CN104998269A - 对于稳定含有蛋白质的制剂有用的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及非表面活性剂化合物(包括，例如聚氧乙烯(POE)山梨聚糖和聚乙二醇(PEG)用于稳定含有蛋白质的制剂和用于防止此类制剂中的蛋白质聚集的方法。

Description

对于稳定含有蛋白质的制剂有用的组合物和方法
本申请为2011年3月21日提交的、发明名称为“对于稳定含有蛋白质的制剂有用的组合物和方法”的PCT申请PCT/US2011/029206的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2012年9月24日，申请号为201180018192.3。
相关申请
本申请是基于37CFR 1.53(b)(1)提交的非临时申请，基于35USC119(e)要求于2010年3月22日提交的临时申请号61/316326的优先权，其内容通过引用整合到本文中。
发明领域
本发明涉及非表面活性剂化合物(包括例如聚氧乙烯(POE)山梨聚糖和聚乙二醇(PEG))用于稳定含有蛋白质的制剂和用于防止此类制剂中的蛋白质聚集的用途。
发明背景
当需要蛋白质制剂的稳定剂以保护蛋白质免受振荡、搅拌、剪切作用和冻融，或在界面上的静止状态而造成的变性时，通常使用非离子去垢剂(即，表面活性剂)(参见例如，美国专利号5,183,746)。作为示例的是在许多含有蛋白质的产品中聚山梨酸酯的用途。例如，聚山梨酸酯20和80(和)用于生物治疗性产品的制剂中，用于防止表面吸附和作为抵抗蛋白质聚集的稳定剂(Kerwin,J.Pharm.Sci.97(8):2924-2936(2008))。聚山梨酸酯是两亲性的、非离子型表面活性剂，由聚氧乙烯(POE)山梨聚糖的脂肪酸酯组成，聚山梨酸酯20是聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯，而聚山梨酸酯80是聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。
然而不幸的是，聚山梨酸酯可以通过氧化或水解进行降解。当聚山梨酸酯分子降解时，产生多种降解副产物，包括例如脂肪酸、POE山梨聚糖、PEG、PEG酯和烷基酸。聚山梨酸酯降解的这类副产物中的某些(包括游离的脂肪酸)可以导致含有蛋白质的制剂中增加的浊度和蛋白质聚集。因此，虽然聚山梨酸酯通常作为蛋白质稳定剂使用，但随时间从聚山梨酸酯降解中释放的脂肪酸和其他降解副产物可以不利地影响聚山梨酸酯在含有蛋白质的制剂中表现出的保护效果。
因此，需要对于防止蛋白质在含有蛋白质的水性制剂中聚集的有用的额外的组合物。
发明概述
本发明基于这样的新发现，即，以某些浓度存在于水性制剂中的聚氧乙烯(POE)山梨聚糖和聚乙二醇(PEG)对于稳定含有蛋白质或含有肽的制剂，和对于防止蛋白质在此类制剂中的聚集是有用的。
因此，在一个方面，本发明涉及包含抗体或其他蛋白质或肽，和POE山梨聚糖的物质组合物。在一个实施方案中，聚氧乙烯山梨聚糖以从约20ppm至约100,000ppm的浓度存在。在另一个实施方案中，包含抗体或其他蛋白质或肽和POE山梨聚糖的物质组合物不含非离子型表面活性剂，例如，不含聚山梨酸酯。任选地，物质组合物还可以不含冻干保护剂(lyoprotectant)，例如糖、游离氨基酸及其变体等。在某些实施方案中，物质组合物可以是水性的或固体的形式。
在另一个方面，本发明涉及包含抗体或其他蛋白质或肽和聚乙二醇的物质组合物。在某些实施方案中，聚乙二醇在所述物质组合物中以低于约10,000ppm的浓度存在，优选在约20ppm至约10,000ppm之间。在另一个实施方案中，物质组合物任选地包含至少一种POE山梨聚糖，所述POE山梨聚糖任选地以从约20ppm至约100,000ppm的浓度存在于所述物质组合物中。物质组合物还可以任选地不含非离子型表面活性剂，例如，不含聚山梨酸酯。任选地，物质组合物还可以不含冻干保护剂(lyoprotectant)，例如糖、游离氨基酸及其变体等。在某些实施方案中，物质组合物可以是水性的或固体的形式。
在另一个方面，本发明涉及包含装有任何本文描述的物质组合物的容器的制品。
在另一个方面，提供了用于制备含有抗体(或其他蛋白质或肽)的稳定组合物方法，通过共同混合抗体或其他蛋白质与POE山梨聚糖或PEG。
在另一个方面，本发明涉及增加抗体或其他蛋白质或肽在水性制剂中的稳定性的方法，包括混合抗体或其他蛋白质或肽与起稳定作用的量的POE山梨聚糖，其中POE山梨聚糖增加抗体或其他蛋白质或肽的稳定性。在一个实施方案中，POE山梨聚糖以从约20ppm至约100,000ppm的浓度存在，可任选地不含非离子型表面活性剂(例如，不含聚山梨酸酯)，或冻干保护剂，例如糖、游离氨基酸及其变体等。
在另一个方面，本发明涉及增加抗体或其他蛋白质或肽在水性制剂中的稳定性的方法，包括混合抗体或其他蛋白质或肽与起稳定作用的量的聚乙二醇，其中聚乙二醇增加抗体或其他蛋白质或肽的稳定性。在一个实施方案中，聚乙二醇以低于约10,000ppm，优选地在约20ppm至约10,000ppm之间的浓度存在。在另一个实施方案中，物质组合物任选地包含至少一种POE山梨聚糖，所述POE山梨聚糖可任选地以从约20ppm至约100,000ppm的浓度存在，并且可以任选地不含非离子型表面活性剂(例如，不含聚山梨酸酯)，或冻干保护剂，例如糖、游离氨基酸及其变体等。
在另一个方面，本发明涉及防止或降低抗体或其他蛋白质或肽在水性制剂中聚集的方法，包括混合抗体或其他蛋白质或肽与POE山梨聚糖。在一个实施方案中，POE山梨聚糖以从约20ppm至约100,000ppm的浓度存在。水性制剂任选地不含非离子型表面活性剂(例如，不含聚山梨酸酯)，或冻干保护剂，例如糖、游离氨基酸及其变体等。在另一个实施方案中，抗体或其他蛋白质的聚集是由搅拌水性溶液诱导的。
在另一个方面，本发明涉及防止或降低抗体或其他蛋白质或肽在水性制剂中聚集的方法，包括混合抗体或其他蛋白质或肽与聚乙二醇。在一个实施方案中，聚乙二醇以低于约10,000ppm，优选地在约20ppm至约10,000ppm之间的浓度存在。在另一个实施方案中，水性制剂任选地包含至少一种POE山梨聚糖，所述POE山梨聚糖任选地以从约20ppm至约100,000ppm的浓度存在，并且可以任选地不含非离子型表面活性剂(例如，不含聚山梨酸酯)，或冻干保护剂，例如糖、游离氨基酸及其变体等。另一个实施方案中，抗体或其他蛋白质的聚集是由搅拌水性溶液诱导的。
在从重组细胞蛋白质或其他污染性蛋白质中纯化蛋白质、肽或抗体的方法中，本发明的实施方案涉及这样的改良，所述改良包括在纯化过程中向蛋白质、肽或抗体添加POE山梨聚糖或聚乙二醇。
本发明的另一个方面是通过在包含自我聚集型抗体或其他蛋白质或肽的水性溶液中混合至少一种POE山梨聚糖或聚乙二醇，然后浓缩所述水性溶液，来制造另外的自我聚集型抗体或其他蛋白质或肽的非聚集型水性溶液的方法。
根据下文详细的说明和实例，本发明的其他特征和优点是显而易见的，但所述说明和实例不应被视为限制。本申请全文引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容都明确的通过引用整合到本文中。
附图简介
图1显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的浊度分析中获得的结果，所述添加物包括聚山梨酸酯20(PS)、月桂酸(LA)或POE山梨聚糖20(POE)。
图2显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的蛋白质浓度分析中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000，都具有多种浓度。
图3显示了从抗IgE抗体与多种添加物组合的蛋白质浓度分析中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000，都具有多种浓度。
图4显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的浊度分析中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000，都具有多种浓度。
图5显示了从抗IgE抗体与多种添加物组合的浊度分析中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000，都具有多种浓度。
图6显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析(大于2μm的颗粒)中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000，都具有多种浓度。
图7显示了从抗IgE抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析(大于2μm的颗粒)中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000，都具有多种浓度。
图8显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析(大于10μm的颗粒)中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000，都具有多种浓度。
图9显示了从抗IgE抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析(大于10μm的颗粒)中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000，都具有多种浓度。
图10显示了从抗IL13抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析(大于50μm的颗粒)中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000，都具有多种浓度。
图11显示了从抗IgE抗体与多种添加物组合的颗粒大小分析(大于50μm的颗粒)中获得的结果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000，都具有多种浓度。
优选实施方案的详细描述
通过参考下列对具体实施方案和本文囊括的实施例的详细说明，可以更容易地理解本发明。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语都具有与发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然任何与本文所述相似或等价的方法和材料也可用于实践或测试本发明，但本文描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物都通过引用以其整体整合到本文中。
抗体和其他蛋白质的聚集主要是由疏水性相互作用导致的，最终导致变性。当部分或完全未折叠的蛋白质的疏水区暴露在水中时，由于通常包埋着的疏水性内部现在暴露在亲水性的水性环境中，导致热力学不利的情况。因此，来自围绕疏水区的结构性水分子的熵减少驱使变性的蛋白质聚集，聚集主要通过已暴露的疏水区。因此，也危及了蛋白质的溶解度。在一些情况下，蛋白质亚基可在某些条件下发生自我关联(不论是天然的或错误的折叠)，这可能导致沉淀和活性丧失。
影响溶液中的蛋白质聚集的因素一般包括蛋白质浓度、pH、温度、其他赋形剂和机械胁迫。在纯化、配合、生产、储藏和使用过程中，一些因素(例如，温度)比其他因素(例如，机械胁迫)更易于控制。制剂研究将指定对pH和赋形剂的恰当选择，所述选择不诱导聚集和/或实际上帮助防止聚集。蛋白质浓度由所需治疗剂量指定，并根据该浓度的多少将决定是否存在更高关联状态(二聚体、四聚体等)的可能性，这可以导致溶液中的聚集。在制剂开发过程中必须进行仔细的研究，以确定何种因素影响蛋白质聚集，以及之后可以如何消除或控制这些因素。
需要鉴别用于肠道外的或其他施用中的抗体或其他蛋白质的稳定溶液制品，该需求可以导致开发用于评估多种添加物对物理稳定性的影响的测试方法。基于已知的影响蛋白质聚集的因素和对此类应用的要求，可以使用涉及搅拌或旋转蛋白质溶液的机械方法来评估物理稳定性。用于鉴别多种添加物防止聚集的能力的物理胁迫测试方法可以涉及暴露于水平面上的振荡或搅拌，或者距离以n rev/min在垂直面旋转的轮轴x cm的旋转。由聚集导致的浊度通常由视觉观察或光散射分析确定为时间的函数。备选地，可以通过HPLC测定，将由于沉淀造成的可溶性蛋白质含量的降低定量为时间的函数。
本发明是基于这样的新发现，即在液体制剂中存在的某些浓度的聚氧乙烯(POE)山梨聚糖和聚乙二醇(PEG)对于稳定含有蛋白质的制剂，和用于防止此类制剂中的蛋白质聚集是有用的。
因此，在一个方面，本发明描述了包含不论高或低浓度的抗体或其他蛋白质以及POE山梨聚糖的物质组合物。如本文中使用的，“聚氧乙烯山梨聚糖”或“POE山梨聚糖”指具有下列化学结构的非表面活性剂化合物：
其中a+b+c+d优选是从约6至约80，更优选是从约8至约60，更优选是从约10至约40，和更优选是从约10至约20。如上述，本领域技术人员应理解化合物(例如本文描述的POE山梨聚糖)的化学合成导致化合物的一定程度的异源混合物，而非完全同源的制品。由此可见，当本文中描述a+b+c+d是例如优选从约6至约80时，应理解所述定义是指由其化学合成获得的异源混合物的主要组分。
POE山梨聚糖可以单个地用作抗体或其他蛋白质的稳定剂，或者可以与其他POE山梨聚糖组合使用，用于稳定水性溶液中的抗体或其他蛋白质。在浓度范围广泛的水性溶液中，POE山梨聚糖可用作抗体或其他蛋白质的稳定(或抗聚集)剂。在本发明的某些实施方案中，在含有抗体或其他蛋白质的水性制剂中，POE山梨聚糖(如果用作单个稳定剂)或POE山梨聚糖(如果组合使用)能以从约20ppm至约100,000ppm，更优选以从100ppm至约50,000ppm，更优选以从150ppm至约10,000ppm，更优选以从200ppm至约5,000ppm，更优选以从200ppm至约1,000ppm的浓度存在。
在另一个方面，本发明描述了包含不论是高浓度或低浓度的抗体或其他蛋白质，以及聚乙二醇的物质组合物。
如本文中使用的，“聚乙二醇”、“PEG”及相似的术语意在涵盖聚乙二醇及其多种衍生物，例如甲氧基-PEG-胺、二胺-PEG等。更具体而言，在本发明的某些实施方案中，术语“聚乙二醇”或“PEG”指具有下列化学结构的非表面活性剂化合物：
其中n是从约5至约240，并可以任选地含有一定程度的不饱和。涵盖在本发明的用途中的PEG可以是支化的或线性的，优选线性的。如上述，本领域技术人员应理解化合物(例如本文描述的PEG)的化学合成导致化合物的一定程度的异源混合物，而非完全同源的制品。由此可见，当本文中描述n优选从约5至240时，应理解所述定义是指由其化学合成获得的异源混合物的主要组分。
PEG可以单个地用作抗体或其他蛋白质的稳定剂，或者可以与其他PEG组合使用，用于稳定水性溶液中的抗体或其他蛋白质。在浓度范围广泛的水性溶液中，PEG可用作抗体或其他蛋白质的稳定(或抗聚集)剂。在本发明的某些实施方案中，在含有抗体或其他蛋白质的水性制剂中，PEG(如果用作单个稳定剂)或PEG(如果组合使用)能以少于约10,000ppm，优选从约20ppm至约10,000ppm，更优选从约200ppm至约10,000ppm，更优选从约200ppm至约5,000ppm，更优选从约200ppm至约1,000ppm，更优选从约200ppm至约500ppm的浓度存在。
优选的PEG包括分子量约200至12,000的聚合物，但更高分子量的聚合物也落入本发明的范围内。PEG包括线性和支化的聚合物，星形分子和通过偶联至少两种不同的PEG聚合物以形成更高分子量的聚合物而形成的PEG嵌段共聚物，这些都是本领域普遍已知的。
“多肽”或“蛋白质”意指这样的氨基酸序列，所述序列的链长度足以产生更高水平的三级和/或四级结构。因此，蛋白质不同于“肽”，后者也是基于氨基酸的分子，但不具有此类结构。一般地，本文使用的蛋白质具有至少约5-20kD，备选地至少约15-20kD，优选至少约20kD的分子量。“肽”意指这样的氨基酸序列，所述序列一般不表现出更高水平的三级和/或四级结构。肽一般具有少于约5kD的分子量。
涵盖在本文定义内的多肽实例包括哺乳动物蛋白质，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；甲状腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；卵泡刺激激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝固因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrands因子；抗凝固因子如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性物质；纤溶酶原活化因子，例如尿激酶或人尿或组织类纤溶酶原活化因子(t-PA)；铃蟾素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(通过活化调控的由正常T细胞表达分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋例如人血清白蛋白；Muellerian抑制性物质；松弛素A链；松弛素B链；prorelaxin；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮细胞生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子例如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5，或-6(NT-3、NT-4、NT-5，或NT-6)，或神经生长因子例如NGF-β；血小板源性生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；红细胞生成素；骨诱导性因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如，例如AIDS包膜的部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调控蛋白；整联蛋白如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如CA125(卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受体；免疫粘附素；和任意上述列举的蛋白质的片段和/或变体，以及与任意上述列举的蛋白质结合的抗体，包括抗体片段。
配制的蛋白质优选是基本纯的，且理想地是基本同质的(即，不含污染蛋白质)。“基本纯的”蛋白质意指基于组合物的总重量，包含按重量计至少约90％，优选按重量计至少约95％的蛋白质的组合物。“基本同质的”蛋白质意指基于组合物的总重量，包含按蛋白质重量计至少约99％的组合物。
在某些实施方案中，蛋白质是抗体。抗体在本文中是针对目标“抗原”的。优选地，抗原是生物学重要的蛋白质，将抗体施用给患疾病或病症的哺乳动物可以在哺乳动物中导致治疗益处。然而，还考虑针对非蛋白质抗原(例如，肿瘤相关的糖脂抗原；参见美国专利5,091,178)的抗体。当抗原是蛋白质时，其可以是跨膜分子(例如，受体)或配体，如生长因子。示例性的抗原包括上述蛋白质。本发明涵盖的抗体的优选的分子靶包括CD多肽，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；HER受体家族成员，如EGF受体(HER1)、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，如LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和av/b3整联蛋白(包括其a或b亚基)(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；多肽C等。任选地与其他分子缀合的可溶性抗原或其片段可用作生成抗体的免疫原。对于跨膜分子，如受体，其片段(例如，受体的胞外结构域)可用作免疫原。备选地，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可源自天然来源(例如，癌细胞系)，或者可以是通过重组技术转化来表达跨膜分子的细胞。
本文中待纯化的抗体实例包括但不限于：HER2抗体，包括曲妥珠单抗(trastuzumab)(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)，美国专利号5,725,856)和培妥珠单抗(pertuzumab)(OMNITARGTM)(WO01/00245)；CD20抗体(见下文)；IL-8抗体(St John等人，Chest，103：932(1993)，和国际公开号WO95/23865)；VEGF或VEGF受体抗体，包括人源化和/或亲和性成熟的VEGF抗体，如人源化VEGF抗体huA4.6.1贝伐珠单抗(bevacizumab)和雷珠单抗(ranibizumab)(Kim等人，Growth Factors，7：53-64(1992)；WO 96/30046和1998年10月15日公开的国际公开号WO 98/45331)；PSCA抗体(WO01/40309)；CD11a抗体，包括依法珠单抗(efalizumab)(美国专利号6,037,454、美国专利号5,622,700、WO 98/23761、Stoppa等人，Transplant Intl.4：3-7(1991)和Hourmant等人，Transplantation 58：377-380(1994))；结合IgE的抗体，包括奥马珠单抗(omalizumab)(Presta等人，J.Immunol.151：2623-2632(1993)和国际公开号WO 95/19181；1998年2月3日公布的美国专利号5,714,338或1992年2月25日公布的美国专利号5,091,313；1993年3月4日公开的WO 93/04173或1998年6月30日公开的国际申请号PCT/US98/13410；美国专利号5,714,338)；CD18抗体(1997年4月22日公布的美国专利号5,622,700，或1997年7月31日公开的WO 97/26912)；Apo-2受体抗体抗体(1998年11月19日公开的WO 98/51793)；组织因子(TF)抗体(1994年11月9日授权的欧洲专利号0 420 937 B1)；α4-α7整联蛋白抗体(1998年2月19日公开的WO98/06248)；EGFR抗体(例如，嵌合的或人源化的225抗体、西妥昔单抗(cetuximab)，如1996年12月19日公开的WO 96/40210中的；CD3抗体，如OKT3(1985年5月7日公布的美国专利号4,515,893)；CD25或Tac抗体，如CHI-621和(参见1997年12月2日公布的美国专利号5,693,762)；CD4抗体，如cM-7412抗体(Choy等人，Arthritis Rheum 39(1)：52-56(1996))；CD52抗体，例如CAMPATH-1H(ILEX/Berlex)(Riechmann等人，Nature332：323-337(1988))；Fc受体抗体，如针对FcγRI的M22抗体(如Graziano等人，J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)中的RI)；癌胚抗原(CEA)抗体，如hMN-14(Sharkey等人，Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995))；针对乳腺上皮细胞的抗体(包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6)(Ceriani等人，Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman等人，Cancer Res.55(23Supp)：5916s-5920s(1995))；结合结肠癌细胞的抗体如C242(Litton等人，Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；CD38抗体，例如AT 13/5(Ellis等人，J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；CD33抗体，如Hu M195(Jurcic等人，CancerRes55(23Suppl)：5908s-5910s(1995))和CMA-676或CDP771；EpCAM抗体，如17-1A；GpIIb/IIIa抗体，如阿昔单抗(abciximab)或c7E3Fab；RSV抗体，如MEDI-493；CMV抗体，如；HIV抗体，如PRO542；肝炎抗体，如Hep B抗体；CA125抗体，包括抗MUC16(WO2007/001851；Yin，BWT和Lloyd，KO，J.Biol.Chen.276：27371-27375(2001))和OvaRex；独特型GD3表位抗体BEC2；αvβ3抗体(例如，；Medimmune)；人肾细胞癌抗体，如ch-G250；ING-1；抗人17-1An抗体(3622W94)；抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；针对GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24；抗人鳞状细胞癌(SF-25)；人白细胞抗原(HLA)抗体，如SmartID10和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)；CD37抗体，如TRU 016(Trubion)；IL-21抗体(Zymogenetics/Novo Nordisk)；抗B细胞抗体(Impheron)；B细胞靶向MAb(Immunogen/Aventis)；1D09C3(Morphosys/GPC)；LymphoRad 131(HGS)；Lym-1抗体，如Lym-1Y-90(USC)或抗Lym-1Oncolym(USC/Peregrine)；LIF 226(EnhancedLifesci.)