ES2329437T3 - Anticuerpos anti-erbb2 humanizados y tratamiento con anticuerpos anti-erbb2. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio pesado variable (VH) de SEC ID No. 4 y la secuencia de aminoácidos del dominio ligero variable (VL) de SEC ID No. 3.

Description

Anticuerpos anti-ErbB2 humanizados y tratamiento con anticuerpos anti-ErbB2.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-ErbB2 humanizados útiles para el tratamiento del cáncer con anticuerpos anti-ErbB2, tales como anticuerpos anti-ErbB2 humanizados.

Antecedentes de la invención

La familia de receptores de tirosina quinasas ErbB son mediadores importantes del crecimiento, diferenciación y supervivencia celular. La familia de receptores puede incluir cuatro miembros diferentes que incluyen el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR o ErbB1), HER2 (ErbB2 o p185^{neu}), HER3 (ErbB3) y HER4 (erbB4 o tyro2).

El EGFR, codificado por el gen erbB1, está implicado de forma causal en tumores humanos. En particular, se ha observado un aumento de la expresión de EGFR en cáncer de mama, vejiga, pulmón, cabeza, cuello y estómago, así como glioblastomas. El aumento de la expresión del receptor EGFR está asociado a menudo con un aumento en la producción del ligando de EGFR, que transforma el factor de crecimiento alfa (TGF-\alpha), por las mismas células tumorales que da lugar a una activación del receptor por un mecanismo estimulador autocrino. Baselga y Menldelsohn Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994). Se han evaluado anticuerpos monoclonales dirigidos contra el EGFR o sus ligandos, TGF-\alpha y EGF como agentes terapéuticos en el tratamiento de dichos tumores. Véase, por ejemplo, Baselga y Menldelsohn, supra; Masui et al., Cancer Research 44: 1002-1007 (1984); y Wu et al. J. Clin. Invest. 95. 1897-1905 (1995).

El segundo miembro de la familia de ErbB, p185^{neu}, se identificó originalmente como el producto del gen transformante de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La forma activada del proto-oncogén neu resulta de una mutación puntual (de valina a ácido glutámico) en la región transmembrana de la proteína codificada. La amplificación del homólogo humano de neu se observa en los cáncer de mama y ovario y se correlaciona con un pronóstico pobre (salmón et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 797-712 (1989); y Patente de Estados Unidos No. 4.968.603). Hasta la fecha, no se ha descrito una mutación puntual análoga a esta en el proto-oncogén neu para tumores humanos. También se ha observado la sobreexpresión de ErbB2 (frecuentemente, pero no uniformemente debido a la amplificación génica) en otros carcinomas incluyendo carcinomas del estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas y vejiga. Véase, entre otros, King et al., Science, 229: 974 (1985); Yokota et al., Lancet: 1: 765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol Cell Biol. 6: 955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res., 3: 21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4: 81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51: 1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50: 421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50: 5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49: 6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3: 354-357 (1990); Aasland et al. Br. J. Cancer 57: 358-363 (1988); Williams et al. Pathiobiology 59: 46-52 (1991); y McCann et al., Cancer, 65: 88-92 (1990). ErbB2 se puede sobreexpresar en el cáncer de próstata (Gu et al. Cancer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross et al. Hum.
Pathol. 28: 827-33 (1997); Ross et al. Cancer 79: 2162-70 (1997); y Sadasivan et al. J. Urol. 150: 126-31 (1993)).

Se han descrito anticuerpos dirigidos contra el productos proteicos p185^{neu} de rata y ErbB2 humano. Drebin y colaboradores han desarrollado anticuerpos contra el producto génico neu de rata, p185^{neu}. Véase, por ejemplo, Drebin et al., Cell 41: 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991) y Wo94/22478. Drebin et al., Oncogene 2: 273-277 (1988) describen que mezclas de anticuerpos reactivos con dos regiones diferentes de p185^{neu} dan lugar a efector sinérgico anti-tumorales sobre células NIH-3T3 transformadas por neu. Véase también la Patente de Estados Unidos 5.824.311 publicada el 20 de octubre de 1998.

Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) describen la generación de un panel de anticuerpos anti-ErbB2 que se caracterizaron utilizando la línea de células de tumor de mama humana SK-BR-3. La proliferación celular relativa de las células SK-BR-3 tras la exposición a los anticuerpos se determinó mediante tinción con violeta cristal de las monocapas después de 72 horas. Utilizando este ensayo, se obtuvo la máxima inhibición con el anticuerpo llamado 4D5 que inhibió la proliferación celular en un 56%. Otros anticuerpos en el panel redujeron la proliferación celular en menor grado en este ensayo. También se observó que el anticuerpo 4D5 sensibilizaba las líneas de células de tumor de mama que sobreexpresan ErbB2 a los efectos citotóxicos de TNF-\alpha. Véase también la Patente de Estados Unidos No. 5.677.171 concedida el 14 de octubre de 1997. Los anticuerpos anti-ErbB2 descritos en Hudziak et al., se caracterizan adicionalmente en Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al. In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3):117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11 (2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9: 1829-1838 (1994); Vitetta et al. Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al. J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); y D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7202-7206 (1994); Lewis et al. Cancer Research 56: 1457-1465 (1996); y Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997).

La versión humanizada recombinante del anticuerpo anti-ErbB2 murino 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 o HERCEPTIN®; Patente de Estados Unidos No. 5.821.337) es clínicamente activa en paciente con cáncer de mama metastático que sobreexpresan ErbB2 que han recibido una terapia anti-cáncer extensa previa (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14: 737-744 (1996)). HERCEPTIN® recibió la aprobación de comercialización de la Admisnitración de Alimentación y Fármacos el 25 de septiembre de 1998 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastático cuyos tumores sobreexpresan la proteína ErbB2.

Se han descrito otros anticuerpos anti-ErbB2 con varias propiedades en Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47: 933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4: 543-548 (1989); Maier et al. Cancer Res. 51: 5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991); Bacus el al. Cancer Research 52: 2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52: 2771-2776 (1992); Hancock et al. Cancer Res. 51: 4575-4580 (1991); Shawver et al. Cancer Res. 54: 1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cancer Res. 54: 3758-3765 (1994); Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267: 15160-15167 (1992); Patente de Estados Unidos No. 5.783.186; y Klapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997).

El cribado por homología ha dado lugar a la identificación de otros dos miembros de la familia de receptores de ErbB; ErbB3 (Patente de Estados Unidos Nos. 5.183.884 y 5.480.968, así como Kraus et al. PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989)) y ErbB4 (solicitud de Patente EP No 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993)). Ambos receptores muestran una mayor expresión en por lo menos algunas líneas celulares de cáncer de mama.

Los receptores de ErbB se encuentran generalmente en varias combinaciones en células y se cree que la heterodimerización aumenta la diversidad de las respuestas celulares a una serie de ligandos de ErbB (Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). El EGFR se une mediante seis ligandos diferentes; factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGP-\alpha), anfirregulina, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF), botacelulina y epirregulina (Groenen et al., Growth Factors 11: 235-257 (1994)). Una familia de proteínas de heregulina resultante del "splicing" alternativo de un único gen son los ligandos para ErbB3 y ErbB4. La familia de heregulina incluye las heregulinas alfa, beta y gamma (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); Patente de Estados Unidos No. 5.641.869 y Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)); factores de diferenciación neu (NDFs), factores de crecimiento glial (GGFs); actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA); y factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF). Para una revisión, véase Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7: 247-262 (1996) y Lee et al. Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995). Recientemente, se identificaron tres ligandos de ErbB adicionales; neuregulina-2 (NRG-2) que se indica que se une a ErbB3 o ErbB4 (Chang et al, Nature 387 509-512 (1997); y Carraway et al Nature 387: 512-516 (1997)); neuregulin-3 que se une a ErbB4 (Zhang et al. PNAS (USA) 94 (18): 9562-7 (1997)); y neuregulin-4 que se une a ErbB4 (Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulina y epiregulina también se unen a ErbB4.

Aunque EGF y TGF\alpha no se unen a ErbB2, el EGF estimula EGFR y ErbB2 para formar un heterodímero, que activa el EGFR y da lugar a la transfosforilación de ErbB2 en el heterodímero. La dimerización y/o transfosforilación parece activar la ERbB2 tirosina quinasa. Véase Earp et al. supra. Asimismo, cuando ErbB3 se coexpresa con ErbB2, se forma un complejo de señalización activo y los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 son capaces de romper este complejo (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269 (20): 14661-14665 (1994)). Adicionalmente, la afinidad de ErbB3 por heregulina (HRG) aumenta hasta un estado de afinidad superior cuando se coexpresa con ErbB2. Véase, también, Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995); y Lewis et al., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996) con respecto al complejo de proteínas ErbB2-ErbB3. ErbB4, como ErbB3, forma un complejo de señalización activo con ErbB2 (Carraway y Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)).

WO89/06692 describe un método de inhibición del crecimiento de células tumorales que sobreexpresa el receptor de HER2 (también conocido como ErbB2) mediante el tratamiento de las células con anticuerpos que inhiben la función del receptor de HER2.

WO98/17797 describe anticuerpos anti-ErbB2 que se unen a un epítopo en el dominio 1 de ErbB2 para inducir la muerte celular vía apoptosis y el uso de estos anticuerpos en un método de inducción de la muerte celular.

WO99/31140 describe el tratamiento de pacientes humanos susceptibles de o diagnosticados con cáncer que sobreexpresa ErbB2 con una combinación de anticuerpo anti-ErbB2 y un agente quimioterapéutico.

Descripción resumida de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a ErbB2, tal como se reivindica.

En la presente invención se contemplan varias ventajas al utilizar un anticuerpo que se une a ErbB2 para tratar el cáncer, en oposición a fármacos dirigidos a EGFR. En particular, EGFR es altamente expresado en hígado y piel y esto proporciona un espacio enorme para un fármaco activo donde el fármaco se une a EGFR. Además, se ha observado toxicidad de la piel para otros fármacos dirigidos a EGFR, tales como el anticuerpo anti-EGFR quimérico C225 y el fármaco de molécula pequeña ZD1839 que se une a EGFR. Se anticipan anticuerpos que se unen a ErbB2 para tener un mejor perfil de seguridad que dichos fármacos.

Cuando se utiliza el anticuerpo para la terapia en la presente invención se bloquea la activación por ligando de un receptor de ErbB y/o presenta una característica biológica de anticuerpo monoclonal 2C4, se consiguen ventajas adicionales. Por ejemplo, mientras que los fármacos dirigidos a EGFR interfieren sólo con EGFR, los anticuerpos de particular interés de la presente invención (por ejemplo, 2C4, incluyendo variantes humanizadas y/o maduras por afinidad del mismo) interferirán con los heterodímeros EGFR/ErbB2, ErbB3/ErbB4 y ErbB2/ErbB3. Además, los anticuerpos de la presente invención que se unen a ErbB2 y bloquean la activación por ligando de un receptor de ErbB serán complementarios a fármacos dirigidos a EGFR, donde los fármacos dirigidos a EGFR no son complementarios entre sí.

El anticuerpo reivindicado es útil para tratar cáncer en un ser humano, donde el cáncer está o no caracterizado por la sobreexpresión del receptor de ErbB2, en un método que comprende administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo reivindicado.

El anticuerpo reivindicado es útil en un método de tratamiento de cáncer independiente de hormonas en un ser humano que comprende administrar al ser humano un cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une al receptor ErbB2 y bloquea la activación del ligando de un receptor ErbB.

El anticuerpo reivindicado es útil en un método de tratamiento de cáncer en un ser humano que comprende administrar al ser humano cantidades terapéuticamente eficaces de (a) un primer anticuerpo que se une a ErbB2 e inhibe el crecimiento de células de cáncer que sobreexpresan ErbB2; y (b) un segundo anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación del ligando de un receptor ErbB.

El anticuerpo reivindicado es útil en un método de tratamiento de cáncer en un ser humano, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de colon, rectal, colorrectal, que comprende administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación del ligando de un receptor ErbB.

También se describen artículos de fabricación para su uso (ente otras cosas) en los métodos anteriores, por ejemplo, un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un anticuerpo que se une a ErbB2, y que comprende además un prospecto que indica que la composición se puede utilizar para tratar el cáncer que expresa el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

También se describe un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un anticuerpo que se une a ErbB22 y bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB, y que comprende además un prospecto que indica que la composición se puede utilizar para tratar el cáncer, donde el cáncer no está caracterizado por la sobreexpresión del receptor ErbB2.

También se describe un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB, y que comprende además un prospecto que indica que la composición se puede utilizar para tratar el cáncer independiente de hormonas.

Se puede proporcionar un artículo de fabricación que comprende (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un primer anticuerpo que se une a ErbB2 e inhibe el crecimiento de células de cáncer que sobreexpresan ErbB2; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un segundo anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB.

Un artículo de fabricación adicional comprende un recipiente y una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB, y que comprende además un prospecto que indica que la composición se puede utilizar para tratar un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de colon, rectal y colorrectal.

La presente invención proporciona adicionalmente: un anticuerpo humanizado que se une a ErbB2 y bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB; una composición que comprende el anticuerpo humanizado y un portador farmacéuticamente aceptable; y un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo humanizado conjugado con un agente citotóxico.

Además, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo humanizado, un vector que comprende el ácido nucleico; una célula huésped que comprende el ácido nucleico o el vector; así como un proceso de producción del anticuerpo humanizado que comprende cultivar una célula huésped que comprende el ácido nucleico, de manera que se expresa el ácido nucleico y, opcionalmente, comprende además la recuperación del anticuerpo humanizado del cultivo de células huésped (por ejemplo, del medio de cultivo de células huéspedes).

La presente invención se refiere además a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a ErbB2 conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina y el uso de dichos conjugados para tratar el cáncer que sobreexpresa ErbB2, por ejemplo, cáncer que sobreexpresa ErbB2 en un humano. Preferiblemente, el anticuerpo en el conjugado es un anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo, 4D5 humanizado (y preferiblemente huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®); o un anticuerpo monoclonal 2C4, por ejemplo, 2C4 humanizado. El anticuerpo en el inmunoconjugado puede ser un anticuerpo intacto (por ejemplo, un anticuerpo IgG_{1} intacto) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un Fab,
F(ab')_{2}, "diabody", etc.).

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B representan el mapeo de epítopos de residuos 22-645 en el dominio extracelular (ECD) de ErbB2 (secuencia de aminoácidos, incluyendo la secuencia señal, mostrada en la figura 1A; SEC ID No. 13), tal como se determina mediante el análisis de mutantes por truncamiento y la mutagénesis dirigida de sitio (Nakamura et al. J. of Virology 67 (10): 6179-6191 (1993); y Renz et al. J. Cell Biol., 125 (6): 1395-1406 (1994)). Los diversos truncamientos o mutaciones puntuales de ECD de ErbB2 se prepararon a partir de ADNc utilizando tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa. Los mutantes de ErbB2 se expresaron como proteínas de fusión gD en un plásmido de expresión en mamíferos. Este plásmido de expresión utiliza el promotor/potenciador de citomegalovirus con terminación de SV40 y señales de poliadenilación localizados en dirección 3' del ADNc insertado. El ADN plasmídico se transfectó en células 293. Un día después de la transfección, las células se marcaron metabólicamente durante toda la noche en metionina y sin cisteína, DMEM bajo en glucosa que contenía suero bovino fetal dializado al 1% y 25 \muCi de ^{35}S metionina y ^{35}S cisteína. Se recogieron los sobrenadantes y se añadieron al sobrenadante los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 o los anticuerpos de control y se incubaron 2-4 horas a 4ºC. Los complejos precipitaron, se aplicaron a un gel en gradiente de SDS de Tricina al 10-20% y se pasó por electroforesis a 100 V. El gel se electrotransfirió sobre una membrana y se analizó mediante autorradiografía. Tal como se muestra en la figura 1B, los anticuerpos anti-ErbB2 7C2, 7F3, 2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 y 3H4 se unen a varios epítopos de ECD de ErbB2.

Las figuras 2A y 2B muestran el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 2C4 y 7F4 sobre la activación de rHRG\beta1 de células MCF7. La figura 2A muestra las curvas de dosis-respuesta para la inhibición por 2C4 o 7F3 de la estimulación de HRG de la fosforilación de tirosina. La figura 2B muestra las curvas dosis-respuesta para la inhibición por 2C4 o 7F3 de rHRG\beta1_{117-244} marcado con ^{125}I que se une a las células MCF7.

La figura 3 representa la inhibición de la unión no específica de rHRG\beta1_{117-244} marcado con ^{125}I a un panel de líneas de células tumorales humanas por los anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 2C4 o 7F3. Los controles de anticuerpos monoclonales son anticuerpos monoclonales murinos emparejados por el isotipo que no lo bloquean la unión a rHRG. La unión no específica a rHRG\beta1_{177-244} marcado con ^{125}I se determinó a partir de incubaciones paralelas realizadas en presencia de 100 nM de rHRG\beta1. Los valores para la unión no específica de rHRG\beta1_{177-244} marcado con ^{125}I fueron inferiores al 1% del total para las líneas celulares analizadas.

Las figuras 4A y 4B muestran el efecto de los anticuerpos monoclonales 2C4 y 4D5 en la proliferación de células MDA-MB-175 (figura 4A) y SK-BR-3 (figura 4B). Las células MDA-MB-175 y SK-BR-3 se sembraron en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante 2 horas. El experimento se llevó a cabo en un medio que contenía suero al 1%. Se añadieron anticuerpos anti-ErbB2 o medio solo y las células se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Posteriormente, se añadieron rHRG\beta1 (1 nM) o medio solo y las células se incubaron durante 4 días. Se lavaron las monocapas y se tiñeron/fijaron con violeta cristal al 0,5%. Para determinar la proliferación celular, se midió la absorbancia a 540 nm.

Las figuras 5A y 5B muestran el efecto del anticuerpo monoclonal 2C4, el anticuerpo HERCEPTIN® o un anticuerpo anti-EGFR en asociación dependiente de heregulina (HRG) de ErbB2 con ErbB3 en células MCF7 que expresan niveles bajos/normales de ErbB2 (figura 5A) y células SK-BR-3 que expresan niveles elevados de ErbB2 (figura 5B); véase, el Ejemplo 2 siguiente.

Las figuras 6A y 6B muestran comparan las actividades del anticuerpo monoclonal 2C4 murino intacto (mu 2C4) y un fragmento Fab de 2C4 quimérico. La figura 6A muestra la inhibición de la unión de ^{125}I-HRG a células MCF7 por el Fab de 2C4 quimérico o el anticuerpo monoclonal 2C4 murino intacto. Las células MCF7 se sembraron en placas de 24 pocillos (1 x 10^{5} células/pocillo) y se desarrollan hasta aproximadamente una confluencia del 85% durante dos días. Los experimentos de unión se realizaron tal como se ha descrito en Lewis et al. Cancer Research 56: 1457-1465 (1996). La figura 6B representa la inhibición de la activación por rHRG\beta1 de la tirosina p180 de fosforilación en células MCF7 realizada tal como se ha descrito en Lewis et al. Cancer Research 56: 1457-1465 (1996).

Las figuras 7A y 7B representan alineaciones de las secuencias de aminoácidos de los dominios ligero variable (V_{L}) (figura 7A) y pesado variable (V_{H}) (figura 7B) del anticuerpo monoclonal murino 2C4 (SEC ID Nos. 1 y 2, respectivamente); los dominios V_{L} y V_{H} de la versión de 2C4 humanizada 574 (SEC ID Nos. 3 y 4, respectivamente), y las estructuras de consenso V_{L} y V_{H} humanas (hum \kappa1, subgrupo kappa ligera I; humIII, subgrupo pesada III) (Sec Id Nos. 5 y 6, respectivamente). Los asteriscos identifican las diferencias entre la versión de 2C4 humanizada 574 y el anticuerpo monoclonal murino 2C4 o entre la versión de 2C4 humanizada 574 y el dominio de estructura humana. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se encuentran entre paréntesis.

Las figuras 8A a 8C muestran la unión de Fab de 2C4 quimérico (Fab.v1) y diversas variantes de 2C4 humanizadas al dominio extracelular de ErbB2 (ECD) tal como se determina mediante ELISA en el Ejemplo 3.

La figura 9 es un diagrama en lazos de los dominios V_{L} y V_{H} del anticuerpo monoclonal 2C4 con el esqueleto de CDR blanco marcado (L1, L2, L3, H1, H2, H3). También se muestran las cadenas laterales de VH evaluadas mediante mutagénesis durante la humanización (véase el Ejemplo 3, tabla 2).

La figura 10 representa el efecto del anticuerpo monoclonal 2C4 o HERCEPTIN® en la activación mediada por EGF, TGF-\alpha o HRG de proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK).

La figura 11 es un gráfico de barras que muestra el efecto de anticuerpos anti-ErbB2 (solos o en combinaciones) en xenoinjertos de adenocarcinoma de pulmón Calu3 (sobreexpresante de 3+ ErbB2). Nota: el tratamiento se detuvo en el día 24.

La figura 12 representa el efecto del anticuerpo monoclonal 2C4 humanizado recombinante (rhuMAb 2C4) o HERCEPTIN® en el crecimiento de las células MDA-175 tal como se evalúa en un ensayo de Azul alamar.

La figura 13 muestra la eficacia de rhuMAb 2C4 contra los xenoinjertos de MCF7.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Un "receptor ErbB" es un receptor de proteína tirosina quinasa que pertenece a la familia de receptores ErbB e incluye EGFR, ErbB2, ErbB3 y ErbB4 y otros miembros de esta familia a identificar en el futuro. El receptor ErbB comprenderá generalmente un dominio extracelular, que se puede unir a un ligando de ErbB; un dominio transmembrana lipofílico; un dominio tirosina quinasa intracelular conservado; y un dominio de señalización carboxi terminal que alberga varios residuos de tirosina que se pueden fosforilar. El receptor ErbB puede ser una receptor ErbB de "secuencia nativa" o una "variante en la secuencia de aminoácidos" de la misma. Preferiblemente, el receptor ErbB es un receptor ErbB humano de secuencia nativa.

El término "ErbB1", "receptor del factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR" se utilizan indistintamente en la presente invención y se refieren a EGFR tal como se describe, por ejemplo, en Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56. 881-914 (1987), incluyendo formas mutantes naturales del mismo (por ejemplo, un EGFR mutante por deleción como en Humphrey et al. PNAS (USA) 87: 4207-4211 (1990)). erbB1 se refiere al gen que codifica el producto proteico EGFR.

Las expresiones "ErbB2" y "HER2" se utilizan indistintamente en la presente invención y se refieren a la proteína HER2 humana descrita aquí, por ejemplo, en Semba et al., PNAs (USA) 82: 6497-6501 (1985) y Yamamoto et al. Nature 319: 230-234 (1986) (Número de acceso del Banco de genes X03363). El término "erbB2" se refiere al gen que codifica ErbB2 humano y "neu" se refiere al gen que codifica p185^{neu} de rata. El ErBB2 preferido es ErbB2 humano de secuencia nativa.

"ErbB3" y "HER3" se refieren al polipéptido receptor tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados unidos No. 5.183.884 y 5.480.968, así como Kraus et al. PNAs (USA) 86: 9193-9197 (1989).

Los términos "ErbB4" y "Her4" se refieren aquí al polipéptido receptor tal como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de patente EP No. 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); y Plowman et al., Nature 366: 473-475 (1993), incluyendo isoformas de los mismos, por ejemplo, tal como se describe en WO99/19488, publicada el 22 de abril de 1999.

Por "ligando de ErbB" se entiende un polipéptido que se une y7o activa un receptor ErbB. El ligando de ErbB. De particular interés en la presente invención es un ligando de ErbB humano de secuencia nativa, tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247: 7612-7621 (1972)); factor de crecimiento transformante alfa (TGF-\alpha) (Marquardt et al., Science 223: 1079-1082 (1984)); anfiregulina también conocida como schwanoma o factor de crecimiento autocrino de queratinocitos (Shoyab et al. Science 243: 1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348: 257-260 (1990); y Cook et al. Mol. Cell. Biol. 11: 2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science 259: 1604-1607 (1993); y Sasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 1173 (1993)); factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251: 936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270: 7495-7500 (1995); y Komurasaki et al. Oncogene 15: 2841-2848 (1997)); una heregulina (ver a continuación); neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387: 512-516 (1997)); neuregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567 (1997)); neuregulina-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)) o cripto (CR-1) (Kannan et al. J. Biol. Chem. 272 (6): 3330-3335 (1997)). Los ligandos de ErbB que se unen a EGFR incluyen EGF, TGF-\alpha, anfiregulina, betacelulina, HB-EGF y epiregulina. Los ligandos de ErbB que se unen a ErbB3 incluyen heregulinas. Los ligandos de ErbB capaces de unirse a ErbB4 incluyen betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y heregulinas.

"Heregulina" (HRG) cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un polipéptido codificado por el producto génico de heregulina tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5,641,869 o Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993). Ejemplos de heregulinas incluyen heregulin-\alpha, heregulin-\beta1, heregulin-\beta2 y heregulin-\beta3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); y la Patente de Estados Unidos No. 5.641.869); factor de diferenciación neu (NDF) (Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)); actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA) (Falls et al. Cell 72:801-815 (1993)); factores de crecimiento glial (GGFs) Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF) (Ho et al. J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)); \gamma-heregulina (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)). El término incluye fragmentos biológicamente activos y/o variantes de secuencias de aminoácidos de un polipéptido HRG de secuencia nativa, tal como un fragmento del dominio de tipo EGF del mismo (por ejemplo, HRG\beta1_{177-244}).

Un "heterooligómero de ErbB" de la presente invención es un oligómero asociado no covalentemente que comprende por lo menos dos receptores ErbB diferentes. Dichos complejos se pueden formar cuando una célula que expresa dos o más receptores ErbB se expone a un ligando de ErbB y se puede aislar mediante inmunoprecipitación y se puede analizar mediante SDS-PAGE tal como se describe en Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994), por ejemplo. Ejemplos de dichos heterooligómeros de ErbB incluyen los complejos EGFR-ErbB2, ErbB2-ErbB3 y ErbB3-ErbB4. Además, el heterooligómero de ErbB puede comprender dos o más receptores ErbB combinados con un receptor ErbB diferente, tal como ErbB3, ErbB4 o EGFR. Otras proteínas, tales como una subunidad del receptor de citoquina (por ejemplo, gp130) se pueden incluir en el heterooligómero.

Por "activación por ligando de un receptor ErbB" se entiende la transducción se señal (por ejemplo, la causada por un dominio quinasa intracelular de un receptor ErbB que fosforila residuos tirosina en el receptor ErbB o un polipéptido sustrato) mediada por el ligando ErbB que se une a un heterooligómero ErbB que comprende el receptor ErbB de interés. Generalmente, esto implicará la unión de un ligando de ErbB a un heterooligómero de ErbB que activa un dominio quinasa de uno o más de los receptores ErbB en el heterooligómero y da lugar así a la fosforilación de residuos de tirosina en uno o más de los receptores ErbB y/o la fosforilación de residuos de tirosina en un polipéptido o polipéptidos adicionales. La activación de receptor ErbB se puede cuantificar utilizando varios ensayos de fosforilación de tirosina.

Un polipéptido de "secuencia nativa" es aquel que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido (por ejemplo, receptor ErbB o ligando de ErbB) derivado de la naturaleza. Dichos polipéptidos de secuencia nativa se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir mediante medios recombinantes o sintéticos. De este modo, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos de un polipéptido humano natural, polipéptido murino o polipéptido de cualquier otra especie de mamífero.

El término "variante en la secuencia de aminoácidos" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren en cierto grado de un polipéptido de secuencia nativa. Normalmente, las variantes en las secuencias de aminoácidos poseerán por lo menos aproximadamente un 70% de homología con por lo menos un dominio de unión a receptor de un ligando de ErbB nativo o con por lo menos un dominio de unión a ligando de un receptor ErbB nativo, y preferiblemente, tendrán por lo menos aproximadamente un 80%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de homología con dichos dominio de unión a receptor o ligando. Las variantes en las secuencias de aminoácidos poseen sustituciones, deleciones y/o inserciones en ciertas posiciones en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos nativa.

"Homología" se define como el porcentaje de residuos en la variante en la secuencia de aminoácidos que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir los espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de homología. Los métodos y programas informáticos para la alineación son conocidos en la técnica. Uno de dichos programas informáticos es "Align2", propiedad de Genentech, Inc., que se presentó con la documentación del usuario en la United States Copyright Office, Washington, DC20559, el 10 de diciembre de 1991.

El término "anticuerpo" se utiliza aquí en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) intactos formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada.

El término "anticuerpo monoclonal" tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un sitio antigénico único. Además, a diferencia de preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se pueden sintetizar mediante sin estar contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por obtenerse a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que se requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar según la presente invención, se pueden fabricar mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de las bibliotecas de anticuerpos en fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por ejemplo.

Entre los anticuerpos monoclonales de la presente invención se incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de cadena o cadenas es idéntico con u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno del dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del viejo Mundo, Simio, etc) y secuencias de la región constante humana.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprende una parte de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente la región de unión a antígeno o variable del mismo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv; diabodies; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de un fragmento o fragmentos de anticuerpos.

Un anticuerpo "intacto" es aquel que comprende una región variable de unión a antígeno, así como un dominio constante de cadena ligera (C_{L}) y dominios constantes de cadena pesada C_{H}1, C_{H}2 y C_{H}3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes en la secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de una variante en la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen la unión a C1q; la citotoxicidad dependiente de complemento; la unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; subregulación de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a "clases" diferentes. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de ellas pueden dividirse a su vez en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma, y \mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcRs) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) reconocen un anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan Fc\gammaRIII solo, mientras que los monocitos expresan Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de Estados Unidos 5.500.362 ó 5.821.337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede determinar in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan por lo menos Fc\gammaRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; prefiriéndose las células PBMCs y NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo, de sangre o PBMCs, tal como se describe aquí.

Los términos "receptor Fc" y "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. La FcR preferida es una FcR humana de secuencia nativa. Además, una FcR preferida es aquella que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc\gammaRI, Fc\gammaRII, y Fc\gammaRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas ("spliced") de estos receptores. Los receptores Fc\gammaRII incluyen Fc\gammaRIIA (un "receptor de activación") y Fc\gammaRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor de activación Fc\gammaRIIA contiene un motivo de activación del inmunoreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición Fc\gammaRIIB contiene un motivo de inhibición del inmunoreceptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (revisado en Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, están comprendidos por el término "FcR" aquí. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976); y Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).

"Citotoxicidad dependiente del complemento" y "CDC" se refieren a la capacidad de una molécula de lisar una diana en presencia del complemento. El mecanismo de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) complejado con un antígeno cognato. Para determinar la activación del complemento se puede realizar un ensayo CDC, por ejemplo tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

"Anticuerpos nativos" son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestos de dos cadenas ligeras (L) idénticas y cos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un puente disulfuro covalente, mientras que el número de uniones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuros entre cadenas espaciados de forma regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido de un conjunto de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante (V_{H}) en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que hay residuos de aminoácidos concretos que forman una interfase entre los dominio variables de cadena ligera y pesada.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos denominados regiones hipervariables en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de dominios variables se denominan regiones estructura ("framework") (FR). Los dominios variables de cadenas ligeras y pesadas nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan ampliamente una configuración de lámina beta, conectadas mediante tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas de manera próxima mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Seuqences of Proteins of Immunological Interest 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende generalmente residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Los residuos de la "región de estructura" o "FR" son aquellos residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se ha definido en la presente invención.

La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio único de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de unión a antígeno y aún es capaz de reticular con el antígeno.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento de antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero V_{H-}V_{L}. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de una Fv que comprende sólo tres regiones hipervariables específicas de antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de una serie de residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente invención para Fab' en el que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes transportan por lo menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')_{2} se produjeron originalmente como parejas de fragmentos de Fab' que tienen cisteínas bisagras entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se puede asignar a uno de dos tipos claramente diferentes, llamados kappa (\kappa) y lambda (\lambda), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, en los que estos dominios se presentan en una única cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994). Los fragmentos scFv de los anticuerpos anti-ErbB2 se describen en WO93/16185; Patente de Estados Unidos 5.571.894 y Patente de Estados Unidos No. 5.587.458.

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El término "diabodies" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena de polipéptido (V_{H} - V_{L}). Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión a antígeno. Los diabodies se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la estructura ("framework") (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo dador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente la acción del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

Los anticuerpos anti-ErbB2 humanizados incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) tal como se describe en la Tabla 3 de la Patente de Estados Unidos 5.821.337; anticuerpos 520C9 humanizado (WO93/21319) y 2C4 humanizado tal como se describe a continuación.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que interferirían con las utilizaciones de diagnóstico y terapéuticas del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos y no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry, y más preferiblemente más de un 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que por lo menos un componente del medio natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

Un anticuerpo "que se une" a un antígeno de interés, por ejemplo, antígeno ErbB2, es aquel que es capaz de unirse a este antígeno con suficiente afinidad, de manera que el anticuerpo es útil como agente terapéutico en el reconocimiento de una célula que expresa el antígeno. Cuando el anticuerpo es aquel que se une a ErbB2, se unirá preferentemente a ErbB2 frente a otros receptores ErbB, y puede ser uno que no reaccione de forma cruzada de manera significativa con otras proteínas tales como EGFR, ErbB3 o ErbB4. En dichas realizaciones, el grado de unión del anticuerpo a estas proteínas que no son ErbB2 (por ejemplo, Superficie celular que se une a receptor endógeno) será inferior al 10% tal como se determina mediante el análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA). Algunas veces, el anticuerpo anti-ErbB2 no reaccionará de forma cruzada de forma significativa con la proteína neu de rata, por ejemplo, tal como se describe en Schecter et al. Nature 312: 513 (1984) y Drebin et al., Nature 312: 545-548 (1984).

Un anticuerpo que "bloquea" la activación por ligando de un receptor ErbB es aquel que reduce o previene dicha activación definida anteriormente, donde el anticuerpo es capaz de bloquear la activación del ligando del receptor ErbB sustancialmente de manera más eficaz que el anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo, aproximadamente de manera tan eficaz como los anticuerpos monoclonales 7F3 o 2C4 o fragmentos Fab de los mismos y preferiblemente aproximadamente de manera tan eficaz como el anticuerpo monoclonal 2C4 o un fragmento Fab del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo que bloquea la activación del ligando de un receptor ErbB puede ser aquel que es aproximadamente un 50-100% más eficaz que 4D5 en el bloqueo de la formación de un heterooligómero de ErbB. El bloqueo de la activación del ligando de un receptor ErbB puede tener lugar mediante cualquier medio, por ejemplo, interfiriendo con: la unión del ligando a un receptor ErbB, formación del complejo de ErbB, actividad tirosina quinasa de un receptor ErbB en un complejo de ErbB y/o la fosforilación de un residuo o residuos de tirosina quinasa en o por un receptor ErbB. Ejemplos de anticuerpos que bloquean la activación por ligando de un receptor ErbB incluyen anticuerpos monoclonales 2C4 y 7F3 (que bloquean la activación por HRG de los heterooligómeros ErbB2/ErbB3 y ErbB2/ErbB4; y la activación por EGF, TGF-\alpha, anfiregulina, HBEGF y/o epiregulina de un heterooligómero EGFR/ErbB2); y los anticuerpos L26, L96 y L288 (Klapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997)), que bloquean la unión de EGF y NDF a células T47D que expresan EGFR, ErbB2, ErbB3 y ErbB4.

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Un anticuerpo que presenta una "característica biológica" de un anticuerpo dado, tal como el anticuerpo monoclonal designado como 2C4, es aquel que posee una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que se distingue de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno (por ejemplo, ErbB2). Por ejemplo, un anticuerpo con una característica biológica de 2C4 puede bloquear la activación por HRG de un heterooligómero de ERbB que comprende ErbB2 y ErbB3 o ErbB4; puede bloquear la activación mediada por EGF, TGF-\alpha y/o HRG de MAPK; y/o puede unirse al mismo epítopo en el dominio extracelular de ErbB2 que el unido por 2C4 (por ejemplo, que bloquea la unión del anticuerpo monoclonal 2C4 a ErbB2).

A menos que se indique lo contrario, la expresión "anticuerpo monoclonal 2C4" se refiere a un anticuerpo que presenta residuos de unión a antígeno de, o derivado de, el anticuerpo 2C4 murino de los ejemplos siguientes. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 2C4 puede ser un anticuerpo monoclonal 2C4 murino o una variante del mismo, tal como anticuerpo 2C4 humanizado, que posee residuos de aminoácidos de unión a antígeno de anticuerpo monoclonal 2C4 murino. Ejemplos de anticuerpos 2C4 humanizados se proporcionan en el ejemplo 3 siguiente. A menos que se indique lo contrario, la expresión "rhuMAb 2C4", cuando se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo que comprende las secuencias variable ligera (V_{L}) y variable pesada (V_{H}) de SEC ID Nos. 3 y 4, respectivamente, fusionadas a secuencias de región constante de IgG1 (no alotipo A) ligera y pesada humanas expresadas opcionalmente por una célula de ovario de hámster chino (CHO).

A menos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo monoclonal 4D5" se refiere a un anticuerpo que presenta residuos de unión a antígeno de, o derivado de, el anticuerpo 4D5 murino (ATCC CRL 10463). Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 4D5 puede ser un anticuerpo monoclonal 4D5 murino o una variante del mismo, tal como un anticuerpo 4D5 humanizado, que posee residuos de aminoácidos de unión a antígeno de anticuerpo monoclonal 4D5 murino. Ejemplos de anticuerpos 4D5 humanizados incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) como en la Patente de Estados Unidos No. 5.821.337, siendo huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) un anticuerpo 4D5 humano preferido.

Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se utiliza aquí, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula de cáncer que expresa ErbB in vitro o in vivo. De este modo, el agente inhibidor del crecimiento puede ser aquel que reduce significativamente el porcentaje de células que expresan ErbB en la fase S. Entre los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento se incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar diferente a la fase S), tales como agentes que inducen la detención de G1 y la fase M. Los bloqueadores clásico de la fase M incluyen vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de topo II, tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que detienen G1 también afectan a la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluoruracilo y ara-C. Se puede encontrar más información en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente la página 13.

Ejemplos de anticuerpos "inhibidores de crecimiento" son aquellos que se unen a ErbB2 e inhiben el crecimiento de células de cáncer que sobreexpresa ErB2. Los anticuerpos anti-ErbB2 inhibidores del crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de células de tumores de mama SK-BR-3 en un cultivo celular en más de un 205, y preferiblemente en más de un 50% (por ejemplo, desde aproximadamente un 50% hasta aproximadamente un 100%) en una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 \mug/ml, donde la inhibición de crecimiento se determina seis días después de la exposición de las células SK-BR-3 al anticuerpo (véase, la Patente de Estados Unidos No. 5.677.171 concedida el 14 de octubre de 1997). El ensayo de inhibición del crecimiento de células SK-BR-3 se describe con más detalle en esta patente y en la presente a continuación. El anticuerpo inhibidor del crecimiento preferido es el anticuerpo monoclonal 4D5, por ejemplo, 4D5 humanizado.

Un anticuerpo que "induce la muerte celular" es aquel que hace que una célula viable se vuelva no viable. La célula es generalmente aquella que expresa el receptor de ErbB2, especialmente cuando la célula sobreexpresa el receptor de ErbB2. Preferiblemente, la célula es una célula cancerosa, por ejemplo, una célula de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas o vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SKBR3, BT474, Calu3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. La muerte celular in vitro se puede determinar en ausencia de complemento y células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). De este modo, el ensayo para la muerte celular se puede realizar utilizando suero inactivado por calor (es decir, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular, se pueden evaluar la pérdida de integridad de la membrana evaluada mediante la captación de yoduro de propidio (PI), azul de tripano (véase Moore et al., Cytotechnology 17: 1-11 [1995]) o 7AAD en relación a células no tratadas. Los anticuerpos inductores de muerte celular preferidos son aquellos que inducen la captación de PI en el ensayo de captación de PI en células BT474 (véase a continuación).

Un anticuerpo que "induce la apoptosis" es aquel que induce la muerte celular programada determinada mediante la unión de annexina V, la fragmentación de ADN, el encogimiento celular, la dilatación del retículo endoplasmático, la fragmentación celular y/o la formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptóticos). La célula es aquella que sobreexpresa el receptor ErbB2. Preferiblemente, la célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas o vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3. Están disponibles varios métodos para evaluar los sucesos celulares asociados a la apoptosis. Por ejemplo, se puede medir la translocación de la fosfatidil serina (PS) mediante la unión a annexina; la fragmentación de ADN se puede evaluar a través del encadenamiento de ADN; y la condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación de ADN se puede evaluar mediante cualquier incremento en células hipodiploides. Preferiblemente, el anticuerpo que induce apoptosis es aquel que da lugar a aproximadamente 2 a 50 veces, preferiblemente aproximadamente 5 a 50 veces, y más preferiblemente aproximadamente 10 a 50 veces, la inducción de la unión a annexina en relación a células no tratadas en un "ensayo de unión a annexina utilizando células BT474" (ver a continuación). Algunas veces, el anticuerpo pro-apoptótico será aquel que bloquea adicionalmente la activación por ligando de ErbB de un receptor ErbB (por ejemplo, anticuerpo 7F3); es decir, el anticuerpo comparte una característica biológica con el anticuerpo monoclonal 2C4. En otras situaciones, el anticuerpo es aquel que no bloquea significativamente la activación por ligando de ErbB de un receptor ErbB (por ejemplo, 7C2). Además, el anticuerpo puede ser uno como 7C2 que, aunque induce la apoptosis, no induce una gran reducción en el porcentaje de células en la fase S (por ejemplo, uno que sólo induce aproximadamente un 0-105 de reducción en el porcentaje de estas células en relación al control).

El "epítopo 2C4" es la región del dominio extracelular de ErbB2 al que se une el anticuerpo 2C4. Con el fin de cribar los anticuerpos que se unen al epítopo 2C4, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina, tal como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, se puede realizar un mapeo de epítopos para valorar si el anticuerpo se une al epítopo 2C4 de ErbB2 (por ejemplo, uno o más residuos en la región de desde aproximadamente el residuo 22 hasta aproximadamente el residuo 584 de ErbB2, inclusive; véase las figuras 1A-B).

El "epítopo 4D5" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 a la que se une el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463). Este epítopo está próximo al dominio transmembrana de ErbB2. Para cribar anticuerpos que se unen al epítopo 4D5, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado ("cross-blocking assay") de rutina, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativamente, se puede realizar un mapeo epitópico para evaluar si el anticuerpo se une al epítopo 4D5 de ErbB2 (por ejemplo, alguno o más residuos en la región desde aproximadamente el residuo 529 hasta aproximadamente el residuo 625, ambos inclusive; véase las figuras 1A-B).

El "epítopo 3H4" es la región en el dominio extracelular de ErbB2 a la que se une el anticuerpo 3H4. Este epítopo incluye residuos desde aproximadamente 541 hasta aproximadamente 599, ambos inclusive, en la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de ErbB2; véase las figuras 1A-B.

El epítopo "7C2/7F3" es la región en el extremo N terminal del dominio extracelular de ErbB2 a la que se unen los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 (cada uno depositado con la ATCC, véase a continuación). Para cribar anticuerpos que se unen al epítopo 7C2/7F3, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado ("cross-blockin assay") de rutina, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativamente, se puede realizar un mapeo epitópico para establecer si el anticuerpo se une al epítopo 7C2/7F3 en ErbB2 (por ejemplo, uno o más residuos en la región desde aproximadamente el residuo 22 hasta aproximadamente el residuo 53 de ErbB2; las figuras 1A-B).

El "tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y a medidas profilácticas o preventivas. Entre los que necesiten el tratamiento se incluyen los que ya padecen el trastorno, así como aquellos en los que se previene el trastorno. Por tanto, el mamífero a tratar en la presente invención puede haber sido diagnosticado con que presenta el trastorno o puede estar predispuesto o susceptible a trastornos.

"Mamífero" para los objetivos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, animales de zoo, deportes o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.

Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo anti-ErbB2. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen aquellas afecciones patológicas que predisponen el mamífero al trastorno en cuestión. Entre los ejemplos no limitantes de trastornos a tratar en la presente invención se incluyen tumores benignos y malignos; leucemias y tumores de linfoides; trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocoélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferiblemente detener) la infiltración de células de cáncer en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferiblemente detener) la metástasis del tumor; inhibir, en cierto grado, el crecimiento del tumor; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Siempre que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o matar las células de cáncer existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia del cáncer, la eficacia se puede medir, por ejemplo, mediante la evaluación del tiempo para la progresión del tumor (TTP) y/o la determinación de la velocidad de respuesta (RR).

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Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza habitualmente por un crecimiento celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores linfoides. Entre los ejemplos más particulares de dichos cánceres se incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer tiroidal, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, así como cáncer de cabeza y cuello.

Un "cáncer que sobreexpresa ErbB" es aquel que comprende células que tiene proteína ErbB presente en su superficie celular. Un "cáncer que expresa ErbB2" es aquel que produce niveles suficientes de ErbB2 en la superficie de las células del mismo, de manera que un anticuerpo anti-ErbB2 se puede unir a la misma y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer.

Un cáncer "caracterizado por una activación excesiva" de un receptor ErbB es aquel en el que el grado de activación del receptor ErbB en células de cáncer supera significativamente el nivel de activación de ese receptor en células no cancerosas del mismo tipo de tejido. Dicha activación excesiva pueden ser el resultado de la sobreexpresión del receptor ErbB y/o superior a los niveles normales de un ligando de ErbB disponible para la activación del receptor ErbB en las células de cáncer. Dicha activación excesiva puede causar y/o ser provocado por el estado tumoroso de una célula de cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se someterá a un ensayo de diagnóstico o pronóstico para determinar si tiene lugar la amplificación y/o sobreexpresión de un receptor ErbB, lo cual da lugar a dicha activación excesiva del receptor ErbB. Alternativamente, o adicionalmente, el cáncer puede someterse a un ensayo de diagnóstico o pronóstico para determinar si tiene lugar la amplificación y/o sobreexpresión de un ligando de ErbB en el cáncer que se atribuye a una activación excesiva del receptor. En un subgrupo de dichos cánceres, la activación excesiva del receptor puede ser el resultado de un mecanismo estimulador autocrino.

En un "mecanismo estimulador endocrino", tiene lugar la autoestimulación en virtud de la célula de cáncer que produce tanto un ligando de ErbB como su receptor ErbB afín. Por ejemplo, el cáncer puede expresar o sobreexpresar EGFR y también puede expresar o sobreexpresar un ligando de EGFR (por ejemplo, EGF, TGF-\alpha, o HB-EGF). En otra realización, el cáncer puede expresar o sobreexpresar ErbB2 y también puede expresar o sobreexpresar una heregulina (por ejemplo, \gamma-HRG).

Un cáncer que "sobreexpresa" un receptor ErbB es aquel que presenta niveles significativamente más elevados de un receptor ErbB, tal como ErbB2, en la superficie celular del mismo, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Dicha sobreexpresión puede estar causada por la amplificación génica o por el aumento de la transcripción o la traducción. La sobreexpresión del receptor ErbB se puede determinar en un ensayo de diagnóstico o pronóstico mediante la evaluación de los niveles incrementados de la proteína ErbB presente en la superficie de una célula (por ejemplo, a través de un ensayo de inmunohistoquímica; IHC). Alternativamente, o adicionalmente, se pueden medir los niveles de ácido nucleico que codifica ErbB en la célula, por ejemplo, a través de hibridación fluorescente in situ (FISH; véase WO98/45479 publicada en Octubre de 1998), transferencia southern, o técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tales como PCR cuantitativa a tiempo real (RT-PCR). También se puede estudiar la sobreexpresión del receptor ErbB midiendo el antígeno desprendido (por ejemplo, dominio extracelular de ErbB) en un fluido biológico, tal como suero (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4.933.294 concedida el 12 de junio de 1990; WO91/05264 publicada el 18 de abril de 1991; Patente de Estados Unidos 5.401.638 concedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). A parte de los ensayos anteriores, están disponibles varios ensayos in vivo para el técnico en la materia. Por ejemplo, se pueden exponer células en el cuerpo de un paciente a un anticuerpo que está opcionalmente marcado con un marcador detectable, por ejemplo un isótopo radioactivo, y se puede evaluar en el paciente la unión del anticuerpo a las células, por ejemplo, mediante el rastreo externo de la radioactividad o mediante el análisis de una biopsia tomada del paciente previamente expuesta al anticuerpo.

De manera inversa, un cáncer que "no se caracteriza por la sobreexpresión del receptor ErbB2" es aquel, que, en un ensayo de diagnóstico, no expresa niveles superiores a los normales de receptor ErbB2 en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido.

Un cáncer que "sobreexpresa" un ligando ErbB es aquel que produce niveles significativamente más elevados de ese ligando en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Dicha sobreexpresión puede estar causada por la amplificación génica o por un aumento de la transcripción o traducción. La sobreexpresión del ligando ErbB se puede determinar de manera diagnóstica evaluando los niveles de ligando (o ácido nucleico que lo codifica) en el paciente, por ejemplo, en una biopsia del tumor o mediante varios ensayos de diagnóstico, tales como IHC, FISH, transferencia southern, PCR o ensayos in vivo descritos anteriormente.

Un cáncer "independiente de hormonas" es aquel cuya proliferación del mismo no es dependiente de la presencia de una hormona que se une a un receptor expresado por las células en el cáncer. Dichos cánceres no experimentan regresión clínica tras la administración de estrategias farmacológicas o quirúrgicas que reducen la concentración de hormonas en el tumor o próximo al mismo. Ejemplos de cánceres independientes de hormonas incluyen cáncer de próstata independiente de andrógeno, cáncer de mama, cáncer de endometrio y cáncer de ovario independientes de estrógeno. Dichos cánceres pueden empezar como tumores independientes de hormonas y progresar desde una etapa sensible a hormonas a un tumor resistente a hormonas después de la terapia anti-hormonal.

El término "agente citotóxico" tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32}) e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como las toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, micótico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen agentes alquilantes, tales como, tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN^{TM}); sulfonatos de alquilo, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carboquone, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloroetamina, clorhidrato de óxido de mecloroetamina, melfalán, novembiquin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubereidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenos de ácido fólico, tales como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico: amsacrina; bestrabucil: bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; Ionidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2''-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida: tiotepa; taxanos, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y docetaxel (Taxotere®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida: mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables. También se incluyen en esta definición agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores, tales como anti-estrógenos incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, aromatasa que inhibe 4(5)-imidazolas, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y anti-andrógenos, tales como flutamida, nilutamida bicalutamida, leuprólido y goserelina; y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmacéuticamente aceptables.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "fármaco dirigido a EGFR" se refiere a un agente terapéutico que se une a EGFR y, opcionalmente, inhibe la activación de EGFR. Entre los ejemplos de dichos agentes se incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se unen a EGFR. Ejemplos de anticuerpos que se unen a EGF incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (véase la Patente de Estados Unidos No. 4.943.533, Mendelsohn et al.) y variantes de los mismos, tales como anticuerpos 225 quimerizados (C225) y 225 humanos reconformados (H225) (véase, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticuerpos que se unen a EGFR mutante de tipo II (Patente de Estados Unidos No. 5.212.290); anticuerpos humanizados y quiméricos que se unen a EGFR tal como se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.891.996; y anticuerpos humanos que se unen a EGFR (véase WO98/50433, Abgenix). El anticuerpo anti-EGFR se puede conjugar con un agente citotóxico, generando de este modo un inmunoconjugado (véase, por ejemplo, EP659.439A2, Merck Patent GmbH). Ejemplos de molécula pequeñas que se unen a EGFR incluyen ZD1839 (Astra Zeneca), CP-358774 (OSI/Pfizer) y AG1478.

Un "agente anti-angiogénico" se refiere a un compuesto que bloquea, o interfiere con, hasta cierto grado, el desarrollo de vasos sanguíneos. El factor anti-angiogénico puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña o un anticuerpo que se unen a un factor de crecimiento o receptor de un factor de crecimiento implicados en la inducción de la angiogénesis. El factor anti-angiogénico preferido de la presente invención es un anticuerpo que se une al Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF).

El término "citoquina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Algunos ejemplos de dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas, y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen hormonas del crecimiento, tales como hormona del crecimiento humano, hormona del crecimiento humano N-metionilo, y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroidal; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteínas, tales como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH), y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor \alpha y \beta de necrosis tumoral; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-\beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGFs), tales como TGF-\alpha y TGF-\beta, factor de crecimiento I y II de tipo insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones, tales como interferón-\alpha, \beta, y \gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs), tales como macrófago-CSF (M-CSF); granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleuquinas (ILs), tales como IL-1, IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral, tal como TNF-\alpha o TNF-\beta, y otros factores de polipéptidos que incluyen LIF y ligando kit (LK). Tal y como se utiliza en la presente invención, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.

El término "profármaco", tal como se utiliza en esta solicitud, hace referencia a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco parental y es capaz de ser activado enzimáticamente o convertido en la forma parental más activa. Véase, por ejemplo, Willman, Prodrugs in Cancer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14:375-382, 615th Meeting, Belfast (1986), y Stella et al., Prodrugs: A Chemical approach to targeted drug delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.) pág. 147-267, Humana Press (1985). Los profármacos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiosfosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados por D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen \beta-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamidas opcionalmente sustituidas o profármacos que contienen fenilacetamidas opcionalmente sustituidas, profármacos de 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en un fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivarse en profármacos para su utilización en la presente invención incluyen, pero sin limitación, los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos que es útil para la liberación de un fármaco (tal como los anticuerpos anti-ErbB2 descritos en la presente invención y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de las membranas biológicas.

El término "prospecto" se utiliza para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de los productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, utilización, dosis, administración, contraindicaciones y/o avisos con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.

Un "cardioprotector" es un compuesto o composición que previene o reduce la disfunción cardiaca (es decir, cardiomiopatía y/o fallo cardiaco congestivo) asociada con la administración de un fármaco, tal como un antibiótico antraciclina y/o un anticuerpo anti-ErbB2, a un paciente. El cardioprotector puede, por ejemplo, bloquear o reducir un efecto cardiotóxico mediado por radicales libres y/o evitar o reducir el daño por estrés oxidativo. Entre los ejemplos de cardioprotectores comprendidos por la presente definición se incluyen el agente quelante de hierro dexrazoxano (ICRF-187) (Seifert et al. The Annals of Pharmacotherapy 28:1063-1072 ); un agente reductor de lípidos y/o antioxidante, tales como probucol (Singal et al. J. Mol. Cell Cardiol. 27:1055-1063 [1995]); amifostina (aminotiol 2-[(3-aminopropil)amino]etanotiol-dihidrógeno fosfato éster, también denominado WR-2721, y la forma desfosforilada de captación celular del mismo denominada WR-1065) y ácido S-3-(3-metilaminopropilamino)propilfosforotioico (WR-151327), véase Green et al. Cancer Research 54:738-741 (1994); digoxina (Bristow, M.R. In: Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease. New York: Elsevier 191-215 [1980]); bloqueadores beta, tales como metoprolol (Hjalmarson et al. Drugs 47: Suppl 4:31-9 [1994]; y Shaddy et al. Am. Heart J. 129: 197-9 [1995]); vitamina E; ácido ascórbico (vitamina C); capturadores de radicals libres, tales como ácido oleanólico, ácido ursólico y N-acetilcisteína (NAC); compuestos para "spin trapping", tales como alfa-fenil-tert-butil nitrona (PBN); (Paracchini et al., Anticancer Res. 13:1607-1612 [1993]); compuestos selenoorgánicos, tales como P251 (Elbesen); y similares.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada normalmente en el medio natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada está en una forma o composición diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico tal como existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye moléculas de ácido nucleico contenidas en células que normalmente expresan el anticuerpo cuando, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora está unido operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está situado para facilitar la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen están contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante la unión en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan según la práctica convencional.

Tal y como se utiliza en la presente invención, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan indistintamente y todas las denominaciones incluyen progenie. De este modo, las palabras "transformantes" y "células transformantes" incluyen las células primarias del sujeto y los cultivos derivados de las mismas sin considerar el número de transferencias. También debe entenderse que la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica tal y como se rastrea en la célula originalmente transformada. Cuando se pretenden designaciones diferentes, serán obvias a partir del contexto.

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II. Producción de anticuerpos anti-ErbB2

A continuación, se realiza una descripción de técnicas de ejemplos para la producción de los anticuerpos utilizados según la presente invención. El antígeno ErbB2 a utilizar para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de ErbB2 o una parte del mismo, que contiene el epítopo deseado. Alternativamente, para generar anticuerpos se pueden utilizan células que expresan ErbB2 en su superficie celular [por ejemplo, células NIH-3T3 transformadas para sobreexpresar ErbB2; o una línea celular de carcinoma, tal como células SKBR3, véase Stancovski et al. PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991)]. Otras formas de ErbB2 útiles para generar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la materia.

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(i) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales se desarrollan preferiblemente en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente a una proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, donde R y R^{1} son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación de, por ejemplo, 100 \mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund y la inyección intradérmica de la solución en múltiples sitios. Un mes más tarde, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a catorce días más tarde los animales sangran y el suero se ensaya para el título de anticuerpo. Los animales se refuerzan hasta que el título se estabiliza. Preferiblemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se pueden producir en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además, los agentes de agregación, tales como el alumbre, se utilizan de forma adecuada para potenciar la respuesta inmune.

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(ii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. De este modo, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir utilizando el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975) o se pueden producir mediante métodos de ADN recombinante (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567).

En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmunizan como se ha descrito anteriormente para conseguir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academia Press. 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y se desarrollan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirán habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes de HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficaz, contribuyen a una producción estable a un nivel elevado de anticuerpo por las células seleccionadas productoras de los anticuerpos, y son sensibles a un medio, tal como medio HAT. Entre éstas, las líneas de células de mieloma preferidas son líneas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Estados Unidos. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

Se ensaya el medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante la inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y se pueden desarrollar mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academia Press, 1986)). Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o medio RPM1-1640. Además, las células de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores ascíticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, fluido ascítico, o suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan en células huésped, tales como células E. coli, células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de ningún otro modo producen proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Entre los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo se incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol Revs., 130:151-188 (1992).

En una realización adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos generados utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Las posteriores publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de afinidad elevada (rango de nM) mediante intercambio de cadenas (Marks et al., Biol. Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas convencionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también se puede modificar, por ejemplo, mediante la sustitución de la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de secuencias murinas homólogas (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567; Morrison et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o mediante unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no es inmunoglobulina.

Habitualmente, dichos polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo divalente quimérico que comprende un sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

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(iii) Anticuerpos humanizados

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se han descrito en la técnica. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente como residuos importados'', que habitualmente se obtienen de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para utilizar en la fabricación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el método denominado "mejor-ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidos. A continuación, la secuencia humana que está más próxima a la del roedor se acepta como la región de estructura humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma región de estructura se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151: 2623 (1993)).

Es también importante que los anticuerpos se humanicen manteniendo una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos conceptuales humanizados utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles normalmente y son familiares para los expertos en la materia. Existen programas informáticos que muestran y visualizan probables estructuras conformaciones tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La observación de estas visualizaciones permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar a partir del receptor y secuencias importadas, de manera que se consigue la característica del anticuerpo deseado, tal como una mayor afinidad para el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al antígeno.

El ejemplo 3 siguiente describe la producción de anticuerpos anti-ErbB2 humanizados de ejemplo que se unen a ErbB2 y se bloquean la activación por el ligando de un receptor ERbB. El anticuerpo humanizado de particular interés aquí bloquea la activación mediada por EGF, TGF-\alpha y/o HRG de MAPK esencialmente de manera tan eficaz como el anticuerpo monoclonal 2C4 murino (o un fragmento Fab del mismo) y/o se une a ErbB2 esencialmente de manera tan eficaz como el anticuerpo monoclonal 2C4 murino (o un fragmento Fab del mismo). El anticuerpo humanizado de la presente invención puede comprender, por ejemplo, residuos de la región hipervariable no humanos incorporados en un dominio pesado variable humano y puede comprender además una sustitución en la región de estructura (FR) en una posición seleccionada del grupo que consiste en 69H, 71H y 73H utilizando el sistema de numeración del dominio variable establecido en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National institutes of Health, Bethesda. MD (1991). Un anticuerpo humanizado puede comprender sustituciones en FR en dos o todas las posiciones 69H, 71H y 73H.

Un anticuerpo humanizado de ejemplo de interés de la presente invención comprende residuos determinantes de complementariedad del dominio pesado variable GFTFTDYTMX, donde X es preferiblemente D o S (SEC ID NO: 7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEC ID NO: 8); y/o NLGPSFYFDY (SEC ID NO: 9), que comprende opcionalmente modificaciones de aminoácidos de estos residuos de CDR, por ejemplo, donde las modificaciones mantienen o mejorar esencialmente la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante del anticuerpo de interés puede tener de aproximadamente uno a aproximadamente siete o aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en las secuencias de CDR pesadas variables anteriores. Dichas variantes de anticuerpo se pueden preparar mediante maduración por afinidad, por ejemplo, tal como se describe a continuación. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia de aminoácidos del dominio pesado variable en la SEC ID No. 4.

El anticuerpo humanizado puede comprender residuos determinantes de complementariedad del dominio ligero variable KASQDVSIGVA (SEC ID NO: 10); SASYX1X2X3, donde X1 es preferiblemente R o L, X2 es preferiblemente Y o E, y X3 es preferiblemente T o S (SEC ID NO: 11); y/o QQYYIYPYT (SEC ID NO: 12), por ejemplo, adicionalmente a los residuos de CDR de dominio pesado variable en el párrafo anterior. Dichos anticuerpos humanizados comprenden opcionalmente modificaciones de aminoácidos de los residuos de CDR anteriores, por ejemplo, donde las modificaciones mantienen o mejoran esencialmente la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo de interés puede tener de aproximadamente uno a aproximadamente siete o aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en las secuencias de CDR ligeras variables anteriores. Dichas variantes de anticuerpo se pueden preparar mediante maduración por afinidad, por ejemplo, tal como se describe a continuación. El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia de aminoácidos del dominio ligero variable en la SEC ID No. 3.

También se describen anticuerpos madurados por afinidad que se unen a ErbB2 y bloquean la activación por ligando de un receptor ErbB. El anticuerpo parental puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, por ejemplo, uno que comprende las secuencias ligeras y/o pesadas variables de las SEC ID Nos. 3 y 4, respectivamente (es decir la variante 574). El anticuerpo madurado por afinidad se une preferiblemente al receptor ErbB2 con una afinidad superior a la de 2C4 murino o la variante 574 (por ejemplo, desde aproximadamente dos o aproximadamente cuatro veces hasta aproximadamente 100 veces o aproximadamente 100 veces de mejora en la afinidad, por ejemplo tal como se valora utilizando un dominio extracelular (ECD) de ERBB2 ELISA). Ejemplos de residuos de CDR pesados variables para la sustitución incluyen H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99, o combinaciones de dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o siete de estos residuos). Ejemplos de residuos de CDR ligeros variables para la alteración incluyen L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 o combinaciones de dos o más (por ejemplo, dos a tres, cuatro, cinco o hasta aproximadamente diez de estos residuos).

Se contemplan varias formas del anticuerpo humanizado o el anticuerpo madurado por afinidad. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o anticuerpo madurado por afinidad puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como una Fab, que está opcionalmente conjugado con uno o más agentes citotóxicos con el fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado o anticuerpo madurado por afinidad puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.

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(iv) Anticuerpos humanos

Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen la región de unión (J_{H}) de la cadena pesada del anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y en la línea germinal da lugar a la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del grupo de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en estos ratones mutantes en la línea germinal dará lugar a la producción de anticuerpos humanos tras la estimulación con antígenos. Ver, por ejemplo Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); y las Patentes de Estados Unidos 5.591.669, 5.589.369 y 5.545.807.

Alternativamente, la tecnología de expresión de fagos (McCafferty et al., Nature 348, 552-553 [1990]) se puede utilizar para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. Según esta técnica, los genes del dominio V de anticuerpo se clonan en el marco en un gen de proteína de recubrimiento principal o secundario de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresan como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena única del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. Así, el fago mimetiza alguna de las propiedades de la célula B. La expresión del fago se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión ver, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos de genes V para la expresión de fagos. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) aislaron un conjunto diverso de anticuerpos de anti-oxazolona a partir de una pequeña librería combinatoria aleatoria de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos en un conjunto diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), o Griffith et al.,
EMBO J. 12, 725-734 (1993). Véase también las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.565.332 y 5.573.905.

Tal como se ha descrito anteriormente, también se pueden generar anticuerpos humanos mediante células B activadas in vivo (véase las Patentes de Estados Unidos 5.567.610 y 5.229.275).

Los anticuerpos anti-ErbB2 humanos se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.772.997 concedida el 30 de junio de 1998 y WO97/00271 publicada el 3 de enero de 1997.

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(v) Fragmentos de anticuerpos

Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Habitualmente, estos fragmentos se derivaban mediante la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir actualmente directamente mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las bibliotecas de anticuerpos en fagos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar directamente de E coli y pueden acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Según otra estrategia, los fragmentos F(Ab')_{2} se pueden aislar directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el técnico de la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es una fragmento Fv de cadena única (scFv). Véase WO 93/16185; Patente de Estados Unidos No. 5.571.894; y Patente de Estados Unidos No. 5.587.458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

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(vi) Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión con por lo menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo se pueden unir a dos epítopos diferentes de la proteína ErbB2. Otros de dichos anticuerpos pueden combinar un sitio de unión a ErbB2 con un sitio o sitios de unión por EGFR, ErbB3 y/o ErbB4. Alternativamente, un brazo anti-ErbB2 puede combinarse con un brazo que se une a una molécula inductora en un leucocito, tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2 o CD3) o receptores Fc para IgG (FC\gammaR), tales como FC\gammaRI (CD64), FC\gammaRII (CD32) y FC\gammaRIII (CD16) con el fin de centrar los mecanismos de defensa celulares en la célula que expresa ErbB2. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos en células que expresan ErbB2. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a ErbB2 y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-\alpha, alcaloide vinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno con isótopo radioactivo). Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}).

WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-Fc\gammaRIII y la Patente de Estados Unidos
5.837.234 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-Fc\gammaRI. En WO98/02463 se muestra un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/Fc\alpha. La Patente de Estados Unidos No. 5.821.337 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3.

Los procedimientos para realizar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción habitual de anticuerpos específicos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante incómoda y los rendimientos de producto son bajos. En WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) se describen procesos similares.

Según una estrategia diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se produce preferiblemente con una dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes de dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da lugar a rendimientos elevados o cuando las proporciones no tienen particular importancia.

En una realización preferida de esta estrategia, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se observó que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado a partir de combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera sencilla de separación. Esta estrategia se describe en WO 94/04690. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

Según otra estrategia descrita en la Patente de Estados Unidos No. 5.731.168, la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de cultivos de células recombinantes. La interfase preferida comprende por lo menos una parte del dominio C_{H}3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales de aminoácidos grandes por más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Entre los anticuerpos biespecíficos se incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, y el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de Estados Unidos No. 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden fabricar utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen en la Patente de Estados Unidos No. 4.676.980 junto con un grupo de técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos utilizando enlaces químicos. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se descomponen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de enlaces disulfuro intermoleculares. A continuación, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

El reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli., que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med, 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')_{2} completamente humanizado. Cada fragmento de Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mama humanos.

Se han descrito también varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de dímeros de Fv de cadena única (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Se consideran los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

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(vii) Otras modificaciones en la secuencia de aminoácidos

Se contempla la modificación o modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-ERbB2 descritos en la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-ErbB2 se preparan mediante la introducción de cambios apropiados de nucleótidos en el ácido nucleico del anticuerpo anti-ErbB2 o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos en las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-ErbB2. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se realiza hasta llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos post-traduccionales del anticuerpo anti-ErbB2, tales como el cambio del número o posición de sitios de glicosilación.

Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo anti-ErbB2 que son posiciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis por rastreo de alanina", tal como se describe por Cunningham y Wells Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí, se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para influir en la interacción de los aminoácidos con el antígeno ErbB2. Aquellas posiciones de aminoácidos que demuestran una sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación mediante la introducción de variantes adicionales u otras en los sitios de sustitución o para los mismos. De este modo, mientras que el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminada, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar la acción de una mutación en un sitio determinado, se realiza la mutagénesis de rastreo de alanina o aleatorio en el codón o región diana y se criban las variantes de anticuerpo anti-ErbB2 expresadas por la actividad deseada.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxi terminales que varían de longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencias de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Entre los ejemplos de inserciones terminales se incluyen un anticuerpo anti-ErbB2 con un residuo metionilo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo anti-ErbB2 incluyen la fusión al N o C terminal del anticuerpo anti-ErbB2
a una enzima (por ejemplo, ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media del anticuerpo en el suero.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen por lo menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-ErbB2 sustituida por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en la FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones dan lugar a un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "ejemplos de sustituciones", en la Tabla 1 o tal como se describe posteriormente en referencia a clases de aminoácidos, y cribar los productos.

TABLA 1

1

Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se realizan mediante la selección de substituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hélice o lámina, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral:

(1)

hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrofílico neutro: cys, ser, thr;

(3)

ácido: asp, glu;

(4)

básico: asn, gln, his, lys, arg;

(5)

residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6)

aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

También se puede sustituir, generalmente por serina, cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación correcta del anticuerpo anti-ErbB2 para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. En cambio, se pueden añadir el enlace o enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante por sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo posterior tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo parental del cual se generan. Una manera conveniente para generar dichas variantes por sustitución implica la maduración por afinidad utilizando la expresión en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se expresan de manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetados en cada partícula. A continuación, las variantes expresadas en el fago se criban por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se describe en la presente invención. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede aplicar la mutagénesis por rastreo de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura del cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el ErbB2 humano. Dichos residuos de contacto y residuos próximos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en la presente invención. Una vez se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado tal como se describe en la presente invención y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para un desarrollo posterior.

Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Por alteración se entiende la eliminación de uno o más grupos carbohidratos hallados en el anticuerpo, y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

La glicosilación de anticuerpos es habitualmente por unión a N u O. La unión a N se refiere a la unión del grupo carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un potencial sitio de glicosilación. La glicosilación por unión a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más habitualmente serina o treonina, aunque también se pueden utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza de manera conveniente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos, de manera que contenga una o más de las secuencias tripéptido descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unidos a N). La alteración también se puede realizar mediante la adición o sustitución por uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos a O).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-ErbB2 se preparan mediante una serie de procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes en las secuencias de aminoácidos naturales) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida de sitio), la mutagénesis de PCR y la mutagénesis de cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-ErbB2.

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, para aumentar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede conseguir mediante la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el residuo o residuos de cisteína se pueden introducir en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor citólisis mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Véase Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-195 (1992) y Schopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con mayor actividad antitumoral también se pueden preparar utilizando reticuladores heterobifuncionales tal como se describe en Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tenga regiones Fc duales y puede tener por tanto una mayor capacidad de lisis de complemento y ADCC. Véase Stevenson et al. anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).

Para incrementar la vida media del anticuerpo en el suero, se puede incorporar un epítopo de unión a receptor salvaje en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) tal como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.739.277, por ejemplo. Tal como se utiliza aquí, el término "epítopo de unión a receptor salvaje" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}) que es responsable del incremento en la vida media de la molécula IgG en el suero in vivo.

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(viii) Cribado ("screening") de anticuerpos con las propiedades deseadas

Las técnicas para generar anticuerpos se han descrito anteriormente. Se seleccionan anticuerpos que tienen ciertas características biológicas según se desee.

Para identificar un anticuerpo que bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB, se puede determinar la capacidad del anticuerpo para bloquear la unión del ligando de ErbB a células que expresan el receptor ErbB (por ejemplo, en conjugación con otro receptor ErbB con el que el receptor ErbB de interés forma un heterooligómero de ErbB). Por ejemplo, las células que expresan de forma natural o se transfectan para expresar receptores ErbB del heterooligómero de ErbB se pueden incubar con el anticuerpo y, a continuación, exponerse a ligando de ErbB marcado. A continuación, se puede evaluar la capacidad del anticuerpo anti-ErbB2 para bloquear la unión del ligando al receptor de ErbB en el heterooligómero de ErbB.

Por ejemplo, la inhibición de la unión de HRG a las líneas de células tumorales de mama MCF7 por anticuerpos anti-ErbB2 se puede realizar utilizando cultivos de MCF7 monocapas en hielo en un formato de placas de 24 pocillos esencialmente tal como se describe en el siguiente ejemplo 1. Se pueden añadir anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 a cada pocillo e incubarse durante 30 minutos. A continuación, se pueden añadir rHRG\beta1_{177-224} marcado con ^{125}I (25 pm) y la incubación se puede continuar durante 4 a 16 horas. Se pueden preparar curvas de dosis-respuesta y se puede calcular un valor IC_{50} para el anticuerpo de interés. En una realización, el anticuerpo que bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB tendrá una IC_{50} para inhibir la unión de HRG a células MCT7 en este ensayo de aproximadamente 50 nM o menos, más preferiblemente 10 nM o menos. Cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab, la IC_{50} para inhibir la unión de HRG a células MCF7 en este ensayo puede ser, por ejemplo, aproximadamente 100 nM o menos, más preferiblemente 50 nM o menos.

Alternativamente, o adicionalmente, se puede evaluar la capacidad del anticuerpo anti-ErbB2 para bloquear la fosforilación de tirosina de un receptor ErbB presente en un heterololigómero de ErbB estimulada por un ligando de ErbB. Por ejemplo, las células que expresan de forma endógena los receptores ErbB o se transfectan para expresarlos se pueden incubar con el anticuerpo y, a continuación, analizar la actividad de fosforilación de tirosina dependiente del ligando de ErbB utilizando un anticuerpo monoclonal antifosfotirosina (que está opcionalmente conjugado con un marcador detectable). El ensayo de activación del receptor quinasa descrito en la patente de Estados unidos No. 5.766.963 también está disponible para determinar la activación del receptor ErbB y el bloqueo de esa actividad por un anticuerpo.

Se puede cribar un anticuerpo que inhibe la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosina p180 en células MCF7 esencialmente tal como se describe en el ejemplo 1 siguiente. Por ejemplo, las células MCF7 se pueden emplear en placas de 24 pocillos y se pueden añadir anticuerpos monoclonales a cada pocillo e incubarse durante 30 minutos a temperatura ambiente; a continuación se puede añadir rHRG\beta1_{117-244} a cada pocillo hasta una concentración final de 0,2 nM y la incubación se puede continuar durante 8 minutos. Se puede aspirar el medio de cada pocillo y las reacciones se pueden detener mediante la adición de 100 \mul de tampón muestra de SDS (5% SDS, 25 mM DTT, y 25 mM de tris-HCl, pH 6,8). Cada muestra (25 \mul) se puede pasar por electroforesis en un gel de gradiente 4-12% (Novex) y, a continuación, se puede transferir por electroforesis a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Se pueden revelar inmunotransferencias de antifosfotirosina (a 1 \mu/ml) y se puede cuantificar la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr - 180.000 mediante densitometría de reflectancia. El anticuerpo seleccionado preferiblemente inhibirá significativamente la estimulación por HRG de la fosforilación de la tirosina p180 hasta aproximadamente 0-35% del control en este ensayo. Se puede preparar una curva dosis-respuesta para la inhibición por HRG de la fosforilación de tirosina p180 determinada mediante densitometría de reflectancia y se puede calcular una IC_{50} para el anticuerpo de interés. En una realización, el anticuerpo que bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB tendrá una IC_{50} para inhibir la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosina p180 en este ensayo de aproximadamente 50 nM o menos, más preferiblemente 10 nM o menos. Cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab, la IC_{50} para inhibir la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosina p180 en este ensayo puede ser, por ejemplo, aproximadamente 100 nM o menos, más preferiblemente 50 nM o menos.

Se puede evaluar también los efectos inhibidores del crecimiento del anticuerpo en células MDA-MB-175, por ejemplo, esencialmente tal como se describe en Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997). Según este ensayo, las células MDA-MB-175 se pueden tratar con un anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 (10 \mug/mL) durante 4 días y se puede teñir con violeta cristal. La incubación con un anticuerpo anti-ErbB2 puede mostrar un efecto inhibidor del crecimiento en esta línea celular similar a la mostrada por el anticuerpo monoclonal 2C4. En una realización adicional, la HRG exógena no invertirá significativamente esta inhibición. Preferiblemente, el anticuerpo será capaz de inhibir la proliferación celular de células MDA-MB-175 en mayor grado que el anticuerpo monoclonal 4D5 (y opcionalmente en mayor grado que el anticuerpo monoclonal 7F3), ambos en presencia y ausencia de HRG exógena.

El anticuerpo anti-ErbB de interés puede bloquear la asociación dependiente de heregulina de ErbB2 con ErbB3 en ambas células MCF7 y SK-BR-3 tal como se determina en un experimento de co-inmunoprecipitación, tal como el descrito en el ejemplo 2 sustancialmente de manera más eficaz que el anticuerpo monoclonal 4D5, y preferiblemente sustancialmente de manera más eficaz que el anticuerpo monoclonal 7F3.

Para identificar los anticuerpos anti-ErbB2 inhibidores del crecimiento, se pueden cribar anticuerpos que inhiben el crecimiento de células cancerosas que sobreexpresan ErbB2. En una realización, el anticuerpo inhibidor del crecimiento de elección es capaz de inhibir el crecimiento de células SK-BR-3 en un cultivo celular en aproximadamente 20-100% y preferiblemente en aproximadamente el 50-100% a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,5 a 30 \mug/ml. Para identificar dichos anticuerpos, se puede realizar un ensayo con SK-BR-3 descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5.677.171. Según este ensayo, las células SK-BR-3 se desarrollan en una mezcla 1:1 de medio F12 y DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina y penicilin estreptomicina. Las células SK-BR-3 se emplacan en 20.000 células en un plato de cultivo celular de 35 mm (2 ml/placa de 35 mm), se añade por plato de 0,5 a 30 \mug/ml del anticuerpo anti-ErbB2. Después de seis días, se cuenta el número de células en comparación con las células no tratadas utilizando un contador celular electrónico COULTER^{TM}. Se pueden seleccionar aquellos anticuerpos que inhiben el crecimiento de las células SK-BR-3 en aproximadamente 20-100% o aproximadamente 50-100% como anticuerpos inhibidores del crecimiento.

Para seleccionar anticuerpos que inducen la muerte celular, la pérdida de integridad de la membrana tal como se indica mediante, por ejemplo, la captación de PI, azul de tripano o 7AAD se puede evaluar en relación al control. El ensayo preferido es el ensayo de captación de PI utilizando células BT474. Según este ensayo, las células BT474 (que se pueden obtener de la American Type Culture Collection (Rockville, MD)) se cultivan en un Medio Eagle Modificado por Dulbecco (D-MEM); F-12 de Ham (50:50) complementado con FBS (Hyclone) inactivado por calor al 10% y 2 mM de L-glutamina. (Por tanto, el ensayo se realiza en ausencia de complemento y células efectoras inmunes). Las células BT474 se siembran a una densidad de 3x10^{6} células por placa en placas de 100 x 20 mm y se dejan unirse durante toda la noche. A continuación, se extrae el medio y se sustituye por medio nuevo solo o medio que contiene 10 \mug/ml del anticuerpo monoclonal apropiado. Las células se incuban durante un periodo de tres días. Después de cada tratamiento, se lavan las monocapas con PBS y se separan por tripsinización. A continuación, las células se centrifugan a 1200 rpm durante 5 minutos a 4ºC, se resuspende el residuo celular en 3 ml de tampón de unión de Ca^{2+} enfriado con hielo (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl_{2}) y se pone en alícuotas en tubos de 12 x 75 taponados con un colador (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la extracción de las aglomeraciones de células. A continuación, se añade PI (10 \mug/ml) a los tubos. Las muestras se pueden analizar utilizando un citómetro de flujo FACSCAN^{TM} y software FACSCONVERT^{TM} CellQuest (Becton Dickinson). Se seleccionan los anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de la muerte celular determinada mediante la captación de PI.

Con el fin de seleccionar anticuerpos que inducen la apoptosis, está disponible un ensayo de unión a annexina utilizando células BT474. Las células BT474 se cultivan y siembran en placas tal como se describe en el párrafo anterior. A continuación, se extrae el medio y se sustituye con un medio nuevo solo o un medio que contiene 10 \mug/ml del anticuerpo monoclonal. Después de un periodo de incubación de tres días, las monocapas se lavan con PBS y se separan mediante tripsinización. A continuación, las células se centrifugan, se resuspenden en tampón de unión a Ca^{2+} y se ponen en alícuotas en tubos tal como se ha descrito anteriormente para el ensayo de la muerte celular. A continuación, se introduce en los tubos annexina marcada (por ejemplo, annexina V-FTIC) (1 \mug/ml). Las muestras se pueden analizar utilizando un citómetro de flujo FACSCAN^{TM} y software FACSCONVERT^{TM} CellQuest (Becton Dickinson). Se seleccionan los anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de unión a annexina en relación con el control como anticuerpos inductores de la apoptosis.

Además del ensayo de unión a annexina, está disponible el ensayo de tinción de ADN utilizando células BT474. Con el fin de realizar este ensayo, las células BT474 que se han tratado con el anticuerpo de interés tal como se ha descrito en los dos párrafos anteriores se incuban con 9 \mug/ml de HOECHST 33342^{TM} durante 2 horas a 37ºC, a continuación se analiza en un citómetro de flujo EPICS ELITE^{TM} (Coulter Corporation) utilizando software MODFITLT ^{TM}
(Verity Software House). Se pueden seleccionar los anticuerpos que inducen un cambio en el porcentaje de células apoptóticas que es dos veces o superior (y preferiblemente 3 veces o superior) que las células no tratadas (hasta un 100% de células apoptóticas) como anticuerpos proapoptóticos utilizando este ensayo.

Para cribar anticuerpos que se unen a un epítopo en ErbB2 unido por un anticuerpo de interés, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado ("cross-blocking assay") de rutina, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativamente, se puede realizar un mapeo epitópico mediante métodos conocidos en el sector.

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(ix) Inmunoconjugados

La presente invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina de molécula pequeña o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

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Los agentes quimioterapéuticos útiles para la generación de dichos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. También se contemplan en la presente invención conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una caliqueamicina, una maitansina (Patente de Estados Unidos No. 5.208.020), un tricoteno y CC 1065.

En una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo se conjuga a una o más moléculas de maitansina (por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo). La maitansina se puede convertir, por ejemplo, en May-SS-Me que se puede reducir a May-SH3 y reaccionar con el anticuerpo modificado (Cari et al., Cancer Research 52: 127-131 [1992]) para generar un inmunoconjugado de anticuerpo maitansinoide.

Otro imunoconjugado de interés comprende un anticuerpo anti-ErbB2 conjugado a una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir roturas del ADN de doble cadena en concentraciones subpicomolares. Entre los análogos estructurales de caliqueamicina que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitación, \gamma_{1}^{I}, \alpha_{2}^{I}, \alpha_{3}^{I}, N-acetil-\gamma_{1}^{I}, PSAG y \theta^{I}_{1} (Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 [1993] y LODE et al. Cancer Research 58: 2925-2928 [1998]). Véase también las patentes de Estados Unidos Nos. 5.714.586, 5.712.374; 5.264.586 y 5.773.001.

Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAPS), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993.

La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa, tal como una desorribonucleasa; ADNasa).

Existe un conjunto de isótopos radioactivos disponibles para la producción de anticuerpos anti-ErbB2 radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32} e isótopos radioactivos de Lu.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se pueden fabricar utilizando un conjunto de agentes bifuncionales acopladores de proteínas, tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Véase WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador separable" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador lábil en ácido, un enlazador sensible a peptidasa, un enlazador dimetilo o un enlazador que contiene disulfuro (Cari et al. Cancer Research 52: 127-131 [1992]).

Alternativamente, se puede fabricar una proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti-ErbB2 y agente citotóxico, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos.

En otra realización, el anticuerpo se puede conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en el prereconocimiento de tumores en los que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación de conjugado no enlazado de la circulación utilizando un agente purificador y, a continuación, la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).

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(x) Terapia de profármaco mediada por enzimas dependiente de anticuerpo (ADEPT)

Los anticuerpos de la presente invención también se pueden utilizar en ADEPT mediante la conjugación del anticuerpo a una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilo, véase WO 81/01145) en un fármaco anticancerígeno activo. Véase, por ejemplo, WO 88/07378 y la Patente de Estados Unidos No. 4.975.278.

El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco de manera que lo convierte en su forma citotóxica más activa.

Entre las enzimas que son útiles en el procedimiento de la presente invención se incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticanceroso, 5-fluoroacilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; enzimas que que dividen los carbohidratos, tales como \beta-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; \beta-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con \beta-lactamas en fármacos libres; y penicilin amidasas, tales como penicilin V amidasa o penicilin G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas" se pueden utilizar para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima se pueden preparar tal y como se ha descrito en la presente invención para la liberación de la abzima a una población de células tumorales.

Las enzimas de la presente invención se pueden unir covalentemente a los anticuerpos anti-ErbB2 mediante técnicas bien conocidas en el sector, tal como la utilización de los reactivos de reticulación heterobifuncionales descritos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención unida a por lo menos una parte funcionalmente activa de una enzima se pueden construir utilizando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).

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(xi) Otras modificaciones de anticuerpos

Se contemplan en la presente invención otras modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir a uno de un conjunto de polímeros proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo también se puede introducir en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización entre fases (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente), en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{a} Edición, Osol, A. Ed. (1980).

Los anticuerpos anti-ErbB2 descritos en la presente invención también se pueden formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); Pat. De Estados Unidos Nos. 4.485.045 y 4.544.545; y WO97/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. Liposomas con mayor tiempo de circulación se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.013.556.

Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con los liposomas tal como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. En el liposoma está contenido opcionalmente un agente quimioterapéutico. Véase Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989).

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III. Vectores, células huésped y métodos recombinantes

La presente invención también proporciona ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo anti-ErbB2 humanizado, vectores y células huésped que comprenden el ácido nucleico; y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aísla y se inserta en un vector replicable para la clonación posterior (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. Entre los componentes del vector se incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

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(i) Componente secuencia señal

El anticuerpo anti-ErbB2 de la presente invención se puede producir recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específica en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduros. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es la que es reconocida y procesada (es decir, dividida por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para células huésped procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal de anticuerpo anti-ErbB2 nativo, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o secuencias líderes de enterotoxina II estables térmicamente. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal nativa se puede sustituir por, por ejemplo, la secuencia líder de la invertasa de levadura, la secuencia líder de factor \alpha (incluyendo secuencias líderes de factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces) o secuencia líder de fosfatasa ácida, la secuencia líder de glucoamilasa de C albicans o la señal descrita en WO 90/13646. En la expresión de células de mamíferos, se disponen las secuencias señal de mamíferos, así como las secuencias líderes secretoras víricas, por ejemplo, la señal gG de herpes simplex.

El ADN para dicha región de precursor está ligada en el marco de lectura a ADN que codifica el anticuerpo anti-ErbB2.

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(ii) Componente origen de replicación

Los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia es la que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Dichas secuencias son bien conocidas para un conjunto de bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu es adecuado para las levaduras, y varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, el componente del origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (el origen de SV40 se puede utilizar habitualmente sólo porque contiene el promotor temprano).

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(iii) Componente de gen de selección

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman de forma satisfactoria con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y sobreviven de esta manera al régimen de selección. Algunos ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del anticuerpo anti-ErbB2, tal como DHFR, timidina quinasa, metalotioneina-I y -II, preferiblemente genes de metalotioneina de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identificaron por primera vez mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza la DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR.

Alternativamente, se pueden seleccionar células huésped (particularmente huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-ErbB2, proteína DHFR de tipo salvaje y otro marcador seleccionable, tal como aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH), mediante el crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Véase la Patente de Estados Unidos No. 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para su utilización en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras YRp7 (Stinchcomb et al. Nature, 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión en trp1 en el genoma de células huésped de levadura proporciona a continuación un medio eficaz para la detección de la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes de Leu-2 (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan mediante plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2.

Además, se pueden utilizar los vectores derivados del plásmido circular de 1,6 \mum pKD1 para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, se describió un sistema de expresión para una producción a gran escala de quimosina recombinante de ternera para K. lactis. Van der Berg, Biol. Technology, 8:135 (1990). También se han descrito vectores de expresión multicopia estables para la secreción de albúminas de suero humanos recombinantes maduras mediante cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Biol. Technology, 9:968-975 (1991).

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(iv) Componente promotor

Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está unido operativamente al ácido nucleico del anticuerpo anti-ErbB2. Entre los promotores adecuados para la utilización con huéspedes procariotas se incluyen el promotor phoA, sistemas de promotores \beta-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotores de triptófano (trp), y promotores híbridos, tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para la utilización en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el anticuerpo anti-ErbB2.

Se conocen secuencias de promotores para eucariotas. Prácticamente, todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases en dirección 5' desde el sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases en dirección 5' desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas es una secuencia AATAAA que pueden ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de manera adecuada en vectores de expresión eucariotas.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para la utilización en huéspedes de levadura se incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otros enzimas glicolíticos, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones de promotor para la alcohol deshidrogenada 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en EP 73.657. Los potenciadores de la levadura también se utilizan de forma ventajosa con promotores de levadura.

La transcripción de anticuerpos anti-ErbB2 de vectores en células huésped de mamíferos se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviario, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y más preferiblemente Virus del Simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación vírico SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. En la Patente de Estados Unidos No. 4.419.446 se describe un sistema para expresar ADN en huéspedes de mamíferos que utiliza el virus de papiloma bovino como un vector. En la Patente de Estados Unidos No. 4.601.978 se describe una modificación de este sistema. Véase también Reyes et al., Nature, 297: 598-601 (1982) en la expresión de ADNc de \beta-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus de herpes simplex. Alternativamente, la repetición terminal larga del virus de sarcoma de rous se puede utilizar como promotor.

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(v) Componente elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo anti-ErbB2 de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa frecuentemente mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Actualmente, se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus de células eucariotas. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en la cara tardía del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv. Nature 297:17-18 (1982) en elementos de potenciación para la activación de promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en la posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante del anticuerpo anti-ErbB2, pero se localiza preferiblemente en un sitio 5' del promotor.

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(vi) Componente de la terminación de la transcripción

Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucariotas (levadura, hongo, insecto, planta, animal, humano o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente de las regiones no traducidas 5', y alguna vez desde 3', de ADNs o ADNcs eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo anti-ErbB2. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. Véase WO 94/11026 y el vector de expresión descrito en la misma.

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(vii) Selección y transformación de células huésped

Entre las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención se incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores descritas anteriormente. Entre las procariotas adecuadas para este objetivo se incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli, tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas tales como E. coli B. E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325) son adecuados. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como hongos o levaduras filamentosas, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican el anticuerpo anti-ErbB2. El Saccharomyces cerevisiae, o la levadura habitual del panadero, es el más habitualmente utilizado entre los microorganismos de huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, un grupo de otros géneros, especies y cepas están disponibles habitualmente y son útiles en la presente invención, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces, tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Candida; Trichoderma reesta (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanmomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y huéspedes de Aspergillus, tales como A. nidulans y A. Níger.

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo anti-ErbB2 glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células vegetales y de insectos. Se han modificado numerosas cepas baculovíricas y variantes y las correspondientes células huéspedes de insecto permisivas de huéspedes, tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Droshophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Una serie de cepas víricas para la transfección están públicamente disponibles, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus se pueden utilizar como el virus del presente documento según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también se pueden utilizar como huéspedes.

Sin embargo, el mayor interés ha estado en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en un cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Entre los ejemplos de líneas celulares de huéspedes mamíferos útiles están la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de embrión humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO. Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción del anticuerpo anti-ErbB2 y se cultivan en un medio con nutrientes habituales modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias
deseadas.

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(viii) Cultivo de células huésped

Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo anti-ErbB2 de la presente invención se puede cultivar en una serie de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Mínimo Esencial (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes de Estados Unidos Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 ó 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195 o la Patente de Estados Unidos Re. 30.985 se pueden utilizar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede suplementar según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), soluciones tampón (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes habitualmente en concentraciones finales a nivel micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario se puede también incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán obvias para un técnico habitual.

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(ix) Purificación de anticuerpo anti-ErbB2

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o se secreta directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, la debris particulada, ya sea células huésped o fragmentos lisados, se elimina, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Biol Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, se descongela la pasta celular en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. La debris celular se puede eliminar mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran generalmente en primer lugar utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de filtración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes accidentales.

La composición de anticuerpos preparada a partir de células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo ésta última la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isótopo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que están basados en cadenas pesadas humanas \gamma1, \gamma2 o \gamma4 (Lindmark et al., J. Immunol Meth 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isótopos de ratón y para \gamma3 humanas (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es frecuentemente agarosa, pero se disponen de otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, tales como el vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permite mayores velocidades de flujo y tiempos de procesado más cortos que los que se pueden conseguir con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX^{TM} (J.T. Baker Philipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina-Sefarosa^{TM}, cromatografía en una resina de intercambio de anión o catión (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfocado, SDS-PAGE y precipitación con sulfato amónico también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperar.

Tras cualquier etapa o etapas de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes se pueden someter a una cromatografía de interacción hidrofóbica a pH bajo utilizando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5 y 4,5, preferiblemente a concentraciones de sales bajas (por ejemplo, sal de aproximadamente 0-0,25 M).

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IV. Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos utilizados según la presente invención se preparan para su almacenamiento mediante la mezcla del anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{a} Edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como, cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabens, tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG). Las formulaciones liofilizadas de anticuerpo anti-ErbB2 preferidas se describen en WO97/04801.

La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la enfermedad concreta a tratar, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afectan de forma adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente anticuerpos que se unen a EGFR, ErbB2 (por ejemplo, un anticuerpo que se une a un epítopo diferente en ErbB2), ErbB3, ErbB4 o el factor endotelial vascular (VEGF) en la formulación. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente citotóxico, una citoquina, un agente inhibidor del crecimiento, un agente anti-hormonal, un fármaco dirigido a EGFR, un agente antiangiogénico y/o un cardioprotector. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada combinadas en cantidades que son eficaces para el objetivo pretendido.

Los principios activos también pueden estar contenidos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización entre fases, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{a} Edición, Osol, A.
Ed. (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación controlada. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de Estados Unidos No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradables, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.

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V. Tratamiento con los anticuerpos anti-ErbB2

Se considera que los anticuerpos anti-ErbB2 de la presente invención se pueden utilizar para tratar varias enfermedades o trastornos. Entre los ejemplos de afecciones o trastornos se incluyen tumores benignos o malignos, leucemias y tumores de linfoide; otros trastornos, tales como neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocoélicos, y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.

En general, la enfermedad o trastorno a tratar es cáncer. Entre los ejemplos de cáncer a tratar se incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores malignos. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma del pulmón escamoso, cáncer del peritoneo, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o útero, carcinoma de glándula salivar, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, así como cáncer de cabeza y cuello.

El cáncer comprenderá generalmente células que expresan ErbB2, de manera que el anticuerpo anti-erbB2 de la presente invención es capaz de unirse al cáncer. Aunque el cáncer se puede caracterizar por la sobreexpresión del receptor ErbB2, la presente solicitud proporciona además un método para tratar el cáncer que no está considerado un cáncer que sobreexpresa ErbB2. Para determinar la expresión de ErbB2 en el cáncer, existen varios ensayos de diagnósitco/pronóstico. En una realización, la sobreeexpresión de ErbB2 se puede analizar mediante IHC, por ejemplo, utilizando HERCEPTEST® (Dako). Se pueden someter secciones de tejido de una biopsia de tumor introducidos en parafina al ensayo de IHC y acordar un criterio de intensidad de tinción de la proteína ErbB2 tal como se indica a continuación:

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Valoración 0

No se observa tinción o se observa tinción de membrana en menos de un 10% de las células tumorales.

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Valoración 1+

Se detecta una tinción de membrana ligera/escasamente perceptible en más de un 10% de las células tumorales. Las células sólo están teñidas en parte de su membrana.

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Valoración 2+

Se observa una tinción de membrana completa de débil a moderada en más de un 10% de las células tumorales.

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Valoración 3+

Se observa una tinción de membrana completa de moderada a fuerte en más de un 10% de las células tumorales.

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Los tumores con valoraciones de 0 ó 1+ para la valoración de la sobreexpresión de ErbB2 se pueden caracterizar como que no sobreexpresan ErbB2, mientras que aquellos tumores con valoraciones de 2+ ó 3+ se pueden caracterizar como que sobreexpresan ErbB2.

Alternativamente, o adicionalmente, se pueden llevar a cabo ensayos FISH, tales como INFORM^{TM} (comercializado por Ventana, Arizona) o PATHVISION^{TM} (Vysis, Illinois), sobre tejido de tumor introducido en parafina y fijado a formalina para determinar el grado (si se produce) de sobreexpresión de ErbB2 en el tumor.

El cáncer puede ser aquel que sobreexpresa (y puede sobreexpresar) EGFR. Entre los ejemplos de cánceres que pueden expresar/sobreexpresar EGFR se incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma del pulmón escamoso, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal, que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o útero, carcinoma de glándula salivar, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, así como cáncer de cabeza y cuello.

El cáncer a tratar puede ser aquel que está caracterizado por una activación en exceso de un receptor ErbB, por ejemplo, EGFR. Dicha activación en exceso puede ser atribuible a la sobreexpresión o mayor producción del receptor ErbB o un ligando de ErbB. En una realización de la presente invención, se realizará un ensayo de diagnóstico o pronóstico para determinar si el cáncer del paciente está caracterizado por una activación en exceso de un receptor ErbB. Por ejemplo, se puede determinar la amplificación de un gen de ErbB y/o la sobreexpresión de un receptor ErbB en el cáncer. Existen en la técnica varios ensayos para determinar dicha amplificación/sobreexpresión e incluyen los ensayos IHC, FISH y desprendimiento de antígenos descritos anteriormente. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden determinar según procedimientos conocidos los niveles de un ligando de ErbB, tales como TGP-\alpha, en o asociado con el tumor. Dichos ensayos pueden detectar proteína y/o el ácido nucleico que lo codifica en la muestra a analizar. Los niveles de ligando de ErbB en el tumor se pueden determinar utilizando inmunohistoquímica (IHC); véase, por ejemplo, Scher et al. Clin. Cancer Research 1:545-550 (1995). Alternativamente, o adicionalmente, se pueden evaluar los niveles de ácido nucleico que codifica el ligando de ErbB en la muestra a analizar; por ejemplo, a través de FISH, transferencia southern o técnicas de PCR.

Además, la sobreexpresión o amplificación de receptor ErbB o ligando de ErbB se puede evaluar utilizando un ensayo de diagnóstico in vivo, por ejemplo, mediante la administración de una molécula (tal como un anticuerpo) que se une a la molécula a detectar y está marcada con un marcador detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo) y se rastrea externamente por el marcador del paciente.

Cuando el cáncer a tratar es un cáncer independiente de hormonas, la expresión de la hormona (por ejemplo, andrógeno) y/o su receptor afín en el tumor se pueden evaluar utilizando cualquiera de los diversos ensayos disponibles, por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, o adicionalmente, el paciente puede ser diagnosticado como que tiene un cáncer independiente de hormonas al no responder más a la terapia anti-andrógeno.

Se puede administrar al paciente un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo anti-ErbB2 conjugado con un agente citotóxico. Preferiblemente, el inmunoconjugado y/o proteína ErbB2 a la que está unido es internalizado o internalizados por la célula, dan lugar a una mayor eficacia terapéutica del inmunoconjugado en la citólisis de la célula cancerosa a la que se une. El agente citotóxico puede ser diana o interferir con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Entre los ejemplos de dichos agentes citotóxicos se incluyen maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleasas y ADN endonucleasas.

Los anticuerpos anti-ErbB2 o inmunoconjugados se administran a un paciente humano según métodos conocidos, tales como la administración intravenosa, por ejemplo, como una infusión con bolo o continua durante un periodo de tiempo mediante las vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalación. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo.

Se pueden combinar otros regímenes terapéuticos con la administración del anticuerpo anti-ErbB2. La administración combinada incluye la coadministración, utilizando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, donde preferiblemente existe un periodo de tiempo durante el cual ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.

El paciente se puede tratar con dos anticuerpos anti-ErbB2 diferentes. Por ejemplo, el paciente se puede tratar con un primer anticuerpo anti-ErbB2 que bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB o un anticuerpo que tiene una característica biológica del anticuerpo monoclonal 2C4, así como un segundo anticuerpo anti-ErbB2 que es inhibidor del crecimiento (por ejemplo, HERCEPTIN®) o un anticuerpo anti-ErbB2 que induce la apoptosis de una célula que sobreexpresa ErbB2 (por ejemplo, 7C2, 7F3, o variantes humanizadas de los mismos). Preferiblemente dicha terapia combinada da lugar a un efecto terapéutico sinérgico. Por ejemplo, se puede tratar el paciente con HERCEPTIN® y a continuación se puede tratar con rhuMAb 2C4, por ejemplo, cuando el paciente no responde a la terapia con HERCEPTIN®. El paciente se puede tratar en primer lugar con rhuMAb 2C4 y, a continuación, recibir la terapia con HERCEPTIN®. El paciente se puede tratar con rhuMAb 2C4 y HERCEPTIN® simultáneamente.

Puede ser deseable administrar combinar la administración del anticuerpo o anticuerpos anti-ErbB2 con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno asociado al tumor. El otro anticuerpo en este caso puede unirse, por ejemplo, a EGFR, ErbB3, ErbB4 o el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

El tratamiento puede implicar la administración combinada de un anticuerpo (o anticuerpos) anti-ErbB2 y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, incluyendo la coadministración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Entre los agentes quimioterapéuticos preferidos se incluyen taxanos (tal como oaclitaxel y docetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. La preparación y pautas de dosificación para dichos agentes quimioterapéuticos se pueden utilizar según las instrucciones de los fabricantes o tal como se determina empíricamente por el técnico en la materia. La preparación y pautas de dosificación para dicha quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & wilkins, Baltimore, MD (1992).

El anticuerpo se puede combinar con un compuesto anti-hormonal, por ejemplo, un compuesto anti-estrógeno, tal como tamoxifeno; una anti-progesterona, tal como onapristona (véase, EP 616 812); o un andrógeno, tal como flutamida, en dosis conocidas para dichas moléculas. Cuando el cáncer a tratar es un cáncer independiente de hormonas, el paciente puede haber sido sometido previamente a terapia anti-hormonal y, después de que el cáncer se convierta en independiente de hormonas, se puede administrar al paciente el anticuerpo anti-ErbB2 (y opcionalmente otros agentes tal como se describen en la presente invención).

A veces, puede ser beneficioso coadministrar también un cardioprotector (para evitar o reducir la disfunción miocárdica asociada con la terapia) o una o más citoquinas al paciente. También se pueden coadministrar un fármaco dirigido a EGFR o un agente antiangiogénico. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente se puede someter a una extracción quirúrgica de células cancerosas y/o terapia de radiación.

Los anticuerpos anti-ErbB2 de la presente invención también se pueden combinar con un fármaco dirigido a EGFR, tal como los descritos anteriormente en la sección de definiciones que dan lugar a un efecto terapéutico complementario y potencialmente sinérgico.

Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriormente son aquellas utilizados actualmente y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo anti-ErbB2.

Para la prevención o el tratamiento de enfermedades, la dosis apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal y como se ha definido anteriormente, la gravedad y la evolución de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con objetivos de prevención o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico responsable. El anticuerpo se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg hasta 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, mediante, por ejemplo, uno o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Una dosis diaria habitual podría variar desde, aproximadamente, 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que tiene lugar la desaparición deseada de los síntomas de la enfermedad. La dosis preferida del anticuerpo estará en el intervalo desde aproximadamente 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. De este modo, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ó 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de manera que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo anti-ErbB2). Se puede administrar una dosis inicial de carga más elevada, seguido de una o más dosis inferiores. Un régimen de dosificación ejemplar comprende la administración de una dosis inicial de carga de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-ErbB2. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas
de dosificación. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

A parte de la administración de la proteína anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo mediante terapia génica. Dicha administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo esta comprendida por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo". Véase, por ejemplo, WO96/07321 publicada el 14 de marzo de 1996 que se refiere al uso de la terapia génica para generar anticuerpos intracelulares.

Existen dos estrategias principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para la liberación in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, normalmente en el punto donde se necesita el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo, se extraen las células del paciente, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y se administran las células modificadas al paciente, ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas en membranas porosas que se implantan en el paciente (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.892.538 y 5.283.187). Existen una serie de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Un vector utilizado normalmente para la liberación ex vivo del gen es un retrovirus.

Entre las técnicas actuales de transferencia de ácido nucleico in vivo preferidas se incluyen la transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus del herpes simplex I, o virus adenoasociados) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son, por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol). En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fiente de ácido nucleico con un agente que reconoce las células diana, tales como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se utilizan liposomas, se pueden utilizar proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie celular asociada con endocitosis para el reconocimiento y/o facilitar la captación, por ejemplo, proteínas cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo de célula concreta, anticuerpos para proteínas que experimentan la internalización en el ciclado, y proteínas que dirigen la localización intracelular y aumentan la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, por Wu et al., J. Biool. Chem. 262: 4429-4432 (1987); y Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990). Para una revisión de los protocolos de marcaje génico y terapia génica actualmente conocidos, véase Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992). Véase también WO 93/25673 y las referencias citadas en la misma.

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VI. Artículos de fabricación

Un artículo de fabricación puede contener materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para el tratamiento de la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-ErbB2. La etiqueta o prospecto indica que la composición se utiliza para el tratamiento de la enfermedad de elección, tal como cáncer. En una realización, la etiqueta o prospecto indica que la composición que comprende el anticuerpo que se une a ErB2 se puede utilizar para tratar el cáncer que expresa un receptor ErbB seleccionado del grupo que consiste e receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ErbB3 y ErbB4, preferiblemente, EGFR. Además, la etiqueta o prospecto puede indicar que el paciente a tratar es aquel que tiene un cáncer caracterizado por una activación en exceso de un receptor ErbB seleccionado entre EGFR, ErbB3 o ErbB4. Por ejemplo, el cáncer puede ser aquel que sobreexpresa uno de estos receptores y/o que sobreexpresa un ligando de ErbB (tal como TGF-\alpha). La etiqueta o prospecto puede indicar también que la composición se puede utilizar para tratar el cáncer, donde el cáncer no está caracterizado por la sobreexpresión del receptor ErbB2. Por ejemplo, mientras que el actual prospecto para HERCEPTIN® indica que el anticuerpo se utiliza para tratar pacientes con cáncer de mama metastático cuyos tumores sobreexpresan la proteína ErbB2, el prospecto de la presente invención puede indicar que el anticuerpo o la composición se utiliza para tratar el cáncer independientemente del grado de sobreexpresión de ErbB2. En otras realizaciones, el prospecto puede indicar que el anticuerpo o la composición se puede utilizar para trata el cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama metastático); cáncer independiente de hormonas; cáncer de próstata, (por ejemplo, cáncer de próstata independiente de andrógeno); cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas); cáncer de colon, rectal o colorrectal; o cualquiera del resto de enfermedades o trastornos descritos en la presente invención. Además, el artículo de fabricación puede comprender (1) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un primer anticuerpo que se une a ErbB2 e inhibe el crecimiento de células cancerosas que sobreexpresan ErbB2; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, donde la composición comprender un segundo anticuerpos que se une a ErbB2 y bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB. El artículo de fabricación en esta realización de la invención puede comprender además un prospecto que indica que las composiciones del primer y el segundo anticuerpo se pueden utilizar para tratar el cáncer. Además, el prospecto puede enseñar al usuario de la composición (que comprende un anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB) a combinar la terapia con el anticuerpo y cualquiera de las terapias adjuntas descritas en la sección anterior (por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un fármaco dirigido a EGFR, un agente antiangiogénico, un compuesto antihormonal, un cardioprotector y/o una citoquina). Alternativamente, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (B WFI), una solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir también otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

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VII. Usos no terapéuticos del anticuerpo anti-ErbB2

Los anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos anti-ErbB2 humanizados) de la invención tienen aplicaciones no terapéuticas adicionales.

Por ejemplo, los anticuerpos se pueden utilizar como agentes de purificación de afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida, tal como una resina Sefadex o papel de filtro, utilizando los procedimientos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína ErbB2 (o fragmento de la misma) a purificar y, a continuación, el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra a excepción de la proteína ErbB2, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como tampón de glicina, pH 5,0, que liberará la proteína ErbB2 del anticuerpo.

Los anticuerpos anti-ErbB2 también pueden ser útiles en los ensayos de diagnóstico para la proteína ErbB32, por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos o suero específicos.

Para las aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo se marcará habitualmente con un grupo detectable. Existen numerosos marcadores disponibles que se pueden agrupar generalmente en las siguientes categorías:

(a) Radioisótopos, tales como ^{35}S, ^{14}C, ^{125}I, ^{3}H, y ^{131}I. El anticuerpo se puede marcar con el radioisótopo utilizando, por ejemplo, las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, volúmenes 1 y 2. Coligen et al., Ed., Wiley-Interscience. Nueva York, Nueva York, Pubs., (1991) y la radiactividad se puede medir utilizando recuento por centelleo.

(b) Hay disponibles marcadores fluorescentes, tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lissamina, ficoeritrina y Texas Red. Los marcadores fluorescentes se pueden conjugar al anticuerpo utilizando las técnicas descritas, por ejemplo, en Current Protocols in Immunology, supra. La fluorescencia se puede cuantificar utilizando un fluorímetro.

(c) Hay varios marcadores de enzima-sustrato disponibles y la Patente de Estados Unidos No. 4.275.149 proporciona una revisión de algunos de éstos. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que se puede medir utilizando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o la quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describen anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente mediante una reacción química y puede entonces emitir luz que se puede medir (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Entre los ejemplos de marcadores enzimáticos se incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de Estados Unidos No. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato deshidrogenada, ureasa, peroxidasa, tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacarida oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym (ed J. Langone y H. Van Vunakis), Academic press, Nueva York, 73: 147-166 (1981).

Entre los ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato se incluyen, por ejemplo:

(i) peroxidasa de rábano picante (HRPO) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, donde la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilen diamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB));

(ii) fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y

(iii) \beta-D-galactosidasa (\beta-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-\beta-D-galactosidasa) o un sustrato fluorogénico 4-metillumbeliferil-\beta-D-galactosidasa.

Para los expertos en la materia, están disponibles numerosas otras combinaciones de enzima-sustrato. Para una revisión general de las mismas, véase la Patente de Estados Unidos Nos. 4.275.149 y 4.318.980.

Algunas veces, el marcador está indirectamente conjugado con el anticuerpo. El técnico experto conoce las diversas técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de marcadores mencionados anteriormente se pueden conjugar con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a avidina y, de este modo, el marcador se puede conjugar con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para conseguir la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina). De este modo, se puede conseguir la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.

En otra realización de la invención, el anticuerpo anti-ErbB2 no necesita estar marcado, y la presencia del mismo se puede detectar utilizando un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo de ErbB2.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directo e indirecto, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques, páginas 147-158 (CRC Press. Inc., 1987).

Para la inmunohistoquímica, la muestra de tumor puede ser reciente o congelada o puede estar envuelta de parafina y fijada con un conservante, tal como formalina, por ejemplo.

Los anticuerpos también se pueden utilizar para ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, el anticuerpo se marca con un radionucleido (tal como ^{111}In, ^{99}Tc, ^{14}C, ^{131}I, ^{125}I, ^{3}H, ^{32}P o ^{35}S), de manera que el tumor se puede localizar utilizando inmunocentelleografía. Por conveniencia, los anticuerpos de la presente invención se pueden disponer en un kit, es decir una combinación de reactivos empaquetados en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por al enzima (por ejemplo, un sustrato precursor que proporciona el cromóforo o fluorófor detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos, tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de diversos reactivos se pueden variar ampliamente para proporcionar las concentraciones en solución de los reactivos que sustancialmente optimizan la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos se pueden disponer como polvos secos, normalmente liofilizados, incluyendo excipientes que en disolución proporcionarán una solución de reactivos que tienen la concentración adecuada.

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VIII. Depósito de materiales

La siguiente línea de células de hibridoma se ha depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

100

Mediante los siguientes ejemplos no limitantes se ilustran más detalles de la invención.

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Ejemplo 1 Producción y caracterización de anticuerpo monoclonal 2C4

Los anticuerpos monoclonales murinos 2C4, 7F3 y 4D5 que se unen específicamente al dominio extracelular de ErbB2 se produjeron tal y como se describe en Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990). Brevemente, las células NIH 3T3/HER2-3_{400} (que expresan aproximadamente 1 x 10^{5} moléculas de ErbB2/célula) producidas tal y como se describe en Hudziak et al Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:7158-7163 (1987) se recogieron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 25 mM de EDTA y se utilizaron para inmunizar ratones BALB/c. Se les administraron inyecciones i.p. a los ratones de 10^{7} células en 0,5 ml de PBS en las semanas 0, 2, 5 y 7. A los ratones con antisueros que inmunoprecipitaron ErbB2 marcado con ^{32}P se les administraron inyecciones i.p. de un extracto de membrana con ErbB2 purificado con aglutinina de germen de trigo-Sefarosa (WGA) en las semanas 9 y 13. A continuación, se inyectaron i.v. 0,1 ml de la preparación de ErbB2 y se fusionaron los esplenocitos con la línea de mieloma de ratón X63-Ag8.653.

Se cribaron sobrenadantes de hibridoma por la unión a ErbB2 mediante ELISA y radioinmunoprecipitación.

Los epítopos de ErbB2 unidos mediante los anticuerpos monoclonales 4D5, 7F3 y 2C4 se determinaron mediante análisis de unión competitiva (Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990)). Se realizaron estudios de bloqueo cruzado en anticuerpos mediante fluorescencia directa en células intactas utilizando la Máquina de Cribado PANDEX^{TM} para cuantificar la fluorescencia. Se conjugó cada anticuerpo monoclonal con isotiocianato de fluoresceína (FITC), utilizando procedimientos establecidos (Wofsy et al. Selected Methods in Cellular Immunology, pág. 287, Mishel y Schiigi (eds.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)). Se tripsinizaron monocapas confluentes de células NIH 3T3/HER2-3_{400}, se lavaron una vez, y se resuspendieron a 1,75 x 10^{6} células/ml en PBS fría que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5% y NaN_{3} al 0,1%. Se añadió una concentración final de un 1% de partículas de látex (IDC, Portland, OR) para reducir la obturación de las membranas de placa PANDEX^{TM}. Se añadieron células en suspensión, 20 \mul, y 20 \mul de anticuerpos monoclonales purificados (de 100 \mug/ml a 0,1 \mug/ml) a los pocillos de placa PANDEX^{TM} y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Se añadió a cada pocillo una dilución predeterminada de anticuerpos monoclonales marcados con FITC en 20 \mul, se incubó durante 30 minutos, se lavó, y se cuantificó la fluorescencia mediante el PANDEX^{TM}. Se consideró que los anticuerpos monoclonales compartían un epítopo si cada uno bloqueaba la unión del otro en un 50% o superior en comparación con un anticuerpo de control irrelevante. En este experimento, se asignaron los epítopos I, G/F y F a los anticuerpos monoclonales 4D5, 7F3 y 2C4, respectivamente.

Se evaluaron las características inhibitorias de crecimiento de los anticuerpos monoclonales 2C4, 7F3 y 4D5 utilizando la línea celular de tumor de mama, SK-BR-3 (ver Hudziak et al. Molec. Cell. Biol. 9(3):1165-1172(1989)). Brevemente, se separaron las células SK-BR-3 mediante la utilización de tripsina al 0,25% (vol/vol) y se suspendió en medio completo a una densidad de 4 x 10^{5} células por ml. Se enplacaron alícuotas de 100 \mul (4 x 10^{4} células) en placas de microdilución de 96 pocillos, se permitió que se adherieran las células, y a continuación se añadieron 100 \mul de medio solo o medio que contenía anticuerpo monoclonal (concentración final de 5 \mug/ml). Después de 72 horas, se lavaron las placas dos veces con PBS (pH 7,5), se tiñeron con violeta cristal (0,5% en metanol), y se analizó la proliferación celular relativa tal y como se describe en Sugarman et al. Science 230:943-945 (1985). Los anticuerpos monoclonales 2C4 y 7F3 inhibieron la proliferación celular relativa de SK-BR-3 en aproximadamente el 20% y aproximadamente el 38%, respectivamente, en comparación con aproximadamente el 56% de inhibición conseguida con el anticuerpo monoclonal 4D5.

Se evaluaron los anticuerpos monoclonales 2C4, 4D5 y 7F3 por su capacidad de inhibir la fosforilación de tirosina estimulada por HRG de proteínas en el rango de M_{r} 180.000 de lisatos de célula entera de células MCF7 (Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996)). Se describe que las células MCF7 expresan todos los receptores ErbB conocidos, pero a niveles relativamente bajos. Dado que ErbB2, ErbB3, y ErbB4 tienen tamaños moleculares casi idénticos, no es posible discernir qué proteína se está fosforilando en la tirosina cuando se evalúan los lisatos de célula entera mediante análisis de transferencia Western.

No obstante, estas células son ideales para los ensayos de fosforilación de tirosina HRG porque bajo las condiciones de ensayo utilizadas, en ausencia de HRG añadido de forma exógena, se mostraron niveles bajos a indetectables de proteínas de fosforilación de tirosina en el rango M_{r} 180.000.

Se emplearon células MCF7 en placas de 24 pocillos y se añadieron anticuerpos monoclonales a ErbB2 a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente; a continuación, se añadió rHRG\beta1_{177-244} a cada pocillo hasta una concentración final de 0,2 nM, y se continuó la incubación durante 8 minutos. Se aspiraron cuidadosamente los medios de cada pocillo, y se pararon las reacciones mediante la adición de 100 \mul de tampón de muestra SDS (SDS al 5%, 25 mM de DTT, y 25 mM de Tris-HCl, pH 6,8). Cada muestra (25 \mul) se sometió a electroforesis en un gel de gradiente al 4-12% (Novex) y a continuación se transfirió electroforéticamente a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Se desarrollaron inmunotransferencias de antifosfotirosina (4G10, de UBI, utilizado a 1 \mug/ml), y se cuantificó la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr\sim180,000 mediante densitometría de reflectancia, tal y como se describe previamente (Holmes et al. Science 256:1205-1210 (1992); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269:14661-14665 (1994)).

Los anticuerpos monoclonales 2C4, 7F3, y 4D5, inhibieron significativamente la generación de una señal de fosforilación de tirosina inducida por HRG a M_{r} 180.000. En ausencia de HRG, ninguno de estos anticuerpos fue capaz de estimular la fosforilación de tirosina de proteínas en el rango de Mr 180.000. Además, estos anticuerpos no reaccionan de forma cruzada con EGFR (Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990)), ErbB3, o ErbB4. Los anticuerpos 2C4 y 7F3 inhibieron significativamente la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosina p180 hasta menos de un 25% de control. El anticuerpo monoclonal 4D5 fue capaz de bloquear la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosina en -50%. La Fig. 2A muestra curvas dosis-respuesta para la inhibición por 2C4 o 7F3 de la estimulación por HRG de la fosforilación de tirosina p180 tal y como se determina mediante densitometría de reflectancia. La evaluación de estas curvas de inhibición utilizando un ajuste de 4 parámetros produjo una IC_{50} de 2,8 \pm 0,7 nM y 29,0 \pm 4,1 nM para 2C4 y 7F3, respectivamente.

Se realizó la inhibición de la unión de HRG a líneas celulares tumorales de mama MCF7 por anticuerpos anti-ErbB2 con cultivos monocapa en hielo en un formato de placas de 24 pocillos (Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996)). Se añadieron anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos. Se añadió rHRG\beta1_{177-224} marcado con ^{125}I (25 pm), y se continuó la incubación de 4 a 16 horas. La Fig. 2B proporciona curvas de dosis-respuesta para la inhibición por 2C4 o 7F3 de la unión de HRG a células MCF7. Se incubaron concentraciones variables de 2C4 o 7F3 con células MCF7 en presencia de rHRG\beta1 marcado con ^{125}I, y las curvas de inhibición se muestran en la Figura 2B. El análisis de estos datos produjo una IC_{50} de 2,4 \pm 0,3 nM y 19,0 \pm 7,3 nM para 2C4 y 7F3, respectivamente. Hubo un máximo de inhibición de -74% para 2C4 y 7F3 de acuerdo con los datos de fosforilación de tirosina.

Para determinar si el efecto de los anticuerpos anti-ErbB2 observado en células MCF7 era un fenómeno general, se incubaron líneas celulares tumorales humanas con 2C4 o 7F3 y se determinó el grado de unión de rHRG\beta1 marcado con ^{125}I específico (Lewis et al. Cancer Research 56:1457 1465 (1996)). Los resultados de este estudio se muestran en la figura 3. La unión de rHRG\beta1 marcado con ^{121}I se podía inhibir significativamente por 2C4 o 7F3 en todas las líneas celulares, con la excepción de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-468, que se había descrito que expresa poco ErbB2 o ninguno. Se describe que las líneas celulares restantes expresan ErbB2 variando ampliamente el nivel de expresión de ErbB2 entre estas líneas celulares. De hecho, el rango de expresión de ErbB2 en las líneas celulares ensayadas varía en más de 2 órdenes de magnitud. Por ejemplo, BT-20, MCF7 y Caov3 expresan \sim10^{4} receptores ErbB2/células, mientras que BT-474 y SK-BR-3 expresan \sim10^{6} receptores ErbB2/célula. Dado el amplio rango de expresión de ErbB2 en estas células y los datos anteriores, se concluyó que la interacción entre ErbB2 y ErbB3 o ErbB4 era por sí misma una interacción de alta afinidad que tiene lugar en la superficie de la membrana plasmática.

Se evaluaron los efectos inhibidores de crecimiento de los anticuerpos monoclonales 2C4 y 4D5 sobre las células MDA-MB-175 y SK-BR-3 en presencia o ausencia de rHRG\beta1 exógeno (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Los niveles de ErbB2 en células MDA-MB-175 son 4-6 veces más elevados que el nivel hallado en células epiteliales normales de mama y el receptor ErbB2-ErbB4 es constitutivamente fosforilado en tirosina en células MDA-MB-175. Las células MDA-MB-175 se trataron con anticuerpos monoclonales anti-ErbB2 2C4 y 4D5 (10 \mug/ml) durante 4 días. En un ensayo de tinción con violeta cristal, la incubación con 2C4 mostró un fuerte efecto inhibidor del crecimiento en esta línea celular (figura 4A). Ha HRg exógena no invirtió significativamente esta inhibición. Por otro lado, 2C4 no reveló un efecto inhibidor en la línea celular SK-BR-3 que sobreexpresa ErbB2 (figura 4B). El anticuerpo monoclonal 2C4 era capaz de inhibir la proliferación celular de células MDA-MB-175 en un grado mayor que el anticuerpo monoclonal 4D5, ambos en presencia y ausencia de HRG exógena. La inhibición de la proliferación celular por 4D5 es dependiente del nivel de expresión de ErbB2 (Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993)). Se pudo detectar una inhibición máxima del 66% en células SK-BR-3 (figura 4B). Sin embargo, este efecto se pudo superar mediante HRG exógena.

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Ejemplo 2 La asociación dependiente de HRG de ErbB2 con ErbB3 es bloqueada por el anticuerpo monoclonal 2C4

Se analizó la capacidad de ErbB3 de asociarse con ErbB2 en un experimento de coinmunoprecipitación. Se sembraron 1,0 x 10^{6} células de MCF7 o SK-BR-3 en placas para el cultivo de tejidos de seis pocillos en medio 50:50 de DMEM/F12 de Ham que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10% y HEPES 10 mM, pH 7,2 (medio de crecimiento) y se dejó unir durante toda la noche. Las células se privaron durante dos horas en un medio de crecimiento sin suero antes de iniciar el experimento.

Las células se lavaron brevemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y, a continuación, se incubaron con 100 nM del anticuerpo indicado diluido en albúmina de suero bovino (BSA) al 0,2% p/v, medio RPMI, con 10 mM de HEPES, pH 7,2 (tampón de unión), o bien, con tampón de unión solo (control). Después de una hora a temperatura ambiente, se añadió HRG hasta una concentración final de 5 nM a la mitad de los pocillos (+). Se añadió un volumen similar de tampón de unión a los otros pocillos (-). La incubación prosiguió durante aproximadamente 10 minutos.

Se extrajeron los sobrenadantes por aspiración y se lisaron las células en RPMI, 10 mM de HEPES, pH 7,2, TRITON X-100^{TM} al 1,0% p/p, CHAPS (tampón de lisis) al 1,0% p/v, que contenía 0,2 mM de PMSF, 10 \mug/ml de leupeptina y 10 TU/ml de aprotinina. Los lisatos se purificaron de material insoluble mediante centrifugación.

El ErbB2 se inmunoprecipitó utilizando un anticuerpo monoclonal acoplado covalentemente a un gel de afinidad (Affi-Prep 10, Bio-Rad). Este anticuerpo (Ab-3, Oncogene Sciences) reconoce un epítopo del dominio citoplasmático. La inmunoprecipitación se realizó añadiendo 10 \mul de una pasta de gel que contenía aproximadamente 8,5 \mug de anticuerpo inmovilizado a cada lisato y se dejó mezclar las muestras a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, se recogieron los geles mediante centrifugación. Los geles se lavaron por grupos tres veces con tampón de lisis para eliminar el material no unido. A continuación, se añadió tampón de muestra SDS y las muestras se calentaron brevemente en un baño de agua hirviendo.

Los sobrenadantes se desplazaron sobre geles de poliacrilamida al 4-12% y se electrotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa. La presencia de ErbB3 se evaluó sondando las manchas ("blots") con un anticuerpo policlonal contra un epítopo del dominio citoplasmático del mismo (c-17, Santa Cruz Biotech). Las manchas se visualizaron utilizando un sustrato quimioluminiscente (ECL, Amersham).

Tal como se muestra en las bandas de control de las figuras 5A y 5B, para las células MCF7 y SK-BR-3, respectivamente, el ErbB3 estaba presente en un inmunoprecipitado de ErbB2 sólo cuando las células se estimulaban con HRG. Si las células se incubaban primero con anticuerpo monoclonal 2C4, la señal de ErbB3 desaparecía en las células MCF7 (figura 5A, banda 2C4+) o se reducía sustancialmente en las células SK-BR-3 (figura 5B, banda 2C4+). Tal como se muestra en las figuras 5A-B, el anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea la asociación dependiente de heregulina de ErbB3 con ErbB2 tanto en células MCF7 como SK-BR-3 sustancialmente de manera más eficaz que HERCEPTIN®. La preincubación con HERCEPTIN® disminuyó la señal de ErbB3 en lisatos de MSCF7, pero tenía poco efecto o nulo en la cantidad de ErbB3 coprecipitado de lisatos de SK-BR-3. La preincubación con un anticuerpo contra el receptor EGF (ab-1, Oncogene Sciences) no presentó efecto sobre la capacidad de ErbB3 de coinmunoprecipitar con ErbB2 en cualquiera de las líneas celulares.

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Ejemplo 3 Anticuerpos 2C4 humanizados

Los dominios variables de anticuerpo monoclonal 2C4 murino se clonó en primer lugar en un vector que permite la producción de un fragmento Fab quimérico de ratón/humano. El ARN total se aisló de las células de hibridoma utilizando un kit de extracción de ARN Stratagene siguiendo los protocolos del fabricante. Los dominios variables se amplificaron mediante RT-PCT, se purificaron por gel y se insertaron en un derivado de un plásmido basado en pUC119 que contenía un dominio constante kappa humano y dominio C_{H}1 humano tal como se ha descrito previamente (Carter et al. PNAs (USA) 89: 4285 (1992); y la Patente de Estados Unidos No. 5.821.337). El plásmido resultante se transformó en la cepa 16C9 de E. coli para la expresión del fragmento Fab. El crecimiento de los cultivos, la inducción de la expresión de la proteína y la purificación del fragmento Fab fueron tal como se ha descrito previamente (Werther et al. J. Immunol. 157: 4986-4995 (1996); Presta et al. Cancer Research 57: 4593-4599 (1997)).

El fragmento Fab de 2C4 quimérico purificado se comparó con el anticuerpo 2C4 parental murino con respecto a su capacidad de inhibir la unión de ^{125}I-HRG a células MCF7 e inhibir la activación por rHRG de la fosforilación de tirosina p180 en células MCF7. Tal como se muestra en la figura 6A, el fragmento Fab de 2C4 quimérico es muy eficaz en la interrupción de la formación del sitio de unión ErbB2-ErbB3 de alta afinidad en la línea celular de cáncer de mama, MCF7. El valor IC_{50} relativo calculado para 2C4 murino intacto es 4,0 \pm 0,4 nM, mientras que el valor para el fragmento Fab es 7,7 \pm 1,1 nM. Tal como se ilustra en la figura 6B, el fragmento Fab de 2C4 quimérico monovalente es muy eficaz en la interrupción de la activación de ErbB2-ErbB3 dependiente de HRG. El valor de IC_{50} calculado para el anti-
cuerpo monoclonal 2C4 murino intacto es 6,0 \pm 2 nM, mientras que el valor para el fragmento Fab es 15,0 \pm 2 nM.

La secuenciación del ADN del clon quimérico permitió la identificación de los residuos de CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) (Figuras 7A y B). Utilizando la mutagénesis dirigida de sitio de oligonucleótidos, las seis regiones de CDR se introdujeron en una región estructura humana completa (VL kappa subgrupo I y VH subgrupo III) contenida en el plásmido VX4 tal como se ha descrito anteriormente (Presta et al., Cancer Research 57: 4593-4599 (1997)). La proteína de la "CDR de intercambio" resultante se expresó y purificó tal como se ha indicado anteriormente. Los estudios de unión se realizaron para comparar las dos versiones. Brevemente, se recubrió una placa NUNC MAXISORP^{TM} con 1 microgramo por ml de dominio extracelular de ErbB2 (ECD; producido tal como se ha descrito en WO 90/14357) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, durante toda la noche a 4ºC, y a continuación, se bloqueó con diluyente de ELISA (BSA al 0,5%, polisorbato 20 al 0,05%, PBS) a temperatura ambiente durante 1 hora. Se incubaron diluciones en serie de muestras en diluyente de ELISA en placas durante dos horas. Después del lavado, se detectó el fragmento Fab unido con anticuerpo kappa anti-humano murino biotinilado (ICN 634771) seguido de peroxidasa de rábano picante conjugada a estreptavidina (Sigma) y utilizando 3,3',5,5'-tetrametil bencidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como sustrato. La absorbancia se leyó a 450 nm. Tal como se muestra en la figura 8A, se perdió toda la unión en la construcción del fragmento Fab humano con CDR de intercambio.

Para restaurar la unión del Fab humanizado, se construyeron mutantes utilizando ADN del CDR de intercambio como plantilla. Utilizando un modelo generado por ordenador (figura 9), se diseñaron estas mutaciones para cambiar los residuos de la región de estructura humana en sus equivalentes murinos en las posiciones donde el cambio podía afectar a las conformaciones de CDR o la interfase anticuerpo-antígeno. Los mutantes se muestran en la tabla 2.

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TABLA 2

3

Las curvas de unión para los diversos mutantes se muestran en las figuras 8A-C. La versión de Fab humanizado 574, con los cambios ArgH71Val, AspH73Arg e IleH69Leu, parece tener la unión restaurada a la del fragmento Fab de 2C4 quimérico. Se pueden modificar residuos de FR y/o CDR adicionales, tales como L2, L54, L55, L56, H35 y/o H48 (por ejemplo, sustituidos de la siguiente manera - IleL2Thr; ArgL54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser; y ValH48Ile) con el fin de refinar adicionalmente o aumentar la unión del anticuerpo humanizado. Alternativamente, o adicionalmente, el anticuerpo humanizado puede estar madurado por afinidad (ver anteriormente) con el fin de mejorar o refinar adicionalmente su afinidad y/u otras actividades biológicas.

La versión de 2C4 humanizado 574 se maduró por afinidad utilizando un método de expresión en fagos. Brevemente, se clonó Fab 2C4.574 humanizado en un vector de expresión de fagos como una fusión de gene III. Cuando las partículas de fago son inducidas mediante infección con el fago auxiliar M13KO7, esta fusión permite que el Fab se exprese en el N-terminal de la proteína de fibra caudal del fago, gene III (Baca et al. J Biol Chem. 272: 10678 (1997)).

Se construyeron bibliotecas individuales para cada una de las 6 CDRs identificadas anteriormente. En estas bibliotecas, los aminoácidos en las CDR que se identificaron utilizando un modelo generado por ordenador (figura 9) como potencialmente significativos en la unión a ErbB2 se dispusieron aleatoriamente utilizando oligos que contenían "NNS" como sus codones. A continuación, las bibliotecas se seleccionaron contra ECD de ErbB2 que recubrían placas NUNC MAXISORP^{TM} con leche en polvo al 3% en PBS con TWEEN 20® (MPBST) al 0,2% utilizado en lugar de todas las soluciones de bloqueo. Con el fin de seleccionar fagos con afinidades superiores a la de 2C4.574, en las rondas de selección 3, 4 y 5, se añadieron ECD de ErbB2 soluble o Fab 2C4.574 soluble durante las etapas de lavado como competidores. Los tiempos de lavado se extendieron hasta 1 hora a temperatura ambiente.

Después de 5 rondas de selección, se analizaron de nuevo los clones individuales mediante ELISA de fagos. Los clones individuales se desarrollaron en placas de cultivo de tejido Costar con base en forma de U con 96 pocillos y se indujeron los fagos mediante la adición de fago auxiliar. Después de crecer durante toda la noche, se agruparon las células de E. coli y los sobrenadantes que contenían fagos se transfirieron a placas de 96 pocillos, donde el fago se bloqueó con MBPST durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas NUNC MAXISORP^{TM} recubiertas con ECD de ErbB2 también se bloquearon con MBPST al igual que antes. El fago bloqueado se incubó en placas durante 2 horas. Después del lavado, se detectó el fago unido utilizando anticuerpo monoclonal anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. 27-9421-01) diluido 1:5000 en MPBST, seguido de 3,3',5,5',-tetrametil benzidina como sustrato. La absorbancia se leyó a 450 nm.

Se secuenció el ADN de los 48 clones de cada biblioteca que produjeron las señales más elevadas. Los clones cuyas secuencias aparecían más frecuentemente se subclonaron en el vector descrito anteriormente que permite la expresión de Fabs solubles. Se indujeron Fabs, se purificaron las proteínas y los Fabs purificados se analizaron por su unión mediante ELISA tal como se ha descrito anteriormente y se comparó la unión con la de la versión 2C4.574 humanziada de partida.

Después de identificar mutaciones interesantes en CDR individuales, se construyeron mutantes adicionales que eran varias combinaciones de éstas y se analizaron al igual que antes. Los mutantes que produjeron una mejor unión en relación a 574 se describen en la tabla 3.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Designación de mutantes derivados de la maduración por afinidad de 2C4.574

4

5

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También se han construido los siguientes mutantes y se encuentran actualmente bajo evaluación:

659.L3.G6

serL50trp, metH34ser, tyrL92pro, ileL931ys

659.L3.G11

serL50trp, metH34ser, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly

659.L3.29

serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL96asn

659.L3.36

serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro

L2F5.L3G6

serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92pro, ileL93lys

L2F5.L3G11

serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly

L2F5.L29

serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe, tyrL96asn

L2F5.L36

serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro

L2F5.L3G6.655

serL50trp, tyrL53gly, metH35ser, tyrL92pro, ileL93lys

L2F5.L3G 11.655

serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly

L2F5.L29.655

serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92phe, tyrL96asn

L2F5.L36.655

serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro

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Los siguientes mutantes, sugeridos por una rastreo por homología, se están construyendo actualmente:

678

thrH30ala

679

thrH30ser

680

lysH64arg

681

leuH96val

682

thrL97ala

683

thrL97ser

684

tyrL96phe

685

tyrL96ala

686

tyrL91phe

687

thrL56ala

688

glnL28ala

689

glnL28glu

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El aminoácido preferido en H34 sería metionina. Se podría realizar un cambio por leucina si se encontrara que hubiera oxidación en esta posición.

Se observó que AsnH52 y asnH53 eran altamente preferidas para la unión. El cambio de estos residuos por alanina o ácido aspártico disminuyó bruscamente la unión.

Se ha preparado un anticuerpo intacto que comprende los dominios variables ligero y pesado de la versión humanizada 574 con la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (véase la Patente de Estados Unidos No. 5.821.337). El anticuerpo intacto es producido por células de Ovario de Hámster Chino (CHO) cells. En la presente invención esta molécula se designa como rhuMAb 2C4.

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Ejemplo 4 El anticuerpo monoclonal 2C4 bloquea la activación mediada por EGF, TGF-\alpha o HRG de MAPK

Muchos receptores de factores de crecimiento se comunican mediante el mecanismo de proteínas quinasa activadas por mitógeno (MAPK). Estas quinasa de especificidad dual son uno de los puntos finales claves en los mecanismos de transducción de señales que en última instancia desencadena la división de las células cancerosas. La capacidad del anticuerpo monoclonal 2C4 o HERCEPTIN® de inhibir la activación por EGF, TGF-\alpha o HRG activation de MAPK se evaluó de la siguiente manera.

Se emplearon células MCF7 (105 células/pocillo) en un medio que contenía suero en placas de cultivo de células con 12 pocillos. Al día siguiente, se extrajo el medio celular y se añadió a cada pocillo medio nuevo que contenía suero al 0,1%. Este procedimiento se repitió a continuación al siguiente día y antes del análisis el medio se sustituyó por tampón de unión libre de suero (Jones et al. J. Biol. Chem. 273: 11667-74 (1998); y Schaefer et al. J. Biol. Chem. 274: 859-66 (1999)). Las células se dejaron equilibrarse hasta temperatura ambiente y, a continuación, se incubaron durante 30 minutos con 0,5 ml de 200 nM de HERCEPTIN® o anticuerpo monoclonal 2C4. A continuación, las células se trataron con 1 nM de EGF, 1 nM de TGF-\alpha o 0,2 nM de HRG durante 15 minutos. La reacción se detuvo mediante la aspiración del medio celular y, a continuación, añadiendo 0,2 mL de tampón de muestra SDS-PAGE que contenía DTT al 1%. La activación de MAPK se evaluó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-MAPK activas (Promega) tal como se ha descrito previamente (Jones et al. J. Biol. Chem. 273: 11667-74 (1998)).

Tal como se muestra en la figura 10, el anticuepro monoclonal 2C4 bloquea significativamente la activación mediada por EGF, TGF-\alpha y HRG de MAPK en un mayor grado que HERCEPTIN®. Estos datos sugieren que el anticuerpo monoclonal 2C4 se une a la superficie de ErbB2 que se utiliza para su asociación con EGFR o ErbB3 y, de este modo, se evita la formación del complejo receptor de señalización.

También se observó que el anticuerpo monoclonal 2C4 inhibía la activación de Akt dependiente de heregulina (HRG) la activación del mecanismo de transducción de la señal de PI3 quinasa es importante para la supervivencia celular (Carraway et al. J. Biol. Chem. 270: 7111-6 (1995)). En células tumorales, la activación de PI3 quinasa puede jugar un papel en el fenotipo invasivo (Tan et al. Cancer Reearch. 59: 1620-1625, (1999)). El mecanismo de supervivencia está mediado principalmente por la AKT serina/treonina quinasa (Bos et al. Trends Biochem Sci. 20: 441-442 (1995). Los complejos formados entre ErbB2 y ErbB3 o bien EGFR pueden iniciar estos mecanismos en respuesta a heregulina o EGF, respectivamente (Olayioye et al. Mol. & Cell. Biol. 18: 5042-51 (1998); Karunagaran et al., EMBO Journal. 15: 254-264 (1996); y Krymskaya et al. Am. J. Physiol. 276: L246-55 (1999)). La incubación de células de cáncer de mama MCF7 con 2C4 inhibe la activación de Akt mediada por heregulina. Además, el nivel basal de activación de AKT presente en ausencia de adición de heregulina se reduce aún más mediante la adición de 2C4. Estos datos sugieren que 2C4 puede inhibir la activación por ligando de ErbB de la PI\cdot quinasa y que esta inhibición puede conducir a apoptosis. La mayor sensibilidad a la apoptosis se puede poner de manifiesto en una mayor sensibilidad de las células tumorales a los efectos tóxicos de la quimioterapia.

De este modo, el anticuerpo monoclonal 2C4 inhibe la señalización de ErbB iniciada por el ligando a través de dos mecanismos principales de transducción de señales - MAP quinasa (un mecanismo principal proliferativo) y PI3 quinasa (un mecanismo principal de supervivencia/anti-apoptótico).

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Ejemplo 5 Combinación de anticuerpo monoclonal 2C4 y HERCEPTIN® in vivo

Se utilizó un modelo de xenoinjerto utilizando la línea celular de adenocarcinoma de pulmón, Calu-3, para valorar la eficacia de los anticuerpos monoclonales anti-Her2, solos o en combinación, para suprimir el crecimiento tumoral. Se inocularon subcutáneamente ratones desnudos hembra NCR con 20 x 10^{6} células en 0,1 ml. Las mediciones de los tumores se tomaron dos veces por sepana y cuando los nódulos tumorales alcanzaron un volumen de 100 mm^{3}, los animales se dispusieron al azar en 7 grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento fueron:

(a) anticuerpo monoclonal de control, MAb 1766;

(b) HERCEPTIN®, 10 mg/kg;

(c) anticuerpo monoclonal 7C2, 10 mg/kg;

(d) anticuerpo monoclonal 2C4, 10 mg/kg;

(e) HERCEPTIN® y 7C2, cada uno a 10 mg/kg;

(f) HERCEPTIN® y 2C4, cada uno a 10 mg/kg; y

(g) anticuerpos monoclonales 2C4 y 7C2, cada uno a 10 mg/kg.

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Los animales se trataron dos veces por semana hasta el día 24. Se midió el volumen de los tumores dos veces por semana hasta el día 38.

Tal como se muestra en el gráfico de barras en la figura 11, el tumor Calu-3 con 2C4 o HERCEPTIN® inhibió significativamente el crecimiento de los tumores. La combinación de HERCEPTIN® y 2C4 o HERCEPTIN® y 7C2 fue superior al anticuerpo monoclonal administrado solo.

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Ejemplo 6 Tratamiento de cáncer colorrectal con anticuerpo monoclonal 2C4

Se implantaron subcutáneamente líneas células colorrectales humanas, tales como HCA-7, LS174T o CaCo-2 en ratones desnudos atímicos tal como se ha descrito en Sheng et al. J. Clin. Invest. 99: 2254-2259 (1997). Una vez los tumores presentaron un volumen de aproximadamente 100 mm^{3}, se trataron los grupos de animales con 10-50 mg/kg de anticuerpos monoclonal 2C4 administrado dos veces por semana mediante inyección en la cavidad intraperitoneal. El anticuerpo monoclonal 2C4 suprime el crecimiento de xenoinjertos colorrectales in vivo.

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Ejemplo 7 Tratamiento del cáncer de mama con 2C4 humanizado

Se evaluó el efecto de rhuMAb 2C4 o HERCEPTIN® en células de cáncer de mama humano que no sobreexpresan ErbB2 en un ensayo de 3 días con azul alamar (Ahmed, S. A. J. Immunol. Methods 170: 211-224 (1994); y Page et al. Int. J. Oncol. 3: 473-476 (1994)). Las células utilizadas en este ensayo fueron células de cáncer de mama humano MDA-175 que expresan ErbB2 en un nivel 1+. Tal como se muestra en la figura 12, el crecimiento de la línea celular de cáncer de mama, MDA-175, se inhibió significativamente de una manera dependiente de la dosis mediante la adición de rhuMAb 2C4 en comparación con el tratamiento con HERCEPTIN®.

Se evaluó la eficacia de rhuMAb 2C4 frente a xenoinjertos de MCF7 que son positivos para el receptor de estrógeno (ER+) y expresan niveles bajos de ErbB2. Se utilizaron ratones hembras suplementados con estrógeno. Se administró rhuMAb 2C4 en una dosis de 30 mg/kg cada semana. Tal como se muestra en la figura 13, rhuMAb 2C4 era eficaz en la inhibición del crecimiento de tumores del cáncer de mama in vivo, donde el cáncer de mama no estaba caracterizado por la sobreexpresión de ErbB2.

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Ejemplo 8 Farmacocinética, Metabolismo y Toxicología de 2C4

rhuMAb 2C4 era estable en suero humano. No se observaron pruebas de agregados o formación de complejos en matrices biológicas. En ratones, rhuMAb 2C4 se eliminó más rápidamente que HERCEPTIN®. Estudios farmacocinéticos indican que la administración semanal de aproximadamente 2-6 mg/kg de rhuMAb 2C4 debe dar lugar a concentraciones en suero similares a la HERCEPTIN® tal como se dosifica actualmente. La exposición de 2C4 a suero resultante debe exceder ampliamente la IC_{50} determinada in vitro.

Se llevó a cabo un estudio toxicológico en monos cinomolgus (2 machos y 2 hembras por grupo). Se administró rhuMAb 2C4 intravenosamente a 0, 10, 50 o 100 mg/kg dos veces a la semana durante 4 semanas. Las mediciones del estudio toxicológico incluyeron los pesos corporales (-2, -1 semanas y semanalmente a partir de entonces); el consumo de comida (cualitativo, diario); exámenes físicos con evaluación de la presión arterial, electrocardiograma (ECG), y temperatura corporal (-2, -1 semanas y semanas 2 y 4, 4 horas después de la dosis de la dosis de la segunda semana); evaluaciones cardíacas por ultrasonido (después de la primera dosis de la semana 1 y al final del estudio, semana 4); patología clínica (línea base y al final de las semanas 2 y 4); urinálisis (línea base y al final de las semanas 2 y 4); muestreo de análisis de anticuerpos (línea base y al final de las semanas 2 y 4); así como necropsia y análisis histopatológico.

Todos los animales en todos los grupos sobrevivieron hasta el final del estudio. No se anotaron observaciones clínicas significativas, o diferencias entre grupos. Los resultados de la necropsia no mostraron anormalidades importantes en órganos de ninguno de los animales. No se observaron anormalidades microscópicas significativas en tejidos de ninguno de los animales. No se anotaron cambios significativos en el ECG desde el inicio hasta la conclusión del estudio. Además, no se observaron diferencias entre los grupos.

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Ejemplo 9 Escalado de la dosis

A los pacientes de cáncer se les administró una primera dosis de rhuMAb 2C4 a uno de cinco niveles de dosis (0,05, 0,5, 2,0, 4,0 ó 10 mg/kg; 6 sujetos por nivel de dosis), seguida de un lavado a las 4 semanas. A los pacientes de la semana 5 se les dio la misma dosis semanalmente 4 veces seguido por un lavado a las 4 semanas. Los pacientes con respuesta completa, respuesta parcial o enfermedad estable son aptos para más estudios.

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Ejemplo 10 Terapia de cáncer de próstata metastático recidivante o refractario

RhuMAb 2C4 es un anticuerpo monoclonal, humanizado y de longitud completa (producido en células CHO) dirigido contra ErbB2. RhuMab 2C4 bloquea la asociación de ErbB2 con otros miembros de la familia ErbB inhibiendo de ese modo la señalización intracelular a través del mecanismo de ErbB. A diferencia de HERCEPTIN®, rhuMAb 2C4 no sólo inhibe el crecimiento de ErbB2 que sobreexpresa tumores, sino que también bloquea el crecimiento de tumores que requieren señalización dependiente del ligando de ErbB.

RhuMAb 2C4 está indicado como un agente único para el tratamiento de pacientes de cáncer de próstata refractario de hormonas (independiente de andrógeno). Los criterios principales para la eficacia incluyen la supervivencia global en comparación con la mejor asistencia disponible (Mitoxantrona/Prednisona), cuando se usa como un único agente, y la seguridad. Los criterios secundarios de la eficacia incluyen: tiempo para la progresión de la enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida, dolor y/o duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 se administra intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. Se suministra el anticuerpo como una formulación líquida multi-dosis (relleno de 20 mL a una concentración de 20 mg/mL o una concentración superior).

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RhuMAb 2C4 también está indicado en combinación con quimioterapia para el tratamiento de pacientes de cáncer de próstata refractaria de hormonas (independiente de andrógeno). Los criterios principales para la eficacia incluyen la supervivencia global en comparación con quimioterapia, y seguridad. Los criterios de eficacia secundarios incluyen: tiempo para la progresión de la enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida, dolor y/o duración de respuesta. RhuMAb 2C4 se administra intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. El anticuerpo se suministra como una formulación líquida multi-dosis (relleno de 20 mL a una concentración de 20 mg/mL o una concentración superior).

Ejemplos de fármacos que pueden combinarse con el anticuerpo anti-ErbB2 (que bloquea la activación por el ligando de un receptor ErbB2) para tratar el cáncer de próstata (por ejemplo cáncer de próstata independiente de andrógeno) incluyen un inhibidor de farnesil transferasa; un agente anti-angiogénico (por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF); un fármaco dirigido a EGFR (por ejemplo C225 o ZD1839); otro anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo un anticuerpo anti-ErbB2 inhibidor de crecimiento, tal como HERCEPTIN®, o un anticuerpo anti-ErbB2 que induce apoptosis, tal como 7C2 o 7F3, incluyendo variantes humanizadas o maduradas por afinidad del mismo); una citoquina (por ejemplo IL-2, IL-12, G-CSF o GM-CSF); un anti-andrógeno (tal como flutamida o acetato de ciproterona); leuprolida; suramina; un agente quimioterapéutico, tal como vinblastina, estramustina, mitoxantrona, liarozol (un agente bloqueador de metabolismo del ácido retinoico), ciclofosfomida, antibióticos de antraciclina, tal como la doxorubicina, un taxano (por ejemplo paclitaxel o docetaxel), o metotrexato, o cualquier combinación de los anteriores, tal como vinblastina/estramustina o ciclofosfamida/doxorubicina/metotrexato; prednisona; hidrocortizona; o combinaciones de los mismos. Pueden administrarse dosis estándar para estos diversos fármacos, por ejemplo 40 mg/m^{2}/semana de docetaxel (TAXOTERE®); 6 (AUC) de carboplatino; y 200 mg/m^{2} de paclitaxel (TAXOL®).

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Ejemplo 11 Terapia de Cáncer de Mama Metastático

RhuMAb 2C4 está indicado como un único agente para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastático cuyos tumores no sobreexpresan ErbB2. Los criterios principales para la eficacia incluyen la velocidad de respuesta y la seguridad. Los criterios secundarios incluyen: supervivencia global, tiempo para la progresión de la enfermedad, calidad de vida, y/o duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 se administra intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. Se suministra el anticuerpo como una formulación líquida multi-dosis (relleno de 20 mL a una concentración de 20 mg/mL o una concentración superior).

RhuMAb 2C4 también está indicado en combinación con quimioterapia para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastático cuyos tumores no sobreexpresan ErbB2. Los criterios principales para la eficacia incluyen la supervivencia global en comparación con sólo quimioterapia, y seguridad. Los criterios de eficacia secundarios incluyen: tiempo para la progresión de la enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida, y/o duración de respuesta. RhuMAb 2C4 se administran intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. El anticuerpo se suministra como una formulación líquida multi-dosis (relleno de 20 mL a una concentración de 20 mg/mL o una concentración superior).

Ejemplos de fármacos que pueden combinarse con el anticuerpo anti-ErbB2 (que bloquea la activación por ligando de un receptor ErbB2) para tratar el cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama metastático que no está caracterizado por la sobreexpresión de ErbB2) incluyen agentes quimioterapéuticos, tales como antibióticos de antraciclina (por ejemplo doxorubicina), ciclofosfomida, un taxano (por ejemplo paclitaxel o docetaxel), navelbine, xeloda, mitomicina C, un compuesto de platino, oxaliplatino, gemcitabina, o combinaciones de dos o más de estos, tales como doxorubicina/ciclofosfomida; otro anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-ErbB2 inhibidor de crecimiento, tal como HERCEPTIN®, o un anticuerpo anti-ErbB2 que induce la apoptosis, tal como 7C2 o 7F3, incluyendo variantes humanizadas o maduradas por afinidad del mismo); un anti-estrógeno (por ejemplo, tamoxifeno); un inhibidor de farnesil transferasa; un agente anti-angiogénico (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF); un fármaco dirigido a EGFR (por ejemplo, C225 o ZD1839); una citoquina (por ejemplo IL-2, IL-12, G-CSF o GM-CSF); o combinaciones de los anteriores. Pueden utilizarse dosis estándar para dichos fármacos adicionales.

RhuMAb 2C4 está adicionalmente indicado en combinación con HERCEPTIN® para el tratamiento de pacientes de cáncer de mama metastático cuyos tumores sobrexpresan ErbB2. Los criterios principales para la eficacia incluyen la velocidad de respuesta, y la seguridad. Los criterios de eficacia secundarios incluyen: tiempo para la progresión de la enfermedad, supervivencia global en comparación con HERCEPTIN® solo, calidad de vida, y/o duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 se administra intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. Se suministra el anticuerpo como una formulación líquida multi-dosis (relleno de 20 mL a una concentración de 20 mg/mL o una concentración superior). HERCEPTIN® se administra IV como una dosis de carga inicial de 4 mg/kg seguida de una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg. HERCEPTIN® se suministra como un polvo liofilizado. Cada vial de HERCEPTIN® contiene 440 mg de HERCEPTIN®, 9,9 mg de L-histidina HCl, 6,4 mg de L-histidina, 400 mg de \alpha-\alpha-trealosa dihidrato, y 1,8 mg de polisorbato 20. La reconstitución con 20 mL de Agua Bacteriostática para Inyección (BWFI) que contiene alcohol bencílico al 1,1% como conservante, produce 21 mL de una solución multi-dosis que contiene 21 mg/mL de HERCEPTIN®, a un pH de aproximadamente 6,0.

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Ejemplo 12 Terapia del Cáncer de Pulmón

RhuMAb 2C4 está indicado como un único agente para el tratamiento de las etapas IIIb o IV de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Los criterios principales para la eficacia incluyen la velocidad de respuesta, y la seguridad. Los criterios de eficacia secundarios incluyen: la supervivencia global, tiempo para la progresión de la enfermedad, calidad de vida, y/o duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 se administra intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. Se suministra el anticuerpo como una formulación líquida multi-dosis (relleno de 20 mL a una concentración de 20 mg/mL o una concentración superior).

RhuMAb 2C4 también está indicado en combinación con quimioterapia para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas metastático. Los criterios principales para la eficacia incluyen la supervivencia global en comparación con la terapia estándar, y la seguridad. Los criterios de eficacia secundarios incluyen: tiempo para la progresión de la enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida y/o duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 se administra intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. Se suministra el anticuerpo como una formulación líquida multi-dosis (relleno de 20 mL a una concentración de 20 mg/mL o una concentración superior).

Ejemplos de fármacos adicionales que pueden combinarse con el anticuerpo (que une ErbB2 y bloquea la activación por el ligando de un receptor ErbB) para tratar el cáncer de pulmón, incluyen agentes quimioterapéuticos, tales como carboplatino, un taxano (por ejemplo, paclitaxel o docetaxel), gemcitabina, navelbine, cisplatino, oxaliplatino, o combinaciones de cualquiera de estos, tales como carboplatino/docetaxel; otro anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-ErbB2 inhibidor del crecimiento, tal como HERCEPTIN®, o un anticuerpo anti-ErbB2 que induce la apoptosis, tal como 7C2 o 7F3, incluyendo variantes humanizadas o maduradas por afinidad del mismo); un inhibidor de farnesil transferasa; un agente anti-angiogénico (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF); un fármaco dirigido a EGFR (por ejemplo, C225 o ZD1839); una citoquina (por ejemplo, IL-2, IL-12, G-CSF o GM-CSF); o combinaciones de los anteriores.

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Ejemplo 13 Terapia de cáncer colorrectal

RhuMAb 2C4 está indicado como un único agente para el tratamiento del cáncer colorrectal metastático. Los criterios principales para la eficacia incluyen la velocidad de respuesta y la seguridad. Los criterios de eficacia secundarios incluyen: supervivencia global, tiempo para la progresión de la enfermedad, calidad de vida, y/o duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 se administra intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. Se suministra el anticuerpo como una formulación líquida multi-dosis (relleno de 20 ml a una concentración de 20 mg/mL o una concentración mayor).

RhuMAb 2C4 también está indicado en combinación con quimioterapia para el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal metastático. Los criterios principales para la eficacia incluyen la supervivencia global en comparación con la terapia estándar, y la seguridad. Los criterios de eficacia secundarios incluyen: tiempo para la progresión de la enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida y/o duración de la respuesta. RhuMAb 2C4 se administra intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta la progresión de la enfermedad. Se suministra el anticuerpo como una formulación líquida multi-dosis (relleno de 20 ml a una concentración de 20 mg/mL o una concentración mayor).

Ejemplos de agentes quimioterapéuticos utilizados para tratar el cáncer colorrectal, que pueden combinarse con el anticuerpo que se une a ErbB2 y bloquea la activación por el ligando de un receptor ErbB, incluyen 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina (LV), CPT-11, levamisol, o combinaciones de dos o más de cualquiera de estos, por ejemplo, 5-FU/LV/CPT-11. Pueden administrarse dosis estándar de dichos agentes quimioterapéuticos. Otros fármacos que pueden combinarse con el anticuerpo anti-ErbB2 para tratar el cáncer colorrectal incluyen un inhibidor de farnesil transferasa; un agente anti-angiogénico (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF); un fármaco dirigido a EGFR (por ejemplo, C225 o ZD1839); una citoquina (por ejemplo, IL-2, IL-12, G-CSF o GM-CSF); otro anticuerpo anti-ErbB2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-ErbB2 inhibidor del crecimiento, tal como HERCEPTIN®, o un anticuerpo anti-ErbB2 que induce la apoptosis, tal como 7C2 o 7F3, incluyendo variantes humanizadas o maduradas por afinidad del mismo); o combinaciones de los anteriores.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 4968603 A [0004]

\bullet WO 9422478 A [0005]

\bullet US 5824311 A [0005]

\bullet US 5677171 A [0006] [0072] [0164]

\bullet US 5821337 A [0007] [0050] [0064] [0070] [0134] [0275] [0289]

\bullet WO 9400136 A [0008]

\bullet US 5783186 A [0008]

\bullet US 5183884 A [0009] [0034]

\bullet US 5480968 A [0009] [0034]

\bullet EP 599274 A [0009] [0035]

\bullet US 5641869 A [0010] [0037] [0037]

\bullet WO 8906692 A [0012]

\bullet WO 9817797 A [0013]

\bullet WO 9931140 A [0014]

\bullet WO 9919488 A [0035]

\bullet US 4816567 A [0044] [0045] [0108] [0118] [0120]

\bullet US 5500362 A [0050]

\bullet WO 9316185 A [0061] [0132]

\bullet US 5571894 A [0061] [0132]

\bullet US 5587458 A [0061] [0132]

\bullet EP 404097 A [0062]

\bullet WO 9311161 A [0062]

\bullet WO 9321319 A [0064]

\bullet WO 9845479 A [0087]

\bullet US 4933294 A [0087]

\bullet WO 9105264 A [0087]

\bullet US 5401638 A [0087]

\bullet US 4943533 A [0093]

\bullet WO 9640210 A [0093]

\bullet US 5212290 A [0093]

\bullet US 5891996 A [0093]

\bullet WO 9850433 A [0093]

\bullet EP 659439 A2 [0093]

\bullet US 5591669 A [0128]

\bullet US 5589369 A [0128]

\bullet US 5545807 A [0128]

\bullet US 5565332 A [0129]

\bullet US 5573905 A [0129]

\bullet US 5567610 A [0130]

\bullet US 5229275 A [0130]

\bullet US 5772997 A [0131]

\bullet WO 9700271 A [0131]

\bullet US 5641870 A [0132]

\bullet WO 9616673 A [0134]

\bullet US 5837234 A [0134]

\bullet WO 9802463 A [0134]

\bullet WO 9308829 A [0135]

\bullet WO 9404690 A [0137]

\bullet US 5731168 A [0138]

\bullet US 4676980 A [0139] [0139]

\bullet WO 9100360 A [0139]

\bullet WO 92200373 A [0139]

\bullet EP 03089 A [0139]

\bullet US 5739277 A [0156]

\bullet US 5766963 A [0160]

\bullet US 5208020 A [0170]

\bullet US 5714586 A [0172]

\bullet US 5712374 A [0172]

\bullet US 5264586 A [0172]

\bullet US 5773001 A [0172]

\bullet WO 9321232 A [0173]

\bullet WO 9411026 A [0176] [0205]

\bullet WO 8101145 A [0179]

\bullet WO 8807378 A [0179]

\bullet US 4975278 A [0179]

\bullet US 4485045 A [0184]

\bullet US 4544545 A [0184]

\bullet WO 9738731 A [0184]

\bullet US 5013556 A [0184]

\bullet WO 9013646 A [0188]

\bullet US 4965199 A [0195]

\bullet EP 73657 A [0201]

\bullet US 4419446 A [0203]

\bullet US 4601978 A [0203]

\bullet DD 266710 [0206]

\bullet EP 402226 A [0207]

\bullet EP 183070 A [0207]

\bullet EP 244234 A [0207]

\bullet US 4767704 A [0212]

\bullet US 4657866 A [0212]

\bullet US 4927762 A [0212]

\bullet US 4560655 A [0212]

\bullet US 5122469 A [0212]

\bullet WO 9003430 A [0212]

\bullet WO 8700195 A [0212]

\bullet US RE30985 E [0212]

\bullet WO 9704801 A [0216]

\bullet US 3773919 A [0219]

\bullet EP 616812 A [0236]

\bullet WO 9607321 A [0241]

\bullet US 4892538 A [0242]

\bullet US 5283187 A [0242]

\bullet WO 9325673 A [0243]

\bullet US 4275149 A [0248] [0250]

\bullet US 4737456 A [0248]

\bullet US 4318980 A [0250]

\bullet WO 9014357 A [0277]

\bullet US 60141316 B [0318]

\newpage

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bulletBaselga; Mendelsohn. Pharmac. Ther., 1994, vol. 64, 127-154 [0003]

\bulletMasui et al. Cancer Research, 1984, vol. 44, 1002-1007 [0003]

\bulletWu et al. J. Clin. Invest., 1985, vol. 95, 1897-1905 [0003]

\bulletSlamon et al. Science, 1987, vol. 235, 177-182 [0004]

\bulletSlamon et al. Science, 1989, vol. 244, 707-712 [0004]

\bulletKing et al. Science, 1985, vol. 229, 974 [0004]

\bulletYokota et al. Lancet, 1986, vol. 1, 765-767 [0004]

\bulletFukushigi et al. Mol Cell Biol., 1986, vol. 6, 955-958 [0004]

\bulletGeurin et al. Oncogene Res., 1988, vol. 3, 21-31 [0004]

\bulletCohen et al. Oncogene, 1989, vol. 4, 81-88 [0004]

\bulletYonemura et al. Cancer Res., 1991, vol. 51, 1034 [0004]

\bulletBorst et al. Gynecol. Oncol., 1990, vol. 38, 364 [0004]

\bulletWeiner et al. Cancer Res., 1990, vol. 50, 421-425 [0004]

\bulletKern et al. Cancer Res., 1989, vol. 49, 6605 [0004]

\bulletZhau et al. Mol. Carcinog., 1990, vol. 3, 354-357 [0004]

\bulletAasland et al. Br. J. Cancer, 1988, vol. 57, 358-363 [0004]

\bulletWilliams et al. Pathiobiology, 1991, vol. 59, 46-52 [0004]

\bulletMcCann et al. Cancer, 1990, vol. 65, 88-92 [0004]

\bulletGu et al. Cancer Lett., 1996, vol. 99, 185-9 [0004]

\bulletRoss et al. Hum. Pathol., 1997, vol. 28, 827-33 [0004]

\bulletRoss et al. Cancer, 1997, vol. 79, 2162-70 [0004]

\bulletSadasivan et al. J. Urol., 1993, vol. 150, 126-31 [0004]

\bulletDrebin et al. Cell, 1985, vol. 41, 695-706 [0005]

\bulletMyers et al. Meth. Enzym., 1991, vol. 198, 277-290 [0005]

\bulletDrebin et al. Oncogene, 1988, vol. 2, 273-277 [0005]

\bulletHudziak et al. Mol. Cell. Biol., 1989, vol. 9 (3), 1165-1172 [0006]

\bulletFendly et al. Cancer Research, 1990, vol. 50, 1550-1558 [0006] [0258] [0260] [0265]

\bulletKotts et al. In Vitro, 1990, vol. 26 (3), 59A [0006]

\bulletSarup et al. Growth Regulation, 1991, vol. 1, 72-82 [0006]

\bulletShepard et al. J. Clin. Immunol., 1991, vol. 11 (3), 117-127 [0006]

\bulletKumar et al. Mol. Cell. Biol., 1991, vol. 11 (2), 979-986 [0006]

\bulletLewis et al. Cancer Immunol. Immunother, 1993, vol. 37, 255-263 [0006] [0268]

\bulletPietras et al. Oncogene, 1994, vol. 9, 1829-1838 [0006]

\bulletVitetta et al. Cancer Research, 1994, vol. 54, 5301-5309 [0006]

\bulletSliwkowski et al. J. Biol. Chem., 1994, vol. 269 (20), 14661-14665 [0006]

\bulletScott et al. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 14300-5 [0006]

\bulletD'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, vol. 91, 7202-7206 [0006]

\bulletLewis et al. Cancer Research, 1996, vol. 56, 1457-1465 [0006] [0030] [0030] [0262] [0266] [0267]

\bulletSchaefer et al. Oncogene, 1997, vol. 15, 1385-1394 [0006] [0010] [0037] [0162] [0268]

\bulletBaselga et al. J. Clin. Oncol., 1996, vol. 14, 737-744 [0007]

\bulletTagliabue et al. Int. J. Cancer, 1991, vol. 47, 933-937 [0008]

\bulletMcKenzie et al. Oncogene, 1989, vol. 4, 543-548 [0008]

\bulletMaier et al. Cancer Res., 1991, vol. 51, 5361-5369 [0008]

\bulletBacus et al. Molecular Carcinogenesis, 1990, vol. 3, 350-362 [0008]

\bulletStancovski et al. PNAS (USA), 1991, vol. 88, 8691-8695 [0008] [0104]

\bulletBacus. Cancer Research, 1992, vol. 52, 2580-2589 [0008]

\bulletXu et al. Int. J. Cancer, vol. 53, 401-408 [0008]

\bulletKasprzyk et al. Cancer Research, 1992, vol. 52, 2771-2776 [0008]

\bulletHancock et al. Cancer Res, 1991, vol. 51, 4575-4580 [0008]

\bulletShawver et al. Cancer Res., 1994, vol. 54, 1367-1373 [0008]

\bulletArteaga et al. Cancer Res., 1994, vol. 54, 3758-3765 [0008]

\bulletHarwerth et al. J. Biol. Chem, 1992, vol. 267, 15160-15167 [0008]

\bulletKlapper et al. Oncogene, 1997, vol. 14, 2099-2109 [0008] [0067]

\bulletKraus et al. PNAS (USA), 1989, vol. 86, 9193-9197 [0009] [0034]

\bulletPlowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 1746-1750 [0009] [0035]

\bulletPlowman et al. Nature, 1993, vol. 366, 473-475 [0009] [0035]

\bulletEarp et al. Breast Cancer Research and Treatment, 1995, vol. 35, 115-132 [0010]

\bulletGroenen et al. Growth Factors, 1994, vol. 11, 235-257 [0010] [0010]

\bulletHolmes et al. Science, 1992, vol. 256, 1205-1210 [0010] [0037] [0264]

\bulletLemke, G. Molec. & Cell. Neurosci., 1996, vol. 7, 247-262 [0010]

\bulletLee et al. Pharm. Rev., 1995, vol. 47, 51-85 [0010]

\bulletChang et al. Nature, 1997, vol. 387, 509-512 [0010]

\bulletCarraway et al. Nature, 1997, vol. 387, 512-516 [0010] [0036]

\bulletZhang et al. PNAS (USA), 1997, vol. 94 (18), 9562-7 [0010]

\bulletHarari et al. Oncogene, 1999, vol. 18, 2681-89 [0010] [0036]

\bulletSliwkowski et al. J. Biol. Chem, 1994, vol. 269 (20), 14661-14665 [0011] [0038]

\bulletLevi et al. Journal of Neuroscience, 1995, vol. 15, 1329-1340 [0011]

\bulletMorrissey et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, 1431-1435 [0011]

\bulletLewis et al. Cancer Res, 1996, vol. 56, 1457-1465 [0011]

\bulletCarraway; Cantley. Cell, 1994, vol. 78, 5-8 [0011]

\bulletNakamura et al. J. of Virology, 1993, vol. 67 (10), 6179-6191 [0030]

\bulletRenz et al. J. Cell Biol, 1994, vol. 125 (6), 1395-1406 [0030]

\bulletCarpenter et al. Ann. Rev. Biochem., 1987, vol. 56, 881-914 [0032]

\bulletHumphrey et al. PNAS (USA), 1990, vol. 87, 4207-4211 [0032]

\bulletSemba et al. PNAS (USA), 1985, vol. 82, 6497-6501 [0033]

\bulletYamamoto et al. Nature, 1986, vol. 319, 230-234 [0033]

\bullet Genebank. X03363 [0033]

\bulletSavage et al. J. Biol. Chem, 1972, vol. 247, 7612-7621 [0036]

\bulletMarquardt et al. Science, 1984, vol. 223, 1079-1082 [0036]

\bulletShoyab et al. Science, 1989, vol. 243, 1074-1076 [0036]

\bulletKimura et al. Nature, 1990, vol. 348, 257-260 [0036]

\bulletCook et al. Mol. Cell, 1991, vol. 11, 2547-2557 [0036]

\bulletShing et al. Science, 1993, vol. 259, 1604-1607 [0036]

\bulletSasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, vol. 190, 1173 [0036]

\bulletHigashiyama et al. Science, 1991, vol. 251, 936-939 [0036]

\bulletToyoda et al. J. Biol. Chem, 1995, vol. 270, 7495-7500 [0036]

\bulletKomurasaki et al. Oncogene, 1997, vol. 15, 2841-2848 [0036]

\bulletZhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, vol. 94, 9562-9567 [0036]

\bulletKannan et al. J. Biol. Chem, 1997, vol. 272 (6), 3330-3335 [0036]

\bulletMarchionni et al. Nature, 1993, vol. 362, 312-318 [0037] [0037]

\bulletPeles et al. Cell, 1992, vol. 69, 205-216 [0037]

\bulletFalls et al. Cell, 1993, vol. 72, 801-815 [0037]

\bulletHo et al. J. Biol. Chem, 1995, vol. 270, 14523-14532 [0037]

\bulletKohler et al. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0044] [0108]

\bulletClackson et al. Nature, 1991, vol. 352, 624-628 [0044] [0117] [0129]

\bulletMarks et al. J. Mol. Biol, 1991, vol. 222, 588-597 [0044]

\bulletMorrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 6851-6855 [0045]

\bulletRavetch; Kinet. Annu. Rev. Immunol, 1991, vol. 9, 457-92 [0050] [0052]

\bulletClynes et al. PNAS (USA), 1998, vol. 95, 652-656 [0050]

\bullet M. in Daëron. Annu. Rev. Immunol., 1997, vol. 15, 203-234 [0052]

\bulletCapel et al. Immunomethods, 1994, vol. 4, 25-34 [0052]

\bulletHaas et al. J. Lab. Clin. Med., 1995, vol. 126, 330-41 [0052]

\bulletGuyer et al. J. Immunol, 1994, vol. 117, 587 [0052]

\bulletKim et al. J. Immunol., 1994, vol. 24, 249 [0052]

\bulletGazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods, 1996, vol. 202, 163 [0053]

\bulletKabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. Public Health Service, National Institutes of Health, 1991 [0055] [0056]

\bulletChothia; Lesk. J. Mol. Biol., 1987, vol. 196, 901-917 [0056]

\bullet The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Springer-Verlag, 1994, vol. 113, 269-315 [0061]

\bulletHollinger et al. Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 6444-6448 [0062]

\bulletJones et al. Nature, 1986, vol. 321, 522-525 [0063] [0120]

\bulletRiechmann et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-327 [0063] [0120]

\bulletPresta. Curr. Op. Struct. Biol., 1992, vol. 2, 593-596 [0063]

\bulletSchecter et al. Nature, 1984, vol. 312, 513 [0066]

\bulletDrebin et al. Nature, 1984, vol. 312, 545-548 [0066]

\bullet Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs. Murakami et al. The Molecular Basis of Cancer. 1995, 13 [0071]

\bulletMoore et al. Cytotechnology, 1995, vol. 17, 1-11 [0073]

\bullet Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 [0075] [0078] [0168]

\bullet Antibodies. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 [0076]

\bulletSias et al. J. Immunol. Methods, 1990, vol. 132, 73-80 [0087]

\bulletWilman. Prodrugs in Cancer Chemotherapy. Biochemical Society Transactions, 1986, vol. 14, 375-382 [0096]

\bullet Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery. Stella et al. Directed Drug Delivery. Humana Press, 1985, 247-267 [0096]

\bulletSeifert et al. The Annals of Pharmacotherapy, 1994, vol. 28, 1063-1072 [0099]

\bulletSingal et al. J. Mol. Cell Cardiol., 1995, vol. 27, 1055-1063 [0099]

\bulletGreen et al. Cancer Research, 1994, vol. 54, 738-741 [0099]

\bulletBristow, M.R. Drug-Induced Heart Disease. Elsevier, 1980, 191-215 [0099]

\bulletHjalmarson et al. Drugs, 1994, vol. 47 (4), 31-9 [0099]

\bulletShaddy et al. Am. Heart J., 1995, vol. 129, 197-9 [0099]

\bulletParacchini et al. Anticancer Res., 1993, vol. 13, 1607-1612 [0099]

\bulletGoding. Monoclonal Antibodies Principles and Practice. Academic Press, 1986, 59-103 [0109]

\bulletKozbor. J. Immunol., 1984, vol. 133, 3001 [0111]

\bulletBrodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc, 1987, 51-63 [0111]

\bulletMunson et al. Anal. Biochem., 1980, vol. 107, 220 [0113]

\bulletGoding. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press, 1986, 59-103 [0114]

\bulletSkerra et al. Curr. Opinion in Immunol., 1993, vol. 5, 256-262 [0116]

\bulletPlückthun. Immunol. Revs., 1992, vol. 130, 151-188 [0116]

\bulletMcCafferty et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-554 [0117]

\bulletMarks et al. J. Mol. Biol, 1991, vol. 222, 581-597 [0117] [0129]

\bulletMarks et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 779-783 [0117]

\bulletWaterhouse. Nuc. Acids. Res., 1993, vol. 21, 2265-2266 [0117]

\bulletMorrison et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 6851 [0118]

\bulletVerhoeyen et al. Science, 1988, vol. 239, 1534-1536 [0120]

\bulletSims et al. J. Immunol., 1993, vol. 151, 2296 [0121]

\bulletChothia et al. J. Mol. Biol., 1987, vol. 196, 901 [0121]

\bulletCarter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 4285 [0121]

\bulletPresla et al. J. Immunol., 1993, vol. 151, 2623 [0121]

\bulletJakobovits et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 2551 [0128]

\bulletJakobovits. Nature, 1993, vol. 362, 255-258 [0128]

\bulletBruggermann et al. Year in Immuno., 1993, vol. 7, 33 [0128]

\bulletMcCafferty et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-553 [0129]

\bulletJohnson, Kevin S.; Chiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology, 1993, vol. 3, 564-571 [0129]

\bulletGriffith et al. EMBO J, 1993, vol. 12, 725-734 [0129]

\bulletMorimoto et al. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 1992, vol. 24, 107-117 [0132]

\bulletBrennan et al. Science, 1985, vol. 229, 81 [0132] [0140]

\bulletCarter et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 163-167 [0132] [0213]

\bulletMillstein et al. Nature, 1983, vol. 305, 537-539 [0135]

\bulletTraunecker et al. EMBO J, 1991, vol. 10, 3655-3659 [0135]

\bulletSuresh et al. Methods in Enzymology, 1986, vol. 121, 210 [0137]

\bulletShalaby et al. J. Exp. Med, 1992, vol. 175, 217-225 [0141]

\bulletKostelny et al. J. Immunol, 1992, vol. 148 (5), 1547-1553 [0142]

\bulletHollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 6444-6448 [0142]

\bulletGruber et al. J. Immunol., 1994, vol. 152, 5368 [0142]

\bulletTutt et al. J. Immunol., 1991, vol. 147, 60 [0143]

\bulletCunningham; Wells. Science, 1989, vol. 244, 1081-1085 [0145]

\bulletCaron et al. J. Exp Med, 1992, vol. 176, 1191-195 [0155]

\bulletShopes, B. J. Immunol, 1992, vol. 148, 2918-2922 [0155]

\bulletWolff et al. Cancer Research, 1993, vol. 53, 2560-2565 [0155]

\bulletStevenson et al. Anti-Cancer Drug Design, 1989, vol. 3, 219-230 [0155]

\bulletChari et al. Cancer Research, 1992, vol. 52, 127-131 [0176]

\bulletHinman et al. Cancer Research, 1993, vol. 53, 3336-3342 [0172]

\bulletLode et al. Cancer Research, 1998, vol. 58, 2925-2928 [0172]

\bulletMassey. Nature, 1987, vol. 328, 457-458 [0181]

\bulletNeuberger et al. Nature, 1984, vol. 312, 604-608 [0182]

\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0183] [0216]

\bulletEpstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 3688 [0184]

\bulletHwang et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4030 [0184]

\bulletMartin et al. J. Biol. Chem, 1982, vol. 257, 286-288 [0185]

\bulletGabizon et al. J. National Cancer Inst., 1989, vol. 81 (19), 1484 [0185]

\bullet Van den Berg. Bio/Technology, 1990, vol. 8, 135 [0197]

\bulletFleer et al. Bio/Technology, 1991, vol. 9, 968-975 [0197]

\bulletReyes et al. Nature, 1982, vol. 297, 598-601 [0203]

\bulletYaniv. Nature, 1982, vol. 297, 17-18 [0204]

\bulletGraham et al. J. Gen Virol., 1977, vol. 36, 59 [0210]

\bulletCHO; Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0210]

\bulletTM4; Mather. Biol. Reprod., 1980, vol. 23, 243-251 [0210]

\bulletMather et al. Annals N. Y. Acad. Sci., 1982, vol. 383, 44-68 [0210]

\bulletHam et al. Meth. Enz., 1979, vol. 58, 44 [0212]

\bulletBarnes et al. Anal. Biochem, 1980, vol. 102, 255 [0212]

\bulletLindmark et al. J. Immunol. Meth., 1983, vol. 62, 1-13 [0214]

\bulletGuss et al. EMBO J., 1986, vol. 5, 15671575 [0214]

\bulletScher et al. Clin. Cancer Research, 1995, vol. 1, 545-550 [0227]

\bullet Chemotherapy Service. Williams & Wilkins, 1992 [0235]

\bulletWu et al. J. Biol. Chem, 1987, vol. 262, 4429-4432 [0243]

\bulletWagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, 3410-3414 [0243]

\bulletAnderson et al. Science, 1992, vol. 256, 808-813 [0243]

\bullet Current Protocols in Immunology. Wiley-Interscience, 1991, vol. 1, 2 [0248]

\bullet Methods in Enzym. Academic press, 1981, vol. 73, 147-166 [0248]

\bulletZola. Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc, 1987, 147-158 [0253]

\bulletHudziak et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1987, vol. 84, 7158-7163 [0258]

\bulletHudziak et al. Molec. Cell. Biol., 1989, vol. 9 (3), 1165-1172 [0261]

\bulletSugarman et al. Science, 1985, vol. 230, 943-945 [0261]

\bulletSliwkowski et al. J. Biol. Chem., 1994, vol. 269, 14661-14665 [0264]

\bulletCarter et al. PNAS (USA), 1992, vol. 89, 4285 [0275]

\bulletWerther et al. J. Immunol., 1996, vol. 157, 4986-4995 [0275]

\bulletPresta et al. Cancer Research, 1997, vol. 57, 4593-4599 [0275] [0277]

\bulletBaca et al. J Biol Chem., 1997, vol. 272, 10678 [0280]

\bulletJones et al. J. Biol. Chem., 1998, vol. 273, 11667-74 [0291]

\bulletSchaefer et al. J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, 859-66 [0291]

\bulletCarraway et al. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 7111-6 [0293]

\bulletTan et al. Cancer Reearch., 1999, vol. 59, 1620-1625 [0293]

\bulletBos et al. Trends Biochem Sci., 1995, vol. 20, 441-442 [0293]

\bulletOlayioye et al. Mol. & Cell. Biol., 1998, vol. 18, 5042-51 [0293]

\bulletKarunagaran et al. EMBO Journal, 1996, vol. 15, 254-264 [0293]

\bulletKrymskaya et al. Am. J. Physiol., 1999, vol. 276, L246-55 [0293]

\bulletSheng et al. J. Clin. Invest., 1997, vol. 99, 2254-2259 [0297]

\bulletAhmed, S. A. J. Immunol. Methods, 1994, vol. 170, 211-224 [0298]

\bulletPage et al. Int. J. Oncol., 1994, vol. 3, 473-476 [0298]

<110> Genentech, Inc.

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Anticuerpos anti-ErbB2 humanizados y tratamiento con anticuerpos anti-ErbB2

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> P1467R2PCT

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\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2000-06-23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/141,316

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-06-25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus Musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

8

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1-119

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fab 574 VH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> aminoácido desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no seguro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5-7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> aminoácido desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 645

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

Claims (17)

1. Anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio pesado variable (VH) de SEC ID No. 4 y la secuencia de aminoácidos del dominio ligero variable (VL) de SEC ID No. 3.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo IgG1 intacto.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, que es un fragmento de anticuerpo.

4. Anticuerpo según la reivindicación 3, que es un fragmento Fab.

5. Formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un portador farmacéuticamente aceptable.

6. Formulación farmacéutica según la reivindicación 5, que es una solución acuosa.

7. Formulación farmacéutica según la reivindicación 5, que está liofilizada.

8. Inmunoconjugado que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 conjugado con un agente citotóxico.

9. Ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

10. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 9.

11. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 10.

12. Célula huésped según la reivindicación 11, que es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

13. Proceso de producción de un anticuerpo que comprende cultivar una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, de manera que se expresa el ácido nucleico y se produce el anticuerpo.

14. Proceso según la reivindicación 13, que comprende además la recuperación del anticuerpo del cultivo de células huésped.

15. Proceso según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo se recupera del medio de cultivo de células huésped.

16. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la célula huésped es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

17. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, que comprende además mezclar el anticuerpo recuperado con un portador, excipiente o estabilizador farmacéuticamente aceptable para preparar una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo.