CN108663526B - 二抗竞争免疫比浊测定试剂盒及其制作和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二抗竞争免疫比浊测定试剂盒及其制作和使用方法,本发明基于抗原‑抗体反应形成免疫复合物而发生沉淀或凝集的现象及胶乳增强免疫比浊的原理,以二抗与一抗反应形成沉淀或凝集为基础,通过制备二抗‑胶乳连接物,以二抗‑胶乳连接物确定一抗抗体滴度,限定一抗的量,在测定反应体系中,有抗原存在时,抗原将和二抗竞争一抗的结合位点,从而抑制一抗和二抗形成免疫复合物,降低凝集或沉淀效果。本发明通过通用性的二抗‑胶乳可以标化胶乳颗粒制备过程,减少不同胶乳,不同制备方法,不同抗体所建立的试剂盒之间产品质量差异,尤其适合临床上制备试剂盒;当抗原过量检测时,可以消除钩状效应所产生的“假阴性”结果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒及其制作和使用方法。
背景技术
免疫比浊分析方法在临床得到普遍开展,有几十种试剂盒已在临床应用,同时新的生物标记物的发现,将不断推进这种新的试剂盒产生。目前主要有两种类型,一种是直接将抗体加入反应体系中,在一定的条件下,抗原、抗体反应形成免疫复合物,产生凝集或沉淀使体系浊度改变,这种浊度变化与体系中抗原浓度具有正向的相关关系,据此可以测定样品中抗原浓度,这种方法通常称为比浊或普通比浊;第二种是在第一种方法基础上发展而来,将抗体结合到固态微粒上,可以增强凝集或沉淀的效果,以提高分析灵敏度,这种方法通常称为增强免疫比浊;以上两种方法通常称为正向免疫比浊方法。
正向增强免疫比浊分析方法一般需要将抗体以物理或化学方法联结到胶乳上,形成胶乳-抗体联结物,对应于不同的分析方案,需要制备不同的胶乳-抗体联结物,胶乳-抗体联结物的质量直接影响分析试剂盒的质量。胶乳-抗体联结物制备受居多因素影响,主要有胶乳自身性质、抗体性质及联结方法等。胶乳自身性质包括胶乳材料及合成方法,胶乳颗粒大小,胶乳表面性状等;抗体性质包括抗体种类、抗原决定族和抗体纯度等;联结方法包括物理方法和化学方法,物理吸附联结方法受粒子表面性状,大小及抗体纯度及吸附过程影响,而化学方法受粒子表面活性基团,交联剂、联结过程等影响。以上居多因素以及标化过程等,导致临床结果受试剂盒产品因素影响而难以标准化,以至于不同医院对同一检测结果无法通用,造成多次检测的现象,增加患者的检测费用。
增强免疫比浊这种均相的免疫分析过程中,维持抗原、抗体适当的比例十分重要,否则当抗原过量时,抗原-抗体免疫复合物产生沉淀或凝集的效果反而会降低,这就是免疫比浊分析中,通常所说的“钩状效应”,由于“钩状效应”存在,过量抗原检测时,免疫复合物形成沉淀的效果反而下降,会测出较低的浓度值,得出“假阴性”结果,这种假阴性结果往往会引起临床误判。
如血清中C反应蛋白(CRP)作为急性时相反应的一个极灵敏的指标,血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著地增高,可达正常水平的2000倍。为避免由于抗原过量时的假阴性结果,有人利用预反应阀值判断的方法,用于过量抗原测定,通过短时间预反应,给定浊度变化的阀值,筛选出抗原过量的样本,稀释后再测定,采用这种方法可以有效的避免“假阴性”结果,但对于不同的分析物质,由于抗体不同,给定的阀值各有所不同,另外,不同批次的抗原抗体质量不完全相同,也影响阀值的设定,除此以外,这种方法不同于常规的免疫分析过程,需要设计专用测定程序或专用设备,无法在一般自动生化分析仪上实现这种分析过程。
发明内容
