CN110133270A - 一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和使用方法 - Google Patents
一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110133270A CN110133270A CN201810132991.7A CN201810132991A CN110133270A CN 110133270 A CN110133270 A CN 110133270A CN 201810132991 A CN201810132991 A CN 201810132991A CN 110133270 A CN110133270 A CN 110133270A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- immunosupress
- turbid
- enhancing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 48
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims abstract description 41
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 34
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 14
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 11
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 7
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 6
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical group C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 claims 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 claims 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 claims 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 abstract description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 3
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 2
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000022461 Glomerular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000013901 Nephropathies and tubular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000004658 acute-phase response Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 amine sulfate Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 231100000852 glomerular disease Toxicity 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000000790 scattering method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和使用方法。采用本发明的增强免疫抑制比浊方法，从免疫反应的原理上克服了现有的增强免疫比浊方法的缺陷，当测量反应体系中无抗原时，连接在胶乳粒子上的抗原将和体系中的限量抗体产生凝集反应，且这种凝集效果达到最大，当测量反应体系中有抗原存在时，由于抗体的量已限定，游离的抗原为过量抗原，过量抗原将抑制抗原‑抗体复合物凝集效果，因此，随反应体系中游离抗原量增加，抗原‑抗体复合物的凝集效果反而会下降，当测量体系中抗原达到一定量时，游离抗原将完全抑制抗体与胶乳上的抗原结合，如果能克服胶乳和样品中过量抗原及其他物质的非特异性结合，反应过程浊度变化将为零。
Description
技术领域
本专利属于生物技术领域，尤其涉及一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和使用方法。
背景技术
免疫分析技术从放射免疫分析方法建立以来，经过几十年发展，以免疫反应原理结合标记技术，建立了以同位素标记技术为基础的放射免疫分析方法，以酶标记技术为基础的酶联免疫分析方法，以发光物质标记技术为基础的生物发光、化学发光和电化学发光的发光免疫分析方法，以金属螯合物标记技术为基础的时间分辨荧光免疫分析方法等等。以上分析方法依赖于检测抗原-抗体复合物中标记物的量测定抗原或抗体。其基本特征是需要分离所形成的抗原-抗体免疫复合物。
另一类免疫分析方法是基于抗原-抗体反应形成沉淀或凝集的现象，当抗原-抗体反应形成沉淀或凝集时，反应体系的光学性质发生改变形成浊度变化，通过透射或散射方法，测定反应体系中浊度变化可以测定对应的抗原或抗体的浓度。这就是通常所说的免疫比浊分析方法，这种方法不需要分离抗原-抗体免疫复合物而直接测定，是一种均相免疫分析方法，由于不需要分离过程，这种方法更加方便，更加有利于自动化分析，尤其适应已被广泛应用于临床检验中的全自动生化分析仪。
免疫比浊这种均相的免疫分析过程中，维持抗原、抗体适当的比例十分重要，否则当抗原过量时，抗原-抗体免疫复合物产生沉淀或凝集的效果反而会降低，这就是免疫比浊分析中，通常所说的“钩状效应”，由于“钩状效应”存在，过量抗原检测时，免疫复合物形成沉淀的效果反而下降，会测出较低的浓度值，得出“假阴性”结果，这种假阴性结果往往会引起临床误判。如血清中C反应蛋白(CRP)作为急性时相反应的一个极灵敏的指标，血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著地增高，可达正常水平的2000倍。又如尿微量白蛋白是反映肾小球疾病和肾损伤的一个非常灵敏的指标。尤其在糖尿病、高血压等疾病发生的早期用于了解肾脏的损伤情况有特殊的意义，正常状态下，人尿液中白蛋白的含量低于20mg/L，当有肾损伤时，微量白蛋白可高达1000mg/L甚至更高。为避免由于抗原过量时的假阴性结果，有人利用预反应阀值判断的方法，用于过量抗原测定，通过短时间预反应，给定浊度变化的阀值，筛选出抗原过量的样本，稀释后再测定，采用这种方法可以有效的避免“假阴性”结果，但对于不同的分析物质，由于抗体不同，给定的阀值各有所不同，另外，不同批次的抗原抗体质量不完全相同，也影响阀值的设定，除此以外，这种方法不同于常规的免疫分析过程，需要设计专用测定程序或专用设备，无法在一般自动生化分析仪上实现这种分析过程。
新型免疫比浊方法中，引入了胶乳微粒，将抗体或抗原连接到纳米胶乳上，在一定的条件下再与对应的抗原、抗原反应，可以形成微球-免疫复合物，增强了免疫复合物的凝集效果，由此增强了分析灵敏度，这就是所谓的增强免疫比浊方法；尽管增强免疫比浊方法有提高分析灵敏度的优势，但胶乳材料、与抗原或抗体连接的方式、两者的比例，所形成微粒的表面性质、反应环境等居多因素直接影响到分析方法的各种参数。
现有的抗体制备(尤其是单克隆抗体)过程中，抗体筛选通常采用酶联免疫方法，由于抗体具有不同的抗原决定簇，不同的抗原决定簇的抗体在与不同微粒-抗原物及不同反应环境发生免疫沉淀或凝集反应时，所产生的浊度变化效果也将有所不同。因此，用此方法筛选到的抗体，不一定适合于免疫比浊分析方法，尤其在用单克隆抗体制备抗体用于免疫比浊试剂时，采用酶联免疫法方法筛选到的抗体，有可能不会产生免疫沉淀而使得免疫比浊方法失效。
上述抗体筛选办法存在的问题主要如下：
1.抗体筛选过程：抗体具有多个抗原决定簇，不同决定簇的抗体将表现出不同的性状，这就要求在制备抗体的过程中，依据不同用途，要采取不同的筛选方法，如用于EILSA的分析用抗体，需要采用ELISA方法筛选，用于病理切片的免疫组化抗体需要用病理组织切片筛选抗体等等。临床免疫比浊试剂盒需要大量使用抗体，且抗体原料是免疫比浊试剂盒中关键性的原料，其质量和价格直接影响到试剂盒的质量和价格，试剂盒研发和生产商通常依据小试工艺确定抗体原料的质量，但涉及到大量的抗体筛选时，需要耗费巨大的时间和经费，如果是希望在抗体制备过程中，尤其是在单抗制备过程中，筛选到最适合免疫比浊分析用的抗体，这种小试方法将无法使用。对于这种免疫比浊专一化的抗体筛选，目前并没有公开的统一方法，这对于试剂盒的研发和生产过程中，其关键性的抗体原料筛选及质量控制等过程中都缺乏有效的方法和依据，尤其是需要制备专一性免疫比浊单抗时，将无法确保在一个制备周期中得到最有效的免疫比浊抗体。
2.以抗体连接胶乳的增强免疫比浊方法：在增强免疫比浊分析过程中，由于受仪器测量范围和胶乳浓度的限制，各种设计方法都存在一定的浓度检测极限，且由于免疫反应的特点，当抗原过量时，免疫反应的浊度反而会随抗原浓度增加而下降，这就是所谓免疫反应的“沟状效应”，在临床检测试剂盒中，这种方法缺陷将导致临床结果的假阴性，从而引起对临床诊断和治疗效果的误判。现有的试剂盒说明书中通常会告知，当遇到抗原过量时，需要稀释样本再测量，同时还会有用于样本稀释所需稀释液的研究数据，但实际过程中，大量的临床样本中，我们无法预知哪些样本需要稀释，也就是说我们无法预知哪些结果是假阴性，如果需要确保无假阴性结果，按现有方法需要对所有的样本进行稀释过程再测定，这在临床上将无法实现。
3.胶乳与抗原或抗体的连接过程及产物的性质，直接影响分析过程，按一般方法，制备的连接物易产生凝集现象，通常需要再制备过程中加入离心、超声等工艺过程，这将增加试剂盒生产工艺流程，尤其再加入了超声的制备工艺不稳定，且工艺过程难以放大。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和方法。采用本发明的增强免疫抑制比浊方法，从免疫反应的原理上克服了现有的增强免疫比浊方法的缺陷，其所利用的就是免疫反应凝集的过量抗原曲线部分，当测量反应体系中无抗原时，连接在胶乳粒子上的抗原将和体系中的抗体产生凝集反应，且这种凝集效果达到最大，当测量反应体系中有抗原存在时，由于抗体的量已限定，游离的抗原为过量抗原，过量抗原将抑制抗原-抗体复合物凝集效果，因此，随反应体系中游离抗原量增加，抗原-抗体复合物的凝集效果反而会下降，当测量体系中抗原达到一定量时，游离抗原将完全抑制抗体与胶乳上的抗原结合，如果能克服胶乳和样品中过量抗原及其他物质的非特异性结合，反应过程浊度变化将为零。尽管这种方法无法将高浓度范围无限扩展，但不会出现假阴性的检测结果，还将有效的筛选出过线的高浓度样本，当确有需要时，可以稀释高浓度样本，再次测定以得到准确结果。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂，包括负载物，负载物上负载有抗原-抗体凝聚体。
进一步的改进，所述负载物为胶乳粒子。
进一步的改进，所述胶乳粒子为40nm-500nm范围的氨基或羧基活性胶乳。
进一步的改进，所述抗原为小分子蛋白连结物所形成的半抗原或生物大分子抗原，所述抗体为小分子蛋白连结物所形成的半抗原或生物大分子抗原所制备的单抗或多抗。
一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂的制作方法，包括如下步骤：
取乳胶粒子溶液，加入活化剂活化后再加入抗原进行连接反应，连接反应结束后加入封闭剂即制备得到抗原-胶乳连接物即增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂。
进一步的改进，所述乳胶粒子为羧基纳米胶乳粒子，活化剂为二环己基碳二亚胺，抗原为人转铁蛋白，抗体为抗人转铁蛋白的单抗或多抗，封闭剂为牛血清白蛋白。
进一步的改进，包括如下步骤：
取粒径100nm,10％浓度的羧基纳米胶乳粒子0.2ml，加入PH 4.6，0.02M磷酸缓冲液0.8ml，加入20ul浓度为20mg/m l的二环己基碳二亚胺，37℃摇床保温反应20分钟活化后，加入0.8ml，PH7.5，0.02M磷酸缓冲液及0.2ml浓度为5mg/ml人转铁蛋白，37℃摇床保温再连接反应60分钟，待连结反应结束后，加PH7.0，0.02M磷酸缓冲液使总溶液的体积到10ml，再加入10％浓度的牛血清白蛋白0.1ml，1％吐温20 0.1ml，37℃摇床保温再反应30分钟封闭并终止反应，即可制备得到人转铁蛋白-胶乳连接物。
一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂的使用方法，包括如下步骤：
所述增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂包括负载物，负载物上负载有抗原-抗体凝聚体；
在全自动生化分析仪内加入被检测单抗或多抗体样品，然后加入增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂，测量吸光差值，筛选出最佳抗体。
进一步的改进，包括如下步骤：
以水倍比稀释上清液得到待测样品，所述上清液为被检测单抗或多抗体样品，以0.02M，PH7.0且含NaCl 0.15M的磷酸盐缓冲液为R1，以增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂为R2，在日立7170S全自动生化分析仪上，按以下参数设定测量程序，测定各种上清液；测定波长：546nm；R1：R2：待测样品＝100：100：20，即加入R1100ul后，加入待测样品20ul，37℃保温5分钟，加入R2 100ul，读取17点和34点的光吸收值，计算第34点和17点的光吸收差值：△A＝A34-A17；在相同比度抗体的条件下光吸收差值最大的即为最佳抗体。
进一步的改进，所述负载物为羧基纳米胶乳粒子，抗原为人转铁蛋白，抗体为抗人转铁蛋白的单抗或多抗，且，封闭剂为牛血清白蛋白。
附图说明
图1为5种克隆腹水纯化单抗滴度筛选图；
图2为6个兔纯化多抗滴度筛选图；
图3为各种单抗1：200稀释的校准曲线图；
图4为各种多抗1：400稀释的校准曲线图；
图5a为单抗测量方法与多抗测量方法比较散点图及回归方程；
图5b为多抗测量方法与试剂盒方法比较散点图及回归方程；
图5c为多抗测量方法(B)与试剂盒方法比较散点图及回归方程。
实施例
实施例1
人转铁蛋白-胶乳连接物(Trf-Latex)及人抗体制备制备：
市售的用于免疫比浊的羧基纳米胶乳粒子(粒径100nm,10％浓度)，取0.2ml粒子，加入PH 4.6，0.02M磷酸缓冲液(PB)0.8ml，-，加入20ul二环己基碳二亚胺(20mg/ml)，37℃摇床保温反应20分钟活化后，加入0.8ml，PH7.5，0.02M磷酸缓冲液(PB)及0.2ml人转铁蛋白(5mg/ml)，37℃摇床保温再反应60分钟，待连结反应结束后，加PH7.0，0.02M磷酸缓冲液使其稀释到10ml，再加入10％浓度的牛血清白蛋白0.1ml，1％吐温20 0.1ml，37℃摇床保温再反应30分钟封闭并终止反应，即可制备出人转铁蛋白-胶乳连接物(Trf-Latex)。
人来源的转铁蛋白(sigma)，加完全福氏佐剂混合后按常规免疫方法免疫小鼠和兔，小鼠脾细胞经细胞融合后及ELISA和Westblot筛选出了五株不同克隆号的单抗细胞株，制备腹水；免疫好的兔心脏取血，离心分离血清。腹水和兔抗血清经硫酸胺方法纯化后，测定蛋白浓度并将各抗体稀释到相同的蛋白浓度备用。
实施例2
抗体滴度检测方法：以水倍比稀释上述被检测单抗或多抗体样品，以0.02M，PH7.0(含NaCl 0.15M)的磷酸盐缓冲液为R1，用以上方法制备的抗原-纳米胶乳连结物为R2，在日立7170S全自动生化分析仪上，按以下参数设定测量程序，测定各种上清液；测定波长：546nm；R1：R2：样品＝100：100：20，即加入R1100ul后，加入样品20ul，37℃保温5分钟，加入R2100ul，读取17点和34点的光吸收值，计算第34点和17点的光吸收差值：△A＝A34-A17。5种不同单抗和6个兔免疫获得的多抗的筛选结果如图1和图2所示，其中单抗已2H5F1为最佳，多抗已3号兔为最佳。
表(一)单抗稀释度筛选
表(二)多抗滴度筛选
实施例3
人转铁蛋白增强免疫抑制比浊分析方法及试剂盒制备
3.1试剂R1配制：以上制备的人转铁蛋白-胶乳连接物(Trf-Latex)，加入防腐剂proclin300，使其浓为0.1％，其中，胶乳浓度为2mg/ml，胶乳与抗原质量比为20：1。
3.2试剂R2配制：每升0.02M，PH7.0(含NaCl 0.15M)的磷酸盐缓冲液中，加入牛血清白蛋白0.1克，单抗5ml或多抗2.5ml，0.1克tween20，1ml proclin300，混匀后，经0.22um的膜过滤。
3.3测量程序：按以下测量参数实施测量实施。测定波长：546nm；R1：R2：样品＝100：100：10，即加入100ul R1后，加入样品10ul，37℃保温5分钟，加入100ul R2，读取17点和34点的光吸收值，计算第34点和17点的光吸收差值：△A＝A34-A17。