；BAFF抗体(例如，WO 03/33658)；BAFF受体抗体(参见例如，WO 02/24909)；BR3抗体；Blys抗体，如贝利木单抗(belimumab)；LYMPHOSTAT-BTM；ISF 154(UCSD/Roche/Tragen)；gomilixima(Idec152；Biogen Idec)；IL-6受体抗体，如atlizumab(ACTEMRATM；Chugai/Roche)；IL-15抗体，如HuMax-Il-15(Genmab/Amgen)；趋化因子受体抗体，如CCR2抗体(例如，MLN1202；Millieneum)；抗补体抗体，如C5抗体(例如，依库珠单抗(eculizumab)、5G1.1；Alexion)；人免疫球蛋白的口服制剂(例如，IgPO；Protein Therapeutics)；IL-12抗体，如ABT-874(CAT/Abbott)；替奈昔单抗(Teneliximab)(BMS-224818；BMS)；CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(WO00/75348)和TNX100(Chiron/Tanox)；TNF-α抗体，包括cA2英利昔单抗(infliximab)、CDP571、MAK-195、阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRATM)、聚乙二醇化的TNF-α抗体片段，如CDP-870(Celltech)、D2E7(Knoll)、抗TNF-α多克隆抗体(例如，PassTNF；Verigen)；CD22抗体，如LL2或依帕珠单抗(epratuzumab)(；Immunomedics)，包括依帕珠单抗Y-90和依帕珠单抗I-131，Abiogen的CD22抗体(Abiogen，意大利)、CMC 544(Wyeth/Celltech)、combotox(UT Soutwestern)、BL22(NIH)和LympoScan Tc99(Immunomedics)。
CD20抗体的实例包括：“C2B8”，现在被称为“利妥昔单抗”(美国专利号5,736,137)；钇-[90]-标记的2B8鼠抗体，被称为“Y2B8”或“替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)”，可自IDEC Pharmaceuticals，Inc.商业购买(美国专利号5,736,137；以ATCC登录号HB11388于1993年6月22日储藏的2B8)；鼠IgG2a“B1”，也被称为“托西莫单抗(Tositumomab)”，任选地用131I标记，生成可自Corixa商业购买的“131I-B1”或“碘I131托西莫单抗”抗体(BEXXARTM)(还参见美国专利号5,595,721)；鼠单克隆抗体“1F5”(Press等人，Blood 69(2)：584-591(1987))及其包括“框架补丁”在内的变体或人源化1F5(WO 2003/002607，Leung，S.；ATCC保藏号HB-96450)；鼠2H7和嵌合的2H7抗体(美国专利号5,677,180)；人源化2H7(WO 2004/056312，Lowman等人)；2F2(HuMax-CD20)，靶向B细胞的细胞膜中的CD20分子的完整的人高亲和力抗体(Genmab，Denmark；参见例如Glennie和van de Winkel，Drug Discovery Today 8：503-510(2003)和Cragg等人，Blood 101：1045-1052(2003)；WO2004/035607；US2004/0167319)；WO 2004/035607和US2004/0167319中示出的人单克隆抗体(Teeling等人)；US 2004/0093621中描述的具有与Fc区结合的复合N-糖苷连接的糖链的抗体(Shitara等人)；结合CD20的单克隆抗体和抗原结合片段(WO 2005/000901，Tedder等人)，如HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11；CD20结合分子，如AME系列抗体，例如WO 2004/103404和US2005/0025764中示出的AME 33抗体(Watkins等人，Eli Lilly/Applied Molecular Evolution，AME)；CD20结合分子，如US 2005/0025764中描述的那些(Watkins等人)；A20抗体或其变体，如嵌合的或人源化的A20抗体(分别是cA20、hA20)或IMMU-106(US 2003/0219433，Immunomedics)；CD20-结合抗体，包括表位缺失的Leu-16、1H4或2B8，任选地与IL-2缀合，如US2005/0069545A1和WO 2005/16969(Carr等人)；结合CD22和CD20的双特异性抗体，例如，hLL2xhA20(WO2005/14618，Chang等人)；可获得自International Leukocyte Typing Workshop的单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2(Valentine等人，在Leukocyte Typing III(McMichael编著，第440页，Oxford University Press(1987))中；1H4(Haisma等人，Blood 92：184(1998))；抗CD20auristatin E缀合物(SeattleGenetics)；抗CD20-IL2(EMD/Biovation/City of Hope)；抗CD20Mab疗法(EpiCyte)；抗CD20抗体TRU 015(Trubion)。
术语“抗体”在本文中包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子，以及抗体片段(例如，Fab、F(ab′)2和Fv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”可互换使用。
基础的4条链的抗体单位是由2条相同的轻链(L)和2条相同的重链(H)组成的异源四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基础的异源四聚体单位和被称为J链的额外多肽组成，并且含有10个抗原结合位点；而IgA抗体包括从2-5个基础的4条链单位，其可以多聚化与J链组合形成多价装配物。在IgG的情况下，4条链单位一般是约150,000道尔顿。每条L链通过1个共价二硫键与H链连接，而2条H链通过一个或多个(取决于H链的同种型)二硫键彼此连接。每条H和L链也具有规律间隔的链内二硫桥。每条H链在N端具有可变结构域(VH)，对于α和γ链而言，VH后有3个恒定结构域(CH)，而对于μ和ε同种型而言，VH后有4个CH结构域。每条L链在N端具有可变结构域(VL)，在其另一端后有恒定结构域。VL与VH配对，而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)配对。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成接触面。成对的VH和VL一起形成单个抗原结合位点。关于不同类的抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw(编著)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，第71页和第6章。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的L链都可归入2个明确不同类型中的一种，称为κ和λ。取决于其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同类或同种型。存在5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能中的相对细微的差异，γ和α类进一步分为亚类，例如，人表达下列亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的“指这样的事实，即可变结构域的某些片段的序列在抗体之间显著不同。V结构域介导抗原结合，定义特定抗体与其特定抗原的特异性。然而，可变性并非均匀地分布在整个可变结构域的范围中。相反，V区由约15-30个氨基酸残基的、被称为框架区(FR)的相对不变的几段序列组成，其被每个长度约9-12个氨基酸残基的、被称为“高变区”或有时被称为“互补决定区”(CDR)的极度可变的较短区域分隔开。每个天然重链和轻链的可变结构域包含4个FR，大部分采用β-片层构象，由3个高变区连接，形成环状连接，在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区由FR紧密相邻地结合在一起，并且与来自其他链的高变区一起对抗体的抗原结合位点的形成起作用(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出多种效应子功能，例如参与抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。
术语“高变区”(也被称为“互补决定区”或CDR)在本文中指免疫球蛋白V区结构域中的抗体氨基酸残基(通常是3或4个具有高度序列可变性的短区域)，其形成抗原结合位点，是抗原特异性的主要决定簇。有至少两种方法用于鉴别CDR残基：(1)基于跨物种序列可变性的方法(即，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health，Bethesda，M S 1991))；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Chothia，C.等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。但是，两种残基鉴别技术定义重叠的区域而非相同区域，可以将它们组合来定义杂交CDR。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从基本均质的抗体群体中获得的抗体，即，除可能天然存在的突变和/或可能以少量存在的翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)外，包括相同群体的单种抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单种抗原性位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规的(多克隆)抗体制品相反，每种单克隆抗体都针对抗原上的单种决定簇。除特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们是通过杂交瘤培养物合成的，不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本均质的抗体群体中获得的，而不被视为要求通过任何特定的方法生产抗体。例如，可以通过由Kohler等人，Nature，256：495(1975)首次描述的杂交瘤方法，或者可以通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)，制备根据本发明的待使用的单克隆抗体。还可以使用例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol. Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术，从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
单克隆抗体在本文中具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)以及此类抗体的片段(只要所述片段表现出所需的生物学活性)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或者属于特定的抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另一种物种或者属于另一种抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源(美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文中的目标嵌合抗体包括“灵长化(primitized)”抗体，其包含源自非人灵长类(例如，旧世界猴子、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
“完整的”抗体是这样的抗体，其包含抗原结合位点和CL，以及至少包含重链结构域CH1、CH2和CH3。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整的抗体具有一种或多种效应子功能。
抗体片段包括完整抗体的一部分，优选地是完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；从抗体片段形成的单链抗体分子和多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生2个相同的、被称为“Fab”片段的抗原结合片段，和残余的“Fc”片段，该名称反映了易于结晶的能力。Fab片段由完整的L链、H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。对于抗原结合而言，每个Fab片段都是单价的，即，其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生单个大的F(ab’)2片段，所述F(ab’)2片段大致对应于2个由二硫化物连接的、具有不同抗原结合活性的Fab片段，且仍然能够交联抗原。Fab′片段不同于Fab片段，其在CH1结构域的羧基端具有若干个额外残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab′-SH在本文中是这样的Fab′的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离的巯基。F(ab’)2抗体片段最初被生产为之间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段对。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
Fc片段包含由二硫化物结合在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应子功能是由Fc区的序列决定的，该区域也被可见于某些细胞类型上的Fc受体(FcR)识别。
“Fv”是含有完全的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密的、非共价关联的一条重链和一条轻链可变区结构域的二聚体组成。这两个结构域的折叠发出了6个高变环(来自H链和L链各3个环)，提供了用于抗原结合的氨基酸残基，并且赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或者进包括抗原特异性的3个CDR的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力，虽然比完整结合位点的亲和力低。
“单链Fv”，也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单条多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含在vH和VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头使sFv能够形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology ofmonoclonal antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
术语“双抗体”指通过构建在VH和VL结构域之间具有短接头(约5-10个残基)的sFv片段(参见前述章节)制备的小抗体片段，如此使得形成链间而非链内的V结构域配对，从而获得二价片段，即，具有2个抗原结合位点的片段。双特异性的双抗体是两个“交换”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体详细描述在例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)中。
“特异性结合”特定多肽或特定多肽上的表位或对于特定多肽或特定多肽上的表位“特异性”的抗体是这样的抗体，所述抗体结合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本不结合任何其他多肽或多肽表位。
术语“固相”描述了本发明的抗体可以附着的非水性基质。涵盖在本文中的固相的实例包括部分地或完全地由玻璃(例如，可控孔度的玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷形成的固相。在某些实施方案中，根据上下文，固相可以包含测定平板的孔；在其他情况下，其是纯化柱(例如，亲和层析柱)。该术语也包括分散颗粒的不连续固相，例如美国专利号4,275,149中描述的那些。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是大部分是人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合亚序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。大部分情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(也是CDR)的残基被来自具有所需的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(如，小鼠、大鼠或兔)的高变区的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，本文中使用的“人源化抗体”还包含既不存在于受体抗体也不存在于供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改善和优化抗体性能。人源化抗体任选地还包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于其他细节，参见Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。
“物种依赖性抗体”，例如，哺乳动物抗人IgE抗体是这样的抗体，其对来自第一种哺乳动物物种的抗原的结合亲和力比对来自第二种哺乳动物物种的该抗原的同源物的结合亲和力更强。一般而言，物种依赖性抗体“特异性地结合”人抗原(即，具有不多于约1x10-7M、备选地不多于约1x10-8M、备选地不多于约1x10-9M的结合亲和力(Kd)值)，但对来自第二种非人哺乳动物物种的抗原同源物的结合亲和力比其与非人抗原的结合亲和力弱至少约50倍，至少约500倍，或者至少约1000倍。物种依赖性抗体可以是上述多种抗体类型中的任一种，但优选是人源化抗体或人抗体。
抗体的“效应子功能”指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，并且随抗体同种型而改变。抗体的效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC指细胞毒性的形式，其中分泌的Ig结合到存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤细胞(NK)、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上，使这些细胞毒性效应子细胞能够特异性地结合具有抗原的靶细胞，并且之后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且是通过该机制杀死靶细胞所必需的。介导ADCC的初级细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)的第464页的表3中总结了造血细胞上的Fc表达。为了评估目标分子的ADCC活性，可以实施体外ACDD测定，如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的。对于此类测定有用的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤细胞(NK)。备选地，或额外地，可以在体内评估目标分子的ADCC活性，例如，在如Clynes等人，PNASUSA 95：652-656(1998)中公布的动物模型中。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的，并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的FcR，包括等位变体和备选地这些受体的剪切形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化型受体”)和FcγRIIB(“抑制型受体”)，具有相似的氨基酸序列，主要在其胞质结构域中有差别。活化型受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见，M.Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中综述了FcR。其他FcR，包括待在将来鉴别的那些，都涵盖在本文的术语“FcR”中。术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体的IgG转移到胎儿中。Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994)。
“人效应子细胞”是表达一种或多种FcR并发挥效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcRIII，并发挥效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤细胞(NK)、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，其中PBMC和MNK细胞是优选的。效应子细胞可以从天然源(例如血液)分离。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体的条件下裂解靶细胞。经典补体途径的活化是由补体系统的第一个组分(C1q)与结合其关联抗原的(恰当亚类的)抗体的结合而起始的。为了评估补体活化，可以实施例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol. Methods 202：163(1996)中描述的CDC测定。
当使用“分离的”来描述本文公布的多种多肽和抗体时，意味着多肽或抗体已经从它的生产环境的组分中鉴别、分离和/或回收。优选地，分离的多肽不与来自它的生产环境中的所有其他组分相关联。它的生产环境的污染性组分，例如由重组的转染细胞造成的污染性组分，是通常干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。在优选的实施方案中，多肽将被纯化至(1)通过使用旋杯式测序仪足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(2)均质(使用考马斯蓝或优选银染法，在非还原或还原条件下，通过SDS-PAGE)。然而，一般地，分离的多肽或抗体是通过至少一个纯化步骤制备的。
编码本文中的多肽和抗体的“分离的”核酸分子是这样的核酸分子，所述核酸分子是从在它的生产环境中与其通常相关联的至少一种污染性核酸分子中鉴别和分离的。优选地，分离的核酸不与和生产环境相关联的所有组分关联。编码本文中的多肽和抗体的分离的核酸分子处于非其被自然发现时的形式或环境的形式。因此，分离的核酸分子不同于编码本文中天然存在于细胞中的的多肽和抗体的核酸。
术语“控制序列”指在特定的宿主生物体中表达有效连接的编码序列所必需的DNA序列。适合原核生物的控制序列包括例如启动子，任选地包括操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸信号和增强子。
当核酸位于与另一种核酸序列的功能性关系中时，所述核酸是“有效连接的”。例如，如果前序列或分泌前导的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则其与多肽的DNA是有效连接的；如果启动子或增强子影响序列转录，则其与编码序列是有效连接的；或者如果核糖体结合位点的放置促进了翻译，则它与编码序列是有效连接的。一般而言，“有效连接的”意味着连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续且处于阅读相(reading phase)中的。然而，增强子不必连续。连接是通过在方便的限制性位点连接而实现的。如果不存在此类位点，则根据常规实践，使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
术语“已附加表位的”用于本文中指包含与“标签多肽”融合的本文所述多肽或抗体的嵌合多肽。标签多肽具有足够的残基来提供针对其制备抗体的表位，然而又足够短使得不干扰与其融合的多肽的活性。优选地，标签多肽是相当足够独特的，使得抗体基本不与其他表位交叉反应。合适的标签多肽一般具有至少6个氨基酸残基，并且通常在约8和50个氨基酸残基之间(优选在约10和20个氨基酸残基之间)。
如本文中使用的，术语“免疫粘附素”表示这样的抗体样分子，所述分子组合了异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能。在结构上，免疫粘附素包含与抗体的抗原识别位点和结合位点不同的(即，“异源的”)、具有所需的结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合体。免疫粘附素分子的粘附部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的、连续的氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以获得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。Ig融合体优选的包括用本文描述的多肽或抗体的结构域替代Ig分子内的至少一个可变区。在特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合体包括IgG1分子的铰链区、CH2和CH3，或铰链区、CH1、CH2和CH3区。关于免疫球蛋白融合体的生产，还参见1995年6月7日公布的美国专利号5,428,130。
术语“药物制剂”指这样的制品，所述制品的形式允许活性成分的生物学活性生效，并且不含有对施用制剂的对象不可接受的毒性的其他组分。
如果在给定的时间时抗体的生物学活性是制备药物制剂时表现出的生物学活性的约10％以内(在测定的误差内)，则抗体在药物制剂中具有“生物学活性”，这首根据抗体在体外或体内与抗原结合的能力和所导致的可测量的生物学应答来确定的。
“稳定的”或“稳定化”制剂是这样的制剂，其中的蛋白质在储藏后基本保留了它的生理学和/或化学稳定性。可以在选定的温度下，测量选定的时间段的稳定性。优选地，制剂在室温(～30℃)下或者在40℃下稳定至少1个月，和/或在约2-8℃下稳定至少1年，优选至少2年。例如，在储藏过程中的聚集程度可用作蛋白质稳定性的标志。因此，“稳定的”制剂可以是这样的制剂，其中少于约10％，并且优选少于约5％的蛋白质在制剂中以聚集物的形式存在。用于测量蛋白质稳定性的多种分析技术是本领域可获得的，综述在例如，在Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中。
增加含有蛋白质的制剂的“稳定性”指降低(相比未处理过的含蛋白质的制剂)或防止制剂中形成蛋白质聚集物。
术语“水性溶液”指这样的溶液，其中水是溶解基质或溶剂。当物质溶解在液体中时，混合物被称为溶液。溶解的物质是溶质，实施溶解的液体是溶剂(在此情况下是水)。
术语“稳定化试剂”或“稳定剂”在本文中是向溶液和混合物或悬浮液或组合物或治疗性组合物中添加的，以维持其处于稳定或不变状态的化学品或化合物；或者是因为其产生涉及原子或分子的改变，导致更稳定的或不变的状态所以使用的化学品或化合物。
术语“聚集物”或“聚集”在本文中意指聚拢到一起，或集合成团或成整体，例如，如在肽、多肽、抗体或其变体的聚集中。聚集物可以自我聚集，或由于其他因素而聚集，例如聚集剂，沉淀剂、搅拌或其他手段和方法，从而导致肽、多肽、抗体或其变体聚拢到一起。
搅拌诱导的聚集是在含有蛋白质的溶液中由搅拌诱导的聚集物形成，其中搅拌是由振荡或搅动引发的运动。
“易于聚集”的抗体是被观察到与其他抗体分子聚集的抗体，尤其是在搅拌的条件下。
“抑制”由搅拌诱导的聚集意指防止、降低或减少由搅拌诱导的聚集的量，是通过比较在包含至少一种搅拌诱导的聚集的抑制剂的含有蛋白质的溶液中存在的聚集物的量，和不包含至少一种搅拌诱导的聚集的抑制剂的含有蛋白质的溶液中存在的聚集物的量来测量的。
搅拌诱导的聚集的抑制量是抑制搅拌诱导的聚集的量。
可用于本发明中用于测量搅拌诱导的聚集的方法包括凝胶电泳、等电聚焦、毛细管电泳、层析如尺寸排阻层析、离子交换层析和逆向高性能液相层析、肽作图、寡糖作图、质谱、紫外吸收光谱学、荧光光谱学、圆二色光谱学、等温滴定量热法、差示扫描量热法、分析超速离心、动态光散射、蛋白水解和交联、浊度测量、过滤阻滞测定、免疫测定、荧光染料结合测定、蛋白质染色测定、显微术和通过ELISA或其他结合测定检测聚集。
“等渗”制剂是具有与人血液基本相同的渗透压的制剂。等渗制剂一般具有从约250至350mOsm的渗透压。术语“低渗”描述了具有低于人血液的渗透压的渗透压的制剂。相应地，术语“高渗”用于描述具有高于人血液的渗透压的渗透压的制剂。例如可以使用蒸汽压或冰冻型渗压计测量等渗性。由于添加盐和/或缓冲液的结果，本发明的制剂是高渗的。
“重构的”制剂是通过在稀释剂中溶解冻干的蛋白质或抗体制剂使得所述蛋白质分散在重构的制剂中而制备的制剂。重构的制剂适合向待用目标蛋白质治疗的患者施用(例如，肠胃外施用)，在本发明的某些实施方案中，可以是适合皮下施用的重构的制剂。
“表面活性剂”是可以在固体-固体、固体-液体、液体-液体和液体-气体的表面发挥效果的表面活性试剂，因为它们的化学组成含有亲水性和疏水性基团。这些材料降低处于空气-水和/或水固体界面处的稀释的溶液中的蛋白质浓度，蛋白质可以吸附在所述界面处并可能聚集。表面活性剂可以结合到蛋白质制剂中的疏水界面上。由于蛋白质单层的解折叠和之后的聚集，特别地当搅拌时水表面上的蛋白质将聚集。
“表面活性剂”可以使蛋白质变性，但也可以使其对于表面变性稳定。一般而言，离子型表面活性剂可以使蛋白质变性。然而，即使在相对高浓度(1％w/v)的条件下，非离子型表面活性剂一般不使蛋白质变性。大部分亲代可接受的非离子型表面活性剂来自聚山梨酸酯或聚醚类。聚山梨酸酯20和80是上市的蛋白质制剂中的当代的表面活性剂稳定剂。然而，蛋白质制剂中使用的其他表面活性剂包括Pluronic F-68和“Brij”类的成员。非离子型表面活性剂可以是基于糖的。基于糖的表面活性剂可以是烷基糖苷类。烷基糖苷的一般结构是R1-O-(CH2)x-R，其中R独立地是CH3或环己基(C6H11)，R1独立地是葡萄糖或麦芽糖。示例性的烷基糖苷类包括这样的烷基糖苷，其中R1是葡萄糖，R是CH3，并且x是5(n-己基-β-D-吡喃葡萄糖苷)、x是6(n-庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷)、x是7(n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷)、x是8(n-壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷)、x是9(n-癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷)和x是11(n-十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷)。有时吡喃葡萄糖苷被称为葡萄糖苷。示例性的烷基糖苷类还包括这样的烷基糖苷，其中R1是麦芽糖，R是CH3，并且x是5(n-己基-β-D-吡喃麦芽糖苷)、x是7(n-辛基-β-D-吡喃麦芽糖苷)、x是8(n-壬基-β-D-吡喃麦芽糖苷)、x是9(n-癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷)、x是10(n-十一烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷)、x是11(n-十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷)、x是12(n-十三烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷)、x是13(n-十四烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷)，和x是15(n-十六烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷)。有时吡喃麦芽糖苷被称为麦芽糖苷。示例性的烷基糖苷类还包括这样的烷基糖苷，其中R1是葡萄糖，x是3，并且R是环己基(3-环己基-1-丙基-β-D-葡萄糖苷)；其中R1是麦芽糖，x是4，和R是环己基(4-环己基-1-丁基-β-D-麦芽糖苷)。
“可药用的酸”包括在配制的浓度和方式下无毒的无机酸和有机酸。例如，合适的无机酸包括盐酸、高氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亚磺酸、磺胺酸、磷酸、碳酸等。合适的有机酸包括直链和支链的烷烃的、芳香烃的、环烃的、脂环族的、芳香脂肪族的、杂环的、饱和的、不饱和的、单、二和三羧酸，包括例如甲酸、乙酸、2-羟基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、t-丁基乙酸、氨基苯甲酸、丙酸、2-羟基丙酸、2-氧基丙酸、丙二酸、环戊基丙酸、环戊基丙酸、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、抗坏血酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、硬脂酸、粘康酸、苦杏仁酸、琥珀酸、扑酸(embonic acid)、反丁烯二酸、苹果酸、马来酸、羟基马来酸、丙二酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、乙醇酸、葡萄糖酸、葡糖酸、丙酮酸、乙醛酸、草酸、甲磺酸、琥珀酸、水杨酸、邻苯二甲酸、palmoic、palmeic、硫氰酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-二乙磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、萘-2-磺酸、对甲基苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧基、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-3-(羟基-2-烯-1-羧酸)、羟基萘甲酸。
“可药用的碱”包括在配制的浓度和方式下无毒的无机碱和有机碱。例如，合适的碱包括从形成无机碱的金属所形成的碱，例如锂、钠、钾、镁、钙、铵、铁、锌、铜、锰、铝、N-甲基葡糖胺、吗啉、哌啶，以及有机无毒碱包括伯胺、仲铵和叔胺、取代胺、环胺和碱性离子交换树脂(例如，N(R′)4 +【其中R′独立地是H或C1-4烷基，例如铵、Tris)】，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙氨基乙醇、trimethamine、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡碱、普鲁卡因、，hydrabamine、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤类、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机无毒碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、trimethamine，双环己胺、胆碱和咖啡碱。
可用于本发明的其他可药用的酸和碱包括源自氨基酸(例如组氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和天冬酰胺)的酸和碱。
“可药用的”缓冲液和盐包括源自上述酸和碱的酸和碱加成盐的。特定的缓冲液和/或盐包括组氨酸、琥珀酸盐和乙酸盐。
“冻干保护剂”是这样的分子，当所述分子与目标蛋白组合时，显著防止或降低蛋白质在冻干和后续储藏时的物理化学不稳定性。示例性的冻干保护剂包括糖及其相应的糖醇；氨基酸，例如谷氨酸一钠或组氨酸；甲胺，例如甜菜碱；易溶盐，例如硫酸镁；多元醇，例如三羟的或更高分子量的糖醇，例如甘油、葡聚糖、赤藓糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；；及其组合。其他示例性的冻干保护剂包括丙三醇和明胶，以及糖类蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水苏糖。还原性糖的实例包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳果糖。非还原性糖的实例包括选自糖醇和其他直链多元醇的多羟基化合物的非还原性糖苷。优选的糖醇是单糖苷，尤其是通过还原二糖(例如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖)获得的化合物。糖苷的侧链基团可以是葡萄糖苷或半乳糖苷。糖醇的其他实例是葡萄糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖。优选的冻干保护剂是非还原性糖海藻糖或蔗糖。
以“冻干保护的量”将冻干保护剂加入到预冻干的制剂中，这意味着，在存在冻干保护量的冻干保护剂的条件下冻干蛋白质后，在冻干和储藏时，蛋白质基本保持了它的物理化学稳定性。
“可药用的糖”是这样的分子，当其与目标蛋白组合时，显著防止或降低蛋白质在储藏时的物理化学不稳定性。当打算将制剂冻干并然后重构时，“可药用的糖”也被称为“冻干保护剂”。示例性的糖及其相应的糖醇包括：氨基酸，例如谷氨酸钠或组氨酸；甲胺，例如甜菜碱；易溶盐，例如硫酸镁；多元醇，例如三羟的或更高分子量的糖醇，例如甘油、葡聚糖、赤藓糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；；及其组合。其他示例性的冻干保护剂包括丙三醇和明胶，以及糖类蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水苏糖。还原性糖的实例包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳果糖。非还原性糖的实例包括选自糖醇和其他直链多元醇的多羟基化合物的非还原性糖苷。优选的糖醇是单糖苷，尤其是通过还原二糖(例如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖)获得的化合物。糖苷的侧链基团可以是葡萄糖苷或半乳糖苷。糖醇的其他实例是葡萄糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖。优选的冻干保护剂是非还原性糖海藻糖或蔗糖。
以“保护量”将可药用的糖加入到(例如，预冻干)制剂中，意味着在储藏过程中(例如，重构和储藏后)，蛋白质基本保持了它的物理化学稳定性。
本文中的目标“稀释剂”是可药用的(对于施用给人是安全无毒的)，并且对于制备液体制剂(例如冻干后重构的制剂)是有用的。示例性的稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲的盐水)、无菌盐溶液、Ringer溶液或葡萄糖[溶液。在备选的实施方案中，稀释剂可包括盐的水性溶液和/或缓冲液。
“防腐剂”是能够添加到本文的制剂中以降低细菌活性的化合物。例如，添加防腐剂可以促进多次使用(多剂量)制剂的生产。潜在的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲铵、氯化苯甲烷铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基是长链化合物)和苯索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳香醇，例如苯酚、丁醇和苯甲醇，烷基对羟基苯甲酸酯类如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯、儿茶酚、雷琐酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。本文中最优选的防腐剂是苯甲醇。
“治疗”指疗法性治疗和预防性或防止性措施。需要治疗的包括已患疾病的，以及需要防止病症的。
用于治疗目的的“哺乳动物”指任何分类为哺乳动物的动物，包括人，驯养的和农场动物，以及动物园、体育运动或宠物动物，如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。优选地，哺乳动物是人。
“病症”是受益于用蛋白质治疗的任何病况。包括慢性和急性病症或疾病，包括那些诱使哺乳动物患所讨论的病症的病理学病况。本文治疗的病症的非限制性实例包括癌症和炎症。
“治疗有效量”是产生对特定的病症的可测量的改善或防止特定的病症至少所需的最低浓度。已知蛋白质的治疗有效量是本领域普遍已知的，而后文发现的蛋白质的治疗有效量可以通过本领域技术人员(例如普通医生)普遍已知的标准技术确定。
按本文所述配制的抗体(包括与毒素缀合的抗体)和其他蛋白质的制备方法是本领域普遍已知的，详细描述在例如WO2007/001851中。
可以按照本发明以水性或冻干的形式配制抗体和其他蛋白质，所述冻干的形式能够重构为水性的形式。
本文描述的制剂可以制备为重构的冻干制剂。将本文描述的蛋白质或抗体冻干，然后重构以生产本发明的液体制剂。在该特别的实施方案中，在如上所述制备目标蛋白后，生产了“预冻干的”制剂。考虑所需的剂量体积、施用模式等，测定存在于预冻干的制剂中的蛋白质的量。例如，完整抗体的起始浓度可以是从约2mg/ml至约50mg/ml，优选从约5mg/ml至约40mg/ml并且最优选从约20-30mg/ml。
待配制的蛋白质一般存在于溶液中。例如，在本发明的液体制剂中，蛋白质可以存在于pH从约4-8，并且优选约5-7的pH缓冲溶液中。缓冲液浓度可以是从约1mM至约20mM，备选地从约3mM至约15mM，取决于例如缓冲液和制剂的(例如，重构制剂的)所需的渗涨度(tonicity)。示例性的缓冲液和/或盐是可药用的，并且可以由合适的酸、碱及其盐产生，例如在“可药用的”酸、碱或缓冲液下定义的那些。
在一个实施方案中，向预冻干的制剂中添加冻干保护剂。预冻干的制剂中的冻干保护剂的量一般使重构后所获得的制剂是等渗的。然而，高渗的重构制剂也可能是合适的。此外，冻干保护剂的量不能太低，使得在冻干时发生不可接受的量的蛋白质降解/聚集。然而，在预冻干制剂中的示例性冻干保护剂浓度是从约10mM至约400mM，备选地从约30mM至约300mM，备选地从约50mM至约100mM。示例性的冻干保护剂包括糖和糖醇，例如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇。然而，在特定环境下，某些冻干保护剂也可以对增加制剂的粘度有作用。因此，需要小心选择特定的冻干保护剂，其使该效果最小化或中和该效果。在上文的“冻干保护剂”的定义中描述了其他的冻干保护剂，其在本文中也被称为“可药用的糖”。
对于每种特定的蛋白质或抗体和冻干保护剂的组合而言，蛋白质与冻干保护剂的比例可以变化。在选择抗体作为蛋白质和糖(例如，蔗糖或海藻糖)作为冻干保护剂，用于生成具有高蛋白质浓度的等渗重构的制剂的情况下，冻干保护剂与抗体的摩尔比可以是从约100至约1500摩尔冻干保护剂比1摩尔抗体，和优选地从约200至约1000摩尔冻干保护剂比1摩尔抗体，例如从约200至约600摩尔冻干保护剂比1摩尔抗体。
冻干保护剂(例如，蔗糖或海藻糖)和增量剂(例如，甘露糖醇或甘油)的混合物可用于制备预冻干制剂。增量剂可以允许生产均匀的冻干饼，其中不含过多的孔穴等。其他可药用的载体、赋形剂或稳定剂，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编著(1980)中所述，也可以包括在预冻干的制剂(和/或冻干的制剂和/或重构的制剂)中，只要它们不对制剂的所需特征产生不利影响。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对受体是无毒的，包括：其他缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂如EDTA；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；可生物降解的聚合物，如聚酯；和/或成盐的抗衡离子，例如钠。
本文中的制剂还可以含有多于一种的、治疗特别指征所必需的蛋白质，优选地具有对其他蛋白质没有不利影响的互补活性的蛋白质。例如，在单个制剂中提供结合所需的靶(例如，受体或抗原)的两种或多种抗体是理想的。此类蛋白质以对预期目的有效的量合适地组合存在。
体内施用所使用的制剂必需是无菌的。可以通过在冻干和重构之前或之后无菌滤膜过滤，来方便的实现。备选地，可以通过例如将除蛋白质以外的成分在约120℃高压灭菌约30分钟，实现对整个混合物的灭菌。
在将蛋白质、任选的冻干保护剂和其他任选的组分一起混合后，将制剂冻干。有多种不同的冻干机可用于该目的，例如Hull50TM(Hull，美国)或GT20TM(Leybold-Heraeus，德国)冻干机。冻干是通过冷冻制剂，并且随后在适合初步干燥的温度下使冰从冰冻内含物中升华来实现的。在该条件下，产品温度低于制剂的共晶点或塌陷温度。通常，在合适的压力下(通常是从约50-250mTorr)，初步干燥的贮存温度(shelf temperature)范围是从约-30至25℃(条件是产物在初步干燥的过程中保持冷冻)。制剂、装有样品的容器(例如，玻璃瓶)的大小和类型，以及液体的体积，将主要决定干燥所需的时间，所述时间范围从若干小时至若干天(例如，40-60hrs)。任选地，取决于产品中所需的剩余湿度水平，还可以实施次级干燥阶段。实施次级干燥的温度是在约0-40℃的范围，主要取决于容器的类型和大小，和所使用的蛋白质的类型。例如，冻干的整个除水阶段的贮存温度可以是从约15-30℃(例如，约20℃)。次级干燥所需的时间和压力是生产合适的冻干饼的时间和压力，取决于例如温度和其他的参数。次级干燥的时间由产物中所需的剩余湿度水平决定，通常需要至少约5小时(例如，10-15小时)。压力可以与初级干燥步骤过程中使用的压力相同。根据制剂和瓶大小，冷冻干燥条件可以变化。
在向患者施用前，用可药用的稀释剂重构冻干的制剂，使重构的制剂中的蛋白质浓度是至少约50mg/ml，例如从约50mg/ml至约400mg/ml，备选地从约80mg/ml至约300mg/ml，备选地从约90mg/ml至约150mg/ml。当需要皮下递送重构的制剂时，重构的制剂中的此类高蛋白质浓度被认为是特别有用的。然而，对于其他施用途径，例如静脉内施用，重构的制剂中较低的蛋白质浓度可为理想的(例如，在重构的制剂中从约5-50mg/ml，或从约10-40mg/ml蛋白质)。在某些实施方案中，重构的制剂中的蛋白质浓度显著高于预冻干的制剂中的蛋白质浓度。例如，重构的制剂中的蛋白质浓度可以是预冻干的制剂中的浓度的约2-40倍，备选地3-10倍，备选地3-6倍(例如，至少3倍或至少4倍)。
重构一般发生在约25℃的温度下，以保证充分水合，但需要时也可以使用其他温度。重构所需的时间取决于例如稀释剂的类型、赋形剂和蛋白质的量。示例性的稀释剂包括无菌水、注射用抑菌水(BWF)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐溶液、Ringer溶液或葡萄糖溶液。稀释剂任选地含有防腐剂。示例性的防腐剂如上所述，优选的防腐剂是芳香醇，例如苯甲醇或酚醇。所使用的防腐剂的量通过评估不同防腐剂浓度与蛋白质的相容性和防腐效力测试来决定。例如，如果防腐剂是芳香醇(例如，苯甲醇)，它可以以从约0.1-2.0％，并且优选地从约0.5-1.5％，但最优选地从约1.0-1.2％的量存在。
优选的，每小瓶重构的制剂具有少于6000个、大小≥10μm的颗粒。
通过混合具有所需的纯度的活性成分和任选的可药用的载体、赋形剂或稳定剂，制备用于储藏的治疗性制剂(Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.18042[1990])。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下，对受体是无毒的，并包括缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠、防腐剂、isotonicifier、稳定剂、金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)，和/或螯合剂，例如EDTA。
当治疗剂是抗体片段时，特异性结合靶蛋白的结合结构域的最小片段是优选的。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计保留结合靶蛋白序列的能力的抗体片段，或者甚至肽分子。此类肽可以是化学合成的和/或通过重组DNA技术生产的(参见例如，Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：7889-7893[1993])。
缓冲液用于控制pH在优化治疗效果的范围内，尤其是当稳定性是pH依赖性的情况下。缓冲液优选以从约50mM至约250mM的浓度存在。用于本发明的合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸，及其盐。例如，柠檬酸、磷酸、琥珀酸、酒石酸、延胡索酸、葡萄糖酸、草酸、乳酸、乙酸。此外，缓冲液可以由组氨酸和三甲基胺盐如Tris组成。
添加防腐剂以延缓微生物生长，通常以从0.2％-1.0％(w/v)的范围存在。用于本发明的合适的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲铵、苯甲烃铵卤化物(例如氯、溴、碘)、苯索氯铵、硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯类例如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚、雷琐酚、环己醇、3-戊醇和间甲苯酚。
存在渗涨度剂，有时被称为“稳定剂”，用于调节或维持液体组合物的渗透压。当与大的带电生物分子(例如蛋白质和抗体)使用时，通常被称为“稳定剂”是因为它们可以与氨基酸侧链的带电基团相互作用，从而减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑其他成分的相对量，渗涨度剂存在的量可以是按重量计在0.1％至25％之间的任何量，优选1至5％。优选的渗涨度剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更多的糖醇，例如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
其他赋形剂包括可用作一种或多种下列物质的活性剂：(1)增量剂，(2)溶解性增强剂，(3)稳定剂和(4)防止变性或吸附到容器壁上的活性剂。此类赋形剂包括：多羟基糖醇(以上枚举的)；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、myoinisitol、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如，肌醇)聚乙二醇；含有硫的还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖例如棉子糖；和多糖例如糊精或葡聚糖。
为了体外施用制剂，其必须是无菌的。可以通过无菌滤膜过滤使制剂无菌。本文中的治疗性组合物一般放在具有无菌进入口的容器中，例如静脉内输液袋或具有可以用皮下注射针头穿刺的瓶塞的小瓶。
施用途径是根据已知的和可接受的方法的，如，通过单次或多次大丸剂或以合适的方式在较长时间段灌注，例如，通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、损害内或关节内的途径注射或灌注、局部施用、吸入、持续释放或缓释的方式。
本文中的制剂还可以含有一种以上的、治疗特定指征必需的活性化合物，优选具有互补活性的、不彼此不利地影响的那些化合物。备选地或额外地，组合物可以包含细胞毒性剂、细胞因子或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量合适地组合存在。
活性成分还可以包载在通过例如凝聚技术或界面聚合所制备的微胶囊，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和多聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳剂中。此类技术公布在Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版中，见上文。
可以制备持续释放的制品。持续释放的制品的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透性基质，所述基质为成形制品的形式，例如膜状或微胶囊状。持续释放的基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸)，或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮氨酰脯氨酸醋酸盐组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。已经用人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白介素-2和MN rpg 120成功地实施了重组蛋白的微胶囊化，用于持续释放。Johnson等人，Nat.Med.2：795-799(1996)；Yasuda等人，Biomed.Ther.27：1221-1223(1993)；Hora等人，Bio/Technology 8：755-758(1990)；Cleland，″Design andProduction of Single Immunization Vaccines Using PolylactidePolyglycolide Microsphere Systems，″in Vaccine Design：The Subunit andAdjuvant Approach，Powell和Newman编著(Plenum Press：New York，1995)，第439-462页；WO 97/03692；WO 96/40072；WO 96/07399；和美国专利号5,654,010。
由于其生物相容性和广泛的生物可降解的性质，可以使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)聚合物开发这些蛋白质的持续释放的制剂。PLGA的降解产物——乳酸和羟基乙酸，可以在人体内快速清除。此外，可以根据其分子量和组成，从数月至数年调节该聚合物的可降解性。Lewis，″Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer″，在Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel Dekker；NewYork，1990)，M.Chasin和R.Langer(编著)第1-41页。
聚合物(如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸)使得分子能够在100天的时间释放，而某些水凝胶则在较短的时间段释放蛋白质。当胶囊化的抗体在体内长时间存留时，它们可能由于暴露在37℃的湿度下而变性或聚集，导致丧失生物学活性，并可能改变免疫原性。可以根据所涉及的机制来设计理性的对策用于稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过二硫键交换而形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制含湿量、使用恰当的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物，来实现稳定化。
脂质体或类蛋白质组合物还可用于配制本文公布的蛋白质或抗体。参见美国专利号4,925,673和5,013,556。
可以通过使用无毒的“水溶性多价金属盐”增强本文描述的蛋白质和抗体的稳定性。实例包括Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+、Sn3+、Al2+和Al3+。可以与上述多价金属阳离子形成水溶性盐的阴离子实例包括从无机酸和/或有机酸形成的阴离子。此类水溶性盐在水中(20℃时)具有至少约20mg/ml，备选地至少约100mg/ml，备选地至少约200mg/ml的溶解度。
可用于形成“水溶性多价金属盐”的合适的无机酸包括盐酸、醋酸、硫酸、硝酸、硫氰酸和磷酸。可以使用的合适有机酸包括脂肪族羧酸和芳香族酸。该定义内的脂肪族酸可被定义为饱和的或不饱和的C2-9羧酸(例如，脂肪族单羧酸、二羧酸和三羧酸)。例如，该定义内的单羧酸包括饱和的C2-9单羧酸乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和capryonic，而不饱和的C2-9单羧酸丙烯酸、propriolic甲基丙烯酸、丁烯酸和异丁烯酸。示例性的二羧酸包括饱和的C2-9二羧酸丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不饱和的C2-9二羧酸包括马来酸、延胡索酸、柠康酸和甲基延胡索酸。示例性的三羧酸包括饱和的C2-9三羧酸丙三羧酸和1，2，3-丁三羧酸。此外，该定义的羧酸还可以含有一个或两个羟基，形成羟基羧酸。示例性的羟基羧酸包括乙醇酸、乳酸、甘油酸、羟基丙二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸。该定义内的芳香酸包括苯甲酸和水杨酸。
可用于帮助稳定本发明的胶囊化的多肽的常用水溶性多价金属盐包括例如：(1)无机酸金属盐卤化物(例如，氯化锌、氯化钙)、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫氰酸盐；(2)脂肪族羧酸金属盐(例如，醋酸钙、醋酸锌、丙酸钙、乳酸锌和酒石酸锌)；和(3)苯甲酸盐的芳香族羧酸金属盐(例如，苯甲酸锌)和水杨酸盐。
为了预防或治疗疾病，活性剂的恰当剂量取决于如上所定义的的待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、是出于预防还是治疗目的施用活性剂、先前的疗法、患者的临床史和对活性剂的应答，以及主治医生的自主裁量。适合以一次或在系列治疗中对患者施用活性剂。
本发明的方法可与治疗病症的已知方法组合，作为组合的或额外的治疗步骤，或者作为疗法制剂的额外组分。
本发明的药物组合物的剂量和所需的药物浓度可以取决于预期的特定用途而改变。确定恰当的剂量或施用途径为本领域普通技术人员所知晓。动物实验提供了用于确定人类疗法的有效剂量的可靠指导。可以遵循Mordenti，J.和Chappell，W."The Use of Interspecies Scaling inToxicokin etics，″In Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi等人编著，Pergamon Press，New York 1989，第42-46页设置的规则，实施有效剂量的种间类推(interspecies scaling)。
当体内施用本文所述多肽或抗体时，普通剂量可以是每天从约10ng/kg哺乳动物体重多至约100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选约1mg/kg/天至10mg/kg/天，取决于施用途径。文献中提供了对特定剂量和递送方法的指导；参见例如美国专利号4,657,760；5,206,344或5,225,212。以下内容也落入本发明的范围内，即，不同的制剂对于不同的治疗和不同的病症是有效的，且预期用来治疗特定器官或组织的施药可能需要以不同于对另一种器官或组织的施药方式的方式来递送。此外，可以通过一次或多次分开的施用或通过连续灌注来施用剂量。对于在若干天或更久的时间的重复施药，根据病况，持续治疗直到出现对疾病症状的理想抑制作用。然而，其他剂量方案也可以是有用的。通过常规技术和测定，可以方便地监控该疗法的进展。
根据已知的方法，向需要用蛋白质治疗的哺乳动物(优选人)施用本发明的制剂(包括但不限于重构的制剂)，如作为大丸剂或通过连续灌注一段时间静脉内施用，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、动脉内、滑膜腔内、鞘膜内、口服、局部或吸入的途径。
在优选的实施方案中，制剂通过皮下(即，皮肤下)施用给哺乳动物。出于此类目的，可以使用注射器注射制剂。然而，用于施用制剂的其他装置也是可获得的，例如注射装置(例如，Inject-easeTM和GenjectTM装置)；注射笔(例如GenPenTM)；自动注射装置、无针装置(例如，MediJectorTM和BioJectorTM)；和皮下膜片(patch)递送系统。
在具体的实施方案中，本发明涉及用于单剂量施药单元的试剂盒。此类试剂盒包含治疗性蛋白质或抗体的水性制剂的容器，包括单室或多室的预填充注射器。示例性的预填充注射器可获得自Vetter GmbH，Ravensburg，德国。
蛋白质的恰当剂量(“疗法有效量”)取决于，例如，待治疗的病况，病况的严重程度和病程，蛋白质是出于预防还是治疗目的施用的，先前疗法，患者的临床史和对蛋白质的应答性，所使用的蛋白质类型，和主治医生的自由裁量。以一次或经过系列治疗对患者合适地施用蛋白质，而且可以在诊断后任何的时间对患者施用蛋白质。蛋白质可以作为唯一治疗施用，或者与对于治疗考虑的病况有用的其他药物或疗法联合施用。
当所选择的蛋白质是抗体时，对患者施用的初始候选剂量是从约0.1-20mg/kg，例如，通过一次或多次分开的施用。然而，其他剂量方案也可以是有用的。通过常规技术可以方便地监控该疗法的进展。
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有制剂、并且优选地提供了关于其使用说明书的制品。制品包含容器。合适的容器包括例如瓶、小瓶(例如，双室小瓶)、注射器(例如，单室或双室注射器)和试管。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。装有制剂的容器上或与容器相关联的标签可以指明重构或使用的说明。标签还可以表明制剂是用于皮下施用或预期用于皮下施用的。装有制剂的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如，2-6次施用)重构的制剂。制品还可以包含第二个容器，其包含合适的稀释剂(例如，BWFI)。在混合稀释剂和冻干的制剂后，重构的制剂中的蛋白质终浓度一般是至少50mg/ml。制品还可以包含基于商业和用户的立场所需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装说明书。
通过下列实施例将更全面的理解本发明。但其不应被视为对本发明范围的限制。本公开内容全文的所有引用都明确地通过引用整合到本文中。
实施例1：对脂肪酸、聚山梨酸酯和POE山梨聚糖对蛋白质聚集的作 用的研究
本实施例说明了聚山梨酸酯、脂肪酸和POE山梨聚糖如何影响水性溶液中的蛋白质聚集。
使用搅拌诱导的蛋白质聚集分析，评价POE山梨聚糖针对溶液中搅拌诱导的抗IL13单克隆抗体的聚集的保护性作用。具体而言，在该研究中，制备与下列潜在的稳定化添加物组合的、含有1mg/ml抗IL13单克隆抗体的缓冲溶液(20mM His-OAc，pH 5.7)：
(i)无添加物，对照；
(ii)月桂酸(29ppm)；
(iii)月桂酸(29ppm)和聚山梨酸酯20(24ppm)；
(iv)POE山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”(150ppm)；
(v)POE山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”(150ppm)和聚山梨酸酯20(24ppm)；
(vi)POE山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”(150ppm)和月桂酸(29ppm)；
(vii)POE山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”(150ppm)，月桂酸(29ppm)和聚山梨酸酯20(24ppm)；
(viii)聚山梨酸酯20(24ppm)。
将9ml含有单克隆抗体的制剂存放到分开的15ml Forma Vitrium小瓶(一式三份)中，密封小瓶，然后允许在台式振荡器上在室温搅拌(70rpm)0小时、4小时或24小时。完成时，立即对每个小瓶的内含物进行UV光谱测定法分析(340-360nm)，测量溶液的浊度。使用1cm路径长度室和Agilent 8453UV分光光度计在25℃下获得浊度。将在没有蛋白质制剂生色团吸光的340、345、350、355和360nm处的吸光值进行平均，并可以测定不可溶的蛋白质聚集物的散射作用。在上述波长下的平均吸收值代表样品的浊度。在这方面，本领域普遍已知含有蛋白质的溶液的浊度与溶液中蛋白质聚集的量直接且定量地相关(例如参见，Dani等人，J.Pharm.Sci.，96(6)：1504-1517(2007))。这些分析的结果显示在图1中。
图1中显示的数据表明，某些聚山梨酸酯降解物(包括脂肪酸、月桂酸)对水性溶液中的蛋白质稳定性具有不利的作用，并且在搅拌时引起蛋白质聚集。相反，向含有抗体的水性溶液中添加POE山梨聚糖防止了在搅拌时蛋白质聚集物的形成。因此，这些数据表明了POE山梨聚糖具有在搅拌时防止蛋白质聚集的作用，因此增强了溶液中的治疗性蛋白质的稳定性。
实施例2：对POE山梨聚糖和PEG对蛋白质聚集的作用的研究
本实施例说明了POE山梨聚糖和PEG作为防止或降低蛋白质聚集的稳定剂的用途。
使用搅拌诱导蛋白质聚集分析，评价多种POE山梨聚糖和PEG针对溶液中搅拌诱导的两种单克隆抗体(抗IL13和抗IgE抗体)的聚集的保护性作用。
在这组研究中，制备含有1mg/ml抗IL13抗体(20mM His-OAc，pH5.7)或抗IgE抗体(His-HisCl，pH 6.0)的缓冲溶液，其中具有下列添加物：
(i)无添加物，对照；
(ii)浓度为200ppm的POE山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”；
(iii)浓度为1000ppm的POE山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”；
(iv)浓度为5000ppm的POE山梨聚糖20“(a+b+c+d＝20)”；
(v)浓度为200ppm的PEG 1000；
(vi)浓度为1000ppm的PEG 1000；
(vii)浓度为5000ppm的PEG 1000；
(viii)浓度为200ppm的PEG 6000；
(ix)浓度为1000ppm的PEG 6000；
(x)浓度为5000ppm的PEG 6000。
将9ml含有单克隆抗体的每种制剂存放到分开的15ml FormaVitrium小瓶(一式三份)中，密封小瓶，然后允许在台式振荡器上在室温搅拌(70rpm)0小时、4小时或24小时。完成时，立即对每个小瓶的内含物进行下列分析，(a)UV光谱测定法分析，以测量过滤后的蛋白质浓度，(b)UV光谱测定法分析(340-360nm)，以测量溶液的浊度，和(c)不透光度(light obscuration)分析，用于测定蛋白质颗粒大小和分布。
A.UV光谱测定法测量蛋白质浓度
在如上所述进行振荡后，立即过滤含有蛋白质的溶液，以移除蛋白质聚集物，然后通过UV光谱测定法确定滤液中的蛋白质浓度。蛋白质浓度数据是使用0.5或1cm路径长度室和Agilent 8453UV分光光度计在25℃获得的。在278nm处使用的消光系数E为1.45和1.60mL mg-1cm-1，来测定通过0.2μm注射器式滤器过滤后的抗体浓度。从在278nm处的吸光值中减去在320nm处的吸光值，来计算散射作用。在这方面，本领域普遍已知可以使用UV吸收分析定量地测量含有蛋白质的溶液中的蛋白质浓度(例如参见，Liu等人，J.Pharm.Sci.，94(9)：1928-1940(2005))。对于抗IL13抗体和抗IgE抗体获得的数据的结果分别显示在图2和3中。
图2和3中的数据表明，搅拌未处理的对照抗体制剂诱导可测量的并且显著的聚集以及在过滤时的蛋白质损失。相反，添加全部测试的多种浓度的POE山梨聚糖或PEG都防止搅拌诱导的蛋白质聚集物形成，并因此防止过滤时的蛋白质损失。这些数据表明，POE山梨聚糖和聚乙二醇通过防止或降低溶液中的蛋白质聚集物形成，而在水性溶液中作为有效的蛋白质稳定剂发挥功能。
B.UV光谱测定法测量溶液浊度
如上所述，在340-360nm处的UV光谱测定法提供了定量地测定溶液中存在的蛋白质聚集物的量的有效手段，其中浊度与存在的聚集的蛋白质的量直接相关。从抗IL13抗体和抗IgE抗体的浊度分析获得的结果分别显示在图4和5中。
图4和5中的数据表明，搅拌未处理的对照抗体制剂诱导其中可测量的和显著的抗体聚集。相反，添加全部测试的多种浓度的POE山梨聚糖或PEG都防止和/或降低了搅拌诱导的蛋白质聚集物形成。这些数据表明，POE山梨聚糖和聚乙二醇通过防止或降低溶液中的蛋白质聚集物形成，而在水性溶液中作为有效的蛋白质稳定剂发挥功能。
C.测定颗粒大小分布
还分析上述含有抗体的水性溶液，以测定其中含有的蛋白质的颗粒大小分布。具体而言，使用与HIAC/Royco 3000A液体注射器采样仪、HRLD-150传感器相连的HIAC/Royco 9703液体颗粒计数器，在室温下测量在2至50μm之间的不可溶的颗粒的数量和大小，并使用PacificSpec 2.0版软件进行分析。检测的上限是～18000颗粒/ml，并且超过该阈值的样品经过恰当稀释后进行测量。以每次注射1.0mL体积，测量每个样品4次。丢弃第1次注射，从最后3次注射获得平均值。在每次样品分析之间，用注射用水清洗系统，至仪器的2μm颗粒计数＜10。≥2、5、10、15、25、35和50μm的亚可见(sub-visible)的颗粒表示为每ml的累积计数。
从这些分析获得的结果分别显示在图6-11中。图6-11中的数据表明，搅拌未处理的对照抗体制剂诱导其中可测量的和显著的抗体聚集。相反，添加全部测试的多种浓度的POE山梨聚糖或PEG都防止和/或降低了搅拌诱导的蛋白质聚集物形成。这些数据表明，POE山梨聚糖和聚乙二醇通过防止或降低溶液中的蛋白质聚集物形成，而在水性溶液中作为有效的蛋白质稳定剂发挥功能。

Claims (21)

1.包含蛋白质和聚乙二醇的物质组合物，其中所述组合物不含聚山梨酸酯并且其中聚乙二醇以10,000ppm或更低的浓度存在。
2.权利要求1的物质组合物，其中蛋白质是抗体。
3.权利要求1的物质组合物，其中聚乙二醇以从20ppm至10,000ppm的浓度存在。
4.权利要求1的物质组合物，其中聚乙二醇选自PEG 1000和PEG 6000。
5.权利要求1的物质组合物，其不含表面活性剂。
6.权利要求1的物质组合物，其是水性形式。
7.权利要求1的物质组合物，其是冻干的形式。
8.权利要求1的物质组合物，其还包含POE山梨聚糖。
9.权利要求8的物质组合物，其中POE山梨聚糖以从20ppm至100,000ppm的浓度存在。
10.权利要求8的物质组合物，其中POE山梨聚糖选自POE山梨聚糖10、POE山梨聚糖20、POE山梨聚糖40和POE山梨聚糖80。
11.包含装有权利要求1至10中任一项的物质组合物的容器的制品。
12.制备稳定的含有蛋白质的制剂的方法，所述方法包括混合蛋白质与聚乙二醇，其中所述聚乙二醇以10,000ppm或更低的浓度存在，从而提供所述稳定的含有蛋白质的制剂。
13.权利要求12的方法，其中所述蛋白质是抗体。
14.权利要求12的方法，其中聚乙二醇选自PEG 1000和PEG 6000。
15.权利要求12的方法，其还包括冻干所述稳定的含有蛋白质的制剂的步骤。
16.增加蛋白质在水性溶液中的稳定性的方法，所述方法包括混合所述蛋白质与聚乙二醇，其中所述聚乙二醇以10,000ppm或更低的浓度存在，并增加所述蛋白质在水性溶液中的稳定性。
17.权利要求16的方法，其中所述蛋白质是抗体。
18.权利要求16的方法，其中聚乙二醇选自PEG 1000和PEG 6000。
19.防止或降低蛋白质在水性溶液中聚集的方法，所述方法包括混合所述蛋白质与聚乙二醇，其中所述聚乙二醇以10,000ppm或更低的浓度存在，并防止或降低所述蛋白质在水性溶液中的聚集。
20.权利要求19的方法，其中所述蛋白质是抗体。
21.权利要求19的方法，其中聚乙二醇选自PEG 1000和PEG 6000。
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