CN106771244B - 一种纤维蛋白原定量检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纤维蛋白原定量检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠、辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体、发光化学底物和终止液，所述试剂盒还包括用于防止磁珠聚集的分散剂，所述分散剂包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。本发明具有分析灵敏度高、特异性好、准确度高、成本低等优点，且使因磁珠的聚集导致试剂盒灵敏度降低的问题得到了解决。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纤维蛋白原定量检测试剂盒及检测方法。
背景技术
纤维蛋白原(FIB)是一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白的前体，分子量340000，半衰期4～6日，血浆中参考值2～4克/升。纤维蛋白原由α、β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连。目前研究表明FIB不仅在凝血、血小板凝集、纤溶以及动脉粥样硬化等过程起着至关重要的作用，还与结直肠癌、非小细胞肺癌、卵巢上皮癌、肝细胞肝癌及尿路上皮癌等肿瘤的发生进展、转移及预后密切相关，其作为肿瘤生物标志物的可行性越来越受人们的重视。
纤维蛋白原的检测方法多达数十种，按原理分为三类:热/盐沉淀法，可凝固蛋白法和免疫法。热盐沉淀法将血浆用PH6.3.K H2PO4-NaOH缓冲液稀释后，加热56℃，使纤维蛋白原凝集而呈现浊度，用比浊法测定其含量。此类方法是根据蛋白质的理化特性而建立的，特异性不高，影响因素多，血浆中其他蛋白影响其测定，所以结果往往偏高。免疫学法是以被测物质(纤维蛋白原)作为抗原，然后用免疫动物的方法制备相应的抗体，利用抗原抗体的特异性结合反应来对被检测物质进行定量。它包括免疫扩散法、免疫电泳酶联免疫吸附实验和免疫比浊等。此法特异性不强，因为这些方法所针对的纤维蛋白原的抗原决定簇也存在于纤维蛋白单体、纤维蛋白(原)降解产物(FDPs)和异常纤维蛋白原中。
磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法，抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统ELISA法相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。
但是由于磁珠粒度小，比表面积大，表面能大，细微的颗粒都趋向于聚集在一起，很容易团聚，这种聚集现象在加入待测样品后似乎更为明显。似乎是待测样品中的某些物质可以引起固体载体的非特异性聚集或降低免疫反应，从而严重影响测试，当用全血作为待测样本时，固体载体变成了容易在反应容器内部上聚集，从而影响了测试的灵敏度。
另外，在利用磁微粒分离酶联免疫检测技术对纤维蛋白原含量进行测定时，需要用稀释液将待测样品稀释，但是该稀释液成本较高，不利于降低成本。
因此，有必要提供一种分析灵敏度高、特异性好、准确度高的试剂盒，其解决了因磁珠的聚集导致试剂盒灵敏度降低的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种用于检测纤维蛋白原的试剂盒，该试剂盒具有分析灵敏度高、特异性好、准确度高、成本低等优点，且使因磁珠的聚集导致试剂盒灵敏度降低的问题得到了解决。
本发明提供了一种用于检测纤维蛋白原的试剂盒，所述试剂盒包括抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠、辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体、发光化学底物和终止液。
为了达到前面所述的目的，本发明的发明人进行了各种研究。发现，将含有分散剂的待测样品进行测试，其可以防止磁珠的相互聚集，且其不会降低免疫反应。除外，分散剂在将抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠和待测样品混合时加入也可以达到前面所述的效果。值得说明的是，分散剂可以以任何浓度加入，只要他们以这样的浓度加入，可以发挥前面所述的效果即可。具体地说，当分散剂加入到样本中时，按照0.01～5μg/μl的浓度加入，优选是0.6～2μg/μl；当分散剂在将抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠和待测样品混合时加入，按照0.1～10μg/μl的浓度加入，优选是2～5μg/μl。在本发明中，分散剂优选包括氨基酸0.06～2份、乙酸0.5～2份和羧甲基葡聚糖2～5份。更优选地，所述分散剂包括氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份。优选地，所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸中的一种。更优选地，氨基酸选自甘氨酸。
