KR20160022354A - 인간화 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제 - Google Patents

인간화 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제 Download PDF

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켄이치 사토
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Abstract

본 발명자들은 항인간 에피레귤린을 발현하는 암세포에 대해 세포상해활성 및 중화활성을 발휘함으로써 암세포의 증식을 저해하는 인간화 EP27 항체의 가변영역 서열 중의 아미노산 잔기를 적절히 치환함으로써, 비인간 동물인 게잡이원숭이 및 인간 동물 간의 종 교차 반응성을 나타내는 항에피레귤린 항체, 화학적 분해가 억제된 항에피레귤린 항체, 등전점이 저하된 항에피레귤린 항체, 열 변성 중간온도가 상승한 항에피레귤린 항체, 회합체량이 저감된 항에피레귤린 항체를 제작하고, 당해 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제를 제작하는 것에 성공하였다.

Description

인간화 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제{Therapeutic agent comprising humanized anti-Epiregulin antibody as active ingredient for non-small-cell lung carcinoma excluding adenocarcinoma}
본 발명은 선암 이외의 비소세포폐암의 치료방법, 및 선암 이외의 비소세포폐암 세포의 증식 억제제 및 항암제에 관한 것이다.
암은 선진국에 있어서 사망률의 주요 원인이다. 암치료의 목적으로 많은 화학요법제가 과거 50년간에 개발되었다. 화학요법제의 대부분은 알킬화제, 대사길항제, 안트라사이클린(anthracycline), 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 저해제 및 항종양제로 분류할 수 있다. 이들 약제 모두가 세포분열 또는 DNA의 합성에 영향을 미쳐 어떠한 형태로 기능하는 메커니즘을 통해 치료효과를 초래한다.
특정 화학요법제의 유효성은 암 간에, 환자 간에, 또는 개개의 환자에 있어서의 시간 경과에 따라 상이하다. 화학요법제에 폭로된 암세포는 이러한 화학요법제에 대한 내성을 발생시켜 다른 복수의 항암제에 대해서도 마찬가지로 교차 내성을 발생시키는 경우도 많다. 또한 상기 화학요법제의 메커니즘에 의해 이들 화학요법제가 정상 세포에 미치는 세포상해의 결과 초래되는 부작용을 제어하기 위해 화학요법제의 용량 또는 용법은 대부분의 경우 제약을 받는다.
종래의 화학요법제 대신에 최근 들어 암세포에 특이적으로 발현하는 분자를 표적으로 하는 분자 표적약의 개발이 진행되고 있다. 이러한 분자 표적약의 등장에 의해 종래의 화학요법제에 고유의 부작용이 회피되어 암환자의 QOL에 기여하는 암치료가 가능해져 있다. 이러한 분자 표적약에는 저분자(small molecule)의 약제 외에 항체 등의 고분자의 약제도 포함된다. 치료 항체는 생체내에 선천적으로 존재하는 분자로 생체에 미치는 독성이 낮다는 이점 외에, 이펙터 기능을 매개로 한 세포상해활성 등의 저분자 약제 이외의 작용 메커니즘에 의해 표적 세포를 특이적으로 상해하여 치료효과를 발휘하는 이점도 갖기 때문에, 최근 많은 치료 항체가 시판되고 있다.
이러한 이펙터 기능을 매개로 한 세포상해활성 등의 저분자 약제 이외의 작용 메커니즘에 의해 표적 세포를 특이적으로 상해하는 항체로서 대장암, 폐선암, 췌장암, 위암, 신장암에서 고발현되고 있는 에피레귤린을 표적으로 하는 치료 항체가 개시되어 있다(특허문헌 1). 구체적으로는 항에피레귤린 항체의 보체 의존성 세포상해(complement-dependent cytotoxicity; CDC)활성, 추가로 항체 의존성 세포상해(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC)활성을 측정한 바, 항에피레귤린 항체는 에피레귤린을 발현하는 세포에 대해 CDC활성 및 ADCC활성을 갖는 것이 발견되었다. 또한 항에피레귤린 항체가 암세포주에 대해 중화작용에 의한 증식 억제 효과가 있는 것이 명확해졌다. 더 나아가서는 이상의 지견(知見)에 의해 항에피레귤린 항체가 원발성의 또는 전이성의 각종 암의 진단, 예방 및 치료에 유효한 것이 발견되었다.
비소세포폐암 중 선암의 경우는 각종 분자 표적약의 개발에 의해 눈부신 치료 성적의 진보가 얻어지고 있다(비특허문헌 1). 한편으로 선암 이외의 비소세포폐암의 경우는 EGFR의 변이가 적은 것으로부터 EGFR 저해제의 치료 대상이 되는 비율이 낮아(비특허문헌 1 및 2), 선암과 비교하여 선암 이외의 비소세포폐암에 대한 표적 분자약이나 화학요법의 치료 효과는 낮은 것이 보고되어 있다(비특허문헌 3~5). 즉 선암 이외의 비소세포성 폐암의 치료 성적 향상을 위한 새로운 치료법의 개발이 요망되고 있다.
한편 상기와 같은 항암제를 포함하여 어떠한 신규 후보 약제도 시판되기 위해서는 엄밀한 시험을 통과해야만 한다. 예를 들면 이러한 시험은 전(前)임상 시험 및 임상 시험으로 구분된다. 그 중 후자는 일반적으로 제I상 시험, 제II상 시험 및 제III상 시험으로 추가로 세분화되어 인간 환자를 사용하여 행해지는 한편, 전자는 동물을 사용하여 실시된다. 일반적으로 전임상 시험의 목적은 약제 후보가 작용하는 동시에, 당해 약제가 유효하며 그리고 안전한 것을 입증하는 것이다. 구체적으로는, 이들 동물 시험의 목적은 약제가 발암성이 아니고 돌연변이 유발성이 아니며 또는 최기형성이 아닌 것을 입증하는 동시에, 약제의 약물 동태학을 이해하는 것이다. 전임상 시험에 있어서 동물에 대한 피험 약제의 안전성 및 피험 약제가 유효성일 가능성이 확립된 경우에만 당해 피험 약제가 인간에게 투여되는 임상 시험이 인가된다.
동물에 있어서의 저분자(small molecule)의 피험 약제(예를 들면 안트라사이클린으로부터 유도되는 신규 항암제)의 작용은 대부분의 경우에서 인간에 대한 투여 시에 당해 약제의 예상되는 작용의 지표가 될 수 있다. 따라서 이러한 전임상 시험으로부터 얻어지는 데이터는 일반적으로 인간에게 투여된 경우의 작용에 대한 높은 예측성을 부여할 것이다. 그러나 이러한 예측성은 모든 종류의 피험 약제에서 얻어지는 것이 아니기 때문에, 전임상 시험의 결과로부터의 예측성 및 임상 시험에 관하여 약제 후보가 인가될 가능성은 매우 감소한다.
일반적으로 항체는 통상은 단백질성인 표적 분자를 매우 특이적으로 인식함으로써 기능하는 것이 가능하다. 대부분의 경우가 단일클론 항체인 피험 항체 약제는 표적 분자 상의 단일 부위 또는 단일 에피토프만을 인식한다. 단일클론 항체가 종래 갖는 높은 표적의 식별기능 때문에 항체는 약제 개발을 위한 매우 흥미깊은 후보가 되어 있는 한편, 이 식별기능 때문에 전임상 시험이 곤란해지는 경우가 있다. 이는 이러한 항체가 결합하는 표적 분자의 서열에 종 의존적인 변이가 있기 때문이다. 인간에게 있어서 예를 들면 에피토프 X를 매개로 분자 Y를 특이적으로 인식하고, 당해 분자에 결합하는 단일클론 항체는 전임상 시험에 사용하는 생물종 중의 대응 표적 분자(오솔로그) Y' 중에 대응하여 존재하는 에피토프 X'가 인간에게 있어서 대응하는 표적 분자 중에 존재하는 X와 상이할 가능성도 있기 때문에, 종종 비인간종에 있어서 오솔로그 분자 Y'를 특이적으로 인식하여 당해 분자에 결합할 수 없다. 인간 및 영장류 항원에 대해 반응성을 갖는 단일클론 항체군 간에서조차 인간 및 침팬지 항원 상동체와만 반응하는 항체의 예가 많이 있다. 예를 들면 항CD3 단일클론 항체에 관하여 그러한 예가 관찰되고 있다. 가장 널리 사용되고 가장 잘 성질이 결정되어 있는 CD3 복합체에 특이적인 단일클론 항체 중 하나는 OKT-3인데, 이는 침팬지 CD3와 반응하나 다른 영장류, 예를 들면 빨간털원숭이의 CD3 상동체 또는 개 CD3와는 반응하지 않는다(비특허문헌 6). 한편 빨간털원숭이 항원을 인식하나 그의 인간 오솔로그를 인식하지 않는 단일클론 항체의 예도 존재한다. 이 그룹의 일례가 빨간털원숭이 유래의 CD3에 대한 단일클론 항체 FN-18이다(비특허문헌 7).
상기와 같은 단일클론 항체의 높은 특이성으로부터 발생하는 전임상 동물 시험에 있어서의 문제에 대항하기 위해 몇 가지의 전략이 채용되고 있다.
제1 공지의 접근법은 침팬지·모델을 사용하여 피험 항체 약제의 전임상 시험을 실시하는 것이다. 침팬지는 유전적 유연이 인간에 가장 가깝고, 그의 게놈은 99%에 걸쳐 인간의 게놈과 동일하기 때문에, 피험 항체 약제가 특이적으로 결합하는 표적 분자의 침팬지에 있어서의 변이는 이 분자의 인간에 있어서의 변이와 동일할 가능성이 매우 높고, 실제 Schlereth 등은 CD3의 변이가 인간과 침팬지에서 공통되고 있는 것을 발견하였다(비특허문헌 8). 따라서 침팬지에 있어서 피험 항체 약제에 의해 이 분자가 인식되지 않을 위험성은 적을 것으로 생각된다. 그러나 침팬지를 사용한 시험은 매우 고가이고 윤리적 문제가 수반된다. 또한 침팬지는 절멸 위험 동물이기 때문에 실험에 사용 가능한 동물의 수는 매우 한정되어 있다. 따라서 피험 항체 약제의 대부분의 개발에서는 침팬지에 있어서의 이러한 전임상 시험은 배제되고 있다.
제2 접근법은 전임상 시험에서 사용하는 분자를 이 시험에 사용하는 동물에게 적응시키는 접근법이다. 이 접근법의 경우는, 시험 동물에 투여하기 위해 소위 「대리(surrogate)」 항체를 구축함으로써 전임상 시험에 있어서 필수인 안전성 정보가 얻어진다. 일반적으로 이러한 대리 항체는 비대리 항체, 즉 인간에 있어서의 실제 피험 항체 약제가 결합하는 표적 분자의 시험 동물의 오솔로그를 특이적으로 인식하고, 당해 오솔로그에 결합하도록 수식되어 있는 항체이다. 따라서 이러한 「대리」 항체를 사용한 접근법의 경우는 2개의 상이한 분자, 즉 피험 임상 약제와 당해 피험 임상 약제의 표적 특이성에 대응하는 동물종에 있어서의 전임상 시험을 위한 피험 전임상 약제를 별개로 개발하여, 그 안전성 등을 조사해야만 한다. 이러한 대리 접근법의 커다란 결점은 전임상 시험을 위한 대리 항체가 피험 임상 항체 약제의 수식물인 것이다. 따라서 대리 항체를 사용한 전임상 시험에서 얻어지는 데이터는 종종 인간에게 직접 적용할 수 없는 경우가 있다. 이 때문에 이들 접근법을 사용한 전임상 연구의 시험 결과에 기초하는 임상 시험 결과의 예견성이 감소될 가능성이 있다.
상기 접근법은 전임상 시험에 사용하는 동물에 적합하도록 피험 약제를 적응시키는 접근법이다. 한편으로 다른 공지의 접근법은 인간에게 투여되는 약제 후보에 전임상 시험에 사용하는 동물을 적응시키는 접근법이다.
인간에 대한 투여가 의도되는 피험 항체 약제에 시험 동물을 적응시키는 하나의 예는, 당해 시험 동물의 종에 내인성인 비인간 분자 대신에 피험 항체 약제가 특이적으로 결합하는 인간 분자를 발현하는 형질전환 동물을 생성하는 것이다. 이 방식에서는 전임상 시험에 있어서 투여되는 피험 항체 약제는 당해 형질전환 시험 동물에 있어서 인간 항원에 결합할 것이다. 이러한 예로서, Bugelski 등에 의해 행해진 연구에서는 인간 환자에 있어서의 관절 류머티즘의 장기 치료를 예측하기 위해 인간 CD4 형질전환 마우스를 사용하여 단일클론 항체 켈릭시맵(keliximab)의 전임상 안전성 평가가 행해졌다(비특허문헌 9). 켈릭시맵은 인간 및 침팬지의 CD4에 대한 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. Bugelski 등은 인간 단백질을 발현하는 형질전환 마우스의 사용이 한정된 교차종 특이성을 갖는 생물 약제를 사용한 침팬지에 있어서의 연구의 유용한 대체법을 제공하는 것으로 결론내고 있다. 그러나 시험 목적을 위한 형질전환 동물의 제작에는 많은 노동력이 필요해지기 때문에 시간 및 비용이 소요된다.
WO2008/047723
Clin.Cancer Res. (2012) 18, 3002-3007 PLoS One. (2012) 7, e40109 J.Thorac.Oncol. (2010) 5, 1416-1423 J.Clin.Oncol. (2010) 28, 5311-5320 Cleve.Clin.J.Med. (2012) 79 Electronic Suppl 1, eS46-50 J.Med.Primatol. (1986) 15, 441-451 J.Med.Primatol. (2001) 40, 141-147 Cancer Immunol. Immunother. (2005) 20, 1-12 Hum.Exp.Toxicol. (2000) 19, 230-243
본 발명은 항에피레귤린 항체를 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암에 대한 항암제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 비인간 동물 및 인간 동물 간의 종 교차 반응성(cross-species reactivity)을 나타내는 항에피레귤린 항체를 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암에 대한 항암제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 화학적 분해가 억제된 항에피레귤린 항체를 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암에 대한 항암제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 등전점이 저하된 항에피레귤린 항체를 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암에 대한 항암제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 회합체량이 저감된 항에피레귤린 항체를 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암에 대한 항암제에 관한 것이다.
본 발명자들은 항에피레귤린 항체(anti-Epiregulin antibody)가 선암 이외의 비소세포폐암의 증식을 억제하는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 인간 에피레귤린을 발현하는 선암 이외의 비소세포폐암의 암세포에 대해 세포상해활성 및 중화활성을 발휘함으로써 당해 암세포의 증식을 저해하는 인간화 EP27 항체의 가변영역 서열 중의 아미노산 잔기를 아르기닌 잔기로 치환함으로써, 게잡이원숭이로부터 단리된 에피레귤린에 대한 결합활성과 인간 에피레귤린에 대한 결합활성의 비가 상승된 항에피레귤린 항체가 선암 이외의 비소세포폐암의 증식을 억제하는 것을 발견하였다. 즉 본 발명자들은 비인간 동물인 게잡이원숭이 및 인간 동물 간의 종 교차 반응성(cross-species reactivity)을 나타내는 항에피레귤린 항체가 선암 이외의 비소세포폐암의 증식을 억제하는 것을 발견하였다. 또한 인간화 EP27 항체의 가변영역 서열 중의 아미노산 잔기를 적절히 치환함으로써, 화학적 분해가 억제된 항에피레귤린 항체가 선암 이외의 비소세포폐암의 증식을 억제하는 것을 발견하였다. 또한 인간화 EP27 항체의 가변영역 서열 중의 아미노산 잔기를 적절히 치환함으로써, 등전점이 저하된 항에피레귤린 항체가 선암 이외의 비소세포폐암의 증식을 억제하는 것을 발견하였다. 또한 인간화 EP27 항체의 가변영역 서열 중의 아미노산 잔기를 적절히 치환함으로써, 회합체량이 저감된 항에피레귤린 항체가 선암 이외의 비소세포폐암의 증식을 억제하는 것을 발견하였다.
보다 구체적으로는 본 발명은 아래에 관한 것이다.
〔1〕항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
〔2〕상기 항에피레귤린 항체가 세포 증식 저해 활성을 갖는,〔1〕에 기재된 치료제.
〔3〕상기 항에피레귤린 항체가 아래의 (1) 내지 (38) 중 어느 하나에 기재된 항체인, 〔1〕또는〔2〕에 기재된 치료제:
(1) CDR1으로서 서열번호：9에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：10에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：11에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：12에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：13에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
(2) (1)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(3) (1)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(4) (1)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(5) (2)에 기재된 중쇄 및 (3)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(6) (2)에 기재된 중쇄 및 (4)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(7) CDR1으로서 서열번호：173에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：174에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：175에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：176에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：177에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：178에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
(8) (7)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(9) (7)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(10) (7)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(11) (8)에 기재된 중쇄 및 (9)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(12) (8)에 기재된 중쇄 및 (10)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(13) CDR1으로서 서열번호：179에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：180에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：181에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：182에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：183에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：184에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
(14) (13)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(15) (13)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(16) (13)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(17) (14)에 기재된 중쇄 및 (15)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(18) (14)에 기재된 중쇄 및 (16)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(19) CDR1으로서 서열번호：185에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：186에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：187에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：188에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：189에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：190에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
(20) (19)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(21) (19)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(22) (19)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(23) (20)에 기재된 중쇄 및 (21)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(24) (20)에 기재된 중쇄 및 (22)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(25) CDR1으로서 서열번호：191에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：192에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：193에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：194에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：195에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：196에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
(26) (25)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(27) (25)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(28) (25)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(29) (26)에 기재된 중쇄 및 (27)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(30) (26)에 기재된 중쇄 및 (28)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(31) CDR1으로서 서열번호：197에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：198에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：199에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：200에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：201에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：202에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
(32) (31)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(33) (31)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(34) (31)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
(35) (32)에 기재된 중쇄 및 (33)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(36) (32)에 기재된 중쇄 및 (34)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
(37) (1) 내지 (36) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1) 내지 (36) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
(38) (1) 내지 (36) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피레귤린의 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
〔4〕상기 항에피레귤린 항체가 서열번호：167에 기재된 아미노산 서열에 있어서 29번째인 Ala부터 69번째인 Ser, 또는 63번째인 Val부터 108번째인 Leu를 인식하는 것을 특징으로 하는, 〔1〕내지〔3〕중 어느 하나에 기재된 치료제.
〔5〕서열번호：9, 10 및 11로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR 및 서열번호：12, 13 및 14로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR을 포함하는 대조 항에피레귤린 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체로서, 서열번호：170으로 표시되는 원숭이 에피레귤린에 대한 KD값(cEREG KD)과 서열번호：34로 표시되는 인간 에피레귤린에 대한 KD값(hEREG KD)의 비(cEREG KD/hEREG KD)가 상기 대조 항에피레귤린 항체의 cEREG KD/hEREG KD보다도 작은 것을 특징으로 하는 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
〔6〕cEREG KD/hEREG KD가 40보다도 작은,〔5〕에 기재된 치료제.
〔7〕cEREG KD/hEREG KD가 10보다도 작은,〔5〕에 기재된 치료제.
〔8〕cEREG KD/hEREG KD가 6보다도 작은,〔5〕에 기재된 치료제.
〔9〕cEREG KD/hEREG KD가 4보다도 작은,〔5〕에 기재된 치료제.
〔10〕상기 항에피레귤린 항체가 서열번호：9로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호：161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR2 및 서열번호：158, 154, 152, 151, 112, 111, 110 및 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호：163, 68, 67 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR1, 서열번호：71, 69 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR2 및 서열번호：164, 48, 47 및 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체인,〔5〕내지〔9〕중 어느 하나에 기재된 치료제.
〔11〕상기 항에피레귤린 항체가 서열번호：150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116 및 115로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역, 및 서열번호：141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 및 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체인,〔5〕내지〔9〕중 어느 하나에 기재된 치료제.
〔12〕아래 중 어느 하나로부터 선택되는 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
(1) 서열번호：150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항에피레귤린 항체,
(2) 서열번호：141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 및 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항에피레귤린 항체, 또는
(3) 서열번호：150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역, 및 서열번호：141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 및 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항에피레귤린 항체.
〔13〕서열번호：26의 중쇄 불변영역을 포함하는〔10〕내지〔12〕중 어느 하나에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
〔14〕서열번호：27의 경쇄 불변영역을 포함하는〔10〕내지〔13〕중 어느 하나에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
〔15〕중화활성을 갖는〔1〕내지〔14〕중 어느 하나에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
〔16〕세포상해활성을 갖는〔1〕내지〔15〕중 어느 하나에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
〔17〕세포상해활성이 CDC인〔16〕에 기재된 치료제.
〔18〕세포상해활성이 ADCC인〔16〕에 기재된 치료제.
〔19〕세포상해활성이 CDC 및 ADCC인〔16〕에 기재된 치료제.
〔20〕서열번호：26의 중쇄 불변영역에 있어서 EU 넘버링으로 표시되는 230번 위치, 240번 위치, 244번 위치, 245번 위치, 247번 위치, 262번 위치, 263번 위치, 266번 위치, 273번 위치, 275번 위치, 299번 위치, 302번 위치, 313번 위치, 323번 위치, 325번 위치, 328번 위치 및 332번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함하는〔16〕내지〔19〕중 어느 하나에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
〔21〕서열번호：26의 중쇄 불변영역에 포함되는 Fc영역에 결합하는 당쇄 중의 푸코오스 함량이 감소되어 있는,〔16〕내지〔19〕중 어느 하나에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
〔22〕서열번호：26의 중쇄 불변영역에 포함되는 Fc영역에 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가되어 있는,〔16〕내지〔19〕중 어느 하나에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
또한 본 발명은 본 발명의 항에피레귤린 항체 또는 본 발명의 치료제를 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 선암 이외의 비소세포폐암의 예방 또는 치료에 있어서 사용하기 위한 본 발명의 항에피레귤린 항체 또는 본 발명의 치료제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 세포 증식 억제제, 암 예방제 또는 암 치료제의 제조에 있어서의 본 발명의 항에피레귤린 항체의 사용에 관한 것이다.
도 1은 각 항체에 있어서의 인간 에피레귤린에 대한 어피니티비(각 항체의 KD값/키메라 항체 EP27의 KD값)를 나타낸 그래프이다. 항체명의 표기는 가변영역만을 기재하였으나, 중쇄는 G1d, 경쇄는 kappa의 불변영역을 포함하는 항체의 시험결과이다.
도 2는 각 항체에 있어서의 어피니티비(원숭이 에피레귤린에 대한 KD값/인간 에피레귤린에 대한 KD값)를 나타낸 그래프이다. 항체명의 표기는 가변영역만을 기재하였으나, 중쇄는 G1d, 경쇄는 kappa의 불변영역을 포함하는 항체의 시험결과이다.
도 3은 각 항체에 있어서의 인간 에피레귤린에 대한 어피니티비(각 항체의 KD값/키메라 항체 EP27의 KD값)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 각 항체에 있어서의 어피니티비(원숭이 에피레귤린에 대한 KD값/인간 에피레귤린에 대한 KD값)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 각 항체에 따른 ADCC활성(특이적 칼세인 AM 유리율)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 각 항체에 따른 중화활성을 인간 에피레귤린에 의존적인 BAF_EGFR 세포 증식 저해율로 나타낸 그래프이다.
도 7은 각 항체에 있어서의 중화활성을 원숭이 에피레귤린에 의존적인 BAF_EGFR 세포 증식 저해율로 나타낸 그래프이다.
도 8은 각 항체에 따른 인 비보(in vivo) 인간 종양 증식 억제활성을 인간 암세포 이식 마우스 모델에 있어서의 항종양활성으로 나타낸 그래프이다.
도 9는 인간 에피레귤린(hsEREG-His) 및 원숭이 에피레귤린(cysEREG-His)의 전기영동 패턴을 나타낸 영동상이다.
도 10은 서로 다른 양의 에피레귤린 단백질을 발현하는 세포의 형광 염색 및 당해 세포가 이식된 마우스의 조직면역학 염색을 나타낸 도면이다.
도 11은 서로 다른 양의 에피레귤린 단백질을 발현하는 세포에 대한 ADCC활성을 나타낸 그래프이다.
도 12는 인 비보 인간 종양 증식 억제활성을 서로 다른 양의 에피레귤린 단백질을 발현하는 세포가 이식된 마우스 모델에 있어서의 항종양활성으로 나타낸 그래프이다.
도 13은 저분화 대장암의 임상증례에 있어서의 에피레귤린의 발현을 나타내는 도면이다.
도 14는 대장암의 전이에 대한 약효를 나타내는, 대장암 줄기세포 PLR123의 종양 생착에 대한 EP27 인간화 글리코맵 항체(humanized EP27 antibody Glycomab)의 약효를 나타내는 도면이다.
도 15는 대장암 줄기세포의 전이에 대한 약효를 나타내는, 대장암 줄기세포 PLR123의 폐 전이에 대한 EP27 인간화 글리코맵 항체의 약효를 나타내는 도면이다.
도 16은 저분화 대장암 모델 COL-53-JCK를 사용한 EP27 인간화 글리코맵 항체의 저분화 대장암에 대한 약효를 나타내는 도면이다.
도 17은 중분화 대장암 모델 PLR379를 사용한 EP27 인간화 글리코맵 항체의 중분화 대장암에 대한 약효를 나타내는 도면이다.
도 18은 폐선암의 임상증례에 있어서의 에피레귤린의 발현을 나타내는 도면이다.
도 19는 인간 폐선암주 Calu-3에 대한 EP27 인간화 글리코맵 항체의 ADCC활성(특이적 칼세인 AM 유리율)을 나타낸 그래프이다.
도 20은 폐선암 모델 Calu-3를 사용한 EP27 인간화 글리코맵 항체의 폐선암에 대한 약효를 나타낸 도면이다.
도 21은 EP27 인간화 글리코맵 항체를 포함하는 항체 약물 복합체가 에피레귤린을 발현하는 DLD-1 세포주의 세포내에 내재화되어 DLD-1 세포주에 대해 세포상해를 일으키는 것을 나타낸 도면이다.
도 22는 대세포암, 다형암, 편평상피암의 인간 임상증례에 있어서의 에피레귤린의 발현을 나타내는 도면이다. (A) 오른쪽은 항에피레귤린 항체를 사용한 면역조직화학적 염색에 의한, 대세포암의 임상증례에 있어서의 에피레귤린의 발현을 나타내는 도면이다. 왼쪽은 대세포암의 임상증례의 HE 염색상을 나타내는 도면이다. (B) 오른쪽은 항에피레귤린 항체를 사용한 면역조직화학적 염색에 의한, 다형암의 임상증례에 있어서의 에피레귤린의 발현을 나타내는 도면이다. 왼쪽은 다형암의 임상증례의 HE 염색상을 나타내는 도면이다. (C) 오른쪽은 항에피레귤린 항체를 사용한 면역조직화학적 염색에 의한, 편평상피암의 임상증례에 있어서의 에피레귤린의 발현을 나타내는 도면이다. 왼쪽은 편평상피암의 임상증례의 HE 염색상을 나타내는 도면이다.
도 23은 대세포폐암에 대한 항에피레귤린 항체의 항종양활성을 나타내는 도면이다. (A) scid 마우스에 이식된 대세포암에 대한 항에피레귤린 항체에 의한 항종양 효과를 나타내는 도면이다. scid 마우스에 이식된 폐 대세포암주(LC-GP-JCK주)의 종양 체적에 대한 항에피레귤린 항체의 투여에 의한 억제 효과를 경시적으로 나타내었다. (B) 오른쪽은 이식 후 18일에 단리된 조직 및 항에피레귤린 항체를 사용한 면역조직화학적 염색에 의한, 폐 대세포암주(LC-GP-JCK주)가 scid 마우스에 이식된 인 비보 모델에 있어서의 에피레귤린의 발현을 나타내는 도면이다. 왼쪽은 동 조직의 HE 염색상을 나타내는 도면이다.
도 24는 폐 편평상피암에 대한 항에피레귤린 항체의 항종양활성을 나타내는 도면이다. (A) scid 마우스에 이식된 편평상피암에 대한 항에피레귤린 항체에 의한 항종양 효과를 나타내는 도면이다. scid 마우스에 이식된 편평상피암주(SK-MES-1주)의 종양 체적에 대한 항에피레귤린 항체의 투여에 의한 억제 효과를 경시적으로 나타내었다. (B) 오른쪽은 이식 후 26일에 단리된 조직 및 항에피레귤린 항체를 사용한 면역조직화학적 염색에 의한, 폐 대세포암주(SK-MES-1주)가 scid 마우스에 이식된 인 비보 모델에 있어서의 에피레귤린의 발현을 나타내는 도면이다. 왼쪽은 동 조직의 HE 염색상을 나타내는 도면이다.
본 발명은 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 비인간 동물 및 인간 동물 간의 종 교차 반응성(cross-species reactivity)을 나타내는 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 화학적 분해가 억제된 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 등전점이 저하된 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 회합체량이 저감된 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제에 관한 것이다.
아래의 정의 및 상세한 설명은 본 명세서에 있어서 설명하는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다.
정의
아미노산
본 명세서에 있어서는 예를 들면 Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, Val/V로 나타내어지는 바와 같이, 아미노산을 1문자 코드 또는 3문자 코드, 또는 그 양쪽으로 표기한다. 또한 본 발명에서 기재되어 있는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산은 번역 후에 수식(예를 들면 N말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다)을 받는 경우도 있는데, 그와 같이 아미노산이 번역 후 수식된 경우라도 당연히 본 발명에서 기재되어 있는 아미노산 서열에 포함된다.
항원
본 발명이 제공하는 항체는 항원으로서 에피레귤린에 결합한다. 에피레귤린은 막 결합형 상피세포 성장인자 단백질이다. 그의 아미노산 서열은 GenBank 등록번호 NP_001423(서열번호：167)에 개시되어 있다. 본 발명에 있어서 에피레귤린의 정의에는 전장 단백질 및 그의 단편 양쪽이 포함된다. 단편이란 에피레귤린의 임의의 영역을 포함하는 폴리펩티드로, 천연의 에피레귤린의 기능을 가지고 있지 않아도 된다. 단편의 예로서 에피레귤린의 세포외영역을 포함하는 단편을 들 수 있다. 에피레귤린의 세포외영역은 서열번호：167의 아미노산 서열에 있어서 30-118번째가 상당한다. 또한 막관통영역은 서열번호：167의 아미노산 서열에 있어서 119-140번째가 상당한다. 또한 본 명세서에 있어서 에피레귤린을 EREG로 칭하는 경우도 있는데, 이들은 동일한 정의의 용어로서 사용된다.
항원 중에 존재하는 항원 결정기를 의미하는 에피토프는, 본 명세서에 있어서 개시되는 항에피레귤린 항체 중의 항원 결합 도메인이 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 따라서 예를 들면 에피토프는 그 구조에 의해 정의될 수 있다. 또한 당해 에피토프를 인식하는 항에피레귤린 항체의 항원에 대한 결합활성에 의해서도 당해 에피토프가 정의될 수 있다. 항원이 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우에는, 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다. 또한 에피토프가 당쇄인 경우에는 특정 당쇄 구조에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다.
선상 에피토프는 예를 들면 아미노산의 1차 서열 중에서 연속되는 복수의 아미노산으로 이루어지는 에피토프와 같이 아미노산의 1차 서열로부터 인식되는 에피토프이다. 선상 에피토프는 전형적으로는 3개 이상 및 가장 보통으로는 5개 이상, 예를 들면 약 8 내지 약 10개, 6 내지 20개의 아미노산이 고유의 서열에 있어서 포함된다.
입체구조 에피토프는 선상 에피토프와는 대조적으로, 에피토프를 포함하는 아미노산의 1차 서열이 인식된 에피토프의 단일 규정 성분이 아닌 에피토프(예를 들면 아미노산의 1차 서열이 반드시 에피토프를 규정하는 항체에 의해 인식되는 것은 아닌 에피토프)이다. 입체구조 에피토프는 선상 에피토프에 대해 증대된 수의 아미노산을 포함할 지도 모른다. 입체구조 에피토프의 인식에 관하여 항체는 펩티드 또는 단백질의 3차원 구조를 인식한다. 예를 들면 단백질 분자가 폴딩되어 3차원 구조를 형성하는 경우에는, 입체구조 에피토프를 형성하는 어떤 아미노산 및/또는 폴리펩티드 주쇄는 병렬이 되어 항체가 에피토프를 인식하는 것을 가능하게 한다. 에피토프의 입체구조를 결정하는 방법으로는, 예를 들면 X선 결정학, 2차원 핵자기 공명 분광학 및 부위 특이적인 스핀 표지 및 전자 상자성 공명 분광학이 포함되는데, 이들에는 한정되지 않는다. 예를 들면 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), 제66권, Morris(편)를 참조.
결합활성
하기에 항체에 따른 에피레귤린에 대한 결합, 즉 에피레귤린 분자 중에 존재하는 에피토프에 대한 결합의 확인방법이 예시되는데, 하기 방법에 한정되는 것은 아니고, 당업자는 항체의 항원에 대한 결합활성을 측정하는 공지의 방법을 적절히 사용하는 것이 가능하다.
예를 들면 항에피레귤린 항체가 에피레귤린 분자 중에 존재하는 선상 에피토프를 인식하는 것은, 예를 들면 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 상기 목적을 위해 에피레귤린의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상의 펩티드가 합성된다. 당해 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 또는 에피레귤린을 코드하는 cDNA(예를 들면 cDNA 서열로서 CR541887(서열번호：169) 등을, mRNA 서열로서 NM_001432 등을 그 예로서 들 수 있다) 중의 세포외 도메인에 상당하는 아미노산 서열을 코드하는 영역을 이용하여 유전자 공학적 수법에 의해 얻어진다. 다음으로 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드와 항에피레귤린 항체의 결합활성이 평가된다. 예를 들면 고정화된 선상 펩티드를 항원으로 하는 ELISA에 의해 당해 펩티드에 대한 당해 항체의 결합활성이 평가될 수 있다. 또는 에피레귤린 발현 세포에 대한 당해 항체의 결합에 있어서의 선상 펩티드에 의한 저해 레벨에 기초하여, 선상 펩티드에 대한 결합활성이 명확해질 수 있다. 이들 시험에 의해 선상 펩티드에 대한 당해 항체의 결합활성이 명확해질 수 있다.
또한 항에피레귤린 항체가 입체구조 에피토프를 인식하는 것은 다음과 같이 하여 확인될 수 있다. 상기 목적을 위해 에피레귤린을 발현하는 세포가 조제된다. 항에피레귤린 항체가 에피레귤린 발현 세포에 접촉했을 때 당해 세포에 강하게 결합하는 한편으로, 당해 항체가 고정화된 에피레귤린의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드에 대해 실질적으로 결합하지 않을 때 등을 들 수 있다. 여기서, 실질적으로 결합하지 않는다는 것은 인간 에피레귤린 발현 세포에 대한 결합활성의 80% 이하, 통상 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하의 결합활성을 말한다.
항에피레귤린 항체의 에피레귤린 발현 세포에 대한 결합활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 Antibodies A Laboratory Manual에 기재된 방법(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420)을 들 수 있다. 즉 에피레귤린 발현 세포를 항원으로 하는 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting)의 원리로 평가될 수 있다.