为解决上述问题,本发明公开了一种胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定方法、试剂盒制作和使用方法。本发明基于抗原-抗体反应形成免疫复合物而发生沉淀或凝集的现象及胶乳增强免疫比浊的原理如图6所示,当测量反应体系中无抗原时,连接在胶乳粒子上的二抗将和体系中的第一抗体(Ab1)产生凝集反应,形成胶乳凝集物,在一定的抗体浓度条件下,这种凝集效果将达到最大,当测量反应体系中有抗原存在时,抗原将与第一抗体反应,形成可溶性免疫复合物,由于大分子的空间位阻效应,抗原将封闭第一抗体上的二抗结合位点,并形成一种竞争性的抑制效果,样品中抗原将竞争性抑制一抗-二抗免疫复合物的凝集效果,因此,随反应体系中游离抗原量增加,一抗与二抗-胶乳反应形成免疫复合物的凝集效果反而会下降,当测量体系中抗原达到一定量时,游离抗原趋向于完全抑制一抗-二抗反应的凝集效果,如果能克服胶乳和样品中其他物质的非特异性结合,反应过程浊度变化将趋向于为零。
采用这种方法,将可以制备一种通用性的二抗-胶乳连接物,配合不同的一抗而用于不同种类的样品测定,这种通用性的二抗-胶乳可以标化胶乳颗粒制备过程,减少不同胶乳,不同制备方法,不同抗体所建立的试剂盒之间产品质量差异,尤其适合临床上制备试剂盒;不仅如此,这种竞争性比浊方法还可以避免免疫比浊分析固有的 “钩状”效应,抗原过量检测时,可以消除钩状效应所产生的“假阴性”结果。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒,包括试剂1和试剂2;试剂1中含有二抗-负载物,试剂2中含有一抗;所述二抗为一抗的抗体,二抗与一抗会发生特异性反应。
进一步的改进,所述一抗为单抗或多抗,所述二抗为单抗或多抗。
进一步的改进,所述一抗为鼠单抗时,所述二抗为兔多抗;所述一抗为兔多抗时,所述二抗为羊多抗。
进一步的改进,所述一抗人转铁蛋白或人D二聚体单克隆抗体时,所述二抗为兔抗小鼠IgG;一抗为兔抗人血清淀粉样多肽A或C反应蛋白多克隆抗体时,二抗为羊抗兔IgG。
进一步的改进,由试剂1和试剂2组成,其中试剂1中含有二抗-负载物,所述负载物为胶乳粒子;试剂2中含有一抗,所述一抗为鼠单抗或兔多抗;二抗-负载物和一抗分别用磷酸缓冲液稀释,分别并加入有牛血清白蛋白、Tween20和Proclin 300。
进一步的改进,所述试剂盒中试剂1和试剂2中各成分的质量/体积百分比组成如下:
试剂组成如下组成:
试剂1:PH7.0,0.02M/L磷酸缓冲液
二抗-胶乳0.01-0.05% g/L
牛血清白蛋白0.01% g/L
Tween20 0.01% g/L
Proclin 300 0.1% g/L
试剂2:PH7.5,0.02M/L磷酸缓冲液
一抗按设定检测浓度稀释
牛血清白蛋白0.01% g/L
NaCl0.15M/L
Tween20 0.001% g/L
Proclin 300 0.1% g/L。
一种胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒的制作方法,包括如下步骤:
取乳胶粒子溶液,加入活化剂活化后再加入二抗进行连接反应,连接反应结束后加入封闭剂、表面活性剂、防腐剂,即制备得到含有二抗-负载物连接物的试剂1,所述负载物为乳胶粒子;用制备得到的二抗-负载物连接物,确定一抗的工作浓度,并按照一抗的工作浓度,用缓冲液稀释一抗,然后加入盐、表面活性剂、防腐剂制备得到含有一抗的试剂2,所述一抗为鼠单抗或兔多抗; 二抗为兔多抗或羊多抗。
进一步的改进,所述乳胶粒子为粒径40-1000nm的羧基纳米胶乳粒子,活化剂为二环己基碳二亚胺或1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺;封闭剂为含氨基的小分子、肽、或蛋白质;表面活性剂为非离子表面活性剂;防腐剂为proclin300,盐为氯化钠。
进一步的改进,乳胶粒子为粒径100nm的羧基胶乳;所述活化剂为二环己基碳二亚胺;封闭剂为蛋白质,所述蛋白质为牛血清白蛋白;表面活性剂为吐温20。
一种胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
(1)校准曲线:分别以对应的各种校准品,以从低到高的顺序,在生化分析仪上,按以下参数设定测量程序,测定波长:546nm;试剂1:试剂2:待测样品=100:100:X,即加入试剂1 100ul后,加入待测样品Xul,37℃保温5分钟,加入试剂2 100ul,读取17点和34点的光吸收值,计算第34点和17点的光吸收差值:△A=A34-A17,以校准品浓度值与 对应的△A,建立spline校准曲线函数;试剂1中含有二抗-负载物,试剂2中含有一抗;
