 수 있다.
항체의 제조
단일클론 항체를 생성하기에 적합한 임의의 방법은 모두 본 발명의 항-IL-36 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 연결되거나 또는 자연적으로 존재하는 IL-36R 동종이량체 또는 이의 단편을 사용해 동물을 면역화할 수 있다. 보조제, 면역 자극제, 반복적 추가 면역 접종을 포함하는 적절한 면역 접종 방법을 사용할 수 있고, 하나 이상의 접근 방법을 사용할 수 있다.
임의의 적합한 형태의 IL-36R은 모두 IL-36R에 대해 특이적인 비인간 항체를 생성하고 상기 항체의 생체 활성을 스크리닝하는 데 사용되는 면역원(항원)으로 사용될 수 있다. 유도 면역원은 천연 동종이량체, 또는 단일/다중 에피토프를 함유한 펩티드를 포함하는 전장의 성숙한 인간 IL-36R일 수 있다. 면역원은 단독으로 사용되거나, 또는 당업계에 공개된 하나 이상의 면역원성 증강제와 조합하여 사용할 수 있다. 면역원은 천연 공급원에서 정제되거나, 또는 유전자 변형된 세포에서 생성될 수 있다. 면역원을 코딩하는 DNA는 공급원에서 게놈이거나 또는 비-게놈(예를 들어, cDNA)일 수 있다. 적합한 유전 벡터를 사용해 면역원을 코딩하는 DNA를 발현할 수 있으며, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 플라스미드 및 비-바이러스 벡터를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명의 항-인간 IL-36R 항체를 생산하는 예시적인 방법은 실시 예 1에 설명된다.
인간화 항체는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 종류에서 선택될 수 있다. 본 발명에서, 항체는 IgG 항체이고, IgG1 서브타입이 사용된다. 하기 실시 예의 상기 생물학적 검정을 사용해 항체를 스크리닝함으로써 필요한 불변 도메인 서열의 최적화를 구현하여 필요한 생체 활성을 생성할 수 있다.
마찬가지로, 임의의 유형의 경쇄는 모두 본 명세서의 화합물 및 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, κ, λ 사슬 또는 이의 변이체는 본 발명의 화합물 및 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 항-인간 IL-36R 항체를 인간화하는 예시적인 방법은 실시 예 2에 설명된다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편 DNA 분자의 서열은 PCR 증폭 또는 게놈 라이브러리 스크리닝 등과 같은 일반적인 기술을 사용해 수득될 수 있다. 또한, 경쇄 및 중쇄의 코딩 서열은 하나로 융합되어 단일 사슬 항체를 형성할 수 있다.
관련 서열이 수득되면, 재조합 방법을 사용해 관련 서열을 대량으로 얻을 수 있다. 일반적으로 이를 벡터에 클로닝하고 세포에 이식한 후, 종래의 방법을 통해 증식된 숙주 세포로부터 분리해 관련 서열을 얻는다.
또한, 특히 단편 길이가 비교적 짧을 때, 인공 합성 방법을 사용해 관련 서열을 합성할 수도 있다. 일반적으로, 먼저 복수의 작은 단편을 합성한 후, 연결하면 매우 긴 서열의 단편을 얻을 수 있다. 그 다음 그 DNA 서열을 당업계에 공지된 다양한 종래의 DNA 분자(또는 예를 들어, 벡터) 및 세포에 도입할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 적합한 DNA 서열 및 적합한 프로모터 또는 조절 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 적합한 숙주 세포가 단백질을 발현할 수 있도록 형질 전환하는 데 사용될 수 있다.
숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포, 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포, 또는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다. 동물 세포는 CHO-S, CHO-K1, HEK-293 세포를 포함할 수 있다(단 이에 국한되지 않는다).
본 발명의 상기 재조합 DNA로 숙주 세포를 형질 전환시키는 단계는 당업계에 공지된 기술을 사용할 수 있다. 수득된 형질 전환체는 통상적인 방법에 의해 배양될 수 있고, 형질 전환체는 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현한다. 사용하는 숙주 세포에 따라 일반적인 배지를 사용해 적절한 조건에서 배양된다.
일반적으로, 본 발명의 항체 발현에 적합한 조건 하에서, 형질 전환된 숙주 세포를 배양한다. 그후 단백질 A-Sepharose, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피 등 당업자에 익숙한 분리 및 정제 방법과 같은 일반적인 면역글로불린 정제 단계를 사용해 본 발명의 항체를 얻는다.
수득된 단일클론 항체는 통상적인 방법으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역 침전 또는 체외 결합 분석(예를 들어, 방사선 면역 측정 분석(RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)에 의해 측정될 수 있다.
항체-약물 접합체(ADC)
본 발명은 본 발명의 항체를 기반으로 하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate，ADC)를 더 제공한다.
일반적으로는, 상기 항체-약물 접합체는 상기 항체, 및 이펙터 분자를 포함하며, 상기 항체와 상기 이펙터 분자의 결합은, 화학적 커플링일 수 있다. 여기서, 상기 이펙터 분자는 치료 활성을 갖는 약물일 수 있다. 또한, 상기 이펙터 분자는 독소 단백질, 화학요법 약물, 소분자 약물 또는 방사성 핵종 중의 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 항체와 상기 이펙터 분자 사이는 커플링제를 통해 커플링될 수 있다. 상기 커플링제의 예로는 비선택적 커플링제, 카르복실기를 이용한 커플링제, 펩티드 사슬, 이황화 결합을 이용한 커플링제 중 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 비선택적 커플링제는 글루타르알데히드와 같이 이펙터 분자와 항체가 공유결합을 형성하도록 연결되는 화합물을 말한다. 상기 카르복실기를 이용한 커플링제는 시스-아코니틱 무수물 유형 커플링제(예를 들어 시스-아코니틱 무수물), 아실 하이드라존 유형 커플링제(커플링 부위는 아실 하이드라존임) 중 어느 하나 이상일 수 있다.
항체 상의 특정 잔기(예를 들어 Cys 또는 Lys 등)는 다양한 작용기와 연결하는 데 사용되며, 여기에는 이미징 제제(예를 들어 발색단 및 형광단), 진단 제제(예를 들어 MRI 조영제 및 방사성 동위원소), 안정제(예를 들어 에틸렌 글리콜 중합체) 및 치료제를 포함한다. 항체는 기능성 제제에 접합되어 항체-기능성 제제 접합체를 형성할 수 있다. 기능성 제제(예를 들어 약물, 검출 제제, 안정제)는 항체에 접합(공유결합)된다. 기능성 제제는 직접적, 또는 링커를 통해 간접적으로 항체에 부착될 수 있다.
항체는 약물에 접합되어 항체-약물 접합체(ADCs)를 형성할 수 있다. 일반적으로는, ADC는 약물과 항체 사이에 위치하는 링커를 포함한다. 링커는 분해성 또는 비분해성 링커일 수 있다. 분해성 링커는 예를 들어 표적 부위에서 링커가 분해됨에 따라 약물이 항체로부터 방출되는 것과 같이 일반적으로 세포내 환경에서 분해되기 쉽다. 적합한 분해성 링커는, 예를 들어 효소 분해성 링커를 포함하며, 여기에는 세포내 프로테아제(예를 들어 리소좀 프로테아제 또는 엔도솜 프로테아제)에 의해 분해될 수 있는 펩티딜 함유 링커, 또는 예를 들어 글루쿠로니다아제에 의해 분해될 수 있는 글루쿠로나이드 함유 링커와 같은 당 링커가 포함된다. 펩티딜 링커는, 예를 들어 발린-시트룰린, 페닐알라닌-리신 또는 발린-알라닌과 같은 디펩티드를 포함할 수 있다. 다른 적합한 분해성 링커는, 예를 들어 pH 민감성 링커(예를 들어, pH가 5.5 미만일 때 가수분해되는 링커, 예를 들어 히드라존 링커) 및 환원 조건 하에서 분해되는 링커(예를 들어, 디설파이드 링커)를 포함한다. 비분해성 링커는 일반적으로 항체가 프로테아제에 의해 가수분해되는 조건에서 약물을 방출한다.
링커가 항체에 부착되기 전, 링커는 특정 아미노산 잔기와 반응할 수 있는 활성 반응기를 가지며, 활성 반응기를 통해 부착이 구현된다. 설프하이드릴기 특이적 활성 반응기는, 예를 들어 말레이미드 화합물, 할로겐 치환 아미드(예를 들어 요오드, 브로모 또는 클로로 치환); 할로겐 치환 에스테르(예를 들어 요오도, 브로모 또는 클로로 치환); 할로겐 치환 메틸 케톤(예: 요오도, 브로모 또는 클로로 치환), 벤질 할라이드(예를 들어 요오도, 브로모 또는 클로로 치환); 비닐 술폰, 피리딜 디설파이드; 예를 들어 3,6-비스-(머큐리 메틸)디옥산과 같은 수은 유도체를 포함할 수 있으며, 반대 이온은 아세테이트, 클로라이드 또는 니트레이트; 및 폴리메틸렌 디메틸 설파이드 티오설포네이트이다. 링커는, 예를 들어 티오석신이미드를 통해 항체에 부착된 말레이미드를 포함할 수 있다.
약물은 임의의 세포 독성, 세포 증식 억제 또는 면역 억제 약물일 수 있다. 실시 양태에서, 링커는 항체와 약물을 접합시키며, 약물은 링커와 결합을 형성할 수 있는 작용기를 가질 수 있다. 예를 들어, 약물은 링커와 결합을 형성할 수 있는 아미노, 카르복실, 설프하이드릴, 히드록실 또는 케토 그룹을 가질 수 있다. 약물이 링커에 직접 부착되는 경우, 약물은 항체에 부착되기 전에 활성 반응기를 갖는다.
유용한 약물 카테고리는, 예를 들어, 항튜불린 약물, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제, 항생제, 엽산 길항제, 항대사제, 화학 감작제, 토포이소머라아제 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다. 본 발명에서, 약물-링커는 간단한 단계로 ADC를 형성하는 데 사용될 수 있다. 기타 실시 양태에서, 이기능성 링커 화합물은 2단계 또는 다단계 방법으로 ADC를 형성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기가 제1 단계에서 링커의 활성 모이어티와 반응하고, 후속 단계에서, 링커 상의 작용기가 약물과 반응하여 ADC를 형성한다.
통상적으로, 링커 상의 작용기는 특이적으로 약물 모이어티 상의 적합한 반응 활성기와 반응이 용이하도록 선택된다. 비제한적 예로서, 아지드화물 기반 모이어티는 특이적으로 약물 모이어티 상의 반응성 알키닐 그룹과 반응하는 데 사용될 수 있다. 약물은 아지드와 알키닐 사이의 1,3-쌍극자 고리 첨가를 통해 링커에 공유결합된다. 다른 유용한 작용기는, 예를 들어 케톤 및 알데하이드(히드라지드 및 알콕시아민과의 반응에 적합하다), 포스핀(아지드와의 반응에 적합하다), 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트(아민 및 알코올과의 반응에 적합하다); 및 N-히드록시석신이미드 에스테르(아민 및 알코올과의 반응에 적합하다)와 같은 활성화된 에스테르를 포함한다. 이러한 접합 전략 및 기타 접합 전략은,《생체접합 기술》, 제2판(Elsevier)에 기재된 바와 같이 당업자에게 잘 알려진 것이다. 당업자는, 약물 모이어티와 링커의 선택적 반응을 위해 반응 활성 작용기의 상보적인 쌍이 선택될 때, 그 상보적인 쌍의 각 구성원이 링커에 사용될 수 있고, 약물에도 사용될 수 있음을 이해할 수 있다.
본 발명은 항체 접합체(ADC)를 형성하기에 충분한 조건 하에서 항체를 약물-링커 화합물에 결합시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있는 ADC를 제조하는 방법을 더 제공한다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 방법은, 항체-링커 접합체를 형성하기에 충분한 조건 하에서, 항체를 이기능성 링커 화합물에 결합시키는 단계를 포함한다. 이들 실시 양태에서, 본 발명의 방법은 추가적으로는, 약물 모이어티를 링커를 통해 항체에 공유결합시키기에 충분한 조건 하에서, 항체 링커 접합체를 약물 모이어티에 접합시키는 단계를 더 포함한다.
특정 실시 양태에서, 항체-약물 접합체 ADC는 하기 분자식으로 표시된다.
Figure pct00002
상기 식에서,
Ab는 항체이며,
LU는 링커이며,
D는 약물이며,
또한 하기 첨자 p는 1 내지 8 중에서 선택된 값이다.
용도
본 발명은, 예를 들어 IL-36 관련 질병을 예방 및/또는 치료에 사용되는 진단제, 또는 약제의 제조에 사용되는 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 상기 IL-36 관련 질병은 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 염증성 장 질환(예를 들어 크론병, 궤양성 대장염 등), 골관절염, 류마티스 관절염(RA), 류마티스성 관절염 또는 골다공증, 염증성 섬유화증(예를 들어 경피증, 폐섬유증 및 경화증), 천식(알레르기성 천식 포함), 알레르기 반응 및 암을 포함하나 이에 국한되지 않는 염증성 질환, 자가면역 질환 등을 포함한다.
약학적 조성물
본 발명은 조성물을 더 제공한다. 특정 경우에서, 상기 조성물은 상기 항체 또는 이의 활성 단편 또는 이의 융합 단백질 또는 이의 ADC 또는 상응하는 CAR-T 세포, 및 제약상 허용되는 벡터를 포함하는 약학적 조성물이다. 일반적으로, 이들 물질은 무독성, 불활성 및 약학적으로 허용되는 수성 벡터 매질에서 제형화될 수 있으며, 여기서 pH는 일반적으로 약 5-8일 수 있고, pH는 약 6-8일 수 있지만, pH값은 제형 물질의 특성 및 치료할 질환에 따라 달라질 수 있다. 제형화된 약학적 조성물은 종양내, 복강내, 정맥내, 또는 국소 투여를 포함하는(단 이에 국한되지 않는다) 일반적인 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 항체는 또한 뉴클레오티드 서열에 의해 세포 내에서 발현되어 세포 요법에 사용될 수 있으며, 예를 들어, 상기 항체는 키메라 항원 수용체 T 세포 면역 요법(CAR-T) 등에 사용된다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 IL-36R 단백질 분자에 직접 결합됨에 따라, IL-36 관련 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 또한, 다른 치료제를 병용할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 안전하고 유효한 양(예를 들어, 0.001-99wt%, 0.01-90wt%일 수 있고, 0.1-80wt%일 수 있다)의 본 발명의 상기 단일클론 항체(또는 이의 접합체) 및 제약상 허용되는 벡터 또는 부형제를 포함한다. 이러한 벡터는 식염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함한다(단 이에 국한되지 않는다). 약학적 제제는 투여 방식과 일치해야 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 주사제 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들어 생리식염수 또는 포도당 및 기타 보조제를 함유하는 수용액을 사용하여 일반적인 방법으로 제조될 수 있다. 주사제, 용액제와 같은 약학적 조성물은 바람직하게는 무균 조건에서 제조된다. 활성 성분의 투여량은 치료학적 유효량이며, 예를 들어 1일 약 1㎍/kg 체중 내지 약 5mg/kg 체중이다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 다른 치료제와 병용될 수 있다.
