WO2010119691A1 - 抗tmprss11e抗体を用いた癌の診断と治療 - Google Patents

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tmprss11e
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cancer
amino acid
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石川俊平
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    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)

Definitions

  • the present invention relates to an anti-TMPRSS11E antibody and cancer diagnosis and treatment using the antibody.
  • TMPRSS11E (also known as DESC1) belongs to the type 2 transmembrane serine protease family. It was discovered as a novel gene whose expression is decreased in squamous cell carcinoma (Lang and Schuller, 2001; Sedghizadeh et al., 2006). Purified soluble TMPRSS11E showed protease activity, and it was reported that cell invasive ability was increased in cells in which TMPRSS11E was forcibly expressed (Viloria et al., 2007). In this paper, as a result of immunohistological staining using polyclonal antibodies, in addition to strong staining in normal kidney and normal liver, staining in some kidney cancers and breast cancers has been reported. However, it has not been reported whether antibodies targeting TMPRSS11E are effective as pharmaceutical compositions such as anticancer agents.
  • An object of the present invention is to provide a novel means for cancer treatment and diagnosis.
  • TMPRSS11E This time we acquired the first monoclonal antibody against TMPRSS11E.
  • This antibody binds to the native form of TMPRSS11E, and TMPRSS11E was found to be highly expressed on the cell membrane in cancer cell lines by flow cytometry.
  • This antibody showed a high tumor effect due to antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity) and internalization activity, indicating that it is a promising therapeutic target.
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • this antibody has a protease activity neutralizing activity and is expected to have an effect by inhibiting the function of TMPRSS11E.
  • the present invention has been made based on these findings, and relates to diagnosis and treatment of cancer using an anti-TMPRSS11E antibody.
  • the present invention provides the following [1] to [20].
  • the antibody according to [2], wherein the cytotoxic activity is complement-dependent cytotoxic activity (CDC activity).
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • CDC activity complement-dependent cytotoxic activity
  • a heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
  • An antibody comprising a region.
  • Heavy chain variable comprising heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8
  • An antibody comprising a region.
  • a heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • An antibody comprising a region.
  • a light chain variable comprising a light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, a light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14.
  • An antibody comprising a region.
  • a light chain variable comprising a light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, a light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17.
  • An antibody comprising a region.
  • a light chain variable comprising a light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, a light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
  • An antibody comprising a region.
  • An antibody comprising the heavy chain variable region of (1) and the light chain variable region of (4).
  • An antibody comprising the heavy chain variable region of (2) and the light chain variable region of (5).
  • An antibody comprising the heavy chain variable region of (3) and the light chain variable region of (6).
  • the antibody according to any one of (1) to (9), wherein one or several amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted.
  • (11) An antibody that binds to the same epitope as that of the TMPRSS11E protein to which the antibody according to any one of (1) to (9) binds.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of [1] to [9] as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition according to [10] which is an anticancer agent.
  • the pharmaceutical composition according to [11] which is an anticancer agent for lung cancer, cervical cancer or esophageal cancer.
  • a method for diagnosing cancer comprising the following steps. (a) preparing a sample isolated from a subject; (b) A step of detecting the expression level of TMPRSS11E protein or TMPRSS11E gene in the sample. [14] The diagnostic method according to [13], which is for diagnosing lung cancer, cervical cancer, or esophageal cancer. [15] A diagnostic agent for cancer comprising the antibody according to any one of [1] to [9]. [16] The diagnostic agent according to [15], which is for diagnosing lung cancer, cervical cancer or esophageal cancer. [17] The antibody according to any one of [1] to [9] for use in diagnosis or treatment of cancer.
  • [18] The antibody according to [17] or [18], wherein the cancer is lung cancer, cervical cancer or esophageal cancer. [19] A method for treating cancer using the antibody according to any one of [1] to [9]. [20] The method for treating cancer according to [19], which is for treating lung cancer, cervical cancer or esophageal cancer.
  • a novel means for the treatment and diagnosis of cancer particularly lung cancer, cervical cancer or esophageal cancer is provided.
  • FIG. 1 shows the amount of TMPRSS11E mRNA in normal tissues and cancer cell lines.
  • FIG. 2 shows the binding activity of the chimerized anti-TMPRSS11E antibody by flow cytometry.
  • FIG. 3 shows the binding activity of anti-TMPRSS11E antibody to cancer cell lines by flow cytometry.
  • FIG. 4 shows ADCC activity by anti-TMPRSS11E antibody against cancer cell lines.
  • FIG. 5 shows the antitumor effect of anti-TMPRSS11E antibody using Hum-ZAP.
  • FIG. 6 shows protease neutralizing activity by anti-TMPRSS11E antibody.
  • FIG. 7 shows immunoblot analysis with anti-TMPRSS11E antibody.
  • FIG. 8 shows immunohistochemical analysis with anti-TMPRSS11E antibody.
  • FIG. 9 shows the binding activity of anti-TMPRSS11E antibody to the SK-Hep1 parent strain and TMPRSS11E expression strain by flow cytometry.
  • FIG. 10 shows the antitumor effect of anti-TM
  • TMPRSS11E TMPRSS11E (also known as DESC1) belongs to the type 2 transmembrane serine protease family.
  • the origin of the TMPRSS11E protein used in the present invention is not particularly limited, and any known TMPRSS11E protein can be used.
  • the TMPRSS11E protein is human TMPRSS11E.
  • TMPRSS11E is expressed in tissues of lung cancer, cervical cancer or esophageal cancer.
  • Anti-TMPRSS11E antibody 2.1 Anti-TMPRSS11E antibody The anti-TMPRSS11E antibody used in the present invention may be bound to the TMPRSS11E protein, and its origin, type, shape, etc. are not particularly limited. Specifically, antibodies such as non-human animal antibodies (eg, mouse antibodies, rat antibodies, camel antibodies), human antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies and the like can be used.
  • the anti-TMPRSS11E antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the binding of the antibody to the TMPRSS11E protein is preferably highly specific, and more preferably specific to human TMPRSS11E.
  • the anti-TMPRSS11E antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • the anti-TMPRSS11E antibody of the present invention may be modified with various molecules such as polyethylene glycol (PEG). Further, as described later, it may be modified with a chemotherapeutic agent having a cytotoxic activity or a radioactive chemical substance.
  • PEG polyethylene glycol
  • antibodies that recognize TMPRSS11E used in the present invention include the following antibodies.
  • a heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
  • An antibody comprising a region.
  • Heavy chain variable comprising heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8
  • An antibody comprising a region.
  • a heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • An antibody comprising a region.
  • a light chain variable comprising a light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, a light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14.
  • An antibody comprising a region.
  • a light chain variable comprising a light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, a light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17.
  • An antibody comprising a region.
  • a light chain variable comprising a light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, a light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
  • An antibody comprising a region.
  • An antibody comprising the heavy chain variable region of (1) and the light chain variable region of (4).
  • An antibody comprising the heavy chain variable region of (2) and the light chain variable region of (5).
  • An antibody comprising the heavy chain variable region of (3) and the light chain variable region of (6).
  • having an activity equivalent to that of the antibody of the present invention means binding activity to TMPRSS11E, neutralizing activity, internalizing activity and / or cytotoxic activity against cells expressing TMPRSS11E (ADCC activity, CDC activity, etc.) ) Is equivalent.
  • the equivalent activity does not necessarily require that the activity is the same.
  • the activity is 50% or more, preferably 70% or more, compared to any of the activities (1) to (9) described above. More preferably, it should have an activity of 90% or more.
  • the upper limit of the activity is not particularly limited, and examples include, for example, 1000% or less, 500% or less, 300% or less, 150% or less, 100% or less.
  • an antibody in which one or several amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the antibody of the present invention is also within the scope of the present invention, and even an artificially produced antibody is naturally produced. There may be.
  • the method of introducing mutation into a polypeptide is one of methods well known to those skilled in the art for preparing a polypeptide functionally equivalent to a certain polypeptide, such as site-directed mutagenesis ( Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res.
  • an antibody functionally equivalent to the antibody by appropriately introducing a mutation into the antibody of the present invention.
  • Amino acid mutations can also occur in nature.
  • an antibody having an amino acid sequence in which one or several amino acids are mutated in the amino acid sequence of the antibody of the present invention and functionally equivalent to the antibody is also included in the antibody of the present invention.
  • the number of amino acids to be mutated is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (for example, within 5 amino acids).
  • the amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • the following classification has been established based on the properties of amino acid side chains.
  • Hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V)
  • Hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T)
  • Amino acids with aliphatic side chains G, A, V, L, I, P
  • An amino acid having a hydroxyl group-containing side chain S, T, Y
  • Amino acids having side chains containing sulfur atoms C, M
  • Amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q)
  • Amino acids with base-containing side chains (R, K, H)
  • Amino acids with aromatic-containing side chains (H, F, Y, W) (Each parenthesis represents a single letter of an
  • a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution by another amino acid residue to one amino acid sequence maintains the biological activity of the original polypeptide Is already known (Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5562-5666, Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409- 6413).
  • the present invention also provides an antibody that binds to the same epitope as that to which any of the above-mentioned antibodies (1) to (9) binds.
  • Specific examples of the antibodies (1) to (9) described above include the TM094, TM191, and EA230 antibodies described in the Examples of the present application. That is, the present invention also provides an antibody that recognizes the same epitope as that recognized by TM094, TM191, and EA230.
  • test antibody shares an epitope with a certain antibody by competition for the same epitope.
  • Competition between antibodies is detected by a cross-blocking assay or the like.
  • a competitive ELISA assay is a preferred cross-blocking assay.
  • the TMPRSS11E protein coated on the well of a microtiter plate is preincubated in the presence or absence of a candidate competitive antibody, and then the anti-TMPRSS11E antibody of the present invention is added. Is done.
  • the amount of the anti-TMPRSS11E antibody of the present invention bound to the TMPRSS11E protein in the well is indirectly correlated with the binding ability of a candidate competitive antibody (test antibody) that competes for binding to the same epitope.
  • the amount of binding increases.
  • the amount of antibody bound to the well can be easily measured by labeling the antibody in advance.
  • biotin-labeled antibodies can be measured by using an avidin peroxidase conjugate and an appropriate substrate.
  • a cross-blocking assay using an enzyme label such as peroxidase is particularly referred to as a competitive ELISA assay.
  • the antibody can be labeled with another labeling substance that can be detected or measured. Specifically, radiolabels or fluorescent labels are known.
  • any antibody bound to the well can be measured by a labeled antibody that recognizes any constant region.
  • the antibodies bound to the wells can be measured by the antibodies that identify the respective classes.
  • the candidate antibody is at least 20%, preferably at least 30%, more preferably at least 50%, more preferably at least 80%. %, If it can block the binding of the anti-TMPRSS11E antibody, the candidate competing antibody is an antibody that binds to substantially the same epitope as the anti-TMPRSS11E antibody of the invention or competes for binding to the same epitope.
  • an antibody that recognizes a region from 159th Ser to 423rd Ile or a region from 42nd Tyr to 191st Arg of TMPRSS11E can be mentioned.
  • Such antibodies have high cytotoxic activity, internalization activity and / or neutralization activity and are therefore useful as pharmaceuticals, particularly as anticancer agents.
  • Recombinant anti-TMPRSS11E antibody When an antibody is administered to a human, it can be a genetically modified antibody that has been artificially modified for the purpose of reducing the heterologous antigenicity of the human.
  • the recombinant antibody includes, for example, a chimeric antibody and a humanized antibody. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody refers to an antibody in which variable regions and constant regions derived from each other are linked.
  • an antibody consisting of the variable regions of the heavy and light chains of a mouse antibody and the constant regions of the heavy and light chains of a human antibody is a mouse-human-heterologous chimeric antibody.
  • a recombinant vector that expresses a chimeric antibody can be prepared by linking DNA encoding the variable region of a mouse antibody to DNA encoding the constant region of a human antibody and incorporating it into an expression vector.
  • the chimeric antibody produced in the culture can be obtained by culturing recombinant cells transformed with the vector and expressing the incorporated DNA.
  • a human antibody is used as the constant region of the chimeric antibody.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ 1, C ⁇ 2, and C ⁇ can be used as constant regions.
  • C ⁇ and C ⁇ can be used as constant regions.
  • the amino acid sequences of these constant regions and the base sequences encoding them are known.
  • one or several amino acids in the human antibody constant region can be substituted, deleted, added and / or inserted.
  • a chimeric antibody is composed of a variable region of a non-human animal-derived antibody and a constant region derived from a human antibody, whereas a humanized antibody is complementary to an antibody derived from a non-human animal. It is composed of a sex determining region (CDR), a framework region (FR) derived from a human antibody, and a constant region derived from a human antibody.
  • CDR sex determining region
  • FR framework region
  • Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies.
  • non-human animals for example, humanized antibodies obtained by grafting mouse antibody CDRs to human antibodies are known. Since humanized antibodies have reduced antigenicity in the human body, they are useful as active ingredients of the therapeutic agent of the present invention.
  • Antibody variable regions are usually composed of three CDRs sandwiched between four FRs.
  • CDRs are regions that substantially determine the binding specificity of an antibody.
  • the amino acid sequence of CDR is rich in diversity.
  • the amino acid sequence constituting FR often shows high homology among antibodies having different binding specificities. Therefore, it is generally said that the binding specificity of one antibody can be transplanted to another antibody by CDR grafting.
  • overlap extension PCR is known as a method for transplanting mouse antibody CDRs to human FRs.
  • a primer in which a nucleotide sequence encoding the CDR of a mouse antibody to be transplanted is added to a primer for synthesizing an FR of a human antibody.
  • Primers are prepared for each of the four FRs.
  • selection of human FRs having high homology with mouse FRs is advantageous in maintaining CDR function. That is, generally, it is preferable to use a human FR comprising an amino acid sequence having high homology with the amino acid sequence of the FR adjacent to the mouse CDR to be transplanted.
  • the base sequences to be linked are designed to be connected to each other in frame.
  • Human FRs are synthesized individually by each primer.
  • a product in which DNA encoding mouse CDR is added to each FR is obtained.
  • the base sequences encoding mouse CDRs of each product are designed to overlap each other.
  • the overlapping CDR portions of the products synthesized using the human antibody gene as a template are annealed with each other to perform a complementary chain synthesis reaction. By this reaction, human FRs are linked via the mouse CDR sequence.
  • a humanized antibody expression vector can be prepared by inserting the DNA obtained as described above and a DNA encoding a human antibody constant region into an expression vector so as to be fused in frame. After introducing this vector into a host to establish recombinant cells, the recombinant cells are cultured, and the DNA encoding the humanized antibody is expressed, whereby the humanized antibody is produced in the culture of the cultured cells. (See European Patent Publication EP 239400, International Publication WO 96/02576).
  • the CDR forms a favorable antigen-binding site when linked via CDR.
  • a human antibody FR can be suitably selected.
  • FR amino acid residues can be substituted so that the CDR of the humanized antibody forms an appropriate antigen-binding site.
  • amino acid sequence mutations can be introduced into FRs by applying the PCR method used for transplantation of mouse CDRs into human FRs.
  • partial nucleotide sequence mutations can be introduced into primers that anneal to the FR.
  • a nucleotide sequence mutation is introduced into the FR synthesized by such a primer.
  • a mutant FR sequence having a desired property can be selected by measuring and evaluating the antigen-binding activity of a mutant antibody substituted with an amino acid by the above method (Sato, K. et al., Cancer Res, 1993, 53 , 851-856).
  • the antibody of the present invention is represented not only by a bivalent antibody represented by IgG (IgG1, IgG2, IgG4, etc.) but also by a monovalent antibody or IgM. Also included are multivalent antibodies.
  • the multivalent antibodies of the present invention include multivalent antibodies that all have the same antigen-binding site, or multivalent antibodies that have some or all different antigen-binding sites.
  • the antibody of the present invention is not limited to the full-length antibody molecule, and may be a low molecular weight antibody or a modified product thereof as long as it binds to the TMPRSS11E protein.
  • the low molecular weight antibody includes an antibody fragment in which a part of a full-length antibody (whole antibody such as whole IgG) is deleted. As long as it has the ability to bind to the TMPRSS11E antigen, partial deletion of the antibody molecule is tolerated.
  • the antibody fragment in the present invention preferably contains either or both of a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL).
  • the antibody fragment in the present invention preferably contains CDR.
  • the number of CDRs contained in the antibody fragment of the present invention is not particularly limited, but preferably contains at least six of heavy chain CDR1, CDR2, CDR3, light chain CDR1, CDR2, and CDR3.
  • the amino acid sequence of VH or VL can contain substitutions, deletions, additions and / or insertions. Furthermore, as long as it has the ability to bind to the TMPRSS11E antigen, either or both of VH and VL can be deleted.
  • the variable region may be chimerized or humanized.
  • Specific examples of antibody fragments include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, and Fv.
  • Specific examples of the low molecular weight antibody include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv (single chain Fv), diabody, sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2 ), ScFv-Fc, and the like.
  • the preferred low molecular weight antibody in the present invention is diabody or sc (Fv) 2. Multimers of these antibodies (eg, dimer, trimer, tetramer, polymer) are also included in the low molecular weight antibody of the present invention.
  • Antibody fragments can be obtained by treating antibodies with enzymes to generate antibody fragments. Digestive enzymes cleave specific positions of antibody fragments to give antibody fragments of a specific structure. As an enzyme that generates an antibody fragment, for example, papain, pepsin, or plasmin is known.In the case of papain digestion, F (ab) 2 or Fab is used. In the case of pepsin digestion, F (ab ′) 2 or Fab ′ is used. give. Alternatively, genes encoding these antibody fragments can be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152). , 2968-2976, Better, M.
  • enzymes to generate antibody fragments for example, papain, pepsin, or plasmin is known. In the case of papain digestion, F (ab) 2 or Fab is used. In the case of pepsin digestion, F (ab ′) 2 or Fab
  • the low molecular weight antibody in the present invention can be an antibody fragment lacking any region as long as it has binding affinity for TMPRSS11E.
  • Diabodies refer to bivalent antibody fragments constructed by gene fusion (Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP404 No. 097, WO 93/11161, etc.). Diabodies are dimers composed of two polypeptide chains. Usually, in the polypeptide chain constituting the dimer, the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a linker in the same chain. The linker in the diabody is generally short enough that the heavy chain variable region and the light chain variable region cannot bind to each other. Specifically, the amino acid residues constituting the linker are, for example, about 5 residues. Therefore, the heavy chain variable region and the light chain variable region encoded on the same polypeptide chain cannot form a single chain variable region fragment but form a dimer with another single chain variable region fragment. As a result, the diabody has two antigen binding sites.
  • scFv is obtained by linking an antibody heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 5879- 5883).
  • the heavy chain variable region and light chain variable region in scFv may be derived from any of the antibodies described herein.
  • the peptide linker that links the variable regions.
  • any single chain peptide consisting of about 3 to 25 residues can be used as a linker.
  • a peptide linker described later can be used.
  • variable regions of both chains can be linked by, for example, the PCR method as described above.
  • the DNA encoding the desired partial amino acid sequence is used as a template.
  • the DNAs encoding the variable regions of the heavy chain and the light chain are each amplified by PCR using a pair of primers having sequences corresponding to the sequences at both ends of the DNA to be amplified.
  • DNA encoding a peptide linker portion is prepared.
  • DNA encoding a peptide linker can also be synthesized using PCR.
  • a base sequence that can be linked to the amplification product of each variable region synthesized separately is added to the 5 ′ side of the primer to be used.
  • a PCR reaction is performed using each DNA of [heavy chain variable region DNA]-[peptide linker DNA]-[light chain variable region DNA] and a primer for assembly PCR.
  • the primer for assembly PCR consists of a combination of a primer that anneals to the 5 ′ side of [heavy chain variable region DNA] and a primer that anneals to the 3 ′ side of [light chain variable region DNA]. That is, the assembly PCR primer is a primer set that can amplify DNA encoding the full-length sequence of scFv to be synthesized. On the other hand, a base sequence that can be linked to each variable region DNA is added to [peptide linker DNA]. As a result, these DNAs are ligated, and the full length of scFv is finally produced as an amplification product by the primers for assembly PCR.
  • an expression vector containing them and a recombinant cell transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method. Further, the scFv can be obtained by culturing the resulting recombinant cells and expressing the DNA encoding the scFv.
  • scFv-Fc is a low molecular weight antibody in which an Fc region is fused to scFv (Cellular & Molecular Immunology 2006; 3: 439-443).
  • scFv used for scFv-Fc is not specifically limited, For example, scFv derived from IgM can be used.
  • the origin of Fc is not particularly limited, and for example, human IgG (human IgG1 etc.) can be used.
  • scFv-Fc scFv- fragment obtained by linking the scFv fragment of IgM antibody and human IgG1 CH2 (eg, C ⁇ 2) and CH3 (eg, C ⁇ 3) at the hinge region (H ⁇ ) of human IgG1.
  • Fc can be mentioned.
  • sc (Fv) 2 is a low molecular weight antibody in which two heavy chain variable regions (VH) and two light chain variable regions (VL) are combined with a linker or the like to form a single chain (Hudson et al, J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189).
  • sc (Fv) 2 can be prepared, for example, by linking scFv with a linker. When linking four antibody variable regions, usually three linkers are required.
  • VHs and two VLs are arranged in the order of VH, VL, VH, and VL ([VH] linker [VL] linker [VH] linker [VL]) starting from the N-terminal side of the single-chain polypeptide.
  • An antibody characterized in that it is preferred.
  • a linker that binds the variable region of an antibody a linker disclosed in any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker (for example, see Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996), etc. Can be used.
  • a plurality of linkers may be the same or different linkers may be used.
  • a peptide linker is preferred.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • the amino acid residue constituting the peptide linker is 1 to 100 amino acids, preferably 3 to 50 amino acids, more preferably 5 to 30 amino acids, particularly preferably 12 to 18 amino acids (for example, 15 amino acids).
  • the amino acid sequence constituting the peptide linker can be any sequence as long as it does not inhibit the scFv binding action.
  • the following amino acid sequence can be used.
  • n for determining the length of the above peptide linker is usually 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2.
  • examples of sc (Fv) 2 that are particularly preferred in the present invention include the following sc (Fv) 2.
  • variable regions can be linked using synthetic chemical linkers (chemical crosslinkers).
  • a crosslinking agent usually used for crosslinking such as peptide compounds can be used in the present invention.
  • the following chemical crosslinking agents are known. These crosslinking agents are commercially available.
  • N-hydroxysuccinimide (NHS), Disuccinimidyl suberate (DSS), Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), Dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), Ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) (EGS), Ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo-EGS), Disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (sulfo-DST), Bis [2- (succinimidooxycarbonyloxy) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimideoxycarbonyloxy) ethyl] sulfone (sulfo-BSOCOES)
  • TMPRSS11E antibody Cytotoxic activity
  • a preferred antibody in the present invention has both a binding affinity for TMPRSS11E and an effector function.
  • Antibody effector functions include antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity and complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity.
  • the therapeutic antibody in the present invention particularly preferably comprises one or both of ADCC activity and CDC activity as an effector function.
  • the antibody of the present invention is preferably an antibody having cytotoxic activity.
  • the cytotoxic activity in the present invention include ADCC activity and CDC activity.
  • ADCC activity means that when a specific antibody adheres to a cell surface antigen of a target cell, an Fc ⁇ receptor-bearing cell (such as an immune cell) binds to the Fc portion via the Fc ⁇ receptor and binds to the target cell. It means an activity that causes injury.
  • CDC activity means cytotoxic activity by the complement system.
  • Whether the anti-TMPRSS11E antibody has ADCC activity or CDC activity can be measured by a known method (for example, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)).
  • effector cells Specifically, first, effector cells, complement solution, and target cells are prepared.
  • i) Preparation of effector cells Spleens are removed from CBA / N mice and the like, and spleen cells are isolated in RPMI1640 medium (Invitrogen). After washing with the same medium containing 10% fetal calf serum (FBS, HyClone), effector cells can be prepared by adjusting the cell concentration to 5 ⁇ 10 6 / ml.
  • FBS fetal calf serum
  • ii) Preparation of complement solution Baby Rabbit Complement (CEDARLANE) can be diluted 10-fold with a medium containing 10% FBS (Invitrogen) to prepare a complement solution.
  • TMPRSS11E protein expressing TMPRSS11E protein are cultured with 0.2 mCi of 51 Cr-sodium chromate (GE Healthcare Biosciences) in DMEM medium containing 10% FBS for 1 hour at 37 ° C.
  • the target cell can be radiolabeled.
  • cells expressing TMPRSS11E protein cells transformed with a gene encoding TMPRSS11E protein, lung cancer cells, cervical cancer, esophageal cancer cells and the like can be used. After radiolabeling, the target cells can be prepared by washing the cells three times with 10% FBS-containing RPMI1640 medium and adjusting the cell concentration to 2 ⁇ 10 5 / ml.
  • ADCC activity or CDC activity can be measured by the method described below.
  • For measurement of ADCC activity add 50 ⁇ l each of target cells and anti-TMPRSS11E antibody to a 96-well U-bottom plate (Becton Dickinson) and react on ice for 15 minutes. Thereafter, 100 ⁇ l of effector cells are added and cultured for 4 hours in a carbon dioxide incubator. The final antibody concentration is 0 or 10 ⁇ g / ml. After the culture, 100 ⁇ l of the supernatant is collected, and the radioactivity is measured with a gamma counter (COBRAII AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company).
  • Cytotoxic activity (%) can be calculated based on the formula (A-C) / (B-C) x 100 using the obtained value.
  • A is the radioactivity (cpm) in each sample
  • B is the radioactivity (cpm) in the sample with 1% NP-40 (manufactured by nacalai tesque)
  • C is the radioactivity (cpm) of the sample containing only the target cells Show.
  • conjugate antibody It is also possible to bind a cytotoxic substance such as a chemotherapeutic agent, a toxic peptide or a radioactive chemical substance to the antibody.
  • a cytotoxic substance such as a chemotherapeutic agent, a toxic peptide or a radioactive chemical substance
  • antibody conjugate can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
  • Preferred chemotherapeutic agents are low molecular chemotherapeutic agents. Small molecule chemotherapeutic agents are less likely to interfere with antibody function after binding to the antibody.
  • the low-molecular chemotherapeutic agent usually has a molecular weight of 100 to 2000, preferably 200 to 1000.
  • the chemotherapeutic agents exemplified here are all low-molecular chemotherapeutic agents.
  • These chemotherapeutic agents in the present invention include a prodrug that is converted into an active chemotherapeutic agent in vivo. Activation of the prodrug may be enzymatic conversion or non-enzymatic conversion.
  • the antibody can also be modified with a toxic peptide.
  • a toxic peptide the following can be mentioned, for example. Diphtheria toxin A chain (Diphtheria toxin A Chain) (Langone JJ, et al., Methods in Enzymology, 93, 307-308, 1983), Pseudomonas Exotoxin (Nature Medicine, 2, 350-353, 1996), lysine chain ( Ricin A Chain) (Fulton RJ, et al., J. Biol.
  • the radioactive chemical substance refers to a chemical substance containing a radioisotope.
  • the radioactive isotope is not particularly limited, and any radioactive isotope may be used.
  • 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, 186 Re, 188 Re, etc. can be used. .
  • one or two or more small molecule chemotherapeutic agents and a toxic peptide can be used in combination to modify the antibody.
  • Coupling between the anti-TMPRSS11E antibody and the above small molecule chemotherapeutic agent can be covalent or non-covalent. Methods for producing antibodies bound with these chemotherapeutic agents are known.
  • Proteinaceous drugs and toxins can be combined with antibodies by genetic engineering techniques.
  • a recombinant vector in which a DNA encoding the toxic peptide and a DNA encoding the anti-TMPRSS11E antibody are fused in frame and incorporated into an expression vector can be constructed.
  • a transformed cell obtained by introducing the vector into an appropriate host cell is cultured, and the incorporated DNA is expressed, whereby an anti-TMPRSS11E antibody bound with a toxic peptide can be obtained as a fusion protein.
  • a proteinaceous drug or toxin is generally arranged on the C-terminal side of the antibody.
  • a peptide linker can be interposed between the antibody and the proteinaceous drug or toxin.
  • bispecific antibody refers to antibodies that have variable regions that recognize different epitopes within the same antibody molecule.
  • bispecific antibodies can have antigen binding sites that recognize different epitopes on the TMPRSS11E molecule. Such a bispecific antibody can bind two antibody molecules to one molecule of TMPRSS11E. As a result, a stronger cytotoxic effect can be expected.
  • a bispecific antibody in which one antigen-binding site recognizes TMPRSS11E and the other antigen-binding site recognizes a cytotoxic substance can also be used.
  • the cytotoxic substance includes a chemotherapeutic agent, a toxic peptide, a radioactive chemical substance, and the like.
  • Such bispecific antibodies capture cytotoxic substances while binding to cells expressing TMPRSS11E.
  • the cytotoxic substance can directly act on TMPRSS11E expressing cells. That is, the bispecific antibody that recognizes the cytotoxic substance can specifically damage the tumor cell and suppress the growth of the tumor cell.
  • a bispecific antibody combined with an antigen binding site that recognizes an antigen other than TMPRSS11E can also be used.
  • TMPRSS11E it is an antigen that is specifically expressed on the cell surface of the target cancer cell and may be combined with an antigen binding site that recognizes an antigen different from TMPRSS11E to form a bispecific antibody. it can.
  • bispecific antibodies can be produced by combining two types of antibodies with different recognition antigens.
  • the antibody to be bound may be a half molecule each having a heavy chain and a light chain, or may be a quarter molecule consisting only of a heavy chain.
  • bispecific antibody-producing fused cells can be prepared by fusing hybridomas that produce different monoclonal antibodies.
  • bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent immunoassay can be used.
  • the antibody of the present invention may be an antibody having a modified sugar chain. It is known that the cytotoxic activity of an antibody can be enhanced by modifying the sugar chain of the antibody. Examples of antibodies with modified sugar chains include antibodies with modified sugar chains (WO99 / 54342, etc.), antibodies lacking fucose added to sugar chains (WO00 / 61739, WO02 / 31140, etc.), bisecting GlcNAc, etc. An antibody having a sugar chain having WO (such as WO02 / 79255) is known.
  • the antibody of the present invention may have internalization activity.
  • an antibody having an internalizing activity means an antibody that is transported into a cell (cytoplasm, vesicle, other organelle, etc.) when bound to TMPRSS11E.
  • Whether or not the antibody has an internalizing activity can be confirmed using a method known to those skilled in the art.
  • an anti-TMPRSS11E antibody bound to a labeling substance is contacted with a cell expressing TMPRSS11E, and the labeling substance
  • a method for confirming whether the TMPRSS11E-expressing cells are induced by contacting an anti-TMPRSS11E antibody conjugated with a cytotoxic substance with a TMPRSS11E-expressing cell, etc. Can be confirmed.
  • An antibody having an internalizing activity can be used as a pharmaceutical composition such as an anticancer agent to be described later by binding, for example, the above-mentioned cytotoxic substance.
  • the antibody of the present invention may have neutralizing activity.
  • the neutralizing activity refers to an activity that inhibits the protease activity of TMPRSS11E.
  • the neutralization activity can be measured by a method known to those skilled in the art, for example, by the method described in Examples.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be produced in the following manner according to a known technique. First, an animal is immunized according to a normal immunization method using TMPRSS11E protein or a partial peptide thereof described later as a sensitizing antigen. The obtained immune cells are fused with a known parent cell by an ordinary cell fusion method to obtain a hybridoma. Further, from this hybridoma, a hybridoma producing an anti-TMPRSS11E antibody is selected by screening cells producing the target antibody by a usual screening method. A desired anti-TMPRSS11E monoclonal antibody is obtained from the selected hybridoma. Specifically, this is performed as follows.
  • TMPRSS11E protein used as a sensitizing antigen for antibody acquisition can be obtained by expressing the TMPRSS11E gene. That is, after inserting a gene sequence encoding TMPRSS11E into a known expression vector and transforming an appropriate host cell, the target human TMPRSS11E protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method. To do. A purified natural TMPRSS11E protein or a fusion protein in which a desired partial polypeptide of TMPRSS11E protein is fused with a different polypeptide can also be used as an immunogen.
  • an Fc fragment of an antibody or a peptide tag can be used.
  • a vector that expresses the fusion protein can be prepared by fusing genes encoding two or more desired polypeptide fragments in-frame and inserting the fusion gene into an expression vector. Methods for producing fusion proteins are described in Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • the TMPRSS11E protein thus purified can be used as a sensitizing antigen used for immunization against mammals.
  • a partial peptide of TMPRSS11E can also be used as a sensitizing antigen.
  • the following peptides can be used as the sensitizing antigen.
  • the region and size of TMPRSS11E used as a partial peptide are not limited.
  • the number of amino acids constituting the peptide to be sensitized antigen is preferably at least 3 or more, for example, 5 or more, or 6 or more. More specifically, a peptide having 8 to 50, preferably 10 to 30 residues can be used as a sensitizing antigen.
  • TMPRSS11E protein A mammal is immunized using TMPRSS11E protein or a partial peptide thereof as a sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized is not particularly limited, but in order to obtain a monoclonal antibody by the cell fusion method, it is preferable to select the immunized animal in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • rodent animals are preferred as immunized animals. Specifically, mice, rats, hamsters, or rabbits can be used as immunized animals. In addition, monkeys and the like can be used as immunized animals.
  • the above animals can be immunized with a sensitizing antigen according to a known method.
  • a mammal can be immunized by injecting a sensitizing antigen intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is administered to mammals several times every 4 to 21 days.
  • the sensitizing antigen is diluted with PBS (Phosphate-Buffered Saline, phosphate buffered saline) or physiological saline at an appropriate dilution ratio and used for immunization.
  • the sensitizing antigen may be administered with an adjuvant.
  • it can be mixed with Freund's complete adjuvant and emulsified to give a sensitizing antigen.
  • An appropriate carrier can be used for immunization with the sensitizing antigen.
  • a partial peptide having a small molecular weight is used as a sensitizing antigen, it is desirable to immunize the sensitizing antigen peptide by binding it to a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • DNA immunization refers to immunization by administering a vector DNA constructed in such a manner that a gene encoding an antigen protein can be expressed in an immunized animal, and expressing the immunizing antigen in the body of the immunized animal. It is a method of giving a stimulus. Compared to general immunization methods that administer protein antigens, DNA immunization can be expected to have the following advantages. ⁇ Implement immune stimulation by maintaining the structure of membrane proteins such as TMPRSS11E. -There is no need to purify immune antigens.
  • DNA expressing TMPRSS11E protein is first administered to an immunized animal.
  • DNA encoding TMPRSS11E can be synthesized by a known method such as PCR.
  • the obtained DNA is inserted into an appropriate expression vector and administered to an immunized animal.
  • the expression vector for example, a commercially available expression vector such as pcDNA3.1 can be used.
  • a method of administering the vector to a living body a generally used method can be used.
  • DNA immunization can be performed by implanting gold particles adsorbed with an expression vector into cells with a gene gun.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion.
  • spleen cells can be used.
  • Mammalian myeloma cells are used as cells to be fused with the above immune cells.
  • the myeloma cell is preferably provided with an appropriate selection marker for screening.
  • a selectable marker refers to a trait that can (or cannot) survive under certain culture conditions.
  • Known selection markers include hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency (hereinafter abbreviated as HGPRT deficiency) or thymidine kinase deficiency (hereinafter abbreviated as TK deficiency).
  • HGPRT deficiency hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency
  • TK deficiency thymidine kinase deficiency
  • Cells having HGPRT or TK deficiency have hypoxanthine-aminopterin-thymidine sensitivity (hereinafter abbreviated as HAT sensitivity).
  • HGPRT-deficient and TK-deficient cells can be selected using a medium containing 6 thioguanine, 8 azaguanine (hereinafter abbreviated as 8AG), or 5 ′ bromodeoxyuridine, respectively.
  • 8AG 8 azaguanine
  • 5 ′ bromodeoxyuridine 5 ′ bromodeoxyuridine
  • Normal cells die because they incorporate these pyrimidine analogs into the DNA, but cells deficient in these enzymes cannot survive these pyrimidine analogs and can survive in selective media.
  • a selectable marker called G418 resistance confers resistance to 2-deoxystreptamine antibiotics (gentamicin analogs) with a neomycin resistance gene.
  • gentamicin analogs gentamicin analogs
  • the following myeloma cells can be used for the production of the monoclonal antibody in the present invention.
  • P3 P3x63Ag8.653
  • P3x63Ag8U.1 Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7)
  • NS-1 Kell. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519
  • MPC-11 Margulies. DH et al., Cell (1976) 8, 405-415
  • SP2 / 0 Shaulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270
  • FO de St.
  • immune cells and myeloma cells according to known methods such as the method of Kohler and Milstein (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46), etc. And cell fusion.
  • cell fusion can be carried out in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like can be used.
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added if desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be set arbitrarily.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for cell fusion for example, RPMI1640 culture solution suitable for growth of myeloma cell line, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this type of cell culture can be used.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be added to the culture medium.
  • the desired fusion cells are formed by mixing a predetermined amount of immune cells and myeloma cells in a culture solution and mixing a PEG solution preheated to about 37 ° C. Is done.
  • PEG having an average molecular weight of about 1000 to 6000 can be usually added at a concentration of 30 to 60% (w / v).
  • cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of hybridomas are removed by sequentially adding the appropriate culture solution listed above, and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma obtained in this way can be selected by using a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • cells having HGPRT or TK deficiency can be selected by culturing in a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). That is, when HAT-sensitive myeloma cells are used for cell fusion, cells that have succeeded in cell fusion with normal cells can be selectively proliferated in the HAT culture solution.
  • the culture using the HAT culture solution is continued for a time sufficient for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die.
  • the target hybridoma can be selected by culturing for several days to several weeks. Subsequently, by carrying out the usual limiting dilution method, screening and single cloning of the hybridoma producing the target antibody can be performed.
  • Screening and single cloning of the target antibody can be preferably performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • the antigen is bound to a carrier such as beads made of polystyrene or the like, or a commercially available 96-well microtiter plate, and reacted with the culture supernatant of the hybridoma.
  • a secondary antibody labeled with an enzyme is reacted.
  • the target antibody that reacts with the sensitizing antigen is contained in the culture supernatant, the secondary antibody binds to the carrier via this antibody.
  • By detecting the secondary antibody that finally binds to the carrier it can be determined whether the antibody of interest is present in the culture supernatant.
  • a hybridoma that produces a desired antibody having the ability to bind to an antigen can be cloned by a limiting dilution method or the like.
  • the antigen a substantially homogeneous TMPRSS11E protein can be suitably used, including those used for immunization.
  • cell lines that express TMPRSS11E, soluble TMPRSS11E, and the like can be used as antigens.
  • a target antibody can be obtained by sensitizing human lymphocytes with an antigen. Specifically, first, human lymphocytes are sensitized with TMPRSS11E protein in vitro. The immunized lymphocytes are then fused with an appropriate fusion partner.
  • the fusion partner for example, a myeloma cell derived from human and having a permanent division ability can be used (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • anti-TMPRSS11E can be obtained by administering TMPRSS11E protein as an antigen to a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes or immunizing with DNA constructed to express TMPRSS11E in the animal.
  • Human antibodies can also be obtained.
  • Antibody-producing cells of the immunized animal can be immortalized by treatment such as cell fusion with an appropriate fusion partner or Epstein-Barr virus infection. From the immortalized cells thus obtained, a human antibody against the TMPRSS11E protein can be isolated (see International Publication WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602).
  • the immortalized cells by cloning the immortalized cells, it is possible to clone cells that produce an antibody having the desired reaction specificity.
  • the immune system of the animal recognizes human TMPRSS11E as a foreign substance. Therefore, a human antibody against human TMPRSS11E can be easily obtained.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody produced as described above can be subcultured in a normal culture solution.
  • the hybridoma can also be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the target monoclonal antibody can be obtained from a culture supernatant obtained by culturing a hybridoma according to a conventional method.
  • a hybridoma can be administered to a mammal compatible therewith to proliferate and a monoclonal antibody can be obtained as its ascites.
  • the former method is suitable for obtaining a highly pure antibody.
  • antibody By using antibody gene cloned from antibody-producing cells, antibody can be produced by genetic engineering technique. .
  • the cloned antibody gene can be expressed as an antibody by incorporating it into an appropriate vector and introducing it into a host. Methods for isolation of antibody genes, introduction into vectors, and transformation of host cells have already been established (eg, Vandamme, AM et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767). -775).
  • cDNA encoding the variable region of an anti-TMPRSS11E antibody can be obtained from a hybridoma cell that produces the anti-TMPRSS11E antibody.
  • total RNA is extracted from the hybridoma.
  • the following method can be used. ⁇ Guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159).
  • Extracted mRNA can be purified using mRNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience) or the like. Alternatively, kits for extracting total mRNA directly from cells such as QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience) are also commercially available. Using such a kit, total mRNA can also be obtained from the hybridoma. From the obtained mRNA, cDNA encoding the antibody variable region can be synthesized using reverse transcriptase. In this case, any 15-30 base sequence selected from sequences common to antibody genes can be used as a primer.
  • cDNA can be synthesized by AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation).
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit manufactured by Clontech
  • 5'-RACE method using PCR Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • PCR 5'-RACE method using PCR
  • Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932 can be used.
  • appropriate restriction enzyme sites described later can be introduced at both ends of the cDNA.
  • the desired cDNA fragment is purified from the obtained PCR product and then ligated with vector DNA.
  • a recombinant vector is produced, introduced into Escherichia coli or the like and a colony is selected, a desired recombinant vector can be prepared from Escherichia coli that has formed the colony. Then, the base sequence of the cDNA can be confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method.
  • a cDNA library can be used to obtain a gene encoding the variable region of an antibody.
  • cDNA is synthesized using mRNA extracted from antibody-producing cells as a template to obtain a cDNA library. It is convenient to use a commercially available kit for the synthesis of the cDNA library. Actually, the amount of mRNA obtained from only a small number of cells is extremely small, and the yield is low when it is directly purified. Therefore, it is usually purified after adding carrier RNA that is apparently free of antibody genes. Alternatively, when a certain amount of RNA can be extracted, it is possible to efficiently extract only RNA of antibody-producing cells. For example, carrier RNA may not be necessary for RNA extraction from 10 or more, 30 or more, preferably 50 or more antibody-producing cells.
  • Antibody gene is amplified by PCR using the obtained cDNA library as a template.
  • Primers for amplifying antibody genes by PCR are known.
  • primers for human antibody gene amplification can be designed based on the disclosure of a paper (J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597). These primers have different nucleotide sequences for each immunoglobulin subclass. Therefore, when a cDNA library whose subclass is unknown is used as a template, the PCR method is performed in consideration of all possibilities.
  • a primer capable of amplifying genes encoding ⁇ 1 to ⁇ 5 as a heavy chain and ⁇ chain and ⁇ chain as a light chain may be used. it can.
  • a primer that anneals to a portion corresponding to the hinge region is generally used as the 3′-side primer.
  • a primer corresponding to each subclass can be used as the 5′-side primer.
  • PCR products using primers for gene amplification of heavy and light chain subclasses should be independent libraries.
  • an immunoglobulin comprising a combination of a heavy chain and a light chain can be reconstructed.
  • the target antibody can be screened using the binding activity of the reconstituted immunoglobulin to TMPRSS11E as an index.
  • a cloned antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region.
  • An expression control region for expressing an antibody includes, for example, an enhancer and a promoter. Subsequently, by transforming an appropriate host cell with this expression vector, a recombinant cell expressing a DNA encoding the anti-TMPRSS11E antibody can be obtained.
  • DNAs encoding antibody heavy chains and light chains can be incorporated into separate expression vectors.
  • a vector in which a heavy chain and a light chain are incorporated into the same host cell at the same time an antibody molecule having a heavy chain and a light chain can be expressed.
  • host cells may be transformed by incorporating DNAs encoding heavy and light chains into a single expression vector (see International Publication WO 94/11523).
  • a host and an expression vector for producing an antibody by introducing an isolated antibody gene into a suitable host are known. Any of these expression systems can be applied to the present invention.
  • animal cells, plant cells, or fungal cells can be used. Specifically, the following cells can be exemplified as animal cells that can be used in the present invention.
  • Mammalian cells CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), Hela, Vero, HEK293, Ba / F3, HL-60, Jurkat, SK-HEP1, etc.
  • Amphibian cells Xenopus oocytes, etc.
  • Insect cells sf9, sf21, Tn5, etc.
  • Nicotiana As plant cells, antibody gene expression systems using cells from the genus Nicotiana such as Nicotiana tabacum are known. Callus cultured cells can be used for transformation of plant cells.
  • Yeast Saccharomyces genus such as Saccharomyces serevisiae, Pichia genus such as methanol-utilizing yeast (Pichia pastoris), Filamentous fungi: Aspergillus genus such as Aspergillus niger.
  • antibody gene expression systems using prokaryotic cells are also known.
  • bacterial cells such as E. coli and Bacillus subtilis can be used in the present invention.
  • the promoter / enhancer can include human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer.
  • a promoter / enhancer derived from a mammalian cell such as a viral promoter / enhancer or human elongation factor 1 ⁇ (HEF1 ⁇ ) can be used for antibody expression.
  • viruses that can utilize promoters / enhancers include retroviruses, polyomaviruses, adenoviruses, and simian virus 40 (SV40).
  • the method of Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108) can be used. Further, the HEF1 ⁇ promoter / enhancer can be easily used for target gene expression by the method of Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
  • the signal sequence of the antibody heavy chain gene or light chain gene is desirable to use as the signal sequence required for secretion outside the cell. It is also possible to use signal sequences possessed by secreted proteins such as IL-3 and IL-6.
  • the gene can be expressed by functionally combining a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoter include lacZ promoter and araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Nature (1989) 341, 544-546; FASEBJ. (1992) 6, 2422-2427) can be used.
  • the araB promoter can be used for expression of the target gene by the method of Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043).
  • the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli. Then, after separating the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is refolded so as to have a desired binding activity by using a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride.
  • a selectable marker can be inserted into the expression vector for amplification of the gene copy number in the host cell system.
  • selection markers such as aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, etc. can be used. it can.
  • Obtaining antibodies from host cells These expression vectors are introduced into host cells, and then transformed host cells are cultured in vitro or in vivo to produce the desired antibodies.
  • Host cells are cultured according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as the culture medium, and serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • the antibody expressed and produced as described above can be purified by using a known method used in normal protein purification alone or in combination as appropriate.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining affinity columns such as protein A columns, chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • transgenic animals can also be used for the production of recombinant antibodies. That is, the target antibody can be obtained from an animal into which a gene encoding the target antibody has been introduced.
  • an antibody gene can be constructed as a fusion gene by inserting in frame into a gene that encodes a protein that is uniquely produced in milk.
  • a protein secreted into milk for example, goat ⁇ -casein can be used.
  • the DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the injected embryo is introduced into a female goat.
  • a desired antibody can be obtained as a fusion protein with a milk protein from milk produced by a transgenic goat (or its offspring) born from a goat that has received the embryo.
  • hormones can be used as appropriate in transgenic goats to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from the transgenic goat (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12,699-702).
  • composition TMPRSS11E is highly expressed specifically in cancer tissues such as lung cancer, cervical cancer and esophageal cancer, and anti-TMPRSS11E antibody has cytotoxic activity specific to cancer cells. Accordingly, anti-TMPRSS11E antibodies are useful for the treatment of cancers that express these TMPRSS11E.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing as an active ingredient an antibody that binds to TMPRSS11E protein.
  • the pharmaceutical composition is a cytostatic agent, particularly an anticancer agent.
  • the cell growth inhibitor and anticancer agent of the present invention are preferably administered to a subject suffering from or possibly suffering from cancer.
  • the anti-TMPRSS11E antibody used in the pharmaceutical composition (for example, anticancer agent) of the present invention is not particularly limited, and for example, any of the anti-TMPRSS11E antibodies described above can be used.
  • containing an antibody that binds to TMPRSS11E as an active ingredient means that the anti-TMPRSS11E antibody is contained as a main active ingredient, and does not limit the content of the anti-TMPRSS11E antibody.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain an anti-TMPRSS11E antibody bound with a cytotoxic substance as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition can be used, for example, as a cell growth inhibitor, particularly an anticancer agent.
  • the cell growth inhibitor and anticancer agent of the present invention are preferably administered to a subject suffering from or possibly suffering from cancer.
  • the phrase “contains an anti-TMPRSS11E antibody bound with a cytotoxic substance as an active ingredient” means that the anti-TMPRSS11E antibody bound with a cytotoxic substance is included as a main active ingredient. It does not limit the content of anti-TMPRSS11E antibody bound by the substance.
  • the targeted cancer is not particularly limited, but is preferably lung cancer, cervical cancer, or esophageal cancer.
  • the cancer may be either a primary lesion or a metastatic lesion.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a patient by either oral or parenteral administration. Preferably, it is parenteral administration. Specific examples of such administration methods include injection administration, nasal administration, transpulmonary administration, and transdermal administration.
  • injection administration the pharmaceutical composition of the present invention can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dosage for example, the dosage can be selected in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg body weight per administration. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.001 to 100,000 mg per patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these doses.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated in accordance with a conventional method (for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA) and contains both pharmaceutically acceptable carriers and additives. It may be.
  • a conventional method for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA
  • pharmaceutically acceptable carriers and additives It may be.
  • it is not limited to these, and other commonly used carriers can be used as appropriate.
  • silicic acid lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylacetal diethylaminoacetate, polyvinylpyrrolidone, gelatin, medium chain fatty acid triglyceride
  • the carrier include polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, and inorganic salts.
  • the anti-TMPRSS11E antibody of the present invention can cause injury to TMPRSS11E-expressing cells or suppress cell proliferation by contacting with TMPRSS11E-expressing cells. Such utilization is also within the scope of the present invention.
  • the antibody used is not particularly limited, and for example, any of the antibodies described above can be used.
  • the cell to which the anti-TMPRSS11E antibody binds is not particularly limited as long as TMPRSS11E is expressed.
  • a preferable TMPRSS11E-expressing cell in the present invention is a cancer cell. More preferred are lung cancer cells or cervical cancer or esophageal cancer cells. The above method can be applied to both primary and metastatic lesions of these cancers.
  • contact is performed, for example, by adding an antibody to a culture solution of TMPRSS11E-expressing cells cultured in a test tube.
  • contact is further performed by administering to a non-human animal transplanted with TMPRSS11E-expressing cells into the body or an animal having cancer cells that endogenously express TMPRSS11E.
  • the following method is preferably used as a method for evaluating or measuring the cytotoxicity caused to the TMPRSS11E-expressing cells by contact with the anti-TMPRSS11E antibody.
  • Examples of a method for evaluating or measuring the cytotoxic activity in a test tube include the above-described measuring methods such as ADCC activity and CDC activity. Whether the anti-TMPRSS11E antibody has ADCC activity or CDC activity can be measured by a known method (for example, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E , Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)).
  • an antibody having the same isotype as the anti-TMPRSS11E antibody and not having the cytotoxic activity is used as the control antibody in the same manner as the anti-TMPRSS11E antibody, and the anti-TMPRSS11E antibody is stronger than the control antibody. It can be determined to have an activity when it exhibits a damaging activity.
  • Antibody isotype is defined by the heavy chain constant region sequence of the amino acid sequence of the antibody. In vivo, the antibody isotype is finally determined by class switching caused by genetic recombination on the chromosome that occurs during maturation of antibody-producing B cells. Differences in isotypes are reflected in differences in the physiological and pathological functions of antibodies. Specifically, for example, it is known that the intensity of cytotoxic activity is influenced by the antibody isotype as well as the antigen expression level. Therefore, in the measurement of the cytotoxic activity described above, it is preferable to use the same isotype as the test antibody as the antibody used as a control.
  • the test antibody in order to evaluate or measure the cytotoxic activity in vivo, for example, after transplanting TMPRSS11E-expressing cancer cells into the skin or subcutaneously of a non-human test animal, the test antibody is administered daily or at intervals of several days from that day or the next day. Administer intravenously or intraperitoneally. Cytotoxic activity can be determined by measuring tumor size over time. Similar to the in vitro evaluation, a control antibody having the same isotype was administered, and cytotoxic activity was observed when the tumor size in the anti-TMPRSS11E antibody administration group was significantly smaller than the tumor size in the control antibody administration group. Then it can be determined.
  • a nude (nu / nu) mouse in which the thymus is genetically deleted and the function of the T lymphocyte is deleted can be preferably used.
  • the mouse it is possible to eliminate the involvement of T lymphocytes in the test animal in the evaluation and measurement of the cytotoxic activity by the administered antibody.
  • Diagnostic agent diagnosis method
  • the present invention also provides a method for diagnosing cancer, which comprises detecting TMPRSS11E protein or a gene encoding TMPRSS11E protein. Significant increase in expression of TMPRSS11E has been confirmed in various cancer tissues or cancer cell lines. Therefore, TMPRSS11E is useful as a marker for specifically detecting cancer.
  • One specific example of the diagnostic method of the present invention is a cancer diagnostic method including the following steps. (a) preparing a sample isolated from a subject; (b) A step of detecting the expression level of TMPRSS11E protein or TMPRSS11E gene in the sample. In the method of the present invention, (c) based on the expression level of the TMPRSS11E protein or TMPRSS11E gene, evaluating the possibility that the subject has cancer, May be included.
  • cancer is diagnosed by detecting TMPRSS11E protein in a sample.
  • the detection of TMPRSS11E protein is preferably performed using an antibody that recognizes TMPRSS11E protein.
  • detection includes quantitative or qualitative detection.
  • qualitative detection can include the following measurements. ⁇ Measurement of whether or not TMPRSS11E protein is present ⁇ Measurement of whether or not TMPRSS11E protein is present in a certain amount or more ⁇ Measurement of comparing the amount of TMPRSS11E protein with other samples (for example, control samples)
  • quantitative detection includes measurement of the concentration of TMPRSS11E protein, measurement of the amount of TMPRSS11E protein, and the like.
  • the test sample in the present invention is not particularly limited as long as it is a sample that may contain the TMPRSS11E protein.
  • a sample collected from the body of a living organism such as a mammal is preferable. Further preferred samples are samples taken from humans.
  • Specific examples of the test sample include blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph fluid, saliva, urine, tissue, and the like.
  • a preferred sample is a sample obtained from a test sample such as a specimen in which tissues or cells collected from the body of an organism are fixed, or a culture solution of cells.
  • the cancer diagnosed by the present invention is not particularly limited and may be any cancer. Specific examples include lung cancer, cervical cancer, and esophageal cancer. In the present invention, both primary lesions and metastatic lesions of these cancers can be diagnosed.
  • the present invention when a protein is detected in a test sample, cancer is diagnosed using the level as an index. Specifically, when the amount of TMPRSS11E protein detected in a test sample is large compared to a negative control or a healthy subject, the subject is more likely to have cancer or suffer from cancer in the future. It is shown. That is, the present invention relates to a method for diagnosing cancer including the following steps. (1) detecting a TMPRSS11E expression level in a biological sample collected from a subject, and (2) A step of determining that the subject has cancer when the expression level of TMPRSS11E detected in (1) is higher than that of a control.
  • the control refers to a sample as a reference for comparison, and includes a negative control and a biological sample of a healthy person.
  • the negative control can be obtained by collecting a biological sample of a healthy person and mixing as necessary.
  • the control expression level of TMPRSS11E can be detected in parallel with the expression level of TMPRSS11E in the biological sample of the subject.
  • the expression level of TMPRSS11E in biological samples of many healthy subjects can be detected in advance, and the standard expression level in healthy subjects can be statistically determined. Specifically, for example, an average value ⁇ 2 ⁇ standard deviation (S.D.) or an average value ⁇ 3 ⁇ standard deviation (S.D.) can be used as the standard value.
  • the mean ⁇ 2 ⁇ standard deviation (S.D.) contains 80% and the mean ⁇ 3 ⁇ standard deviation (S.D.) contains 90% of healthy subjects.
  • the expression level of TMPRSS11E in the control can be set using the ROC curve.
  • the ROC curve (receiver operating characteristic curve) is a graph showing the detection sensitivity on the vertical axis and the false positive rate (that is, “1-specificity”) on the horizontal axis.
  • an ROC curve can be obtained by plotting changes in sensitivity and false positive rate when the reference value for determining the expression level of TMPRSS11E in a biological sample is continuously changed.
  • the “reference value” for obtaining the ROC curve is a numerical value temporarily used for statistical analysis.
  • the “reference value” for obtaining the ROC curve is generally changed continuously within a range that can cover all selectable reference values. For example, the reference value can be changed between the minimum value and the maximum value of the measured values of TMPRSS11E of the population to be analyzed.
  • a standard value that can be expected to have a desired detection sensitivity and accuracy is also called a cut-off value.
  • the expression level of TMPRSS11E detected in (1) is compared with the cut-off value.
  • the expression level of TMPRSS11E detected in (1) is higher than the cut-off value, the subject's cancer is detected.
  • the expression level of TMPRSS11E can be determined by any method. Specifically, the expression level of TMPRSS11E can be determined by evaluating the amount of TMPRSS11E mRNA, the amount of TMPRSS11E protein, or the biological activity of TMPRSS11E protein. The amount of TMPRSS11E mRNA or protein can be determined by a method as described herein.
  • a particularly suitable subject is a human.
  • the TMPRSS11E protein of the animal species is detected.
  • the method for detecting the TMPRSS11E protein contained in the test sample is not particularly limited, but it is preferably detected by an immunological method as exemplified below using an anti-TMPRSS11E antibody.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA
  • Radioimmunoassay RIA
  • Enzyme immunoassay EIA
  • Fluorescence immunoassay FIA
  • Luminescent immunoassay LIA
  • Immunoprecipitation IP
  • TIA Immunoturbidimetry
  • WB Western blot
  • IHC Immunohistochemistry
  • SRID Immunodiffusion
  • Dot blot Slot blot method.
  • the immunohistochemistry (IHC) method includes a step of detecting TMPRSS11E protein on a section on which tissue or cells obtained from a patient suffering from cancer is immobilized, and is preferable as a method for diagnosing cancer.
  • One of the immunological assay methods One of the immunological assay methods.
  • the immunological methods described above, such as the immunohistochemistry (IHC) method, are methods known to those skilled in the art.
  • TMPRSS11E is a membrane protein whose expression is specifically enhanced in cancer cells
  • cancer cells or cancer tissues can be detected with an anti-TMPRSS11E antibody.
  • cancer tissue in a living body can be detected with an anti-TMPRSS11E antibody.
  • this method comprises (1) a step of administering an antibody that binds to a TMPRSS11E protein labeled with a labeling substance such as a radioisotope to a subject, and (2) detecting the accumulation of the labeling substance.
  • the antibodies can be detectably labeled. For example, the behavior of a fluorescent substance, a luminescent substance, or an antibody labeled with a radioisotope in a living body can be traced. An antibody labeled with a fluorescent substance or a luminescent substance can be observed using an endoscope or a laparoscope.
  • a radioisotope can image the localization of an antibody by following its radioactivity.
  • the localization of anti-TMPRSS11E antibody in vivo indicates the presence of cancer cells.
  • a positron emitting nuclide can be used as a radioisotope for labeling an antibody to detect cancer in vivo.
  • antibodies can be labeled with positron emitting nuclides such as 18F, 55Co, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr, and 124I.
  • a known method Acta Oncol. 32, 825-830, 1993 can be used to label the anti-TMPRSS11E antibody with these positron emitting nuclides.
  • the radiation emitted by the radionuclide is measured from outside the body by PET (positron tomography device) and converted into an image by computer tomography. Is done.
  • PET is a device for non-invasively obtaining data on the behavior of a drug in the body. With PET, radiation intensity can be quantitatively imaged as signal intensity.
  • antigen molecules that are highly expressed in a specific cancer can be detected without taking a sample from the patient.
  • the anti-TMPRSS11E antibody can be radiolabeled with a short-lived nuclide using a positron emitting nuclide such as 11C, 13N, 15O, 18F, and 45Ti in addition to the above-mentioned nuclide.
  • a positron emitting nuclide such as 11C, 13N, 15O, 18F, and 45Ti in addition to the above-mentioned nuclide.
  • the anti-TMPRSS11E antibody can be labeled with various radioisotopes.
  • the anti-TMPRSS11E antibody administered to the patient accumulates in the primary and metastatic lesions according to the specificity of the anti-TMPRSS11E antibody for the pathological tissue at each site. If the anti-TMPRSS11E antibody is labeled with a positron emitting nuclide, the presence of the primary and metastatic foci is detected by the localization of the radioactivity by detecting the radioactivity.
  • 25-4000 keV gamma particles or positron emission activity values can be used appropriately.
  • an appropriate nuclide is selected and administered in a larger amount, a therapeutic effect can be expected.
  • a gamma particle of 70-700 keV or a nuclide that gives a positron emission value can be used.
  • the expression of a TMPRSS11E polynucleotide is detected.
  • the polynucleotide detected in the present invention is not particularly limited, but mRNA is preferable.
  • detection includes quantitative or qualitative detection. For example, the following measurement operation can be given as qualitative detection. -Simply measuring whether TMPRSS11E mRNA is present, Measurement of whether or not TMPRSS11E mRNA is present above a certain amount, ⁇ Measurement that compares the amount of TMPRSS11E mRNA with other samples (eg, control samples).
  • quantitative detection includes measurement of the concentration of TMPRSS11E mRNA, measurement of the amount of TMPRSS11E mRNA, and the like.
  • test sample in the present invention any sample that may contain TMPRSS11E mRNA can be used.
  • a sample collected from the body of a living organism such as a mammal is preferable, and a sample collected from a human is more preferable.
  • Specific examples of the test sample include blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph fluid, saliva, urine, tissue, and the like.
  • a preferable sample includes a sample obtained from a test sample, such as a specimen in which tissues or cells collected from the body of an organism are fixed, or a culture solution of cells, and the like.
  • an in situ hybridization method is preferably used.
  • the in situ hybridization method has been developed as a method for confirming the presence or distribution of specific DNA or RNA in cells or tissues and the intensity of its expression. In principle, this utilizes the property that a probe nucleic acid having a base sequence complementary to a specific nucleic acid sequence in a cell specifically forms a complex.
  • RI radioisotope
  • hapten antigenic substance
  • an RI label can be preferably used.
  • a fluorescent label using a non-radioactive material such as biotin or hapten such as digoxigenin can be used.
  • a detection method by fluorescence in situ hybridization called FISH is used.
  • the cancer diagnosed by the present invention is not particularly limited. Specific examples include lung cancer, cervical cancer, and esophageal cancer. In the present invention, both primary lesions and metastatic lesions of these cancers can be diagnosed.
  • any animal species that expresses the TMPRSS11E gene can be used as the subject.
  • a particularly suitable subject is a human.
  • the TMPRSS11E gene of the animal species is detected.
  • TMPRSS11E mRNA contained in the sample is detected.
  • cDNA synthesized from mRNA can also be detected.
  • if mRNA of TMPRSS11E or cDNA encoding TMPRSS11E is detected in a test sample it is determined that there is a possibility of cancer. For example, if the amount of TMPRSS11E mRNA or cDNA encoding TMPRSS11E detected in a test sample is higher than that in a negative control or healthy subject, the subject has cancer or will suffer from future cancer. It is shown that there is a high probability of doing.
  • Methods for detecting mRNA are known. Specifically, for example, a nucleic acid hybridization method using an immobilized sample selected from a gene chip, a cDNA array, and a membrane filter, an RT-PCR method, a real-time PCR method, a subtraction method, a differential display method, a differential high method. Hybridization methods, cross-hybridization methods, and the like can be used in the present invention.
  • the detection method of the present invention described above can be automated using various automatic inspection apparatuses. By automation, a large number of samples can be inspected in a short time.
  • the present invention also provides a diagnostic agent or kit for diagnosing cancer comprising a reagent for detecting TMPRSS11E protein in a test sample.
  • the diagnostic agent of the present invention contains at least an anti-TMPRSS11E antibody.
  • a kit for diagnosing cancer can be obtained by combining the diagnostic reagent for cancer of the present invention with other elements used for detection of TMPRSS11E. That is, the present invention includes an antibody that binds to TMPRSS11E, a reagent for detecting the binding between the antibody and TMPRSS11E, and a kit for diagnosis of cancer, which may further comprise a control sample comprising a biological sample containing TMPRSS11E. About.
  • the kit of the present invention may further include instructions for explaining the measurement operation.
  • Example 1 mRNA expression analysis of TMPRSS11E using real-time PCR Lung cancer cell lines h2009, h2087, h2122, and h209 were purchased from ATCC. After culturing under the conditions described in the attached material, 1 ⁇ 10 7 cells were collected, and total RNA was prepared using Trizol (Invitrogen). After 1 ⁇ g of total RNA was treated with DNase I (Invitrogen), cDNA was synthesized using oligo (dT) as a primer using SuperScript III First Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). For various normal tissue total RNAs shown in Table 1, cDNA was synthesized in the same manner.
  • real-time PCR was performed by the intercalator method using SYBR Green I. That is, 20 ⁇ l of reaction including SYBR (registered trademark) Premix Ex Taq (Takara), sense primer (SEQ ID NO: 31), and antisense primer (SEQ ID NO: 32) using cDNA derived from 3.3 ng of total RNA equivalent as a template.
  • the liquid was subjected to 33 cycles of 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds.
  • a standard curve was created based on a sample using a PCR product purified in advance as a template, and the amount of cDNA in the sample was converted from the quantitative value. As shown in FIG.
  • TMPRSS11E mRNA showed high levels in lung cancer strains h2009, h2087, h2122, and h209, and in normal tissues, it was confined to the tonsils, esophagus, and cervix.
  • TMPRSS11E (Accession No. NM 014058) is a dimorphic membrane protein consisting of 423 amino acids.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. It has trypsin-like serine protease domain and SEA domain in extracellular region. Since we found that TMPRSS11E is highly expressed in certain cancers this time, we started the production of anti-TMPRSS11E antibody.
  • the amplification product by PCR reaction was inserted into pGEM-T easy using pGEM-T Easy Vector System I (Promega). The sequence was confirmed by ABI3730 DNA Analyzer. This was cleaved with EcoRI and NotI and then cloned into the pMCN vector.
  • the pMCN vector can be induced for expression under the mouse CMV promoter (Accession No. U68299) and has a neomycin resistance gene incorporated therein.
  • This expression plasmid DNA was introduced into DG44 cells and Ba / F3 cells by electroporation, and a constant expression strain was established by selection with 500 ⁇ g / mL geneticin. DG44 cells were purchased from Invitrogen, and Ba / F3 was purchased from RIKEN.
  • sTMPRSS11Ep1 / mouse IgG2a Fc fusion protein As an immunogen, a fusion protein of sTMPESS11Ep1 region (Ser159-Ile423) containing serine protease domain and mouse IgG2aFc was prepared. PCR reaction was performed using a sense primer to which an EcoRI recognition sequence, a kozak sequence and a mouse IL3 signal sequence were added at the 5 ′ end, and an antisense primer to which a CpoI recognition sequence was added.
  • pMCDN Cloned into mIgG2aFc was pMCDN Cloned into mIgG2aFc.
  • pMCDN mIgG2aFc is derived from the pMCN vector, and the Fc sequence below the hinge of mouse heavy chain IgG2a is inserted into the EcoRI and NotI recognition sites, and the sTMPRSS11Ep1 and mIgG2aFc sequences are linked by the CpoI recognition sequence.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 33 is sTMPRSS11Ep1
  • the base sequence of mIgG2aFc, the sequence represented by SEQ ID NO: 34 is sTMPRSS11Ep1
  • the amino acid sequence of mIgG2aFc is shown.
  • pMCDN sTMPRSS11Ep1 mIgG2aFc was introduced into DG44 cells (Invitrogen) by electroporation, and stationary expression cells were established by selection with 500 ⁇ g / mL geneticin. Perform large-scale culture of cells with constant expression, and use sTMPRSS11Ep1 from the culture supernatant. The mIgG2aFc protein was purified.
  • the culture supernatant was charged onto a Hi Trap rProtein A (GE) column, washed with a binding buffer (20 mM sodium phosphate (pH 7.0)), and then an elution buffer (0.1 M glycine-HCl (pH 2.7)). Eluted with. Elution was performed in a tube to which neutralization buffer (1M Tris-HCl (pH 9.0)) was added, and neutralized immediately. Next, gel filtration with Superdex 200 HR 26/60 (GE) was performed, and the solution was replaced with PBS. The purified protein was quantified using the DC protein assay (BIO-RAD) and converted using the attached bovine IgG as a standard.
  • mice or MRL / MpJUmmCrj-lpr / lpr mice (hereinafter, MRL / lpr mice, purchased from Charles River, Japan) were used as immunized animals. Immunization starts at 6 weeks of age, and sTMPRSS11Ep1 for the first immunization mIgG2aFc was prepared to 50 ⁇ g / animal, and emulsified with Freund's complete adjuvant (FCA, Becton Dickinson) was administered subcutaneously.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • RPMI1640 medium (GIBCO BRL), dilute PEG1500, remove PEG1500 by centrifugation, then inoculate a suspension in RPMI1640 with 10% FBS into a 96-well culture plate to 100 ⁇ L / well did.
  • RPMI1640 (hereinafter referred to as HAT medium) containing 10% FBS, 1 x HAT media supplement (SIGMA), 0.5 x BM-Condimed H1 Hybridoma cloning supplement (Roche Diagnostics) to 100 ⁇ L / well Added.
  • Half of the culture broth was replaced with HAT medium after a few days, and screening was performed using the culture supernatant after 7 days.
  • Antibody purification was performed using Hi Trap Protein G HP in the same manner as described above for the culture supernatant of hybridomas cultured in HAT medium using FBS (Ultra low IgG) (GIBCO BRL) as serum.
  • FBS Ultra low IgG
  • GIBCO BRL GIBCO BRL
  • the eluted fraction was replaced with PBS using a PD-10 column (Amersham) and stored at 4 ° C.
  • the purified antibody was quantified using DC protein assay (BIO-RAD) and converted using the attached bovine IgG as a standard.
  • RNA was extracted from 1 ⁇ 10 7 hybridoma cells using RNeasy Plant Mini Kits (QIAGEN). Using 1 ⁇ g of total RNA, complementary to SMART RACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH), synthetic oligonucleotide MHC-IgG1 (SEQ ID NO: 35) complementary to mouse IgG1 constant region sequence or mouse ⁇ chain constant region base sequence The 5 ′ terminal gene fragment was amplified using a new synthetic oligonucleotide kappa (SEQ ID NO: 36). The reverse transcription reaction was performed at 42 ° C.
  • PCR solution is 5 ⁇ L of 10 ⁇ Advantage 2 PCR Buffer, 5 ⁇ L of 10 ⁇ Universal Primer A Mix, 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 ⁇ L of Advantage 2 Polymerase Mix (above, manufactured by CLONTECH), Contains 2.5 ⁇ L reverse transcription product, 10 pmole of synthetic oligonucleotide MHC-IgG1 or kappa, 5 cycles of 94 ° C. initial temperature for 30 seconds, 94 ° C. for 5 seconds, 72 ° C.
  • the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of TM094 is shown in SEQ ID NO: 37, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 38, the nucleotide sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 39, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 40.
  • the base sequence of the heavy chain variable region of TM191 is shown in SEQ ID NO: 41, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 42, the base sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 43, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 44.
  • Example 4 Production of anti-TMPRSS11E mouse-human chimerized antibody
  • the heavy chain and light chain variable region sequences of each antibody were linked to human heavy chain and human light chain constant region sequences.
  • PCR was performed using a Kozak sequence complementary to the 5 ′ terminal base sequence of the variable region, a synthetic oligonucleotide having an EcoRI site, and a synthetic oligonucleotide complementary to the 3 ′ terminal base sequence having an NheI site. Went.
  • PCR was performed using a Kozak sequence complementary to the 5 ′ terminal base sequence of the variable region, a synthetic oligonucleotide having a BamHI site, and a synthetic oligonucleotide complementary to the 3 ′ terminal base sequence having a BsiWI site. Went.
  • the obtained PCR product was used as an antibody expression plasmid pMCDN. Cloned into G1k.
  • pMCDN G1k has a structure in which a human IgG1 constant region is cloned into a pMCDN vector, and a mouse heavy chain variable region and a human heavy chain ( ⁇ 1 chain) constant region are linked by an NheI site.
  • Another expression unit containing a mouse CMV promoter and a human ⁇ chain constant region are inserted, and the mouse light chain variable region and the human light chain ( ⁇ chain) constant region are linked by a BsiWI site.
  • This plasmid expresses neomycin resistance gene, DHFR gene, and anti-TMPRSS11E mouse-human chimerized antibody gene in animal cells.
  • the heavy chain base sequence of chimerized TM094 is shown in SEQ ID NO: 45
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 46
  • the light chain base sequence of chimerized TM094 is shown in SEQ ID NO: 47
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 48.
  • the base sequence of the heavy chain of chimerized TM191 is shown in SEQ ID NO: 49, the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 50, the base sequence of the light chain of chimerized TM191 is shown in SEQ ID NO: 51, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 52.
  • pMCDN G1k TM094, pMCDN G1k TM191 was introduced into DG44 cells by electroporation.
  • Anti-TMPRSS11E chimerized antibody constant expression CHO cells were established by selection with 500 ⁇ g / mL geneticin.
  • the culture supernatant was purified using a Hi Trap rProtein A column.
  • Purified antibodies chi.TM094 (DG), chi.TM191 (DG)
  • PD-10 column quantified by DC Protein Assay, and stored at 4 ° C.
  • Example 5 Production of low-fucose anti-TMPRSS11E mouse-human chimerized antibody
  • a method for enhancing the ADCC activity of an antibody a method of modifying the sugar chain of the antibody is known.
  • WO 99/54342 describes improving ADCC activity by modifying antibody glycosylation.
  • WO 00/61739 describes that ADCC activity is regulated by the presence or absence of fucose in the sugar chain of an antibody.
  • WO 02/31140 describes preparing an antibody having a sugar chain that does not contain ⁇ -1,6 core fucose by producing the antibody in YB2 / 0 cells.
  • CHO cells in which the fucose transporter gene is knocked out (CHO Examples relating to (FTKO) are described, and it is also possible to produce antibodies having sugar chains that do not contain ⁇ -1,6 core fucose.
  • the anti-TMPRSS11E mouse-human chimerized antibody expression plasmid constructed above is Introduced into FTKO cells by electroporation and selected with 500 ⁇ g / mL Geneticin, anti-TMPRSS11E chimerized antibody constant expression CHO FTKO cells were established. Next, the culture supernatant was purified using a Hi Trap rProtein A column. Purified antibodies (chi.TM094 (FTKO), chi.TM191 (FTKO)) were buffer-exchanged with PBS using a PD-10 column, quantified by DC Protein Assay, and stored at 4 ° C.
  • Example 6 Evaluation of binding activity of anti-TMPRSS11E antibody by flow cytometry The binding of the above-constructed TMPRSS11E constant-expressing cell and its parent strain was evaluated by flow cytometry.
  • Anti-TMPRSS11E antibody diluted to an appropriate concentration was added to 5 ⁇ 10 5 cells and allowed to react on ice for 1 hour. After washing the cells by centrifugation, FITC-labeled anti-human IgG antibody was added and allowed to react on ice for 1 hour. The cells were washed by centrifugation, suspended in a medium containing 2 ⁇ g / mL propidium iodide, and subjected to a FACS Calibur manufactured by Becton Dickinson. As shown in FIG.
  • TMPRSS11E is highly expressed not only at the RNA level but also at the protein level.
  • DAKO's QIFIKIT As a result of estimating the number of antigen expression per cell using DAKO's QIFIKIT, there are about 26,000 molecules expressed in H2009 and about 40,000 molecules in ME-180, indicating that they are sufficiently expressed as target antigens for antibody drugs. There was found.
  • Example 7 Measurement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity of anti-TMPRSS11E antibody 1.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • CD16-NK92 cells For culture of CD16-NK92 cells, 500 ⁇ g / ml geneticin, penicillin / streptomycin (Invitrogen), 0.2 mM inositol (Sigma), 0.1 mM 2-mercaptoethanol (Invitrogen), 0.02 mM folic acid (Sigma), 100 Alpha minimum essential medium without ribonucleosides and deoxyribonucleosides with L-glutamine medium (Invitrogen) containing U / ml recombinant human interleukin-2 (Peprotech), 10% horse serum (Invitrogen), 10% fetal bovine serum (Invitrogen) was used.
  • Invitrogen penicillin / streptomycin
  • 0.2 mM inositol Sigma
  • 0.1 mM 2-mercaptoethanol Invitrogen
  • 0.02 mM folic acid 100 Alpha minimum essential medium without ribonucleosides and deoxyribonucleosides with L
  • Specific chromium release rate (%) (AC) ⁇ 100 / (BC)
  • A is the radioactivity (cpm) of each well
  • B is the average value of the radioactivity (cpm) of wells with 100 ⁇ l of 2% Nonidet P-40 solution (Code No.252-23, Nacalai Tesque)
  • C is The average value of radioactivity (cpm) of wells to which 100 ⁇ l of medium was added is shown. The test was repeated, and the average value and standard deviation of the specific chromium release rate were calculated.
  • Example 8 Anti-tumor effect by anti-TMPRSS11E antibody using Hum-ZAP
  • Hum-ZAP was obtained by binding saporin, which is a protein synthesis inhibitory toxin, to an anti-human IgG antibody, and was produced by Advanced Targeting Systems.
  • saporin which is a protein synthesis inhibitory toxin
  • 500 cells / 50 ⁇ L / well of h2009 and ME-180 cells were seeded into a 96-well plate, and a mixture of 100 ng Hum-ZAP and 100 ng anti-TMPRSS11E chimerized antibody (TM094, TM191) was added.
  • TMPRSS11E belongs to the type 2 serine protease family and has a protease domain. Antibodies that bind to TMPRSS11E may neutralize this function.
  • a protease evaluation system was constructed using Enzchek Gelatinase / Collagenase Assay Kit (Molecular Probes). 1 ⁇ g of TM191 was added to 600 ng of the soluble human sTMPRSS11Ep1 / mouse IgG2a Fc fusion protein (11E-Fc) constructed as described above, and left at 4 ° C. for 1 hour.
  • Example 10 Immunoblot analysis with anti-TMPRSS11E antibody A fusion protein of the region of TMPRSS11E SEA domain (Tyr42-Arg191) and mouse IgG2a Fc region was prepared according to the above method. This was immunized to Balb / c mice and MRL / lpr mice, and hybridomas were established by the same method as described above. Screening was performed by ELISA using a pMALc2x vector from New England Biolabs, which was expressed and purified in Escherichia coli as a fusion protein of MBP and SEA domain.
  • RNA was extracted from a hybridoma producing EA230 showing strong binding activity, and the gene sequence of the antibody variable region was determined according to the above method.
  • the base sequence of the heavy chain variable region of EA230 is shown in SEQ ID NO: 53
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 54
  • the base sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 55
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 56.
  • Cell lysates of Ba / F3, TMPRSS11E-expressing Ba / F3 (BaF / TMPRSS11E), TMPRSS11E-negative cancer cell line VMRC-LCD, TMPRSS11E-positive cancer cell line h2009, and ME-180 were prepared.
  • NP-40 Lysis Buffer (0.5% (v / v) Nonidet P40, 20mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 5mM EDTA) to 1x10 6 cells, and let stand at 4 ° C for 15 minutes The supernatant after centrifugation (14,000 rpm, 15 min) was used as a lysate. The lysate corresponding to 2 ⁇ 10 5 cells was separated by SDS-PAGE and transferred to Immobilon-P (Millipore) using Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (BIO-RAD).
  • the membrane was gently washed with TBS-T (0.05% Tween20, TBS) and then shaken with TBS-T containing 5% skim milk for 1 hour. After shaking with TBS-T for about 10 minutes, 0.5 ⁇ g / mL EA230 antibody diluted with TBS-T containing 1% skim milk was added and shaken for 1 hour. Wash with TBS-T (10 minutes x 3 times), shake for 1 hour with HRP-anti-mouse IgG antibody (GE) diluted 1/2000 in TBS-T with 1% skim milk, and then wash with TBS-T ( 10 minutes x 3 times). Color development was performed using ECL-Plus (GE) and developed using Hyperfilm ECL (GE). As shown in FIG.
  • EA230 did not react with the Ba / F3 parent strain, and a band was detected at the position of several 50 kDa in the TMPRSS11E forced expression strain. Since the predicted molecular weight of TMPRSS11E is 47.7 kDa, it is likely that TMPRSS11E that has undergone sugar chain modification has been detected. That is, EA230 can specifically detect TMPRSS11E by immunoblotting. A similar band was detected in the cancer cell line, and it was confirmed that TMPRSS11E was highly expressed in the cancer cell line.
  • IHC analysis was performed using EA230.
  • Lung cancer tissue array as Test slide, Lung cancer tissues with corresponding normal tissues (ISU ABXIS, A716II), Cervical cancer tissue array as Multiple (uterine cervix) cervical squamous cancer tissue array (Biomax, CR803), as esophageal cancer tissue array Human Common Cancers Array (SuperBioChips, MA1) was used.
  • an Envision Kit manufactured by DAKO was used for staining.
  • the tissue was deparaffinized and then activated with an autoclave (120 ° C., 10 min) with 10 mM citrate buffer (pH 6.0), and stained with 10 ⁇ g / mL EA230 according to the attached manual.
  • an autoclave 120 ° C., 10 min
  • 10 mM citrate buffer pH 6.0
  • 10 ⁇ g / mL EA230 10 ⁇ g / mL EA230 according to the attached manual.
  • FIG. 8 strong staining of cancer tissues was observed in lung cancer, cervical cancer and esophageal cancer.
  • TMPRSS11E was also highly expressed in clinical cancer tissues (Lang and Schuller, 2001). Staining was confined to the cell membrane, and TMPRSS11E was considered promising as a target antigen for antibody drugs.
  • Example 12 In vivo antitumor effect of anti-TMPRSS11E antibody 1.
  • Preparation of mouse IgG2ak type TM191 The H191 and L chain variable region sequences of TM191 were excised from the human-mouse chimeric TM191 expression plasmid prepared in Example 4 and cloned into the pMCDN mG2ak vector.
  • the pMCDN mG2ak vector has a structure in which a mouse IgG2a constant region is cloned into the pMCDN vector, and the mouse H chain variable region and the constant region are linked by an NheI site.
  • Another expression unit containing a mouse CMV promoter and a mouse ⁇ chain constant region are inserted, and the mouse L chain variable region and the constant region are linked by a BsiWI site.
  • This plasmid expresses neomycin resistance gene, DHFR gene, mouse IgG2a type TM191 antibody gene in animal cells.
  • the base sequence of the H chain of mouse IgG2a type TM191 is shown in SEQ ID NO: 57
  • the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 58
  • the base sequence of the L chain of mouse kappa type TM191 is shown in SEQ ID NO: 59
  • the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 60.
  • pMCDN mG2ak TM191 was introduced into DG44 cells and CHO FTKO by electroporation. Stationary expression CHO cells were established by selection with 500 ⁇ g / mL Geneticin. Next, the culture supernatant was purified using a Hi Trap rProtein A column. The purified antibodies (TM191 mIgG2ak (DG) and TM191 mIgG2ak (FTKO)) were buffer-exchanged with PBS using a PD-10 column, quantified by DC Protein Assay, and stored at 4 ° C.
  • DG mIgG2ak
  • FTKO TM191 mIgG2ak
  • TMPRSS11E-expressing hepatoma cell line SK-Hep-1 cell a hepatoma cell line, was purchased from ATCC and purchased at D-MEM (SIGMA), 10% FBS (BOVAGEN), 1% penicillin-streptomyicin (GIBCO) Cultured.
  • SIGMA D-MEM
  • FBS FBS
  • GEBCO penicillin-streptomyicin
  • the full-length TMPRSS11E gene cloned in Example 2 was cloned into the pCOSII-Zeo vector.
  • the pCOSII-Zeo vector incorporates a zeocin resistance gene.
  • the prepared TPMRSS11E expression plasmid was introduced into SK-Hep-1 cells by electroporation, selected with 800 ⁇ g / mL Zeocin, and a TMPRSS11E expression strain was established by limiting dilution. As shown in FIG. 9, in flowcytometry, TM191 did not bind to the parent strain SK-Hep1, and strong binding to TMPRSS11E forced expression strain was shown.
  • TM191 mIgG2ak (DG) and TM191 mIgG2ak (FTKO) prepared in 1. were administered at a dose of 0.5 mg / mL (5 mg / kg) using PBS (-) (SIGMA) on the day of administration. Group), or 2.5 mg / mL (25 mg / kg administration group), and the mice were grouped in 3.1 and administered via the tail vein at 10 mL / kg. Administration was performed once a week for a total of 4 times. Tumor size and body weight were measured twice a week during this period and until one week after the final administration.
  • the antibody of the present invention can be used as an anticancer agent and a diagnostic agent for cancer.

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Abstract

【課題】本発明の課題は、癌の治療及び診断のための新規な手段を提供することにある。 【解決手段】TMPRSS11Eに対するモノクローナル抗体を取得し、本抗体はTMPRSS11Eのネイティブフォームに結合し、フローサイトメトリーにてTMPRSS11Eは癌細胞株で細胞膜上に高発現する事を見出した。本抗体は抗体依存性細胞傷害活性(ADCC活性)、インターナライズ活性による高腫瘍効果を示し、治療標的として有望である。また、本抗体はプロテアーゼ活性の中和活性を有し、TMPRSS11Eの機能阻害による効果も期待される。

Description

抗TMPRSS11E抗体を用いた癌の診断と治療
　本出願は、日本特許出願２００９－１００１６３（２００９年４月１６日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
　本発明は、抗TMPRSS11E抗体、及び前記抗体を利用した癌の診断と治療に関する。
　TMPRSS11E(別名DESC1)は、２型膜貫通性のセリンプロテアーゼファミリーに属する。扁平上皮癌で発現が低下する新規遺伝子として発見された(Lang　and　Schuller,　2001;　Sedghizadeh　et　al.,　2006)。精製した可溶型TMPRSS11Eはプロテアーゼ活性を示し、またTMPRSS11Eを強制発現させた細胞で細胞浸潤能が上昇する事が報告された(Viloria　et　al.,　2007)。本論文ではポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色の結果、正常腎臓、正常肝臓での強い染色に加え、一部の腎臓癌、乳癌での染色が報告されている。
　しかしながら、TMPRSS11Eをターゲットとした抗体が抗癌剤などの医薬組成物として有効であるか否かは報告されていない。
Lang,　J.C.　and　Schuller,　D.E.　(2001)　Differential　expression　of　a　novel　serine　protease　homologue　in　squamous　cell　carcinoma　of　the　head　and　neck.　Br　J　Cancer　84,　237-43. Sedghizadeh,　P.P.,　Mallery,　S.R.,　Thompson,　S.J.,　Kresty,　L.,　Beck,　F.M.,　Parkinson,　E.K.,　Biancamano,　J.　and　Lang,　J.C.　(2006)　Expression　of　the　serine　protease　DESC1　correlates　directly　with　normal　keratinocyte　differentiation　and　inversely　with　head　and　neck　squamous　cell　carcinoma　progression.　Head　Neck　28,　432-40. Viloria,　C.G.,　Peinado,　J.R.,　Astudillo,　A.,　Garcia-Suarez,　O.,　Gonzalez,　M.V.,　Suarez,　C.　and　Cal,　S.　(2007)　Human　DESC1　serine　protease　confers　tumorigenic　properties　to　MDCK　cells　and　it　is　upregulated　in　tumours　of　different　origin.　Br　J　Cancer　97,　201-9.
　本発明の課題は、癌の治療及び診断のための新規な手段を提供することにある。
　今回我々は、TMPRSS11Eに対するモノクローナル抗体を初めて取得した。本抗体はTMPRSS11Eのネイティブフォームに結合し、フローサイトメトリーにてTMPRSS11Eは癌細胞株で細胞膜上に高発現する事を見出した。本抗体は抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）、インターナライズ活性による高腫瘍効果を示し、治療標的として有望であることを示した。また、本抗体はプロテアーゼ活性の中和活性を有し、TMPRSS11Eの機能阻害による効果も期待される。
　すなわち、本発明は、これらの知見に基づいてなされたものであり、抗TMPRSS11E抗体を用いた癌の診断と治療に関する。本発明は、以下の[１]～[２０]を提供する。
[１]TMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体。
[２]細胞傷害活性を有することを特徴とする[１]に記載の抗体。
[３]細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）である[２]に記載の抗体。
[４]細胞傷害活性が、補体依存性細胞傷害活性（CDC活性）である[２]に記載の抗体。
[５]インターナライズ活性を有することを特徴とする[１]～[４]いずれかに記載の抗体。
[６]細胞傷害性物質が結合していることを特徴とする[５]に記載の抗体。
[７]中和活性を有することを特徴とする[１]～[６]いずれかに記載の抗体。
[８]以下のいずれかに記載のTMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（２）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（３）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（５）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（６）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（７）（１）の重鎖可変領域と（４）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（８）（２）の重鎖可変領域と（５）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（９）（３）の重鎖可変領域と（６）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（１０）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
（１１）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体が結合するTMPRSS11Eタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
[９]配列番号２の159-423番目のアミノ酸配列からなるエピトープを認識することを特徴とする[１]～[７]のいずれかに記載の抗体。
[１０][１]～[９]いずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
[１１]抗癌剤である[１０]に記載の医薬組成物。
[１２]肺癌または子宮頸癌または食道癌を対象とする抗癌剤である[１１]に記載の医薬組成物。
[１３]以下の工程を含む癌の診断方法。
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11E遺伝子の発現量を検出する工程。
[１４]肺癌または子宮頸癌または食道癌を診断するためのものである、[１３]に記載の診断方法。
[１５][１]～[９]のいずれかに記載の抗体を含む癌の診断薬。
[１６]肺癌または子宮頸癌または食道癌を診断するためのものである、[１５]に記載の診断薬。
[１７]癌の診断または治療において使用するための、[１]～[９]のいずれかに記載の抗体。
[１８]癌が、肺癌または子宮頸癌または食道癌である、[１７]または[１８]に記載の抗体。
[１９][１]～[９]のいずれかに記載の抗体を使用する、癌の治療方法。
[２０]肺癌または子宮頸癌または食道癌を治療するためのものである、[１９]に記載の癌の治療方法。
　本発明によれば、癌、とくに肺癌または子宮頸癌または食道癌の治療と診断のための新規な手段が提供される。
図１は、正常組織及び癌細胞株におけるTMPRSS11E　mRNA量を示す。 図２は、フローサイトメトリーによるキメラ化抗TMPRSS11E抗体の結合活性を示す。 図３は、フローサイトメトリーによる抗TMPRSS11E抗体の癌細胞株に対する結合活性を示す。 図４は、癌細胞株に対する抗TMPRSS11E抗体によるADCC活性を示す。 図５は、Hum-ZAPを用いた抗TMPRSS11E抗体による抗腫瘍効果を示す。 図６は、抗TMPRSS11E抗体によるプロテアーゼ中和活性を示す。 図７は、抗TMPRSS11E抗体によるイムノブロット解析を示す。 図８は、抗TMPRSS11E抗体による免疫組織化学解析を示す。 図９は、フローサイトメトリーによる抗TMPRSS11E抗体のSK-Hep1親株およびTMPRSS11E発現株に対する結合活性を示す。 図１０は、抗TMPRSS11E抗体による抗腫瘍効果を示す。
１．TMPRSS11E
　TMPRSS11E(別名DESC1)は、２型膜貫通性のセリンプロテアーゼファミリーに属する。
　本発明で用いられるTMPRSS11Eタンパク質の由来は特に限定されず、公知のTMPRSS11Eタンパク質のいずれを用いることも可能である。好ましくは、TMPRSS11Eタンパク質はヒトTMPRSS11Eである。ヒトTMPRSS11Eのアミノ酸配列とこれをコードする塩基配列は当該分野において公知であり、公共のデータベースであるGenBankやUnigene等に、例えば、GenBank　Accession　No:NM　014058（塩基配列＝配列番号１、アミノ酸配列＝配列番号２）として登録されている。
　発明者らは、抗TMPRSS11E抗体を用いた発現解析の結果、TMPRSS11Eが肺癌または子宮頸癌または食道癌の組織で発現していることを見出した。
２．抗TMPRSS11E抗体
２．１　抗TMPRSS11E抗体
　本発明で用いられる抗TMPRSS11E抗体は、TMPRSS11Eタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは特に限定されない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体が使用できる。本発明において使用される抗TMPRSS11E抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体のTMPRSS11Eタンパク質への結合は特異性の高いものであることが好ましく、特にヒトTMPRSS11Eに特異的であることがより好ましい。
　本発明で使用される抗TMPRSS11E抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として取得できる。本発明で使用される抗TMPRSS11E抗体としては、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。
　本発明の抗TMPRSS11E抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子で修飾してもよい。また、後述するように、細胞傷害活性を有する化学療法剤や放射性化学物質等で修飾してもよい。
　本発明で用いられるTMPRSS11Eを認識する抗体の例として、例えば以下の抗体を挙げることができる。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（２）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（３）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（５）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（６）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（７）（１）の重鎖可変領域と（４）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（８）（２）の重鎖可変領域と（５）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（９）（３）の重鎖可変領域と（６）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（１０）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
（１１）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体が結合するTMPRSS11Eタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
　本発明において、本発明の抗体と同等の活性を有するとは、TMPRSS11Eへの結合活性、中和活性、インターナライズ活性及び／又はTMPRSS11Eを発現する細胞への細胞傷害活性（ADCC活性、CDC活性など）が同等であることをいう。本発明において活性が同等とは、必ずしも活性が同一であることは要求されず、例えば上述の（１）～（９）のいずれかの活性と比較して50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上の活性を有していればよい。活性の上限は特に限定されず、例えば1000%以下、500%以下、300%以下、150%以下、100%以下などの例をあげることができる。
　本発明の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体も本発明の範囲内であり、人為的に作製されたものでも、自然的に生じたものであってもよい。ポリペプチドに変異を導入する方法は、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法の一つである、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh,　T.　et　al.　(1995)　Gene　152,　271-275、Zoller,　MJ,　and　Smith,　M.(1983)　Methods　Enzymol.　100,　468-500、Kramer,　W.　et　al.　(1984)　Nucleic　Acids　Res.　12,　9441-9456、Kramer　W,　and　Fritz　HJ(1987)　Methods.　Enzymol.　154,　350-367、Kunkel,TA(1985)　Proc　Natl　Acad　Sci　USA.　82,　488-492、Kunkel　(1988)　Methods　Enzymol.　85,　2763-2766）などを用いて、当業者であれば、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
　このような変異体において、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）である。
　変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
　あるアミノ酸配列に対する１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、元のポリペプチドの生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark,　D.　F.　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA　(1984)　81,　5662-5666、Zoller,　M.　J.　and　Smith,　M.,　Nucleic　Acids　Research　(1982)　10,　6487-6500、Wang,　A.　et　al.,　Science　224,　1431-1433、Dalbadie-McFarland,　G.　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA　(1982)　79,　6409-6413）。すなわち、一般に、あるポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、各群に分類されたアミノ酸の間で相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いといわれている。本発明において、上記アミノ酸群の群内のアミノ酸間の置換を保存的置換と言う。
　また本発明は、上述の（１）～（９）いずれかの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体もまた提供する。上述の（１）～（９）の抗体の具体的な例として、本願実施例に記載されたTM094、TM191、EA230の抗体を挙げることができる。すなわち本発明は、TM094、TM191、EA230が認識するエピトープと同一のエピトープを認識する抗体も提供する。
　被験抗体が、ある抗体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。
　具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたTMPRSS11Eタンパク質を、候補の競合抗体の存在下、又は非存在下でプレインキュベートした後に、本発明の抗TMPRSS11E抗体が添加される。ウェル中のTMPRSS11Eタンパク質に結合した本発明の抗TMPRSS11E抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被験抗体）の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明の抗TMPRSS11E抗体のTMPRSS11Eタンパク質をコートしたウェルへの結合量は低下し、一方、被験抗体のTMPRSS11Eタンパク質をコートしたウェルへの結合量は増加する。
　ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイと言う。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。
　さらに被験抗体が本発明の抗TMPRSS11E抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合したいずれかの抗体を、いずれかの定常領域を認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体を測定することができる。
　候補の競合抗体の非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも80％、抗TMPRSS11E抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体は本発明の抗TMPRSS11E抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。
　また、本発明の抗体の好ましい態様として、TMPRSS11Eの159番目のSerから423番目のIleまでの領域または42番目のTyrから191番目のArgまでの領域を認識する抗体を挙げることができる。
　このような抗体は高い細胞傷害活性、インターナライズ活性および／または中和活性を有していることから、医薬品、特に抗癌剤として有用である。
２．２　遺伝子組換え型抗TMPRSS11E抗体
　抗体がヒトに投与される場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。遺伝子組換え型抗体とは、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを含む。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。
（１）キメラ抗体
　キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体をいう。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス－ヒト－異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される当該キメラ抗体を取得できる。
　キメラ抗体の定常領域には、ヒト抗体のものが使用される。例えば重鎖においては、Cγ１、Cγ２、Cγ３、Cγ４、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、及びCεを定常領域として利用することができる。また軽鎖においてはCκ、及びCλを定常領域として使用できる。これらの定常領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体自体の安定性、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体定常領域中の１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入することができる。
（２）ヒト化抗体
　一般にキメラ抗体が、ヒト以外の動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とから構成されるのに対して、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity　determining　region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR；framework　region）及びヒト抗体由来の定常領域とから構成される。ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
　抗体の可変領域は、通常、４つのFRにはさまれた３つのCDRで構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。
　ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばオーバーラップエクステンションPCR（Overlap　Extension　PCR）が公知である。オーバーラップエクステンションPCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加されたプライマーを用いる。プライマーは４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと相同性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利であるといわれている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
　また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
　最終的に３つのCDRと４つのFRが連結された可変領域遺伝子は、その5’末端と3'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体定常領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト化抗体発現用ベクターが作成できる。このベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、組換え細胞を培養し、ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、ヒト化抗体が培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP　239400　、国際公開WO　96/02576参照）。
　上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、ヒト化抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato,　K.et　al.,　Cancer　Res,　1993,　53,　851-856）。
（３）低分子化抗体
　本発明の抗体には、TMPRSS11Eタンパク質に結合する限り、IgG（IgG1、IgG2、IgG4など）に代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、又は、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、TMPRSS11Eタンパク質に結合する限り、低分子化抗体又はその修飾物であってもよい。
　低分子化抗体は、全長抗体（whole　antibody、例えばwhole　IgG等）の一部分が欠損している抗体断片を含む。TMPRSS11E抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）のいずれか、又は両方を含んでいることが好ましい。また、本発明における抗体断片はCDRを含んでいることが好ましい。本発明の抗体断片に含まれるCDRの数は特に限定されないが、重鎖CDR1、CDR2、CDR3、軽鎖CDR1、CDR2、CDR3の６つを少なくとも含んでいることが好ましい。
　VH又はVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入を含むことができる。さらにTMPRSS11E抗原への結合能を有する限り、VH及びVLのいずれか、又は両方の一部を欠損させることもできる。また、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single　chain　Fv）、ダイアボディー、sc(Fv)2（single　chain　(Fv)2）、scFv-Fcなどを挙げることができる。本発明において好ましい低分子化抗体はダイアボディー又はsc(Fv)2である。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。
　抗体の断片は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、特定の構造の抗体断片を与える。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知であり、パパイン消化の場合、F(ab)2又はFabを、ペプシン消化の場合、F(ab’)2又はFab’を与える。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co,　M.S.　et　al.,　J.　Immunol.（1994）152,　2968-2976、Better,　M.　&　Horwitz,　A.　H.　Methods　in　Enzymology（1989）178,　476-496、Plueckthun,　A.　&　Skerra,　A.　Methods　in　Enzymology（1989）178,　497-515、Lamoyi,　E.,　Methods　in　Enzymology（1986）121,　652-663、Rousseaux,　J.　et　al.,　Methods　in　Enzymology（1986）121,　663-669、Bird,　R.　E.　et　al.,　TIBTECH（1991）9,　132-137参照）。
　酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。本発明における低分子化抗体は、TMPRSS11Eに対する結合親和性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片であることができる。
i)ダイアボディー
　ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の抗体断片を指す（Holliger　P　et　al.,　Proc.Natl.Acad.Sci.USA　90:　6444-6448　(1993)、EP404,097号、WO93/11161号等）。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中で重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされる重鎖可変領域と軽鎖可変領域とは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。
ii）scFv
　scFvは、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston,　J.　S.　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　U.S.A,　1988,　85,　5879-5883）。scFvにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。可変領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から25残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。
　両鎖の可変領域は、たとえば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法による可変領域の連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするDNA配列、及び
抗体の軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするDNA配列
　増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、重鎖と軽鎖の可変領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各可変領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［重鎖可変領域DNA］－［ペプチドリンカーDNA］－［軽鎖可変領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。
　アセンブリーPCR用のプライマーは、［重鎖可変領域DNA］の5’側にアニールするプライマーと、［軽鎖可変領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各可変領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。
iii)scFv-Fc
　scFv-FcはscFvにFc領域を融合させた低分子化抗体である（Cellular　&　Molecular　Immunology　2006；　3：439-443）。scFv-Fcに用いられるscFvの由来は特に限定されないが、例えばIgM由来のscFvを用いることができる。また、Fcの由来は特に限定されないが、例えばヒトIgG（ヒトIgG1など）を用いることができる。従って、scFv-Fcの好ましい態様の例として、IgM抗体のscFv断片と、ヒトIgG1のCH2(たとえば、Cγ2)とCH3（たとえば、Cγ3)をヒトIgG1のヒンジ領域（Hγ)で連結させたscFv-Fcを挙げることができる。
iv)sc(Fv)2
　sc(Fv)2は、2つの重鎖可変領域（VH）及び2つの軽鎖可変領域（VL）をリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson　et　al、J　Immunol.　Methods　1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。
　また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。
　2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
　抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein　Engineering,　9(3),　299-305,　1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、さらに好ましくは5から30アミノ酸、特に好ましくは12から18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
　ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。例えば、ペプチドリンカーの場合次のようなアミノ酸配列を利用することができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号２１）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号２２）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号２３）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号２４）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号２５)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号２６）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号２７）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号２８）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号２９）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号３０）)n
　［nは１以上の整数である］。
　ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定するnは、通常１～５、好ましくは１～３、より好ましくは１又は２である。
　よって本発明において特に好ましいsc(Fv)2の態様としては、例えば、以下のsc(Fv)2を挙げることができる。
［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］。
　あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用して可変領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えば次のような化学架橋剤が公知である。これらの架橋剤は市販されている。N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、
ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、
ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、
エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－EGS）、
ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－DST）、
ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、及び
ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）など。
３．抗TMPRSS11E抗体の活性
（１）細胞障害活性
　癌などの細胞増殖性疾患の治療においては、抗体は、そのエフェクター活性を維持していることが望ましい。すなわち、本発明における好ましい抗体は、TMPRSS11Eに対する結合親和性とエフェクター機能の両方を有する。抗体のエフェクター機能には、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent　cell-mediated　cytotoxicity：ADCC）活性及び補体依存性細胞傷害（complement-dependent　cytotoxicity：CDC）活性が含まれる。本発明における治療用の抗体は、特に好ましくは、ADCC活性及びCDC活性のいずれか、又は両方をエフェクター機能として備える。
　本発明の抗体が治療目的で用いられる場合、抗体は好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。
　本発明における細胞傷害活性としては、例えば、ADCC活性、CDC活性などを挙げることができる。本発明において、ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。一方、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。
　抗TMPRSS11E抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current　protocols　in　Immunology,　Chapter7.　Immunologic　studies　in　humans,　Editor,　John　E,　Coligan　et　al.,　John　Wiley　&　Sons,　Inc.,(1993)等）。
　具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製が実施される。
i）エフェクター細胞の調製
　CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地（Invitrogen社製）中で脾臓細胞が分離される。10％ウシ胎児血清（FBS、HyClone社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。
ii）補体溶液の調製
　Baby　Rabbit　Complement（CEDARLANE社製）を10％　FBS含有培地（Invitrogen社製）にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
iii）標的細胞の調製
　TMPRSS11Eタンパク質を発現する細胞を0.2　mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）とともに、10％　FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより、該標的細胞を放射性標識できる。TMPRSS11Eタンパク質を発現する細胞としては、TMPRSS11Eタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、肺癌細胞、子宮頸癌、食道癌細胞等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10％　FBS含有RPMI1640培地にて３回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。
　ADCC活性、又はCDC活性は下記に述べる方法により測定できる。ADCC活性の測定の場合は、96ウェルＵ底プレート（Becton　Dickinson社製）に、標的細胞と、抗TMPRSS11E抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、エフェクター細胞100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0又は10μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンター（COBRAII　AUTO-GAMMA、MODEL　D5005、Packard　Instrument　Company社製）で放射活性を測定する。細胞傷害活性（%）は得られた値を使用して(A-C)　/　(B-C)　x　100の計算式に基づいて計算できる。Aは各試料における放射活性（cpm）、Bは1％　NP-40（nacalai　tesque社製)を加えた試料における放射活性（cpm）、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm）を示す。
　一方、CDC活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton　Dickinson社製）に、標的細胞と、抗TMPRSS11E抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、補体溶液100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0又は3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。
　一方、抗体コンジュゲートによる細胞傷害活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton　Dickinson社製）に、標的細胞と、抗TMPRSS11E抗体コンジュゲートを50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。炭酸ガスインキュベーター内で1から4時間培養する。抗体の終濃度は0又は3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。
（２）コンジュゲート抗体
　抗体に化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質などの細胞傷害性物質を結合することも可能である。このような抗体修飾物（以下、抗体コンジュゲートと称する。）は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
　抗TMPRSS11E抗体に結合させて細胞傷害活性を機能させる化学療法剤としては、たとえば次のような化学療法剤が例示できる：アザリビン（azaribine）、アナストロゾール（anastrozole）、アザシチジン（azacytidine）、ブレオマイシン（bleomycin）、ボルテゾミブ（bortezomib）、ブリオスタチン-1（bryostatin-1）、ブスルファン（busulfan）、カンプトテシン（camptothecin）、10-ヒドロキシカンプトテシン（10-hydroxycamptothecin）、カルムスチン（carmustine）、セレブレックス（celebrex）、クロラムブシル（chlorambucil）、シスプラチン（cisplatin）、イリノテカン（irinotecan）、カルボプラチン（carboplatin）、クラドリビン（cladribine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、シタラビン（cytarabine）、ダカルバジン（dacarbazine）、ドセタキセル（docetaxel）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノマイシングルクロニド（daunomycin　glucuronide）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デキサメタゾン（dexamethasone）、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ドキソルビシンブルクロニド（doxorubicin　glucuronide）、エピルビシン（epirubicin）、エチニルエストラジオール（ethinyl　estradiol）、エストラムスチン（estramustine）、エトポシド（etoposide）、エトポシドグルクロニド（etoposide　glucuronide）、フロキシウリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、フルタミド（flutamide）、フルオロウラシル（fluorouracil）、フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（hydroxyprogesterone　caproate）、ヒドロキシウレア（hydroxyurea）、イダルビシン（idarubicin）、イフォスファミド（ifosfamide）、ロイコボリン（leucovorin）、ロムスチン（lomustine）、メクロレタミン（mechlorethamine）、メドロキシプロゲステロンアセテート（medroxyprogesterone　acetate）、メゲストロールアセテート（megestrol　acetate）、メルファラン（melphalan）、メルカプトプリン（mercaptopurine）、メトトレキセート（methotrexate）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、ミトラマイシン（mithramycin）、ミトマイシン（mitomycin）、ミトタン（mitotane）、フェニルブチレート（phenylbutyrate）、プレドニゾン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、パクリタキセル（paclitaxel）、ペントスタチン（pentostatin）、セムスチン（semustine）、ストレプトゾシン（streptozocin）、タモキシフェン（tamoxifen）、タキサン類（taxanes）、タキソール（taxol）、テストステロンプロピオネート（testosterone　propionate）、サリドマイド（thalidomide）、チオグアニン（thioguanine）、チオテパ（thiotepa）、テニポシド（teniposide）、トポテカン（topotecan）、ウラシルマスタード（uracil　mustard）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビノレルビン（vinorelbine）、ビンクリスチン（vincristine）。
　好ましい化学療法剤は、低分子の化学療法剤である。低分子の化学療法剤は、抗体への結合の後も、抗体の機能に干渉する可能性が低い。本発明において、低分子の化学療法剤は、通常100～2000、好ましくは200～1000の分子量を有する。ここに例示した化学療法剤は、いずれも低分子の化学療法剤である。これらの本発明における化学療法剤は、生体内で活性な化学療法剤に変換されるプロドラッグを含む。プロドラッグの活性化は酵素的な変換であっても、非酵素的な変換であっても良い。
　また、抗体を毒性ペプチドで修飾することもできる。毒性ペプチドの例としては、例えば、次のものを挙げることができる。ジフテリアトキシンＡ鎖(Diphtheria　toxin　A　Chain)(Langone　J.J.,et　al.,Methods　in　Enzymology,93,307-308,1983)、シュードモナスエキソトキシン(Pseudomonas　Exotoxin)(Nature　Medicine,2,350-353,1996)、リシン鎖(Ricin　A　Chain)(Fulton　R.J.,et　al.,J.Biol.Chem.,261,5314-5319,1986;Sivam　G.,et　al.,Cancer　Res.,47,3169-3173,1987;Cumber　A.J.et　al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak　E.J.,et　al.,Cancer　Res.,50,7519-7562,1990;Gheeite　V.,et　al.,J.Immunol.Methods,142,223-230,1991);無糖鎖リシンＡ鎖(Deglicosylated　Ricin　A　Chain)(Thorpe　P.E.,et　al.,Cancer　Res.,47,5924-5931,1987);アブリンＡ鎖(Abrin　A　Chain)(Wawrzynczak　E.J.,et　al.,Br.J.Cancer,66,361-366,1992;Wawrzynczak　E.J.,et　al.,Cancer　Res.,50,7519-7562,1990;Sivam　G.,et　al.,Cancer　Res.,47,3169-3173,1987;Thorpe　P.E.,et　al.,Cancer　Res.,47,5924-5931,1987);ゲロニン(Gelonin)(Sivam　G.,et　al.,Cancer　Res.,47,3169-3173,1987;Cumber　A.J.et　al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;WawrzynczakE.J.,et　al.,Cancer　Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ポークウイード抗ウィルス蛋白（PAP-s;Pokeweed　anti-viral　protein　fromseeds)(Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ブリオジン(Briodin)(Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);サポリン(Saporin)(Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルジン(Momordin)(Cumber　A.J.,et　al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak　E.J.,et　al.,Cancer　Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルコキン(Momorcochin)(Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３２(Dianthin　32)(Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３０(Dianthin　30)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);モデッシン(Modeccin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);ビスカミン(Viscumin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);ボルケシン(Volkesin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);ドデカンドリン(Dodecandrin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);トリチン(Tritin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);ルフィン(Luffin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);トリコキリン(Trichokirin)(Casellas　P.,et　al.,Eur.J.Biochem.176,581-588,1988;Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)。
　本発明において放射性化学物質とは、放射性同位体を含む化学物質のことをいう。放射性同位体は特に限定されず、如何なる放射性同位体を用いてもよいが、例えば、32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Reなどを用いることが可能である。
　また別の態様では、一又は二以上の低分子化学療法剤と毒性ペプチドをそれぞれ組み合わせて抗体の修飾に使用できる。抗TMPRSS11E抗体と上記の低分子化学療法剤との結合は共有結合又は非共有結合が利用できる。これら化学療法剤を結合した抗体の作製方法は公知である。
　タンパク質性の薬剤や毒素は、遺伝子工学的な手法によって抗体と結合することができる。具体的には、たとえば上記毒性ペプチドをコードするDNAと抗TMPRSS11E抗体をコードするDNAをインフレームで融合させて発現ベクター中に組み込んだ組換えベクターが構築できる。該ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を培養し、組み込んだDNAを発現させて、毒性ペプチドを結合した抗TMPRSS11E抗体を融合タンパク質として得ることができる。抗体との融合タンパク質を得る場合、一般に、抗体のC末端側にタンパク質性の薬剤や毒素が配置される。抗体と、タンパク質性の薬剤や毒素の間には、ペプチドリンカーを介在させることもできる。
（３）二重特異性抗体
　さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体（bispecific　antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はTMPRSS11E分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体は、１分子のTMPRSS11Eに対して２分子の抗体分子が結合できる。その結果、より強力な細胞傷害作用を期待できる。
　あるいは、一方の抗原結合部位がTMPRSS11Eを認識し、他方の抗原結合部位が細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。細胞傷害性物質には、具体的には、化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質等が含まれる。このような二重特異性抗体は、TMPRSS11Eを発現している細胞に結合する一方で、細胞傷害性物質を捕捉する。その結果、細胞傷害性物質をTMPRSS11E発現細胞に直接作用させることができる。すなわち細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体によって、腫瘍細胞を特異的に傷害し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。
　また本発明においては、TMPRSS11E以外の抗原を認識する抗原結合部位と組み合わせた二重特異性抗体を用いることもできる。たとえば、TMPRSS11Eと同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であって、TMPRSS11Eとは異なる抗原を認識するような抗原結合部位と組み合わせて二重特異性抗体とすることができる。
　二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれが重鎖と軽鎖を有する１／２分子であっても良いし、重鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
　抗体の抗原結合活性（Antibodies　A　Laboratory　Manual.　Ed　Harlow,　David　Lane,　Cold　Spring　Harbor　Laboratory,　1988）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
（４）糖鎖の改変
　本発明の抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞傷害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、糖鎖が修飾された抗体（WO99/54342など）、糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（WO00/61739、WO02/31140など）、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（WO02/79255など）などが公知である。
（５）インターナライズ活性
　また、本発明の抗体はインターナライズ活性を有していてもよい。本発明において「インターナライズ活性を有する抗体」とは、TMPRSS11Eに結合した際に細胞内（細胞質内、小胞内、他の小器官内など）に輸送される抗体を意味する。
　抗体がインターナライズ活性を有するか否かは当業者に公知の方法を用いて確認することができ、例えば、標識物質を結合した抗TMPRSS11E抗体をTMPRSS11Eを発現する細胞に接触させ該標識物質が細胞内に取り込まれたか否かを確認する方法、細胞傷害性物質を結合した抗TMPRSS11E抗体をTMPRSS11Eを発現する細胞に接触させ該TMPRSS11E発現細胞に細胞死が誘導されたか否かを確認する方法、などにより確認することができる。
　インターナライズ活性を有する抗体は例えば上述の細胞傷害性物質を結合することにより、後述する抗癌剤などの医薬組成物として用いることができる。
（６）中和活性
　また、本発明の抗体は中和活性を有していてもよい。本発明において中和活性とは、TMPRSS11Eが有するプロテアーゼ活性を阻害する活性のことをいう。中和活性の測定は当業者に公知の方法で行うことが可能であり、例えば、実施例に記載の方法で測定することが可能である。
４．　抗TMPRSS11E抗体の作製
４．１　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる抗TMPRSS11E抗体の作製
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術にしたがい、以下のようにして作製できる。まず、TMPRSS11Eタンパク質、あるいは後述するその部分ペプチドを感作抗原として使用し、通常の免疫方法にしたがって動物を免疫する。得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。さらにこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって、抗TMPRSS11E抗体を産生するハイブリドーマを選択する。選択したハイブリドーマから所望の抗TMPRSS11Eモノクローナル抗体を得る。具体的には、以下のようにして行う。
（１）TMPRSS11Eタンパク質の調製
　まず、TMPRSS11E遺伝子を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用されるTMPRSS11Eタンパク質が取得できる。すなわち、TMPRSS11Eをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は培養上清中から、目的のヒトTMPRSS11Eタンパク質を公知の方法で精製する。精製した天然のTMPRSS11Eタンパク質、あるいは、TMPRSS11Eタンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどを利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular　Cloning　2nd　ed.（Sambrook,J　et　al.,　Molecular　Cloning　2nd　ed.,　9.47-9.58,　Cold　Spring　Harbor　Lab.　press,　1989）に記載されている。
　このようにして精製されたTMPRSS11Eタンパク質を、哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。TMPRSS11Eの部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。たとえば、次のようなペプチドを感作抗原とすることができる。
・ヒトTMPRSS11Eのアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド。
・TMPRSS11E遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド。
・TMPRSS11Eタンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド。
　部分ペプチドとして用いるTMPRSS11Eの領域及び大きさは限定されない。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は、少なくとも３以上、たとえば、５以上、あるいは６以上であることが好ましい。より具体的には、８～５０、好ましくは１０～３０残基のペプチドを感作抗原とすることができる。
（２）TMPRSS11Eタンパク質による免疫
　TMPRSS11Eタンパク質あるいはその部分ペプチドを感作抗原として、哺乳動物を免疫する。免疫される哺乳動物は、特に限定されないが、モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。
　上記の動物は、公知の方法にしたがい、感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内又は皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。感作抗原は、PBS（Phosphate-Buffered　Saline、リン酸緩衝食塩水）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈されて免疫に使用される。さらに、感作抗原はアジュバントとともに投与されてもよい。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
（３）DNA免疫
　モノクローナル抗体は、DNA免疫（DNA　Immunization）によっても得ることができる。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターDNAを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。蛋白質抗原を投与する一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性を期待できる。
・TMPRSS11Eのような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる。
・免疫抗原を精製する必要が無い。
　DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず、TMPRSS11Eタンパク質を発現するDNAを免疫動物に投与する。TMPRSS11EをコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成することができる。得られたDNAを適当な発現ベクターに挿入し、免疫動物に投与する。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターを利用することができる。ベクターを生体に投与する方法も、一般に用いられている方法を利用することができる。たとえば、発現ベクターを吸着させた金粒子を、遺伝子銃（gene　gun）で細胞内に打ち込むことによってＤＮＡ免疫を行うことができる。
（４）ハイブリドーマの作製
　上述のように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
　上記の免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるため、HAT選択培地中でも増殖するようになる。
　HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地を用いて、選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他、G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、以下のようなミエローマ細胞を、本発明におけるモノクローナル抗体の製造に利用することができる。
P3（P3x63Ag8.653）（J.　Immunol.（1979）123,　1548-1550）、
P3x63Ag8U.1（Current　Topics　in　Microbiology　and　Immunology（1978）81,　1-7）、
NS-1（Kohler.　G.　and　Milstein,　C.　Eur.　J.　Immunol.（1976）6,　511-519）、
MPC-11（Margulies.　D.H.　et　al.,　Cell（1976）8,　405-415）、
SP2/0（Shulman,　M.　et　al.,　Nature（1978）276,　269-270）、
FO（de　St.　Groth,　S.　F.　etal.,　J.　Immunol.　Methods（1980）35,　1-21）、
S194（Trowbridge,　I.　S.　J.　Exp.　Med.（1978）148,　313-323）、
R210（Galfre,　G.　et　al.,　Nature（1979）277,　131-133）等。
　基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler.　G.　and　Milstein,　C.、Methods　Enzymol.（1981）73,　3-46）等に準じて、免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。
　より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、細胞融合を実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。さらに融合効率を高めるために、所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。
　細胞融合法においては、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって、目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60％（w/v）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。
　細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって、このようにして得られたハイブリドーマを選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞を選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを実施できる。
　目的とする抗体のスクリーニング及び単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に、酵素で標識した二次抗体等を反応させる。培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては、免疫に用いたものを始め、実質的に同質なTMPRSS11Eタンパク質が好適に使用できる。たとえばTMPRSS11Eを発現する細胞株、可溶型TMPRSS11Eなどを抗原として利用することができる。
　ヒトTMPRSS11Eに対する抗体の産生には、国際公開WO03/104453に記載された方法を利用することもできる。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をTMPRSS11Eタンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平1-59878号公報参照）。
　さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となるTMPRSS11Eタンパク質を投与するか、又はTMPRSS11Eを当該動物中において発現するように構築されたDNAによって免疫することによって、抗TMPRSS11Eヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞から、TMPRSS11Eタンパク質に対するヒト抗体を単離することができる（国際公開WO　94/25585、WO　93/12227、WO　92/03918、WO　94/02602参照）。さらに不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、当該動物の免疫システムは、ヒトTMPRSS11Eを異物と認識する。したがって、ヒトTMPRSS11Eに対するヒト抗体を容易に得ることができる。
（５）ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得
　以上のようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。
　目的とするモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。
４．２　遺伝子工学的手法による抗TMPRSS11E抗体の作製
（１）抗体遺伝子のクローニング
　抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子を利用することにより、遺伝子工学的手法を用いて、抗体を作製することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme,　A.　M.　et　al.,　Eur.J.　Biochem.（1990）192,　767-775参照）。
　たとえば、抗TMPRSS11E抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗TMPRSS11E抗体の可変領域をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。
・グアニジン超遠心法（Chirgwin,　J.　M.　et　al.,　Biochemistry（1979）18,　5294-5299）
・AGPC法（Chomczynski,　P.et　al.,　Anal.　Biochem.（1987）162,　156-159）。
　抽出されたmRNAは、mRNA　Purification　Kit　（GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep　mRNA　Purification　Kit　（GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体可変領域をコードするcDNAを合成することができる。その際、抗体遺伝子に共通な配列より選び出した任意の15-30塩基の配列をプライマーとして用いることができる。cDNAは、AMV　Reverse　Transcriptase　First-strand　cDNA　Synthesis　Kit（生化学工業社製）等によって合成することができる。また、cDNAの合成及び増幅のために、5’-Ampli　FINDER　RACE　Kit（Clontech製）及びPCRを用いた5’-RACE法（Frohman,　M.　A.　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA（1988）85,　8998-9002、Belyavsky,　A.et　al.,　Nucleic　Acids　Res.（1989）17,　2919-2932）を利用することができる。さらにこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。
　得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、cDNAの塩基配列を、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認することができる。
　また、抗体の可変領域をコードする遺伝子を得るために、cDNAライブラリーを利用することもできる。まず抗体産生細胞から抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを得る。cDNAライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアRNAを添加した後に精製される。あるいは一定量のRNAを抽出できる場合には、抗体産生細胞のRNAのみでも効率よく抽出することができる。たとえば10以上、あるいは30以上、好ましくは50以上の抗体産生細胞からのRNA抽出には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。
　得られたcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、論文（J.　Mol.　Biol.　(1991)　222,　581-597）などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列となる。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してPCR法が行われる。
　具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１～γ５、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーを用いることができる。
　重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるPCR産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの、TMPRSS11Eに対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。
（２）宿主細胞への抗体遺伝子の導入
　抗TMPRSS11E抗体を製造するために、クローニングされた抗体遺伝子を、発現制御領域の制御下で発現するように発現ベクターに組み込む。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗TMPRSS11E抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。
　抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖及び軽鎖をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。重鎖と軽鎖が組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfect）することによって、重鎖と軽鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいは重鎖及び軽鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開WO　94/11523参照）。
　単離した抗体遺伝子を適当な宿主に導入して抗体を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、次のような細胞を例示することができる。
i)　哺乳類細胞：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby　hamster　kidney）、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など
ii)　両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
iii)　昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など。
　植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana　tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。
　さらに真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる：
酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces　serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces　）属、メタノール資化酵母（Pichia　pastoris）などのPichia属、
糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus　niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属。
　あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E.　coli）、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。
　哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human　cytomegalovirus　immediate　early　promoter/enhancer）を挙げることができる。
　また、その他に、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等を、抗体発現のために使用することができる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等を示すことができる。
　SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277,　108）を利用することができる。また、HEF1αプロモーター／エンハンサーはMizushimaらの方法（Nucleic　Acids　Res.（1990）18,　5322）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。
　動物細胞を用いて抗体を産生させる場合に、細胞外への分泌のために必要とされるシグナル配列としては、抗体の重鎖遺伝子又は軽鎖遺伝子のシグナル配列を用いることが望ましい。また、IL-3やIL-6などの分泌タンパク質が有するシグナル配列を用いることも可能である。
　大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341,　544-546　;　FASEBJ.（1992）6,　2422-2427）を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法（Science（1988）240,　1041-1043）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。
　抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei,　S.　P.　et　al.,　J.　Bacteriol.（1987）169,　4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素やグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。
　発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカーを挿入することができる。具体的には、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等のような選択マーカーを利用することができる。
（３）宿主細胞からの抗体の取得
　これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、次に、形質転換された宿主細胞をインビトロ又はインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
　上述のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies　A　Laboratory　Manual.　Ed　Harlow,　David　Lane,　Cold　Spring　Harbor　Laboratory,　1988）。
４．３　トランスジェニック動物による抗体産生
　組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、目的とする抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（又はその子孫）が産生する乳汁から、乳汁タンパク質との融合タンパク質として、所望の抗体を取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる（Ebert,　K.M.　et　al.,　Bio/Technology（1994）12,699-702）。
５．医薬組成物
　TMPRSS11Eは肺癌、子宮頸癌、食道癌等の癌組織で特異的に高発現し、抗TMPRSS11E抗体は、癌細胞特異的な細胞傷害活性を有する。したがって、抗TMPRSS11E抗体は、これらのTMPRSS11Eを発現する癌の治療に有用である。
　すなわち、本発明は、TMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。ある実施形態において、前記医薬組成物は細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤である。本発明の細胞増殖抑制剤及び抗癌剤は、癌を罹患している対象又は罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
　本発明の医薬組成物（例えば、抗癌剤）において用いられる抗TMPRSS11E抗体は特に限定されず、例えば上述した任意の抗TMPRSS11E抗体を用いることができる。
　本発明において、「TMPRSS11Eに結合する抗体を有効成分として含有する」とは、抗TMPRSS11E抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗TMPRSS11E抗体の含有率を制限するものではない。
　本発明の医薬組成物は、細胞傷害性物質が結合した抗TMPRSS11E抗体を有効成分としてもよい。前記医薬組成物は、例えば、細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤として利用できる。本発明の細胞増殖抑制剤及び抗癌剤は、癌を罹患している対象又は罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
　本発明において、「細胞傷害性物質が結合した抗TMPRSS11E抗体を有効成分として含有する」とは、細胞傷害性物質が結合した抗TMPRSS11E抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、細胞傷害性物質が結合した抗TMPRSS11E抗体の含有率を制限するものではない。
　本発明の医薬組成物が対象とする疾患が癌の場合、対象となる癌は特に限定されないが、肺癌、子宮頸癌、食道癌であることが好ましい。癌は原発巣及び転移巣のいずれであってもよい。
　本発明の医薬組成物は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって、本発明の医薬組成物を全身又は局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1　kgあたり0.0001　mgから1000　mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000　mgの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
　本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's　Pharmaceutical　Science,　latest　edition,　Mark　Publishing　Company,　Easton,　U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。さらにこれらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。
　本発明の抗TMPRSS11E抗体は、TMPRSS11E発現細胞と接触させることによりTMPRSS11E発現細胞に傷害を引き起こす又は細胞の増殖を抑制することができる。こうした利用方法も、本発明の範囲である。用いられる抗体は、特に限定されず、例えば上述した任意の抗体を用いることが可能である。抗TMPRSS11E抗体が結合する細胞は、TMPRSS11Eが発現している細胞であれば特に限定されない。本発明における好ましいTMPRSS11E発現細胞は癌細胞である。より好ましくは、肺癌細胞または子宮頸癌または食道癌細胞である。上記方法は、これらの癌の、原発巣及び転移巣のいずれに対しても適用することができる。
　本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養しているTMPRSS11E発現細胞の培養液に抗体を添加することにより行われる。また本発明において「接触」はさらに、TMPRSS11E発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や内在的にTMPRSS11Eを発現する癌細胞を有する動物に投与することによっても行われる。
　抗TMPRSS11E抗体の接触によってTMPRSS11E発現細胞に引き起こされた細胞傷害を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞傷害活性を評価又は測定する方法としては、上記のADCC活性、CDC活性などの測定法を挙げることができる。抗TMPRSS11E抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current　protocols　in　Immunology,　Chapter　7.　Immunologic　studies　in　humans,　Editor,　John　E,　Coligan　et　al.,　John　Wiley　&　Sons,　Inc.,(1993)等）。活性の測定に際しては、対照抗体として抗TMPRSS11E抗体と同一のアイソタイプを有する抗体で該細胞傷害活性を有しない抗体を、抗TMPRSS11E抗体と同様に使用して、抗TMPRSS11E抗体が対照抗体よりも強い細胞傷害活性を示す場合に活性を有すると判定することができる。
　抗体のアイソタイプは、その抗体のアミノ酸配列の重鎖定常領域の配列で規定される。生体内においては、抗体産生Ｂ細胞の成熟化の際に起こる染色体上の遺伝子組み換えにより生じるクラススイッチによって抗体のアイソタイプが最終的に決定される。アイソタイプの相違が抗体の生理的・病理的機能の相違に反映される。具体的には、例えば、細胞傷害活性の強度は抗原の発現量と共に、抗体のアイソタイプによっても影響されることが知られている。従って、上記記載の細胞傷害活性の測定に際しては、対照として用いられる抗体は被験抗体と同一のアイソタイプを用いることが好ましい。
　また、生体内で細胞傷害活性を評価、あるいは測定するために、例えばTMPRSS11E発現癌細胞を非ヒト被検動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被験抗体を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより細胞傷害活性を判定することができる。試験管内での評価と同様に同一のアイソタイプを有する対照抗体を投与し、抗TMPRSS11E抗体投与群における腫瘍の大きさが対照抗体投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さい場合に細胞傷害活性を有すると判定することができる。非ヒト被検動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのＴリンパ球の機能を欠失したヌード（nu/nu）マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与された抗体による細胞傷害活性の評価・測定に当たって被検動物中のTリンパ球の関与を除くことができる。
６．診断薬（診断方法）
　また、本発明はTMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11Eタンパク質をコードする遺伝子を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。種々の癌組織あるいは癌細胞株において、TMPRSS11Eの顕著な発現亢進が確認されている。したがって、TMPRSS11Eは、癌を特異的に検出するためのマーカーとして有用である。
　本発明の診断方法の具体例の一つとして、以下の工程を含む癌の診断方法を挙げることができる。
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11E遺伝子の発現量を検出する工程。本発明の方法においては、さらに
(c)上記TMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11E遺伝子の発現量に基づいて、被験者が癌である可能性を評価する工程、
を含んでも良い。
６．１　TMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11Eタンパク質をコードする遺伝子の検出
　本発明の方法の1つの態様においては、試料中のTMPRSS11Eタンパク質を検出することにより癌の診断が行われる。TMPRSS11Eタンパク質の検出はTMPRSS11Eタンパク質を認識する抗体を用いて行われることが好ましい。
　本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出としては、次のような測定を挙げることができる。
・単にTMPRSS11Eタンパク質が存在するか否かの測定
・TMPRSS11Eタンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
・TMPRSS11Eタンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など。
　一方、定量的な検出とは、TMPRSS11Eタンパク質の濃度の測定、TMPRSS11Eタンパク質の量の測定などを挙げることができる。
　本発明における被検試料は、TMPRSS11Eタンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されない。具体的には、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましい。さらに好ましい試料は、ヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織などが例示できる。好ましい試料は、生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの被検試料から得られる試料である。
　本発明によって診断される癌は、特に制限されることはなく如何なる癌でもよい。具体的には、肺癌、子宮頸癌、食道癌などを挙げることができる。本発明においては、これらの癌の原発病巣、及び転移病巣のいずれをも診断することができる。
　本発明においては、被検試料中にタンパク質が検出された場合に、そのレベルを指標として癌が診断される。具体的には、陰性コントロール又は健常者と比較して被検試料中に検出されるTMPRSS11Eタンパク質の量が多い場合に、被検者が癌である、又は将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。すなわち本発明は、次の工程を含む癌の診断方法に関する。
(1)　被検者から採取された生体試料中のTMPRSS11E発現レベルを検出する工程、及び
(2)　(1)で検出されたTMPRSS11Eの発現レベルが、対照と比較して高い場合に被検者が癌を有すると判定される工程。
　本発明において、対照とは、比較の基準となる試料をいい、陰性コントロールや健常者の生体試料が含まれる。陰性コントロールは、健常者の生体試料を採取し、必要に応じて混合することによって得ることができる。対照のTMPRSS11Eの発現レベルは、被検者の生体試料におけるTMPRSS11Eの発現レベルと平行して検出することができる。あるいは、予め、多数の健常者の生体試料におけるTMPRSS11Eの発現レベルを検出し、健常者における標準的な発現レベルを統計学的に決定することができる。具体的には、たとえば、平均値±２×標準偏差(S.D.)、あるいは平均値±３×標準偏差(S.D.)を標準値として用いることもできる。統計学的に、平均値±２×標準偏差(S.D.)は80％の、また平均値±３×標準偏差(S.D.)は90％の健常者の値を含む。
　あるいは、対照におけるTMPRSS11Eの発現レベルを、ROC曲線を利用して設定することができる。ROC曲線(receiver　operating　characteristic　curve；受信者操作特性曲線）は、縦軸に検出感度を、横軸に擬陽性率（すなわち"１－特異度"）を示すグラフである。本発明においては、生体試料中のTMPRSS11Eの発現レベルを判定するための基準値を連続的に変化させたときの、感度と擬陽性率の変化をプロットすることによって、ROC曲線を得ることができる。
　なおROC曲線を得るための「基準値」は、統計学的な解析のために一時的に利用される数値である。ROC曲線を得るための「基準値」は、一般的には、選択しうる全ての基準値をカバーできる範囲内で、連続的に変化させられる。たとえば、解析される集団のTMPRSS11Eの測定値の最小値と最大値の間で、基準値を変化させることができる。
　得られたROC曲線に基づいて、所望の検出感度、並びに精度を期待できる標準値を選択することができる。ROC曲線などによって統計学的に設定された標準値は、カットオフ値(cut-off　value)とも呼ばれる。カットオフ値に基づく癌の検出方法においては、上記工程(2)において、(1)で検出されたTMPRSS11Eの発現レベルが、カットオフ値と比較される。そして、カットオフ値よりも(1)で検出されたTMPRSS11Eの発現レベルが高いときに、被検者の癌が検出される。
　本発明において、TMPRSS11Eの発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、TMPRSS11EのmRNAの量、TMPRSS11Eタンパク質の量、またはTMPRSS11Eタンパク質の生物学的な活性を評価することによって、TMPRSS11Eの発現レベルを知ることができる。TMPRSS11EのmRNAやタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定することができる。
　本発明においては、特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物を被験者とするときは、当該動物種のTMPRSS11Eタンパク質が検出される。
　被検試料に含まれるTMPRSS11Eタンパク質の検出方法は、特に限定されないが、抗TMPRSS11E抗体を用いた、以下に例示されるような免疫学的方法により検出することが好ましい。
酵素結合免疫吸着法（ELISA）、
ラジオイムノアッセイ（RIA）、
エンザイムイムノアッセイ（EIA）、
蛍光イムノアッセイ（FIA）、
発光イムノアッセイ（LIA）、
免疫沈降法（IP）、
免疫比濁法（TIA）、
ウエスタンブロット（WB）、
免疫組織化学（IHC）法、
免疫拡散法（SRID）、
ドットブロット法、
スロットブロット法。
　これらの手法の中で、免疫組織化学（IHC）法は、癌に羅患した患者から取得した組織若しくは細胞を固定化した切片上でTMPRSS11Eタンパク質を検出する工程を含み、癌の診断方法として好ましい免疫学的アッセイ法の一つである。免疫組織化学（IHC）法などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法である。
　TMPRSS11Eは、癌細胞において特異的に発現が増強している膜タンパク質であることから、抗TMPRSS11E抗体によって、癌細胞、あるいは癌組織を検出することができる。上記の免疫組織学的な解析によって、生体から採取された細胞や組織に含まれる癌細胞が検出される。
　別な好ましい態様では、生体内の癌組織を抗TMPRSS11E抗体によって検出することもできる。この方法は、具体的には、(1)放射性同位元素等の標識物質で標識されたTMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体を被検者に投与する工程と、(2)該標識物質の集積を検出する工程を含む。生体内に投与した抗体を追跡するために、抗体は、検出可能に標識することができる。たとえば蛍光物質や発光物質、あるいは放射性同位元素で標識された抗体の生体における挙動を追跡することができる。蛍光物質や発光物質で標識された抗体は、内視鏡や腹腔鏡を利用して観察することができる。放射性同位元素は、その放射活性を追跡することによって、抗体の局在を画像化することができる。本発明において、生体内における抗TMPRSS11E抗体の局在は、癌細胞の存在を表している。
　生体内の癌を検出するために抗体を標識する放射性同位元素として、陽電子放出核種を利用することができる。たとえば18F、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、及び124Iのような陽電子放出核種で抗体を標識することができる。これらの陽電子放出核種による抗TMPRSS11E抗体の標識には、公知の方法（Acta　Oncol.　32,　825-830,　1993）を利用することができる。
　陽電子放出核種で標識された抗TMPRSS11E抗体がヒトや動物に投与された後に、PET（ポジトロン断層撮影装置）により、その放射性核種が放射する放射線が体外から計測され、コンピュータートモグラフィーの手法で画像に変換される。PETは、薬物の体内挙動などに関するデータを非侵襲的に得るための装置である。PETによって、放射強度をシグナル強度として定量的に画像化することができる。上記のようにPETを使用することによって、患者から試料を採取することなく特定の癌で高発現する抗原分子を検出できる。抗TMPRSS11E抗体は、上記の核種の他に11C、13N、15O、18F、45Ti等の陽電子放出核種を用いた短寿命核種によって放射標識することもできる。
　医療用サイクロトロンによる上記核種を用いた短寿命核種の生産、短寿命放射標識化合物の製造技術等に関する研究開発が進められている。これらの技術により抗TMPRSS11E抗体を種々の放射性同位元素によって標識することができる。患者に投与された抗TMPRSS11E抗体は、各部位の病理組織に対する抗TMPRSS11E抗体の特異性に従って原発巣及び転移巣に集積する。抗TMPRSS11E抗体が陽電子放出核種で標識されていれば、その放射活性を検出することにより、該原発巣及び転移巣の存在が放射活性の局在によって検出される。該診断用途に用いる場合には25-4000　keVのガンマ粒子又は陽電子放射量の活性値が適切に使用できる。また、適切な核種を選択して、さらに大量に投与すれば治療効果も期待できる。放射線による抗癌作用を得るためには、70-700　keVのガンマ粒子又は陽電子放射量値を与える核種を使用できる。
６．２　TMPRSS11Eタンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出
　本発明の方法の別の態様においては、TMPRSS11Eのポリヌクレオチドの発現を検出する。本発明において検出されるポリヌクレオチドは特に限定されないが、mRNAが好ましい。本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出として、次のような測定操作を挙げることができる。
・単にTMPRSS11EのmRNAが存在するか否かの測定、
・TMPRSS11EのmRNAが一定の量以上存在するか否かの測定、
・TMPRSS11EのmRNAの量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など。
　一方、定量的な検出とは、TMPRSS11EのmRNAの濃度の測定、TMPRSS11EのmRNAの量の測定などを挙げることができる。
　本発明における被検試料としては、TMPRSS11EのmRNAが含まれる可能性のある任意の試料を利用することができる。哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織などが例示できる。好ましい試料は生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
　生物の体から採取された組織、若しくは細胞が固定化された標本、又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料を用いる場合には、インシトゥーハイブリダイゼーション法が好適に用いられる。インシトゥーハイブリダイゼーション法は、細胞や組織内の特定のDNAやRNAの有無若しくは分布及びその発現の強弱を確認する手法として発展してきた。原理としては細胞内の特定の核酸配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸が特異的に複合体を形成する性質を利用したものである。当該プローブに予め放射性同位元素（RI）や抗原物質（ハプテン）等を標識しておくことにより、当該標識の検出を通じてハイブリダイゼーションした箇所が識別可能となることから、インシトゥーハイブリダイゼーション法は細胞内DNAやRNAなどの検出等に用いられている。プローブの標識としては好適にはRIによる標識を用いることができる。さらに好適な例としては、非放射性物質のビオチンやジゴキシゲニン等のハプテン等を利用した蛍光標識を用いることができる。特に好適な例としてはFISHと呼ばれる蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（fluorescence　in　situ　hibridization）による検出法が用いられる。
　本発明によって診断される癌は、特に制限されない。具体的には、肺癌、子宮頸癌、食道癌などを挙げることができる。本発明においては、これらの癌の原発病巣、及び転移病巣のいずれをも診断することができる。
　本発明においてはTMPRSS11E遺伝子を発現する任意の動物種を被験者とすることができる。特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物種を被験者とするときには、当該動物種のTMPRSS11Eの遺伝子が検出される。
　以下に検出方法の具体的な態様を記載する。まず、被検者から試料を調製する。次いで、該試料に含まれるTMPRSS11EのmRNAを検出する。本発明においては、mRNAから合成したcDNAを検出することもできる。本発明においては、被検試料中にTMPRSS11EのmRNAやTMPRSS11EをコードするcDNAが検出された場合、癌の可能性があると判定される。たとえば、陰性コントロール又は健常者と比較して、被検試料中に検出されるTMPRSS11EのmRNAやTMPRSS11EをコードするcDNAの量が多い場合に、被検者が癌である、又は将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。
　ｍRNAを検出する方法は、公知である。具体的には、例えば遺伝子チップ、cDNAアレイ、及びメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法等を本発明に利用することができる。
　上記した本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもできる。自動化することによって、短時間に多数の試料を検査することができる。
６．３　癌の診断のためのキット
　本発明は、被検試料中のTMPRSS11Eタンパク質を検出するための試薬を含む、癌の診断のための診断薬又はキットも提供する。本発明の診断薬は、少なくとも抗TMPRSS11E抗体を含む。
　本発明の癌の診断用試薬と、TMPRSS11Eの検出に用いられるその他の要素を組み合わせることによって、癌の診断のためのキットとすることができる。すなわち本発明は、TMPRSS11Eに結合する抗体と、該抗体とTMPRSS11Eとの結合を検出する試薬を含み、さらにTMPRSS11Eを含む生体試料からなる対照試料を含んでいてもよい、癌の診断のためのキットに関する。本発明のキットには、さらに測定操作を説明するための指示書をキットに添付することもできる。
　以下、実施例により、本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
[実施例１]　　リアルタイムPCRを用いたTMPRSS11EのmRNA発現解析
　肺癌細胞株h2009、h2087、h2122、h209はATCCより購入した。添付資料に記載の条件下で培養後１×10７個相当の細胞を回収し、Trizol（Invitrogen社）を用いて全　RNAを調製した。1μgの全　RNAについて、DNase　I　(Invitrogen社）処理後、SuperScript　III　First　Strand　Synthesis　System　for　RT-PCR　(Invitrogen社)　を用いoligo　(dT)　をプライマーとしてcDNAを合成した。表1に示す各種正常組織全　RNAに関しても同様の方法でcDNAを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これらのcDNAを用い、SYBR　Green　Iを用いたインターカレーター法によるリアルタイムPCRを実施した。すなわち3.3ngの全　RNA相当を由来とするcDNAを鋳型とし、SYBR（登録商標）Premix　Ex　Taq（Takara社）、センスプライマー（配列番号３１）、アンチセンスプライマー（配列番号３２）を含む20μlの反応液に対し、95　℃で5秒、60℃で30秒からなるサイクルを33回行った。事前に精製したPCR産物を鋳型としたサンプルをもとに標準曲線を作成し、その定量値からサンプルのcDNA量を換算した。図１に示すように、TMPRSS11EのmRNAは肺癌株であるh2009、h2087、h2122、h209で高値を示し、正常組織では扁桃、食道、子宮頸部に限局していた。
[実施例2]　抗TMPRSS11E抗体の作製
TMPRSS11E（Accession　No.　NM　014058）は423アミノ酸からなる二型膜タンパク質である。塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示す。細胞外領域にトリプシン様セリンプロテアーゼドメイン及びSEAドメインを有する。今回ある種の癌でTMPRSS11Eが高発現している事を見出したので、抗TMPRSS11E抗体の作製に着手した。
1.　ヒトTMPRSS11E発現細胞株の樹立
　はじめにTMPRSS11E全長遺伝子をクローニングした。すなわちH2009のcDNAを鋳型として、5’端にEcoRI認識配列、kozak配列を付加したセンスプライマー、3'端にタグ配列とNotI配列を付加したアンチセンスプライマーを設計し、10xKOD-Plus　buffer、2mM　dNTPs、25mM　MgSO4、KOD-Plus（Takara社製）を含む反応液に対し、94　℃で30秒、50℃で10秒、72℃で1.5分からなるサイクルを35回行った。PCR反応による増幅産物はpGEM-T　Easy　Vector　System　I（Promega社）を用いてpGEM-T　easyに挿入した。配列はABI3730　DNA　Analyzerにより確認した。これをEcoRI、NotIにより切断後、pMCNベクターへクローニングした。pMCNベクターは、マウスCMVプロモータ（Accession　No.　U68299）下で発現誘導可能で、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれている。エレクトロポレーション法により本発現プラスミドDNAをDG44細胞およびBa/F3細胞へ導入し、定常発現株を500μg/mL　ジェネテシン　での選抜により樹立した。DG44細胞はInvitrogen社、Ba/F3は理化学研究所より購入した。
2.　可溶型ヒトsTMPRSS11Ep1／マウスIgG2a　Fc融合蛋白の作製
　免疫原としてセリンプロテアーゼドメインを含むsTMPESS11Ep1領域（Ser159-Ile423）とマウスIgG2aFcの融合蛋白を作製した。5'端にEcoRI認識配列、kozak配列、マウスIL3シグナル配列を付加したセンスプライマーと、CpoI認識配列を付加したアンチセンスプライマーを用いたPCR反応を行った。pGEM-T　Easyにクローニングし塩基配列を確認した後、EcoRI、CpoIにより消化した断片をpMCDN　mIgG2aFcにクローニングした。pMCDN　mIgG2aFcはpMCNベクターを由来とし、EcoRI,　NotI認識部位にマウス重鎖IgG2aのヒンジ以下のFc配列を挿入し、CpoI認識配列でsTMPRSS11Ep1とmIgG2aFc配列が連結される。配列番号３３で表される配列はsTMPRSS11Ep1　mIgG2aFcの塩基配列を、配列番号３４で表される配列はsTMPRSS11Ep1　mIgG2aFcのアミノ酸配列を示す。
　pMCDN　sTMPRSS11Ep1　mIgG2aFcをDG44細胞（Invitrogen社）へエレクトロポレーション法により導入し、500μg/mL　ジェネテシン　での選抜により、定常発現細胞を樹立した。定常発現細胞の大量培養を実施し、培養上清からsTMPRSS11Ep1　mIgG2aFc蛋白を精製した。培養上清をHi　Trap　rProtein　A　(GE社製)カラムにチャージし、結合バッファー（20mM　リン酸ナトリウム　(pH7.0)）にて洗浄後、溶出バッファー（0.1M　グリシン-HCl　(pH2.7)）で溶出した。溶出は中和バッファー（1M　Tris-HCl(pH9.0)）を加えたチューブへ行い直ちに中和した。次にSuperdex　200　HR　26/60(GE社)によるゲルろ過を行い、PBSに置換した。精製蛋白の定量はDC　protein　assay　(BIO-RAD社)を用い、添付のウシIgGをスタンダードとして換算した。
3.　抗TMPRSS11E抗体の作製
　Balb/cマウス、もしくはMRL/MpJUmmCrj-lpr/lprマウス（以下、MRL/lprマウス、日本チャールズ・リバーより購入）を免疫動物として用いた。6週齢より免疫を開始し、初回免疫にはsTMPRSS11Ep1　mIgG2aFcを50μg/匹となるように調製し、フロイント完全アジュバント（FCA、ベクトンディッキンソン社）を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。2週間後に25μg/匹となるように調製したものをフロイント不完全アジュバント（FIA、ベクトンディッキンソン社）でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降１週間間隔で追加免疫を２から3回行った。最終免疫の４日後、脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞P3-X63Ag8U1（P3U1、ATCCより購入）と2:1になるように混合し、PEG1500（ロシュ・ダイアグノスティック社）を徐々に加える事により細胞融合を行った。慎重にRPMI1640培地（GIBCO　BRL社）を加えPEG1500を希釈し、遠心操作によりPEG1500を除去した後、10％FBS入りRPMI1640にて懸濁したものを100μL　/ウェルとなるように96穴培養プレートに播種した。翌日、100μL　/ウェルとなるように10％FBS、1　x　HAT　media　supplement　(SIGMA社）、0.5　x　BM-Condimed　H1　Hybridoma　cloning　supplement　(ロシュ・ダイアグノスティック社）を含むRPMI1640　(以降、HAT培地）を添加した。2,　3日後に培養液の半分をHAT培地に置き換え、7日後の培養上清を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングは上記樹立したTMPRSS11E発現DG44細胞を用いたフローサイトメトリーにより行った。陽性クローンについては親株であるDG44細胞には結合しないことを確認後、限界希釈法によりモノクローン化した。樹立されたハイブリドーマ、TM094、TM191はRoche社のIsostripを用いてアイソタイプを決定した結果、いずれもIgG1,　kappaであった。
　抗体の精製は、FBS(Ultra　low　IgG)（GIBCO　BRL社）を血清として用いたHAT培地にて培養したハイブリドーマの培養上清を、上記と同様にHi　Trap　ProteinG　HPを用い行った。溶出画分については、PD-10カラム（Amersham社）を用いてPBSに置換した後、4℃で保管した。精製抗体の定量はDC　protein　assay　(BIO-RAD社)を用い、添付のウシIgGをスタンダードとして換算した。
[実施例3]　抗TMPRSS11E抗体可変領域遺伝子配列の決定
　TM094、TM191について抗体可変領域遺伝子の配列を決定した。全　RNAは、RNeasy　Plant　Mini　Kits（QIAGEN社）を用いて１×10７細胞のハイブリドーマより抽出した。１μｇの全　RNAを使用して、SMART　RACE　cDNA　Amplification　Kit（CLONTECH社）、マウスIgG1定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1（配列番号３５）またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドkappa（配列番号３６）を用い、５’末端側遺伝子断片を増幅した。逆転写反応は42℃で１時間30分間反応した。PCR溶液50μLは、５μLの10×Advantage　2　PCR　Buffer、５μＬの10×Universal　Primer　A　Mix、0.2mM　dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、１μＬのAdvantage　2　Polymerase　Mix（以上、CLONTECH社製）、2.5μＬの逆転写反応産物、10pmoleの合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1またはkappaを含有し、94℃の初期温度にて30秒間そして94℃にて５秒間、72℃にて３分間のサイクルを５回反復し、94℃にて５秒間、70℃にて10秒間、72℃にて３分間のサイクルを５回反復し、さらに94℃にて５秒間、68℃にて10秒間、72℃にて３分間のサイクルを25回反復した。最後に反応産物を72℃で７分間加熱した。各PCR産物はQIAquick　Gel　Extraction　Kit（QIAGEN社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、pGEM-T　Easyベクターへクローニングし、塩基配列を決定した。TM094の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号３７、アミノ酸配列を配列番号３８、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号３９、アミノ酸配列を配列番号４０に示す。TM191の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号４１、アミノ酸配列を配列番号４２、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号４３、アミノ酸配列を配列番号４４に示す。
[実施例4]　抗TMPRSS11Eマウス－ヒトキメラ化抗体の作製
　各抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列をヒト重鎖およびヒト軽鎖定常領域配列に連結した。重鎖については可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列、EcoRI部位を有する合成オリゴヌクレオチド、およびNheI部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った。軽鎖については可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列、BamHI部位を有する合成オリゴヌクレオチド、およびBsiWI部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った。得られたPCR産物を抗体発現プラスミドpMCDN　G1kにクローニングした。pMCDN　G1kは、pMCDNベクターにヒトIgG1定常領域がクローニングされており、NheI部位によりマウス重鎖可変領域とヒト重鎖（γ１鎖）定常領域が連結する構造を持つ。また、もう一つマウスCMVプロモータを含む発現ユニット、及びヒトκ鎖定常領域が挿入されており、BsiWI部位によりマウス軽鎖可変領域とヒト軽鎖（κ鎖）定常領域が連結する構造を持つ。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、抗TMPRSS11Eマウス―ヒトキメラ化抗体遺伝子を発現する。キメラ化TM094の重鎖の塩基配列を配列番号４５に、アミノ酸配列を配列番号４６に、キメラ化TM094の軽鎖の塩基配列を配列番号４７に、アミノ酸配列を配列番号４８に示す。キメラ化TM191の重鎖の塩基配列を配列番号４９に、アミノ酸配列を配列番号５０に、キメラ化TM191の軽鎖の塩基配列を配列番号５１に、アミノ酸配列を配列番号５２に示す。
　pMCDN　G1k　TM094、pMCDN　G1k　TM191をDG44細胞へエレクトロポレーションにより導入した。500μg/mL　ジェネテシン　での選抜により、抗TMPRSS11Eキメラ化抗体定常発現CHO細胞を樹立した。次に培養上清よりHi　Trap　rProtein　Aカラムを用いて精製を行った。精製抗体(chi.TM094(DG)、chi.TM191(DG))はPD-10カラムにてPBSにバッファー交換し、　DC　Protein　Assayにより定量し、4℃で保管した。
[実施例5]　低フコース抗TMPRSS11Eマウス－ヒトキメラ化抗体の作製
　抗体のADCC活性を増強する方法としては、抗体の糖鎖を改変する方法が知られている。例えば、WO　99/54342には、抗体のグリコシル化を修飾することによりADCC活性を改良することが記載されている。また、WO　00/61739には、抗体の糖鎖におけるフコースの存否によりADCC活性を調節することが記載されている。WO　02/31140には、YB2/0細胞において抗体を産生せしめることにより、α-1,6コアーフコースを含まない糖鎖を有する抗体を調製することが記載されている。WO2005/017155においては、フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトしたCHO細胞（CHO　FTKO）に関する実施例が記載されており、同様にα-1,6コアーフコースを含まない糖鎖を有する抗体を生産することが可能である。
　上記構築した抗TMPRSS11Eマウスーヒトキメラ化抗体発現プラスミドをCHO　FTKO細胞へエレクトロポレーション法により導入し、500μg/mL　ジェネテシン　での選抜により、抗TMPRSS11Eキメラ化抗体定常発現CHO　FTKO細胞を樹立した。次に培養上清よりHi　Trap　rProtein　Aカラムを用いて精製を行った。精製抗体(chi.TM094(FTKO)、chi.TM191(FTKO))はPD-10カラムにてPBSにバッファー交換し、　DC　Protein　Assayにより定量し、4℃で保管した。
[実施例6]　抗TMPRSS11E抗体のフローサイトメトリーによる結合活性評価
　上記構築したTMPRSS11E定常発現細胞、その親株に対する結合をフローサイトメトリーにより評価した。5x105個相当の細胞に適当な濃度に希釈した抗TMPRSS11E抗体を加え、氷上で１時間反応させた。細胞を遠心により洗浄後、FITC標識抗ヒトIgG抗体を添加し氷上で１時間反応させた。細胞を遠心により洗浄後、2μg/mL　ヨウ化プロピジウムを含む培地に懸濁し、ベクトンディッキンソン社のFACS　Caliburに供した。図２に示すように全ての抗体は、Ba/F3親株に対して結合せず、TMPRSS11E強制発現株には濃度依存的な強い結合活性を示した。この事からこれら抗体はTMPRSS11Eに特異的に結合する事が判明した。キメラ化抗体と低フコース型キメラ化抗体の結合活性は同等であった。次に、種々の癌細胞株に対する結合活性をフローサイトメトリーにより評価した。図3に示すように、肺癌株であるh2009、h2087、子宮癌株であるME-180（ATCCより購入）、大腸癌株であるcolo201（Japanese　Collection　of　Research　Bioresourcesより購入）に対し結合活性を示した。これら癌細胞株において、TMPRSS11EがRNAレベルのみならず、蛋白レベルでも高発現している事が判明した。DAKO社のQIFIKITを用いて細胞あたりの抗原発現数を概算した結果、H2009では約26,000分子、ME-180では約40,000分子の発現があり、抗体医薬の標的抗原として十分な発現をしている事が判明した。
[実施例7]抗TMPRSS11E抗体の抗体依存性細胞介在性細胞傷害　(ADCC)活性の測定
1.　全長ヒトCD16定常発現細胞の樹立
　全長ヒトCD16　(RefSeq　ID、NM＿000569)を哺乳細胞発現用ベクター(pMCDN)にクローニングした(pMCDN/CD16)。pMCDN/CD16をNK-92細胞(ATCCより購入、CRL-2407)へエレクトロポレーションにより導入し、500　μg/ml　ジェネテシンでの選抜により、全長ヒトCD16を定常的に発現するNK-92細胞株(CD16-NK92)を樹立した。CD16-NK92細胞の培養には500　μg/ml　ジェネテシン、ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen社)、0.2　mM　イノシトール(Sigma社)、0.1　mM　2-メルカプトエタノール(Invitrogen社)、0.02　mM　葉酸(Sigma社)、100　U/ml　組換えヒトインターロイキン-2　(Peprotech社)、10%　ウマ血清(Invitrogen社)、10%　ウシ胎児血清(Invitrogen社)を含むAlpha　minimum　essential　medium　without　ribonucleosides　and　deoxyribonucleosides　with　L-glutamine培地(Invitrogen社)を用いた。
2.　抗TMPRSS11E抗体のADCC活性の測定
　H2009、colo201細胞を96ウェル平底プレートの各ウェルに50μlずつ添加し、5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて2日間培養した。10%　ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地(以下、培地と称する。)　にChromium-51　(Code　No.　CJS4、GEヘルスケアバイオサイエンス社)を240μCi/ml添加した溶液を各ウェルに10μlずつ添加し、引き続き1時間培養した。各ウェルを300μlの培地で洗浄したあと100μlの培地を添加した。次に、抗TMPRSS11E抗体またはコントロールヒトIgG1抗体(Cat.　No.　PHP010、Serotec社)を50μlずつ添加した。続いて培地にて1×106個/mlに懸濁されたCD16-NK92細胞を50μlずつ添加した。該プレートは5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて4時間培養後、上清100μlの放射活性をガンマカウンター（1480　WIZARD　3”、Wallac社）にて測定した。下式に基づいて特異的クロム遊離率を決定した。
特異的クロム遊離率（%）=(A-C)×100/(B-C)
　Aは各ウェルの放射活性(cpm)、Bは100μl　の2%　Nonidet　P-40溶液（Code　No.252-23、Nacalai　Tesque社）を添加したウェルの放射活性(cpm)の平均値、Cは100μlの培地を添加したウェルの放射活性(cpm)の平均値を示す。試験は重複して行い、特異的クロム遊離率の平均値及び標準偏差を算出した。
M　E-180については、20μg/mLのCalcein-AM（DOJINDO社）により標識し、同様の方法で抗体、エフェクター細胞を作用させ、上清100μLの蛍光度をARVO（WALLAC社）を用いて計測し、特異的Calcein-AM遊離率（%）を算出した。
　図４に示すように、各癌細胞株に対し、抗TMPRSS11E抗体によるADCC活性が認められた。また、低フコース化によりADCC活性の増強が確認された。
[実施例8]　Hum-ZAPを用いた抗TMPRSS11E抗体による抗腫瘍効果
　次に、TMPRSS11Eを標的としたイムノトキシンが抗腫瘍効果を示す事ができるか、Hum-ZAPを用いて評価した。Hum-ZAPは、抗ヒトIgG抗体に蛋白合成阻害のトキシンであるサポリンを結合させたもので、Advanced　Targeting　Systems社製のものを用いた。前日にh2009、ME-180細胞を500個/　50μL/　ウェルで96ウェルプレートに蒔き込み、100ngのHum-ZAPと100ngの抗TMPRSS11Eキメラ化抗体(TM094、TM191)を混合したものを添加した。96時間培養後にCell　Count　Reagent　SF　(Nacalai　Tesque社）を10μL添加し、2時間後に450nmの吸光度を測定した。図５に示すように、Hum-ZAP単独では増殖抑制が認められないものの、抗TMPRSS11E抗体に依存して、抗腫瘍効果が認められた。
[実施例9]　抗TMPRSS11E抗体によるプロテアーゼ活性中和活性
　TMPRSS11Eは2型セリンプロテアーゼファミリーに属し、プロテアーゼドメインを有する。TMPRSS11Eに結合する抗体はこの機能を中和する可能性がある。Enzchek　Gelatinase　/Collagenase　Assay　Kit　(Molecular　Probes社)を用いて、プロテアーゼ評価系を構築した。上記構築した可溶型ヒトsTMPRSS11Ep1／マウスIgG2a　Fc融合蛋白（11E-Fc）600ngに対し1μgのTM191を添加し4℃で1時間放置した。これをキット添付のマニュアルに従い、蛍光物質で標識されたDQ-Gelatinを添加し、室温で反応させ継時的に蛍光度を測定した。図６に示すように、11E-Fc非存在下では蛍光度の上昇は認められず、11E-Fcの添加に依存して蛍光度の上昇が確認された。11E-FcにコントロールIgGを添加したサンプルでは変化が認められなかったが、TM191と混合すると蛍光度の上昇が認められなくなった。この事から、TM191は、TMPRSS11Eのプロテアーゼ活性を中和する活性を有していることが判明した。
[実施例10]　抗TMPRSS11E抗体によるイムノブロット解析
　TMPRSS11EのSEAドメイン(Tyr42-Arg191)の領域とマウスIgG2a　Fc領域の融合蛋白を上記方法に従い作製した。これをBalb/cマウス、MRL/lprマウスへ免疫し、上記と同様の方法でハイブリドーマを樹立した。スクリーニングには、New　England　Biolabs社のpMALc2xベクターを用い、MBPとSEAドメインの融合蛋白質として大腸菌にて発現、精製したものを固相化したELISAにより行った。強い結合活性を示したEA230を産生するハイブリドーマよりRNAを抽出し、上記方法に従い抗体可変領域の遺伝子配列を決定した。EA230の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号５３、アミノ酸配列を配列番号５４、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号５５、アミノ酸配列を配列番号５６に示す。
　Ba/F3、TMPRSS11E発現Ba/F3(BaF/TMPRSS11E)、TMPRSS11E陰性癌細胞株VMRC-LCD、TMPRSS11E陽性癌細胞株h2009、ME-180の細胞ライセートを作製した。細胞1x106個に対しNP-40　Lysis　Buffer　(0.5%　(v/v)　Nonidet　P40,　20mM　Tris-HCl　(pH7.5),　150mM　NaCl,　5mM　EDTA)を50μL添加し、4℃で15分放置後、遠心（14,000rpm,　15min）後の上清をライセートとして使用した。細胞2x105個相当のライセートをSDS-PAGEにより分離後、Trans-Blot　SD　Semi-Dry　Electrophoretic　Transfer　Cell　(BIO-RAD社)を用いてイモビロン-P（Millipore社）へトランスファーした。メンブレンをTBS-T（0.05%　Tween20,　TBS）で軽く洗った後、5%スキムミルク入りTBS-Tで1時間振とうした。TBS-Tで約10分間振とうした後、1%スキムミルク入りTBS-Tで希釈した0.5μg/mLのEA230抗体を加え１時間振とうした。TBS-Tで洗い（10分間x3回）、1%スキムミルク入りTBS-Tで1/2000に希釈したHRP-抗マウスIgG抗体（GE社）で1時間振とう後、TBS-Tで洗った（10分x3回）。発色はECL-Plus　(GE社)を用いて行い、Hyperfilm　ECL（GE社）を用いて現像した。図７に示すように、EA230はBa/F3親株には反応せず、TMPRSS11E強制発現株では50数kＤａ位置にバンドが検出された。TMPRSS11Eの予想分子量は47.7kDaであるため、おそらく糖鎖修飾を受けたTMPRSS11Eが検出されていると考えられる。すなわち、EA230はイムノブロットでTMPRSS11Eを特異的に検出できる。癌細胞株においても同様のバンドが検出され、確かに癌細胞株ではTMPRSS11Eが高発現していることが確認された。
[実施例11]　抗TMPRSS11E抗体による免疫組織化学（immunohistochemistry(IHC)）解析
　臨床癌組織でのTMPRSS11Eの発現を評価する目的で、EA230を用いてIHC解析を行った。肺癌組織アレイとしてTest　slide,　Lung　cancer　tissues　with　corresponding　normal　tissues　(ISU　ABXIS社,　A716II）、子宮頸癌組織アレイとしてMultiple　(uterine　cervix)　cervical　squamous　cancer　tissue　array　(Biomax社,　CR803)、食道癌組織アレイとしてHuman　Common　Cancers　Array（SuperBioChips社,　MA1）を使用した。染色はDAKO社のEnvision　Kitを用いた。組織を脱パラフィン処理後、10mM　クエン酸バッファー（pH6.0）でオートクレーブ（120℃,　10min）による賦活化処理を行い、添付のマニュアルに従い、10μg/mLのEA230を用いて染色を行った。図８に示すように、肺癌および子宮頸癌および食道癌で癌組織の強い染色が認められた。このことから臨床癌組織においてもTMPRSS11Eは高発現している事が判明した(Lang　and　Schuller,　2001)。染色は細胞膜に限局しており、TMPRSS11Eは抗体医薬の標的抗原として有望であると考えられた。
[実施例12]　抗TMPRSS11E抗体によるin　vivo抗腫瘍効果
1.　マウスIgG2ak型TM191の作製
　実施例4で作製したヒトーマウスキメラ型TM191発現プラスミドよりTM191のＨ鎖およびＬ鎖可変領域配列を切り出し、pMCDN　mG2akベクターへクローニングした。pMCDN　mG２akベクターは、pMCDNベクターにマウスIgG2a定常領域がクローニングされており、NheI部位によりマウスＨ鎖可変領域と定常領域が連結する構造を持つ。また、もう一つmouse　CMVプロモータを含む発現ユニット、及びマウスκ鎖定常領域が挿入されており、BsiWI部位によりマウスＬ鎖可変領域と定常領域が連結する構造を持つ。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、マウスIgG2a型TM191抗体遺伝子を発現する。マウスIgG2a型TM191のH鎖の塩基配列を配列番号５７に、アミノ酸配列を配列番号５８に、マウスkappa型TM191のL鎖の塩基配列を配列番号５９に、アミノ酸配列を配列番号６０に示す。pMCDN　mG2ak　TM191をDG44細胞、及びCHO　FTKOへエレクトロポレーションにより導入した。500μg/mL　Geneticin　での選抜により定常発現CHO細胞を樹立した。次に培養上清よりHi　Trap　rProtein　Aカラムを用いて精製を行った。精製抗体(TM191　mIgG2ak　(DG)、TM191　mIgG2ak　(FTKO))はPD-10カラムにてPBSにバッファー交換し、　DC　Protein　Assayにより定量し、4℃で保管した。
2.　TMPRSS11E発現肝癌細胞株の樹立
　肝癌細胞株であるSK-Hep-1細胞はATCCより購入し、D-MEM　(SIGMA),　10%　FBS　(BOVAGEN),　1%　penicillin-streptomyicin　(GIBCO)にて培養した。実施例２でクローニングした全長TMPRSS11E遺伝子をpCOSII-Zeoベクターへクローニングした。pCOSII-Zeoベクターはゼオシン耐性遺伝子が組み込まれている。作製したTPMRSS11E発現プラスミドをエレクトロポレーション法によりSK-Hep-1細胞へ導入し、800μg/mL　Zeocinで選抜し、限界希釈法によりTMPRSS11E発現株を樹立した。図９に示すようにflowcytometryにおいて、親株であるSK-Hep1へはTM191は結合せず、TMPRSS11E強制発現株に対しては強い結合を示した。
3.　TMPRSS11E発現細胞のin　vivo抗腫瘍効果
3.1.　ヒト肝臓癌移植マウスモデルの作製
　あらかじめ前日に抗アシアロGM1抗体（和光純薬社）0.2mgを腹腔内投与したC.B-17/Icr-scidマウス（メス、腫瘍移植時6週齢、日本クレア）56匹に、1.2で取得されたTMPRSS11E発現肝癌細胞株を5E6cells/mouse(培地（D-MEM　(SIGMA),　10%　FBS　(BOVAGEN),　1%　penicillin-streptomyicin　(GIBCO),　400μg/mL　geneticin　(GIBCO),　800μg/mL　Zeocin　(Invitrogen)）とマトリゲルで1:1混和した細胞懸濁液)で皮下に移植した。
　移植14日目にノギスで腫瘍サイズ（長径x短径x　短径(mm3)）と体重を測定し、１群6匹の全6群に群分けし、投与を開始した。
3.2.　抗体の投与と測定
　1.で調製された抗体TM191　mIgG2ak　(DG)、TM191　mIgG2ak　(FTKO)を、投与する当日にPBS(-)（SIGMA）を用いて0.5mg/mL(5mg/kg投与群)、あるいは2.5mg/mL(25mg/kg投与群)になるように調製し、3.1で群分けしたマウスに10mL/kgにて、尾静脈より投与した。投与は週に1回、全4回行った。その間および最終投与１週間後までの間、週に2回、腫瘍サイズと体重の測定を行った。
3.3.　結果
　TM191　mIgG2ak　(DG)、TM191　mIgG2ak　(FTKO)の投与により5mg/kg投与群、25mg/kg投与群ともに皮下に移植したヒト肝臓癌は有意に増殖が阻害された（図１０）。
　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
　本発明の抗体は、抗癌剤として、および癌の診断薬として用いることができる。

Claims (20)

  1. TMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体。
  2. 細胞傷害活性を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
  3. 細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）である請求項２に記載の抗体。
  4. 細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性（CDC活性）である請求項２に記載の抗体。
  5. インターナライズ活性を有することを特徴とする請求項１～４いずれかに記載の抗体。
  6. 細胞傷害性物質が結合していることを特徴とする請求項５に記載の抗体。
  7. 中和活性を有することを特徴とする請求項１～６いずれかに記載の抗体。
  8. 以下のいずれかに記載のTMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体。
    （１）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
    （２）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
    （３）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
    （４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
    （５）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
    （６）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
    （７）（１）の重鎖可変領域と（４）の軽鎖可変領域を含む抗体。
    （８）（２）の重鎖可変領域と（５）の軽鎖可変領域を含む抗体。
    （９）（３）の重鎖可変領域と（６）の軽鎖可変領域を含む抗体。
    （１０）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
    （１１）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体が結合するTMPRSS11Eタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
  9. 配列番号２の159-423番目のアミノ酸配列からなるエピトープを認識することを特徴とする請求項１～７いずれかに記載の抗体。
  10. 請求項１～９いずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
  11. 抗癌剤である請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 肺癌または子宮頸癌または食道癌を対象とする抗癌剤である請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 以下の工程を含む癌の診断方法。
    (a)被験者から単離された試料を準備する工程、
    (b)上記試料におけるTMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11E遺伝子の発現量を検出する工程。
  14. 肺癌または子宮頸癌または食道癌を診断するためのものである、請求項１３に記載の診断方法。
  15. 請求項１～９いずれかに記載の抗体を含む癌の診断薬。
  16. 肺癌または子宮頸癌または食道癌を診断するためのものである、請求項１５に記載の診断薬。
  17. 癌の診断または治療において使用するための、請求項１～９いずれかに記載の抗体。
  18. 癌が、肺癌または子宮頸癌または食道癌である、請求項１７に記載の抗体。
  19. 請求項１～９のいずれかに記載の抗体を使用する、癌の治療方法。
  20. 肺癌または子宮頸癌または食道癌を治療するためのものである、請求項１９に記載の癌の治療方法。
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