CN103396486A - 使用抗ereg抗体的癌症的诊断和治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了癌症的诊断方法，其特征在于：检测epiregulin(EREG)蛋白质。发现EREG在大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌或肾癌中以非常高的频率、在基因水平和蛋白质水平表达亢进。在本发明的癌症的诊断或治疗中，使用识别EREG蛋白质的抗体。还公开了含有与EREG结合的抗体作为有效成分的药物组合物、细胞增殖抑制剂和抗癌药。进一步公开了通过使EREG表达细胞和与EREG结合的抗体接触，在EREG表达细胞中引发细胞毒的方法和抑制EREG表达细胞的增殖的方法。

Description

使用抗EREG抗体的癌症的诊断和治疗
本申请是原案申请日为2007年10月12日、原案申请号为200780045915.2(PCT/JP2007/069988)、发明名称为“使用抗EREG抗体的癌症的诊断和治疗”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及癌症的诊断和治疗方法、以及细胞增殖抑制剂和抗癌药。
背景技术
丰田等人纯化的上皮细胞成长因子(epidermal growth factor，以下记作EGF)家族的成员被命名为epiregulin(EREG)。已知EREG发挥诱导Hela细胞的形态变化的癌增殖抑制因子的作用(非专利文献1)。由丰田等人纯化的来自小鼠的EREG(成熟蛋白质)的氨基酸序列包含46个氨基酸残基，与EGF家族的其它成员显示出24％～50％左右的序列同源性。另外，小鼠EREG对人上皮癌细胞株A431细胞上的EGF受体显示出低亲和性。在丰田等人进行的人EREG基因的克隆和表达分析中显示：其它EGF家族成员在人组织中普遍表达，相对于此，在巨噬细胞、胎盘、各种癌细胞中可检测到EREG的表达(非专利文献2)。另外，有人公开了可溶型EREG对几种癌细胞具有增殖抑制效果(WO94/29340)。
高桥等人揭示了：Erk(MPK3)和p38(MAPK14)在大鼠的分化型动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，以下记作VSMC)中的活化诱导细胞的去分化。并且证实VSMC分泌的EREG发挥自分泌和/或旁分泌分化因子的作用。另外，有可能发挥VSMC的分化因子作用的不饱和溶血磷脂酸和PDGFB同型二聚体，以Erk-和p38 Mapk-依赖型的方式迅速增量调节EREG的mRNA表达。逆转录酶-多聚酶链式反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction；以下记作RT-PCR)分析和免疫组织化学(immunohistochemical，immunohistochemistry；以下记作IHC)分析明确了：EREG在动脉粥样硬化血管或气囊损伤大鼠动脉中的局限性表达。根据上述结果，高桥等人推测：EREG参与了动脉粥样硬化等血管重建进程(非专利文献3)。
Minn等人基于体内选择、转录组分析、功能分析和临床研究，鉴定了几个与乳癌的肺转移相关的基因簇，明确了其中的一个分子为EREG(非专利文献4)。
白泽等人进一步明确：EREG不仅在角质形成细胞中表达，还在组织巨噬细胞中表达；以及EREG缺失小鼠出现慢性皮炎的症状。通过本小鼠的分析中的诸多研究显示：在与外部环境的边界(boundary)，EREG在角质形成细胞和巨噬细胞引起的免疫和炎症相关应答中发挥重要作用(非专利文献5)。
如上所述，明确了皮炎、癌转移、动脉粥样硬化与EREG的相关性。但迄今为止，关于与EREG结合且具有中和活性和细胞毒活性的抗体对表达EREG的癌细胞的影响，则没有具体的记载。
非专利文献1：J.Biol.Chem.270：7495-7500，1995
非专利文献2：Biochem.J.326：69-75，1997
非专利文献3：Circulation 108：2524-2529，2003
非专利文献4：Nature 436：518-524，2005
非专利文献5：Proc.Nat.Acad.Sci.101：13921-13926，2004
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供抗EREG抗体及其用途。更详细而言，其目的在于提供使用抗EREG抗体诊断和治疗癌症的新型方法、含有抗EREG抗体的新型细胞增殖抑制剂和抗癌药、以及新型抗EREG抗体。
解决课题的方法
本发明人等发现：EREG在大肠癌等癌细胞中高度表达。并且，在测定抗EREG抗体的补体依赖性细胞毒(complement-dependentcytotoxicity；CDC)活性以及抗体依赖性细胞毒(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity；ADCC)活性时，发现抗EREG抗体对EREG表达细胞具有CDC活性和ADCC活性。另外明确了：抗EREG抗体对癌细胞株具有中和作用所产生的增殖抑制效果。根据上述认识，本发明人等进一步发现：抗EREG抗体对原发性或转移性的各种癌症的诊断、预防和治疗有效，从而完成了本发明。更具体而言，本发明人等发现：EREG可用作用于治疗或诊断包括大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌在内的EREG表达亢进的癌症的手段，从而完成了本发明。
本发明提供含有与EREG蛋白质结合的抗体作为有效成分的药物组合物。本发明还提供含有与EREG蛋白质结合的抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂。本发明又提供含有与EREG蛋白质结合的抗体作为有效成分的抗癌药。优选与EREG蛋白质结合的抗体为具有细胞毒活性的抗体。进一步优选该抗体为进一步具有中和活性的抗体。在本发明的优选方式中，可作为治疗对象的癌症为大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌。基于本发明的含有抗EREG抗体的抗癌药对上述EREG表达亢进的癌症、即原发性或转移性的癌症的治疗有用。本发明中特别优选的治疗对象为原发性大肠癌、转移性大肠癌、胰腺癌。
本发明还提供含有与EREG蛋白质结合的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的药物组合物对EREG表达亢进的癌症的治疗和/或预防有用。即，本发明涉及与EREG蛋白质结合的抗体在制造用于癌症的治疗和/或预防的药物组合物中的应用。
在另一方式中，本发明提供通过使EREG表达细胞和与EREG蛋白质结合的抗体接触而在表达EREG蛋白质的细胞中引发细胞毒的方法。本发明还提供通过使表达EREG蛋白质的细胞和与EREG蛋白质结合的抗体接触来抑制表达EREG蛋白质的细胞增殖的方法。优选与EREG蛋白质结合的抗体为具有细胞毒活性的抗体。还优选表达EREG蛋白质的细胞为癌细胞。
在又一方式中，本发明提供与EREG蛋白质结合、且对表达EREG蛋白质的细胞具有细胞毒活性的抗体。优选该细胞毒活性为ADCC活性。优选该细胞毒活性为CDC活性。本发明还提供结合有细胞毒性物质的抗体。本发明中，作为抗体所结合的细胞毒性物质，可以例示化疗药物、放射性同位素和毒性肽。本发明中的抗体优选为抗体本身具有细胞毒活性的抗体。
本发明进一步提供与EREG蛋白质结合、且对表达EREG蛋白质的细胞具有细胞毒活性、并具有中和活性的抗体。
在另一方式中，本发明提供EREG蛋白质作为癌症诊断标志物的应用。
另外，在又一方式中，本发明提供癌症的诊断方法，其特征在于：使用与EREG蛋白质结合的抗体检测EREG蛋白质。在本发明的方法中，优选检测EREG蛋白质的胞外区。还优选本发明的方法使用识别EREG蛋白质的抗体来进行。在本发明的方法中，优选检测血液中、血清中或血浆中的EREG蛋白质、或从细胞中分离的EREG蛋白质。
在另一方式中，本发明提供癌症的诊断方法，该方法包括以下步骤：
(a)从受试者体内采取试样的步骤；
(b)使用与EREG蛋白质结合的抗体，检测采集的试样中所含的EREG蛋白质的步骤。
本发明中，上述试样只要可以从受试者体内采集即可，可以使用任何试样。在一方式中，使用从受试者体内采集的血液试样。本发明中优选的血液试样为血清。在另一方式中，还使用通过外科或活组织检查(biopsy)从受试者体内采集的试样。该诊断方法所涉及的癌症只要是作为对象的癌细胞表达EREG蛋白质的癌症即可，可以是任何癌症。本发明中优选的癌症为：大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌和肾癌。基于本发明，上述癌症的原发性病灶和转移性病灶均可诊断。特别优选的癌症为原发性大肠癌、转移性大肠癌和胰腺癌。
本发明中，从受试者体内采集试样的步骤也可描述为提供从受试者体内采集的试样的步骤。
在另一方式中，本发明提供癌症的诊断方法，该方法包括：(1)给予受试者用放射性同位素标记的与EREG蛋白质结合的抗体的步骤；以及(2)检测上述放射性同位素的累积的步骤。在某方式中，放射性同位素为正电子发射核素。本发明中优选的正电子发射核素例如可以从11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr和124I中选择。
在另一方式中，本发明提供癌症的诊断方法，其特征在于：检测编码EREG蛋白质的基因的表达。
在又一方式中，本发明提供在本发明的诊断方法中使用的诊断试剂或试剂盒。
此外，本发明提供用于筛选癌症治疗药的候选化合物的方法。在本发明中，例如可以以EREG的表达水平为指标，选择癌症治疗药的候选化合物。或者，还可以以对EREG的细胞增殖刺激作用的中和作用为指标，选择癌症治疗药的候选化合物。
即，本发明提供以下发明。
[1]药物组合物，该药物组合物含有与EREG蛋白质结合的抗体作为有效成分。
[2]细胞增殖抑制剂，该细胞增殖抑制剂含有与EREG蛋白质结合的抗体作为有效成分。
[3]抗癌药，该抗癌药含有与EREG蛋白质结合的抗体作为有效成分。
[4][3]所述的抗癌药，其中，与EREG蛋白质结合的抗体为具有细胞增殖抑制活性的抗体。
[5][3]或[4]所述的抗癌药，其中，与EREG蛋白质结合的抗体为以下(1)～(57)中任一项所述的抗体：
(1)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
(2)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：8的氨基酸序列的117～452位的氨基酸序列。
(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(4)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：14的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
(5)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：18的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(6)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链。
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链。
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链。
(10)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：49的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：51的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：53的氨基酸序列。
(11)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：149的氨基酸序列的118～441位的氨基酸序列。
(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(13)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：55的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：57的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：59的氨基酸序列。
(14)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：151的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(15)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(16)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(13)所述的L链。
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链。
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链。
(19)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：61的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：63的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：65的氨基酸序列。
(20)抗体，该抗体含有(19)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：153的氨基酸序列的116～439位的氨基酸序列。
(21)抗体，该抗体含有(19)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(22)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：67的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：69的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：71的氨基酸序列。
(23)抗体，该抗体含有(22)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：155的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(24)抗体，该抗体含有(22)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(25)抗体，该抗体具有(19)所述的H链和(22)所述的L链。
(26)抗体，该抗体具有(20)所述的H链和(23)所述的L链。
(27)抗体，该抗体具有(21)所述的H链和(24)所述的L链。
(28)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：73的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：75的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：77的氨基酸序列。
(29)抗体，该抗体含有(28)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：157的氨基酸序列的119～442位的氨基酸序列。
(30)抗体，该抗体含有(28)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(31)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：79的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：81的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：83的氨基酸序列。
(32)抗体，该抗体含有(31)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：159的氨基酸序列的109～215位的氨基酸序列。
(33)抗体，该抗体含有(31)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(34)抗体，该抗体具有(28)所述的H链和(31)所述的L链。
(35)抗体，该抗体具有(29)所述的H链和(32)所述的L链。
(36)抗体，该抗体具有(30)所述的H链和(33)所述的L链。
(37)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：85的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：87的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：89的氨基酸序列。
(38)抗体，该抗体含有(37)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：161的氨基酸序列的117～440位的氨基酸序列。
(39)抗体，该抗体含有(37)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(40)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：91的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：93的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：95的氨基酸序列。
(41)抗体，该抗体含有(40)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：163的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(42)抗体，该抗体含有(40)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(43)抗体，该抗体含有(37)所述的H链和(40)所述的L链。
(44)抗体，该抗体含有(38)所述的H链和(41)所述的L链。
(45)抗体，该抗体含有(39)所述的H链和(42)所述的L链。
(46)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：97的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：99的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：101的氨基酸序列。
(47)抗体，该抗体含有(46)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：165的氨基酸序列的113～436位的氨基酸序列。
(48)抗体，该抗体含有(46)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(49)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：103的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：105的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：107的氨基酸序列。
(50)抗体，该抗体含有(49)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：167的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(51)抗体，该抗体含有(49)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(52)抗体，该抗体具有(46)所述的H链和(49)所述的L链。
(53)抗体，该抗体具有(47)所述的H链和(50)所述的L链。
(54)抗体，该抗体具有(48)所述的H链和(51)所述的L链。
(55)抗体，该抗体是在(1)～(54)中任一项所述的抗体中有一个或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(54)中任一项所述的抗体具有同等活性。
(56)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(1)～(55)中任一项所述的抗体所结合的EREG蛋白质的表位相同。
(57)(1)～(56)中任一项所述的抗体的小分子抗体。
[6][3]～[5]中任一项所述的抗癌药，其特征在于：与EREG蛋白质结合的抗体识别SEQ ID NO：21的氨基酸序列中第29位的Ala～第69位的Ser或第63位的Val～第108位的Leu。
[7][3]～[6]中任一项所述的抗癌药，其中，癌症为选自大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌和肾癌中的任一种癌。
[8][7]所述的抗癌药，其中，癌症为原发性癌症。
[9][7]所述的抗癌药，其中，癌症为转移性癌症。
[10]抗体，该抗体与EREG蛋白质结合，并且对表达EREG蛋白质的细胞具有细胞增殖抑制活性。
[11][10]所述的抗体，其中，细胞增殖抑制活性为细胞毒活性。
[12][11]所述的抗体，其中，细胞毒活性为ADCC活性。
[13][11]所述的抗体，其中，细胞毒活性为CDC活性。
[14][10]～[13]中任一项所述的抗体，其特征在于：进一步附加具有对EREG蛋白质的中和活性。
[15][10]所述的抗体，其中，细胞增殖抑制活性为中和活性。
[16]小分子抗体，该小分子抗体由[10]所述的抗体制成。
[17][10]～[16]中任一项所述的抗体，该抗体结合有化疗药物或毒性肽。
[18]抗体，该抗体与EREG蛋白质结合，并结合有选自化疗药物、毒性肽和放射性同位素的任一种细胞毒性物质。
[19][10]～[18]中任一项所述的抗体，其中，该抗体为以下(1)～(57)中任一项所述的抗体：
(1)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
(2)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：8的氨基酸序列的117～452位的氨基酸序列。
(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(4)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：14的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
(5)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：18的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(6)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链。
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链。
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链。
(10)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：49的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：51的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：53的氨基酸序列。
(11)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：149的氨基酸序列的118～441位的氨基酸序列。
(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(13)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：55的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：57的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：59的氨基酸序列。
(14)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：151的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(15)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(16)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(13)所述的L链。
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链。
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链。
(19)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：61的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：63的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：65的氨基酸序列。
(20)抗体，该抗体含有(19)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：153的氨基酸序列的116～439位的氨基酸序列。
(21)抗体，该抗体含有(19)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(22)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：67的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：69的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：71的氨基酸序列。
(23)抗体，该抗体含有(22)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：155的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(24)抗体，该抗体含有(22)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(25)抗体，该抗体具有(19)所述的H链和(22)所述的L链。
(26)抗体，该抗体具有(20)所述的H链和(23)所述的L链。
(27)抗体，该抗体具有(21)所述的H链和(24)所述的L链。
(28)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：73的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：75的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：77的氨基酸序列。