(2)样品测定:依据以上建立的校准曲线,在相同的测量程序下,测定样品,得到样品的浓度。
综上所述,胶乳增强二抗竞争免疫试剂盒制备的具体方法是:1.将兔抗小鼠IgG二抗以化学方法结合到胶乳微粒上,加入一定的PH缓冲液、防腐剂、无机盐、表面活性剂等,制备成通常所说的反应试剂1(R1); 2、用已制备的此反应试剂1(R1),确定一抗工作浓度;3、制备包含一定工作浓度的一抗液、其中还包括PH缓冲液、防腐剂、无机盐、表面活性剂等组分的反应试剂2(R2);3. 采用一定朔源方法,制备试剂盒所需的校准品。实施分析时按自动生化分析仪一般的加样过程进行,先加入一定量的R1试剂,37℃保温3-5分钟后加入一定体积校准品或样品,混匀,再加入一定体积的R2试剂,继续反应一定时间,从加入R1试剂开始,在一定波长下,定时检测反应过程的透射光吸收值或散射光吸收值。依据常规终点方法或速率方法,选定数学模型,建立校准品抗原浓度与吸收值校准曲线,再以样品测定的光吸收变化值,计算样品浓度。
本发明的优点如下:1.针对不同分析物,通常需要制备不同种类抗体胶乳联结物,胶乳-抗体联结物的质量是试剂盒产品质量的关键因素,胶乳-抗体联结物的质量受胶乳自身性质、抗体性质及联结方法等。胶乳自身性质包括胶乳材料及合成方法,胶乳颗粒大小,胶乳表面性状等;抗体性质包括抗体种类、抗原决定族和抗体纯度等;联结方法包括物理方法和化学方法,物理吸附联结方法受粒子表面性状,大小及抗体纯度及吸附过程影响,而化学方法受粒子表面活性基团,交联剂、联结过程等影响。以上居多因素影响,同时由于抗体蛋白和胶乳颗粒的多样性,即使是同一胶乳和抗体,无任是采用物理方法还是化学方法,不同生产商,由于不同胶乳-抗体联结物制备方法不完全一致,都无法获得完全相同试剂盒产品。导致临床结果受试剂盒产品因素影响而难以标准化,以至于不同医院对同一检测结果无法通用,造成多次检测的现象,增加患者的检测费用。采用二抗-胶乳建立方法,可以避免不同胶乳,不同一抗及不同制备胶乳-抗体联结物等因素对产品质量的影响,有利于临床检测结果标化,达到检测结果通用,减少患者检测费用。
2.现有的免疫比浊方法,对于每一种分析物,需要制备对应的一种胶乳-抗体联结物,其试剂盒的研发过程需要对抗体种类,胶乳种类,胶乳大小及联结方法进行研究获得最佳的检测方案,制备出试剂盒;生物技术日新月异,临床上有价值的新标识物不断被发现,需要开发的新试剂盒不断增加,这为试剂盒开发增加了巨大的工作量,同时许多抗原价格昂贵甚至难以得到,采用抗原连接的抑制比浊方法难以实现。若采用通用性的二抗-胶乳联结物,开发方法,可以避免居多种类抗原影响,可以达到同一种二抗-胶乳联结物测定不同抗原的目的,即同一种二抗-胶乳形成不同抗原种类的试剂盒,可以极大地节省试剂盒研发时间,减少研发工作量。
3.与胶乳增强免疫抑制比浊方法比较:胶乳增强免疫抑制比浊方法通常需要制备抗原-胶乳联结物,且联结物需要较高浓度的抗原物质,对应价格较高的抗原,这种方法研发及实际生产过程都需要较高的抗原成本,由于二抗价格相对较低,如果采用二抗通用性试剂,可以降低研发及生产成本。
4.目前市面上的胶乳免疫比浊试剂盒,以所谓正向免疫比浊为主流,即胶乳联结第一抗体形成以胶乳-抗体试剂,样品中的抗原与胶乳-抗体(一抗)形成免疫复合物,产生浊度,由此测定样品中抗原浓度,这种技术需要针对不同的抗原制备不同的胶乳-一抗联结物,以本发明的方法,只需要制备针对不同一抗的二抗胶乳这种通用性的试剂,就可以用于不同的抗原分析,如上技术方案种一中制备的抗小鼠IgG胶乳-二抗试剂,结合单克隆抗体可以分别测定血清中D-二聚体及尿液中的转铁蛋白,如图(2),图(3)所示,而所制备的抗兔IgG二抗,可以分别测定由兔产生的一抗的人血清中SAA及CRP,如图(4),图(5)所示;不仅如此,这种二抗胶乳试剂,还可以筛选到同类抗体中的最佳抗体用于试剂盒制备,如图(1)所示。
5.按此方法制备的试剂盒,基本技术参数,包括精密度,偏差,检测下线等,可以满足目前临床需要,结果如表(二)所示。
6.基质效应,直接影响样品测定结果,而这种基质效应往往由于非特异结合所引起,采用竞争性分析方法,可以有效避免这种非特异性结合对结果的影响,高、低值样品的混合测定的结表面,这种二抗竞争分析方法,在测定范围内,样品稀释效果符合测定要求,如表(三)所示。
7.正向的胶乳免疫比浊方法,通常有所谓的“钩状”效应,当抗原过量时,会出现假阴性结果,二抗竞争分析方法可以有限避免假阴性出现,对应D-D,当样品浓度高达100mg/L,不会出现结果降低的现象,而对应于Trf,SAA,CRP,当样品浓度高达2000mg/L时,也不会出现结果降低的现象,这有利的扩充了临床应用范围,如表(四)。
由上述可知,采用胶乳连接抗原的方式所建立的抑制比浊方法,可以克服“钩状效应”所产生的假阴性结果,但需要制备胶乳-抗原连接物质,建立方法需要耗费大量抗原物质,有许多抗原物质价格昂贵甚至难以得到。
因此,本发明采用胶乳连接二抗,制备二抗胶乳,以二抗-胶乳连接物确定抗人单克隆抗体或多抗(一抗)滴度,限定一抗,二抗的量,在测定反应体系中,有抗原存在时,抗原将和二抗竞争一抗的结合位点,从而抑制一抗和二抗形成免疫复合物,降低凝集或沉淀效果。采用这种方法,可以制备一种通用性的二抗-胶乳连接物,配合不同的一抗而用于不同种类的样品测定。
附图说明
图1为单抗、多抗滴度测定图;
图2为D-D校准曲线图;
图3为Trf校准曲线图;
图4为SAA校准曲线图;
图5 为CRP校准曲线图;
图6为二抗竞争抑制比浊原理图。
具体实施方式
实施例1
1.1兔抗小鼠IgG二抗-胶乳连接物(YSab-Latex)制备
市售的用于免疫比浊的羧基纳米胶乳粒子(粒径100nm,10%浓度),取0.2ml粒子,加入PH 4.6,0.02M磷酸缓冲液(PB)0.8ml,稀释到1%粒子浓度,加入20ul二环己基碳二亚胺(20mg/ml),37℃摇床保温反应20分钟活化后,加入0.5ml,PH7.5,0.02M磷酸缓冲液(PB)及0.02ml纯化兔抗小鼠抗体(10mg/ml),37℃摇床保温再反应60分钟,待联结反应结束后,加PH7.5,0.02M磷酸缓冲液使其稀释到10ml,再加入10%浓度的牛血清白蛋白0.1ml,1% tween0.1ml, 37℃摇床保温再反应30分钟封闭并终止反应,即可制备出兔抗小鼠二抗-胶乳连接物(YSab-Latex)。
1.2 羊抗兔IgG二抗-胶乳联结物(YTab-Latex)制备
市售的用于免疫比浊的羧基纳米胶乳粒子(粒径100nm,10%浓度),取0.2ml粒子,加入PH 4.6,0.02M磷酸缓冲液(PB)0.8ml,稀释到1%粒子浓度,加入20ul二环己基碳二亚胺(20mg/ml),37℃摇床保温反应20分钟活化后,加入0.5ml,PH7.5,0.02M磷酸缓冲液(PB)及0.01ml纯化羊抗兔抗体(10mg/ml),37℃摇床保温再反应60分钟,待联结反应结束后,加PH7.5,0.02M磷酸缓冲液使其稀释到10ml,再加入10%浓度的牛血清白蛋白0.1ml,1% tween0.1ml, 37℃摇床保温再反应30分钟封闭并终止反应,即可制备出羊抗兔IgG二抗-胶乳连接物(YTab-Latex)。
实施例2
一抗的滴度测定:
2.1小鼠单克隆抗体滴度测定:以水倍比稀释被检测的小鼠抗人转铁蛋白、D-二聚体(DD2)单克隆抗体(Tfr),以0.02M,PH7.0(含NaCl 0.15M)的磷酸盐缓冲液为R1,用以上方法制备的兔抗小鼠IgG二抗-胶乳连联结物(YSab-Latex)为R2,在日立7170S全自动生化分析仪上,按以下参数设定测量程序,测定不同稀释度的一抗液;测定波长:546nm;R1:R2:样品=100:100:20,即加入100ulR1后,加入样品20ul,37℃保温5分钟,再加入100ul R2,读取17点和34点的光吸收值,计算第34点和17点的光吸收差值:△A=A34-A17。差值最大的稀释度即为一抗的工作浓度(滴度)。
2.2兔多克隆抗体滴度测定:以水倍比稀释被检测的兔抗人血清淀粉样多肽A及C反应蛋白(CRP)多克隆抗体,以0.02M,PH7.0(含NaCl 0.15M)的磷酸盐缓冲液为R1,用以上方法制备的羊抗兔IgG二抗-胶乳连联结物(YTab-Latex)为R2,在日立7170S全自动生化分析仪上,按以下参数设定测量程序,测定不同稀释度的一抗液;测定波长:546nm;R1:R2:样品=100:100:20,即加入100ulR1后,加入样品20ul,37℃保温5分钟,再加入100ul R2,读取17点和34点的光吸收值,计算第34点和17点的光吸收差值:△A=A34-A17。差值最大的稀释度即为一抗的工作浓度(滴度)。
结果如表(一)和图1所示:其中表(一)加粗数字对应的滴度即对应一抗选定的滴度。
表(一)单抗、多抗滴度测定
实施例3
3.1兔抗小鼠IgG二抗试剂盒的制备:
3.1.1兔抗小鼠IgG二抗D-D试剂盒:
试剂R1配制:以上制备的兔抗小鼠IgG二抗-胶乳连接物(YSab-Latex)加入防腐剂proclin300,使其浓为0.1%,其中,胶乳浓度为2mg/ml。
试剂R2配制:每升0.02M,PH7.0(含NaCl 0.15M)的磷酸盐缓冲液中,加入牛血清白蛋白1克,0.1克tween20 ,1ml proclin300,混匀后,经0.22um的膜过滤,用以上液体按1:100稀释小鼠抗人D-D单抗。
3.1.2 兔抗小鼠IgG二抗Tf试剂盒:
试剂R1配制:(同上D-D试剂盒R1)以上制备的兔抗小鼠IgG二抗-胶乳连接物(YSab-Latex)加入防腐剂proclin300,使其浓为0.1%,其中,胶乳浓度为2mg/ml。
试剂R2配制:每升0.02M,PH7.0(含NaCl 0.15M)的磷酸盐缓冲液中,加入牛血清白蛋白1克,0.1克tween20 ,1ml proclin300,混匀后,经0.22um的膜过滤,用以上液体按1:100稀释小鼠抗人Tf单抗。
3.1.3测量程序,以上制备兔抗小鼠IgG二抗-胶乳连接物(YTab-Latex)R1及对应的R2试剂,分别按以下测量参数测定校准品,建立各自校准曲线并测定样品。测定波长:546nm;R1:R2:样品=100:100:10,即加入100ul R1后,加入样品10ul,37℃保温5分钟,加入100ul R2,读取17点和34点的光吸收值,计算第34点和17点的光吸收差值:△A=A34-A17。
3.1.4测量用校准曲线制备及样品测定:市购D-D校准品水配制成0,0.45,1.10,2.20,4.1,6.35,15.5(mg/L);人转铁蛋白校准品,用生理盐水配制成以下浓度系列的标准浓度:0、5、10,20、50、100、200(mg/L),按以上参数校准全自动生化分析仪,按样条函数计算模型,建立校准曲线。
3.2羊抗兔IgG二抗试剂盒:
3.2.1羊抗兔IgG二抗SAA试剂盒
试剂R1配制:以上制备的羊抗兔IgG二抗-胶乳连接物(YTab-Latex)加入防腐剂proclin300,使其浓为0.1%,其中,胶乳浓度为2mg/ml。
试剂R2配制:每升0.02M,PH7.0(含NaCl 0.15M)的磷酸盐缓冲液中,加入牛血清白蛋白1克,0.1克tween20 ,1ml proclin300,混匀后,经0.22um的膜过滤,用以上液体按1:400稀释兔抗人SAA多抗。
3.1.2 羊抗兔IgG二抗CRP试剂盒:
试剂R1配制:(同上SAA试剂盒R1)以上制备的兔抗小鼠IgG二抗-胶乳连接物(YTab-Latex)加入防腐剂proclin300,使其浓为0.1%,其中,胶乳浓度为2mg/ml。
试剂R2配制:每升0.02M,PH7.0(含NaCl 0.15M)的磷酸盐缓冲液中,加入牛血清白蛋白1克,0.1克tween20 ,1ml proclin300,混匀后,经0.22um的膜过滤,用以上液体按1:300稀释一抗。
3.1.3测量程序,以上制备羊抗兔IgG二抗-胶乳连接物(YTab-Latex)R1及对应的R2试剂,分别按以下测量参数测定校准品,建立各自校准曲线并测定样品。测定波长:546nm;R1:R2:样品=100:100:10,即加入100ul R1后,加入样品10ul,37℃保温5分钟,加入100ul R2,读取17点和34点的光吸收值,计算第34点和17点的光吸收差值:△A=A34-A17。
3.1.4测量用校准曲线制备及样品测定:市购SAA校准品水配制成0、5、10,20、50、100、200(mg/L);CRP校准品,用水配制成以下浓度0,0.5,5,10,50,100,200(mg/L),按以上参数校准全自动生化分析仪,按样条函数计算模型,建立校准曲线。
实施例4
按以上方法分别建立校准曲线,待通过校准后,将各自校准品按样品回测,每个校准品重复测定10次,得到测定值,最低检测下线以零点测定值的3SD计算。校准曲线分别如图2-5所示,其它结果如下表(二)。
表(二)校准品回测精密度及偏差
实施例5
按以上建立的校准曲线,四种对应的高值及低值样品(Trf为尿样,其他为血清样品),低值样品X1和高值样品X2,按以下比例分别混合高地值样品X1+0X2,3X1+X2,2X1+2X2,0X1+X2,分别测定各混合样品浓度,每个样品测定3次,计算各样品均值及百分偏差(见表三),在此混合稀释条件下,样品浓度结果与稀释有较好线性关系。选定各种低值血清,加入标准抗原,加入体积不超过10%后,再用低值血清稀释高值样品,按50,100,200倍稀释后分别测定样品浓度,每个样品测定三次,计算均值(不计原始样品浓度),结果见表(四),以上D-D,Trf,SAA,CRP浓度分别高达100,2000,2000,2000(mg/L)时,未见假性降低的测定结果,稀释后可反映出实际浓度值。
表(三)高低值样品混合稀释测定结果
表(四)高值样品及稀释后浓度测定(mg/L)
上述各试剂可以有如下替换方式:
1、连接反应的试剂类型
市售的胶乳有至少三种类型,包括羧基,羟基,巯基等,所采取的连接抗原的方法各有所不同,但其基本的设计是将抗原连接到胶乳粒子上,无任采取那种方法,最种得到的结果都是制备出合适的胶乳-抗原的连接物质以便于增强免疫比浊分析。对于羧基胶乳,也可以采取不同的活化试剂包括EDC,EDC钠盐,TBE等等,在一定的合适PH、温度等条件下以制备胶乳-抗原连接物。
2、粒子的类型
市售的胶乳包涵各种不同粒度大小,如羧基胶乳有40,80,100,150,200,300,500,1000纳米等等,无任选取何种大小的胶乳,在一定条件下都可以制备出胶乳-二抗连接物以实现上述过程。
3、名字,竞争免疫比浊反应
基于二抗连接物所建立的增强抑制比浊方法,目前没有在专业表述上统一,有人将其称为竞争免疫比浊或抑制免疫比浊等,尽管名称不同,其实际原理完全一样。
4、抗体的种类及抗原的种类
连接到胶乳粒子上的抗体,可以是多种,包括单抗和多抗,单抗又包括鼠单抗和兔单抗等等,多抗包括兔多抗,羊多抗等等。
5、仪器的类型
目前,用以检测免疫比浊反应的仪器有至少两种类型,一种是基于透射比浊测定生化分析仪,还有一种是基于散射比浊测定的所谓特种蛋白测定仪。包括半自动及全自动两种类型,生产厂家也有许多,比较有名的国外厂家有日立,西门子,罗氏、贝克曼等,国内产家有迈瑞、库备尔、科华、优利特等。各种仪器类型都可以用于抗体筛选、试剂盒方法建立及临床应用。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但并不仅仅限于说明书和实施方案中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里所示出与描述的图例。
Claims (10)
1.一种胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒,其特征在于,包括试剂1和试剂2;试剂1中含有二抗-负载物,试剂2中含有一抗;所述二抗为一抗的抗体,二抗与一抗会发生特异性反应;负载物为胶乳粒子。
2.如权利要求1所述的胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒,其特征在于,所述一抗为单抗或多抗,所述二抗为单抗或多抗。
