JP6162864B2 - 抗Desmoglein3抗体を用いる癌の診断および治療 - Google Patents
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Description
本発明は更に、DSG3タンパク質に結合し、かつ、DSG3タンパク質を発現する細胞に対して細胞障害活性を有し、かつ細胞崩壊活性を有しない抗体を提供する。
別の態様においては、本発明は、癌診断マーカーとしてのDSG3タンパク質の使用を提供する。
(a) 被験者から試料を採取する工程;
(b) 採取された試料に含まれるDSG3タンパク質を、DSG3タンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程
を含む癌の診断方法を提供する。本発明において上記該試料は被験者から採取できるものであればいかなるものでも使用でき、一の態様においては被験者から採取した血清が使用され、また別の態様では被験者から生検(バイオプシー)により採取された試料も使用される。該診断方法に係る癌は、対象とする癌細胞がDSG3タンパク質を発現する癌であればいずれの癌でもよいが、好ましくは肺癌であり、さらに好ましくは非小細胞肺癌である。本発明においては、被験者から試料を採取する工程は被験者から採取された試料を提供する工程と表現することもできる。
また別の態様においては、本発明は、DSG3タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。
さらに別の態様においては、本発明は、本発明の診断方法に用いるための診断薬やキットを提供する。
〔1〕DSG3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
〔2〕DSG3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
〔3〕DSG3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する抗癌剤。
〔4〕DSG3タンパク質に結合する抗体が細胞障害活性を有する抗体である、〔3〕に記載の抗癌剤。
〔5〕DSG3タンパク質に結合する抗体が、以下(1)から(47)のいずれかに記載の抗体である、〔3〕または〔4〕に記載の抗癌剤;
(1)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:6に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(2)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:14に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:16に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(5)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:18に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(6)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(7)(1)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(8)(2)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(9)(3)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(10)CDR1として配列番号:22に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:24に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:26に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(11)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:28に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(12)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(13)CDR1として配列番号:30に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:32に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:34に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(14)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:36に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(15)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(16)(10)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(17)(11)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(18)(12)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(19)(1)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を有する抗体、
(20)(2)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を有する抗体、
(21)(3)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を有する抗体、
(22)(10)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を有する抗体、
(23)(11)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を有する抗体、
(24)(12)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を有する抗体、
(25)CDR1として配列番号:81に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:83に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号:85に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(26)(25)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:28に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(27)(25)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(28)CDR1として配列番号:87に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:89に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(29)(28)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:36に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(30)(28)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(31)(25)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を含む抗体、
(32)(26)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を含む抗体、
(33)(27)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を含む抗体、
(34)(1)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を有する抗体、
(35)(2)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を有する抗体、
(36)(3)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を有する抗体、
(37)(10)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を有する抗体、
(38)(11)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を有する抗体、
(39)(12)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を有する抗体、
(40)(25)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(41)(26)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(42)(27)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(43)(25)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(44)(26)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(45)(27)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(46)(1)から(45)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)から(45)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
(47)(1)から(45)のいずれかに記載の抗体が結合するDSG3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
〔6〕癌が肺癌、大腸癌、食道癌、胃癌、膵癌、皮膚癌又は子宮癌である、〔3〕から〔5〕のいずれかに記載の抗癌剤。
〔7〕肺癌が非小細胞肺癌である〔6〕に記載の抗癌剤。
〔8〕DSG3タンパク質を発現する細胞とDSG3タンパク質に結合する抗体とを接触させることにより該DSG3発現細胞に細胞障害を引き起こす方法。
〔9〕DSG3タンパク質を発現する細胞とDSG3タンパク質に結合する抗体とを接触させることにより該DSG3発現細胞の増殖を抑制する方法。
〔10〕DSG3タンパク質に結合する抗体が細胞障害活性を有する抗体である、〔8〕または〔9〕に記載の方法。
〔11〕DSG3タンパク質に結合する抗体が、以下(1)から(47)のいずれかに記載の抗体である、〔8〕から〔10〕のいずれかに記載の方法;