(29)抗体，该抗体含有(28)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：157的氨基酸序列的119～442位的氨基酸序列。
(30)抗体，该抗体含有(28)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(31)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：79的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：81的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：83的氨基酸序列。
(32)抗体，该抗体含有(31)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：159的氨基酸序列的109～215位的氨基酸序列。
(33)抗体，该抗体含有(31)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(34)抗体，该抗体具有(28)所述的H链和(31)所述的L链。
(35)抗体，该抗体具有(29)所述的H链和(32)所述的L链。
(36)抗体，该抗体具有(30)所述的H链和(33)所述的L链。
(37)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：85的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：87的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：89的氨基酸序列。
(38)抗体，该抗体含有(37)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：161的氨基酸序列的117～440位的氨基酸序列。
(39)抗体，该抗体含有(37)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(40)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：91的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：93的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：95的氨基酸序列。
(41)抗体，该抗体含有(40)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：163的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(42)抗体，该抗体含有(40)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(43)抗体，该抗体含有(37)所述的H链和(40)所述的L链。
(44)抗体，该抗体含有(38)所述的H链和(41)所述的L链。
(45)抗体，该抗体含有(39)所述的H链和(42)所述的L链。
(46)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：97的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：99的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：101的氨基酸序列。
(47)抗体，该抗体含有(46)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：165的氨基酸序列的113～436位的氨基酸序列。
(48)抗体，该抗体含有(46)所述的H链，其中H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(49)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：103的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：105的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：107的氨基酸序列。
(50)抗体，该抗体含有(49)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：167的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(51)抗体，该抗体含有(49)所述的L链，其中L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(52)抗体，该抗体具有(46)所述的H链和(49)所述的L链。
(53)抗体，该抗体具有(47)所述的H链和(50)所述的L链。
(54)抗体，该抗体具有(48)所述的H链和(51)所述的L链。
(55)抗体，该抗体是在(1)～(54)中任一项所述的抗体中有一个或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(54)中任一项所述的抗体具有同等活性。
(56)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(1)～(55)中任一项所述的抗体所结合的EREG蛋白质的表位相同。
(57)(1)～(56)中任一项所述的抗体的小分子抗体。
[20][10]～[20]中任一项所述的抗体，其特征在于：识别SEQ ID NO：21的氨基酸序列中第29位的Ala～第69位的Ser或第63位的Val～第108位的Leu。
[21]EREG蛋白质和/或EREG mRNA作为癌症诊断标志物的应用。
[22]癌症的诊断方法，该方法包括：使与EREG蛋白质结合的抗体与EREG蛋白质结合的步骤。
[23]癌症的诊断方法，该方法包括以下步骤：
(a)从受试者体内采集试样的步骤；
(b)使用与EREG蛋白质结合的抗体检测采集的试样中所含的EREG蛋白质的步骤。
[24]癌症的诊断方法，该方法包括：(1)给予受试者用放射性同位素标记的与EREG蛋白质结合的抗体的步骤；以及(2)检测上述放射性同位素的累积的步骤。
[25][22]所述的诊断方法，其中，放射性同位素为正电子发射核素。
[26][25]所述的诊断方法，其中，正电子发射核素为选自11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr和124I的任一种核素。
[27]癌症的诊断方法，其特征在于：检测编码EREG蛋白质的基因的表达。
[28][22]～[27]中任一项所述的诊断方法，其中，癌症为选自大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌和肾癌的任一种癌。
[29][28]所述的诊断方法，其中，癌症为原发性癌症。
[30][28]所述的诊断方法，其中，癌症为转移性癌症。
[31]诊断药物，该诊断药物含有与EREG蛋白质结合的抗体，并用于癌症的诊断方法。
[32]试剂盒，该试剂盒含有与EREG蛋白质结合的抗体和包括EREG蛋白质的生物试剂，并用于癌症的诊断方法。
[33]癌症治疗药的候选化合物的筛选方法，该方法包括以下步骤：
(1)使被检化合物与EREG表达细胞接触的步骤；
(2)测定EREG表达细胞中EREG的表达水平的步骤；以及
(3)选择与对照相比使EREG的表达水平降低的化合物作为癌症治疗药的候选化合物的步骤。
[34][33]所述的方法，其中，EREG的表达水平通过分泌在培养上清中的EREG蛋白质的水平来评价。
[35]癌症治疗药的候选化合物的筛选方法，该方法包括以下步骤：
(1)在EREG和被检化合物的存在下，培养EREG依赖性增殖的细胞的步骤；
(2)测定细胞增殖水平的步骤；以及
(3)选择与对照相比抑制细胞增殖的被检化合物作为癌症治疗药的候选化合物的步骤。
发明效果
基于各种癌组织或癌细胞株的基因表达分析，确认EREG基因在癌细胞中呈现显著的表达亢进。另一方面，在正常细胞中，EREG的表达水平非常低。因此，EREG可作为用于特异性检测癌症的标志物。
在本发明中，确认到抗EREG抗体对EREG表达细胞的细胞毒作用。EREG的表达水平在正常细胞中非常低，而在癌细胞中亢进。这证实通过给予抗EREG抗体，例如在机体内可获得癌细胞特异性的细胞毒作用。
并且，在本发明中，确认到EREG依赖性的细胞增殖被抗EREG抗体中和。因此，在优选方式中，抗EREG抗体除产生细胞毒作用外，还通过中和EREG的细胞增殖作用，来抑制癌细胞的增殖。
附图简述
图1是显示正常组织和癌组织中EREG mRNA的转录量的图。纵轴表示探针ID：205767_at HG-U133A的信号强度(以基因芯片U133A的全部基因的表达分值的平均作为100的相对值)。
图2是显示癌细胞株中EREG mRNA的转录量的图。纵轴表示探针ID：205767_at HG-U133A的信号强度(以基因芯片U133A的全部基因的表达分值的平均作为100的相对值)。
图3是表示使用流式细胞术来显示抗EREG单克隆抗体与EREG_DG细胞的结合活性的试验结果的图。纵轴表示细胞数(荧光计数值)，横轴表示荧光强度值。
图4是表示使用流式细胞术来显示抗EREG单克隆抗体与大肠癌细胞株DLD1的结合活性的试验结果的图。纵轴表示细胞数(荧光计数值)，横轴表示荧光强度值。
图5是显示抗EREG单克隆抗体对大肠癌细胞株DLD1的CDC活性的图。纵轴表示铬游离率(％)，横轴表示抗体的种类。
图6是显示抗EREG单克隆抗体对大肠癌细胞株DLD1的ADCC活性的图。纵轴表示铬游离率(％)，横轴表示抗体的种类。
图7是显示EGFR_BAF细胞对人EREG的增殖依赖性的图。纵轴表示450nm的吸光度(参比波长为655nm)，横轴表示EREG的浓度(ng/mL)。
图8是显示胰脏癌细胞株AsPC1对人EREG的增殖依赖性的图。纵轴表示450nm的吸光度(参比波长为655nm)，横轴表示EREG的浓度(ng/mL)。
图9是显示大肠癌细胞株DLD1对人EREG的增殖依赖性的图。纵轴表示450nm的吸光度(参比波长为655nm)，横轴表示EREG的浓度(ng/mL)。
图10是使用EGFR_BAF细胞来显示抗EREG单克隆抗体对人EREG的中和活性的图。纵轴表示细胞增殖率(各抗体浓度下的吸光度/对照的吸光度×100％)，横轴表示抗体浓度(μg/mL)。
图11是使用胰脏癌细胞株AsPC1来显示抗EREG单克隆抗体对人EREG的中和活性的图。纵轴表示细胞增殖率(各抗体浓度下的吸光度/对照的吸光度×100％)，横轴表示抗体浓度(μg/mL)。
图12是显示通过鉴定可变区序列而重构的嵌合抗体与EREG结合的情况的图。
图13是显示嵌合抗体对癌细胞株的ADCC诱导活性的图。
图14是显示嵌合抗体对EREG的种交叉性分析结果的图。
图15是显示比较重组可溶型EREG与EGF的EREG受体活化能的结果的图。
图16是显示通过EREG强制表达细胞共培养引起EGF受体活化、以及利用抗EREG抗体抑制该活化的图。
图17是显示通过EREG强制表达细胞共培养引起EGF受体活化、以及利用抗EREG抗体抑制该活化的图。
图18是显示通过DLD-1细胞共培养引起EREG受体活化、以及该活化因添加抗EREG抗体而被抑制的图。
图19是显示利用使用抗EREG抗体的夹层ELISA法检测可溶型EREG蛋白质的情况的图。
图20是显示利用抗EREG小鼠单克隆抗体EP27进行的免疫染色结果的图。
图21-1是显示使用小鼠抗EREG抗体和人嵌合抗EREG抗体的抗原蛋白质的夹层ELISA的结果的图。
图21-2是显示图21-1的后续的图。
图21-3是显示图21-2的后续的图。
图22是显示根据夹层ELISA的数据对抗体的结合反应性图案进行聚类分析的结果的图。
具体实施方式
EREG是膜结合型上皮细胞成长因子蛋白质。其氨基酸序列和编码该序列的基因序列分别公开在GemBank检索号NP_001423(SEQID NO：22)和NM_001432(SEQ ID NO：21)中。在本发明中，EREG蛋白质的含义包括全长蛋白质及其片段两者。片段是指含有EREG蛋白质的任意区域的多肽，可以不具有天然EREG蛋白质的功能。片段的例子可以是包括EREG蛋白质的胞外区的片段。EREG蛋白质的胞外区在SEQ ID NO：22的氨基酸序列中相当于第29～122位。跨膜区在SEQ ID NO：22的氨基酸序列中相当于第123～140位。
本发明中，临床检样和癌细胞株的分析显示：在原发性大肠癌、转移性大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌组织中，EREG以非常高的频率在基因水平表达。并且，在癌细胞株中，EREG更以蛋白质水平高度表达。即，EREG蛋白质可作为癌症的诊断标志物。
EREG基因表达的检测
本发明的癌症诊断方法包括检测EREG基因表达的步骤。在本发明方法的一方式中，检测EREG蛋白质的表达。
本发明中，检测包括定量或定性的检测。例如，定性检测可以是下述测定：
仅测定是否存在EREG蛋白质；
测定是否存在一定量以上的EREG蛋白质；
将EREG蛋白质的量与其它试样(例如对照试样等)进行比较的测定等。
而定量检测可以是：EREG蛋白质浓度的测定、EREG蛋白质量的测定等。
本发明中的被检试样只要是可能含有EREG蛋白质的试样即可，没有特别限定。具体优选从哺乳类等生物的体内采集的试样。进一步优选的试样为从人体内采集的试样。被检试样的具体例子例如有：血液、间质液、血浆、血管外液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿等。优选的试样为血液试样。血液试样包括血清、血浆和全血。这些血液试样中，优选血清。此外，本发明的被检试样还包括由下述被检试样得到的试样，所述被检试样为：将从生物体内采集的组织或细胞固定而得到的标本或细胞的培养液等。
对根据本发明诊断的癌症没有特别限定，可以是任何癌症。具体有大肠癌、转移性大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌或肾癌等。本发明中，对上述癌症的原发病灶和转移病灶均可诊断。本发明中，特别优选的癌症为原发性大肠癌、转移性大肠癌和胰腺癌。
本发明中，当在被检试样中检测出EREG蛋白质时，即检测出癌症。具体而言，与阴性对照或正常者相比，被检试样中检测出的EREG蛋白质的量多时，显示受试者患有癌症、或者将来罹患癌症的可能性高。即，本发明涉及癌症的检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)检测从受试者体内采集的生物样品中EREG的表达水平的步骤；和
(2)当(1)中检测的EREG的表达水平与对照相比高时，显示受试者患有癌症的步骤。
本发明中，对照包括阴性对照和正常者的生物样品。阴性对照可以通过采集正常者的生物样品，并根据需要进行混合而得到。对照的EREG表达水平可以和受试者的生物样品中的EREG表达水平同时检测。或者，可以预先检测多名正常者的生物样品中的EREG表达水平，再对正常者中的标准表达水平进行统计学判定。具体而言，例如还可以使用平均值±2×标准偏差(S.D.)或平均值±3×标准偏差(S.D.)作为标准值。在统计学上，平均值±2×标准偏差(S.D.)包括80％的正常者的值，而平均值±3×标准偏差(S.D.)包括90％的正常者的值。
或者，可以利用ROC曲线设定对照中的EREG的表达水平。ROC曲线(receiver operating characteristic curve；接收者操作特性曲线)是纵轴表示检测灵敏度、横轴表示假阳性率(即“1-特异度”)的曲线图。本发明中，当连续改变用于判定生物样品中的EREG表达水平的基准值时，通过将灵敏度和假阳性率的变化作图，可以得到ROC曲线。
需要说明的是，用于得到ROC曲线的“基准值”，是为了进行统计学分析而暂时使用的数值。用于得到ROC曲线的“基准值”通常在可以覆盖可选择的所有基准值的范围内连续变化。例如可以使基准值在所分析的集团的EREG测定值的最小值与最大值之间变化。
基于所得的ROC曲线，可以选择可以期待所需的检测灵敏度以及精度的标准值。根据ROC曲线等在统计学上设定的标准值也称为截断值(cut-off值)。基于截断值的癌症的检测方法为：在上述步骤(2)中，将(1)中检测的EREG的表达水平与截断值比较。而且，当(1)中检测的EREG的表达水平比截断值高时，表示受试者被检测出癌症。
本发明中，EREG的表达水平可以通过任意方法来确定。具体而言，通过评价EREG的mRNA的量、EREG蛋白质的量、以及EREG蛋白质的生物学活性，可以知道EREG的表达水平。EREG的mRNA和蛋白质的量可以通过本说明书中所述的方法来确定。或者，还可以使用诱导EREG依赖性细胞增殖的细胞，来评价细胞增殖诱导活性，作为EREG的生物学活性。
本发明中，可以以表达EREG蛋白质的任意动物种作为受试者。例如已知猴、牛、绵羊、小鼠、狗、猫、仓鼠等人以外的多种哺乳类表达EREG蛋白质。因此，本发明中的受试者包括这些动物。特别适合的受试者是人。需要说明的是，以人以外的动物作为受试者时，当然可以检测该动物种的EREG蛋白质。
作为本发明的诊断方法的优选方式，可以列举下述癌症的诊断方法，该方法包括：在固定有组织或细胞的切片上检测EREG蛋白质的步骤，所述组织或细胞从罹患了上述癌症的患者体内获得。在本发明的另一方式中，更可以列举下述诊断方法，该方法包括：检测从细胞中游离出、存在于血液中的EREG蛋白质的步骤。特别优选本发明为下述癌症的诊断方法，该方法包括：检测存在于血液中的、含有EREG蛋白质胞外区的片段的步骤。
对被检试样中所含的EREG蛋白质的检测方法没有特别限定。优选通过使用抗EREG抗体的免疫学方法进行检测。作为免疫学方法，例如可以采用下述方法：
放射免疫测定(RIA)；
酶联免疫测定(EIA)；
荧光免疫测定(FIA)；
发光免疫测定(LIA)；
免疫沉淀法(IP)；
免疫比浊法(TIA)；
蛋白质印迹法(WB)；
免疫组织化学法(IHC)；以及
免疫扩散法(SRID)。
上述方法中，酶联免疫测定是优选的免疫学测定法之一。作为优选的酶联免疫测定，可以更具体地例示酶联免疫吸附定量法(enzyme-linked immunosorbent assay：ELISA)。作为ELISA的一个方式，例如有夹层ELISA(sandwich ELISA)。ELISA等上述免疫学方法是本领域技术人员所公知的方法。
使用抗EREG抗体的常规检测方法例如有以下方法。首先，将抗EREG抗体固定在支撑体上，之后封闭支撑体，以防止蛋白质与支撑体的非特异性结合。封闭时使用例如胎牛血清白蛋白(BSA)、明胶、白蛋白等。用于使抗体与支撑体结合的各种方法是公知的。例如，聚苯乙烯树脂等合成树脂物理性吸附抗体。或者，还可以使抗体化学结合于导入有官能团的支撑体上。为了化学结合抗体，还可以利用二官能性接头。
接下来，向支撑体中加入被检试样进行培养。此时，已经与支撑体结合的抗EREG抗体与被检试样中的EREG蛋白质结合。然后，检测经由抗EREG抗体与支撑体结合的EREG。在检测与支撑体结合的EREG之前，还可以清洗支撑体。与支撑体结合的EREG例如可以通过识别EREG的第二抗体来检测。第二抗体可以用标记物标记。或者，还可以通过识别第二抗体的第三抗体(二次抗体)间接标记第二抗体。如此操作，通过定性或定量检测与支撑体上的抗EREG抗体结合的EREG蛋白质，可以检测被检试样中的EREG蛋白质。以下，进一步说明几个具体例子。
本发明中，用于固定抗EREG抗体的支撑体可以使用以下原材料。
不溶性多糖类：琼脂糖、纤维素等；
合成树脂：有机硅树脂、聚苯乙烯树脂、聚丙烯酰胺树脂、尼龙树脂、聚碳酸酯树脂等；以及
玻璃等不溶性支撑体。
上述支撑体可以以珠或板等形状使用。为珠状时，可以使用填充有它们的柱等。为板状时，可以使用多孔板(96孔多孔板等)或生物传感芯片等。在抗EREG抗体与支撑体的结合中，利用化学键合或物理吸附等通常使用的方法，可以使抗EREG抗体与支撑体结合。这些支撑体均可优选使用市售品。
抗EREG抗体与EREG蛋白质的结合通常在缓冲液中进行。缓冲液例如可以使用：磷酸缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等。培养条件可以是已经常用的条件，例如优选在4℃～室温之间的温度下培养1小时～24小时。培养后的清洗只要不妨碍EREG蛋白质与抗EREG抗体的结合即可，例如优选使用含有吐温20等表面活性剂的缓冲液等。
在本发明的EREG蛋白质检测方法中，除了制备检测该EREG蛋白质含量的被检试样外，还可适当制备对照试样。对照试样的例子有：不含EREG蛋白质的阴性对照试样、或含有EREG蛋白质的阳性对照试样等。这种情况下，通过比较由不含EREG蛋白质的阴性对照试样得到的结果和由含有EREG蛋白质的阳性对照试样得到的结果，可以确认被检试样中是否存在EREG蛋白质。另外，制备使浓度阶段性变化的一系列对照试样，以数值的形式得到相对于各对照试样的检测结果，之后基于与EREG蛋白质的浓度值对应的测定值，可以得到标准曲线。由被检试样中所含的EREG蛋白质的测定结果和标准曲线，可以定量检测被检试样中所含的EREG蛋白质。
作为检测经由抗EREG抗体与支撑体结合的EREG蛋白质的优选方式，可以列举使用用标记物标记的抗EREG抗体的方法。例如，使被检试样与固定在支撑体上的抗EREG抗体接触，根据需要进行清洗，之后使特异性识别EREG蛋白质的标记抗体结合，从而可以检测该EREG蛋白质。
抗EREG抗体可以利用通常已知的方法进行标记。标记物可以使用荧光染料、酶、辅酶、化学发光物质、放射性物质等本领域技术人员所公知的标记物。具体而言，下述标记物可用于抗体的标记：放射性同位素：32P、14C、125I、3H、131I等；
荧光染料：荧光素、罗丹明、丹磺酰氯、伞形酮等；
酶：萤光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、微过氧化物酶等；以及
结合亲和性物质：生物素等。
使用生物素作为标记物时，利用使碱性磷酸酶等酶结合的抗生物素蛋白，可以检测生物素标记抗体。为了使标记物与抗EREG抗体结合，可以采用戊二醛法、马来酰亚胺法、二硫吡啶法、高碘酸法等公知的方法。
标记物的检测方法也是公知的。例如，检测用放射性物质标记的抗EREG抗体时，可以利用液体闪烁计数仪检测放射活性。检测用酶标记的抗EREG抗体时，向该标记抗EREG抗体中加入底物，然后可以通过底物的酶促变化进行检测。催化显色反应或发光反应的酶与底物的组合是公知的。例如，用于检测过氧化物酶的底物的具体例子有：2，2-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1，2-苯二胺(邻苯二胺)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)等。使用上述显色底物时，可以通过吸光光度计来追踪反应。底物为荧光发光物质时，使用荧光光度计可以检测底物的酶促变化。
作为本发明的EREG蛋白质的检测方法的特别优选的方式，可以列举使用用生物素标记的抗EREG抗体和抗生物素蛋白的方法。具体而言，可以利用结合有酶的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白检测生物素标记的抗EREG抗体。结合有碱性磷酸酶、过氧化物酶等酶的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白是公知的。
本发明的检测EREG蛋白质的方法的另一方式为：使用一种以上的特异性识别EREG蛋白质的一次抗体和一种以上的特异性识别该一次抗体的二次抗体的方法。
使用二次抗体时，使用来自不同于与支撑体结合的抗体(固化抗体)的动物种的抗EREG抗体作为液相抗体。液相抗体与被固相抗体捕获的EREG蛋白质结合。并且，二次抗体与液相抗体结合。二次抗体与液相抗体结合，但不能与固相抗体结合。因此，支撑体上残留的二次抗体的量取决于经由EREG蛋白质与支撑体结合的液相抗体的量。上述操作的结果，通过定性或定量检测结合的二次抗体，可以检测出被检试样中的EREG蛋白质。此时，二次抗体可以用标记物适当标记。
作为本发明的EREG蛋白质的检测方法的又一方式，可以列举利用凝聚反应的检测方法。该方法中，使用吸附有抗EREG抗体的载体可以检测EREG蛋白质。吸附抗体的载体只要是不溶性的、不发生非特异性反应、且稳定即可，可以使用任何载体。例如可以使用胶乳颗粒、皂土、胶棉、高岭土、固定羊红细胞等。胶乳颗粒是均匀性和稳定性优异的优选载体。胶乳颗粒例如可使用聚苯乙烯胶乳颗粒、苯乙烯-丁二烯共聚物胶乳颗粒、聚乙烯基甲苯胶乳颗粒等。或者，导入了羧基等官能团的胶乳颗粒也是公知的。例如聚苯乙烯胶乳颗粒是优选的胶乳颗粒。
具有疏水性表面的胶乳颗粒，通过与抗体混合可物理性吸附抗体。或者，当胶乳颗粒具有官能团时，还可化学性结合抗体。将结合有抗体的颗粒与试样混合，并搅拌一定时间。试样中EREG蛋白质的浓度越高，颗粒的聚集度越大，因此通过肉眼估算该聚集度，可以检测EREG蛋白质。另外，通过用分光光度计等测定聚集导致的浊度或散射光的增加，也可检测EREG蛋白质。
作为本发明的EREG蛋白质的检测方法的又一方式，可以列举如：使用利用了表面等离子体共振现象的生物传感器的方法。通过使用利用了表面等离子体共振现象的生物传感器，无需标记该蛋白质，即可实时以表面等离子体共振信号的形式观察蛋白质与蛋白质间的相互作用。例如，通过使用BIAcore(Biacore社制)等生物传感器，可以检测EREG蛋白质与抗EREG抗体的结合。具体而言，使被检试样与固定有抗EREG抗体的传感芯片接触，可以以共振信号的变化的形式检测与抗EREG抗体结合的EREG蛋白质。
EREG是癌细胞中特异性表达增强的膜蛋白质。因此，利用抗EREG抗体可以检测癌细胞或癌组织。例如，通过使用抗EREG抗体的免疫组织学分析，检测从机体内采集的细胞或组织中所含的癌细胞。或者，还可以利用抗EREG抗体来检测机体内的癌组织。即，本发明涉及癌症的检测方法，该方法包括：(1)给予受试者用放射性同位素标记的与EREG蛋白质结合的抗体的步骤；以及(2)检测上述放射性同位素的累积的步骤。为了追踪给予到机体内的抗体，可以标记抗体以能够进行检测。例如，可以追踪用荧光物质、发光物质或放射性同位素标记的抗体在机体内的行为。用荧光物质或发光物质标记的抗体，可以使用内视镜或腹腔镜来观察。至于放射性同位素，通过追踪其放射活性，可以将抗体的定位图像化。本发明中，机体内的抗EREG抗体的定位表示癌细胞的存在。
为了检测机体内的癌症，标记抗体的放射性同位素可以使用正电子发射核素。例如可以用18F、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr和124I等正电子发射核素标记抗体。利用这些正电子发射核素标记抗EREG抗体时，可采用公知的方法(Acta Oncol.32，825～830，1993)。
将用正电子发射核素标记的抗EREG抗体给予人或动物后，使用PET(正电子断层摄影装置)从体外计测该放射性核素放射的放射线，通过计算机层析成像的方法转换为图像。PET是用于非侵袭性地获得有关药物的体内行为等的数据的装置。利用PET可以将放射强度以信号强度的形式定量图像化。通过按上述方式使用PET，无需从患者体内采集试样，即可检测在特定癌症中高度表达的抗原分子。抗EREG抗体除了用上述核素标记外，还可以利用使用11C、13N、15O、18F、45Ti等正电子发射核素的短寿命核素进行放射标记。
使用由医疗用回旋加速器得到的上述核素的短寿命核素的生产、短寿命放射标记化合物的制备技术等相关研究开发得到推进。利用上述技术，可以用各种放射性同位素标记抗EREG抗体。给予患者的抗EREG抗体，根据抗EREG抗体对各部位的病理组织的特异性而累积在原发灶和转移灶中。抗EREG抗体用正电子发射核素标记时，检测其放射活性，从而根据放射活性的定位，检测该原发灶和转移灶的存在。用于该诊断用途时，可适当使用25～4000keV的γ粒子或正电子放射量的活性值。另外，选择适当的核素、再大量给予时，也有望获得治疗效果。为了得到放射性产生的抗癌作用，可以使用给予70～700keV的γ粒子或正电子放射量值的核素。
在本发明方法的另一方式中，检测EREG mRNA的表达。本发明中，检测包含定量或定性检测。定性检测的例子有：下述测定操作。
仅测定是否存在EREG mRNA；
测定是否存在一定量以上的EREG mRNA；以及
将EREG mRNA的量与其它试样(例如对照试样等)进行比较的测定等。而定量检测可以是：EREG mRNA浓度的测定、EREG mRNA量的测定等。
