JP6009733B2 - 抗tm4sf20抗体を用いた癌の診断と治療 - Google Patents
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Description
[1] TM4SF20タンパク質に結合する抗体に関する。
[2] 細胞傷害活性を有することを特徴とする上記[1]に記載の抗体。
[3] 細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性(ADCC活性)である上記[2]に記載の抗体。
[4] 細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性(CDC活性)である上記[2]に記載の抗体。
[5] 以下のいずれかに記載の抗体。
(1)配列番号:79に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:80に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号:81に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(B8)。
(2)配列番号:85に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:86に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号:87に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(B11)。
(3)配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号:93に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(B12)。
(4)配列番号:97に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:98に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号:99に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(B15)。
(5)配列番号:103に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:104に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号:105に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(C7)。
(6)配列番号:109に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:110に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号:111に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(C9)。
(7)配列番号:82に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号:84に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(B8)。
(8)配列番号:88に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:89に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号:90に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(B11)。
(9)配列番号:94に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:95に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号:96に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(B12)。
(10)配列番号:100に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号:102に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(B15)。
(11)配列番号:106に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:107に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号:108に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(C7)。
(12)配列番号:112に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:113に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号:114に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(C9)。
(13)(1)の重鎖可変領域と(7)の軽鎖可変領域を含む抗体(B8)。
(14)(2)の重鎖可変領域と(8)の軽鎖可変領域を含む抗体(B11)。
(15)(3)の重鎖可変領域と(9)の軽鎖可変領域を含む抗体(B12)。
(16)(4)の重鎖可変領域と(10)の軽鎖可変領域を含む抗体(B15)。
(17)(5)の重鎖可変領域と(11)の軽鎖可変領域を含む抗体(C7)。
(18)(6)の重鎖可変領域と(12)の軽鎖可変領域を含む抗体(C9)。
(19)(1)から(18)のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入された抗体であって、(1)から(18)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
(20)(1)から(18)のいずれかに記載の抗体が結合するTM4SF20タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
[7] 上記[1]〜[5]いずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
[8] 抗癌剤である上記[7]に記載の医薬組成物。
[9] 胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌の治療に用いられる上記[8]に記載の医薬組成物。
[10] 以下の工程を含む癌の診断方法。
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTM4SF20タンパク質又はTM4SF20遺伝子の発現量を検出する工程。
[11] 胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌を診断する為の上記[10]に記載の診断方法。
[12] 上記[1]〜[6]のいずれかに記載の抗体を含む癌の診断薬。
[13] 胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌を診断するためのものである、上記[12]に記載の診断薬。
本願発明にかかるTransmembrane 4 L6 family member 20 (TM4SF20)は、細胞膜上に発現する4回膜貫通タンパクであり、L6 tetraspanin familyに属する。L6 tetraspanin familyにはTM4SF1 (L6)、TM4SF4 (ILTMP)、TM4SF5等がある。いずれも4回膜貫通タンパクであり、N末とC末に短い細胞内領域を有し、膜貫通領域1 (TM1)とTM2の間の細胞外領域は短く、TM3とTM4の間の細胞外領域は長い。
本発明で用いられる抗TM4SF20抗体は、TM4SF20タンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは特に限定されない。具体的には、非ヒト動物の抗体(例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体)、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明において使用される抗TM4SF20抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体のTM4SF20タンパク質への結合は特異性の高いものであることが好ましく、特にヒトTM4SF20に特異的であることがより好ましい。
(1)配列番号:79に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:80に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号:81に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(B8)。
(2)配列番号:85に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:86に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号:87に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(B11)。
(3)配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号:93に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(B12)。
(4)配列番号:97に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:98に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号:99に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(B15)。
(5)配列番号:103に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:104に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号:105に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(C7)。
(6)配列番号:109に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:110に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号:111に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(C9)。
(7)配列番号:82に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号:84に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(B8)。
(8)配列番号:88に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:89に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号:90に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(B11)。
(9)配列番号:94に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:95に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号:96に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(B12)。
(10)配列番号:100に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号:102に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(B15)。
(11)配列番号:106に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:107に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号:108に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(C7)。
(12)配列番号:112に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:113に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、配列番号:114に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(C9)。
(13)(1)の重鎖可変領域と(7)の軽鎖可変領域を含む抗体(B8)。
(14)(2)の重鎖可変領域と(8)の軽鎖可変領域を含む抗体(B11)。
(15)(3)の重鎖可変領域と(9)の軽鎖可変領域を含む抗体(B12)。
(16)(4)の重鎖可変領域と(10)の軽鎖可変領域を含む抗体(B15)。
(17)(5)の重鎖可変領域と(11)の軽鎖可変領域を含む抗体(C7)。
(18)(6)の重鎖可変領域と(12)の軽鎖可変領域を含む抗体(C9)。
(19)(1)から(18)のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入された抗体であって、(1)から(18)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
(20)(1)から(18)のいずれかに記載の抗体が結合するTM4SF20タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、
親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)
(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)
なお、エピトープを測定する際には、本発明の抗TM4SF20抗体の定常領域を被検抗体の定常領域と同一の定常領域に置換してもよい。
さらに、本発明の抗体の好ましい他の態様として、配列番号:116(TM4SF20)のアミノ酸配列において168番目のアミノ酸から184番目のアミノ酸までの領域を認識する抗体を挙げることができる。
キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体をいう。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される当該キメラ抗体を取得できる。キメラ抗体及びヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用される。
一般にキメラ抗体が、ヒト以外の動物由来抗体のV領域とヒト抗体由来のC領域とから構成されるのに対して、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域(CDR;complementarity determining region)と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域(FR;framework region)及びヒト抗体由来のC領域とから構成される。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明の抗体には、TM4SF20タンパク質に結合する限り、IgG(IgG1、IgG2、IgG4など)に代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、又は、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、TM4SF20タンパク質に結合する限り、低分子化抗体又はその修飾物であってもよい。
パパイン消化:F(ab)2又はFab
ペプシン消化:F(ab')2又はFab'
抗体のH鎖又はH鎖V領域をコードするDNA配列、及び
抗体のL鎖又はL鎖V領域をコードするDNA配列
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:117)
Ser・Gly・Gly・Gly(配列番号:118)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:119)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:120)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:121)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:122)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:123)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:124)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:119))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:120))n
[nは1以上の整数である]
[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]
N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、
ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、
ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)、
ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP)、
ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)、
エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、
エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)(スルホ−EGS)、
ジスクシンイミジル酒石酸塩(DST)、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩(スルホ−DST)、
ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、及び
ビス[2-(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(スルホ-BSOCOES)など
癌などの細胞増殖性疾患の治療においては、抗体は、そのエフェクター活性を維持していることが望ましい。すなわち、本発明における好ましい抗体は、TM4SF20に対する結合親和とエフェクター機能の両方を有する。抗体のエフェクター機能には、ADCC活性及びCDC活性が含まれる。本発明における治療用の抗体は、特に好ましくは、ADCC活性及びCDC活性のいずれか、又は両方をエフェクター機能として備える。
本発明の抗体が治療目的で用いられる場合、抗体は好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。
i)エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(Invitrogen社製)中で脾臓細胞が分離される。10%ウシ胎児血清(FBS、HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を10% FBS含有培地(Invitrogen社製)にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
TM4SF20タンパク質を発現する細胞を0.2 mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)とともに、10% FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。TM4SF20タンパク質を発現する細胞としては、TM4SF20タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、胃癌細胞、肺腺癌細胞、膵臓癌細胞、大腸癌細胞等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10% FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。
抗体に化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質などの細胞傷害性物質を結合することも可能である。このような抗体修飾物(以下、抗体コンジュゲートと称する。)は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
また別の態様では、一又は二以上の低分子化学療法剤と毒性ペプチドをそれぞれ組み合わせて抗体の修飾に使用できる。抗TM4SF20抗体と上記の低分子化学療法剤との結合は共有結合又は非共有結合が利用できる。これら化学療法剤を結合した抗体の作製方法は公知である。
さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体(bispecific antibody)であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はTM4SF20分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体は、1分子のTM4SF20に対して2分子の抗体分子が結合できる。その結果、より強力な細胞傷害作用を期待できる。
本発明の抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞傷害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、次のような抗体が公知である。
糖鎖が修飾された抗体(WO99/54342など)、
糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体(WO00/61739、WO02/31140など)、
バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体(WO02/79255など)など
また、本発明の抗体はインターナライズ活性を有していてもよい。本発明において「インターナライズ活性を有する抗体」とは、TM4SF20に結合した際に細胞内(細胞質内、小胞内、他の小器官内など)に輸送される抗体を意味する。
4.1 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる抗TM4SF20抗体の作製
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術にしたがい、以下のようにして作製できる。まず、TM4SF20タンパク質、あるいは後述するその部分ペプチドを感作抗原として使用し、通常の免疫方法にしたがって動物を免疫する。得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。さらにこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって抗TM4SF20抗体を産生するハイブリドーマを選択する。選択したハイブリドーマから所望の抗TM4SF20モノクローナル抗体を得る。具体的には、以下のようにして行う。
まず、TM4SF20遺伝子を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用されるTM4SF20タンパク質が取得できる。すなわち、TM4SF20をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は培養上清中から、目的のヒトTM4SF20タンパク質が公知の方法で精製する。精製した天然のTM4SF20タンパク質、あるいは、TM4SF20タンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどを利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)に記載されている。
・ヒトTM4SF20のアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド。
・TM4SF20遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド。
・TM4SF20タンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド。
TM4SF20タンパク質あるいはその部分ペプチドを感作抗原として、哺乳動物を免疫する。免疫される哺乳動物は、特に限定されないが、モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。
モノクローナル抗体は、DNA免疫(DNA Immunization)によっても得ることができる。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターDNAを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。蛋白質抗原を投与する一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性を期待できる。
−TM4SF20のような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる
−免疫抗原を精製する必要が無い
上述のように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979)123, 1548-1550)
P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7)
NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976)6, 511-519)
MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell(1976)8, 405-415)
SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978)276, 269-270)
FO(de St. Groth, S. F. etal., J. Immunol. Methods(1980)35, 1-21)
S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978)148, 313-323)
R210(Galfre, G. et al., Nature(1979)277, 131-133)等
以上のようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。
(1) 抗体遺伝子のクローニング
抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子を利用することにより、遺伝子工学的手法を用いて、抗体を作製することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている(例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.(1990)192, 767-775参照)。
・グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979)18, 5294-5299)
・AGPC法(Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.(1987)162, 156-159)
抗TM4SF20抗体を製造するために、クローニングされた抗体遺伝子を、発現制御領域の制御下で発現するように発現ベクターに組み込む。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗TM4SF20抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。
i) 哺乳類細胞、:CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など
ii) 両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
iii) 昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
さらに真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる:
酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces)属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus)属。
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH)遺伝子
チミジンキナーゼ(TK)遺伝子
大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子
ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等
これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、次に、形質転換された宿主細胞をインビトロ又はインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできる。
組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、目的とする抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ(又はその子孫)が産生する乳汁からは、所望の抗体を乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology(1994)12, 699-702)。
TM4SF20は胃癌、肺腺癌、膵臓癌、大腸癌等の癌組織で特異的に高発現し、抗TM4SF20抗体は、癌細胞特異的な細胞傷害作用を有する。したがって、抗TM4SF20抗体は、これらのTM4SF20を発現する癌の治療に有用である。
また、本発明はTM4SF20タンパク質又はTM4SF20タンパク質をコードする遺伝子を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。TM4SF20は種々の癌組織あるいは癌細胞株において顕著な発現亢進が確認されている。したがって、TM4SF20は、癌を特異的に検出するためのマーカーとして有用である。
本発明の方法の1つの態様においては、試料中のTM4SF20タンパク質を検出することにより癌の診断が行われる。TM4SF20タンパク質の検出はTM4SF20タンパク質を認識する抗体を用いて行われることが好ましい。
本発明の診断方法の具体例の一つとして、以下の工程を含む癌の診断方法を挙げることができる。
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTM4SF20タンパク質又はTM4SF20遺伝子の発現量を検出する工程。
また、本発明の診断方法においては、上述の(a)および(b)の工程にさらに、(c)上記TM4SF20タンパク質又はTM4SF20遺伝子の発現量に基づいて被験者が癌である可能性を評価する工程、を含んでもよい。
・単にTM4SF20タンパク質が存在するか否かの測定
・TM4SF20タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
・TM4SF20タンパク質の量を他の試料(例えば、コントロール試料など)と比較する測定など
(1) 被検者から採取された生体試料中のTM4SF20発現レベルを検出する工程、及び
(2) (1)で検出されたTM4SF20の発現レベルが、対照と比較して高い場合に被検者が癌を有することが示される工程。
酵素結合免疫吸着法(ELISA)、
ラジオイムノアッセイ(RIA)、
エンザイムイムノアッセイ(EIA)、
蛍光イムノアッセイ(FIA)、
発光イムノアッセイ(LIA)、
免疫沈降法(IP)、
免疫比濁法(TIA)、
ウエスタンブロット(WB)、
免疫組織化学(IHC)法、
免疫拡散法(SRID)、
ドットブロット法、
スロットブロット法。
本発明の方法の別の態様においては、TM4SF20の遺伝子の発現を検出する。本発明において検出される遺伝子は特に限定されないが、mRNAが好ましい。本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出として、次のような測定操作を挙げることができる。
・単にTM4SF20のmRNAが存在するか否かの測定、
・TM4SF20のmRNAが一定の量以上存在するか否かの測定、
・TM4SF20のmRNAの量を他の試料(例えば、コントロール試料など)と比較する測定など
本発明は、被検試料中のTM4SF20タンパク質を検出するための試薬を含む、癌の診断のための診断薬又はキットも提供する。本発明の診断薬は、少なくとも抗TM4SF20抗体を含む。
1.TM4SF20のクローニング
癌細胞株A549 (JCRB)からTrizol (Invitrogen)を用いてtotal RNAを抽出し、さらにSuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen)を用いて製品添付の方法に従ってcDNAを作製した。このcDNAをテンプレートとして、配列番号:1で表されるプライマー(NotI認識配列-Kozak配列-TM4SF20の5'末端配列)、配列番号:2で表されるプライマー(XbaI認識配列-TM4SF20の3'末端配列)を用いてPCR増幅を行い、増幅産物をpGEM-T Easy Vector Systems (Promega)を用いてpGEM-T Easyベクターにクローニングした(pGEM-T_TM4SF20)。PCR増幅にはKOD Plus Ver.2 (東洋紡)を用い、5μLの10×KOD Plus Ver.2 buffer、5μLのdNTP mixture、3μLの25 mM MgSO4、1.5μLの配列番号:1のプライマー (10μM)、1.5μLの配列番号:2のプライマー (10μM)、2.5μLのA549 cDNA、1μLのKOD Plus Polymerase、30.5μLのヌクレアーゼフリー水を含む溶液を調製し、94℃ 2分、(98℃ 10秒、72℃ 30秒、68℃ 2分)×5サイクル、(98℃ 10秒、70℃ 30秒、68℃ 2分)×5サイクル、(98℃ 10秒、68℃ 2分)×25サイクル、72℃ 7分で増幅を行った。pGEM-T_TM4SF20の配列をシークエンスし、RefSeq Accession No. NM_024795.3と同じであることを確認した。
TM4SF20 cDNAを哺乳動物細胞用発現ベクター(pMC及びpCOS2)にクローニングした。pMCはマウスCMVプロモーター(GenBank Accession No. U68299)による制御下で発現誘導が可能なベクターである。pCOS2はヒトEEF1A1プロモーター(GenBank Accession No. NM_001402)による制御下で発現誘導が可能で、かつネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。pGEM-T_TM4SF20をNotI、XbaIで消化し、pMC及びpCOS2のNotI、XbaIサイトにクローニングした(pMC_TM4SF20及びpCOS2_TM4SF20)。
TM4SF20 cDNAを哺乳動物細胞用発現ベクター(pMCDN2_ntHA)にクローニングした。pMCDN2_ntHAはマウスCMVプロモーターによる制御下で発現誘導が可能で、かつネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。また、挿入した目的遺伝子の5'側にHAタグ配列が付加される。HAタグ配列とはインフルエンザのヘマグルチニンタンパク質由来のHAエピトープ配列 (YPYDVPDYA)であり、HA特異的抗体により認識される。配列番号:3で表されるプライマー(NheI認識配列-TM4SF20の開始コドンを除く5'末端配列)及び配列番号:4で表されるプライマー(NotI認識配列-TM4SF20のストップコドンを除く3'末端配列)を用い、pGEM-T_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。増幅断片をNheI、NotIで消化し、pMCDN2_ntHAのNheI、NotIサイトにクローニングした(pMCDN2_TM4SF20_ntHA)。pMCDN2_TM4SF20_ntHAの開始コドンからストップコドンまでの塩基配列を配列番号:5に、アミノ酸配列を配列番号:6に示す。
MRL/MpJUmmCrj-lpr/lprマウス(オス、6週令、日本チャールス・リバー)に対し、Helios Gene Gun (Bio-Rad)を用いて製品添付の方法により1週間に2回、合計10回のDNA免疫を行った(day0-day32)。DNA免疫にはpMC_TM4SF20及びpCOS2_TM4SF20発現ベクターを同時に用いた。DNA免疫に引き続きTM4SF20_Ba/F3細胞5×106個を尾静脈内に投与した(day35)。その後、1匹はday42に再度TM4SF20_Ba/F3細胞を尾静脈内に投与し、その4日後に脾臓細胞を摘出した。別の1匹はday63に再度TM4SF20_Ba/F3細胞を尾静脈内に投与し、その3日後に脾臓細胞を摘出した。いずれも脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株P3-X63Ag8U1 (P3U1、ATCC)を3:1〜4:1になるよう混合し、PEG1500 (Roche Diagnostics)を徐々に加えハイブリドーマを作製した。RPMI1640培地を加え遠心後、上清を除去することによりPEG1500を除去した。次にHAT培地(10% FBS、penicillin-streptomycin、1×HAT media supplement (Sigma)、0.5×BM-Condimed H1 Hybridoma Cloning Supplement (Roche Diagnostics)を含むRPMI1640培地)に懸濁し、96ウェルプレート8枚にP3U1細胞が1×105個/ウェルになるように播種した。これを37℃、5% CO2インキュベーターにて7日間培養後、培養上清を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングは、培養上清に含まれる抗体のTM4SF20_Ba/F3細胞及び親株Ba/F3細胞に対する結合をフローサイトメーター(FACS Calibur、Becton Dickinson)を用いて測定することにより行った。TM4SF20_Ba/F3細胞に特異的に結合したウェルのハイブリドーマの培養を継続し、同様な方法で再度スクリーニングを行った後、限界希釈法によりモノクローン化を行った。以上により、TM4SF20に特異的に結合する抗体としてクローンB8、B11、B12、B15、C7、C9を樹立した。
1.マウスTM4SF20 (mTM4SF20)のクローニング
Mouse Normal Tissue Small Intestine cDNA (Cosmo Bio)をテンプレートとして、配列番号:7で表されるプライマー(mTM4SF20の5'末端配列)、配列番号:8で表されるプライマー(mTM4SF20の3'末端配列)を用いてPCR増幅を行い、増幅産物をpGEM-T Easy Vector Systems (Promega)を用いてpGEM-T Easyベクターにクローニングした(pGEM-T_mTM4SF20)。PCR増幅にはKOD Plus Ver.2 (東洋紡)を用い、5μLの10×KOD Plus Ver.2 buffer、5μLのdNTP mixture、3μLの25 mM MgSO4、1.5μLの配列番号:7のプライマー (10μM)、1.5μLの配列番号:8のプライマー (10μM)、2μLのmouse small intestine cDNA、1μLのKOD Plus Polymerase、31μLのヌクレアーゼフリー水を含む溶液を調製し、94℃ 2分、(98℃ 10秒、57℃ 30秒、68℃ 1分)×27サイクルで増幅を行った。pGEM-T_mTM4SF20の配列をシークエンスしたところ、GenBankに登録さている配列(RefSeq Accession No. NM_025453.3)と比べて、塩基配列では4塩基、アミノ酸配列では2アミノ酸、異なっていた。クローニングしたmTM4SF20の塩基配列を配列番号:9に、アミノ酸配列を配列番号:10に示す。
mTM4SF20 cDNAをpMCDN2_ntHAにクローニングした。配列番号:11で表されるプライマー(NheI認識配列-mTM4SF20の開始コドンを除く5'末端配列)及び配列番号:12で表されるプライマー(NotI認識配列-mTM4SF20のストップコドンを除く3'末端配列)を用い、pGEM-T_mTM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。増幅断片をNheI、NotIで消化し、pMCDN2_ntHAのNheI、NotIサイトにクローニングした(pMCDN2_mTM4SF20_ntHA)。
TM4SF20 cDNAを哺乳動物細胞用発現ベクター(pCOS2_ctHA)にクローニングした。pCOS2_ctHAはマウスCMVプロモーターによる制御下で発現誘導が可能で、かつネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。挿入した目的遺伝子の3'側にHAタグ配列が付加される。配列番号:1で表されるプライマー(NotI認識配列-Kozak配列-TM4SF20の5'末端配列)及び配列番号:17で表されるプライマー(BamHI認識配列-TM4SF20のストップコドンを除く3'末端配列)を用い、pMC_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。増幅断片をNotI、BamHIで消化し、pCOS2_ctHAのNotI、BamHIサイトにクローニングした(pCOS2_TM4SF20_ctHA)。pCOS2_TM4SF20_ctHAの開始コドンからストップコドンまでの塩基配列を配列番号:18に、アミノ酸配列を配列番号:19に示す。
実施例2で作製した抗TM4SF20抗体のmTM4SF20に対する結合をフローサイトメトリーにて評価した。細胞にはmTM4SF20_CHO、陽性対照としてTM4SF20_CHO、陰性対照としてDG44細胞を用いた。
実施例2で作製した抗TM4SF20抗体のエピトープを解析するため、TM4SF20の2つの細胞外ループのうち、第一ループ(36-44番目のアミノ酸)もしくは第二ループ(105-185番目のアミノ酸、いずれもUniProt accession number Q53R12より)の配列を、それぞれmTM4SF20の配列に置換した(キメラTM4SF20)。これをCHO細胞に発現させ、抗TM4SF20抗体の結合をフローサイトメトリーにて解析した。
第一ループをmTM4SF20に置換したキメラTM4SF20 (キメラTM4SF20 version 1)のcDNAをpMCDN2_ntHAにクローニングした。配列番号:3で表されるプライマー(NheI認識配列-TM4SF20の開始コドンを除く5'末端配列)及び配列番号:20で表されるプライマー(第一ループをmTM4SF20に置換したTM4SF20の配列)を用い、pGEM-T_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。同様に配列番号:21で表されるプライマー(第一ループをmTM4SF20に置換したTM4SF20の配列)及び配列番号:4で表されるプライマー(NotI認識配列-TM4SF20のストップコドンを除く3'末端配列)を用い、pGEM-T_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。これら二つの増幅断片をテンプレートとして、配列番号:3で表されるプライマー及び配列番号:4で表されるプライマーを用いてPCR増幅を行った。増幅断片をNheI、NotIで消化し、pMCDN2_ntHAのNheI、NotIサイトにクローニングした(pMCDN2_キメラTM4SF20 ver.1_ntHA)。
第二ループをmTM4SF20に置換したキメラTM4SF20 (キメラTM4SF20 version 2)のcDNAをpMCDN2_ntHAにクローニングした。配列番号:25で表されるプライマー(TM4SF20の第二ループ直前の配列-mTM4SF20第二ループの5'末端配列)及び配列番号:26で表されるプライマー(TM4SF20の第二ループ直後の配列-mTM4SF20第二ループの3'末端配列)を用い、pGEM-T_mTM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。また、配列番号:3で表されるプライマー(NheI認識配列-TM4SF20の開始コドンを除く5'末端配列)及び配列番号:27で表されるプライマー(mTM4SF20第二ループの5'末端配列-TM4SF20の第二ループ直前の配列)を用い、pGEM-T_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。同様に配列番号:28で表されるプライマー(mTM4SF20第二ループの3'末端配列-TM4SF20の第二ループ直後の配列)及び配列番号:4で表されるプライマー(NotI認識配列-TM4SF20のストップコドンを除く3'末端配列)を用い、pGEM-T_TM4SF20をテンプレートとしてPCR増幅を行った。これら三つの増幅断片をテンプレートとして、配列番号:3で表されるプライマー及び配列番号:4で表されるプライマーを用いてPCR増幅を行った。増幅断片をNheI、NotIで消化し、pMCDN2_ntHAのNheI、NotIサイトにクローニングした(pMCDN2_キメラTM4SF20 ver.2_ntHA)。
実施例2で作製した抗TM4SF20抗体のキメラTM4SF20に対する結合をフローサイトメトリーにて評価した。細胞にはキメラTM4SF20 ver.1_CHO、キメラTM4SF20 ver.2_CHO、陰性対照としてDG44細胞を用いた。
エピトープをより詳細に解析するため、TM4SF20の第二ループを含む100アミノ酸(101-200番目のアミノ酸)をベースとし、そこから種々のアミノ酸配列を欠失させたペプチドを作製した。これらのペプチドを大腸菌で発現させ、抗TM4SF20抗体の結合をウェスタンブロットにて評価した。
1.ヒト癌細胞株におけるTM4SF20の発現の評価
実施例2で作製した抗TM4SF20抗体を用いて、ヒト癌細胞株の細胞膜上におけるTM4SF20の発現をフローサイトメトリーを用いて評価した。一次抗体には抗TM4SF20抗体(精製抗体)又は陰性対照抗体(mIgG2a、BD Biosciences Pharmingen)、細胞にはマイクロアレイ解析(実施例1)でTM4SF20 mRNAの発現が高かった肺腺癌細胞株A549 (JCRB)を用いた。フローサイトメトリーは実施例3と同様に行い、一次抗体は10μg/mLの濃度で用いた。その結果、A549細胞で細胞膜上にTM4SF20の発現が確認された(図9)。
実施例2で作製した抗TM4SF20抗体のADCC活性を測定した。標的細胞にはA549細胞を用いた。A549細胞を培地(10%FBSを添加したMEM培地(Invitrogen))にて2×105個/mLに調製し、96ウェル平底プレートに50μL/ウェル加えた。37℃、5% CO2インキュベーターにて一晩培養することにより細胞をプレートに付着させた後、Chromium-51 (GE Healthcare)を加えさらに1時間培養した。細胞を剥がさないように慎重に培地で洗浄後、培地を50μL/ウェル加えた。次に培地で40μg/mLに調製した抗TM4SF20抗体(精製抗体)もしくはmIgG2aを50μL/ウェル加えた。室温にて15分間静置後、培地で4×106個/mLに調製したエフェクター細胞を100μL/ウェル加えた。エフェクター細胞にはマウスFcγreceptor III (RefSeq Accession No. NM_010188)の細胞外領域及びヒトFcεreceptor I-gamma (RefSeq Accession No. NM_004106)の膜貫通領域と細胞内領域を含むキメラタンパク質をNK-92細胞(ATCC)に定常発現させた細胞(特願2007-20155、WO2008/093688)を用いた。プレートを37℃、5% CO2インキュベーターにて4時間培養後、100μL/ウェルの培養上清を回収しガンマカウンター(1480 WIZARD 3''、Wallac)を用いて放射活性(cpm)を測定し、以下の式を用いて特異的クロム遊離率(%)を求めた。
特異的クロム遊離率(%) = (A-C)×100/(B-C)
同様にして抗TM4SF20抗体のCDC活性を測定した。CDC活性の測定では、エフェクター細胞の代わりに培地で50%に希釈したウサギ血清(Baby Rabbit Complement、Cedarlane)を100μL/ウェル加えた後、プレートを37℃、5% CO2インキュベーターにて1.5時間培養した。その結果、抗TM4SF20抗体B8、B15がCDC活性を有することが明らかとなった(図10B)。
TM4SF20 mRNAが胃癌で発現していたことから(実施例1)、胃癌におけるTM4SF20タンパクの発現を免疫組織化学染色により解析した。臨床胃癌検体より4% paraformaldehyde固定AMeX包埋パラフィンブロックを作製し、5μmの薄切切片を作製した。これらの切片についてVentana HX Discovery System (Ventana Medical Systems)を用いて下記のように免疫組織化学的に染色した。各切片を脱パラフィン後に洗浄し、内因性peroxidaseの除去のため3.0% hydrogen peroxide solution (Inhibitor D、Ventana Medical Systems)を用いて37℃にて4分間反応させた。洗浄後、非特異的反応の除去のためProtein Block (Dako)を加え、室温にて30分間反応させた。洗浄後、一次抗体として25μg/mLの抗TM4SF20抗体クローンB11を加え室温にて2時間反応させた。洗浄後、二次抗体(Ventana Universal Secondary Antibody、Ventana Medical Systems)を加え、室温にて30分間反応させた。洗浄後、非特異的反応の除去のためBlocker D (Ventana Medical Systems)にて室温にて2分間反応させ、続いてstreptavidin horseradish peroxidase (Ventana Medical Systems)を加え、37℃にて16分間反応させた。洗浄後、diaminobenzidine (DAB map solution、Ventana Medical Systems)とhydrogen peroxide solution (DAB map solution、Ventana Medical Systems)を混和して加え、基質の発色のため42℃にて8分間反応させた。さらにCopper sulfate solution (Ventana Medical Systems)にて発色の増感を行った。洗浄後、ヘマトキシリンにて核染を行い、脱水、透徹、封入を行った。
実施例2にて作製した抗TM4SF20抗体の可変領域の塩基配列を決定した。それぞれの抗体を産生するハイブリドーマ細胞1×106個からTrizol (Invitrogen)を用いてtotal RNAを精製した。Total RNA 1μgを使用し、SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)、マウスIgG1定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1 (配列番号:51)、マウスIgG2a定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-G2a (配列番号:52)、マウスIgG2b定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-G2b (配列番号:53)又はマウスκ鎖定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMLC-kappa (配列番号:54)を用い、抗体のH鎖、L鎖cDNAの上述オリゴヌクレオチド配列に相当する位置から5'-cDNA末端までの配列をPCR増幅した。増幅産物をpGEM-T Easy Vector Systems (Promega)を用いてpGEM-T Easyベクターにクローニングし、cDNA配列を決定した。各抗体の可変領域配列を下表にまとめた。
配列番号:2−プライマーhSF20RXba
配列番号:3−プライマーhSF20FNhe
配列番号:4−プライマーhSF20RNot
配列番号:5−プラスミドpMCDN2_TM4SF20_ntHA(開始コドン−終止コドン)
配列番号:6−プラスミドpMCDN2_TM4SF20_ntHA(開始コドン−終止コドン)
配列番号:7−プライマーmSF-F
配列番号:8−プライマーmSF-R
配列番号:9−プラスミドpGEM-T_mTM4SF20(開始コドン−終止コドン)
配列番号:10−プラスミドpGEM-T_mTM4SF20(開始コドン−終止コドン)
配列番号:11−プライマーmSF20FNhe
配列番号:12−プライマーmSF20RNot
配列番号:13−プライマーh.mTM20FHANot
配列番号:14−プライマーmTM20RHABam
配列番号:15−プラスミドpCOS2_mTM4SF20_ntHA(開始コドン−終止コドン)
配列番号:16−プラスミドpCOS2_mTM4SF20_ntHA(開始コドン−終止コドン)
配列番号:17−プライマーhSF20RBamH
配列番号:18−プラスミドpCOS2_TM4SF20_ctHA(開始コドン−終止コドン)
配列番号:19−プラスミドpCOS2_TM4SF20_ctHA(開始コドン−終止コドン)
配列番号:20−プライマーhmTM4SF20ver1R1
配列番号:21−プライマーhmTM4SF20ver1F1
配列番号:22−プライマーhTM20RHABam
配列番号:23−プラスミドpCOS2_chimeraTM4SF20 ver.1_ntHA(開始コドン−終止コドン)
配列番号:24−プラスミドpCOS2_chimeraTM4SF20 ver.1_ntHA(開始コドン−終止コドン)
配列番号:25−プライマーhmTM4SF20-2-F1
配列番号:26−プライマーhmTM4SF20-2-R1
配列番号:27−プライマーhmTM4SF20-2-R2
配列番号:28−プライマーhmTM4SF20-2-F3
配列番号:29−プラスミドpCOS2_chimeraTM4SF20 ver.2_ntHA(開始コドン−終止コドン)
配列番号:30−プラスミドpCOS2_chimeraTM4SF20 ver.2_ntHA(開始コドン−終止コドン)
配列番号:31−プライマーF2
配列番号:32−プライマーR1
配列番号:33−プライマーF3
配列番号:34−プライマーF4
配列番号:35−プライマーF1
配列番号:36−プライマーR2
配列番号:37−プライマーR3
配列番号:38−プライマーR4
配列番号:39−コンストラクトGST_TM4SF20_N1
配列番号:40−コンストラクトGST_TM4SF20_N1
配列番号:41−コンストラクトGST_TM4SF20_N2
配列番号:42−コンストラクトGST_TM4SF20_N2
配列番号:43−コンストラクトGST_TM4SF20_N3
配列番号:44−コンストラクトGST_TM4SF20_N3
配列番号:45−コンストラクトGST_TM4SF20_C1
配列番号:46−コンストラクトGST_TM4SF20_C1
配列番号:47−コンストラクトGST_TM4SF20_C2
配列番号:48−コンストラクトGST_TM4SF20_C2
配列番号:49−コンストラクトGST_TM4SF20_C3
配列番号:50−コンストラクトGST_TM4SF20_C3
配列番号:51−合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1
配列番号:52−合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG2a
配列番号:53−合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG2b
配列番号:54−合成オリゴヌクレオチドMLC-kappa
配列番号:55−B8 H V
配列番号:56−B8 H V
配列番号:57−B8 L V
配列番号:58−B8 L V
配列番号:59−B11 H V
配列番号:60−B11 H V
配列番号:61−B11 L V
配列番号:62−B11 L V
配列番号:63−B12 H V
配列番号:64−B12 H V
配列番号:65−B12 L V
配列番号:66−B12 L V
配列番号:67−B15 H V
配列番号:68−B15 H V
配列番号:69−B15 L V
配列番号:70−B15 L V
配列番号:71−C7 H V
配列番号:72−C7 H V
配列番号:73−C7 L V
配列番号:74−C7 L V
配列番号:75−C9 H V
配列番号:76−C9 H V
配列番号:77−C9 L V
配列番号:78−C9 L V
配列番号:79−B8 H CDR1
配列番号:80−B8 H CDR2
配列番号:81−B8 H CDR3
配列番号:82−B8 L CDR1
配列番号:83−B8 L CDR2
配列番号:84−B8 L CDR3
配列番号:85−B11 H CDR1
配列番号:86−B11 H CDR2
配列番号:87−B11 H CDR3
配列番号:88−B11 L CDR1
配列番号:89−B11 L CDR2
配列番号:90−B11 L CDR3
配列番号:91−B12 H CDR1
配列番号:92−B12 H CDR2
配列番号:93−B12 H CDR3
配列番号:94−B12 L CDR1
配列番号:95−B12 L CDR2
配列番号:96−B12 L CDR3
配列番号:97−B15 H CDR1
配列番号:98−B15 H CDR2
配列番号:99−B15 H CDR3
配列番号:100−B15 L CDR1
配列番号:101−B15 L CDR2
配列番号:102−B15 L CDR3
配列番号:103−C7 H CDR1
配列番号:104−C7 H CDR2
配列番号:105−C7 H CDR3
配列番号:106−C7 L CDR1
配列番号:107−C7 L CDR2
配列番号:108−C7 L CDR3
配列番号:109−C9 H CDR1
配列番号:110−C9 H CDR2
配列番号:111−C9 H CDR3
配列番号:112−C9 L CDR1
配列番号:113−C9 L CDR2
配列番号:114−C9 L CDR3
配列番号:115−human TM4SF20 (GenBank Accession No:NM_024795)
配列番号:116−human TM4SF20 (GenBank Accession No:NM_024795)
配列番号:117−リンカー
配列番号:118−リンカー
配列番号:119−リンカー
配列番号:120−リンカー
配列番号:121−リンカー
配列番号:122−リンカー
配列番号:123−リンカー
配列番号:124−リンカー
Claims (11)
- TM4SF20タンパク質に結合する抗体であって、配列番号:116の168-184番目のアミノ酸配列をエピトープとして認識し、細胞傷害活性を有する抗体。
- 細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性(ADCC活性)である請求項1に記載の抗体。
- 細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性(CDC活性)である請求項1に記載の抗体。
- 以下のいずれかに記載のTM4SF20タンパク質に結合する請求項1〜3のいずれかに記載の抗体。
(1)配列番号:79に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:80に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号:81に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を
含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:82に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号:84に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
(2)配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号:93に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:94に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:95に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号:96に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
(3)配列番号:97に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:98に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号:99に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:100に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号:102に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
(4)配列番号:103に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:104に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号:105に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:106に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:107に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号:108に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
(5)配列番号:109に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号:110に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号:111に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号:112に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号:113に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号:114に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
(6)(1)から(5)のいずれかに記載の抗体が結合するTM4SF20タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。 - 請求項1〜4いずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
- 抗癌剤である請求項5に記載の医薬組成物。
- 胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌の治療に用いられる請求項6に記載の医薬組成物。
- 被験者から単離された試料におけるTM4SF20タンパク質の発現量を請求項1〜4のいずれかに記載の抗体を用いて検出する工程を含む癌の検出方法。
- 胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌を検出するためのものである、請求項8に記載の検出方法。
- 請求項1〜4いずれかに記載の抗体を含む癌の検出薬。
- 胃癌、肺腺癌、膵臓癌、及び大腸癌から選択される癌を検出するためのものである、請求項10に記載の検出薬。
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JPN6010006978; LIU, A.Y., et al.: 'Chimeric mouse-human IgG1 antibody that can mediate lysis of cancer cells.' Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.84, No.10, 198705, p.3439-3443 * |
JPN6010007085; MARKEN, J.S., et al.: 'Cloning and expression of the tumor-associated antigen L6.' Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.89, No.8, 199204, p.3503-3507 * |
JPN6010007087; HELLSTROM, I., et al.: 'Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas.' Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.83, No.18, 198609, p.7059-7063 * |
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