(1)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:6に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(2)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:14に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:16に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(5)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:18に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(6)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(7)(1)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(8)(2)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(9)(3)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(10)CDR1として配列番号:22に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:24に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:26に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(11)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:28に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(12)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(13)CDR1として配列番号:30に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:32に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:34に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(14)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:36に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(15)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(16)(10)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(17)(11)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(18)(12)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(19)(1)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を有する抗体、
(20)(2)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を有する抗体、
(21)(3)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を有する抗体、
(22)(10)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を有する抗体、
(23)(11)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を有する抗体、
(24)(12)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を有する抗体、
(25)CDR1として配列番号:81に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:83に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号:85に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(26)(25)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:28に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(27)(25)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(28)CDR1として配列番号:87に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:89に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(29)(28)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:36に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(30)(28)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(31)(25)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を含む抗体、
(32)(26)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を含む抗体、
(33)(27)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を含む抗体、
(34)(1)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を有する抗体、
(35)(2)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を有する抗体、
(36)(3)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を有する抗体、
(37)(10)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を有する抗体、
(38)(11)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を有する抗体、
(39)(12)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を有する抗体、
(40)(25)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(41)(26)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(42)(27)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(43)(25)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(44)(26)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(45)(27)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(46)(1)から(45)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)から(45)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
(47)(1)から(45)のいずれかに記載の抗体が結合するDSG3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
〔12〕DSG3タンパク質を発現する細胞が癌細胞である、〔8〕から〔11〕のいずれかに記載の方法。
〔13〕DSG3タンパク質に結合し、かつDSG3タンパク質を発現する細胞に対して細胞障害活性を有する抗体。
〔14〕細胞障害活性がADCC活性である〔13〕に記載の抗体。
〔15〕細胞障害活性がCDC活性である〔13〕に記載の抗体。
〔16〕低分子の化学療法剤、または、毒性ペプチドを結合した〔13〕から〔15〕のいずれかに記載の抗体。
〔17〕DSG3タンパク質に結合する抗体であって、低分子の化学療法剤、または、毒性ペプチドが結合された抗体。
〔18〕以下(1)から(47)のいずれかに記載の抗体である、〔13〕から〔17〕のいずれかに記載の抗体;
(1)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:6に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(2)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:14に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:16に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(5)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:18に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(6)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(7)(1)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(8)(2)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(9)(3)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(10)CDR1として配列番号:22に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:24に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:26に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(11)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:28に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(12)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(13)CDR1として配列番号:30に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:32に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:34に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(14)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:36に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(15)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(16)(10)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(17)(11)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(18)(12)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(19)(1)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を有する抗体、
(20)(2)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を有する抗体、
(21)(3)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を有する抗体、
(22)(10)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を有する抗体、
(23)(11)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を有する抗体、