本发明中的被检试样可以使用有可能含有EREG mRNA的任意试样。优选从哺乳类等生物的体内采集的试样，进一步优选为从人体内采集的试样。被检试样的具体例子例如有：血液、间质液、血浆、血管外液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿等。优选的试样为血液试样。血液试样中包括血清、血浆或全血。此外，本发明的被检试样中还包括由下述被检试样获得的试样，所述被检试样为将从生物体内采集的组织或细胞固定而得到的标本或细胞的培养液等。
对所要诊断的癌症没有特别限定。具体有大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌或肾癌等。本发明中，对上述癌症的原发病灶和转移病灶均可诊断。特别优选的癌症为原发性大肠癌、转移性大肠癌和胰腺癌。
本发明中，可以以表达EREG蛋白质的任意动物种作为受试者。例如已知猴、牛、绵羊、小鼠、狗、猫、仓鼠等人以外的多种哺乳类表达EREG。特别适合的受试者是人。需要说明的是，当以人以外的动物种作为受试者时，检测该动物种的EREG mRNA。
以下给出检测方法的具体方式。首先，由受试者制备试样。然后，检测该试样中所含的EREG mRNA。本发明中，还可检测由mRNA合成的cDNA。本发明中，在被检试样中检测出EREG mRNA或编码EREG的cDNA时，意味着受试者被检测出癌症。例如，与阴性对照或正常者相比，在被检试样中检测出的EREG mRNA或编码EREG的cDNA的量多时，显示受试者患有癌症、或者将来罹患癌症的可能性大。
检测mRNA的方法是公知的。在本发明中，具体可以利用例如RNA印迹法、RT-PCR法、DNA阵列法等。
上述本发明的检测方法，还可以使用各种自动检查装置自动进行。通过自动化，可以一次性检查大量试样。
本发明的目的还在于提供用于诊断癌症的诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒含有用于检测被检试样中的EREG蛋白质的试剂。本发明的诊断试剂至少含有抗EREG抗体。基于ELISA法等EIA法进行时，本发明的诊断试剂或试剂盒可以含有固定有抗体的载体。或者，还可以供给预先与载体结合的抗体。基于使用胶乳等载体的聚集法时，本发明的诊断试剂或试剂盒可以含有抗体所吸附的载体。
通过将本发明的癌症诊断用试剂与用于检测EREG的其它要素组合，可以制成用于诊断癌症的试剂盒。即，本发明涉及用于诊断癌症的试剂盒，该试剂盒含有与EREG结合的抗体和包含含有EREG的生物样品的对照试样。本发明的试剂盒可以进一步附加含有用于EREG的免疫分析的试剂。例如，可以将用于检测酶标记的显色底物和用于清洗固相的洗涤液组合作为ELISA用的试剂。此外，还可以在试剂盒中附带用于说明测定操作的说明书。
本发明还提供用于诊断癌症的诊断试剂或试剂盒，该诊断试剂或试剂盒含有用于检测被检试样中的EREG mRNA或编码EREG的cDNA的试剂。本发明的诊断试剂至少含有编码EREG的DNA(SEQID NO：21；包含NM_001423中所述核苷酸序列的DNA)或含有至少15个与其互补链互补的核苷酸的寡核苷酸。
这里的“互补链”是指，包含A:T(为RNA时则为U)、G:C碱基对的双链核酸中相对于一条链的另一条链。另外，“互补的”并不限于在至少15个连续的核苷酸区完全为互补序列的情形，还可以在核苷酸序列上具有至少70％、优选至少80％、更优选90％、进一步优选95％以上的同源性。用于确定同源性的算法可以采用本说明书中所述的方法。
上述寡核苷酸可以用作用于检测或扩增编码EREG的DNA的探针或引物、用于检测该DNA表达的探针或引物。探针可以以DNA阵列基板的形式使用。
使用该寡核苷酸作为引物时，其长度通常为15bp～100bp。优选的引物的长度为17bp～30bp。引物可以使用可扩增编码EREG的DNA或其互补链的至少一部分的任意引物。用作引物时，3’侧的区域可制成互补的，在5’侧可以附加限制酶识别序列或tag等。
另外，可以使用与编码EREG的DNA或其互补链的至少一部分特异性杂交的任意寡核苷酸作为探针。用于检测mRNA的探针的核苷酸序列选自与EREG的有义链互补的核苷酸序列。该探针通常至少具有15bp以上的链长。
本发明中，寡核苷酸可以在适当标记后作为探针。标记寡核苷酸的方法是公知的。例如可以以用32P标记的ATP作为底物，使用T4多核苷酸激酶将寡核苷酸的5’端磷酸化来进行标记。或者可以例示：使用DNA聚合酶，以随机六聚寡核苷酸等作为引物，摄入已标记的底物核苷酸的方法(随机引物法等)。在随机引物法中，使用克列诺酶等作为DNA聚合酶。另外，核苷酸可以用32P等放射性同位素、荧光染料、生物素或地高辛等进行标记。
本发明中的寡核苷酸，例如可以利用市售的寡核苷酸合成仪来制备。探针还可以制成通过限制酶处理等获得的双链DNA片段的形式。
上述诊断试剂或试剂盒中，除作为有效成分的寡核苷酸和抗体外，根据需要，例如可以混合无菌水、生理盐水、植物油、表面活性剂、脂类、助溶剂、缓冲剂、蛋白质稳定剂(BSA或明胶等)、保存剂、封闭溶液、反应溶液、反应中止液、用于处理试样的试剂等。
抗EREG抗体的制备
本发明中使用的抗EREG抗体只要与EREG蛋白质特异性结合即可，不限定其来源、种类和形状。具体而言，可以使用非人动物的抗体(例如小鼠抗体、大鼠抗体、骆驼抗体)、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体等公知的抗体。本发明中，所用抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体等。优选的抗体为单克隆抗体。
本发明中使用的抗EREG抗体，可以利用公知的方法，以单克隆或多克隆抗体的形式获得。本发明中使用的抗EREG抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体包括：通过杂交瘤产生的单克隆抗体；以及利用基因工程的方法，由用含有抗体基因的表达载体转化的宿主产生的单克隆抗体等。
产生单克隆抗体的杂交瘤基本上可以采用公知技术如下制备。首先，使用EREG蛋白质作为致敏抗原，按照常规的免疫方法对其进行免疫。按照常规的细胞融合法使由免疫动物得到的免疫细胞与公知的亲本细胞融合，得到杂交瘤。再利用通常的筛选法，从该杂交瘤中筛选产生目标抗体的细胞，从而可以选择产生抗EREG抗体的杂交瘤。
具体而言，单克隆抗体的制备可如下进行。首先，通过表达EREG基因，可以获得用作取得抗体的致敏抗原的EREG蛋白质。EREG基因的核苷酸序列公开在GenBank检索号NM_001432(SEQ ID NO：21)等中。即，将编码EREG的基因序列插入公知的表达载体中，转化适当的宿主细胞，之后按照公知的方法，可以从其宿主细胞中或培养上清中纯化目标人EREG蛋白质。纯化的天然EREG蛋白质也可同样使用。另外，象本发明所使用的那样，还可以利用使EREG蛋白质的所需的部分多肽与不同的多肽融合的融合蛋白作为免疫原。为了制造作为免疫原的融合蛋白，例如可以利用抗体的Fc片段或肽tag等。表达融合蛋白的载体可如下制作：通过使所需的编码两种或两种以上多肽片段的基因进行符合读框的融合，将该融合基因按上述方式插入表达载体中来制作。融合蛋白的制作方法例如记载在Molecular Cloning 2nded.(Sambrook，J等人.，Molecular Cloning 2nd ed.，9.47～9.58，ColdSpring Harbor Lab.Press，1989)中。
如此操作而纯化的EREG蛋白质可以用作用于对哺乳动物进行免疫的致敏抗原。EREG的部分肽也可用作致敏抗原。例如，可以以下述肽作为致敏抗原。
由人EREG的氨基酸序列通过化学合成获得的肽；
将EREG基因的一部分整合到表达载体中，使其表达而获得的肽；利用蛋白分解酶分解EREG蛋白质而获得的肽。
对用作部分肽的EREG的区域和大小没有限定。优选的区域可以从构成EREG的胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：22的氨基酸序列中第29-122位)中选择。构成作为致敏抗原的肽的氨基酸数目优选为至少3以上、例如5以上或6以上。更具体而言，可以以8～50、优选10～30个残基的肽作为致敏抗原。
对用该致敏抗原免疫的哺乳动物没有特别限定。为了利用细胞融合法得到单克隆抗体，优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的适合性来选择免疫动物。通常作为免疫动物，优选啮齿类动物。具体可以以小鼠、大鼠、仓鼠或兔作为免疫动物。此外，猴等也可作为免疫动物。
可以按照公知的方法，利用致敏抗原免疫上述动物。例如常规方法为：通过腹腔内或皮下注射致敏抗原，可以对哺乳动物实施免疫。具体而言，每4～21天对哺乳动物多次给予该致敏抗原。致敏抗原用PBS(磷酸缓冲盐)或生理盐水等按适当的稀释倍率稀释后用于免疫。并且，可以将致敏抗原与佐剂一同给药。例如，可以将致敏抗原与弗氏完全佐剂混合、乳化，作为致敏抗原。另外，用致敏抗原进行免疫时可使用适当的载体。特别是使用分子量小的部分肽作为致敏抗原时，优选将该致敏抗原肽与白蛋白、钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)等载体蛋白结合后进行免疫。
如此地对哺乳动物进行免疫，确认血清中所需抗体量升高后，从哺乳动物中采集免疫细胞用于细胞融合。优选的免疫细胞特别可以使用脾细胞。
与上述免疫细胞融合的细胞使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。优选骨髓瘤细胞具备用于筛选的适当的选择标志物。选择标志物是指，可以(或者不可以)在特定的培养条件下生存的特性。选择标志物中，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷(以下简记为HGPRT缺陷)或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷(以下简记为TK缺陷)等是公知的。存在HGPRT或TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷感受性(以下简记为HAT感受性)。HAT感受性的细胞在HAT选择培养基中无法进行DNA合成而死亡，但与正常细胞融合时，利用正常细胞的补救途径可以继续进行DNA的合成，所以在HAT选择培养基中也能够增殖。
HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞，各自可以在含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下简记为8AG)或5’-溴脱氧尿苷的培养基中进行选择。正常细胞由于将上述嘧啶类似物摄入DNA中而死亡，但缺失了上述酶的细胞由于不摄入上述嘧啶类似物，所以可以在选择培养基中生存。此外，被称作G418耐性的选择标志物由于新霉素耐性基因，提供对2-脱氧链霉胺类抗生素(庆大霉素类似物)的耐性。适于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是公知的。例如，制造本发明的单克隆抗体时可以使用下述骨髓瘤细胞。
P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)；
P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)；
NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)；
MPC-11(Margulies.D.H.等人.，Cell(1976)8，405-415)；
SP2/0(Shulman，M.等人.，Nature(1978)276，269-270)；
FO(de St.Groth，S.F.等人.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)；
S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)；以及
R210(Galfre，G.等人.，Nature(1979)277，131-133)等。
基本上可以按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)，进行上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体而言，例如在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中，可以实施上述细胞融合。融合促进剂例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等。为了进一步提高融合效率，根据需要，还可以添加二甲基亚砜等辅助剂。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，优选相对于骨髓瘤细胞，使免疫细胞为1～10倍。用于上述细胞融合的培养液例如可以使用：适合上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及用于该种细胞培养的常规培养液。并且，可以在培养液中添加胎牛血清(FCS)等血清补液。
细胞融合可如下形成：将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，再混合预先加热至37℃左右的PEG溶液，从而形成目标融合细胞(杂交瘤)。在细胞融合法中，通常可以以30～60％(w/v)的浓度添加例如平均分子量为1000～6000左右的PEG。接着，依次添加上述例举的适当培养液，离心以除去上清，通过重复该操作，可除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。
如此操作而得到的杂交瘤，可以通过使用选择培养液而进行选择，所述选择培养液对应于用于细胞融合的杂交瘤所具有的选择标志物。例如，具有HGPRT或TK缺陷的细胞，可通过在HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养液)中培养来进行选择。即，将HAT感受性的骨髓瘤细胞用于细胞融合时，在HAT培养液中，成功与正常细胞进行细胞融合的细胞能够选择性地增殖。为了使目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，使用上述HAT培养液继续培养足够的时间。具体而言，通常通过培养数天至数周，可以选择目标杂交瘤。接着，通过实施常规的极限稀释法，可以实施产生目标抗体的杂交瘤的筛选和单一克隆。或者，还可以按照国际公开WO03/104453中所述的方法制备识别EREG的抗体。
目标抗体的筛选和单一克隆可优选按照基于公知的抗原抗体反应的筛选方法进行实施。例如，使抗原与用聚苯乙烯等制成的珠或市售的96孔微量滴定板等载体结合，再与杂交瘤的培养上清反应。然后清洗载体，之后与用酶标记的二次抗体等反应。当培养上清中含有与致敏抗原反应的目标抗体时，二次抗体经由该抗体与载体结合。最终，通过检测与载体结合的二次抗体，可以确定培养上清中是否存在目的抗体。利用极限稀释法等可以克隆能与抗原结合的产生所需抗体的杂交瘤。此时，抗原不仅可以使用用于免疫的抗原，还可以适当使用实施上为相同性质的EREG蛋白质。例如，可以使用EREG的胞外结构域、或者包含构成该区的部分氨基酸序列的寡肽作为抗原。
除通过用抗原对人以外的动物进行免疫而获得上述杂交瘤的方法外，对人淋巴细胞进行抗原致敏，也可得到目标抗体。具体而言，首先，在体外用EREG蛋白质致敏人淋巴细胞。然后，使免疫致敏的淋巴细胞与适当的融合配偶体融合。融合配偶体可以使用例如来自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞(参照日本特公平1-59878号公报)。通过该方法得到的抗EREG抗体是与EREG蛋白质具有结合活性的人抗体。
并且，通过对具有完全人抗体基因的所有组成成分的转基因动物给予作为抗原的EREG蛋白质，也可得到抗EREG抗体。免疫动物的抗体产生细胞通过与适当的融合配偶体进行细胞融合、或者通过EB病毒感染等处理，可以使之无限增殖。通过从如此操作而得到的无限增殖细胞中可以分离抗EREG蛋白质的人抗体(参照国际公开WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602)。并且，通过克隆无限增殖的细胞，也可以克隆具有目标反应特异性的产生抗体的细胞。以转基因动物作为免疫动物时，该动物的免疫系统将人EREG识别为异物。因此，可以容易地得到抗人EREG的人抗体。
如此操作而制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可在常规培养液中继代培养。还可以在液氮中长期保存该杂交瘤。
按照常规方法培养该杂交瘤，从其培养上清中可以获得目标单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤给予与其具有适合性的哺乳动物以使其增殖，以其腹水的形式获得单克隆抗体。前一种方法适合获得高纯度的抗体。
本发明中，还可以利用由抗体产生细胞克隆的抗体基因所编码的抗体。将克隆的抗体基因整合到适当的载体中，再导入宿主中，从而可以以抗体的形式表达。用于抗体基因的分离、载体的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经确立(例如参照Vandamme，A.M.等人.，Eur.J.Biochem.(1990)192，767～775)。
例如，可以从产生抗EREG抗体的杂交瘤细胞中得到编码抗EREG抗体的可变区(V区)的cDNA。因此，通常首先从杂交瘤中提取总RNA。作为用于从细胞中提取mRNA的方法，可以采用以下方法。胍超离心法(Chirgwin，J.M.等人.，Biochemistry(1979)18，5294～5299)；APGC法(Chomczynski，P.等人.，Anal.Biochem.(1987)162，156～159)。
所提取的mRNA可以用mRNA纯化试剂盒(GE HealthcareBio-Sciences制备)等进行纯化。或者，象QuickPrep mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Bio-Sciences制备)等那样，用于从细胞中直接提取总mRNA的试剂盒也有市售。使用这种试剂盒，也可以从杂交瘤中得到总mRNA。可以使用逆转录酶，由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可以通过AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(AMVReverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit)(生化学工业社制)等来合成。为了进行cDNA的合成和扩增，可以采用5’-AmpliFINDER RACE试剂盒(Clontech制备)和使用PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.等人.，Proc.Natl.Acid.Sci.USA(1988)85，8998～9002、Belyavsky，A.等人.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919～2932)。并且，在上述cDNA的合成过程中，可以向cDNA的两个末端导入后述的适当的限制酶切位点。
由所得的PCR产物纯化目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如上制备重组载体，将其导入大肠杆菌等中，选择集落后，可以由形成该集落的大肠杆菌制备所需的重组载体。而且，关于该重组载体是否具有目标cDNA的核苷酸序列，这可以通过公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等进行确认。
为了得到编码可变区的基因，还可以使用利用引物扩增可变区基因的PCR法。首先，以提取的mRNA为模板合成cDNA，得到cDNA文库。在cDNA文库的合成中，使用市售的试剂盒是便利的。实际上，由于仅由少数细胞得到的mRNA极其微量，所以若将其直接纯化则收率低。因此，通常是添加已明确不含抗体基因的载体RNA后再纯化。或者，在可以提取一定量的RNA时，即使仅是抗体产生细胞的RNA，也可以高效率地提取。例如从10以上、或30以上、优选50以上的抗体产生细胞中提取RNA时，有时不必添加载体RNA。
已所得cDNA文库为模板，利用PCR法扩增抗体基因。用于通过PCR法扩增抗体基因的引物是公知的。例如，可以根据论文(J.Mol.Biol.(1991)222，581-597)等公开的内容，设计人抗体基因扩增用的引物。这些引物在每一免疫球蛋白的亚级都形成不同的核苷酸序列。因此，以亚级不明确的cDNA文库为模板时，考虑所有可能性后再进行PCR法。
具体而言，例如为了取得编码人IgG的基因时，可以使用可扩增编码作为重链的γ1～γ5、作为轻链的κ链和λ链的基因的引物。为了扩增IgG的可变区基因，通常3’侧的引物中使用相当于铰链区的部分退火的引物。而5’侧的引物中可以使用相当于各亚级的引物。
将由重链和轻链的各亚级的基因扩增用引物得到的PCR产物制成各自独立的文库。利用如此合成的文库，可以重构包含重链与轻链的组合的免疫球蛋白。以重构的免疫球蛋白与EREG的结合活性为指标，可以筛选目标抗体。
例如，为了获取抗EREG抗体时，进一步优选抗体与EREG的结合为特异性的。与EREG结合的抗体例如可以如下筛选。
(1)使抗体与EREG接触的步骤，所述抗体含有由杂交瘤得到的cDNA所编码的V区；
(2)检测EREG与抗体之间结合的步骤；以及
(3)选择与EREG结合的抗体的步骤。
检测抗体与EREG之间结合的方法是公知的。具体而言，使被检抗体与固定有载体的EREG反应，接下来使之与识别抗体的标记抗体反应。清洗后检测出载体上的标记抗体时，可以证明该被检抗体与EREG结合。标记中可以使用过氧化物酶或β-半乳糖苷酶等酶活性蛋白质、或FITC等荧光物质。为了评价抗体的结合活性，还可以使用表达EREG的细胞的固定标本。
作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还可采用利用了噬菌体载体的淘选法。按上述方式获取抗体基因作为重链和轻链的亚级的文库时，利用噬菌体载体的筛选法是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因通过以适当的接头序列连接，可以形成单链Fv(scFv)。将编码scFv的基因插入噬菌体载体中时，可以得到在表面表达scFv的噬菌体。使该噬菌体与目标抗原接触，回收与抗原结合的噬菌体时，可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。根据需要重复该操作，可以浓缩具有目标结合活性的scFv。
本发明中，编码抗体的多核苷酸可以编码抗体的全长、或者可以编码抗体的一部分。抗体的一部分是指抗体分子的任意部分。以下，作为表示抗体的一部分的用语，有时使用抗体片段。本发明中优选的抗体片段包括抗体的互补链决定区(complementarity determinationregion；CDR)。进一步优选本发明的抗体片段包括构成可变区的全部的3个CDR。
获得编码目标抗EREG抗体V区的cDNA后，通过识别插入到该cDNA的两个末端的限制酶切位点的限制酶消化该cDNA。优选的限制酶识别、消化在构成抗体基因的核苷酸序列中出现的可能性低的核苷酸序列。为了进一步将1复制的消化片段按正确方向插入载体中，优选提供附着末端的限制酶。通过将上述被消化的编码抗EREG抗体V区的cDNA插入适当的表达载体中，可以得到抗体表达载体。此时，通过使编码抗体恒定区(C区)的基因与编码上述V区的基因进行符合读框的融合，可以得到嵌合抗体。此处的嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等的异种嵌合抗体外，人-人同种嵌合抗体也包括在本发明的嵌合抗体中。预先将上述V区基因插入具有恒定区的表达载体中，也可以构建嵌合抗体表达载体。
具体而言，例如在保持有编码所需抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’侧，可以预先配置消化上述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。用相同组合的限制酶消化两者，使之进行符合读框的融合，从而构建嵌合抗体表达载体。
为了制备本发明中使用的抗EREG抗体，可以将抗体基因整合到表达载体中，使在表达控制区的控制下表达。用于表达抗体的表达控制区例如包括增强子和启动子。接着，使用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗EREG抗体的DNA的重组细胞。
为了表达抗体基因，可以将编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA分别整合到另一表达载体中。将整合有H链和L链的载体同时转化(co-transfect)到相同的宿主细胞中，从而可以使具备H链和L链的抗体分子表达。或者，可以将编码H链和L链的DNA整合到单一的表达载体中，来转化宿主细胞(参照国际公开WO 94/11523)。
用于暂且分离抗体基因、再导入适当的宿主细胞中以制备抗体的宿主与表达载体的多个组合是公知的。这些表达系统均可应用于本发明。使用真核细胞作为宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体而言，可用于本发明的动物细胞可以例示下述细胞：
(1)哺乳类细胞：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、Hela、Vero等；
(2)两栖类细胞：非洲爪蟾卵细胞等；以及
(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。
或者，作为植物细胞，来自烟草(Nicotiana tabacum)等烟草属(Nicotiana)的细胞产生的抗体基因的表达系统是公知的。在植物细胞的转化中，可以使用进行了愈伤组织培养的细胞。
并且，作为真菌细胞，可以使用下述细胞。酵母：啤酒糖酵母(Saccharomyces serevisiae)等糖酵母属(Saccharomyces)、甲醇型毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属(Pichia)；
丝状菌：黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉属(Aspergillus)。
或者，使用原核细胞的抗体基因的表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可以将大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞用于本发明。
通过转化将含有目标抗体基因的表达载体导入上述细胞中。通过在体外培养被转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所需的抗体。
另外，在重组型抗体的产生中，除了使用上述宿主细胞外，还可以使用转基因动物。即，将编码目标抗体的基因导入动物体内，可以由该动物得到该抗体。例如，通过将抗体基因符合读框地插入到编码乳汁中特性产生的蛋白质的基因内部，可以构建融合基因。作为乳汁中所分泌的蛋白质，例如可以使用山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入到山羊胚胎中，再将该注入胚胎导入雌山羊体内。接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从该转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，可以以与乳汁蛋白质形成的融合蛋白的形式获得所需抗体。另外，为了增加由转基因山羊产生的含有所需抗体的乳汁量，可以将激素适当用于转基因山羊(Ebert，K.M.等人.，Bio/Technology(1994)12，699～702)。
本发明的重组抗体的C区可以使用来自动物抗体的C区。例如，小鼠抗体的H链C区可以使用Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε，L链C区可以使用Cκ、Cλ。另外，除小鼠抗体以外的动物抗体可以使用大鼠、兔、山羊、绵羊、骆驼、猴等的动物抗体。它们的序列是公知的。为了改善抗体或其产生的稳定性，可以对C区进行修饰。
本发明中，将抗体给予人时，为了降低对人的异种抗原性等，可以制成人工修饰的基因重组型抗体。基因重组型抗体例如包括：嵌合抗体、人源化抗体等。这些修饰抗体可以采用公知的方法进行制备。
嵌合抗体是指将来源互不相同的可变区和恒定区连接而成的抗体。例如，包含小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体是小鼠-人-异种嵌合抗体。将编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，将其整合到表达载体中，从而可以制备表达嵌合抗体的重组载体。培养通过该载体转化的重组细胞，使整合的DNA表达，从而可以获得培养中所产生的该嵌合抗体。在嵌合抗体和人源化抗体的C区使用人抗体的C区。
例如，在H链中，可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε作为C区。在L链中，可以使用Cκ和Cλ作为C区。上述C区的氨基酸序列以及编码该氨基酸序列的核苷酸序列是公知的。为了改善抗体本身或抗体产生的稳定性，可以对人抗体C区进行修饰。
通常，嵌合抗体由来自人以外的动物的抗体的V区和来自人抗体的C区构成。相对于此，人源化抗体由来自人以外的动物的抗体的互补性决定区(CDR)和来自人抗体的构架区(FR)、以及来自人抗体的C区构成。由于人源化抗体在人体内的抗原性降低，因此可用作本发明的治疗药的有效成分。
例如，作为本发明中的单克隆抗体，优选通过将基于本发明而制作的抗EREG单克隆抗体B3#18的可变区和构成人恒定区的氨基酸序列连接而得到的小鼠-人嵌合抗体。即，本发明提供小鼠-人嵌合单克隆抗体，该抗体含有包括下述氨基酸序列的H链和L链。
H链：SEQ ID NO：10所述的氨基酸序列中1～446位的氨基酸序列(除信号序列：-19～-1以外的序列)
L链：SEQ ID NO：20所述的氨基酸序列中1～213位的氨基酸序列(除信号序列：-20～-1以外的序列)
并且，本发明的嵌合抗体的优选的其它例子有以下抗体：
抗体，该抗体含有H链和L链，所述H链具有SEQ ID NO：129所述的氨基酸序列中除去信号序列(-19～-1)后的序列，所述L链具有SEQ ID NO：131所述的氨基酸序列中除去信号序列(-19～-1)后的序列；
抗体，该抗体含有H链和L链，所述H链具有SEQ ID NO：133所述的氨基酸序列中除去信号序列(-19～-1)后的序列，所述L链具有SEQ ID NO：135所述的氨基酸序列中除去信号序列(-19～-1)后的序列；
抗体，该抗体含有H链和L链，所述H链具有SEQ ID NO：137所述的氨基酸序列中除去信号序列(-19～-1)后的序列，所述L链具有SEQ ID NO：139所述的氨基酸序列中除去信号序列(-19～-1)后的序列；
抗体，该抗体含有H链和L链，所述H链具有SEQ ID NO：141所述的氨基酸序列中除去信号序列(-19～-1)后的序列，所述L链具有SEQ ID NO：143所述的氨基酸序列中除去信号序列(-19～-1)后的序列；以及
抗体，该抗体含有H链和L链，所述H链具有SEQ ID NO：145所述的氨基酸序列中除去信号序列(-19～-1)后的序列，所述L链具有SEQ ID NO：147所述的氨基酸序列中除去信号序列(-19～-1)后的序列。
抗体可变区通常由夹在4个构架区(FR)中的3个互补性决定区(CDR)构成。CDR实质上是决定抗体的结合特异性的区。CDR的氨基酸序列富有多样性。一方面，构成FR的氨基酸序列即使在具有不同结合特异性的抗体间往往也显示出高度同源性。因此，通常通过移植CDR，可以将某抗体的结合特异性移植到其它抗体中。
人源化抗体也称作重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于得到人源化抗体的常规基因重组方法也是已知的。
具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，例如重叠序列延伸PCR(Overlap Extension PCR)是公知的。在重叠序列延伸PCR中，将移植了编码小鼠抗体CDR的核苷酸序列附加在用于合成人抗体FR的引物上。分别准备4个FR的引物。通常，向人FR中移植小鼠CDR时，选择与小鼠的FR同源性高的人FR，这对维持CDR的功能有利。即，通常优选利用包含与移植了小鼠CDR相邻的FR的氨基酸序列同源性高的氨基酸序列的人FR。
另外，被连接的核苷酸序列设计成彼此符合读框地进行连接。利用各自的引物分别合成人FR。其结果，得到在各FR中附加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的核苷酸序列设计成相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR经由小鼠CDR序列进行连接。
最终，连接有3个CDR和4个FR的全长V区基因使用下述引物进行扩增，所述引物为对其5’末端和3’末端退火且附加有适当的限制酶识别序列。将如上得到的DNA与编码人抗体C区的DNA插入表达载体中，使符合读框地融合，从而可以制备人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主中，建立重组细胞，之后培养该重组细胞，使编码该人源化抗体的DNA表达，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧洲专利公开EP 239400、国际公开WO96/02576)。
通过定性或定量测定并评价如上制备的人源化抗体与抗原的结合活性，可以适当选择经由CDR连接时该CDR可形成良好的抗原结合部位的人抗体的FR。根据需要，还可以置换FR的氨基酸残基，使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位。例如，应用用于向人FR中移植小鼠CDR的PCR法，可以向FR中导入氨基酸序列的突变。具体而言，可以向对FR退火的引物中导入一部分核苷酸序列的突变。利用上述引物合成的FR中，导入了核苷酸序列的突变。通过用上述方法测定并评价置换了氨基酸的突变型抗体与抗原的结合活性，可以选择具有所需性质的突变FR序列(Sato，K.等人.，Cancer Res，1993，53，851～856)。
另外，人抗体的获得方法也是已知的。例如，在体外用所需抗原或表达所需抗原的细胞致敏人淋巴细胞。接着，使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞融合，从而可以获得与抗原具有结合活性的所需人抗体(参照日本特公平1-59878)。在作为融合配偶体的人骨髓瘤细胞中，例如可以使用U266等。
通过用所需抗原对具有完全人抗体基因的所有组成成分的转基因动物进行免疫，可以获得所需的人抗体(参照国际公开WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735)。并且，还已知使用人抗体文库，通过淘选获得人抗体的技术。例如，利用噬菌体展示法，使人抗体的V区作为单链抗体(scFv)在噬菌体表面表达，可以选择与抗原结合的噬菌体。通过分析所选择的噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定了与抗原结合的scFv的DNA序列后，使该V区序列与所需人抗体C区序列进行符合读框的融合，之后插入适当的表达载体中，从而可以制备表达载体。将该表达载体导入上述所例举的优选的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，从而可获得该人抗体。这些方法已经公知(国际公开WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388)。
本发明所使用的抗体，只要与EREG蛋白质结合即可，不仅包括IgG所代表的二价抗体，还包括一价抗体或IgM所代表的多价抗体。本发明的多价抗体包括：具有完全相同的抗原结合部位的多价抗体、或具有一部分或完全不同的抗原结合部位的多价抗体。本发明所使用的抗体并不限于抗体的全长分子，只要与EREG蛋白质结合即可，可以是小分子抗体或其修饰物。
小分子抗体包括全长抗体(whole antibody，例如全长IgG等)的一部分缺失的抗体片段。只要与EREG抗原具有结合能力即可，允许抗体分子的部分缺失。本发明中的抗体片段优选含有重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。VH或VL的氨基酸序列可以包括置换、缺失、附加和/或插入。并且，只要与EREG抗原具有结合能力即可，可以缺失VH和/或VL的一部分。另外，可变区可以进行嵌合或人源化。抗体片段的具体例子例如有：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。小分子抗体的具体例子例如有：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体、sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。这些抗体的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、多聚体)也包含在本发明的小分子抗体中。
抗体片段可以通过用酶处理抗体生成抗体片段而得到。作为生成抗体片段的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶等是公知的。或者，构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体中，之后可以在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.等人.，J.Immunol.(1994)152，2968～2976；Better，M.和Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476～496；Plueckthun，A.和Skerra，A.Methods inEnzymology(1989)178，476～496；Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652～663；Rousseaux，J.等人.，Methods in Enzymology(1989)121，663～669；Bird，R.E.等人.，TIBTECH(1991)9，132～137)。
消化酶切断抗体片段的特定位置，给予下述特定结构的抗体片段。对上述酶解得到的抗体片段应用基因工程方法时，可以使抗体的任意部分缺失。
木瓜蛋白酶消化：F(ab)2或Fab
胃蛋白酶消化：F(ab’)2或Fab’
纤溶酶消化：Facb
因此，本发明中的小分子抗体只要与EREG具有结合亲和性即可，可以是缺失了任意区的抗体片段。并且，特别是在本发明的癌症等细胞增殖性疾病的治疗中，优选抗体维持其效应子活性。即，本发明中优选的小分子抗体具有与EREG的结合亲和性和效应子功能两者。抗体的效应子功能包括ADCC活性和CDC活性。本发明中的治疗用抗体，特别优选具有ADCC活性和/或CDC活性作为效应子功能。
双抗体(Diabody)是指通过基因融合构建的二价抗体片段(HolligerP等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444～6448(1993)；EP404,097号；WO93/11161号等)。双抗体是由两条多肽链构成的二聚体。通常，构成二聚物的多肽链，各自在同一条链中VL和VH通过接头进行结合。双抗体中的接头通常短至VL和VH无法相互结合。具体而言，构成接头的氨基酸残基例如为5个残基左右。因此，编码在同一条多肽链上的VL和VH无法形成单链可变区片段，而是与另一单链可变区片段形成二聚体。其结果，双抗体具有两个抗原结合部位。
scFv可通过连接抗体的H链V区和L链V区而得到。在scFv中，H链V区和L链V区经由接头、优选肽接头进行连接(Huston，J.S.等人.，Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.(1988)85，5879～5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以来自本说明书中作为抗体而记载的任何抗体。对连接V区的肽接头没有特别限定。例如可以使用包含3～25个残基左右的任意单链肽作为接头。具体而言，例如可以使用后述的肽接头等。
V区例如可以按照上述PCR法进行连接。为了利用PCR法连接V区，首先，在下述DNA中，以编码全部或所需的部分氨基酸序列的DNA作为模板：
上述编码抗体H链或H链V区的DNA序列；以及
上述编码抗体L链或L链V区的DNA序列。
编码H链和L链的V区的DNA分别利用PCR法进行扩增，所述PCR法使用具有与应扩增的DNA两端的序列对应的序列的一对引物。接着，准备编码肽接头部分的DNA。编码肽接头的DNA也可利用PCR来合成。在此时使用的引物的5’侧附加可与另外合成的各V区的扩增产物连接的核苷酸序列。接着，利用[H链V区DNA]-[肽接头DNA]-[L链V区DNA]的各DNA和装配PCR用的引物进行PCR反应。
装配PCR用的引物包含在[H链V区DNA]的5’侧退火的引物和在[L链V区DNA]的3’侧退火的引物的组合。即，装配PCR用引物是指可以扩增编码应合成的csFv的全长序列的引物组。另一方面，[肽接头DNA]中附加有可与各V区DNA连接的核苷酸序列。其结果，连接上述DNA，再利用装配PCR用引物，最终以扩增产物的形式生成csFv的全长。暂且制作编码scFv的DNA，按照常规方法可以获取含有上述DNA的表达载体和通过该表达载体转化的重组细胞。其结果，培养所得的重组细胞，使编码该scFv的DNA表达，从而可获得该scFv。
sc(Fv)2是两个VH和两个VL通过接头等连接形成单链的小分子抗体(Hudson等人.，J Immunol.Methods 1999；231：177～189)。sc(Fv)2例如可以通过用接头连接scFv来制备。
优选具有以下特征的抗体，所述特征为：2个VH和2个VL以单链多肽的N末端侧为基点，按照VH、VL、VH、VL([VH]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VL])的顺序排列。
2个VH和2个VL的顺序并不特别限于上述排列，可以按照任何顺序进行排列。例如包括以下排列：
[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]
[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]
[VH]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VL]
[VL]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VH]
[VL]-接头-[VH]-接头-[VL]-接头-[VH]
连接抗体可变区的接头可以使用能够通过基因工程导入的任意肽接头、或化学合成接头(例如参照Protein Engineering，9(3)，299～305，1996)中公开的接头等。本发明中优选肽接头。对肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可以根据目的适当选择。通常，构成肽接头的氨基酸残基为1～100个氨基酸，优选3～50个氨基酸，进一步优选5～30个氨基酸，特别优选为12～18个氨基酸(例如15个氨基酸)。
构成肽接头的氨基酸序列，只要不阻碍scFv的结合活性即可，可以形成任意序列。例如，当为肽接头时，可以使用下述氨基酸序列。
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：23)
Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：24)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：25)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：26)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：27)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：28)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：29)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：30)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：31))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：32))n
[n为1以上的整数]
关于肽接头的氨基酸序列，本领域技术人员可以根据目的适当选择。例如，决定上述肽接头的长度的n通常为1～5，优选1～3，更优选为1或2。
因此，本发明中特别优选的sc(Fv)2的方式例如有以下sc(Fv)2。
[VH]-肽接头(15个氨基酸)-[VL]-肽接头(15个氨基酸)-[VH]-肽接头(15个氨基酸)-[VL]
或者，还可以利用化学合成接头(化学交联剂)来连接V区。本发明中可以使用通常用于交联肽化合物等的交联剂。例如下述化学交联剂是公知的。这些交联剂均有销售。
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；
二琥珀酰亚氨基辛二酸酯(DSS)；
双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3)；
二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DSP)；
二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)；
双(琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)；
双(磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(磺基-EGS)；
二琥珀酰亚氨基酒石酸盐(DST)；
二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐(磺基-DST)；
双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)；以及
双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等。
连接4个抗体可变区时，通常需要3个接头。多个接头可以使用相同的接头，也可以使用不同的接头。本发明中，优选的小分子抗体为双抗体或sc(Fv)2。为了获得上述小分子抗体，可以用酶、例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等处理抗体，生成抗体片段；或者构建编码这些抗体片段的DNA，将其导入表达载体中，之后在适当的宿主细胞中表达即可(例如参照Co，M.S.等人.，J.Immunol.(1994)152，2968～2976；Better，M.和Horwitz，A.H.Methods Enzymol(1989)178，476～496；Plueckthun，A.和Skerra，A.Methods Enzymol(1989)178，497～515；Lamoyi，E.，Methods Enzymol(1986)121，652～663；Rousseaux，J.等人.，Methods Enzymol(1986)121，663～669；Bird，R.E.和Walker，B.W.，Trends Biotechnol.(1991)9，132～137)。
本发明的抗体可以使用识别EREG的任意抗体。例如，优选的抗体可以例示以下(1)～(57)所述的抗体。这些抗体例如可以是全长抗体、小分子抗体、动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
(1)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：2的氨基酸序列(B3#18抗体的H链CDR1序列)、作为CDR2的SEQ ID NO：4的氨基酸序列(B3#18抗体的H链CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO：6的氨基酸序列(B3#18抗体的H链CDR3序列)。
(2)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，该H链具有作为CH(H链恒定区)的SEQ ID NO：8的氨基酸序列的117～452位的氨基酸序列(B3#18抗体的CH序列)。
(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列(DF151小鼠-人嵌合抗体的CH序列)。
(4)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：12的氨基酸序列(B3#18抗体的L链CDR1序列)、作为CDR2的SEQ ID NO：14的氨基酸序列(B3#18抗体的L链CDR2序列)、以及作为CDR3的SEQ ID NO：16的氨基酸序列(B3#18抗体的L链CDR3序列)。
(5)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，该L链具有作为CL(L链恒定区)的SEQ ID NO：18的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列(B3#18抗体的CL的序列)。
(6)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列(B3#18小鼠-人嵌合抗体的CL的序列)。
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链。
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链。
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链。
(10)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：49的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：51的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：53的氨基酸序列。
(11)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：149的氨基酸序列的118～441位的氨基酸序列。
(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(13)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：55的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：57的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：59的氨基酸序列。
(14)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：151的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(15)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(16)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(13)所述的L链。
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链。
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链。
(19)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：61的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：63的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：65的氨基酸序列。
(20)抗体，该抗体含有(19)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：153的氨基酸序列的116～439位的氨基酸序列。
(21)抗体，该抗体含有(19)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(22)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：67的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：69的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：71的氨基酸序列。
(23)抗体，该抗体含有(22)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：155的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(24)抗体，该抗体含有(22)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(25)抗体，该抗体具有(19)所述的H链和(22)所述的L链。
(26)抗体，该抗体具有(20)所述的H链和(23)所述的L链。
(27)抗体，该抗体具有(21)所述的H链和(24)所述的L链。
(28)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：73的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：75的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：77的氨基酸序列。
(29)抗体，该抗体含有(28)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：157的氨基酸序列的119～442位的氨基酸序列。
(30)抗体，该抗体含有(28)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(31)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：79的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：81的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：83的氨基酸序列。
(32)抗体，该抗体含有(31)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：159的氨基酸序列的109～215位的氨基酸序列。
(33)抗体，该抗体含有(31)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(34)抗体，该抗体含有(28)所述的H链和(31)所述的L链。
(35)抗体，该抗体含有(29)所述的H链和(32)所述的L链。
(36)抗体，该抗体含有(30)所述的H链和(33)所述的L链。
(37)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：85的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：87的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：89的氨基酸序列。