ELISA 포맷에 있어서 항에피레귤린 항체의 에피레귤린 발현 세포에 대한 결합활성은 효소반응에 의해 생성되는 시그날 레벨을 비교함으로써 정량적으로 평가된다. 즉, 에피레귤린 발현 세포를 고정화한 ELISA 플레이트에 피험 항체를 첨가하고, 세포에 결합한 피험 항체가 피험 항체를 인식하는 효소 표지 항체를 이용하여 검출된다. 또는 FACS에 있어서는 피험 항체의 희석계열을 제작하여 에피레귤린 발현 세포에 대한 항체 결합 역가(titer)를 결정함으로써, 에피레귤린 발현 세포에 대한 피험 항체의 결합활성이 비교될 수 있다.
완충액 등에 현탁한 세포 표면 상에 발현하고 있는 항원에 대한 피험 항체의 결합은 플로우 사이토미터에 의해 검출할 수 있다. 플로우 사이토미터로서는, 예를 들면 다음과 같은 장치가 알려져 있다.
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(모두 BD Biosciences사의 상품명)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(모두 Beckman Coulter사의 상품명)
예를 들면 항에피레귤린 항체의 에피레귤린에 대한 결합활성의 적합한 측정방법의 일례로서 다음의 방법을 들 수 있다. 먼저 에피레귤린을 발현하는 세포와 반응시킨 피험 항체를 인식하는 FITC 표지한 2차 항체로 염색한다. 피험 항체를 적절히 적합한 완충액으로 희석함으로써 당해 항에피레귤린 항체를 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면 10 ㎍/mL부터 10 ng/mL까지 사이의 어느 하나의 농도로 사용될 수 있다. 다음으로 FACSCalibur(BD사)에 의해 형광강도와 세포수가 측정된다. 당해 세포에 대한 항체의 결합량은 CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 기하평균값(Geometric Mean value)에 반영된다. 즉 당해 기하평균값을 얻음으로써 피험 항체의 결합량으로 나타내어지는 피험 항체의 결합활성이 측정될 수 있다.
항에피레귤린 항체가 어떤 항체와 에피토프를 공유하는 것은 양자의 동일한 에피토프에 대한 경합에 의해 확인될 수 있다. 항체 간의 경합은 교차 블로킹 어세이 등에 의해 검출된다. 예를 들면 경합 ELISA 어세이는 바람직한 교차 블로킹 어세이다.
구체적으로는 교차 블로킹 어세이에 있어서는, 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코트한 에피레귤린 단백질이 후보가 되는 경합 항체의 존재하 또는 비존재하에서 프리인큐베이트된 후에 피험 항체가 첨가된다. 웰 중의 에피레귤린 단백질에 결합한 피험 항체의 양은 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경합하는 후보가 되는 경합 항체의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 경합 항체의 친화성이 커지면 커질수록 피험 항체의 에피레귤린 단백질을 코트한 웰에 대한 결합활성은 저하된다.
에피레귤린 단백질을 매개로 웰에 결합한 피험 항체의 양은 사전에 항체를 표지해둠으로써 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들면 비오틴 표지된 항체는 아비딘 퍼옥시다아제 콘쥬게이트와 적절한 기질을 사용함으로써 측정된다. 퍼옥시다아제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이는 특히 경합 ELISA 어세이라 불린다. 항체는 검출 또는 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지될 수 있다. 구체적으로는 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.
후보의 경합 항체의 비존재하에서 실시되는 대조 시험에 있어서 얻어지는 결합활성과 비교하여 경합 항체가 에피레귤린에 대한 항체의 결합을 20% 이상, 바람직하게는 20-50% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상 블로킹할 수 있다면, 당해 피험 항체는 경합 항체와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경합하는 항체이다.
항에피레귤린 항체가 결합하는 에피토프의 구조가 동정되어 있는 경우에는, 피험 항체와 대조 항체가 에피토프를 공유하는 것은 당해 에피토프를 구성하는 펩티드에 아미노산 변이를 도입한 펩티드에 대한 양자 항체의 결합활성을 비교함으로써 평가될 수 있다.
이러한 결합활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 상기 ELISA 포맷에 있어서 변이를 도입한 선상의 펩티드에 대한 피험 항체 및 대조 항체의 결합활성을 비교함으로써 측정될 수 있다. ELISA 이외의 방법으로서는 칼럼에 결합한 당해 변이 펩티드에 대한 결합활성을 당해 칼럼에 피험 항체와 대조 항체를 유하(flowing)시킨 후에 용출액 중에 용출되는 항체를 정량함으로써도 측정될 수 있다. 변이 펩티드를 예를 들면 GST와의 융합 펩티드로서 칼럼에 흡착시키는 방법은 공지이다.
또한 동정된 에피토프가 입체 에피토프인 경우에는, 피험 항체와 대조 항체가 에피토프를 공유하는 것은 다음의 방법으로 평가될 수 있다. 먼저 에피레귤린을 발현하는 세포와 에피토프에 변이가 도입된 에피레귤린을 발현하는 세포가 조제된다. 이들 세포가 PBS 등의 적절한 완충액에 현탁된 세포 현탁액에 대해 피험 항체와 대조 항체가 첨가된다. 이어서 적절히 완충액으로 세정된 세포 현탁액에 대해 피험 항체와 대조 항체를 인식할 수 있는 FITC 표지된 항체가 첨가된다. 표지 항체에 의해 염색된 세포의 형광강도와 세포수가 FACSCalibur(BD사)에 의해 측정된다. 피험 항체와 대조 항체의 농도는 적합한 완충액에 의해 적절히 희석함으로써 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면 10 ㎍/mL부터 10 ng/mL까지 사이의 어느 하나의 농도로 사용된다. 당해 세포에 대한 표지 항체의 결합량은 CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 기하평균값에 반영된다. 즉 당해 기하평균값을 얻음으로써 표지 항체의 결합량으로 표시되는 피험 항체와 대조 항체의 결합활성을 측정할 수 있다.
본 방법에 있어서, 예를 들면 「변이 에피레귤린 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」 것은 아래의 방법으로 판단할 수 있다. 먼저 변이 에피레귤린을 발현하는 세포에 대해 결합한 피험 항체와 대조 항체가 표지 항체로 염색된다. 이어서 세포의 형광강도가 검출된다. 형광 검출에 플로우 사이토메트리로서 FACSCalibur를 사용한 경우, 얻어진 형광강도는 CELL QUEST Software를 사용하여 해석될 수 있다. 항체의 존재하 및 비존재하에서의 기하평균값으로부터 이 비교값(ΔGeo-Mean)을 하기의 계산식(식 1)을 토대로 산출함으로써, 항체의 결합에 의한 형광강도의 증가 비율을 구할 수 있다.
(식 1)
Figure pct00001
해석에 의해 얻어지는 피험 항체의 변이 에피레귤린 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 기하평균 비교값(변이 에피레귤린 분자 ΔGeo-Mean값)을 피험 항체의 에피레귤린 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 ΔGeo-Mean 비교값과 비교한다. 이 경우에 있어서, 변이 에피레귤린 발현 세포 및 에피레귤린 발현 세포에 대한 ΔGeo-Mean 비교값을 구할 때 사용하는 피험 항체의 농도는 서로 동일 또는 실질적으로 동일한 농도로 조제되는 것이 특히 바람직하다. 사전에 에피레귤린 중의 에피토프를 인식하고 있는 것이 확인된 항체가 대조 항체로서 이용된다.
피험 항체의 변이 에피레귤린 발현 세포에 대한 ΔGeo-Mean 비교값이 피험 항체의 에피레귤린 발현 세포에 대한 ΔGeo-Mean 비교값의 적어도 80%, 바람직하게는 50%, 더욱 바람직하게는 30%, 특히 바람직하게는 15%보다 작으면 「변이 에피레귤린 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」것으로 한다. Geo-Mean값(Geometric Mean)을 구하는 계산식은 CELL QUEST Software User's Guide(BD biosciences사)에 기재되어 있다. 비교값을 비교함으로써 그것이 실질적으로 동일하다고 볼 수 있는 정도라면 피험 항에피레귤린 항체와 대조 항에피레귤린 항체의 에피토프는 동일하다고 평가될 수 있다.
항체
본 명세서에 있어서 항체란, 천연의 것이거나 또는 부분적 또는 완전 합성에 의해 제조된 면역 글로불린을 말한다. 항체는 그것이 천연으로 존재하는 혈장이나 혈청 등의 천연자원이나 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 배양상청으로부터 단리될 수 있고, 또는 유전자 재조합 등의 수법을 사용함으로써 부분적으로 또는 완전하게 합성될 수 있다. 항체의 예로서는 면역 글로불린의 아이소타입 및 그들 아이소타입의 서브클래스를 적합하게 들 수 있다. 인간의 면역 글로불린으로서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM의 9종류의 클래스(아이소타입)가 알려져 있다. 본 발명의 항체에는 이들 아이소타입 중 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 포함될 수 있다.
목적하는 결합활성을 갖는 항체를 제작하는 방법은 당업자에게 있어서 공지이다. 아래에 에피레귤린에 결합하는 항체(항에피레귤린 항체)를 제작하는 비한정의 한 방법이 예시된다.
항에피레귤린 항체는 공지의 수단을 사용하여 다중클론 항체 또는 단일클론 항체로서 취득될 수 있다. 항에피레귤린 항체로서는 포유동물 유래의 단일클론 항체가 적합하게 제작될 수 있다. 포유동물 유래의 단일클론 항체에는 하이브리도마에 의해 생산되는 것 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환한 숙주세포에 의해 생산되는 것 등이 포함된다. 또한 본원 발명의 단일클론 항체에는 「인간화 항체」나 「키메라 항체」가 포함된다.
단일클론 항체 생산 하이브리도마는 공지 기술을 사용함으로써, 예를 들면 아래와 같이 제작될 수 있다. 즉 에피레귤린 단백질을 감작 항원으로서 사용하여 통상의 면역방법에 따라 포유동물이 면역된다. 얻어지는 면역세포가 통상의 세포 융합법에 의해 공지의 친세포와 융합된다. 다음으로 통상의 스크리닝법에 의해 에피레귤린 분자 중의 에피토프에 결합하는 단일클론 항체 생산 세포를 스크리닝함으로써 항에피레귤린 항체를 생산하는 하이브리도마가 선택될 수 있다.
구체적으로는 단일클론 항체의 제작은 예를 들면 아래에 나타내는 바와 같이 행해진다. 먼저 서열번호：169에 그의 뉴클레오티드 서열이 개시된 인간 에피레귤린 유전자를 발현함으로써, 항체 취득의 감작 항원으로서 사용되는 서열번호：167로 표시되는 인간 에피레귤린 단백질이 취득될 수 있다. 즉 인간 에피레귤린을 코드하는 유전자 서열을 공지의 발현 벡터에 삽입함으로써 적당한 숙주세포가 형질전환된다. 당해 숙주세포 중으로부터 목적하는 인간 에피레귤린 단백질이 공지의 방법으로 정제된다. 또한 배양상청 중으로부터 가용형의 인간 에피레귤린을 취득하기 위해서는, 예를 들면 서열번호：167로 표시되는 인간 에피레귤린 폴리펩티드 서열 중 30~118번째의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드나 30~108번째의 아미노산에 포함되는 서열번호：34로 표시되는 단백질이 발현된다. 또한 정제한 천연의 인간 에피레귤린 단백질도 또한 동일하게 감작 항원으로서 사용될 수 있다.
포유동물에 대한 면역에 사용하는 감작 항원으로서 당해 정제 에피레귤린 단백질을 사용할 수 있다. 에피레귤린의 부분 펩티드도 또한 감작 항원으로서 사용할 수 있다. 이때 당해 부분 펩티드는 인간 에피레귤린의 아미노산 서열로부터 화학합성으로도 취득될 수 있다. 또한 인간 에피레귤린 유전자의 일부를 발현 벡터에 삽입하여 발현시킴으로써도 취득될 수 있다. 더 나아가서는 단백질 분해효소를 사용하여 인간 에피레귤린 단백질을 분해함으로써도 취득될 수 있으나, 부분 펩티드로서 사용하는 인간 에피레귤린 펩티드의 영역 및 크기는 특별한 태양에 한정되지 않는다. 바람직한 영역은 서열번호：167로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 30~118번째 또는 30~108번째의 아미노산에 상당하는 아미노산 서열로부터 임의의 서열이 선택될 수 있다. 감작 항원으로 하는 펩티드를 구성하는 아미노산의 수는 적어도 5 이상, 예를 들면 6 이상 또는 7 이상인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 8~50, 바람직하게는 10~30 잔기의 펩티드가 감작 항원으로서 사용될 수 있다.
또한 에피레귤린 단백질의 목적하는 부분 폴리펩티드나 펩티드를 상이한 폴리펩티드와 융합한 융합 단백질이 감작 항원으로서 이용될 수 있다. 감작 항원으로서 사용되는 융합 단백질을 제조하기 위해, 예를 들면 항체의 Fc 단편이나 펩티드 태그 등이 적합하게 이용될 수 있다. 융합 단백질을 발현하는 벡터는 목적하는 2종류 또는 그 이상의 폴리펩티드 단편을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되고, 당해 융합 유전자가 상기와 같이 발현 벡터에 삽입됨으로써 제작될 수 있다. 융합 단백질의 제작방법은 Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. press)에 기재되어 있다. 감작 항원으로서 사용되는 에피레귤린의 취득방법 및 이를 사용한 면역방법은 WO2008/047723 등에도 구체적으로 기재되어 있다.
당해 감작 항원으로 면역되는 포유동물로서는 특정 동물에 한정되는 것은 아니나, 세포 융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면 마우스, 랫트, 햄스터, 또는 토끼, 원숭이 등이 적합하게 사용된다.
공지의 방법에 따라 상기 동물이 감작 항원에 의해 면역된다. 예를 들면 일반적인 방법으로서, 감작 항원이 포유동물의 복강내 또는 피하 주사에 의해 투여됨으로써 면역이 실시된다. 구체적으로는 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당한 희석 배율로 희석된 감작 항원이 목적하는 바에 따라 통상의 애쥬번트, 예를 들면 프로인트 완전 애쥬번트와 혼합되어 유화된 후에, 당해 감작 항원이 포유동물에 4~21일마다 수 회 투여된다. 또한 감작 항원의 면역시에는 적당한 담체가 사용될 수 있다. 특히 분자량이 작은 부분 펩티드가 감작 항원으로서 사용되는 경우에는 알부민, 키홀림펫 헤모시아닌 등의 담체 단백질과 결합한 당해 감작 항원 펩티드를 면역하는 것이 바람직한 경우도 있다.
또한 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 DNA 면역을 사용하여 아래와 같이 해도 제작될 수 있다. DNA 면역이란 면역 동물 중에서 항원 단백질을 코드하는 유전자가 발현될 수 있는 태양으로 구축된 벡터 DNA가 투여된 당해 면역 동물 중에서, 감작 항원이 당해 면역 동물의 생체내에서 발현됨으로써 면역 자극이 부여되는 면역방법이다. 단백질 항원이 면역 동물에 투여되는 일반적인 면역방법과 비교하여 DNA 면역에는 다음과 같은 우위성이 기대된다.
-에피레귤린과 같은 막단백질의 구조를 유지하여 면역 자극이 부여될 수 있다
-면역 항원을 정제할 필요가 없다
DNA 면역에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 얻기 위해 먼저 에피레귤린 단백질을 발현하는 DNA가 면역 동물에 투여된다. 에피레귤린을 코드하는 DNA는 PCR 등의 공지의 방법으로 합성될 수 있다. 얻어진 DNA가 적당한 발현 벡터에 삽입되고 면역 동물에 투여된다. 발현 벡터로서는 예를 들면 pcDNA3.1 등의 시판의 발현 벡터가 적합하게 이용될 수 있다. 벡터를 생체에 투여하는 방법으로서 일반적으로 사용되고 있는 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면 발현 벡터가 흡착된 금 입자가 gene gun으로 면역 동물 개체의 세포내에 도입됨으로써 DNA 면역이 행해진다. 또한 에피레귤린을 인식하는 항체의 제작은 국제공개 WO2003/104453에 기재된 방법을 사용해서도 제작될 수 있다.
이와 같이 포유동물이 면역되어 혈청 중에 있어서의 에피레귤린에 결합하는 항체 역가의 상승이 확인된 후에, 포유동물로부터 면역세포가 채취되어 세포 융합에 제공된다. 바람직한 면역세포로서는 특히 비장세포가 사용될 수 있다.
상기 면역세포와 융합되는 세포로서 포유동물의 골수종 세포가 사용된다. 골수종 세포는 스크리닝을 위한 적당한 선택 마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택 마커란 특정 배양 조건하에서 생존할 수 있는(또는 할 수 없는) 형질을 가리킨다. 선택 마커에는 히포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스페라아제 결손(이하 HGPRT 결손으로 생략한다) 또는 티미딘 키나아제 결손(이하 TK 결손으로 생략한다) 등이 공지이다. HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 감수성(이하 HAT 감수성으로 생략한다)을 갖는다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택배지 중에서 DNA 합성을 행할 수 없어 사멸되나, 정상 세포와 융합하면 정상 세포의 샐비지 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속할 수 있기 때문에 HAT 선택배지 중에서도 증식하게 된다.
HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는 각각 6-티오구아닌, 8-아자구아닌(이하 8AG로 생략한다) 또는 5'-브로모데옥시우리딘을 포함하는 배지에서 선택될 수 있다. 이들 피리미딘 아날로그를 DNA 중에 포함시키는 정상 세포는 사멸하는 한편, 이들 피리미딘 아날로그를 포함시키지 못하는 이들 효소를 결손한 세포는 선택배지 중에서 생존할 수 있다. 이 밖에 G418 내성으로 불리는 선택 마커는, 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민계 항생물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 부여한다. 세포 융합에 적합한 각종 골수종 세포가 공지이다.
이러한 골수종 세포로서, 예를 들면 P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1(C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519), MPC-11(Cell (1976) 8 (3), 405-415), SP2/0(Nature (1978) 276 (5685), 269-270), FO(J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21), S194/5.XX0.BU.1(J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323), R210(Nature (1979) 277 (5692), 131-133) 등이 적합하게 사용될 수 있다.
기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 쾰러와 밀스테인 등의 방법(Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준하여 상기 면역세포와 골수종 세포의 세포 융합이 행해진다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 세포 융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양 배양액 중에서 상기 세포 융합이 실시될 수 있다. 융합 촉진제로서는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 추가로 융합 효율을 높이기 위해 목적하는 바에 따라 디메틸설폭시드 등의 보조제가 첨가되어 사용된다.
면역세포와 골수종 세포의 사용 비율은 임의로 설정될 수 있다. 예를 들면 골수종 세포에 대해 면역세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이 종의 세포 배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용되고, 또한 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액이 적합하게 첨가될 수 있다.
세포 융합은 상기 면역세포와 골수종 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 사전에 37℃ 정도로 가온된 PEG 용액(예를 들면 평균 분자량 1,000~6,000 정도)이 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가된다. 혼합액이 완만하게 혼합됨으로써 목적하는 융합 세포(하이브리도마)가 형성된다. 이어서 상기에 예로 든 적당한 배양액이 축차 첨가되고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포 융합제 등이 제거될 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸되기에 충분한 시간(통상 이러한 충분한 시간은 수 일 내지 수 주간이다) 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속될 수 있다. 이어서 통상의 한계희석법에 의해 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시된다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는 세포 융합에 사용된 골수종이 갖는 선택 마커에 따른 선택 배양액을 이용함으로써 선택될 수 있다. 예를 들면 HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 즉 HAT 감수성의 골수종 세포를 세포 융합에 사용한 경우, HAT 배양액 중에서 정상 세포와의 세포 융합에 성공한 세포가 선택적으로 증식될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸되기에 충분한 시간, 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속된다. 구체적으로는 일반적으로 수 일 내지 수 주간의 배양에 의해 목적하는 하이브리도마가 선택될 수 있다. 이어서 통상의 한계희석법에 의해 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시될 수 있다.
목적하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝이 공지의 항원 항체 반응에 기초하는 스크리닝방법에 의해 적합하게 실시될 수 있다. 예를 들면 에피레귤린에 결합하는 단일클론 항체는 세포 표면에 발현한 에피레귤린에 결합할 수 있다. 이러한 단일클론 항체는 예를 들면 FACS(fluorescence activated cell sorting)에 의해 스크리닝될 수 있다. FACS는 형광 항체와 접촉시킨 세포를 레이저광으로 해석하고, 개개의 세포가 발하는 형광을 측정함으로써 세포 표면에 대한 항체의 결합을 측정하는 것을 가능하게 하는 시스템이다.
FACS에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해서는 먼저 에피레귤린을 발현하는 세포를 조제한다. 스크리닝을 위한 바람직한 세포는 에피레귤린을 강제 발현시킨 포유동물 세포이다. 숙주세포로서 사용한 형질전환되어 있지 않은 포유동물 세포를 대조로서 사용함으로써, 세포 표면의 에피레귤린에 대한 항체의 결합활성이 선택적으로 검출될 수 있다. 즉 숙주세포에 결합하지 않고 에피레귤린 강제 발현 세포에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택함으로써, 에피레귤린 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마가 취득될 수 있다.
또는 고정화한 에피레귤린 발현 세포에 대한 항체의 결합활성이 ELISA의 원리에 기초하여 평가될 수 있다. 예를 들면 ELISA 플레이트의 웰에 에피레귤린 발현 세포가 고정화된다. 하이브리도마의 배양상청을 웰 내의 고정화 세포에 접촉시켜 고정화 세포에 결합하는 항체가 검출된다. 단일클론 항체가 마우스 유래인 경우, 세포에 결합한 항체는 항마우스 이뮤노 글로불린 항체에 의해 검출될 수 있다. 이들의 스크리닝에 의해 선택된 항원에 대한 결합능을 갖는 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 한계희석법에 의해 클로닝될 수 있다.
이와 같이 하여 제작되는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대 배양될 수 있다. 또한 당해 하이브리도마는 액체질소 중에서 장기에 걸쳐 보존될 수 있다.
당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양상청으로부터 목적하는 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 또는 하이브리도마를 이와 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시키고, 그의 복수(腹水)로부터 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻기에 적합한 것이다.
당해 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 클로닝되는 항체 유전자에 의해 코드되는 항체도 적합하게 이용될 수 있다. 클로닝한 항체 유전자를 적당한 벡터에 삽입하여 숙주에 도입함으로써 당해 유전자에 의해 코드되는 항체가 발현된다. 항체 유전자의 단리와 벡터로의 도입, 그리고 숙주세포의 형질전환을 위한 방법은 예를 들면 Vandamme 등에 의해 이미 확립되어 있다(Eur.J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775). 하기에 기술하는 바와 같이 재조합 항체의 제조방법도 또한 공지이다.
예를 들면 항에피레귤린 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 항에피레귤린 항체의 가변영역(V영역)을 코드하는 cDNA가 취득된다. 그 때문에 통상 먼저 하이브리도마로부터 전체 RNA가 추출된다. 세포로부터 mRNA를 추출하기 위한 방법으로서, 예를 들면 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다.
-구아닌 초원심법(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
-AGPC법(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
추출된 mRNA는 mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등을 사용하여 정제될 수 있다. 또는 QuickPrep mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등과 같이 세포로부터 직접 전체 mRNA를 추출하기 위한 키트도 시판되고 있다. 이러한 키트를 사용하여 하이브리도마로부터 mRNA가 취득될 수 있다. 얻어진 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체 V영역을 코드하는 cDNA가 합성될 수 있다. cDNA는 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학공업사 제조) 등에 의해 합성될 수 있다. 또한 cDNA의 합성 및 증폭을 위해 SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech 제조) 및 PCR을 사용한 5'-RACE법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002, Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)이 적절히 이용될 수 있다. 또한 이러한 cDNA의 합성 과정에 있어서 cDNA의 양 말단에 후술하는 적절한 제한효소 사이트가 도입될 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 cDNA 단편이 정제되고, 이어서 벡터 DNA와 연결된다. 이와 같이 재조합 벡터가 제작되고 대장균 등에 도입되어 콜로니가 선택된 후에, 당해 콜로니를 형성한 대장균으로부터 목적하는 재조합 벡터가 조제될 수 있다. 그리고 당해 재조합 벡터가 목적으로 하는 cDNA의 염기서열을 가지고 있는지 여부에 대해서 공지의 방법, 예를 들면 디데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션법 등에 의해 확인된다.
가변영역을 코드하는 유전자를 취득하기 위해서는 가변영역 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 5'-RACE법을 이용하는 것이 간편하다. 먼저 하이브리도마 세포로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성되고, 5'-RACE cDNA 라이브러리가 얻어진다. 5'-RACE cDNA 라이브러리의 합성에는 SMART RACE cDNA 증폭 키트 등 시판의 키트가 적절히 사용된다.
얻어진 5'-RACE cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법에 의해 항체 유전자가 증폭된다. 공지의 항체 유전자 서열을 토대로 마우스 항체 유전자 증폭용 프라이머가 디자인될 수 있다. 이들 프라이머는 이뮤노 글로불린의 서브클래스별로 상이한 염기서열이다. 따라서 서브클래스는 사전에 Iso Strip 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트(로슈 다이아그노스틱스) 등의 시판 키트를 사용하여 결정해두는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 예를 들면 마우스 IgG를 코드하는 유전자의 취득을 목적으로 할 때는, 중쇄로서 γ1, γ2a, γ2b, γ3, 경쇄로서 κ쇄와 λ쇄를 코드하는 유전자의 증폭이 가능한 프라이머가 이용될 수 있다. IgG의 가변영역 유전자를 증폭하기 위해서는, 일반적으로 3'측의 프라이머에는 가변영역에 가까운 불변영역에 상당하는 부분에 어닐링하는 프라이머가 이용된다. 한편 5'측의 프라이머에는 5' RACE cDNA 라이브러리 제작 키트에 부속하는 프라이머가 이용된다.
이렇게 증폭된 PCR 산물을 이용하여 중쇄와 경쇄의 조합으로 이루어지는 이뮤노 글로불린이 재구성될 수 있다. 재구성된 이뮤노 글로불린의 에피레귤린에 대한 결합활성을 지표로 하여 목적하는 항체가 스크리닝될 수 있다. 에피레귤린에 대한 항체의 취득을 목적으로 할 때, 항체의 에피레귤린에 대한 결합은 특이적인 것이 더욱 바람직하다. 에피레귤린에 결합하는 항체는 예를 들면 다음과 같이 하여 스크리닝될 수 있다；
(1) 하이브리도마로부터 얻어진 cDNA에 의해 코드되는 V영역을 포함하는 항체를 에피레귤린 발현 세포에 접촉시키는 공정,
(2) 에피레귤린 발현 세포와 항체의 결합을 검출하는 공정, 및
(3) 에피레귤린 발현 세포에 결합하는 항체를 선택하는 공정.
항체와 에피레귤린 발현 세포의 결합을 검출하는 방법은 공지이다. 구체적으로는, 앞서 기술한 FACS 등의 수법에 의해 항체와 에피레귤린 발현 세포의 결합이 검출될 수 있다. 항체의 결합활성을 평가하기 위해 에피레귤린 발현 세포의 고정 표본이 적절히 이용될 수 있다.
결합활성을 지표로 하는 항체의 스크리닝방법으로서 파지 벡터를 이용한 패닝법도 적합하게 사용된다. 다중클론 항체 발현 세포군으로부터 항체 유전자를 중쇄와 경쇄의 서브클래스의 라이브러리로서 취득한 경우에는, 파지 벡터를 이용한 스크리닝방법이 유리하다. 중쇄와 경쇄의 가변영역을 코드하는 유전자는 적당한 링커 서열로 연결함으로써 싱글 체인 Fv(scFv)를 형성할 수 있다. scFv를 코드하는 유전자를 파지 벡터에 삽입함으로써 scFv를 표면에 발현하는 파지가 취득될 수 있다. 이 파지와 목적하는 항원의 접촉 후에 항원에 결합한 파지를 회수함으로써, 목적의 결합활성을 갖는 scFv를 코드하는 DNA가 회수될 수 있다. 이 조작을 필요에 따라 반복함으로써 목적하는 결합활성을 갖는 scFv가 농축될 수 있다.
목적으로 하는 항에피레귤린 항체의 V영역을 코드하는 cDNA가 얻어진 후에, 당해 cDNA의 양 말단에 삽입한 제한효소 사이트를 인식하는 제한효소에 의해 당해 cDNA가 소화된다. 바람직한 제한효소는 항체 유전자를 구성하는 염기서열에 출현하는 빈도가 낮은 염기서열을 인식하여 소화한다. 또한 1카피의 소화 단편을 벡터에 바른 방향으로 삽입하기 위해서는 부착 말단을 부여하는 제한효소의 삽입이 바람직하다. 상기와 같이 소화된 항IL-6R 항체의 V영역을 코드하는 cDNA를 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 항체 발현 벡터가 취득될 수 있다. 이때 항체 불변영역(C영역)을 코드하는 유전자와 상기 V영역을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되면 키메라 항체가 취득된다. 여기서 키메라 항체란 불변영역과 가변영역의 유래가 상이한 것을 말한다. 따라서 마우스-인간 등의 이종 키메라 항체에 더하여 인간-인간 동종 키메라 항체도 본 발명에 있어서의 키메라 항체에 포함된다. 사전에 불변영역을 갖는 발현 벡터에 상기 V영역 유전자를 삽입함으로써 키메라 항체 발현 벡터가 구축될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 목적하는 항체 불변영역(C영역)을 코드하는 DNA를 보유한 발현 벡터의 5'측에 상기 V영역 유전자를 소화하는 제한효소의 제한효소 인식 서열이 적절히 배치될 수 있다. 같은 조합의 제한효소로 소화된 양자가 인프레임으로 융합됨으로써 키메라 항체 발현 벡터가 구축된다.
에피레귤린에 결합하는 단일클론 항체를 제조하기 위해 항체 유전자가 발현 제어영역에 의한 제어하에서 발현되도록 발현 벡터에 삽입된다. 항체를 발현하기 위한 발현 제어영역이란, 예를 들면 인핸서나 프로모터를 포함한다. 또한 발현된 항체가 세포외로 분비되도록 적절한 시그날 서열이 아미노 말단에 부가될 수 있다. 뒤에 기재되는 실시예에서는 시그날 서열로서 아미노산 서열 MGWSCIILFLVATATGVHS(서열번호：168)를 갖는 펩티드가 사용되고 있는데, 이것 이외에도 적합한 시그날 서열이 부가된다. 발현된 폴리펩티드는 상기 서열의 카르복실 말단 부분에서 절단되고, 절단된 폴리펩티드가 성숙 폴리펩티드로서 세포외로 분비될 수 있다. 이어서 이 발현 벡터에 의해 적당한 숙주세포가 형질전환됨으로써 항에피레귤린 항체를 코드하는 DNA를 발현하는 재조합 세포가 취득될 수 있다.
항체 유전자의 발현을 위해 항체 중쇄(H쇄) 및 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA는 각각 다른 발현 벡터에 삽입된다. H쇄와 L쇄가 삽입된 벡터에 의해 같은 숙주세포로 동시에 형질전환(co-transfect)됨으로써 H쇄와 L쇄를 구비한 항체 분자가 발현될 수 있다. 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA가 단일 발현 벡터에 삽입됨으로써 숙주세포가 형질전환될 수 있다(국제공개 WO1994/011523을 참조할 것).
단리된 항체 유전자를 적당한 숙주에 도입함으로써 항체를 제작하기 위한 숙주세포와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이들 발현계는 모두 본 발명의 항원 결합 도메인을 단리하는 데 응용될 수 있다. 진핵세포가 숙주세포로서 사용되는 경우, 동물세포, 식물세포 또는 진균세포가 적절히 사용될 수 있다. 구체적으로는, 동물세포로서는 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.
(1) 포유류세포：CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), Hela, Vero, HEK(human embryonic kidney)293 등
(2) 양서류세포：아프리카 발톱 개구리 난모세포 등
(3) 곤충세포：sf9, sf21, Tn5 등
또는 식물세포로서는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아나(Nicotiana)속 유래의 세포에 의한 항체 유전자의 발현계가 공지이다. 식물세포의 형질전환에는 캘러스 배양한 세포가 적절히 이용될 수 있다.
또한 진균세포로서는 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다.
-효모：사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces serevisiae) 등의 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 메탄올 자화 효모(Pichia pastoris) 등의 Pichia속
-사상균：아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스(Aspergillus)속
또한 원핵세포를 이용한 항체 유전자의 발현계도 공지이다. 예를 들면 세균세포를 사용하는 경우, 대장균(E. coli), 고초균 등의 세균세포가 적절히 이용될 수 있다. 이들 세포 중에 목적으로 하는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 형질전환에 의해 도입된다. 형질전환된 세포를 인 비트로(in vitro)에서 배양함으로써 당해 형질전환 세포의 배양물로부터 목적하는 항체가 취득될 수 있다.
재조합 항체의 생산에는 상기 숙주세포에 더하여 형질전환 동물도 이용될 수 있다. 즉 목적하는 항체를 코드하는 유전자가 도입된 동물로부터 당해 항체를 얻을 수 있다. 예를 들면 항체 유전자는 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 내부에 인프레임으로 삽입함으로써 융합 유전자로서 구축될 수 있다. 유즙 중에 분비되는 단백질로서 예를 들면 염소 β카제인 등이 이용될 수 있다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편은 염소의 배(胚)로 주입되고, 당해 주입된 배가 암컷 염소로 도입된다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소(또는 그의 자손)가 생산하는 유즙으로부터는 목적하는 항체가 유즙 단백질과의 융합 단백질로서 취득될 수 있다. 또한 형질전환 염소로부터 생산되는 목적하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해 호르몬이 형질전환 염소에 대해 투여될 수 있다(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702).
본 명세서에 있어서 기재되는 항에피레귤린 항체가 인간에게 투여되는 경우, 당해 항체에 있어서의 항원 결합 도메인으로서, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체 유래의 항원 결합 도메인이 적절히 채용될 수 있다. 유전자 재조합형 항체에는 예를 들면 인간화(Humanized) 항체 등이 포함된다. 이들 개변 항체는 공지의 방법을 사용하여 적절히 제조된다.
본 명세서에 있어서 기재되는 항에피레귤린 항체에 있어서의 항원 결합 도메인을 제작하기 위해 사용되는 항체의 가변영역은, 통상 4개의 프레임워크 영역(FR) 사이에 끼인 3개의 상보성 결정영역(complementarity-determining region ; CDR)으로 구성되어 있다. CDR은 실질적으로 항체의 결합 특이성을 결정하고 있는 영역이다. CDR의 아미노산 서열은 다양성이 풍부하다. 한편 FR을 구성하는 아미노산 서열은 상이한 결합 특이성을 갖는 항체 사이에서도 높은 동일성을 나타내는 것이 많다. 이 때문에 일반적으로 CDR의 이식에 의해 어떤 항체의 결합 특이성을 다른 항체에 이식할 수 있는 것으로 되어 있다.
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체로도 불린다. 구체적으로는 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는 마우스의 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서, 예를 들면 Overlap Extension PCR이 공지이다. Overlap Extension PCR에 있어서는 인간 항체의 FR을 합성하기 위한 프라이머에 이식 대상 마우스 항체의 CDR을 코드하는 염기서열이 부가된다. 프라라이머는 4개의 FR의 각각에 대해서 준비된다. 일반적으로 마우스 CDR의 인간 FR으로의 이식에 있어서는 마우스의 FR과 동일성이 높은 인간 FR을 선택하는 것이 CDR의 기능 유지에 있어서 유리한 것으로 되어 있다. 즉, 일반적으로 이식 대상 마우스 CDR에 인접해 있는 FR의 아미노산 서열과 동일성이 높은 아미노산 서열로 이루어지는 인간 FR을 이용하는 것이 바람직하다.
또한 연결되는 염기서열은 서로 인프레임으로 접속되도록 디자인된다. 각각의 프라이머에 의해 인간 FR이 개별적으로 합성된다. 그 결과, 각 FR에 마우스 CDR을 코드하는 DNA가 부가된 산물이 얻어진다. 각 산물의 마우스 CDR을 코드하는 염기서열은 서로 오버랩되도록 디자인되어 있다. 계속해서 인간 항체 유전자를 주형으로 하여 합성된 산물의 오버랩된 CDR 부분을 서로 어닐링시켜서 상보가닥 합성반응이 행해진다. 이 반응에 의해 인간 FR이 마우스 CDR의 서열을 매개로 연결된다.
최종적으로 3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 V영역 유전자는, 그의 5'말단과 3'말단에 어닐링되어 적당한 제한효소 인식 서열이 부가된 프라이머에 의해 그 전장이 증폭된다. 상기와 같이 얻어진 DNA와 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA를 인프레임으로 융합되도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써 인간형 항체 발현용 벡터를 제작할 수 있다. 당해 삽입 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에, 당해 재조합 세포를 배양하여 당해 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써 당해 인간화 항체가 당해 배양세포의 배양물 중에 생산된다(유럽 특허공개 EP239400, 국제공개 WO1996/002576 참조).
상기와 같이 제작된 인간화 항체의 항원에 대한 결합활성을 정성적 또는 정량적으로 측정하고 평가함으로써, CDR을 매개로 연결되었을 때에 당해 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 인간 항체의 FR을 적합하게 선택할 수 있다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환하는 것도 가능하다. 예를 들면 마우스 CDR의 인간 FR으로의 이식에 사용한 PCR법을 응용하여 FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는 FR에 어닐링하는 프라이머에 부분적인 염기서열의 변이를 도입할 수 있다. 이러한 프라이머에 의해 합성된 FR에는 염기서열의 변이가 도입된다. 아미노산을 치환한 변이형 항체의 항원에 대한 결합활성을 상기 방법으로 측정하고 평가함으로써 목적하는 성질을 갖는 변이 FR 서열이 선택될 수 있다(Cancer Res., (1993) 53, 851-856).
또한 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역 동물로 하고, DNA 면역에 의해 목적하는 인간 항체가 취득될 수 있다.
또한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면 인간 항체의 V영역이 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써 항원에 결합하는 인간 항체의 V영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V영역 서열을 목적하는 인간 항체 C영역의 서열과 인프레임으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 예로 든 바와 같은 적합한 발현 세포 중에 도입하고, 당해 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).
또한 항체 유전자를 취득하는 방법으로서 Bernasconi 등(Science (2002) 298, 2199-2202) 또는 WO2008/081008에 기재된 바와 같은 B세포 클로닝(각각의 항체의 코드 서열의 동정 및 클로닝, 그의 단리 및 각각의 항체(특히, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 제작을 위한 발현 벡터 구축을 위한 사용 등)의 수법이 상기 외에 적절히 사용될 수 있다.
EU 넘버링 및 Kabat 넘버링
본 발명에서 사용되고 있는 방법에 의하면 항체의 CDR과 FR에 할당되는 아미노산 위치는 Kabat에 따라 규정된다(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987년 및 1991년). 본 명세서에 있어서 항에피레귤린 항체의 가변영역의 아미노산은 Kabat 넘버링에 따라, 불변영역의 아미노산은 Kabat의 아미노산 위치에 준한 EU 넘버링에 따라 표시된다.
아미노산의 개변
항체의 아미노산 서열 중의 아미노산의 개변을 위해서는, 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법이 적절히 채용될 수 있다. 또한 천연의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 아미노산의 개변방법으로서 복수의 공지의 방법도 또한 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들면 종지 코돈의 하나인 UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적인 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합된 tRNA가 포함되는 무세포 번역계 시스템(Clover Direct(Protein Express)) 등도 적합하게 사용된다.
본 명세서에 있어서 아미노산의 개변 부위를 나타낼 때 사용되는 「및/또는」의 용어의 의의는 「및」과 「또는」이 적절히 조합된 모든 조합을 포함한다. 구체적으로는, 예를 들면 「33번 위치, 55번 위치 및/또는 96번 위치의 아미노산이 치환되어 있다」는 것은 아래의 아미노산의 개변의 변형이 포함된다；
(a) 33번 위치, (b) 55번 위치, (c) 96번 위치, (d) 33번 위치 및 55번 위치, (e) 33번 위치 및 96번 위치, (f) 55번 위치 및 96번 위치, (g) 33번 위치 및 55번 위치 및 96번 위치.
면역원성의 저감
본 발명의 항체는 인간 숙주에 있어서 예측되는 면역원성이 저감되어 있는 것이 바람직하다.
「저면역원성」이란, 치료 효과를 달성하기에 충분한 시간에 있어서 항체 투여의 계속된 효과를 저하시키기에 충분한 양의 항체가 투여되는 개체의 적어도 과반수에 있어서 항체가 항체 반응을 야기하지 않는 것을 의미한다.
인간에 있어서의 면역원성의 레벨은 MHC 클래스 II 결합 예측 프로그램 Propred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred)를 사용하여 모든 대립 유전자의 1% 역치 해석을 사용하여 예측할 수 있다. 사용 가능한 다른 프로그램으로서는:
-Rankpep(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)
-Epibase(Algonomics proprietary software: algonomics.com)
가 포함된다.
면역원성이 저감된 분자는 초기의 도너 분자와 비교하여 표적 집단에 있어서 고도로 발현되는 MHC 클래스 II 대립 유전자에 결합하는 것으로 예측되는 펩티드를 포함하지 않거나, 당해 펩티드의 수가 저감되어 있다(Flower 등(Drug Discov. Today (2004) 9(2), 82-90)).
MHC 클래스 II 결합의 기능 분석은 당해 단백질에 대응하는 중복되는 펩티드를 생성하여, T세포 활성화를 야기하는 그들의 능력을 시험하거나(T세포 증식 분석) 또는 리포터 펩티드인 기지의 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 치환함으로써 실시할 수 있다(Hammer 등(J. Exp. Med. (1994) 180, 2353-2358)).
본 발명의 항에피레귤린 항체의 면역원성을 저감하기 위해 몇 가지 방법이 채용될 수 있다. 제1 방법은 상기한 항체의 인간화를 행하는 방법이다. 보다 구체적으로는 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스로부터 단리된 항에피레귤린 항체의 CDR이 인간 항체에 이식된다. 에피레귤린에 대한 결합을 유지 또는 증강시키기 위해, 추가적으로 인간화 항에피레귤린 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기가 치환될 수 있다.
본 발명의 마우스로부터 단리된 항에피레귤린 항체의 비한정의 일태양으로서는, WO2008/047723에 기재되는 EP03, EP08, EP20, EP24, EP27 또는 EP29 항체가 예시될 수 있다. EP03 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 본 명세서에 있어서 각각 서열번호：173, 174 및 175, 및 176, 177 및 178로서 기재된다. EP08 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 본 명세서에 있어서 각각 서열번호：179, 180 및 181, 및 182, 183 및 184로서 기재된다. EP20 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 본 명세서에 있어서 각각 서열번호：185, 186 및 187, 및 188, 189 및 190으로서 기재된다. 또한 EP24 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 본 명세서에 있어서 각각 서열번호：191, 192 및 193, 및 194, 195 및 196으로서 기재된다. EP27 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 본 명세서에 있어서 각각 서열번호：9, 10 및 11, 및 12, 13 및 14로서 기재된다. 또한 EP29 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 본 명세서에 있어서 각각 서열번호：197, 198 및 199, 및 200, 201 및 202로서 기재된다.
본 발명의 마우스로부터 단리된 항에피레귤린 항체의 CDR의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：9로 표시되는 중쇄 CDR1(HCDR1), 서열번호：10으로 표시되는 중쇄 CDR2(HCDR2) 및 서열번호：11로 표시되는 중쇄 CDR3(HCDR3)를 들 수 있다. 또한 본 발명의 마우스로부터 단리된 항에피레귤린 항체의 CDR의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：12로 표시되는 경쇄 CDR1(LCDR1), 서열번호：13으로 표시되는 경쇄 CDR2(LCDR2) 및 서열번호：14로 표시되는 경쇄 CDR3(LCDR3)를 들 수 있다.
본 발명의 인간 항체의 FR의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：1로 표시되는 중쇄 FR1(HFR1), 서열번호：2로 표시되는 중쇄 FR2(HFR2), 서열번호：3으로 표시되는 중쇄 FR3(HFR3) 및 서열번호：4로 표시되는 중쇄 FR4(HFR4)를 들 수 있다. 또한 본 발명의 인간 항체의 FR의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：5로 표시되는 경쇄 FR1(LFR1), 서열번호：6으로 표시되는 경쇄 FR2(LFR2), 서열번호：7로 표시되는 경쇄 FR3(LFR3) 및 서열번호：8로 표시되는 경쇄 FR4(LFR4)를 들 수 있다.
본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 가변영역의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：15로 표시되는 중쇄 가변영역을 들 수 있다. 또한 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 가변영역의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：16으로 표시되는 경쇄 가변영역을 들 수 있다.
또한 본 발명의 인간 항체의 FR의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：17로 표시되는 중쇄 FR1(HFR1) 또는 서열번호：18로 표시되는 중쇄 FR3(HFR3)를 들 수 있다. 또한 본 발명의 인간 항체의 FR의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：20으로 표시되는 경쇄 FR2(LFR2), 서열번호：21로 표시되는 경쇄 FR3(LFR3) 또는 서열번호：23으로 표시되는 경쇄 FR3(LFR3)를 들 수 있다.
본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 가변영역의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：19로 표시되는 중쇄 가변영역을 들 수 있다. 또한 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 가변영역의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：22 또는 서열번호：24로 표시되는 경쇄 가변영역을 들 수 있다.
또한 본 발명의 인간화 항체의 FR의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：35로 표시되는 중쇄 FR3(HFR3) 또는 서열번호：36으로 표시되는 중쇄 FR3(HFR3)를 들 수 있다. 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 가변영역의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：37 또는 서열번호：38로 표시되는 중쇄 가변영역을 들 수 있다.
제2 방법은 항에피레귤린 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산이 개변된 개변 서열을, 상기 MHC 클래스 II 결합 예측 프로그램을 사용해서 해석하여 면역원성이 감약된 개변 서열을 설계하는 방법이다. 본 발명의 항에피레귤린 항체의 면역원성을 감약시키기 위해 아미노산을 개변하는 부위의 비한정의 예로서, 서열번호：38로 표시되는 항에피레귤린 항체의 중쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 87번 위치 및/또는 101번 위치의 아미노산을 적합하게 들 수 있다. 또한 항에피레귤린 항체의 면역원성을 감약시키기 위해 아미노산을 개변하는 부위의 비한정의 예로서, 서열번호：29로 표시되는 항에피레귤린 항체의 경쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 24번 위치의 아미노산을 적합하게 들 수 있다.
상기 아미노산 치환의 비한정의 일태양으로서는, 서열번호：38로 표시되는 항에피레귤린 항체의 중쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 87번 위치의 아미노산의 Ser(S)으로의 치환 및/또는 101번 위치의 아미노산의 Tyr(Y) 또는 Phe(F)로의 치환을 적합하게 들 수 있다. 또한 상기 아미노산 치환의 비한정의 일태양으로서는, 서열번호：29로 표시되는 항에피레귤린 항체의 경쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 24번 위치의 아미노산의 Arg(R)로의 치환을 적합하게 들 수 있다.
제3 방법은 예를 들면 IgG1 항체의 불변영역을 포함하는 항에피레귤린 항체를 설계할 때, IgG1의 알로타입인 G1m3 타입(서열번호：31로 표시되는 서열의 C말단에 GK가 부가된 서열), G1m17,1 타입(서열번호：26) 또는 G1m17 타입(서열번호：30으로 표시되는 서열의 C말단에 GK가 부가된 서열)으로부터 선택되는 알로타입의 불변영역을 적절히 선택하는 방법이다. 항체 약제가 투여되는 인간 생물종의 알로타입과 당해 항체 약제의 알로타입의 적합성이 당해 생물종의 면역응답에 영향을 미치는 것이 알려져 있다(Genes and Immunity (2011) 12, 213-221).
면역원성이 저감된 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 중쇄의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄를 들 수 있다. 또한 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 경쇄의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：29, 57, 58, 80-85, 99, 128-130, 136 및 141로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 들 수 있다.
면역원성이 저감된 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 서열번호：29, 57, 58, 80-85, 99, 128-130, 136 및 141로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 인간화 항에피레귤린 항체를 들 수 있다.
탈아미드화, 이성화, 가수분해의 억제
본 발명의 항에피레귤린 항체는 탈아미드화, 이성화, 가수분해가 억제되어 있는 것이 바람직하다.
단백질 의약품의 회합체량을 조절하는 것은 품질 관리상, 또한 약효 및 면역원성에 미치는 영향을 고려한 경우 대단히 중요하다(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714). 일반적으로 회합화는 단백질 용액 환경에 기인하는 콜로이드 안정성(colloidal stability)과 단백질 구조에 기인하는 입체 배좌 안정성(conformational stability) 양쪽에 영향을 받는다(J. Phar.m Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315). 항체 제제의 처방 검토에 의해 항체농도나 pH, 완충액종, 이온강도, 첨가제 등을 스크리닝함으로써 콜로이드 안정성에 유효한 조건을 얻는 것이 가능하다. 한편 입체 배좌 안정성은 아미노산 서열에 의존하는 부분도 있어, 항체의 경우는 CDR의 정규 구조(canonical structures)나 FR의 공통서열(consensus sequence), VH/VL 계면 등의 특징적인 구조를 유지하는 것이 중요하게 여겨지고 있다(Jung 등(J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716), Xiang 등(J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390), Ewert 등(Methods. (2004) 34 (2), 184-199), Vargas-Madrazo 등(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3) 113-120) 및 Morea 등(J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294).
탈아미드화 반응이란 아스파라긴 및 글루타민의 측쇄에 있어서 비효소적으로 일어나, 아스파라긴 및 글루타민의 측쇄에 존재하는 아미드가 카르복실산으로 변화하는 반응을 말한다. 또한 이성화는 아스파라긴 및 아스파라긴산의 측쇄에 있는 카르보닐기가 C말단측에 있는 잔기의 질소원자 전자쌍에 공격받은 결과, 아스파라긴의 탈아미드화 또는 아스파라긴산의 탈수에 의해 불안정한 환상 이미드 중간체가 형성되는 것에 기인한다. 이 중간체는 개열(開裂)에 의해 대부분이 이소아스파라긴산으로, 나머지가 아스파라긴산으로 변화된다. 글루타민의 경우에는 탈아미드화 속도가 일반적으로 아스파라긴의 경우의 10분의 1인데, 이 메커니즘은 본질적으로 동일하고 진행에 수분자만을 필요로 한다. 이들 항체 등의 단백질의 보존 중에 일어나는 탈아미드화, 이성화 반응은 전술한 이질성(heterogeneity)의 원인이 되는 것으로부터 가능한 한 억제되는 것이 요망된다. 또한 탈아미드화 반응은 특히 아스파라긴과 글리신이 인접한 부위(Asn-Gly)에서 일어나기 쉬운 것이 보고되어 있다(Geiger 등(J. Biol. Chem. (1987) 262, 785-794). 또한 아스파라긴산은 가수분해 반응에 의해 펩티드 사슬의 절단이 일어나는 것이 보고되어 있고, 특히 C말단측에 프롤린이 존재하는 서열(Asp-Pro)은 산성 조건하에서의 분해가 일어나기 쉽다고 알려져 있다(Segalas 등(FEBS Letters (1995) 371, 171-175)).
탈아미드화, 이성화, 가수분해를 억제하기 위해, 탈아미드화를 받는 부위인 글루타미닐 잔기 및 아스파라기닐 잔기를 제거하는 아미노산의 개변 등이 적절히 실시될 수 있다. 제거가 특히 유용한 탈아미드화 부위의 비한정의 일태양으로서는 탈아미드화 반응이 촉진되는 부위, 즉 NG 및 QG 서열로서 표시되는 모티브 중의 글리신 잔기, 아스파라긴 잔기 또는 글루타민 잔기를 적합하게 들 수 있다. 이들 중 어느 하나의 아미노산 잔기(N, Q 또는 G)의 치환은 탈아미드화 반응을 현저히 억제할 수 있다(WO2003/057881 또는 WO2005/067620 등). 또한 항체를 생산하는 세포의 배양방법을 조정함으로써 탈아미드화 반응이 억제된 항체를 제조하기 위한 방법도 적절히 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 항에피레귤린 항체로서는 상기 탈아미드화 반응을 억제하는 기술이 적용된 항에피레귤린 항체도 또한 포함된다.
탈아미드화를 받는 부위의 비한정의 예로서, 서열번호：38로 표시되는 항에피레귤린 항체의 중쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 31번 위치, 52번 위치, 54번 위치, 56번 위치 및/또는 101번 위치의 아미노산을 적합하게 들 수 있다. 또한 탈아미드화를 받는 부위의 비한정의 예로서, 서열번호：29로 표시되는 항에피레귤린 항체의 경쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 28번 위치, 92번 위치 및/또는 93번 위치의 아미노산을 적합하게 들 수 있다.
상기 아미노산 치환의 비한정의 일태양으로서는, 서열번호：38로 표시되는 항에피레귤린 항체의 중쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 31번 위치의 아미노산의 Ala(A)로의 치환 및/또는 55번 위치의 아미노산의 Thr(T), Lys(K), Phe(F), Val(V), Arg(R) 또는 Leu(L)로의 치환을 적합하게 들 수 있다. 또한 상기 아미노산 치환의 비한정의 일태양으로서는, 서열번호：29로 표시되는 항에피레귤린 항체의 경쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치의 아미노산의 Glu(E)로의 치환 및/또는 93번 위치의 아미노산의 Arg(R) 또는 Gln(Q)으로의 치환을 적합하게 들 수 있다.
탈아미드화, 이성화, 가수분해가 억제된 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 중쇄의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：49-56, 98, 115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄를 들 수 있다. 또한 탈아미드화, 이성화, 가수분해가 억제된 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 경쇄의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：57, 58, 128 및 141로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 들 수 있다.
탈아미드화, 이성화, 가수분해가 억제된 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：49-56, 98, 115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 서열번호：57, 58, 128 및 141로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 인간화 항에피레귤린 항체를 들 수 있다.
등전점의 개변
본 발명의 항에피레귤린 항체는 그 등전점이 개변되어 있는 것이 바람직하다. 항체의 혈장 중 반감기를 제어하는 방법의 하나로서, 항체 분자 표면에 노출되는 아미노산 잔기를 개변하여 항체 분자 표면 전하를 조절하는 방법이 알려져 있다(WO2007/114319 및 WO2009/041543). 구체적으로는 항체가 갖는 등전점(pI)의 값을 저하시킴으로써 항체의 혈장 중 반감기를 신장시키는 것이 가능한 것이 알려져 있다. 이와는 반대로 항체의 등전점이 상승함으로써 혈장 중 반감기가 단축되고 항체의 조직 이행성이 향상되는 것이 바람직하다(Vaisitti 등(J. Biol. Regul. Homeost. Agents. (2005) 19 (3-4), 105-112), Pardridge 등(J. Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286 (1), 548-554)). 그 한편으로 그 등전점을 감소시킨 개변 항체의 항종양 효과가 개변 전의 항체와 비교하여 증강되어 있는 것도 알려져 있다(WO2009/041062).
항체 등의 단백질의 pI는 폴리펩티드가 실효 전하를 띠는 pH로서 정의된다. 당분야에서는 단백질 용해성은 전형적으로 당해 용액의 pH가 단백질의 등전점(pI)과 동일할 때 가장 낮은 것을 알 수 있다. 따라서 그 pI에 기초하여 부여된 pH, 예를 들면 pH 6에 있어서의 단백질의 용해성을 평가하는 것이 가능하다. 단백질의 pI는 또한 액체 제제에 있어서의 단백질 점성의 우수한 지표이기도 하다. 높은 pI는 높은 용해성 및 낮은 점성을 나타낸다(고농도 제제의 경우 특히 중요하다). 본 발명의 비한정의 일태양에서는 사전에 정한 역치보다 높은 pI를 갖는 후보 도메인을 선택한다. 항체의 pI는 항체의 생체 분포나 약효에 있어서도 특정 역할을 한다. 예를 들면 항체의 pI가 높아지면 그 세포내 및/또는 맥관외 국재화가 증대되는 것도 알고 있다. 목적하는 바를 달성하기 위해 어떠한 pI의 특성이 특정 항체에 가장 바람직한지를 결정할 필요가 있다. 몇 가지의 실시태양에서는 pI값이 약 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0 이상인 항체가 취득될 수 있다. 다른 비한정의 일태양에서는 pI값이 약 9.0, 8.5, 8.0, 7.5, 7.0, 6.5, 6.0, 5.5 또는 5.0 미만인 항체가 선택될 수 있다. 당업자에게는 단일 단백질이 복수의 전하 형태를 가질 수 있는 것은 이해될 것이다. 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만 단백질의 전하는 다수의 다양한 작용 메커니즘에 의해 개변할 수 있고, 이러한 메커니즘으로서 한정되는 것은 아니나 아미노산 치환, 양이온화, 탈아미노, 카르복실-말단 아미노산 불균질성, 인산화 및 글리코실화 등을 들 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 pI는 주요 전하 형태의 pI로서 정의된다.
단백질의 pI는 다양한 방법으로 결정할 수 있고, 그러한 방법으로서 한정되는 것은 아니나 등전점 전기영동 및 각종 컴퓨터 알고리즘(예를 들면 Bjellqvist 등(Electrophoresis (1993) 14, 1023을 참조)을 비한정의 일태양으로서 들 수 있다. 비한정의 일태양에서는 다온도(multi temp) 삼냉각욕 재순환 유닛 및 EPS 3501 XL 전원을 구비한 Pharmacia Biotech Multiphor 2 전기영동 장치를 사용하여 결정된다. 프리캐스트 암폴린 겔(Amersham Biosciences, pI 범위：2.5~10)이 5 ㎍의 단백질과 함께 제공된다. 광범위한 pI 마커 표준(Amersham, pI 범위：3~10, 8 μL)을 사용하여 항체의 상대 pI가 결정된다. 1,500 V, 50 mA의 조건하에서 105분 전기영동이 실시된다. 이어서 정제수로 1x로 희석한 Sigma 고정용액(5x)을 사용하여 겔이 고정된다. 심플리 블루(Simply Blue)염료(Invitrogen)를 사용하여 실온에서 하룻밤의 조건하에서 당해 겔이 염색된다. 25% 에탄올, 8% 초산 및 67% 정제수로 이루어지는 용액을 사용하여 당해 겔이 탈염된다. Bio-Rad 농도계를 사용하여 표준의 교정곡선을 토대로 등전점이 결정된다.
본 발명의 항에피레귤린 항체의 등전점을 변화시키기 위해, 항에피레귤린 항체의 아미노산 서열 중에서 전하를 띤 아미노산을 제거하거나 또는 항에피레귤린 항체의 아미노산 서열에 전하를 띤 아미노산을 부가, 또는 삽입하는 아미노산의 개변 등이 적절히 실시될 수 있다. 아미노산 중에는 전하를 띤 아미노산이 존재하는 것이 알려져 있다. 일반적으로 양의 전하를 띤 아미노산(양전하 아미노산)으로서는 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H)이 알려져 있다. 음의 전하를 띤 아미노산(음전하 아미노산)으로서는 아스파라긴산(D), 글루타민산(E) 등이 알려져 있다. 이들 이외의 아미노산은 전하를 갖지 않는 아미노산으로서 알려져 있다.
상기 「개변된 아미노산 잔기」로서는, 바람직하게는 아래의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기의 부가, 삽입 또는 제거로부터 적절히 선택되는데, 특별히 이들 아미노산에 제한되지 않는다.
(a) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D)
(b) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H)
또한 원래의(개변 전의) 아미노산 잔기가 이미 전하를 갖는 경우, 전하를 갖지 않는 아미노산 잔기가 되도록 개변하는 것도 본 발명의 바람직한 태양 중 하나이다. 즉 본 발명에 있어서의 개변으로서는 (1) 전하를 갖는 아미노산으로부터 전하를 갖지 않는 아미노산으로의 치환, (2) 전하를 갖는 아미노산으로부터 당해 아미노산과는 반대의 전하를 갖는 아미노산으로의 치환, (3) 전하를 갖지 않는 아미노산으로부터 전하를 갖는 아미노산으로의 치환을 들 수 있다.
본 발명의 항에피레귤린 항체의 등전점을 변화시키기 위해 아미노산을 개변하는 부위의 비한정의 예로서, 서열번호：38로 표시되는 항에피레귤린 항체의 중쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 13번 위치, 61번 위치, 62번 위치, 64번 위치, 65번 위치, 97번 위치 및/또는 98번 위치의 아미노산을 적합하게 들 수 있다. 또한 항에피레귤린 항체의 등전점을 변화시키기 위해 아미노산을 개변하는 부위의 비한정의 예로서, 서열번호：29로 표시되는 항에피레귤린 항체의 경쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 24번 위치, 55번 위치, 56번 위치 및/또는 107번 위치의 아미노산을 적합하게 들 수 있다.
상기 아미노산 치환의 비한정의 일태양으로서는, 서열번호：38로 표시되는 항에피레귤린 항체의 중쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 14번 위치의 아미노산의 Asn(N) 또는 Lys(K)로의 치환, 61번 위치의 아미노산의 Asp(D) 또는 Glu(E)로의 치환, 62번 위치의 아미노산의 Ser(S) 또는 Gln(Q)으로의 치환, 64번 위치의 아미노산의 Asp(D) 또는 Glu(E)로의 치환, 65번 위치의 아미노산의 Asp(D) 또는 Glu(E)로의 치환, 97번 위치의 아미노산의 Arg(R)로의 치환 및/또는 98번 위치의 아미노산의 Glu(E)로의 치환을 적합하게 들 수 있다. 또한 상기 아미노산 치환의 비한정의 일태양으로서는, 서열번호：29로 표시되는 항에피레귤린 항체의 경쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 24번 위치의 아미노산의 Gln(Q) 또는 Ser(S)으로의 치환, 55번 위치의 아미노산의 Glu(E)로의 치환, 56번 위치의 아미노산의 Glu(E)로의 치환 및/또는 106a번 위치의 아미노산의 Glu(E)로의 치환을 적합하게 들 수 있다.
등전점이 개변된 본 발명의 항에피레귤린 항체의 중쇄의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：72-79, 98, 115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄를 들 수 있다. 또한 등전점이 개변된 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 경쇄의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：80-85 및 99로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 들 수 있다.
등전점이 개변된 본 발명의 항에피레귤린 항체의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：72-79, 98, 115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 서열번호：80-85 및 99로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 항에피레귤린 항체를 들 수 있다.
안정성의 개선
본 발명의 항에피레귤린 항체는 그 안정성이 개선되어 있는 것이 바람직하다. 항체의 안정성을 나타내는 하나 이상의 파라미터로서 도메인의 열융해온도(Tm)값을 들 수 있다. 항체의 Tm값은 항체의 열안정성이 우수한 지표가 되며 또한 항체의 보관기간의 지표로도 될 수 있다. Tm값이 낮을수록 회합체의 형성/낮은 안정성을 나타내는 것에 대해, Tm값이 높을수록 회합체의 불형성/높은 안정성을 나타낸다. 따라서 Tm값이 높은 항체가 제공되는 것이 바람직하다. 본 발명의 비한정의 일태양에서는 사전에 정한 역치보다도 높은 Tm값을 갖는 항체가 선택된다. 몇 가지 실시형태에서는 적어도 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃ 또는 100℃ 이상의 Tm값을 갖는 항체가 선택된다.
항체의 열융해온도(Tm)는 당분야에서 주지의 모든 표준적 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면 Vermeer 등은 시차주사 열량측정(DSC) 및 원이색성(CD) 스펙트로스코피에 의해, 아이소타입 2b의 단일클론 마우스 항랫트 IgG의 언폴딩 및 변성을 연구하였다(Biophys. J. (2000) 78, 394-404, Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. (2000) 161, 139-150, J. Colloid Interface Sci. (2000) 225, 394-397, 2000, Biophys. J. (2000) 79, 2150-2154). 그 결과, IgG의 폴딩 및 언폴딩은 2개의 주요한 전환(transition)을 특징으로 하는 것으로 생각되어, 이들 전환 자체도 다양한 공정이 중합된 것인 것을 알 수 있었다. DSC 및 CD 실험 양쪽에서 확인되는 쌍봉 분포는 실험에 있어서의 주사속도에는 좌우되지 않았다. 2개의 전환은 독립되어 있는 듯 하여 언폴딩은 불가역이었다. 당해 IgG로부터 소화된 Fab 및 Fc 프래그먼트의 2차 구조 및 열역학적 안정성이 완전한(intact) 면역 글로불린의 그것과 비교되었다(Vermeer 등(Biophys. J. (2000) 79, 2150-2154)). 완전한 IgG에 확인되는 2개의 피크는 각각 Fab 및 Fc 프래그먼트에 할당되는 것을 알 수 있었다. Vermeer 등은 또한 열에 의한 유발 이외에 일반적으로 IgG의 구조적 섭동(structural perturbation)을 pH의 변경(Biophys. J. (2000) 78, 394-404) 또는 소수성 환경과의 상호작용, 예를 들면 테플론 표면으로의 흡착 또는 계면활성제와의 상호작용(Vermeer 등, 1998, Biochim. Biophys. Acta. (1988) 1425, 1-12, Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. (2000) 161, 139-150, J.Colloid Interface Sci. 225 (2000) 394-397)에 의해 유발시킬 수 있는 것도 명확하게 하였다.
본 발명의 비한정의 일태양에서는 단리된 항체를 포함하는 샘플을 사용하여 항체의 Tm값이 측정된다. 일실시형태에서는 항체의 Tm값은 VP-DSC(MicroCal, LLC)를 사용하여 주사속도：1.0℃/분 및 온도 범위：25~120℃의 조건하에서 측정된다. 5분의 주사 전 온도 조절과 함께 필터시간 8초가 사용될 수 있다. 구체예에서는 Pierce 투석 컵(3.5 kD)을 사용하여 25 mM 히스티딘-HCl으로의 투석에 의해 샘플이 조제된다. 평균 항체농도는 50 ㎍/mL로, 이는 280 nm의 흡광도로부터 결정될 수 있다. 장치와 함께 제공된 Origin 소프트웨어를 사용하여 제조자의 순서에 따라 융해온도가 결정된다. 간단하게는 샘플과 대조 셀 양쪽에 다수의 베이스라인을 버퍼와 함께 흘려넣음으로써 열평형이 확립된다. 베이스라인을 샘플 서모그램으로부터 뺀 후, 데이터를 농도 기준화하고 디콘볼루션(deconvolution) 함수를 사용하여 적합시킨다. 다른 실시태양에서는 항체의 안정성은 아래의 방법을 사용하여 평가된다. 하나 이상의 측정기준은 추가로 다양한 pH값, 다양한 온도, 다양한 전단응력 및 다양한 동결/해동 사이클로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다양한 조건하에 있어서의 항체의 안정성을 나타내는 측정기준이 포함될 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양에서는 DSC는 Setaram Micro-DSC III(Setaram, Caluire, 프랑스)를 사용하여 측정될 수 있다. 적절한 블랭크 용액을 포함하는 1 mL의 대조 셀에 대해 1 mL의 샘플 셀에서 열량계에 샘플이 배치된다. 열량계 내에서 4시간 25℃에서 셀이 안정화된 후, 선택된 가열속도로 최종 온도까지 당해 셀이 가열된다. Setaram 소프트웨어(Setaram, 버젼 1.3)를 사용하여 전이온도 및 엔탈피가 결정될 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양에서는 열변성/재생곡선은 원이색성(CD) 스펙트로스코피를 사용하여 취득될 수 있다. 온도 및/또는 예를 들면 pH의 함수로서의 IgG의 2차 구조의 변화를 CD 스펙트로스코피로 조사할 수 있다(Fasman 등(Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules. (1996) Plenum Press)). de Jongh 등에 의하면 이 방법의 이점은 분광신호가 주위 용액의 존재에 영향을 받지 않는 것과, 명확한 절차로 다양한 구조 엘리먼트의 기준 스펙트럼을 토대로 2차 구조를 해명할 수 있는 것에 있다(Biochemistry (1994) 33, 14521-14528). 2차 구조 엘리먼트의 분획은 CD 스펙트럼으로부터 취득할 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양에서는 JASCO 분광 편광계, 모델 J-715(JASCO International Co.)로 측정될 수 있다. 0.1 ㎝ 광로 길이의 석영 큐벳이 사용될 수 있다. 온도 조절은 JASCO PTC-348WI(JASCO International) 열전대를 사용하여 실시될 수 있다. 분해능：0.2℃ 및 시상수(time constant)：16초의 Peltier 열전대를 사용하여 온도 주사가 기록된다. 원자외선 영역(0.2 nm 분해능)에서의 파장 주사는 적합한 주사속도를 갖는 복수의 주사의 축적에 의해 취득될 수 있다.
열변성/재생곡선은 분광법에 의해 측정하는 것도 가능하다. 용액 중의 단백질이 가열에 응답하여 변성되면 분자는 응집되고 용액은 추가로 강하게 빛을 산란시킨다. 응집에 의해 샘플의 광학적 투명성에 변화가 일어나기 때문에, 규정 파장의 가시 또는 자외선 흡수의 변화를 모니터링함으로써 응집을 측정할 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양에서는 형광 분광학을 사용하여 열변성/재생곡선이 취득될 수 있다. 일실시형태에서는 고유 단백질 형광, 예를 들면 고유 트립토판 형광이 모니터링된다. 다른 실시형태에서는 형광 프로브 분자를 모니터링한다. 형광 분광학 실험을 실시하는 방법은 당업자에게는 주지이다. 예를 들면 Bashford 등(Spectrophotometry and Spectrofluorometry: A Practical Approach (1987) 91-114, IRL Press Ltd.), Bell J.E.(Spectroscopy in Biochemistry (1981) Vol.I, 155-194, CRC Press) 또는 Brand 등(Ann. Rev. Biochem. (1972) 41, 843)을 참조할 것.
그의 생물학적 활성과 마찬가지로 항체의 물리학적 및 화학구조에 기초한 항체 조성물의 안정성을 평가하기 위한 다양한 방법이 이용 가능하다. 예를 들면 항체의 변성을 검토하기 위해 상기 분석 외에 전하 이동 흡수, 형광 분광법, NMR, rCGE(환원 모세관 겔 전기영동) 및/또는 HPSEC(고속 사이즈 배제 크로마토그래피) 등의 방법이 이용 가능하다(예를 들면 Wang 등(J. Parenteral Science & Technology 42 (Suppl), S4-S26)).
환원 모세관 겔 전기영동 및 고속 사이즈 배제 크로마토그래피는 단백질의 회합체나 단백질의 분해물 및 단백질 단편의 형성을 평가하기 위한 가장 일반적이고 간편한 방법이다. 이에 본 발명에 의해 제공되는 항에피레귤린 항체를 포함하는 조성물의 안정성은 이들 방법으로도 평가될 수 있다.
본 발명의 항에피레귤린 항체의 안정성을 개변하기 위해 항에피레귤린 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산의 개변 등이 적절히 실시될 수 있다.
본 발명의 항에피레귤린 항체의 안정성 개변을 위한 비한정의 일태양으로서, 항에피레귤린 항체가 IgG1 항체인 경우에는 인간 IgG 항체의 중쇄 C말단 서열(G1, 서열번호：25) 유래의 이질성으로서 보고되어 있는, C말단 아미노산의 리신 잔기의 결손 및 C말단의 두 아미노산인 글리신, 리신 양쪽의 결손에 의한 C말단 아미노기의 아미드화(Anal. Biochem. (2007) 360 (1), 75-83)를 저감시키는 방법으로서, 중쇄 C말단의 두 아미노산, 즉 EU 넘버링으로 표시되는 446번 위치의 글리신 및 447번 위치의 리신을 결손시키는 개변(WO2009/041613)을 적합하게 들 수 있다. 본 발명의 항에피레귤린 항체의 중쇄 C말단 서열에 유래하는 이질성은 존재하지 않는 것이 바람직하기 때문에, 인간 IgG1의 EU 넘버링으로 표시되는 446번 위치의 글리신 및 447번 위치의 리신을 결손시킨 IgG1 서열(G1d, 서열번호：26)이 불변영역 서열로서 이용될 수 있다.
안정성이 개선된 본 발명의 항에피레귤린 항체의 중쇄의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄를 들 수 있다. 또한 안정성이 개선된 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 경쇄의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：99, 128-130, 136 및 141로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 들 수 있다.
안정성이 개선된 본 발명의 항에피레귤린 항체의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：37, 38, 49-56, 72-79, 92-98, 115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 서열번호：99, 128-130, 136 및 141로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 항에피레귤린 항체를 들 수 있다.
회합체량의 저감
본 발명의 항에피레귤린 항체는 그 회합체량이 저감되어 있는 것이 바람직하다. 단백질 의약품의 회합체량을 조절하는 것은 품질 관리상, 또한 약효 및 면역원성에 미치는 영향을 고려한 경우 대단히 중요하다(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714). 일반적으로 회합화는 단백질 용액 환경에 기인하는 콜로이드 안정성과 단백질 구조에 기인하는 입체 배좌 안정성 양쪽에 영향을 받는다(J. Pharm. Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315). 항체 제제의 처방 검토에 의해 항체농도나 pH, 완충액종, 이온강도, 첨가제 등을 스크리닝함으로써 콜로이드 안정성에 유효한 바람직한 조건을 얻는 것이 가능하다. 한편 입체 배좌 안정성은 아미노산 서열에 의존하는 부분도 있어, 항체의 경우는 CDR의 정규 구조나 FR의 공통서열, VH/VL 계면 등의 특징적인 구조를 유지하는 것이 중요하게 여겨지고 있는 것으로 생각된다(Jung 등(J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716), Xiang 등(J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390), Ewert 등(Methods. (2004) 34 (2), 184-199), Vargas-Madrazo 등(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120), Morea 등(J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294), Vargas-Madrazo 등(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120)).
단백질의 물리적, 화학적 구조 및 그들의 생물활성을 토대로 항체 제제를 포함하는 단백질 제제의 안정성을 평가하는 데에 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면 단백질의 변성을 연구하기 위해서는 전하 이동 흡수, 열분석, 형광 분광법, 원이색성(CD), NMR 및 HPSEC, 접선 유동 여과(tangential-flow-filtration;TFF), 정적 광산란법(SLS), 푸리에 변환 적외 분광법(FTIR), 요소 유발 단백질 언폴딩 기술, 고유 트립토판 형광, 시차주사 열량측정법 및 1-아닐리노-8-나프탈렌설폰산(ANS) 단백질 결합 기술 등의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면 Wang 등(J. of Parenteral Science & Technology (1988) 42 (Suppl), S4-S26)에 기재된 방법으로부터 선택하여 적절히 사용하는 것이 가능하다.
rCGE 및 HPSEC는 단백질 응집체의 형성, 단백질 분해 및 단백질 단편화를 평가하는 가장 일반적이고 가장 간단한 방법이다. 따라서 본 발명의 액체 제제의 안정성은 이들 방법으로 평가할 수 있다.
예를 들면 본 발명의 항에피레귤린 항체의 안정성은 HPSEC 또는 rCGE에 의해 평가할 수 있고, 그때 피크 영역률은 미분해 항체 또는 미분해 항체 프래그먼트를 나타낸다. 비한정의 일태양에서는 약 250 ㎍의 항체(상기 항체를 10 ㎎/mL로 포함하는 액체 제제 약 25 μL)를, TSK SW x1 가드 칼럼(6.0 ㎜×4.0 ㎝)을 장착한 TosoH Biosep TSK G3000SWXL 칼럼(7.8 ㎜×30 ㎝)에 주입한다. 항체(그 항체 프래그먼트를 포함)는 0.1 M 황산나트륨 및 0.05% 아지드화나트륨을 포함하는 0.1 M 인산이나트륨을 사용하여 유량 0.8-1.0 mL/min에 의해 균일 농도로 용출시킨다. 용출 단백질은 UV 흡광도 280 nm를 사용하여 검출된다. 어세이에서는 대조로서 참조 표준을 러닝시켜 약 12~14분간에 관찰된, 포함시킨 용량 피크를 제외한 다른 모든 피크와 비교하여 생성 모노머 피크의 영역률로서 그 결과가 보고된다. 모노머 피크보다도 빨리 용출되는 피크가 응집률로서 기록된다.
본 발명의 항에피레귤린 항체의 회합체량를 저감시키기 위해 항에피레귤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 분자 간의 소수성 상호작용이 감약된다. 구체적으로는, 항에피레귤린 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열 중의 소수성 잔기를 친수성 잔기로 치환하는 아미노산의 개변 등이 적절히 실시된다. 적합한 비한정의 일태양에서는, 항에피레귤린 항체의 CDR 내에 포함되는 소수성 잔기를 친수성 잔기로 치환하는 아미노산의 개변 등이 적절히 시행된다. 아미노산 중에는 친수성 아미노산 및 소수성 아미노산이 존재하는 것이 알려져 있다. 일반적으로 친수성 아미노산으로서는 Asp(D), Glu(E), Arg(R), Lys(K), His(H), Gly(G), Ser(S), Thr(T), Cys(C), Asn(N), Gln(Q), Tyr(Y)이 알려져 있다. 소수성 아미노산으로서는 Ala(A), Val(V), Leu(L), Ile(I), Met(M), Trp(W), Phe(F), Pro(P)가 알려져 있다. 상기 아미노산의 개변으로서는 바람직하게는 상기 소수성 잔기 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산의 상기 친수성 잔기 중에서 선택되는 아미노산으로의 치환으로부터 적절히 선택되는데, 특별히 특정 아미노산에 제한되지 않는다.
본 발명의 항에피레귤린 항체의 회합체량을 저감시키기 위해 아미노산을 개변하는 부위의 비한정의 예로서, 서열번호：38로 표시되는 항에피레귤린 항체의 중쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 60번 위치 및/또는 98번 위치의 아미노산을 적합하게 들 수 있다.
상기 아미노산 치환의 비한정의 일태양으로서는, 서열번호：38로 표시되는 항에피레귤린 항체의 중쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 60번 위치의 아미노산의 His(H), Lys(K), Thr(T), Ser(S) 또는 Arg(R)로의 치환 및/또는 98번 위치의 아미노산의 Ser(S) 또는 Glu(E)로의 치환을 적합하게 들 수 있다.
회합체량이 저감된 본 발명의 항에피레귤린 항체의 중쇄의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：92-98, 115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄를 들 수 있다.
회합체량이 저감된 본 발명의 항에피레귤린 항체의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：92-98, 115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 서열번호：99, 128-130, 136 및 141로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 항에피레귤린 항체를 들 수 있다.
비인간 동물의 에피레귤린 및 인간 동물의 에피레귤린에 결합하는 종 교차 반응성의 부여
본 발명의 항에피레귤린 항체는 비인간 동물 및 인간 동물 간의 종 교차 반응성(cross-species reactivity)을 나타내는 항에피레귤린 항체가 바람직하다. 즉 본 발명은 서열번호：9, 10 및 11로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR 및 서열번호：12, 13 및 14로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR을 포함하는 항에피레귤린 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체로서, 서열번호：170으로 표시되는 원숭이 에피레귤린에 대한 KD값(cEREG KD)과 서열번호：34로 표시되는 인간 에피레귤린에 대한 KD값(hEREG KD)의 비(cEREG KD/hEREG KD)가 서열번호：9, 10 및 11로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR 및 서열번호：12, 13 및 14로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR을 포함하는 항에피레귤린 항체의 cEREG KD/hEREG KD보다도 작은 것을 특징으로 하는 항에피레귤린 항체를 제공한다.
구체적으로는 본 발명은 서열번호：9, 10 및 11로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR 및 서열번호：12, 13 및 14로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR을 포함하는 항에피레귤린 항체의 원숭이 에피레귤린에 대한 결합활성을 개변하기 위해 상기 CDR의 아미노산 서열이 개변되었다. 원숭이 에피레귤린과 인간 에피레귤린의 구조 상의 상위도 명확하지는 않았기 때문에, 항에피레귤린 항체의 어느 아미노산 잔기를 개변하면 원숭이 에피레귤린에 대한 결합활성을 증강시킬 수 있는 것인지 등의 안내는 전혀 나타내어져 있지 않았다. 본 발명에서는 CDR의 임의의 부위의 아미노산 잔기가 치환된 복수의 항체 서열이 디자인되었다. 구체적으로는 상기 CDR 서열 중의 아미노산이 Arg(R) 잔기로 치환된 항에피레귤린 항체가 제작되었다.
CDR 서열 중의 아미노산이 Arg(R) 잔기로 치환된 항에피레귤린 항체는 놀랍게도 원숭이 에피레귤린에 대한 결합활성이 증강되었다. 즉 항에피레귤린 항체의 CDR 서열 중의 아미노산을 Arg(R) 잔기로 치환함으로써 비인간 동물의 에피레귤린 및 인간 동물의 에피레귤린에 결합하는 종 교차 반응성을 부여하는 것이 가능하였다.
서열번호：170으로 표시되는 원숭이 에피레귤린에 대한 KD값(cEREG KD)은 상기 결합활성의 항목에서 기재된 방법으로 산출될 수 있다. 항에피레귤린 항체의 에피레귤린에 대한 결합활성은 당업자에게 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 그 측정 조건에 대해서는 당업자가 적절히 결정하는 것이 가능하다. 항에피레귤린 항체의 에피레귤린에 대한 결합활성은 KD(Dissociation constant：해리상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate：해리속도상수), 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation：겉보기 해리속도상수) 등으로서 평가하는 것이 가능하다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스케차드 플롯, FACS 등을 사용하는 것이 가능하다. 당해 KD값을 서열번호：34로 표시되는 인간 에피레귤린에 대한 KD값(hEREG KD)으로 나눔으로써 원숭이 에피레귤린에 대한 KD값(cEREG KD)과 인간 에피레귤린에 대한 KD값(hEREG KD)의 비(cEREG KD/hEREG KD)가 결정될 수 있다.
본 발명에 있어서 cEREG KD/hEREG KD는 40보다도 작은 것이 바람직하다. 또한 비한정의 일태양에서는 cEREG KD/hEREG KD는 10보다도 작은 것이 바람직하다. 다른 비한정의 일태양에서는 cEREG KD/hEREG KD는 6보다도 작은 것이 바람직하고, 또 다른 비한정의 일태양에서는 cEREG KD/hEREG KD는 4보다도 작은 것이 적합하다.
본 발명에 의해 제공되는 비인간 동물의 에피레귤린 및 인간 동물의 에피레귤린에 결합하는 종 교차 반응성을 부여하기 위해 아미노산을 개변하는 부위의 비한정의 예로서, 서열번호：38로 표시되는 항에피레귤린 항체의 중쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 33번 위치, 51번 위치, 54번 위치, 55번 위치, 56번 위치, 57번 위치, 58번 위치, 59번 위치, 60번 위치, 62번 위치, 65번 위치, 96번 위치, 97번 위치 및/또는 98번 위치의 아미노산을 적합하게 들 수 있다. 또한 본 발명에 의해 제공되는 비인간 동물의 에피레귤린 및 인간 동물의 에피레귤린에 결합하는 종 교차 반응성을 부여하기 위해 아미노산을 개변하는 부위의 비한정의 예로서, 서열번호：29로 표시되는 항에피레귤린 항체의 경쇄 서열 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 24번 위치, 93번 위치 및/또는 94번 위치의 아미노산을 적합하게 들 수 있다. 상기 아미노산의 하나 이상의 Arg(R)로의 치환을 아미노산의 개변의 적합한 예로서 들 수 있다.
종 교차성이 부여된 본 발명의 항에피레귤린 항체의 중쇄의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄를 들 수 있다. 또한 등전점이 개변된 본 발명의 인간화 항에피레귤린 항체의 경쇄의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：128-130, 136 및 141로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 들 수 있다.
종 교차성이 부여된 본 발명의 항에피레귤린 항체의 비한정의 일태양으로서는 서열번호：98, 115-127, 131-135, 137-140 및 142-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 서열번호：29, 128-130, 136 및 141로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 항에피레귤린 항체를 들 수 있다.
중화활성
본 발명의 항에피레귤린 항체는 바람직하게는 중화활성을 갖는 항체이다. 일반적으로 중화활성이란, 바이러스나 독소 등 세포에 대해 생물학적 활성을 갖는 리간드의 당해 생물학적 활성을 저해하는 활성을 말한다. 즉 중화활성을 갖는 물질이란, 당해 리간드 또는 당해 리간드가 결합하는 수용체에 결합하여 당해 리간드와 수용체의 결합을 저해하는 물질을 가리킨다. 중화활성에 의해 리간드와의 결합을 저지당한 수용체는 당해 수용체를 통한 생물학적 활성을 발휘할 수 없게 된다. 이러한 중화활성을 갖는 항체는 일반적으로 중화항체라 불린다. 당해 중화활성은 대상으로 하는 리간드의 존재하에 있어서 당해 생물학적 활성을 그 중화활성을 평가하는 피검 물질의 존재 또는 비존재하 조건 간에 비교함으로써 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 에피레귤린의 주요한 수용체로서 생각되고 있는 EGF 수용체의 경우, 리간드의 결합에 의해 이량체를 형성하고, 세포내에 존재하는 스스로의 도메인인 티로신키나아제를 활성화한다. 활성화된 티로신키나아제는 자기 인산화에 의해 인산화 티로신을 포함하는 펩티드를 형성하고, 그들에 다양한 시그날 전달의 액세서리 분자를 회합시킨다. 그들은 주로 PLCγ(포스포리파아제 Cγ), Shc, Grb2 등이다. 이들 액세서리 분자 중 앞의 2개는 추가로 EGF 수용체의 티로신키나아제에 의해 인산화를 받는다. EGF 수용체로부터의 시그날 전달에 있어서의 주요한 경로는 Shc, Grb2, Sos, Ras, Raf/MAPK 키나아제/MAP 키나아제의 순서로 인산화가 전달되는 경로이다. 또한 부경로인 PLCγ로부터 PKC로의 경로가 존재하는 것으로 생각되고 있다.
이러한 세포내의 시그날 캐스케이드는 세포종별로 상이하기 때문에 목적으로 하는 표적 세포별로 적절히 표적분자를 설정할 수 있어, 상기 인자에 한정되는 것은 아니다. 생체내 시그날의 활성화 측정 키트는 시판의 것을 적절히 사용할 수 있다(예를 들면 프로테인키나아제 C활성 측정 시스템(GE 헬스케어 바이오사이언스 주식회사) 등).
또한 생체내 시그날 캐스케이드의 하류에 존재하는 표적 유전자에 대한 전사 유도 작용을 지표로 하여 생체내 시그날의 활성화를 검출하는 것도 가능하다. 전사 활성의 변화는 리포터 어세이의 원리로 검출할 수 있다. 구체적으로는, 표적 유전자의 전사 인자 또는 프로모터 영역의 하류에 GFP(Green Fluorescence Protein)나 루시페라아제 등의 리포터 유전자를 배치하고 그 리포터 활성을 측정함으로써 전사 활성의 변화를 리포터 활성으로서 측정할 수 있다.
또한 EGF 수용체는 통상은 세포 증식을 촉진하는 방향으로 작용하기 때문에, 표적으로 하는 세포의 증식활성을 측정함으로써 생체내 시그날 전달의 활성화를 평가할 수 있다. 본 발명에 있어서는 후자의 세포 증식 활성을 평가함으로써 본 발명의 중화항체의 중화활성을 평가하는데, 본 방법에 한정되는 것은 아니고 선택한 표적 세포별로 상기에 예로 든 방법을 적합하게 채용하여 평가할 수 있다.
즉 예를 들면 아래와 같은 세포 증식 활성을 측정함으로써 항에피레귤린 항체의 중화활성을 평가 또는 측정할 수 있다. 예를 들면 배지 중에 첨가한 [3H] 라벨한 티미딘의 생세포에 의한 흡수를 DNA 복제능력의 지표로서 측정하는 방법이 사용된다. 보다 간편한 방법으로서 트리판 블루 등의 색소를 세포외로 배제하는 능력을 현미경하에서 계측하는 색소 배제법이나 MTT법이 사용된다. 후자는 생세포가 테트라졸륨염인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 청색의 포르마잔 산물로 전환하는 능력을 갖는 것을 이용하고 있다. 보다 구체적으로는, 피검 세포의 배양액에 피험 항체를 첨가하고 일정 시간 경과 후에, MTT 용액을 배양액에 첨가하고 일정 시간 정치함으로써 MTT를 세포에 흡수시킨다. 그 결과, 황색의 화합물인 MTT가 세포내의 미토콘드리아 내의 숙신산 탈수소효소에 의해 청색의 화합물로 변환된다. 이 청색 생성물을 용해하여 정색(呈色)시킨 후에 그 흡광도를 측정함으로써 생세포수의 지표로 하는 것이다.
MTT 이외에 MTS, XTT, WST-1, WST-8 등의 시약도 시판되고 있어(nacalai tesque 등) 적합하게 사용할 수 있다. 또한 세포의 ATP나 세포 배양물의 임피던스를 지표로 하여 세포 증식 활성을 평가하는 방법도 공지이다. 활성의 측정시에는 대조 항체로서 항에피레귤린 항체와 동일 아이소타입을 갖는 항체로 당해 중화활성을 갖지 않는 결합 항체를 항에피레귤린 항체와 동일하게 사용하여, 항에피레귤린 항체가 대조 항체보다도 강한 중화활성을 나타냄으로써 활성을 판정할 수 있다. 중화활성의 측정방법의 구체예는 WO2008/047723 등에도 개시되어 있어, 당업자는 이들 공지의 측정방법도 적절히 사용하는 것이 가능하다.
세포상해활성
본 발명에서 사용되는 항체는 바람직하게는 세포상해활성을 갖는 항체이다.
본 발명에 있어서의 세포상해활성으로서는, 예를 들면 항체 의존성 세포 개재성 세포상해(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)활성, 보체 의존성 세포상해(complement-dependent cytotoxicity：CDC)활성 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 CDC활성이란 보체계에 의한 세포상해활성을 의미한다. 한편 ADCC활성이란 표적 세포의 세포 표면 항원에 특이적 항체가 부착되었을 때, 그 Fc 부분에 Fcγ 수용체 보유 세포(면역세포 등)가 Fcγ 수용체를 매개로 결합하여 표적 세포에 상해를 미치는 활성을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 항체는 CDC활성 또는 ADCC활성을 갖는 항체여도 되고, 또는 CDC활성 및 ADCC활성을 겸비하는 항체여도 된다.
항에피레귤린 항체가 ADCC활성을 갖는지 여부 또는 CDC활성을 갖는지 여부는 공지의 방법으로 측정할 수 있다(예를 들면 Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993) 등).
구체적으로는 먼저 이펙터 세포, 보체 용액, 표적 세포의 조제가 실시된다.
(1) 이펙터 세포의 조제
CBA/N 마우스 등으로부터 비장을 적출하여 RPMI1640 배지(Invitrogen사 제조) 중에서 비장 세포가 분리된다. 10% 소태아혈청(FBS, HyClone사 제조)을 포함하는 동 배지로 세정 후 세포농도를 5×106/mL로 조제함으로써 이펙터 세포를 조제할 수 있다.
(2) 보체 용액의 조제
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE사 제조)를 10% FBS 함유 배지(Invitrogen사 제조)로 10배 희석하여 보체 용액을 조제할 수 있다.
(3) 표적 세포의 조제
에피레귤린 단백질을 발현하는 세포를 0.2 mCi의 51Cr-크롬산나트륨(GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)과 함께 10% FBS 함유 DMEM 배지 중 37℃에서 1시간 배양함으로써 당해 표적 세포가 방사성 표지될 수 있다. 에피레귤린 단백질을 발현하는 세포로서는 에피레귤린 단백질을 코드하는 유전자로 형질전환된 세포, 원발성 대장암 세포, 전이성 대장암 세포, 폐선암 세포, 췌장암 세포, 위암 세포, 신장암 세포, 대장암 세포, 식도암 세포 등이 이용될 수 있다. 방사성 표지 후, 세포를 10% FBS 함유 RPMI1640 배지로 3회 세정하고 세포농도를 2×105/mL로 조제함으로써 당해 표적 세포를 조제할 수 있다.
ADCC활성 또는 CDC활성은 아래에 기술하는 방법으로 측정될 수 있다. ADCC활성 측정의 경우는, 각 웰에 표적 세포와 항에피레귤린 항체가 50 μL씩 첨가된 96 웰 U바닥 플레이트(Becton Dickinson사 제조)가 빙상에서 15분간 정치된다. 그 후 각 웰에 이펙터 세포 100 μL가 첨가된 플레이트는 탄산가스 인큐베이터 내에서 4시간 인큐베이트된다. 항체의 최종농도는 0 또는 10 ㎍/mL로 조제될 수 있다. 인큐베이션 후 회수된 100 μL의 상청 중의 방사활성이 감마 카운터(COBRAII AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company사 제조)를 사용하여 측정된다. 세포상해활성(%)은 얻어진 값을 사용하여
(식 2)
Figure pct00002
의 계산식을 토대로 계산된다. A는 각 시료에 있어서의 방사활성(cpm), B는 1% NP-40(nacalai tesque사 제조)을 첨가한 시료에 있어서의 방사활성(cpm), C는 표적 세포만을 포함하는 시료의 방사활성(cpm)을 나타낸다.
한편 CDC활성 측정의 경우는, 각 웰에 표적 세포와 항에피레귤린 항체가 50 μL씩 첨가된 96 웰 바닥이 평평한 플레이트(Becton Dickinson사 제조)가 빙상에서 15분간 정치된다. 그 후 각 웰에 보체 용액 100 μL가 첨가된 플레이트는 탄산가스 인큐베이터 내에서 4시간 인큐베이트된다. 항체의 최종농도는 0 또는 3 ㎍/mL로 조제된다. 인큐베이션 후 회수된 100 μL의 상청 중의 방사활성이 감마 카운터를 사용하여 측정된다. 세포상해활성은 ADCC활성의 측정과 동일하게 계산된다.
ADCC활성이 증강된 항에피레귤린 항체
본 발명의 항에피레귤린 항체로서는 ADCC활성이 증강된 항에피레귤린 항체도 적합하게 사용될 수 있다. 상기와 같이 ADCC활성이란 표적 세포의 세포 표면 항원에 특이적 항체가 부착되었을 때, 그 Fc 부분에 Fcγ 수용체 발현 세포(면역세포 등)가 Fcγ 수용체를 매개로 결합하여 표적 세포에 상해를 끼치는 활성을 의미하기 때문에, 면역세포 등의 Fcγ 수용체 발현 세포의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성을 증강시킴으로써 항에피레귤린 항체가 개재하는 ADCC활성을 증강시키는 것이 가능하다. 면역세포 등의 Fcγ 수용체 발현 세포의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성을 증강시키는 방법으로서 적어도 하기 3개의 공지 방법이 이용될 수 있다.
(1) Fc영역의 아미노산이 개변된 항에피레귤린 항체
본 발명의 항에피레귤린 항체에 포함되는 Fc영역의 아미노산의 개변에 의해 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 증강된 항에피레귤린 항체가 취득될 수 있다. 개변을 위한 바람직한 IgG형 면역 글로불린의 Fc영역으로서는, 예를 들면 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역을 들 수 있다.
다른 아미노산으로의 개변은 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 증강되는 한 어떠한 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 본 발명의 항에피레귤린 항체가 인간 Fc영역으로서 인간 IgG1의 Fc영역을 포함하고 있는 경우, Fcγ 수용체에 대한 결합이 인간 IgG1 유래의 Fc영역의 결합활성보다 증강되는 효과를 초래하는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. Fcγ 수용체에 대한 결합활성을 증강시키기 위한 아미노산 개변으로서는, 예를 들면 WO2007/024249, WO2007/021841, WO2006/031370, WO2000/042072, WO2004/029207, WO2004/099249, WO2006/105338, WO2007/041635, WO2008/092117, WO2005/070963, WO2006/020114, WO2006/116260 및 WO2006/023403 등에 있어서 보고되어 있다.
그러한 개변이 가능한 아미노산으로서, 예를 들면 EU 넘버링으로 표시되는 221번 위치, 222번 위치, 223번 위치, 224번 위치, 225번 위치, 227번 위치, 228번 위치, 230번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 241번 위치, 243번 위치, 244번 위치, 245번 위치, 246번 위치, 247번 위치, 249번 위치, 250번 위치, 251번 위치, 254번 위치, 255번 위치, 256번 위치, 258번 위치, 260번 위치, 262번 위치, 263번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 268번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 271번 위치, 272번 위치, 273번 위치, 274번 위치, 275번 위치, 276번 위치, 278번 위치, 279번 위치, 280번 위치, 281번 위치, 282번 위치, 283번 위치, 284번 위치, 285번 위치, 286번 위치, 288번 위치, 290번 위치, 291번 위치, 292번 위치, 293번 위치, 294번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 301번 위치, 302번 위치, 303번 위치, 304번 위치, 305번 위치, 311번 위치, 313번 위치, 315번 위치, 317번 위치, 318번 위치, 320번 위치, 322번 위치, 323번 위치, 324번 위치, 325번 위치, 326번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치, 333번 위치, 334번 위치, 335번 위치, 336번 위치, 337번 위치, 339번 위치, 376번 위치, 377번 위치, 378번 위치, 379번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 385번 위치, 392번 위치, 396번 위치, 421번 위치, 427번 위치, 428번 위치, 429번 위치, 434번 위치, 436번 위치 및 440번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 들 수 있다. 이들 아미노산의 개변에 의해 본 발명의 항에피레귤린 항체의 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합이 증강될 수 있다. 본 발명의 항에피레귤린 항체는 서열번호：26의 중쇄 불변영역에 있어서 예를 들면 EU 넘버링으로 표시되는 230번 위치, 240번 위치, 244번 위치, 245번 위치, 247번 위치, 262번 위치, 263번 위치, 266번 위치, 273번 위치, 275번 위치, 299번 위치, 302번 위치, 313번 위치, 323번 위치, 325번 위치, 328번 위치 및 332번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함해도 된다.
본 발명에 사용하기 위해 특히 바람직한 개변으로서는, 예를 들면 본 발명의 항에피레귤린 항체의 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는；
221번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,
222번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,
223번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Lys 중 어느 하나,
224번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,
225번 위치의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Trp 중 어느 하나,
227번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,
228번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,
230번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나,
231번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,
232번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,
233번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
234번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
235번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
236번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
237번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
238번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
239번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
240번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,
241번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Leu, Arg, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
243번 위치의 아미노산이 Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
244번 위치의 아미노산이 His,
245번 위치의 아미노산이 Ala,
246번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,
247번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
249번 위치의 아미노산이 Glu, His, Gln 또는 Tyr 중 어느 하나,
250번 위치의 아미노산이 Glu 또는 Gln 중 어느 하나,
251번 위치의 아미노산이 Phe,
254번 위치의 아미노산이 Phe, Met 또는 Tyr 중 어느 하나,
255번 위치의 아미노산이 Glu, Leu 또는 Tyr 중 어느 하나,
256번 위치의 아미노산이 Ala, Met 또는 Pro 중 어느 하나,
258번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His, Ser 또는 Tyr 중 어느 하나,
260번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,
262번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Phe, Ile 또는 Thr 중 어느 하나,
263번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,
264번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
265번 위치의 아미노산이 Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
266번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,
267번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
268번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,
269번 위치의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
270번 위치의 아미노산이 Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
271번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
272번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
273번 위치의 아미노산이 Phe 또는 Ile 중 어느 하나,
274번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
275번 위치의 아미노산이 Leu 또는 Trp 중 어느 하나,
276번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
278번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,
279번 위치의 아미노산이 Ala,
280번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
281번 위치의 아미노산이 Asp, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,
282번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,
283번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg 또는 Tyr 중 어느 하나,
284번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Leu, Asn, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나,
285번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Lys, Gln, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
286번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,
288번 위치의 아미노산이 Asn, Asp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,
290번 위치의 아미노산이 Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
291번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln 또는 Thr 중 어느 하나,
292번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Pro, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나,
293번 위치의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
294번 위치의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
295번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
296번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr 또는 Val 중 어느 하나,
297번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
298번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
299번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
300번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,
301번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,
302번 위치의 아미노산이 Ile,
303번 위치의 아미노산이 Asp, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나,
304번 위치의 아미노산이 Asp, His, Leu, Asn 또는 Thr 중 어느 하나,
305번 위치의 아미노산이 Glu, Ile, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나,
311번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Asn, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
313번 위치의 아미노산이 Phe,
315번 위치의 아미노산이 Leu,
317번 위치의 아미노산이 Glu 또는 Gln,
318번 위치의 아미노산이 His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
320번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
322번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
323번 위치의 아미노산이 Ile,
324번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
325번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
326번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
327번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
328번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
329번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
330번 위치의 아미노산이 Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
331번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
332번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
333번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
334번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro 또는 Thr 중 어느 하나,
335번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
336번 위치의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,
337번 위치의 아미노산이 Glu, His 또는 Asn 중 어느 하나,
339번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 중 어느 하나,
376번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Val 중 어느 하나,
377번 위치의 아미노산이 Gly 또는 Lys 중 어느 하나,
378번 위치의 아미노산이 Asp,
379번 위치의 아미노산이 Asn,
380번 위치의 아미노산이 Ala, Asn 또는 Ser 중 어느 하나,
382번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Ile 중 어느 하나,
385번 위치의 아미노산이 Glu,
392번 위치의 아미노산이 Thr,
396번 위치의 아미노산이 Leu,
421번 위치의 아미노산이 Lys,
427번 위치의 아미노산이 Asn,
428번 위치의 아미노산이 Phe 또는 Leu 중 어느 하나,
429번 위치의 아미노산이 Met,
434번 위치의 아미노산이 Trp,
436번 위치의 아미노산이 Ile, 또는
440번 위치의 아미노산이 Gly, His, Ile, Leu 또는 Tyr 중 어느 하나
의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산의 개변을 들 수 있다. 또한 개변되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않고, 1개소만의 아미노산이 개변될 수 있고 2개소 이상의 아미노산이 개변될 수 있다. 2개소 이상의 아미노산의 개변의 조합으로서는, 예를 들면 표 1-1 및 표 1-2에 기재되는 바와 같은 조합을 들 수 있다.
[표 1-1]
Figure pct00003
표 1-2는 표 1-1의 계속되는 표이다.
[표 1-2]
Figure pct00004
본 명세서에 있어서 항에피레귤린 항체의 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 증강되었다는 것은, 상기 아미노산의 개변이 실시된 항에피레귤린 항체의 Fc영역의 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이, 이들 인간 Fcγ 수용체에 대한 상기 아미노산의 개변이 실시되기 전의 항에피레귤린 항체의 Fc영역의 결합활성보다도 높은 것을 말한다. 예를 들면 상기 해석방법을 토대로 대조로 하는 개변 전의 항에피레귤린 항체의 결합활성과 비교하여 개변 후의 항에피레귤린 항체의 결합활성이 105% 이상, 바람직하게는 110% 이상, 115% 이상, 120% 이상, 125% 이상, 특히 바람직하게는 130% 이상, 135% 이상, 140% 이상, 145% 이상, 150% 이상, 155% 이상, 160% 이상, 165% 이상, 170% 이상, 175% 이상, 180% 이상, 185% 이상, 190% 이상, 195% 이상, 2배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상, 5배 이상, 7.5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상의 결합활성을 나타내는 것을 말한다.
(2) Fc영역에 결합하는 당쇄 중의 푸코오스 함량이 감소되어 있는 항 에피레귤린 항체
본 발명의 항에피레귤린 항체의 비한정의 일태양으로서, 당해 항에피레귤린 항체의 Fc영역에 결합한 당쇄의 조성이 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율이 높아지도록 수식된 항에피레귤린 항체를 적합하게 들 수 있다. 후술되는 당쇄 구조의 해석방법에 따라서 당업자는 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율이 높은 항에피레귤린 항체를 적절히 선택하는 것이 가능하다. 그러한 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율은 10%~100% 중에서 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 비한정의 일태양에서는 당해 비율은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 중에서 선택될 수 있다. 항체의 Fc영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코오스 잔기를 제거하면 FcγRIIIa에 대한 친화성이 증강되는 것이 알려져 있다(J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473). 이러한 Fc영역을 포함하는 IgG1 항체는 후술하는 ADCC활성이 증강되어 있는 것이 알려져 있는 것으로부터, 당해 Fc영역을 포함하는 항에피레귤린 항체는 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항에피레귤린 항체로서도 유용하다. 항체 Fc영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코오스 잔기가 제거된 항체의 비한정의 일태양으로서 글리코실화가 수식된 항체(WO1999/054342)를 적합하게 들 수 있다.
항체 Fc영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코오스 잔기가 제거된 항체의 다른 비한정의 일태양으로서, 당쇄에 부가하는 푸코오스가 결손된 항체(WO2000/061739, WO2002/031140, WO2006/067913 등)도 또한 적합하게 들 수 있다. 당쇄 수식을 받는 폴리펩티드의 당쇄 구조를 형성하는 활성이 개변된 결과, 당쇄에 푸코오스를 부가하는 능력이 낮은 숙주세포가 당쇄에 부가하는 푸코오스가 결손된 항체를 제작하기 위해 사용된다. 당해 숙주세포에 있어서 목적하는 항체 유전자를 발현함으로써, 당해 숙주세포의 배양액으로부터 그 당쇄 중의 푸코오스가 결손된 당해 항체가 회수될 수 있다. 폴리펩티드의 당쇄 구조를 형성하는 활성으로서 푸코실트랜스페라아제(EC 2.4.1.152), 푸코오스 트랜스포터(SLC35C1), GMD(GDP-만노오스-4,6-데히드라타제)(EC 4.2.1.47), Fx(GDP-케토-6-데옥시만노오스-3,5-에피머라제, 4-리덕타제)(EC 1.1.1.271) 및 GFPP(GDP-β-L-푸코오스 피로포스포릴라제)(EC 2.7.7.30)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소 또는 트랜스포터의 활성을 비한정의 적합한 예로서 들 수 있다. 이들 효소 또는 트랜스포터는 그 활성을 발휘할 수 있다면 반드시 그 구조는 특정되는 것은 아니다. 본 명세서에 있어서는 이들 활성을 발휘하는 것이 가능한 단백질을 기능성 단백질이라 한다. 이들 활성을 개변하는 방법의 비한정의 일태양으로서 이들 활성의 결실을 들 수 있다. 이들 활성이 결실된 숙주세포를 제작하기 위해 이들 기능성 단백질의 유전자를 기능 불능으로 파괴하는 방법 등 공지의 방법이 적절히 채용될 수 있다(WO2000/061739, WO2002/031140, WO2006/067913 등). 그러한 활성이 결실된 숙주세포는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포, HEK293 세포 또는 하이브리도마 세포 등에 내재성인 이들 기능성 단백질의 유전자를 기능 불능으로 파괴하는 방법 등에 의해 제작될 수 있다.