(24)(12)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を有する抗体、
(25)CDR1として配列番号:81に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:83に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号:85に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(26)(25)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:28に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(27)(25)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(28)CDR1として配列番号:87に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:89に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(29)(28)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:36に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(30)(28)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(31)(25)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を含む抗体、
(32)(26)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を含む抗体、
(33)(27)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を含む抗体、
(34)(1)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を有する抗体、
(35)(2)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を有する抗体、
(36)(3)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を有する抗体、
(37)(10)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を有する抗体、
(38)(11)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を有する抗体、
(39)(12)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を有する抗体、
(40)(25)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(41)(26)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(42)(27)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(43)(25)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(44)(26)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(45)(27)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(46)(1)から(45)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)から(45)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
(47)(1)から(45)のいずれかに記載の抗体が結合するDSG3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
〔19〕癌診断マーカーとしてのDSG3タンパク質の使用。
〔20〕DSG3タンパク質に結合する抗体を用いてDSG3タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
〔21〕以下の工程:
(a) 被験者から試料を採取する工程;
(b) 採取された試料に含まれるDSG3タンパク質を、DSG3タンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程
を含む癌の診断方法。
〔22〕DSG3タンパク質に結合する抗体が、陽電子放出核種により標識された抗体である〔20〕または〔21〕に記載の診断方法。
〔23〕陽電子放出核種が11C、13N、15O、18F、45Ti、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、124Iのいずれかから選択される核種である〔22〕に記載の診断方法。
〔24〕DSG3タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出することを特徴とする癌の診断方法。
〔25〕癌が肺癌、大腸癌、食道癌、胃癌、膵癌、皮膚癌又は子宮癌である〔20〕から〔24〕のいずれかに記載の診断方法。
〔26〕肺癌が非小細胞肺癌である〔25〕に記載の診断方法。
〔27〕〔20〕から〔26〕のいずれかに記載の診断方法に用いるための診断薬。
〔28〕〔20〕から〔26〕のいずれかに記載の診断方法に用いるためのキット。
〔29〕細胞増殖抑制剤の製造におけるDSG3タンパク質に結合する抗体の使用。
〔30〕抗癌剤の製造におけるDSG3タンパク質に結合する抗体の使用。
〔31〕DSG3タンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む細胞増殖を抑制する方法。
〔32〕DSG3タンパク質に結合する抗体を対象に投与する工程を含む癌を予防または治療する方法。
DSG3(Desmoglein3)は、軸索誘導受容体蛋白質であり、そのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、それぞれGenBank登録番号NP_001935(配列番号:40)及びNM_001944(配列番号:39)に開示されている。本発明において、DSG3タンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。断片とは、DSG3タンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のDSG3タンパク質の機能を有していなくてもよい。断片の例としては、限定されないが、DSG3タンパク質の細胞外領域を含む断片が挙げられる。DSG3タンパク質の細胞外領域は配列番号:40のアミノ酸配列において1−616番目が相当する。又、膜貫通領域は配列番号:40のアミノ酸配列において617−641番目が相当する。
本発明の方法は、DSG3遺伝子発現を検出することを特徴とする。本発明の方法の1つの態様においては、DSG3タンパク質の発現を検出する。
本発明において検出とは、定量的または定性的な検出を含み、例えば、定性的な検出としては、単にDSG3タンパク質が存在するか否かの測定、DSG3タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、DSG3タンパク質の量を他の試料(例えば、コントロール試料など)と比較する測定などを挙げることができる。一方、定量的な検出とは、DSG3タンパク質の濃度の測定、DSG3タンパク質の量の測定などを挙げることができる。
本発明においては、被検試料中にDSG3タンパク質が検出された場合、陰性コントロールまたは健常者と比較して被検試料中に検出されるDSG3タンパク質の量が多いと判断される場合に、被験者が癌である、または将来癌を羅患する可能性が高いと判定できる。
本発明における被験者としてはDSG3タンパク質を遺伝的に有する動物種であればよく、係る動物種としてサル、ウシ、ヒツジ、マウス、イヌ、ネコ、ハムスター等ヒト以外の多くの哺乳類が知られている。特に好適に用いられる被験者はヒトであるが、これに制限されるものではない。
これらのような方法としては、当業者らに周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を挙げることができる。
上記した本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
本発明の診断方法はin vitro又はin vivoのどちらでも行なうことが可能であるが、in vitroで行なわれることが好ましい。
本発明の癌の診断方法の好ましい態様として以下の工程を含む方法を挙げることができる。
(a) 被験者から採取された試料を提供する工程;
(b) (a)の試料に含まれるDSG3タンパク質を検出する工程。
さらに、本発明の癌の診断方法の好ましい態様として以下の工程を含む方法を挙げることができる。
(a) 被験者から採取された試料を提供する工程;
(b) (a)の試料に含まれるDSG3遺伝子を検出する工程。
本発明で用いられる抗DSG3抗体はDSG3タンパク質に特異的に結合すればよく、その由来、種類(モノクローナル、ポリクローナル)および形状は問われない。具体的には、動物抗体(例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体)、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
該感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
このように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:72)
Ser・Gly・Gly・Gly(配列番号:73)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:74)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:75)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:76)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:77)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:78)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:79)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:74))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:75))n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]
(1)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のH鎖CDR1の配列)、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のH鎖CDR2の配列)、およびCDR3として配列番号:6に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のH鎖CDR3の配列)を有するH鎖を含む抗体、
(2)(1)に記載のH鎖であって、CH(H鎖定常領域)として配列番号:8に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のCHの配列)を有するH鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列(DF151マウス−ヒトキメラ抗体のCHの配列)を有するH鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のL鎖CDR1の配列)、CDR2として配列番号:14に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のL鎖CDR2の配列)、およびCDR3として配列番号:16に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のL鎖CDR3の配列)を有するL鎖を含む抗体、