(38)抗体，该抗体含有(37)所述的H链，所述H链具有作为CH的SEQ ID NO：161的氨基酸序列的117～440位的氨基酸序列。
(39)抗体，该抗体含有(37)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(40)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：91的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：93的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：95的氨基酸序列。
(41)抗体，该抗体含有(40)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：163的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(42)抗体，该抗体含有(40)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(43)抗体，该抗体具有(37)所述的H链和(40)所述的L链。
(44)抗体，该抗体具有(38)所述的H链和(41)所述的L链。
(45)抗体，该抗体具有(39)所述的H链和(42)所述的L链。
(46)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：97的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：99的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：101的氨基酸序列。
(47)抗体，该抗体含有(46)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：165的氨基酸序列的113～436位的氨基酸序列。
(48)抗体，该抗体含有(46)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(49)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：103的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：105的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：107的氨基酸序列。
(50)抗体，该抗体含有(49)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：167的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(51)抗体，该抗体含有(49)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(52)抗体，该抗体具有(46)所述的H链和(49)所述的L链。
(53)抗体，该抗体具有(47)所述的H链和(50)所述的L链。
(54)抗体，该抗体具有(48)所述的H链和(51)所述的L链。
(55)抗体，该抗体是在(1)～(54)中任一项所述的抗体中有一个或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(54)中任一项所述的抗体具有同等活性。
(56)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(1)～(55)中任一项所述的抗体所结合的EREG蛋白质的表位相同。
(57)(1)～(56)中任一项所述的抗体的小分子抗体。
上述(1)所述的具有下述CDR的H链中的VH可以例示：具有SEQID NO：44所述氨基酸序列(B3#18抗体的VH序列)的VH。
CDR1：SEQ ID NO：2的氨基酸序列(B3#18(EP27)抗体的H链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：4的氨基酸序列(B3#18(EP27)抗体的H链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：6的氨基酸序列(B3#18(EP27)抗体的H链的CDR3序列)
上述(4)所述的具有下述CDR的L链中的VL可以例示：具有SEQID NO：46所述氨基酸序列(B3#18抗体的VL序列)的VL。
CDR1：SEQ ID NO：12的氨基酸序列(B3#18(EP27)抗体的L链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：14的氨基酸序列(B3#18(EP27)抗体的L链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：16的氨基酸序列(B3#18(EP27)抗体的L链的CDR3序列)
上述(10)所述的具有下述CDR的H链中的VH可以例示：具有SEQ ID NO：109所述氨基酸序列(C7(EP03)的VH序列)的VH。
CDR1：SEQ ID NO：49的氨基酸序列(C7(EP03)抗体的H链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：51的氨基酸序列(C7(EP03)抗体的H链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：53的氨基酸序列(C7(EP03)抗体的H链的CDR3序列)
上述(13)所述的具有下述CDR的L链中的VL可以例示：具有SEQ ID NO：111所述氨基酸序列(C7(EP03)抗体的VL序列)的VL。
CDR1：SEQ ID NO：55的氨基酸序列(C7(EP03)抗体的L链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：57的氨基酸序列(C7(EP03)抗体的L链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：59的氨基酸序列(C7(EP03)抗体的L链的CDR3序列)
上述(19)所述的具有下述CDR的H链中的VH可以例示：具有SEQ ID NO：113所述氨基酸序列(#15(EP08)的VH序列)的VH。
CDR1：SEQ ID NO：61的氨基酸序列(#15(EP08)抗体的H链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：63的氨基酸序列(#15(EP08)抗体的H链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：65的氨基酸序列(#15(EP08)抗体的H链的CDR3序列)
上述(22)所述的具有下述CDR的L链中的VL可以例示：具有SEQ ID NO：115所述氨基酸序列(#15(EP08)抗体的VL序列)的VL。
CDR1∶SEQ ID NO：67的氨基酸序列(#15(EP08)抗体的L链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：69的氨基酸序列(#15(EP08)抗体的L链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：71的氨基酸序列(#15(EP08)抗体的L链的CDR3序列)
上述(28)所述的具有下述CDR的H链中的VH可以例示：具有SEQ ID NO：117所述氨基酸序列(B2#30(EP20)的VH序列)的VH。
CDR1：SEQ ID NO：73的氨基酸序列(B2#30(EP20)抗体的H链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：75的氨基酸序列(B2#30(EP20)抗体的H链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：77的氨基酸序列(B2#30(EP20)抗体的H链的CDR3序列)
上述(31)所述的具有下述CDR的L链中的VL可以例示：具有SEQ ID NO：119所述氨基酸序列(B2#30(EP20)抗体的VL序列)的VL。
CDR1：SEQ ID NO：79的氨基酸序列(B2#30(EP20)抗体的L链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：81的氨基酸序列(B2#30(EP20)抗体的L链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：83的氨基酸序列(B2#30(EP20)抗体的L链的CDR3序列)
上述(37)所述的具有下述CDR的H链中的VH可以例示：具有SEQ ID NO：121所述氨基酸序列(B3#8(EP24)抗体的VH序列)的VH。
CDR1：SEQ ID NO：85的氨基酸序列(B3#8(EP24)抗体的H链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：87的氨基酸序列(B3#8(EP24)抗体的H链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：89的氨基酸序列(B3#8(EP24)抗体的H链的CDR3序列)
上述(40)所述的具有下述CDR的L链中的VL可以例示：具有SEQ ID NO：123所述氨基酸序列(B3#8(EP24)抗体的VL序列)的VL。
CDR1：SEQ ID NO：91的氨基酸序列(B3#8(EP24)抗体的L链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：93的氨基酸序列(B3#8(EP24)抗体的L链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：95的氨基酸序列(B3#8(EP24)抗体的L链的CDR3序列)
上述(46)所述的具有下述CDR的H链中的VH可以例示：具有SEQ ID NO：125所述氨基酸序列(B3#41(EP29)抗体的VH序列)的VH。
CDR1：SEQ ID NO：97的氨基酸序列(B3#41(EP29)抗体的H链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：99的氨基酸序列(B3#41(EP29)抗体的H链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：101的氨基酸序列(B3#41(EP29)抗体的H链的CDR3序列)
上述(49)所述的具有下述CDR的L链中的VL可以例示：具有SEQ ID NO：127所述氨基酸序列(B3#41(EP29)抗体的VL序列)的VL。
CDR1：SEQ ID NO：103的氨基酸序列(B3#41(EP29)抗体的L链的CDR1序列)；
CDR2：SEQ ID NO：105的氨基酸序列(B3#41(EP29)抗体的L链的CDR2序列)；以及
CDR3：SEQ ID NO：107的氨基酸序列(B3#41(EP29)抗体的L链的CDR3序列)
上述(1)～(57)所述的抗体不仅包括一价抗体，还包括二价以上的多价抗体。本发明的多价抗体包括具有完全相同的抗原结合部位的多价抗体、或者具有一部分或完全不同的抗原结合部位的多价抗体。
上述(55)所述抗体的优选方式为：CDR未被修饰的抗体。例如，上述(55)所述的抗体中，“在(1)所述的抗体中，有一个或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的、与(1)所述的抗体具有同等活性的抗体”的优选方式为：“抗体，该抗体为与(1)所述的抗体具有同等活性、在(1)所述的抗体中有一个或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，其含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQID NO：2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：6的氨基酸序列”。上述(55)所述的抗体中，其它抗体的优选方式也可同样描述。
向多肽中导入突变的方法，是用于制备与某种多肽功能相同的多肽的、本领域技术人员所熟知的方法之一。例如，本领域技术人员可采用位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh，T.等人.(1995)Gene 152，271～275；Zoller，MJ，和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468～500；Kramer，W.等人.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441～9456；Kramer，W.和Fritz HJ(1987)Methods Enzymol.154，350～367；Kunkel，TA(1985)Proc Natl Acid Sci USA.82，488～492；Kunkel(1988)Methods.Enzymol.85，2763～2766)等，向本发明的抗体中导入适当的突变，从而可以制备与该抗体功能相同的抗体。另外，氨基酸的突变在自然界中也可发生。如上所述，在本发明抗体的氨基酸序列中，具有一个或多个氨基酸发生突变的氨基酸序列、且与该抗体功能相同的抗体也包含在本发明的抗体中。
上述突变体中，突变的氨基酸数目通常为50个氨基酸以内，优选为30个氨基酸以内，进一步优选为10个氨基酸以内(例如5个氨基酸以内)。
在突变的氨基酸残基中，优选突变成保存有氨基酸侧链的性质的其它氨基酸。例如，根据氨基酸侧链的性质，确立以下分类：
疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；
亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；
具有脂族支链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)；
具有含羟基支链的氨基酸(S、T、Y)；
具有含硫原子支链的氨基酸(C、M)；
具有羧酸和含酰胺支链的氨基酸(D、N、E、Q)；
具有碱性支链的氨基酸(R、K、H)；以及
具有含芳族支链的氨基酸(H、F、Y、W)
(括号内均表示氨基酸的单一字母标记)。
已知具有对某一氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的缺失、附加和/或用其它氨基酸的置换进行修饰的氨基酸序列的多肽可保持其生物学活性(Mark，D.F.等人.，Proc.Natl.Acid.Sci.USA(1984)81，5662～5666；Zoller，M.J.和Smith，M.，Nucleic Acid Research(1982)10，6487～6500；Wang，A.等人.，Science 224，1431～1433；Dalbadie-McFarland，G.等人.，Proc.Natl.Acid.Sci.USA.(1982)79，6409～6413)。即，通常构成某多肽的氨基酸序列中，被分成各组的氨基酸在相互置换时，该多肽的活性得以保持的可能性高。本发明中，将上述氨基酸组的组内氨基酸间的置换称作保守置换。
本发明还提供与表位结合的抗体，所述表位与本发明所公开的抗EREG抗体所结合的表位相同。即，本发明涉及识别与上述(1)～(57)中任一项的抗体所识别的表位相同的表位的抗体及其用途。上述抗体例如可以通过以下方法获得。
被检抗体与某抗体共有表位，这可通过两者对同一表位的竞争来确认。抗体间的竞争通过交叉阻断测定等进行检测。例如，竞争ELISA测定为优选的交叉阻断测定。
具体而言，在交叉阻断测定中，在候选的竞争抗体的存在或非存在下，培养包被在微量板的孔上的EREG蛋白质，之后添加本发明的抗EREG抗体。与孔中的EREG蛋白质结合的本发明的抗EREG抗体的量与对相同表位竞争性结合的候选竞争抗体(被检抗体)的结合能力间接相关。即，被检抗体与相同表位的亲和性越大，则本发明的抗EREG抗体与包被EREG蛋白质的孔的结合活性越降低。或者反之，被检抗体与同一表位的亲和性越大，则被检抗体与包被EREG蛋白质的孔的结合活性越增加。
关于与孔结合的抗体量，通过预先标记抗体，可以容易地测定。例如，生物素标记的抗体可通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物和适当的底物来测定。将利用了过氧化物酶等酶标记的交叉阻断测定特别地称作竞争ELISA测定。抗体可以用可检测或可测定的其它标记物标记。具体而言，放射标记或荧光标记等是公知的。
并且，当被检抗体具有来自与本发明的抗EREG抗体不同种的恒定区时，还可以通过识别任一恒定区的标记抗体来测定与孔结合的任一种抗体。或者，即使是来自同种的抗体，当类别(class)不同时，可以利用识别各类别的抗体测定与孔结合的抗体。
与在候选竞争抗体非存在下实施的对照试验中得到的结合活性相比，候选抗体可以阻断至少20％、优选至少20～50％、进一步优选至少50％的抗EREG抗体的结合时，该候选竞争抗体是与本发明的抗EREG抗体实质上结合在同一表位上、或者是竞争结合在同一表位上的抗体。结合在与抗EREG抗体所结合的表位相同的表位上的抗体例如有上述(57)所述的抗体，但并不限于此。
如上所述，上述(1)～(57)所述的抗体中不仅包括一价抗体，还包括多价抗体。本发明的多价抗体中，包括具有完全相同的抗原结合部位的多价抗体、或者具有部分或完全不同的抗原结合部位的多价抗体。
作为抗体修饰物，还可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。而且，抗体上还可以结合化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等。上述抗体修饰物(以下称为抗体缀合物)可以通过对所得抗体施行化学修饰而获得。尚需说明的是，抗体的修饰方法在该领域中已经确立。如后所述，还可以以双特异性抗体(bispecific antibody)等分子型的形式获取，所述双特异性抗体通过基因重组技术设计成不仅识别EREG蛋白质、还识别化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等的形式。本发明中的“抗体”也包括这些抗体。
与抗EREG抗体结合、发挥细胞毒活性作用的化疗药物可以例示如下述化疗药物：
阿扎立平、阿那曲唑、5-氮杂胞苷、博来霉素、硼替佐米(Bortezomib)、苔藓抑素-1、白消安、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、道诺霉素葡萄糖醛酸苷、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基尿、伊达比星、异环磷酰胺、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、普卡霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、泼尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、紫杉烷类、泰素、丙酸睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、长春碱、长春瑞滨、长春新碱。
本发明中，优选的化疗药物为小分子化疗药物。小分子化疗药物与抗体结合后，其干涉抗体功能的可能性也小。本发明中，小分子化疗药物通常具有100～2000、优选200～1000的分子量。此处例示的化疗药物均为小分子化疗药物。本发明中的这些化疗药物包括在机体内转化成活性化疗药物的前体药物。前体药物的活化可以是酶转化，也可以是非酶转化。
另外，还可以用蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、豹蛙酶(Onconase)、DNase I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、L-天冬酰胺酶、PEG L-天冬酰胺酶等毒性肽修饰抗体。在另一方式中，将一种或两种以上的低分子化疗药物与毒性肽分别组合，可用于抗体的修饰。抗EREG抗体与上述小分子化疗药物的结合可以利用共价键或非共价键。结合有上述化疗药物的抗体的制备方法是公知的。
并且，蛋白质性的药物或毒素可以通过基因工程的方法与抗体结合。具体而言，例如使编码上述毒性肽的DNA与编码抗EREG抗体的DNA进行符合读框的融合，之后整合到表达载体中，可以构建重组载体。将该载体导入适当的宿主细胞中，培养由此得到的转化细胞，使整合的DNA表达，可以以融合蛋白的形式获取结合有毒性肽的抗EREG抗体。以融合蛋白的形式得到抗体时，通常将蛋白质性的药物或毒素配置在抗体的C末端侧。还可以使肽接头介于抗体与蛋白质性的药物或毒素之间。
并且，本发明中使用的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体是指，在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体。本发明中，双特异性抗体可以具有识别EREG分子上的不同表位的抗原结合部位。这种双特异性抗体相对于1分子的EREG可以结合2分子的抗体分子。其结果，有望获得更强效的细胞毒作用。
或者，还可以形成其中一个抗原结合部位识别EREG、另一个抗原结合部位识别细胞毒性物质的双特异性抗体。细胞毒性物质具体包括化疗药物、毒性肽或放射性化学物质等。这种双特异性抗体与表达EREG的细胞结合，另一方面捕获细胞毒性物质。其结果，可以使细胞毒性物质直接作用于表达EREG的细胞。即，利用识别细胞毒性物质的双特异性抗体，可以特异性阻碍肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的增殖。
本发明中，还可以组合识别EREG以外的抗原的双特异性抗体。例如，可以组合识别非EREG抗原的双特异性抗体，所述抗原与EREG一样在作为靶的癌细胞的细胞表面特异性表达。
用于制备双特异性抗体的方法是公知的。例如，使识别抗原不同的两种抗体结合，可以制作双特异性抗体。进行结合的抗体可以是各自具有H链和L链的1/2分子，也可以是仅包含H链的1/4分子。或者，使产生不同的单克隆抗体的杂交瘤融合，也可以制备产生双特异性抗体的融合细胞。并且，利用基因工程方法可以制备双特异性抗体。
如上构建的抗体基因，可以利用公知的方法使之表达并获得。当为哺乳类细胞时，可以使polyA信号与常用的有效启动子、要表达的抗体基因、其3’侧下游进行功能性结合来表达。例如，启动子/增强子可以是人巨细胞病毒早期启动子/增强子。
此外，可以将病毒启动子/增强子、或人延伸因子1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子等用于抗体表达。可以利用启动子/增强子的病毒具体有：逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等。
使用SV40启动子/增强子时，可以采用Mulligan等人的方法(Nature(1979)277，108)。另外，利用Mizushima等人的方法(NucleicAcids Res.(1990)18，5322)，可以容易地将HEF1α启动子/增强子用于目标基因的表达。
当为大肠杆菌时，使常用的有效启动子、用于抗体分泌的信号序列和要表达的抗体基因功能性连接，可以表达该基因。启动子例如有lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可以采用Ward等人的方法(Nature(1989)341，544～546；FASEBJ.(1992)6，2422～2427)。或者，利用Better等人的方法(Science(1988)240，1041～1043)，可以将araB启动子用于目标基因的表达。
用于抗体分泌的信号序列在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pel B信号序列(Lei，S.P.等人.，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。接着，分离在周质中产生的抗体，之后通过使用尿素的胍盐酸盐等蛋白质改性剂，可重折叠抗体的结构，使其具有所需的结合活性。
插入到表达载体中的复制起点可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。并且，为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数，可以向表达载体中插入选择标志物。具体可以使用下述选择标志物：
氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因；
胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因；
大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因；以及
二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
为了制备本发明所使用的抗体，可以使用任意的表达系统、例如真核细胞或原核细胞系统。真核细胞例如有：建立的哺乳类细胞系、昆虫细胞系、真丝状菌细胞和酵母细胞等动物细胞等。原核细胞例如有大肠杆菌细胞等细菌细胞。优选本发明中使用的抗体用哺乳类细胞来表达。哺乳类细胞可以使用：例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero、Hela细胞等。
接下来，将转化的宿主细胞在体外或体内进行培养，产生目标抗体。宿主细胞的培养可以按照公知的方法进行。例如，培养液可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，还可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补液。
如上表达并产生的抗体，可以通过将常规蛋白质纯化中使用的公知方法单独使用或适当组合来进行纯化。例如，可以通过适当选择并组合蛋白A柱等亲和柱、色谱柱、滤器、超滤、盐析、透析等，来分离、纯化抗体(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
测定抗体的抗原结合活性(Antibodies A Laboratory Manual.EdHarlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)时，可以采用公知的方法。例如可以使用ELISA(酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶联免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)或荧光免疫法等。
本发明所使用的抗体可以是糖链被修饰的抗体。已知通过修饰抗体的糖链，可以增强抗体的细胞毒活性。作为糖链被修饰的抗体，例如以下抗体是公知的。
进行糖基化修饰的抗体(WO99/54342等)；
附加在糖链上的岩藻糖缺失的抗体(WO00/61739、WO02/31140等)；
具有具等分GlcNAc的糖链的抗体(WO02/79255等)等。
本发明所使用的抗体优选为具有细胞毒活性的抗体。
本发明中的细胞毒活性例如有：抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒(CDC)活性等。本发明中，CDC活性是指补体系统产生的细胞毒活性。而ADCC活性是指，特异性抗体附着于靶细胞的细胞表面抗原上时，保有Fcγ受体的细胞(免疫细胞等)经由Fcγ受体与其Fc部位结合，给靶细胞带来阻碍的活性。
抗EREG抗体是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活性，这可以利用公知的方法进行测定(例如Current protocols inImmunology，Chapter7.Immunologic studies in humans，Editor，John E，Coligan等人.，John Wiley&Sons，Inc.，(1993)等)。
具体而言，首先，制备效应细胞、补体溶液、靶细胞。
(1)效应细胞的制备
从CBA/N小鼠等中摘出脾脏，在RPMI1640培养基(Invitrogen公司制备)中分离脾细胞。用含有10％胎牛血清(FBS、HyClone公司制备)的相同培养基清洗，之后将细胞浓度调整至5×106个细胞/mL，即可制备效应细胞。
(2)补体溶液的制备
将幼兔补体(Baby Rabbit Complement)(CEDARLANE公司制备)用含有10％FBS的培养基(Invitrogen公司制备)稀释10倍，可以制备补体溶液。
(3)靶细胞的制备
将表达EREG蛋白质的细胞与0.2mCi的51Cr-铬酸钠(GEHealthcare Bio-Sciences公司制备)一起在含有10％FBS的DMEM培养基中、在37℃下培养1小时，从而可以放射性标记该靶细胞。表达EREG蛋白质的细胞可以使用以编码EREG蛋白质的基因转化的细胞、原发性大肠癌、转移性大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌细胞、大肠癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞等。放射性标记后，将细胞用含有10％FBS的RPMI1640培养基清洗3次，将细胞浓度调整至2×105个细胞/mL，从而可以制备该靶细胞。
ADCC活性或CDC活性可以利用下述方法测定。测定ADCC活性时，在96孔U底板(Becton Dickinson公司制造)中分别加入50μL靶细胞和抗EREG抗体，在冰上反应15分钟。之后，加入100μL效应细胞，在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的终浓度为0或10μg/mL。培养后，回收100μL上清，用γ计数仪(COBRAIIAUTO-GAMMA，型号D5005，Packard Instrument Company公司制造)测定放射活性。细胞毒活性(％)可以使用所得值、根据算式(A-C)/(B-C)×100来计算。A表示各试样的放射活性(cpm)，B表示加入了1％NP-40(nacalai tesque公司制备)的试样的放射活性(cpm)，C表示只含靶细胞的试样的放射活性(cpm)。
另一方面，测定CDC活性时，向96孔平底板(Becton Dickinson公司制造)中分别加入50μL靶细胞和抗EREG抗体，在冰上反应15分钟。之后，加入100μL补体溶液，在二氧化碳培养箱内培养4小时。抗体的终浓度为0或3μg/mL。培养后，回收100μL上清，用γ计数仪测定放射活性。细胞毒活性可以和ADCC活性的测定同样计算。
而当测定抗体缀合物产生的细胞毒活性时，向96孔平底板(BectonDickinson公司制造)中分别加入50μL靶细胞和抗EREG抗体缀合物，在冰上反应15分钟。在二氧化碳培养箱内培养1～4小时。使抗体的终浓度达到0或3μg/mL。培养后，回收100μL上清，用γ计数仪测定放射活性。细胞毒活性可以和ADCC活性的测定同样计算。
本发明的具有细胞毒活性的抗体，进一步优选为具有中和活性的抗体。通常，中和活性是指，病毒或毒素等对细胞具有生物学活性的配体抑制该生物学活性的活性。即，具有中和活性的物质是指，与该配体或该配体所结合的受体结合、阻碍该配体与受体结合的物质。利用中和活性阻碍与配体的结合的受体，无法发挥该受体介导的生物学活性。具有这种中和活性的抗体通常被称作中和抗体。该中和活性可以在作为对象的配体的存在下，通过在评价其中和活性的被检物质的存在或非存在下的条件之间比较该生物学活性来测定。
当为被认为是本发明所涉及的EREG的主要受体的EGF受体时，通过配体的结合形成二聚物，将存在于细胞内的自身结构域—酪氨酸激酶活化。被活化的酪氨酸激酶通过自身磷酸化，形成含有磷酸化酪氨酸的肽，使各种信号传递的附属分子与上述肽缔合。上述肽主要是PLCγ(磷脂酶Cγ)、Sch、Grb2等。上述附属分子中，前两者进一步通过EGF受体的酪氨酸激酶进行磷酸化。来自EGF受体的信号传递中的主要途径按照Shc、Grb2、Sos、Ras、Raf/MAPK激酶/MAP激酶的顺序传递磷酸化。认为还存在旁路途径—从PLCγ到PKC的途径。
由于上述细胞内的信号级联在每一细胞种中都不同，所以每种目标靶细胞可以设定适当的靶分子，并不限于上述因子。机体内信号活化的测定试剂盒可以适当使用市售品(例如蛋白激酶C活性测定系统(GE Healthcare Bio-Sciences株式会社)等)。
另外，以对存在于机体内信号级联下游的靶基因的转录诱导作用为指标，也可检测机体内信号的活化。转录活性的变化可以根据报告基因测定的原理进行检测。具体而言，将GFP(绿色荧光蛋白)或荧光素酶等报告基因配置在靶基因的转录因子或启动子区的下游，通过测定其报告基因活性，可以以报告基因活性的形式测定转录活性的变化。
并且，由于EGF受体通常起到促进细胞增殖的作用，所以通过测定靶细胞的增殖活性，可以评价机体内信号传递的活化。本发明中，通过评价后者的细胞增殖活性，来评价本发明的中和抗体的中和活性，但并不限于本方法，对于所选择的每一种靶细胞，可以适当采用上述列举的方法进行评价。
即，例如通过测定下述细胞增殖活性，可以评价或测定抗EREG抗体的中和活性。例如采用下述方法：以添加在培养基中的[3H]标记的胸苷向活细胞中的摄入作为DNA复制能力的指标进行测定的方法。
更简便的方法是在显微镜下计测将台盼蓝等色素排除到细胞外的能力的色素排除法或MTT法。后者利用的是：活细胞具有将四唑盐MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)转化成蓝色的甲
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(formazan)产物的能力。更具体而言，向被检细胞的培养液中添加被检抗体，经过一定时间后向培养液中添加MTT溶液，静置一定时间，使MTT摄入到细胞中。其结果，黄色化合物MTT通过细胞中线粒体内的琥珀酸脱氢酶变换为蓝色化合物。溶解该蓝色产物使其显色，之后测定其吸光度，以此作为活细胞数的指标。
除MTT外，MTS、XTT、WST-1、WST-8等试剂也有销售(nacalaitesque等)，可适当使用。此外，以细胞的ATP或细胞培养物的阻抗(impedance)为指标，评价细胞增殖活性的方法也是公知的。测定活性时，以具有与抗EREG抗体相同的同工型而不具有该中和活性的结合抗体作为对照抗体，与抗EREG抗体同样地加以使用，抗EREG抗体显示出较对照抗体强的中和活性，由此可以判定活性。
增殖被抗EREG抗体抑制的细胞只要是表达EREG蛋白质的细胞即可，没有特别限定。优选的EREG表达细胞例如为癌细胞。具体而言，来自大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌的细胞适合作为本发明中的EREG表达细胞。根据本发明，可以得到对上述癌症的原发病灶和转移病灶均有效的细胞增殖抑制效果。进一步优选的癌细胞为原发性大肠癌、转移性大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌。因此，抗EREG抗体可用于起因于细胞增殖的疾病、例如大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌等的治疗和预防。上述癌症无论是原发病灶还是转移病灶，均可成为治疗或预防的对象。为了治疗和/或预防原发性大肠癌、转移性大肠癌、胰腺癌，更优选使用抗EREG抗体。并且，在上述癌症中，EREG依赖性增殖的癌症优选作为本发明的治疗和/或预防的对象。
本发明还提供多核苷酸，所述多核苷酸是编码本发明抗体的多核苷酸、或者与该多核苷酸在严谨条件下杂交且编码与本发明抗体具有同等活性的抗体的多核苷酸。另外，本发明提供含有上述多核苷酸的载体、含有该载体的转化体(包括转化细胞)。
本发明的多核苷酸只要编码本发明的抗体即可，没有特别限定，可以是包含多个脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等的碱基或碱基对的聚合物。本发明的多核苷酸可以含有天然以外的碱基。
本发明的多核苷酸可以在利用基因工程方法表达抗体时使用。还可以在选择与本发明抗体具有同等功能的抗体时作为探针使用。即，使用编码本发明抗体的多核苷酸或其一部分作为探针，利用杂交、基因扩增技术(例如PCR)等技术，可以获得与该多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码与本发明抗体具有同等活性的抗体的DNA。这种DNA也包括在本发明的多核苷酸中。杂交技术(Sambrook，J等人.，MolecularCloning 2nd ed.，9.47～9.58，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)为本领域技术人员所熟知。
杂交条件例如有低严谨条件。低严谨条件是指，在杂交后的清洗中，例如为42℃、0.1×SSC、0.1％SDS的条件，优选为50℃、0.1×SSC、0.1％SDS的条件。更优选的杂交条件例如有高严谨条件。高严谨条件例如是65℃、5×SSC和0.1％SDS的条件。在这些条件下，可以期待如同提高温度一样，有效获得具有高同源性的多核苷酸。但是，作为影响杂交严谨度的要素，要考虑温度或盐浓度等多个要素，本领域技术人员通过适当选择这些要素，可以实现同样的严谨度。
利用上述杂交技术或基因扩增技术得到的多核苷酸所编码的、与本发明抗体功能同等的抗体，通常在氨基酸序列方面与这些抗体具有高度同源性。本发明的抗体也包括与本发明抗体功能相同、且与该抗体的氨基酸序列具有高同源性的抗体。高同源性是指，在氨基酸水平通常具有至少50％以上的同一性、优选75％以上的同一性、进一步优选85％以上的同一性、更进一步优选95％以上的同一性。确定多肽的同源性时，可以遵照文献(Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.Proc.Natl.Sci.USA(1983)80，726～730)所述的算法。
药物组合物
从另一角度来看，本发明提供含有与EREG蛋白质结合的抗体作为有效成分的药物组合物。此外，本发明涉及含有与EREG蛋白质结合的抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂、特别是抗癌药。优选将本发明的细胞增殖抑制剂和抗癌药给予罹患癌症的对象或有可能罹患癌症的对象。
本发明中，含有与EREG蛋白质结合的抗体作为有效成分的细胞增殖抑制剂还可描述为：抑制细胞增殖的方法，该方法包括将与EREG蛋白质结合的抗体给予对象的步骤；或者，与EREG蛋白质结合的抗体在制造细胞增殖抑制剂中的应用。
本发明中，含有与EREG蛋白质结合的抗体作为有效成分的抗癌药还可描述为：预防或治疗癌症的方法，该方法包括将与EREG蛋白质结合的抗体给予对象的步骤；或者，与EREG蛋白质结合的抗体在制造抗癌药中的应用。
本发明中，“含有与EREG结合的抗体作为有效成分”是指，含有抗EREG抗体作为主要活性成分，并不限定抗EREG抗体的含有率。
本发明的药物组合物(例如细胞增殖抑制剂、抗癌药，下同)中所含的抗体只要与EREG蛋白质结合即可，没有特别限定，可以例示本说明书中所述的抗体。
本发明的药物组合物可以通过口服、胃肠外给药等任一种途径给予患者。优选为胃肠外给药。所述给药方法具体有：注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。注射给药的例子有：例如可以通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部给予本发明的药物组合物。还可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。给药量例如可以在每次、每kg体重0.0001mg～1000mg的范围内选择。或者，例如可以在每位患者0.001mg～100000mg/个体的范围内选择给药量。但本发明的药物组合物并不限于上述给药量。
本发明的药物组合物可以按照常规方法制成制剂(例如Remington’s Pharmaceutical Science，latest edition，Mark PublishingCompany，Easton，U.S.A)，可以同时含有药学上可接受的载体或添加剂。例如有表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。并不限于这些，可以进一步适当使用其它常用的载体。载体具体有：轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
本发明还提供：通过使EREG表达细胞和与EREG蛋白质结合的抗体接触，而在EREG表达细胞中引发毒性的方法或抑制细胞增殖的方法。
即，本发明包括以下方式。
—在EREG表达细胞中引发细胞毒的方法，该方法包括使表达EREG蛋白质的细胞和与EREG蛋白质结合的抗体接触的步骤。
—抑制EREG表达细胞增殖的方法，该方法包括使表达EREG蛋白质的细胞和与EREG蛋白质结合的抗体接触的步骤。
—上述方法，其中，与EREG蛋白质结合的抗体为具有细胞毒活性的抗体。
—上述方法，其中，与EREG蛋白质结合的抗体为具有中和活性的抗体。
—上述方法，其中，与EREG蛋白质结合的抗体为以下(1)～(57)中任一项所述的抗体。
(1)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
(2)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：8的氨基酸序列的117～452位的氨基酸序列。
(3)抗体，该抗体含有(1)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(4)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：14的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
(5)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQID NO：18的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(6)抗体，该抗体含有(4)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(7)抗体，该抗体含有(1)所述的H链和(4)所述的L链。
(8)抗体，该抗体含有(2)所述的H链和(5)所述的L链。
(9)抗体，该抗体含有(3)所述的H链和(6)所述的L链。
(10)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：49的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：51的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：53的氨基酸序列。
(11)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：149的氨基酸序列的118～441位的氨基酸序列。
(12)抗体，该抗体含有(10)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(13)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：55的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：57的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：59的氨基酸序列。
(14)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：151的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(15)抗体，该抗体含有(13)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(16)抗体，该抗体含有(10)所述的H链和(13)所述的L链。
(17)抗体，该抗体含有(11)所述的H链和(14)所述的L链。
(18)抗体，该抗体含有(12)所述的H链和(15)所述的L链。
(19)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：61的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：63的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：65的氨基酸序列。
(20)抗体，该抗体含有(19)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：153的氨基酸序列的116～439位的氨基酸序列。
(21)抗体，该抗体含有(19)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(22)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：67的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：69的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：71的氨基酸序列。
(23)抗体，该抗体含有(22)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：155的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(24)抗体，该抗体含有(22)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(25)抗体，该抗体具有(19)所述的H链和(22)所述的L链。
(26)抗体，该抗体具有(20)所述的H链和(23)所述的L链。
(27)抗体，该抗体具有(21)所述的H链和(24)所述的L链。
(28)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：73的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：75的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：77的氨基酸序列。
(29)抗体，该抗体含有(28)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：157的氨基酸序列的119～442位的氨基酸序列。
(30)抗体，该抗体含有(28)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(31)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：79的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：81的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：83的氨基酸序列。
(32)抗体，该抗体含有(31)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：159的氨基酸序列的109～215位的氨基酸序列。
(33)抗体，该抗体含有(31)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(34)抗体，该抗体含有(28)所述的H链和(31)所述的L链。
(35)抗体，该抗体含有(29)所述的H链和(32)所述的L链。
(36)抗体，该抗体含有(30)所述的H链和(33)所述的L链。
(37)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：85的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：87的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：89的氨基酸序列。
(38)抗体，该抗体含有(37)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：161的氨基酸序列的117～440位的氨基酸序列。
(39)抗体，该抗体含有(37)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(40)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：91的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：93的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：95的氨基酸序列。
(41)抗体，该抗体含有(40)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：163的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(42)抗体，该抗体含有(40)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(43)抗体，该抗体具有(37)所述的H链和(40)所述的L链。
(44)抗体，该抗体具有(38)所述的H链和(41)所述的L链。
(45)抗体，该抗体具有(39)所述的H链和(42)所述的L链。
(46)抗体，该抗体含有H链，所述H链具有作为CDR1的SEQ IDNO：97的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：99的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：101的氨基酸序列。
(47)抗体，该抗体含有(46)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：165的氨基酸序列的113～436位的氨基酸序列。
(48)抗体，该抗体含有(46)所述的H链，该H链具有作为CH的SEQ ID NO：10的氨基酸序列的117～446位的氨基酸序列。
(49)抗体，该抗体含有L链，所述L链具有作为CDR1的SEQ IDNO：103的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：105的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO：107的氨基酸序列。
(50)抗体，该抗体含有(49)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：167的氨基酸序列的108～214位的氨基酸序列。
(51)抗体，该抗体含有(49)所述的L链，该L链具有作为CL的SEQ ID NO：20的氨基酸序列的107～213位的氨基酸序列。
(52)抗体，该抗体具有(46)所述的H链和(49)所述的L链。
(53)抗体，该抗体具有(47)所述的H链和(50)所述的L链。
(54)抗体，该抗体具有(48)所述的H链和(51)所述的L链。
(55)抗体，该抗体是在(1)～(54)中任一项所述的抗体中有一个或多个氨基酸被置换、缺失、附加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(54)中任一项所述的抗体具有同等活性。
(56)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(1)～(55)中任一项所述的抗体所结合的EREG蛋白质的表位相同。
(57)(1)～(56)中任一项所述的抗体的小分子抗体。
—上述方法，其中，表达EREG蛋白质的细胞为癌细胞。
如上所述，上述(1)～(57)所述的抗体中，不仅包括一价抗体，还包括二价以上的多价抗体。本发明的多价抗体中，包括具有完全相同的抗原结合部位的多价抗体、或具有部分或完全不同的抗原结合部位的多价抗体。
如上所述，与EREG蛋白质结合的抗体作为本发明的细胞增殖抑制剂中所含的与EREG蛋白质结合的抗体。抗EREG抗体所结合的细胞只要是表达EREG的细胞即可，没有特别限定。本发明中优选的EREG表达细胞为癌细胞。更优选为大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌和肾癌的细胞。本发明的方法对上述癌症的原发病灶和转移病灶均适用。进一步优选的癌细胞为原发性大肠癌、转移性大肠癌和胰腺癌的细胞。
本发明中，“接触”例如可以通过向在试管内培养的EREG表达细胞的培养液中添加抗体来进行。这种情况下，所添加的抗体的形状可以适当使用溶液或通过冷冻干燥等得到的固体等形状。以水溶液形式添加时，可以是纯粹地只含有抗体的水溶液，也可以是含有例如上述表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。对添加浓度没有特别限定，但培养液中的最终浓度优选为1pg/mL～1g/mL的范围，更优选为1ng/mL～1mg/mL，进一步优选使用1μg/mL～1mg/mL。
在另一方式中，本发明中的“接触”还可以通过对将EREG表达细胞移植到体内的非人动物、或具有内源性表达EREG的癌细胞的动物进行给药来进行。给药方法可以通过口服、胃肠外给药中的任一种途径来实施。特别优选为胃肠外给药的给药方法，所述给药方法具体有：注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。注射给药的例子例如有：通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部给予本发明的药物组合物、细胞增殖抑制剂和抗癌药。此外，可以根据受试动物的年龄、症状选择适当的给药方法。以水溶液形式给药时，可以是纯粹地只含有抗体的水溶液，也可以是含有例如上述表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等的溶液。给药量例如可以在每次、每kg体重0.0001mg～1000mg/的范围内选择。或者，例如可以在每位患者0.001mg～100000mg/个体的范围内选择给药量。但本发明的抗体给药量并不限于上述给药量。
作为评价或测定通过抗EREG抗体的接触在EREG表达细胞中引发的细胞毒的方法，优选采用以下方法。在试管内评价或测定该细胞毒活性的方法有：上述抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性、补体依赖性细胞毒(CDC)活性等的测定方法。抗EREG抗体是否具有ADCC活性、或者是否具有CDC活性，这可以按照公知的方法进行测定(例如Current protocols in Immunology，Chapter 7.Immunologicstudies in humans，Editor，John E，Coligan等人.，John Wiley&Sons，Inc.，(1993)等)。测定活性时，以具有与抗EREG抗体相同的同工型、但不具有该细胞毒活性的结合抗体作为对照抗体，与抗EREG抗体同样地加以使用，根据抗EREG抗体显示出较对照抗体强的细胞毒活性，可以判定活性。
抗体的同工型由该抗体的氨基酸序列的H链恒定区的序列来规定。在机体内，根据产生抗体的B细胞成熟时发生的染色体上的基因重组所产生的类别转换，最终决定抗体的同工型。同工型的不同反映在抗体的生理、病理性功能的不同。具体而言，例如已知细胞毒活性的强度和抗原的表达量同时受抗体的同工型影响。因此，测定上述细胞毒活性时，用作对照的抗体优选使用与被检抗体相同的同工型。
此外，为了在机体内评价或测定细胞毒活性，例如将表达EREG的癌细胞移植到非人被检动物的皮内或皮下，之后从当天或第二天起每天或间隔数天静脉或腹腔内给予被检抗体。通过每天测定肿瘤的大小，可以确定细胞毒活性。与试管内的评价同样，给予具有相同同工型的对照抗体，根据抗EREG抗体给药组的肿瘤大小明显小于对照抗体给药组的肿瘤大小，可以判定细胞毒活性。使用小鼠作为非人被检动物时，可适当使用遗传性缺失胸腺从而缺失其T淋巴细胞的功能的裸小鼠(nu/nu)。通过使用该小鼠，在评价、测定给予的抗体所产生的细胞毒活性时，可以排除被检动物中T淋巴细胞的干预。
作为评价或测定由抗EREG抗体的接触产生的对EREG表达细胞增殖的抑制效果的方法，可以适当使用与上述中和活性测定方法相同的方法。
作为在机体内评价或测定细胞增殖抑制活性的方法，可适当使用与上述在机体内评价或测定细胞毒活性的方法相同的方法。
筛选方法
由本发明人等明确：细胞分泌的EREG诱导EREG依赖性增殖的细胞的细胞增殖。还确认到：EREG在癌细胞中特异性表达亢进。因此，通过抑制EREG表达细胞中EREG的表达水平，可以治疗癌症。即，根据本发明，表明了抑制癌细胞的EREG表达水平的化合物可作为癌症治疗药的候选化合物。基于上述认识，本发明提供癌症治疗药的候选化合物的筛选方法，该方法包括以下步骤：
(1)使被检化合物与EREG表达细胞接触的步骤；
(2)测定EREG表达细胞中EREG的表达水平的步骤；以及
(3)选择与对照相比使EREG的表达水平降低的化合物作为癌症治疗药的候选化合物的步骤。
本发明中，EREG表达细胞例如可以使用表达EREG的癌细胞。具体而言，例如在图2中显示出EREG的表达亢进的癌细胞株均可在本发明的筛选方法中应用。具体而言，作为可用于本发明的筛选方法的细胞，可以使用下述癌细胞株。以下例示的细胞株均可从细胞库获取。上述细胞株的培养条件已经确立。具体可以在例如表2所示的条件下培养。
食道癌细胞株：TE2
胃癌细胞株：GT3
          ：MKN45
          ：2M
          ：2MD3
大肠癌细胞株：CACO2
            ：DLD1
            ：hCT116
            ：LOVO
肝癌细胞株：Alexander(亚历山大细胞)
胰腺癌细胞株：Capan1
            ：Paca2
            ：PK-1
肾癌细胞株：Caki1
          ：Caki2
肺癌细胞株：A549
          ：H157
          ：H1648
          ：H2009
          ：H23
          ：H2347
          ：H522
在被检化合物的存在下培养上述细胞株，测定该细胞株中EREG的表达水平。EREG的表达水平可以通过测定细胞内mRNA的量、或者分泌在细胞内、细胞表面或细胞外的EREG蛋白质的量来评价。EREG的mRNA或蛋白质的测定方法可以采用本说明书中所述的任意方法。由本发明人等确认：所分泌的EREG在EREG依赖性增殖的细胞中的细胞增殖诱导作用。因此，以分泌在细胞外的EREG的量为指标的抗癌药候选化合物的筛选方法是本发明的优选方式。
本发明中，与对照相比EREG的表达水平低的被检化合物被选择作为目标候选化合物。本发明中的对照例如可以使用在被检化合物的非存在下培养的相同细胞株。或者，还可以以在预先已明确对EREG表达水平具有影响的化合物的存在下培养的细胞株作为对照。通过使用上述对象，还可以选择较某种化合物的作用更大的化合物。
本发明中，还可以以被检化合物对EREG的中和作用为指标，来筛选癌症治疗药。即，本发明涉及癌症治疗药的候选化合物的筛选方法，该方法包括以下步骤：
(1)在EREG和被检化合物的存在下，培养EREG依赖性增殖的细胞的步骤；
(2)测定细胞增殖水平的步骤；以及
(3)选择与对照相比抑制了细胞增殖的被检化合物作为癌症治疗药的候选化合物的步骤。
本发明中，EREG依赖性增殖的细胞是指，对EREG显示出用量依赖性细胞增殖的细胞。例如在后述实施例中，胰腺癌细胞株AsPC1显示出EREG的用量依赖性细胞增殖。或者，根据本发明人等的认识，明确了通过使EGF受体/G-CSF受体的嵌合受体表达，可以赋予EREG依赖性。具体而言，用编码包含EGF受体的胞外结构域和G-CSF受体的胞内结构域的嵌合受体的DNA转化的小鼠细胞，对人EREG显示出用量依赖性的细胞增殖。因此，如此操作而人为诱导出EGFR依赖性的细胞也可应用于本发明的筛选方法。
然后，测定在EREG和被检化合物的存在下培养的EREG依赖性增殖的细胞的增殖水平。细胞增殖可以按照任意的方法进行测定。例如，可以使用实施例所示的市售的存活细胞计数用试剂，来比较存活细胞数。或者，用于有效进行更大规模的筛选的系统也有销售。例如，可以使用多孔板来评价各孔的存活细胞数的系统已实际应用。比较存活细胞数的结果，可以选择与对照相比抑制了细胞数增加的被检化合物作为癌症治疗药的候选化合物。
在本发明的筛选方法中，例如可以使用在被检化合物的非存在下培养的相同细胞株作为对照。或者，还可以以在预先已明确对由EREG的分泌形式产生的细胞增殖诱导作用具有影响的化合物的存在下培养的细胞株作为对照。通过使用上述对象，还可以选择较某种化合物的作用更大的化合物。
按照本发明的筛选方法选择的候选化合物，可以作为以抑制EREG的作用为作用机理的抗癌药的治疗药的候选化合物。本发明中，通过抗EREG抗体可确认癌症的治疗效果。因此，按照本发明的筛选方法选择的化合物，也可期待与抗体相同的作用。按照本发明的筛选方法选择的候选化合物，根据需要，进一步评价其对其它癌细胞株或初代培养细胞的作用、以及对正常细胞的毒性等的影响。通过上述评价，可以选择可作为癌症治疗药的化合物。一系列的作为癌症治疗药的评价方法已经确立。
在本发明的筛选方法中，可以使用天然的或人工合成的所有化合物作为被检化合物。例如，本发明中的被检化合物的文库优选蛋白质文库或抗体文库。或者，还可以以提呈蛋白质或抗体的噬菌体文库作为被检化合物。并且，还可以使用组合文库等人工合成化合物的文库作为被检化合物。
需要说明的是，本说明书中引用的所有先行技术文献均作为参照而纳入本说明书中。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的范围并不受这些实施例的限定。
实施例1.各种癌症中的人EREG的基因表达分析
1-1.使用基因芯片的人EREG基因表达分析
为了探索在大肠癌或胰腺癌等癌组织中特异性表达亢进的基因，使用基因芯片U133A(Affymetrix公司制备)，实施正常组织、癌组织和癌细胞株的网罗性(comprehensive)基因表达分析。
首先，使用ISOGEN(Nippon Gene公司制备)，按照常规方法由表1和表2所示的正常组织、癌组织和癌细胞株制备总RNA。然后，使用各10μg的上述总RNA，供给使用基因芯片U-133A(Affymetrix公司制备)的转录分析，从而进行基因表达分析。该方法根据表达分析技术手册(Affymetrix公司制订)来实施。以全部基因的表达分值的平均值作为100，探索在癌组织或癌细胞中表达亢进的基因。
其结果，明确了人EREG mRNA(探针ID：205767_at HG-U133A)在调查的正常组织中没有显著的表达，而在原发性大肠癌、转移性大肠癌、肺腺癌、胰腺癌组织以及大肠癌细胞株(CACO2、DLD1、HCT116、LOVO)、胃癌细胞株(2M、2MD3)、肝癌细胞株(Alexander)、胰腺癌细胞株(Capan1、Paca2)、肾癌细胞株(Caki1、Caki2)、以及原发性大肠癌、转移性大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌细胞株(H157、H1648、H2009、H23、H2347)中表达亢进(图1和图2)。
由以上结果可知：人EREG基因(探针ID：205767_at HG-U133A)在正常组织中表达量非常低；相对于此，在原发性大肠癌、转移性大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、大肠癌、胰腺癌、胃癌和肾癌等广泛的癌症种类中表达亢进。
[表1]
EREG基因表达分析中使用的组织
组织 来源
全脑 Clontech 64020-1
肺 临床检样1例
气管 Clontech 64091-1
心脏 Ambion 7966
肾脏 Ambion 7976
肝脏 临床样品(外科)
胰脏 Ambion 7954
胃 临床样品(外科)
小肠 Ambion 7984
大肠 Ambion 7986
骨髓 Clontech 64106-1
末梢血单核细胞 临床检样1例
睾丸 Clontech 64027-1
前列腺 Ambion 7988
卵巢 Ambion 7974
皮肤 Stratagene 735031
肺腺癌1 临床检样1例
肺腺癌2 临床检样1例
肺腺癌3 临床检样1例
肺腺癌4 临床检样1例
肺腺癌5 临床检样1例
原发性大肠癌1 临床检样1例
原发性大肠癌2 临床检样1例
原发性大肠癌3 临床检样1例
原发性大肠癌4 临床检样1例
转移性大肠癌1 临床检样1例
转移性大肠癌2 临床检样1例
转移性大肠癌3 临床检样1例
转移性大肠癌4 临床检样1例
转移性大肠癌5 临床检样1例
转移性大肠癌6 临床检样1例
转移性大肠癌7 临床检样1例
胰腺癌1 临床检样1例
胰腺癌2 临床检样1例
胰腺癌3 临床检样1例
胰腺癌4 临床检样1例
[表2]
EREG基因表达分析中使用的细胞株和培养条件
癌种类 细胞株 培养基 血清(％)
脑肿瘤 U251 DMEM 10
乳腺癌 MCF7 RPMI1640 10
食道癌 TE2 RPMI1640 10
胃癌 AGS RPMI1640 10
GT3 DMEM 10
KatoIII RPMI1640∶DMEM＝1∶1 10
MKN45 RPMI1640 10
MKN74 RPMI1640 10
2M DMEM 10
2MD3 DMEM 10
大肠癌 CACO2 DMEM 20
DLD1 RPMI1640 10
hCT116 McCoy5A 10
LOVO HamF12∶DMEM＝1∶1 10
SW480 RPMI1640 10
肝癌 Alexander DMEM 10
HepG2 DMEM 10
HLE DMEM 10
HuH6 DMEM 10
HuH7 DMEM 10
胰腺癌 Capan1 DMEM 20
KLM1 RPMI1640 10
Pane1 RPMI1640 10
Paca2 RPMI1640 10
PK-1 RPMI1640 10
肾癌 Caki1 RPMI1640 10
Caki2 RPMI1640 10
肺癌 A549 DMEM 10
Lu130 RPMI1640 10
H1359 RPMI1640 10
H157 RPMI1640 10
H1648 HamF12∶DMEM＝1∶1 10
H2009 HamF12∶DMEM＝1∶1 10
H23 RPMI1640 10
H2347 RPMI1640 10
H522 RPMI1640 10
子宫颈癌 Hela DMEM 10
实施例2.抗EREG单克隆抗体的制作
2-1.表达全长人EREG的细胞的建立
将序列如SEQ ID NO：21所示的全长人EREG cDNA(NM_001432)按常规方法进行分离，将其基因片段克隆到哺乳细胞表达用载体(pMCN)中，命名为hEREG/pMCN。pMCN可以在小鼠CMV启动子(ACCESSION No.U68299)的控制下表达诱导外来基因，并且是插入有新霉素抗性基因的载体。利用电穿孔法将hEREG/pMCN导入CHO细胞DG44株(Invitrogen公司)中，通过在500μg/mL的遗传霉素(Geneticin)中选择，建立恒定表达全长人EREG的CHO细胞，命名为EREG_DG。
2-2.可溶型人EREG/小鼠IgG2a Fc融合蛋白(sEREG-mFc)的制作
接下来，制作可溶型人EREG/小鼠IgG2a Fc融合蛋白(以下称为sEREG-mFc)，作为用于制作抗EREG抗体的免疫抗原。
在pMCDN载体上构建通过铰链部位的CpoI识别序列连接人EREG胞外区(7-122氨基酸)和小鼠IgG2a恒定区而得到的sEREG_mFc，命名为sEREG_mFc/pMCDN，所述pMCDN载体是将DHFR基因整合到表达载体pMCN中而得到的。SEQ ID NO：33所示的序列表示sEREG_mFc基因的核苷酸序列，SEQ ID NO：34所示的序列表示sEREG_mFc的氨基酸序列。利用电穿孔法将sEREG_mFc/pMCDN导入CHO细胞DG44株(Invitrogen公司)中，通过在500μg/mL的遗传霉素中选择，建立表达sEREG_mFc的CHO细胞。
接下来，从培养上清中纯化sEREG_mFc。将培养上清添加到HiTrap ProteinG HP(Amersham公司CAT#17-0404-01)柱上，用结合缓冲液(20mM的磷酸钠(pH 7.0))清洗后，用洗脱缓冲液(0.1M的甘氨酸-HCl(pH2.7))洗脱目标sEREG_mFc。洗脱液回收到加入了中和缓冲液(1M的Tris-HCl(pH9.0))的管中，立即中和。接下来，将洗脱的sEREG_mFc供给利用Superdex 200 HR 10/30(Amersham公司)进行的凝胶过滤，该溶液被置换成PBS。纯化蛋白的定量使用DC蛋白测定(BIO-RAD公司)来实施，以添附的牛IgG作为标准试样，换算其中含有的蛋白质量。
2-3.抗EREG单克隆抗体的制作
使用Balb/c和MRL/MpJ-Tnfrsf6<lpr>/Crlj小鼠(日本Charles River)作为免疫动物。从5～8周龄开始免疫，初次免疫时按100μg/只制备sEREG_mFc，用弗氏完全佐剂(FCA，Beckton Dickinson公司)制成乳液，将所得乳液进行皮下给药。两周后将制备成50μg/只的sEREG_mFc用弗氏不完全佐剂(FIA，Beckton Dickinson公司)制成乳液，进行皮下给药。以后按1周的间隔追加免疫2～3次，最终免疫是将sEREG_mFc用PBS稀释至50μg/只，进行尾静脉内给药。
最终免疫4天后，摘出脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞P3-X63 Ag8U1(P3U1，购自ATCC)按2∶1进行混合，之后缓慢加入PEG1500(RocheDiagnostics公司)，进行细胞融合。慎重地加入RPMI1640培养基(GIBCO BRL公司)，稀释PEG1500，之后通过离心操作除去PEG1500。之后，用含有10％FBS、1×HAT培养基添加剂(SIGMA公司)、0.5×BM-Condimed H1杂交瘤克隆添加剂(Roche Diagnostics公司)的RPMI1640(以后记作HAT培养基)悬浮，按200μL/孔接种在96孔培养板中。通过使用人流式细胞仪评价与EREG_DG的结合活性，来进行筛选。其结果，利用极限稀释法将显示阳性结合活性的克隆制成单克隆。
再利用使用Helios Gene Gun系统(Bio-Rad)的DNA免疫法对小鼠进行免疫，获取单克隆抗体。金-DNA(人EREG全长表达载体)颗粒在试管上的包被按照Helios Gene Gun操作指南进行。量取50mg 1.0μm的金颗粒，用0.1ml 0.05M的亚精胺溶液悬浮、混合，加入0.1ml1mg/ml的质粒溶液，进行涡旋。再加入0.1ml 1M的CaCl2，放置10分钟，轻微离心后除去上清，用乙醇悬浮、离心。将乙醇脱水的操作重复3次后，最终悬浮于6ml 0.05mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮-乙醇溶液中。将该溶液吸入包被用试管中，包被、干燥试管，用试管切刀切成0.5英寸长。
对达到4～5周龄的小鼠MRL/MpJ-Tnfrsf6<lpr>/Crlj，按1～3次/周的间隔进行DNA免疫(～200psi氦压力)，在此期间间断性地监测血清中的抗EREG抗体效价。对于确认到血清抗体效价上升的个体，尾静脉内或腹腔内给予EREG强制表达细胞株(5×106个细胞/只)。饲养2～3天后摘出脾脏，分离含有抗体产生细胞的单核细胞。利用与sEREG_mFc免疫时相同的方法进行细胞融合和克隆化。
从在加入了血清的HAT培养基中培养的杂交瘤的培养上清中纯化抗体。加入到培养基中的血清为FBS(Ultra low IgG)(GIBCO BRL公司)。利用实施例2-2所示的、与sEREG_mFc的纯化方法相同的方法，使用Hi Trap ProteinG HP从培养上清中纯化抗体。使用PD-10柱(Amersham公司)将Hi Trap ProteinG HP的洗脱组分置换成PBS，之后在4℃下保管。纯化抗体的定量使用DC蛋白测定(BIO-RAD公司)来实施，以添附的牛IgG作为标准试样，换算其中含有的蛋白质量。
其结果，表3所示的克隆B2#30(IgG1，Kappa)、B3#18(IgG2b，Kappa)以及B3#41(IgG1，Kappa)等被成功分离。
[表3]
已分离的抗EREG小鼠单克隆抗体的抗体亚型、识别表位部位和种交叉性
Figure BDA00003525093200871
*注(ereg)：虽然结合，但反应性弱
NA：未分析
2-4.利用流式细胞术评价结合活性
使用通过上述方法获得的抗体，利用流式细胞术评价与EREG_DG的结合。向EREG_DG中添加稀释至适当浓度的抗EREG抗体，在冰上反应60分钟，所述EREG_DG以1×105个细胞/mL的密度悬浮于FACS缓冲液(1％FBS/PBS)中。细胞用FACS缓冲液清洗1次后，添加FITC标记抗小鼠IgG抗体，在冰上反应30分钟。反应后，通过离心除去上清，之后将细胞悬浮于150μL FACS缓冲液中，供给利用流式细胞术进行的分析。
流式细胞仪使用FACS Calibur(Becton Dickinson公司)。使用前散射光和侧散射光的直方图，对活细胞集团设定阀值(gate)。加入到EREG_DG中，一并评价与人大肠癌细胞株DLD1的结合活性。由图2所示的结果可知：人大肠癌细胞株DLD1与EREG_DG细胞同样，确认到人EREG基因的表达亢进。
如图3所示，杂交瘤所产生的抗EREG单克隆抗体(B2#30、B3#18以及B3#41)与EREG_DG强烈结合，但不与作为母株的DG44细胞结合。由上述试验结果判定：上述单克隆抗体与提呈于细胞膜上的EREG发生特异性结合。
另外，确认到上述本发明的抗EREG单克隆抗体对于亢进表达人EREG基因的DLD1，也如同对EREG_DG一样发生特异性结合(图4)。
迄今为止，有关人EREG基因表达亢进，在膀胱癌(Thogersen，V.等人.，Cancer Res.61：6227-6233，2001)、胰腺癌(Zhu.Z.，等人.，Biochem.Biophys.Res.Commun.273：1019-1024，2000)、前列腺癌(Torring，N.，等人.，Anticancer Res.20：91-95，2000)、大肠癌(Baba，I.，等人.，Cancer Res.60：6886-6889，2000)等中有报道，但关于人EREG基因的表达亢进与人EREG蛋白质的表达亢进相关，这是在本发明中首次公开。
实施例3.抗EREG单克隆抗体的补体依赖性细胞毒(CDC)活性和抗体 依赖性细胞毒(ADCC)活性的测定
3-1.抗EREG单克隆抗体的CDC活性的测定
使用人大肠癌细胞株DLD1作为靶细胞。培养DLD1时使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(GIBCO BRL公司)。通过离心(1000rpm，5分钟，4℃)回收5×105个DLD1细胞，将细胞团块悬浮于约200μL的培养基和3.7MBq的铬-51(Code No.CJS4，Amersham PharmaciaBiotech)中，之后在5％二氧化碳培养箱中、在37℃下培养1小时。将上述细胞用培养基清洗3次，之后用培养基制备成细胞密度为1×104个细胞/mL，按每100μL添加到96孔平底板中。
接下来，用培养基稀释抗EREG单克隆抗体(B3#18_IgG2b)和对照小鼠IgG2a抗体(Cat.No.553453，BD Biosciences Pharmingen)，之后向各孔中分别添加50μL。将抗体制备成终浓度为10μg/mL。接着，将幼兔补体(Cat.No.CL3441，Cederlane)用培养基稀释5倍后，向该板的各孔中分别添加50μL，将该板在5％二氧化碳培养箱中、在37℃下静置1.5小时。静置后将该板离心(1000rpm、5分钟、4℃)，从各孔中分别回收100μL的上清，用γ计数仪(1480WIZARD 3”，Wallac)测定回收的上清的放射活性。根据下式求出特异性铬游离率。
特异性铬游离率(％)＝(A-C)×100/(B-C)
式中，A表示各孔中的放射活性(cpm)；
B表示在100μL细胞中添加有100μL 2％NP-40溶液(Nonidet P-40，Code No.252-23，Nacalai Tesque株式会社)的孔中的放射活性(cpm)的平均值；而
C表示在100μL细胞中添加有100μL培养基的孔中的放射活性(cpm)的平均值。测定利用双份实验来进行，算出来自各孔的上清的特异性铬游离率的平均值和标准偏差。
其结果，如图5所示，在试验所使用的抗EREG单克隆抗体中确认到CDC活性。另一方面，用作对照的小鼠IgG2a抗体在相同浓度下未显示出CDC活性。
3-2.抗EREG单克隆抗体的ADCC活性的测定
测定ADCC活性时，与测定CDC活性时一样，使用人大肠癌细胞株DLD1来实施。即，用96孔平底板培养细胞，并使之与铬-51反应，之后用含有10％FBS的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)清洗，再添加100μL培养基。接下来，用培养基稀释抗EREG单克隆抗体(B2#30、B3#18和B3#41)，之后向该板的各孔中分别添加50μL。按终浓度1μg/mL添加抗体。接着，向各孔中分别添加50μL效应细胞溶液(1×107个细胞/mL)，将该板在5％二氧化碳培养箱中、在37℃下静置4小时，确定特异性铬游离率。效应细胞使用下述细胞：将Balb/c小鼠(日本Charles River株式会社)的脾细胞用含有50ng/mL重组人白细胞介素-2(Cat.No.200-02，Peprotech)的培养基培养5天所得的细胞、或者将相同小鼠的骨髓细胞用含有50ng/mL重组人白细胞介素-2和10ng/mL重组小鼠GM-CSF(Cat.No.315-03，Peprotech)的培养基培养6天所得的细胞。
由其结果可知：试验中使用的所有抗EREG单克隆抗体均对DLD1诱导ADCC活性(图6)。
实施例4.抗EREG单克隆抗体对由人EREG产生的细胞增殖刺激的 中和活性的测定
4-1.表达EGFR-mG-CSF嵌合受体的Ba/F3细胞株(EGFR_BAF)的建立
利于常规方法分离序列如SEQ ID NO：35(GenenBank Acc.No.NM_005228)所示的人EGF受体(以下记作“EGFR”)，之后制作可以表达使人EGF受体与mG-CSFR融合而得到的嵌合受体的载体。即，制作表达人EGFR的胞外区(Met7-Ser645)与小鼠G-CSFR(NM_007782)的胞内区的嵌合受体(hEGFR/mG-CSFR)的载体(pCV_hEGFR/mG-CSFR)。该嵌合受体hEGFR/mG-CSFR的核苷酸序列见SEQ ID NO：39，其氨基酸序列见SEQ ID NO：40。
利于电穿孔法(Gene Pulser；BioRad)，在0.33kV、950μFD的条件下，将15μg经Pvu I切断而直链化的嵌合受体(hEGFR/mG-CSFR)表达载体(pCV_hEGFR/mG-CSFR)导入Ba/F3细胞中。导入了基因的细胞用含有10％FBS(GIBCO公司)、200μg/mL遗传霉素和重组人EREG(R&D Systems公司，Cat：1195-EP/CF，200ng/mL)的RPMI1640培养基进行选择，分离EGFR_BAF株。
4-2.EGFR_BAF的EREG依赖性评价
实施测定利用4-1.所述的方法分离的EGFR_BAF的人EREG浓度依赖性细胞增殖的试验。清洗细胞以除去培养时的人EREG，并再次悬浮于RPMI1640+10％FBS培养基中，之后按2×104个细胞/100μL/孔的密度接种在96孔板上。将人EREG(R&D Systems公司)用培养基稀释、调制成各浓度(7.8～250ng/mL)后添加到细胞中，之后将细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养3天。培养后，按照说明书加入Cell CountReagent SF(Nacalai Tesque公司)的测定试剂，显色2小时，用Benchmark Plus(Bio-Rad公司)测定反应液的吸光度(450/655nm)。
与上述同样地测定人胰腺癌细胞株AsPC1和人大肠癌细胞株DLD1对人EREG的依赖性增殖。培养基使用CHO-S-SFMII(GIBCO公司)。
由结果可知：EGFR_BAF(图7)和AsPC1(图8)依赖于人EREG的浓度而增殖。而DLD1不具有人EREG的依赖性(图9)。
4-3.抗EREG单克隆抗体对人EREG依赖性细胞增殖的中和活性的测定
使用已建立的EGFR_BAF，测定抗EREG单克隆抗体对人EREG依赖性增殖的中和活性。将EGFR_BAF悬浮于含有人EREG(终浓度为125ng/mL)的RPMI1640+10％FBS培养基中，之后按2×104个细胞/孔的密度接种在96孔板上。将抗EREG单克隆抗体用培养基稀释至各浓度(0.008～25μg/mL)后添加到细胞中，之后将细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养3天。培养后，加入测定试剂盒Cell Count Reagent SF(Nacalai Tesque公司)的测定试剂，显色2小时。以655nm为参比波长，用Benchmark Plus(Bio-Rad公司)测定反应液在450nm下的吸光度。
以抗体浓度为0μg/mL时的数值作为对照值，算出细胞增殖率(各抗体浓度下的OD值/对照的OD值×100(％))。抑制活性的阳性对照使用公知的抗人EREG山羊多克隆抗体(R&D Systems公司，Cat：AF1195)。在产品附录中，记载着该抗体对成纤维细胞株Balb/3T3的人EREG依赖性增殖的中和活性。但有关对癌细胞株的增殖抑制效果的信息，附录中则没有记载。
另外，关于使用AsPC1作为靶细胞的抗EREG单克隆抗体的中和活性，也按照与上述相同的方法，在抗体浓度为25、2.5、0.25μg/mL的3种条件下进行测定。
各自的结果见图10和图11。
结果显示：在使用EGFR_BAF和AsPC1的任一系统中，B2#30和B3#18均显示出中和活性，但B3#41的中和活性非常弱。另外，与B2#30或B3#18相比，公知的抗hEREG山羊多克隆抗体的中和活性非常弱。
由以上结果可知：B2#30和B3#18具有EREG依赖性中和活性，抑制胰腺癌细胞株AsPC1的增殖。
此次分离的抗EREG单克隆抗体(B2#30和B3#18)兼具由ADCC活性或CDC活性产生的杀细胞效果和人EREG依赖性细胞增殖抑制效果(中和活性)，是对抗人EREG基因表达亢进的癌细胞的新型机制的抗体药物，这通过本研究得到证明。
实施例5.抗EREG单克隆抗体的可变区基因序列的确定
由产生B3#18(EP27)的杂交瘤确定抗体可变区的基因序列，所述B3#18(EP27)保持EREG依赖性中和活性，且对DLD1细胞株显示出ADCC活性和CDC活性。使用从产生抗EREG抗体B3#18的杂交瘤中提取的总RNA，通过RT-PCR法扩增该抗体可变区基因。总RNA是使用RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN公司)，从1×107个细胞的杂交瘤中提取。
使用1μg的总RNA，利用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(CLONTECH公司)构建RACE文库。使用与小鼠IgG2b恒定区序列互补的合成寡核苷酸MHC-IgG2b(SEQ ID NO：41)或与小鼠κ链恒定区核苷酸序列互补的合成寡核苷酸kappa(SEQ ID NO：42)，扩增5’末端侧基因片段。逆转录反应在42℃下进行1小时30分钟。PCR溶液(50μL中)的组成如下：
5μL 10×Advantage 2PCR缓冲液；
5μL 10×Universal Primer A Mix；
0.2mM dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；
1μL Advantage 2聚合酶Mix(以上由CLONTECH公司制备)；
2.5μL逆转录反应产物；以及
10pmole合成寡核苷酸MHC-IgG2b或kappa。
PCR和反应条件如下：
在94℃的初始温度下反应30秒/94℃下反应5秒/72℃下反应3分钟的循环重复5次；
94℃下反应5秒/70℃下反应10秒/72℃下反应3分钟的循环重复5次；以及
94℃下反应5秒/68℃下反应10秒/72℃下反应3分钟的循环重复25次；
最后，将反应产物在72℃下加热7分钟。各PCR产物使用QIAquick Gel纯化试剂盒(QIAGEN公司制备)，由琼脂糖凝胶进行纯化，之后克隆到pGEM-T Easy载体(Promega公司制备)中，确定其核苷酸序列。B3#18的H链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：43、氨基酸序列见SEQ ID NO：44，L链可变区的核苷酸序列见SEQ ID NO：45，而氨基酸序列见SEQ ID NO：46。
对于C7(EP03)、#15(EP08)、B2#30(EP20)、B3#8(EP24)和B3#41(EP29)，按照相同的方法确定可变区序列。扩增重链可变区时使用与小鼠IgG1恒定区序列互补的合成寡核苷酸MHC-IgG1(SEQ ID NO：47、5’-ccatggagttagtttgggcagcagatcc-3’)。所确定的可变区核苷酸序列见SEQ ID NO：108(EP03、重链)、110(EP03、轻链)、112(EP08、重链)、114(EP08、轻链)、116(EP20、重链)、118(EP20、轻链)、120(EP24、重链)、122(EP24、轻链)、124(EP29、重链)、126(EP29、轻链)。可变区翻译序列见SEQ ID NO：109(EP03、重链)、111(EP03、轻链)、113(EP08、重链)、115(EP08、轻链)、117(EP20、重链)、119(EP20、轻链)、121(EP24、重链)、123(EP24、轻链)、125(EP29、重链)、127(EP29、轻链)。各抗体的可变区序列编号、CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列汇总在表4中。
[表4]抗EREG单克隆抗体的CDR序列、与序列号的对应关系
Figure BDA00003525093200941
实施例6.重组嵌合抗体与EREG的结合活性的确认
通过以下方法确认重组嵌合抗体保持与EREG的结合性，所述重组嵌合抗体具有所分离的抗体可变区序列和人IgG1/IgK恒定区序列。PCR扩增各自的重链可变区序列，之后整合到人嵌合抗体表达载体的重链克隆位点中。随后PCR扩增轻链可变区序列，之后整合到上述整合有重链的人嵌合抗体表达载体的轻链克隆位点中。在构建的细胞表达载体中，重链和轻链中的抗体基因均设计成在小鼠CMV启动子下转录。各人嵌合抗体的核苷酸序列及其翻译序列的序列编号的对应汇总在表5中。
[表5]
各人嵌合抗体的序列编号
Figure BDA00003525093200951
使用人嵌合抗体表达载体，利用电穿孔法转化DG44细胞。以通过存在于人嵌合抗体表达载体上的选择标志物获得的遗传霉素耐性为指标，进行重组细胞克隆选择。利用使用抗人抗体的夹层ELISA法检测克隆化的重组细胞培养上清中的抗体量，选择重组抗体表达细胞。使用HiTrap Protein A柱(Amersham Bioscience)，按照附录手册从选择的重组细胞的培养上清中纯化人嵌合抗体。
将sEREG-mFc包被在Nunc-Immuno板上，用含有BSA的溶液封闭后，分析纯化的嵌合抗体的结合反应性。添加嵌合抗体，培养1小时后清洗板，添加碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体(BIOSOURCE，AHI0305)，使之反应。清洗后，加入检测试剂Sigma 104，来测定嵌合抗体结合量。如图12所示，嵌合抗体对EREG显示出容量依赖性结合。由以上结果确认：所分离的抗体可变区序列确实来自抗EREG抗体。
实施例7.嵌合抗EREG抗体的体外ADCC活性
使用嵌合抗体的人PBMC的体外ADCC活性见图13。使用预先注入有200μL 1000单位/mL的肝素溶液(Novo Heparin注5千单位，Novo Nordisk公司)的注射器，从正常人体内采集50mL末梢血。将该末梢血用PBS(-)稀释2倍后4等分，加入到预先注入了15mLFicoll-Paque PLUS(GE Healthcare公司)并进行了离心操作的Leucosep淋巴细胞分离管(Cat.No.227290，Greiner bio-one公司)中。将其离心(2150rpm，10分钟，室温)后，分离收集单核细胞组分层。用含有10％FBS的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(SIGMA公司制备)(以下记作10％FBS/D-MEM)清洗细胞1次，之后用10％FBS/D-MEM将细胞密度调整至5×106个细胞/mL，制成人PBMC溶液。
利用与实施例3相同的方法，对DLD-1和MIA-PaCa2细胞进行铬-51标记。向靶细胞中添加调制成各浓度的抗体溶液，在室温下反应15分钟后加入人PBMC溶液(5×105个细胞/孔)，在5％二氧化碳培养箱中培养约4小时，用γ计数仪测定培养后的培养上清中的放射活性，利用实施例3所述的方法算出铬游离率。在所有嵌合抗体中均确认到ADCC诱导活性，嵌合抗体EP20、EP27、EP08具有特别强的活性。关于各抗体的ADCC诱导强度，在胰腺癌细胞株MIA-PaCa2和大肠癌细胞株DLD-1中显示出相同的趋势。
实施例8.抗EREG抗体的种交叉性和表位分析
分析所分离的抗体与小鼠EREG和猴EREG的交叉反应性。以cDNA文库为模板，对全长小鼠EREG cDNA(NM_007950)和猴EREGcDNA(XM_001102069)进行PCR扩增及克隆。所分离的序列分别见SEQ ID NO：168和169。利用实施例2所示的方法，制备可溶型小鼠EREG/小鼠IgG2a Fc融合蛋白(以下记作小鼠EREG-mFc)和可溶型猴EREG/小鼠IgG2a Fc融合蛋白(以下记作猴EREG-mFc)。小鼠EREG-mFc和猴EREG-mFc的序列分别见SEQ ID NO：170和171。将人EREG-mFc、小鼠EREG-mFc、猴EREG-mFc分别包被在Nunc-Immuno板上，用含有BSA的溶液封闭。之后，分析纯化的嵌合抗体的结合反应性。添加嵌合抗体，培养1小时后清洗板，添加碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体(BIOSOURCE，AHI0305)，使之反应。清洗后，加入检测试剂Sigma 104，来测定嵌合抗体结合量(图14)。将在同一抗体浓度下与各种EREG的结合作图，如横轴[人EREG-mFc]对纵轴[小鼠EREG-mFc]、横轴[人EREG-mFc]对纵轴[猴EREG-mFc]，从而展示在同一抗体浓度下抗体与EREG的结合饱和度的不同。沿横轴的图表示与人EREG的结合选择性，表明EP08虽然与人EREG结合，但不与小鼠EREG结合。显示出抛物线图的EP27也与小鼠分子结合，但为了达到结合饱和，需要更高浓度的抗体，即与人EREG相比，EP27与小鼠EREG的结合亲和性弱。给予对角线图的抗体对不同种的EREG显示出与人同等的亲和性。使用产生杂交瘤的小鼠抗体进行同样的分析，结果汇总在表3中。以未反应(-)、非常弱的反应性(+)、与人相比稍弱(++)、与人分子同等的反应性(+++)四个等级表示。
为了进行抗体的表位部位分析，分析与人EREG胞外结构域部分片段的结合反应性。以GST融合蛋白的形式表达SEQ ID NO：21的人EREG的29Ala～69Ser的N末端部分序列并进行纯化。所得重组蛋白序列见SEQ ID NO：172。具有成熟型EGF结构域结构的可溶型人EREG片段(相当于SEQ ID NO：21的63Val～108Leu)从R&D Systems(cat.no.1195-EP/CF)购入。将EREG序列片段固定在免疫板上，利用ELISA法研究抗体的结合反应性，其结果汇总在表3中。大多数抗体与含有EGF结构域的可溶型EREG片段(表3中表示成ereg)结合。EP25、EP32与N末端部分序列(Nterm)结合。分离的所有抗体与任意的肽片段结合，不存在识别109残基以后的序列的抗体。
实施例9.利用EREG表达细胞活化EGF受体信号
有人将可溶型EREG作为低亲和性EGF家族配体进行了报道(参考文献：Shelly等人.(1998)J Biol Chem 273，10496-505；Jones等人.(1999)FEBS Lett 447，227-31)。由使用EGFR_BaF的作用比较确认：与EGF相比，EREG对EGF受体仅显示出1/100以下的低活性(亲和性)(图15)。生理条件下，EREG并不是血中大量存在的因子。另有报道称：伴随着癌化，EREG在基因水平的表达出现上升，但并没有报道在癌症患者的血中检测出高浓度的EREG蛋白质。本发明人等假设不是可溶型EREG、而是在细胞膜上表达的膜型EREG刺激邻近的EGF受体，并对存在上述局部活化机制的假设进行了如下验证。首先，将EREG强制表达细胞和EGFR_BaF进行共培养，来确认在不存在可溶型EREG的情况下EGFR_BaF的增殖是否得到促进。将EREG表达细胞EREG_DG、作为阴性对照的DG44细胞按5×103个细胞/孔接种在96孔板中，在FCS存在下培养过夜。第二天添加1×104的EGFR_BaF、作为阴性对照的Ba/F3细胞，继续培养3天。如图16所示，即使与不表达EREG的DG44细胞共培养，EGFR_BaF的增殖也丝毫没有受到刺激；而通过与EREG强制表达细胞EREG_DG共培养，观察到显著的EGFR_BaF增殖促进。EREG_DG引起的增殖促进通过添加抗EREG抗体EP20(10μg/mL)而被抑制。通过添加WST-8试剂来定量EGFR_BaF细胞增殖(图17)。结果显示：即使将Ba/F3细胞与EREG_DG细胞共培养，也没有产生增殖刺激；以及通过EREG_DG与EGFR_BaF的共培养而得到促进的细胞增殖因添加抗EREG抗体而几乎完全被抑制。
通过基因芯片分析，确认在大肠癌细胞株DLD-1中，除EREG外，双调蛋白(EGF配体家族成员)也在基因水平产生过量表达。在EGF受体信号中，存在活化受体的配体家族分子的重复性，阻碍一个配体，这在理论上并不等价于阻碍受体信号活化。结果显示：将DLD-1和EGFR_BaF共培养时，与Ba/F3相比，EGFR_BaF中存在显著的增殖刺激；以及该增殖刺激因添加抗EREG中和抗体EP20、EP27而被抑制(图18)。
利用夹层ELISA法定量EREG DG、DLD-1细胞培养上清中的可溶性EREG量。将小鼠EP30包被在免疫板上、封闭，之后添加作为浓度标准品的可溶型重组人EREG(R&D Systems)和作为被检样品的培养3天后的细胞培养上清。培养后，用嵌合EP20抗体和碱性磷酸酶标记抗人IgG抗体检测EREG。使用标准品的可溶型EREG检测结果见图19。培养上清中的EREG量在EREG_DG(A405/655检测值为0.157)、DLD-1(A405/655检测值为0.184)中均在检测限(1ng/mL)以下。以上结果表明：EREG介导的EGF受体信号的活化发生在邻近的细胞间；以及膜型EREG很有可能参与了活化。
该结果、即EREG介导的EGF受体活化通过细胞间相互作用而高效率发生，这由本发明首次发现，该活化可被抗EREG抗体抑制也是首次发现。
实施例10.通过免疫组织染色检测大肠癌组织中的EREG蛋白质
通过免疫组织染色，确认到癌组织中表达EREG蛋白质、且该蛋白质定位于癌细胞膜上。免疫组织染色使用由临床癌组织制作的组织阵列来进行，组织标本的制作如下进行。将手术后摘出的组织用4％多聚甲醛固定一夜，之后用0.01M磷酸缓冲液清洗2小时，按照AMeX法(参考文献：Sato等人.(1986)Am J Pathol 125，431-5)包埋在石蜡中。从该包埋块中切取直径为1.5mm的癌组织，移植到约2.5×3.0cm的新的包埋块中，排列不同的组织，形成组织阵列。薄切组织阵列，脱石蜡后，使用Ventana HX Discovery系统(Ventana Medical Systems，Inc.)进行免疫组织染色。向薄切的组织中添加50μg/mL的抗EREG小鼠单克隆抗体(EP27)，使之反应。加入作为二次抗体的过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体，之后用DAB进行显色反应。其结果，在大肠癌原发部位确认到EREG蛋白质的表达、以及该蛋白质定位于细胞膜上(图20)。另一方面，在非癌部分组织中，在相同的染色条件下完全没有检测到EREG蛋白质。在癌组织中检测出EREG蛋白质的表达、以及确认到该蛋白质定位于膜上，这在本发明中首次显示。
实施例11.利用夹层ELISA进行抗EREG单克隆抗体的表位识别分类
在实施例8中已经明确：多数抗体的识别表位位于EREG的成熟型EGF结构域内。更详细而言，利用夹层ELISA法分析对同一抗原分子不发生结合竞争、且表位不同的抗体的组合。将小鼠抗EREG抗体稀释至1μg/mL，固定在Nunc-Immuno板上。封闭后，按100μL/孔添加50μg/mL的成熟型EGF结构域结构的可溶型人EREG片段(SEQ ID NO：21的63Val～108Leu)或100μg/mL的人EREG-mFc(SEQ IDNO：34)，使抗原分子被小鼠抗体捕获。清洗后，添加抗EREG嵌合抗体(抗体浓度为1、0.33、0.11、0.037μg/mL)，利用碱性磷酸酶标记抗人IgG抗体和Sigma 104显色检测嵌合抗体与被捕获的抗原分子的结合反应性。使用统计分析软件R(URL http://www.R-project.org.)，对所得数据(图21-1～图21-3)进行聚类分析，树形图见图22。图22中，到横轴支化点的距离越远，表明夹层ELISA系统中的反应模式越不同、抗原识别方式越不同。EP20能够和EP27等多数抗体结合，可知其具有特征性的表位。图22中属于EP29～EP25聚类的抗体几乎不允许与其它抗体同时结合，推测抗原分子被这些抗体牢牢捕获。
产业实用性
本发明的EREG蛋白质特异性抗体，可用作大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌或肾癌等的诊断试剂。本发明的诊断试剂可用于诊断原发性或转移性的癌症。具体而言，通过检测从患者体内采集的生物样品中所含的EREG蛋白质或编码EREG的mRNA，可以检测癌症。或者，通过检测机体内EREG表达细胞的定位，可以检测出机体内原发性大肠癌、转移性大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌或肾癌的存在。
另外，本发明的具有细胞毒活性的抗EREG抗体可用于治疗或预防表达EREG蛋白质的癌症。具体而言，基于本发明，提供大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌等的各种癌细胞的细胞毒性剂或细胞增殖抑制剂。本发明的癌细胞的细胞毒性剂或细胞增殖抑制剂对原发性和转移性的任一种癌症均可适用。
并且，本发明的具有细胞毒活性的抗EREG抗体可用作大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌等各种癌症的治疗药。本发明中，抗EREG抗体还可用作原发性和转移性的任一种癌症的治疗药。
而且，编码本发明抗体的基因和通过该基因转化的重组细胞可用于制作发挥上述效果或更适当的效果的重组抗体。
此外，基于本发明的认识，可以筛选作为癌症治疗药有效的候选化合物。根据本发明，明确了癌症的EREG依赖性增殖。因此，根据本发明的筛选方法选择的化合物，可谓是抑制癌症的EREG依赖性增殖的化合物。根据本发明而选择的化合物可作为候选化合物，所述候选化合物通过评价其安全性和对癌症的特异性而明确其作为抗癌药的有用性。
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Claims (13)

1.抗体，所述抗体与EREG蛋白质结合，并且对表达EREG蛋白质的细胞具有细胞毒活性，所述细胞毒活性为ADCC或CDC活性。
2.权利要求1所述的抗体，其中，进一步附加具有对EREG蛋白质的中和活性。
3.权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体结合有选自化疗药物、毒性肽和放射性同位素的任一种细胞毒性物质。
4.抗体，所述抗体与EREG蛋白质结合，并且为以下(1)~(43)中任一项所述的抗体：
(1) 抗体，所述抗体含有H链和L链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 6的氨基酸序列；所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 12的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 14的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 16的氨基酸序列；
(2) (1)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有作为CH的SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的117~452位的氨基酸序列；
(3) (1)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有作为CH的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的117~446位的氨基酸序列；
(4) (1)所述的抗体，其中，所述抗体的L链具有作为CL的SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的107~213位的氨基酸序列；
(5) (1)所述的抗体，其中，所述抗体的L链作为CL的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的107~213位的氨基酸序列；
(6) (1)所述的抗体，所述抗体含有(2)所述的CH和(4)所述的CL；
(7) (1)所述的抗体，所述抗体含有(3)所述的CH和(5)所述的CL；
(8) 抗体，所述抗体含有H链和L链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 49的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 51的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 53的氨基酸序列；所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 55的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 57的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 59的氨基酸序列；
(9) (8)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有来源于小鼠IgG1的CH；
(10) (8)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有作为CH的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的117~446位的氨基酸序列；
(11) (8)所述的抗体，其中，所述抗体的L链具有来源于小鼠Kappa链的CL；
(12) (8)所述的抗体，其中，所述抗体的L链具有作为CL的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的107~213位的氨基酸序列；
(13) (8)所述的抗体，所述抗体含有(9)所述的CH和(11)所述的CL；
(14) (8)所述的抗体，所述抗体含有(10)所述的CH和(12)所述的CL；
(15) 抗体，所述抗体含有H链和L链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 61的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 63的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 65的氨基酸序列；所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 67的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 69的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 71的氨基酸序列；
(16) (15)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有来源于小鼠IgG1的CH；
(17) (15)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有作为CH的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的117~446位的氨基酸序列；
(18) (15)所述的抗体，其中，所述抗体的L链具有来源于小鼠Kappa链的CL；
(19) (15)所述的抗体，其中，所述抗体的L链具有作为CL的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的107~213位的氨基酸序列；
(20) (15)所述的抗体，所述抗体含有(16)所述的CH和(18)所述的CL；
(21) (15)所述的抗体，所述抗体含有(17)所述的CH和(19)所述的CL；
(22) 抗体，所述抗体含有H链和L链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 73的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 75的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 77的氨基酸序列；所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 79的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 81的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 83的氨基酸序列；
(23) (22)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有来源于小鼠IgG1的CH；
(24) (22)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有作为CH的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的117~446位的氨基酸序列；
(25) (22)所述的抗体，其中，所述抗体的L链具有来源于小鼠Kappa链的CL；
(26) (22)所述的抗体，其中，所述抗体的L链具有作为CL的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的107~213位的氨基酸序列；
(27) (22)所述的抗体，所述抗体含有(23)所述的CH和(25)所述的CL；
(28) (22)所述的抗体，所述抗体含有(24)所述的CH和(26)所述的CL；
(29) 抗体，所述抗体含有H链和L链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 85的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 87的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 89的氨基酸序列；所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 91的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 93的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 95的氨基酸序列；
(30) (29)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有来源于小鼠IgG1的CH；
(31) (29)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有作为CH的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的117~446位的氨基酸序列；
(32) (29)所述的抗体，其中，所述抗体的L链具有来源于小鼠Kappa链的CL；
(33) (29)所述的抗体，其中，所述抗体的L链具有作为CL的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的107~213位的氨基酸序列；
(34) (29)所述的抗体，所述抗体含有(30)所述的CH和(32)所述的CL；
(35) (29)所述的抗体，所述抗体含有(31)所述的CH和(33)所述的CL；
(36) 抗体，所述抗体含有H链和L链，所述H链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 97的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 99的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 101的氨基酸序列；所述L链具有作为CDR1的SEQ ID NO: 103的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO: 105的氨基酸序列、以及作为CDR3的SEQ ID NO: 107的氨基酸序列；
(37) (36)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有来源于小鼠IgG1的CH；
(38) (36)所述的抗体，其中，所述抗体的H链具有作为CH的SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的117~446位的氨基酸序列；
(39) (36)所述的抗体，其中，所述抗体的L链具有来源于小鼠Kappa链的CL；
(40) (36)所述的抗体，其中，所述抗体的L链具有作为CL的SEQ ID NO: 20的氨基酸序列的107~213位的氨基酸序列；
(41) (36)所述的抗体，所述抗体含有(37)所述的CH和(39)所述的CL；
(42) (36)所述的抗体，所述抗体含有(38)所述的CH和(40)所述的CL；
(43) 抗体，所述抗体与(1)~(42)中任一项所述的抗体所结合的EREG蛋白质的表位相同。
5.抗体，所述抗体与EREG蛋白质结合，其中，所述抗体识别SEQ ID NO: 21的氨基酸序列中第29位的Ala~第69位的Ser或第63位的Val~第108位的Leu。
6.权利要求1~5中任一项所述的抗体用于检测受试者中的癌症的应用，其中，所述抗体检测从所述受试者采集的试样中的EREG蛋白质。
7.权利要求6所述的应用，其中，所述癌症为原发性癌症或转移性癌症。
8.权利要求7所述的应用，其中，所述癌症为选自大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌和肾癌中的任一种癌。
9.癌症的诊断方法，所述方法包括：(1)给予受试者用放射性同位素标记的与EREG蛋白质结合的抗体的步骤；以及(2)检测上述放射性同位素的累积的步骤。
10.权利要求9所述的诊断方法，其中，所述放射性同位素为正电子发射核素。
11.权利要求10所述的诊断方法，其中，所述正电子发射核素为选自11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr和124I的任一种核素。
12.权利要求11所述的诊断方法，其中，所述癌症为原发性癌症或转移性癌症。
13.权利要求12所述的诊断方法，其中，所述癌症为选自大肠癌、肺腺癌、胰腺癌、胃癌和肾癌中的任一种癌。
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