JP5918540B2 - 抗ｄｌｌ３抗体 - Google Patents

Description

本出願は、日本特許出願２０１０−０１９３９１（２０１０年１月２９日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。

本発明は、抗癌剤ならびに癌の診断方法に関する。

小細胞肺癌は肺癌のうち約20%をしめる。小細胞肺癌は進行がはやく、多くの症例では診断時に既にリンパ節転移や遠隔転移が認められるため、外科手術が難しい。抗癌剤に対して初期には高い感受性を示すことから、化学療法が第一選択の治療法として考えられている。しかし癌は化学療法耐性へと速やかに移行して再発し、その3年生存率は5%以下である。ゆえに新しい治療法が求められている。

Delta-like 3(DLL3)はNotchリガンドファミリメンバーに属するI型膜蛋白質である。DLL3は正常な体節形成とパタニングに必要である。DLL3変異は常染色体劣性異常脊椎肋骨異形成症(spondylocostal dysostosis)患者において肋骨欠損と脊椎分裂を引き起こす［非特許文献1,2］。DLL1が細胞表面に局在し、Notchに結合する一方で、DLL3は主にゴルジに局在し、Notchに結合しない［非特許文献3,4］。

膵癌細胞株においてDLL3染色体遺伝子の増幅および遺伝子の発現亢進が起きていること［非特許文献5］、ならびに、一部のグリオーマでDLL3の発現亢進が起きていること［非特許文献6］を報告した先行研究が存在する。しかしながら、細胞表面上でのDLL3蛋白質数についての報告はない。細胞表面上の抗原分子を抗体でターゲッティング、抗体依存性細胞傷害活性を抗腫瘍メカニズムとして癌細胞を殺すためには、通常の抗体では10⁵個以上の、ADCC誘導能を高めた低フコース化抗体でも10⁴個オーダーの抗原分子の発現が必要である［非特許文献7］。したがって、DLL3が抗体を利用した治療標的として適切であるかどうかは不明である。

研究試薬として、マウス抗DLL3モノクローナル抗体(MAB4315, R&D System)が既に市販されている。

Bulman, M.P. et al. (2000) Nat Genet 24, 438-441. Turnpenny, P.D. et al. (2003) J Med Genet 40, 333-339. Geffers, I. et al. (2007) J Cell Biol 178, 465-476. Ladi, E. et al. (2005) J Cell Biol 170, 983-992. Phillips, H.S. (2006) Cancer Cell 9,157-173. Mulledndore, M.E. (2009) Clin Cancer Res 15, 2291-2301. 設楽研也 (2009) YAKUGAKU ZASSHI 129,3-9.

本発明は、新規抗体およびこれを用いた抗癌剤ならびに癌の診断方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、DLL3が小細胞肺癌でmRNA発現亢進していることを見出した。正常組織での発現は、胎児脳を除き、いずれも低かった。本発明者らはDLL3蛋白質に対するモノクローナル抗体を作製したが、抗体結合能として測定される細胞表面の抗原量は発現細胞あたりわずか10⁴未満であった。しかし、細胞外ドメインC末端付近の特徴あるエピトープに結合し、細胞膜上のDLL3に結合して安定に存在する抗体は、意外にもADCC誘導活性をもつことを見出した。すなわち、本発明者らは抗腫瘍活性を有する抗体を選抜することに成功した。また、毒素を結合させた抗体は、DLL3発現細胞に細胞傷害を与える活性をもつことを見出した。以上の知見により、本発明者らは抗DLL3抗体が、DLL3を発現する原発性あるいは転移性の癌の診断、予防および治療に有効であることを見出して本発明を完成させた。

本発明は、DLL3タンパク質に結合する抗体を提供する。好ましくは、本発明の抗体は細胞傷害活性を有する。特に好ましくは、細胞傷害活性は抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）である。また好ましくは、本発明の抗体はインターナライズ活性を有する。また好ましくは、本発明の抗体には細胞傷害性物質が結合している。また好ましくは、本発明の抗体は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するヒトDLL3において、216番目のアミノ酸〜492番目までのアミノ酸の領域を認識する。

別の観点においては、本発明は、以下のいずれかに記載のDLL3タンパク質に結合する抗体：
（１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
（２）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
（３）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
（４）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
（５）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（６）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（７）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（８）配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（９）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（１０）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（１１）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（１２）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（１３）（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体；
（１４）（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体が結合するDLL3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、
を提供する。

さらに別の観点においては、本発明は、上述のいずれかの抗体を有効成分として含む医薬組成物を提供する。好ましくは、本発明の医薬組成物は抗癌剤である。特に好ましくは、抗癌剤は肺癌を対象とする。

さらに別の観点においては、本発明は、以下の工程を含む癌の診断方法
(a)被験者から単離された試料を提供する工程、
(b)上記試料におけるDLL3タンパク質又はDLL3遺伝子の発現量を検出する工程、
を提供する。好ましくは、本発明の診断方法は肺癌を診断するためのものである。本発明はまた、上述のいずれかの抗体を含む癌の診断薬を提供する。

図１は、小細胞肺癌および胎児脳でのDLL3発現亢進を示す。 図２は、抗DLL3モノクローナル抗体の可溶型DLL3蛋白質への結合を示す。 図３は、抗体の細胞膜上DLL3蛋白質への結合、細胞に結合した抗体のターンオーバーを示す。 図４は、抗DLL3抗体(濃度2.5μg/ml)によるADCC誘導を示す。 図５は、ターゲット細胞DLL3/BaF3(a)およびNCI-H1184(b)に対するADCC活性の抗体濃度依存性を示す。 図６は、抗DLL3抗体/トキシン標識した抗マウス2次抗体Mab-ZAPの取り込みによる細胞増殖抑制を示す。 図７は、組換え抗DLL3抗体の細胞表面上DLL3蛋白質への結合を示す。 図８は、組換え抗DLL3ヒトキメラ抗体の可溶型DLL3蛋白質への結合およびマウスDLL3抗体による抗DLL3キメラ抗体の可溶型DLL3蛋白質への結合競合を示す。 図９は、全長および可溶型DLL3蛋白質の構造概要および抗DLL3抗体の認識部位を示す。 図１０は、組換え抗DLL3ヒトキメラ抗体DL306の細胞表面上DLL3蛋白質への結合を示す。 図１１は、ターゲット細胞DLL3/BaF3およびNCI-H1184に対する抗DLL3ヒトキメラ抗体のADCC活性の抗体濃度依存性を示す。 図１２は、ターゲット細胞DLL3/BaF3およびNCI-H1184に対する抗DLL3マウス低フコース化抗体のADCC活性の抗体濃度依存性を示す。

DLL3
DLL3（Delta-like 3）のアミノ酸配列は公知であり、例えばヒトDLL3のアミノ酸配列は配列番号：１（NM＿016941）、マウスDLL3のアミノ酸配列は配列番号：２、（NM＿007866）に記載されている。

本発明で使用されるDLL3タンパク質は上述の配列を有するDLL3タンパク質でもよいし、上述の配列において１又は複数のアミノ酸が改変された改変体であってもよい。上述の配列において１又は複数のアミノ酸が改変された改変体の例としては、上述のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは80%以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは90%以上の相同性を有するポリペプチド、より好ましくは95%以上の相同性を有するポリペプチドを挙げることができる。又、これらのDLL3の部分ペプチドであってもよい。

本発明で使用されるDLL3タンパク質の由来は限定されないが、ヒトDLL3タンパク質であることが好ましい。

抗DLL3抗体
本発明で用いられる抗DLL3抗体は、DLL3タンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは特に限定されない。具体的には、非ヒト動物由来の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト由来のヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体が使用できる。本発明において使用される抗DLL3抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。

本発明で用いられる抗DLL3抗体は抗ヒトDLL3抗体であることが好ましい。抗ヒトDLL3抗体は、ヒトDLL3に特異的に結合する抗体であってもよいし、ヒトDLL3以外に他の動物由来のDLL3（例えばマウスDLL3）に結合する抗体であってもよい。

本発明で使用される抗DLL3抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として取得できる。本発明で使用される抗DLL3抗体としては、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。

本発明の抗DLL3抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子で修飾してもよい。また、後述するように、細胞傷害活性を有する化学療法剤や放射性化学物質等で修飾してもよい。

本発明で用いられる、DLL3を認識してこれに結合する抗体の例として、例えば以下の抗体を挙げることができる：
（１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(DL301)；
（２）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(DL306)；
（３）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(DL309)；
（４）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(DL312)；
（５）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL301)；
（６）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL306)；
（７）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL309)；
（８）配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL312)；
（９）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（DL301）；
（１０）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL306)；
（１１）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL309)；
（１２）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL312)；
（１３）（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体；および
（１４）（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体が結合するDLL3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。

上述の（１）〜（１２）の抗体が定常領域を含む場合、使用される定常領域は特に限定されず、如何なる定常領域が使用されてもよい。本発明で使用される好ましい定常領域としてヒト由来の定常領域を挙げることができる。例えば、重鎖定常領域の場合、ヒトIgG1由来の定常領域、ヒトIgG2由来の定常領域、ヒトIgG3由来の定常領域、ヒトIgG４由来の定常領域などを使用することができる。又、例えば、軽鎖定常領域の場合、ヒトκ鎖由来の定常領域、ヒトλ鎖由来の定常領域などを使用できる。本発明で使用される定常領域は天然配列を有する定常領域であってもよいし、天然配列を有する定常領域において１又は複数のアミノ酸が改変された改変体であってもよい。

上述の（１）〜（１２）の抗体がFRを含む場合、使用されるFRは特に限定されず、ヒトDLL3への結合活性が維持される限り如何なるFRが使用されてもよい。本発明で使用されるFRの好ましい例としては、ヒト抗体由来のFRを挙げることができる。抗体の抗原への結合活性を維持したままFRを置換する技術は公知であるので、当業者は適宜、FRを選択することが可能である。本発明で使用されるFRは天然配列を有するFRであってもよいし、天然配列において１又は複数のアミノ酸が改変されたFRであってもよい。

配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域の例としては、配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を挙げることができる。又、当該重鎖可変領域を含む重鎖の例としては、配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖を挙げることができる。

配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域の例としては、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を挙げることができる。又、当該重鎖可変領域を含む重鎖の例としては、配列番号２２又は配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖を挙げることができる。

配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域の例としては、配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を挙げることができる。又、当該重鎖可変領域を含む重鎖の例としては、配列番号３４又は配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖を挙げることができる。

配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域の例としては、配列番号：４５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を挙げることができる。又、当該重鎖可変領域を含む重鎖の例としては、配列番号４６又は配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖を挙げることができる。

配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域の例としては、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を挙げることができる。又、当該軽鎖可変領域を含む軽鎖の例としては、配列番号：１６又は配列番号：１７のアミノ酸配列を有する軽鎖を挙げることができる。

配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域の例としては、配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を挙げることができる。又、当該軽鎖可変領域を含む軽鎖の例としては、配列番号：２８又は配列番号：２９のアミノ酸配列を有する軽鎖を挙げることができる。

配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域の例としては、配列番号：３９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を挙げることができる。又、当該軽鎖可変領域を含む軽鎖の例としては、配列番号：４０又は配列番号：４１のアミノ酸配列を有する軽鎖を挙げることができる。

配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域の例としては、配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を挙げることができる。又、当該軽鎖可変領域を含む軽鎖の例としては、配列番号：５２又は配列番号：５３のアミノ酸配列を有する軽鎖を挙げることができる。

本発明において、本発明の抗体と同等の活性を有するとは、DLL3への結合活性、インターナライズ活性及び／又はDLL3を発現する細胞への細胞傷害活性（ADCC活性など）が同等であることをいう。本発明において活性が同等とは、必ずしも活性が同一であることは要求されず、例えば上述の（１）〜（１２）のいずれかの活性と比較して50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上の活性を有していればよい。活性の上限は特に限定されず、例えば1000%以下、500%以下、300%以下、150%以下、100%以下などの例をあげることができる。

本発明の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体も本発明の範囲内であり、人為的に作製されたものでも、自然的に生じたものであってもよい。ポリペプチドに変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などが挙げられ、これは、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法の一つである。当業者であれば、このような方法を用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。

このような変異体において、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）である。

変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している：
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。

あるアミノ酸配列に対する１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、元のポリペプチドの生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666、Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。すなわち、一般に、あるポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、各群に分類されたアミノ酸の間で相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いといわれている。本発明において、上記アミノ酸群の群内のアミノ酸間の置換を保存的置換と言う。

また本発明は、上述の（１）〜（１２）いずれかの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体もまた提供する。上述の（１）〜（１２）の抗体の具体的な例として、下記の実施例に記載されたDL301、DL306、DL309、DL312の抗体を挙げることができる。すなわち本発明は、これらの抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを認識する抗体も提供する。

被験抗体が、ある抗体とエピトープを共有するか否かは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。

具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたDLL3タンパク質を、候補の競合抗体の存在下、又は非存在下でプレインキュベートした後に、本発明の抗DLL3抗体が添加される。ウェル中のDLL3タンパク質に結合した本発明の抗DLL3抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被験抗体）の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明の抗DLL3抗体のDLL3タンパク質をコートしたウェルへの結合量は低下し、一方、被験抗体のDLL3タンパク質をコートしたウェルへの結合量は増加する。

ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイと言う。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。

さらに被験抗体が本発明の抗DLL3抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合した抗体を、いずれかの定常領域を認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体を測定することができる。

競合抗体の非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも80％、抗DLL3抗体の結合をブロックできるならば、該候補抗体は本発明の抗DLL3抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。

さらに、本発明の抗体の例として、ヒトDLL3（配列番号：１）の27番目のアミノ酸〜175番目のアミノ酸までの領域を認識する抗体、ヒトDLL3の216番目のアミノ酸〜492番目のアミノ酸までの領域を認識する抗体を挙げることができる。又、本発明の抗体の他の態様として、ヒトDLL3に結合するが、配列番号：６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（DLL3delta1-Fc）および配列番号：７のアミノ酸配列からなるポリペプチド(DLL3delta2-Fc)には結合しない抗体、ならびに、ヒトDLL3に結合し、かつ配列番号：６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（DLL3delta1-Fc）および配列番号：７のアミノ酸配列からなるポリペプチド(DLL3delta2-Fc)にも結合する抗体を挙げることができる。

本発明の抗体はADCC活性、インターナライズ活性などの活性を有することから、医薬品、特に抗癌剤として有用である。

遺伝子組換え型抗DLL3抗体
抗体がヒトに投与されるべきものである場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。遺伝子組換え型抗体とは、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを含む。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。

（１）キメラ抗体
キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体をいう。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される当該キメラ抗体を取得できる。

キメラ抗体の定常領域には、ヒト抗体のものが使用される。例えば重鎖においては、Cγ１、Cγ２、Cγ３、Cγ４、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、及びCεを定常領域として利用することができる。また軽鎖においてはCκやCλを定常領域として使用できる。これらの定常領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体自体の安定性、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体定常領域中の１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入することができる。

（２）ヒト化抗体
一般にキメラ抗体が、ヒト以外の動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とから構成されるのに対して、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity determining region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR；framework region）及びヒト抗体由来の定常領域とから構成される。ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。

抗体の可変領域は、通常、４つのFRにはさまれた３つのCDRで構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。

ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばオーバーラップエクステンションPCR（Overlap Extension PCR）が公知である。オーバーラップエクステンションPCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加されたプライマーを用いる。プライマーは４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと相同性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利であるといわれている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。

また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、オーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。

最終的に３つのCDRと４つのFRが連結された可変領域遺伝子は、その5’末端と3'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体定常領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト化抗体発現用ベクターが作成できる。このベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、組換え細胞を培養し、ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、ヒト化抗体が培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP 239400 、国際公開WO 96/02576参照）。

上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、ヒト化抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856）。

（３）多価抗体
本発明の抗体には、DLL3タンパク質に結合する限り、IgG（IgG1、IgG2、IgG4など）に代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、又は、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。

（４）低分子化抗体
本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、DLL3タンパク質に結合する限り、低分子化抗体又はその修飾物であってもよい。

低分子化抗体は、全長抗体（whole antibody、例えばwhole IgG等）の一部分が欠損している抗体断片を含む。DLL3抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）のいずれか、又は両方を含んでいることが好ましい。また、本発明における抗体断片はCDRを含んでいることが好ましい。本発明の抗体断片に含まれるCDRの数は特に限定されないが、重鎖CDR1、CDR2、CDR3、軽鎖CDR1、CDR2、CDR3の６つを少なくとも含んでいることが好ましい。

VH又はVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入を含むことができる。さらにDLL3抗原への結合能を有する限り、VH及びVLのいずれか、又は両方の一部を欠損させることもできる。また、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single chain Fv）、ダイアボディー、sc(Fv)2（single chain (Fv)2）、scFv-Fcなどを挙げることができる。本発明において好ましい低分子化抗体はダイアボディー又はsc(Fv)2である。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。

抗体の断片は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、特定の構造の抗体断片を与える。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知であり、パパイン消化の場合、F(ab)2又はFabを、ペプシン消化の場合、F(ab’)2又はFab’を与える。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 497-515、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1986）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1986）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。

酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。本発明における低分子化抗体は、DLL3に対する結合親和性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片であることができる。

i)ダイアボディー
ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の抗体断片を指す（Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等）。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中で重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされる重鎖可変領域と軽鎖可変領域とは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。

ii）scFv
scFvは、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85, 5879-5883）。scFvにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。可変領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から25残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。

両鎖の可変領域は、たとえばPCR法によって連結することができる。PCR法による可変領域の連結のために、まず抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするDNA配列、及び抗体の軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするDNA配列のうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。

増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、重鎖と軽鎖の可変領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各可変領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［重鎖可変領域DNA］−［ペプチドリンカーDNA］−［軽鎖可変領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。

アセンブリーPCR用のプライマーは、［重鎖可変領域DNA］の5’側にアニールするプライマーと、［軽鎖可変領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各可変領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。

iii)scFv-Fc
scFv-FcはscFvにFc領域を融合させた低分子化抗体である（Cellular & Molecular Immunology 2006； 3： 439-443）。scFv-Fcに用いられるscFvの由来は特に限定されないが、例えばIgM由来のscFvを用いることができる。また、Fcの由来は特に限定されないが、例えばヒトIgG（ヒトIgG1など）を用いることができる。従って、scFv-Fcの好ましい態様の例として、IgM抗体のscFv断片と、ヒトIgG1のCH2(たとえば、Cγ2)とCH3（たとえば、Cγ3)をヒトIgG1のヒンジ領域（Hγ)で連結させたscFv-Fcを挙げることができる。

iv)sc(Fv)2
sc(Fv)2は、2つの重鎖可変領域（VH）及び2つの軽鎖可変領域（VL）をリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。

また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。

2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］

抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、さらに好ましくは5から30アミノ酸、特に好ましくは12から18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。

ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。例えば、ペプチドリンカーの場合次のようなアミノ酸配列を利用することができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号61）
Ser・Gly・Gly・Gly (配列番号62）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号63）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly (配列番号64）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号65）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly (配列番号66）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号67）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly (配列番号68）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly)n
［nは１以上の整数である］。

ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定するnは、通常１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１又は２である。

よって本発明において特に好ましいsc(Fv)2の態様としては、例えば、以下のsc(Fv)2を挙げることができる：
［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］。

あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用して可変領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えば次のような化学架橋剤が公知である。これらの架橋剤は市販されている：N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、
ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、
ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、
エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、
ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、
ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、及び
ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）など。

抗DLL3抗体の活性
（１）細胞障害活性
癌などの細胞増殖性疾患の治療においては、抗体は、そのエフェクター活性を維持していることが望ましい。すなわち、本発明における好ましい抗体は、DLL3に対する結合親和性とエフェクター機能の両方を有する。抗体のエフェクター機能には、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）活性及び補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性が含まれる。本発明における治療用の抗体は、特に好ましくは、ADCC活性をエフェクター機能として備える。

本発明の抗体が治療目的で用いられる場合、抗体は好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。

本発明における細胞傷害活性としては、例えば、ADCC活性、CDC活性などを挙げることができる。本発明において、ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。一方、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。

抗DLL3抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等）。具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製が実施される。

i）エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地（Invitrogen社製）中で脾臓細胞が分離される。10％ウシ胎児血清（FBS、HyClone社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×10⁶/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。

ii）補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement（CEDARLANE社製）を10％ FBS含有培地（Invitrogen社製）にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。

iii）標的細胞の調製
DLL3タンパク質を発現する細胞を0.2 mCiの⁵¹Cr-クロム酸ナトリウム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）とともに、10％ FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。DLL3タンパク質を発現する細胞としては、DLL3タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、小細胞肺癌細胞株等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10％ FBS含有RPMI1640培地にて３回洗浄し、細胞濃度を2×10⁵/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。

ADCC活性、又はCDC活性は下記に述べる方法により測定できる。ADCC活性の測定の場合は、96ウェルＵ底プレート（Becton Dickinson社製）に、標的細胞と、抗DLL3抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、エフェクター細胞100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0又は10μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンター（COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company社製）で放射活性を測定する。細胞傷害活性（%）は得られた値を使用して(A-C) / (B-C) x 100の計算式に基づいて計算できる。Aは各試料における放射活性（cpm）、Bは1％NP-40（nacalai tesque社製)を加えた試料における放射活性（cpm）、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm）を示す。

一方、CDC活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton Dickinson社製）に、標的細胞と、抗DLL3抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、補体溶液100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0又は3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。

一方、抗体コンジュゲートによる細胞傷害活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton Dickinson社製）に、標的細胞と、抗DLL3抗体コンジュゲートを50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。炭酸ガスインキュベーター内で1から4時間培養する。抗体の終濃度は0又は3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。

（２）コンジュゲート抗体
抗体に化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質などの細胞傷害性物質を結合することも可能である。このような抗体修飾物（以下、抗体コンジュゲートと称する。）は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。

抗DLL3抗体に結合させて細胞傷害活性を機能させる化学療法剤としては、たとえば次のような化学療法剤が例示できる：アザリビン（azaribine）、アナストロゾール（anastrozole）、アザシチジン（azacytidine）、ブレオマイシン（bleomycin）、ボルテゾミブ（bortezomib）、ブリオスタチン-1（bryostatin-1）、ブスルファン（busulfan）、カンプトテシン（camptothecin）、10-ヒドロキシカンプトテシン（10-hydroxycamptothecin）、カルムスチン（carmustine）、セレブレックス（celebrex）、クロラムブシル（chlorambucil）、シスプラチン（cisplatin）、イリノテカン（irinotecan）、カルボプラチン（carboplatin）、クラドリビン（cladribine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、シタラビン（cytarabine）、ダカルバジン（dacarbazine）、ドセタキセル（docetaxel）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノマイシングルクロニド（daunomycin glucuronide）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デキサメタゾン（dexamethasone）、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ドキソルビシンブルクロニド（doxorubicin glucuronide）、エピルビシン（epirubicin）、エチニルエストラジオール（ethinyl estradiol）、エストラムスチン（estramustine）、エトポシド（etoposide）、エトポシドグルクロニド（etoposide glucuronide）、フロキシウリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、フルタミド（flutamide）、フルオロウラシル（fluorouracil）、フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（hydroxyprogesterone caproate）、ヒドロキシウレア（hydroxyurea）、イダルビシン（idarubicin）、イフォスファミド（ifosfamide）、ロイコボリン（leucovorin）、ロムスチン（lomustine）、メクロレタミン（mechlorethamine）、メドロキシプロゲステロンアセテート（medroxyprogesterone acetate）、メゲストロールアセテート（megestrol acetate）、メルファラン（melphalan）、メルカプトプリン（mercaptopurine）、メトトレキセート（methotrexate）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、ミトラマイシン（mithramycin）、ミトマイシン（mitomycin）、ミトタン（mitotane）、フェニルブチレート（phenylbutyrate）、プレドニゾン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、パクリタキセル（paclitaxel）、ペントスタチン（pentostatin）、セムスチン（semustine）、ストレプトゾシン（streptozocin）、タモキシフェン（tamoxifen）、タキサン類（taxanes）、タキソール（taxol）、テストステロンプロピオネート（testosterone propionate）、サリドマイド（thalidomide）、チオグアニン（thioguanine）、チオテパ（thiotepa）、テニポシド（teniposide）、トポテカン（topotecan）、ウラシルマスタード（uracil mustard）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビノレルビン（vinorelbine）、ビンクリスチン（vincristine）。

好ましい化学療法剤は、低分子の化学療法剤である。低分子の化学療法剤は、抗体への結合の後も、抗体の機能に干渉する可能性が低い。本発明において、低分子の化学療法剤は、通常100〜2000、好ましくは200〜1000の分子量を有する。ここに例示した化学療法剤は、いずれも低分子の化学療法剤である。これらの本発明における化学療法剤は、生体内で活性な化学療法剤に変換されるプロドラッグを含む。プロドラッグの活性化は酵素的な変換であっても、非酵素的な変換であっても良い。

また、抗体を毒性ペプチドで修飾することもできる。毒性ペプチドの例としては、例えば、次のものを挙げることができる。ジフテリアトキシンＡ鎖(Diphtheria toxin A Chain)(Langone J.J.,et al.,Methods in Enzymology,93,307-308,1983)、シュードモナスエキソトキシン(Pseudomonas Exotoxin)(Nature Medicine,2,350-353,1996)、リシン鎖(Ricin A Chain)(Fulton R.J.,et al.,J.Biol.Chem.,261,5314-5319,1986;Sivam G.,et al.,Cancer Res.,47,3169-3173,1987;Cumber A.J.et al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak E.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519-7562,1990;Gheeite V.,et al.,J.Immunol.Methods,142,223-230,1991);無糖鎖リシンＡ鎖(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpe P.E.,et al.,Cancer Res.,47,5924-5931,1987);アブリンＡ鎖(Abrin A Chain)(Wawrzynczak E.J.,et al.,Br.J.Cancer,66,361-366,1992;Wawrzynczak E.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519-7562,1990;Sivam G.,et al.,Cancer Res.,47,3169-3173,1987;Thorpe P.E.,et al.,Cancer Res.,47,5924-5931,1987);ゲロニン(Gelonin)(Sivam G.,et al.,Cancer Res.,47,3169-3173,1987;Cumber A.J.et al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;WawrzynczakE.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ポークウイード抗ウィルス蛋白（PAP-s;Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ブリオジン(Briodin)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);サポリン(Saporin)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルジン(Momordin)(Cumber A.J.,et al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak E.J.,et al.,Cancer Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルコキン(Momorcochin)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３２(Dianthin 32)(Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３０(Dianthin 30)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986);モデッシン(Modeccin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986);ビスカミン(Viscumin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986);ボルケシン(Volkesin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986);ドデカンドリン(Dodecandrin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986);トリチン(Tritin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986);ルフィン(Luffin)(Stirpe F.,Barbieri L.,FEBS letter 195,1-8,1986);トリコキリン(Trichokirin)(Casellas P.,et al.,Eur.J.Biochem.176,581-588,1988;Bolognesi A.,et al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)。

本発明において放射性化学物質とは、放射性同位体を含む化学物質のことをいう。放射性同位体は特に限定されず、如何なる放射性同位体を用いてもよいが、例えば、³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Reなどを用いることが可能である。

また別の態様では、一又は二以上の低分子化学療法剤と毒性ペプチドをそれぞれ組み合わせて抗体の修飾に使用できる。抗DLL3抗体と上記の低分子化学療法剤との結合は共有結合又は非共有結合が利用できる。これら化学療法剤を結合した抗体の作製方法は公知である。

タンパク質性の薬剤や毒素は、遺伝子工学的な手法によって抗体と結合することができる。具体的には、たとえば上記毒性ペプチドをコードするDNAと抗DLL3抗体をコードするDNAをインフレームで融合させて発現ベクター中に組み込んだ組換えベクターが構築できる。該ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を培養し、組み込んだDNAを発現させて、毒性ペプチドを結合した抗DLL3抗体を融合タンパク質として得ることができる。抗体との融合タンパク質を得る場合、一般に、抗体のC末端側にタンパク質性の薬剤や毒素を配置される。抗体と、タンパク質性の薬剤や毒素の間には、ペプチドリンカーを介在させることもできる。

（３）二重特異性抗体
さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はDLL3分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体は、１分子のDLL3に対して２分子の抗体分子が結合できる。その結果、より強力な細胞傷害作用を期待できる。

あるいは、一方の抗原結合部位がDLL3を認識し、他方の抗原結合部位が細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。細胞傷害性物質には、具体的には、化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質等が含まれる。このような二重特異性抗体は、DLL3を発現している細胞に結合する一方で、細胞傷害性物質を捕捉する。その結果、細胞傷害性物質をDLL3発現細胞に直接作用させることができる。すなわち細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体によって、腫瘍細胞を特異的に傷害し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。

また本発明においては、DLL3以外の抗原を認識する抗原結合部位と組み合わせた二重特異性抗体を用いることもできる。たとえば、DLL3と同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であって、DLL3とは異なる抗原を認識するような抗原結合部位と組み合わせて二重特異性抗体とすることができる。

二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれが重鎖と軽鎖を有する１／２分子であっても良いし、重鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。

抗体の抗原結合活性（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。

（４）糖鎖の改変
本発明の抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞傷害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、糖鎖が修飾された抗体（WO99/54342など）、糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（WO00/61739、WO02/31140など）、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（WO02/79255など）などが公知である。

（５）インターナライズ活性
また、本発明の抗体はインターナライズ活性を有していてもよい。本発明において「インターナライズ活性を有する抗体」とは、DLL3に結合した際に細胞内（細胞質内、小胞内、他の小器官内など）に輸送される抗体を意味する。

抗体がインターナライズ活性を有するか否かは当業者に公知の方法を用いて確認することができ、例えば、標識物質を結合した抗DLL3抗体をDLL3を発現する細胞に接触させ該標識物質が細胞内に取り込まれたか否かを確認する方法、細胞傷害性物質を結合した抗DLL3抗体をDLL3を発現する細胞に接触させ該DLL3発現細胞に細胞死が誘導されたか否かを確認する方法、などにより確認することができる。

より具体的には、例えば、実施例に記載された方法により抗DLL3抗体のインターナライズ活性を測定することが可能である。

インターナライズ活性を有する抗体は例えば上述の細胞傷害性物質を結合することにより、後述する抗癌剤などの医薬組成物として用いることができる。

抗DLL3抗体の作製
１． モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる抗DLL3抗体の作製
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術にしたがい、以下のようにして作製できる。まず、DLL3タンパク質、あるいは後述するその部分ペプチドを感作抗原として使用し、通常の免疫方法にしたがって動物を免疫する。得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。さらにこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって抗DLL3抗体を産生するハイブリドーマを選択する。選択したハイブリドーマから所望の抗DLL3モノクローナル抗体を得る。具体的には、以下のようにして行う。

（１）DLL3タンパク質の調製
まず、DLL3遺伝子を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用されるDLL3タンパク質が取得できる。すなわち、DLL3をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は培養上清中から、目的のヒトDLL3タンパク質を公知の方法で精製する。精製した天然のDLL3タンパク質、あるいは、DLL3タンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどを利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular Cloning 2nd ed.（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）に記載されている。

このようにして精製されたDLL3タンパク質を、哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。DLL3の部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。たとえば、次のようなペプチドを感作抗原とすることができる。

部分ペプチドとして用いるDLL3の領域及び大きさは限定されない。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は、少なくとも３以上、たとえば、５以上、あるいは６以上であることが好ましい。より具体的には、８〜５０、好ましくは１０〜３０残基のペプチドを感作抗原とすることができる。

（２）DLL3タンパク質による免疫
DLL3タンパク質あるいはその部分ペプチドを感作抗原として、哺乳動物を免疫する。免疫される哺乳動物は、特に限定されないが、モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。

上記の動物は、公知の方法にしたがい、感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内又は皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。感作抗原は、PBS（Phosphate-Buffered Saline、リン酸緩衝食塩水）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用される。さらに、感作抗原をアジュバントとともに投与してもよい。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。

（３）DNA免疫
モノクローナル抗体は、DNA免疫（DNA Immunization）によっても得ることができる。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターDNAを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。蛋白質抗原を投与する一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性を期待できる。
・DLL3のような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる。
・免疫抗原を精製する必要が無い。

DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず、DLL3タンパク質を発現するDNAを免疫動物に投与する。DLL3をコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成することができる。得られたDNAを適当な発現ベクターに挿入し、免疫動物に投与する。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターを利用することができる。ベクターを生体に投与する方法も、一般に用いられている方法を利用することができる。たとえば、発現ベクターを吸着させた金粒子を、遺伝子銃（gene gun）で細胞内に打ち込むことによってＤＮＡ免疫を行うことができる。

（４）ハイブリドーマの作製
上述のように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。

上記の免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。

HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他、G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、以下のようなミエローマ細胞を、本発明におけるモノクローナル抗体の製造に利用することができる。

P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979）123, 1548-1550）、
P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、
NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、
MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、
SP2/0（Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、
FO（de St. Groth, S. F. etal., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、
S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、
R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等。

基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて、免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。

より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。さらに融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。

細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60％（w/v）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。

このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞を選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングが実施できる。

目的とする抗体のスクリーニング及び単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては免疫に用いたものを始め、実質的に同質なDLL3タンパク質が好適に使用できる。たとえばDLL3を発現する細胞株、可溶型DLL3などを抗原として利用することができる。

ヒトDLL3に対する抗体の産生には、国際公開WO03/104453に記載された方法を利用することもできる。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をDLL3タンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平1-59878号公報参照）。

さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となるDLL3タンパク質を投与するか、又はDLL3を当該動物中において発現するように構築されたDNAによって免疫することによって、抗DLL3ヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞から、DLL3タンパク質に対するヒト抗体を単離することができる（国際公開WO 94/25585、WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602参照）。さらに不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、当該動物の免疫システムは、ヒトDLL3を異物と認識する。したがって、ヒトDLL3に対するヒト抗体を容易に得ることができる。

（５）ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得
以上のようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。

目的とするモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。

２． 遺伝子工学的手法による抗DLL3抗体の作製
（１）抗体遺伝子のクローニング
抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子を利用することにより、遺伝子工学的手法を用いて、抗体を作製することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.（1990）192, 767-775参照）。

たとえば、抗DLL3抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗DLL3抗体の可変領域をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。
・グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）
・AGPC法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）。

抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体可変領域をコードするcDNAを合成することができる。その際、抗体遺伝子に共通な配列より選び出した任意の15-30塩基の配列をプライマーとして用いることができる。cDNAは、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等によって合成することができる。また、cDNAの合成及び増幅のために、5’-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）及びPCRを用いた5’-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）を利用することができる。さらにこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。

得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、cDNAの塩基配列を、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認することができる。

また、抗体の可変領域をコードする遺伝子を得るために、cDNAライブラリーを利用することもできる。まず抗体産生細胞から抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを得る。cDNAライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアRNAを添加した後にmRNAを精製する。あるいは抗体産生細胞から一定量のRNAを抽出できる場合には、キャリアRNAを添加しなくても効率よく抽出することができる。たとえば10以上、あるいは30以上、好ましくは50以上の抗体産生細胞からのRNA抽出には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。

得られたcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、論文（J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597）などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列をもつ。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してプライマーを選択してPCR法が行われる。

具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１〜γ５、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーを用いることができる。

重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるPCR産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの、DLL3に対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。

（２）宿主細胞への抗体遺伝子の導入
抗DLL3抗体を製造するために、クローニングされた抗体遺伝子を、発現制御領域の制御下で発現するように発現ベクターに組み込む。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗DLL3抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。

抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖及び軽鎖をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。重鎖と軽鎖が組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfect）することによって、重鎖と軽鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいは重鎖及び軽鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開WO 94/11523参照）。

単離した抗体遺伝子を適当な宿主に導入して抗体を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、次のような細胞を例示することができる。
i) 哺乳類細胞：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など
ii) 両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
iii) 昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など。

植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。

さらに真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる：
酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces ）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属、糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属。

あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E. coli）、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。

哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。

また、その他に、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等を、抗体発現のために使用することができる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等を示すことができる。

SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）を利用することができる。また、HEF1αプロモーター／エンハンサーはMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。

動物細胞を用いて抗体を産生させる場合に、細胞外への分泌のために必要とされるシグナル配列としては抗体の重鎖遺伝子又は軽鎖遺伝子のシグナル配列を用いることが望ましい。また、IL-3やIL-6などの分泌タンパク質が有するシグナル配列を用いることも可能である。

大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341, 544-546 ; FASEBJ.（1992）6, 2422-2427）を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。

抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al., J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素やグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。

発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカーを挿入することができる。具体的には、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等のような選択マーカーを利用することができる。

（３）宿主細胞からの抗体の取得
これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、次に、形質転換された宿主細胞をインビトロ又はインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。

上述のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。

従って、本発明は、本発明の抗体をコードする遺伝子を提供する。さらに本発明は当該遺伝子を含むベクターを提供する。さらに本発明は当該ベクターを保持する宿主細胞を提供する。さらに本発明は当該宿主細胞を培養する工程を含む、当該遺伝子によりコードされる抗体を製造する方法を提供する。

３． トランスジェニック動物による抗体産生
組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、目的とする抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（又はその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体を乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。

医薬組成物
DLL3は小細胞肺癌の癌組織で高発現していることから、抗DLL3抗体は癌細胞特異的な細胞傷害活性を有する。したがって、抗DLL3抗体は、DLL3を発現する癌の治療に有用である。

すなわち、本発明は、DLL3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。ある実施形態において、前記医薬組成物は細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤である。本発明の細胞増殖抑制剤及び抗癌剤は、癌を罹患している対象又は罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。

本発明の医薬組成物（例えば、抗癌剤）において用いられる抗DLL3抗体は特に限定されず、例えば上述した任意の抗DLL3抗体を用いることができる。

本発明において、「DLL3に結合する抗体を有効成分として含有する」とは、抗DLL3抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗DLL3抗体の含有率を制限するものではない。

本発明の医薬組成物は、細胞傷害性物質が結合した抗DLL3抗体を有効成分としてもよい。前記医薬組成物は、例えば、細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤として利用できる。本発明の細胞増殖抑制剤及び抗癌剤は、癌を罹患している対象又は罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。

本発明において、「細胞傷害性物質が結合した抗DLL3抗体を有効成分として含有する」とは、細胞傷害性物質が結合した抗DLL3抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、細胞傷害性物質が結合した抗DLL3抗体の含有率を制限するものではない。

本発明の医薬組成物が対象とする疾患が癌の場合、対象となる癌は特に限定されないが、肺癌、特に小細胞肺癌であることが好ましい。癌は原発巣及び転移巣のいずれであってもよい。

本発明の医薬組成物は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身又は局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000 mgの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。さらにこれらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。

本発明の抗DLL3抗体は、DLL3発現細胞と接触させることによりDLL3発現細胞に傷害を引き起こす又は細胞の増殖を抑制することができる。こうした利用方法も、本発明の範囲である。用いられる抗体は、特に限定されず、例えば上述した任意の抗体を用いることが可能である。抗DLL3抗体が結合する細胞はDLL3が発現している細胞であれば特に限定されない。本発明における好ましいDLL3発現細胞は癌細胞である。より好ましくは、肺癌細胞、特に小細胞肺癌細胞である。

本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養しているDLL3発現細胞の培養液に抗体を添加することにより行われる。また本発明において「接触」はさらに、DLL3発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や内在的にDLL3を発現する癌細胞を有する動物に投与することによっても行われる。

抗DLL3抗体の接触によってDLL3発現細胞に引き起こされた細胞傷害を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞傷害活性を評価又は測定する方法としては、上記のADCC活性、CDC活性などの測定法を挙げることができる。抗DLL3抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等）。活性の測定に際しては、対照抗体として抗DLL3抗体と同一のアイソタイプを有する抗体で該細胞に結合しない抗体を、抗DLL3抗体と同様に使用して、抗DLL3抗体が対照抗体よりも強い細胞傷害活性を示す場合に活性を有すると判定することができる。

抗体のアイソタイプは、その抗体のアミノ酸配列の重鎖定常領域の配列で規定される。生体内においては、抗体産生Ｂ細胞の成熟化の際に起こる染色体上の遺伝子組み換えにより生じるクラススイッチによって抗体のアイソタイプが最終的に決定される。アイソタイプの相違が抗体の生理的・病理的機能の相違に反映される。具体的には、例えば、細胞傷害活性の強度は抗原の発現量と共に、抗体のアイソタイプによっても影響されることが知られている。従って、上記記載の細胞傷害活性の測定に際しては、対照として用いられる抗体は被験抗体と同一のアイソタイプを用いることが好ましい。

また、生体内で細胞傷害活性を評価、あるいは測定するために、例えばDLL3発現癌細胞を非ヒト被検動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被験抗体を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより細胞傷害活性を判定することができる。試験管内での評価と同様に同一のアイソタイプを有する対照抗体を投与し、抗DLL3抗体投与群における腫瘍の大きさが対照抗体投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さい場合に細胞傷害活性を有すると判定することができる。非ヒト被検動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのＴリンパ球の機能を欠失したヌード（nu/nu）マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与された抗体による細胞傷害活性の評価・測定に当たって被検動物中のTリンパ球の関与を除くことができる。

診断薬（診断方法）
また、本発明はDLL3タンパク質又はDLL3タンパク質をコードする遺伝子を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。DLL3は癌組織あるいは癌細胞株において顕著な発現亢進が確認されている。したがって、DLL3は、癌を特異的に検出するためのマーカーとして有用である。

本発明の診断方法の具体例の一つとして、以下の工程を含む癌の診断方法を挙げることができる。
(a)被験者から単離された試料を提供する工程、
(b)上記試料におけるDLL3タンパク質又はDLL3遺伝子の発現量を検出する工程。

本発明の方法においては、さらに
(c)上記DLL3タンパク質又はDLL3遺伝子の発現量に基づいて、被験者が癌である可能性を評価する工程、
を含んでも良い。

DLL3タンパク質又はDLL3タンパク質をコードする遺伝子の検出
本発明の方法の1つの態様においては、試料中のDLL3タンパク質を検出することにより癌の診断が行われる。DLL3タンパク質の検出はDLL3タンパク質を認識する抗体を用いて行われることが好ましい。

本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出としては、次のような測定を挙げることができる。
・単にDLL3タンパク質が存在するか否かの測定
・DLL3タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
・DLL3タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など。

一方、定量的な検出とは、DLL3タンパク質の濃度の測定、DLL3タンパク質の量の測定などを挙げることができる。

本発明における被検試料は、DLL3タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されない。具体的には、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましい。さらに好ましい試料は、ヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織などが例示できる。好ましい試料は、生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの被検試料から得られる試料である。

本発明によって診断される癌は、特に制限されることはなく如何なる癌でもよい。具体的には、肺癌、特に小細胞肺癌を挙げることができる。本発明においては、原発病巣及び転移病巣のいずれをも診断することができる。

本発明においては、被検試料中にタンパク質が検出された場合に、そのレベルを指標として癌が診断される。具体的には、陰性コントロール又は健常者と比較して被検試料中に検出されるDLL3タンパク質の量が多い場合に、被検者が癌である、又は将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。すなわち本発明は、次の工程を含む癌の診断方法に関する。

(1) 被検者から採取された生体試料中のDLL3発現レベルを検出する工程、及び
(2) (1)で検出されたDLL3の発現レベルが、対照と比較して高い場合に被検者が癌を有すると判定される工程。

本発明において、対照とは、比較の基準となる試料をいい、陰性コントロールや健常者の生体試料が含まれる。陰性コントロールは、健常者の生体試料を採取し、必要に応じて混合することによって得ることができる。対照のDLL3の発現レベルは、被検者の生体試料におけるDLL3の発現レベルと平行して検出することができる。あるいは、予め、多数の健常者の生体試料におけるDLL3の発現レベルを検出し、健常者における標準的な発現レベルを統計学的に決定することができる。具体的には、たとえば、平均値±２×標準偏差(S.D.)、あるいは平均値±３×標準偏差(S.D.)を標準値として用いることもできる。統計学的に、平均値±２×標準偏差(S.D.)は80％の、また平均値±３×標準偏差(S.D.)は90％の健常者の値を含む。

あるいは、対照におけるDLL3の発現レベルを、ROC曲線を利用して設定することができる。ROC曲線(receiver operating characteristic curve；受信者操作特性曲線）は、縦軸に検出感度を、横軸に擬陽性率（すなわち"１−特異度"）を示すグラフである。本発明においては、生体試料中のDLL3の発現レベルを判定するための基準値を連続的に変化させたときの、感度と擬陽性率の変化をプロットすることによって、ROC曲線を得ることができる。

なおROC曲線を得るための「基準値」は、統計学的な解析のために一時的に利用される数値である。ROC曲線を得るための「基準値」は、一般的には、選択しうる全ての基準値をカバーできる範囲内で、連続的に変化させられる。たとえば、解析される集団のDLL3の測定値の最小値と最大値の間で、基準値を変化させることができる。

得られたROC曲線に基づいて、所望の検出感度、並びに精度を期待できる標準値を選択することができる。ROC曲線などによって統計学的に設定された標準値は、カットオフ値(cut-off value)とも呼ばれる。カットオフ値に基づく癌の検出方法においては、上記工程(2)において、(1)で検出されたDLL3の発現レベルが、カットオフ値と比較される。そして、カットオフ値よりも(1)で検出されたDLL3の発現レベルが高いときに、被検者の癌が検出される。

本発明において、DLL3の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、DLL3のmRNAの量、DLL3タンパク質の量、またはDLL3タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、DLL3の発現レベルを知ることができる。DLL3のmRNAやタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定することができる。

本発明においては、特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物を被験者とするときは、当該動物種のDLL3タンパク質が検出される。

被検試料に含まれるDLL3タンパク質の検出方法は、特に限定されないが、抗DLL3抗体を用いた、以下に例示されるような免疫学的方法により検出することが好ましい。
酵素結合免疫吸着法（ELISA）、
ラジオイムノアッセイ（RIA）、
エンザイムイムノアッセイ（EIA）、
蛍光イムノアッセイ（FIA）、
発光イムノアッセイ（LIA）、
免疫沈降法（IP）、
免疫比濁法（TIA）、
ウエスタンブロット（WB）、
免疫組織化学（IHC）法、
免疫拡散法（SRID）、
ドットブロット法、
スロットブロット法。

これらの手法の中で、免疫組織化学（IHC）法は、癌に羅患した患者から取得した組織若しくは細胞を固定化した切片上でDLL3タンパク質を検出する工程を含み、癌の診断方法として好ましい免疫学的アッセイ法の一つである。免疫組織化学（IHC）法などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法である。

DLL3は、癌細胞において特異的に発現が増強している膜タンパク質であることから、抗DLL3抗体によって、癌細胞、あるいは癌組織を検出することができる。上記の免疫組織学的な解析によって、生体から採取された細胞や組織に含まれる癌細胞が検出される。

別な好ましい態様では、生体内の癌組織を抗DLL3抗体によって検出することもできる。この方法は、具体的には、(1)放射性同位元素等の標識物質で標識されたDLL3タンパク質に結合する抗体を被検者に投与する工程と、(2)該標識物質の集積を検出する工程を含む。生体内に投与した抗体を追跡するために、抗体は、検出可能に標識することができる。たとえば蛍光物質や発光物質、あるいは放射性同位元素で標識された抗体の生体における挙動を追跡することができる。蛍光物質や発光物質で標識された抗体は、内視鏡や腹腔鏡を利用して観察することができる。放射性同位元素は、その放射活性を追跡することによって、抗体の局在を画像化することができる。本発明において、生体内における抗DLL3抗体の局在は、癌細胞の存在を表している。

生体内の癌を検出するために抗体を標識する放射性同位元素として、陽電子放出核種を利用することができる。たとえば18F、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、及び124Iのような陽電子放出核種で抗体を標識することができる。これらの陽電子放出核種による抗DLL3抗体の標識には、公知の方法（Acta Oncol. 32, 825-830, 1993）を利用することができる。

陽電子放出核種で標識された抗DLL3抗体がヒトや動物に投与された後に、PET（ポジトロン断層撮影装置）により、その放射性核種が放射する放射線が体外から計測され、コンピュータートモグラフィーの手法で画像に変換される。PETは、薬物の体内挙動などに関するデータを非侵襲的に得るための装置である。PETによって、放射強度をシグナル強度として定量的に画像化することができる。上記のようにPETを使用することによって、患者から試料を採取することなく特定の癌で高発現する抗原分子が検出できる。抗DLL3抗体は、上記の核種の他に11C、13N、15O、18F、45Ti等の陽電子放出核種を用いた短寿命核種によって放射標識することもできる。

医療用サイクロトロンによる上記核種を用いた短寿命核種の生産、短寿命放射標識化合物の製造技術等に関する研究開発が進められている。これらの技術により抗DLL3抗体を種々の放射性同位元素によって標識することができる。患者に投与された抗DLL3抗体は、各部位の病理組織に対する抗DLL3抗体の特異性に従って原発巣及び転移巣に集積する。抗DLL3抗体が陽電子放出核種で標識されていれば、その放射活性を検出することにより該原発巣及び転移巣の存在が放射活性の局在によって検出される。該診断用途に用いる場合には25-4000 keVのガンマ粒子又は陽電子放射量の活性値が適切に使用できる。また、適切な核種を選択して、さらに大量に投与すれば治療効果も期待できる。放射線による抗癌作用を得るためには、70-700 keVのガンマ粒子又は陽電子放射量値を与える核種を使用できる。

DLL3タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出
本発明の方法の別の態様においては、DLL3のポリヌクレオチドの発現を検出する。本発明において検出されるポリヌクレオチドは特に限定されないが、mRNAが好ましい。本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出として、次のような測定操作を挙げることができる。
・単にDLL3のmRNAが存在するか否かの測定、
・DLL3のmRNAが一定の量以上存在するか否かの測定、
・DLL3のmRNAの量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など。

一方、定量的な検出とは、DLL3のmRNAの濃度の測定、DLL3のmRNAの量の測定などを挙げることができる。

本発明における被検試料としては、DLL3のmRNAが含まれる可能性のある任意の試料を利用することができる。哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織などが例示できる。好ましい試料は生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。

生物の体から採取された組織、若しくは細胞が固定化された標本、又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料を用いる場合にはインシトゥーハイブリダイゼーション法が好適に用いられる。インシトゥーハイブリダイゼーション法は、細胞や組織内の特定のDNAやRNAの有無若しくは分布及びその発現の強弱を確認する手法として発展してきた。原理としては細胞内の特定の核酸配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸が特異的に複合体を形成する性質を利用したものである。当該プローブに予め放射性同位元素（RI）や抗原物質（ハプテン）等を標識しておくことにより、当該標識の検出を通じてハイブリダイゼーションした箇所が識別可能となることから、インシトゥーハイブリダイゼーション法は細胞内DNAやRNAなどの検出等に用いられている。プローブの標識としては好適にはRIによる標識を用いることができる。さらに好適な例としては、非放射性物質のビオチンやジゴキシゲニン等のハプテン等を利用した蛍光標識を用いることができる。特に好適な例としてはFISHと呼ばれる蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hibridization）による検出法が用いられる。

本発明によって診断される癌は、特に制限されない。具体的には、肺癌、特に小細胞肺癌を挙げることができる。本発明においては、原発病巣及び転移病巣のいずれをも診断することができる。

本発明においてはDLL3遺伝子を発現する任意の動物種を被験者とすることができる。特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物種を被験者とするときには、当該動物種のDLL3の遺伝子が検出される。

以下に検出方法の具体的な態様を記載する。まず、被検者から試料を調製する。次いで、該試料に含まれるDLL3のmRNAを検出する。本発明においては、mRNAから合成したcDNAを検出することもできる。本発明においては、被検試料中にDLL3のmRNAやDLL3をコードするcDNAが検出された場合、癌の可能性があると判定される。たとえば、陰性コントロール又は健常者と比較して、被検試料中に検出されるDLL3のmRNAやDLL3をコードするcDNAの量が多い場合に、被検者が癌である、又は将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。

ｍRNAを検出する方法は、公知である。具体的には、例えば遺伝子チップ、cDNAアレイ、及びメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法等を本発明に利用することができる。

上記した本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもできる。自動化することによって、短時間に多数の試料を検査することができる。

癌の診断のためのキット
本発明は、被検試料中のDLL3タンパク質を検出するための試薬を含む、癌の診断のための診断薬又はキットも提供する。本発明の診断薬は、少なくとも抗DLL3抗体を含む。

本発明の癌の診断用試薬と、DLL3の検出に用いられるその他の要素を組み合わせることによって、癌の診断のためのキットとすることができる。すなわち本発明は、DLL3に結合する抗体と、該抗体とDLL3との結合を検出する試薬を含み、さらにDLL3を含む生体試料からなる対照試料を含んでいてもよい、癌の診断のためのキットに関する。本発明のキットには、さらに測定操作を説明するための指示書をキットに添付することもできる。

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

〔実施例1〕DLL3(delta-like 3)の小細胞肺癌における転写亢進
ヒトDLL3 mRNAの臨床癌、癌細胞株、各種正常臓器における遺伝子発現分布を Human Exon 1.0 ST Array (Affymetrix社) を用いて解析した。発現解析において、13例の小細胞肺癌癌摘出組織の腫瘍部、3種類の小細胞肺癌細胞株、及び49種類の正常組織(Clontech 社、Ambion社、STRATAGENE社、Cell APPLICATIONS社、Panomics社、CHEMICON社、BioChain Institute社から購入)に由来するtotal RNAを使用した。全ての臨床癌摘出組織の腫瘍部及び癌細胞株(ATCCから購入)については、Trizol (Invitrogen)を用いて製品添付の方法に従ってtotal RNA抽出を実施した。上述のtotal RNA 1μgを用い、GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay Manual (Affymetrix)に準じて遺伝子発現解析実験を実施、Human Exon 1.0 ST Array Dataの数値化は、Affymetrix社提供のExACT (Exon Array Computational Tool)ソフトウェアを用いて実施した。

Human Exon 1.0 ST Array上にはDLL3に対するコアプローブセットが13個存在した。これらプローブセット発現値の平均を求め、組織間での遺伝子発現量を比較した。正常組織、小細胞肺癌摘出組織の腫瘍部および小細胞肺癌細胞株の発現データを図1に示した。

小細胞肺癌摘出組織の腫瘍部、小細胞肺癌細胞株において、胎児脳を除く正常組織に比較しヒトDLL3遺伝子発現が著明に亢進していることが見出された。結果は、ヒトDLL3を分子標的とした抗腫瘍剤を用いた治療法の有効性、すなわち、正常組織へダメージを与えずに腫瘍を縮小させる可能性を期待させる。

〔実施例2〕cDNAクローニング、組換え細胞の作製
配列番号:1および57で示されるヒトDLL3 cDNA（NM＿016941）をヒト胎児脳cDNAライブラリよりPCR増幅し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。pMCNは、マウスCMVプロモータ（GenBank: U68299）下で外来遺伝子を発現させることが可能である。pMCNベクターはジェネティシン耐性遺伝子をもっている。ヒトDLL3発現ベクターでCHO細胞株DG44（Invitrogen）を形質転換した。ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトDLL3蛋白質を安定発現するクローン化細胞を市販抗DLL3抗体(R&D Systems, MAB4315)で選抜し、ヒトDLL3/DG細胞を樹立した。同様にしてヒトDLL3発現ベクターでマウスIL-3依存性 pro B 細胞株Ba/F3を形質転換し、ヒトDLL3/BaF3細胞を樹立した。

配列番号:2および58で示されるマウスDLL3 cDNA（NM＿007866）をマウス胎児cDNAライブラリよりPCR増幅し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。マウスDLL3発現ベクターで細胞株Ba/F3を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。マウスDLL3蛋白質発現細胞を市販抗体(R&D Systems, MAB4315)で選抜しマウスDLL3/BaF3細胞を樹立した。

配列番号:3および59で示されるヒトDLL1 cDNA（NM＿005618）をヒト脾臓cDNAライブラリよりPCR増幅し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。ヒトDLL1発現ベクターで細胞株Ba/F3を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトDLL1蛋白質発現細胞を市販抗体(R&D Systems, MAB1818)で選抜しヒトDLL1/BaF3細胞を樹立した。

配列番号:4および60で示されるヒトNotch1 cDNA（NM＿017617）を乳癌細胞株DU4475 cDNAライブラリよりPCR増幅し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。ヒトNotch1発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトNotch1蛋白質発現細胞を市販抗体(GeneTex, GTX23294)で選抜しヒトNotch1/DG44細胞を樹立した。

DLL3抗体を取得するための免疫原ならびに取得した抗体のエピトープ決定を目的として、DLL3可溶型蛋白質およびそのN末端欠失変異体蛋白質産生株を作製した。ヒトDLL3細胞外配列はNotch受容体結合モチーフDSLドメイン(アミノ酸配列番号176-215)、6個のEGF様ドメイン（1:216-249, 2:274-310, 3:312-351, 4:353-389, 5:391-427, 6:429-465）から構成される。

ヒトDLL3細胞外領域 (配列番号:1アミノ酸配列27-492)とマウスIgG2a抗体定常領域配列からなるキメラ分子ヒトDLL3-Fc（配列番号:5）をコードするcDNAを作製し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。ヒトDLL3-Fc発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトDLL3-Fc蛋白質を高発現するクローンを、抗マウス抗体を用いたELISAで選抜し、ヒトDLL3-Fc産生DG44細胞を樹立した。

ヒトDLL3細胞外領域部分配列(配列番号:1アミノ酸配列176-492)とマウスIgG2a抗体定常領域配列からなるキメラ分子ヒトDLL3delta1-Fc（配列番号:6）をコードするcDNAを作製し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。ヒトDLL3delta1-Fc発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトDLL3delta1delta1-Fc蛋白質を高発現するクローンを、抗マウス抗体を用いたELISAで選抜し、ヒトDLL3delta1-Fc産生DG44細胞を樹立した。

ヒトDLL3細胞外領域部分配列(配列番号:1アミノ酸配列216-492)とマウスIgG2a抗体定常領域配列からなるキメラ分子ヒトDLL3delta2-Fc（配列番号:7）をコードするcDNAを作製し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。ヒトDLL3delta2-Fc発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトDLL3delta1delta2-Fc蛋白質を高発現するクローンを、抗マウス抗体を用いたELISAで選抜し、ヒトDLL3delta2-Fc産生DG44細胞を樹立した。

マウスDLL3細胞外領域 (配列番号:2 アミノ酸配列33-490)とマウスIgG2a抗体定常領域配列からなるキメラ分子ヒトDLL3-Fc（配列番号:8）をコードするcDNAを作製し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。マウスDLL3-Fc発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。マウスDLL3-Fc蛋白質を高発現するクローンを、抗マウス抗体を用いたELISAで選抜し、マウスDLL3-Fc産生DG44細胞を樹立した。

Fc融合蛋白質産生株培養上清より、ProteinGアフィニティカラムクロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて目的蛋白質を精製した。精製蛋白質濃度は既知濃度のIgGをスタンダートとして用いてDCプロテインアッセイ(バイオラッド)で決定した。

〔実施例3〕抗DLL3抗体の取得、エピトープおよび抗体インターナライゼーションの解析
Balb/c(日本チャールス・リバー)およびMRL/MpJJmsSlc-lpr/lpr(日本エスエルシー)マウスに6〜7週令より免疫を行った。初回免疫時にはフロイント完全アジュバント(ベクトン・ディッキンソン)を用いてエマルジョンを作製し0.1mg ヒトDLL3-Fc/headとなるように皮下に抗原蛋白質を投与した。二週置いたのち、週一回合計3〜6回のフロイント不完全アジュバントで作製した抗原エマルジョンを作製し0.05mg/headの容量で皮下投与した。血清抗体価上昇の認められたマウス個体に対し0.05mgの抗原蛋白質を静脈内に投与した。3日後にその脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞P3-X63Ag8U1(ATCC)と細胞数比で約3:1の割合で混合し、ポリエチレングリコール(PEG)法にて細胞融合した。遠心操作によりPEGを除去したのち、1x HAT media supplemet(シグマ)、0.5x BM-Condimed H1 Hybridomacloning supplement(ロシュダイアグノスティック)、10%牛胎児血清を含むRPMI1640培地に懸濁し、細胞濃度を調製したのち96ウェルプレートに細胞を播き込んだ。ハイブリドーマコロニー形成を確認した後、培養上清中に含まれる抗DLL3抗体の有無をヒトDLL3-Fcをコートしたプレートを用いてELISA解析した。陽性ウェルに含まれるハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりクローン化し、抗DLL3抗体を産生するハイブリドーマ株を樹立した。モノクローナル抗体のアイソタイプをIsoStrip(ロシュダイアグノスティック)を用いて決定した。

樹立したハイブリドーマ培養上清より、ProteinGアフィニティカラムクロマトグラフィ、および脱塩処理によりIgGモノクローナル抗体を精製した。精製抗体濃度はDCプロテインアッセイにより決定した。

ヒトDLL3-Fc、マウスDLL3-Fc、ヒトDLL3delta1-Fc、ヒトDLL3delta2-FcをそれぞれNuncイムノプレート(439454)に固層化した。続いて牛血清アルブミンを含む溶液でプレートの未反応表面をブロッキングした。洗浄後、適切な濃度になるように調製された抗体希釈液を添加し、1時間、室温にてインキュベートした。プレートから反応液を除去、Tween20を含むTBSで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識した抗マウスIgK抗体をプレートに添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄後、アルカリフォスファターゼ基質Sigma104を添加し、室温にてインキュベートした。インキュベーション後の波長405nmおよび参照波長655nmでの吸光度を測定した。結果を図2に示した。すべての精製抗体が、用量依存的にヒトDLL3-Fcに結合した。モノクローナル抗体DL301, DL302, DL306, DL312および市販抗体MAB4315はマウスDLL3-Fcに結合した。市販抗体MAB4315はヒトDLL3delta1-Fcに結合したが、ヒトDLL3delta2-Fcに結合しなかったことより、そのエピトープはDSLドメインにあることが示された。DL303, DL304, DL307, DL311抗体はヒトDLL3delta1-Fc、ヒトDLL3delta2-Fc両方に結合しなかった。したがってこれらの抗体のエピトープは配列番号1のアミノ酸配列27-175の間に存在すると推測された。DL301, DL302, DL305, DL306, DL308,DL309, DL312は、ヒトDLL3delta1-Fc、ヒトDLL3delta2-Fc両方に結合したことから、これら抗体のエピトープは配列番号1のアミノ酸配列216-492上にあることが示された。図9に全長DLL3蛋白質および可溶型DLL3Fc融合蛋白質の構造概要、抗DLL3抗体の認識部位を示した。

細胞膜上に発現するヒトDLL3へのモノクローナル抗体の結合、ヒトDLL3-モノクローナル抗体複合体の細胞膜上での挙動をフローサイトメトリー解析した。FACS buffer(1% 牛胎児血清、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS)でヒトDLL3/BaF3細胞を懸濁し、1x10⁶細胞/ml、終濃度5μg/mlのモノクローナル抗体となるように4℃で30分間反応させた。遠心し、上清を除去した後、FACS bufferで細胞を一度洗浄した。FITC標識抗マウスIgG(H+L)抗体(ベックマンコールター)を添加し、4℃、30分間インキュベートした。遠心して未反応のFITC抗体を除去したのち、細胞を再懸濁してフローサイトメーターFACSCalibur(ベクトンディッキンソン)で解析した。DLL3-抗体複合体の細胞膜上からの移動消失を解析する目的では、ヒトDLL3/BaF3細胞を10%牛胎児血清(FBS)、マウスIL3を含むRPMI1640培養液に懸濁した。1x10⁶細胞/ml、終濃度5μg/mlのモノクローナル抗体となるように混合し、CO2インキュベーター中37℃で1時間、もしくは4時間反応させた。反応後、上述と同様の方法にて細胞膜上に結合した抗体量をフローサイトメトリー解析した。細胞ヒストグラムプロット蛍光強度の幾何平均値(X Geo Mean)をFACSCalibur付属解析ソフトウェアCELLQuestProを用いて求めた。単離した抗DLL3モノクローナル抗体はすべて細胞上のDLL3に結合した(図3(a))。4℃で抗体と細胞を反応させると、DLL3-抗体複合体の細胞膜上から細胞内への取り込みなどの膜流動性は抑制される。37℃で抗体と細胞を反応させると、DLL3-抗体複合体の細胞内への取り込み、プロテアーゼ分解などによる細胞膜上からの遊離であるシェディングが起こりうる。37℃、1時間および4時間インキュベーションした場合の、それぞれのモノクローナル抗体の細胞膜上の結合量を、4℃における細胞結合量と比較した相対値として図3(b)に示した。37℃でインキュベーションした場合、細胞膜表面上のDL303, DL304, DL305, DL308, DL309, MAB4315抗体量は減少した。結果はDLL3-抗体複合体のインターナライゼーション、もしくはシェディングを示唆している。一方、DL301, DL306, DL307, DL311, DL312は37℃でインキュベーションした場合、細胞膜表面上の抗体量はほとんど変わらないか、逆に増加した。後者の抗体はDLL3複合体として細胞膜上に安定に滞在できることを示している。

細胞表面上のDLL3蛋白質数を、フローサイトメトリーによる抗原量定量分析システムQIFIKIT(DAKO, F0479)を用いて決定した。終濃度5μg/mlの抗DLL3抗体DL303を一次抗体として使用し、添付プロトコールに従い、解析した。ヒトDLL3/BaF3, NCI-H1184(ATCC), NCI-H1436(ATCC), Y79(理研Cell Bank )の細胞表面の抗原数はそれぞれ、約9000, 7000, 6000, 3000であった。

〔実施例4〕抗DLL3抗体によるADCC活性の誘導、抗体トキシン複合体を介した増殖抑制
抗DLL3抗体の、カルセインラベルしたDLL3発現細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)誘導活性を調べた。DLL3を発現する、ヒトDLL3/BaF3および小細胞肺癌細胞株NCI-H1184(ATCC)を、20μg/ml Calcein-AM(Dojindo, 349-07201)存在下で90分間培養し、遠心、洗浄することで、カルセインラベルしたターゲット細胞を準備した。96ウェルプレート(Coster 3799)に1x10⁴のターゲット細胞を播き込んだ。つづいて適切な終濃度になるように調製された抗体を添加して室温にて15分間インキュベートした。各ウェルに5x10⁴のエフェクター細胞を添加し、反応プレートを37℃、CO2インキュベーター中にてインキュベートした。エフェクター細胞にはマウスFcγR3-ヒトFcγR3キメラ分子を発現するNK92細胞(WO 2008/093688)が用いられた。4時間インキュベートした後、遠心したプレートの各ウェルより100μlの培養上清を回収し、蛍光強度をARVO SX(Wallac)を用いて測定した。

下式によりADCC誘導活性を算出した。
ADCC[%]=(A-C)/(B-C) × 100
ここでAは各ウェルにおける蛍光強度、Bは終濃度1% Nonidet P-40で細胞溶解した上清中の蛍光強度平均値、Cは培地のみ添加した場合の蛍光強度平均値である。各々の実験条件において3点測定し、平均値と標準偏差を算出した。図4は終濃度2.5μg/mlで抗体を添加した場合のDLL3/BaF3細胞に対するADCC誘導活性を示す。コントロール抗体であるIgG1, IgG2bにADCC活性が認められなかった一方で、DL301, DL306, DL312にADCC誘導活性が認められた。市販モノクローナル抗体MAB4315には明瞭なADCC誘導活性は認められなかった。図5は、DLL3/BaF3とNCI-H1184に対しDL301, DL306, D312抗体が用量依存的にADCCを誘導することを示す。

抗DLL3モノクローナル抗体の細胞内への取り込みを、トキシン標識した抗マウス2次抗体Mab-ZAP(Advanced Targeting Systems)を用いて評価した。96ウェルプレートに1ウェルあたり5x10³のDLL3/BaF3細胞を播き込んだ。続いて終濃度1μg/mlになるように抗DLL3マウスモノクローナル抗体およびMabZAPを添加し、37℃、CO2インキュベーター中でインキュベートした。4日後、生細胞数測定試薬SF(ナカライテスク)を添加し、マイクロプレートリーダーを用いて450nm、対照波長620nmの吸光度を測定することで細胞増殖を測定した(図6)。抗DLL3モノクローナル抗体およびMabZAPを細胞に添加すると、細胞の増殖は抑制された。ADCC誘導活性が認められたDL301, DL306, DL312は、抗体とDLL3発現細胞を混合して37℃培養した後に細胞上に残存する抗体量が多く、かつ、MabZAP複合体の細胞内取り込みによる増殖抑制効果は低かった。

〔実施例5〕抗体可変領域クローニング、組換え抗体の作製
抗DLL3抗体を産生するハイブリドーマ全RNAよりSmart 5’-RACE cDNAライブラリ(Clontech)を作製した。全RNA調製はRNeasy Miniカラム(Qiagen)を用いて行った。cDNAライブラリ作製は製造者の指示に従った。抗体定常領域配列に相補するプライマーを使い、抗体可変領域配列(VH, VL)をPCR増幅した。PCR増幅したフラグメントをpCR2.1TOPOにクローニングし、その塩基配列を決定した。得られたVH、VL配列とヒトIgG1定常領域配列からなるキメラ抗体発現ベクターを構築した。軽鎖、重鎖はともに一つの哺乳動物細胞発現ベクターに組み込まれ、両者はマウスCMVプロモータ下で転写される。表1は同定した抗体可変領域配列とそのCDR配列、マウス抗体全長配列、キメラ抗体配列の配列番号の対応を示す。

キメラ抗体発現ベクターをCOS-7細胞に導入し、一過的にキメラ抗体を発現させた。COS-7培養上清中のキメラ抗体がヒトDLL3蛋白質に結合することをフローサイトメトリー法とELISA法で確認した。COS-7培養上清中のキメラ抗体濃度をサンドイッチELISA法で算出した。この際既知濃度のヒトキメラ抗体を濃度算出のスタンダートとして利用した。FACS buffer(1% 牛胎児血清を含むPBS)に懸濁されたヒトDLL3/BaF3細胞に終濃度1μg/mlとなるようキメラ抗体を添加した。30分間4℃にてインキュベーション、洗浄、FITCラベルした抗ヒト抗体(Beckman-Coulter)と反応させ、フローサイトメーターFACSCaliburで結合を解析した。図7に示したように、キメラ抗体DL301, DL309, DL312はヒトDLL3/BaF3に結合した。いずれのキメラ抗体も強制発現細胞の親株であるBa/F3細胞には結合しなかった。ヒトDLL3-FcをNuncイムノプレートに固層化し、固層化蛋白質に対するキメラ抗体の結合を解析した。抗原に結合したキメラ抗体を検出するために、キメラ抗体添加後に、アルカリフォスファターゼ標識した抗ヒト抗体(Biosource、AHI0305)、アルカリフォスファターゼ基質Sigma104を順に添加し、その吸光度を求めた。DL301, DL309, DL312キメラ抗体は用量依存的にヒトDLL3-Fcに結合した(図8(a))。

〔実施例6〕競合ELISAによるエピトープグルーピング
キメラ抗体とマウス抗体の抗原分子に対する結合競合をELISA法で解析した(図8(b))。Nuncイムノプレートに1ウェルあたり10ngのヒトDLL3-Fcを添加し固層化した。終濃度50ng/mlのキメラ抗体および適切に希釈されたマウス抗体の混和物をDLL3-Fc蛋白質固層化プレートに添加した。プレートを室温にて1時間インキュベートした後、洗浄、アルカリフォスファターゼ標識した抗ヒト抗体を添加してインキュベートした。インキュベーション後、Sigma104を添加し、吸光度を測定した。キメラ抗体の抗原分子への結合はもととなるマウスモノクローナル抗体のそれと競合的であった。DL301マウス抗体以外の抗体はDL301キメラ抗体の抗原への結合を阻害しなかった。DL312マウス抗体以外の抗体はDL312キメラ抗体の抗原への結合を阻害しなかった。したがって、DL301、DL312はそれぞれユニークなエピトープに結合することが示された。DL305, DL308, DL309マウス抗体はそれぞれほぼ同程度にDL309キメラ抗体の抗原への結合を阻害した。したがってこれら3抗体のエピトープは同一であると考えられる。ADCC誘導活性が認められたDL306マウス抗体は、DL301キメラ抗体、DL309キメラ抗体、DL312キメラ抗体の抗原への結合を阻害しなかった。DL306はDL301,DL309,DL312とは独立なエピトープを認識していることが示された。

〔実施例7〕組換え抗DLL3抗体発現株樹立、組換え抗体精製
DL306キメラ抗体発現ベクターをCOS-7細胞に導入し、一過的にキメラ抗体を発現させた。COS-7培養上清中のキメラ抗体がヒトDLL3蛋白質に結合することをフローサイトメトリー法で確認した。COS-7培養上清中のキメラ抗体濃度をサンドイッチELISA法で算出した。この際既知濃度のヒトキメラ抗体を濃度算出のスタンダートとして利用した。FACS buffer(1% 牛胎児血清を含むPBS)に懸濁されたヒトDLL3/BaF3細胞に終濃度1μg/mlとなるようキメラ抗体を添加した。30分間4℃にてインキュベーション、洗浄、FITCラベルした抗ヒト抗体(Beckman-Coulter)と反応させ、フローサイトメーターFACSCaliburで結合を解析した。図10に示したように、キメラ抗体DL306はヒトDLL3/BaF3に結合し、親株であるBa/F3細胞には結合しなかった。

DL301, DL306, DL309, DL312ヒトキメラ抗体発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトキメラ抗体を高発現するクローンを、抗ヒト抗体を用いたELISAで選抜し、ヒトキメラ抗体産生DG44細胞を樹立した。

ヒトキメラ抗体産生株培養上清より、rProteinAアフィニティカラムクロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて目的蛋白質を精製した。精製蛋白質濃度は既知濃度のIgGをスタンダートとして用いてDCプロテインアッセイ(バイオラッド)で決定した。

DL301, DL306, DL312 のVH,VL配列とマウスIgG2a定常領域配列からなるマウスIgG2a抗体発現ベクターを構築した。軽鎖、重鎖はともに一つの哺乳動物細胞発現ベクターに組み込まれ、両者はマウスCMVプロモータ下で転写される。マウスIgG2a抗体発現ベクターでフコーストランスポーターを欠失させたCHO細胞株(WO2005/017155)を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。マウスIgG2a抗体を高発現するクローンを、抗マウスIgG2a抗体を用いたELISAで選抜し、低フコース化マウスIgG2a抗体産生CHO細胞を樹立した。低フコース化マウスIgG2a抗体産生株培養上清より、ProteinGアフィニティカラムクロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて目的蛋白質を精製した。精製蛋白質濃度は既知濃度のIgGをスタンダートとして用いてDCプロテインアッセイで決定した。

〔実施例8〕組換え抗DLL3抗体によるADCC活性の誘導
ヒトキメラおよびマウスIgG2a組換え抗DLL3抗体の、カルセインラベルしたDLL3発現細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)誘導活性を調べた。DLL3を発現する、ヒトDLL3/BaF3および小細胞肺癌細胞株NCI-H1184(ATCC)を、20μg/ml Calcein-AM(Dojindo, 349-07201)存在下で90分間培養し、遠心、洗浄することで、カルセインラベルしたターゲット細胞を準備した。96ウェルプレート(Coster 3799)に1x10⁴のターゲット細胞を播き込んだ。つづいて適切な終濃度になるように調製された抗体を添加して室温にて15分間インキュベートした。各ウェルに5x10⁴のエフェクター細胞を添加し、反応プレートを37℃、CO2インキュベーター中にてインキュベートした。低フコース化マウスIgG2a組換え抗体のエフェクター細胞としてマウスFcγR4ヒトFcγR3キメラ分子(WO 2008/093688)を発現するNK92細胞が用いられた。ヒトキメラ組換え抗体のエフェクター細胞としてヒトFcγR3分子を発現するNK92細胞が用いられた。4時間インキュベートした後、遠心したプレートの各ウェルより100μlの培養上清を回収し、蛍光強度をARVO SXを用いて測定した。ADCC誘導活性を実施例4に記載した方法にて算出した。

図11は、DLL3/BaF3とNCI-H1184に対し組換えヒトキメラ抗体DL301, DL306, DL309, D312が用量依存的にADCCを誘導することを示す。
図12は、DLL3/BaF3とNCI-H1184に対し低フコース化組換えマウスIgG2a抗体DL301, DL306, D312が用量依存的にADCCを誘導することを示す。

本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

Claims (3)

1. 配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するヒトDLL3において、216番目のアミノ酸から492番目までのアミノ酸の領域に結合し、細胞傷害活性を有する以下のいずれかに記載の抗体を有効成分として含む小細胞肺癌を対象とする抗癌剤：
   （１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
   （２）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
   （３）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
   （４）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；または
   （５）（１）から（４）のいずれかに記載の抗体が結合するDLL3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合し細胞傷害性を有する抗体。
2. 細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）である請求項１に記載の抗癌剤。
3. 前記抗体がインターナライズ活性を有し細胞傷害性物質が結合していることを特徴とする請求項１に記載の抗癌剤。
   
   
   

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