약학적 조성물을 사용하는 경우, 안전하고 유효한 양의 약학적 조성물을 포유동물에게 투여하며, 여기서 그 안전하고 유효한 양은 일반적으로 적어도 약 10㎍/kg 체중이고, 대부분의 경우에서 약 50mg/kg 체중을 초과하지 않으며, 그 제량은 약 10㎍/kg 체중 내지 약 20mg/kg 체중일 수 있다. 당연하게는, 구체적 제량은 투여 경로, 환자의 건강 상태 등의 요인을 고려해야 하며, 이는 모두 숙련된 의사의 기술 내에 있다.
검출 용도 및 키트
본 발명의 항체는 검출 용도에 사용될 수 있으며, 예를 들어 샘플 검출에 사용되어 진단 정보를 제공한다.
본 발명에서, 사용되는 시료(샘플)는 세포, 조직 시료 및 생검 시료를 포함한다. 본 발명에 사용되는 용어 "생검"은 당업자에게 공지된 모든 종류의 생검을 포함해야 한다. 따라서 본 발명에 사용되는 생검은 내시경 방법 또는 장기 천자 또는 바늘 생검을 통해 준비된 조직 시료를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용되는 시료는 고정 또는 보존된 세포 또는 조직 시료를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 항체(또는 이의 단편)를 포함한 키트를 더 제공하며, 예를 들어, 상기 키트는 용기, 사용설명서, 완충제 등을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 검출 플레이트에 고정될 수 있다.
본 발명에 관련된 항체 또는 이의 단편은 하기의 우수한 기술적 효과를 가질 수 있다.
(a) 본 발명의 항체는 우수한 생체 활성 및 특이성을 갖는다.
(b) 뮤린 항체 및 키메라 항체에 비해, 본 발명의 인간화 항체는 IL-36R과 유사한 친화도를 유지하는 동시에, 더 낮은 면역원성을 갖는다.
(c) 본 발명 항체의 IL-36R에 대한 차단은 환자의 염증인자의 발현 경로를 뚜렷하게 억제할 수 있다.
(d) 본 발명의 항체는 일부 비인간 포유동물(예를 들어 원숭이)의 IL-36R에 대해 인간 IL-36R에 상당하는 친화도를 가지므로, 동물 모델에서 시험 및 품질 관리 검출에 용이하다.
(e) 본 발명의 항체는 IL-36R에 결합하여 IL-36α, IL-36β, IL-36γ가 IL-36R에 결합하는 활성화 신호 경로를 차단하고, 염증성 사이토카인(예를 들어 IL-6, IL-8, GM-CSF)을 감소시킨다.
본 발명은 구체적 실시 예를 결합하여 하기에서 추가로 설명된다. 이러한 실시 예는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니라 본 발명을 설명하기 위한 것임을 이해해야 한다. 하기의 실시 예에는 특정 조건의 실험 방법이 명시되지 않으며, 통상적으로 Sambrook 등, 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 조건, 또는 제조업체가 권장하는 조건과 같은 일반적인 조건을 띠른다. 별도로 명시되지 않는 한, 백분율 및 부수는 중량 백분율 및 중량부이다.
실시 예
실시 예 1
뮤린 단일클론 항체를 제조하는 방법은 Kohler 및 Milstein이 1975년 발명한 하이브리도마 제조 기술을 사용한다(Nature, 1975，256：495-497). 먼저 인간 IL-36R Fc 태그 단백질(ACRO, #IL2-H5254)을 프로인드 보조제로 유화시킨 후, 복수의 스트레인 마우스를 면역화시킨다. 4차 면역화 후 혈청을 취하여 ELISA 방법으로 역가를 검출하고, 가장 우수한 마우스를 선별해 비장 세포와 SP2/0 골수종 세포를 융합시킨다. HAT로 하이브리도마 다중클론 세포를 스크리닝한 후, 다중클론 배양 상청액에 대해 인간 IL-36R, 원숭이 IL-36R, 인간 IL1R1의 결합 활성을 검출하고, 및 다중클론 항체의 IL-36 자극인자에 대한 기능적 억제 효과를 검출한다. 최상의 다중클론을 선별해 단일 클론화를 수행하고, 마찬가지로 단일클론에 대해 결합 활성 및 기능적 활성을 스크리닝하고, Biacore 방법을 통해 친환도를 검출하며, 최종적으로 선별된 최적의 하이브리도마 단일클론 세포주의 서열을 분석한다.
하이브리도마 스크리닝 부분 데이터
클론 이름 결합 활성 OD450 값 인간 IL-36R에 대한 결합 활성 MFI 비율(하이브리도마 상청액/양성 대조군) 원숭이 IL-36R에 대한 결합 활성 MFI 비율(하이브리도마 상청액/양성 대조군) 인간 IL1R1에 대한 결합 활성 MFI 비율(하이브리도마 상청액/음성 대조군) 인간 IL36β 기능적 활성 IL-6 차단 비율(하이브리도마 상청액/양성 대조군) 인간 IL36α 기능적 활성 IL-8 차단 비율(하이브리도마 상청액/양성 대조군) 인간 IL36β 기능적 활성 IL-8 차단 비율(하이브리도마 상청액/양성 대조군) 인간 IL36γ 기능적 활성 IL-8 차단 비율(하이브리도마 상청액/양성 대조군)
6(1)-B8 1.293 75.66% 94.41% 120.18% 10.50% 4.78% 5.08% 5.77%
6(2)-G8 1.74 94.54% 81.50% 114.91% 13.18% 5.61% 6.45% 5.58%
21(1)-E4 0.943 67.89% 90.03% 122.81% 5.70% -3.19% -1.97% -2.50%
21(2)-F3 1.681 80.91% 91.36% 114.91% 1.18% -2.61% -1.88% -2.31%
65(1)-B5 1.355 56.84% 85.44% 111.40% 23.05% 15.66% 18.02% 12.87%
65(2)-F11 1.319 71.60% 88.52% 116.67% 21.66% 15.90% 17.72% 13.17%
74(1)-E2 1.917 109.76% 85.93% 114.04% 1.00% -3.11% -3.15% -2.89%
74(2)-G5 1.827 103.89% 97.44% 114.91% 2.84% -2.86% -2.66% -2.60%
79(1)-C7 2.133 112.13% 100.76% 110.53% 13.08% 3.12% 3.51% 3.34%
79(2)-G7 1.085 75.48% 102.59% 121.93% 8.75% 4.70% 1.46% 3.24%
84(1)-C11 2.277 84.52% 86.85% 115.79% 0.90% -3.27% -3.35% -2.99%
84(2)-C3 2.324 64.61% 104.35% 114.91% 0.81% -4.02% -3.05% -3.47%
111(1)-E5 2.161 81.64% 105.10% 118.42% 0.07% -4.02% -4.62% -3.86%
111(2)-B3 2.36 102.30% 103.62% 116.67% 0.07% -4.68% -4.62% -4.06%
130(1)-H7 1.316 113.29% 110.61% 119.30% 30.89% 44.55% 26.64% 25.52%
130(2)-A2 1.507 83.19% 130.12% 123.68% 31.35% 43.22% 27.13% 22.31%
140(1)-C1 1.768 84.57% 102.87% 117.54% 1.92% -4.35% -3.74% -3.09%
172(1)-H4 1.442 95.40% 96.88% 114.91% 44.92% 58.91% 46.82% 68.93%
172(2)-C4 1.814 82.50% 89.66% 116.67% 45.10% 55.75% 46.73% 67.56%
179(1)-G7 1.667 74.17% 113.09% 114.04% 30.06% 27.19% 24.48% 18.32%
180(1)-H5 2.082 81.42% 79.75% 116.67% 9.48% 0.21% 1.46% -1.63%
180(2)-D3 2.477 65.03% 86.87% 114.91% 13.54% 3.54% 4.89% 1.78%
181(2)-F10 2.959 49.74% 109.08% 126.32% 20.65% 15.07% 12.53% 10.15%
182(1)-C8 1.843 93.33% 86.26% 120.18% 50.27% 74.76% 57.11% 55.89%
183(1)-H7 2.016 84.65% 84.83% 115.79% 30.89% 26.86% 23.99% 22.31%
183(2)-F12 1.857 59.34% 84.47% 127.19% 24.71% 18.23% 18.90% 14.53%
184(1)-F8 2.27 96.60% 86.57% 118.42% 0.26% -3.60% -5.11% -4.06%
184(2)-B9 2.408 98.36% 89.91% 120.18% -1.80% -4.45% -7.19% -3.44%
표 1과 같이, 다수의 하이브리도마 스크리닝을 거쳐, 하이브리도마6（1）-B8, 111（1）-E5 항체 발현 상청액은 세포 결합 수준에서 인간 IL-36R, 원숭이 IL-36R 단백질에 대해 모두 높은 결합 활성을 가지며, 인간 IL1R1 단백질에 대해 특이적 결합이 없고, IL-36 자극인자(IL-36α, IL-36β, IL-36γ)에 의해 자극되어 생성된 사이토카인에 대해 뚜렷한 기능적 차단 효과가 있는 것으로 나타났다.
실시예 2. 항-IL-36R 항체 가변 영역 유전자 서열 클로닝 및 인간화
2.1. 하이브리도마 세포에서 항체의 가변 영역 유전자 클로닝
TAKARA의 5'RACE 기술 원리를 기반으로 하이브리도마 세포주에 의해 발현되는 마우스 항체 가변 영역의 cDNA 서열을 클로닝한다. 간단하게 말하면, SMARTer 5'RACE 합성 키트(TAKARA，제품번호 634859)를 이용해 설명서에 따라 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 유전자 특이성 cDNA를 합성한다. PCR 프라이머를 이용하여 cDNA 서열의 5' 및 3' 말단을 변형하며, 상기 프라이머는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA에 각각 적절한 리더 서열을 추가하도록 설계됨에 따라, 얻어진 PCR 산물이 심리스 클로닝 방법을 통해 종래의 재조합 항체에서 발현되는 중쇄 벡터 pHB-Fc 및 경쇄 벡터 pHB-C
Figure pct00003
에 클로닝될 수 있다. pHB-Fc 발현 벡터는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자 서열을 포함하며, 여기서 CH2는 항체 ADCC 이펙터 효과가 약화되는 L234A 및 L235A(Eu numbering) 돌연변이를 갖고, pHB-Cκ 벡터는 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 서열을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 PCR 증폭 산물은 In-fusion 클로닝 제제(TAKARA, 제품번호 639650)를 통해 발현 벡터에 클로닝하여 인간-마우스 키메라 항체 발현 벡터를 수득하고, E.coli DH5α 대장균 수용성 세포(YEASTERN 바이오테크, 제품번호 FYE607-80VL)로 형질 전환한다. 단일클론 콜로니를 선별해 Sanger 시퀀싱을 수행하고, 분석을 거쳐 항체 가변 영역 서열을 획득한다.
그 결과 경쇄는 실시예 1의 하이브리도마 6（1）-B8에서 유래되고, 중쇄는 실시예 1의 하이브리도마 111（1）-E5에서 유래되고, 가변 영역 서열이 하기와 같은 항-IL-36R 키메라 항체(화보 바이오팜 번호 900497)를 수득한다.
900497 HCVR 서열번호 1
QVQLQQTGSVLVRPGTSVKLSCKASGYTFTSSWMHWAKQRPGQGLEWIGEIHPNSAKTNYNEKFKGKATLTVDTFSSTAYVDLSSLASEDSAVYYCARVDYGKPWFAYWGQGTLVTVSA
900497 LCVR 서열번호 2
QIVLTQSPTIMSASPGERVTMTCSASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTINSMEAEDAATYYCQQFQSSPLTFGAGTKLGLK
여기서, 밑줄 친 부분은 CDRs이다(IMGT 정의, 단일 열은 하기와 같다).
뮤린 항-IL-36R 항체 CDR 서열
도메인 서열 서열번호
VH CDR1 GYTFTSSW 3
CDR2 IHPNSAKT 4
CDR3 ARVDYGKPWFAY 5
VL CDR1 SSVSSSY 6
CDR2 STS 7
CDR3 QQFQSSPLT 8
2.2. 키메라 항체의 발현
2.1에서 수득된 발현 벡터를 대장균에 의해 증폭시키고, 내독소 제거 플라스미드 추출 키트(텐건 바이오테크(베이징) 유한회사, 제품번호 DP117)를 이용해 충분한 양의 플라스미드를 제조하여 키메라 항체의 일시적 형질감염 발현에 사용한다. 발현에 사용되는 숙주 세포는 CHO-S 세포(써모 피셔 사이언티픽, 제품번호 R80007)이다. 제조된 두 개의 중쇄 벡터를 각각 경쇄 벡터와 함께 폴리에테르이미드(PEI, Polysciences，제품번호 24765-1)와 혼합하여 리포솜 복합체를 형성한 후, CHO-S 세포를 형질감염시키고 이산화탄소 진탕기에 넣어 5-7일 동안 배양한다. 세포 배양 상청액을 원심분리하여 수집하고, Protein A 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 정제하여 인간-마우스 키메라 항체를 얻는다.
2.3. 뮤린 항-인간 IL-36R 항체의 인간화――인간화 항체의 제조 방법
항체의 인간화는 하기의 방법을 사용한다. 키메라 항체(화보 바이오팜 번호 900497)의 가변 영역 서열을 NCBI IgBlast 데이터베이스의 가용 서열과 비교하고, 동정 및 분석을 통해 최종적으로 CDR 이식 중쇄 및 경쇄의 구축에 적합한 인간 유래 프레임워크(FR 영역)를 결정한다.
변형 시, 인간 항체 FR 영역의 보존된 아미노산 잔기 및 항체 FR 영역의 중요한 아미노산 잔기에 따라 변형 부위를 설계하고, 키메라 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대해 각각 인간화 돌연변이를 설계하며, PCR 기술을 이용해 인간화 점 돌연변이 항체 발현 플라스미드를 증폭 및 구축한다. 인간화 점 돌연변이 항체 발현 플라스미드를 각각 CHO-S 세포를 통해 발현시키고, 정제한 후 인간화 항체 단백질을 수득한다. Biacore 및 세포 생체 활성 등의 검출 방법을 사용해 인간화 항체의 친화도, 활성화된 사이토카인 방출 등의 지표를 스크리닝하여 성능이 우수한 인간화 항-IL-36R 항체를 3개를 얻는다. 수득된 인간화 항-IL-36R 항체의 번호는 900513, 900527 및 900534이며, 이의 VH 및 VL 서열은 하기와 같다.
900513, 900527 및 900534 HCVR 서열번호 9
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSSWMHWAKQAPGQGLEWIGEIHPNSAKTNYNQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARVDYGKPWFAYWGQGTLVTVSS
900513 LCVR 서열번호 10
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLWIYSTSNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFATYYCQQFQSSPLTFGQGTKLEIK
900527 LCVR 서열번호 11
QIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLWIYSTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFATYYCQQFQSSPLTFGQGTKLEIK
900534 LCVR 서열번호 12
QIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFATYYCQQFQSSPLTFGQGTKLEIK
여기서, 밑줄 친 영역은CDRs이고(IMGT 정의), 900513, 900527 및 900534는 각각 3개의 인간화 항체 단백질 번호이다. 인간화 항체 900513, 900527 및 900534의 CDR 영역은 키메라 항체 900497의 CDR 영역과 동일하고, 인간화 항체의 FR 영역은 키메라 900497을 기반으로 돌연변이된다.
실시 예 3. 항-인간 IL-36R 인간화 항체의 생체 활성 검출
3.1. Biacore(SPR)를 사용한 항체 친화도 검출
시험 재료 및 장비는 하기와 같다.
His 태그 인간 IL-1 Rrp2/IL-1 R6 단백질(Human IL-1 Rrp2/IL-1 R6 Protein, His Tag），ACRO Biosystems，IL2-H52H6
HBS-EP+（10X），GE，BR-1006-69
Series S Sensor Chip CM5，GE，29-1275-56
His Capture Kit，GE，28995056
BIACORE，GE，Biacore 8K
pH1.5 글리신 용액, GE,BR100354
시험 방법은 하기와 같다.
Sereis S Sensor Chip CM5 칩을 상온에서 20~30min 동안 평형화시킨 후, 칩을 장비에 장착한다. His Capture Kit 설명서에 따라 anti-His 항체를 Series S Sensor Chip CM5에 고정한다. HBS-EP(10x) 용액 초순수로 10배 희석하여 실행 완충액(Running Buffer)으로 사용한다. 실행 완충액을 이용해 항원(His 태그된 인간 IL-1 Rrp2/IL-1 R6 단백질)을 1μg/ml, 10μL/min으로 희석하고, 15초 동안 주입하여 항원 50RU 정도를 포획한다. 평형 완충액을 이용해 항체 샘플을 30nM, 15nM, 7.5nM, 3.75nM, 1.875nM, 0.9375nM, 0.46875nM으로 희석한다. 실행 완충액을 0농도로 사용한다. 30μL/min 유속에서, 120s 동안 결합, 900s 동안 해리시킨다. pH1.5 글리신 용액으로 칩을 재생한다. 포획법 단일 순환 동역학 프로그램을 사용해 샘플을 분석하고, 해당 분석 프로그램을 선택하여 데이터를 분석하여 분명한 참조 결합(reference binding)이 없음을 확인하고, Kinetics，1:1 결합 모델(binding modle), 피팅 분석을 사용하여 샘플의 동역학 매개변수를 얻는다.
후보 항-인간 IL-36R 인간화 항체의 친화도 측정
단백질 번호 ka (l/Ms) kd (l/s) KD (M)
900513 9.04E+05 1.34E-05 1.48E-11
900527 9.67E+05 4.37E-05 4.52E-11
900534 8.81E+05 5.10E-05 5.79E-11
900497 6.60E+05 1.68E-05 2.54E-11
900389 7.39E+05 1.17E-05 1.58E-11
참고 : 900389는 BI이 개발한 항-인간 IL-36R 항체이고, 화보 바이오팜에 의해 특허(WO2013/074569A1)에 개시된 서열에 따라 가변 영역 유전자로 합성되어 독립적으로 발현된다. 구체적으로는, 900389의 중쇄 가변 영역은 WO2013/074569A1에서 서열번호 89로 표시되는 81B4vH33_90vH이고, 900389의 경쇄 가변 영역은 WO2013/074569A1에서 서열번호 77로 표시되는 81B4vK32_105vK이고, 81B4vH33_90Vh 및 81B4vK32_105vK는 모두 뮤린 항체 81B4를 기반으로 인간화 개조에 의해 수득된 것이다. 900389의 불변 영역은 본 발명의 후보 항체와 동일하다.
각 인간화 항체의 인간 IL-1 Rrp2에 대한 결합 친화도 상수（KD（M））는 표 3과 같다. 결과에 따르면, 본 발명의 인간화 단일클론 항체의 친화도는 10-11에 근접하는 매우 강한 친화도를 갖는 것으로 나타났다.
3.2. 항-인간 IL-36R 항체의 huIL-36 자극인자에 대한 기능 억제 효과 검출
인간 난소암 세포계 NCI/ADR-RES를 웰당 100μL(웰당 세포 수 4.5Х104개)를 96웰 세포 배양 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하며, 검출할 샘플을 연속 희석한 후 50μL/웰에 첨가하여 37℃, 5% CO2에서 15min 동안 배양한다. 각각 리간드 huIL-36α（1μg/mL）, huIL-36β（80ng/mL）, huIL-36γ（120ng/mL）를 50μL/웰에 첨가하여 충분히 혼합한 후, 37℃ 5% CO2에서 18-24h 동안 배양한다. 원심분리하여 세포 배양 상청액을 수집하고, Biolegend ELISA 키트를 사용해, huIL-6(1:100 희석, 제품번호 430503), huIL-8(1:5 희석, 제품번호 431503) 및 huGM-CSF(1:2 희석, 제품번호 432003)를 검출한다. huIL-36β의 자극 효과 하에, NCI/ADR-RES 세포 내 NF-κb의 활성화 효과를 검출한다. 리간드 huIL-36β를 240ng/mL로 희석하고, 검출할 항체와 사전 배양된 세포에 첨가하여 37℃, 5% CO2에서 30 min 동안 배양한다. 원심분리하여 상청액을 제거하고, 세포를 용해시킨 후 용해물을 취해 키트(Cisbio, 제품번호 64NFBPEG)로 NF-κB 인산화를 검출한다.
인간화 후보 항체의 생체 활성 검출 결과
자극인자 검출 지표
/IC50 ( ng/mL)		 900389 900513 900527 900534 900497
IL-36 α IL-6 21.85 12.40 15.03 21.58 33.22
IL-8 57.45 39.78 31.53 30.39 43.91
GM-CSF 33.17 20.65 22.00 20.17 32.83
IL-36 β IL-6 24.59 22.34 13.92 16.80 20.39
IL-8 34.44 22.09 22.27 21.97 29.21
GM-CSF 26.91 18.40 17.36 18.65 22.36
IL-36 γ IL-6 26.44 12.05 16.18 17.61 19.78
IL-8 33.71 18.00 19.81 17.95 28.37
GM-CSF 32.67 17.87 19.81 20.97 28.75
IL-36 β pNF-κB 179.00 105.30 71.44 64.92 115.10
결과는 도 1 내지 도 4 및 표 4와 같이, 인간화 항체 900513, 900527, 900534는 인간 자극인자 IL-36α, IL-36β, IL-36γ의 기능에 대해 뚜렷한 차단 효과를 가지므로, 사이토카인 IL-6, IL-8, GM-CSF의 분비 및 NF-κB의 인산화를 차단할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 4. 키메라 항체 및 인간화 항체의 비특이적 결합 실험(SPR)
본 실험은 SPR 방법을 사용해 항체와 비표적 분자의 비특이적 흡착 효과를 측정하며, 실험에 사용되는 장비 및 제제 재료는 표 5 및 표 6과 같다.
장비
명칭 제조업체 모델 번호
Biacore GE Biacore 8K 1305
제제 재료
이름 제조업체/유래 제품번호 배치번호
Series S Sensor Chip CM5 GE BR-1005-30 10253038
계란 유래 라이소자임 용액 Sigma L3790 SLBM3565V
대두 유래 트립신 억제제 1-S형 Sigma T-2327 SLBJ6832V
다중클론 토끼 항-라이소자임 ABcam Ab391 GR215714-19
트립신 억제제에 대한 항체 LifeSpan Biosciences LS-C76609 26978
시리즈 센서 칩CM5(GE，#BR-1005-30) 칩을 실온에 두고 20~30min 동안 평형화시키고, Biacore 8K(GE) 장비에 장착한다. 아미노 커플링 키트(GE，#BR-1000-50)를 사용해 계란 유래 라이소자임 용액(Sigma，#L3790) 및 대두 유래 트립신 억제제 1-S형(Sigma，#T-2327)를 각각 CM5 칩에 고정한다. 주입 완충액은 HBS-EP（1X）(GE，#BR-1006-69)이고, 4개 평형화 주기를 설정한다. 평형 완충액으로 각각 다중클론 토끼 항-라이소자임(ABcam，Ab391), 트립신 억제제에 대한 항체(Anti-trypsin inhibitor antibody, LifeSpan Biosciences, #LS-C76609), 키메라 항체 및 인간화 항체를 1000nM으로 희석하고, 유속 5μL/min, 주입 채널 1, 2 및 3, Flow Cell 1 및 2를 설정한다. 결합 시간은 10min이고, 해리 시간은 15min이다. 유속 50μL/min으로 재생하고, 먼저 0.85% 인산 용액(ProteOn，176-2260)으로 60s 동안 재생한 후, 다시 50mM 수산화나트륨 용액으로 30s 동안 재생한다.
여기서, 샘플 900389는 BI가 개발한 항-인간 IL-36R 인간화 항체이고, 화보 바이오팜에 의해 특허에 따라 가변 영역 유전자로 합성되어 독립적으로 발현된다. 샘플 900497는 화보에 의해 하이브리도마 스크리닝 구축된 항-IL-36R 키메라 항체이다.
결과는 표 7과 같으며, 900389는 계란 유래 라이소자임 용액에 대한 결합 신호가 20RU보다 크므로, 비특이적 정전기 및 소수성 결합 효과가 있는 것으로 간주된다. 900497은 계란 유래 라이소자임 용액 및 대두 유래 트립신 억제제 1-S형에 대한 결합 신호가 모두 20 미만이므로, 비특이적 정전기 및 소수성 결합 효과가 없는 것으로 간주될 수 있다.
샘플의 비특이적 결합량 비교
이름 라이소자임 （RU） 트립신 억제제（RU） 불활성화 카르복시메틸 덱스트란（RU） 카르복시메틸 덱스트란（RU）
완충액 24.0 12.9 16.2 14.0
다중클론 토끼 항-라이소자임 9316.9 32.2 34.3 27.7
트립신 억제제에 대한 항체 65.1 6259.1 36.8 22.5
900389 55.0 27.5 16.3 14.2
900497 24.3 16.7 16.4 14.4
참고 : 일반적으로 Buffer의 영향을 공제한 후, 응답 값이 20RU 미만이면 상호작용이 비교적 약한 것으로 간주되어 무시될 수 있다. 20RU 이상이면 뚜렷한 상호작용이 있는 것으로 간주된다. 100RU 이상이면 상호작용이 매우 강한 것으로 간주된다.
실시 예 5. 안정적 세포주 항체의 세포 결합 및 기능 실험
BI 대조군 서열 900389, 화보에 의해 스크리닝된 인간화 서열 900527, TNP IgG1（Fc silence）900543을 각각 화보 GS 벡터에 삽입하여, 재조합 발현 플라스미드를 구축하고 각각 CHO-K1 세포를 형질감염시켜 안정적 세포주를 구축한다. 화보 900527에서 구축된 안정적 세포주 단백질 번호는 HB0034이고, 스크리닝된 단일클론 세포주는 상류 공정에 의해 최적화된 후 발현량이 4g/L 이상이다. 안정적 세포주에 의해 발현된 항체를 정제한 후 유세포 분석 결합 실험 및 기능 실험을 통해 검출한다. 샘플 900543은 TNP IgG1（Fc silence） 음성 대조군 항체이다.
5.1. 안정적 세포주 항체의 유세포 분석 결합 실험
안정적 세포주 항체의 인간 IL-36R, 원숭이 IL-36R에 대한 결합 활성을 검출하며, 유세포 분석 검출 세포는 화보에 의해 내부적으로 구축되어 인간 IL-36R, 원숭이 IL-36R을 발현하는 CHO-K1 세포주이다.
검출 결과는 표 8 및 도 5, 도 6과 같다.
항체와 인간 IL-36R, 원숭이 IL-36R의 결합 활성 검출
항체 이름 인간 IL-36R에 대한 결합 활성
EC50 (ug/mL)		 인간 IL-36R에 대한 결합 활성
EC90 (ug/mL)		 원숭이 IL-36R에 대한 결합 활성
EC50 (ug/mL)		 원숭이 IL-36R에 대한 결합 활성
EC90 (ug/mL)
900389 0.1245 0.4428 0.1307 0.5305
HB0034 0.062 0.2786 0.05954 0.2915
900543 결합 없음 결합 없음 결합 없음 결합 없음
결과에 따르면, 화보 단일클론 항체 HB0034와 인간 IL-36R, 원숭이 IL-36R은 모두 매우 높은 결합 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 양성 대조군 900389 항체에 비해, 본 발명의 항체는 EC50 값이 더 낮고, 인간 IL-36R에 대한 결합 활성이 더 강하다.
5.2. 안정적 세포주 항체의 huIL-36 자극인자에 대한 기능 억제 효과 검출 실험
5.2.1. NCI/ADR-RES 세포에서 항체의 huIL-36 자극인자에 대한 기능 억제 효과
인간 난소암 세포계 NCI/ADR-RES를 웰당 100μL（웰당 세포 수 4.5Х104개）를 96웰 세포 배양 플레이트에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하며, 검출할 샘플을 연속 희석한 후 50μL/웰에 첨가하여 37℃ 5% CO2에서 15min 동안 배양한다. 리간드 huIL-36β（40ng/mL）를 50μL/웰에 첨가하여 충분히 혼합한 후, 37℃, 5% CO2에서 18-24h 동안 배양한다. 원심분리하여 세포 배양 상청액을 수집하고, HTRF 키트(Cat#62HIL06PEG，CISBIO)를 사용해 huIL-6을 검출한다.
결과는 표 9 및 도 7과 같다.
NCI/ADR-RES 세포에서 항체의 huIL-36 자극인자에 대한 기능 억제 효과
항체 이름 IL-36β가 NCI/ADR-RES를 자극하여 HuIL-6 검출
IC50 (ug/mL)		 IL-36β가 NCI/ADR-RES를 자극하여 HuIL-6 검출
IC90 (ug/mL)
900389 0.02541 0.1485
HB0034 0.008874 0.1134
900543 효과 없음 효과 없음
결과에 따르면, 안정적 세포주 인간화 항체 HB0034는 인간 자극인자 IL-36β의 기능에 대해 뚜렷한 차단 효과를 가지므로, 사이토카인 IL-6의 분비를 차단할 수 있는 것으로 나타났다. 양성 대조군 900389 항체에 비해, 본 발명의 항체는 IC50 값이 더 낮고, 차단 효과가 더 강하다.
5.2.2. HIF 세포에서 항체의 huIL-36 자극인자에 대한 기능 억제 효과
HIF(Human Intestinal Fibroblasts) 세포를 Serum Starvd 배지를 사용해 세포를 4.5E5/ml 세포 현탁액으로 준비하고, 웰당 100ul（45000개 세포）를 96wp에 첨가하여 밤새 배양한다. 항체를 연속 희석한 후 50ul/웰을 첨가하고, 37℃에서 15min 동안 배양한다. IL-36α를 1000ng/ml로 희석하고, 웰당 50ul를 첨가하여 잘 혼합한다. 37℃, 5%CO2에서 4h 동안 배양하고, 원심분리해서 상청액을 수집하여 인간 IL-6의 함량을 검출한다. IL-36β를 80ng/m로 희석하고, 웰당 50ul를 첨가하여 잘 혼합한다. 37℃, 5%CO2에서 4h 동안 배양하고, 원심분리해서 상청액을 수집하여 인간 IL-6의 함량을 검출한다. IL-36β를 40ng/m로 희석하고, 웰당 50ul를 첨가하여 잘 혼합한다. 37℃, 5%CO2에서 20min 동안 배양하고, 키트를 사용해 pNFκB의 함량을 검출한다.
결과는 표 10 및 도 8, 표 11 및 도 9, 표 12 및 도 10과 같다.
HIF 세포에서 항체의 huIL-36 자극인자에 대한 기능 억제 효과
항체 이름 IL-36α가 HIF를 자극하여 HuIL-6 검출
IC50 (ug/mL)		 IL-36α가 HIF를 자극하여 HuIL-6 검출
IC90 (ug/mL)nL)
900389 0.08537 2.059
900497 0.1458 3.425
HB0034 0.04794 2.246
HIF 세포에서 항체의 huIL-36 자극인자에 대한 기능 억제 효과
항체 이름 IL-36β가 HIF를 자극하여 HuIL-6 검출
IC50 (ug/mL)		 IL-36β가 HIF를 자극하여 HuIL-6 검출
IC90 (ug/mL)
900389 0.07276 1.386
900497 0.08373 3.644
HB0034 0.05458 2.138
HIF 세포에서 항체의 huIL-36 자극인자에 대한 기능 억제 효과
항체 이름 IL-36β가 HIF를 자극하여 pNFκB 검출
IC50 (ug/mL)		 IL-36β가 HIF를 자극하여 pNFκB 검출
IC90 (ug/mL)
900389 0.1670 0.4188
900497 0.1002 0.7757
HB0034 0.1049 0.6863
결과에 따르면, 안정적 세포주 인간화 항체 HB0034는 인간 자극인자 IL-36α, IL-36β의 기능에 대해 뚜렷한 차단 효과를 가지므로, 사이토카인 IL-6의 분비 및 NF-κB의 인산화를 차단할 수 있는 것으로 나타났다. 양성 대조군 900389 항체에 비해, 본 발명의 항체는 IC50 값이 더 낮고, 차단 효과가 더 강하다.
실시 예 6. 인간화 항체의 비특이적 결합 실험(SPR)
본 실험은 SPR 방법을 사용해 항체 샘플(900389 및 HB0034)의 비표적 분자에 대한 비특이적 흡착 효과를 측정하며, 실험에 사용되는 제제 재료는 표 13과 같다.
제제 재료
명칭 제조업체/유래 제품번호 배치번호
Series S Sensor Chip CM5 GE BR-1005-30 10253038
Lysozyme solution from chicken egg Sigma L3790 SLBM3565V
Trypsin inhibitor type 1-S from Glycine max Sigma T-2327 SLBJ6832V
Polyclonal rabbit anti-lysozyme Abcam Ab391 GR215714-19
Anti-trypsin inhibitor antibody LifeSpan Biosciences LS-C76609 26978
시리즈 센서 칩CM5(GE，#BR-1005-30) 칩을 실온에 두고 20~30min 동안 평형화시키고, Biacore 8K(GE) 장비에 장착한다. 아미노 커플링 키트(GE，#BR-1000-50)를 사용해 계란 유래 라이소자임 용액(Sigma，#L3790) 및 대두 유래 트립신 억제제 1-S형(Sigma，#T-2327)을 각각 CM5 칩 채널 1 및 2에 고정한다. 실행 완충액은 HBS-EP（1X）(GE，#BR-1006-69)이고, 5개 평형화 주기를 설정한다. 실행 완충액으로 다중클론 토끼 항-라이소자임(ABcam，Ab391), Anti-trypsin inhibitor antibody（LifeSpan Biosciences，#LS-C76609）, 키메라 항체 및 인간화 항체를 1000nM으로 희석하고, 유속 5μL/min, 주입 채널 1, 2 및 3, Flow Cell 1 및 2를 설정한다. 결합 시간은 10min이고, 해리 시간은 15min이다. 유속 50μL/min으로 재생하고, 먼저 0.85% 인산 용액(BIO-RAD，#176-2260)으로 60s 동안 재생한 후, 다시 50mM 수산화나트륨 용액(GE, #BR-1003-58)으로 30s 동안 재생한다.
결과는 표 14와 같으며, B1 대조군 항체 900389는 라이소자임에 대한 결합 응답 값이 20RU보다 크지만, 트립신에 대한 응답 값은 20RU 미만이므로, 그 샘플이 음전하를 갖는 것으로 나타난다. 본 실험에서, 900389는 카르복시메틸 덱스트란과 53.9RU의 결합 응답 값을 가지므로, 그 샘플이 카르복시메틸 덱스트란에 결합할 수 있음을 나타낸다. HB0034는 라이소자임 및 트립신에 대한 결합 응답 값이 모두 20RU 미만이므로, 그 샘플은 분명한 비특이적 정전기 결합 효과가 없는 것으로 간주될 수 있다.
샘플의 비특이적 결합량 비교
이름 라이소자임
（RU）		 트립신 억제제
（RU）		 불활성화 카르복시메틸 텍스트란
（RU）		 카르복시메틸 덱스트란
（RU）
완충액 0 0 0 0
다중클론 토끼 항-라이소자임 5554.4 15.1 -8.5 18.0
트립신 억제제에 대한 항체 17.5 9920.5 -7.3 14.6
900389（BI 대조군 항체） 21.6 14.6 0.3 53.9
HB0034 12.1 12.0 -1.3 -2.4
참고 : 일반적으로 Buffer의 영향을 공제한 후, 응답 값이 20RU 미만이면 상호작용이 비교적 약한 것으로 간주되어 무시될 수 있다. 20RU 이상이면 뚜렷한 상호작용이 있는 것으로 간주된다. 100RU 이상이면 상호작용이 매우 강한 것으로 간주된다.
실시 예 7. 인간화 항체의 건선에 대한 치료 효과
사이노몰구스 원숭이를 모델 대조군, 양성 대조군, HB0034 저용량군, HB0034 중용량군 및 HB0034 고용량군으로 그룹당 6마리씩 5그룹으로 나눈다. 이미퀴모드 크림(IMQ)을 도포하여 건선 모델을 형성한다. 첫 모델링 당일（Day0） 및 4일째（Day4），HB0034 저용량, 중용량, 고용량 그룹에 각각 정맥주사로 5, 15, 50 mg/kg HB0034를 투여하며, 모델 대조군은 생리식염수를 투여하고, 양성 대조군은 덱사메타손(5mg/cm2， 도포 투여, 1일 1회)을 투여한다.