3.4测量用校准曲线制备及样品测定：人转铁蛋白校准品，用生理盐水配制成以下浓度系列的标准浓度：0、5、20、50、100、200(mg/L)，按以上参数校准全自动生化分析仪，按样条函数计算模型，建立校准曲线。
3.5按以上测量方法，利用已校准的校准曲线和测量程序，测量样品，得到测定结果。
3.6单抗胶乳增强抑制免疫比浊分析方法：5种单抗配制成1：200的稀释度，按以上校准曲线分别测定，结果见表(三)，图3筛选到的最佳的抗体为2H5F1。
表(三)各种单抗1：200稀释的校准曲线
3.7多抗胶乳增强抑制免疫比浊分析方法：6种多抗配制成1：400的稀释度，按以上校准曲线分别测定，结果见表(四)，图4筛选到的最佳的抗体为3#兔。
表(四)各种多抗1：400稀释的校准曲线546nm的反应度(△)
3.8方法比较：以人转铁蛋白-胶乳连接物(Trf-Latex)分别与单抗2H5F1(1：200)及多抗3#(1：400)分别建立的增强免疫抑制比浊方法(方法A，方法B)，分别按以上测量程序检测人尿样(100份)并与市售试剂盒方法(方法C)依据NCCLS(EP9-A2)原则比较三种方法测量结果。三种方法结比较见(表五)散点图见图5a、5b和5c
表(五)三种方法样品测定结果比较
| 回归方程 | R | |
| A方法与B方法 | Y＝1.018*X-0.836 | 0.9949 |
| A方法与C方法 | Y＝0.858*X+2.99 | 0.9877 |
| B方法与C方法 | Y＝0.841*X+3.76 | 0.9893 |
3.9高值样品测定：三个高值样品种，其中市售试剂盒测定的结果出现假阴性结果，但A，B两种方法均未出现假阴性。将样品用生理盐水稀释10倍后再测定三次，三种方法均可以测定到高值准确结果。
表(六)三个高值样品稀释前后三种方法测定结果比较
尽管本发明的实施方案已公开如上，但并不仅仅限于说明书和实施方案中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里所示出与描述的图例。
Claims (10)
1.一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂，其特征在于，包括负载物，负载物上负载有抗原-抗体凝聚体。
2.如权利要求1所述的增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂，其特征在于，所述负载物为胶乳粒子。
3.如权利要求2所述的增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂，其特征在于，所述胶乳粒子为40nm-500nm范围的氨基或羧基活性胶乳。
4.如权利要求1所述的增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂，其特征在于，所述抗原为小分子的蛋白连结物所形成的半抗原或生物大分子抗原，所述抗体为小分子的蛋白连结物所形成的半抗原或生物大分子抗原所制备的单抗或多抗。
5.一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
取乳胶粒子溶液，加入活化剂活化后再加入抗原进行连接反应，连接反应结束后加入封闭剂即制备得到抗原-胶乳连接物即增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂。
6.如权利要求5所述的增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂的制作方法，其特征在于，所述乳胶粒子为羧基纳米胶乳粒子，活化剂为二环己基碳二亚胺，抗原为人转铁蛋白，抗体为抗人转铁蛋白的单抗或多抗，封闭剂为牛血清白蛋白。
7.权利要求6所述的增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
取粒径100nm,10％浓度的羧基纳米胶乳粒子0.2ml，加入PH 4.6，0.02M磷酸缓冲液0.8ml，加入20ul浓度为20mg/m l的二环己基碳二亚胺，37℃摇床保温反应20分钟活化后，加入0.8ml，PH7.5，0.02M磷酸缓冲液及0.2ml浓度为5mg/ml人转铁蛋白，37℃摇床保温再连接反应60分钟，待连结反应结束后，加PH7.0，0.02M磷酸缓冲液使总溶液的体积到10ml，再加入10％浓度的牛血清白蛋白0.1ml，1％吐温200.1ml，37℃摇床保温再反应30分钟封闭并终止反应，即可制备得到人转铁蛋白-胶乳连接物。
8.一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
所述增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂包括负载物，负载物上负载有抗原-抗体凝聚体；
在全自动生化分析仪内加入被检测单抗或多抗体样品，然后加入增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂，测量吸光差值，筛选出最佳抗体。
9.如权利要求8所述的增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
以水倍比稀释单抗或多抗体样品，以0.02M，PH7.0且含NaCl 0.15M的磷酸盐缓冲液为R1，以增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂为R2，在日立7170S全自动生化分析仪上，按以下参数设定测量程序，测定各种倍比稀释的单抗或多抗；测定波长：546nm；R1：R2：待测样品＝100：100：20，即加入R1 100ul后，加入待测样品20ul，37℃保温5分钟，加入R2 100ul，读取17点和34点的光吸收值，计算第34点和17点的光吸收差值：△A＝A34-A17；在相同抗体稀释度的条件下光吸收差值最大的即为最佳抗体。
10.如权利要求8所述的增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂的使用方法，其特征在于，所述负载物为羧基纳米胶乳粒子，抗原为人转铁蛋白，抗体为抗人转铁蛋白的单抗或多抗，封闭剂为牛血清白蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810132991.7A CN110133270A (zh) | 2018-02-09 | 2018-02-09 | 一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810132991.7A CN110133270A (zh) | 2018-02-09 | 2018-02-09 | 一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110133270A true CN110133270A (zh) | 2019-08-16 |
Family
ID=67567584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810132991.7A Pending CN110133270A (zh) | 2018-02-09 | 2018-02-09 | 一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110133270A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110567926A (zh) * | 2019-09-11 | 2019-12-13 | 江苏宜偌维盛生物技术有限公司 | 时间分辨荧光微球偶联新型工艺及荧光微球的应用 |
| CN114047338A (zh) * | 2021-11-10 | 2022-02-15 | 上海捷门生物技术有限公司 | 一种尿液转铁蛋白检测试剂盒及其检测方法 |
| CN114236116A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-03-25 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 一种胶乳增强免疫比浊法试剂和用于提高胶乳增强免疫比浊法试剂检测准确度的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4341758A (en) * | 1978-10-14 | 1982-07-27 | Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. | Immunochemical assay reagent for the determination of haptens, and assay method therewith |
| CN102539756A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-07-04 | 王滔 | 测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫¾®球方法 |
| CN102621296A (zh) * | 2012-01-06 | 2012-08-01 | 天津医科大学 | 一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶联蛋白质的方法 |
| CN102628868A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-08-08 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒 |
| CN102854314A (zh) * | 2012-10-10 | 2013-01-02 | 深圳康美生物科技股份有限公司 | 一种胶乳免疫比浊法进行幽门螺杆菌抗体检测的试剂盒 |
| CN106290822A (zh) * | 2016-07-28 | 2017-01-04 | 武汉景川诊断技术股份有限公司 | D‑二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用 |
| CN106324239A (zh) * | 2016-07-28 | 2017-01-11 | 武汉景川诊断技术股份有限公司 | C‑反应蛋白免疫胶乳微球制备方法及应用 |
-
2018
- 2018-02-09 CN CN201810132991.7A patent/CN110133270A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4341758A (en) * | 1978-10-14 | 1982-07-27 | Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. | Immunochemical assay reagent for the determination of haptens, and assay method therewith |
| CN102539756A (zh) * | 2011-12-23 | 2012-07-04 | 王滔 | 测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫¾®球方法 |
| CN102628868A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-08-08 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒 |
| CN102621296A (zh) * | 2012-01-06 | 2012-08-01 | 天津医科大学 | 一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶联蛋白质的方法 |
| CN102854314A (zh) * | 2012-10-10 | 2013-01-02 | 深圳康美生物科技股份有限公司 | 一种胶乳免疫比浊法进行幽门螺杆菌抗体检测的试剂盒 |
| CN106290822A (zh) * | 2016-07-28 | 2017-01-04 | 武汉景川诊断技术股份有限公司 | D‑二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用 |
| CN106324239A (zh) * | 2016-07-28 | 2017-01-11 | 武汉景川诊断技术股份有限公司 | C‑反应蛋白免疫胶乳微球制备方法及应用 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110567926A (zh) * | 2019-09-11 | 2019-12-13 | 江苏宜偌维盛生物技术有限公司 | 时间分辨荧光微球偶联新型工艺及荧光微球的应用 |
| CN114047338A (zh) * | 2021-11-10 | 2022-02-15 | 上海捷门生物技术有限公司 | 一种尿液转铁蛋白检测试剂盒及其检测方法 |
| CN114047338B (zh) * | 2021-11-10 | 2024-03-12 | 上海捷门生物技术有限公司 | 一种尿液转铁蛋白检测试剂盒及其检测方法 |
| CN114236116A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-03-25 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 一种胶乳增强免疫比浊法试剂和用于提高胶乳增强免疫比浊法试剂检测准确度的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108398557A (zh) | 一种髓过氧化物酶荧光免疫层析试纸条及试纸卡 | |
| CN101699287B (zh) | 匀相溶胶颗粒型胱抑素c测定试剂盒及其制备方法 | |
| CN105510604A (zh) | 一种提高胶乳试剂灵敏度和线性的方法 | |
| CN101377492A (zh) | 胱抑素c测定试剂盒 | |
| JP5199067B2 (ja) | 免疫凝集反応試薬キット及び抗原の測定方法 | |
| EP1801590B1 (en) | Method of assaying antigen and reagent therefor | |
| CA2745610A1 (en) | Method for measuring cystatin c in human body fluid | |
| CN110133270A (zh) | 一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和使用方法 | |
| JP7483168B2 (ja) | フェリチン測定試薬 | |
| CN108663526B (zh) | 二抗竞争免疫比浊测定试剂盒及其制作和使用方法 | |
| US10845362B2 (en) | Competition assay | |
| Van Lente et al. | Evaluation of a nephelometric assay for haptoglobin and its clinical usefulness. | |
| CN111239404B (zh) | 一种可以同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒 | |
| CN108776231A (zh) | 一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒及其制作和使用方法 | |
| JPH04248465A (ja) | 結合可能なアナライトを測定するための免疫沈降法、およびこの方法を実施するための試薬 | |
| JP3513075B2 (ja) | 免疫測定法及びそのための試薬 | |
| CN102369441A (zh) | 免疫分析方法及用于该方法的试剂 | |
| JPH01301165A (ja) | 免疫測定法 | |
| JPS605900B2 (ja) | 抗原性物質の定量法 | |
| CN105974130B (zh) | 基于胶乳免疫比浊法的IgA试剂盒及其制备方法 | |
| JP5177677B2 (ja) | 抗原およびその抗原に対する抗体を測定する方法、並びにそれに用いる測定用試薬 | |
| JP3423085B2 (ja) | 免疫測定法 | |
| CN114324877B (zh) | 一种兼具低值精密度以及抗hook能力的胶乳免疫比浊试剂 | |
| CN106771244B (zh) | 一种纤维蛋白原定量检测试剂盒及检测方法 | |
| JPH08292192A (ja) | 免疫測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190816 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |