HU226742B1 - Humanized anti-erbb2 antibodies and treatment with anti-erbb2 antibodies - Google Patents

Humanized anti-erbb2 antibodies and treatment with anti-erbb2 antibodies Download PDF

Info

Publication number
HU226742B1
HU226742B1 HU0201695A HUP0201695A HU226742B1 HU 226742 B1 HU226742 B1 HU 226742B1 HU 0201695 A HU0201695 A HU 0201695A HU P0201695 A HUP0201695 A HU P0201695A HU 226742 B1 HU226742 B1 HU 226742B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
erbb2
cells
antibodies
cancer
Prior art date
Application number
HU0201695A
Other languages
English (en)
Inventor
Camellia W Adams
Leonard G Presta
Mark Sliwkowsky
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22495168&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU226742(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of HUP0201695A2 publication Critical patent/HUP0201695A2/hu
Publication of HUP0201695A3 publication Critical patent/HUP0201695A3/hu
Publication of HU226742B1 publication Critical patent/HU226742B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medical Preparation Storing Or Oral Administration Devices (AREA)
  • Packages (AREA)

Description

A találmány tárgyát képezik a humanizált antiErbB2 antitestek, valamint az ilyen antitestek alkalmazása rákos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti anti-ErbB antitestet tartalmazó készítményeket hordozó termékek; továbbá a találmány szerinti anti-ErbB2 antitestet kódoló izolált nukleinsavak; az ilyen nukleinsavakat hordozó vektorok; valamint az ilyen vektorokat tartalmazó gazdasejtek. Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti humanizált antitestek előállítási eljárásai.
A receptor tirozin-kinázok ErbB-családjának tagjai a sejtszaporodás, -differenciáció és -túlélés fontos mediátorai. A receptorcsalád négy tagból áll, melyek a következők: epidermális növekedési faktor receptor (EGFR vagy ErbB1); HER2 (ErbB2 vagy p185neu); HER3 (ErbB3); és HER4 (Erb4 vagy tyro2).
Az EGFR (melyet az erőB1-gén kódol) jelenlétét időnként humán malignáns betegségek esetében mutatták ki. Valójában az EGFR fokozott mértékű termelődését emlő, húgyhólyag, tüdő, fej, nyak és gyomor rákos megbetegedésénél, illetve glioblasztómákban figyelték meg. Az EGFR-receptor fokozott mértékű termelődése gyakran az EGFR-ligandum, a transzformáló növekedési faktor-α (TGF-a) ugyanazon tumorsejtek általi megnövekedett szintű termelésével függ össze, ami autokrin stimulációs reakcióút révén eredményezi a receptor aktiválását [Baselga és Mendelsohn: Pharmac. Ther. 64, 127 (1994)]. Az EGFR vagy ligandumai (TGF-α és EGF) elleni monoklonális antitesteket az ilyen malignáns betegségek kezelésére szolgáló terápiás hatóanyagokként tanulmányozták [ld. Baselga és Mendelsohn: Pharmac. Ther. 64, 127 (1994); Masui és mtsai.: Cancer Research 44, 1002 (1984); Wu és mtsai.: J. Clin. Invest. 95, 1897 (1995)].
Az ErbB-család második tagját, a p185neu-t, eredetileg vegyszerrel kezelt patkányok neuroblasztómáiból származó transzformáló gének termékeként azonosították. A neu protoonkogén aktivált alakja a kódolót protein transzmembránrégiójában bekövetkezett pontmutáció (valin->glutaminsav) eredménye. A neu humán homológjának sokszorozódását megfigyelték emlőrákokban és petefészekrákokban, és ez rossz prognózissal volt összefüggésben [Slamon és mtsai.: Science 235, 177 (1987); Slamon és mtsai.: Science 244, 707 (1989); és 4 968 603 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Mind ez idáig humán tumorokban a neu protoonkogénben lévőhöz hasonló pontmutációról nem számoltak be. Az ErbB2 túlzott mértékű termelődését (amely gyakran, de nem egységesen, génamplifikáció eredménye) más carcinomák esetében is megfigyelték, többek között a gyomor, endometrium, nyálmirigy, tüdő, vese, vastagbél, pajzsmirigy, hasnyálmirigy és húgyhólyag carcinomáiban [ld. pl. King és mtsai.: Science 229, 974 (1985); Yokota és mtsai.: Láncét. 1, 765 (1986); Fukushigi és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 6, 955 (1986); Geurin és mtsai.: Oncogene Rés. 3, 21 (1988); Cohen és mtsai.: Oncogene 4, 81 (1989); Yonemura és mtsai.: Cancer Rés. 51, 1034 (1991); Borst és mtsai.: Gynecol. Oncol. 38, 364 (1990); Weiner és mtsai.: Cancer Rés. 50, 421 (1990); Kern és mtsai.: Cancer Rés. 50, 5184 (1990); Park és mtsai.: Cancer Rés. 49, 6605 (1989); Zhau és mtsai.: Mól. Carcinog. 3, 354 (1990); Aasland és mtsai.: Br. J. Cancer 57, 358 (1988); Williams és mtsai.: Pathobiology 59, 46 (1991); és McCann és mtsai.: Cancer 65, 88 (1990)]. Az ErbB2-receptor prosztatadaganatokban túlzott mértékben termelődhet [Gu és mtsai.: Cancer Lett. 99, 185 (1996); Ross és mtsai.: Hűm. Pathol. 28, 827 (1997); Ross és mtsai.: Cancer 79, 2162 (1997); és Sadasivan és mtsai.: J. Ural. 150, 126 (1993)].
Korábban patkányeredetű p185neu és humán ErbB2-proteinek elleni antitesteket is feltártak. Drebin és mtsai. a patkányeredetű neu-géntermék, a p185neu elleni antitesteket hoztak létre [ld. pl. Drebin és mtsai.: Cell 41, 695 (1985); Myers és mtsai.: Meth. Enzym. 198, 277 (1991); és WO 94/22478 számú nemzetközi közzétételi irat], Drebin és mtsai. [Oncogene 2, 273 (1988)] beszámoltak arról, hogy a p185neu két külön régiójával reaktív antitestek elegye szinergikus tumorellenes hatást fejtett ki a csupasz egerekbe ültetett - neugénnel transzformált - NIH-3T3-sejtekre [ld. még az 5 824 311 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást].
Hudziak és mtsai. [Mól. Cell. Bioi. 9(3), 1165 (1989)] anti-ErbB2 antitestek sorozatának létrehozását írták le, mely antitesteket az SK-BR-3 humán emlőtumor-sejtvonal alkalmazásával karakterizálták. Az SK-BR-3 sejtek - antitestekkel történő érintkeztetés utáni - relatív proliferációját az egyrétegű sejttenyészetek 72 óra elteltével végzett kristályibolya-festésével határozták meg. E vizsgálati eljárásban a maximális gátlást a 4D5-antitesttel kapták, amely a sejtek proliferációját 56%-ban gátolta. A szóban forgó antitestsorozat egyéb tagjai e vizsgálati eljárásban kisebb mértékben gátolták a sejtproliferációt. Megállapították továbbá, hogy a 4D5-antitest az ErbB2-t túlzott mértékben termelő emlőtumor-sejtvonalakat szenzitizálja a TNF citotoxikus hatásaira, [ld. még: 5 677 171 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás], A Hudziak és mtsai. által leírt anti-ErbB2 antitestek további karakterizálását illetően lásd Fendly és mtsai.: Cancer Research 50, 1550 (1990); Kotts és mtsai.: In Vitro 26(3), 59A (1990); Sarup és mtsai.: Growth Regulation 1, 72 (1991); Shepard és mtsai.: J. Clin. Immunoi. 11(3), 117 (1991); Kumar és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 11(2), 979 (1991); Lewis és mtsai.: Cancer Immunoi. Immunother. 37, 255 (1993); Pietras és mtsai.: Oncogene 9, 1829 (1994); Vitetta és mtsai.: Cancer Research 54, 5301 (1994); Sliwkowski és mtsai.: J. Bioi. Chem. 269(20), 14 661 (1994); Scott és mtsai.: J. Bioi. Chem. 266, 14 300 (1991); D’Souza és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 7202 (1994); Lewis és mtsai.: Cancer Research 56, 1457 (1996); Schaeferés mtsai.: Oncogene 15, 1385 (1997).
Az ErbB2 elleni egéreredetű 4D5-antitest rekombináns humanizált változatát (huMAb4D5-8; rhuMAb HER2 vagy HERCEPTIN®; lásd 5 821 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) klinikai tesztekben aktívnak bizonyult olyan metasztázisos emlőrákos
HU 226 742 Β1 betegekben, akikben az ErbB2 túlzott mértékben termelődött, és akiket korábban rákellenes terápiával kezeltek [Baselga és mtsai.: J. Clin. Oncol. 14, 737 (1996)]. A HERCEPTIN® kereskedelmi forgalmazását a „Food and Drug Administration” 1998. szeptember 25-én engedélyezte olyan metasztázisos emlőrákban szenvedő páciensek kezelésére, akik emlőtumora túlzott mértékben termeli az ErbB2-proteint.
Egyéb, különböző tulajdonságú anti-ErbB2 antitesteket is feltártak [Id. pl. Tagliabue és mtsai.: J. Cancer 47, 933 (1991); McKenzie és mtsai.: Oncogene 4, 543 (1989); Maier és mtsai.: Cancer Rés. 51, 5361 (1991); Bacus és mtsai.: Molecular Carcinogenesis 3, 350 (1990); Stancovski és mtsai.: PNAS (USA) 88, 8691 (1991); Bacus és mtsai.: Cancer Research 52, 2580 (1992); Xu és mtsai.: Int. J. Cancer 53, 401 (1993); WO 94/00136 számú nemzetközi közzétételi irat; Kasprzyk és mtsai.: Cancer Research 52, 2771 (1992); Hancock és mtsai.: Cancer Research 51, 4575 (1991); Shawver és mtsai.: Cancer Research 54, 1367 (1994); Arteaga és mtsai.: Cancer Research 54, 3758 (1994); Harwerth és mtsai.: J. Bioi. Chem. 267, 15 160 (1992); 5 783 186 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Klapperés mtsai.: Oncogene 14, 2099 (1997)].
Homológiaszűréssel az ErbB-receptorcsalád két másik tagját is azonosították: ErbB3 [5 183 884 és 5 480 968 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; valamint Kraus és mtsai.: PNAS (USA) 86, 9193 (1989)] és ErbB4 [599 274 számú európai szabadalmi bejelentés; Plowman és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1746 (1993); és Plowman és mtsai.: Natúré 366, 473 (1993)]. E két receptor - legalább néhány emlőráksejtvonalban - fokozott mértékű termelődést mutat.
Az ErbB-receptorok a sejtekben rendszerint különféle kombinációkban találhatók meg, és a heterodimerizáció vélhetően fokozza a különböző ErbB-ligandumokra adott celluláris reakciók diverzitását [Earp és mtsai.: Breast Cancer Research and Treatment 35, 115 (1995)]. Az EGFR-t hat különböző ligandum köti meg, melyek a következők: epidermális növekedési faktor (AGF), transzformáló növekedési faktor-alfa (TGF-α), amphiregulin, heparinkötő epidermális faktor (HB-EGF), betacellulin és epiregulin [Groenen és mtsai.: Growth Factors 11, 235 (1994)]. Az egyetlen gén alternatív „splicing” folyamatai eredményeként létrejött heregulin-proteincsalád az ErbB3 és ErbB4 ligandumaiként funkcionál. A heregulincsaládba a következő proteinek tartoznak: α-, β- és γ-heregulin [Holmes és mtsai.: Science 256, 1205 (1992); 5 641 869 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; és Schaefer és mtsai.: Oncogene 15, 1385 (1997)]; neu-differenciációs faktorok (NDF-ek), gliasejt-növekedési faktorok; acetilkolinreceptor-indukáló aktivitás (ARIA); és szenzoros és motoros neuron eredetű faktor (SMDF). E proteinek áttekintését illetően lásd Groenen és mtsai.: Growth Factors 11, 235 (1994); Lemke: Molec. & Cell. Neurosci. 7, 247 (1996); Lee és mtsai.: Pharm. Rév. 47, 51 (1995)]. Újabban három további ErbB-ligandumot azonosítottak, melyek a következők: neuregulin-2 (NRG-2), amely ErbB3-hoz és ErbB4-hez kötődik [Id. Chang és mtsai.: Natúré 387, 509 (1997); Carraway és mtsai.: Natúré 387, 512 (1997)]; neuregulin-3 (NRG-3), amely az ErbB4-hez kötődik [Id. Zhang és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 9562 (1997)]; és neuregulin-4, amely szintén az ErbB4-hez kötődik [Id. Harari és mtsai.: Oncogene 18, 2681 (1999)]. A HB-EGF, a betacellulin, és az epiregulin szintén az ErbB4-hez kötődik.
Bár az EGF és a TGFa nem kötődik az ErbB2-höz, az EGF serkenti az EGFR és az ErbB2 heterodimerképzését, ami aktiválja az EGFR-t, és a heterodimerben az ErbB2 transzfoszforilációjához vezet. Úgy tűnik, hogy a dimerizáció és/vagy transzfoszforiláció aktiválja az ErbB2 tirozin-kinázt [Earp és mtsai., lásd fentebb]. Hasonlóan, ha az ErbB3 az ErbB2-vel együtt termelődik, aktív jelátviteli komplex jön létre, és az ErbB2 elleni antitestek képesek e komplex felbontására [Sliwkowski és mtsai.: J. Bioi. Chem. 269(20), 14 661 (1994)]. Ezen túlmenően, az ErbB3 heregulinra (HRG) vonatkozó affinitása fokozódik, ha az ErbB2-vel együtt expresszálódik [Id. Levi és mtsai.: Journal of Neuroscience 15, 1329 (1995); Morrissey és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1431 (1995); és Lewis és mtsai.: Cancer Rés. 56, 1457 (1996), az ErbB2-ErbB3 proteinkomplex vonatkozásában], Az ErbB4 - az ErbB3-hoz hasonlóan aktív jelátviteli komplexet képez az ErbB2-vel [Id. Carraway és Cantley: Cell 78, 5 (1994)].
A találmány szerinti megoldás értelmében ErbB2receptorhoz kötődő antitest gyógyászatilag hatásos mennyiségének alkalmazását tárjuk fel epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) termelésével jellemezhető rák emberben történő kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására.
Az ErbB2-höz kötődő antitest ilyen rákok kezelésére történő alkalmazásának az EGFR-t megcélzó hatóanyagokkal szemben több előnye is van. Az EGFR a májban és a bőrben termelődik nagy mennyiségben, ami az EGFR-hez kötődő aktív drog óriási veszteségét okozza. Ezen túlmenően, egyéb EGFR-re irányuló drogok (pl. EGFR elleni kimérikus C225-antitest és az EGFR-t megkötő, kis molekulájú ZD1839-drog) esetében is megfigyeltek bőrtoxicitást. Az ErbB2-t megkötő antitestek várhatóan nagyobb biztonsággal alkalmazhatók, mint az említett egyéb hatóanyagok.
Amennyiben a találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazott antitest blokkolja egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását és/vagy a 2C4 monoklonális antitest biológiai tulajdonságával bír, további előnyök érhetők el. Például, míg az EGFR-t megcélzó hatóanyagok csak az EGFR-t gátolják, a találmány szerint alkalmazott antitestek (pl. 2C4-antitest és humanizált és/vagy affinitásfejlesztett változatai) az EGFR/ErbB2, ErbB3/ErbB4 és ErbB2/ErbB3 heterodimerekre egyaránt hatást gyakorolnak. Ezen túlmenően, az ErbB2-t megkötő és az ErbB-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló antitestek kiegészítői az EGFR-re irányuló drogoknak, míg ezek a drogok egymásnak nem kiegészítői.
A találmány szerinti megoldás egy további szempontja értelmében ErbB2-receptort megkötő és egy
HU 226 742 Β1
ErbB-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló antitest gyógyászatilag hatásos mennyiségének alkalmazását tárjuk fel olyan rák emberben történő kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására, amelyre az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) túlzott mértékű termelődése nem jellemző.
Ezen túlmenően, ErbB2-receptort megkötő és egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló antitest gyógyászatilag hatásos mennyiségének hormonfüggetlen rák emberben történő kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására történő alkalmazását tárjuk fel.
Feltárjuk továbbá egy első antitest (amely megköti az ErbB2-receptort és gátolja az ErbB2-receptort túlzott mértékben termelő ráksejtek szaporodását) és egy második antitest (amely megköti az ErbB2-receptort és blokkolja egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását) gyógyászatilag hatásos mennyiségeinek rákos betegség emberben történő kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására történő alkalmazását.
Ezen túlmenően, ErbB2-receptort megkötő és egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló antitest gyógyászatilag hatásos mennyiségének alkalmazását tárjuk fel vastagbélrák, végbélrák, vastag- és végbélrák emberben történő kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására.
A találmány további megvalósítási módjai értelmében termékeket tárunk fel, többek között, epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) termelésével jellemezhető rákos betegségben szenvedő ember kezelésére történő alkalmazásra. Például feltárunk egy terméket, amely egy tartályból és az abban lévő, ErbB2-t megkötő antitestet tartalmazó készítményből áll, tartalmaz továbbá egy termékismertetőt, amely jelzi, hogy a készítmény epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) termelésével jellemezhető rák kezelésére alkalmazható.
Feltárunk továbbá egy olyan terméket, amely egy tartályból és az abban lévő, ErbB2-t megkötő és egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló antitestet tartalmazó készítményből áll, tartalmaz továbbá egy termékismertetőt, amely jelzi, hogy a készítmény olyan rák kezelésére alkalmazható, amelyre nem jellemző az ErbB2-receptor túlzott mértékű termelődése.
Ezen túlmenően, feltárunk egy terméket, amely egy tartályból és az abban lévő, ErbB2-t megkötő és egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló antitestet tartalmazó készítményből áll, tartalmaz továbbá egy termékismertetőt, amely jelzi, hogy a készítmény hormonfüggetlen rák kezelésére alkalmazható.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint feltárunk egy terméket, amely a következő komponensekből áll: (a) első tartály és az abban lévő készítmény, amely ErbB2-t megkötő és az ErB2-t túlzott mértékben termelő rákos sejtek szaporodását gátló első antitestet tartalmaz; (b) második tartály és az abban lévő készítmény, amely ErbB2-t megkötő és egy ErbBreceptor ligandum általi aktiválását blokkoló második antitestet tartalmaz.
Ezen túlmenően feltárunk egy terméket, amely egy tartályból és az abban lévő, ErbB2-t megkötő és egy
ErbB-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló antitestet tartalmazó készítményből áll, tartalmaz továbbá egy termékismertetőt, amely jelzi, hogy a készítmény vastagbélrák, végbélrák és vastag- és végbélrák kezelésére alkalmazható.
A találmány további megvalósítási módjai értelmében feltárunk egy humanizált antitestet, amely megköti az ErbB2-receptort és gátolja egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását; feltárunk továbbá egy készítményt, amely találmány szerinti humanizált antitestet és gyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmaz; és feltárunk egy immunkonjugátumot, amely a találmány szerinti humanizált antitestet citotoxikus hatóanyaggal kombinálva tartalmazza.
Ezenfelül a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti humanizált antitestet kódoló izolált nukleinsav; az ilyen nukleinsavat hordozó vektor; a találmány szerinti nukleinsavat vagy vektort tartalmazó gazdasejt; valamint eljárás a találmány szerinti humanizált antitest előállítására, melynek során az azt kódoló nukleinsavat tartalmazó gazdasejtet a nukleinsav expresszálódását lehetővé tevő módon tenyésztjük, és - adott esetben a gazdasejttenyészetből (pl. a gazdasejt tenyésztő tápközegéből) kinyerjük a humanizált antitestet.
A találmány tárgyához tartozik továbbá egy immunkonjugátum, amely ErbB2-t megkötő antitestet egy vagy több calicheamicinmolekulához konjugálva tartalmaz. Szintén a találmány tárgyát képezi az ilyen konjugátumok alkalmazása ErbB2-t termelő rák (pl. ErbB2-t túlzott mértékben termelő rák) emberben történő kezelésére. A konjugátum antitestként előnyösen 4D5 monoklonális antitestet, pl. humanizált 4D5-antitestet (előnyösen a huMAb4D5-8-antitestet; HERCEPTIN®) vagy 2C4 monoklonális antitestet (pl. humanizált 2C4-antitestet) tartalmaz. Az immunkonjugátum antitestként ép antitestet (pl. ét IgG 1) vagy antitestfragmenst [pl. Fab, F(ab’)2, diatest stb.) egyaránt tartalmazhat.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1A. és 1B. ábrán az ErbB2 (13. azonosító számú szekvencia; szignálszekvenciát is magában foglaló aminosavszekvencia, lásd 1A. ábra) - extracelluláris doménen (ECD) belüli - 22-645. aminosavainak csonkított mutáns analízissel és helyspecifikus mutagenezissel [Id. Nakamura és mtsai.: J. of Virology 67(10), 6179 (1993); Renz és mtsai.: J. Cell Bioi. 725(6), 1395 (1994)] epitóp-térképezését mutatjuk be. A különböző ErbB2ECD csonkításos mutációkat és pontmutációkat polimeráz-láncreakció alkalmazásával, cDNS-ből hoztuk létre. Az ErbB2-mutánsokat emlős expressziós plazmid alkalmazásával gD fúziós proteinekként termeltettük. Ez az expressziós plazmid citomegalovírus-promotert, erősítőszekvenciát, SV40 terminációs és poliadenilációs szignálokat tartalmaz (az inszertált cDNS-től 3’-irányban). A plazmid-DNS-t 293-as sejtekbe transzfektáltuk, majd a transzfekció után egy nappal a sejteket - 1% dializált
HU 226 742 Β1 magzati borjúszérumot és 25 pCi 35S-metionint és 25 μθ 35S-ciszteint tartalmazó metionin- és ciszteinmentes, alacsony glükóztartalmú DMEM-tápközegben - egy éjszakán át metabolikus jelölésnek vetettük alá. A felülúszókat összegyűjtöttük, antiErbB2 monoklonális antitesteket vagy kontrollantitesteket adtunk hozzájuk, és 4 °C-on 2-4 óra hosszat inkubáltuk. A komplexeket precipitáltuk, 10-20% Tricin-SDS gradiens gélre vittük és 100 V feszültséggel elektroforézist végeztünk. A gélt elektroblot módszerrel membránra másoltuk és autoradiográfiásan analizáltuk. Ahogy az 1B. ábrán látható, a 7C2, 7F3, 2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 és 3H4 anti-ErbB2 antitestek az ErbB2 különböző ECD-epitópjaihoz kötődnek.
A 2A. és 2B. ábrán a 2C4 és 7F3 anti-ErbB2 monoklonális antitest - MCF7-sejtek rHRGpi általi aktiválására gyakorolt - hatását mutatjuk be. A 2A. ábrán a 2C4 és 7F3 monoklonális antitestek - tirozinfoszforiláció HRGstimulációjára gyakorolt - gátlóhatásának dózis-reakció görbéje látható. A 2B. ábrán a 125l-izotóppal jelölt rHRGpi177_244 MCF7sejtekhez történő kötődése 2C4 és 7F3 monoklonális antitestek általi gátlásának dózisreakció görbéjét mutatjuk be.
A 3. ábrán 125l-izotóppal jelölt rHRGpi177_244 különböző humán tumorsejtvonalakhoz történő specifikus kötődésének 2C4 és 7F3 antiErbB2 monoklonális antitest általi gátlását szemléltetjük. Monoklonális antitest kontrollként (MAb-kontroll) egyeztetett izotípusú egéreredetű monoklonális antitesteket alkalmaztunk, amelyek nem blokkolják az rHRG kötődését. A 125l-izotóppal jelölt rHRGpi177_244 nem specifikus kötődését 100 nM rHRGpi jelenlétében végzett párhuzamos inkubálások alapján határoztuk meg. A 125l-izotóppal jelölt rHRGpi177_244 nem specifikus kötődési értéke valamennyi tesztelt sejtvonalra az összes kötődés kevesebb mint 1%-a volt.
A 4A. és 4B. ábrán a 2C4 és 4D5 monoklonális antitestek MDA-MB-175-, illetve SK-BR-3-sejtek proliferációjára gyakorolt hatását mutatjuk be. Az MDA-MB-175- és SK-BR-3-sejteket 96 üregű tálcákra helyeztük és két óra hosszat hagytuk őket letapadni. A kísérletet 1% szérumot tartalmazó tápközegben végeztük. A sejtekhez anti-ErbB2 antitesteket vagy csak tápközeget adtunk, és a tálcákat 37 °C-on két óra hosszat inkubáltuk. Ezután a sejtekhez rHRGpi-et (1 nM) vagy csak tápközeget adtunk, és az inkubálást négy napig folytattuk. Az egyrétegű sejttenyészeteket leöblítettük és 0,5% kristályibolyával festettük és fixáltuk. A sejtproliferációt
540 nm hullámhossznál mért abszorbancia alapján határoztuk meg.
Az 5A. és 5B. ábrán a 2C4 monoklonális antitestnek, a HERCEPTIN® antitestnek és egy anti-EGFR antitestnek - ErbB2-t alacsony/normális szinten termelő MCF7-sejtekben (5A. ábra), illetve az ErbB2-t nagy mennyiségben termelő SK-BR-3-sejtekben (5B. ábra) - az ErbB2 ErbB3-mal történő, heregulin (HRG)-dependens asszociációjára gyakorolt hatását szemléltetjük.
A 6A. és 6B. ábrán egéreredetű ép 2C4 monoklonális antitest (mu 2C4) és kimérikus 2C4 Fab-fragmens aktivitását hasonlítjuk össze. A 6A. ábrán a kimérikus 2C4 Fabfragmens és az egéreredetű ép 2C4 monoklonális antitest - 125I-HRG MCF7-sejtekhez történő kötődését - gátlóhatását mutatjuk be. Az MCF7-sejteket 24 üregű tálcákra (1 *105 sejt/üreg) helyeztük, és két nap alatt kb. 85%-os konfluens állapot eléréséig szaporítottuk. A kötési teszteket Lewis és mtsai. [Cancer Rés. 56, 1457 (1996)] leírása szerint végeztük. A 6B. ábrán az antitestek - p180 tirozinfoszforiláció rHRGpi általi aktiválását MCF7-sejtekben gátló - hatását mutatjuk be. A kísérletet itt is Lewis és mtsai. [Cancer Rés. 56, 1457 (1996)] leírása szerint végeztük.
A 7A. ábrán az egéreredetű 2C4 monoklonális antitest könnyű lánc variábilis (VL) doménje aminosavszekvenciájának (1. azonosító számú szekvencia), a 7B. ábrán pedig az egéreredetű 2C4 monoklonális antitest nehéz lánc variábilis (VH) doménje aminosavszekvenciájának (2. azonosító számú szekvencia) a humanizált 2C4 574-es változata VL és VH doménjével (3., illetve 4. azonosító számú szekvencia), valamint humán VL és VH konszenzus vázrégiókkal (hűm Kl=könnyű lánc kappa 1. alcsoport; humlll=nehéz lánc Ili. alcsoport; 5., ill. 6. azonosító számú szekvencia) végzett összehasonlítását mutatjuk be. A csillagok az 574-es humanizált 2C4-változat és a 2C4 monoklonális antitest közötti, illetve az 574-es humanizált 2C4-változat és a humán vázrégió közötti különbségeket jelzik. A komplementaritást meghatározó régiókat (CDR-ek) zárójelbe tettük.
A 8A-8C. ábrákon a kimérikus 2C4 Fab-fragmens (Fab.vl) és több humanizált 2C4-változat ErbB2 extracelluláris doménjéhez (ECD) történő kötődését szemléltetjük. A kötődési analízist a 3. példában leírtak szerint, ELISA-teszttel végeztük.
A 9. ábrán a 2C4 monoklonális antitest VL és VH doménjének szalagdiagramját mutatjuk be, fehér színnel feltüntetve a CDR-gerincet (L1, L2, L3, H1, H2, H3). A humanizálás so5
HU 226 742 Β1 rán mutagenezissel értékelt VH oldalláncokat (lásd 3. példa, 2. táblázat) szintén feltüntettük.
A 10. ábrán a 2C4 monoklonális antitest és a HERCEPTIN® mitogén aktiválta protein-kináz (MAPK) - EGF, TGF-α vagy HRG által közvetített - aktiválására gyakorolt hatását mutatjuk be.
A 11. ábrán az anti-ErbB2 antitestek (önmagukban vagy kombinációban) Calu3 tüdőadenocarcinoma xenograftokra (3+ szintű ErbB2-túltermelés) gyakorolt hatását szemléltető oszlopdiagram látható (a kezelést a 24. napon leállítottuk).
A 12. ábrán a rekombináns humanizált 2C4 monoklonális antitest (rhuMAb 2C4) és a HERCEPTIN® MDA-175-sejtek szaporodására „Alamar Blue” vizsgálati tesztben - kifejtett hatását mutatjuk be.
A 13. ábrán az rhuMAb 2C4 MCF7 xenograftok elleni hatékonyságát mutatjuk be.
I. Definíciók
Az „ErbB-receptor” vagy „ErbB” kifejezésen olyan tirozin-kináz receptor-proteint értünk, amely az ErbBreceptorcsaládba tartozik. Az ErbB-receptorok közé tartoznak a következők: ErbB1 (EGFR), ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3) és ErbB4 (HER4), valamint e család még azonosításra váró tagjai. Az ErbB-receptor általában a következő komponensekből áll: extracelluláris dómén, amely ErbB-ligandumhoz kötődhet; lipofil transzmembrán dómén; konzervált intracelluláris tirozin-kináz dómén; és C-terminális szignáldomén, amely több foszforilálható tirozint tartalmaz. Az ErbB-receptor „natív szekvenciájú” ErbB-receptor vagy annak funkcionális származéka (pl. aminosavszekvencia-változata) lehet. Az ErbB-receptor előnyösen natív szekvenciájú humán ErbB-receptor.
Az „ErbB1 ”, „epidermális növekedési faktor receptor” és „EGFR” kifejezések - melyek egymás szinonimáiként alkalmazhatók - az EGFR-re vonatkoznak [melynek leírását lásd pl. Carpenter és mtsai.: Ann. Rév. Biochem. 56, 881 (1987)], ideértve ezek természetben előforduló mutáns alakjait [pl. deléciós mutáns EGFR; lásd Humphrey és mtsai.: PNAS (USA) 87, 4207 (1990)]. Az erőB1 kifejezés az EGFR-proteint kódoló gént jelenti.
Az „ErbB2” és „HER2” kifejezések - melyeket egymás szinonimáiként alkalmazunk - humán HER2-proteinre vonatkoznak [melynek leírását lásd pl. Semba és mtsai.: PNAS (USA) 82, 6497 (1985) és Yamamoto és mtsai.: Natúré 319, 230 (1986); GenBank nyilvántartási szám: XO3363]. Az„eróB2” kifejezés a humán HER2-t kódoló gént jelenti, míg a „neu” kifejezés a patkányeredetű p185neu-t kódoló génre vonatkozik. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös ErbB2 a natív szekvenciájú humán ErbB2.
Az „ErbB3” és „HER3” kifejezés receptor-polipeptidre [Id. 5 183 884 és 5 480 968 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás, valamint Kraus és mtsai.: PNAS (USA) 86, 9193 (1989)] vonatkozik.
Az „ErbB4” és „HER4” kifejezés receptor-polipeptidre [Id. pl. 599 274 számú európai szabadalmi bejelentés; Plowman és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1746 (1993); Plowman és mtsai.: Natúré 366, 473 (1993)], valamint izoalakjaira vonatkozik (lásd pl. a WO 99/19488 számú nemzetközi közzétételi iratot).
Az „ErbB-ligandum” kifejezésen olyan polipeptidet értünk, amely ErbB-receptorhoz kötődik és/vagy aktiválja azt. A találmány szerinti megoldás szempontjából különösen jelentős ErbB-ligandumok a natív szekvenciájú humán ErbB-ligandumok, mint pl. az epidermális növekedési faktor [EGF; Savage és mtsai.: J. Bioi. Chem. 247, 7612 (1972)]; transzformáló növekedési faktor-α [TNF-a; Marquardt és mtsai.: Science 223, 1079 (1984)]; amphiregulin, más néven scwanoma vagy keratinocita autokrin növekedési faktor [Shoyab és mtsai.: Science 243, 1074 (1989); Kimura és mtsai.: Natúré 348, 257 (1990); Cook és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 11, 2547 (1991)]; betacellulin [Shing és mtsai.: Science 259, 1604 (1993); Sasada és mtsai.: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 190, 1173 (1993)]; heparinkötő epidermális növekedési faktor [ΗΒ-EGF; Higashiyama és mtsai.: Science 251, 936 (1991)]; epiregulin [Toyoda és mtsai.: J. Bioi. Chem. 270, 7495 (1995); Komurasaki és mtsai.: Oncogene 15, 2841 (1997)]; heregulin (lásd később); neuregulin-2 [NRG-2; Carraway és mtsai.: Natúré 387, 512 (1997)]; neuregulin-3 [NRG-3; Zhang és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 9562 (1997)] vagy cripto [CR-1; Kannan és mtsai.: J. Bioi. Chem. 272(6), 3330 (1997)]. Az EGFR-t megkötő ErbB-ligandumok közé tartozik az EGF, TGF-α, amphiregulin, betacellulin, ΗΒ-EGF és epiregulin; a HER3-hoz kötődő ErbB-ligandumok a heregulinok; míg a HER4 megkötésére képes ErbB-ligandumok a következők: betacellulin, epiregulin, ΗΒ-EGF, NRG-2, NRG-3 és a heregulinok.
Ahogy itt használjuk, a „heregulin” (HRG) olyan peptidet jelent, amelyet a heregulingén kódol [Id. 5 641 869 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás vagy Marchionni és mtsai.: Natúré 362, 312 (1993)]. A heregulinok példái közé tartozik a heregulin -a, hereguIiη-β1, hereguIiη—β2 és hereguIiη-β3 [Holmes és mtsai.: Science 256, 1205 (1992); 5 641 869 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás]; neu differenciálódási faktor [NDF; lásd Peles és mtsai.: Cell 69, 205 (1992)]; acetilkolinreceptor-indukáló aktivitás [ARIA; Falls és mtsai.: Cell 72, 801 (1993)]; gliasejt eredetű növekedési faktorok [GGF-ek; lásd Marchionni és mtsai.: Natúré 362, 312 (1993)]; szenzoros és motoros neuron eredetű faktor [SMDF; lásd Ho és mtsai.: J. Bioi. Chem. 270, 14523 (1995)]; γ-heregulin [Schaefer és mtsai.: Oncogene 15, 1385 (1997)]. A heregulin kifejezés jelentése kiterjed a természetben előforduló HRG-polipeptid biológiailag aktív fragmenseire és/vagy aminosavszekvencia-változataira is, pl. EGF-szerű dómén fragmensére (HRGpi177_244).
Az „ErbB heterooligomer” kifejezés egy nem kovalens kötéssel kapcsolt oligomer, amely legalább két különböző ErbB-receptort tartalmaz. Az ilyen komplexek akkor jönnek létre, ha két vagy több ErbB-receptort termelő sejtet ErbB-ligandummal érintkeztetünk, majd im6
HU 226 742 Β1 munprecipitációval izolálhatok és SDS-PAGE vizsgálati eljárással analizálhatók [Id. pl. Sliwkowski és mtsai.: J. Bioi. Chem. 269(20), 14 661 (1994)]. Az ilyen ErbB heterooligomerek példái a következők: EGFR-ErbB2, ErbB2-ErbB3 és ErbB3-ErbB4 komplexek. Ezen túlmenően, az ErbB heterooligomer két vagy több HER2receptort is tartalmazhat, melyek különböző ErbB-receptorokkal (ErbB3, ErbB4 vagy EGFR) lehetnek kombinálva. A heterooligomerben más protein, például citokinreceptor-alegység (pl. gp130) is jelen lehet.
Az „RbB-receptor ligandum általi aktiválása” kifejezésen olyan szignáltranszdukciót értünk (pl. amelyet egy ErbB-receptor intracelluláris kinázdoménje okoz, amely foszforilálja az ErbB-receptorban vagy egy szubsztrátpolipeptidben lévő tirozinokat), amelyet az ErbB-ligandum - kérdéses ErbB-receptort tartalmazó ErbB heterooligomerhez történő kötődése közvetít. E folyamat során egy ErbB-ligandum ErbB heterooligomerhez kötődik, ami aktiválja a heterooligomerben lévő egy vagy több ErbB-receptor kinázdoménjét, s ezáltal egy vagy több ErbB-receptor tirozinjainak és/vagy további szubsztrátpolipeptid(ek) tirozinjainak foszforilációját eredményezi. Az ErbB-receptor aktiválása különféle tirozinfoszforilációs tesztekkel határozható meg (kvantitatív analízissel).
A „natív szekvenciájú” polipeptid olyan polipeptid, amely egy természetből izolált polipeptidével (pl. ErbBreceptor vagy ErbB-ligandum) azonos aminosavszekvenciát tartalmaz. Az ilyen polipeptidek a természetből izolálhatok vagy rekombináns vagy szintézises módszerekkel állíthatók elő. Ennek megfelelően, egy natív szekvenciájú polipeptid természetben előforduló humán polipeptid, egéreredetű polipeptid vagy más emlősfaj-eredetű polipeptid aminosavszekvenciáját tartalmazhatja.
Az „aminosavszekvencia-változat” kifejezés olyan polipeptidre vonatkozik, amelynek aminosavszekvenciája bizonyos mértékben eltér a natív szekvenciájú polipeptidtől. Az aminosavszekvencia-változatok rendszerint legalább 70%-ban homológok egy natív ErbB-ligandum legalább egy receptorkötő doménjével vagy egy natív ErbB-receptor legalább egy ligandumkötő doménjével; előnyösen ez a homológia legalább kb. 80%-os, még előnyösebben legalább 90%-os. Az aminosavszekvencia-változatok a natív aminosavszekvencia bizonyos pozícióiban szubsztitúciókat, deléciókat és/vagy inszerciókat tartalmaznak.
A „homológia”, definíciója szerint, az aminosavszekvencia-változat azon aminosavainak százalékos aránya, amelyek a vonatkoztatási szekvenciával végzett egymás alá rendezés („alignment”) - és szekvenciákban a maximális százalékos homológia elérése céljából hézagok beiktatása - után a vonatkoztatási szekvencia megfelelő aminosavaival azonosnak bizonyulnak. A szekvenciák egymás alá rendezésére alkalmas eljárások és számítógépes programok szakember számára jól ismertek. Az egyik ilyen számítógépes program az „Align 2” (Genentech, Inc.), amelyet felhasználói dokumentációval együtt az Egyesült Államok Jogvédő Hivatalánál (Washington DC 20559) 1991. december 10-én vettek nyilvántartásba.
A találmány leírásában az „antitest” kifejezést legtágabb értelmében használjuk, s jelentése kiterjed az ép monoklonális antitestekre, poliklonális antitestekre, a legalább két ép antitestből álló multispecifikus antitestekre (pl. bispecifikus antitestek), valamint az antitestfragmensekre, feltéve, hogy azok rendelkeznek a kívánt biológiai aktivitással.
Ahogy itt használjuk, a „monoklonális antitest” kifejezésen lényegében homogén antitestpopulációból származó antitestet értünk, vagyis a populációt alkotó egyes antitestek - az esetlegesen kis mennyiségben előforduló természetes mutációktól eltekintve - azonosak. A monoklonális antitestek rendkívül specifikusak: egyetlen antigénhatású hely ellen irányulnak. Ezen túlmenően, ellentétben a poliklonális antitestek készítményeivel, amelyek különböző determinánsok (epitópok) elleni különböző antitesteket tartalmaznak, minden egyes monoklonális antitest az antigén egyetlen determinánsa ellen irányul. A monoklonális antitestek - specifitásukon túlmenően - azért is előnyösek, mert más antitestektől mentesen szintetizálhatok. A „monoklonális” jelző az antitest azon sajátságát jelenti, hogy antitestek lényegében homogén populációjából nyerhető, és nem utal arra, hogy az antitest bármilyen konkrét eljárással lenne előállítható. Például a találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazandó monoklonális antitestek az elsőként Kohler és mtsai. [Natúré 256, 495 (1975)] által leírt hibridómaeljárással vagy rekombináns DNS-technikák (lásd pl. 4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) alkalmazásával állíthatók elő. A monoklonális antitestek fág antitestkönyvtárakból is izolálhatok, például a Clackson és mtsai. [Natúré 352, 624 (1991)] és Marks és mtsai. [J. Mól. Bioi. 222, 581 (1991)] által leírt technikák alkalmazásával.
A monoklonális antitestek konkrét példái közé tartoznak a „kiméra” antitestek, amelyekben a nehéz és/vagy könnyű lánc egy része azonos vagy homológ egy adott fajból származó - vagy egy adott antitestosztályhoz vagy -alosztályhoz tartozó - antitestek megfelelő szekvenciáival, míg a lánc(ok) többi része azonos vagy homológ egy másik fajból származó vagy egy másik antitestosztályba vagy -alosztályba tartozó - antitestek megfelelő szekvenciáival. A monoklonális antitestek közé tartoznak az ilyen kiméra antitestek fragmensei, feltéve, hogy képesek a kívánt biológiai aktivitás kifejtésére [4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Morrison és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)]. Aszóban forgó kiméra antitestek közé tartoznak az úgynevezett „főemlősített („primatizált”) antitestek, amelyek nem humán főemlősből (pl. óvilági majomból, emberszabású majomból) származó variábilis dómén antigénkötő szekvenciát és humán konstans régió szekvenciákat tartalmaznak.
Az „antitestfragmens” egy ép antitest része, amely - előnyösen - tartalmazza annak antigénkötő vagy variábilis régióját. Az antitestfragmensek példái közé tartoznak a következők: Fab-, Fab’-, F(ab’)2- és Fv-fragmensek; diatestek; lineáris antitestek; egyláncú anti7
HU 226 742 Β1 testmolekulák; és antitestfragmens(ek)ből álló multispecifikus antitestek.
Az „ép” antitest antigénkötő variábilis régióból, továbbá könnyű lánc konstans doménből (CL) és nehéz lánc konstans doménekből (CH1, CH2 és CH3) áll. A konstans domének natív szekvenciája konstans domének (pl. humán natív szekvenciájú konstans domének) vagy azok aminosavszekvencia-változatai lehetnek. Az ép antitest előnyösen egy vagy több effektorfunkcióval bír.
Az antitestek „effektorfunkciói” olyan biológiai aktivitások, amelyek egy antitest Fc-régiójának (natív szekvenciájú Fc-régió vagy annak aminosavszekvencia-változata) tulajdoníthatók. Az antitest effektorfunkciói közé tartoznak a következők: C1q-kötés; komplementdependens citotoxicitás; Fc-receptor megkötése; antitestdependens sejt közvetítette citoxicitás (ADCC); fagocitózis; sejtfelületi receptorok (pl. B-sejt-receptor, BCR) gátlása stb.
Az ép antitestek - nehéz láncaik konstans doménjének aminosavszekvenciájától függően - különböző „osztályokba” sorolhatók. Az ép antitestek öt fő osztálya létezik: IgA, IgD, IgE, IgG és IgM, melyek közül több további „alosztályokra” (izotípusokra) osztható, pl. IgG 1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA és lgA2. A különböző antitestosztályoknak megfelelő nehéz lánc konstans domének elnevezése a következő: α, δ, ε, γ, illetve μ. A különféle Ig-osztályok alegységszerkezete és háromdimenziós konfigurációja szakember számára jól ismert.
Az „antitestdependens sejtközvetítette citotoxicitás” és „ADCC” kifejezés olyan sejtközvetítette reakciót jelent, amelynek során Fc-receptorokat (FcR) termelő, nem specifikus citotoxikus sejtek [pl. természetes „killer”-sejtek (NK-sejtek), neutrofilek vagy makrofágok] egy célsejten lévő, kötött antitestet ismernek fel, és ezt követően a célsejt lízisét okozzák. Az ADCC-t közvetítő elsődleges sejtek, az NK-sejtek, csak FcyRIIl-at termelnek, míg a monociták az FcvRI-et, FovRII-t és FcyRIII-at egyaránt termelik. A vérképzési sejtek FcRtermelését illetően lásd Ravetch és Kínét cikkének [Annu. Rév. Immunoi. 9, 457 (1991)] 3. táblázatát. Egy adott molekula ADCC-aktivitásának értékelésére in vitro ADCC-teszt alkalmazható (lásd pl. 5 500 362 és 5 821 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az ilyen vizsgálati eljárásokban alkalmazható effektorsejtek közé tartoznak a perifériás vér egymagvú sejtjei (PBMC) és a természetes killersejtek. Más módon - vagy ezen túlmenően - egy adott molekula ADCC-aktivitása in vivő is tesztelhető, például állatmodell alkalmazásával [Id. Clynes és mtsai.: PNAS (USA) 95, 652(1998)].
A „humán effektorsejtek” olyan leukociták, amelyek egy vagy több Fc-receptort termelnek és effektorfunkciót töltenek be. A sejtek előnyösen legalább az FcyRIII-at termelik, és ADCC effektorfunkciót töltenek be. Az ADCC-t közvetítő humán leukociták példái közé tartoznak a perifériás vér egymagvú sejtjei (PBMC), a természetes „killer’-sejtek, a monociták, a citotoxikus T-sejtek és a neutrofilek, melyek közül a találmány szerinti megoldás szempontjából a PBMC-k és az NK-sejtek előnyösek. Az effektorsejtek természetes forrásukból (pl. vérből vagy perifériás vér egymagvú sejtjei közül) izolálhatok.
Az „Fc-receptor” vagy „FcR” kifejezésen olyan receptort értünk, amely egy antitest Fc-régiójához képes kötődni. Az Fc-receptor előnyösen natív szekvenciájú humán FcR. Ezenfelül, a találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös Fc-receptor IgG-antitest megkötésére képes (vagyis γ-receptor), mint pl. az FcyRI, FcyRII és FcyRIII alosztályok tagjai, ideértve ezek allélváltozatait és alternatív „splicing” események következtében létrejött alakjait. Az FcyRII-receptorok közé tartozik az FcyRIlA („aktiváló receptor”), és az FcyRIIB („gátló receptor”), melyek hasonló aminosavszekvenciát tartalmaznak - elsősorban citoplazmikus doménjükben térnek el egymástól. Az aktiváló FcyRI IA-receptor citoplazmikus doménjében immunreceptor tirozinalapú aktiváló motívumot (ITAM), míg a gátló FcyRIIBreceptor citoplazmikus doménjében immunreceptor tirozinalapú gátló motívumot (ITIM) tartalmaz [áttekintést lásd Daéron: Annu. Rév. Immunoi. 15, 203 (1997)]. Az Fc-receptorok áttekintő leírását illetően lásd Ravetch és Kinet: Annu. Rév. Immunoi. 9, 457 (1991); Capel és mtsai.: Immunomethods 4, 25 (1994); és de Haas és mtsai.: J. Láb. Clin. Med. 126, 330 (1995). Az Fc-receptor kifejezés magában foglalja az egyéb Fc-receptorokat {ideértve a még azonosításra váró Fc-receptorokat, valamint az újszülöttkori Fc-receptort [FcRn, amely az anyai IgG-molekulák magzatba történő átviteléért felelős; lásd Guyer és mtsai.: J. Immunoi. 117, 587 (1976); és Kim és mtsai.: J. Immunoi. 24, 249 (1994)]}.
A „komplementdependens citotoxicitás” vagy „CDC” kifejezés egy molekula célsejtet - komplement jelenlétében - lizáló képességére vonatkozik. A komplementaktiválási reakcióutat a komplementrendszer első komponensének (C1q) egy közös eredetű antigénnel komplexált molekulához (pl. antitesthez) történő kötődése indítja be. A komplementaktiválás vizsgálatára CDC-tesztet [Id. Gazzano-Santoro és mtsai.: J. Immunoi. Methods 202, 163 (1996)] végezhetünk.
A „natív antitestek” rendszerint kb. 150 000 dalton molekulatömegű heterotetramer glikoproteinek, amelyek két azonos könnyű (L) láncból és két azonos nehéz (H) láncból állnak. Mindkét könnyű lánc egy kovalens diszulfidhíddal kapcsolódik a nehéz lánchoz, míg a különböző immunglobulin-izotípusokban a nehéz láncok között eltérő számú diszulfidkötés található. A nehéz és könnyű láncokban, egymástól szabályos távolságokra, láncon belüli diszulfidkötések helyezkednek el. Mindkét nehéz lánc egyik végén variábilis dómén (VH) található, melyet számos konstans dómén követ. A könnyű láncok egyik végén variábilis dómén (VL), másik végén konstans dómén helyezkedik el; a könnyű lánc konstans doménje a nehéz lánc első konstans doménjével, míg a könnyű lánc variábilis doménje a nehéz lánc variábilis doménjével illeszkedik. Úgy tartják, hogy a nehéz és a könnyű lánc variábilis doménjei között bizonyos aminosavak határfelületet képeznek.
HU 226 742 Β1
Az antitestekkel összefüggésben használt „variábilis” kifejezés arra vonatkozik, hogy a variábilis dómén bizonyos részeinek aminosavszekvenciája az egyes antitestekben nagymértékben eltér egymástól, és ezek a szakaszok felelősek az adott antitest adott antigénre vonatkozó specifitásáért. Mindazonáltal, a variabilitás az antitest variábilis doménjeiben nem egyenletesen oszlik meg, hanem három szakaszra koncentrálódik: ezek az úgynevezett hipervariábilis régiók, amelyek a könnyű lánc és a nehéz lánc variábilis doménjeiben egyaránt megtalálhatók. A variábilis dómén konzerváltabb szakaszait vázrégióknak (FR) nevezzük. A natív antitestek nehéz és könnyű láncainak variábilis doménjei egyenként négy vázrégiót tartalmaznak (melyek többnyire β-redős konfigurációt vesznek fel), és ezeket három komplementaritást meghatározó régió (CDR) köti össze, melyek hurkokat képeznek, és ezek a hurkok kötik össze a β-redős struktúrát (és néhány esetben annak részét is képezik). Az egyes láncokban a vázrégiók szorosan összetartják a komplementaritást meghatározó régiókat, melyek - a másik láncban lévő komplementaritást meghatározó régiókkal együtt - az antitest antigénkötö helyeinek létrehozásában játszanak szerepet [Id. Kábát és mtsai.: „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5. kiadás, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)].
A konstans domének közvetlenül nem játszanak közre az antitest antigénhez történő kötődésében, azonban különféle effektorfunkciókat töltenek be - pl. az antitest részvétele az antitestdependens celluláris citotoxicitásban (ADCC).
Ahogy a találmány leírásában használjuk, a „hipervariábilis régió” kifejezésen egy antitest antigénkötésért felelős aminosavaiból álló régiót értünk. A hipervariábilis régió általában „komplementaritást meghatározó régióból” (CDR) származó aminosavakat tartalmaz - pl. a könnyű lánc variábilis doménjének 24-34. aminosavait (L1), 50-56. aminosavait (L2) és 89-97. aminosavait (L3), valamint a nehéz lánc variábilis doménjének 31-35. aminosavait (H1), 50-65. aminosavait (H2) és 95-102. aminosavait (H3) [Id. Kábát és mtsai.: „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5. kiadás, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] -, és/vagy „hipervariábilis hurokból” származó aminosavakat [pl. a könnyű lánc variábilis doménjének 26-32. aminosavait (L1), 50-52. aminosavait (L2) és 91-96. aminosavait (L3), valamint a nehéz lánc variábilis doménjének 26-32. aminosavait (H1), 53-55. aminosavait (H2) és 96-101. aminosavait (H3); Chothia és Lesk: J. Mól. Bioi. 196, 901 (1987)] tartalmaz. A vázrégiót (FR) alkotó aminosavak a variábilis dómén azon aminosavai, amelyek nem a hipervariábilis régió részét képezik.
Az antitestek papainos emésztése két azonos antigénkötő fragmenst (Fab-fragmensek, melyek egy-egy antigénkötő helyet tartalmaznak), valamint egy maradék Fc-fragmenst eredményez, amelynek neve kristályosodási hajlamára („crystallize”) utal. A pepszines kezelés F(ab’)2-fragmenst eredményez, amelynek két antigénkötő helye van, és képes az antigén keresztkötésére.
Az „Fv-fragmens” az a minimális méretű antitestfragmens, amely még komplett antigénfelismerő és antigénkötő helyet tartalmaz. Ez a régió egy nehéz lánc és egy könnyű lánc variábilis dómén - szoros, nem kovalens kötésű - dimeréből áll. Erre a konfigurációra jellemző, hogy a két variábilis dómén három-három hipervariábilis régiója interakcióba lép, antigénkötő helyet meghatározva ezáltal a VH-VL dimer felületén. A hat hipervariábilis régió - együttesen - az antitest számára antigénkötő specifitást biztosít. Mindazonáltal egyetlen variábilis doménnek (vagy egy Fv-fragmens felének, amely csak három - antigénre specifikus - hipervariábilis régiót tartalmaz) is megvan az a képessége, hogy felismerje és megkösse az antigént, ha kisebb affinitással is, mint a teljes kötőhely megléte esetén.
A Fab-fragmens a könnyű lánc konstans doménjét és a nehéz lánc első konstans doménjét (CH1) is tartalmazza. A Fab’-fragmensek annyiban térnek el a Fabfragmensektől, hogy a nehéz lánc CH1-doménjének C-terminálisán néhány plusz aminosavat tartalmaznak, köztük az antitest csukló („hinge”) régiójának egy vagy több ciszteinjét. A „Fab’-SH” olyan Fab’-fragmens, amelyben a konstans dómén ciszteinje(i) legalább egy szabad tiocsoportot tartalmaz(nak). Az F(ab’)2-fragmensek eredetileg két Fab’-fragmensből jönnek létre, melyek között ciszteinek helyezkednek el. Az antitestfragmensek egyéb kémiai kapcsolási módjai is ismeretesek.
A gerincesekből származó antitestek (immunglobulinok) „könnyű láncai” - konstans doménjeik aminosavszekvenciája alapján - két jól elkülöníthető típus valamelyikébe sorolhatók; ez a két típus a kappa (k) és a lambda (λ).
Az „egyláncú Fv-fragmens” vagy „scFv-fragmens” olyan antitestfragmens, amely egy antitest VH és VL doménjeit tartalmazza, oly módon, hogy ezek a domének egyetlen polipeptidláncon helyezkednek el. Az Fv-polipeptid a VH és VL dómén között előnyösen egy kapcsoló („linker”) polipeptidet tartalmaz, amely az scFv számára lehetővé teszi az antigénkötéshez szükséges szerkezet kialakítását. Az scFv áttekintését lásd Plückthun: „The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” 113, 269 (1994). Az anti-ErbB2 antitest scFv-fragmenseinek leírását illetően lásd a WO 93/16185 számú nemzetközi közzétételi iratot, valamint az 5 571 894 és 5 587 458 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat.
A „diatest” kifejezés olyan kisméretű, két antigénkötő helyet tartalmazó antitestfragmensre vonatkozik, amely nehéz lánc variábilis domént (VH) könnyű lánc variábilis doménhez (VL) kapcsolva, egyazon peptidláncon (VH-VL) tartalmaz. Az azonos láncon lévő két dómén közötti párosodáshoz túl rövid kapcsolópeptid beiktatása révén a domének arra vannak kényszerítve, hogy egy másik lánc komplementer doménjeivel párosodjanak, és így képezzenek két antigénkötő helyet. A diatestek részletesebb leírását lásd pl. EP 404 097 számú európai szabadalmi leírás; WO 93/11161 számú nemzetközi
HU 226 742 Β1 közzétételi irat; és Hollinger és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444(1993).
A nem humán (pl. rágcsálóeredetű) antitestek „humanizált” alakjai olyan kiméra antitestek, amelyek minimális mennyiségű, nem humán immunglobulinból származó szekvenciát tartalmaznak. A humanizált antitestek többnyire olyan humán immunglobulinok (recipiens antitest), amelyekben a recipiens antitest hipervariábilis régiójának aminosavai egy nem humán fajból (pl. egérből, patkányból, nyúlból vagy nem humán főemlősből) származó antitest (donor antitest) hipervariábilis régiójának aminosavaival vannak helyettesítve. Néhány esetben a humán immunglobulin vázrégiójának (FR) aminosavai nem humán immunglobulin megfelelő aminosavaival vannak helyettesítve. Ezenfelül, a humanizált antitestek olyan aminosavakat is tartalmazhatnak, amelyek nem találhatók meg a recipiens antitestben vagy a donor antitestben. Ezek a módosítások az antitest további finomítása céljából hajthatók végre. A humanizált antitest általában egy - jellemzően két variábilis dómén lényegében egészét tartalmazza, mely(ek)ben a hipervariábilis hurkok mindegyike vagy lényegében mindegyike megfelel egy nem humán immunglobulinénak, és a vázrégiók mindegyike vagy lényegében mindegyike humán immunglobulin-szekvenciából származik. A humanizált antitest, adott esetben, egy immunglobulin (jellemzően egy humán immunglobulin) konstans régiójának legalább egy részét is tartalmazza. További részleteket illetően lásd Jones és mtsai.: Natúré 321, 522 (1986); Riechmann és mtsai.: Natúré 332, 323 (1988); Presta: Curr. Op. Struct. Bioi. 2, 593 (1992).
A humanizált anti-ErbB2 antitestek közé tartoznak a következők: huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 és huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®); lásd az 5 821 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás 3. táblázatában, melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk; valamint a humanizált 520 09-antitest (WO 93/21319 számú nemzetközi közzétételi irat) és az alábbiakban leírt humanizált 2C4-antitestek.
Az „izolált” antitest kifejezésen egy - természetes környezetében megtalálható - komponenstől elválasztott és/vagy elkülönített antitestet értünk. A természetes környezetben megtalálható szennyező komponensek az antitest diagnosztikai vagy gyógyászati felhasználását akadályoznák; az ilyen komponensek közé tartoznak az enzimek, hormonok és egyéb - proteinszerű vagy nem proteinszerű - oldott anyagok. A találmány előnyös megvalósítási módjai értelmében az antitest tisztításának mértéke a következő: (1) a Lowry-eljárással végzett meghatározás szerint 95 m/m%-nál nagyobb, legelőnyösebben 99 m/m%-nál nagyobb; (2) forgócsészés („spinning cup”) szekvenátor alkalmazásával legalább 15 aminosavas N-terminális vagy belső aminosavszekvencia kinyeréséhez szükséges tisztaság; vagy (3) redukáló vagy nem redukáló feltételekkel végzett SDS-PAGE-analízissel (Coomassie-kék vagy előnyösen ezüstfestés alkalmazásával) homogenitásnak megfelelő tisztaság. Az izolált antitest kifejezés jelentése kiterjed a rekombináns sejtekben in situ megtalálható antitestre, mivel az ilyen sejtekben az antitest természetes környezetének legalább egy komponense hiányzik. Mindazonáltal az izolált antitesteket általában legalább egy tisztítási lépést követően kapjuk.
Egy kérdéses antigént (pl. ErbB2-antigént) „megkötő” antitesten olyan antitestet értünk, amely az antigént kellő affinitással képes megkötni, miáltal terápiás hatóanyagként alkalmazható az antigént termelő sejt megcélzására. Amennyiben az antitest ErbB2-receptorhoz képes kötődni, rendszerint elsősorban az ErbB2-receptort fogja megkötni (szemben más ErbB-receptorokkal), és előfordulhat, hogy más proteinekkel (pl. EGFR, ErbB3 vagy ErbB4) jelentős mértékben nem lép keresztreakcióba. Az ilyen megvalósítási módokban az antitest nem ErbB2-proteinekhez történő kötődésének (pl. endogén receptorhoz történő sejtfelületi kötődés) mértéke - fluoreszcencia aktiválta sejtosztályozási (FACS) analízissel vagy radioimmunprecipitációval (RIA) meghatározva - 10%-nál kisebb lesz. Bizonyos esetekben az anti-ErbB2 antitest nem lép jelentős mértékű keresztreakcióba a patkányeredetű neu-proteinnel [Id. pl. Schecterés mtsai.: Natúré 312, 513 (1984); Drebin és mtsai.: Natúré 312, 545 (1984)].
Egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását „blokkoló” antitest kifejezésen olyan antitestet értünk, amely csökkenti vagy gátolja a szóban forgó (fentebb leírt) aktiválást, azzal, hogy az antitest lényegesen hatékonyabban képes gátolni az ErbB-receptor ligandum általi aktiválását, mint a 4D5 monoklonális antitest (pl. körülbelül olyan hatékonysággal, mint a 7F3 vagy 2C4 monoklonális antitest vagy ezek Fab-fragmensei, és előnyösen kb. olyan hatékonyan, mint a 2C4 monoklonális antitest vagy Fab-fragmense). Például, az ErbB-receptor ligandum általi aktiválását gátló antitest olyan antitest, amely egy ErbB heterooligomer képződését 50—100%-kal hatékonyabban blokkolja, mint a 4D5-antitest. Egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválásának gátlása tetszőleges módon blokkolható, például a ligandum ErbB-receptorhoz történő kötődésének megakadályozásával; az ErbB-komplex kialakulásának gátlásával; egy ErbB-komplexben lévő ErbB-receptor tirozin-kináz aktivitásának gátlásával; és/vagy ErbB-receptorban lévő tirozin(ok) foszforilációjának gátlásával. Az ErbB-receptorok ligandum általi aktiválását gátló antitestek példái közé tartoznak a következők: 2C4 és 7F3 monoklonális antitest (melyek az ErbB2/ErbB3 és ErbB2/ErbB4 heterooligomerek HRG általi aktiválását, valamint az EGFR/ErbB2 heterooligomer EGF, TGF-α, amphiregulin, HB-EGF és/vagy epiregulin általi aktiválását blokkolják); továbbá az L26-, L96- és L288-antitest [Klapper és mtsai.: Oncogene 14, 2099 (1997)], melyek az EGF és NDF - EGFR-t, ErbB2-t, ErbB3-at és ErbB4-et termelő - T47D-sejtekhez történő kötődését gátolják.
Egy adott antitest (pl. 2C4 monoklonális antitest) „biológiai tulajdonságával bíró antitest kifejezésen olyan antitestet értünk, amely az adott antitest biológiai tulajdonságai közül eggyel vagy többel bír, ami megkü10
HU 226 742 Β1 lönbözteti az ugyanazon antigénhez (pl. ErbB2-receptorhoz) kötődő egyéb antitestektől. Például a 2C4-antitest biológiai tulajdonságával bíró antitest blokkolhatja egy - ErbB2-t és ErbB3-at vagy ErbB4-et tartalmazó ErbB heterooligomer HRG általi aktiválását; blokkolja egy - EGFR-t és ErbB2-t tartalmazó - ErbB-receptorEGF, TGFa, HB-EGF, epiregulin és/vagy amphiregulin általi aktiválását; blokkolja az MAPK EGF, TGF-a és/vagy HRG közvetítette aktiválását; és/vagy az ErbB2 extracelluláris doménjének ugyanazon epitópjához kötődik, mint a 2C4-antitest (pl. amely blokkolja a 2C4 monoklonális antitest ErbB2-höz történő kötődését).
Ha másképpen nem jelezzük, a „2C4 monoklonális antitest” kifejezés olyan antitestre vonatkozik, amely a példákban leírt egéreredetű 2C4-antitest antigénkötö aminosavait tartalmazza. Például, a 2C4 monoklonális antitest egéreredetű 2C4 monoklonális antitest vagy változata lehet, például humanizált 2C4-antitest, amely az egéreredetű 2C4-antitest antigénkötö aminosavait tartalmazza. A humanizált 2C4-antitestek jellemző képviselőit a 3. példában ismertetjük. Ha másképpen nem jelezzük, az „rhuMAb 2C4” kifejezés olyan antitestre vonatkozik, amely a 3. azonosító számú szekvenciaként bemutatott variábilis könnyű lánc (VL) szekvenciát és a 4. azonosító számú szekvenciaként bemutatott variábilis nehéz lánc (VL) szekvenciát humán lgG1 (nem A-allotípus) könnyű és nehéz láncának konstans régió szekvenciáihoz fuzionáltatva tartalmazza (adott esetben CHO-sejtekben termeltetve).
Ha másképpen nem jelezzük, a „4D5 monoklonális antitest” kifejezés olyan antitestre vonatkozik, amely egéreredetű 4D5-antitestből származó antigénkötő aminosavakat tartalmaz. Például, a 4D5 monoklonális antitest egéreredetű 4D5 monoklonális antitest (ATCC CRL 10463) vagy annak változata lehet (például humanizált 4D5-antitest), amely az egéreredetű 4D5 monoklonális antitest antigénkötő aminosavait tartalmazza. A jellemző humanizált 4D5-antitestek példái a következők: huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 és huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®), lásd 5 821 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás, melyek közül a huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) az előnyös humanizált 4D5-antitest.
Ahogy itt használjuk, a „sejtszaporodást gátló hatóanyag” kifejezés olyan vegyületre vagy készítményre vonatkozik, amely in vitro vagy in vivő gátolja egy sejt elsősorban ErbB-receptort termelő ráksejt - szaporodását. Ilyenformán a szaporodást gátló hatóanyag jelentős mértékben csökkentheti az S-fázisban lévő ErbB-termelő sejtek százalékos arányát. A szaporodást gátló hatóanyagok jellemző példái közé tartoznak a sejtciklus előrehaladását (az S-fázistól eltérő ponton) blokkoló hatóanyagok, például a G1-fázisban vagy az M-fázisban történő megrekedést indukáló anyagok. A klasszikus M-fázis-blokkolók közé tartoznak a vincavegyületek (pl. cincristin és vinblastin), a taxánok és topo-ll-inhibitorok, pl. doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposid és bleomycin. A G1-fázist feltartóztató hatóanyagok S-fázisban történő blokkolásba is átnyúlhatnak, mint pl. a DNS-alkilező szerek (pl. tamoxifen, prednison, dacarbazin, mechlorethamin, cisplatin, methotrexat, 5-fluoruracil és ara-C). További részleteket illetően lásd „The Molecular Basis of Cancer”, szerk.: Mendesohn és Israel, 1. fejezet, Murakami és mtsai.: „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs” (WB Saunders; Philadelphia, 1995), különös tekintettel a 13. oldalra.
A „sejtszaporodást gátló” antitestek jellemző példái azok, amelyek kötődnek az ErbB2-receptorhoz, és gátolják az ErbB2-t túlzott mértékben termelő ráksejtek szaporodását. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös, sejtszaporodást gátló antiErbB2 antitestek sejttenyészetben, kb. 0,5-30 pg/ml koncentrációban 20%-nál nagyobb mértékben, előnyösen 50%-nál nagyobb mértékben (kb. 50-100%-ban) gátolják az SK-BR-3 emlőtumorsejtek szaporodását (a szaporodásgátlást az SK-BR-3 sejtek antitesttel történő érintkeztetése után hat nappal meghatározva; lásd 5 677 171 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az SK-BR-3 sejtek szaporodásgátlási tesztjének részletes leírását lásd az 5 677 171 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és az alábbiakban. Az előnyös szaporodásgátló antitest a 4D5 monoklonális antitest, pl. humanizált 4D5-antitest.
A „sejthalált” indukáló molekula (pl. antitest) olyan molekula, amely életképes sejtet életképtelenné tesz. A szóban forgó sejt általában ErbB2-receptort termelő sejt, elsősorban ErbB2-receptort túlzott mértékben termelő sejt. A szóban forgó sejt előnyösen ráksejt, pl. emlőrák-, petefészekrák-, gyomorrák-, endometriumrák-, nyálmirigyrák-, tüdőrák-, veserák-, vastagbélrák-, pajzsmirigyrák-, hasnyálmirigyrák-, prosztatarák- vagy húgyhólyagráksejt. In vitro a sejt SK-BR-3, BT474, CaIu3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 vagy SKOV3 sejt lehet. In vitro a sejthalál - az antitestdependens sejt közvetítette citotoxicitás (ADCC) és a komplementdependens citotoxicitás (CDC) által indukált sejthalál megkülönböztetése érdekében - komplement és immuneffektorsejtek hiányában határozható meg. Ilyenformán a sejthalál kimutatási tesztje hővel inaktivált szérum alkalmazásával (vagyis komplement hiányában) és immuneffektorsejtek hiányában hajtható végre. Annak megállapítása céljából, hogy a molekula képes-e sejthalált indukálni, a sejtmembrán épségének - propidium-jodid (Pl), tripánkék [Id. Moore és mtsai.: Cytotechnology 17, 1 (1995)] vagy 7AAD felvétele alapján meghatározott - károsodása a kezeletlen sejtekéhez viszonyítva értékelhető. Az előnyös sejthalált indukáló antitestek azok, amelyek P1-felvételi teszt során BT474-sejtekben P1-felvételt képesek indukálni.
Az „apoptózist indukáló” molekula (pl. antitest) olyan molekula, amely programozott sejthalált indukál, amely standard apoptózistesztekkel - pl. annexin-V megkötése, DNS-fragmentáció, sejtzsugorodás, endoplazmatikus retikulum tágulása, sejtfeldarabolódás és/vagy membránvezikulák (ún. apoptózisos testek) képződése alapján - határozható meg. A szóban forgó sejt általában ErbB2-receptort termelő sejt, elsősorban
HU 226 742 Β1
ErbB2-receptort túlzott mértékben termelő sejt. A szóban forgó sejt előnyösen ráksejt, pl. emlőrák-, petefészekrák-, gyomorrák-, endometriumrák-, nyálmirigyrák-, tüdőrák-, veserák-, vastagbélrák-, pajzsmirigyrák-, hasnyálmirigyrák-, prosztatarák- vagy húgyhólyagráksejt. In vitro a sejt SK-BR-3, BT474, Calu3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 vagy SK0V3 sejt lehet. Az apoptózissal kapcsolatos celluláris események értékelésére különféle eljárások állnak rendelkezésre. Például annexinkötés alapján foszfatidil-szerin (PS) transzlokáció mérhető; DNS-létrázás alapján DNSfragmentáció; és hipodiploid sejtek számának növekedése alapján DNS-fragmentációval együttes sejtmag/kromatin kondenzáció értékelhető. Az apoptózist indukáló molekula előnyösen olyan molekula, amely BT474-sejtek alkalmazásával végzett annexinkötési tesztben - a kezeletlen sejtekhez viszonyítva - kb. 2-50-szeres, előnyösen kb. 5-50-szeres, legelőnyösebben kb. 10-50-szeres annexinindukciót eredményez. Bizonyos esetekben a proapoptózisos molekula olyan molekula, amely gátolja egy ErbB-receptor ErbBligandum általi aktiválását is (pl. 7F3-antitest), vagyis az antitest a 2C4 monoklonális antitestével azonos biológiai tulajdonsággal bír. Más esetekben az ilyen molekula nem blokkolja jelentős mértékben egy ErbB-receptor ErbB-ligandum általi aktiválását (pl. 7C2-antitest). Ezen túlmenően, az antitest anélkül is indukálhat apoptózist (mint pl. a 7C2-antitest), hogy az S-fázisban lévő sejtek százalékos arányának nagymértékű csökkenését okozná (pl. az ilyen sejtek százalékos arányát a kontrolihoz képest csak 0—10%-kal csökkentő molekula).
A „2C4-epitóp” az ErbB2 extracelluláris doménjének azon régiója, amelyhez a 2C4-antitest kötődni képes. A 2C4-epitóphoz kötődni képes antitestek azonosítására rutinszerű keresztblokkolási tesztet végezhetünk [Id. pl. „Antibodies, A Laboratory Manual, szerk.: Harlow és Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)]. Más módon, epitóp-térképezést végezhetünk annak meghatározása céljából, hogy az antitest kötődik-e az ErbB2 2C4-epitópjához (pl. az ErbB2 kb. 22. aminosavától kb. 584. aminosaváig terjedő régióban egy vagy több aminosavhoz; lásd 1 A. és 1B. ábra).
A ,,4D5-epitóp’’ az ErbB2 extracelluláris doménjének azon régiója, amelyhez a 4D5-antitest (ATCC CRL 10463) kötődni képes. Ez az epitóp közel van az ErbB2 transzmembrán doménjéhez. A 4D5-epitóphoz kötődő antitestek azonosítása céljából szokványos keresztblokkolási tesztet végezhetünk (lásd pl. Harlow és Lane, lásd fentebb). Más módon, epitóp-térképezést végezhetünk annak meghatározása céljából, hogy az antitest kötődik-e az ErbB2 4D5-epitópjához (pl. az ErbB2 kb. 529. aminosavától kb. 625. aminosaváig terjedő régióban egy vagy több aminosavhoz, lásd 1A. és 1B. ábra).
A „3H4-epitóp” az ErbB2 extracelluláris doménjének azon régiója, amelyhez a 3H4-antitest kötődni képes. Ez az epitóp az ErbB2 extracelluláris doménje aminosavszekvenciájának kb. 541-599. aminosavait foglalja magában (lásd 1A. és 1B. ábra).
A „7C2/7F3-epitóp” az ErbB2 extracelluláris doménje N-terminálisának azon régiója, amelyhez a 7C2és/vagy 7F3-antitest (mindkettő az ATCC-nél letétbe helyezve, lásd lentebb) kötődni képes. A 7C2/7F3-epitóphoz kötődni képes antitestek azonosítása céljából szokványos keresztblokkolási tesztet végezhetünk (lásd pl. Harlow és Lane, lásd fentebb). Más módon, epitóp-térképezést végezhetünk annak meghatározása céljából, hogy az antitest kötődik-e az ErbB2 7C2/7F3epitópjához, pl. az ErbB2 kb. 22. aminosavától kb. 53. aminosaváig terjedő régióban egy vagy több aminosavhoz (lásd 1A. és 1B. ábra).
A „kezelés kifejezésen terápiás célú, illetve megelőzési célú (profilaktikus) kezelést értünk. A kezelésre szoruló páciensek közé tartoznak a már rendellenességtől szenvedők, illetve azok, akiknél a rendellenesség kifejlődésének megelőzésére van szükség. Ilyenformán egy kezelendő emlős a betegségtől vagy rendellenességtől szenvedőnek vagy a betegségre fogékonynak diagnosztizálható.
A találmány céljaira az „emlős” kifejezésen az emlősök osztályába sorolt állatokat értünk, ideértve az embert, a háziállatokat és gazdasági haszonállatokat, állatkerti állatokat, sportolási, ill. kedvtelési célból tartott állatokat (pl. kutyák, lovak, macskák, szarvasmarhák stb.). Az emlős kifejezésen előnyösen embert értünk.
A „rendellenesség” kifejezés olyan állapotot jelent, amelyre az anti-ErbB2 antitesttel végzett kezelés jótékony hatású. Az ilyen rendellenességek közé krónikus és akut rendellenességek vagy betegségek tartoznak, ideértve azon kóros állapotokat is, amelyek az emlőst hajlamossá teszik a szóban forgó rendellenesség kialakulására. A találmány szerinti megoldás értelmében kezelhető rendellenességek példái közé tartoznak, többek között, a következők: jóindulatú és malignáns tumorok; leukózisok és malignáns lymphoid betegségek; valamint egyéb rendellenességek, mint pl. idegsejt-, gliasejt-, asztrocita-, hipotalamusz-, mirigy-, makrofág-, epithelsejt-, stroma-, blasztocöl-, gyulladásos, angiogén és immunológiai rendellenességek.
A „terápiás szempontból hatásos mennyiség” kifejezésen egy hatóanyag azon mennyiségét értjük, amely hatásos egy adott betegség vagy rendellenesség emlősben történő kezelésére. Rákos betegség esetén a hatóanyag terápiás szempontból hatásos mennyisége: csökkenti a rákos sejtek számát; csökkentheti a tumor méretét; gátolja (azaz bizonyos mértékben lassítja, előnyösen blokkolja) a rákos sejt perifériás szervekbe történő infiltrációját; gátolja (azaz bizonyos mértékben lassítja, előnyösen blokkolja) a tumor metasztázisát; gátolja (bizonyos mértékben) a tumor növekedését; és/vagy bizonyos mértékben enyhíti a rákkal összefüggő egy vagy több tünetet. A hatóanyagnak a létező ráksejtek szaporodásának gátlására és/vagy pusztítására kifejtett hatásának mértéke citosztatikus és/vagy citotoxikus lehet. Rákterápia esetében a hatékonyság, például a betegség progressziós idejének (TTP) mérésével és/vagy a reakcióráta (RR) mérésével határozható meg.
HU 226 742 Β1
A „rák” és „rákos” kifejezések emlősök olyan fiziológiai állapotára vonatkoznak, amelyek szabályozatlan sejtszaporodással jellemezhetők. A rákok példái közé tartoznak, többek között, a carcinomák, limfómák, blastomák, sarcomák, leukémiák, valamint a leukózisok és a limfoid malignáns betegségek. A rákok konkrét példái közé tartozik a pikkelysejtes rák (pl. epithelialis pikkelysejtes rák), a tüdőrák (kissejtes és nem kissejtes tüdőrák, tüdőadenocarcinoma és pikkelysejtes tüdőcarcinoma), hashártyarák, hepatocelluláris rák, gyomor- vagy hasi rákok, pl. gastrointestinalis rák, hasnyálmirigyrák, glioblastoma, méhnyakrák, petefészekrák, májrák, húgyhólyagrák, hepatoma, emlőrák, vastagbélrák, végbélrák, vastag- és végbélrák, endometrium- vagy méhcarcinoma, nyálmirigyrák, veserák, prosztatarák, szeméremtestrák, pajzsmirigyrák, májcarcinoma, végbélcarcinoma, peniscarcinoma, valamint fej- és nyakrák.
Az „ErbB-receptort termelő rák” vagy „ErbB-receptor termelésével jellemezhető rák” kifejezésen olyan rákot értünk, amely - sejtfelületükön ErbB-proteint hordozó - sejteket tartalmaz. Az ilyen rákos sejtek felületükön elegendő ErbB2-receptort termelnek ahhoz, hogy egy anti-ErbB2 antitest képes legyen hozzájuk kötődni, és a rák vonatkozásában terápiás hatást kifejteni.
Az ErbB-receptor „túlzott mértékű aktiválásával jellemezhető rák” kifejezés olyan rákra vonatkozik, amelynél a rákos sejtekben lévő ErbB-receptor aktiváltsági szintje jelentősen meghaladja az ugyanazon szövettípus nem rákos sejtjeiben lévő ErbB-receptoré. Az ilyen túlzott aktiválást az ErbB-receptor túltermelődése és/vagy a rákos sejtekben az ErbB-receptor aktiválására hozzáférhető ErbB-ligandum normálisnál nagyobb mennyisége okozhatja. A túlzott aktiválás egy rákos sejt malignáns állapotát idézheti elő (és/vagy a túlzott aktiválást maga a rákos sejt malignáns állapota is okozhatja). Bizonyos megvalósítási módokban a rákot diagnosztikai vagy prognosztizáló vizsgálatnak vetjük alá, hogy meghatározzuk, vajon kimutatható-e egy ErbB-receptor amplifikációja és/vagy túltermelődése, amely az ErbB-receptor túlzott aktiválását eredményezheti. Más módon, vagy ezenfelül, diagnosztikai és prognosztizáló vizsgálatot végezhetünk annak megállapítása céljából, hogy a rákban kimutatható-e egy ErbB-ligandum amplifikációja és/vagy túltermelődése, ami a receptor túlzott aktiválását okozhatja. Az ilyen rákok egy részénél a receptor túlzott mértékű aktiválását autokrin stimulátor reakcióút idézheti elő.
Egy „autokrin” stimulátor reakcióútban önstimuláció következik be azáltal, hogy a ráksejt egyaránt termeli az ErbB-ligandumot és az annak megfelelő ErbB-receptort. Például, a rákos sejt termeli vagy túltermeli az EGFR-t, miközben EGFR-ligandumot (pl. EGF-et, TGF-a-t vagy HB-EGF-et) is termel vagy túltermel. Más esetben a ráksejt ErbB2-t és heregulint (pl. γ-HRG-t) egyaránt termel vagy túltermel.
Az ErbB-receptort „túlzott mértékben termelő” vagy „túltermelő” rák kifejezésen olyan rákot értünk, amely egy ErbB-receptort (pl. HER2-t) lényegesen nagyobb mennyiségben termel, mint az ugyanazon szövettípus nem rákos sejtjei. Az ilyen túlzott mértékű termelődést génsokszorozódás vagy fokozott mértékű transzkripció vagy transzláció okozhatja. Az ErbB-receptor túlzott mértékű termelődése diagnosztikai vagy prognosztizáló teszttel, az ErbB-receptor sejtfelületen jelen lévő fokozott szintjének meghatározásával értékelhető [pl. immunhisztokémiai (IHC) teszttel]. Más módon - vagy emellett - meghatározhatjuk a sejtben lévő, ErbB-t kódoló nukleinsav mennyiségét is, például fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH; lásd WO 98/45479 számú nemzetközi közzétételi irat), Southern-blot technikával vagy polimeráz-láncreakciós (PCR) technikával, pl. valós idejű („reál time”) kvantitatív PCR (RT-PCR) alkalmazásával. Az ErbB-receptor túlzott mértékű termelődése biológiai mintába (pl. vérsavóba) kibocsátott antigén (pl. ErbB extracelluláris dómén) mennyiségének mérésével is meghatározható [Id. pl. 4 933 294 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; WO 91/05264 számú nemzetközi közzétételi irat; 5 401 638 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Sias és mtsai.: J. Immunoi. Methods 132, 73 (1990)]. A fenti tesztek mellett számos in vivő vizsgálati eljárás is a szakember rendelkezésére áll. Például a páciens testében lévő sejteket - adott esetben detektálható jelölőanyaggal, pl. radioaktív izotóppal jelölt - antitesttel érintkeztethetjük, és az antitest sejtekhez történő kötődése, például a radioaktivitás külsődleges pásztázásával vagy a páciensből vett biopszia vizsgálatával határozható meg.
Ezzel szemben az a rák, amelyre az „ErbB2-receptor túlzott mértékű termelődése nem jellemző”, olyan rák, amely diagnosztikai tesztben az ErbB2-receptort nem termeli nagyobb mennyiségben, mint az azonos szövettípusból származó nem rákos sejt.
Az „ErbB-ligandumot túlzott mértékben termelő” rák kifejezésen olyan rákot értünk, amely lényegesen nagyobb mennyiségben termeli az ErbB-ligandumot, mint az azonos szövettípusból származó nem rákos sejt. Az ilyen túlzott mértékű termelődést génsokszorozódás vagy fokozott mértékű transzkripció vagy transzláció okozhatja. Az ErbB-ligandum túlzott mértékű termelődése diagnosztikai teszttel, a páciensben lévő ligandum (vagy az azt kódoló nukleinsav) szintjének meghatározásával mutatható ki, pl. tumorbiopsziában végzett meghatározással vagy olyan tesztekkel, mint az IHC, FISH, Southern-blot analízis, PCR vagy a fentebb említett in vivő tesztek.
A „hormonfüggetlen” rák kifejezésen olyan rákot értünk, amelyben a rákos sejtek proliferációja nem függ a rákos sejtek által termelt receptorhoz kötődő hormon jelenlététől. Az ilyen rákok - a hormon koncentrációját a tumorban vagy annak közelében csökkentő - gyógyszeres kezelés vagy sebészeti beavatkozás hatására nem mutatnak klinikai regressziót. A hormonfüggetlen rákok jellemző példái közé tartozik az androgénhormonfüggetlen prosztatarák, az ösztrogénfüggetlen emlőrák, endometriumrák és petefészekrák. Az ilyen rákok hormonfüggő tumorokként kezdődhetnek, és antihormonális terápiát követően hormonszenzitív stádiumból hormonnal nehezen kezelhető tumorokká fejlődhetnek.
Ahogy a leírásban használjuk, a „citotoxikus hatóanyag” kifejezésen olyan anyagot értünk, amely gátolja
HU 226 742 Β1 a sejtek működését, és/vagy azok elpusztítását eredményezi. A citotoxikus hatóanyagok közé tartoznak a radioaktív izotópok (pl. At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, és a Lu radioaktív izotópjai); a kemoterápiás hatóanyagok; valamint a toxinok, pl. a kis molekulájú toxinok és az enzimatikusan aktív toxinok, melyek bakteriális, gomba-, növényi vagy állati eredetűek lehetnek (ideértve az ilyen toxinok fragmenseit és/vagy változatait).
A „kemoterápiás hatóanyag” kifejezésen rák kezelésére alkalmas vegyületet értünk. A kemoterápiás hatóanyagok példái közé tartoznak a következők: alkilezőszerek, pl. thiotepa és ciklofoszfamid (CYTOXAN™); alkilszulfonátok, pl. buszulfán, improszulfén és piposzulfán; aziridinek, pl. benzodopa, carboquon, meturedopa és uredopa; etiléniminek és metilamelaminok, pl. altretamin, trietilénmelamin, trietilén-foszforamid, trietilén-tiofoszforamid és trimetilolomelamin; nitrogénmustárok, pl. klórambucil, klórnafazin, cholofoszfamid, esztramusztin, ifoszfamid, meklóretamin, meklóretamin-oxid-hidroklorid, melphalan, novembichin, phenesterin, prednimusztin, trofoszfamid, uracil-mustár; nitrosureák, pl. carmustin, chlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotikumok, pl. aclacinomicinek, actinomicin, authramicin, azaszerin, bleomicinek, cactinomicin, calicheamicin, carabicin, carminomicin, carzinofilin, chromomicinek, dactionixnicin, aunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucin, doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomicin, mitomicinek, mikofenolsav, nogalamicin, olivomicinek, peplomicin, potfiromicin, puromicin, quelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabolitok, pl. methotrexát és 5-fluoruracil (5-FU); folsavanalógok, pl. denopterin, methotrexát, pteropterin, trimetrexát; purinanalógok, pl. fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinanalógok, pl. ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, carmofur, cytarabin, didezoxiuridindoxifluridin, enocitabin, floxuridin, 5-FU; androgének, pl. calusteron, dromostanolon-propionát, epitiostanol, mepitiostán, testolakton; mellékvesehormon elleni hatóanyagok, pl. aminoglutatimid, mitotan, trilostan; folsavkiegészítők, pl. frolinsav; aceglaton; aldofoszfamid-glikozid; aminolevulinsav; amsacrin; bestrabucil; bisantren; edatraxát; defofamin; demecolcin; diaziquon; elfornitin; elliptinum-acetát; etoglucid; gallium-nitrát; hidroxi-karbamid; leninan; lonidamin; mitoguazon; mitoxantron; mopidamol; nitracrin; pentostatin; phenamet; pirarubicin; podofillinsav; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK; razoxán; sizofiran; spirogermánium; tenuazonsav; triaziquon; 2,2’,2”-triklór-trietil-amin; uretán; vindezin; dacarbazin; mannomustin; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitozin; arabinozid (Ara-C); ciklofoszfamid; tiotepa; taxoidok, pl. paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ, USA) és doxataxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Franciaország); chlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; markaptopurin; methotrexát; platinaanalógok, pl. cisplatin és carboplatin; vinblasztin; platina; etoposid (VP-16); ifoszfamid; mitomicin-C; mitoxantron; vincristin; vinorelbin; navelbin; novantron; teniposid; daunomicin; aminopterin; xeloda; ibandronát; CPT-11; topoizomeráz inhibitor RFS 2000; difluor-metilornitin (DMFO); retinasav; esperamicinek; capecitabin; valamint a felsorolt vegyületek gyógyászati szempontból elfogadható sói, savai és származékai. A kemoterápiás hatóanyagok közé tartoznak az anti hormonális hatóanyagok, amelyek a hormonok tumorokra kifejtett hatását szabályozzák vagy gátolják; ilyenek pl. az antiösztrogének, pl. a tamoxifen, raloxifen, aromatázgátló 4(5)-imidazolok, t-hidroxitamoxifen, trioxifén, keoxifén, LY117018, onapriston és toremifén (Fareston); és antiandrogének, pl. flutamid, nilutamid, bicalutamid, leuprolid és goserelin; valamint a felsoroltak gyógyászati szempontból elfogadható sói, savai és származékai.
Az „EGFR-t megcélzó” vagy „EGFR-re irányuló” drog vagy hatóanyag kifejezésen olyan hatóanyagot értünk, amely kötődik az EGFR-hez és - adott esetben gátolja annak aktivitását. Az ilyen hatóanyagok példái közé tartoznak az EGFR-hez kötődő antitestek és kisméretű molekulák. Az EGFR-t megkötő antitestek jellemző példái közé tartoznak a következők: MAb579 (ATCC CRL HB 8506), MAb455 (ATCC CRL HB8507), MAb225 (ATCC CRL 8508), MAb528 (ATCC CRL 8509) (lásd 4 943 533 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás), valamint ezek változatai, pl. a kimérikus 225-antitest (C225) és az átalakított humán 225-antitest (H225; lásd WO 96/40210 számú nemzetközi közzétételi irat; Imclone Systems Inc.); a II. típusú mutáns EGFR-hez kötődő antitestek (lásd 5 212 290 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás); és az EGFRhez kötődő humán antitestek (lásd WO 98/50433 számú nemzetközi közzétételi irat; Abgenix). Az EGFR elleni antitest citotoxikus hatóanyaghoz konjugálható, miáltal immunkonjugátumot kapunk (lásd pl. EP 659 439 A2 számú európai szabadalmi bejelentés). Az EGFR-hez kötődő kisméretű molekulák példáiként az ZD1839-et (Astra Zeneca), CP-358774-et (OSl/Pfizer) és az AG1478-at említjük.
Az „angiogenezist gátló hatóanyag” kifejezésen olyan vegyületet értünk, amely blokkolja vagy bizonyos mértékben gátolja a vérerek képződését. Az angiogenezist gátló faktor, például kisméretű molekula vagy antitest, amely képes megkötni egy angiogenezisben szerepet játszó növekedési faktort vagy növekedési faktor receptort. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös angiogenezist gátló faktor a vascularis endothelialis növekedési faktort (VEGF) megkötő antitest.
A „citokin” kifejezés egy adott sejtpopuláció által kiválasztott - intercelluláris mediátorként más sejtekre ható - proteinek általános elnevezése. Az ilyen citokinek jellemző képviselői a limfokinek, monokinek és a szokványos polipeptid hormonok. A citokinek közé tartoznak a növekedési hormonok, mint pl. a humán növekedési hormon, a humán növekedési hormon N-metionil-származéka, és a szarvasmarha növekedési hormon; parathyroid hormon; tiroxin; inzulin; proinzulin; relaxin; prorelaxin; glikoprotein hormonok, pl. follikuluszstimuláló hormon (FSH), pajzsmirigy-stimuláló hormon
HU 226 742 Β1 (TSH) és luteinizáló hormon (LH); májeredetű növekedési faktor; fibroblaszt növekedési faktor; prolaktin; méhlepény-eredetű laktogén; tumornekrózis-faktor-a és -β; müllerianosist gátló szubsztancia; egéreredetű gonadotropinasszociált peptid; inhibin; aktivin; vascularis endotheliális növekedési faktor; integrin; trombopoietin (TPO); idegsejt-növekedési faktorok, pl. NGF-β; vérlemezke-eredetű növekedési faktor; transzformáló növekedési faktorok (TGF-ek), pl. TGF-α és TGF-β; inzulinszerű növekedési faktor-l és -II; eritropoietin (EPO); oszteoinduktív faktorok; interferonok, pl. interferon-α, -β és -γ; kolonizációt stimuláló faktorok (CSF-ek), pl. makrofágeredetű CSF (M-CSF), granulocita-makrofág-eredetű CSF (GM-CSF), és granulocitaeredetű CSF (G-CSF); interleukinek (IL-ek), pl. IL—1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL—12, IL—15; továbbá egyéb polipeptidfaktorok, pl. LIF és kit-ligandum (KL). Ahogy a leírásban használjuk, a „citokinek” kifejezés jelentése természetes forrásokból vagy rekombináns sejttenyészetböl származó proteinekre (illetve a natív szekvenciájú citokinek biológiai aktivitású ekvivalenseire) egyaránt kiterjed.
Ahogy a találmány leírásában használjuk, a „prodrog” kifejezésen egy gyógyászatilag aktív vegyület prekurzorát vagy származékát értjük, amely a tumorsejtekre az eredeti hatóanyagnál (drognál) kevésbé citotoxikus, és enzimatikusan a nagyobb aktivitású eredeti alakká aktiválható, illetve alakítható [Id. pl. Wilman: Biochemical Society Transactions 14, 375 (1986); és Stella és mtsai.: „Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, a „Directed Drug Delivery” című kiadvány (szerk.: Borchardt és mtsai., Humana Press) 247-267. oldalain (1985)]. A találmány szerinti prodrogok közé tartoznak, többek között, a következők: foszfáttartalmú prodrogok, tiofoszfáttartalmú prodrogok, szulfáttartalmú prodrogok, peptidtartalmú prodrogok, D-aminosavval modifikált prodrogok, glikozilált prodrogok, β-laktám-tartalmú prodrogok, adott esetben szubsztituált fenoxi-acetamid-tartalmú prodrogok, adott esetben szubsztituált fenil-acetamid-tartalmú prodrogok, 5-fluorcitozin és egyéb 5-fluoruridin prodrogok, amelyek nagyobb aktivitású, szabad citotoxikus drogokká alakíthatók. A találmány szerinti felhasználás céljából prodrog alakká derivatizálható citotoxikus drogok példái közé tartoznak, többek között, a fentebb említett kemoterápiás hatóanyagok.
A „liposzóma” kifejezésen kisméretű vezikulát értünk, amely különféle típusú lipidekből, foszfolipidekből és/vagy felületaktív anyagokból áll, és hatóanyagok (pl. találmány szerinti anti-ErbB2 antitestek és, adott esetben, kemoterápiás hatóanyag) emlősnek történő adagolására alkalmazhatók. A liposzóma komponensei rendszerint kettős réteg formátumban vannak elrendeződve (hasonlóan a biológiai membránok lipidelrendeződéséhez).
A „termékismertető” kifejezésen gyógyászati termékekhez általánosan mellékelt útmutatót értünk, amely a gyógyászati termék alkalmazására vonatkozó indikációkat, a gyógyszer dozírozását, adagolási módját, ellenjavallatait és/vagy figyelmeztetéseket tartalmaz.
A „kardioprotektáns” kifejezésen olyan vegyületet vagy készítményt értünk, amely gátolja vagy csökkenti egy hatóanyag - pl. egy anthracyclin antibiotikum és/vagy anti-ErbB antitest vagy annak maytansinoidkonjugátuma - páciensnek történő adagolásával összefüggő szívizom-diszfunkciót (szívizombántalmat és/vagy pangásos szívelégtelenséget). A kardioprotektáns például blokkolja vagy csökkenti a szabad gyökök közvetítette kardiotoxikus hatásokat és/vagy megakadályozza vagy csökkenti az oxidatív stressz sérülést. Az így definiált kardioprotektánsok példái közé tartoznak a következők: vas-kelát-képző dexrazoxán [ICRF187; Steifert és mtsai.: The Annals of Pharmacotherapy 28, 1063 (1994)]; lipidszintcsökkentő hatóanyag és/vagy antioxidáns, pl. probucol [Singal és mtsai.: J. Mól. Cell Cardiol. 27, 1055 (1995)]; amifostin (aminotiol-2-[(3-ami no-propil)-amino]-etán-tiol-d ihid rogénfoszfát észter, más néven WR-2721, valamint ennek defoszforilált - sejt által felvett - alakja, a WR-1065) és S-3-(3-metil-amino-propil-amino)-propil-foszfortiosav (WR-151327); lásd Green és mtsai.: Cancer Research 54, 738 (1994); digoxin [Bristow: „Drug-lnduced Heart Disease”, szerk.: Bristow, New York, Elsevier, 191215. old. (1980)]; β-blokkolók, pl. metoprolol [Hjalmarson és mtsai.: Drugs 47 (Suppl. 4), 31 (1994); Shaddy és mtsai.: Am. Heart J. 129, 197 (1995)] E-vitamin; aszkorbinsav (C-vitamin); szabadgyök-megkötök, pl. oleanolsav, ursolsav és N-acetilcisztein (NAC); „spin trapping” vegyületek, pl. α-fenil-t-butil-nitron [PBN; Paracchini és mtsai.: Anticancer Rés. 13, 1607 (1993)]; szerves szelénvegyületek, pl. P251 (Elbesen); és hasonlók.
Az „izolált” nukleinsavmolekula olyan nukleinsavmolekula, amely legalább egy, természetes forrásában megtalálható szennyező nukleinsavmolekulától el van különítve. Az izolált nukleinsavmolekula nem azonos a természetben megtalálható alakjával. Ilyenformán az izolált nukleinsavmolekulák megkülönböztethetők a természetes sejtekben létező nukleinsavmolekuláktól. Mindazonáltal izolált nukleinsavmolekula az is, amely az antitestet rendesen termelő sejtben, de a természetes sejtektől eltérő kromoszomális helyen található meg.
A „szabályozószekvenciák” kifejezésen olyan DNSszekvenciákat értünk, amelyek egy adott gazdaszervezetben egy működőképesen kapcsolt kódolószekvencia expresszáltatásához szükségesek. A prokarióta gazdasejtek számára megfelelő szabályozószekvencia például a promoter, adott esetben az operátorszekvencia, valamint a riboszómakötő hely. Az eukarióta sejtekről ismeretes, hogy promotereket, erősítőszekvenciákat, „splicing’-szignálokat és poliadenilációs szignálokat alkalmaznak.
Egy nukleinsav akkor „működőképesen kapcsolt”, ha egy másik nukleinsavszekvenciával funkcionális kapcsolatban van. Például egy preszekvencia vagy szekréciós vezetőszekvencia DNS-e akkor van működőképesen egy polipeptidet kódoló DNS-hez kapcsolva, ha olyan preproteinként expresszálódik, amely részt vesz a polipeptid szekréciójában. Egy promoter vagy egy erősítőszekvencia akkor van működőképe15
HU 226 742 Β1 sen egy kódolószekvenciához kapcsolva, ha hatással van a szekvencia transzkripciójára. Egy riboszómakötő hely akkor van működőképesen egy kódolószekvenciához kapcsolva, ha elősegíti a transzlációt. A „működőképesen kapcsolt” kifejezés általában azt jelenti, hogy az összekapcsolt DNS-szekvenciák egymással határosak, és - szekréciós vezetőszekvencia esetében - egymással határosak és azonos leolvasási fázisban vannak, ugyanakkor, az erősítőszekvenciák esetében nem követelmény, hogy összeérőek legyenek. Az összekapcsolás szokványos restrikciós helyeknél ligálással valósítható meg. Ha ilyen helyek nem léteznek, az általános gyakorlatnak megfelelően szintetikus oligonukleotid-adapterek vagy kapcsolószekvenciák alkalmazhatók.
A leírásban a „sejt”, „sejtvonal” és „sejttenyészet” kifejezéseket egymás szinonimáiként alkalmazzuk, és valamennyi ilyen megjelölés magában foglalja az utódokat is. Ilyenformán, a „transzformáns” és „transzformáit sejt kifejezések jelentése kiterjed az elsődleges, eredeti sejtre és a belőle származó tenyészetekre (függetlenül az átoltások számától). Természetesen az utódok DNS-tartalmukban nem pontosan egyformák, ami a szándékos vagy véletlenszerű mutációk következménye. A funkciójuk és biológiai aktivitásuk tekintetében azonos mutáns utódok szintén e kifejezés jelentéskörébe tartoznak. Az ettől eltérő megjelölések a szövegösszefüggésből nyilvánvalók lesznek.
II. Anti-ErbB2 antitestek előállítása
A következőkben a találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazott antitestek előállításának jellemző technikáit ismertetjük. Az antitestek termeltetésére ErbB2-antigénként, például az ErbB2 extracelluláris doménjének szolúbilis alakját vagy annak - kívánt epitópot tartalmazó - részét alkalmazzuk. Más módon, antitestek termeltetésére sejtfelületükön ErbB2-t termelő sejtek alkalmazhatók [pl. ErbB2 túltermelése céljából transzformált NIH-3T3-sejtek vagy carcinomasejtvonal, pl. SK-BR-3-sejtek; lásd Stancovski és mtsai.: PNAS (USA) 88, 8691 (1991)]. Az ErbB2-antitestek létrehozására alkalmas - egyéb alakjai szakember számára jól ismertek.
(i) Poliklonális antitestek
A poliklonális antitesteket előnyösen állatokban, a megfelelő antigén és adjuváns többszöri szubkután (se) vagy intraperitoneális (ip) injektálásával termeltetjük. A releváns antigént előnyös lehet olyan proteinhez konjugálni, amely az immunizálni kívánt fajban immunogén hatású. Az ilyen proteinek példái a „keyhole limpet” hemocianin, a szérumalbumin, a szarvasmarhaeredetű thyroglobulin és a szójabab-tripszininhibitor. A konjugálás bifunkciós vagy derivatizáló ágens alkalmazásával történhet, például maleimidobenzoil-szulfoszukcinimid-észter (konjugálás ciszteineken keresztül), N-hidroxiszukcinimid (konjugálás lizineken keresztül), glutáraldehid, borostyánkősavanhidrid, SOCI2 vagy R1N=C=NR (amelyben R és R1 jelentése egymástól eltérő alkilcsoport) alkalmazásával.
Az állatokat az antigén, az immunogén konjugátumok vagy származékok ellen úgy immunizáljuk, hogy a protein vagy a konjugátum például 100 pg-ját (nyulak esetében), illetve 5 pg-ját (egerek esetében) háromszoros térfogatú Freund-féle komplett adjuvánssal elegyítjük, és az oldatot intradermálisan az állat testének több pontjába injektáljuk. Egy hónap elteltével az állatoknak - több helyre adott szubkután injekcióval - a peptid vagy konjugátum eredeti mennyiségének 1/5—1/10-ével (Freund-féle komplett adjuvánsban) emlékeztetőoltást adunk. 7-14 nappal később az állatokból vért veszünk, és a vérsavóban meghatározzuk az antitesttitert. Az emlékeztetőoltásokat addig ismételjük, míg az antitesttiter platót nem ér el. Az állatoknak az emlékeztetőoltást előnyösen azonos antigén (de eltérő proteinnel és/vagy eltérő keresztkötő reagenssel képzett) konjugátumával végezzük. A konjugátumok rekombináns sejttenyészetben, fúziós proteinekként is előállíthatok. Az immunreakció serkentésére aggregációt elősegítő hatóanyagok (pl. alumínium-hidroxid, „alum”) is alkalmazhatók.
(ii) Monoklonális antitestek
A monoklonális antitestek lényegében homogén antitestek populációjából származnak, vagyis a populációt alkotó egyes antitestek egymással azonosak (a minimális mennyiségben esetlegesen előforduló természetes mutációktól eltekintve). Ilyenformán a „monoklonális” jelző az antitestek azon tulajdonságára vonatkozik, hogy nem különböző antitestek elegyeként léteznek.
A monoklonális antitestek az elsőként Kohler és mtsai. [Natúré 256, 495 (1975)] által leírt hibridómaeljárással, valamint rekombináns DNS-technikák (4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) alkalmazásával állíthatók elő.
A hibridómaeljárás során egeret vagy egyéb alkalmas gazdaállatot (pl. hörcsögöt) a fentebb leírtak szerint immunizálunk, hogy olyan limfociták termelődését váltsuk ki, amelyek az immunizálásra alkalmazott proteinhez specifikusan kötődő antitesteket termelnek (illetve azok termelésére képesek). Más módon, a limfocitákat in vitro immunizálhatjuk. Ezt követően a limfocitákat megfelelő fuzionáltató ágens (pl. polietilénglikol) alkalmazásával myelomasejtekhez fuzionáljuk, miáltal hibridómasejteket kapunk [Goding: „Monoclonal Antibodies: Principles and Practice”, 59-103. old., Academic Press (1986)].
Az így létrehozott hibridómasejteket megfelelő előnyösen a fuzionálatlan kiindulási myelomasejtek szaporodását és túlélését gátló egy vagy több anyagot tartalmazó - tenyésztő tápközegben szaporítjuk. Például, ha a kiindulási myelomasejtekből hiányzik a hipoxanthin guanin foszforibozil transzferáz enzim (HGPRT vagy HPRT), a hibridómák tenyésztésére rendszerint hipoxanthint, aminopterint és timidint tartalmazó tápközeget (HAT-tápközeg) alkalmazunk, amely gátolja a HGPRT-deficiens sejtek szaporodását.
A fuzionáltatásra előnyösen olyan myelomasejteket alkalmazunk, amelyek hatékonyan fuzionálhatok; elősegítik a kiválasztott antitesttermelő sejtek stabil és
HU 226 742 Β1 nagymértékű antitesttermelését; és valamely tápközegre (pl. HAT-tápközegre) érzékenyek. Ezek közül előnyösen egéreredetű myelomasejteket alkalmazunk; ilyenek például a MOPC-21 és MPC-11 egértumorokból származó sejtvonalak (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornia, USA) és az SP-2 vagy X63-Ag8-653 sejtek (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA). Humán monoklonális antitestek termelésére humán myelomasejtek és egér/humán heteromyelomasejtek alkalmazását is leírták [Id. Kozbor: J. Immunoi. 133, 3001 (1984); Brodeur és mtsai.: „Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications’’, 51-63. old., Marcel Dekker, Inc., New York (1987)].
A tenyésztő tápközeget (amelyben a hibridómasejteket szaporítottuk) az antigén elleni monoklonális antitestek termelődésére vizsgáljuk. A hibridómasejtek által termelt monoklonális antitestek kötési specifitását előnyösen immunprecipitációval vagy in vitro kötődési teszttel - pl. radioimmunteszttel (RIA) vagy enzimkötött immunszorbens vizsgálati eljárással (ELISA) - határozzuk meg.
A monoklonális antitest kötési affinitása, például a Munson és mtsai. [Anal. Biochem. 107, 220 (1980)] által leírt Scatchard-analízissei határozható meg.
A kívánt specifitású, affinitású és/vagy aktivitású antitesteket termelő hibridómasejtek azonosítása után a kiónokat limitáló hígítással szubklónozhatjuk és szokványos eljárásokkal szaporíthatjuk [Id. Goding: „Monoclonal Antibodies: Principles and Practice”, 59-103. old. (Academic Press, 1986)]. Az e célra alkalmas tenyésztő tápközegek példái közé tartozik a D-MEM és az RPMI1640 tápközeg. Más módon, a hibridómasejtek hasűri tumorokként állatokban in vivő is szaporíthatok.
A szubklónok által kiválasztott monoklonális antitesteket előnyösen hagyományos immunglobulin-tisztítási technikák (pl. protein-A Sepharose, hidroxilapatitkromatográfia, gélelektroforézis, dialízis vagy affinitás! kromatográfia) alkalmazásával választjuk el a tenyésztő tápközegtől, hasűri folyadéktól vagy vérsavótól.
A monoklonális antitesteket kódoló DNS-ek szokványos eljárásokkal egyszerűen izolálhatok és szekvenálhatók (pl. specifikusan az egéreredetű antitestek nehéz, ill. könnyű láncát kódoló génekhez hibridizáló oligonukleotidpróbák alkalmazásával). Az ilyen DNS-ek előnyös forrásául hibridómasejtek szolgálnak. Izolálás után a DNS-t expressziós vektorokba inszertálhatjuk, és a vektorokkal gazdasejteket - pl. E. colisejteket, majomeredetű COS-sejteket, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket vagy myelomasejteket (melyek egyébként immunglobulin-proteint nem termelnek) - transzfektálhatunk, miáltal a rekombináns gazdasejtekben monoklonális antitestek termelődnek. Az antitestet kódoló DNS baktériumokban rekombináns módszerekkel történő előállítását illetően lásd pl. Skerra és mtsai.: Curr. Opinion in Immunoi. 5, 256 (1993); Plückthun: Immunoi. Revs. 130, 151 (1992).
A találmány egyéb megvalósítási módjainak megfelelően az antitestek vagy antitestfragmensek a McCafferty és mtsai. [Natúré 348, 552 (1990)] által leírt technikák alkalmazásával létrehozott antitest-fágkönyvtárakból izolálhatok. Clarkson és mtsai. [Natúré 352, 624 (1991)] és Marks és mtsai. [J. Mól. Bioi. 222, 581 (1991)] egéreredetű, illetve humán antitestek fágkönyvtárak alkalmazásával történő izolálását írták le. Később ismertették a nagy (nM nagyságrendű) affinitású humán antitestek lánckombinálással („chain-shuffling”) történő előállítását [Id. Marks és mtsai.: Bio/Technology 10, 779 (1992)]. Ezen túlmenően, a kombinatorikus infekciót és in vivő rekombinációt mint a nagyon nagy méretű fágkönyvtárak előállításának stratégiáját írták le [Waterhouse és mtsai.: Nucl. Acids Rés. 21, 2265 (1993)]. Ilyenformán ezek a technikák a monoklonális antitestek izolálásának hagyományos hibridómatechnikáinak működőképes alternatívái.
Az antitestet kódoló DNS például úgy módosítható, hogy a humán nehéz és könnyű lánc konstans doménjeinek kódolószekvenciájával egéreredetű antitestek homológ szekvenciáit helyettesítjük [4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Morrison és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)], vagy az immunglobulin kódolószekvenciájához kovalens kötéssel egy nem immunglobulin-polipeptid kódolószekvenciájának egészét vagy részét kapcsoljuk.
Az ilyen nem immunglobulin-polipeptidekkel rendszerint az antitestek konstans doménjeit helyettesítjük, vagy más módon, egy antitest egy antigénkombinálódási helyének variábilis doménjeit helyettesítjük velük, hogy olyan bivalens kiméra antitestet hozzunk létre, amely egy bizonyos antigénre specifikus antigénkombinálódási helyet, valamint egy másik antigénre specifikus antigénkombinálódási helyet tartalmaz.
(iii) Humanizált antitestek
A nem humán antitestek humanizálás! eljárásainak leírása az idevonatkozó szakirodalomban megtalálható. A humanizált antitest előnyösen egy vagy több, nem humán forrásból származó aminosavat tartalmaz. Ezeket a nem humán aminosavakat gyakran „import” aminosavaknak nevezzük, melyek rendszerint egy „import” variábilis doménből származnak. Az antitestek humanizálását lényegében Winter és mtsai. eljárásával hajtjuk végre [Jones és mtsai.: Natúré 321, 522 (1986); Riechmann és mtsai.: Natúré 332, 323 (1988); Verhoyen és mtsai.: Science 239, 1534 (1988)], oly módon, hogy egy humán antitest megfelelő szekvenciáit hipervariábilis szekvenciákkal helyettesítjük. Ennek megfelelően, az ilyen „humanizált” antitestek kiméra antitestek (lásd 4 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás), amelyekben az antitest - teljes humán variábilis doménnél lényegesen kisebb - része van helyettesítve egy nem humán fajból származó, megfelelő szekvenciával. A gyakorlatban a humanizált antitestek rendszerint olyan humán antitestek, amelyekben a hipervariábilis régió néhány aminosava - és esetleg a vázrégió (FR) néhány aminosava - rágcsálóeredetű antitestek analóg pozícióiból származó aminosavakkal van helyettesítve.
Az antigenitás csökkentése szempontjából nagy jelentősége van a humanizált antitestek létrehozására al17
HU 226 742 Β1 kalmazandó (nehéz és könnyű láncból származó) humán variábilis domének kiválasztásának. Az úgynevezett „legjobb egyezés” módszer szerint egy rágcsálóeredetű antitest variábilis doménjének szekvenciáját ismert humán variábilis domének szekvenciáit tartalmazó teljes könyvtárral hasonlítjuk össze. A rágcsálóeredetű szekvenciával legközelebbi egyezést mutató humán szekvenciát a humanizált antitest humán vázrégiójának (FR) fogadjuk el [Sims és mtsai.: J. Immunoi. 151, 2296 (1993); Chothia és mtsai.: J. Mól. Bioi. 196, 901 (1987)]. Egy másik módszer szerint az összes egy bizonyos alcsoportba tartozó könnyű és nehéz láncot tartalmazó - humán antitest konszenzusszekvenciájából származó vázrégiót alkalmazunk. Különböző humanizált antitestek esetében ugyanaz a vázrégió használható [Carter és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta és mtsai.: J. Immunoi. 151, 2623 (1993)].
Lényeges továbbá, hogy az antitestek a humanizálást követően is megtartsák az antigénre vonatkozó affinitásukat és egyéb kedvező biológiai tulajdonságaikat. Ennek érdekében, az egyik előnyös eljárás szerint, a humanizált antitesteket a kiindulási szekvenciák és a különböző lehetséges humanizált termékek - háromdimenziós modellek felhasználásával végzett - analizálását követően állítjuk elő. Az immunglobulinok háromdimenziós modelljei széleskörűen hozzáférhetők és szakember számára jól ismertek. Számítógépes programok állnak rendelkezésre a kiválasztott lehetséges immunglobulin-szekvenciák valószínű háromdimenziós konformációs struktúráinak illusztrálására és megjelenítésére. Az így megjelenített struktúrák tanulmányozása elősegíti az egyes aminosavaknak a lehetséges immunglobulin-szekvencia működésében betöltött szerepének vizsgálatát, azaz a lehetséges immunglobulin antigénhez kötődő képességét befolyásoló aminosavak vizsgálatát. Ezen a módon kiválaszthatók a vázrégió aminosavai, és a recipiens és import szekvenciákból úgy kombinálhatók, hogy a kívánt antitesttulajdonságokat [pl. a célantigén(ek)re vonatkozó fokozott affinitás] kapjuk. A komplementaritást meghatározó régió aminosavai általában közvetlenül és jelentős mértékben játszanak szerepet az antigénkötés befolyásolásában.
A 3. példában egy jellemző humanizált antiErbB2 antitest előállítását mutatjuk be, mely antitest megköti az ErbB2-receptort, és blokkolja egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását. A találmány szerinti megoldás szempontjából különösen jelentős humanizált antitest az MAPK - EGF, TGF-α és/vagy HRG közvetítette - aktiválását lényegében ugyanolyan hatékonyan blokkolja, mintáz egéreredetű 2C4 monoklonális antitest (vagy annak Fab-fragmense) és/vagy az ErbB2-receptort ugyanolyan hatékonysággal köti meg, mint az egéreredetű 2C4 monoklonális antitest (vagy annak Fab-fragmense). A humanizált antitest például humán variábilis nehéz lánc doménbe foglalva - nem humán hipervariábilis régióból származó aminosavakat tartalmazhat, továbbá a vázrégióban - a 69H, 71H és 73H pozíciók közül kiválasztott pozícióban [a variábilis domének Kabat-féle számozása szerint; lásd Kábát és mtsai.: „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5. kiadás, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] - is tartalmazhat szubsztitúciót. Az egyik megvalósítási mód szerint a humanizált antitest a 69H, 71H és 73H pozíciók közül kettőben vagy mindháromban tartalmaz vázrégiószubsztitúciót.
Az egyik jellemző humanizált antitest nehéz lánc variábilis dómén komplementaritást meghatározó régiójának (CDR) aminosavait tartalmazza: GFTFTDYTMX (ahol „X” jelentése előnyösen: D vagy S; 7. azonosító számú szekvencia); DVNPNSGG SIYNQRFKG (8. azonosító számú szekvencia); és/vagy NLGPSFYFDY (9. azonosító számú szekvencia), és adott esetben e CDR-aminosavakban módosításokat hordozhat, például ha a módosítás fenntartja vagy javítja az antitest affinitását. Például, a szóban forgó antitestváltozat a nehéz lánc variábilis régiójának CDRszekvenciáiban kb. 1-7 vagy kb. 1-5 aminosavszubsztitúciót tartalmazhat. Az ilyen antitestváltozatok affinitásfejlesztéssel, pl. az alábbiakban leírtak szerint állíthatók elő. A találmány szerinti megoldás szempontjából legelőnyösebb humanizált antitest a 4. azonosító számú szekvenciában bemutatott nehéz lánc variábilis dómén aminosavszekvenciát tartalmazza.
A humanizált antitest - például az előző bekezdésben említett nehéz lánc variábilis domént CDR-aminosavakon felül - könnyű lánc variábilis dómén komplementaritást meghatározó régiójának aminosavait is tartalmazhatja: KASQDVSIGVA (10. azonosító számú szekvencia); SASYX1X2X3, amelyben X1 jelentése, előnyösen: R vagy L; X2 jelentése, előnyösen: Y vagy E; és X3 jelentése, előnyösen: T vagy S (11. azonosító számú szekvencia); és/vagy QQYYIYPYT (12. azonosító számú szekvencia). Az ilyen humanizált antitestek, adott esetben, e CDR-aminosavakban módosításokat hordozhatnak, például ha a módosítás fenntartja vagy javítja az antitest affinitását. Például a szóban forgó antitestváltozat a nehéz lánc variábilis régiójának CDRszekvenciáiban kb. 1-7 vagy kb. 1-5 aminosavszubsztitúciót tartalmazhat. Az ilyen antitestváltozatok affinitásfejlesztéssel, pl. az alábbiakban leírtak szerint állíthatók elő. A találmány szerinti megoldás szempontjából legelőnyösebb humanizált antitest a 3. azonosító számú szekvenciában bemutatott könnyű lánc variábilis dómén aminosavszekvenciát tartalmazza.
A találmány szerinti megoldás értelmében affinitásfejlesztéssel javított antitesteket is alkalmazhatunk, amelyek megkötik az ErbB2-t és blokkolják egy ErbBreceptor ligandum általi aktiválását. Kiindulási antitestként humán antitestet vagy humanizált antitestet (pl. a 3., illetve 4. azonosító számú szekvenciaként bemutatott könnyű és/vagy nehéz lánc variábilis szekvenciákat tartalmazó antitestet, azaz az 574-antitestet) alkalmazhatunk. Az affinitásfejlesztett antitest előnyösen az egéreredetű 2C4-antitesténél vagy az 574-es változaténál jobb affinitással kötődik az ErbB2-receptorhoz [pl. kb. 2-4-szeres, 100-szoros vagy akár 1000-szeres affinitással, ami pl. ErbB2-extracelluláris dómén (ECD)
HU 226 742 Β1
ELISA-teszttel értékelhető], A szubsztitúcióra alkalmas nehéz lánc CDR-aminosavak jellemző példái a következők: H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 vagy ezek kombinációi (pl. ezek közül 2-7 aminosavat érintő szubsztitúciók). A szubsztitúcióra alkalmas könnyű lánc CDR-aminosavak jellemző példái a következők: L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 vagy ezek kombinációi (pl. ezek közül 2-10 aminosavat érintő szubsztitúciók).
A találmány szerinti megoldás értelmében a humanizált antitest vagy affinitásfejlesztett antitest különböző alakjai alkalmazhatók. Például a humanizált antitest vagy affinitásfejlesztett antitest lehet antitestfragmens (pl. Fab-fragmens), amely adott esetben egy vagy több citotoxikus hatóanyaghoz van konjugálva (ami immunkonjugátumot eredményez). Más módon, a humanizált antitest vagy affinitásfejlesztett antitest teljes antitest is lehet (pl. teljes IgG 1 -antitest).
(iv) Humán antitestek
Az antitestek humanizálásának alternatíváját jelenti a humán antitestek létrehozása. Például lehetőség van olyan transzgenikus állatok (pl. egerek) létrehozására, amelyek immunizálást követően - endogén immunglobulin-termelődés nélkül - képesek a humán antitestek teljes repertoárjának termelésére. Például leírták, hogy kiméra és csíravonalmutáns egerekben az antitest nehéz lánc kapcsolódási régiójának (JH) génjében bekövetkezett homozigóta-deléció az endogén antitesttermelődés teljes gátlását eredményezi. A humán csíravonal-eredetű immunglobulingének ilyen csíravonalmutáns egerekbe történő bejuttatása - antigénstimulus hatására - humán antitestek termelődését eredményezi [Id. pl. Jakobovits és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits és mtsai.: Natúré 362, 255 (1993); Bruggermann és mtsai.: Year in Immuno. 7, 33 (1993); és 5 591 669; 5 589 369 és 5 545 807 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás].
Más lehetőség szerint, humán antitestek és antitestfragmensek - immunizálatlan donorokból származó immunglobulin variábilis (V) doménjének génrepertoárjából történő - in vitro előállítására a fágon való megjelenítési („phage-display) technika [McCafferty és mtsai.: Natúré 348, 552 (1990)] is alkalmazható. E módszer szerint az antitest V-doménjét kódoló géneket fonalas bakteriofág (pl. M13 vagy fd) nagy vagy kis burokproteingénjével azonos leolvasási fázisban klónozzuk, és a fágrészecske felületén funkcionális antitestfragmensekként jelenítjük meg. Mivel a fonalas részecske a fág genomjának egyszálú DNS-kópiáját tartalmazza, az antitest funkcionális tulajdonságain alapuló szelektálás az ilyen tulajdonságokkal bíró antitestet kódoló gén kiválasztását eredményezi. Ilyenformán a fág a B-sejt bizonyos sajátságait utánozza. A fágon való megjelenítés különböző formátumokban valósítható meg; ezek összefoglaló áttekintését lásd pl. Johnson és mtsai. [Current Opinion in Structural Biology 3, 564 (1993)]. A fágon való megjelenítésre a V-gén-szakaszok különféle forrásai alkalmazhatók. Clackson és mtsai. [Natúré 352, 624 (1991)] immunizált egerek lépjél bői származó V-gének kisméretű random kombinatorikus könyvtárából antioxazolon antitestek diverz sorozatát izolálták. Marks és mtsai. [J. Mól. Bioi. 222, 581 (1991)] és Griffith és mtsai. [EMBO J. 12, 725 (1993)] által leírt eljárásokkal immunizálatlan humán donorokból származó V-gének repertoárja hozható létre, és antigének diverz sorozata (beleértve a saját antigéneket is) elleni antitestek izolálhatok (lásd még 5 565 332 és 5 573 905 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások).
A humán antitestek in vitro aktivált B-sejtekkel is termeltethetők (lásd 5 567 610 és 5 229 275 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás).
A humán anti-ErbB2 antitestek leírását illetően lásd 5 772 997 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás és WO 97/00271 számú nemzetközi közzétételi irat.
(v) Antitestfragmensek
Az antitestfragmensek előállítására különféle technikákat fejlesztettek ki. Ezek a fragmensek hagyományosan intakt antitestek proteolitikus emésztésével hozhatók létre [Id. Morimoto és mtsai.: Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 107 (1992); és Brennan és mtsai.: Science 229, 81 (1985)], azonban ezek a fragmensek rekombináns gazdasejtek alkalmazásával közvetlenül is előállíthatok. Például az antitestfragmensek a fentebb leírt antitest fágkönyvtárakból izolálhatok. Más módon, a Fab’-SH fragmensek £ co//'-ból közvetlenül kinyerhetők, és kémiai kapcsolással F(ab’)2-fragmensekké alakíthatók [Carter és mtsai.: Bio/Technology 10, 163 (1992)]. Egy másik lehetőség szerint az F(ab’)2-fragmensek közvetlenül rekombináns gazdasejttenyészetből izolálhatok. Az antitestfragmensek előállításának egyéb technikái szakemberszámára jól ismertek. Más megvalósítási módokban a kiválasztott antitest egyláncú Fv-fragmens (scFv); lásd WO 93/16185 számú nemzetközi közzétételi irat; valamint 5 571 894 és 5 587 458 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Az antitestfragmens lehet „lineáris antitest” is (lásd pl. 5 641 870 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A lineáris antitestfragmensek monospecifikusak vagy bispecifikusak lehetnek.
(vi) Bispecifikus antitestek
A bispecifikus antitestek olyan antitestek, amelyek legalább két különböző epitópra specifikusak. A jellemző bispecifikus antitestek az ErbB2-protein két különböző epitópjához képesek kötődni. Más bispecifikus antitestekben az ERbB2 kötőhelyet EGFR-t, ErbB3-at és/vagy ErbB4-et megkötő kötőhellyel van kombinálva. Más módon, egy ErbB2-t megkötő kar olyan antitestkarral kombinálható, amely leukocitán lévő triggermolekulához - pl. T-sejt-receptor molekulához (pl. CD2 vagy CD3) vagy IgG Fc-receptorához (FcyR), pl. Fc/RI (CD64), FcyRII (CD32) és FcyRIII (CD16) - kötődik, miáltal a celluláris védekező mechanizmus az ErbB2-t termelő sejtre összpontosítható. A bispecifikus
HU 226 742 Β1 antitestek arra is alkalmazhatók, hogy a citotoxikus hatóanyagokat az ErbB2-t termelő sejtekre lokalizáljuk.
A WO 96/16673 számú nemzetközi közzétételi iratban bispecifikus anti-ErbB2/anti-FcyRIII antitestet, az 5 837 234 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban bispecifikus anti-ErbB2/anti-FcYRI antitestet tártak fel. A bispecifikus anti-ErbB2/Fc antitestet a WO 98/02463 számú nemzetközi közzétételi iratban tárták fel. Az 5 821 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban bispecifikus anti-ErbB2/antiCD3 antitestet tártak fel.
A bispecifikus antitestek előállítási eljárásai szakember számára jól ismertek. A teljes hosszúságú bispecifikus antitestek szokványos előállítási módja két immunglobulin nehéz lánc/könnyű lánc pár együttes expresszáltatásán alapul [a két lánc különböző specifitású; Millstein és mtsai.: Natúré 305, 537 (1983)]. Az immunglobulin nehéz és könnyű láncainak véletlenszerű választéka miatt e hibridómák (kvadrómák) potenciálisan tíz különböző antitestmolekula elegyét termelik, melyek közül csupán egy rendelkezik a megfelelő bispecifikus szerkezettel. A megfelelő molekula - általában affinitási kromatográfiával végzett - tisztítása igen munkaigényes, és a kitermelési százaléka alacsony. Hasonló eljárások leírását illetően lásd a WO 93/08829 számú nemzetközi közzétételi iratot, valamint Traunecker és mtsai.: EMBO J. 70, 3655 (1991).
Egy másik lehetőség szerint az antitestek kívánt kötési specifitású variábilis doménjeit (antitest-antigén kombinálódási helyek) immunglobulin konstans dómén szekvenciáihoz fuzionáljuk. A fúziót előnyösen egy immunglobulin nehéz lánc konstans doménjével valósítjuk meg, amely legalább a csukló- („hinge”), CH2- és CH3-régió részét tartalmazza. Előnyös, ha a konstans dómén tartalmazza - a könnyű lánchoz történő kötődéshez szükséges helyet magában foglaló - első nehéz lánc konstans régiót (CH1). Az immunglobulin nehéz lánc fúziókat - és kívánt esetben az immunglobulin nehéz láncot - kódoló DNS-eket külön expressziós vektorokba inszertáljuk, és azokat együttesen megfelelő gazdaorganizmusba transzferáljuk. Ez nagy rugalmasságot biztosít a három polipeptid relatív arányának beállításában, azon megvalósítási módokban, ahol az optimális hozam elérése érdekében a konstrukcióban a három különböző polipeptidláncot nem azonos arányokban alkalmazzuk. Mindazonáltal lehetőség van arra is, hogy két vagy mindhárom polipeptidlánc kódolószekvenciáját egyazon expressziós vektorba inszertáljuk (olyan esetekben, ha legalább két polipeptidlánc azonos arányban történő expressziója eredményezi a nagy hozamot vagy ha a láncok relatív arányának nincs különösebb jelentősége).
E megoldás egy előnyös megvalósítási módja értelmében a bispecifikus antitestek - az egyik karon - hibrid immunglobulin nehéz láncból (első kötőspecifitás) és - a másik karon - egy hibrid immunglobulin nehéz lánc/könnyű lánc párból (második kötőspecifitást biztosítva) állnak. Azt találtuk, hogy ez az aszimmetrikus struktúra elősegíti a kívánt bispecifikus vegyület nemkívánatos immunglobulin-lánckombinációktól történő elválasztását, mivel az immunglobulin könnyű láncnak a bispecifikus molekula csupán egyik felében való jelenléte egyszerű elkülönítést tesz lehetővé. E megoldás leírását lásd a WO 94/04 690 számú nemzetközi közzétételi iratban. A bispecifikus antitestek előállításának további részleteit illetően lásd pl. Suresh és mtsai.: Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Egy másik megoldás (lásd 5 731 168 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) szerint a rekombináns sejttenyészetből kinyerhető heterodimerek százalékos arányának maximalizálása érdekében antitestmolekula-pár közötti határfelület alakítható ki. Az előnyös határfelület egy antitest konstans doménje CH3doménjének legalább egy részét tartalmazza. Az eljárás során az első antitestmolekula határfelületéből egy vagy több kisméretű aminosav-oldalláncot nagyobb oldallánccal (pl. tirozin vagy triptofán) helyettesítünk. A második antitestmolekula határfelületén a nagy oldallánc(ok)éval azonos vagy hasonló méretű kompenzáló „üregeket hozhatunk létre, oly módon, hogy a nagyobb aminosav-oldalláncokat kisebbekre (pl. alaninra vagy treoninra) cseréljük. Ez a mechanizmus a heterodimer jobb hozamát biztosítja (a nemkívánatos végtermékekhez, pl. homodimerekhez viszonyítva).
A bispecifikus antitestek antitestfragmensekből történő előállításának technikái a szakirodalomból szintén jól ismertek. Például a bispecifikus antitestek előállíthatok kémiai kapcsolás alkalmazásával. Brennan és mtsai. [Science 229, 81 (1985)] eljárásában az intakt antitesteket proteolitikusan emésztve F(ab’)2-fragmenseket hoznak létre, majd ezeket a fragmenseket - a vicinális ditiolok stabilizálása és az intermolekuláris diszulfidképződés megakadályozása érdekében ditiolkomplexáló ágens (nátrium-arzenit) jelenlétében redukálják. Az így kapott Fab’-fragmenseket tio-nitro-benzoát (TNB)-származékokká alakítják, majd az Fab’TNB-származékok egyikét merkapto-etil-aminnal végzett redukcióval visszaalakítják Fab’-tiollá, és azt a másik Fab’-TNB-származék ekvimoláris mennyiségével elegyítik, miáltal a bispecifikus antitesthez jutnak. Az így létrehozott bispecifikus antitestek enzimek szelektív immobilizálására alkalmazhatók.
Az utóbbi években lehetővé vált a Fab’-SH fragmensek £ co//'-sejtekből történő közvetlen kinyerése. E fragmensek kémiai kapcsolásával bispecifikus antitestek hozhatók létre. Shalaby és mtsai. [J. Exp. Med. 175, 217 (1992)] teljesen humanizált bispecifikus antitest F(ab’)2 molekula előállítását tárták fel. Mindkét Fab’-fragmenst külön-külön E. colival termeltették, és a bispecifikus antitestet irányított in vitro kémiai kapcsolással hozták létre. Az általuk előállított bispecifikus antitest ErbB2-receptort túlzott mennyiségben termelő sejtekhez és normál humán T-sejtekhez képes kötődni, és képes kiváltani a humán citotoxikus limfociták humán emlőtumorsejtek elleni litikus aktivitását.
A bispecifikus antitestek fragmenseinek közvetlenül rekombináns sejttenyészetekben történő előállítására és izolálására különféle eljárásokat tártak fel. Például Kostelny és mtsai. [J. Immunoi. 148(5), 1547 (1992)] leucin-„cipzárak” alkalmazásával bispecifikus antiteste20
HU 226 742 Β1 két állítottak elő. Az Fos- és Jun-proteinből származó leucincipzár peptideket génfúzió alkalmazásával két különböző antitest Fab’-fragmenséhez kapcsolták. Az antitesthomodimereket a csuklórégiónál redukálva monomereket kaptak, majd ezeket visszaoxidálva antitestheterodimereket hoztak létre. Ez az eljárás antitesthomodimerek előállítására is alkalmazható. A Hollinger és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444 (1993)] által feltárt „diatest” technika a bispecifikus antitestfragmensek előállításának alternatív mechanizmusát reprezentálja. Az ilyen fragmensek egy nehéz lánc variábilis domént (VH) egy könnyű lánc variábilis doménhez (VL) kapcsolva tartalmaznak, olyan kapcsolószekvencián keresztül, amely túl rövid ahhoz, hogy az ugyanazon láncon lévő két dómén között párosodás következzen be. Ennek megfelelően, az egyik fragmens VHés VL-doménje kényszerítve van, hogy a másik fragmensen lévő komplementer VL- és VH-doménnel alkosson párt, miáltal két antigénkötő hely képződik. A bispecifikus antitestfragmensek előállításának egy másik, egyláncú Fv-dimerek alkalmazásán alapuló módszerét Gruber és mtsai. tárták fel [J. Immunoi. 152, 5368 (1994)].
A kettőnél több értékű antitestek szintén a találmány tárgyához tartoznak. Például előállíthatok trispecifikus antitestek is [Id. Tutt és mtsai.: J. Immunoi. 147, 60 (1991)].
(vii) Egyéb aminosavszekvencia-módosítások
A következőkben a találmány szerinti antiErbB2 antitestek aminosavszekvencia-módosításait ismertetjük. Például kívánatos lehet az antitest kötési affinitásának és/vagy egyéb biológiai tulajdonságainak javítása. Az antiErbB2 antitest aminosavszekvenciaváltozatait úgy hozhatjuk létre, hogy az anti-ErbB2 antitestet kódoló nukleinsavba megfelelő nukleotidmódosításokat iktatunk be, vagy más módon peptidszintézist hajtunk végre. Az ilyen módosítások közé tartoznak az anti-ErbB2 antitest aminosavszekvenciáját érintő deléciók és/vagy inszerciók és/vagy szubsztitúciók. A végső konstrukció létrehozása céljából a deléciók, inszerciók és szubsztitúciók bármely kombinációja alkalmazható, feltéve, hogy a végtermék a kívánt tulajdonságokkal bír. Az aminosav-változtatások módosíthatják az anti-ErbB2 antitest poszttranszlációs érési folyamatait is (pl. a glikozilációs helyek számának vagy pozíciójának változtatásával).
Az anti-ErbB2 antitest - mutagenezis helyszíneként előnyös - aminosavai vagy régiói azonosításának egyik hasznos eljárása az „alaninpásztázási mutagenezis néven ismert technika [Cunningham és Wells: Science 244, 1081 (1989)]. Ezen eljárás szerint azonosítunk egy aminosavat vagy célaminosavak csoportját (pl. töltéssel bíró aminosavak, pl. Arg, Asp, His, Lys és Glu), és ez(eke)t semleges vagy negatív töltésű aminosavval (legelőnyösebben alaninnal vagy polialaninnal) helyettesítjük, abból a célból, hogy befolyásoljuk az aminosavak és az ErbB2-antigén közötti kölcsönhatást. A szubsztitúcióra funkcionális érzékenységet mutató aminosavpozíciók meghatározását ezután úgy finomíthatjuk, hogy a szubsztitúció helyén vagy annak közelében újabb vagy egyéb mutációkat hozunk létre. Ilyenformán, bár az aminosavmódosítások helye előre meghatározott, a mutáció természete önmagában nem előre meghatározott. Például az adott helyen végrehajtott mutáció eredményének vizsgálata céljából a célkodonnál vagy célrégióban alaninpásztázást vagy random mutagenezist végzünk, és az expresszált antiErbB2 antitestváltozatokat a kívánt aktivitásra szelektáljuk.
Az aminosavszekvencia inszerciói lehetnek Nés/vagy C-terminális fúziók, amelyek egy aminosavtól száz vagy még több aminosav hosszúságig terjedő polipeptid aminosavszekvenciához történő hozzákapcsolását jelentik, illetve egy vagy több aminosavas, szekvencián belüli inszerciók lehetnek. A terminális inszerciók példái közé tartoznak az N-terminális metionint tartalmazó anti-ErbB2 antitestek, a citotoxikus polipeptidhez fuzionált antitestek, továbbá az anti-ErbB2 antitest N- vagy C-terminálisának enzimhez (pl. ADEPT) vagy olyan polipeptidhez történő fuzionáltatása, amely fokozza az antagonista vérsavóban mérhető felezési idejét.
Az aminosavszekvencia-változatok egy másik típusát reprezentálják az aminosavszubsztitúciós változatok, amelyek az anti-ErbB2 antitestmolekula legalább egy aminosava helyett egy másik aminosavat tartalmaznak. Az antitest szubsztitúciós mutagenezisének legnagyobb jelentőségű pontjai a hipervariábilis régiók, de a vázrégióban végrehajtott szubsztitúciók is jelentős hatásúak lehetnek. A konzervatív szubsztitúciókat az 1. táblázat „előnyös szubsztitúciók” oszlopában mutatjuk be. Ha ezek a helyettesítések a biológiai aktivitás megváltozását eredményezik, úgy további, jelentősebb szubsztitúciós módosításokat végezhetünk, melyeket az 1. táblázat „lehetséges szubsztitúciók” oszlopában (illetve később az aminosavak csoportosítása kapcsán) mutatunk be, és az így létrehozott változatokat szelektáljuk.
1. táblázat
Eredeti aminosav Lehetséges szubsztitúciók Előnyös szubsztitúciók
Alá (A) Val, Leu, Ile Val
Arg (R) Lys, Gin, Asn Lys
Asn(N) Gin, His, Asp, Lys, Arg Gin
Asp (D) Glu, Asn Glu
Cys (C) Ser, Alá Ser
Gin (Q) Asn, Glu Asn
Glu (E) Asp, Gin Asp
Gly(G) Alá Alá
His(H) Asn, Gin, Lys, Arg Arg
lle(l) Leu, Val, Met, Alá, Phe, norleucin Leu
Leu (L) norleucin, Ile, Val, Met, Alá, Phe Ile
HU 226 742 Β1
1. táblázat (folytatás)
Eredeti aminosav Lehetséges szubsztitúciók Előnyös szubsztitúciók
Lys(K) Arg, Gin, Asn Arg
Met (M) Leu, Phe, Ile Leu
Phe (F) Leu, Val, Ile, Alá, Tyr Tyr
Pro (P) Alá Alá
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp (W) Tyr, Phe Tyr
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Alá, norleucin Leu
Az antitestek biológiai tulajdonságai szempontjából lényeges módosítások úgy valósíthatók meg, hogy kiválasztjuk azokat a szubsztitúciókat, amelyek a következők tekintetében jelentős mértékben különböznek az eredeti aminosavtól: (a) a szubsztitúció közelében a polipeptidváz szerkezetének fenntartásában (pl. redős vagy helikális konformáció); (b) a molekula célhelyén a töltés és hidrofobitás fenntartásában; vagy (c) az oldallánc fizikai kiterjedésének fenntartásában. A természetben előforduló aminosavakat - oldalláncaik tulajdonságai alapján - a következő csoportokba soroljuk:
(1) hidrofób: norleucin, Met, Alá, Val, Leu, Ile;
(2) semleges, hidrofil: Cys, Ser, Thr;
(3) savas: Asp, Glu;
(4) bázisos: Asn, Gin, His, Lys, Arg;
(5) láncorientációt befolyásoló aminosavak: Gly, Pro;
(6) aromás: Trp, Tyr, Phe.
A nem konzervatív szubsztitúció azt jelenti, hogy az egyik csoportba tartozó aminosav egy másik csoportba tartozó aminosawal van helyettesítve.
Az anti-ErbB antitest pontos konformációjának fenntartásában szerepet nem játszó ciszteinek szintén helyettesíthetők (általában szerinnel), ami növeli a molekula oxidatív stabilitását, és megakadályozza a rendellenes keresztkötésképzést. Ezzel szemben az antitest stabilitásának növelése érdekében (különösen olyan esetekben, ha az antagonista egy antitestfragmens, pl. Fv-fragmens) ciszteinkötések iktathatok be.
A szubsztitúciós változatok egy különösen előnyös típusa az eredeti antitest hipervariábilis régiója egy vagy több aminosavának szubsztitúcióját foglalják magukban. A további javításra kiválasztott változat(ok) az eredeti antitesthez képest javított biológiai tulajdonságújak) lesz(nek). Az ilyen szubsztitúciós változatok létrehozásának egyik alkalmas módja a fágfelületen történő megjelenítéssel végzett affinitásfejlesztés. Röviden összefoglalva; a hipervariábilis régió több helyén (pl. 6-7 helyen) mutagenezist végzünk, hogy mindegyik helyen valamennyi lehetséges aminosavszubsztitúciót létrehozzuk. Az így kapott antitestváltozatokat különkülön, fonalas fágrészecskéken az M13 - fágrészecskékbe csomagolt - III. géntermékével képzett fúziós proteinekként jelenítjük meg. A tágon megjelenített változatokat biológiai aktivitásukra (pl. kötési affinitásukra) teszteljük. A hipervariábilis régió módosításra alkalmas helyeinek azonosítása céljából alaninpásztázási mutagenezist végezhetünk, amellyel meghatározható, hogy a hipervariábilis régió mely aminosavai járulnak hozzá az antigénkötéshez. Más módon vagy emellett, az antitest és az antigén közötti érintkezési pontok azonosítása céljából előnyös lehet az antigén-antitest komplex kristályszerkezetének vizsgálata. Az ilyen érintkezési (kontakt) aminosavak és az ezekkel szomszédos aminosavak a szóban forgó technikával végzett szubsztitúcióra kiszemelt aminosavakat reprezentálják. Az ilyen változatok létrehozása után a változatok sorozatát az itt ismertetett módon szkríneljük, és további fejlesztésre az egy vagy több releváns tesztben kimagasló tulajdonságúnak bizonyuló antitesteket választjuk ki.
Az antitest aminosavmódosításainak egy másik típusa az antitest eredeti glikozilációs mintázatának megváltozását eredményezi. E változáson az antitest egy vagy több szénhidrátgyökének eltávolítását és/vagy egy vagy több - az antitestben eredetileg nem található - glikozilációs hely beiktatását értjük.
A polipeptidek glikozilációja N- vagy O-kötésű lehet. Az N-kötésű glikoziláció azt jelenti, hogy a szénhidrátgyök egy aszparagin oldalláncához kötődik. A szénhidrátgyök aszparagin-oldallánchoz történő enzimatikus kapcsolásának felismerési helyéül az aszparagin-X-szerin és aszparagin-X-treonin tripeptidszekvenciák (amelyekben „X” jelentése: tetszőleges aminosav, a prolin kivételével) szolgálnak. Ilyenformán a polipeptidekben az ilyen tripeptidszekvenciák jelenléte potenciális glikozilációs helyet teremt. Az „O-kötésű” glikoziláció azt jelenti, hogy az N-acetil-galaktózamin, galaktóz vagy xilóz valamelyike hidroxi-aminosavhoz (többnyire szerinhez vagy treoninhoz) kötődik, bár 5-hidroxiprolin vagy 5-hidroxilizin is alkalmazható.
A glikozilációs helyek antitestbe történő beiktatása úgy is végrehajtható, hogy - N-kötésű glikoziláció esetén - a polipeptid a fenti tripeptidszekvenciák közül egyet vagy többet tartalmazzon, illetve - O-kötésű glikoziláció esetén - a glikozilációs helyek egy vagy több szerin vagy treonin addíciójával vagy behelyettesítésével hozhatók létre.
Az antitest aminosavszekvencia-változatait kódoló nukleinsavmolekulák különféle, jól ismert eljárásokkal állíthatók elő. Az ilyen eljárások közé tartozik, többek között, a természetes forrásból történő izolálás (természetben előforduló aminosavszekvencia-változat esetén), valamint az antitest korábban előállított változatának vagy változatnak nem minősíthető alakjának oligonukleotid közvetítette (vagy helyspecifikus) mutagenezisével, PCR-mutagenezisével vagy kazettamutagenezisével végzett előállítás.
A találmány szerinti antitestet effektorfunkciója vonatkozásában is módosíthatjuk, pl. antigéndependens sejtközvetítette citotoxicitásának (ADCC) és/vagy komplementdependens citotoxicitásának (CDC) növelése céljából. Ez úgy hajtható végre, hogy az antitest Fc-régiójába egy vagy több aminosavszubsztitúciót iktatunk be. Más módon vagy ezen felül, az Fc-régióba
HU 226 742 Β1 cisztein(ek) építhető(k) be, ami e régióban lehetővé teszi a láncok közötti diszulfidhíd-képződést. Az így létrehozott homodimer antitest javított internalizációs képességű és/vagy fokozott mértékű komplement közvetítette sejtpusztítást és antitestdependens celluláris citotoxicitást (ADCC) fejt ki [Id. Cáron és mtsai.: J. Exp. Med. 176, 1191 (1992); és Shopes: J. Immunoi. 148, 2918 (1992)]. Wolff és mtsai. [Cancer Research 53, 2560 (1993)] leírása szerint, heterodifunkciós keresztkötésképzők alkalmazásával, megnövelt tumorellenes aktivitású homodimer antitestek is előállíthatok. Más módon, kifejleszthetünk olyan antitestet, amely két Fc-régiót tartalmaz, ezáltal fokozott mértékű komplement lízist és ADCC-aktivitást mutat [Id. Stevenson és mtsai.: Anti-Cancer Drug Design 3, 219 (1989)].
Az antitest vérsavóban mért felezési idejének növelése céljából az antitestbe (előnyösen antitestfragmensbe) „mentőreceptor-kötő epitópot” („salvage receptor binding epitope”; lásd pl. 5 739 277 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) iktathatunk be. A mentőreceptor-kötő epitóp” kifejezésen egy IgG-molekula (pl. IgG-,, lgG2, lgG3 vagy lgG4) Fc-régiójának olyan epitópját értjük, amely az IgG-molekula in vivő felezési idejének növeléséért felelős.
(ix) Kívánt tulajdonságú antitestek szelektálása
Az antitestek előállítási módszereit a fentiekben tárgyaltuk. Kívánt esetben az antitesteket bizonyos biológiai tulajdonságokra szelektálhatjuk.
Egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló antitest azonosítása érdekében az antitestet azon képességére vizsgálhatjuk, hogy kötődik-e az ErbB-receptort - pl. egy másik ErbB-receptorral (amellyel a kérdéses ErbB-receptor heterooligomert képez) együtt termelő sejtekhez. Például az ErbB heterooligomerekben lévő ErbB-receptorokat eredetileg is termelő (vagy azok termeltetése érdekében transzfektált) sejteket az antitesttel inkubálhatjuk, majd jelölt ErbB-ligandummal érintkeztetjük, majd meghatározzuk az antiErbB2 antitest - ErbB heterooligomerben lévő - ErbBreceptor ligandumkötését gátló képességét.
Például a HRG-polipeptid MCF7 emlőtumorsejtekhez történő kötődésének anti-ErbB2 antitestek általi gátlása 24 üregű tálca formátumban, jégen készített egyrétegű MCF7-tenyészetek alkalmazásával, lényegében az 1. példában leírtak szerint hajtható végre. A tálca mindegyik üregében anti-ErbB2 antitesteket adunk, majd 30 perces inkubálás után az üregekhez 125l-izotóppal jelölt rHRG1177_224-polipeptidet (25 pm) adunk, majd az inkubálást 4-16 óra hosszat folytatjuk. Dózis-reakció görbéket készíthetünk, és a kérdéses antitestre kiszámíthatjuk az IC50-értéket. Az egyik megvalósítási mód szerint az ErbB-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló antitestnek e tesztben - a HRG MCF7-sejtekhez történő kötődésére vonatkozó - időértéke 50 nM vagy kisebb, előnyösebben 10 nM vagy kisebb. Amennyiben az antitest egy antitestfragmens, pl. Fab-fragmens, e tesztben - a HRG-polipeptid MCF7-sejtekhez történő kötődésére vonatkozó - IC50értéke kb. 100 nM vagy kisebb, még előnyösebben 50 nM vagy kisebb.
Más módon (vagy ezen túlmenően) az antiErbB2 antitestnek egy ErbB heterooligomerben lévő ErbB-receptor ErbB-ligandum által stimulált tirozinfoszforilációját blokkoló képességét értékelhetjük. Például az ErbB-receptort endogén módon termelő sejteket (vagy az ErbB-receptor termeltetése érdekében transzfektált sejteket) az antitesttel inkubáljuk, majd foszfotirozin elleni monoklonális antitest (amely adott esetben detektálható jelölővel konjugálható) alkalmazásával vizsgáljuk az ErbB-ligandum dependens tirozinfoszforilációs aktivitást. Az 5 766 863 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban feltárt kinázreceptor-aktiválási teszt szintén alkalmas az ErbB-receptor aktiválásának - és ezen aktivitás antitest általi blokkolásának meghatározására.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint olyan antitest azonosítására végzünk szelektálást, amely MCF7-sejtekben gátolja a p180-protein tirozinfoszforilációjának HRG-polipeptid általi stimulációját (lásd 1. példa). Például az MCF7-sejteket 24 üregű tálcákra szélesztjük, majd mindegyik üreghez ErbB2 elleni antitesteket adunk, és a tálcákat szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. Ezt követően mindegyik üreghez - 0,2 nM végkoncentrációban - rHRG1177_244-polipeptidet adunk, és az inkubálást 8 percig folytatjuk. A tápközeget mindegyik üregből leszívjuk, és a reakciókat 100 μΙ SDS-mintapuffer (5% SDS, 25 mM DTT és 25 mM Tris-HCI, pH=6,8) hozzáadásával leállítjuk. Valamennyi mintát (25 μΙ) 4-12%-os gradiensgélen (Novex) elektroforizáljuk, majd elektroforetikusan polivinilidén-difluorid membránra másoljuk. Antifoszfotirozin (1 pg/ml-nél) immunbiotokat hívunk elő, és a fő reaktív csík (180 000 D molekulatömegnél) intenzitását reflexiódenzitometriával határozzuk meg. A kiszelektált antitest e tesztben, előnyös esetben, jelentős mértékben gátolja a p180 tirozinfoszforilációjának HRG általi stimulációját (a kontrolihoz viszonyítva kb. 0-35%). A p180 tirozinfoszforilációja HRG általi stimulációjának - reflexiódenzitometriával meghatározott gátlására dózis-reakció görbét készíthetünk, és annak alapján kiszámíthatjuk a kérdéses antitest IC50-értékét. Az egyik megvalósítási mód szerint az ErbB-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló antitestnek a p180 tirozinfoszforilációjának HRG általi stimulációjára vonatkozó IC50-értéke kb. 50 nM vagy kisebb, még előnyösebben 10 nM vagy kisebb. Amennyiben az antitest egy antitestfragmens, pl. Fab-fragmens, e tesztben - a p180 tirozinfoszforilációjának HRG általi stimulációjára vonatkozó - IC50-értéke kb. 100 nM vagy kisebb, még előnyösebben 50 nM vagy kisebb.
A fentieken túlmenően elvégezhetjük az antitest MDA-MB-175-sejtekre gyakorolt szaporodásgátló hatásainak vizsgálatát is, például a Schaefer és mtsai. [Oncogene 15, 1385 (1997)] által leírt eljárás szerint. E vizsgálati eljárás szerint az MDA-MB-175-sejteket négy napig anti-ErbB2 monoklonális antitesttel (10 g/ml) kezeljük és kristályibolyával festjük. Az anti-ErbB antitesttel végzett inkubálás e sejtvonalra - a 2C4 monokloná23
HU 226 742 Β1 lis antitest által mutatotthoz hasonló - szaporodásgátló hatást gyakorol. Egy másik megvalósítási mód szerint exogén eredetű HRG-polipeptid nem képes jelentős mértékben visszafordítani a gátlást. Az antitest előnyösen - exogén HRG jelenlétében és hiányában egyaránt - nagyobb mértékben gátolja az MDA-MB-175sejtek proliferációját, mint a 4D5 monoklonális antitest (és adott esetben nagyobb mértékben, mint a 7F3 monoklonális antitest).
Az egyik megvalósítási mód értelmében a szóban forgó anti-ErbB2 antitest MCF7- és SK-BR-3-sejtekben (koimmunprecipitációs kísérletben meghatározva) egyaránt képes blokkolni az ErbB ErbB3-mal történő - heregulindependens - asszociációját (és előnyösen sokkal hatékonyabban, mint a 7F3 monoklonális antitest).
A sejthalált indukáló antitestek szelektálása céljából a sejtmembrán épségének csökkenését - propidium-jodid (P1), tripánkék vagy 7AAD felvétele alapján - kontrollsejtekéhez viszonyítva értékeljük. Előnyösen BT474-sejtek alkalmazásával végzett P1 -felvételi tesztet végzünk. E teszt során BT474-sejteket (American Type Culture Collection, Rockville, MD) Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközeg (D-MEM) és Ham-féle F12tápközeg 1:1 arányú 10% hőinaktivált magzati borjúszérummal (FBS, Hyclone) és 2 mM L-glutaminnal kiegészített elegyében tenyésztjük (így a tesztet komplement és immuneffektorsejtek hiányában végezzük). A BT474-sejteket 100^20 mm-es csészékben, csészénként 3χ106 sejt mennyiségben helyezzük el, és egy éjszakán át hagyjuk letapadni. Ezután a tápközeget eltávolítjuk és friss tápközeggel vagy a megfelelő monoklonális antitest 10 g/ml-ét tartalmazó tápközeggel helyettesítjük. A sejteket három napig inkubáljuk. Az egyes kezelések után az egyrétegű sejttenyészeteket foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) mossuk és tripszines kezeléssel leválasztjuk a csészék faláról. Ezt követően a sejteket 4 °C-on 1200-as percenkénti fordulatszámmal 5 percig centrifugáljuk, a sejtüledéket 3 ml jéghideg Ca2+-kötő pufferben (10 mM HEPES, pH=7,4; 140 mM NaCI; 2,5 mM CaCI2) újraszuszpendáljuk, és a sejtcsomók eltávolítása érdekében 35 mm-es szűrővel lezárt 12x75-ös kémcsövekbe szortírozzuk (kémcsövenként 1 ml; kezelési csoportonként 3 kémcső). A kémcsövekbe ezután propidium-jodidot (Pl; 10 pg/ml) adunk. A mintákat FACSCAN áramlási citométer és FACSCONVERT CellQuest szoftver (Becton Dickinson) alkalmazásával vizsgáljuk. A Pl-felvétel alapján statisztikailag szignifikáns szintű sejthalált indukáló antitesteket sejthalált indukáló antitestekként azonosítjuk.
Az apoptózist indukáló antitestek szelektálása céljából - BT474-sejtek alkalmazásával - annexinkötési tesztet végezhetünk. A BT474-sejteket az előző bekezdésben leírtak szerint tenyésztjük és oltjuk csészékbe. A tápközeget ezután eltávolítjuk, majd friss tápközeggel vagy a megfelelő monoklonális antitest 10 pg/ml-ét tartalmazó tápközeggel helyettesítjük. Háromnapos inkubálás után az egyrétegű sejttenyészeteket foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) mossuk és tripszines kezeléssel leválasztjuk a csészék faláról. Ezt követően a sejteket centrifugáljuk, Ca2+-kötő pufferben újraszuszpendáljuk, és a fentebb leírtak szerint kémcsövekbe szortírozzuk. A kémcsövekbe ezután jelölt annexint (pl. annexin V-FTIC; 1 pg/ml) adunk. A mintákat FACSCAN áramlási citométer és FACSCONVERT CellQuest szoftver (Becton Dickinson) alkalmazásával vizsgáljuk. A kontrolihoz képest statisztikailag szignifikáns szintű annexinkötődést indukáló antitesteket apoptózist indukáló antitestekként azonosítjuk.
Az annexinkötési teszten kívül BT474-sejtek alkalmazásával végzett DNS-festési tesztet is végezhetünk. E teszthez az előző két bekezdésben leírtak szerint a kérdéses antitesttel kezelt BT474-sejteket 9 pg/ml HOECHST 33342-vel 37 °C-on két óra hosszat kezeltük, majd EPICS ELITE áramlási citométerrel (Coulter Corporation), MODFIT LT szoftver (Verity Software House) alkalmazásával analizáltuk. E teszt alkalmazásával az apoptózisos sejtek százalékos arányában - a kezeletlen sejtekhez képest - kétszeres vagy nagyobb (előnyösen háromszoros vagy nagyobb) változást (az apoptózisos sejtek egészen 100%-áig) indukáló antitesteket proapoptózisos antitestekként azonosítjuk.
Egy szóban forgó antitest által megkötött ErbB2-antigén epitópjához kötődő antitestek kiszelektálása céljából rutinszerű keresztblokkolási kísérletet végezhetünk [Id. „Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, szerk.: Harlow és Lane (1988)]. Más módon, vagy ezen túlmenően, szakember számára jól ismert eljárások alkalmazásával epitóp-térképezést végezhetünk (lásd 1A. és 1B. ábra).
(ix) Immunkonjugátumok
A találmány szerinti megoldás értelmében az antitestek immunkonjugátumai is alkalmazhatók, amelyekben az antitest citotoxikus hatóanyaghoz, pl. kemoterápiás hatóanyaghoz, toxinhoz (pl. kis molekulájú toxin vagy enzimatikus aktivitású toxin, amely lehet bakteriális, gombaeredetű, növényi vagy állati eredetű, ideértve az ilyen toxinok fragmenseit és/vagy változatait is) vagy radioaktív izotópokhoz vannak konjugálva (utóbbiak a radiokonjugátumok).
Az ilyen immunkonjugátumok létrehozására alkalmas kemoterápiás hatóanyagokat fentebb ismertettük. Az antitestek kis molekulájú toxinnal - pl. calicheamicin, maytansin (5 208 020 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás), trichothene és CC1065 - képzett konjugátumai szintén a találmány tárgyához tartoznak.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében az antitestet egy vagy több maytansinmolekulához konjugálva (pl. egy antitestmolekulára számítva kb. 1-10 maytansinmolekula) alkalmazzuk. A maytansin, például May-SS-Me-vé alakítható, amely azután MaySH3-má redukálható, és módosított antitesttel reagáltatva [Chari és mtsai.: Cancer Research 52, 127 (1992)] maytansinoid-antitest konjugátum hozható létre.
Más módon, az antitestet egy vagy több calicheamicinmolekulához konjugálhatjuk. Az antibiotikumok calicheamicincsaládja pM alatti koncentrációkban a kettős szálú DNS-ben szakadásokat képes okozni. A calicheamicin konjugálás céljára alkalmas strukturá24
HU 226 742 Β1 lis analógjai közé tartozik, többek között, a γ·/, α2', α3', N-acetil-γι1, PSAG és Θ1 [Hinman és mtsai.: Cancer Research 53, 3336 (1993) és Lode és mtsai.: Cancer Research 58, 2925 (1998); lásd még az 5 264 586 és 5 773 001 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat, melyeket teljes terjedelmükben a kitanítás részének tekintünk].
A konjugálásra alkalmazható, enzimatikusan aktív toxinok és fragmenseik közé tartozik a diftériatoxin A-lánca, a diftériatoxin nem kötő aktív fragmensei, az exotoxin A-lánca (Pseudomonas aeruginosából), ricin A-lánca, abrin A-lánca, modeccin A-lánca, a-sarcin, Aleurites fordii proteinek, dianthin-proteinek, Phytolaca americana proteinek (PAPI, PAPII és PAP-S), Momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, Saponaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, fenomicin, enomicin és a tricothecének (lásd pl. WO 93/21232 számú nemzetközi közzétételi irat).
A találmány oltalmi körébe tartoznak az antitestek nukleolitikus aktivitású vegyülettel [pl. ribonukleázzal vagy DNS-endonukleázzal, pl. dezoxiribonukleázzal (DNáz)] képzett konjugátumai.
A radiokonjugált anti-ErbB2 antitestek létrehozására számos radioaktív izotóp alkalmazható, mint pl. a At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, valamint a Lu radioaktív izotópjai.
Az antitest citotoxikus hatóanyaggal alkotott konjugátumai különféle difunkciós proteinkapcsoló ágensek alkalmazásával hozhatók létre, melyek példái a következők: N-szukcin imidi l-3-(2-piridi l-ditiol)-propionát (SPDP), szukcinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciklohexán-1-karboxilát, iminotiolán (IT), difunkciós imidoészterszármazékok (pl. dimetil-apimidát-HCI), aktív észterek (pl. diszukcinimidil-szuberát); aldehidek (pl. glutáraldehid), diazidovegyületek [pl. di-(p-azido-benzoil)-hexándiamin], di-diazonium-származékok [pl. di-(p-diazonium-benzoil)-etilén-diamin], diizocianátok (pl. toluol2,6-diizocianát) és difluorvegyületek (pl. 1,5-difluor-2,4dinitro-benzol). Például ricin immunotoxin előállítására a Vitetta és mtsai. [Science 238, 1098 (1987)] által leírt eljárás alkalmazható. Radionukleotid antagonistához történő konjugálására alkalmazható kelátképző szerek egyik jellemző példája a karbon-14-jelzett 1-izotiocianatobenzil-3-metil-dietilén-triamin-pentaecetsav (MXDTPA; lásd WO 94/11026 számú nemzetközi közzétételi irat). Kapcsolóként („linker”) „hasítható kapcsolót” alkalmazhatunk, amely lehetővé teszi, hogy a citotoxikus hatóanyag a sejtben felszabaduljon. Az ilyen kapcsolók savbomlékonyak vagy peptidázérzékenyek, illetve dimetil-kapcsolók vagy diszulfidtartalmú kapcsolók lehetnek [Chari és mtsai.: Cancer Research 52,127 (1992)].
Más módon, anti-ErbB2 antitestet és citotoxikus hatóanyagot tartalmazó fúziós proteint is előállíthatunk, például rekombináns technikák vagy peptidszintézis alkalmazásával.
Egy további megvalósítási mód értelmében az antitestet receptorhoz (pl. sztreptavidinhez) konjugálhatjuk. Az ilyen receptor a tumor előzetes megcélzására alkalmazható, oly módon, hogy az antitestreceptorkonjugátumot beadjuk a páciensnek, majd a nem kötődött konjugátumot megfelelő tisztító ágens alkalmazásával eltávolítjuk a keringésből, és ezután a páciensnek citotoxikus hatóanyaggal (pl. radionukleotid) konjugált ligandumot (pl. avidint) adunk be.
(x) Antitestdependens enzim közvetítette prodrog terápia (ADEPT)
A találmány szerinti antitestek antitestdependens enzim közvetítette prodrog terápiában (ADEPT) is alkalmazhatók, oly módon, hogy az antitestet prodrogaktiváló enzimmel konjugáljuk, amely egy prodrogot (pl. peptidil kemoterápiás hatóanyagot; lásd WO 81/01145 számú nemzetközi közzétételi irat) aktív rákellenes hatóanyaggá alakít át (lásd pl. WO 88/07378 számú nemzetközi közzétételi irat és 4 975 278 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás).
Az ADEPT céljára alkalmas konjugátumok enzimkomponenseként olyan enzim alkalmazható, amely egy prodrogot aktívabb, citotoxikus alakká képes átalakítani.
A találmány szerinti eljárásban hasznosan alkalmazható enzimek közé tartoznak többek között a következők: alkalikus foszfatáz, amely foszfáttartalmú prodrogok szabad drogokká történő átalakítására alkalmas; arilszulfatáz, amely szulfáttartalmú prodrogok szabad drogokká történő átalakítására alkalmas; citozin dezamináz, amely nem toxikus 5-fluorcitozin rákellenes hatóanyaggá (5-fluoruracillá) történő átalakítására alkalmas; proteázok, pl. Serratia proteáz, termolizin, szubtilizin, karboxipeptidázok és chatepszinek (pl. chatepszin-B és -L), melyek peptidtartalmú prodrogok szabad drogokká történő átalakítására alkalmasak; D-alanil-karboxipeptidázok, melyek D-aminosav szubsztituenseket tartalmazó prodrogok szabad drogokká történő átalakítására alkalmasak; szénhidráthasító enzimek, pl. β-galaktozidáz és neuraminidáz, melyek glikozilált prodrogok szabad drogokká történő átalakítására alkalmasak; β-laktamáz, amely β-laktámokkal derivatizált drogok szabad drogokká történő átalakítására alkalmas; és penicillin amidázok, pl. penicillin-V amidáz vagy penicillin-G amidáz, melyek amin-nitrogénatomjukon fenoxi-acetil-, illetve fenil-acetil-csoporttal derivatizált drogok szabad drogokká történő átalakítására alkalmasak. Más módon, a találmány szerinti prodrogok aktív szabad drogokká történő átalakítására enzimatikus aktivitású antitestek, úgynevezett „abzimek” is alkalmazhatók [Id. pl. Massey: Natúré 328, 457 (1987)]. Az antagonista-abzim konjugátumok a leírásban az abzim tumorsejt-populációba történő bejuttatásánál ismertetett módon állíthatók elő.
A találmány szerinti enzimek a szakirodalomból jól ismert eljárások (pl. heterodifunkciós keresztkötő reagensek) alkalmazásával, kovalens kötéssel kapcsolhatók az anti-ErbB2 antitestekhez. Más módon, szakember számára jól ismert rekombináns DNS-technikák alkalmazásával olyan fúziós proteinek hozhatók létre, amelyek egy találmány szerinti antitestnek legalább az antigénkötő régióját egy találmány szerinti enzim legalább egy funkcionálisan aktív részéhez kapcsolva tar25
HU 226 742 Β1 talmazzák [ld. pl. Neubergerés mtsai.: Natúré 312, 604 (1984)].
(xi) Az antitestek egyéb módosításai
Az antitestek egyéb módosításai is a találmány oltalmi köréhez tartoznak. Például az antitest különféle nem protein jellegű polimerhez (pl. polietilénglikolhoz, polipropilénglikolhoz, polioxi-alkilénekhez vagy polietilénglikol és polipropilénglikol kopolimereihez) kapcsolható. Ezenfelül az antitestet - koacervációs technikákkal vagy határfelületi polimerizációval [pl. hidroxi-metilcellulóz- vagy zselatinmikrokapszulák, illetve poli(metilmetacilát)-mikrokapszulák alkalmazásával] előállított mikrokapszulákba; kolloidális drogcélbajuttató rendszerekbe (pl. liposzómák, albuminmikrogömbök, mikroemulziók, nanorészecskék és nanopkapszulák alkalmazásával); vagy makroemulziókba foglalhatjuk. E technikák leírását lásd: „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 16., kiadás, szerk.: Osol, A. (1980).
Az anti-ErbB2 antitestek liposzómákba foglalt alakban is előállíthatók. Az antitestet tartalmazó liposzómák szakember számára jól ismert eljárásokkal állíthatók elő [ld. pl. Epstein és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); 4 485 045 és 4 544 545 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; és WO 97/38731 számú nemzetközi közzétételi irat]. Az 5 013 556 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban megnövelt keringési idejű liposzómákat tártak fel.
A különösen előnyös liposzómák foszfatidilkolint, koleszterint és PEG-gel derivatizált foszfatidil-etanolamint (PEG-PE) tartalmazó lipidkészítmény alkalmazásával végzett - reverz fázisú lepárlási eljárással állíthatók elő. A liposzómákat meghatározott pórusméretű filtereken átpréselve kívánt átmérőjű liposzómákhoz juthatunk. A találmány szerinti antitest Fab’-fragmensei diszulfid kicserélődési reakcióval, Martin és mtsai. [J. Bioi. Chem. 257, 286 (1982)] leírása szerint konjugálhatók a liposzómákhoz. A liposzómába adott esetben kemoterápiás hatóanyagot foglalhatunk [ld. Gabizon és mtsai.: J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989)].
III. Vektorok, gazdasejtek és rekombináns eljárások
A találmány tárgyához tartoznak a humanizált antiErbB2 antitestet kódoló izolált nukleinsavak; az ilyen nukleinsavakat tartalmazó vektorok és gazdasejtek, valamint az antitest előállításának rekombináns eljárásai is.
Az antitest rekombináns módszerekkel történő előállítása során a megfelelő, kódoló nukleinsavat izoláljuk és - további klónozás (DNS-amplifikáció) vagy expresszáltatás céljából - replikációra képes vektorba inszertáljuk. A monoklonális antitestet kódoló DNS hagyományos eljárásokkal (pl. az antitest nehéz és könnyű láncait kódoló génekhez specifikusan kötődő oligonukleotidpróbák alkalmazásával) könnyen izolálható és szekvenálható. Az inszertálásra számos vektor alkalmazható, melyek - többek között - a következő komponensek közül egyet vagy többet tartalmazhatnak: szignálszekvencia, replikációs kezdőhely, egy vagy több markergén, erősítőszekvencia („enhancer”), promoter és transzkripciós terminációs szekvencia.
(i) Szignálszekvencia-komponens
A találmány szerinti anti-ErbB2 antitest rekombináns módszerekkel történő előállítása nemcsak közvetlenül, de heterológ polipeptiddel (amely előnyösen szignálszekvencia vagy egyéb, az érett protein vagy polipeptid N-terminálisán specifikus hasítási helyet tartalmazó polipeptid) alkotott fúziós polipeptid előállításával is végrehajtható. Heterológ szignálszekvenciaként előnyösen olyat választunk ki, amelyet a gazdasejt felismer és feldolgoz (vagyis szignálpeptidázzal hasít). Azon prokarióta gazdasejtek esetében, amelyek nem ismerik fel az anti-ErbB2 antitest natív szignálszekvenciáját, azt prokarióta szignálszekvenciával helyettesítjük, például a következők közül: alkalikus foszfatáz, penicillináz, Ipp vagy hőstabil enterotoxin II vezetőszekvenciák. Élesztősejtekben végzett szekréció esetén a natív szignálszekvencia, például élesztőeredetű invertáz vezetőszekvenciájával, α-faktor vezetőszekvenciájával (ideértve a Saccharomyces- és Kluyveromyces-eredetíí a-faktor vezetőszekvenciáját), savas foszfatáz vezetőszekvenciájával, C. a/5/cans-eredetű glükoamiláz vezetőszekvenciájával vagy a WO 90/13646 számú nemzetközi közzétételi iratban feltárt szignálszekvenciával helyettesíthető. Emlőseredetű sejtekben végzett expresszáltatáshoz emlőseredetű szignálszekvenciák, valamint virális szekréciós vezetőszekvenciák (pl. herpes simplex vírus gD szignálszekvenciája) alkalmazhatók.
Az ilyen prekurzorrégiók DNS-ét a polipeptidváltozatot kódoló DNS-hez azonos leolvasási fázisban ligáljuk.
(ii) Replikációs kezdőhely komponens
Az expressziós és klónozóvektorok egyaránt tartalmaznak olyan nukleinsavszekvenciát, amely lehetővé teszi, hogy a vektor egy vagy több kiválasztott gazdasejtben replikációra legyen képes. A klónozóvektorokban ilyen szekvenciaként általában a vektor - gazda kromoszomális DNS-étől független - replikációját elősegítő szekvenciát alkalmazunk, melyek példái a replikációs kezdőhelyek vagy önálló replikációra képes szekvenciák. Ezek a szekvenciák különféle baktériumok, élesztők és vírusok esetében jól ismertek. A legtöbb Gram-negatív baktériumban a pBR322-plazmid replikációs kezdőhelye; az élesztőkben a 2y-plazmid kezdőhelye; míg emlőseredetű sejtekben különféle víruseredetű (SV40, polyoma, adenovírus, VSV vagy BPV) replikációs kezdőhelyek alkalmazhatók. A replikációs kezdőhely komponensre emlőseredetű sejtekben történő expresszáltatásra alkalmas expressziós vektorokban általában nincs szükség (az SV40 kezdőhely általában csak azért használatos, mert korai promotert tartalmaz).
(iii) Szelektálható markergén komponens
Az expressziós és klónozóvektorok tartalmazhatnak szelektálható markergént is. A jellemző markergének
HU 226 742 Β1 olyan proteineket kódolnak, amelyek (a) antibiotikumokkal vagy egyéb toxinokkal (pl. ampicillin, neomicin, methotrexát vagy tetraciklin) szemben rezisztenciát biztosítanak; (b) auxotróf hiányokat kompenzálnak; vagy (c) komplex tápközegben nem található, kulcsfontosságú tápanyagokat biztosítanak (pl. a Bacillus fajok számára nélkülözhetetlen D-alanin racemázt kódoló gén).
A szelektálás! módszerek egyik példája értelmében a gazdasejt szaporodását gátló drogot alkalmazunk. A heterológ génnel sikeresen transzformált sejtek drogrezisztenciát biztosító proteint termelnek, ezáltal a szelekciós eljárást túlélik. Az ilyen domináns szelekciós rendszerekben jellemzően neomicint, mikofenolsavat vagy higromicint alkalmazhatunk.
Az emlőseredetű sejtek esetében alkalmazható szelektálható markerek példái közé tartoznak azok, amelyek lehetővé teszik az anti-ErbB2 antitestet kódoló nukleinsav felvételét illetően kompetens sejtek azonosítását; ezek példái a DHFR, timidin-kináz, metallotionein-l és -II, előnyösen főemlős-eredetű metallotionein-gének, adenozin-dezamináz, ornithin-dekarboxiláz stb.
Például a szelektálható DHFR-génnel transzformált sejtek azonosítása céljából a transzformánsokat először methotrexátot (Mtx; amely a DHFR kompetitív antagonistája) tartalmazó tenyésztő tápközegben tenyésztjük. A vad típusú DHFR szelekciós markerként történő alkalmazásához megfelelő gazdasejt a DHFR-aktivitásában deficiens - kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonal.
Más módon, az anti-ErbB2 antitestet, vad típusú DHFR-proteint és további szelektálható markert [pl. aminoglikozid 3’-foszfotranszferázt (APH)] kódoló DNS-szekvenciával transzformált (vagy kotranszformált) gazdasejteket - előnyösen endogén DHFR-t tartalmazó vad típusú gazdasejteket - olyan tápközegben történő szaporodásuk alapján szelektálhatunk, amely a szelektálható marker számára szelekciós hatóanyagot tartalmaz, például aminoglikozidos antibiotikumot (kanamicint, neomicint vagy G418-at); lásd 4 965 199 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás.
Élesztősejtek esetében szelekciós génként az YRp7 élesztőplazmidban lévő trp1 -gént alkalmazhatjuk [Stinchcomb és mtsai.: Natúré 282, 39 (1979)]. A trp1 gén a triptofán jelenlétében szaporodásra képtelen mutáns élesztőtörzsek (pl. ATCC 44076 vagy PEP4-1) számára nyújt szelektálható markert [Jones: Genetics 85, 12 (1977)]. Az élesztő gazdasejt genomjában a trp1 -gén sérülése hatékony környezetet biztosít ahhoz, hogy a transzformánsokat a triptofán hiányában bekövetkező szaporodás alapján detektáljuk. Hasonlóan, a Leu2-deficiens élesztőtörzsek (ATCC 20622 vagy ATCC 38626) a Leu2-gént hordozó ismert plazmidokkal komplementálhatók.
Ezen túlmenően, az 1,6 pm cirkuláris pKD1-plazmidból származó vektorok Kluyveromyces élesztők transzformálására alkalmazhatók. Más módon, Van den Berg [Bio/Technology 8, 135 (1990)] rekombináns borjúeredetű chymosin K. lactisban történő, nagy volumenű termeltetésére alkalmas expressziós rendszert írt le. Érett rekombináns humán szérumalbumin Klvyveromyces ipari törzsei általi szekréciójára stabil sokkópiás expressziós vektorokat írtak le [Fleer és mtsai.: Bio/Technology 9, 968 (1991)].
(iv) Promoterkomponens
Az expressziós és klónozóvektorok rendszerint tartalmaznak gazdasejt által felismerhető és az antiErbB2 antitestet kódoló nukleinsavhoz működőképesen kapcsolt promotert is. A prokarióta gazdasejtekben alkalmazható promoterek közé tartozik a phoA-promoter, a β-laktamáz és laktóz promoterrendszerek, az alkalikus foszfatáz promotere, triptofán (trp) promoterrendszer, valamint hibrid promoterek, mint pl. a tacpromoter. Mindazonáltal egyéb ismert bakteriális promoterek is alkalmazhatók. A bakteriális rendszerekben alkalmazható promoterek - az anti-ErbB2 antitestet kódoló DNS-hez működőképesen kapcsolva - Shine-Dalgarno (S. D.) szekvenciát is tartalmaznak.
Az eukarióta sejtek esetében is ismeretesek promoterszekvenciák. Gyakorlatilag valamennyi eukarióta gén tartalmazó adeninben és timinben gazdag (ATgazdag) régiót, amely a transzkripciós kezdőhelytől 5’-irányban, hozzávetőleg 25-30 bázis távolságban helyezkedik el. Számos gén transzkripciós kezdőhelyétől 5’-irányban, 70-80 bázis távolságban egy másik szekvencia is megtalálható; ez a CNCAAT régió (ahol N jelentése tetszőleges nukleotid). A legtöbb eukarióta gén 3’-végén AATAAA szekvencia helyezkedik el, amely a poli-A faroknak a kódolószekvencia 3’-végéhez történő kapcsolódásának szignálja lehet. Az eukarióta expressziós vektorokba, alkalmas módon, e szekvenciák mindegyike beépíthető (inszertálható).
Az élesztő gazdasejtek esetében alkalmazható promoterszekvenciák közé tartoznak a 3-foszfoglicerát kináz vagy egyéb glikolitikus enzimek (pl. enoláz, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz-6-foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerát mutáz, piruvát kináz, triózfoszfát izomeráz, foszfoglükóz izomeráz és glükokináz) génjeinek promoterei.
Az élesztősejtekben alkalmazható promoterek egyéb példái az indukálható promoterek, amelyek további előnye, hogy a transzkripciót a szaporodási feltételek szabályozzák. Az ilyen promoterek közé tartoznak a következő enzimek génjeinek promoterei: alkohol dehidrogenáz-2, izocitokróm-C, savfoszfatáz, nitrogénmetabolizmussal kapcsolatos lebontóenzimek, metallotionein, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, valamint a maltóz és galaktóz felhasználásért felelős enzimek. Az élesztőben történő expresszáltatáshoz megfelelő vektorok és promoterek leírását illetően lásd az EP 73 657 számú európai szabadalmi leírást. Az élesztőpromoterekkel együtt élesztőeredetű erősítőszekvenciák is alkalmazhatók.
Emlőseredetű gazdasejtekben az anti-ErbB2 antitest transzkripcióját, például vírusok [pl. polyoma-vírus, baromfihimlő-vírus, adenovírus (pl. adenovírus-2), szarvasmarha-papillomavírus, madár-sarcomavírus, cytomegalovírus, retrovírus, hetpatitis-B vírus, és leg27
HU 226 742 Β1 előnyösebben SV40 vírus] genomjából származó promoterek vagy heterológ emlőseredetű promoterekből, pl. aktinpromoterből, immunglobulin-promoterből vagy hősokkpromoterekből származó promoterek szabályozhatják, feltéve, hogy az alkalmazott gazdasejtrendszerrel kompatibilisek.
Az SV40-vírus korai és kései promoterei, alkalmas módon, SV40 restrikciós fragmensként nyerhetők ki, amely SV40-eredetű replikációs kezdőhelyet is tartalmaz. A humán cytomegalovírus azonnali korai promotere Hindlll E restrikciós fragmensként izolálható. DNS-ek emlőseredetű gazdasejtekben - vektorként szarvasmarha-papillomavírus alkalmazásával - történő expresszáltatására alkalmas rendszert a 4 419 446 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban tártak fel. E rendszer módosított változatának leírását illetően lásd a 4 601 978 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást. A humán β-interferon cDNS egéreredetű sejtekben - herpes simplex vírusból származó timidin-kináz promoter szabályozása alatt történő expresszáltatásának leírását lásd: Reyes és mtsai.: Natúré 297, 598 (1982). Más módon, promoterként Rous-sarcoma-vírus hosszú terminális ismétlődése is alkalmazható.
(v) Erősítőszekvencia-komponens
A találmány szerinti anti-ErbB2 antitestet kódoló DNS transzkripciója magasabb rendű eukarióta gazdasejtekben gyakran úgy fokozható, hogy a vektorba erősítőszekvenciát inszertálunk. Számos, emlőseredetű génekből (globin, elasztáz, albumin, α-fetoprotein és inzulin génjei) ismert erősítőszekvencia áll rendelkezésre, azonban jellemzően eukarióta sejteket fertőző vírusokból származó erősítőszekvenciákat alkalmazunk. Ezek példái a következők: SV40 erősítőszekvenciája (a replikációs kezdőhely kései oldalán; 100-270. bázispár); citomegalovírus korai promoter erősítőszekvenciája; polyomavírus erősítőszekvenciája (a replikációs kezdőhely kései oldalán); és adenovírus-eredetű erősítőszekvenciák. Az eukarióta promotereket aktiváló erősítőszekvenciákat illetően lásd még Yaniv: Natúré 297, 17 (1982). Az erősítőszekvencia a polipeptidváltozatot kódoló szekvenciától 5’- vagy 3’-irányban azonban előnyösen a promotertől 5’-irányban - helyezhető el.
(vi) Transzkripciós terminációs komponens
Az eukarióta gazdasejtekben (élesztősejtekben, gombasejtekben, rovarsejtekben, növényi sejtekben, állati sejtekben, humán sejtekben vagy egyéb, soksejtű organizmusból származó magvas sejtekben) alkalmazható expressziós vektorok a transzkripció terminációjához és az mRNS stabilizálásához szükséges szekvenciákat is tartalmaznak. Az ilyen szekvenciák az eukarióta vagy virális DNS-ek vagy cDNS-ek nem transzlálódó régióitól 5’-irányban - esetenként 3’-irányban - helyezkednek el. Ezek a régiók olyan nukleotidokat tartalmaznak, amelyek az anti-ErbB2 antitestet kódoló mRNS nem transzlálódó részében poliadenilált fragmensekként íródnak át. A találmány szerinti megoldás szempontjából hasznos egyik transzkripciós terminációs komponens a szarvasmarha-eredetű növekedési hormon poliadenilációs régiója (lásd a WO 94/11026 számú nemzetközi közzétételi iratot és az abban feltárt expressziós vektort).
(vii) A gazdasejtek szelektálása és transzformálása
A találmány szerinti vektorokban lévő DNS-ek klónozására és expresszáltatására alkalmas gazdasejtek a fentebb leírt prokarióta, élesztő és magasabbrendű eukarióta sejtek. Az erre a célra alkalmazható prokarióta sejtek közé tartoznak a valódi baktériumok, vagyis a Gram-negatív és Gram-pozitív organizmusok, mint pl. a bélbaktériumok, például az Escherichia fajok (pl. E. coli), az Enterobacter fajok, Erwinia fajok, Klebsiella fajok, Proteus fajok, Salmonella fajok (pl. Salmonella typhimurium), Serratia fajok (pl. Serratia marcescens), és a Shigella fajok, valamint a Bacillusok, például a 6. subtilis és a β. licheniformis (pl. β. licheniformis 4tP; lásd DD 266 710 számú, 1989. április 12-én közzétett német szabadalmi leírás); a Pseudomonas fajok (pl. P. aeruginosa) és a Streptomyces fajok. Az £ coli-törzsek közül klónozás céljára előnyösen az £ coli 294-törzs (ATCC 31446) alkalmazható, azonban egyéb törzsek - pl., többek között, £ coli B, £ coli X1776 (ATCC 31537) és £ co//W3110 (ATCC 27325) - is alkalmasak.
Az anti-ErbB2 antitestet kódoló DNS-szekvenciákat hordozó vektorok számára klónozó vagy expresszáltató gazdasejtként - a prokarióták mellett - eukarióta mikroorganizmusok (például fonalas gombák vagy élesztők) is alkalmasak. Az alacsonyabb rendű eukarióta gazdamikroorganizmusok közül a Saccharomyces cerevisiae (vagy sütőélesztő) a leggyakrabban alkalmazott gazdasejt, azonban az eukarióta mikroorganizmusok számos egyéb nemzetsége, faja és törzse is alkalmazható, mint pl. a Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces fajok [pl. K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans és K. marxianusj; Yarrowia fajok (EP 402 226); Pichia pastoris (EP 183 070); Candida fajok; Trichoderma reesia (EP 244 234); Nevrospora crassa; Schwanniomyces fajok (pl. Schwanniomyces occidentalis); valamint fonalas gombák, pl. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium és Aspergillus fajok (pl. Aspergillus nidulans és A. niger).
A glikozilált anti-ErbB2 antitest termeltetésére gazdasejtként többsejtű organizmusokból származó gazdasejtek is alkalmazhatók. A gerinctelenekből származó sejtek közé növényi sejtek és rovarsejtek tartoznak. Számos baculovírustörzset és változatot, illetve gazdasejtként a megfelelő, fertőzésre alkalmas rovarsejtet azonosítottak, mint pl. a Spodoptera frugiperda (hernyó), Aedes aegypti (szúnyog), Aedes albopictus (szúnyog), Drosophila melanogaster (gyümölcslégy) és Bombiyx móri. Számos különféle vírustörzs áll rendelkezésre (pl. az Avtographa californica NPV-vírus L-l változata; és a Bombyx móri NPV-vírus Bm-5 törzse), és a találmány szerinti megoldás értelmében az ilyen
HU 226 742 Β1 vírusok, például Spodoptera frugiperda sejtek transzfektálására alkalmazhatók.
Gazdasejtként gyapot-, kukorica-, burgonya-, szójabab-, petúnia-, paradicsom- és dohányeredetű sejtek tenyészetei is alkalmazhatók.
Mindazonáltal az érdeklődés középpontjába a gerincesekből származó sejtek gazdasejtként történő alkalmazása került, és a gerinces állatok sejtjeinek tenyészetben történő szaporítása (szövettenyésztés) rutinszerű eljárássá vált. Az emlőseredetű gazdasejtek példái közé tartoznak a következők: SV40-vírussal transzformált CV1 majomvesesejtek (COS-7, ATCC CRL 1651); humán embrionális veseeredetű sejtvonalak [293-as sejtek, ill. szuszpenziótenyészetben történő szaporítás céljából szubklónozott 293-as sejtek; Graham és mtsai.: J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)]; újszülött hörcsögvesesejtek (BHK, ATCC CCL 10); kínai hörcsög petefészek sejtek/-DHFR [CHO, Urlaub és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)]; egéreredetű Sertoli-sejtek [TM4, Mather: Bioi. Repród. 23, 243 (1980)]; majomvesesejtek (CV1, ATCC CCL 70); afrikai zöldmajom vesesejtek (VERO-76, ATCC CRL1587); humán méhnyak-carcinomasejtek (HeLa, ATCC CCL 2); kutyavesesejtek (MDCK, ATCC CCL 34); Buffalo-patkány májsejtek (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humán tüdősejtek (W138, ATCC CCL 75); humán májsejtek (Hep G2, HB 8065); egéreredetű emlőtumorsejtek (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-sejtek [Mather és mtsai.: Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44 (1982)]; MRC5sejtek; FS4-sejtek; és humán hepatoma-sejtvonal (Hep G2).
A gazdasejteket az anti-ErbB2 antitest termeltetése céljából a fentebb leírt expressziós vagy klónozóvektorokkal transzformáljuk, és - a promoterek indukálása, transzformánsok szelektálása vagy a kívánt szekvenciákat kódoló gének amplifikálása céljából módosítottszokványos tápközegben tenyésztjük.
(viii) Gazdasejtek tenyésztése
A találmány szerinti anti-ErbB2 antitest termeltetésére alkalmazott gazdasejtek tenyésztésére különféle tápközegeket alkalmazhatunk, melyek közül kereskedelmi forgalomban beszerezhető a Ham-féle F10-tápközeg (Gibco), a MEM-tápközeg (minimál esszenciális tápközeg; Sigma), az RPMI-1640 tápközeg (Sigma) és a Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközeg (DMEM; Sigma). Az említetteken kívül egyéb tápközegek is alkalmazhatók [Id. pl. Ham és mtsai.: Meth. Enz. 58, 44 (1979); Barnes és mtsai.: Anal. Biochem. 102, 255 (1980); 4 767 704; 4 657 866; 4 927 762; 4 560 655; és 5 122 469 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; WO 90/03430 és WO 87/00195 számú nemzetközi közzétételi irat; valamint U. S. Patent Re. 30 985], Szükség esetén e tápközegek hormonokkal és/vagy egyéb növekedési faktorokkal (pl. inzulin, transzferrin vagy epidermális növekedési faktor), sókkal (pl. nátrium-klorid, kalcium-, magnézium- és foszfátsók), pufferekkel (pl. HEPES), nukleotidokkal (pl. adenozin vagy timidin), antibiotikumokkal (pl. Gentamycin™), nyomelemekkel (definíció szerint: μΜ tartományba eső végkoncentrációban jelen lévő szervetlen vegyületek) és glükózzal vagy egyenértékű energiaforrással egészíthetők ki. Ezen túlmenően, a tápközegekhez a szakember számára jól ismert egyéb szükséges kiegészítő anyagok bármelyike hozzáadható. A tenyésztést a termeltetésre kiválasztott gazdasejt esetében általánosan alkalmazott feltételeket (pl. hőmérséklet, pH és hasonlók) mellett végezzük.
(ix) Az anti-ErbB2 antitestek tisztítása
A találmány szerinti antitest - rekombináns technikák alkalmazásával - intracellulárisan, periplazmikus térben vagy közvetlenül a tápközegbe kiválasztva termeltethető. Ha az antitestet intracellulárisan termeltetjük, első lépésként a tápközegből centrifugálással vagy ultraszűréssel eltávolítjuk a szemcsés üledéket (amely a gazdasejtekből vagy az emésztett törmelékből áll). Carter és mtsai. [Bio/Technology 10, 163 (1992)] eljárást írtak le E. co//'-sejtek periplazmikus terébe kiválasztott antitestek izolálására. Ennek során a sejtmasszát nátrium-acetát (pH=3,5), EDTA és fenil-metilszulfonil-fluorid (PMSF) jelenlétében kb. 30 perc alatt felolvasztjuk. A sejtüledék centrifugálással eltávolítható. Amennyiben az antitest a tápközegbe van kiválasztva, az ilyen expressziós rendszerek alkalmazásával kapott felülúszókat először általában kereskedelmi forgalomban beszerezhető proteinbetöményítő szűrővel (pl. Amicon vagy Millipore Pellicon ultrafiltrációs egység) bekoncentráljuk. E lépések során a proteolízis gátlása céljából proteázinhibitort (pl. PMSF) alkalmazhatunk, és az esetleges szennyező mikroorganizmusok szaporodásának gátlására antibiotikumok alkalmazhatók.
A sejtekből előállított antitest, például hidroxilapatitkromatográfiával, gélelektroforézissel, dialízissel vagy affinitási kromatográfiával tisztítható, melyek közül előnyösen az affinitási kromatográfiát alkalmazhatjuk. A protein-A affinitási ligandumként történő alkalmazása az antitestben lévő Ig-Fc-régió fajtájától és izotípusától függ. A protein-A a humán γ1, γ2 vagy γ4 nehéz láncokon alapuló antitestek tisztítására alkalmazható [Lindmark és mtsai.: J. Immunoi. Meth. 62, 1 (1983)]. A protein-G valamennyi egérizotípushoz, valamint a humán y3-hoz ajánlott [Guss és mtsai.: EMBO J. 5, 1567 (1986)]. Az affinitási ligandumot leggyakrabban agarózhoz kapcsoljuk, de más ágyazóanyagok is alkalmazhatók. A mechanikailag stabil ágyazóanyagok - pl. szabályozott pórusméretű üveg vagy poli(sztirol-divinil)-benzol - nagyobb átfolyási sebességet és rövidebb feldolgozási időt tesznek lehetővé, mint az agaróz. Ha a polipeptidváltozat CH3-domént tartalmaz, a tisztításra Bakerbond ABX™ gyantát (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) alkalmazhatunk. Az antitest tisztítására - a kinyerni kívánt antitesttől függően - egyéb proteintisztítási technikák is alkalmasak, mint pl. az ioncserélő oszlopon végzett frakcionálás, etanolos precipitáció, reverz fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia, szilikagél-kromatográfia, Heparin-Sepharose™ kromatográfia, anion- vagy kationcserélő gyantán (pl. poliaszparaginsav-oszlopon) végzett kromatográfia, kromatofoku29
HU 226 742 Β1 szálás, SDS-PAGE és ammónium-szulfátos precipitáció.
Az előzetes tisztítási lépés(eke)t követően a kívánt polipeptidváltozatot és szennyező anyagokat tartalmazó elegyet - előnyösen kis sókoncentráció (pl. 0-0,25 M) mellett - alacsony pH-η végzett hidrofób kölcsönhatási kromatográfiának vetjük alá, melynek során kb. 2,5-4,5-es pH-jú eluálópuffert alkalmazunk.
IV. Gyógyászati készítmények
A találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazott antitestekből oly módon készíthetünk tárolásra alkalmas gyógyászati készítményeket, hogy kívánt tisztaságú antitestet és - adott esetben - fiziológiai szempontból elfogadható hordozókat, kötőanyagokat és stabilizálószereket [Id. Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. kiadás, szerk.: Osol (1980)] elegyítünk (liofilizátum vagy vizes oldat alakjában). Az erre a célra alkalmas hordozók, kötőanyagok és stabilizálószerek az alkalmazott dózisokban és koncentrációkban nem lehetnek toxikusak a páciensre. Az ilyen anyagok a következők: pufferek (pl. foszfát, citrát és egyéb szerves savak); antioxidánsok [pl. oktadecil-dimetil-benzil-ammónium-klorid, hexamethonium-klorid, benzalkonium-klorid, benzethonium-klorid, fenil, butil- vagy benzil-alkohol, alkilparabének (pl. metilvagy propilparabén), cacetchol, rezorcinol, ciklohexanol, 3-pentanol és m-krezol]; kis molekulatömegű (legfeljebb kb. 10 aminosavas) polipeptidek; proteinek (pl. szérumalbumin, zselatin vagy immunglobulinok); hidrofil polimerek [pl. poli(vinil-pirrolidon)]; aminosavak (pl. glicin, glutamin, aszparagin, hisztidin, arginin vagy lizin); monoszacharidok, diszacharidok és egyéb szénhidrátok (pl. glükóz, mannóz vagy dextrinek); kelátképzők (pl. EDTA); cukrok (pl. szacharóz, mannitoi, trehalóz vagy szorbitol); sóképző ellenionok (pl. nátrium); fémkomplexek (pl. Zn-protein komplexek); és/vagy nem ionos felületaktív anyagok [pl. Tween™, Pluronics™ vagy polietilénglikol (PEG)]. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös liofilizált anti-ErbB2 antitestkészítményeket a WO 97/04801 számú nemzetközi közzétételi iratban tárták fel (melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének tekintünk).
A szóban forgó gyógyászati készítmény - az adott indikációtól függően - egynél több (előnyösen egymás hatását károsan nem befolyásoló, komplementer aktivitású) hatóanyagot is tartalmazhat. Például az ilyen készítmény tartalmazhat olyan antitesteket is, amelyek képesek megkötni az EGFR-t, ErbB2-t (pl. az ErbB2 egy másik epitópját), ErbB3-at, ErbB4-et vagy vaszkuláris endothelialis faktort (VEGF). Más módon, vagy ezen túlmenően, a készítmény tartalmazhat citotoxikus hatóanyagot, kemoterápiás hatóanyagot, citokint, sejtszaporodást gátló hatóanyagot, antihormonális hatóanyagot, EGFR-re irányuló hatóanyagot, angiogenezist gátló hatóanyagot és/vagy kardioprotektánst is. Az ilyen molekulák, alkalmas módon, a kívánt cél eléréséhez megfelelő kombinációban és mennyiségben lehetnek jelen a készítményben.
Az aktív összetevők mikrokapszulába is foglalhatók, amely, például koacervációs technikával (hidroximetil-cellulóz- vagy zselatinmikrokapszula) vagy határfelületi polimerizációval állítható elő [poli(metilmetakrilát)-mikrokapszula]. Más módon, az aktív összetevők kolloidális célbajuttató rendszerekbe (pl. liposzómák, albuminmikrogömbök, mikroemulziók, nanoszemcsék és nanokapszulák) vagy makroemulziókba foglalhatók. Az ilyen technikák leírását lásd: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. kiadás, szerk.: Osol (1980)].
A találmány szerinti megoldás értelmében tartós hatóanyag-kibocsátású készítmények is előállíthatok. Az ilyen készítmények jellemző példái közé tartoznak az antitestet tartalmazó, szilárd hidrofób polimerekből készített féligáteresztő ágyazóanyagok, amelyek pl. filmek vagy mikrokapszulák formájában állíthatók elő. A tartós hatóanyag-felszabadulást biztosító ágyazóanyagok példái a következők: poliészterek; hidrogélek [pl. poli(2-hidroxi-etil-metakrilát) vagy polivinil-alkohol]; polilaktidok (3 773 919 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás); L-glutaminsav és γ-etil-L-glutamát kopolimerei; lebonthatatlan etilén-vinil-acetát kopolimerek; lebontható tejsav-glikolsav kopolimerek (pl. LUPRON DEPOT™, amely tejsav-glikolsav kopolimerből és leuprolid-acetátból álló, injektálható mikrogömbkészítmény); és poli-D-(—)-3-hidroxi-vajsav.
Az in vivő adagolásra szánt készítményeknek sterileknek kell lenniük, ami steril szűrőmembránok alkalmazásával végzett szűréssel egyszerűen biztosítható.
V. Anti-ErbB2 antitestekkel végzett kezelés
A találmány szerinti megoldás értelmében az antiErbB2 antitestek különféle betegségek vagy rendellenességek kezelésére alkalmazhatók, melyek jellemző példái közé tartoznak a következők: jóindulatú és malignáns tumorok; leukózisok és limfoid malignáns betegségek; valamint egyéb rendellenességek, mint pl. idegsejt-, gliasejt-, asztrocita-, hipotalamusz-, mirigy-, makrofág-, epithelsejt-, stroma-, blasztocöl-, gyulladásos, angiogén és immunológiai rendellenességek.
A találmány szerinti megoldás értelmében kezelhető betegség vagy rendellenesség általában rákos betegség, melyek példái közé tartozik, többek között, a carcinoma, limfóma, blastoma, sarcoma, leukózis és a malignáns limfoid rendellenességek. A rákbetegségek konkrét példái közé tartoznak a következők: pikkelysejtes rák (pl. epithelialis pikkelysejtes rák), a tüdőrák (kissejtes és nem kissejtes tüdőrák), tüdőadenocarcinoma és pikkelysejtes tüdőcarcinoma, hashártyarák, hepatocelluláris rák, gyomor- vagy hasi rákok, pl. gastrointestinalis rák, hasnyálmirigyrák, glioblastoma, méhnyakrák, petefészekrák, májrák, húgyhólyagrák, hepatoma, emlőrák, vastagbélrák, végbélrák, vastagvégbélrák, endometrium- vagy méhcarcinoma, nyálmirigyrák, veserák, prosztatarák, szeméremtestrák, pajzsmirigyrák, májcarcinoma, végbélcarcinoma, peniscarcinoma, valamint fej- és nyakrák.
A szóban forgó rákok általában ErbB2-receptort termelő sejteket tartalmaznak, így az anti-ErbB2 antitestek képesek a tumorhoz kötődni. Bár az anti-ErbB2 antitestek az ErbB2-receptor túlzott mértékű termelésével
HU 226 742 Β1 jellemezhető rákok kezelésére alkalmasak, a találmány tárgyához tartozik az anti-ErbB2 antitestek olyan rákos betegségek kezelésére történő alkalmazása, amelyekre nem jellemző az ErbB2-receptor túlzott mértékű termelése. A rákban az ErbB2-receptor termelődésének meghatározására különféle diagnosztikai és prognosztizáló tesztek állnak rendelkezésre. Az egyik megvalósítási mód értelmében az ErbB2 túltermelődését IHCvel, például HERCEPTEST® (Dako) alkalmazásával teszteljük. Az IHC-tesztben tumorbiopsziából származó, paraffinba ágyazott szövetmetszeteket vizsgálunk, és a szöveteket az ErbB2-protein festődési intenzitása alapján értékeljük, a következők szerint:
O=festődés nem tapasztalható, vagy a tumorsejtek kevesebb mint 10%-ában figyelhető meg membránfestődés;
1+=a tumorsejtek több mint 10%-ában gyenge, alig észrevehető membránfestődés detektálható;
2+=a tumorsejtek több mint 10%-ában enyhén/mérsékelten komplett membránfestődés figyelhető meg;
3+=a tumorsejtek több mint 10%-ában mérsékelten/erősen komplett membránfestődés figyelhető meg.
A „0” vagy „1+” ErbB2-túltermelődési pontszámmal értékelt tumorok az ErbB2-t nem túltermelő tumorként jellemezhetők, míg a „2+” és „3+” pontszámú tumorok az ErbB2-t túltermelőként azonosíthatók.
Más módon vagy ezen túlmenően, formalinnal fixált, paraffinba ágyazott tumorszövet felhasználásával, a tumor ErbB2-túltermelése mértékének (ha kimutatható egyáltalán) meghatározására FISH-teszteket - például INFORM™ (Ventana, Arizona) vagy PATHVISION™ tesztet (Vysis, Illinois) végezhetünk.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a rák EGFR-t termel (esetleg túlzott mértékben). Az EGFR-t termelő (túlzott mértékben termelő) rákok példái közé tartoznak a következők: pikkelysejtes rák (pl. epithelialis pikkelysejtes rák), tüdőrák (kissejtes tüdőrák, nem kissejtes tüdőrák, tüdőadenocarcinoma és pikkelysejtes tüdőcarcinoma), hashártyarák, hepatocelluláris rák, gyomor- vagy hasi rákok, pl. gastrointestinalis rák, hasnyálmirigyrák, glioblastoma, méhnyakrák, petefészekrák, májrák, húgyhólyagrák, hepatoma, emlőrák, vastagbélrák, végbélrák, vastag- és végbélrák, endometrium- vagy méhcarcinoma, nyálmirigyrák, veserák, prosztatarák, szeméremtestrák, pajzsmirigyrák, májcarcinoma, végbélcarcinoma, peniscarcinoma, valamint fej- és nyakrák.
A találmány szerinti megoldás értelmében kezelhető rákra jellemző lehet egy ErbB-receptor (pl. EGFR) túlzott mértékű aktiválása. Az ilyen túlzott aktiválást az ErbB-receptor vagy egy ErbB-ligandum túlzott vagy fokozott mértékű termelődése okozhatja. A találmány egyik megvalósítási módja szerint diagnosztikai vagy prognosztizáló vizsgálatot végzünk, hogy meghatározzuk, vajon az adott rákra jellemző-e egy ErbB-receptor túlzott aktiválása. Például a rákban meghatározhatjuk az ErbB-gén amplifikációját és/vagy az ErbB-receptor túltermelődését. A génamplifikáció/túltermelődés meghatározására különféle eljárások állnak rendelkezésre, mint pl. IHC-teszt, FISH-teszt és biológiai mintába kibocsátott antigén mennyiségi meghatározása. Más módon vagy ezen felül, ismert eljárások alkalmazásával meghatározható egy ErbB-ligandum (pl. TGF-α) tumorban lévő (vagy tumorral összefüggő) szintje. Az ilyen tesztekkel a vizsgálandó mintában lévő proteint és/vagy a proteint kódoló nukleinsavat detektáljuk. Az egyik megvalósítási mód szerint a tumorban ErbB-ligandum mennyisége immunhisztokémiai teszttel (IHCteszt) határozható meg [Id. pl. Scher és mtsai.: Clin. Cancer Research 1, 545 (1995)]. Más módon vagy ezen túlmenően, a vizsgálandó mintában az ErbB-ligandumot kódoló nukleinsav mennyiségét is meghatározhatjuk (pl. FISH-teszttel, Southern-blot analízissel vagy PCR-technikákkal).
Az ErbB-receptor vagy ErbB-ligandum túltermelődése vagy amplifikációja in vivő diagnosztikai teszttel is értékelhető, például oly módon, hogy a páciensnek a kimutatni kívánt molekulához kötődni képes, és detektálható jelölőanyaggal (pl. radioaktív izotóppal jelölt) molekulát (pl. antitestet) adagolunk, és a páciens külsődleges pásztázásával lokalizáljuk a jelölőanyagot.
Amennyiben a kezelni kívánt rák hormonfüggetlen, a tumorban a hormon (pl. androgénhormon) és/vagy megfelelő receptora termelődését különböző vizsgálati eljárásokkal (pl. a fentebb leírtak szerint) értékelhetjük. Más módon vagy ezenfelül, a páciens hormonfüggetlen rákban szenvedőnek diagnosztizálható, ha androgénhormon-ellenes terápiára nem reagál.
A találmány bizonyos megvalósítási módjai értelmében a páciensnek immunkonjugátumot adagolunk, amely az anti-ErbB2 antitestet citotoxikus hatóanyaghoz konjugálva tartalmazza. Előnyös esetben az immunkonjugátumot és/vagy az ErbB-proteint (amelyhez az immunkonjugátum kötődik) a sejt internalizálja, ami az immunkonjugátum fokozott terápiás hatékonyságát eredményezi azon rákos sejtek elpusztításában, amelyhez kötődni képes. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a citotoxikus hatóanyag a rákos sejtben lévő nukleinsavat célozza meg vagy gátolja azt. Az ilyen citotoxikus hatóanyagok példái közé tartoznak a maytansinoidok, calicheamicinek, ribonukleázok és DNS-endonukleázok.
Az anti-ErbB antitesteket vagy immunkonjugátumokat ismert módszerekkel, például intravénás (pl. boluszinjekcióval vagy folyamatos infúzióval), intramuszkuláris, intraperitoneális, intracerebrospinalis, szubkután, intraarticularis, intrasynovialis, intrathecalis, orális, topikus vagy inhalációs adagolással adjuk be a pácienseknek, mely adagolási módok közül az intravénás és a szubkután adagolást részesítjük előnyben.
Az anti-ErbB antitest adagolásával egyéb terápiás adagolási sémák is kombinálhatók. A kombinált adagolás lehet együttes adagolás (külön készítmények vagy egyetlen gyógyászati készítmény alkalmazásával), továbbá lehet egymás utáni adagolás (bármely sorrendben), melynek során megfelelő időtartamot biztosítunk arra, hogy mindkét (vagy valamennyi) aktív hatóanyag kifejthesse biológiai aktivitását.
Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint a pácienst két különböző anti-ErbB antitesttel kezeljük. Pél31
HU 226 742 Β1 dául a páciens kezelésére alkalmazhatunk egy első anti-ErbB2 antitestet, amely blokkolja egy ErbB-receptor lígandum általi gátlását, vagy amely a 2C4 monoklonális antitest biológiai tulajdonságaival bír; második antitestként pedig sejtszaporodást gátló anti-ErbB2 antitestet (pl. HERCEPTIN®-t) vagy ErbB2-receptort túlzott mértékben termelő sejt apoptózisát indukáló antiErbB2 antitestet (pl. 7C2, 7F3 vagy ezek humanizált változatai) alkalmazunk. Az ilyen kombinált terápia előnyösen szinergikus hatást eredményez. Például a pácienst először HERCEPTIN®-nel, majd rhuMAb2C4antitesttel kezeljük (pl. olyan esetben, ha a páciens nem reagál a HERCEPTIN®-terápiára). Egy másik megvalósítási mód szerint először az rhuMAb2C4-antitesttel végezzük a kezelést, és azt követően alkalmazzuk a HERCEPTIN®-terápiát. Egy további megvalósítási mód értelmében a pácienst egyidejűleg kezeljük a HERCEPTIN®-nel és a rhuMAb2C4-antitesttel.
Előnyös lehet az anti-ErbB antitest(ek) adagolását más tumorasszociált antigén elleni antitest adagolásával kombinálni. Ilyen esetben másik antitestként, például EGFR-hez, ErbB3-hoz, ErbB4-hez vagy vascularis endothelialis növekedési faktorhoz (VEGF) kötődő antitest alkalmazható.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a kezelést egy anti-ErbB2 antitest(ek) és egy vagy több kemoterápiás hatóanyag vagy sejtszaporodást gátló hatóanyag kombinált adagolásával végezzük (ideértve a különböző kemoterápiás hatóanyagok keverékeinek együttes adagolását is). A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös kemoterápiás hatóanyagok közé tartoznak a taxánok (pl. paclitaxel és doxetaxel) és/vagy az anthracyclin antibiotikumok. Az ilyen kemoterápiás hatóanyagok előkészítését és dozírozását a gyártó útmutatásai szerint végezhetjük, illetve a kezelőorvos kísérleti úton határozhatja meg. A kemoterápiás hatóanyagok előkészítését és dozírozását illetően lásd: „Chemotherapy Service”, szerk.: M. C. Perry, Williams és Wilkins, Baltimore, MD (1992).
Az antitest hormonellenes vegyülettel is kombinálható, így pl. - az ilyen molekulákra ismert dózisokban ösztrogénellenes vegyülettel (pl. tamoxifen); progeszteronellenes vegyülettel (pl. onapriston; lásd EP 618 812); vagy androgénhormon-ellenes vegyülettel (pl. flutamid). Amennyiben a kezelni kívánt rák hormonfüggetlen, a pácienst előzőleg hormonellenes terápiának vethetjük alá, és - miután a rák hormonfüggetlenné válik, megkezdhetjük az anti-ErbB2 antitest (és adott esetben a fentebb leírt egyéb hatóanyagok) adagolását.
Bizonyos esetekben előnyös lehet kardioprotektánst (a terápiával összefüggő szívizom-károsodás megelőzése vagy csökkentése érdekében) vagy egy vagy több citokint adagolni. Lehetőség van EGFR-re irányuló hatóanyag vagy angiogenezist gátló hatóanyag antitesttel együttes adagolására is. A fenti terápiás sémákon kívül a pácienst - a rákos sejtek eltávolítása céljából - sebészeti beavatkozásnak és/vagy sugárkezelésnek vethetjük alá.
Az anti-ErbB2 antitesteket EGFR-re irányuló hatóanyagokkal (pl. a definícióknál megadottakkal) is kombinálhatjuk, ami kiegészítő - és potenciálisan szinergikus - gyógyászati hatást eredményezhet.
A fentebb felsorolt, együttesen adagolható hatóanyagok dózisait a gyógyászati gyakorlatban jelenleg alkalmazott dózisoknak megfelelően állapítjuk meg, illetve, az adott hatóanyag és az anti-ErbB2 antitest kombinált (szinergikus) hatásának függvényében csökkentett dózisokat alkalmazhatunk.
Egy betegség megelőzése vagy kezelése céljából az antitest megfelelő adagolása a kezelni kívánt betegség típusától, a betegség súlyosságától vagy lefolyásának menetétől, a kezelés profilaktikus vagy terápiás természetétől, a korábban végzett gyógykezelésektől, a páciens klinikai történetétől és antitestre adott reakciójától, valamint a kezelőorvos saját megítélésétől függően határozható meg. Az antitestet, alkalmas módon, egy alkalommal vagy kezeléssorozat során adagoljuk. Az antitestet- a betegség típusától és súlyosságától függően kb. 1 pg/kg-tól 15 mg/kg-ig terjedő kezdő dózisban (pl. 0,1-20 mg/kg) adagoljuk, függetlenül attól, hogy egy vagy több alkalommal végzett beadást vagy folyamatos infúziós adagolást végzünk. A jellemző napi dózis - a fenti tényezőktől függően - kb. 1 pg/kg-tól 100 mg/kg-ig vagy még tovább terjedhet. A több napon keresztül vagy még hosszabb ideig végzett, ismételt adagolás esetén a kezelést - az adott állapottól függően - addig folytatjuk, míg a betegség tüneteinek kívánt mérséklődése nem következik be. Az antitest előnyös dozírozása kb. 0,05 mg/kg-tól kb. 10 mg/kg-ig terjed. Ilyenformán a páciensnek egy vagy több kb. 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg vagy 10 mg/kg nagyságú dózist (vagy ezek bármely kombinációját) adagolhatunk. Ezek a dózisok megszakításokkal adagolhatok (pl. hetente vagy háromhetente, például oly módon, hogy a páciensnek az antiErbB2 antitest kb. 2-20, például kb. hat dózisát adagoljuk). Egy kezdő dózis után egy vagy több kisebb dózis adható. Az anti-ErbB2 antitest előnyös adagolási sémája szerint kb. 4 mg/kg-os kezdő dózist alkalmazunk, majd kb. 2 mg/kg-os heti fenntartó dózist adagolunk, azonban egyéb adagolási sémák is hasznosak lehetnek. A terápia folyamata hagyományos technikák és tesztek alkalmazásával egyszerűen nyomon követhető.
Az antitestprotein páciensnek történő adagolása mellett a találmány tárgyához tartozik az antitest génterápiás módszerrel történő adagolása is. Az antitestet kódoló nukleinsav adagolását magában foglalja az „antitest gyógyászati szempontból hatásos mennyiségének adagolása” kifejezés (lásd pl. WO 96/07321 számú nemzetközi közzétételi irat, amely a génterápia intracelluláris antitestek létrehozása céljából történő alkalmazására vonatkozik).
A nukleinsav (amely adott esetben vektorba lehet inszertálva) páciens sejtjeibe történő juttatására két fő módszer létezik: az in vivő és az ex vivő. Az in vivő bejuttatáshoz a nukleinsavat közvetlenül a páciensbe injektáljuk (rendszerint a páciens testének azon pontján, ahol az antitestre szükség van). Ex vivő kezelésnél a páciens sejtjeit eltávolítjuk, az izolált sejtekbe bejuttatjuk a nukleinsavat, majd az így módosított sejteket közvetlenül - vagy például porózus membránba csoma32
HU 226 742 Β1 golva - visszaültetjük a páciensbe [Id. pl. 4 892 538 és 5 283 187 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. A nukleinsavak élő sejtekbe történő bejuttatására számos technika áll rendelkezésre. Az alkalmazandó eljárás attól függ, hogy a nukleinsavat tenyészetben lévő sejtekbe in vitro vagy a gazdában lévő sejtekbe in vivő kívánjuk-e bejuttatni. A nukleinsavak emlőseredetű sejtekbe in vitro történő bejuttatására alkalmas technikák közé tartozik a liposzómák alkalmazása, az elektroporáció, mikroinjektálás, sejtfúzió, DEAE-dextrán alkalmazása, kalcium-foszfátos precipitáció stb. A gének ex vivő bejuttatására általánosan alkalmazott vektor a retrovírus.
A jelenleg előnyösnek tekinthető in vivő nukleinsavbejuttatási technikák közé tartozik a vírusvektorok (pl. adenovirus, herpes simplex I vírus vagy adenoasszociált vírus), valamint a lipidalapú rendszerek alkalmazásával végzett transzfekció. A lipid közvetítette génbejuttatásra alkalmas lipidek jellemző példája a DOTMA, a DOPE és a DC-Chol. Bizonyos esetekben a nukleinsavforráshoz a célsejteket megcélzó hatóanyagot kell mellékelni (például sejtfelületi membránproteinre vagy magára a célsejtre specifikus antitestet vagy a célsejten lévő receptorra specifikus ligandumot). Liposzómák alkalmazása esetén a liposzóma célba juttatására és/vagy felvételének elősegítésére endocitózissal kapcsolatos sejtfelületi membránproteinhez kötődő proteineket alkalmazhatunk. A receptor közvetítette endocitózis technikájának leírását lásd pl. Wu és mtsai.: J. Bioi. Chem. 262, 4429 (1987); Wagner és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410 (1990). Az ismert génterápiás eljárások áttekintő leírását illetően lásd Anderson és mtsai.: Science 256, 808 (1992); WO 93/25673 számú nemzetközi közzétételi irat, valamint az abban felsorolt hivatkozások.
VI. Termékek
A találmány egy következő megvalósítási módja értelmében a fentebb említett betegségek és rendellenességek kezelésére alkalmas anyagokat tartalmazó terméket tárunk fel. A találmány szerinti termék tartályból és az azon lévő (vagy ahhoz mellékelt) címkéből vagy termékismertetőből áll. Az ilyen tartályok például palackok, fiolák, fecskendők és hasonlók lehetnek, és különféle anyagokból (pl. üvegből vagy műanyagból) készülhetnek. A tartály az adott betegség kezelésére hatásos készítményt tartalmaz, és steril nyílással lehet ellátva (pl. szubkután injekciós tűvel átszúrható dugóval lezárt intravénásoldat-tasak vagy fiola). A készítmény legalább egy aktív hatóanyagként anti-ErbB antitestet tartalmaz. A címke vagy termékismertető arról ad felvilágosítást, hogy a készítmény milyen betegség (pl. rák) kezelésére alkalmazható. Az egyik megvalósítási mód szerint a címke vagy termékismertető arról ad felvilágosítást, hogy az ErbB2-receptort megkötő antitestet tartalmazó készítmény ErbB-receptor [epidermális növekedési faktor receptor (EGFR), ErbB3 vagy ErbB4, előnyösen EGFR] termelésével jellemezhető rák kezelésére alkalmazható. A címke vagy termékismertető tartalmazhatja azt is, hogy a készítmény egy
ErbB-receptor (EGFR, ErbB3 vagy ErbB4) túlzott mértékű aktiválásával jellemezhető rák kezelésére alkalmazható. Például a szóban forgó rák e receptorokat túlzott mértékben termelő rák vagy egy ErbB-ligandumot (pl. TGF-a-t) túlzott mértékben termelő rák lehet. Mindezeken felül, a címke vagy termékismertető felvilágosítást nyújthat arról is, hogy a készítmény olyan rák kezelésére szolgál, amelyre nem jellemző az ErbB2-receptor túlzott mértékű termelődése. Például míg a HERCEPTIN® termékismertetőjén az áll, hogy az antitest metasztázisos emlőrákban szenvedő páciensek kezelésére szolgál, mely páciensek tumora túlzott mértékben termeli az ErbB2-proteint, a találmány szerinti termék termékismertetője arról ad tájékoztatást, hogy az antitest vagy készítmény rák kezelésére alkalmazható, függetlenül az ErbB2 túltermelődésének mértékétől. A találmány más megvalósítási módjai értelmében a termékismertető azt jelzi, hogy az antitest vagy a készítmény a következő rákos betegségek kezelésére alkalmazható: emlőrák (pl. metasztázisos emlőrák); hormonfüggetlen rák; prosztatarák (pl. androgénhormon-független prosztatarák); tüdőrák (pl. kissejtes vagy nem kissejtes tüdőrák); vastagbélrák, végbélrák vagy vastag- és végbélrák; vagy a találmány leírásában említett egyéb betegségek és rendellenességek. Ezen túlmenően a találmány szerinti termék tartalmazhat (a) egy első tartályt, amely egy - ErbB2-t túlzott mértékben termelő rákos sejtek szaporodását gátló és ErbB2-receptort megkötő - első antitestet tartalmazó készítményt foglal magában; és (b) tartalmazhat egy második tartályt is, amely egy - ErbB2-receptort megkötő és egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását gátló - második antitestet tartalmazó készítményt foglal magában. A találmány e megvalósítási módja szerinti termék termékismertetőt is tartalmazhat, amely arról ad felvilágosítást, hogy az első és a második antitestkészítmény rák kezelésére alkalmazható. Ezen túlmenően a termékismertető arról nyújthat tájékoztatást, hogy az (ErbB2-receptort megkötő és egy ErbB-receptor ligandum általi aktiválását gátló antitestet tartalmazó) készítmény az előző szakaszban leírt kiegészítő hatóanyagokkal (pl. kemoterápiás hatóanyaggal, EGFR-re irányuló hatóanyaggal, angiogenezist gátló hatóanyaggal, hormonellenes vegyülettel, kardioprotektánssal és/vagy citokinnel) kombinálva alkalmazható. Más módon - vagy ezen túlmenően - a találmány szerinti termék tartalmazhat egy második (vagy harmadik) tartályt is, amely gyógyászati szempontból elfogadható hordozót [pl. bakteriosztatikus injektálható vizet (BWFI), foszfátpufferelt sóoldatot, Ringer-oldatot vagy dextrózoldatot] tartalmaz. A termék egyéb, kereskedelmi és felhasználói szempontból hasznos anyagokat is tartalmazhat, így pl. további puffereket, diluendomokat, szűrőket, tűket és fecskendőket.
VII. Az anti-ErbB2 antitest nem gyógyászati célú alkalmazásai
A találmány szerinti antitestek (pl. humanizált antiErbB2 antitestek) nem terápiás célokra is felhasználhatók.
HU 226 742 Β1
Például az antitestek affinitástisztítási ágensként is alkalmazhatók. Ennek során az antitesteket szilárd fázison (pl. Sephadex-gyanta vagy szűrőpapír), jól ismert módszerekkel immobilizáljuk, majd az immobilizált antitestet a tisztítani kívánt ErbB2-proteint (vagy fragmensét) tartalmazó mintával érintkeztetjük, és a hordozót megfelelő oldószerrel mossuk, amely - a immobilizált antitesthez kötődő, tisztítani kívánt ErbB2-protein kivételével - a mintában lévő valamennyi anyagot eltávolítja. Végül a hordozót egy másik alkalmas oldószerrel, pl. glicinpufferrel (pH=5,0) mossuk, amely az antitestről leválasztja az ErbB2-proteint.
Az anti-ErbB2 antitestek diagnosztikai tesztekben például az ErbB2-protein-specifikus sejtekben, szövetekben vagy vérsavóban bekövetkező termelődésének detektálására - is alkalmazhatók.
Diagnosztikai célú felhasználás esetén az antitestet rendszerint detektálható jelölőanyaggal jelöljük. Számos jelölőanyag ismeretes, melyek általánosan a következő csoportokba sorolhatók:
(a) Radioaktív izotópok (pl. 35S, 14C, 125l, 3H vagy 1311). Az antitest radioaktív izotópos jelölése, például a „Current Protocols in Immunology”, 1. és 2. kötetében [szerk.: Coligen, Wiley-lnterscience, New York, New York Pubs. (1991)] leírtak szerint hajtható végre, és a radioaktivitás szcintillációs számlálással mérhető.
(b) Fluoreszcens jelölök, pl. ritkaföldfém-kelátok (európium-kelátok) vagy fluoreszcein és származékai, rodamin és származékai, dansyl, Lissamine, fikoeritrin és Texas-vörös. A fluoreszcens jelölök antitesthez történő konjugálását illetően lásd pl. a fentebb idézett hivatkozást. A fluoreszcencia kvantitatív meghatározása fluoriméter alkalmazásával hajtható végre.
(c) Enzim-szubsztrátjelölök; néhányuk leírásátlásd a 4 275 149 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Az enzim rendszerint egy kromogén szubsztrát kémiai átalakulását katalizálja, ami különféle technikák alkalmazásával mérhető. Például az enzim a szubsztrátban színváltozást katalizál, ami spektrofotometriai módszerrel mérhető. Más módon, az enzim megváltoztatja a szubsztrát fluoreszcenciáját vagy kemilumineszcenciáját. A fluoreszcenciaváltozás kvantitatív meghatározási módszerét fentebb említettük. A kemilumineszcens szubsztrát kémiai reakció következtében elektromosan gerjesztődik, és fényt emittál, ami például kemiluminométerrel mérhető, vagy egy fluoreszcens fogadómolekulának energiát ad át. Az enzimatikus jelölők példái közé tartoznak a luciferázok (pl. szentjánosbogár-luciferáz és bakteriális luciferáz; 4 737 456 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás); luciferin, 2,3-dihidro-ftalazin-dionok, malát dehidrogenáz, ureáz, peroxidáz (pl. tormaperoxidáz; HRPO), alkalikus foszfatáz, β-galaktozidáz, glükoamiláz, lizozim, cukor oxidázok (pl. glükóz oxidáz, galaktóz oxidáz és glükóz-6-foszfát dehidrogenáz), heterociklikus oxidázok (pl. urikáz és xantin oxidáz), laktoperoxidáz, mikroperoxidáz és hasonlók. Az enzimek antitestekhez történő konjugálásának módszereit illetően lásd: O’Sullivan és mtsai.: Methods in Enzym. 73, 147 (1981).
Az enzim-szubsztrát kombinációk jellemző példáiként említhetők a következők:
(i) tormaperoxidáz (HRPO) és hidrogén-peroxidáz szubsztrát; a hidrogén-peroxidáz színezékprekurzort oxidál [pl. ortofenilén-diamin (OPD) vagy 3,3’,5,5’tetrametil-benzidin-hidroklorid (TMB)];
(ii) alkalikus foszfatáz (AP) és para-nitro-fenil-foszfát (kromogén szubsztrát); és (iii) β-D-galaktozidáz (β-D-Gal) és kromogén szubsztrát (pl. p-nitro-fenil-fj-D-galaktozidáz) vagy fluorogén szubsztrát [4-(metil-umbelliferil)^-D-galaktozidáz].
Szakember számára számos egyéb enzimszubsztrát kombináció ismeretes. Ezek összefoglaló áttekintését illetően lásd a 4 275 149 és 4 318 980 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat.
Bizonyos esetekben a jelölőt közvetve kapcsoljuk az antitesthez; ennek technikái szakember számára jól ismertek. Például az antitestet biotinhoz konjugálhatjuk, és a jelölöanyagok fentebb felsorolt három csoportjába tartozók bármelyike avidinhez konjugálható (és fordítva). A biotin szelektíven kötődik az avidinhez, és így a jelölő indirekt módon konjugálható az antitesthez. Más módon, a jelölő antitesthez történő közvetett konjugálása érdekében a antitestet kisméretű hapténhez (pl. digoxin) kapcsoljuk, és a jelölők valamely típusát antihaptén antitesttel (pl. antidigoxin antitesttel) konjugáljuk. Ezzel a módszerrel a jelölőanyag közvetett módon konjugálható az antitesthez.
A találmány egy következő megvalósítási módja értelmében az anti-ErbB2 antitestet nem szükséges jelölővel ellátni; jelenléte a hozzá kötődni képes, jelölt antitest alkalmazásával detektálható.
A találmány szerinti antitestek bármely ismert vizsgálati eljárásban felhasználhatók, így például kompetitív kötődési tesztekben, direkt és indirekt szendvicstesztekben és immunprecipitációs tesztekben [Zola: „Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques”, 147-158. old., CRC Press, Inc. (1987)].
Immunhisztokémiai vizsgálathoz friss, fagyasztott vagy paraffinba ágyazott és tartósítószerrel (pl. formalinnal) fixált tumorminta alkalmazható.
Az antitestek in vivő diagnosztikai tesztekben is alkalmazhatók. Az antitestet általában radionukliddal (pl. 1111n, 90Tc, 14C,1311,125l, 3H, 32P vagy 35S) jelöljük, oly módon, hogy a tumor immunszcintiográfiás módszerrel lokalizálható legyen. Az egyszerűség kedvéért a találmány szerinti antitestek reagenskészletbe foglalhatók, amely előre meghatározott mennyiségű reagensek csomagolt kombinációja, és útmutatást is tartalmaz a diagnosztikai teszt elvégzéséhez. Amennyiben az antitest enzimmel van jelölve, a reagenskészlet az enzimhez szükséges szubsztrátokat és kofaktorokat is tartalmaz (pl. detektálható kromofort vagy fluorofort biztosító szubsztrátprekurzort). Az egyéb komponensek közé tartoznak a stabilizátorok, pufferek (pl. blokkolópuffer vagy lizálópuffer) és hasonlók. A különböző reagensek relatív mennyisége tág határok közt változhat, hogy az oldatban a reagensek koncentrációja a teszt érzékenységéhez legmegfelelőbb legyen. A reagenskészletben
HU 226 742 Β1 a reagensek száraz (rendszerint liofilizált) por alakjában lehetnek jelen, amely kötőanyagot (excipienst) is tartalmaz, mely feloldódva megfelelő koncentrációjú reagensoldat kialakulását biztosítja.
Vili. Anyagok letétbe helyezése
Az alábbi hibridóma-sejtvonalakat az American
Type Culture Collectionnél (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, CA 20110-2209, USA) helyeztük letétbe:
Antitest elnevezése ATCC nyilv. szám Letétbe helyezés dátuma
7C2 ATCCHB-12215 1996. okt. 17.
7F3 ATCCHB-12216 1996. okt. 17.
4D5 ATCC CRL 10463 1990. május 24.
2C4 ATCC HB-12697 1999. ápr. 8.
A találmány szerinti megoldást a következőkben kísérleti példák bemutatásán keresztül szemléltetjük. A találmány leírásában említett valamennyi hivatkozást teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni.
1. példa
A 2C4 monoklonális antitest előállítása, karakterízálása és humanizálása
Az egéreredetű 2C4, 7F3 és 4D5 monoklonális antitestet (amelyek specifikusan kötődnek az ErbB2 extracelluláris doménjéhez) a Fendly és mtsai. [Cancer Research 50, 1550 (1990)] által leírt eljárással állítottuk elő. Röviden összefoglalva: Hudziak és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7158 (1987)] által leírt módon előállított NIH-3T3/HER-2-3400 sejteket (melyek sejtenként hozzávetőleg 1*105 ErbB2-molekulát termelnek) 25 mM EDTA-t tartalmazó foszfátpufferelt sóoldatban (PBS) összegyűjtöttünk, és az így kapott sejtszuszpenzióval BALB/c-egereket immunizáltunk. Az egereknek a 0., 2., 5. és 7. héten intraperitoneális (ip.) injektálással 0,5 ml PBS-ben 107 sejtet adagoltunk. A 32P-izotóppal jelölt ErbB2-receptort immunprecipitáló antiszérumot termelő egereket a 9. és 13. héten intraperitoneálisan - búzacsíra-agglutinin/Sepharose (WGA) gyantán tisztított - ErbB2 membránkivonattal oltottuk. Ezt követően az egereknek intravénásán 0,1 ml ErbB2-készítményt adtunk be, és a lépsejteket (szplenocitákat) egéreredetű X63-Ag8.653 myelomasejtvonallal fuzionáltattuk.
A hibridóma-felülúszókat ELISA-teszttel és radioimmunprecipitációval ErbB2-kötődésre szelektáltuk.
A 4D5, 7F3 és 2C4 monoklonális antitest által megkötött ErbB2-epitópokat kompetitív kötési analízissel azonosítottuk [Fendly és mtsai.: Cancer Research 50, 1550 (1990)]. Ép sejtekkel végzett direkt fluoreszcencia alapján (a fluoreszcencia kvantitatív meghatározására PANDEX™ Screen Machine készüléket alkalmazva) keresztblokkolási kísérleteket végeztünk. Az egyes monoklonális antitesteket - ismert eljárások alkalmazásával [Id. Wofsy és mtsai.: „Selected Methods in Cellular Immunology”, szerk.: Mishel és Schiigi, 287. old., San Francisco, W. J. Freeman Co. (1980)] - fluoreszcein-izotiocianáthoz (FITC) konjugáltuk. A NIH-3T3/HER-2-3400 sejtek konfluens egyrétegű tenyészetét tripszinnel kezeltük, egyszer lemostuk, majd - 0,5% szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) és 0,1% NaN3-ot tartalmazó - hideg foszfátpufferelt sóoldatban 1,75^106 sejt/ml sejtsűrűségben újraszuszpendáltuk. A PANDEX™ tálca membránjai eltömődésének csökkentése érdekében a sejtszuszpenzióhoz 1% végkoncentrációban latexszemcséket (IDC, Portland, OR) adtunk. A PANDEX™ tálca üregeibe 20 μΙ sejtszuszpenziót és tisztított monoklonális antitestek 20 μΙ térfogatú oldatát (100 pg/ml-től 0,1 pg/ml-ig terjedő koncentrációban) adtunk, és jégen 30 percig inkubáltuk. Ezután mindegyik üreghez FITCvel jelölt monoklonális antitest előre meghatározott hígításait adtuk (20 μΙ térfogatban), majd 30 perces inkubálás és az azt követő mosás után a fluoreszcenciát PANDEX™ készülék alkalmazásával kvantitatíve meghatároztuk.
A monoklonális antitesteket akkor tekintettük közös epitópot felismerőnek, ha mindegyik legalább 50%-ban gátolta a másik kötődését (irreleváns kontroll monoklonális antitesttel összehasonlítva). E kísérletben azt találtuk, hogy a 4D5-antitest az „I” epitópot; a 7F3-antitest a G/F epitópot; és a 2C4-antitest az F epitópot ismeri fel.
A 2C4, 7F3 és 4D5 monoklonális antitest sejtszaporodást gátló tulajdonságát SK-BR-3 emlőtumor-sejtvonal alkalmazásával értékeltük [Id. Hudziak és mtsai.: Mól. Cell. Bioi. 9(3), 1165 (1989)]. Röviden összefoglalva: az SK-BR-3-sejteket 0,25 VA/% tripszinoldat alkalmazásával leválasztottuk a tálcák faláról, és 4χ105 sejt/ml sejtsűrűséggel komplett tápközegben szuszpendáltuk. 96 üregű mikrotitertálcák üregeibe 100 μΙ térfogatú aliquotokat (4χ104 sejt) helyeztünk, a sejteket hagytuk az üregek falához tapadni, majd az üregekhez 100 μΙ tápközeget (önmagában) vagy szintén 100 μΙ, de monoklonális antitestet (5 pg/ml végkoncentrációban) is tartalmazó tápközeget adtunk. 72 óra elteltével a tálcákat foszfátpufferelt sóoldattal (pH=7,5) leöblítettük, kristályibolyával (0,5%-os metanolos oldat) megfestettük, majd Sugarman és mtsai. [Science 230, 943 (1985)] leírása szerint relatív sejtproliferációra teszteltük. Az SK-BR-3-sejtek relatív sejtproliferációját a 2C4 és 7F3 monoklonális antitest kb. 20%-ban, illetve kb. 38%-ban, míg a 4D5 monoklonális antitest kb. 56%-ban gátolta.
A 2C4, 4D5 és 7F3 monoklonális antitestet MCF7-sejtek teljes sejtes lizátumából származó, 180 000 D molekulatömeg-tartományba tartozó - proteinek HRG-stimulálta tirozinfoszforilációját gátló képességére is teszteltük [Lewis és mtsai.: Cancer Research 56, 1457 (1996)]. Az MCF7-sejtekről leírták, hogy termeli valamennyi ismert ErbB-receptort, de viszonylag alacsony szinten. Mivel az ErbB2, ErbB3 és ErbB4 molekulatömege csaknem azonos, a teljes sejtes lizátumok Western-blot analízisével nem lehet megállapítani, hogy melyik protein tirozinfoszforilációja következik be.
HU 226 742 Β1
Mindazonáltal, ezek a sejtek ideálisak a HRG tirozinfoszforilációs tesztek végrehajtásához, mivel az alkalmazott vizsgálati feltételek mellett - exogén HRG hiányában - kis vagy kimutathatatlan koncentrációban tartalmazzák a 180 000-es molekulatömeg-tartományba tartozó tirozin-foszforilált proteineket.
Az MCF7-sejteket 24 üregű tálcákra szélesztettük, majd mindegyik üreghez ErbB2 elleni monoklonális antitesteket adtunk, és a tálcákat szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk. Ezt követően mindegyik üreghez - 0,2 nM végkoncentrációban - rHRG1177_244-polipepiidet adtunk, és az inkubálást 8 percig folytattuk. A tápközeget óvatosan mindegyik üregből leszívtuk, és a reakciókat 100 μΙ SDS-mintapuffer (5% SDS, 25 mM DTT és 25 mM Tris-HCI, pH=6,8) hozzáadásával leállítottuk. Valamennyi mintát (25 μΙ) 4-12%-os gradiensgélen (Novex) elektroforizáltuk, majd elektroforetikusan polivinilidén-difluorid membránra másoltuk. Antifoszfotirozin (4G10; az UBI terméke; 1 pg/ml koncentrációban alkalmazva) immunbiotokat hívtunk elő, és a fő reaktív csík (180 000 D molekulatömegnél) intenzitását reflexió denzitometriával határoztuk meg [Id. Holmes és mtsai.: Science 256, 1205 (1992); Slikowski és mtsai.: J. Bioi. Chem. 269, 14 661 (1994)].
A 2C4, 7F3 és 4D5 monoklonális antitest e tesztben jelentős mértékben gátolta a 180 000-es molekulatömegnél jelentkező, HRG indukálta tirozinfoszforilációs jel keletkezését. Ugyanakkor ezek az antitestek nem lépnek keresztreakcióba az EGFR-rel [Fendly és mtsai.: Cancer Research 50, 1550 (1990)], az ErbB3mal és az ErbB4-gyel. A 2C4 és 7F3 antitest jelentős mértékben gátolta a p180 tirozinfoszforiláció HRG általi stimulációját (a kontroll <25%-a), míg a 4D5 monoklonális antitest a tirozinfoszforiláció HRG általi stimulációját 50%-ban gátolta. A 2A. ábrán a p180 tirozinfoszforilációja HRG-stimulációjának 2C4 és 7F3 monoklonális antitest általi gátlásának dózis-reakció görbéit mutatjuk be. E gátlási görbék négyparaméteres görbeillesztés alkalmazásával végzett értékelése alapján a 2C4-antitestre 2,8±0,7 nM, míg a 7F3-antitestre 29,0±4,1 nM IC50-értéket kaptunk.
A HRG-polipeptid MCF7 emlőtumorsejtekhez történő kötődésének anti-ErbB2 antitestek általi gátlását 24 üregű tálca formátumban hajtottuk végre [Lewis és mtsai.: Cancer Rés. 56, 1457 (1996)]. A tálca mindegyik üregébe anti-ErbB2 monoklonális antitesteket adtunk, 30 perces inkubálás után az üregekhez 125lizotóppal jelölt rHRG1177_224-polipeptidet (25 pm) adtunk, majd az inkubálást 4-16 óra hosszat folytatjuk. A 2B. ábrán a HRG MCF7-sejtekhez történő kötődése 2C4- és 7F3-antitest általi gátlásának dózis-reakció görbéit mutatjuk be. Az MCF7-sejteket - 125l-izotóppal jelölt rHRGpi jelenlétében - a 2C4, illetve 7F3 monoklonális antitest különböző koncentrációival inkubáltuk, és a gátlási görbéket a 2B. ábrán mutatjuk be. Az adatok feldolgozása alapján a 2C4-antitest IC50-értéke 2,4±0,3 nM, míg a 7F3-antitest IC50-értéke 19,0±7,3 nM volt. A 2C4-re és 7F3-ra kapott kb. 74%-os maximális gátlás összhangban van a tirozinfoszforilációs adatokkal.
Annak kiderítése érdekében, hogy az antiErbB2 antitestek MCF7-sejtekre megfigyelt hatása általános jelensége, humán tumorsejtvonalakat 2C4, illetve 7F3 monoklonális antitesttel inkubáltunk, és meghatároztuk a 125l-izotóppal jelölt rHRGpi specifikus kötődésének mértékét [Lewis és mtsai.: Cancer Research 56, 1457 (1996)]. E kísérlet eredményeit a 3. ábrán mutatjuk be. A125l-izotóppal jelölt rHRGpi kötődését a 2C4, illetve 7F3 monoklonális antitest valamennyi tesztelt sejtvonalban jelentős mértékben gátolta; ez alól kivételt képezett az MDA-MB-468 emlőráksejtvonal, amely korábbi leírások alapján ErbB2-t csak kis mennyiségben vagy egyáltalán nem termel. A többi sejtvonal - tág határok között változó mértékben - termeli az ErbB2-t. Valójában a tesztelt sejtvonalakban az ErbB2-termelődés szintje több mint két nagyságrend mértékű eltéréseket mutat. Például a BT-20, MCF7 és Caov3 sejtenként kb. 104 ErbB2-receptort termel, míg a BT-474 és SK-BR-3 ErbB2-receptor termelése kb. 106/sejt. E sejtekben az ErbB2-termelődés szintjének különbözősége és a fenti adatok alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy az ErbB2 és ErbB3 vagy ErbB4 közötti kölcsönhatás önmagában egy nagy affinitású kölcsönhatás, amely a plazmamembrán felületén játszódik le.
A 2C4 és 4D5 monoklonális antitestek MDA-MB175-sejtekre és SK-BR-3-sejtekre - exogén rHRGpi jelenlétében vagy hiányában - gyakorolt szaporodásgátló hatását is megvizsgáltuk [Id. Schaefer és mtsai.: Oncogene 15, 1385 (1997)]. MDA-MB-175-sejtekben az ErbB2-koncentráció 4-6-szor nagyobb, mint a normális emlőepithelsejtekben, és az ErbB2-ErbB4 receptor MDA-MB-175-sejtekben konstitutív tirozinfoszforilációt mutat. Az MDA-MB-175-sejteket négy napon át 2C4 és 4D5 anti-ErbB2 monoklonális antitesttel (10 pg/ml) kezeltük. Kristályibolyával végzett festés alapján a 2C4antitest e sejtvonalra nagymértékű szaporodásgátló hatást gyakorolt (lásd 4A. ábra). Az exogén HRG e gátlást nem fordította vissza. Másrészről a 2C4-antitest az ErbB2-t túlzott mértékben termelő SK-BR-3-sejtvonalra nem gyakorolt gátlóhatást (lásd 4B. ábra). Ugyanakkor a 2C4-antitest MDA-MB-175-sejtekre nagyobb mértékű sejtproliferáció-gátló hatást fejtett ki, minta 4D5-antitest (exogén HRG jelenlétében és hiányában egyaránt). A 4D5-antitest sejtproliferációt gátló hatása az ErbB2 termelődésének szintjétől függ [Lewis és mtsai.: Cancer Immunoi. Immunother. 37, 255 (1993)]. Az SK-BR-3-sejtekben 66%-os maximális gátlást detektáltunk (lásd 4B. ábra), azonban ez a hatás exogén HRGvel visszafordítható.
2. példa
A 2C4 monoklonális antitest blokkolja az ErbB2 és ErbB3 HRG-dependens asszociációját
Az ErbB3 ErbB2-vel történő asszociációs képességét koimmunprecipitációs kísérletben teszteltük. Hatüregű szövettenyésztő tálcák üregeibe - 10% magzati borjúszérumot (FBS) és 10 mM HEPES-t (pH=7,2) tartalmazó 50:50 DMEM/Ham-féle F12-tápközegben (nö36
HU 226 742 Β1 vesztő tápközeg) - 1,0χ106 MCF7- vagy SK-BR-3-sejtet helyeztünk. A sejteket egy éjszakán át hagytuk az üregek falához tapadni, majd a kísérlet megkezdése előtt borjúszérum nélküli növesztő tápközegben két óra hosszat éheztettük.
A sejteket foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) gyorsan leöblítettük, majd a megadott antitest-0,2 m/V% szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) tartalmazó RPMItápközegben készített - 100 nM oldatával és 10 mM HEPES-pufferrel, pH=7,2 (kötőpuffer) vagy csak kötőpufferrel (kontroll) szobahőmérsékleten egy óra hosszat inkubáltuk. Ezt követően az üregek feléhez (+) 5 mM végkoncentrációban HRG-t, míg a többi üreghez (-) hasonló térfogatú kötőpuffert adtunk. Az inkubálást kb. 10 percig folytattuk.
A felülúszókat leszívtuk, és a sejteket lizálópufferben (RPMI; 10 mM HEPES, pH=7,2; 1,0 VA/% Triton X-100™; 1,0 mA/% CHAPS) feltártuk, mely lizálópuffer 0,2 mM PMSF-et, 10 pg/ml leupeptint és 10 TU/ml aprotinint is tartalmazott. A lizátumokból az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítottuk.
Az ErbB2-t - affinitási gélhez (Affi-Prep 10; BioRad) kovalens kötéssel kapcsolt - monoklonális antitesttel immunprecipitáltuk. Ez az antitest (Ab-3; Oncogene Sciences) citoplazmikus dómén epitópot ismer fel. Az immunprecipitáció végrehajtásához mindegyik lizátumhoz 10 μΙ - hozzávetőleg 8,5 gg immobilizált antitestet tartalmazó - gélszuszpenziót adtunk, és a mintákat szobahőmérsékleten két óra hosszat kevertük. A géleket centrifugálással összegyűjtöttük, majd a nem kötődött anyag eltávolítása céljából - adagonként háromszor lizálópufferrel mostuk. SDS-mintapuffer hozzáadása után a mintákat rövid ideig forró vízfürdőben melegítettük.
A felülúszókat 4-12%-os poliakrilamid-géleken futtattuk és elektroblot módszerrel nitro-cellulóz-membránokra vittük át. Az ErbB3 jelenlétének meghatározása céljából a foltokat próbaként - az ErbB3 citoplazmikus dómén epitópja elleni - poliklonális antitest (c-17; Santa Cruz Biotech) alkalmazásával teszteltük. A foltokat kemilumineszcens szubsztrát (ECL, Amersham) alkalmazásával tettük láthatóvá.
Ahogy az 5A. és 5B. ábra kontrollsávjaiban látható, MCF7-, illetve SK-BR-3-sejtekben az ErbB3 csak akkor volt jelen az ErbB2 immunprecipitátumban, ha a sejteket HRG-vel stimuláltuk. Ha a sejteket először 2C4 monoklonális antitesttel inkubáltuk, az ErbB3 jel az MCF7sejtekben eltűnt (lásd 5A. ábra, „2C4 +” sáv), az SK-BR-3-sejtekben pedig jelentős mértékben csökkent (5B. ábra, „2C4 +” sáv). Ahogy az 5A. és 5B. ábrán látható, a 2C4 monoklonális antitest lényegesen nagyobb hatékonysággal gátolja az ErbB3 ErbB2-vel történő heregulindependensasszociációját, minta HERCEPTIN® (MCF7- és SK-BR-3-sejtekben egyaránt). A HERCEPTIN®-nel végzett előinkubálás az MCF7-sejtek lizátumában csökkentette az ErbB3 jelet, az SK-BR-3-sejtek lizátumából együttesen precipitálódott ErbB3 mennyiségére azonban nem vagy alig volt hatással. Az EGFreceptor elleni antitesttel (Ab-1; Oncogene Sciences) végzett előinkubálás egyik tesztelt sejtvonalban sem volt hatással az ErbB3 ErbB2-vel együttes precipitálódási képességére.
3. példa
Humanizált 2C4-antitestek
Az egéreredetű 2C4 monoklonális antitest variábilis doménjeit először olyan vektorba klónoztuk, amely kimérikus egér/humán Fab-fragmens termelődését teszi lehetővé. A hibridómasejtekből Stratagene RNS-kivonó reagenskészlet alkalmazásával - a gyártó útmutatásai szerint - össz-RNS-t izoláltunk. A variábilis domént reverz transzkriptázos polimeráz-láncreakcióval (RTPCR) amplifikáltuk, gélen tisztítottuk, és pUC119-alapú plazmid - humán kappa konstans domént és humán CH1-domént tartalmazó - származékába inszertáltuk [Id. Carter és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); 5 821 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás], A kapott plazmiddal - a Fab-fragmens expresszáltatása céljából - 16C9 E. coli-törzset transzformáltunk. A tenyészetek növesztését, a proteintermelődés indukálását és a Fab-fragmens tisztítását korábbi leírás szerint végeztük [Id. Werther és mtsai.: J. Immunoi. 157, 4986 (1996); Presta és mtsai.: Cancer Research 57, 4593 (1997)].
A tisztított kimérikus 2C4 Fab-fragmenst - a 125lHRG MCF7-sejtekhez történő kötődését gátló képessége, és MCF7-sejtekben a p180 tirozinfoszforilációjának rHRG általi aktiválását gátló hatása tekintetében összehasonlítottuk a kiindulási egéreredetű 2C4-antitesttel. Ahogy a 6A. ábrán látható, a kimérikus 2C4 Fab-fragmens nagyon hatásosan gátolja az MCF7 humán emlőráksejtvonalon a nagy affinitású ErbB2-ErbB3 kötőhely kialakulását. Az ép egéreredetű 2C4-antitestre számított relatív IC50-érték 4,0±0,4 nM, míg a Fab-fragmens relatív IC50-értéke 7,7±1,1 nM volt. Ahogy a 6B. ábrán látható, a monovalens kimérikus 2C4 Fab-fragmens nagyon hatásos a HRG-dependens ErbB2-ErbB3 aktiválás gátlásában. Az ép egéreredetű 2C4 monoklonális antitestre számított IC50-érték 6,0±2 nM, míg a Fab-fragmensre 15,0±2 nM volt.
A kimérikus klón DNS-szekvenálása lehetővé tette a komplementaritást meghatározó régió (CDR) aminosavainak azonosítását [Kábát és mtsai.: „Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. kiadás, Public Health Services, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] (lásd 7A. és 7B. ábra). Helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával e CDR-régiók közül mind a hatot - VX4-plazmidban elhelyezkedő - komplett humán vázrégióba (I. VL kappa alcsoport és III. VH alcsoport) inszertáltuk [Id. Presta és mtsai.: Cancer Research 57, 4593 (1997)]. E „CDR-átültetés eredményeként kapott proteint a fentiek szerint termeltettük és tisztítottuk. A két változat összehasonlítására kötési teszteket végeztünk. Ennek során Nunc Maxisorp™ tálcát a WO 90/14357 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint előállított ErbB2 extracelluláris dómén 50 mM karbonátpufferben (pH=9,6) készített 1 pg/ml koncentrációjú oldatával vontunk be (egy éjszakán 4 °C-on végzett inkubálással), majd szobahőmérsékleten egy óra hosszat ELISA-diluendummal
HU 226 742 Β1 (0,5% szarvasmarha-szérumalbumint és 0,05% poliszorbát-20-at tartalmazó foszfátpufferelt sóoldat) blokkoltuk. A minták ELISA-diluendumban készített sorozathígításait a tálcákon 2 óra hosszat inkubáltuk. Mosás után a kötött Fab-fragmenst humán kappa-lánc elleni biotinilált egéreredetű antitesttel (ICN 634771), majd sztreptavidinnel konjugált tormaperoxidázzal inkubáltuk, és szubsztrátként 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) alkalmazásával detektáltuk. Az abszorbanciát 450 nm-nél olvastuk le. Ahogy a 8A. ábrán látható, a „CDR-átültetett” („CDR swap”) humán Fab-fragmens esetében a kötődés teljesen megszűnt.
A humanizált Fab-fragmens kötődésének helyreállítása érdekében - templátként a CDR-átültetésből származó DNS alkalmazásával - mutánsokat hoztunk létre. Számítógépes modell (lásd 9. ábra) felhasználásával ezeket a mutációkat a humán vázrégió aminosavainak egéreredetű megfelelőikkel történő helyettesítésére terveztük, olyan pozíciókban, amelyekben a változás módosíthatja az antitest-antigén határfelületet vagy a CDR-konformációt. A létrehozott mutánsokat a 2. táblázatban mutatjuk be.
2. táblázat
Humanizált 2C4 vázrégiómutánsok
Mutáns azonosító száma Szubsztitúciók a vázrégióban
560 ArgH71Val
561 AspH73Arg
562 ArgH71Val, AspH73Arg
568 ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly
569 ArgH71Val, AspH73Arg, PheH67Ala
570 ArgH71Val, AspH73Arg, AsnH76Arg
571 ArgH71Val, AspH73Arg, LeuH78Val
574 ArgH71Val, AspH73Arg, lleH69Leu
56869 ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly, PheH67Ala
A különböző mutánsok kötési görbéit a 8A-8C. ábrákon mutatjuk be. Az ArgH71Val, AspH73Arg, lleH69Leu szubsztitúciókat hordozó 574-es humanizált Fabváltozat kötési affinitása az eredeti kimérikus 2C4 Fabfragmens affinitásának szintjére állt vissza. A humanizált antitest kötési affinitásának finomítása vagy fokozása céljából a vázrégió és/vagy a komplementaritást meghatározó régiók további aminosavait (pl. L2, L54, L55, L56, H35 és/vagy H48) módosíthatjuk (pl. szubsztitúcióval, a következők szerint: lleL2Thr, ArgL54Leu, TyrL55Glu, ThrL56Ser, AspH35Ser és ValH48lle). Más módon vagy ezen felül, a humanizált antitest - affinitásának és/vagy biológiai aktivitásának további javítása vagy finomítása érdekében - affinitásfejlesztésnek vethető alá (lásd fentebb).
Az 574-es humanizált 2C4 változat affinitásfejlesztését fágon való megjelenítési eljárással hajtottuk végre. Ennek során a humanizált 2C4.574 Fab-fragmenst - génlll fúzióként - fág-„display” vektorba klónoztuk. Ha a fágrészecskéket M13KO7 helper-fággal végzett infekcióval indukáljuk, ez a fúzió a Fab számára lehetővé teszi, hogy a fág farokrostproteinjének (génül) N-terminálisán jelenjen meg [Baca és mtsai.: J. Bioi. Chem. 272, 10 678(1997)].
A fentebb azonosított hat komplementaritást meghatározó régióra (CDR) külön-külön könyvtárakat hoztunk létre. E könyvtárakban a CDR-ek azon aminosavait, amelyeket számítógépes modell (lásd 9. ábra) alkalmazásával az ErbB2-höz történő kötődés szempontjából potenciálisan jelentősnek találtunk, kodonjaikként „NNS”-t tartalmazó oligonukleotidok alkalmazásával randomizáltuk. A könyvtárakat ezután - 3% tejport és 0,2% TWEEN-20®-at tartalmazó PBS-ben (MPBST, melyet a blokkolóoldatok helyett használtunk) - Nunc Maxisorp™ tálcákra felvitt ErbB2 ECDvel szemben teszteltük („panning”). A 2C4.574 változaténál nagyobb affinitású fág kiválasztása érdekében a 3., 4. és 5. tesztelési körökben a mosási lépések alatt - kompetitorként - szolúbilis ErbB2-ECD-t vagy szolúbilis 2C4.574 Fab-fragmenst adtunk. A mosás időtartamát szobahőmérsékleten egy órára növeltük.
Öt tesztelési kör után a külön kiónokat ismételten fág-ELISA-teszttel analizáltuk. A külön kiónokat 96 üregű, U aljú Costar szövettenyésztő tálcákon szaporítottuk, és a fágot helper-fág hozzáadásával indukáltuk. Egyéjszakás tenyésztés után az £ co//'-sejteket leülepítettük, és a fágtartalmú felülúszókat 96 üregű tálcákra helyeztük át, amelyen a fágot szobahőmérsékleten egy óra hosszat MPBST-vel blokkoltuk. Az ErbB2ECD-vel bevont Nunc Maxisorp™ tálcákat a fentiek szerint szintén MPBST-vel blokkoltuk. A blokkolt fágot a tálcákon két óra hosszat inkubáltuk, majd mosás után a kötött fágot tormaperoxidázzal konjugált antiM13 monoklonális antitest (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. 27-9421-01) (MPBST-ben készített 1:5000 arányú hígítás), majd szubsztrátként 3,3’,5,5’tetrametilbenzidin alkalmazásával detektáltuk. Az abszorbanciát 450 nm-nél olvastuk le.
Az egyes könyvtárakból a legnagyobb jelet adó 48-48 kiónt DNS-szekvenálásnak vetettük alá. Azokat a kiónokat, amelyek szekvenciája a legnagyobb gyakorisággal fordult elő, a fentebb említett vektorba szubklónoztuk, amely lehetővé teszi a szolúbilis Fabfragmensek expresszióját. Ezeket a Fab-fragmenseket indukáltuk, a proteineket tisztítottuk, majd a tisztított Fab-fragmensek kötődését a fentebb leírtak szerint ELISA-teszttel vizsgáltuk, és a kötődést a kiindulási humanizált 2C4.574 változatéhoz viszonyítottuk.
Az egyes komplementaritást meghatározó régiókban az érdekes mutációk azonosítása után - a fentebb leírtakhoz hasonlóan - olyan további mutánsokat hoztunk létre és teszteltünk, amelyek az előzőek különböző kombinációi voltak. Az 574-es változatéhoz képest javított kötődést mutató mutánsokat a 3. táblázatban soroljuk fel.
HU 226 742 Β1
3. táblázat
A 2C4.574 antitestváltozat affinitásfejlesztésével kapott mutánsok
Mutáns Eltérés az 574-es változattól Mutáns/ 574*
H3.A1 SerH99Trp, MetH34Leu 0,380
L2.F5 SerL50Trp, TyrL53Gly, MetH34Leu 0,087
H1.3.B3 ThrH28Gln, ThrH30Ser, MetH34Leu 0,572
L3.G6 TyrL92Pro, lleL93Lys, MetH34Leu 0,569
L3.G11 TyrL92Ser, lleL93Arg, TyrL94Gly, MetH34Leu 0,561
L3.29 TyrL92Phe, TyrL96Asn, MetH34Leu 0,552
L3.36 TyrL92Phe, TyrL94Leu, TyrL96Pro MetH34Leu 0,215
654 SerL50Trp, MetH34Leu 0,176
655 MetH34Ser 0,542
659 SerL5GTrp, MetH34Ser 0,076
L2.F5.H3.A1 SerL50Trp, TyrL53Gly, MetH34Leu, SerH99Trp 0,175
L3G6.H3.A1 TyrL92Pro, lleL93Lys, MetH34Leu, SerH99Trp 0,218
H1.3.B3.H3. A1 ThrH28Gln, ThrH30Ser, MetH34Leu, SerH99Trp 0,306
L3.G11.H3. A1 TyrL92Ser, lleL93Arg, TyrL94Gly, MetH34Leu, SerH99Trp 0,248
654.H3.A1 SerL50Trp, MetH34Leu, SerH99Trp 0,133
654.L3.G6 SerL50Trp, MetH34Leu, TyrL92Pro, lleL93Lys 0,213
654.L3.29 SerL50Trp, MetH34Leu, TyrL92Phe, TyrL96Asn 0,236
654.L3.36 SerL50Trp, MetH35Leu, TyrL92Phe, TyrL94Leu, TyrL96Pro 0,141
* Arányszám, amely ErbB2-ECD ELISA-tesztben az adott mutánsnak a standardgörbe közepes OD-értékéhez tartozó mennyisége és az 574-es változatnak a standardgörbe közepes OD-értékéhez tartozó mennyisége arányát adja meg.
További mutánsokat is létrehoztunk, melyek jelenleg értékelés alatt állnak:
659.L3.G6 SerL50Trp, MetH34Ser, TyrL92Pro, lleL93Lys
659.L3.G11 SerL50Trp, MetH34Ser, TyrL92Ser, lleL93Arg, TyrL94Gly
659.L3.29 SerL50Trp, MetH34Ser, TyrL92Phe, TyrL96Asn
659.L3.36 SerL50Trp, MetH34Ser, TyrL92Phe, TyrL94Leu, TyrL96Pro
L2F5.L3G6 SerL50Trp, TyrL53Gly, MetH34Leu, TyrL92Pro, lleL93Lys
L2F5.L3G11 SerL50Trp, TyrL53Gly, MetH34Leu, TyrL92Ser, lleL93Arg, TyrL94Gly
L2F5.L29 SerL50Trp, TyrL53Gly, MetH34Leu, TyrL92Phe, TyrL96Asn
L2F5.L36 SerL50Trp, TyrL53Gly, MetH34Leu, TyrL92Phe, TyrL94Leu, TyrL96Pro
L2F5.L3G6.655 SerL50Trp, TyrL53Gly, MetH35Ser, TyrL92Pro, lleL93Lys
L2F5.L3G11.655 SerL50Trp, TyrL53Gly, MetH34Ser, TyrL92Ser, lleL93Arg, TyrL94Gly
L2F5.L29.655 SerL50Trp, TyrL53Gly, MetH34Ser, TyrL92Phe, TyrL96Asn
L2F5.L36.655 SerL50Trp, TyrL53Gly, MetH34Ser, TyrL92Phe, TyrL94Leu, TyrL96Pro
A következő, homológiapásztázás alapján felvetődött mutánsok létrehozása jelenleg van folyamatban:
678 ThrH30Ala
679 ThrH30Ser
680 LysH64Arg
681 LeuH96Val
682 ThrL97Ala
683 ThrL97Ser
684 TyrL96Phe
685 TyrL96Ala
686 TyrL91Phe
687 ThrL56Ala
688 GlnL28Ala
689 GlnL28Glu
A H34 pozícióban előnyös aminosav lehet a metionin. A leucinra történő módosítás megvalósítható lenne, ha e pozícióban oxidációt lehetne kimutatni.
Az AsnH52 és AsnH53 pozíciók a kötődés szempontjából igen előnyösnek bizonyultak. Ezen aminosavak alaninnal vagy aszparaginsavval történő helyettesítése rendkívüli mértékben csökkentette a kötődést.
Korábban előállítottunk egy teljes antitestet, amely az 574-es humanizált változat könnyű és nehéz lánca variábilis doménjeit humán lgG1 nehéz lánc konstans régiójával együtt tartalmazza. Ezt a teljes (ép) antitestet kínai hörcsög petefészek sejtekben (CHO-sejtek) termeltettük. A leírásban e molekulát rhuMAb 2C4-nek nevezzük.
4. példa
A 2C4 monoklonális antitest blokkolja az MAPK
EGF, TGF-α vagy HRG közvetítette aktiválását
A mitogén aktiválta protein-kináz (MAPK) reakcióútban számos növekedésifaktor-receptor folytat jelátvitelt. Ezek a kettős specifitású kinázok olyan szignáltranszdukciós reakcióútak kulcsfontosságú végpontjai, amelyek végül a ráksejtek osztódását indukálják.
HU 226 742 Β1
A 2C4 monoklonális antitestnek vagy a HERCEPTIN®nek az MAPK - EGF, TGF-α vagy HRG közvetítette aktiválását gátló hatását a következő módon vizsgáltuk.
MCF7-sejteket (105 sejt/üreg) 12 üregű sejttenyésztő tálcán szérumtartalmú tápközegbe helyeztünk. A következő napon a tápközeget eltávolítottuk, és mindegyik üregbe 0,1% szérumot tartalmazó friss tápközeget töltöttünk. Ezt a következő napon megismételtük, és a tesztelés előtt a tápközeget szérummentes kötőpufferrel [Jones és mtsai.: J. Bioi. Chem. 273, 11667 (1998); Schaefer és mtsai.: J. Bioi. Chem. 274, 859 (1999)] helyettesítettük. A sejteket szobahőmérsékleten hagytuk kiegyensúlyozódni, majd 30 percig a 2C4 monoklonális antitest vagy a HERCEPTIN® 0,5 ml 200 nM koncentrációjú oldatával inkubáltuk. A sejteket ezután 15 percig 1 nM EGF-fel, 1 nM TGF-a-val vagy 0,2 nM HRG-vel kezeltük. A reakciót a tápközeg leszívatásával, majd 0,2 ml (1% DTT-t tartalmazó) SDS-PAGE mintapuffer hozzáadásával állítottuk le. Az MAPKaktiválást aktív MAPK elleni antitest (Promega) alkalmazásával végzett western-blot analízissel [Id. Jones és mtsai.: J. Bioi. Chem. 273, 11 667 (1998)] értékeltük.
Ahogy a 10. ábrán látható, a 2C4 monoklonális antitest jelentős (a HERCEPTIN®-nél nagyobb) mértékben blokkolta az MAPK EGF, TGF-α és HRG közvetítette aktiválását. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a 2C4 monoklonális antitest az ErbB2 azon felszínéhez kötődik, amely az EGFR-hez vagy ErbB3-hoz történő kapcsolódására használatos, ezáltal megakadályozza a jelátvivő receptorkomplex kialakulását.
A 2C4 monoklonális antitestről kimutattuk, hogy gátolja a heregulin- (HRG-)dependens Akt-aktiválást is. A PI3-kináz szignáltranszdukciós reakcióút aktiválása jelentős szerepet játszik a sejtek túlélésében [Carraway és mtsai.: J. Bioi. Chem. 270, 7111 (1995)]. Tumorsejtekben a PI3-kináz aktiválása az invazív fenotípusban játszhat szerepet [Tan és mtsai.: Cancer Research 59, 1620 (1999)]. A túlélési reakcióutat elsősorban az AKT szerin/treonin-kináz közvetíti [Bős és mtsai.: Trends Biochem. Sci. 20, 441 (1995)]. Az ErbB2 és az ErbB3 vagy EGFR között kialakult komplexek e reakcióutakat a heregulinra, illetve EGF-re reagálva indíthatják be [Olayioye és mtsai.: Mól. & Cell. Bioi. 18, 5042 (1998); Karunagaran és mtsai.: EMBO J. 15, 254 (1996); Krymskaya és mtsai.: Am. J. Physiol. 276, L246 (1999)]. Az MCF7 emlőráksejtek 2C4-antitesttel végzett inkubálása gátolja a heregulin közvetítette AKT-aktiválást. Ezen túlmenően, az AKT-aktiválás heregulin hozzáadása nélkül mérhető alapszintjét a 2C4-antitest hozzáadása tovább csökkenti. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a 2C4-antitest gátolja a PI3-kináz ErbB-ligandum általi aktiválását, és ez a gátlás apoptózishoz vezethet. Az apoptózisra vonatkozó fokozott érzékenység a tumorsejtekben a kemoterápia toxikus hatásaira vonatkozó nagyobb érzékenységként manifesztálódhat.
A fentiek alapján, a 2C4 monoklonális antitest két fő szignáltranszdukciós reakcióúton is gátolja a ligandum aktiválta ErbB-jelátvitelt. Ez a két reakcióút a MAP-kináz (fő proliferatív reakcióút) és a PI3-kináz (fő túlélési/antiapoptózisos reakcióút).
5. példa
A 2C4 monoklonális antitest és a HERCEPTIbfi in vivő kombinálása
Az anti-HER2 monoklonális antitestek tumornövekedés gátlására (önmagukban vagy kombinációban) kifejtett hatásának vizsgálatára a Calu-3 tüdőadenocarcinoma sejtvonal felhasználásával xenograft modellt alkalmaztunk. Nőstény csupasz NCR-egereket 0,1 ml térfogatban 20*106 Calu3-sejttel szubkután beoltottunk. A tumorokat hetente kétszer lemértük, és ha a tumorcsomók elérték a 100 mm3-es térfogatot, az állatokat véletlenszerűen hét kezelési csoportba osztottuk. A kezelési csoportok a következők:
(a) kontroll monoklonális antitest, MAb 1766;
(b) HERCEPTIN®, 10 mg/kg;
(c) 7C2 monoklonális antitest (10 mg/kg);
(d) 2C4 monoklonális antitest (10 mg/kg);
(e) HERCEPTIN® és 7C2-antitest (mindkettő mg/kg);
(f) HERCEPTIN® és 2C4-antitest (mindkettő mg/kg); és (g) 2C4 és 7C2 monoklonális antitest (mindkettő mg/kg).
Az állatokat a 24. napig hetente kétszer kezeltük. A tumorok térfogatát a 38. napig hetente kétszer mértük.
Ahogy a 11. ábrán bemutatott oszlopgrafikonon látható, a Calu-3 tumort hordozó egerek 2C4-gyel vagy HERCEPTIN®-nel végzett kezelése jelentős mértékben gátolta a tumorok növekedését. A HERCEPTIN® és a 2C4-antitest, valamint a HERCEPTIN® és a 7C2-antitest kombinációja az önmagukban alkalmazott antitestekhez képest sokkal nagyobb gátlást eredményezett.
6. példa
Vastag- és végbélrák kezelése 2C4 monoklonális antitesttel
Humán vastag- és végbélráksejtvonalakat (pl. HCA-7, LS174T vagy CaCo-2) szubkután thymus nélküli csupasz egerekbe implantáltuk [Id. Sheng és mtsai.: J. Clin. Invest. 99, 2254 (1997)]. Miután a tumorok kb. 100 mm3-es térfogatúra nőttek, a kezelési csoportokat 10-50 mg/kg 2C4 monoklonális antitesttel kezeltük. A kezelést az egerek peritoneális üregébe adott hetente kétszeri injektálással végeztük. A 2C4 monoklonális antitest szuppresszálta a vastag- és végbélrákxenograftok növekedését.
7. példa
Emlőrák kezelése humanizált 2C4-antitesttel
Az rhuMAb 2C4 és a HERCEPTIN® - ErbB2-t nem túltermelő - humán emlőráksejtekre gyakorolt hatását háromnapos „Alamar Blue” teszttel vizsgáltuk [Ahmed: J. Immunoi. Methods 170, 211 (1994); Page és mtsai.: Int. J. Oncol. 3, 473 (1994)]. E vizsgálati eljárásban MDA-175 humán emlőráksejteket alkalmaztunk, amelyek az ErbB2-t 1+ szinten termelik. Ahogy a 12. ábrán látható, az MDA-175 emlőráksejtek szaporodását az
HU 226 742 Β1 rhuMAb2C4-antitest adagolása dózisfüggő módon gátolta, nagyobb mértékben, mint a HERCEPTIN®-nel végzett kezelés.
Az rhuMAb2C4-antitest - ösztrogénreceptorra pozitív (ER+) és kis mennyiségű ErbB2-t termelő MCF7 xenograftok elleni hatását is megvizsgáltuk. A kísérlethez ösztrogénnel kezelt nőstény egereket alkalmaztunk. Az rhuMAb2C4-antitestet hetente egyszer 30 mg/kg dózisban adagoljuk. Ahogy a 13. ábrán látható, az rhuMAb2C4-antitest in vivő hatásosan gátolta az ErbB2-t nem túltermelő emlőtumor növekedését.
8. példa
A 2C4-antitest farmakokinetikája, metabolizmusa és toxikológiája
Az rhuMAb2C4-antitest humán vérsavóban stabil volt. Biológiai anyagokban komplexaggregátumok képződésének bizonyítékait nem találtuk. Egerekben az rhuMAb2C4-antitest gyorsabban kiürült, mint a HERCEPTIN®. A farmakokinetikai vizsgálatok azt jelzik, hogy az rhuMAb2C4-antitest kb. 2-6 mg/kg dózisban történő heti adagolása a vérsavóban a HERCEPTIN® jelenleg elfogadott adagolásakor tapasztalhatóhoz hasonló koncentrációt eredményez. A vérsavó 2C4-tartalma jelentősen meghaladhatja az in vitro meghatározott IC50-értéket.
A toxikológiai vizsgálatot Cynomolgus majmokban (csoportonként két hím és két nőstény) végeztük. Az rhuMAb2C4-antitestet négy héten át, hetente kétszer intravénásán (0,10, 50 vagy 100 mg/kg dózisban) adagoljuk. A toxikológiai vizsgálat során a következő vizsgálatokat végeztük: mértük a testtömeget (a kezelés elkezdése előtt egy és két héttel, majd utána hetente); megfigyeltük a táplálékfogyasztást (kvalitatíve, naponta); mértük a vérnyomást és a testhőmérsékletet, és elektrokardiogramot (EKG) készítettünk (a kezelés megkezdése előtt egy és két héttel, valamint utána a 2. és 4. héten, a második dózis beadása után négy órával); szívultrahang-vizsgálatok (az első héten az első dózis beadása után, majd a vizsgálat végén, a 4. héten); klinikai patológia (alapszint és a 2. és 4. hét végén); vizeletvizsgálat (alapszint és a 2. és 4. hét végén); antitestanalízis (alapszint és a 2. és 4. hét végén); valamint boncolás és szövettani analízis.
A kísérlet végéig mindegyik csoportban mindegyik állat életben maradt. Jelentős klinikai észrevételeket, illetve az egyes csoportok között különbségeket nem találtunk. A boncolás eredménye a szervekben látható rendellenességeket nem mutatott. Egyik állat szöveteiben sem találtunk mikroszkopikus abnormalitásokat. A kísérlet elejétől a végéig az EKG-ban sem tapasztaltunk jelentős változásokat. Az egyes csoportok között nem voltak eltérések.
9. példa
Dóziskiterjesztés
Rákos betegeknek ötféle dózisnagysággal (0,05 mg/kg, 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg vagy 10 mg/kg, dózisnagyságonként hat páciens) első ehuMAb2C4-dózist adtunk be, majd négyhetes kiürülési periódust iktattunk be. Az 5. héten a betegeknek hetente négyszer azonos dózist adtunk, majd újabb négyhetes kiürülési időszak következett. A teljes reakciót, részleges reakciót vagy stabil betegséget mutató páciensek megfelelőek a kiterjesztési kísérletekhez.
10. példa
Kiújuló vagy nehezen kezelhető metasztázisos prosztatarák terápiája
Az rhuMAb2C4 egy - CHO-sejtekben termeltetett ErbB2 elleni, teljes hosszúságú, humanizált monoklonális antitest, amely blokkolja az ErbB-család más tagjaival asszociált ErbB2-t, ezáltal gátolja az ErbB-reakcióúton keresztül lezajló intracelluláris jelátvitelt. Az rhuMAb2C4 - a HERCEPTIN®-nel ellentétben - nemcsak az ErbB2-t túlzott mértékben termelő tumorok növekedését gátolja, hanem mindazokét, amelyek ErbBligandum-dependens jelátvitelt igényelnek.
Az rhuMAb2C4-antitestet a hormonnal nehezen kezelhető (androgénhormon-független) prosztatarákos páciensek kezelésének önálló hatóanyagaként javalljuk. Az elsődleges hatékonysági végpontok közé tartozik a rendelkezésre álló legjobb kezeléssel (Mitoxantron/Prednison) - egyedüli hatóanyagként alkalmazva elérhetőhöz viszonyított teljes túlélés és biztonság. A másodlagos hatékonysági végpontok közé tartoznak a következők: a betegség progressziójáig eltelt idő; reakcióráta; életminőség; fájdalom és/vagy a reakció időtartama. Az rhuMAb2C4-antitestet hetente (2 mg/kg dózissal) vagy háromhetente (4 mg/kg dózissal) intravénásán adagoljuk mindaddig, míg a betegség progressziója be nem következik. Az antitest kiszerelése többdózisos folyadékkészítmény (20 ml 20 mg/ml vagy nagyobb koncentrációjú töltet).
Az rhuMAb2C4-antitest javallott hormonnal nehezen kezelhető (androgénhormon-független) prosztatarákos páciensek kemoterápiával kombinált kezelésére is. Az elsődleges hatékonysági végpontok közé tartozik a kemoterápiával elérhetőhöz viszonyított teljes túlélés és a biztonság. A másodlagos hatékonysági végpontok közé tartoznak a következők: a betegség progressziójáig eltelt idő; reakcióráta; életminőség; fájdalom és/vagy a reakció időtartama. Az rhuMAb2C4-antitestet hetente (2 mg/kg dózissal) vagy háromhetente (4 mg/kg dózissal) intravénásán adagoljuk mindaddig, míg a betegség progressziója be nem következik. Az antitest kiszerelése többdózisos folyadékkészítmény (20 ml 20 mg/ml vagy nagyobb koncentrációjú töltet).
Az ErbB2-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló anti-ErbB2 antitesttel - prosztatarák (pl. androgénfüggetlen prosztatarák) kezelése céljából - kombinálható hatóanyagok példái közé tartoznak a következők: farnesyl transzferáz inhibitor; angiogenezist gátló hatóanyag (pl. anti-VEGF antitest); EGFR-t megcélzó hatóanyag (pl. C225 vagy ZD1839); másik antiErbB2 antitest [pl. sejtszaporodást gátló anti-ErbB2 antitest (pl. HERCEPTIN®) vagy apoptózist indukáló antiErbB2 antitest (pl. 7C2 vagy 7F3), ideértve ezek humanizált és/vagy affinitásfejlesztett változatait]; citokin (pl. IL—2, IL—12, G-CSF vagy GM-CSF); androgénhormon41
HU 226 742 Β1 ellenes vegyület (pl. flutamid vagy cyproterin-acetát); leuprolid; suramin; kemoterápiás hatóanyag, pl. vinblastin, estramustin, mitoxantron, liarozol (retinsavmetabolizmus-blokkoló hatóanyag), ciklofoszfamid, anthracyclin antibiotikumok (pl. doxorubicin), taxán (pl. paclitaxel vagy docetaxel) vagy methotrexát, valamint ezek tetszőleges kombinációi, pl. vinblastin/estramustin vagy ciklofoszfamid/doxorubicin/methotrexát; prednison; hidrokortizon; vagy ezek kombináció. Az ilyen hatóanyagok standarddózisukban adagolhatok, pl. hetente 40 mg/m2 docetaxel (TAXOTERE®); 6 (AUC) carboplatin; és 200 mg/m2 paclitaxel (TAXIL®).
11. példa
Metasztázisos emlőrák kezelése
Az rhuMAb2C4-antitest önálló hatóanyagként olyan metasztázisos emlőrákban szenvedő páciensek kezelésére javallott, akik tumorjaira nem jellemző az ErbB2 túlzott mértékű termelése. Az elsődleges hatékonysági végpontok közé tartozik a reakcióráta és a biztonság. A másodlagos hatékonysági végpontok közé tartoznak a következők: teljes túlélés, a betegség progressziójáig eltelt idő, életminőség, és/vagy a reakció időtartama. Az rhuMAb2C4-antitestet hetente (2 mg/kg dózissal) vagy háromhetente (4 mg/kg dózissal) intravénásán adagoljuk mindaddig, míg a betegség progressziója be nem következik. Az antitest kiszerelése többdózisos folyadékkészítmény (20 ml 20 mg/ml vagy nagyobb koncentrációjú töltet).
Az rhuMAb2C4-antitest kemoterápiával kombinálva is javallott olyan metasztázisos emlőrákban szenvedő páciensek kezelésére, akik tumorjaira nem jellemző az ErbB2 túlzott mértékű termelése. Az elsődleges hatékonysági végpontok közé tartozik a csak kemoterápia alkalmazása esetén tapasztalhatóhoz viszonyított teljes túlélés és a biztonság. A másodlagos hatékonysági végpontok közé tartoznak a következők: a betegség progressziójáig eltelt idő, reakcióráta, életminőség és/vagy a reakció időtartama. Az rhuMAb2C4-antitestet hetente (2 mg/kg dózissal) vagy háromhetente (4 mg/kg dózissal) intravénásán adagoljuk mindaddig, míg a betegség progressziója be nem következik. Az antitest kiszerelése többdózisos folyadékkészítmény (20 ml 20 mg/ml vagy nagyobb koncentrációjú töltet).
Az ErbB2-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló anti-ErbB2 antitesttel - emlőrák (pl. ErbB2-t nem túltermelő metasztázisos emlőrák) kezelése céljából kombinálható hatóanyagok példái közé tartoznak a következők: kemoterápiás hatóanyagok, pl. anthracyclin antibiotikumok (pl. doxorubicin), ciklofoszfomid, taxán (pl. paclitaxel vagy docetaxel), navelbin, xeloda, mitomicin C, platinavegyület, oxaliplatin, gemcitabin vagy ezek kombinációi (pl. doxorubicin/ciklofoszfomid); másik anti-ErbB2 antitest [pl. sejtszaporodást gátló antiErbB2 antitest (pl. HERCEPTIN®) vagy apoptózist indukáló anti-ErbB2 antitest (pl. 7C2 vagy 7F3), ideértve ezek humanizált és/vagy affinitásfejlesztett változatait]; ösztrogénellenes vegyület (pl. tamoxifen); farnesyl transzferáz inhibitor; angiogenezist gátló hatóanyag (pl. anti-VEGF antitest); EGFR-t megcélzó hatóanyag (pl. C225 vagy ZD1839); citokin (pl. IL-2, IL-12, G-CSF vagy GM-CSF); vagy ezek kombinációi. Az ilyen hatóanyagok standarddózisukban adagolhatok.
Az rhuMAb2C4-antitest HERCEPTIN®-nel kombinálva olyan metasztázisos emlőrákban szenvedő betegek kezelésére is javallott, akik tumora túlzott mértékben termeli az ErbB2-receptort. Az elsődleges hatékonysági végpontok közé tartozik a reakcióráta és a biztonság. A másodlagos hatékonysági végpontok közé tartoznak a következők: a betegség progressziójáig eltelt idő, a csak HERCEPTIN®-nel végzett kezelés esetén tapasztalhatóhoz viszonyított teljes túlélés, életminőség és/vagy a reakció időtartama. Az rhuMAb2C4-antitestet hetente (2 mg/kg dózissal) vagy háromhetente (4 mg/kg dózissal) intravénásán adagoljuk mindaddig, míg a betegség progressziója be nem következik. Az antitest kiszerelése többdózisos folyadékkészítmény (20 ml 20 mg/ml vagy nagyobb koncentrációjú töltet). A HERCEPTIN®-t intravénásán, 4 mg/kg kezdő dózis beadásával, majd heti egyszeri, 2 mg/kg-os fenntartó dózissal adagoljuk. A HERCEPTIN® kiszerelése liofilizált por. Egy HERCEPTIN®-fiola 440 mg HERCEPTIN®-t, 9,9 mg L-hisztidin-HCI-ot, 6,4 mg L-hisztidint, 400 mg α-α-trehalóz-dihidrátot és
1,8 mg poliszorbát-20-at tartalmaz. Egy fiola tartalmát ml - tartósítószerként 1,1% benzil-alkoholt tartalmazó bakteriosztatikus injektálható vízzel (BWFI) rekonstituálva 21 ml többdózisos oldatot kapunk, amely mg/ml HERCEPTIN®-t tartalmaz (pH=kb. 6,0).
12. példa
Tüdőrák kezelése
Az rhuMAb2C4-antitest önálló hatóanyagként lllb vagy IV. stádiumú, nem kissejtes tüdőrák (NSCLC) kezelésére is javallott. Az elsődleges hatékonysági végpontok a reakcióráta és a biztonság. A másodlagos hatékonysági végpontok közé tartoznak a következők: teljes túlélés, a betegség progressziójáig eltelt idő, életminőség, és/vagy a reakció időtartama. Az rhuMAb2C4antitestet hetente (2 mg/kg dózissal) vagy háromhetente (4 mg/kg dózissal) intravénásán adagoljuk mindaddig, míg a betegség progressziója be nem következik. Az antitest kiszerelése többdózisos folyadékkészítmény (20 ml 20 mg/ml vagy nagyobb koncentrációjú töltet).
Az rhuMAb2C4-antitest kemoterápiával kombinálva is javallott lllb vagy IV. stádiumú, nem kissejtes tüdőrákban (NSCLC) szenvedő betegek kezelésére. Az elsődleges hatékonysági végpontok közé tartozik a standardterápia alkalmazása esetén tapasztalhatóhoz viszonyított teljes túlélés és a biztonság. A másodlagos hatékonysági végpontok közé tartoznak a következők: a betegség progressziójáig eltelt idő, reakcióráta, életminőség és/vagy a reakció időtartama. Az rhuMAb2C4-antitestet hetente (2 mg/kg dózissal) vagy háromhetente (4 mg/kg dózissal) intravénásán adagoljuk mindaddig, míg a betegség progressziója be nem következik. Az antitest kiszerelése többdózisos folyadékkészítmény (20 ml 20 mg/ml vagy nagyobb koncentrációjú töltet).
Az ErbB2-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló és az ErbB2-receptort megkötő antitesttel - tüdő42
HU 226 742 Β1 rák kezelése céljából - kombinálható hatóanyagok példái közé tartoznak a következők: kemoterápiás hatóanyagok, pl. carboplatin, taxán (pl. paclitaxel vagy docetaxel), gemcitabin, navelbin, cisplatin, oxaliplatin vagy ezek kombinációi (pl. carboplatin/docetaxel); má- 5 sík anti-ErbB2 antitest [pl. sejtszaporodást gátló antiErbB2 antitest (pl. HERCEPTIN®) vagy apoptózist indukáló anti-ErbB2 antitest (pl. 7C2 vagy 7F3), ideértve ezek humanizált és/vagy affinitásfejlesztett változatait]; farnesyl transzferáz inhibitor; angiogenezist gátló ható- 10 anyag (pl. anti-VEGF antitest); EGFR-t megcélzó hatóanyag (pl. C225 vagy ZD1839); citokin (pl. IL—2, IL—12, G-CSF vagy GM-CSF); vagy ezek kombinációi.
13. példa 15
Vastag- és végbélrák kezelése Az rhuMAb2C4-antitest önálló hatóanyagként metasztázisos vastag- és végbélrák kezelésére is javallott. Az elsődleges hatékonysági végpontok a reakcióráta és a biztonság. A másodlagos hatékonysági vég- 20 pontok közé tartoznak a következők: teljes túlélés, a betegség progressziójáig eltelt idő, életminőség, és/vagy a reakció időtartama. Az rhuMAb2C4-antitestet hetente (2 mg/kg dózissal) vagy háromhetente (4 mg/kg dózissal) intravénásán adagoljuk mindaddig, 25 míg a betegség progressziója be nem következik. Az antitest kiszerelése többdózisos folyadékkészítmény (20 ml 20 mg/ml vagy nagyobb koncentrációjú töltet).
Az rhuMAb2C4-antitest kemoterápiával kombinálva is javallott metasztázisos vastag- és végbélrákban 30 szenvedő betegek kezelésére. Az elsődleges hatékonysági végpontok közé tartozik a standardterápia alkalmazása esetén tapasztalhatóhoz viszonyított teljes túlélés és a biztonság. A másodlagos hatékonysági végpontok közé tartoznak a következők: a betegség progressziójáig eltelt idő, reakcióráta, életminőség és/vagy a reakció időtartama. Az rhuMAb2C4-antitestet hetente (2 mg/kg dózissal) vagy háromhetente (4 mg/kg dózissal) intravénásán adagoljuk mindaddig, míg a betegség progressziója be nem következik. Az antitest kiszerelése többdózisos folyadékkészítmény (20 ml 20 mg/ml vagy nagyobb koncentrációjú töltet).
Az ErbB2-receptort megkötő és az ErbB2-receptor ligandum általi aktiválását blokkoló antitesttel - vastagés végbélrák kezelése céljából - kombinálható hatóanyagok példái közé tartoznak a következők: 5-fluoruracil (5-FU), leucovorin (LV), CPT-11, levamisol vagy ezek kombinációi (pl. 5-FU/LV/CPT-11). Ezek a kemoterápiás hatóanyagok standarddózisaikban adagolhatok. Az anti-ErbB2 antitesttel vastag- és végbélrák kezelése érdekében kombinálható egyéb hatóanyagok a következők: farnesyl transzferáz inhibitor; angiogenezist gátló hatóanyag (pl. anti-VEGF antitest); EGFR-t megcélzó hatóanyag (pl. C225 vagy ZD1839); citokin (pl. IL—2, IL—12, G-CSF vagy GM-CSF); másik antiErbB2 antitest [pl. sejtszaporodást gátló anti-ErbB2 antitest (pl. HERCEPTIN®) vagy apoptózist indukáló antiErbB2 antitest (pl. 7C2 vagy 7F3), ideértve ezek humanizált és/vagy affinitásfejlesztett változatait]; valamint ezek kombinációi.
Szekvencialista
Szekvenciák száma: 13 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 1
Asp 1 Thr Val Met Thr 5 Gin Ser His Lys Ile 10 Met Ser Thr Ser Val 15
Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Ser
20 25 30
Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75
Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin
80 85 90
HU 226 742 Β1
Tyr Tyr Ile Tyr Pro 95 Tyr Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105
Ile Lys
<21O>2 <211> 119 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Alá Ser Gly Phe Thr Phe Thr
20 25 30
Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu
35 40 45
Glu Trp Ile Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Lle Tyr
50 55 60
Asn Gin Arg Phe Lys Gly Lys Alá Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser
65 70 75
Ser Arg Ile Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr
95 100 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
110 115 <2103 <211> 107 <212> PRT <213> Mesterséges szekvencia <220 <223> Humanizált VL-szekvencia <400 3
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Alá Ser Val 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Alá Ser Gin Asp Val Ser
20 25 30
Ile Gly Val Alá Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Alá Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75
HU 226 742 Β1
Ser Ser Leu Gin Pro Glu 80 Asp Phe Alá Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90
Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu
95 100 105
Ile Lys
<2104 <211> 119 <212> PRT
<213> Mesterséges szekvencia
<220
<223> Humanizált VH-szekvencia
<400 4
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Phe Thr Phe Thr
20 25 30
Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Alá Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr
50 55 60
Asn Gin Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr
95 100 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 <21O>5 <211>107 <212> PRT <213> Mesterséges szekvencia <220>
<223> könnyű lánc konszenzusszekvencia <400> 5
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Alá Ser Val 15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Alá Ser Gin Ser Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Leu Alá Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá Pro Lys
35 40 45
HU 226 742 Β1
Leu Leu Ile Tyr Alá 50 Alá Ser Ser Leu Glu 55 Ser Gly Val Pro Ser 60
Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75
Ser Ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Alá Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90
Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu
100 105
Ile Lys <21 O>6 <211> 119 <212> PRT <213> Mesterséges szekvencia
<220: >
<223: > nehé íz lánc konsz :enzus szekvencia
<400: >6
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Alá Met Ser Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Alá Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
50 55 60
Alá Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp
80 85 90
Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu
95 100 105
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 <21 O>7 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
<221 > bizonytalan <222> 10 <223> ismeretlen aminosav
HU 226 742 Β1 <400>7
Gly Phe Thr Phe 1
Thr
Asp
Tyr
Thr Met Xaa 10 <21 O>8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gin Arg Phe 15 10 15
Lys Gly <210>9 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9
Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr 15 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10
Lys Alá Ser Gin Asp Val Ser Ile Gly Val Alá 15 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220>
<221 > bizonytalan <222> 5-7 <223> ismeretlen aminosav <400> 11
Ser Alá Ser Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus
HU 226 742 Β1 <400> 12
Gin Gin Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 13 <211 >645 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13
Met 1 Glu Leu Alá Alá 5 Leu Cys Arg Trp Gly 10 Leu Leu Leu Alá Leu 15
Leu Pro Pro Gly Alá Alá Ser Thr Gin Val Cys Thr Gly Thr Asp
20 25 30
Met Lys Leu Arg Leu Pro Alá Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met
35 40 45
Leu Arg His Leu Tyr Gin Gly Cys Gin Val Val Gin Gly Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Alá Ser Leu Ser Phe Leu Gin
65 70 75
Asp Ile Gin Glu Val Gin Gly Tyr Val Leu Ile Alá His Asn Gin
80 85 90
Val Arg Gin Val Pro Leu Gin Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr
95 100 105
Gin Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Alá Leu Alá Val Leu Asp Asn Gly
110 115 120
Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Alá Ser Pro Gly
125 130 135
Gly Leu Arg Glu Leu Gin Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
140 145 150
Gly Gly Val Leu Ile Gin Arg Asn Pro Gin Leu Cys Tyr Gin Asp
155 160 165
Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gin Leu Alá
170 175 180
Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Alá Cys His Pro Cys
185 190 195
Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu
200 205 210
Asp Cys Gin Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Alá Gly Gly Cys Alá
215 220 225
Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gin Cys
230 235 240
HU 226 742 Β1
Alá Alá Gly Cys Thr 245 Gly Pro Lys His Ser 250 Asp Cys Leu Alá Cys 255
Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Alá
260 265 270
Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro
275 280 285
Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Alá Ser Cys Val Thr Alá Cys Pro
290 295 300
Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys
305 310 315
Pro Leu His Asn Gin Glu Val Thr Alá Glu Asp Gly Thr Gin Arg
320 325 330
Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Alá Arg Val Cys Tyr Gly Leu
335 340 345
Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Alá Val Thr Ser Alá Asn
350 355 360
Ile Gin Glu Phe Alá Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Alá
365 370 375
Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Alá Ser Asn Thr Alá
380 385 390
Pro Leu Gin Pro Glu Gin Leu Gin Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu
395 400 405
Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Alá Trp Pro Asp Ser Leu Pro
410 415 420
Asp Leu Ser Val Phe Gin Asn Leu Gin Val Ile Arg Gly Arg Ile
425 430 435
Leu His Asn Gly Alá Tyr Ser Leu Thr Leu Gin Gly Leu Gly Ile
440 445 450
Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu
455 4 60 465
Alá Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
470 475 480
Pro Trp Asp Gin Leu Phe Arg Asn Pro His Gin Alá Leu Leu His
485 490 495
Thr Alá Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Alá
500 505 510
Cys His Gin Leu Cys Alá Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro
515 520 525
Thr Gin Cys Val Asn Cys Ser Gin Phe Leu Arg Gly Gin Glu Cys
530 535 540
HU 226 742 Β1

Claims (18)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Antitest, amely a 4. azonosító számú szekvenciában (SEQ ID NO: 4) megadott nehéz lánc variábilis (VH) dómén aminosavszekvenciát és a 3. azonosító számú szekvenciában (SEQ ID NO: 3) megadott könnyű lánc variábilis (VL) dómén aminosavszekvenciát tartalmazza.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely egy ép IgG 1-antitest.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti antitest, amely egy antitestfragmens.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti antitest, amely egy Fabfragmens.
  5. 5. Gyógyászati készítmény, amely az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antitestet és gyógyászati szempontból elfogadható hordozót tartalmaz.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely vizes oldat.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely liofilizálva van.
  8. 8. Immunkonjugátum, amely 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antitestet citotoxikus hatóanyaggal konjugálva tartalmaz.
  9. 9. Izolált nukleinsav, amely 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antitestet kódol.
  10. 10. Vektor, amely 9. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz.
  11. 11. Gazdasejt, amely 10. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti gazdasejt, amely emlőseredetű sejt.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti gazdasejt, amely kínai hörcsög petefészek (CHO) sejt.
  14. 14. Eljárás antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antitestet kódoló nukleinsavat tartalmazó gazdasejtet oly módon tenyésztjük, hogy a nukleinsav expresszálódjon és az antitest termelődjön.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként a gazdasejttenyészetből kinyerjük az antitestet.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitestet a gazdasejt tenyésztő tápközegéből nyerjük ki.
  17. 17. A 14-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtet alkalmazunk.
  18. 18. A 14-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként a kinyert antitestet gyógyászati szempontból elfogadható hordozóval, segédanyaggal vagy stabilizálószerrel elegyítjük, miáltal antitestet tartalmazó gyógyászati készítményt állítunk elő.
HU0201695A 1999-06-25 2000-06-23 Humanized anti-erbb2 antibodies and treatment with anti-erbb2 antibodies HU226742B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14131699P 1999-06-25 1999-06-25
PCT/US2000/017366 WO2001000245A2 (en) 1999-06-25 2000-06-23 HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0201695A2 HUP0201695A2 (en) 2002-09-28
HUP0201695A3 HUP0201695A3 (en) 2005-06-28
HU226742B1 true HU226742B1 (en) 2009-08-28

