JP5746018B2 - 抗tmprss11e抗体を用いた癌の診断と治療 - Google Patents
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Description
しかしながら、TMPRSS11Eをターゲットとした抗体が抗癌剤などの医薬組成物として有効であるか否かは報告されていない。
[1]TMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体。
[2]細胞傷害活性を有することを特徴とする[1]に記載の抗体。
[3]細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害活性(ADCC活性)である[2]に記載の抗体。
[4]細胞傷害活性が、補体依存性細胞傷害活性(CDC活性)である[2]に記載の抗体。
[5]インターナライズ活性を有することを特徴とする[1]〜[4]いずれかに記載の抗体。
[6]細胞傷害性物質が結合していることを特徴とする[5]に記載の抗体。
[7]中和活性を有することを特徴とする[1]〜[6]いずれかに記載の抗体。
[8]以下のいずれかに記載のTMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体。
(1)配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
(2)配列番号6に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号7に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号8に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
(3)配列番号9に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号10に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号11に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
(4)配列番号12に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号13に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号14に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
(5)配列番号15に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号16に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号17に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
(6)配列番号18に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号19に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号20に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
(7)(1)の重鎖可変領域と(4)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(8)(2)の重鎖可変領域と(5)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(9)(3)の重鎖可変領域と(6)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(10)(1)から(9)のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入された抗体であって、(1)から(9)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
(11)(1)から(9)のいずれかに記載の抗体が結合するTMPRSS11Eタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
[9]配列番号2の159-423番目のアミノ酸配列からなるエピトープを認識することを特徴とする[1]〜[7]のいずれかに記載の抗体。
[10][1]〜[9]いずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
[11]抗癌剤である[10]に記載の医薬組成物。
[12]肺癌または子宮頸癌または食道癌を対象とする抗癌剤である[11]に記載の医薬組成物。
[13]以下の工程を含む癌の診断方法。
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11E遺伝子の発現量を検出する工程。
[14]肺癌または子宮頸癌または食道癌を診断するためのものである、[13]に記載の診断方法。
[15][1]〜[9]のいずれかに記載の抗体を含む癌の診断薬。
[16]肺癌または子宮頸癌または食道癌を診断するためのものである、[15]に記載の診断薬。
[17]癌の診断または治療において使用するための、[1]〜[9]のいずれかに記載の抗体。
[18]癌が、肺癌または子宮頸癌または食道癌である、[17]または[18]に記載の抗体。
[19][1]〜[9]のいずれかに記載の抗体を使用する、癌の治療方法。
[20]肺癌または子宮頸癌または食道癌を治療するためのものである、[19]に記載の癌の治療方法。
TMPRSS11E(別名DESC1)は、2型膜貫通性のセリンプロテアーゼファミリーに属する。
本発明で用いられるTMPRSS11Eタンパク質の由来は特に限定されず、公知のTMPRSS11Eタンパク質のいずれを用いることも可能である。好ましくは、TMPRSS11Eタンパク質はヒトTMPRSS11Eである。ヒトTMPRSS11Eのアミノ酸配列とこれをコードする塩基配列は当該分野において公知であり、公共のデータベースであるGenBankやUnigene等に、例えば、GenBank Accession No:NM 014058(塩基配列=配列番号1、アミノ酸配列=配列番号2)として登録されている。
2.1 抗TMPRSS11E抗体
本発明で用いられる抗TMPRSS11E抗体は、TMPRSS11Eタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは特に限定されない。具体的には、非ヒト動物の抗体(例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体)、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体が使用できる。本発明において使用される抗TMPRSS11E抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体のTMPRSS11Eタンパク質への結合は特異性の高いものであることが好ましく、特にヒトTMPRSS11Eに特異的であることがより好ましい。
(1)配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
(2)配列番号6に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号7に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号8に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
(3)配列番号9に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号10に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号11に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
(4)配列番号12に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号13に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号14に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
(5)配列番号15に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号16に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号17に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
(6)配列番号18に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号19に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号20に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
(7)(1)の重鎖可変領域と(4)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(8)(2)の重鎖可変領域と(5)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(9)(3)の重鎖可変領域と(6)の軽鎖可変領域を含む抗体。
(10)(1)から(9)のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入された抗体であって、(1)から(9)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
(11)(1)から(9)のいずれかに記載の抗体が結合するTMPRSS11Eタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、
親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)
(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。
抗体がヒトに投与される場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。遺伝子組換え型抗体とは、例えば、キメラ(Chimeric)抗体、ヒト化(Humanized)抗体などを含む。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体をいう。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される当該キメラ抗体を取得できる。
一般にキメラ抗体が、ヒト以外の動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とから構成されるのに対して、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域(CDR;complementarity determining region)と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域(FR;framework region)及びヒト抗体由来の定常領域とから構成される。ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明の抗体には、TMPRSS11Eタンパク質に結合する限り、IgG(IgG1、IgG2、IgG4など)に代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、又は、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、TMPRSS11Eタンパク質に結合する限り、低分子化抗体又はその修飾物であってもよい。
ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を指す(Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中で重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされる重鎖可変領域と軽鎖可変領域とは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。
scFvは、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85, 5879-5883)。scFvにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。可変領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば3から25残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。
抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするDNA配列、及び
抗体の軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするDNA配列
scFv-FcはscFvにFc領域を融合させた低分子化抗体である(Cellular & Molecular Immunology 2006; 3:439-443)。scFv-Fcに用いられるscFvの由来は特に限定されないが、例えばIgM由来のscFvを用いることができる。また、Fcの由来は特に限定されないが、例えばヒトIgG(ヒトIgG1など)を用いることができる。従って、scFv-Fcの好ましい態様の例として、IgM抗体のscFv断片と、ヒトIgG1のCH2(たとえば、Cγ2)とCH3(たとえば、Cγ3)をヒトIgG1のヒンジ領域(Hγ)で連結させたscFv-Fcを挙げることができる。
sc(Fv)2は、2つの重鎖可変領域(VH)及び2つの軽鎖可変領域(VL)をリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である(Hudson et al、J Immunol. Methods 1999;231:177-189)。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号21)
Ser・Gly・Gly・Gly(配列番号22)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号23)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号24)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号25)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号26)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号27)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号28)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号29))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号30))n
[nは1以上の整数である]。
[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]。
ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、
ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)、
ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP)、
ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)、
エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、
エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)(スルホ−EGS)、
ジスクシンイミジル酒石酸塩(DST)、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩(スルホ−DST)、
ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、及び
ビス[2-(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(スルホ-BSOCOES)など。
(1)細胞障害活性
癌などの細胞増殖性疾患の治療においては、抗体は、そのエフェクター活性を維持していることが望ましい。すなわち、本発明における好ましい抗体は、TMPRSS11Eに対する結合親和性とエフェクター機能の両方を有する。抗体のエフェクター機能には、抗体依存性細胞介在性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ADCC)活性及び補体依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity:CDC)活性が含まれる。本発明における治療用の抗体は、特に好ましくは、ADCC活性及びCDC活性のいずれか、又は両方をエフェクター機能として備える。
本発明における細胞傷害活性としては、例えば、ADCC活性、CDC活性などを挙げることができる。本発明において、ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞(免疫細胞等)がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。一方、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。
i)エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(Invitrogen社製)中で脾臓細胞が分離される。10%ウシ胎児血清(FBS、HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。
ii)補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を10% FBS含有培地(Invitrogen社製)にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
iii)標的細胞の調製
TMPRSS11Eタンパク質を発現する細胞を0.2 mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)とともに、10% FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより、該標的細胞を放射性標識できる。TMPRSS11Eタンパク質を発現する細胞としては、TMPRSS11Eタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、肺癌細胞、子宮頸癌、食道癌細胞等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10% FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。
抗体に化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質などの細胞傷害性物質を結合することも可能である。このような抗体修飾物(以下、抗体コンジュゲートと称する。)は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体(bispecific antibody)であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はTMPRSS11E分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体は、1分子のTMPRSS11Eに対して2分子の抗体分子が結合できる。その結果、より強力な細胞傷害作用を期待できる。
本発明の抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞傷害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、糖鎖が修飾された抗体(WO99/54342など)、糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体(WO00/61739、WO02/31140など)、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体(WO02/79255など)などが公知である。
また、本発明の抗体はインターナライズ活性を有していてもよい。本発明において「インターナライズ活性を有する抗体」とは、TMPRSS11Eに結合した際に細胞内(細胞質内、小胞内、他の小器官内など)に輸送される抗体を意味する。
また、本発明の抗体は中和活性を有していてもよい。本発明において中和活性とは、TMPRSS11Eが有するプロテアーゼ活性を阻害する活性のことをいう。中和活性の測定は当業者に公知の方法で行うことが可能であり、例えば、実施例に記載の方法で測定することが可能である。
4.1 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる抗TMPRSS11E抗体の作製
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術にしたがい、以下のようにして作製できる。まず、TMPRSS11Eタンパク質、あるいは後述するその部分ペプチドを感作抗原として使用し、通常の免疫方法にしたがって動物を免疫する。得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。さらにこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって、抗TMPRSS11E抗体を産生するハイブリドーマを選択する。選択したハイブリドーマから所望の抗TMPRSS11Eモノクローナル抗体を得る。具体的には、以下のようにして行う。
まず、TMPRSS11E遺伝子を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用されるTMPRSS11Eタンパク質が取得できる。すなわち、TMPRSS11Eをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は培養上清中から、目的のヒトTMPRSS11Eタンパク質を公知の方法で精製する。精製した天然のTMPRSS11Eタンパク質、あるいは、TMPRSS11Eタンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどを利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)に記載されている。
・ヒトTMPRSS11Eのアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド。
・TMPRSS11E遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド。
・TMPRSS11Eタンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド。
TMPRSS11Eタンパク質あるいはその部分ペプチドを感作抗原として、哺乳動物を免疫する。免疫される哺乳動物は、特に限定されないが、モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。
モノクローナル抗体は、DNA免疫(DNA Immunization)によっても得ることができる。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターDNAを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。蛋白質抗原を投与する一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性を期待できる。
・TMPRSS11Eのような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる。
・免疫抗原を精製する必要が無い。
上述のように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979)123, 1548-1550)、
P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7)、
NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976)6, 511-519)、
MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell(1976)8, 405-415)、
SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978)276, 269-270)、
FO(de St. Groth, S. F. etal., J. Immunol. Methods(1980)35, 1-21)、
S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978)148, 313-323)、
R210(Galfre, G. et al., Nature(1979)277, 131-133)等。
以上のようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。
(1)抗体遺伝子のクローニング
抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子を利用することにより、遺伝子工学的手法を用いて、抗体を作製することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている(例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.(1990)192, 767-775参照)。
・グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979)18, 5294-5299)
・AGPC法(Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.(1987)162, 156-159)。
抗TMPRSS11E抗体を製造するために、クローニングされた抗体遺伝子を、発現制御領域の制御下で発現するように発現ベクターに組み込む。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗TMPRSS11E抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。
i) 哺乳類細胞:CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など
ii) 両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
iii) 昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など。
酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces )属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属、
糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus)属。
これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、次に、形質転換された宿主細胞をインビトロ又はインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできる。
組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、目的とする抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ(又はその子孫)が産生する乳汁から、乳汁タンパク質との融合タンパク質として、所望の抗体を取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology(1994)12,699-702)。
TMPRSS11Eは肺癌、子宮頸癌、食道癌等の癌組織で特異的に高発現し、抗TMPRSS11E抗体は、癌細胞特異的な細胞傷害活性を有する。したがって、抗TMPRSS11E抗体は、これらのTMPRSS11Eを発現する癌の治療に有用である。
また、本発明はTMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11Eタンパク質をコードする遺伝子を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。種々の癌組織あるいは癌細胞株において、TMPRSS11Eの顕著な発現亢進が確認されている。したがって、TMPRSS11Eは、癌を特異的に検出するためのマーカーとして有用である。
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11E遺伝子の発現量を検出する工程。本発明の方法においては、さらに
(c)上記TMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11E遺伝子の発現量に基づいて、被験者が癌である可能性を評価する工程、
を含んでも良い。
本発明の方法の1つの態様においては、試料中のTMPRSS11Eタンパク質を検出することにより癌の診断が行われる。TMPRSS11Eタンパク質の検出はTMPRSS11Eタンパク質を認識する抗体を用いて行われることが好ましい。
・単にTMPRSS11Eタンパク質が存在するか否かの測定
・TMPRSS11Eタンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
・TMPRSS11Eタンパク質の量を他の試料(例えば、コントロール試料など)と比較する測定など。
(1) 被検者から採取された生体試料中のTMPRSS11E発現レベルを検出する工程、及び
(2) (1)で検出されたTMPRSS11Eの発現レベルが、対照と比較して高い場合に被検者が癌を有すると判定される工程。
酵素結合免疫吸着法(ELISA)、
ラジオイムノアッセイ(RIA)、
エンザイムイムノアッセイ(EIA)、
蛍光イムノアッセイ(FIA)、
発光イムノアッセイ(LIA)、
免疫沈降法(IP)、
免疫比濁法(TIA)、
ウエスタンブロット(WB)、
免疫組織化学(IHC)法、
免疫拡散法(SRID)、
ドットブロット法、
スロットブロット法。
本発明の方法の別の態様においては、TMPRSS11Eのポリヌクレオチドの発現を検出する。本発明において検出されるポリヌクレオチドは特に限定されないが、mRNAが好ましい。本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出として、次のような測定操作を挙げることができる。
・単にTMPRSS11EのmRNAが存在するか否かの測定、
・TMPRSS11EのmRNAが一定の量以上存在するか否かの測定、
・TMPRSS11EのmRNAの量を他の試料(例えば、コントロール試料など)と比較する測定など。
本発明は、被検試料中のTMPRSS11Eタンパク質を検出するための試薬を含む、癌の診断のための診断薬又はキットも提供する。本発明の診断薬は、少なくとも抗TMPRSS11E抗体を含む。
肺癌細胞株h2009、h2087、h2122、h209はATCCより購入した。添付資料に記載の条件下で培養後1×107個相当の細胞を回収し、Trizol(Invitrogen社)を用いて全 RNAを調製した。1μgの全 RNAについて、DNase I (Invitrogen社)処理後、SuperScript III First Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen社) を用いoligo (dT) をプライマーとしてcDNAを合成した。表1に示す各種正常組織全 RNAに関しても同様の方法でcDNAを合成した。
TMPRSS11E(Accession No. NM 014058)は423アミノ酸からなる二型膜タンパク質である。塩基配列を配列番号1、アミノ酸配列を配列番号2に示す。細胞外領域にトリプシン様セリンプロテアーゼドメイン及びSEAドメインを有する。今回ある種の癌でTMPRSS11Eが高発現している事を見出したので、抗TMPRSS11E抗体の作製に着手した。
はじめにTMPRSS11E全長遺伝子をクローニングした。すなわちH2009のcDNAを鋳型として、5’端にEcoRI認識配列、kozak配列を付加したセンスプライマー、3'端にタグ配列とNotI配列を付加したアンチセンスプライマーを設計し、10xKOD-Plus buffer、2mM dNTPs、25mM MgSO4、KOD-Plus(Takara社製)を含む反応液に対し、94 ℃で30秒、50℃で10秒、72℃で1.5分からなるサイクルを35回行った。PCR反応による増幅産物はpGEM-T Easy Vector System I(Promega社)を用いてpGEM-T easyに挿入した。配列はABI3730 DNA Analyzerにより確認した。これをEcoRI、NotIにより切断後、pMCNベクターへクローニングした。pMCNベクターは、マウスCMVプロモータ(Accession No. U68299)下で発現誘導可能で、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれている。エレクトロポレーション法により本発現プラスミドDNAをDG44細胞およびBa/F3細胞へ導入し、定常発現株を500μg/mL ジェネテシン での選抜により樹立した。DG44細胞はInvitrogen社、Ba/F3は理化学研究所より購入した。
免疫原としてセリンプロテアーゼドメインを含むsTMPESS11Ep1領域(Ser159-Ile423)とマウスIgG2aFcの融合蛋白を作製した。5'端にEcoRI認識配列、kozak配列、マウスIL3シグナル配列を付加したセンスプライマーと、CpoI認識配列を付加したアンチセンスプライマーを用いたPCR反応を行った。pGEM-T Easyにクローニングし塩基配列を確認した後、EcoRI、CpoIにより消化した断片をpMCDN mIgG2aFcにクローニングした。pMCDN mIgG2aFcはpMCNベクターを由来とし、EcoRI, NotI認識部位にマウス重鎖IgG2aのヒンジ以下のFc配列を挿入し、CpoI認識配列でsTMPRSS11Ep1とmIgG2aFc配列が連結される。配列番号33で表される配列はsTMPRSS11Ep1 mIgG2aFcの塩基配列を、配列番号34で表される配列はsTMPRSS11Ep1 mIgG2aFcのアミノ酸配列を示す。
pMCDN sTMPRSS11Ep1 mIgG2aFcをDG44細胞(Invitrogen社)へエレクトロポレーション法により導入し、500μg/mL ジェネテシン での選抜により、定常発現細胞を樹立した。定常発現細胞の大量培養を実施し、培養上清からsTMPRSS11Ep1 mIgG2aFc蛋白を精製した。培養上清をHi Trap rProtein A (GE社製)カラムにチャージし、結合バッファー(20mM リン酸ナトリウム (pH7.0))にて洗浄後、溶出バッファー(0.1M グリシン-HCl (pH2.7))で溶出した。溶出は中和バッファー(1M Tris-HCl(pH9.0))を加えたチューブへ行い直ちに中和した。次にSuperdex 200 HR 26/60(GE社)によるゲルろ過を行い、PBSに置換した。精製蛋白の定量はDC protein assay (BIO-RAD社)を用い、添付のウシIgGをスタンダードとして換算した。
Balb/cマウス、もしくはMRL/MpJUmmCrj-lpr/lprマウス(以下、MRL/lprマウス、日本チャールズ・リバーより購入)を免疫動物として用いた。6週齢より免疫を開始し、初回免疫にはsTMPRSS11Ep1 mIgG2aFcを50μg/匹となるように調製し、フロイント完全アジュバント(FCA、ベクトンディッキンソン社)を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。2週間後に25μg/匹となるように調製したものをフロイント不完全アジュバント(FIA、ベクトンディッキンソン社)でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降1週間間隔で追加免疫を2から3回行った。最終免疫の4日後、脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞P3-X63Ag8U1(P3U1、ATCCより購入)と2:1になるように混合し、PEG1500(ロシュ・ダイアグノスティック社)を徐々に加える事により細胞融合を行った。慎重にRPMI1640培地(GIBCO BRL社)を加えPEG1500を希釈し、遠心操作によりPEG1500を除去した後、10%FBS入りRPMI1640にて懸濁したものを100μL /ウェルとなるように96穴培養プレートに播種した。翌日、100μL /ウェルとなるように10%FBS、1 x HAT media supplement (SIGMA社)、0.5 x BM-Condimed H1 Hybridoma cloning supplement (ロシュ・ダイアグノスティック社)を含むRPMI1640 (以降、HAT培地)を添加した。2, 3日後に培養液の半分をHAT培地に置き換え、7日後の培養上清を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングは上記樹立したTMPRSS11E発現DG44細胞を用いたフローサイトメトリーにより行った。陽性クローンについては親株であるDG44細胞には結合しないことを確認後、限界希釈法によりモノクローン化した。樹立されたハイブリドーマ、TM094、TM191はRoche社のIsostripを用いてアイソタイプを決定した結果、いずれもIgG1, kappaであった。
TM094、TM191について抗体可変領域遺伝子の配列を決定した。全 RNAは、RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN社)を用いて1×107細胞のハイブリドーマより抽出した。1μgの全 RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社)、マウスIgG1定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1(配列番号35)またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドkappa(配列番号36)を用い、5’末端側遺伝子断片を増幅した。逆転写反応は42℃で1時間30分間反応した。PCR溶液50μLは、5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、5μLの10×Universal Primer A Mix、0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix(以上、CLONTECH社製)、2.5μLの逆転写反応産物、10pmoleの合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1またはkappaを含有し、94℃の初期温度にて30秒間そして94℃にて5秒間、72℃にて3分間のサイクルを5回反復し、94℃にて5秒間、70℃にて10秒間、72℃にて3分間のサイクルを5回反復し、さらに94℃にて5秒間、68℃にて10秒間、72℃にて3分間のサイクルを25回反復した。最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。各PCR産物はQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、アガロースゲルから精製した後、pGEM-T Easyベクターへクローニングし、塩基配列を決定した。TM094の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号37、アミノ酸配列を配列番号38、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号39、アミノ酸配列を配列番号40に示す。TM191の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号41、アミノ酸配列を配列番号42、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号43、アミノ酸配列を配列番号44に示す。
各抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列をヒト重鎖およびヒト軽鎖定常領域配列に連結した。重鎖については可変領域の5’末端側塩基配列に相補的でコザック配列、EcoRI部位を有する合成オリゴヌクレオチド、およびNheI部位を有する3’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った。軽鎖については可変領域の5’末端側塩基配列に相補的でコザック配列、BamHI部位を有する合成オリゴヌクレオチド、およびBsiWI部位を有する3’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った。得られたPCR産物を抗体発現プラスミドpMCDN G1kにクローニングした。pMCDN G1kは、pMCDNベクターにヒトIgG1定常領域がクローニングされており、NheI部位によりマウス重鎖可変領域とヒト重鎖(γ1鎖)定常領域が連結する構造を持つ。また、もう一つマウスCMVプロモータを含む発現ユニット、及びヒトκ鎖定常領域が挿入されており、BsiWI部位によりマウス軽鎖可変領域とヒト軽鎖(κ鎖)定常領域が連結する構造を持つ。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、抗TMPRSS11Eマウス―ヒトキメラ化抗体遺伝子を発現する。キメラ化TM094の重鎖の塩基配列を配列番号45に、アミノ酸配列を配列番号46に、キメラ化TM094の軽鎖の塩基配列を配列番号47に、アミノ酸配列を配列番号48に示す。キメラ化TM191の重鎖の塩基配列を配列番号49に、アミノ酸配列を配列番号50に、キメラ化TM191の軽鎖の塩基配列を配列番号51に、アミノ酸配列を配列番号52に示す。
抗体のADCC活性を増強する方法としては、抗体の糖鎖を改変する方法が知られている。例えば、WO 99/54342には、抗体のグリコシル化を修飾することによりADCC活性を改良することが記載されている。また、WO 00/61739には、抗体の糖鎖におけるフコースの存否によりADCC活性を調節することが記載されている。WO 02/31140には、YB2/0細胞において抗体を産生せしめることにより、α-1,6コアーフコースを含まない糖鎖を有する抗体を調製することが記載されている。WO2005/017155においては、フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトしたCHO細胞(CHO FTKO)に関する実施例が記載されており、同様にα-1,6コアーフコースを含まない糖鎖を有する抗体を生産することが可能である。
上記構築した抗TMPRSS11Eマウスーヒトキメラ化抗体発現プラスミドをCHO FTKO細胞へエレクトロポレーション法により導入し、500μg/mL ジェネテシン での選抜により、抗TMPRSS11Eキメラ化抗体定常発現CHO FTKO細胞を樹立した。次に培養上清よりHi Trap rProtein Aカラムを用いて精製を行った。精製抗体(chi.TM094(FTKO)、chi.TM191(FTKO))はPD-10カラムにてPBSにバッファー交換し、 DC Protein Assayにより定量し、4℃で保管した。
上記構築したTMPRSS11E定常発現細胞、その親株に対する結合をフローサイトメトリーにより評価した。5x105個相当の細胞に適当な濃度に希釈した抗TMPRSS11E抗体を加え、氷上で1時間反応させた。細胞を遠心により洗浄後、FITC標識抗ヒトIgG抗体を添加し氷上で1時間反応させた。細胞を遠心により洗浄後、2μg/mL ヨウ化プロピジウムを含む培地に懸濁し、ベクトンディッキンソン社のFACS Caliburに供した。図2に示すように全ての抗体は、Ba/F3親株に対して結合せず、TMPRSS11E強制発現株には濃度依存的な強い結合活性を示した。この事からこれら抗体はTMPRSS11Eに特異的に結合する事が判明した。キメラ化抗体と低フコース型キメラ化抗体の結合活性は同等であった。次に、種々の癌細胞株に対する結合活性をフローサイトメトリーにより評価した。図3に示すように、肺癌株であるh2009、h2087、子宮癌株であるME-180(ATCCより購入)、大腸癌株であるcolo201(Japanese Collection of Research Bioresourcesより購入)に対し結合活性を示した。これら癌細胞株において、TMPRSS11EがRNAレベルのみならず、蛋白レベルでも高発現している事が判明した。DAKO社のQIFIKITを用いて細胞あたりの抗原発現数を概算した結果、H2009では約26,000分子、ME-180では約40,000分子の発現があり、抗体医薬の標的抗原として十分な発現をしている事が判明した。
1. 全長ヒトCD16定常発現細胞の樹立
全長ヒトCD16 (RefSeq ID、NM_000569)を哺乳細胞発現用ベクター(pMCDN)にクローニングした(pMCDN/CD16)。pMCDN/CD16をNK-92細胞(ATCCより購入、CRL-2407)へエレクトロポレーションにより導入し、500 μg/ml ジェネテシンでの選抜により、全長ヒトCD16を定常的に発現するNK-92細胞株(CD16-NK92)を樹立した。CD16-NK92細胞の培養には500 μg/ml ジェネテシン、ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen社)、0.2 mM イノシトール(Sigma社)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(Invitrogen社)、0.02 mM 葉酸(Sigma社)、100 U/ml 組換えヒトインターロイキン-2 (Peprotech社)、10% ウマ血清(Invitrogen社)、10% ウシ胎児血清(Invitrogen社)を含むAlpha minimum essential medium without ribonucleosides and deoxyribonucleosides with L-glutamine培地(Invitrogen社)を用いた。
H2009、colo201細胞を96ウェル平底プレートの各ウェルに50μlずつ添加し、5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて2日間培養した。10% ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地(以下、培地と称する。) にChromium-51 (Code No. CJS4、GEヘルスケアバイオサイエンス社)を240μCi/ml添加した溶液を各ウェルに10μlずつ添加し、引き続き1時間培養した。各ウェルを300μlの培地で洗浄したあと100μlの培地を添加した。次に、抗TMPRSS11E抗体またはコントロールヒトIgG1抗体(Cat. No. PHP010、Serotec社)を50μlずつ添加した。続いて培地にて1×106個/mlに懸濁されたCD16-NK92細胞を50μlずつ添加した。該プレートは5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて4時間培養後、上清100μlの放射活性をガンマカウンター(1480 WIZARD 3”、Wallac社)にて測定した。下式に基づいて特異的クロム遊離率を決定した。
特異的クロム遊離率(%)=(A-C)×100/(B-C)
Aは各ウェルの放射活性(cpm)、Bは100μl の2% Nonidet P-40溶液(Code No.252-23、Nacalai Tesque社)を添加したウェルの放射活性(cpm)の平均値、Cは100μlの培地を添加したウェルの放射活性(cpm)の平均値を示す。試験は重複して行い、特異的クロム遊離率の平均値及び標準偏差を算出した。
M E-180については、20μg/mLのCalcein-AM(DOJINDO社)により標識し、同様の方法で抗体、エフェクター細胞を作用させ、上清100μLの蛍光度をARVO(WALLAC社)を用いて計測し、特異的Calcein-AM遊離率(%)を算出した。
図4に示すように、各癌細胞株に対し、抗TMPRSS11E抗体によるADCC活性が認められた。また、低フコース化によりADCC活性の増強が確認された。
次に、TMPRSS11Eを標的としたイムノトキシンが抗腫瘍効果を示す事ができるか、Hum-ZAPを用いて評価した。Hum-ZAPは、抗ヒトIgG抗体に蛋白合成阻害のトキシンであるサポリンを結合させたもので、Advanced Targeting Systems社製のものを用いた。前日にh2009、ME-180細胞を500個/ 50μL/ ウェルで96ウェルプレートに蒔き込み、100ngのHum-ZAPと100ngの抗TMPRSS11Eキメラ化抗体(TM094、TM191)を混合したものを添加した。96時間培養後にCell Count Reagent SF (Nacalai Tesque社)を10μL添加し、2時間後に450nmの吸光度を測定した。図5に示すように、Hum-ZAP単独では増殖抑制が認められないものの、抗TMPRSS11E抗体に依存して、抗腫瘍効果が認められた。
TMPRSS11Eは2型セリンプロテアーゼファミリーに属し、プロテアーゼドメインを有する。TMPRSS11Eに結合する抗体はこの機能を中和する可能性がある。Enzchek Gelatinase /Collagenase Assay Kit (Molecular Probes社)を用いて、プロテアーゼ評価系を構築した。上記構築した可溶型ヒトsTMPRSS11Ep1/マウスIgG2a Fc融合蛋白(11E-Fc)600ngに対し1μgのTM191を添加し4℃で1時間放置した。これをキット添付のマニュアルに従い、蛍光物質で標識されたDQ-Gelatinを添加し、室温で反応させ継時的に蛍光度を測定した。図6に示すように、11E-Fc非存在下では蛍光度の上昇は認められず、11E-Fcの添加に依存して蛍光度の上昇が確認された。11E-FcにコントロールIgGを添加したサンプルでは変化が認められなかったが、TM191と混合すると蛍光度の上昇が認められなくなった。この事から、TM191は、TMPRSS11Eのプロテアーゼ活性を中和する活性を有していることが判明した。
TMPRSS11EのSEAドメイン(Tyr42-Arg191)の領域とマウスIgG2a Fc領域の融合蛋白を上記方法に従い作製した。これをBalb/cマウス、MRL/lprマウスへ免疫し、上記と同様の方法でハイブリドーマを樹立した。スクリーニングには、New England Biolabs社のpMALc2xベクターを用い、MBPとSEAドメインの融合蛋白質として大腸菌にて発現、精製したものを固相化したELISAにより行った。強い結合活性を示したEA230を産生するハイブリドーマよりRNAを抽出し、上記方法に従い抗体可変領域の遺伝子配列を決定した。EA230の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号53、アミノ酸配列を配列番号54、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号55、アミノ酸配列を配列番号56に示す。
Ba/F3、TMPRSS11E発現Ba/F3(BaF/TMPRSS11E)、TMPRSS11E陰性癌細胞株VMRC-LCD、TMPRSS11E陽性癌細胞株h2009、ME-180の細胞ライセートを作製した。細胞1x106個に対しNP-40 Lysis Buffer (0.5% (v/v) Nonidet P40, 20mM Tris-HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 5mM EDTA)を50μL添加し、4℃で15分放置後、遠心(14,000rpm, 15min)後の上清をライセートとして使用した。細胞2x105個相当のライセートをSDS-PAGEにより分離後、Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (BIO-RAD社)を用いてイモビロン-P(Millipore社)へトランスファーした。メンブレンをTBS-T(0.05% Tween20, TBS)で軽く洗った後、5%スキムミルク入りTBS-Tで1時間振とうした。TBS-Tで約10分間振とうした後、1%スキムミルク入りTBS-Tで希釈した0.5μg/mLのEA230抗体を加え1時間振とうした。TBS-Tで洗い(10分間x3回)、1%スキムミルク入りTBS-Tで1/2000に希釈したHRP-抗マウスIgG抗体(GE社)で1時間振とう後、TBS-Tで洗った(10分x3回)。発色はECL-Plus (GE社)を用いて行い、Hyperfilm ECL(GE社)を用いて現像した。図7に示すように、EA230はBa/F3親株には反応せず、TMPRSS11E強制発現株では50数kDa位置にバンドが検出された。TMPRSS11Eの予想分子量は47.7kDaであるため、おそらく糖鎖修飾を受けたTMPRSS11Eが検出されていると考えられる。すなわち、EA230はイムノブロットでTMPRSS11Eを特異的に検出できる。癌細胞株においても同様のバンドが検出され、確かに癌細胞株ではTMPRSS11Eが高発現していることが確認された。
臨床癌組織でのTMPRSS11Eの発現を評価する目的で、EA230を用いてIHC解析を行った。肺癌組織アレイとしてTest slide, Lung cancer tissues with corresponding normal tissues (ISU ABXIS社, A716II)、子宮頸癌組織アレイとしてMultiple (uterine cervix) cervical squamous cancer tissue array (Biomax社, CR803)、食道癌組織アレイとしてHuman Common Cancers Array(SuperBioChips社, MA1)を使用した。染色はDAKO社のEnvision Kitを用いた。組織を脱パラフィン処理後、10mM クエン酸バッファー(pH6.0)でオートクレーブ(120℃, 10min)による賦活化処理を行い、添付のマニュアルに従い、10μg/mLのEA230を用いて染色を行った。図8に示すように、肺癌および子宮頸癌および食道癌で癌組織の強い染色が認められた。このことから臨床癌組織においてもTMPRSS11Eは高発現している事が判明した(Lang and Schuller, 2001)。染色は細胞膜に限局しており、TMPRSS11Eは抗体医薬の標的抗原として有望であると考えられた。
1. マウスIgG2ak型TM191の作製
実施例4で作製したヒトーマウスキメラ型TM191発現プラスミドよりTM191のH鎖およびL鎖可変領域配列を切り出し、pMCDN mG2akベクターへクローニングした。pMCDN mG2akベクターは、pMCDNベクターにマウスIgG2a定常領域がクローニングされており、NheI部位によりマウスH鎖可変領域と定常領域が連結する構造を持つ。また、もう一つmouse CMVプロモータを含む発現ユニット、及びマウスκ鎖定常領域が挿入されており、BsiWI部位によりマウスL鎖可変領域と定常領域が連結する構造を持つ。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、マウスIgG2a型TM191抗体遺伝子を発現する。マウスIgG2a型TM191のH鎖の塩基配列を配列番号57に、アミノ酸配列を配列番号58に、マウスkappa型TM191のL鎖の塩基配列を配列番号59に、アミノ酸配列を配列番号60に示す。pMCDN mG2ak TM191をDG44細胞、及びCHO FTKOへエレクトロポレーションにより導入した。500μg/mL Geneticin での選抜により定常発現CHO細胞を樹立した。次に培養上清よりHi Trap rProtein Aカラムを用いて精製を行った。精製抗体(TM191 mIgG2ak (DG)、TM191 mIgG2ak (FTKO))はPD-10カラムにてPBSにバッファー交換し、 DC Protein Assayにより定量し、4℃で保管した。
肝癌細胞株であるSK-Hep-1細胞はATCCより購入し、D-MEM (SIGMA), 10% FBS (BOVAGEN), 1% penicillin-streptomyicin (GIBCO)にて培養した。実施例2でクローニングした全長TMPRSS11E遺伝子をpCOSII-Zeoベクターへクローニングした。pCOSII-Zeoベクターはゼオシン耐性遺伝子が組み込まれている。作製したTPMRSS11E発現プラスミドをエレクトロポレーション法によりSK-Hep-1細胞へ導入し、800μg/mL Zeocinで選抜し、限界希釈法によりTMPRSS11E発現株を樹立した。図9に示すようにflowcytometryにおいて、親株であるSK-Hep1へはTM191は結合せず、TMPRSS11E強制発現株に対しては強い結合を示した。
3.1. ヒト肝臓癌移植マウスモデルの作製
あらかじめ前日に抗アシアロGM1抗体(和光純薬社)0.2mgを腹腔内投与したC.B-17/Icr-scidマウス(メス、腫瘍移植時6週齢、日本クレア)56匹に、1.2で取得されたTMPRSS11E発現肝癌細胞株を5E6cells/mouse(培地(D-MEM (SIGMA), 10% FBS (BOVAGEN), 1% penicillin-streptomyicin (GIBCO), 400μg/mL geneticin (GIBCO), 800μg/mL Zeocin (Invitrogen))とマトリゲルで1:1混和した細胞懸濁液)で皮下に移植した。
移植14日目にノギスで腫瘍サイズ(長径x短径x 短径(mm3))と体重を測定し、1群6匹の全6群に群分けし、投与を開始した。
1.で調製された抗体TM191 mIgG2ak (DG)、TM191 mIgG2ak (FTKO)を、投与する当日にPBS(-)(SIGMA)を用いて0.5mg/mL(5mg/kg投与群)、あるいは2.5mg/mL(25mg/kg投与群)になるように調製し、3.1で群分けしたマウスに10mL/kgにて、尾静脈より投与した。投与は週に1回、全4回行った。その間および最終投与1週間後までの間、週に2回、腫瘍サイズと体重の測定を行った。
TM191 mIgG2ak (DG)、TM191 mIgG2ak (FTKO)の投与により5mg/kg投与群、25mg/kg投与群ともに皮下に移植したヒト肝臓癌は有意に増殖が阻害された(図10)。
Claims (18)
- 配列番号42に記載の重鎖可変領域および配列番号44に記載の軽鎖可変領域を含むTMPRSS11Eタンパク質に結合するモノクローナル抗体。
- 細胞傷害活性を有することを特徴とする請求項1に記載の抗体。
- 細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性(ADCC活性)である請求項2に記載の抗体。
- 細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性(CDC活性)である請求項2に記載の抗体。
- インターナライズ活性を有することを特徴とする請求項1〜4いずれかに記載の抗体。
- 細胞傷害性物質が結合していることを特徴とする請求項5に記載の抗体。
- 中和活性を有することを特徴とする請求項1〜6いずれかに記載の抗体。
- 以下のいずれかに記載のTMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体。
(1)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号15に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号16に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号17に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含み、細胞障害活性を有する抗体。
(2)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号15に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号16に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号17に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含み、インターナライズ活性を有する抗体。
(3)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号15に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、配列番号16に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及び配列番号17に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含み、中和活性を有する抗体。
(4)上記(1)に記載の抗体とTMPRSS11Eタンパク質に対する結合が競合し、細胞障害活性を有する抗体。
(5)上記(2)に記載の抗体とTMPRSS11Eタンパク質に対する結合が競合し、インターナライズ活性を有する抗体。
(6)上記(3)に記載の抗体とTMPRSS11Eタンパク質のエピトープに対する結合が競合し、中和活性を有する抗体。 - 配列番号2の159-423番目のアミノ酸配列からなるエピトープを認識することを特徴とする請求項1〜7いずれかに記載の抗体。
- 請求項1〜9いずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
- 抗癌剤である請求項10に記載の医薬組成物。
- 肺癌または子宮頸癌または食道癌を対象とする抗癌剤である請求項11に記載の医薬組成物。
- 被験者から単離された試料におけるTMPRSS11Eタンパク質を請求項1〜9いずれかに記載の抗体を用いて検出することを含む、前記試料における癌の存在を検出する方法。
- 肺癌または子宮頸癌または食道癌を診断するためのものである、請求項13に記載の方法。
- 請求項1〜9いずれかに記載の抗体を含む癌の検出薬。
- 肺癌または子宮頸癌または食道癌を検出するためのものである、請求項15に記載の検出薬。
- 癌の検出または治療において使用するための、請求項1〜9いずれかに記載の抗体。
- 癌が、肺癌または子宮頸癌または食道癌である、請求項17に記載の抗体。
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