실험 결과에 따르면, 실험 종료 시, 각 그룹의 체중은 모두 약간 감소하고, HB0034 치료 그룹은 제량의 증가를 따라 체중 감소폭이 감소하는 경향을 보인다. 생리식염수(모델 그룹)와 비교하면, 5mg/kg 제량에서, HB0034는 모델링 피부조직 중 IL-17, IL-36의 수준이 뚜렷하게 감소하고（p＜0.05）, 피부 병리학적 점수가 개선되는 경향이 있었으나, 차이가 분명하지는 않다（p＞0.05）（표 15 참조）. 15mg/kg 제량에서, HB0034는 모델 PASI의 점수가 분명하게 개선되고（실험 종료점 Day10，p＜0.05）， 피부 병리학적 점수도 개선되는 경향이 있지만, 차이가 분명하지는 않다（p＞0.05）（표 15, 도 12 참조）. 모델링 피부조직 중 IL-17, IL-36의 수준은 뚜렷하게 감소한다（p＜0.05）. 50 mg/kg 제량에서, HB0034는 모델 PASI 점수가 분명하게 개선되고（Day4~10，p<0.05）, 피부 병리학적 점수 및 피부 IL-17, IL-36의 수준이 모두 뚜렷하게 감소한다（p＜0.05）（표 15, 도 11 내지 도 12 참조）, 여기서, 도 11에서, n=6, *p<0.05, **p<0.01 vs. 생리식염수이다. 도 12에서, n=6, **p<0.01 vs. 생리식염수이다.
그 모델에서 양성 대조군 약물 덱사메타손（5mg/cm2）의 효능은 15 mg/kg HB0034보다 약간 우수하고, 50 mg/kg HB0034보다 약간 약하다.
따라서, HB0034는 15~50 mg/kg 제량에서（i.v.，Q4DХ2）, IMQ에 의해 유발되는 피부 홍반, 비듬 및 피부비후의 건선 증상을 용량 의존적으로 개선하고, PASI 점수를 감소시키고, 모델링 부위의 피부 병리학적 점수를 개선하고 피부조직 IL-17, IL-36 수준을 저하시킴을 알 수 있다. HB0034는 IMQ에 의해 유도되는 사이노몰구스 원숭이의 건선 모델에서, 최소 유효량은 15mg/kg이다.
이미퀴모드에 의해 유도된 사이노몰구스 원숭이 건선 모델 피부조직에서 IL-17및 IL-36 수준에 대한 HB0034의 효과
그룹별 IL-17 농도
（pg/mL）		 IL-36 농도
（pg/mL）
A그룹 : 생리식염수 17.4±0.84 12.49±1.81
B그룹 : 덱사메타손 8.62±0.59** 5.27±0.52**
C그룹：HB0034 5mg/kg 10.25±1.73** 5.97±1.12*
D그룹：HB0034 15mg/kg 8.59±0.85** 2.97±0.95**
E그룹：HB0034 50mg/kg 7.34±0.07** 0.96±0.69**
여기서, mean±SEM, n=6, *p<0.05, **p<0.01 vs. 생리식염수이다.
본 발명에 언급된 모든 논문은 모두 각 논문이 개별적으로 참고용으로 인용되는 것처럼 본 발명에 참고용으로 인용된다. 또한, 본 발명의 상기 개시된 내용을 읽은 후, 당업자는 본 발명을 다양하게 변경 또는 수정할 수 있으며, 이러한 등가의 형식은 모두 본 발명의 청구범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (17)

  1. 서열번호 3으로 표시되는 CDR1,
    서열번호 4로 표시되는 CDR2, 및
    서열번호 5로 표시되는 CDR3의 3개의 상보성 결정 영역 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    서열번호 6으로 표시되는 CDR1',
    서열번호 7로 표시되는 CDR2', 및
    서열번호 8로 표시되는 CDR3'의 3개의 상보성 결정 영역 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 동물 유래 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 9로 표시되며, 및/또는
    상기 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 2, 10, 11 또는 12로 표시되는 것을 특징으로 하는 항체.
  4. (i) 제1항의 상기 항체, 및
    (ii) 발현 및/또는 정제를 돕기 위한 선택적 태그 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
  5. 단일클론 항체 항원 결합 영역의 scFV 세그먼트는 IL-36R에 특이적으로 결합하는 결합 영역이며,
    상기 scFv의 중쇄 가변 영역은,
    서열번호 3으로 표시되는 CDR1,
    서열번호 4로 표시되는 CDR2, 및
    서열번호 5로 표시되는 CDR3의 3개의 상보성 결정 영역 CDR을 포함하며, 및
    상기 scFv의 경쇄 가변 영역은,
    서열번호 6으로 표시되는 CDR1',
    서열번호 7로 표시되는 CDR2', 및
    서열번호 8로 표시되는 CDR3'의 3개의 상보성 결정 영역 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 CAR 작제물.
  6. 제5항의 상기 외인성 CAR 작제물을 발현하는 것을 특징으로 하는 면역 세포.
  7. (a) 제1항의 상기 항체인 항체 모이어티, 및
    (b) 검출 가능한 표지, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소, 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된 상기 항체 모이어티와 접합되는 접합 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  8. 제1항의 상기 항체, 제4항의 상기 재조합 단백질, 제5항의 상기 CAR 작제물, 제6항의 상기 면역 세포, 제7항의 상기 항체-약물 접합체, 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되며,
    (a) 검출 제제 또는 키트의 제조, 및/또는 (b) IL-36 관련 질병을 예방 및/또는 치료하는 약제의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 활성 성분의 용도.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 IL-36 관련 질병은 건선을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  10. (i) 제1항의 상기 항체, 제4항의 상기 재조합 단백질, 제5항의 상기 CAR 작제물, 제6항의 상기 면역 세포, 제7항의 상기 항체-약물 접합체, 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 활성 성분,
    (ii) 제약상 허용되는 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제1항의 상기 항체, 제4항의 상기 재조합 단백질, 또는 제5항의 상기 CAR 작제물을 코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  13. 제12항의 상기 벡터 또는 게놈에 통합된 제11항의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 숙주 세포.
  14. 샘플에서 IL-36R 단백질을 비진단성 체외 검출하는 방법으로,
    상기 방법은,
    (1) 상기 샘플을 제1항의 상기 항체 또는 제7항의 상기 항체-약물 접합체와 체외에서 접촉시키는 단계,
    (2) 복합체의 형성이 샘플에 IL-36R 단백질이 존재함을 의미하는 항원-항체 복합체 형성 여부를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 기판(지지판) 및 제1항의 상기 항체 또는 제7항의 상기 항체-약물 접합체가 포함된 테스트 스트립을 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 플레이트.
  16. (1) 제1항의 상기 항체를 포함하는 제1 용기, 및/또는
    (2) 제1항의 상기 항체에 대한 2차 항체를 포함하는 제2 용기,
    또는, 제15항의 상기 검출 플레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법으로,
    상기 방법은,
    (a) 발현에 적합한 조건 하에서, 제13항의 숙주 세포를 배양하는 단계,
    (b) 배양물로부터 제1항의 상기 항체 또는 제4항의 상기 재조합 단백질인 재조합 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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