3.如权利要求2所述的胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒,其特征在于,所述一抗为鼠单抗时,所述二抗为兔多抗;所述一抗为兔多抗时,所述二抗为羊多抗。
4.如权利要求3所述的胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒,其特征在于,所述一抗为人转铁蛋白或人D二聚体单克隆抗体时,所述二抗为兔抗小鼠IgG;一抗为兔抗人血清淀粉样多肽A或C反应蛋白多克隆抗体时,二抗为羊抗兔IgG。
5.如权利要求1所述的胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒,其特征在于,由试剂1和试剂2组成,其中试剂1中含有二抗-负载物,所述负载物为胶乳粒子;试剂2中含有一抗,所述一抗为鼠单抗或兔多抗;二抗-负载物和一抗分别用磷酸缓冲液稀释,再分别加入有牛血清白蛋白、Tween20和Proclin 300。
6.如权利要求5所述的胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中试剂1和试剂2中各成分的质量/体积百分比组成如下:
试剂组成如下:
试剂1:PH7.0,0.02M/L磷酸缓冲液
二抗-胶乳0.01-0.05% g/L
牛血清白蛋白0.01% g/L
Tween20 0.01% g/L
Proclin 300 0.1% g/L
试剂2:PH7.5,0.02M/L磷酸缓冲液
一抗按设定检测浓度稀释
牛血清白蛋白0.01% g/L
NaCl0.15M/L
Tween20 0.001% g/L
Proclin 300 0.1% g/L。
7.一种胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒的制作方法,其特征在于,包括如下步骤:
取乳胶粒子溶液,加入活化剂活化后再加入二抗进行连接反应,连接反应结束后加入封闭剂、表面活性剂、防腐剂,即制备得到含有二抗-负载物连接物的试剂1,所述负载物为乳胶粒子;用制备得到的二抗-负载物连接物,确定一抗的工作浓度,并按照一抗的工作浓度,用缓冲液稀释一抗,然后加入盐、表面活性剂、防腐剂制备得到含有一抗的试剂2,所述一抗为鼠单抗或兔多抗; 二抗为兔多抗或羊多抗。
8.如权利要求7所述的胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒的制作方法,其特征在于,所述乳胶粒子为粒径40-1000nm的羧基纳米胶乳粒子,活化剂为二环己基碳二亚胺或1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺;封闭剂为含氨基的小分子、肽、或蛋白质;表面活性剂为非离子表面活性剂;防腐剂为proclin300,盐为氯化钠。
9.如权利要求8所述的胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒的制作方法,其特征在于,乳胶粒子为粒径100nm的羧基胶乳;所述活化剂为二环己基碳二亚胺;封闭剂为蛋白质,所述蛋白质为牛血清白蛋白;表面活性剂为吐温20。
10.一种胶乳增强二抗竞争免疫比浊测定试剂盒的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)校准曲线:分别以对应的各种校准品,以从低到高的顺序,在生化分析仪上,按以下参数设定测量程序,测定波长:546nm;试剂1:试剂2:待测样品=100:100:X,即加入试剂1100ul后,加入待测样品Xul,37℃保温5分钟,加入试剂2 100ul,读取17点和34点的光吸收值,计算第34点和17点的光吸收差值:△A=A34-A17,以校准品浓度值与对应的△A,建立spline校准曲线函数;试剂1中含有二抗-负载物,试剂2中含有一抗;所述负载物为胶乳粒子;
(2)样品测定:依据以上建立的校准曲线,在相同的测量程序下,测定样品,得到样品的浓度。
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