优选地，所述发光化学底物为AMPPD，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，所述磁珠的内核为四氧化三铁，其粒径为0.3～1.0μm。
优选地，所述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠由以下步骤制得：
a)将磁珠用MES缓冲液分散，使磁珠的终浓度为50～80mg/mL；
b)用三倍磁珠溶液体积的MES缓冲液清洗磁珠两次后，再用MES缓冲液重新分散磁珠，使磁珠的终浓度为12～24mg/mL；
c)取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于步骤b)所得的磁珠溶液中，搅拌反应后再向反应体系中加入抗纤维蛋白原多克隆抗体溶液，搅拌混匀，室温下搅拌过夜；
d)将磁珠与反应体系分离后用MES缓冲液洗涤磁珠两次，再用MES缓冲液重新分散磁珠，磁珠的终浓度为25～45mg/mL；向重新分散后的磁珠溶液中加入1％BSA封闭液，室温封闭2～4小时，将磁珠与反应体系分离；再用pH7.4的Tris-HCl缓冲液清洗磁珠两次后用pH7.4的Tris-HCl缓冲液分散磁珠，使磁珠的终浓度为8～22mg/mL，得到所述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠；
所述辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体由以下步骤制得：
S1、将辣根过氧化物酶溶解于蒸馏水中，加入0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌，得到混合溶液；将得到的混合溶液装入透析袋中用醋酸钠缓冲液透析过夜；
S2、向透析液中加入碳酸盐缓冲液至pH值为8.5～9.0，加入抗纤维蛋白原多克隆抗体，混匀，室温下避光搅拌反应；
S3、向所述步骤S2得到的反应产物中加入NaBH4溶液，混匀，静置反应，将反应得到的反应产物装入透析袋中于PBS缓冲液中搅拌过夜后取出，在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，静置，离心，弃上清；将沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤后，将沉淀物溶于PBS缓冲液中后装入透析袋中透析去除铵离子后，将溶液离心，去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等体积甘油后混匀分装，冰冻保存。
优选地，所述试剂盒还包括纤维蛋白原标准品、样品稀释液和洗涤液PBST。
一般在测试前，需要将血浆进行稀释。由于目前的血浆稀释液价格昂贵，不利于降低成本。发明人经过长期的试验研究，终于研究出一种新的血浆稀释液，其为含有0.2～2mg/ml的甘油和0.05～0.8mg/ml的β-巯基乙醇的质量分数为0.9％的生理盐水。更优选地，所述样品稀释液为含有1.5mg/ml的甘油和0.08mg/ml的β-巯基乙醇的质量分数为0.9％的生理盐水。该样品稀释液的效果比预想中的好，其与市场上的血浆稀释液所测各标本的结果差异无显著性，两组稀释液的结果之间具有较好的一致性。以血浆稀释液为参照，本发明样品稀释液89.3％，特异性为82.6％，准确度为88.9％，，由此可见，用本发明样品稀释液替代现有的血浆稀释液具有一定的可行性。
相应地，本发明还提供了一种利用上述的试剂盒检测纤维蛋白原的方法，包括以下步骤：
A)用样品稀释液将待检样品稀释至10～15μg/ml，取上述稀释后的待测样品于反应杯中，加入抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠，室温孵育20～30min后，加入辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体，室温孵育20～30min；
B)分离磁珠，并用洗涤液洗涤后加入发光化学底物，作用10～30min，测定其发光强度；
C)根据标准品中纤维蛋白原的浓度与光强度的关系绘制标准工作曲线，样品光强度在标准曲线上相对应的浓度值即为待测样品中纤维蛋白原的测定浓度。
优选地，所述步骤A)还包括在待测样品中加入分散剂或者在加入抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠后加入分散剂的步骤。
与现有技术相比，本发明试剂盒具有以下优势：
1)本发明提供了一种纤维蛋白原磁微粒化学发光免疫分析检测试剂盒，其具有分析灵敏度高、特异性好、准确度高、成本低等优点，且使因磁珠的聚集导致试剂盒灵敏度降低的问题得到了解决。
2)本发明通过加入分散剂，其能有效避免磁珠在反应过程中黏附于反应容器内壁和相互聚集的现象，提高了试剂盒的灵敏度。
具体实施方式：
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明纤维蛋白原标准品为牛纤维蛋白原，购于上海江莱生物科技有限公司，编号140626；磁珠购自西安金磁纳米生物技术有限公司；抗纤维蛋白原多克隆抗体和抗纤维蛋白原多克隆抗体购自上海金标生物有限公司。
实施例1、本发明试剂盒的制备
①抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠的制备：
将粒径为0.6μm磁珠用MES缓冲液分散，使磁珠的终浓度为60mg/mL；用三倍磁珠溶液体积的MES缓冲液清洗磁珠两次后，再用MES缓冲液重新分散磁珠，使磁珠的终浓度为16mg/mL；取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于上述步骤所得的磁珠溶液中，搅拌反应后再向反应体系中加入抗纤维蛋白原多克隆抗体溶液，搅拌混匀，室温下搅拌过夜；将磁珠与反应体系分离后用MES缓冲液洗涤磁珠两次，再用MES缓冲液重新分散磁珠，磁珠的终浓度为35mg/mL；向重新分散后的磁珠溶液中加入1％BSA封闭液，室温封闭3小时，将磁珠与反应体系分离；再用pH7.4的Tris-HCl缓冲液清洗磁珠两次后用pH7.4的Tris-HCl缓冲液分散磁珠，使磁珠的终浓度为16mg/mL，得到所述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠。
②辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体的制备：
将辣根过氧化物酶溶解于蒸馏水中，加入0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌，得到混合溶液；将得到的混合溶液装入透析袋中用醋酸钠缓冲液透析过夜；向透析液中加入碳酸盐缓冲液至pH值为9.0，加入抗纤维蛋白原多克隆抗体，混匀，室温下避光搅拌反应；向上述步骤得到的反应产物中加入NaBH4溶液，混匀，静置反应，将反应得到的反应产物装入透析袋中于PBS缓冲液中搅拌过夜后取出，在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，静置，离心，弃上清；将沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤后，将沉淀物溶于PBS缓冲液中后装入透析袋中透析去除铵离子后，将溶液离心，去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等体积甘油后混匀分装，冰冻保存。
③分散剂的制备：取羧甲基葡聚糖3.5份和甘氨酸0.15份溶于去离子水中配制成2％的混合溶液，加入乙酸0.8份，混合均匀，即得。
④样品稀释液的制备：取100ml 0.9％的生理盐水，加入150mg甘油和8mgβ-巯基乙醇，混匀，即得。
⑤将上述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠、辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体、分散剂、样品稀释液、终止液、洗涤液PBS、纤维蛋白原标准品和发光化学底物分装并密封保存，即得纤维蛋白原检测试剂盒。
实施例2、本发明试剂盒的制备
实施例2与实施例1的区别在于：步骤③分散剂的制备中加入甘氨酸0.06份、乙酸0.5份和羧甲基葡聚糖2份；步骤④样品稀释液的制备中，加入20mg甘油和5mgβ-巯基乙醇，其余参数及其操作如实施例1所示。
实施例3、本发明试剂盒的制备
实施例3与实施例1的区别在于：步骤③分散剂的制备中加入赖氨酸2份、乙酸2份和羧甲基葡聚糖5份；步骤④样品稀释液的制备中，加入200mg甘油和80mgβ-巯基乙醇，其余参数及其操作如实施例1所示。
实施例4、本发明试剂盒的检测方法
A)用样品稀释液将待检样品稀释至15μg/ml，取20μl上述稀释后的待测样品于反应杯中(校准管以标准品作为样本，空白以蒸馏水作为样本)，加入50μl抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠和150μg分散剂，室温孵育20min后，加入50μl辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体，室温孵育20min；
B)分离磁珠，并用200μl洗涤液洗涤后加入50μl发光化学底物，作用15min，测定其发光强度；
C)根据标准品中纤维蛋白原的浓度与光强度的关系绘制标准工作曲线，样品光强度在标准曲线上相对应的浓度值即为待测样品中纤维蛋白原的测定浓度。
实施例5、
实施例5与实施例4的区别在于：分散剂直接与待测样品混合，用量为50μg，其余参数及其操作如实施例4所示。
试验例一、性能测试
按照本领域中常规的检验规程对实施例1～3所制备的试剂盒进行机检验，检验标准见表1，检验结果见表2。
表1 检验标准
表2 实施例1～3所制备的试剂盒检定结果对比
由表2可知，本发明实施例1～3所制备的试剂盒其各项指标均符合相关标准，性能优良。
试验例二、本发明实施例1所制备的试剂盒与现有的人纤维蛋白原(FIB)ELISA检测试剂盒的性能对比
1.供试试剂盒
本发明实施例1所制备的试剂盒；人纤维蛋白原(FIB)ELISA检测试剂盒(购于上海盈公生物技术有限公司)。
2.试验方法和结果
将实施例1所制备的试剂盒和ELISA检测试剂盒对浓度为20ng/ml的纤维蛋白原标准品进行检测，实施例1检测结果根据实施例4所得标准曲线计算得出，ELISA检测试剂盒检测样本的操作过程和标准曲线的绘制参考其产品说明书进行。通过分析检测结果对两种检测试剂盒的重复性和准确度进行分析和比较，在试验过程中，每个试剂盒对标准品重复测定10次，分别计算测定均值(M)和标准差(S)，以S/M×100％计算变异系数进行重复性考察，以(1-M/样本浓度)×100％计算相对偏差进行准确度考察，试验结果见表3。
表3 实施例1所制备的试剂盒与现有的人纤维蛋白原(FIB)ELISA检测试剂盒性能对比
由上表可知，本发明的试剂盒与市场上获得认可的具有优异准确度的纤维蛋白原检测试剂盒有高度一致性，证明本发明试剂盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度，同时，本发明所制备的试剂盒其重复性和准确度性能优良，不亚于市场上同类的检测试剂盒。
试验例三、不同分散剂组成对磁珠聚集现象的影响
除分散剂组成不同外，其余参数操作如实施例1制备得到各组试剂盒，利用各组试剂盒对样本进行检测，目测反应过程中磁珠在反应容器上的黏附和聚集现象，记录结果如表4。
表4 结果
| 分散剂组成 | 磁珠与反应容器的黏附 | 磁珠的聚集 |
| 不加分散剂 | 存在 | 存在 |
| 氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份 | 没有 | 没有 |
| 氨基酸0.35份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份 | 存在 | 没有 |
| 氨基酸0.95份和羧甲基葡聚糖3.5份 | 存在 | 存在 |
由上表可知，当存在分散剂时，磁珠没有出现在反应容器内壁上黏附和相互聚集现象，且后续结果表明，分散剂的存在对检测结果的准确性无不良影响。当不加入分散剂时，磁珠在反应容器的内壁上有非常严重的黏附现象，且磁珠之间相互聚集，所以后续洗涤过程中无法顺利的进行，故而可认为对检测结果的准确性产生了影响。值得说明的是，即使是改变分散剂的组成或者改变各组分的用量也会引起磁珠的聚集，如当去掉乙酸时，磁珠有明显的黏附和聚集现象，当增加氨基酸的用量时，容易使得磁珠在反应容器内壁上黏附。
试验例四、本发明样品稀释液与现有血浆稀释液的性能对比
1.供试样本
试验样本30例，男10例，女20例，年龄18～56岁，平均年龄36岁。
2.供试试剂：
本发明样品稀释液(含有0.2～2mg/ml的甘油和0.05～0.8mg/ml的β-巯基乙醇的质量分数为0.9％的生理盐水)；上海太阳纤维蛋白原含量测定试剂盒提供的原装血浆稀释液。
3.试验方法：
清晨空腹静脉采血，使用3.8％枸橼酸钠真空采血管抗凝，离心分离血浆待测。①血浆稀释液法:25μl抗凝血浆与350μl血浆稀释液混匀，按仪器说明书操作，在4小时内完成测试。②样品稀释液法:采用本发明所述样品稀释液(含有0.2～2mg/ml的甘油和0.05～0.8mg/ml的β-巯基乙醇的质量分数为0.9％的生理盐水)取代原装血浆稀释液，稀释标本后按仪器说明书操作。精密度试验:质控血浆Fib为3.36g/L(批号:6633237)，分别用血浆稀释液和样品稀释液稀释后重复测定10次。
4.统计学处理：Fib正常参考值为2.0～4.0g/L。
5.结果
5.1 血浆稀释液和样品稀释液Fib测定结果：两种稀释液的测定结果无明显差异性(P＞0.05)，见表5。
表5 血浆稀释与本发明样品稀释液检测纤维蛋白原结果
| 试剂 | 例数 | 纤维蛋白原含量(g/L) | 阳性例数 | 阳性率％ |
| 血浆稀释液 | 30 | 2.68±1.35 | 20 | 66.7％ |
| 本发明样品稀释液 | 30 | 2.98±1.56 | 17 | 56.7％ |
5.2 精密度试验：用血浆稀释液重复10次测定Fib结果为(3.33±0.26)g/L，用本发明样品稀释液重复10次测定Fib结果为(3.45±0.23)g/L，两种稀释液的CV均为3.3％，这说明本发明样品稀释液与上海太阳纤维蛋白原含量测定试剂盒提供的原装血浆稀释液测定结果显著相关。
5.3 测试评价：以血浆稀释液对对照，本发明样品稀释液检测Fib的敏感性为89.3％，特异性为82.6％，准确度为88.9％，这说明本发明样品稀释液与上海太阳纤维蛋白原含量测定试剂盒提供的原装血浆稀释液之间具有良好的一致性，用本发明样品稀释液替换现有的血浆稀释液具有一定的可行性。
Claims (9)
1.一种纤维蛋白原定量检测试剂盒，所述试剂盒包括抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠、辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体、发光化学底物和终止液，其特征在于，所述试剂盒还包括用于防止磁珠聚集的分散剂，所述分散剂包括氨基酸0.15份、乙酸0.8份和羧甲基葡聚糖3.5份。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氨基酸选自甘氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸中的一种。
3.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光化学底物为AMPPD，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，所述磁珠的内核为四氧化三铁，其粒径为0.3～1.0μm。
4.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠由以下步骤制得：
a)将磁珠用MES缓冲液分散，使磁珠的终浓度为50～80mg/mL；
b)用三倍磁珠溶液体积的MES缓冲液清洗磁珠两次后，再用MES缓冲液重新分散磁珠，使磁珠的终浓度为12～24mg/mL；
c)取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解于步骤b)所得的磁珠溶液中，搅拌反应后再向反应体系中加入抗纤维蛋白原多克隆抗体溶液，搅拌混匀，室温下搅拌过夜；
d)将磁珠与反应体系分离后用MES缓冲液洗涤磁珠两次，再用MES缓冲液重新分散磁珠，磁珠的终浓度为25～45mg/mL；向重新分散后的磁珠溶液中加入1％BSA封闭液，室温封闭2～4小时，将磁珠与反应体系分离；再用pH7.4的Tris-HCl缓冲液清洗磁珠两次后用pH7.4的Tris-HCl缓冲液分散磁珠，使磁珠的终浓度为8～22mg/mL，得到所述抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠；
所述辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体由以下步骤制得：
S1、将辣根过氧化物酶溶解于蒸馏水中，加入0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌，得到混合溶液；将得到的混合溶液装入透析袋中用醋酸钠缓冲液透析过夜；
S2、向透析液中加入碳酸盐缓冲液至pH值为8.5～9.0，加入抗纤维蛋白原多克隆抗体，混匀，室温下避光搅拌反应；
S3、向所述步骤S2得到的反应产物中加入NaBH4溶液，混匀，静置反应，将反应得到的反应产物装入透析袋中于PBS缓冲液中搅拌过夜后取出，在搅拌下逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，静置，离心，弃上清；将沉淀物用半饱和硫酸铵洗涤后，将沉淀物溶于PBS缓冲液中后装入透析袋中透析去除铵离子后，将溶液离心，去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等体积甘油后混匀分装，冰冻保存。
5.如权利要求1～4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括纤维蛋白原标准品、样品稀释液和洗涤液PBST。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含有0.2～2mg/ml的甘油和0.05～0.8mg/ml的β-巯基乙醇的质量分数为0.9％的生理盐水。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含有1.5mg/ml的甘油和0.08mg/ml的β-巯基乙醇的质量分数为0.9％的生理盐水。
8.一种利用如权利要求1～7任一所述的试剂盒定量检测纤维蛋白原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)用样品稀释液将待检样品稀释至10～15μg/ml，取上述稀释后的待测样品置于反应杯中，加入抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠，室温孵育20～30min后，加入辣根过氧化物酶标抗纤维蛋白原多克隆抗体，室温孵育20～30min；
B)分离磁珠，并用洗涤液洗涤后加入发光化学底物，作用10～30min，测定其发光强度；
C)根据标准品中纤维蛋白原的浓度与光强度的关系绘制标准工作曲线，样品光强度在标准曲线上相对应的浓度值即为待测样品中纤维蛋白原的测定浓度。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤A)还包括在待测样品中加入分散剂或者在加入抗纤维蛋白原多克隆抗体包被的磁珠后加入分散剂的步骤。
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