항에피레귤린 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 형질도입된 상기 숙주세포의 배양상청으로부터 회수함으로써, 항체 Fc영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코오스 잔기가 제거된 항에피레귤린 항체가 회수된다.
(3) 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역을 포함하는 항에피레귤린 항체
본 발명의 항에피레귤린 항체의 비한정의 일태양으로서, 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역을 포함하는 항에피레귤린 항체도 적합하게 들 수 있다. 바이섹팅 GlcNAc 구조를 포함하는 당쇄를 갖는 항체(WO2002/079255 등)가 공지이다. 바이섹팅 GlcNAc 구조를 포함하는 당쇄를 형성하는 활성을 갖는 숙주세포가 바이섹팅 GlcNAc 구조를 포함하는 당쇄가 부가된 항체를 제작하기 위해 사용된다. 비한정의 적합한 일태양에서는, GnTIII(β-1,4-만노실-글리코프로테인, 4-β-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제)(EC 2.4.1.144) 활성 또는 GalT(β-1,4-갈락토실트랜스페라아제)(EC 2.4.1.38) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자를 발현하는 숙주세포가 제작된다. 다른 비한정의 적합한 일태양에서는, 상기 기능성 단백질에 더하여 인간 ManII(만노시다제 II)(3.2.1.114) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자, GnTI(β-1,2-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 I)(EC 2.4.1.94) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자, GnTII(β-1,2-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 II)(EC 2.4.1.143) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자, ManI(만노시다제)(EC 3.2.1.113) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자 및 α-1,6-푸코실트랜스페라아제(EC 2.4.1.68)와 공발현하는 숙주세포가 제작된다(WO2004/065540). 상기와 같은 바이섹팅 GlcNAc 구조를 포함하는 당쇄를 형성하는 활성을 갖는 숙주세포는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포, HEK293 세포 또는 하이브리도마 세포 등에 상기 기능성 단백질의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 형질도입함으로써 제작될 수 있다.
항에피레귤린 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 형질도입된 상기 숙주세포의 배양상청으로부터 회수함으로써 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역을 포함하는 항에피레귤린 항체가 회수된다. 항체에 연결된 당쇄 구조를 해석하기 위해서는 공지의 방법이 사용될 수 있다. 비한정의 일태양에서는, 본 발명의 항에피레귤린 항체에 N-Glycosidase F(Roche diagnostics)를 작용시킴으로써 항에피레귤린 항체에 결합하는 당쇄가 단백질로부터 유리된다(J. Pharm. Sci. (1994) 83(12), 1670-1675). 에탄올을 사용한 단백질 제거 조작 후(J. Clin. Invest. (2001), 108(11), 1687-95) 유리 당쇄가 농축 건고되고, 이어서 2-아미노피리딘 또는 2-아미노벤즈아미드에 의해 형광 표지가 실시된다(Anal. Biochem. (1995) 230 (2), 229-238). 얻어진 2-AP화 당쇄 또는 2-AB화 당쇄가 셀룰로오스 카트리지를 사용한 고상 추출에 의해 탈시약된 후 원심분리에 의해 농축되어, 정제 2-AB화 당쇄로서 이후의 해석에 제공된다. 다음으로 β-Galactosidase(생화학 공업)를 정제 2-AB화 당쇄에 작용시킴으로써 아갈락토실 2-AB화 당쇄가 조제된다. 본 발명의 항에피레귤린 항체로부터 유리된 당쇄를 출발 재료로 하여 조제된 아갈락토실 2-AB화 당쇄는 아미드 칼럼 TSKgel Amide-80(도소)에 의한 순상 HPLC에 의해 분석되어 그 크로마토그램이 비교된다.
또한 항체의 Fc영역과 FcgR의 상호작용의 강도는 Zn2 + 이온 농도 의존적인 것이 보고되어 있다(Immunology Letters 143 (2012) 60-69). 항체는 Fc영역의 Zn2 + 이온 농도가 높을수록 Fc영역과 FcgR의 상호작용은 증강된다. 항체의 Fc영역의 CH3에 존재하는 His310, His435가 Zn2 +를 킬레이트함으로써 먼 위치에 있는 Fc영역의 각 CH2 도메인이 열린다. 이것에 의해 CH2 도메인과 FcgR이 상호작용하기 쉬워져 Fc영역과 FcgR의 상호작용이 증강된다. 본 발명의 항체의 비한정의 일태양으로서 EU 넘버링으로 표시되는 310번 위치의 His, 435번 위치의 His, 433번 위치의 His 및/또는 434번 위치의 Asn에 Zn2 +가 킬레이트된 항체를 들 수 있다.
항체 약물 복합체( Antibody - Drug Conjugate)
본 발명의 항에피레귤린 항체의 비한정의 일태양으로서, 항에피레귤린 항체에 세포상해활성을 갖는 약물이 연결된 항에피레귤린 항체 약물 복합체도 적합하게 들 수 있다. 항체 약물 복합체( Antibody - Drug Conjugate)는 이하 본 명세서 에 있어서 ADC로 지칭되는 경우도 있다. 보다 구체적으로는 본 발명에서 사용되는 항에피레귤린 항체 약물 복합체는 증식 억제제, 또는 독성 펩티드 또는 방사성 화학물질 등의 세포상해성 물질과 적절히 연결될 수 있다. 본 발명에 있어서 방사성 화학물질이란 방사성 동위체를 포함하는 물질을 말한다. 방사성 동위체는 특별히 한정되지 않고 어떠한 방사성 동위체도 사용될 수 있지만, 예를 들면 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 186Re, 188Re 등을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 항에피레귤린 항체 약물 복합체는 얻어진 항에피레귤린 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 즉 증식 억제제 또는 세포상해성 물질과 항에피레귤린 항체가 서로 화학적으로 공액 가능(예, 공유 결합하는 것이 가능)한 바와 같이, 링커 분자는 증식 억제제 또는 세포상해성 물질을 항체에 화학결합(전술한 바와 같은)을 매개로 연결된다.
바람직하게는 결합제(링커)는 절단 가능한 링커이다. 보다 바람직하게는 온화한 조건(즉 약물 활성이 영향을 받지 않는 세포내의 조건)하 링커는 절단된다. 적합한 절단 가능한 링커의 예로서는 디설피드 링커, 산에 불안정한 링커, 빛에 불안정한 링커, 펩티다아제에 불안정한 링커 및 에스테라아제에 불안정한 링커를 들 수 있다. 디설피드를 포함하는 링커는 생리학적 조건하에서 일어날 수 있는 디설피드 교환을 통해 절단 가능한 링커이다. 산에 불안정한 링커는 산성 pH에서 절단 가능한 링커이다. 예를 들면 엔도솜 및 리소좀 등의 특정 세포내 구획(intracellular compartment)은 산성 pH(pH 4~5)를 가져 산에 불안정한 링커를 절단하기에 적합한 조건을 제공한다. 빛에 불안정한 링커는 빛에 폭로 가능한 체표면 및 많은 체강에 있어서 유용하다. 또한 적외선광은 조직을 투과할 수 있다. 펩티다아제에 불안정한 링커는 세포내 또는 세포외의 특정 펩티드를 절단시키는 데 사용될 수 있다(예, Trouet 등(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982) 79, 626-629 및 Umemoto 등 Int.J.Cancer (1989) 43, 677-684 참조).
이러한 ADC는 상기 화학적인 수식 외에 증식 억제제, 또는 독성 펩티드 또는 방사성 화학물질 등의 세포상해성 물질을 인식하도록 유전자 재조합 기술을 사용하여 설계한 이중 특이성 항체(bispecific antibody)와 같은 분자형으로서도 취득될 수 있다. 본 발명에 있어서의 「항에피레귤린 항체」에는 이들 항체도 포함된다.
또한 본 발명이 제공하는 항에피레귤린 항체 약물 복합체의 비한정의 일태양으로서 리신, 아브린, 리보뉴클레아제, 온코나아제, DNase I, 스타필로코커스 엔테로톡신 A, 포크위드 항바이러스 단백, 겔로닌, 디프테리아 톡신, 슈도모나스 엑소톡신, 슈도모나스 엔도톡신, L-아스파라기나아제, PEG L-아스파라기나아제 등의 독성 펩티드로 수식된 항에피레귤린 항체도 예시된다. 또 다른 태양에서는, 하나 또는 둘 이상의 증식 억제제와 독성 펩티드 등의 세포상해성 물질을 각각 조합해서 항에피레귤린 항체의 수식에 사용될 수 있다. 상기한 바와 같이, 항에피레귤린 항체와 상기 증식 억제제, 또는 독성 펩티드 또는 방사성 화학물질 등의 세포상해성 물질과의 연결에는 공유 결합 또는 비공유 결합이 이용될 수 있다. 이들 증식 억제제, 또는 독성 펩티드 또는 방사성 화학물질 등의 세포상해성 물질이 연결된 ADC의 제작방법은 공지이다. 예를 들면 항에피레귤린 항체와 증식 억제제, 또는 독성 펩티드 또는 방사성 화학물질 등의 세포상해성 물질이 직접 결합되는 경우의 연결기는, 예를 들면 그 연결 시에 SH기가 이용되는 디설피드 결합을 들 수 있다. 구체적으로는 환원제, 예를 들면 디티오트레이톨 등으로 그 Fc영역의 분자내 디설피드 결합이 환원된 항에피레귤린 항체 및 그 분자내의 디설피드 결합이 동일하게 환원된 증식 억제제 또는 세포상해성 물질을 디설피드 결합으로 연결시킨다. 연결 전에 활성화 촉진제, 예를 들면 엘만 시약(Ellman's reagent)으로 항체 또는 증식 억제제, 또는 세포상해성 물질 중 어느 한쪽을 활성화시켜 양자 간의 디설피드 결합 형성이 촉진될 수 있다. 항에피레귤린 항체와 증식 억제제, 또는 독성 펩티드 또는 방사성 화학물질 등의 세포상해성 물질을 직접 결합하는 그 밖의 방법으로서, 예를 들면 시프 염기를 사용한 방법, 카르보디이미드법, 활성 에스테르법(N-hydroxysucccinimide법), 혼합 안하이드라이드(Mixed anhydride)를 사용한 방법, 디아조 반응을 사용한 방법 등을 비한정의 적합한 예로서 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 독성 펩티드로서는, 예를 들면 아래의 것이 예시될 수 있다.
-디프테리아 톡신 A 사슬(Diphtheria toxin A Chain)(Langone 등(Methods in Enzymology (1993) 93, 307-308)
-슈도모나스 엑소톡신(Pseudomonas Exotoxin)(Pai 등(Nat. Med. (1996) 2 (3), 350-353)
-리신 사슬(Ricin A Chain)(Fulton 등(J. Biol. Chem. (1986) 261, 5314-5319), Sivam 등(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173), Cumber 등(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24), Wawrzynczak 등(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562), Gheeite 등(J. Immunol. Methods (1991) 142, 223-230))
-무당쇄 리신 A 사슬(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpe 등(Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931)
-아브린 A 사슬(Abrin A Chain)(Wawrzynczak 등(Br. J. Cancer (1992) 66, 361-366), ;Wawrzynczak 등(Cancer Res (1990) 50, 7519-7562), Sivam 등(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173), Thorpe 등(Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931)
-겔로닌(Gelonin)(Sivam 등(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173), Cumber 등(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24), Wawrzynczak 등(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562), Bolognesi 등(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))
-포크위드 항바이러스 단백(PAP-s 또는 Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi 등(Clin. Exp. Immunol. (1992), 89, 341-346))
-브리오딘(Briodin)(Bolognesi 등(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))
-사포린(Saporin)(Bolognesi 등(Clin. Exp. Immunol. (1992), 89, 341-346))
-모모르딘(Momordin)(Cumber 등(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24), (Wawrzynczak 등(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562)(Bolognesi 등(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)
-모모르코킨(Momorcochin)(Bolognesi 등(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)
-디안틴 32(Dianthin 32)(Bolognesi 등(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)
-디안틴 30(Dianthin 30)(Stirpe 등(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
-모덱신(Modeccin)(Stirpe 등(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
-비스쿠민(Viscumin)(Stirpe 등(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
-볼케신(Volkesin)(Stirpe 등(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
-도데칸드린(Dodecandrin)(Stirpe 등(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
-트리틴(Tritin)(Stirpe 등(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
-루핀(Luffin)(Stirpe 등(FEBS Let. (1986) 195, 1-8)
-트리코키린(Trichokirin)(Casellas 등(Eur. J. Biochem. (1988) 176, 581-588), Bolognesi 등(Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346)
단백질 또는 펩티드성의 약제나 독소는 유전자 공학적인 수법으로도 항에피레귤린 항체와 연결될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 상기 독성 펩티드를 코드하는 DNA와 본 발명의 항에피레귤린 항체를 코드하는 DNA를 인프레임으로 융합시킨 재조합 DNA가 발현 벡터 중에 삽입된 재조합 벡터가 구축될 수 있다. 당해 벡터를 적절한 숙주세포에 도입함으로써 얻어지는 형질전환 세포를 배양하여 삽입된 DNA가 당해 세포 중에서 발현한다. 상기 배양액으로부터 단리 및 정제하여 독성 펩티드가 연결된 항에피레귤린 항체 약물 복합체가 취득될 수 있다. 항체와의 융합 단백질을 얻는 경우, 일반적으로 항체의 C말단측에 단백질성의 약제나 독소가 배치되도록 이들 DNA가 연결되는 경우가 많으나 이들에 한정되지 않는다. 항체와 단백질성의 약제나 독소 사이에는 펩티드 링커를 개재시키는 것도 가능하다.
증식 억제제
비한정의 일태양에서는 증식 억제제로서 DNA 손상제, 항유사분열제(antimitotic agent) 및/또는 대사길항제를 적합하게 들 수 있다. DNA 손상제는 알킬화제, 토포이소머라제 저해제 및/또는 DNA 인터칼레이터일 수 있다. 카르보플라틴(DNA 알킬화제), 에토포시드(토포이소머라제 II의 저해제), 독소루비신(DNA 인터칼레이터), 도세탁셀(항유사분열제) 및 Gemzar(겜시타빈, 대사길항제) 등이 비한정의 적합한 증식 억제제로서 예시될 수 있다.
대사길항제는 아래의 적어도 하나로부터 선택될 수 있다. 플루오로우라실(5-FU), 플록스우리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트, 젤로다(Xeloda), 아라논(Arranon), 류코보린, 히드록시 요소, 티오구아닌(6-TG), 메르캅토퓨린(6-MP), 시타라빈, 펜토스타틴, 인산플루다라빈, 클라드리빈(2-CDA), 아스파라기나아제, 겜시타빈, 페메트렉세드, 보르테조밉, 아미노프테린, 랄티트렉세드, 클로파라빈, 에노시타빈, 사파시타빈 및 아자시티딘 등으로부터 선택되는 1개 이상의 토포이소머라제 저해제가 사용될 수 있다.
항에피레귤린 항체 약물 복합체는 세포내에 흡수된 경우, 당해 복합체에 연결된 증식 억제제 또는 독성 펩티드 등의 세포상해성 물질에 의해 당해 항체를 흡수한 세포에 세포사를 유도하는 것이 가능하다. 따라서 증식 억제제 또는 독성 펩티드 등의 세포상해성 물질이 연결된 항체는 추가로 내재화 활성(internalizing activity)을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서 「내재화 활성을 갖는 항체」란, 세포 표면 상의 에피레귤린에 결합했을 때에 세포내(세포질내, 소포내, 다른 소기관내 등)에 수송되는 항체를 의미한다. 항체가 내재화 활성을 갖는지 여부는 당업자에게 공지의 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 예를 들면 표지 물질이 결합한 항에피레귤린 항체를 에피레귤린을 발현하는 세포에 접촉시켜 당해 표지 물질이 세포내에 흡수되었는지 여부를 확인하는 방법, 증식 억제제 또는 독성 펩티드 등의 세포상해성 물질을 결합한 항에피레귤린 항체를 에피레귤린을 발현하는 세포에 접촉시킨 결과, 당해 에피레귤린 발현 세포에 세포사가 유도되었는지 여부를 확인하는 방법 등에 의해 확인할 수 있다. 보다 구체적으로는 하기 실시예에 기재된 방법 등에 의해 항체가 내재화 활성을 갖는지 여부를 확인하는 것이 가능하다.
ADCC 등의 세포상해활성을 갖는 항체는 세포 표면에 발현하는 표적 항원에 결합한 후, 당해 항원에 대한 결합을 매개로 세포 표면에 체재함으로써 NK 세포 등의 이펙터 세포가 당해 항체의 Fc영역에 결합하는 결과, 당해 이펙터 세포가 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 세포상해를 일으킨다. 이에 대해 ADC로서 사용되는 항체는 항원에 결합한 후, 세포내에 내재화되는 것이 바람직하다. 상기 작용 메커니즘으로부터 추정되는 바와 같이, 통상 ADCC 등의 세포상해활성에 의해 표적 세포를 상해하는 항체의 내재화 활성은 작은 것이 바람직하고, ADC로서 표적 세포를 상해하는 항체의 내재화 활성은 큰 것이 바람직한 것으로 생각되고 있다(Anticancer Research (1993) 13, 2207-2212). 이에 대해 놀랍게도 본원의 항에피레귤린 항체는 그 중화활성에 의해 에피레귤린을 발현하는 세포의 증식 억제를 발휘할 뿐 아니라, ADCC 등의 세포상해활성에 의해 에피레귤린을 발현하는 세포에 대한 세포상해를 일으키는 한편으로, 본원의 항에피레귤린 항체를 포함하는 항체 약물 복합체도 에피레귤린을 발현하는 세포에 대해 세포상해활성을 일으키는 것이 명확해졌다.
저분자 항체
비한정의 일태양에서는 본 발명의 항에피레귤린 항체 약물 복합체에 포함되는 항에피레귤린 항체는 저분자 항체일 수도 있다. 저분자 항체는 전장 항체(whole antibody, 예를 들면 whole IgG 등)의 부분이 결손되어 있는 항체 단편을 포함한다. 에피레귤린 항원에 대한 결합활성을 갖는 한, 항체 분자의 부분적인 결손은 허용된다. 본 발명에 있어서의 항체 단편은 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL) 중 어느 하나 또는 양쪽을 포함하고 있는 것이 바람직하다. VH 또는 VL의 아미노산 서열은 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 추가로 에피레귤린 항원에 대한 결합활성을 갖는 한, VH 및 VL 중 어느 하나 또는 양쪽 부분을 결손시키는 것도 가능하다. 또한 가변영역은 키메라화나 인간화되어 있어도 된다. 항체 단편의 구체예로서는, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 등을 들 수 있다. 또한 저분자 항체의 구체예로서는, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv(single chain Fv), 디아바디(Diabody), sc(Fv)2(single chain (Fv)2) 등이 예시될 수 있다. 이들 항체의 다량체(예를 들면 다이머, 트리머, 테트라머, 폴리머)도 본 발명의 저분자 항체에 포함된다.
저분자 항체는 항체를 효소로 처리하여 항체 단편을 생성시킴으로써 얻는 것이 가능하다. 항체 단편을 생성하는 효소로서 예를 들면 파파인, 펩신 또는 플라스민 등이 공지이다. 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자가 삽입된 발현 벡터가 도입된 적절한 숙주세포를 배양하여 발현한 항체 단편을 그 배양액으로부터 단리 및 정제하여 취득될 수 있다(예를 들면 Co 등(J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better 등(Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496), Plueckthun 등(Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496), Lamoyi(Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663), Rousseaux 등(Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669), Bird 등(TIBTECH (1991) 9, 132-137) 참조).
디아바디는 유전자 융합에 의해 구축된 2가(bivalent)의 항체 단편을 가리킨다(Holliger 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 6444-6448, EP404,097, WO1993/11161 등). 디아바디는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 다이머이다. 통상 다이머를 구성하는 폴리펩티드 사슬은 각각 동일 사슬 중에서 VL 및 VH의 링커에 의해 결합되어 있다. 디아바디에 있어서의 링커는 일반적으로 VL과 VH가 서로 결합할 수 없을 정도로 짧다. 구체적으로는 링커를 구성하는 아미노산 잔기는 예를 들면 5잔기 정도이다. 이 때문에 동일 폴리펩티드 사슬 상에 코드되는 VL과 VH는 단일 사슬 가변영역 단편을 형성하지 못하여 다른 단일 사슬 가변영역 단편과 이량체를 형성한다. 그 결과, 디아바디는 2개의 항원 결합 부위를 갖게 된다. scFv는 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결함으로써 취득될 수 있다. 구체적으로는 H쇄 V영역과 L쇄 V영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 매개로 연결되어 scFv가 제작될 수 있다(Huston 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, (1988) 85, 5879-5883). scFv에 있어서의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 본 명세서에 항체로서 기재된 항에피레귤린 항체 중 어느 항체 유래여도 된다. V영역을 연결하는 펩티드 링커에는 특별히 구조 또는 성질에 제한은 없다. 예를 들면 3~25잔기 정도로 이루어지는 임의의 단일 사슬 펩티드를 링커로서 사용할 수 있다.
sc(Fv)2는 2개의 VH 및 2개의 VL을 링커 등으로 결합하여 단일 사슬로 한 저분자 항체이다(Hudson 등(J. Immunol. Methods (1999) 231, 177-189). sc(Fv)2는 예를 들면 scFv를 링커로 연결함으로써 제작될 수 있다.
의약 조성물(치료제)
다른 관점에서 본 발명은 본 발명의 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물(또는 치료제)을 제공한다. 또한 본 발명의 의약 조성물(또는 치료제)은 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 함유하는 세포 증식 억제제, 특히 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 세포 증식 억제제 및 항암제는 암을 앓고 있는 대상 또는 앓고 있을 가능성이 있는 대상에게 투여되는 것이 바람직하다. 본 발명의 세포 증식 억제제 및 항암제는 폐선암 이외의 비소세포폐암을 앓고 있는 대상 또는 앓고 있을 가능성이 있는 대상에게 투여되는 것이 바람직하다. 본 발명의 세포 증식 억제제 및 항암제는 특히 대세포암, 다형암 또는 편평상피암 중 어느 하나의 비소세포폐암을 앓고 있는 대상 또는 앓고 있을 가능성이 있는 대상에게 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 함유하는 세포 증식 억제제는 항에피레귤린 항체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 세포 증식을 억제하는 방법, 세포 증식 억제에 있어서 사용하기 위한 항에피레귤린 항체 또는 세포 증식 억제제의 제조에 있어서의 항에피레귤린 항체의 사용으로 표현하는 것도 가능하다.
또한 본 발명에 있어서 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 함유하는 항암제는 항에피레귤린 항체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법으로 표현하는 것도 가능하다. 바람직한 암으로서는 폐선암 이외의 비소세포폐암, 보다 적합하게는 대세포암, 다형암 또는 편평상피암 중 어느 하나의 비소세포폐암을 들 수 있다. 또한 본 발명에 있어서 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 함유하는 항암제는 암의 예방 또는 치료에 있어서 사용하기 위한 항에피레귤린 항체 또는 항암제의 제조에 있어서의 항에피레귤린 항체의 사용으로 표현하는 것도 가능하다. 당해 항암제에 의해 치료되는 암으로서는 페선암 이외의 비소세포폐암, 보다 적합하게는 대세포암, 다형암 또는 편평상피암 중 어느 하나의 비소세포폐암을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 함유한다는 것은 항에피레귤린 항체를 주요한 활성 성분으로서 포함한다는 의미로, 항에피레귤린 항체의 함유율을 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 의약 조성물(예를 들면 본 발명의 세포 증식 억제제, 항암제. 이하 동일.)에 함유되는 항체는 에피레귤린 단백질과 결합하는 한 특별히 제한은 없고, 본 명세서 중에 기재된 항체가 예시될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 경구, 비경구 투여 중 어느 하나에 의해 대상(환자)에 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여이다. 이러한 투여방법으로서는 구체적으로는 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. 주사 투여의 예로서는 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 본 발명의 의약 조성물을 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 투여량으로서는 예를 들면 1회의 투여에 대해 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1,000 ㎎의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 또는 예를 들면 환자당 0.001~100,000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그러나 본 발명의 의약 조성물은 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물은 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있고(예를 들면 Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 포함하는 것이어도 된다. 예를 들면 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있다. 또한 이들에 제한되지 않고 기타 상용의 담체를 적절히 사용할 수 있다. 구체적으로는 경질 무수규산, 젖당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로스칼슘, 카르멜로스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세리드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염류 등을 담체로서 들 수 있다.
항에피레귤린 항체는 본 발명의 의약 조성물에 함유되는 에피레귤린 단백질에 결합하는 항체로서 상기한 바와 같다. 항에피레귤린 항체가 결합하는 세포는 에피레귤린이 발현되고 있는 세포라면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서의 바람직한 에피레귤린 발현 세포는 암세포이다. 보다 바람직하게는 폐선암 이외의 비소세포폐암, 특히 대세포암, 다형암 또는 편평상피암 중 어느 하나의 비소세포폐암이다. 본 발명의 방법은 이들 암의 원발소(primary focus) 및 전이소(metastatic focus) 중 어느 것에 대해서도 적용할 수 있다. 더욱 바람직한 암세포는 선암 이외의 원발성 비소세포폐암 세포 또는 선암 이외의 전이성 비소세포폐암 세포이다. 선암 이외의 원발성 비소세포폐암 세포로서는 대세포암, 다형암 또는 편평상피암 중 어느 하나의 원발성 비소세포폐암을 들 수 있다. 선암 이외의 전이성 비소세포폐암 세포로서는 대세포암, 다형암 또는 편평상피암 중 어느 하나의 전이성 비소세포폐암을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「접촉」은, 예를 들면 시험관 내에서 배양하고 있는 에피레귤린 발현 세포의 배양액에 항체를 첨가함으로써 행해진다. 이 경우에 있어서 첨가되는 항체의 형상으로서는 용액 또는 동결건조 등에 의해 얻어지는 고체 등의 형상을 적절히 사용할 수 있다. 수용액으로서 첨가되는 경우에 있어서는 순수하게 항체만을 함유하는 수용액이어도 되고, 예를 들면 상기 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함하는 용액이어도 된다. 첨가하는 농도는 특별히 한정되지 않으나, 배양액 중의 최종 농도로서 바람직하게는 1 pg/mL~1 g/mL의 범위이고, 보다 바람직하게는 1 ng/mL~1 ㎎/mL이며, 더욱 바람직하게는 1 ㎍/mL~1 ㎎/mL가 적합하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 있어서 「접촉」은 또한, 다른 태양에서는 에피레귤린 발현 세포를 체내에 이식한 비인간 동물이나 내재적으로 에피레귤린을 발현하는 암세포를 갖는 동물에 항체를 투여함으로써도 행해진다. 투여방법은 경구, 비경구 투여 중 어느 하나에 의해 실시할 수 있다. 특히 바람직하게는 비경구 투여에 의한 투여방법이며, 이러한 투여방법으로서는 구체적으로는 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. 주사 투여의 예로서는 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 본 발명의 의약 조성물 세포 증식 저해제 및 항암제를 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한 피험 동물의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 수용액으로서 투여되는 경우에 있어서는 순수하게 항체만을 함유하는 수용액이어도 되고, 예를 들면 상기 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함하는 용액이어도 된다. 투여량으로서는 예를 들면 1회의 투여에 대해 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1,000 ㎎의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 또는 예를 들면 환자당 0.001~100,000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그러나 본 발명의 항체 투여량은 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다.
에피레귤린 단백질이 고발현되고 있는 암세포를 포함하는 대상에 투여되는 암치료제
본 발명은 또한 암치료제가 투여되는 대상이 단리된 조직 표품에서 검출된 에피레귤린 단백질이 고발현되고 있는 암세포를 포함하는 대상인 암치료제를 제공한다. 에피레귤린 단백질의 발현량은 본 명세서에 기재된 방법 외에 당업자에게 공지의 방법으로 결정하는 것이 가능하다. 본 발명의 암치료제가 투여되는 대상인지 여부를 결정하기 위해 대상의 후보로부터 단리된 조직 표품에 있어서의 에피레귤린 단백질의 발현량이 결정될 수 있다. 당해 표품에 있어서 에피레귤린 단백질이 검출되면 당해 표품이 유래하는 대상이 본 발명의 암치료제가 투여되는 대상이 될 수 있다. 에피레귤린 단백질의 발현량은 특정 수치에 한정되지 않으나, 비한정의 태양으로서 103, 104, 105, 106, 107, 108의 수치의 자릿수(오더)의 범위로부터 적절히 설정될 수 있다. 비한정의 일태양으로서 1×103, 2×103, 3×103, 4×103, 5×103, 6×103, 7×103, 8×103, 9×103, 1×104, 2×104, 3×104, 4×104, 5×104, 6×104, 7×104, 8×104, 9×104, 1×105, 2×105, 3×105, 4×105, 5×105, 6×105, 7×105, 8×105, 9×105, 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108 중 어느 하나로부터 선택되는 에피레귤린 단백질의 발현량이 투여되는 대상을 선택하기 위한 기준으로서 설정될 수 있는 수치(역치)의 적합한 예로서 예시될 수 있다. 상기 수치는 유효숫자 한 자리로서 산출된 수치일 수 있는데, 이 경우에 있어서 예를 들면 유효숫자 한 자리로 산출된 에피레귤린의 발현량이 1×103이라는 것은, 유효숫자 두 자리로서 산출된 경우에는 에피레귤린의 발현량이 0.5×103, 0.6×103, 0.7×103, 0.8×103, 0.9×103, 1.0×103, 1.1×103, 1.2×103, 1.3×103, 1.4×103 중 어느 하나를 포함하는 수치인 경우도 있다.
조직 표품
본 발명에서 사용되는 용어 「조직 표품」이란 개체, 체액(예를 들면 혈액, 혈청, 혈장 및 척수액), 조직 배양물 또는 조직 절편 등으로부터 얻어지는 임의의 생물학적 표품을 말한다. 생물학적 표품으로서 사용되는 것으로서 피험체 표품을 적합하게 들 수 있다. 바람직한 피험체 표품은 피험체로부터 얻어진 조직으로, 더욱 바람직하게는 피험체의 대장 조직이다. 대장 조직을 채취하는 방법으로서는 공지의 방법인 생체 검사(biopsy)가 적합하게 사용된다. 생체 검사의 수단으로서 공지의 수단이 적절히 사용될 수 있다. 그러한 예로서 흡인 생체 검사, 클러치 생체 검사, 찰과 생체 검사, 세포진단용 생체 검사, 내시경 생체 검사, 세침 흡인 생체 검사, 침 생체 검사, 경기관지적 폐 생체 검사 등의 생체 검사(biopsy)에 의해 또는 외과수술 시에 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서는 조직 표품이 현미경 하에서 투과광선에 의해 관찰되기 때문에 조직 표품이 현미경에 사용되는 광선을 충분히 투과하는 정도로 얇게 잘라진다. 얇게 자르기의 전단계로서 조직 표품이 고정된다. 즉 조직·세포의 단백질에 탈수나 변성을 일으켜 응고시킴으로써 조직을 구성하는 세포가 신속하게 사멸되어 그 구조가 안정화 및 불용화된다. 먼저 고정의 대상이 되는 조직 표품이 파라핀 포매 절편을 만들기에 적합한 크기 및 형태의 단편으로서 수술용 메스 등의 날붙이로 잘라내어진다. 이어서 고정을 실시하기 위해 사용되는 시약인 고정액 중에서 당해 단편이 침지된다. 고정액으로서는 포르말린, 더욱 바람직하게는 중성 완충 포르말린이 적합하게 사용된다. 중성 완충 포르말린의 농도는 조직 표품의 특성 또는 물성에 따라 적절히 선택된다. 농도는 1~50%, 바람직하게는 5~25%, 더욱 바람직하게는 10~15% 사이에서 적절히 변경되어 사용될 수 있다. 조직 표품이 침지된 고정액이 진공 펌프를 사용하여 적절히 탈기된다. 고정은 조직 표본을 상압 및 실온의 조건하에서 고정액 중에 수 시간 방치함으로써 실시된다. 고정에 소요되는 시간은 1시간~7일간, 바람직하게는 2시간~3일간, 또한 바람직하게는 3시간~24시간, 더욱 바람직하게는 4시간~16시간의 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 고정 후에 인산 완충액 등에 추가로 수 시간(2시간~48시간, 바람직하게는 3시간~24시간, 더욱 바람직하게는 4시간~16시간의 범위에서 적절히 선택될 수 있는 시간) 적절히 침지된다.
다음으로 고정이 적용된 조직 표품으로부터 동결 절편법 또는 파라핀 절편법을 사용하여 절편이 적합하게 제작될 수 있다. 동결 절편법의 적합한 예로서는 O.C.T.compound(Miles. Inc) 중에 조직을 투입하여 동결시킨 것을 크라이오스탯(동결 절편 제작장치)을 사용하여 얇게 자르는 방법을 들 수 있다. 파라핀 절편법에 있어서는 고정이 적용된 조직 표품이 포매제에 침지되어 굳어짐으로써 균일하고 적절한 경도가 부여된다. 포매제로서는 파라핀이 적합하게 사용될 수 있다. 고정이 적용된 조직 표품은 에탄올을 사용하여 탈수된다. 구체적으로는 조직 표품이 70% 에탄올, 80% 에탄올, 100% 에탄올에 순차 침지됨으로써 당해 조직 표품이 탈수된다. 침지에 소요되는 시간 및 횟수는 1시간~수 일 및 1회~3회의 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 또한 실온 또는 4℃에 있어서도 침지될 수 있으나, 4℃에 있어서 침지되는 경우에는 침지시간은 철야 등 그 시간이 긴편이 바람직하다. 이어서 그 액상이 크실렌으로 치환된 후에 조직 표품이 파라핀에 의해 포매된다. 그 액상의 크실렌으로의 치환에 소요되는 시간은 1시간~수 시간의 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 그때 실온에서 치환될 수 있고 4℃에 있어서도 치환될 수 있는데, 4℃에 있어서 치환되는 경우에는 치환의 시간은 철야 등 그 시간이 긴편이 바람직하다. 파라핀 포매에 소요되는 시간 및 횟수는 1시간~수 시간 및 1회~4회의 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 그때 실온에서 포매될 수 있고 4℃에 있어서도 포매될 수 있는데, 4℃에 있어서 포매되는 경우에는 포매의 시간은 철야 등 그 시간이 긴편이 바람직하다. 또한 파라핀 포매 반응이 자동화 처리되는 파라핀 포매장치(EG1160, Leica 등)를 사용함으로써 조직 표품이 적합하게 파라핀 포매될 수 있다.
전술한 바와 같이 하여 파라핀 포매된 조직 표품을 밑나무(base)에 접착함으로써 「블록」이 제작되고, 이 블록이 미크로톰에 의해 1~20 ㎛의 두께로부터 선택되는 목적하는 두께로 얇게 잘라진다. 얇게 잘린 조직 절편은 투과성의 지지체인 슬라이드 글라스 상에 정치됨으로써 고착된다. 이 경우에 있어서 조직 절편의 박리를 방지하기 위해 슬라이드 글라스에 0.01% 폴리-L-리신(Sigma)을 도포하여 건조시킨 슬라이드 글라스도 적합하게 사용될 수 있다. 고착된 조직 절편은 수 분~1시간 사이에서 선택되는 적절한 시간 풍건된다.
항원 부활화(antigen retrieval)
본 발명의 방법에 있어서는 포르말린 고정에 의해 항체와의 반응성이 감약된 항원의 반응성이 부활화된다. 본 발명에 있어서는 2개의 조직 표품 중 하나의 표품에 대해 프로테아제 항원 부활화법(PIER법)을 적용하고, 다른 표품에 대해 열유도 항원 부활화법(HIER법)을 적용하여 항체와 반응시켰을 때의 양자 간의 염색 정도의 상위가 수치화된다.
열유도 항원 부활화법은 마이크로파에 의한 가열방법이나 오토클레이브에 의한 가열방법 또는 자비처리(boiling treatment)에 의한 가열방법 등이 적절히 사용된다. 액온이 약 98℃로 유지되도록 780 W의 출력으로 자비처리하는 경우, 처리 등 부활하에 소요되는 시간은 5분-60분 사이에서 적절히 선택되고, 예를 들면 10분간이다. 항원의 부활화 처리는 10 mM 구연산나트륨 완충액 외에 시판의 Target Retrieval Solution(DakoCytomation) 등 중에서 행할 수 있다. 하기 실시예에 있어서는 Target Retrieval Solution을 사용한다. 부활화 처리 결과로서 에피레귤린 항체가 인식하는 항원 중의 에피토프가 항체와의 결합성을 획득하여, 후술하는 항원과 항체의 복합체의 검출이 가능해지는 것이라면 어느 완충액, 수용액도 적합하게 사용된다.
프로테아제 항원 부활화법에 있어서 사용되는 프로테아제는 그 종류나 유래에 대해서 특별히 한정되지 않고, 일반적으로 입수 가능한 프로테아제를 적절히 선택하여 사용될 수 있다. 사용되는 프로테아제의 예로서 0.01N 염산 중 0.05% 농도의 펩신 또는 pH 7.6의 Tris 완충액 중 0.01% 농도의 CaCl2를 추가로 함유하는 0.1% 농도의 트립신, 10 mM의 EDTA 및 0.5%의 SDS를 포함하는 pH 7.8의 10 mM Tris 염산 완충액 중 1~50 ㎍/㎖ 농도의 프로테아제 K 등을 적합하게 들 수 있다. 추가로 프로테아제 K를 사용하는 경우, 그 반응액의 pH는 6.5~9.5 사이에서 적절히 선택되고, SH 시약이나 트립신 저해제나 키모트립신 저해제도 적절히 이용될 수 있다. 본 명세서 실시예 중에서 기재되는 히스토파인 HER2 키트(MONO)(니치레이 바이오사이언스)에 첨부되는 프로테아제도 이러한 적합한 프로테아제의 구체예로서 들 수 있다. 프로테아제 항원 부활화는 통상 37℃에서 행해지는데, 반응온도는 25℃~50℃의 범위 내에서 적절히 변경될 수 있다. 프로테아제 항원 부활화가 37℃에서 행해지는 경우에는 반응시간은 예를 들면 1분~5시간 사이에서 적절히 선택되며, 예를 들면 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 등이다. 부활화 처리가 종료된 후, 당해 처리가 실시된 조직 표품은 세정용 완충액에 의해 세정된다. 세정용 완충액은 PBS(Phosphate buffer saline)가 적합하게 사용되는 외에, Tris 염산 완충액도 적합하게 사용될 수 있다. 통상 세정 조건으로서는 실온에서 5분간의 세정을 3회 실시하는 방법이 채용되는데, 세정의 시간 및 온도는 적절히 변경될 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 검출용 물질로서는 통상 항체, 핵산 등을 들 수 있다. 예를 들면 (1) EREG 단백질을 검출하는 것이 가능한 EREG 항체를 사용한 면역학적 수법에 의해 EREG 단백질을 검출하는 것, (2) EREG를 코드하는 mRNA를 검출하는 것이 가능한 당해 mRNA에 상보적인 핵산 분자(예를 들면 DNA, RNA, mRNA) 등이 사용되는데, 적합하게는 상보적 핵산 분자로, 이러한 핵산 분자끼리의 하이브리다이제이션을 이용하여 EREG를 코드하는 mRNA를 검출하는 것(예를 들면 FISH법)이 가능하다. 본 발명에 있어서는 면역학적 수법, 특히 조직면역학 염색법이 적합하게 사용될 수 있다.
조직 표품과 에피레귤린 항체의 반응
열유도 항원 부활화법에 의한 항원 부활화 처리가 실시된 조직 표품 및 프로테아제 항원 부활화법에 의한 항원 부활화 처리가 실시된 조직 표품에 대해 에피레귤린 항체를 1차 항체로서 반응시킨다. 당해 반응은 에피레귤린 항체가 항원 중의 에피토프를 인식하여 항원 항체 복합체를 형성하기에 적절한 조건하에서 실시된다. 통상 당해 반응은 4℃에서 철야 또는 37℃에서 1시간 실시되는데, 반응 조건은 항체가 항원 중의 에피토프를 인식하여 항원 항체 복합체를 형성하기에 적절한 범위에서 적절히 변경될 수 있다. 예를 들면 반응온도는 4℃~50℃의 범위 내에서 변경될 수 있고, 반응시간은 1분~7일 사이에서 변경될 수 있다. 저온에서의 반응이 실시되는 경우에는 긴 시간 반응시키는 것이 바람직하다. 1차 항체 반응이 종료된 후 조직 표품은 세정용 완충액에 의해 세정된다. 세정용 완충액은 PBS(Phosphate buffer saline)가 적합하게 사용되는 외에, Tris 염산 완충액도 적합하게 사용될 수 있다. 통상 세정 조건으로서는 실온에서 5분간의 세정을 3회 실시하는 방법이 채용되는데, 세정의 시간 및 온도는 적절히 변경될 수 있다.
이어서 1차 항체 반응이 실시된 조직 표품에 대해 1차 항체를 인식하는 2차 항체를 반응시킨다. 통상 2차 항체를 가시화하기 위한 표지물질에 의해 사전에 표지된 2차 항체가 사용된다. 표지 물질로서는 FITC(플루오레세인이소티오시아네이트)나 Cy2(Amersham), Alexa488(Molecular Probe) 등의 형광색소, 퍼옥시다아제나 알칼리포스파타아제 등의 효소 또는 금 콜로이드 등을 적합하게 들 수 있다.
2차 항체와의 반응은 항에피레귤린 항체와 당해 항에피레귤린 항체를 인식하는 2차 항체가 항원 항체 복합체를 형성하기에 적절한 조건하에서 실시된다. 통상 당해 반응은 실온 또는 37℃에서 30분~1시간 실시되는데, 에피레귤린 항체와 2차 항체가 항원 항체 복합체를 형성하기에 적절한 범위에서 적절히 변경될 수 있다. 예를 들면 반응온도는 4℃~50℃의 범위 내에서 변경될 수 있고, 반응시간은 1분~7일 사이에서 변경될 수 있다. 저온에서의 반응이 실시되는 경우에는 오랜 시간 반응시키는 것이 바람직하다. 2차 항체 반응이 종료된 후 조직 표품은 세정용 완충액에 의해 세정된다. 세정용 완충액은 PBS(Phosphate buffer saline)가 적합하게 사용되는 외에, Tris 염산 완충액도 적합하게 사용될 수 있다. 통상 세정 조건으로서는 실온에서 5분간의 세정을 3회 실시하는 방법이 채용되는데, 세정의 시간 및 온도는 적절히 변경될 수 있다.
다음으로 2차 항체 반응이 실시된 조직 표품에 대해 표지 물질을 가시화하는 물질을 반응시킨다. 2차 항체의 표지 물질로서 퍼옥시다아제를 사용한 경우에는, 0.02% 과산화수소와 pH 7.2의 0.1M 트리스 염산 완충액으로 0.1% 농도로 조제된 DAB(디아미노벤지딘)용액을 인큐베이트 직전에 등량 혼합함으로써 얻어지는 반응액으로 조직 표품이 인큐베이트된다. DAB 외에는 DAB-Ni나 AEC+(이상, DAKO) 등의 발색기질이 적절히 선택될 수 있다. 인큐베이트 과정에 있어서 가끔 현미경하에서 발색 정도를 관찰하고, 적절한 발색이 확인된 단계에서 조직 표품을 PBS에 침지함으로써 가시화 반응이 정지된다.
2차 항체의 표지 물질로서 알칼리포스파타아제를 사용한 경우에는, BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴인산)/NBT(니트로블루테트라졸륨)(Zymed) 기질 용액(10 mM 농도의 MgCl2 및 28 mM 농도의 NaCl을 함유하는 pH 9.8의 50 mM 탄산나트륨 완충액에, 0.4 mM 농도로 NBT 및 0.38 mM 농도로 BCIP가 용해된 것)으로 조직 표품이 인큐베이트된다. 또한 BCIP 및 NBT 외에는 Permanent Red, Fast Red 또는 Fuchsin+(이상, DAKO) 등도 적절히 사용될 수 있다. 인큐베이트에 앞서 1 mM 농도의 내재성 알칼리포스파타아제의 저해제인 염화 레바미솔(나칼라이테스크), 0.1M 염화나트륨 및 50 mM 염화마그네슘을 포함하는 0.1M 트리스-염산 완충액(pH 9.5)과 실온에서 1분~수 시간 프리인큐베이트해도 된다. 인큐베이트 과정에 있어서 가끔 현미경하에서 관찰하고, 반응 최종산물인 보라색의 포르마잔의 침착이 관찰된 단계에서 조직 표품을 수세 또는 2% 폴리비닐알코올을 포함하는 TBS에 의한 반응 정지 후, TBST(0.1%의 Tween20을 포함하는 TBS)로 세정된다. 금 콜로이드가 2차 항체의 표지로서 사용되는 경우에는 은 증감에 의해 금입자에 금속은이 부착됨으로써 금 콜로이드가 가시화된다. 은 증감의 방법은 당업자에게 공지이다.
FITC(플루오레세인이소티오시아네이트)나 Cy2(Amersham), Alexa488(Molecular Probe) 등의 형광색소를 2차 항체의 표지 물질로서 사용한 경우에는 가시화 물질의 반응공정은 불필요하여, 당해 형광물질의 여기파장의 빛을 조사하고 방출되는 빛이 형광 현미경을 사용함으로써 적절히 검출될 수 있다
본 발명에 있어서 상기와 같이 피험 대상으로부터 단리된 조직 표품에 포함되는 에피레귤린 단백질이 검출된다. 검출된 당해 조직 표품에 포함되는 에피레귤린 단백질이 암세포를 포함하는 조직 중에 고발현되고 있는지 여부는, 상기 조직 면역학적 염색법에 의해 얻어진 염색 패턴이 수치화된 염색 강도 스코어에 의해 판정하는 것이 가능하다. 염색 패턴 수치화의 비한정의 일태양으로서 예를 들면 하기와 같은 판정 기준이 예시된다.
-염색 강도 스코어 0：검체 조직 중의 종양세포 중에서 에피레귤린 양성을 나타내고 있는 세포가 없거나 또는 10%에 못미치는 것
-염색 강도 스코어 1：검체 조직 중의 종양세포 중에서 에피레귤린 양성을 나타내고 있는 세포가 10% 이상 있으나, 종양세포의 일부 막에 국한된 약한 염색 강도를 갖는 것
-염색 강도 스코어 2：검체 조직 중의 종양세포 중에서 에피레귤린 양성을 나타내고 있는 세포가 30% 이상 있는 것, 또는 검체 조직 중의 종양세포 중에서 에피레귤린 양성을 나타내고 있는 세포가 10% 이상 있고, 종양세포의 막에 국한된 중간 정도의 염색 강도를 갖는 것
-염색 강도 스코어 3：검체 조직 중의 종양세포 중에서 에피레귤린 양성을 나타내고 있는 세포가 60% 이상 있는 것, 또는 검체 조직 중의 종양세포 중에서 에피레귤린 양성을 나타내고 있는 세포가 10% 이상 있고, 종양세포의 막에 국한된 강한 정도의 염색 강도를 갖는 것
또한 본 발명에 있어서 상기 조직 면역학적 염색법에 의해 얻어진 염색 패턴이 수치화된 염색 강도 스코어를 토대로 피험 대상으로부터 단리된 조직 표품에 포함되는 에피레귤린 발현량의 판정을 행할 때, 검출 교정용으로 조제된 사전에 에피레귤린 단백질의 발현량이 결정된 염색 패턴의 상과 비교하는 것도 가능하다. 에피레귤린 단백질 발현량의 결정에는 항원 정량을 위한 검량선 작성에 사용하는 형광 표지 비드를 사용한 공지의 수법(예를 들면 BD Quantibrite PETM 등)이 적절히 사용될 수 있다.
상기 방법에 의해 피험 대상으로부터 단리된 조직 표품에 포함되는 에피레귤린이 고발현하고 있는지 여부가 결정될 수 있다. 고발현의 예시로서 예를 들면 세포당 에피레귤린 분자의 발현 수로 환산한 경우에 1×104, 2×104, 3×104, 4×104, 5×104, 6×104, 7×104, 8×104, 9×104, 1×105, 2×105, 3×105, 4×105, 5×105, 6×105, 7×105, 8×105, 9×105, 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107의 범위로부터 적절히 선택될 수 있다.
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
아래에 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
〔참고실시예 1〕키메라 항체 EP27의 인간화
1-1．인간화용 프레임워크 서열의 선정
마우스 가변영역과 인간 IgG1 불변영역으로 이루어지는 키메라 항체 EP27(WO2008/047723 기재)의 인간화가 실시되었다. CDR, FR의 결정은 Kabat의 정의(Kabat 넘버링)에 따랐다.
맨처음 데이터베이스 상의 인간 항체 가변영역 서열과 EP27 마우스 가변영역 서열을 비교함으로써 인간화의 템플레이트와 이용할 수 있는 아래의 인간 FR 서열이 선택되었다. 데이터베이스로서 IMGT Database(http://www.imgt.org/) 및 NCBI GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)가 이용되었다. 표 2에 선택된 FR 서열을 나타내었다.
Figure pct00005
다음으로 EP27 가변영역의 H쇄 및 L쇄의 CDR 서열(표 3, 서열번호：9~14)을 상기에서 선택한 인간 FR과 연결함으로써 인간화 항체 가변영역 서열이 디자인되었다. 이들이 인간화 H쇄 가변영역 서열 HA(서열번호：15), 인간화 L쇄 가변영역 서열 LA(서열번호：16)로 되었다.
Figure pct00006
1-2． EP27 인간화 가변영역 HJ의 디자인
표 2에서 선택된 H쇄 FR1의 서열에 있어서 Kabat 넘버링으로 표시되는 2번, 4번, 24번, 27번, 29번의 아미노산 잔기는 upper core를 형성하여 항체 구조의 안정화에 기여하는 것이 보고되어 있다(Ewert 등(Methods. 2004 Oct;34(2):184-99)). 또한 Chothia의 정의에서는 Kabat 넘버링으로 표시되는 26~30번의 아미노산 잔기는 CDR1에 포함된다(Honegger 등, J. Mol. Biol. (2001) 309, 657-670). 이들 정보로부터 키메라 항체 EP27과 동등한 항원 결합활성을 갖는 인간화 항체를 제작하기 위해, 상기에 해당하는 아미노산 잔기가 EP27 마우스 가변영역 서열에 존재하는 잔기로 되돌려졌다. 따라서 표 2에서 선택한 인간 H쇄 FR1(서열번호：1)의 Kabat 넘버링으로 표시되는 2번, 24번, 27번, 28번, 29번, 30번의 아미노산 잔기가 EP27 마우스 가변영역 서열에 존재하는 아미노산 잔기로 되돌려진 인간화 H쇄 FR1(표 4, 서열번호：17)이 새롭게 디자인되었다.
표 2에서 선택된 H쇄 FR3의 서열에 있어서 Kabat 넘버링으로 표시되는 93번의 아미노산 잔기는 Ala이나, EP27 마우스 가변영역 서열의 아미노산 잔기는 Val이다. 마우스 및 인간의 germline 서열의 데이터베이스 IMGT Database(http://www.imgt.org/)로부터 해당 부위에 Val이 포함되어 있는 서열은 적은 것이 확인되었다. EP27 마우스 가변영역 서열에 포함되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 93번의 Val은 항원 결합에 관여하는 것으로 생각되었기 때문에, 표 2에서 선택된 인간 H쇄 FR3(서열번호：3)의 Kabat 93번의 아미노산 잔기가 EP27 마우스 가변영역 서열에 존재하는 잔기로 치환된 인간화 H쇄 FR3(표 4, 서열번호：18)가 새롭게 디자인되었다.
인간화 H쇄 가변영역 서열 HA(서열번호：15)로부터 새롭게 디자인된 표 4에 나타낸 FR1(표 4, 서열번호：17) 및 FR3(표 4, 서열번호：18)를 포함하는 인간화 H쇄 가변영역 서열 HJ(서열번호：19)가 디자인되었다.
Figure pct00007
1-3． EP27 인간화 가변영역 LB , L18의 디자인
표 2에서 선택된 L쇄 FR2의 서열에 있어서 Kabat 넘버링으로 표시되는 49번은 Tyr인데, EP27 마우스 가변영역 서열에서는 Gln이다. 마우스 및 인간의 germline 서열의 데이터베이스 IMGT Database(http://www.imgt.org/)로부터, 해당 부위에 Gln이 포함되어 있는 서열은 적은 것이 확인되었다. 따라서 EP27 마우스 가변영역 서열에 포함되는 49번의 Gln은 항원 결합에 관여할 가능성이 시사되었다. 이것으로부터 표 2에서 선택된 인간 L쇄 FR2(서열번호：6)의 Kabat 넘버링으로 표시되는 49번의 아미노산 잔기가 EP27 마우스 가변영역 서열의 아미노산 잔기로 치환된 인간화 L쇄 FR2(표 5, 서열번호：20)가 새롭게 디자인되었다.
표 2에서 선택된 L쇄 FR3의 서열에 있어서 Kabat 넘버링으로 표시되는 71번은 upper core를 형성하여 항체 구조의 안정화에 기여하는 것이 보고되어 있다(Ewert 등(Methods. 2004 Oct;34(2):184-99)). 키메라 항체 EP27과 동등한 항원 결합활성을 갖는 인간화 항체를 제작하기 위해, 상기에 해당하는 아미노산 잔기를 EP27 마우스 가변영역 서열의 아미노산 잔기로 치환하기 위해, 표 2에서 선택된 인간 L쇄 FR3(서열번호：7)의 Kabat 넘버링으로 표시되는 71번의 아미노산 잔기가 EP27 마우스 가변영역 서열의 아미노산 잔기로 치환된 인간화 L쇄 FR3(표 5, 서열번호：21)가 새롭게 디자인되었다.
인간화 L쇄 가변영역 서열 LA(서열번호：16)로부터 새롭게 디자인된 FR2, FR3(표 5, 서열번호：20, 21)를 포함하는 인간화 L쇄 가변영역 서열 LB(서열번호：22)가 디자인되었다.
또한 인간화 L쇄 가변영역 서열 LA(서열번호：16)로부터 새롭게 디자인된 FR2(표 5, 서열번호：20) 및 Accession No. AB064134(NCBI GenBank)에 기재된 인간 항체 L쇄 서열의 FR3(표 5, 서열번호：23)를 포함하는 인간화 L쇄 가변영역 서열 L18(서열번호：24)이 디자인되었다.
Figure pct00008
1-4． EP27 인간화 항체 서열의 제작
맨처음 EP27 인간화 가변영역의 cDNA를 제작하기 위해 H쇄(HJ), L쇄(LB)에 대해서 합성 올리고 DNA를 각각 설계하였다. 다음으로 각 합성 올리고 DNA를 혼화하고 어셈블 PCR법 등의 당업자 공지의 방법으로 EP27 인간화 항체의 가변영역을 코드하는 유전자 단편을 증폭하였다. 마지막으로 얻어진 증폭 단편을 적당한 동물세포 발현 벡터에 의해 클로닝하여 인간 IgG1 불변영역 유전자와 연결하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다.
인간 IgG 항체의 H쇄 C말단 서열(G1, 서열번호：25) 유래의 이질성으로서 C말단 아미노산의 리신 잔기의 결손 및 C말단의 2아미노산의 글리신, 리신 양쪽의 결손에 의한 C말단 아미노기의 아미드화가 보고되어 있다(Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.). 이들 이질성을 저감시키는 방법으로서 H쇄 C말단의 2아미노산, 즉 EU 넘버링으로 표시되는 446번의 글리신 및 447번의 리신을 결손시키는 방법이 알려져 있다(WO2009/041613). EP27 인간화 항체의 경우도 H쇄 C말단 서열에 유래하는 이질성은 존재하지 않는 것이 바람직하기 때문에, 인간 IgG1의 EU 넘버링으로 표시되는 446번의 글리신 및 447번의 리신을 결손시킨 IgG1 서열(G1d, 서열번호：26)을 불변영역 서열로서 이용할 수 있다. 한편 L쇄 불변영역으로서는 천연형 인간 κ쇄(k, 서열번호：27)를 불변영역 서열로서 이용할 수 있다. 이상과 같이 하여 얻은 EP27 인간화 항체 서열의 H쇄로서 HJ-G1d(서열번호：28), L쇄로서 LB-k(서열번호：29)가 제작되었다. 또한 IgG1 불변영역에는 알로타입이 보고되어 있는데(Jefferis 등, mAbs 1:4, 1-7; July/August 2009), 상기 IgG1의 G1m17,1 타입의 불변영역(서열번호：26) 이외에도 G1m17 타입(서열번호：30)이나 G1m3 타입(서열번호：31)을 EP27 인간화 항체의 제작에 이용할 수 있다.
1-5． EP27 인간화 항체의 평가
제작한 EP27 인간화 항체 서열을 평가하기 위해 H쇄(HJ-G1d, 서열번호：28) 및 L쇄(LB-k, 서열번호：29)를 공발현시킴으로써 EP27 인간화 항체 HJ-G1d/LB-k가 얻어졌다. 구체적으로는 상기에서 제작한 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 인간 태아 신장암세포 유래 HEK293H주(Invitrogen) 또는 FreeStyle293 세포(Invitrogen)에 일과성으로 도입함으로써 항체를 발현시켰다. 얻어진 배양상청으로부터 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE 헬스케어) 등을 사용한 당업자 공지의 방법으로 항체가 정제되었다. 항체를 포함하는 용액을 분광광도계로 측정(파장 280 nm)하고, 얻어진 흡광도와 PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 항체농도가 산출되었다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423). 또한 대조로서 키메라 항체 EP27인 cH-G1/cL-k도 H쇄(cH-G1, 서열번호：32) 및 L쇄(cL-k, 서열번호：33)를 사용하여 동일한 수법으로 제작되었다.
키메라 항체 EP27에 대한 에피레귤린 결합 저해 평가계(참고실시예 23)에 의해 인간 에피레귤린(서열번호：167)에 대한 EP27 인간화 항체의 결합능이 평가되었다. 키메라 항체 EP27(cH-G1/cL-k)의 IC50 농도를 100으로 한 경우 EP27 인간화 항체 HJ-G1d/LB-k의 값은 24였다.
1-6． 키메라 항체와 동등한 활성을 갖는 EP27 인간화 항체의 제작
EP27 인간화 항체의 H쇄 서열 HJ-G1d의 FR 서열의 일부 아미노산 잔기가 EP27 마우스 가변영역 서열의 아미노산 잔기로 치환된 서열이 디자인되었다. 맨처음 Kabat 넘버링으로 표시되는 75-76번의 아미노산 잔기가 인간 FR3 서열의 아미노산 잔기인 Thr-Asp로부터 EP27 마우스 가변영역 서열에 포함되어 있는 아미노산 잔기인 Ser-Asn으로 치환된 서열(서열번호：35), 또한 76번의 Asp만이 EP27 마우스 가변영역 서열의 아미노산 잔기인 Asn으로 치환된 서열(서열번호：36)이 디자인되었다(표 6). 다음으로 인간화 H쇄 가변영역 서열 HJ-G1d(서열번호：28)를 포함하는 발현 벡터에 변이를 도입함으로써 표 6에 나타낸 FR3 서열(서열번호：35)을 갖는 인간화 H쇄 가변영역 서열인 HS-G1d(서열번호：37)가 제작되었다. 아미노산 잔기 치환의 도입은 PCR법 등을 사용하여 당업자 공지의 방법으로 행해졌다. 마찬가지로 표 6에 나타내어진 FR3 서열(서열번호：36)을 포함하는 인간화 H쇄 가변영역 서열인 HY-G1d(서열번호：38)가 제작되었다. 상기 1-1~1-4와 동일한 방법으로 EP27 인간화 항체 HS-G1d/LB-k, HY-G1d/LB-k 및 HY-G1d/L18-k가 얻어졌다. 얻어진 항체의 인간 에피레귤린에 대한 결합능이 키메라 항체 EP27에 대한 에피레귤린 결합 저해(참고실시예 23)로서 평가되었다. 그 결과, 키메라 항체 EP27(cH-G1/cL-k)의 IC50 농도를 100으로 한 경우 EP27 인간화 항체 HS-G1d/LB-k, HY-G1d/LB-k 및 HY-G1d/L18-k의 IC50 농도는 각각 142, 146, 100이었다.
이상으로부터, 인간화에 의해 키메라 항체 EP27과 비교하여 면역원성 리스크가 감약되었을 뿐 아니라 키메라 항체 EP27과 동등한 항원 결합능을 갖는 EP27 인간화 항체 서열이 발견되었다.
Figure pct00009
〔참고실시예 2〕탈아미드화, 이성화, 가수분해 반응을 억제하는 변이의 도입
의약품에 사용하는 항체는 단일의 항체 생산 세포에 유래하는 클론으로부터 얻어지는 단일클론 항체임에도 불구하고 이질성이 존재한다. 그러한 항체의 이질성은 산화, 탈아미드화, 이성화, 가수분해 등의 수식에 의해 일어나고, 항체를 비롯한 단백질이 장기간의 보존 중이나 열 스트레스, 광 스트레스 등의 스트레스 조건하에 노출됨으로써 증가하는 것이 알려져 있다(Heterogeneity of Monoclonal Antibodies:Journal of pharmaceutical sciences, vol.97,No.7,2426-2447). 그러나 항체를 의약품으로서 개발하는데 있어서 그 단백질의 물성, 그 중에서도 균일성과 안정성은 매우 중요하여, 목적 물질의 이질성을 저감시켜 가능한 한 단일 물질인 것이 요망된다.
탈아미드화 반응이란 아스파라긴 및 글루타민의 측쇄에 있어서 비효소적으로 일어나, 아스파라긴 및 글루타민의 측쇄에 존재하는 아미드가 카르복실산으로 변화하는 반응이다. 또한 이성화는 아스파라긴 및 아스파라긴산의 측쇄에 있는 카르보닐기가 C말단측에 있는 잔기의 질소원자 전자쌍에 공격받은 결과, 아스파라긴의 탈아미드화 또는 아스파라긴산의 탈수에 의해 불안정한 환상 이미드 중간체가 형성되는 것에 기인한다. 이 중간체는 개열에 의해 대부분이 이소아스파라긴산으로, 나머지가 아스파라긴산으로 변화한다. 이들 항체 등의 단백질의 보존 중에 일어나는 탈아미드화, 이성화 반응은 전술한 이질성의 원인이 되는 것으로부터 가능한 한 억제되는 것이 요망된다. 또한 탈아미드화 반응은 특히 아스파라긴과 글리신이 인접한 부위(Asn-Gly)에서 일어나기 쉬운 것이 보고되어 있다(Geiger 등 J. Biol. Chem. 1987; 262:785-794). 또한 아스파라긴산은 가수분해 반응에 의해 펩티드 사슬의 절단이 일어나는 것이 보고되어 있고, 특히 C말단측에 프롤린이 존재하는 서열(Asp-Pro)은 산성 조건하에서의 분해가 일어나기 쉬운 것으로 알려져 있다(Segalas 등, FEBS Letters 1995; 371:171-175).
인간화 H쇄 가변영역 서열 HY의 CDR 서열에 있어서 아스파라긴 및 아스파라긴산 잔기는 Kabat 넘버링으로 표시되는 31번(Asp), 52번(Asp), 54번(Asn), 56번(Asn), 101번(Asp)에 존재한다. 인간화 L쇄 가변영역 서열 LB의 CDR 서열에 있어서는 Kabat 넘버링으로 표시되는 28번(Asp), 92번(Asp), 93번(Asn)에 존재한다. 이들 부위의 아미노산 잔기의 치환에 의해 탈아미드화, 이성화, 가수분해 반응이 억제된 개변체가 얻어지는지가 검토되었다.
아미노산 잔기의 치환에 의한 상기 분해반응의 억제를 목적으로 해당 잔기가 다른 잔기로 치환되었다. 구체적으로는 표 7에 나타내어진 CDR 서열(서열번호：39~46)을 포함하는 H쇄 유전자로서 H71-G1d(서열번호：49), H57-G1d(서열번호：50), H61-G1d(서열번호：51), H65-G1d(서열번호：52), H66-G1d(서열번호：53), H67-G1d(서열번호：54), H23-G1d(서열번호：55), H40-G1d(서열번호：56)가 제작되었다. 마찬가지로 표 7에 나타내어진 CDR 서열(서열번호：47, 48)을 포함하는 L쇄 유전자로서 L30-k(서열번호：57), L32-k(서열번호：58)가 디자인되었다. 참고실시예 1의 수법에 의해 잔기 치환이 도입된 H쇄 유전자 벡터를 LB-k 벡터와 공발현하여 EP27 인간화 항체 H71-G1d/LB-k, H57-G1d/LB-k, H61-G1d/LB-k, H65-G1d/LB-k, H66-G1d/LB-k, H67-G1d/LB-k, H23-G1d/LB-k, H40-G1d/LB-k가 얻어졌다. 마찬가지로 잔기 치환이 도입된 L쇄 유전자 벡터를 HY-G1d 벡터와 공발현하여 EP27 인간화 항체 HY-G1d/L32-k가 얻어졌다. 인간 에피레귤린에 대한 얻어진 항체의 결합능이 키메라 항체 EP27에 대한 에피레귤린 결합 저해(참고실시예 23)로서 평가된 결과를 표 8에 나타내었다. 이것으로부터 표 7로 나타내어진 서열을 포함하는 항체는 키메라 항체 EP27과 동등한 결합활성을 갖는 것이 확인되었다. 이상으로부터 탈아미드화, 이성화 반응 등의 화학적 분해가 억제된 EP27 인간화 항체 서열이 발견되었다.
Figure pct00010
Figure pct00011
(IC50 농도：키메라 항체 EP27(cH-G1/cL-k)의 IC50 농도를 100으로 한 경우의 각 항체의 IC50 농도)
〔참고실시예 3〕등전점을 변화시키는 변이의 도입
항체의 혈장 중 반감기를 제어하는 방법 중 하나로서, 항체 분자 표면에 노출되는 아미노산 잔기를 개변하여 항체 분자 표면 전하를 조절하는 방법이 알려져 있다(WO2007/114319 및 WO2009/041543). 구체적으로는 항체가 갖는 등전점(pI)의 값을 저하시킴으로써 항체의 혈장 중 반감기를 신장시키는 것이 가능한 것이 알려져 있다. 그와는 반대로 항체의 등전점이 상승함으로써 혈장 중 반감기가 단축되어 항체의 조직 이행성이 향상되는 것이 알려져 있다(Vaisitti 등(J. Biol. Regul. Homeost. Agents. (2005) 19 (3-4), 105-112), Pardridge 등(J. Pharmacol. Exp. Ther. (1998) 286 (1), 548-554)).
이상의 사실로부터 등전점을 변화시킨 EP27 인간화 항체는 혈장 중 반감기의 신장 또는 조직 이행성의 향상에 의해 보다 강한 항종양 활성이 기대된다. 이에 EP27 인간화 항체의 항원에 대한 결합활성이나 그 입체구조에 영향을 미치지 않고 항체 분자 표면의 전하를 조절함으로써 항체의 약물동태를 제어하는 것이 가능해지는 아미노산 잔기의 동정이 시도되었다. 구체적으로는 EP27 인간화 항체 HY-G1d/LB-k(H쇄 HY-G1d, 서열번호：38 및 L쇄 LB-k, 서열번호：29)의 항원 결합 저해 활성을 크게 저하시키지 않고 그 등전점을 저하시키는 것이 가능한 변이 개소가 탐색되었다.
EP27 인간화 항체 HY-G1d/LB-k의 입체구조 모델을 사용하여 에피레귤린에 대한 결합을 크게 저하시키지 않고 가변영역의 등전점을 변화시킬 수 있는 잔기가 스크리닝되었다. 구체적으로는 표 9에 나타내어진 CDR 서열(서열번호：59~71) 중 어느 하나 또는 복수를 포함하는 H쇄 유전자로서 H3-G1d(서열번호：72), H5-G1d(서열번호：73), H6-G1d(서열번호：74), H7-G1d(서열번호：75), H8-G1d(서열번호：76), H9-G1d(서열번호：77), H10-G1d(서열번호：78), H31-G1d(서열번호：79)가 디자인되었다. 마찬가지로 표 9에 나타내어진 CDR 서열을 포함하는 L쇄 유전자로서 L1-k(서열번호：80), L2-k(서열번호：81), L12-k(서열번호：82), L20-k(서열번호：83), L21-k(서열번호：84), L23-k(서열번호：85)가 디자인되었다. 참고실시예 1의 수법에 의해 잔기 치환이 도입된 H쇄 유전자 벡터를 LB-k 벡터와 공발현하여 EP27 인간화 항체 H3-G1d/LB-k, H5-G1d/LB-k, H6-G1d/LB-k, H7-G1d/LB-k, H8-G1d/LB-k, H9-G1d/LB-k, H10-G1d/LB-k, H31-G1d/LB-k가 얻어졌다. 마찬가지로 잔기 치환이 도입된 L쇄 유전자 벡터를 HY-G1d 벡터와 공발현하여 EP27 인간화 항체 HY-G1d/L1-k, HY-G1d/L2-k, HY-G1d/L12-k, HY-G1d/L63-k가 얻어졌다. 얻어진 항체의 인간 에피레귤린에 대한 결합능이 키메라 항체 EP27에 대한 에피레귤린 결합 저해(참고실시예 23)로서 평가되었다. 그 결과, 표 10에 나타내어진 바와 같이, 각 EP27 인간화 항체의 항원 결합능은 키메라 항체 EP27과 동등하였다. 상기 검토로부터 항체의 등전점이 변화될 수 있는 EP27 인간화 항체 서열이 발견되었다.
Figure pct00012
Figure pct00013
(IC50 농도：키메라 항체 EP27(cH-G1/cL-k)의 IC50 농도를 100으로 한 경우의 각 항체의 IC50 농도)
〔참고실시예 4〕회합체량을 저감시키는 변이의 도입
단백질 의약품의 회합체량을 조절하는 것은 품질 관리상, 또한 약효 및 면역원성에 미치는 영향을 고려한 경우 매우 중요하다(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 708-714). 일반적으로 회합화는 단백질 용액 환경에 기인하는 콜로이드 안정성과 단백질 구조에 기인하는 입체 배좌 안정성의 양쪽에 영향을 받는다(J. Pharm. Sci. (2010) 100 (4), 1306-1315). 항체 제제의 처방 검토에 의해 항체농도나 pH, 완충액종, 이온강도, 첨가제 등을 스크리닝함으로써 콜로이드 안정성에 유효한 바람직한 조건을 얻는 것이 가능하다. 한편 입체 배좌 안정성은 아미노산 서열에 의존하는 부분도 있어 항체의 경우는 CDR의 정규 구조나 FR의 공통서열, VH/VL 계면 등의 특징적인 구조를 유지하는 것이 중요하다고 여겨지는 것으로 생각된다(Jung 등(J. Mol. Biol. (2001) 309 (3), 701-716), Xiang 등(J. Mol. Biol. (1995) 253 (3), 385-390), Ewert 등(Methods. (2004) 34 (2), 184-199), Vargas-Madrazo 등(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120), Morea 등(J. Mol. Biol. (1998) 275, 269-294), Vargas-Madrazo 등(J. Mol. Recognit. (2003) 16 (3), 113-120)).
상기의 관점으로부터 본 발명에서는 보다 구조적으로 안정하다고 생각되는 인간화 항체의 제작을 목표로 한 디자인이 행해졌다. 그 결과, EP27 인간화 항체 HY-G1d/LB-k가 발견되었다. HY-G1d/LB-k에 포함되는 회합체량을 더욱 줄이기 위해, HY-G1d/LB-k의 CDR 내에 포함되는 소수성 잔기를 친수성 잔기로 치환하여 분자간의 소수성 상호작용을 감약시키는 것에 의한 회합화 억제효과가 검토되었다.
구체적으로는 EP27 인간화 항체 HY-G1d/LB-k(H쇄 HY-G1d/서열번호：38, L쇄 LB-k/서열번호：29)에 대해 표 11에 나타내어진 CDR 서열(서열번호：86~91) 중 어느 하나가 도입된 H쇄 유전자로서 H25-G1d(서열번호：92), H41-G1d(서열번호：93), H42-G1d(서열번호：94), H43-G1d(서열번호：95), H44-G1d(서열번호：96), H45-G1d(서열번호：97)가 디자인되었다. 참고실시예 1의 수법에 의해 잔기가 치환된 H쇄 유전자 벡터를 LB-k 벡터와 공발현하여 EP27 인간화 항체 H25-G1d/LB-k, H41-G1d/LB-k, H42-G1d/LB-k, H43-G1d/LB-k, H44-G1d/LB-k, H45-G1d/LB-k가 얻어졌다. 이들 EP27 인간화 항체에 포함되는 회합체량을 겔여과 크로마토그래프법(참고실시예 27)에 의해 측정한 결과를 표 12에 나타내었다. 이것으로부터 키메라 항체 EP27(cH-G1d/cL-k)과 비교하여 대폭으로 회합체량이 감소된 EP27 인간화 항체 서열이 발견되었다.
Figure pct00014
Figure pct00015
또한 얻어진 항체의 인간 에피레귤린에 대한 결합능이 키메라 항체 EP27에 대한 에피레귤린 결합 저해(참고실시예 23)로서 평가되었다. 표 13에 나타내어지는 바와 같이, 각 EP27 인간화 항체의 항원 결합능은 키메라 항체 EP27과 동등하였다. 상기 검토로부터, 그 회합체량이 억제되고 키메라 항체 EP27과 동등한 항원 결합능을 갖는 EP27 인간화 항체 서열이 발견되었다.
Figure pct00016
(IC50 농도：키메라 항체 EP27(cH-G1/cL-k)의 IC50 농도를 100으로 한 경우의 각 항체의 IC50 농도)
또한 참고실시예 1~4에서 발견된 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 서열이 임의로 조합된 EP27 인간화 항체로서 디자인된 아래의 항체；
H87-G1d/LB-k(H쇄：서열번호：98, L쇄：서열번호：29),
H87-G1d/L21-k(H쇄：서열번호：98, L쇄：서열번호：84),
H87-G1d/L37-k(H쇄：서열번호：98, L쇄：서열번호：99)
가 참고실시예 1의 방법으로 제작되었다. 인간 에피레귤린에 대한 결합능이 키메라 항체 EP27에 대한 에피레귤린 결합 저해(참고실시예 23)로서 평가되었다. 그 결과, 표 14에 나타낸 바와 같이, 어느 항체도 키메라 항체 EP27(cH-G1/cL-k)과 동등한 결합능을 가지고 있었다. 또한 이들 EP27 인간화 항체에 포함되는 회합체량이 겔여과 크로마토그래프법(참고실시예 27)으로, Fab의 열 변성 중간온도(Tm)가 시차주사 열량 분석계(참고실시예 28)로, 추가로 등전점(pI)이 등전점 전기영동법(참고실시예 29)에 의해 측정되었다. 표 14에 나타낸 바와 같이, 키메라 항체 EP27(cH-G1d/cL-k)과 비교하여 그 회합체량이 대폭 감소되고 그 Tm값은 상승하는 것이 확인되었다. 이것으로부터 참고실시예 1~4에서 나타내어진 인간화에 의한 면역원성 리스크 저감, 화학적 분해의 억제, 등전점의 저하, 회합체량의 저감이 달성된 EP27 인간화 항체 서열이 발견되었다.
Figure pct00017
(IC50 농도：키메라 항체 EP27(cH-G1/cL-k)의 IC50 농도를 100으로 한 경우의 각 항체의 IC50 농도)
〔참고실시예 5〕원숭이 항원 결합능의 개선 및 면역원성을 저감시키는 변이의 도입
의약품을 개발할 때, 일반적으로 전임상 시험에서의 독성·안전성 평가는 임상 시험에서의 투여량 결정이나 각종 리스크 평가를 위한 중용한 검토로 생각된다. 항체 의약품의 경우, 그 항원 결합 특이성으로부터 전임상 시험에 사용하는 동물종의 선택이 한정되는 경우가 있어, 대부분의 경우 인간과 유전자적으로 가까운 영장류가 선택된다. 그러나 목적으로 하는 항체가 영장류의 항원과 결합하지 않거나 또는 그 결합능이 인간 항원에 대한 결합능과 비교하여 현저히 상이한 경우, 영장류를 사용한 평가가 타당하다고는 판단되지 않는 경우가 있다. 이러한 사례에 대응하기 위해, 사용하는 동물종의 항원과 결합하는 대리 항체(surrogate antibody)를 사용하거나 인간 항원 형질전환 동물을 사용함으로써 전임상 시험에서의 독성·안전성을 평가하는 시도가 이루어지고 있다(Chapman 등(Nat. Rev. Drug Discov. (2007) 6, 120-126)).
목적으로 하는 항체의 항원 결합능을 변화시키는 방법으로서는 파지 라이브러리(Phage library)나 리보솜 디스플레이(Ribosome display)를 사용한 친화도 성숙(affinity maturation) 등 당업자 공지의 방법에 의한 아미노산 잔기의 치환이 유효한 것으로 알려져 있다. 또한 항원과 항체 가변영역 결합 부위의 입체구조로부터 계산 과학적 수법에 의해 종 교차성을 개선시키는 것도 가능하다(Farady 등, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19 (2009) 3744-3747). 그러나 대규모의 스크리닝이나 계산 과학적 수법에 의존하지 않고 항인간 에피레귤린 항체의 항원에 대한 결합능을 변화시킨 보고는 없다. 또한 원숭이 에피레귤린과 인간 에피레귤린의 구조상의 상위도 명확하지 않기 때문에, 항인간 에피레귤린 항체의 어느 아미노산 잔기를 개변하면 원숭이 에피레귤린에 대한 결합활성을 증강시킬 수 있는 것인가 등의 안내는 전혀 나타내어져 있지 않았다. 본 발명에서는 CDR의 임의의 부위의 아미노산 잔기가 치환된 복수의 항체 서열이 디자인되었다. 참고실시예 1의 수법으로 이들 잔기가 치환된 항체 유전자의 제작과 항체 발현을 행하였다. 구체적으로는 표 15에 나타내어지는 H쇄 CDR2 및 CDR3, L쇄 CDR3가 Arg 잔기로 치환된 서열이 디자인되고, 표 16에 나타내는 항체가 제작되었다. 인간 및 원숭이 에피레귤린에 대한 어피니티는 표면 플라즈몬 산란을 이용한 장치(BIACORE)를 사용하여 평가되었다(참고실시예 24).
그 결과, 키메라 항체 EP27과 비교하여 인간 에피레귤린에 대한 어피니티가 저하되지 않고, 원숭이 에피레귤린에 대한 어피니티가 증강되어, 원숭이 에피레귤린과 인간 에피레귤린의 교차성을 나타내는 지표인 어피니티비(=원숭이 에피레귤린에 대한 KD값/인간 에피레귤린에 대한 KD값)가 작은 EP27 인간화 항체 서열이 발견되었다(도 1 및 2).
Figure pct00018
Figure pct00019
또한 의료용 의약품의 개발에 있어서 투여 후의 의약품에 대한 항체의 출현은 약효, 안전성 상의 과제이다. 이 때문에 목적으로 하는 의약품의 면역원성을 저하시키는 조작이 중요하다. 생물학적 제제(biologics)의 면역원성을 예측하는 수법으로서는 인 비보(in vivo), 인 비트로(in vitro), 인 실리코(in silico)의 수법이 존재하고, 실제 임상에 있어서의 항의약품 항체의 출현률과의 상관에 대해서도 보고가 이루어져 있다(Baker 등(Curr. Drug Saf. (2010) 5 (4), 308-313, Bryson 등(BioDrugs. (2010) 24 (1), 1-8), Groot 등(Curr. Opin. Pharmacol. (2008) 8 (5), 620-626). 본 발명에 있어서도 참고실시예 31에 기재된 수법으로 T-cell epitope를 예측함으로써, 목적으로 하는 항체의 항원 결합능을 손상시키지 않고 또한 면역원성 리스크를 저하시키는 EP27 인간화 항체 서열이 예측 가능하다.
참고실시예 1~4에서 발견된 개변을 포함하는 서열에 대해, 원숭이 에피레귤린에 대한 어피니티의 개선 및/또는 면역원성을 저감시키는 변이가 임의로 조합된 서열이 디자인되었다. 이렇게 하여 디자인된 표 17(서열번호：115~150)에 나타내어지는 EP27 인간화 항체가 참고실시예 1의 방법으로 제작되었다. 표 17에 기재된 EP27 인간화 항체의 변이 CDR 서열을 표 18에 나타내었다. 인간 및 원숭이 에피레귤린에 대한 어피니티의 평가는 표면 플라즈몬 산란을 이용한 장치(BIACORE)가 사용되었다(참고실시예 24). 도 3에 나타낸 바와 같이, 각 EP27 인간화 항체의 인간 에피레귤린에 대한 어피니티는 키메라 항체 EP27(cH-G1/cL-k)의 affinty와 동등하였다. 또한 원숭이 항원과 인간 항원의 어피니티의 차를 나타내는 지표로서 어피니티비(=원숭이 에피레귤린에 대한 KD값/인간 에피레귤린에 대한 KD값)를 비교한 바, 키메라 항체와 비교하여 각 EP27 인간화 항체의 양 항원에 대한 어피니티의 차가 크게 감소하는 것이 확인되었다(도 4). 이것으로부터 인간 에피레귤린에 대한 어피니티를 저하시키지 않고 원숭이 에피레귤린에 대한 어피니티가 개선된 EP27 인간화 항체 서열이 발견되었다.
Figure pct00020
Figure pct00021
또한 이들 EP27 인간화 항체에 포함되는 회합체량이 겔여과 크로마토그래프법(참고실시예 27)으로, 이들 EP27 인간화 항체로부터 조제된 Fab의 열 변성 중간온도(Tm)가 시차주사 열량 분석계(참고실시예 28)에 의해 측정되었다. 표 19에 나타낸 바와 같이, 키메라 항체 EP27(cH-G1d/cL-k)과 비교하여 회합체량이 대폭 감소되고 Tm값이 상승하는 것이 확인되었다. 이것으로부터 참고실시예 1~5에 나타내어진 인간화에 의한 면역원성 리스크 저감, 화학적 분해의 억제, 등전점의 저하, 회합체량의 저감, 원숭이 항원에 대한 결합능의 개선이 포함된 EP27 인간화 항체 서열이 발견되었다.
Figure pct00022
(KD비는 cH-G1/cL-k를 1로 했을 때의 상대비를 나타낸다.)
〔참고실시예 6〕인간 말초혈 단핵구를 이펙터 세포로서 사용한 각 피험 항체의 ADCC활성
인간 말초혈 단핵구(이하, 인간 PBMC로 지칭한다.)를 이펙터 세포로서 사용하여 각 피험 항체의 ADCC활성이 아래와 같이 측정되었다. 인간 유래 이펙터 세포는 인간 말초혈로부터 채취한 단핵구 분획을 사용하였다. 그 결과, 시험에 사용된 모든 EP27 인간화 항체가 MIA PaCa-2 세포에 대해 ADCC를 유도하는 것이 명확해졌다(참고실시예 25)(도 5).
〔참고실시예 7〕항에피레귤린 단일클론 항체의 인간 또는 원숭이 에피레귤린에 의한 세포 증식 자극에 대한 중화활성의 측정
참고실시예 5에 있어서 원숭이와의 어피니티가 증강된 EP27 인간화 항체 서열이 발견되었다. 이에 세포에 있어서의 활성을 평가하기 위해 원숭이 및 인간 에피레귤린에 의한 세포 증식 자극에 대한 EP27 인간화 항체의 중화활성이 측정되었다. 세포는 BAF_EGFR을 사용하고, 금번 평가한 모든 EP27 인간화 항체는 인간 및 원숭이 에피레귤린에 의존한 EGFR_BAF 세포의 증식을 저해하는 중화활성이 검토되어(참고실시예 26), 어느 EP27 인간화 항체도 키메라 항체에 비해 원숭이 에피레귤린에 대한 중화활성이 증강되었다(도 6, 7).
〔참고실시예 8〕인 비보 모델을 사용한 EP27 인간화 항체의 약효 시험
인간 종양을 이식한 마우스 모델을 사용하여 참고실시예 6 및 참고실시예 7에 있어서 세포내에서 활성이 확인된 EP27 인간화 항체의 인 비보에서의 항종양 활성이 평가되었다(참고실시예 32). 평가된 MIA PaCa-2 및 DLD-1 인간 암세포 이식 마우스 모델에 있어서의 각 피험 항체의 항종양 효과는 투여 시료의 투여 최종일부터 7일 후의 종양 체적을 측정함으로써 평가되었다. 그 결과, 도 8에 나타내는 바와 같이 cH-G1/cL-k 항체, H206-G1d/L73-k 항체, H240-G1d/L73-k 항체의 각 항체가 10 ㎎/㎏으로 투여된 경우, 동물 모델에 있어서도 개변된 EP27 인간화 항체에 의한 우수한 약효가 확인되었다.
〔참고실시예 9〕항에피레귤린 항체를 사용한 면역조직화학적 염색
EP27 항체를 사용하여 항원 발현량을 반영한 면역조직화학적 염색방법이 확립되었다. 발현량이 상이한 EREG 강제 발현 세포주인 SKE-18(그의 항원량은 7.7×103으로 추산되었다), SKE-23(그의 항원량은 6.1×104으로 추산되었다), SKE-4B2(그의 항원량은 2.9×105으로 추산되었다)와 숙주세포의 SK-HEP-1(항원량 8.4×102)이 scid 마우스에 이식된 조직의 파라핀 포매 블록을 사용하여 면역조직화학적 염색이 행해졌다. 이들 파라핀 블록으로부터 제작된 얇게 잘린 조직 절편에 있어서의 EREG의 발현이 EP27 항체를 1차 항체로 하는 인큐베이션 후에 2차 항체로서 토끼 항마우스 IgG 다중클론 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories), 3차 항체로서 폴리머-HRP(Dako cytomation)와 결합한 염소 항토끼 IgG 항체와 반응시킴으로써 디아미노벤지딘을 기질로 하여 가시화되었다. 도 10으로 나타낸 바와 같이, 염색된 세포·조직은 EREG의 발현량에 따라 염색성의 계조성(階調性)이 확인되었다. 또한 이들 세포의 발현량에 따른 H240-G1d/L73-k 항체의 인 비트로에서의 ADCC활성이 확인되었다(도 11). 상기 시험에 있어서는 H240-G1d/L73-k 항체로서 저푸코오스 항체가 사용되었다. 당해 저푸코오스 항체는 WO2004/065540에 기재된 방법에 따라 제작되었다. 이하에서는 당해 저푸코오스 항체는 EP27 인간화 글리코맵 항체로도 지칭된다. 상기 4개의 EREG 강제 발현 세포주에 더하여 항원량이 2.8×104으로 추산된 SKE-10 및 SKE-15에 대한 H240-G1d/L73-k 항체의 인 비트로에서의 ADCC활성이 확인되었다. 도 11과 동일하게 이들 세포의 발현량에 따른 H240-G1d/L73-k 항체의 인 비트로에서의 ADCC활성이 확인되었다(표 20). 또한 이들 세포의 발현량에 따른 H240-G1d/L73-k 항체의 인 비보에서의 종양 증식 억제활성도 확인되었다(도 12). 즉 면역조직화학적 염색법에 의한 EREG 발현량의 평가와 약효 사이에 상관이 확인되었다.
Figure pct00023
〔참고실시예 10〕임상 저분화 대장암에 있어서의 EREG의 발현
저분화 대장암의 임상 9증례에서의 EREG 발현을 검토하기 위해 동 증례의 얇게 자른 파라핀 포매 표본을 참고실시예 9에 기재되는 염색법으로 염색한 바, 7/9증례에서 명확한 양성상(positive image)이 확인되었다(도 13).
〔참고실시예 11〕대장암 줄기세포의 종양 생착에 대한 EP27 인간화 글리코맵 항체의 약효
인간 대장암 종양 모델 PLR123(WO02012/046797)으로부터 단리된 세포수 1×106의 대장암 줄기세포가 서혜부에 이식된 SCID 마우스에 당해 줄기세포의 투여 다음날부터 EP27 인간화 글리코맵 항체가 10 ㎎/㎏으로 주 1회 투여되었다. 그 결과, 윌콕슨의 부호 순위 검정(SAS 시스템 8.02 TS 레벨 02M0 및 SAS 전임상 팩키지 Version 5.00.010720)을 행한 바, 이식 후 29일째에서 도 14에 나타내는 바와 같이 항체군에서는 대조군과 비교하여 유의하게 종양 생착이 억제되어 있는 것이 확인되었다.
〔참고실시예 12〕대장암 줄기세포의 전이에 대한 EP27 인간화 글리코맵 항체의 약효
인간 대장암 종양 모델 PLR123으로부터 단리된 세포수 2×106의 대장암 줄기세포가 꼬리정맥으로부터 이식된 SCID-beige 마우스에 당해 줄기세포의 투여 3일 후에 EP27 인간화 글리코맵 항체가 10 ㎎/㎏으로 주 1회 투여되었다. 그 결과, 이식 후 52일째에서 도 15에 나타내는 바와 같이 항체 투여군에서는 대조군과 비교하여 마우스 폐에 있어서의 종양 덩어리 수(전이병소 수) 및 종양 덩어리 크기(전이병소 직경)가 유의하게 억제되어 있는 것이 확인되었다.
〔참고실시예 13〕저분화 대장암에 대한 EP27 인간화 글리코맵 항체의 약효
인간 저분화 대장암 종양 COL-53-JCK(실험동물 중앙연구소)의 종양 조직편이 이식된 SCID 마우스에 당해 종양 조직편의 이식 후 14일째부터 EP27 인간화 글리코맵 항체가 10 ㎎/㎏으로 주 1회 투여되었다. 그 결과, 당해 항체의 투여 개시 후 14일째에 종양 체적을 평가한 바 항체 투여군에서는 대조군과 비교하여 유의하게 종양 체적이 억제되어 있는 것이 확인되었다(도 16).
〔참고실시예 14〕중분화 대장암에 대한 EP27 인간화 글리코맵 항체의 약효
인간 중분화 대장암 종양 모델인 PLR379(PCT/JP2012/072852)에 있어서의 종양은 종양 발아(Tumor budding)가 관찰되는 형태 상의 특징을 갖는데, 에피레귤린의 발현은 종양 발아 부위에 상관없이 검출된다. 당해 PLR379의 종양 조직편이 이식된 SCID 마우스에 당해 종양 조직편의 이식 후 21일째부터 EP27 인간화 글리코맵 항체가 10 ㎎/㎏으로 주 1회 투여되었다. 당해 항체의 투여 개시 후 18일째에 종양 체적을 평가한 바 항체 투여군에서는 대조군과 비교하여 유의하게 종양 체적이 억제되어 있는 것이 확인되었다(도 17).
〔참고실시예 15〕임상 폐선암에 있어서의 EREG의 발현
폐선암의 임상 7증례에서의 EREG 발현을 검토하기 위해 동 증례의 얇게 자른 파라핀 포매 표본이 참고실시예 9에 기재된 염색법으로 염색되었다. 그 결과, 4/7증례에서 명확한 양성상이 확인되었다(도 18).
〔참고실시예 16〕인간 말초혈 단핵구를 이펙터 세포로서 사용한 EP27 인간화 글리코맵 항체의 ADCC활성
인간 폐선암주 Calu-3에 대해 인간 PBMC를 이펙터 세포로서 사용한 ADCC활성이 평가되었다. 그 결과, EP27 인간화 글리코맵 항체가 Calu-3 세포에 대해 ADCC를 유도하는 것이 확인되었다(도 19).
〔참고실시예 17〕폐선암에 대한 EP27 인간화 글리코맵 항체의 약효
인간 폐선암 모델 Calu-3의 종양 조직편이 이식된 SCID 마우스에 당해 종양 이식편의 이식 후 13일째부터 EP27 인간화 글리코맵 항체가 10 ㎎/㎏으로 주 1회 투여되었다. 당해 항체의 투여 개시 후 28일째에 종양 체적을 측정한 바 항체 투여군에서는 대조군과 비교하여 유의하게 종양 증식이 억제되어 있는 것이 확인되었다(도 20).
〔참고실시예 18〕EP27 인간화 항체의 세포 내재화
EP27 인간화 항체의 세포 내재화는 아래의 시스템으로 평가되었다. 1차 항체가 내재화되면 2차 항체에 포합(抱合)된 리보솜 불활성화 단백질 사포린은 2차 항체의 1차 항체로의 결합을 매개로 세포내로 수송된다. 내재화되면 사포린은 IgG 포합체로부터 분리되어 단백질 합성을 저해하고, 최종적으로 세포사를 일으키게 된다. 각 웰당 EREG를 발현하는 세포주 DLD-1 또는 대조로 하는 세포주 SK-HEP1이 각각 1×103 세포의 세포밀도로 파종된 96-well 마이크로플레이트의 각 웰에 파종 다음날에 1차 항체로서 EP27 인간화 글리코맵 항체, 2차 항체로서 리보솜 불활성화 단백질이 결합한 인간 단일클론 항체를 인식하는 염소 IgG, Hum-ZAP(Advanced Targeting Systems)가 첨가되었다. 첨가 4일 후에 WST8(Dojindo)로 세포 생존율이 평가되었다. 도 21에 나타내는 바와 같이 EP27 인간화 글리코맵 항체는 EREG를 발현하는 세포주 DLD-1에 대해서만 세포상해를 일으켰다. 한편으로 대조로서 사용된 세포주 SK-HEP1에 대해서는 세포상해를 일으키지 않았다.
〔참고실시예 19 〕인간 및 게잡이원숭이 에피레귤린 유전자의 단리
전장 인간 EREG cDNA(CR541887, 서열번호：169)는 통상의 방법에 의해 단리되고, 그 유전자 단편이 포유 세포 발현용 벡터(pMCN)에 클로닝된 플라스미드가 hEREG/pMCN으로 명명되었다. pMCN은 mouse CMV 프로모터(ACCESSION No. U 68299)하에서 외래 유전자를 발현 유도시키는 것이 가능하며, 또한 네오마이신 내성 유전자가 삽입된 벡터이다. 전장 게잡이원숭이 EREG cDNA는 빨간털원숭이 EREG cDNA(XM_001102069) 서열정보를 토대로, 게잡이원숭이 cDNA 라이브러리로부터 통상의 방법에 의해 단리된 유전자 단편(서열번호：165를 코드하는 유전자 단편)이 포유 세포 발현용 벡터(pMCN)에 클로닝된 플라스미드가 cyEREG/pMCN으로 명명되었다. hEREG/pMCN 및 cyEREG/pMCN이 CHO 세포 DG44주(Invitrogen)로 전기천공에 의해 도입되고, 500 ㎍/mL Geneticin으로의 선발에 의해 전장 인간 EREG 정상(定常) 발현 CHO 세포 및 전장 게잡이원숭이 EREG 정상 발현 CHO가 수립되어, 각각 hEREG_DG 및 cyEREG_DG로 명명되었다.
〔참고실시예 20 〕인간 및 게잡이원숭이 성숙형 에피레귤린 발현방법의 수립
인간 및 게잡이원숭이 에피레귤린 유전자의 성숙형 인간 EREG 세포외영역(각각 서열번호：170 및 서열번호：34로 표시되는 폴리펩티드의 N말단에 서열번호 171의 서열이 융합된 폴리펩티드)의 C말단에 6개의 히스티딘 반복 서열을 발현하는 cDNA가 PCR법에 의해 증폭되었다. 이들이 각각 삽입된 포유동물 세포용 발현 벡터가 제한효소로 직쇄상으로 된 후, Free style 293 세포에 293 펙틴을 사용하여 도입함으로써 인간 및 게잡이원숭이 성숙형 에피레귤린을 일과성으로 발현시켰다.
〔참고실시예 21〕 에피레귤린의 조제
성숙형 인간 에피레귤린 유전자 및 성숙형 게잡이원숭이 에피레귤린 유전자가 각각 포유동물 세포용 발현 벡터에 삽입되었다. 각 유전자를 하기 방법으로 발현시킨 동물세포의 배양액으로부터 단리된 성숙형 인간 EREG-6His 및 게잡이원숭이 EREG-6His 융합 단백이 정제되었다.
포유동물 세포용 발현 벡터에 성숙형 인간 EREG 세포외영역(서열번호：34의 N말단에 서열번호：171의 서열이 융합된 폴리펩티드)과 6개의 히스티딘 영역이 인프레임으로 연결된 hsEREG-6His 발현 벡터가 구축되었다(발현된 융합 폴리펩티드는 이하 hsEREG-His로 불린다). 포유동물 세포용 발현 벡터에 성숙형 게잡이원숭이 EREG 세포외영역(서열번호：170의 N말단에 서열번호：171의 서열이 융합된 폴리펩티드)과 6개의 히스티딘 영역이 인프레임으로 연결된 csEREG-6His 발현 벡터가 구축되었다(발현된 EREG는 이하 cysEREG-His로 불린다). hsEREG-6His 발현 벡터 및 csEREG-6His 발현 벡터는 FreeStyle 293 세포(Invitrogen)로 293fectin(Invitrogen)에 의해 도입되어, 형질 도입주가 500 ㎍/mL 제오신으로의 선발에 의해 37℃의 8%CO2 인큐베이터 중에서 6일간 배양되었다.
다음으로 배양상청으로부터 hsEREG-His와 cysEREG-His가 정제되었다. 배양상청에 대해 최종농도 10 mM 이미다졸이 되도록 4 M 이미다졸이 첨가된 혼합액은 HisMicroSpin Purification System(Amersham)의 Ni 레진과 혼합되었다. 당해 레진을 20 mM 이미다졸 및 50 mM 이미다졸로 세정 후, 200 mM 이미다졸로 hsEREG-His 또는 cysEREG-His가 용출되고(용출 분획 1), 계속해서 400 mM 이미다졸로 hsEREG-His 또는 cysEREG-His가 용출되었다(용출 분획 2). 다음으로 용출된 hsEREG-His 또는 cysEREG-His를 포함하는 완충액은 Bio-tech 투석 컵 MWCO8000을 사용하여 PBS로 투석 치환되었다. 정제 단백의 정량은 280 nm의 파장으로부터 PACE법을 사용하여 그 함유 단백질량이 환산되었다.
정제 단백질의 전기영동 패턴을 (도 9)에 나타내었다.
〔참고실시예 22〕 에피레귤린 ELISA계 확립
성숙형 EGF 도메인 구조를 갖는 가용형 인간 EREG 단편(63Val로부터 108Leu에 상당하는 서열번호：34에 기재된 폴리펩티드)은 R&D Systems(cat.no. 1195- EP/CF)로부터 구입되었다. 가용형 인간 EREG 단편을 nunc 이뮤노 플레이트에 코트하고 BSA를 포함하는 용액으로 블로킹 후에 정제 항EREG 항체의 결합 반응성이 해석되었다. 정제 항EREG 항체를 첨가하고부터 1시간의 인큐베이션 후, 세정된 플레이트의 각 웰에 알칼리포스파타아제 표지한 항인간 IgG 항체(Zymed)를 첨가함으로써 반응이 실시되었다. 각 웰의 세정을 행한 후, 검출 시약 시그마 p-니트로페닐인산정(Sigma p-Nitrophenyl phosphate Tablets)을 첨가함으로써 항체 결합량이 측정되었다.
〔참고실시예 23〕경합 ELISA에 의한 에피레귤린 결합 저해계 확립
성숙형 EGF 도메인 구조를 갖는 가용형 인간 EREG 단편(63Val로부터 108Leu에 상당하는 서열번호：34에 기재된 폴리펩티드)은 R&D Systems(cat.no. 1195- EP/CF)로부터 구입되었다. 가용형 인간 EREG 단편을 nunc 이뮤노 플레이트에 코트하고 BSA를 포함하는 용액으로 블로킹 후에 마우스 하이브리도마 유래의 EP27에 대한 정제 인간화 항EREG 항체의 경합 결합 반응성이 해석되었다. 마우스 하이브리도마 유래의 EP27 및 정제 인간화 항EREG 항체를 첨가하고부터 2시간의 인큐베이션 후, 세정된 플레이트의 각 웰에 알칼리포스파타아제 표지한 항인간 IgG 항체(Zymed)를 첨가함으로써 반응이 실시되었다. 각 웰의 세정을 행한 후, 검출 시약 시그마 p-니트로페닐인산정(Sigma p-Nitrophenyl phosphate Tablets)을 첨가함으로써 항체 결합량(A405/655 검출값)이 측정되었다.
〔참고실시예 24〕항원 결합능 (어피니티 측정법 )의 확립
항EREG 항체의 항원에 대한 친화성과 결합속도상수를 BiacoreTM-T100(GE 헬스케어·재팬)에 의한 표면 플라즈몬 공명 어세이의 싱글-사이클 키네틱스법(single-cycle kinetics method)으로 측정하였다. 러닝버퍼에는 HBS-EP+(GE 헬스케어·재팬)를 사용하고 아민 커플링 키트(GE 헬스케어·재팬)를 사용하여 Protein A를 CM5 칩(카르복시메틸덱스트란 피복 칩)에 공유 결합시켰다. 러닝버퍼에는 HBS-EP+(GE 헬스케어·재팬)를 사용하고 아민 커플링 키트(GE 헬스케어·재팬)를 사용하여 Protein A를 CM5 칩(카르복시메틸덱스트란 피복 칩)에 공유 결합시켰다. 각 항EREG 항체는 Protein A에 약 350 RU 포착되도록 조제하였다. 애널라이트로서 사용한 인간 EREG 또는 게잡이원숭이 EREG는 HBS-EP+를 사용하여 0, 0.7, 1.4, 2.8, 5.6, 11.2 nM로 조제하였다. 측정은 먼저 항체 용액을 Protein A에 포착시키고, 추가로 유속 30 μL/min로 0.7, 1.4, 2.8, 5.6, 11.2 nM의 인간 EREG 또는 게잡이원숭이 EREG 용액을 각 3 min씩 연속해서 인젝션함으로써 반응시킨 후, HBS-EP+로 전환하여 15 min 해리상을 측정하였다. 해리상의 측정 종료 후, 25 mM NaOH로 세정하고 센서칩을 재생하였다. 농도 0의 측정은 동일하게 항체 용액을 Protein A에 포착시키고, HBS-EP+를 각 3 min씩 5회 연속해서 인젝션함으로써 반응시킨 후, HBS-EP+로 전환하여 15 min 해리상을 측정하였다. 해리상의 측정 종료 후, 25 mM NaOH로 세정하고 센서칩을 재생하였다. 얻어진 센서그램으로부터 Biacore 전용의 데이터 해석 소프트웨어인 Biacore T100 Evaluation Software Version 2.0.1을 사용해서 속도론적인 해석을 행하여 결합속도상수(ka), 해리속도상수(kd) 및 속도상수비를 산출하였다. 결과를 표 21에 나타내었다. 또한 측정값의 일간 차를 보정하기 위해 도 1~4, 표 16 및 19에서는 같은 날 측정한 대조 시료(cH-G1/cL-k)의 값을 1로 한 비를 나타내었다.
Figure pct00024
〔참고실시예 25〕 ADCC활성 측정법의 확립
인간 유래 이펙터 세포로서 인간 말초혈로부터 채취한 단핵구 분획이 사용되었다. 1,000 단위/mL의 헤파린 용액(노보·헤파린 주사 5천 단위, 노보·노르디스크)이 사전에 200 μL 주입된 주사기를 사용하여 건강한 정상인 자원봉사자(성인 남성)로부터 말초혈 50 mL가 채취되었다. PBS(-)로 2배로 희석된 당해 말초혈이 Ficoll-Paque PLUS를 사전에 주입하여 원심분리 조작이 행해졌다. Leucosep 림프구 분리관(Greiner bio-one)에 첨가되었다. 이를 원심분리(2150 rpm, 10분간, 실온)한 후, 단핵구 분획층이 분취되었다. 10% FBS/D-MEM으로 1회 세포를 세정한 후, 10% FBS/D-MEM으로 세포밀도를 5×106/mL로 조제함으로써 이펙터 세포 부유액이 조제되었다. 당해 세포 현탁액이 인간 PBMC 용액으로서 이후의 실험에 제공되었다.
표적 세포 부유액은 시험시에 사용시 조제되었다. 인간 췌장암 세포주 MIA PaCa-2 세포(ATCC)는 10%FBS, 2.5% 말혈청(Horse Serum), 4 mmol/L L-글루타민(L-Glutamine)(Invitrogen), 4.5 g/L 글루코오스(glucose)(Invitrogen), 1.5 g/L 중탄산나트륨(Sodium bicarbonate)(Invitrogen)을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Media)(Invitrogen)(이하, 계대용 배지라 한다.) 중에서 계대되어 유지되었다. 표지 시약은 12 μL의 4 ㎎/mL로 조제된 Calcein-AM/DMSO stock 용액(nacalai)을 포함하는 튜브에 10%FBS/D-MEM을 228 μL 첨가하고 가볍게 현탁하여 Calcein-AM 용액으로 하였다. 원심분리(1200 rpm, 5분간, 4℃)된 1×106개의 MIA PaCa-2 세포주에 대해, 상기와 같이 조제된 Calcein-AM 용액을 세포 펠릿 1×106/개당 200 μL로 첨가함으로써 세포 현탁액이 조제되었다. 당해 현탁액의 전량이 플라스틱 채혈관(일본 제약)에 옮겨져 37℃의 CO2 인큐베이터 중에서 2시간 배양되었다. 10%FBS/D-MEM으로 3회 세정된 세포를 20×104/mL(1×104/50 μL)가 되도록 10%FBS/D-MEM으로 현탁함으로써 표적 세포 부유액이 조제되었다.
표적 세포 부유액은 96 웰 바닥이 평평한 플레이트에 100 μL의 배지가 첨가되었다. 다음으로 항에피레귤린 단일클론 항체(H206-G1d/L73-k(서열번호：142/141), H240-G1d/L73-k(서열번호：150/141) 및 키메라 EP27(서열번호：32/33))를 배지에서 희석한 후에 당해 플레이트의 각 웰에 50 μL씩 첨가되었다. 항체는 최종농도 0.0001~10 ㎍/mL로 첨가되었다. 계속해서 PBMC 용액(1×107개/mL)이 각 웰에 50 μL씩 첨가되고, 당해 플레이트가 5% 탄산 가스 인큐베이터 중에서 37℃에서 4시간 정치되어, 특이적 칼세인-AM 유리율이 결정되었다. 플레이트를 원심분리(1200 rpm, 5분간, 실온)된 당해 플레이트의 각 웰로부터 회수된 100 μL의 상청의 형광강도(λex=490 nm, λem=515 nm)가 형광광도계를 사용하여 측정되었다. 하기 식(식 3)으로 특이적 칼세인 유리율을 구하였다.
(식 3)
Figure pct00025
A는 각 웰에 있어서의 형광강도, B는 50 μL의 10% FBS/D-MEM에 50 μL의 표적 세포 부유액과 100 μL의 NP-40 용액이 첨가된 웰에 있어서의 형광강도의 평균값, C는 50 μL 10% FBS/D-MEM에 50 μL의 표적 세포 부유액과 100 μL의 10% FBS/D-MEM이 첨가된 웰에 있어서의 형광강도의 평균값을 나타낸다. 시험은 N=3으로 행하고, 각 항체농도의 특이적 칼세인 유리율이 Microsoft Office Excel 2007을 사용하여 결정되었다.
〔참고실시예 26〕중화활성 측정법
(1) 인간 EGFR 키메라 수용체를 발현하는 Ba /F3 세포주(EGFR _ BAF)의 수립
통상의 방법으로 그 서열이 서열번호:166(GeneBank Acc. No. NM_005228)으로 나타내어지는 인간 EGF 수용체(이하, 「hEGFR」으로 기재한다.)가 단리된 후에 인간 EGF 수용체를 발현하는 벡터(pCXZD1/EGFR#3)가 제작되었다.
Pvu I으로 절단함으로써 직쇄화한 hEGFR 발현 벡터(pCXZD1/EGFR#3) 15 ㎍이 0.33 kV, 950 μFD의 조건하에서 Ba/F3 세포에 전기천공(Gene Pulser; BioRad)에 의해 도입되었다. 유전자가 도입된 세포는 10% FBS, 300 ㎍/mL 제오신 및 재조합체 인간 에피레귤린(R&D 시스템즈사, Cat:1195-EP/CF, 200 ng/mL)을 함유하는 RPMI1640 배지에서 선발되어 EGFR_BAF주의 단리가 행해졌다.
( 2) 항에피레귤린 항체의 인간 에피레귤린 또는 원숭이 에피레귤린 의존적인 EGFR_ BAF주의 세포 증식에 대한 중화활성
(1)에 기재된 방법으로 단리된 EGFR_BAF주를 사용하여 인간 에피레귤린 또는 원숭이 에피레귤린 의존성 세포 증식에 대한 항에피레귤린 항체의 중화활성을 측정하는 시험이 실시되었다. 배양 시의 인간 에피레귤린을 제거하기 위해 세포가 세정되고, 재차 hsEREG-His 또는 cysEREG-His(최종농도 2.5 ng/mL) 및 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에 현탁되어, 2×104세포/100 μL/well의 밀도로 96웰 플레이트에 파종되었다. 항에피레귤린 항체가 각 농도(0.014~30 ㎍/mL)로 배지에 의해 희석된 후에 세포에 첨가되고, 그 후 세포는 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 3일 배양되었다. 배양 후, Cell Counting Kit(도진 화학 연구소사)의 측정 시약을 첨가하여 2시간 발색을 행하고, 반응액의 흡광도(450/655 nm)가 Benchmark Plus(BIO-RAD사)를 사용하여 측정되었다. 항체농도 0 ㎍/mL의 수치를 대조값으로 하여 세포 증식 억제율(각 항체농도에 있어서의 OD값/대조의 OD값×100(%))이 산출되었다.
〔참고실시예 27〕겔여과 크로마토그래프법에 의한 회합체량의 측정
칼럼으로서 G3000SWXL(입자경 5 ㎛, 7.8 ㎜I.D.×30 ㎝, TOSOH 제조)을 사용하고, 이동상으로서 300 mM NaCl을 포함하는 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)을 사용한 겔여과 크로마토그래피에 의해 회합체량이 측정되었다. Alliance system(Waters 제조)에 접속된 칼럼이 유량 0.5 mL/min로 평형화된 후, 당해 칼럼에 5-10 ㎍의 항체 용액이 주입되었다. 항체의 용출이 자외 흡광도 검출기(215 또는 280 nm)로 검출되었다. 얻어진 크로마토그램으로부터 총 피크 면적에 포함되는 회합체 피크 면적의 존재비율이 산출되었다.
〔참고실시예 28〕시차주사 열량 분석계에 의한 열 변성 중간온도( Tm)의 측정
150 mmol/L의 염화나트륨을 포함하는 20 mol/L의 초산나트륨 완충 용액(pH 6.0)으로 조제된 투석 외액에 50-100 ㎍ 상당량의 항체 용액이 봉입된 투석막을 침지함으로써 하루 투석되었다. 투석 외액으로 항체농도가 50-100 ㎍/mL로 조제된 것이 시료 용액으로서 Tm값의 측정에 사용되었다.
적절한 DSC장치, 예를 들면 DSC-II(Calorimetry Sciences Corporation 제조), MicroCal VP-DSC(GE healthcare 제조)가 이 실험을 위해 사용 가능하다. 충분히 탈기된 시료 용액 및 참조 용액(투석 외액)을 각각 열량계 셀에 봉입함으로써 40℃에서 열평형화가 충분히 행해졌다. 다음으로 DSC 주사가 40℃~100℃에서 약 1K~2.5K/분 주사속도로 실시되었다. 결과는 온도의 함수로서의 변성 피크의 정점으로서 나타내어진다. 비특허문헌(Rodolfo 등, Immunology Letters, 1999년, p47-52)을 참고로 Fab 도메인의 피크 어사인을 행함으로써 시료의 열 변성 중간온도가 산출되었다.
〔참고실시예 29〕 등전점 전기영동에 의한 pI 측정
Phastsystem Cassette(AmerchamBioscience)를 사용하여 아래의 팽윤액 중에서 30 min 정도 Phast-Gel Dry IEF(AmerchamBioscience) 겔을 팽윤시켰다.
Figure pct00026
팽윤된 겔을 사용하여 PhastSystem(AmerchamBioscience)에 의해 아래의 프로그램으로 전기영동이 행해졌다. 샘플은 스텝 2에서 겔에 첨가되었다. pI 마커로서 Calibration Kit for pI(AmerchamBioscience)가 사용되었다.
Figure pct00027
Silver staining Kit, protein(AmerchamBioscience)을 사용하여 키트에 첨부되어 있는 프로토콜에 따라 20% TCA로 고정된 영동 후의 겔의 은염색이 행해졌다. 염색 후, pI 마커의 기지 등전점으로부터 샘플의 등전점이 산출되었다.
〔참고실시예 30〕아푸코실 항체 발현주의 구축
상동 염색체 상의 양쪽 푸코오스 트랜스포터 유전자의 발현이 인위적으로 억제되어 있는 세포에서는 푸코오스 트랜스포터의 기능이 저해된다. 이 세포를 사용함으로써 푸코오스가 결손된 항체를 얻는 것이 가능하다(WO2006/067913 등). 또한 베타 1,4-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 III(beta 1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III)와 골지 알파-만노시다제 II(Golgi alpha-mannosidase II)가 강제 발현되는 세포에서 항체를 생산시켜도 푸코오스가 결손된 항체를 얻는 것이 가능하다(Ferrara 등, Biotechnol. Bioeng. (2006) 93 (5), 851-861). 이들 당업자 공지의 수법에 의해 조제된 아푸코실화 EREG 항체가 검토에 사용되었다.
〔참고실시예 31〕인 실리코 면역원성 예측 툴 Epibase를 사용한 면역원성 리스크 평가
임상에 있어서의 항체 의약품의 유용성과 약효는 항의약품 항체(ADAs)에 의해 제한된다. ADAs는 항체 의약품의 약효 및 동태에 영향을 미쳐 때로는 심각한 부작용을 초래하는 경우가 있다. 면역원성에 영향을 미치는 인자는 다수 보고되어 있는데, 특히 T세포 에피토프가 항원에 포함되는 것이 중요한 것으로 알려져 있다. 이 T세포 에피토프를 예측하는 인 실리코 툴로서는 Epibase(Lonza), iTope/TCED(Antitope) 및 EpiMatrix(EpiVax) 등이 이용 가능하다. 이들 툴을 사용함으로써 목적으로 하는 단백질에 존재하는 T세포 에피토프를 포함하는 서열을 예측할 수 있는 것이 보고되어 있다(Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.).
Epibase Light(Lonza)는 FASTER algorism(Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.)을 사용하여 9-mer 펩티드와 major DRB1 대립 유전자(allele)의 결합능을 계산하는 인 실리코 툴이다. 본 툴은 MHC classII에 대한 강한 결합 및 중간 정도의 결합이 되는 T세포 에피토프를 동정할 수 있다.
각 개변 항체의 인 실리코 면역원성 스코어는 Epibase Light(Lonza) 시스템 내의 아래의 계산식(식 4)에 의해 구해진다.
(식 4)
Figure pct00028
계산에는 DRB1 알로타입의 존재비가 반영되고, 이것에는 아래에 나타내는 Caucasian에 있어서의 존재비를 사용할 수 있다.
DRB1*1501(24.5%), DRB1*0301(23.7%), DRB1*0701(23.3%), DRB1*0101(15.0%), DRB1*1101(11.6%), DRB1*1302(8.2%), DRB1*1401/1454(4.9%), DRB1*0901(2.3%), DRB1*1502(0.5%), DRB1*1202(0.1%)
각 개변 항체 서열 중에 포함되는 강한 결합과 중간 정도의 결합의 모든 에피토프를 FASTER algorism에 의해 구한 후, 인간 생식 계열(germ line) 서열 및 가변영역과 불변영역의 경계 서열을 제외한 것이 critical epitope로서 면역원성 스코어 계산에 사용된다. 스코어가 낮을수록 면역원성 리스크가 작은 서열로 생각된다.
〔참고실시예 32〕 인 비보 모델을 사용한 항에피레귤린 항체의 약효 시험
(1) 인 비보 모델에 대한 이식에 제공하는 세포주의 유지
인 비보 모델로서 MIA PaCa-2 세포(ATCC) 및 DLD-1(ATCC)이 사용되었다. MIA PaCa-2 세포는 10%FBS, 2.5% 말혈청, 4 mmol/l L-글루타민(Invitrogen), 4.5 g/l 글루코오스(Invitrogen), 1.5 g/l 중탄산나트륨(Invitrogen)을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Media)(Invitrogen)(이하, 계대용 배지라 한다.) 중에서 계대되어 유지되었다. DLD-1 세포는 10%FBS, 10 mmol/l HEPES(Invitrogen), 4.5 g/l 글루코오스(Invitrogen), 1 mmol/l 피루빈산나트륨(Sodium Pyruvate)(Invitrogen)을 포함하는 RPMI1640 배지(SIGMA)(이하, 계대용 배지라 한다.) 중에서 계대되어 유지되었다.
(2) MIA PaCa -2 및 DLD - 1 세포 증식 마우스 모델의 제작
MIA PaCa-2 및 DLD-1 세포의 세포 현탁액이 계대용 배지와 MATRIGEL Matrix(BD Bioscience)를 1:1로 포함하는 용액을 사용하여 5×107세포/mL가 되도록 조제되어 100 ㎕가 복강내로 투여된 SCID 마우스(암컷, 5주령)(일본 클레아)의 복부 피하로 당해 세포 현탁액 100 ㎕(5×106세포/마우스)가 이식되었다. 종양 체적은 식 5를 사용하여 산출되고, 종양 체적의 평균이 130-330 ㎣가 된 시점에서 모델이 성립된 것으로 판단되었다.
(식 5)
Figure pct00029
(3) 각 피험 항체 를 포함하는 투여 시료의 조제
cH-G1/cL-k 항체, H206-G1d/L7-3k 항체, H240-G1d/L73-k 항체의 각 항체를 포함하는 투여 시료가 그 투여 당일에 생리식염수를 사용하여 0.04 ㎎/mL(0.4 ㎎/㎏ 투여군) 또는 0.2 ㎎/mL(2 ㎎/㎏ 투여군)가 되도록 조제되었다.
(4) 항체를 포함하는 투여 시료의 투여
(2)에서 제작된 마우스 모델에 대한 MIA PaCa-2 세포의 이식 후 13일부터 주 1회씩 17일의 기간에 걸쳐, DLD 세포 상기 이식 후 12일부터 주 1회씩 14일의 기간에 걸쳐, (3)에서 조제된 투여 시료가 10 mL/㎏의 투여량으로 꼬리정맥으로부터 투여되었다. 음성 대조로서 생리식염수를 동일하게 주 1회씩 각각의 기간에 걸쳐 10 mL/㎏의 투여량으로 꼬리정맥으로부터 투여되었다. 어느 군도 5마리를 1군으로 하고, 각 군에 대해 각 피험 항체를 포함하는 투여 시료의 투여가 실시되었다.
(5) 각 피험 항체 의 항종양 효과의 평가
인간 암세포 이식 마우스 모델에 있어서의 각 피험 항체의 항종양 효과가 투여 시료의 투여 최종일로부터 3일 또는 7일 후의 종양 체적을 측정함으로써 평가되었다.
〔실시예 1〕임상 폐암에 있어서의 에피레귤린 단백질의 발현
임상 암조직을 사용한 면역조직화학적 염색을 사용하여 폐암의 대세포암, 다형암, 편평상피암에 있어서의 에피레귤린의 발현이 검토되었다. 인간 임상 폐암의 파라핀 블록으로 제작된 얇게 자른 조직 절편과 1차 항체로서 사용된 EP27 항체의 인큐베이션 후에, 2차 항체로서 토끼 항마우스 IgG 다중클론 항체(Jackson Imunoresearch Laboratories), 3차 항체로서 폴리머-HRP(Dako cytomation)와 결합한 염소 항토끼 IgG 항체와 당해 절편을 반응시켰다. 항체 간의 결합이 디아미노벤지딘을 사용하여 가시화되었다. 그 결과, 대세포폐암(신경내분비종양의 형태를 나타내지 않는 암) 4예, 다형암 3예, 편평상피암(기저세포서열이 불명료화되어 대형 각화상피가 기저막 부근 또는 그것을 넘어 침윤되는 형태의 암과, 균질한 세포가 중층되어 명료한 이행상 없이 편평화·호산성화·괴사되어 있어 분화 경향이 불명료한 형태의 암) 9예에 있어서 명확한 에피레귤린의 양성상이 확인되었다(도 22).
〔실시예 2〕폐 대세포암에 대한 항에피레귤린 항체의 항종양 효과
폐 대세포암에 대한 항에피레귤린 항체의 인 비보에서의 항종양 효과를 검토하기 위해, 에피레귤린을 발현하는 폐 대세포암주인 LC-GP-JCK주(공익재단법인 실험동물 중앙연구소)를 사용하여 다음에 나타내는 절차로 인 비보 모델이 제작되었다. SCID 마우스의 복부 피하로 이식된 LC-GP-JCK 종양으로부터 가로 세로 3 ㎜ 정도의 종양 덩어리가 적출되었다. 당해 종양 덩어리가 SCID 마우스(암컷, 6주령)(일본 클레아)의 복부 피하로 이식되었다. 종양 체적은 식 5를 사용하여 산출되고, 종양 체적의 평균이 300-400 ㎣가 된 시점에서 모델이 성립된 것으로 판단되었다(도 23B). 이 모델에서는 이식된 암세포가 임상암과 동일한 면역조직화학적 염색에 의해 에피레귤린 양성인 것이 확인되었다. 2 ㎎/㎏의 용량으로 EP27 인간화 글리코맵 항체가 1회/주로 2회에 걸쳐 본 모델의 정맥내에 투여되었다. 경시적으로 측정된 종양의 단경과 장경을 식 5에 적용시킴으로써 종양 체적이 산출되었다. 그 결과, 비히클 투여군(대조)과 비교하여 항에피레귤린 항체 투여군에서 유의하게 종양 체적이 작아, 항에피레귤린 항체에 의한 종양 증식 저해가 확인되었다(도 23A).
〔실시예 3〕폐 편평상피암에 대한 항에피레귤린 항체의 항종양 효과
폐 편평상피암에 대한 항에피레귤린 항체의 인 비보에서의 항종양 효과를 검토하기 위해 에피레귤린을 발현하는 편평상피암주인 SK-MES-1주(ATCC)를 사용하여 다음에 나타내는 절차로 인 비보 모델이 제작되었다. HBSS(Hanks' balanced salt solution)(SIGMA)와 매트리겔 매트릭스(MATRIGEL Matrix)(BD Bioscience)를 1:1로 포함하는 용액을 사용하여 5×107세포/mL가 되도록 조제된 SK-MES-1 세포의 세포 현탁액의 200 ㎕(1×107세포/마우스)가 SCID 마우스(암컷, 6주령)(일본 클레아)의 복부 피하로 이식되었다. 종양 체적은 식 5를 사용하여 산출되고, 종양 체적의 평균이 150-250 ㎣가 된 시점에서 모델이 성립된 것으로 판단되었다. 이 모델에서는 이식된 암세포가 임상암과 동일한 면역조직화학적 염색에 의해 에피레귤린 양성인 것이 확인되었다(도 24B). 본 모델에서 10 ㎎/㎏(0.2 mL/20 g 마우스)의 용량으로 EP27 인간화 글리코맵 항체가 본 모델의 정맥내에 투여되었다. 경시적으로 종양의 단경과 장경을 식 5에 적용시킴으로써 종양 체적이 산출되었다. 비히클 투여군과 비교하여 항에피레귤린 항체 투여군에서 유의하게 종양 체적이 작아, 항에피레귤린 항체에 의한 종양 증식 저해가 확인되었다(도 24A).
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA MIYAGI CANCER CENTER RESEARCH INSTITUTE <120> THERAPEUTIC AGENTS FOR NON-SMALL CELL LUNG CANCER EXCEPT FOR ADENOCARCINOMA COMPRISING HUMANIZED ANTI-EPIREGULIN ANTIBODIES AS ACTIVE INGREDIENTS <130> C1-A1303P <150> JP 2013-131249 <151> 2013-06-24 <160> 202 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr 20 25 30 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens 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<223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 93 Gln Asp Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Leu Asn Gly Asn Thr Lys Tyr His Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Gly Thr Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 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Asp Pro Leu Arg Arg Gln Thr Lys Tyr Lys Glu Lys Phe Glu 1 5 10 15 Gly <210> 160 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 160 Arg Ile Asp Pro Leu Arg Lys Gln Thr Lys Tyr Arg Glu Lys Phe Glu 1 5 10 15 Gly <210> 161 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 161 Arg Ile Asp Pro Leu Arg His Gln Thr Lys Tyr Arg Glu Lys Phe Glu 1 5 10 15 Gly <210> 162 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 162 Arg Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 163 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 163 Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Lys Tyr Ile Ala 1 5 10 <210> 164 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 164 Leu Gln Tyr Glu Gln Leu Arg Thr 1 5 <210> 165 <211> 169 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 165 Met Pro Ala Gly Arg Arg Met Glu Met Leu Ser Ala Gly Arg Val Pro 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Cys Leu Gly Phe His Leu Leu Gln Ala Val Leu Ser 20 25 30 Thr Thr Val Ile Pro Ser Cys Ile Pro Gly Glu Ser Ser Asp Asn Cys 35 40 45 Thr Ala Leu Val Gln Thr Glu Asp Asn Pro Arg Val Ala Gln Val Ser 50 55 60 Ile Thr Lys Cys Asn Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln 65 70 75 80 Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val 85 90 95 Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Tyr Leu Thr Val His Gln 100 105 110 Pro Leu Ser Lys Glu Tyr Val Ala Leu Thr Val Ile Leu Ile Ile Leu 115 120 125 Phe Leu Ile Ile Val Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Cys Arg Trp Tyr 130 135 140 Arg Asn Arg Lys Ser Lys Glu Pro Lys Lys Glu Tyr Glu Arg Val Thr 145 150 155 160 Ser Gly Asp Pro Glu Leu Pro Gln Val 165 <210> 166 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu 675 680 685 Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700 Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu 725 730 735 Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser 740 745 750 Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser 755 760 765 Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser 770 775 780 Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815 Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg 820 825 830 Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro 835 840 845 Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860 Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895 Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser 900 905 910 Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu 915 920 925 Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr 930 935 940 Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys 945 950 955 960 Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975 Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro 980 985 990 Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp 995 1000 1005 Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe 1010 1015 1020 Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu 1025 1030 1035 Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn 1040 1045 1050 Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg 1055 1060 1065 Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp 1070 1075 1080 Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro 1085 1090 1095 Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln 1100 1105 1110 Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro 1115 1120 1125 His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln 1130 1135 1140 Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala 1145 1150 1155 Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln 1160 1165 1170 Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys 1175 1180 1185 Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln 1190 1195 1200 Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210 <210> 167 <211> 169 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Met Thr Ala Gly Arg Arg Met Glu Met Leu Cys Ala Gly Arg Val Pro 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Cys Leu Gly Phe His Leu Leu Gln Ala Val Leu Ser 20 25 30 Thr Thr Val Ile Pro Ser Cys Ile Pro Gly Glu Ser Ser Asp Asn Cys 35 40 45 Thr Ala Leu Val Gln Thr Glu Asp Asn Pro Arg Val Ala Gln Val Ser 50 55 60 Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln 65 70 75 80 Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val 85 90 95 Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Thr Val His Gln 100 105 110 Pro Leu Ser Lys Glu Tyr Val Ala Leu Thr Val Ile Leu Ile Ile Leu 115 120 125 Phe Leu Ile Thr Val Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Cys Arg Trp Tyr 130 135 140 Arg Asn Arg Lys Ser Lys Glu Pro Lys Lys Glu Tyr Glu Arg Val Thr 145 150 155 160 Ser Gly Asp Pro Glu Leu Pro Gln Val 165 <210> 168 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 168 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 169 <211> 507 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 169 atgaccgcgg ggaggaggat ggagatgctc tgtgccggca gggtccctgc gctgctgctc 60 tgcctgggtt tccatcttct acaggcagtc ctcagtacaa ctgtgattcc atcatgtatc 120 ccaggagagt ccagtgataa ctgcacagct ttagttcaga cagaagacaa tccacgtgtg 180 gctcaagtgt caataacaaa gtgtagctct gacatgaatg gctattgttt gcatggacag 240 tgcatctatc tggtggacat gagtcaaaac tactgcaggt gtgaagtggg ttatactggt 300 gtccgatgtg aacacttctt tttaaccgtc caccaacctt taagcaaaga gtatgtggct 360 ttgaccgtga ttcttattat tttgtttctt atcacagtcg tcggttccac atattatttc 420 tgcagatggt acagaaatcg aaaaagtaaa gaaccaaaga aggaatatga gagagttacc 480 tcaggggatc cagagttgcc gcaagtc 507 <210> 170 <211> 46 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 170 Val Ser Ile Thr Lys Cys Asn Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His 1 5 10 15 Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys 20 25 30 Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Tyr Leu 35 40 45 <210> 171 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Met Val Leu Ser Thr Thr Val Ile Pro Ser Cys Ile Pro Gly Glu Ser 1 5 10 15 Ser Asp Asn Cys Thr Ala Leu Val Gln Thr Glu Asp Asn Pro Arg Val 20 25 30 Ala Gln <210> 172 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 172 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 173 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 173 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 174 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 174 Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 175 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 175 Leu Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 <210> 176 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 176 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Asn Ile Ala 1 5 10 <210> 177 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 177 Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro 1 5 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 178 Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 179 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 179 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 180 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 180 Glu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 181 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 181 Trp Lys Leu Gly Thr Tyr 1 5 <210> 182 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 182 Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 183 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 183 Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser 1 5 <210> 184 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 184 Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 185 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 185 Val Tyr Ser Leu His 1 5 <210> 186 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 186 Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ala Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 187 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 187 Glu Gly Asn Gly Asn Pro Leu Asp Tyr 1 5 <210> 188 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 188 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 189 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 189 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 190 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 190 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 191 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 191 Ser Tyr Gly Val His 1 5 <210> 192 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 192 Val Ile Trp Arg Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 193 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 193 Asn Trp Asn Gly Leu Met Asp Tyr 1 5 <210> 194 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 194 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 195 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 195 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 196 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 196 Gln Gln Gly His Thr Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 197 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 197 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 198 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 198 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 1 5 10 15 <210> 199 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 199 Val Met Ala Tyr 1 <210> 200 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 200 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser Leu Asn 1 5 10 <210> 201 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 201 Ala Thr Ser Asn Leu Asp Ser 1 5 <210> 202 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 202 Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Trp Thr 1 5

Claims (22)

  1. 항에피레귤린 항체(anti-Epiregulin antibody)를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항에피레귤린 항체가 세포 증식 저해 활성을 갖는 치료제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항에피레귤린 항체가 아래의 (1) 내지 (38) 중 어느 하나에 기재된 항체인 치료제:
    (1) CDR1으로서 서열번호：9에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：10에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：11에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：12에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：13에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：14에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
    (2) (1)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (3) (1)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (4) (1)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (5) (2)에 기재된 중쇄 및 (3)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (6) (2)에 기재된 중쇄 및 (4)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (7) CDR1으로서 서열번호：173에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：174에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：175에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：176에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：177에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：178에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
    (8) (7)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (9) (7)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (10) (7)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (11) (8)에 기재된 중쇄 및 (9)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (12) (8)에 기재된 중쇄 및 (10)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (13) CDR1으로서 서열번호：179에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：180에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：181에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：182에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：183에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：184에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
    (14) (13)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (15) (13)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (16) (13)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (17) (14)에 기재된 중쇄 및 (15)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (18) (14)에 기재된 중쇄 및 (16)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (19) CDR1으로서 서열번호：185에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：186에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：187에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：188에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：189에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：190에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
    (20) (19)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (21) (19)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (22) (19)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (23) (20)에 기재된 중쇄 및 (21)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (24) (20)에 기재된 중쇄 및 (22)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (25) CDR1으로서 서열번호：191에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：192에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：193에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：194에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：195에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：196에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
    (26) (25)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (27) (25)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (28) (25)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (29) (26)에 기재된 중쇄 및 (27)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (30) (26)에 기재된 중쇄 및 (28)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (31) CDR1으로서 서열번호：197에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：198에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：199에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 CDR1으로서 서열번호：200에 기재된 아미노산 서열, CDR2로서 서열번호：201에 기재된 아미노산 서열 및 CDR3로서 서열번호：202에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
    (32) (31)에 기재된 항체로서, CH로서 서열번호：26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (33) (31)에 기재된 항체로서, CL로서 서열번호：27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (34) (31)에 기재된 경쇄로서, CL로서 서열번호：172에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변영역을 포함하는 항체,
    (35) (32)에 기재된 중쇄 및 (33)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (36) (32)에 기재된 중쇄 및 (34)에 기재된 경쇄를 포함하는 항체,
    (37) (1) 내지 (36) 중 어느 하나에 기재된 항체에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 항체로서, (1) 내지 (36) 중 어느 하나에 기재된 항체와 동등한 활성을 갖는 항체,
    (38) (1) 내지 (36) 중 어느 하나에 기재된 항체가 결합하는 에피레귤린의 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항에피레귤린 항체가 서열번호：167에 기재된 아미노산 서열에 있어서 29번째인 Ala부터 69번째인 Ser, 또는 63번째인 Val부터 108번째인 Leu를 인식하는 것을 특징으로 하는 치료제.
  5. 서열번호：9, 10 및 11로 표시되는 중쇄 가변영역 CDR 및 서열번호：12, 13 및 14로 표시되는 경쇄 가변영역 CDR을 포함하는 대조 항에피레귤린 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 항체로서, 서열번호：170으로 표시되는 원숭이 에피레귤린에 대한 KD값(cEREG KD)과 서열번호：34로 표시되는 인간 에피레귤린에 대한 KD값(hEREG KD)의 비(cEREG KD/hEREG KD)가 상기 대조 항에피레귤린 항체의 cEREG KD/hEREG KD보다도 작은 것을 특징으로 하는 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
  6. 제5항에 있어서,
    cEREG KD/hEREG KD가 40보다도 작은 치료제.
  7. 제5항에 있어서,
    cEREG KD/hEREG KD가 10보다도 작은 치료제.
  8. 제5항에 있어서,
    cEREG KD/hEREG KD가 6보다도 작은 치료제.
  9. 제5항에 있어서,
    cEREG KD/hEREG KD가 4보다도 작은 치료제.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항에피레귤린 항체가 서열번호：9로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호：161, 160, 159, 157, 156, 155, 153, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR2 및 서열번호：158, 154, 152, 151, 112, 111, 110 및 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호：163, 68, 67 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR1, 서열번호：71, 69 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR2 및 서열번호：164, 48, 47 및 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체인 치료제.
  11. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항에피레귤린 항체가 서열번호：150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116 및 115로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역, 및 서열번호：141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 및 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체인 치료제.
  12. 아래 중 어느 하나로부터 선택되는 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제:
    (1) 서열번호：150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항에피레귤린 항체,
    (2) 서열번호：141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 및 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항에피레귤린 항체, 또는
    (3) 서열번호：150, 149, 148, 147, 146, 145, 144, 143, 142, 140, 139, 138, 137, 135, 134, 133, 132, 131, 127, 126, 125, 124, 123, 122, 121, 120, 119, 118, 117, 116, 115, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49 및 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변영역, 및 서열번호：141, 136, 130, 129, 128, 99, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 58, 57 및 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항에피레귤린 항체.
  13. 서열번호：26의 중쇄 불변영역을 포함하는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
  14. 서열번호：27의 경쇄 불변영역을 포함하는 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
  15. 중화활성을 갖는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
  16. 세포상해활성을 갖는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
  17. 제16항에 있어서,
    세포상해활성이 CDC인 치료제.
  18. 제16항에 있어서,
    세포상해활성이 ADCC인 치료제.
  19. 제16항에 있어서,
    세포상해활성이 CDC 및 ADCC인 치료제.
  20. 서열번호：26의 중쇄 불변영역에 있어서 EU 넘버링으로 표시되는 230번 위치, 240번 위치, 244번 위치, 245번 위치, 247번 위치, 262번 위치, 263번 위치, 266번 위치, 273번 위치, 275번 위치, 299번 위치, 302번 위치, 313번 위치, 323번 위치, 325번 위치, 328번 위치 및 332번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함하는 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
  21. 서열번호：26의 중쇄 불변영역에 포함되는 Fc영역에 결합하는 당쇄 중의 푸코오스 함량이 감소되어 있는, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
  22. 서열번호：26의 중쇄 불변영역에 포함되는 Fc영역에 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가되어 있는, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 유효성분으로서 포함하는, 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제.
KR1020167001353A 2013-06-24 2014-06-23 인간화 항에피레귤린 항체를 유효성분으로서 포함하는 선암 이외의 비소세포폐암의 치료제 KR20160022354A (ko)

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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010137654A1 (ja) 2009-05-29 2010-12-02 株式会社未来創薬研究所 Egfファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
US10618952B2 (en) * 2015-10-30 2020-04-14 Medimmune Limited Prevention of N-terminal truncation in IgG light chains
JPWO2018155611A1 (ja) 2017-02-24 2019-12-12 中外製薬株式会社 薬学的組成物、抗原結合分子、治療方法、およびスクリーニング方法
JP7314146B2 (ja) 2017-12-28 2023-07-25 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
CN111072772B (zh) * 2019-12-31 2023-08-04 上海良润生物医药科技有限公司 一种肽标签及其在检测或纯化融合蛋白质的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008047723A1 (en) 2006-10-12 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
CA2131151A1 (en) 1992-03-24 1994-09-30 Kevin S. Johnson Methods for producing members of specific binding pairs
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
CA2194907A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Kouji Matsushima Reshaped human antibody against human interleukin-8
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6852318B1 (en) * 1998-05-08 2005-02-08 The Regents Of The University Of California Methods for detecting and inhibiting angiogenesis
NZ539776A (en) 1999-01-15 2006-12-22 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
EP2270148A3 (en) 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
ES2639222T5 (es) * 2000-10-06 2023-11-24 Kyowa Kirin Co Ltd Células que producen unas composiciones de anticuerpo
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
WO2002036142A2 (en) * 2000-11-03 2002-05-10 University Of Vermont And State Agricultural College Compositions for inhibiting grb7
JP2005500018A (ja) * 2001-04-02 2005-01-06 アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション ＧｎＴＩＩＩと同時発現する組換え抗体
AU2002362197A1 (en) 2001-12-28 2003-07-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of stabilizing protein
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EP1514928B1 (en) 2002-06-05 2013-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing antibodies using baculoviruses
ES2562177T3 (es) 2002-09-27 2016-03-02 Xencor Inc. Variantes de Fc optimizadas y métodos para su generación
US7393531B2 (en) * 2003-01-21 2008-07-01 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP
ATE475708T1 (de) 2003-01-22 2010-08-15 Glycart Biotechnology Ag Fusionskonstrukte und deren verwendung zur produktion von antikörpern mit erhöhter fc rezeptor bindungsaffinität und effektorfunktion
JP4315982B2 (ja) 2004-01-09 2009-08-19 ファイザー インコーポレイティッド ＭＡｄＣＡＭに対する抗体
JP4762156B2 (ja) 2004-01-12 2011-08-31 アプライド モレキュラー エボリューション，インコーポレイテッド Ｆｃ領域変異体
ES2426817T3 (es) 2004-08-04 2013-10-25 Mentrik Biotech, Llc Regiones Fc variantes
AU2005277567A1 (en) 2004-08-16 2006-03-02 Medimmune, Llc Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
US20060067930A1 (en) 2004-08-19 2006-03-30 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
EP1829961A4 (en) 2004-12-22 2008-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY USING A CELL WHOSE FUCOSE CARRIER FUNCTION IS INHIBITED
CA2602663A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
AU2006239851B2 (en) 2005-04-26 2011-06-16 Medimmune, Llc Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
DK2573114T3 (en) 2005-08-10 2016-07-04 Macrogenics Inc The identification and production of antibodies with variant Fc regions, and methods of using same
DK1931709T3 (en) 2005-10-03 2017-03-13 Xencor Inc FC VARIETIES WITH OPTIMIZED FC RECEPTOR BINDING PROPERTIES
EP4342995A2 (en) 2006-03-31 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
SI2436696T1 (sl) 2007-01-05 2017-10-30 University Of Zurich Anti-beta-amiloidno protitelo in načini njegove uporabe
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
MX2010003450A (es) 2007-09-26 2010-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de anticuerpo modificada.
JP2009078946A (ja) 2007-09-26 2009-04-16 Fujifilm Corp コア−シェル型金属酸化物粒子及びその製造方法
AU2008305851B2 (en) 2007-09-28 2014-12-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody having improved kinetics in plasma
GB0909906D0 (en) * 2009-06-09 2009-07-22 Affitech As Antibodies
GB0909904D0 (en) * 2009-06-09 2009-07-22 Affitech As Product
CN103328626B (zh) 2010-10-06 2017-02-08 中外制药株式会社 癌干细胞群及其制备方法
CN103827300A (zh) * 2011-06-30 2014-05-28 中外制药株式会社 异源二聚化多肽
EP3603671A3 (en) * 2011-10-28 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell-specific molecule
TWI593705B (zh) * 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
JP6433297B2 (ja) * 2012-12-27 2018-12-05 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008047723A1 (en) 2006-10-12 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cancer Immunol. Immunother. (2005) 20, 1-12
Cleve.Clin.J.Med. (2012) 79 Electronic Suppl 1, eS46-50
Clin.Cancer Res. (2012) 18, 3002-3007
Hum.Exp.Toxicol. (2000) 19, 230-243
J.Clin.Oncol. (2010) 28, 5311-5320
J.Med.Primatol. (1986) 15, 441-451
J.Med.Primatol. (2001) 40, 141-147
J.Thorac.Oncol. (2010) 5, 1416-1423
PLoS One. (2012) 7, e40109

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