Family

ID=22495168

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0201695A HU226742B1 (en) 1999-06-25 2000-06-23 Humanized anti-erbb2 antibodies and treatment with anti-erbb2 antibodies

Country Status (33)

Country Link
EP (2) EP1189641B1 (hu)
JP (2) JP4283474B2 (hu)
KR (2) KR100850389B1 (hu)
CN (4) CN101121021B (hu)
AR (1) AR024464A1 (hu)
AT (2) AT500848B1 (hu)
AU (2) AU784045B2 (hu)
BE (1) BE2013C020I2 (hu)
BR (2) BR122014028365B8 (hu)
CA (2) CA2727172A1 (hu)
CH (1) CH694589A5 (hu)
CY (2) CY1109525T1 (hu)
CZ (1) CZ299702B6 (hu)
DE (2) DE60042648D1 (hu)
DK (1) DK1189641T5 (hu)
ES (1) ES2329437T3 (hu)
FR (1) FR13C0016I2 (hu)
GB (1) GB2368796B (hu)
GE (1) GEP20104998B (hu)
HK (1) HK1044888A1 (hu)
HU (1) HU226742B1 (hu)
IL (3) IL146954A0 (hu)
LU (1) LU92164I2 (hu)
MX (1) MXPA01013458A (hu)
NO (3) NO328377B1 (hu)
NZ (2) NZ516830A (hu)
PL (2) PL204629B1 (hu)
PT (1) PT1189641E (hu)
RU (2) RU2270029C2 (hu)
SI (3) SI2283867T1 (hu)
TR (1) TR200103756T2 (hu)
WO (1) WO2001000245A2 (hu)
ZA (2) ZA200109786B (hu)

Families Citing this family (227)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8038994B2 (en) 1996-05-15 2011-10-18 Quest Pharmatech Inc. Combination therapy for treating disease
BRPI0012196B8 (pt) * 1999-06-25 2021-05-25 Genentech Inc artigo industrializado
WO2001000245A2 (en) * 1999-06-25 2001-01-04 Genentech, Inc. HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
US6825333B1 (en) 1999-08-20 2004-11-30 Chiron Corporation EGFH2 genes and gene products
TR200200472T2 (tr) * 1999-08-27 2002-06-21 Genentech, Inc. Anti-Erb B2 antikorları ile tedavi için dozajlar
WO2001024763A2 (en) 1999-10-01 2001-04-12 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US20020064785A1 (en) 2000-05-19 2002-05-30 Genentech Inc. Gene detection assay for improving the likelihood of an effective response to an ErbB antagonist cancer therapy
EP1228766A1 (en) * 2001-01-31 2002-08-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. PYK2 phosphorylation by HER3 induces tumor invasion
AT500649A1 (de) * 2001-10-26 2006-02-15 Altarex Medical Corp Kombinationstherapie zur krankheitsbehandlung
US7585491B2 (en) * 2002-12-13 2009-09-08 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
CA2481509A1 (en) * 2002-04-11 2003-10-23 Suzanna Tatarewicz Her-2 receptor tyrosine kinase molecules and uses thereof
ITTO20020340A1 (it) * 2002-04-19 2003-10-20 Biother Di Contardi Gabriella Localizzazione del recettore her2 mediante anticorpo umanizzato biotinilato.
AU2003237367A1 (en) 2002-06-03 2003-12-19 Chiron Corporation Use of nrg4, or inhibitors thereof, in the treatment of colon and pancreatic cancer
AT413486B (de) * 2002-07-03 2006-03-15 Igeneon Krebs Immuntherapie Verwendung eines antikörpers gerichtet gegen lewis-antigene
NO340576B1 (no) * 2002-07-11 2017-05-15 Hoffmann La Roche Rekombinant, humanisert antistoff 2C4 (rhuMab 2C4) for anvendelse sammen med et andre, forskjellig vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoff i en fremgangsmåte for behandling av kreft i en pasient og anvendelse derav for fremstilling av et medikament
DK1585966T3 (da) 2002-07-15 2012-02-20 Hoffmann La Roche Behandling af cancer med anti-ErbB2-antistoffet rhuMab 2C4
WO2004009112A1 (en) 2002-07-18 2004-01-29 Helix Biopharma Corp. Use of urease for inhibiting cancer cell growth
US7264800B2 (en) 2002-07-18 2007-09-04 Helix Biopharma Corporation Method and composition for inhibiting cancer cell growth
PT1523496E (pt) 2002-07-18 2011-09-29 Merus B V Produção de misturas de anticorpos de forma recombinante
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
AU2003248982B2 (en) * 2002-08-01 2009-12-10 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
JP4790413B2 (ja) * 2002-10-08 2011-10-12 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 抗体療法
JP2007517767A (ja) * 2003-03-11 2007-07-05 ダナ ファーバー キャンサー インスティテュート ウイルスの病原性の阻害方法
KR100872210B1 (ko) * 2003-04-23 2008-12-05 메다렉스, 인코포레이티드 인터페론 알파 수용체-1 (ｉｆｎａｒ-1)에 대한 인체화항체
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
AT500651B9 (de) * 2003-05-27 2010-04-15 Altropus Gmbh Aktiv immunisierender antikörper
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
SI1648940T1 (sl) 2003-07-28 2016-08-31 Genentech, Inc. Zmanjševanje izluževanja proteina A med afinitetno kromatografijo proteina A
WO2005020923A2 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Cedars-Sinai Medical Center Composition and method for the treatment of cancer and other physiologic conditions based on modulation of the ppar-gamma pathway and her-kinase axis
EP1664082B1 (en) * 2003-09-18 2014-03-05 MacroGenics West, Inc. Kid3 and anti-kid3 antibodies
KR20070003806A (ko) * 2003-11-28 2007-01-05 미트라 메디컬 아베 Ｅｒｂ 항원의 표적화
EP1753463A2 (en) * 2004-06-01 2007-02-21 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods
GT200500155A (es) * 2004-06-16 2006-05-15 Terapia del càncer resistente al platino
KR20170054551A (ko) 2004-07-22 2017-05-17 제넨테크, 인크. Ｈｅｒ２ 항체 조성물
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
RU2412947C2 (ru) 2004-09-23 2011-02-27 Дженентек, Инк. Антитела, сконструированные на основе цистеинов, и их конъюгаты
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2006063042A2 (en) * 2004-12-07 2006-06-15 Genentech, Inc. Selecting patients for therapy with a her inhibitor
UA94899C2 (ru) 2005-01-21 2011-06-25 Дженентек, Инк. Фиксированное дозирование антител к her
RS53128B (en) 2005-02-23 2014-06-30 Genentech Inc. Extending the time of disease progression or survival in patients with ovarian cancers using PERTUZUMAB
AR053272A1 (es) * 2005-05-11 2007-04-25 Hoffmann La Roche Determinacion de responsivos a la quimioterapia
AU2006255686A1 (en) 2005-06-06 2006-12-14 Genentech, Inc. Transgenic models for different genes and their use for gene characterization
US7700299B2 (en) 2005-08-12 2010-04-20 Hoffmann-La Roche Inc. Method for predicting the response to a treatment
WO2007021423A2 (en) 2005-08-15 2007-02-22 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
KR101164820B1 (ko) 2005-09-22 2012-07-12 삼성전자주식회사 디스플레이장치
US8080534B2 (en) 2005-10-14 2011-12-20 Phigenix, Inc Targeting PAX2 for the treatment of breast cancer
ZA200804162B (en) 2005-11-21 2009-12-30 Genentech Inc Novel gene disruptions, compositions and methods relating thereto
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
AU2007233263A1 (en) 2006-02-17 2007-10-11 Genentech, Inc. Gene disruptons, compositions and methods relating thereto
TW200812615A (en) 2006-03-22 2008-03-16 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an antibody for vascular endothelial growth factor and an antibody for human epithelial growth factor receptor type 2
AR060358A1 (es) 2006-04-06 2008-06-11 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinazolinas para la inhibicion de pdk 1
WO2008036437A2 (en) 2006-04-19 2008-03-27 Genentech, Inc. Novel gene disruptions, compositions and methods relating thereto
CN103030696B (zh) 2006-05-30 2016-09-28 健泰科生物技术公司 抗体和免疫偶联物及其用途
MX2008015581A (es) * 2006-06-05 2008-12-17 Genentech Inc Prolongacion de la supervivencia de pacientes con cancer con niveles elevados de egf o tgf-alfa.
SG174090A1 (en) 2006-08-21 2011-09-29 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an anti-vegf antibody
WO2008031531A1 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor therapy with a combination of anti-her2 antibodies
CN103396486A (zh) * 2006-10-12 2013-11-20 中外制药株式会社 使用抗ereg抗体的癌症的诊断和治疗
PL2845866T3 (pl) 2006-10-27 2017-10-31 Genentech Inc Przeciwciała i immunokoniugaty oraz ich zastosowanie
SI2132573T1 (sl) 2007-03-02 2014-07-31 Genentech, Inc. Napovedovanje odziva na inhibitor dimerizacije HER na osnovi nizke ekspresije HER3
DK2171090T3 (da) 2007-06-08 2013-06-10 Genentech Inc Genekspressionsmarkører for tumorresistens over for HER2-inhibitorbehandling
US9551033B2 (en) 2007-06-08 2017-01-24 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to HER2 inhibitor treatment
EP2069795A4 (en) * 2007-06-18 2010-10-06 Medimmune Llc SYNERGISTIC TREATMENT OF EPHA2 AND ERBB2 EXPRESSIVE CELLS
CL2008002085A1 (es) 2007-07-16 2008-11-21 Genentech Inc Anticuerpo humanizado anti-cd79b/igbeta/b29; polinucleotido codificacnte, vector, celula huesped; metodo de fabricacion; inmunoconjugado; composicion farmaceutica; uso para tratar cancer; metodo in vitro para determinar presencia de cd79b, oinhibir crecimiento de celulas quqe expresa cd79b; ensayo in vitro para detectar celulas b
AU2008276128B2 (en) 2007-07-16 2013-10-10 Genentech, Inc. Humanized anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
EP3441402A1 (en) 2007-10-30 2019-02-13 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography
JP2011504740A (ja) * 2007-11-27 2011-02-17 アブリンクス エン．ヴェー． ヘテロ二量体サイトカイン及び／又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド
PE20091523A1 (es) 2007-12-20 2009-10-29 Novartis Ag Derivados de tiazol como inhibidores de la enzima fosfatidilinositol 3-cinasa (pi3k)
PE20091174A1 (es) * 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
US8574577B2 (en) 2008-01-03 2013-11-05 The Scripps Research Institute VEGF antibodies comprising modular recognition domains
WO2009088805A2 (en) 2008-01-03 2009-07-16 The Scripps Research Institute Antibody targeting through a modular recognition domain
US8557242B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute ERBB2 antibodies comprising modular recognition domains
US8454960B2 (en) 2008-01-03 2013-06-04 The Scripps Research Institute Multispecific antibody targeting and multivalency through modular recognition domains
US8557243B2 (en) 2008-01-03 2013-10-15 The Scripps Research Institute EFGR antibodies comprising modular recognition domains
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
HUE029869T2 (hu) 2008-01-31 2017-04-28 Genentech Inc Anti-CD79B antitestek és immunkonjugátumok, valamint alkalmazási eljárások
KR101881168B1 (ko) 2008-03-14 2018-07-24 제넨테크, 인크. 약물 저항성과 관련된 유전적 변이
MY188477A (en) * 2008-03-18 2021-12-13 Genentech Inc Combinations of an anti-her2 antibody-drug conjugate and chemotherapeutic agents, and methods of use
RU2553225C2 (ru) 2008-05-23 2015-06-10 Сива Корпорейшн Способ облегчения регенерации
BRPI0812682A2 (pt) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc tratamento de cáncer de mama metastático
KR20110076918A (ko) 2008-09-10 2011-07-06 제넨테크, 인크. 단백질의 산화성 분해를 방지하기 위한 조성물 및 방법
ES2738700T3 (es) 2009-02-13 2020-01-24 Immunomedics Inc Inmunoconjugados con un enlace escindible intracelularmente
SG10201402742YA (en) 2009-03-20 2014-08-28 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
CN102471380B (zh) 2009-04-01 2015-01-14 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗FcRH5抗体和免疫偶联物及使用方法
SG175078A1 (en) 2009-04-07 2011-11-28 Roche Glycart Ag Bispecific anti-erbb-1/anti-c-met antibodies
US20120141501A1 (en) 2009-05-29 2012-06-07 Forerunner Pharma Research Co. Ltd Pharmaceutical Composition Containing Antagonist of EGF Family Ligand as Component
EP2435071A1 (en) 2009-05-29 2012-04-04 F. Hoffmann-La Roche AG Modulators for her2 signaling in her2 expressing patients with gastric cancer
US8293753B2 (en) 2009-07-02 2012-10-23 Novartis Ag Substituted 2-carboxamide cycloamino ureas
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
US8512983B2 (en) 2009-08-11 2013-08-20 Martin Gawlitzek Production of proteins in glutamine-free cell culture media
AU2010284446A1 (en) * 2009-08-15 2012-03-08 Genentech, Inc. Anti-angiogenesis therapy for the treatment of previously treated breast cancer
PL2473617T3 (pl) 2009-09-01 2020-06-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Ulepszone oczyszczanie białka poprzez zmodyfikowaną elucję z białka A
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
TR201804897T4 (tr) 2009-10-07 2018-06-21 Macrogenics Inc Fukosi̇lasyon ölçüsünün deği̇şi̇mleri̇nden dolayi geli̇şmi̇ş efektör i̇şlevi̇ sergi̇leyen fc bölgesi̇ni̇ i̇çeren poli̇pepti̇tler ve bunlarin kullanimlarina yöneli̇k yöntemler
TW201122101A (en) * 2009-10-28 2011-07-01 Facet Biotech Corp Anti-EGFR antibodies and their uses
EP2496601B1 (en) 2009-11-05 2017-06-07 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and composition for secretion of heterologous polypeptides
DK2719708T3 (da) 2009-11-13 2018-01-29 Daiichi Sankyo Europe Gmbh Materiale og fremgangsmåder til behandling eller forebyggelse af her-3-relaterede sygdomme
WO2011069104A2 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Genentech, Inc. Multispecific antibodies, antibody analogs, compositions, and methods
MX340014B (es) * 2010-02-04 2016-06-22 Toray Industries Composicion farmaceutica para el tratamiento y/o prevencion del cancer.
MY160556A (en) * 2010-02-18 2017-03-15 Genentech Inc Neuregulin antagonists and use thereof in treating cancer
US8609095B2 (en) 2010-03-04 2013-12-17 Symphogen A/S Anti-HER2 antibodies and compositions
TR201905081T4 (tr) 2010-03-22 2019-05-21 Hoffmann La Roche Protein içeren formülasyonların stabilizasyonu için yararlı bileşimler ve yöntemler.
BR112012027828A2 (pt) 2010-05-03 2016-08-09 Genentech Inc composição de matéria, artigo de fabricação e método de redução da viscosidade de uma formulação contendo proteína e de preparação de uma formulação aquosa contendo proteína
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
WO2011147986A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
CA2800769C (en) 2010-05-27 2021-11-02 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2 epitope
HUE030820T2 (hu) 2010-05-28 2017-06-28 Hoffmann La Roche Laktát-szint csökkentése és polipeptid-termelés fokozása laktát-dehidrogenáz és piruvát-dehidrogenáz-kináz expressziójának leszabályozásával
CA2795972A1 (en) 2010-06-03 2011-12-08 Genentech, Inc. Immuno-pet imaging of antibodies and immunoconjugates and uses therefor
CN114246952A (zh) 2010-06-08 2022-03-29 基因泰克公司 半胱氨酸改造的抗体和偶联物
EP3586826B1 (en) 2010-06-24 2021-05-12 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods for stabilizing protein-containing formulations
US20120100166A1 (en) 2010-07-15 2012-04-26 Zyngenia, Inc. Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof
AR082418A1 (es) 2010-08-02 2012-12-05 Novartis Ag Formas cristalinas de 1-(4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il)-amida de 2-amida del acido (s)-pirrolidin-1,2-dicarboxilico
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
US8721571B2 (en) 2010-11-22 2014-05-13 Siwa Corporation Selective removal of cells having accumulated agents
WO2012069466A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Novartis Ag Multispecific molecules
CN103380144B (zh) 2010-12-21 2016-03-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 同等型富集的抗体制备物及其获得方法
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
EP2655414B1 (en) 2010-12-23 2018-08-29 Roche Diagniostics GmbH Bispecific binding agent
PT2670753T (pt) 2011-01-31 2017-01-10 Novartis Ag Novos derivados heterocíclicos
CN103649326B (zh) * 2011-03-08 2016-08-17 宾夕法尼亚大学理事会 用于治疗和诊断用途的抗体样蛋白
CA2832389A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
EP2714738B1 (en) 2011-05-24 2018-10-10 Zyngenia, Inc. Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
BR112014003431A2 (pt) 2011-08-17 2017-06-13 Genentech Inc anticorpo, ácido nucleico, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, imunoconjugado, formulação farmacêutica, agente farmacêutico, uso do anticorpo, método de tratamento de um indivíduo que tem câncer e método de aumento de tempo para recorrência de tumor
CN104334189A (zh) 2011-10-14 2015-02-04 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Her2二聚化抑制剂帕妥珠单抗的用途和包含her2二聚化抑制剂帕妥珠单抗的制品
US9327023B2 (en) 2011-10-25 2016-05-03 The Regents Of The University Of Michigan HER2 targeting agent treatment in non-HER2-amplified cancers having HER2 expressing cancer stem cells
CN104039790B (zh) 2011-10-28 2016-04-13 诺华股份有限公司 嘌呤衍生物及它们在治疗疾病中的应用
US9220775B2 (en) 2011-11-23 2015-12-29 Medimmune Llc Binding molecules specific for HER3 and uses thereof
KR20140098834A (ko) 2011-11-30 2014-08-08 제넨테크, 인크. 암에서의 erbb3 돌연변이
WO2013083810A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Identification of non-responders to her2 inhibitors
US10364268B2 (en) 2011-12-22 2019-07-30 Genentech, Inc. Ion exchange membrane chromatography
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
JP2015506955A (ja) 2012-01-31 2015-03-05 スミスクライン ビーチャム （コーク） リミテッド がんを治療する方法
EP2638916A1 (en) 2012-03-16 2013-09-18 Covagen AG Novel binding molecules with antitumoral activity
WO2013148315A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
NZ630568A (en) 2012-04-20 2017-06-30 Merus Nv Methods and means for the production of ch3 domain-comprising molecules
KR101505157B1 (ko) * 2012-05-08 2015-03-24 주식회사 종근당 항―ＥｒｂＢ２ 항체 변이체
EP2849756A1 (en) 2012-05-16 2015-03-25 Novartis AG Dosage regimen for a pi-3 kinase inhibitor
KR102291355B1 (ko) 2012-11-30 2021-08-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-l1 억제제 공동치료를 필요로 하는 환자의 식별방법
US20150329524A1 (en) 2013-01-10 2015-11-19 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Fatty acid synthase inhibitors
US9180185B2 (en) 2013-01-11 2015-11-10 Hoffman-La Roche Inc. Combination therapy of anti-HER3 antibodies
MX2015013163A (es) 2013-03-15 2016-04-04 Zyngenia Inc Complejos multiespecificos multivalente y monovalentes y sus usos.
CN104628846B (zh) 2013-11-06 2019-12-06 三生国健药业（上海）股份有限公司 重组蛋白质的纯化方法
RU2656161C1 (ru) 2013-11-19 2018-05-31 Ремеджен, Лтд. Анти-неr2 антитело и его конъюгат
US10947319B2 (en) 2013-11-27 2021-03-16 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2
EP3076969B1 (en) 2013-12-06 2021-09-01 Novartis AG Dosage regimen for an alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor
ES2727351T3 (es) 2014-01-31 2019-10-15 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de fármaco-anticuerpo dirigido contra HER2
WO2015128837A1 (en) 2014-02-26 2015-09-03 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Methods of treating cancer patients responding to ezh2 inhibitor gsk126
JP6644717B2 (ja) 2014-03-14 2020-02-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 異種ポリペプチドを分泌させるための方法及び組成物
MX2016012830A (es) 2014-04-11 2017-01-05 Medimmune Llc Anticuerpos contra el receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (her2) biespecificos.
EP3388449A3 (en) 2014-09-12 2018-10-24 F. Hoffmann-La Roche AG Cysteine engineered antibodies and conjugates
US10385380B2 (en) 2014-10-02 2019-08-20 The Regents Of The University Of California Personalized protease assay to measure protease activity in neoplasms
US10358502B2 (en) 2014-12-18 2019-07-23 Siwa Corporation Product and method for treating sarcopenia
US9993535B2 (en) 2014-12-18 2018-06-12 Siwa Corporation Method and composition for treating sarcopenia
KR101515535B1 (ko) 2015-01-28 2015-05-06 주식회사 종근당 항―ＥｒｂＢ２ 항체 변이체
MA41414A (fr) 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
CA2984458A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 Zymeworks Inc. Antigen-binding constructs targeting her2
EP3331919A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination therapy comprising anti ctla-4 antibodies
BR112018007422A2 (pt) * 2015-10-13 2018-10-30 Siwa Corp anticorpos anti-age e métodos de uso dos mesmos
KR20180073674A (ko) 2015-11-02 2018-07-02 노파르티스 아게 포스파티딜이노시톨 3-키나제 억제제에 대한 투여 요법
CN106729743B (zh) 2015-11-23 2021-09-21 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗ErbB2抗体-药物偶联物及其组合物、制备方法和应用
CA3006934A1 (en) 2015-12-01 2017-06-08 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination of antibodies targeting bcma, pd-1 and ox40 in cancer treatments and uses therof
KR102424513B1 (ko) 2015-12-14 2022-07-25 마크로제닉스, 인크. Pd-1 및 ctla-4과의 면역반응성을 가진 이중특이적 분자, 및 이것의 사용 방법
CN105646704B (zh) * 2015-12-28 2019-11-15 广西医科大学 抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26、乳腺特异性表达载体、转基因FVB小鼠及其制备方法
EP3337829B1 (en) 2016-02-19 2020-01-08 Siwa Corporation Method and composition for treating cancer, killing metastatic cancer cells and preventing cancer metastasis using antibody to advanced glycation end products (age)
WO2017160990A1 (en) * 2016-03-15 2017-09-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating er+, her2-, hrg+ breast cancer using combination therapies comprising an anti-erbb3 antibody
KR20180133452A (ko) 2016-04-15 2018-12-14 시와 코퍼레이션 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 항-노화 항체
EP3454863A1 (en) 2016-05-10 2019-03-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations therapies for the treatment of cancer
WO2017196263A1 (en) * 2016-05-12 2017-11-16 Agency For Science, Technology And Research Anti-erbb-2 antibodies and uses thereof
EP3475306A1 (en) 2016-06-23 2019-05-01 Siwa Corporation Vaccines for use in treating various diseases and disorders
WO2018060833A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Novartis Ag Dosage regimen for alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor alpelisib
JPWO2018066626A1 (ja) 2016-10-07 2019-07-18 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ２抗体−薬物コンジュゲート投与による耐性癌の治療
TW201828993A (zh) 2016-12-12 2018-08-16 日商第一三共股份有限公司 抗體－藥物結合物與免疫檢查點抑制劑之組合
US10995151B1 (en) 2017-01-06 2021-05-04 Siwa Corporation Methods and compositions for treating disease-related cachexia
US10961321B1 (en) 2017-01-06 2021-03-30 Siwa Corporation Methods and compositions for treating pain associated with inflammation
JP7069476B2 (ja) * 2017-01-06 2022-05-18 博奥信生物技▲術▼（南京）有限公司 ＥｒｂＢ２抗体およびその使用
US10925937B1 (en) 2017-01-06 2021-02-23 Siwa Corporation Vaccines for use in treating juvenile disorders associated with inflammation
US10858449B1 (en) 2017-01-06 2020-12-08 Siwa Corporation Methods and compositions for treating osteoarthritis
US11459394B2 (en) 2017-02-24 2022-10-04 Macrogenics, Inc. Bispecific binding molecules that are capable of binding CD137 and tumor antigens, and uses thereof
TW201834649A (zh) 2017-03-02 2018-10-01 新加坡商亞獅康私人有限公司 癌症療法
EP3589661B1 (en) 2017-03-02 2023-11-01 Genentech, Inc. Adjuvant treatment of her2-positive breast cancer
WO2018175752A1 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Genentech, Inc. Optimized antibody compositions for treatment of ocular disorders
EP3609923A1 (en) 2017-04-13 2020-02-19 Siwa Corporation Humanized monoclonal advanced glycation end-product antibody
WO2018222135A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Aslan Pharmaceuticals Pte Ltd Cancer therapy
CN107417791B (zh) * 2017-08-17 2020-09-22 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 抗人ErbB2双特异性抗体、其制备方法及用途
US20210128741A1 (en) 2017-08-23 2021-05-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate preparation and lyophilization for same
EP3677568A4 (en) 2017-08-31 2021-05-12 Daiichi Sankyo Company, Limited INNOVATIVE PROCESS FOR THE PRODUCTION OF AN ANTIBODY-ACTIVE CONJUGATE
CA3073924C (en) 2017-08-31 2023-10-17 Daiichi Sankyo Company, Limited Improved method for producing antibody-drug conjugate
CN107789631B (zh) * 2017-11-03 2021-03-16 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 抗人ErbB2双表位抗体-药物偶联物及其应用
BR112020011810A2 (pt) 2017-12-12 2020-11-17 Macrogenics, Inc. molécula de ligação cd16 x antígeno de doença, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, e método para o tratamento de uma doença
US11518801B1 (en) 2017-12-22 2022-12-06 Siwa Corporation Methods and compositions for treating diabetes and diabetic complications
CN111787949A (zh) 2018-02-15 2020-10-16 宏观基因有限公司 变体cd3-结合结构域及其在用于治疗疾病的组合疗法中的用途
EP3560945A1 (en) 2018-04-27 2019-10-30 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for purification of polypeptides using polysorbates
EP3804764A4 (en) 2018-05-28 2022-04-06 Daiichi Sankyo Company, Limited TREATMENT OF HER2 MUTANT CANCER BY ADMINISTRATION OF ANTI-HER2 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
CA3106995A1 (en) 2018-07-23 2020-01-30 Trevi Therapeutics, Inc. Treatment of chronic cough, breathlessness, or dyspnea with nalbuphine compositions
BR112021001194A2 (pt) 2018-07-25 2021-04-27 Daiichi Sankyo Company, Limited métodos para produzir um conjugado anticorpo-fármaco e para produzir uma composição farmacêutica
JP7406488B2 (ja) 2018-07-27 2023-12-27 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質
TWI822822B (zh) 2018-07-31 2023-11-21 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之用途
US20210290775A1 (en) 2018-08-06 2021-09-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and tubulin inhibitor
JP7481255B2 (ja) 2018-08-23 2024-05-10 第一三共株式会社 抗体薬物複合体の感受性マーカー
KR20210064325A (ko) 2018-09-25 2021-06-02 에이비에스씨아이, 엘엘씨 단백질 정제 방법
WO2020084503A1 (en) 2018-10-26 2020-04-30 Cadila Healthcare Limited A composition comprising antibody with reduced level of basic variants thereof
AU2019396895A1 (en) 2018-12-11 2021-07-08 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate with PARP inhibitor
JPWO2020130125A1 (ja) 2018-12-21 2021-11-04 第一三共株式会社 抗体−薬物コンジュゲートとキナーゼ阻害剤の組み合わせ
CN113795512A (zh) 2019-02-01 2021-12-14 葛兰素史克知识产权开发有限公司 包含贝兰他单抗莫福汀和抗ox4抗体的癌症组合治疗及其用途和方法
AU2020254582A1 (en) 2019-04-01 2021-09-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for stabilizing protein-containing formulations
CN112007169B (zh) * 2019-05-30 2022-03-08 湖南大学 一种核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途
CN110205302B (zh) * 2019-06-24 2021-03-23 扬州大学 一株分泌抗麦考酚酸单克隆抗体的细胞株、其单克隆抗体及其应用
MX2021015651A (es) 2019-06-26 2022-06-14 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Proteinas de union a la proteina accesoria del receptor de interleucina-1 (il1rap).
CN110551214A (zh) * 2019-08-27 2019-12-10 杨澜 一种人源化抗Periostin单克隆抗体、及其制备方法和应用
CA3167689A1 (en) 2020-01-28 2021-08-05 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatments and uses and methods thereof
WO2021260582A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
BR112022026205A2 (pt) 2020-06-24 2023-03-14 Astrazeneca Uk Ltd Produto farmacêutico, uso de um conjugado anticorpo anti-her2-fármaco ou um inibidor de atr na fabricação de um medicamento, e, método de tratamento do câncer
WO2021260583A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
CN116615248A (zh) 2020-06-24 2023-08-18 阿斯利康(英国)有限公司 抗体-药物缀合物和cdk9抑制剂的组合
US20230256110A1 (en) 2020-06-24 2023-08-17 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and atm inhibitor
KR20230042055A (ko) 2020-07-20 2023-03-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 her2 항체-약물 콘주게이트와 her 이량체화 저해제의 조합
MX2023004047A (es) 2020-10-09 2023-04-27 Astrazeneca Uk Ltd Combinacion de conjugado de anticuerpo-farmaco e inhibidor selectivo de poli(adp-ribosa)polimerasas 1 (parp1).
IL302812A (en) 2020-11-11 2023-07-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Antibody-drug conjugate combinations with anti-SIRP alpha antibody
WO2023100829A1 (ja) 2021-11-30 2023-06-08 第一三共株式会社 プロテアーゼ分解性マスク抗体
TW202333800A (zh) 2021-12-28 2023-09-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及rasg12c抑制劑之組合
KR20240141757A (ko) 2022-02-09 2024-09-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 환경 응답성 마스킹 항체 및 그 이용
WO2023209591A1 (en) 2022-04-27 2023-11-02 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate with ezh1 and/or ezh2 inhibitor
WO2023218378A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of an antibody specific for a tumor antigen and a cd47 inhibitor
WO2024023750A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and bispecific checkpoint inhibitor
CN117224689B (zh) * 2023-11-16 2024-02-23 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 联合抗her2抗体和化疗剂治疗胃癌的用途

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
EP0171407B1 (en) 1984-01-30 1993-11-18 Imperial Cancer Research Technology Limited Improvements relating to growth factors
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5401638A (en) 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4968603A (en) 1986-12-31 1990-11-06 The Regents Of The University Of California Determination of status in neoplastic disease
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US5824311A (en) 1987-11-30 1998-10-20 Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of tumors with monoclonal antibodies against oncogene antigens
US5720937A (en) * 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
JP3040121B2 (ja) * 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
WO1990014357A1 (en) 1989-05-19 1990-11-29 Genentech, Inc. Her2 extracellular domain
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
ATE135373T1 (de) 1989-09-08 1996-03-15 Univ Johns Hopkins Modifikationen der struktur des egf-rezeptor-gens in menschlichen glioma
JP3208427B2 (ja) 1989-09-29 2001-09-10 オー・エス・アイ・ファーマシューテイカルズ・インコーポレイテッド ヒトの生物学的流体中のｎｅｕ関連タンパク質の検出及び定量
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) * 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JPH06507398A (ja) 1991-05-14 1994-08-25 リプリジェン　コーポレーション Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体
IL101943A0 (en) 1991-05-24 1992-12-30 Genentech Inc Structure,production and use of heregulin
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5264586A (en) 1991-07-17 1993-11-23 The Scripps Research Institute Analogs of calicheamicin gamma1I, method of making and using the same
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
DE69334351D1 (de) 1992-02-06 2011-05-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches Bindeprotein für Tumormarker
WO1993016177A1 (en) 1992-02-11 1993-08-19 Cell Genesys, Inc. Homogenotization of gene-targeting events
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
JPH08504172A (ja) 1992-06-30 1996-05-07 オンコロジクス，インコーポレイティド 抗−ｅｒｂＢ−２モノクロナール抗体の組み合わせ物及び使用方法
CA2140280A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Avi J. Ashkenazi Bispecific immunoadhesins
FR2697752B1 (fr) * 1992-11-10 1995-04-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Compositions antitumorales contenant des dérivés du taxane.
DE69329503T2 (de) 1992-11-13 2001-05-03 Idec Pharma Corp Therapeutische Verwendung von chimerischen und markierten Antikörpern, die gegen ein Differenzierung-Antigen gerichtet sind, dessen Expression auf menschliche B Lymphozyt beschränkt ist, für die Behandlung von B-Zell-Lymphoma
CA2103323A1 (en) 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
DE69326937T2 (de) 1993-03-24 2000-12-28 Berlex Biosciences, Richmond Kombination von Antihormonale und bindende Moleküle zur Krebsbehandlung
AU6527894A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Prevention of tumors with monoclonal antibodies against (neu)
AU697142B2 (en) 1993-11-23 1998-10-01 Genentech Inc. Protein tyrosine kinases named Rse
DE69428764T2 (de) 1993-12-24 2002-06-20 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5910486A (en) 1994-09-06 1999-06-08 Uab Research Foundation Methods for modulating protein function in cells using, intracellular antibody homologues
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
EP1241264A1 (en) 1994-12-02 2002-09-18 Chiron Corporation Monoclonal antibodies to colon cancer antigen
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
CA2222231A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
WO1997000271A1 (en) 1995-06-14 1997-01-03 The Regents Of The University Of California Novel high affinity human antibodies to tumor antigens
WO1997004801A1 (en) 1995-07-27 1997-02-13 Genentech, Inc. Stabile isotonic lyophilized protein formulation
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
CA2257839C (en) * 1996-07-12 2012-10-23 Genentech, Inc. Gamma-heregulin
KR100539030B1 (ko) * 1996-08-12 2005-12-27 셀진 코포레이션 면역치료제 및 이를 이용하여 사이토카인 농도를 감소시키는 방법
EP0931147A1 (en) * 1996-10-18 1999-07-28 Genentech, Inc. ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
WO1999019488A1 (en) 1997-10-15 1999-04-22 Children's Medical Center Corporation Novel human egf receptors and use thereof
ZA9811162B (en) * 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
US6316462B1 (en) * 1999-04-09 2001-11-13 Schering Corporation Methods of inducing cancer cell death and tumor regression
DE60040981D1 (de) * 1999-05-14 2009-01-15 Genentech Inc BEHANDLUNG MIT ANTI-ErbB2 ANTIKÖRPERN
JP4579471B2 (ja) * 1999-06-25 2010-11-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いる前立腺癌の処置
WO2001000245A2 (en) * 1999-06-25 2001-01-04 Genentech, Inc. HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
BRPI0012196B8 (pt) * 1999-06-25 2021-05-25 Genentech Inc artigo industrializado
TR200200472T2 (tr) * 1999-08-27 2002-06-21 Genentech, Inc. Anti-Erb B2 antikorları ile tedavi için dozajlar

Also Published As

Publication number Publication date
KR100850389B1 (ko) 2008-08-04
IL146954A (en) 2009-09-22
RU2005132788A (ru) 2007-04-27
PL352321A1 (en) 2003-08-11
CZ299702B6 (cs) 2008-10-22
CN101121021A (zh) 2008-02-13
BRPI0012198B8 (pt) 2021-05-25
CN101121021B (zh) 2011-12-07
EP1189641A2 (en) 2002-03-27
GB2368796B (en) 2004-08-04
HUP0201695A2 (en) 2002-09-28
EP2112167A3 (en) 2010-12-22
CZ20014596A3 (cs) 2003-02-12
ZA200109786B (en) 2002-11-28
AT500848A1 (de) 2006-04-15
RU2270029C2 (ru) 2006-02-20
MXPA01013458A (es) 2002-07-30
NO20016329L (no) 2002-02-25
NO328377B1 (no) 2010-02-08
NZ516830A (en) 2004-07-30
WO2001000245A3 (en) 2001-10-25
NO20016329D0 (no) 2001-12-21
BR122014028365B1 (pt) 2020-01-28
BR122014028365B8 (pt) 2021-07-06
CN101518653A (zh) 2009-09-02
DK1189641T3 (da) 2009-11-16
NO336040B1 (no) 2015-04-27
KR100797308B1 (ko) 2008-01-23
KR20070094993A (ko) 2007-09-27
AT500848B1 (de) 2008-01-15
GB2368796A (en) 2002-05-15
IL146954A0 (en) 2002-08-14
TR200103756T2 (tr) 2002-06-21
CH694589A5 (de) 2005-04-15
PL204629B1 (pl) 2010-01-29
DE10084743T1 (de) 2002-08-14
IL197359A0 (en) 2011-07-31
SI1189641T1 (sl) 2009-12-31
BE2013C020I2 (hu) 2019-08-21
EP2112167A2 (en) 2009-10-28
DE60042648D1 (de) 2009-09-10
JP2003503366A (ja) 2003-01-28
ZA200110263B (en) 2003-02-26
BR0012198A (pt) 2002-04-02
CA2727172A1 (en) 2001-01-04
JP2009142280A (ja) 2009-07-02
CY1109525T1 (el) 2014-08-13
KR20020068264A (ko) 2002-08-27
HK1044888A1 (en) 2002-11-08
NO2013005I1 (no) 2013-04-02
WO2001000245A2 (en) 2001-01-04
ATE437655T1 (de) 2009-08-15
ES2329437T3 (es) 2009-11-26
NZ531426A (en) 2005-10-28
AU2005242195A1 (en) 2006-01-12
AR024464A1 (es) 2002-10-02
NO2013005I2 (no) 2013-03-12
CN101518653B (zh) 2015-08-19
CY2013010I1 (el) 2015-08-05
RU2430739C2 (ru) 2011-10-10
AU784045B2 (en) 2006-01-19
CN101121750A (zh) 2008-02-13
CN1370082A (zh) 2002-09-18
FR13C0016I2 (fr) 2014-05-16
RU2430739C9 (ru) 2015-12-20
EP1189641B1 (en) 2009-07-29
SI2283867T1 (sl) 2014-07-31
FR13C0016I1 (hu) 2013-04-12
CA2376596A1 (en) 2001-01-04
CN100340575C (zh) 2007-10-03
CA2376596C (en) 2009-10-06
AU2005242195B2 (en) 2009-06-11
AU5763200A (en) 2001-01-31
HUP0201695A3 (en) 2005-06-28
PT1189641E (pt) 2009-11-04
DK1189641T5 (da) 2011-04-11
GB0200506D0 (en) 2002-02-27
PL203326B1 (pl) 2009-09-30
GEP20104998B (en) 2010-06-10
LU92164I2 (fr) 2013-05-07
CY2013010I2 (el) 2015-08-05
BRPI0012198B1 (pt) 2016-12-20
NO20091792L (no) 2002-02-25
SI2283866T1 (sl) 2015-07-31
JP4283474B2 (ja) 2009-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU226742B1 (en) Humanized anti-erbb2 antibodies and treatment with anti-erbb2 antibodies
JP5069843B2 (ja) 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いる処置に応答性である腫瘍を同定するための方法
JP4969440B2 (ja) 疼痛治療のためのＥｒｂＢアンタゴニスト
KR100754049B1 (ko) 전립선암을 치료하기 위한 약제 제조에 사용되는 항-ErbB2 항체 및 조성물
US7537931B2 (en) Humanized anti-ERBB2 antibodies and treatment with anti-ERBB2 antibodies
US20040013667A1 (en) Treatment with anti-ErbB2 antibodies
KR20180107323A (ko) 항-ＥｒｂＢ２ 항체를 이용한 치료 방법
JP2008188013A (ja) 抗ＥｒｂＢ２抗体
NO20151725L (no) Rekombinant, humanisert antistoff 2C4 (rhuMab 2C4) for anvendelse sammen med et andre, forskjellig vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoff i en fremgangsmåte for behandling av kreft i en pasient og anvendelse derav for fremstilling av et medikament

Legal Events

Date Code Title Description
AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: NINCS ANGOL CIME!; FIRST REG. NO: EU/1/13/813/001 20130304

Spc suppl protection certif: S1300005

Filing date: 20130312

Expiry date: 20200623

FG4S Grant of supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: PERJETA (PERTUZUMAB); REGISTRATION NO/DATE: EU/1/13/813/001 20130304

Spc suppl protection certif: S1300005

Filing date: 20130312

Expiry date: 20200623

Extension date: 20250623