(5)(4)に記載のL鎖であって、CL(L鎖定常領域)として配列番号:18に記載のアミノ酸配列(DF151抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体、
(6)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列(DF151マウス−ヒトキメラ抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体、
(7)(1)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(8)(2)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(9)(3)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(10)CDR1として配列番号:22に記載のアミノ酸配列(DF364抗体のH鎖CDR1の配列)、CDR2として配列番号:24に記載のアミノ酸配列(DF364抗体のH鎖CDR2の配列)、およびCDR3として配列番号:26に記載のアミノ酸配列(DF364抗体のH鎖CDR3の配列)を有するH鎖を含む抗体、
(11)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:28に記載のアミノ酸配列(DF364抗体のCHの配列)を有するH鎖を含む抗体、
(12)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列(DF364マウス−ヒトキメラ抗体のCHの配列)を有するH鎖を含む抗体、
(13)CDR1として配列番号:30に記載のアミノ酸配列(DF364抗体のL鎖CDR1の配列)、CDR2として配列番号:32に記載のアミノ酸配列(DF364抗体のL鎖CDR2の配列)、およびCDR3として配列番号:34に記載のアミノ酸配列(DF364抗体のL鎖CDR3の配列)を有するL鎖を含む抗体、
(14)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:36に記載のアミノ酸配列(DF364抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体、
(15)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列(DF364マウス−ヒトキメラ抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体、
(16)(10)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(17)(11)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(18)(12)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(19)(1)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を有する抗体、
(20)(2)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を有する抗体、
(21)(3)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を有する抗体、
(22)(10)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を有する抗体、
(23)(11)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を有する抗体、
(24)(12)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を有する抗体、
(25)CDR1として配列番号:81に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のH鎖CDR1の配列)、CDR2として配列番号:83に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のH鎖CDR2の配列)、CDR3として配列番号:85に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のH鎖CDR3の配列)を有するH鎖を含む抗体、
(26)(25)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:28に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のCHの配列)を有するH鎖を含む抗体、
(27)(25)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列(DF366マウス−ヒトキメラ抗体のCHの配列)を有するH鎖を含む抗体、
(28)CDR1として配列番号:87に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のL鎖CDR1の配列)、CDR2として配列番号:89に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のL鎖CDR2の配列)、CDR3として配列番号:91に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のL鎖CDR3の配列)を有するL鎖を含む抗体、
(29)(28)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:36に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体、
(30)(28)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列(DF366マウス−ヒトキメラ抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体、
(31)(25)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を含む抗体、
(32)(26)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を含む抗体、
(33)(27)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を含む抗体、
(34)(1)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を有する抗体、
(35)(2)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を有する抗体、
(36)(3)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を有する抗体、
(37)(10)に記載のH鎖、および(28)に記載のL鎖を有する抗体、
(38)(11)に記載のH鎖、および(29)に記載のL鎖を有する抗体、
(39)(12)に記載のH鎖、および(30)に記載のL鎖を有する抗体、
(40)(25)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(41)(26)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(42)(27)に記載のH鎖、および(6)に記載のL鎖を含む抗体、
(43)(25)に記載のH鎖、および(13)に記載のL鎖を含む抗体、
(44)(26)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体、
(45)(27)に記載のH鎖、および(15)に記載のL鎖を含む抗体、
(46)(1)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:108に記載のアミノ酸配列(マウスIgG2a抗体のCHの配列)を有するH鎖を含む抗体、
(47)(4)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:112に記載のアミノ酸配列(マウスIgG2a抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体、
(48)(10)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:108に記載のアミノ酸配列(マウスIgG2a抗体のCHの配列)を有するH鎖を含む抗体、
(49)(13)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:112に記載のアミノ酸配列(マウスIgG2a抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体、
(50)(25)に記載のH鎖であって、CHとして配列番号:108に記載のアミノ酸配列(マウスIgG2a抗体のCHの配列)を有するH鎖を含む抗体、
(51)(28)に記載のL鎖であって、CLとして配列番号:112に記載のアミノ酸配列(マウスIgG2a抗体のCLの配列)を有するL鎖を含む抗体、
(52)(46)に記載のH鎖、および(47)に記載のL鎖を含む抗体、
(53)(48)に記載のH鎖、および(49)に記載のL鎖を含む抗体、
(54)(50)に記載のH鎖、および(51)に記載のL鎖を含む抗体、
(55)(46)に記載のH鎖、および(49)に記載のL鎖を含む抗体、
(56)(48)に記載のH鎖、および(51)に記載のL鎖を含む抗体、
(57)(50)に記載のH鎖、および(47)に記載のL鎖を含む抗体、
(58)(46)に記載のH鎖、および(51)に記載のL鎖を含む抗体、
(59)(48)に記載のH鎖、および(47)に記載のL鎖を含む抗体、
(60)(50)に記載のH鎖、および(49)に記載のL鎖を含む抗体、
(61)(1)から(60)のいずれかに記載の抗体において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入された抗体であって、(1)から(60)のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
(62)(1)から(60)のいずれかに記載の抗体が結合するDSG3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
また、上記(25)に記載の「CDR1として配列番号:81に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のH鎖CDR1の配列)、CDR2として配列番号:83に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のH鎖CDR2の配列)、CDR3として配列番号:85に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のH鎖CDR3の配列)を有するH鎖」におけるVHとしては、配列番号:93に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のVHの配列)を有するVHが例示できる。
また、上記(28)に記載の「CDR1として配列番号:87に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のL鎖CDR1の配列)、CDR2として配列番号:89に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のL鎖CDR2の配列)、CDR3として配列番号:91に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のL鎖CDR3の配列)を有するL鎖」におけるVLとしては、配列番号:95に記載のアミノ酸配列(DF366抗体のVLの配列)を有するVLが例示できる。
被検抗体が、本願発明で開示された抗DSG3抗体が結合したエピトープと同じエピトープへの結合に対して競合可能であるか否かを決定するために、交叉ブロッキングアッセイ、例えば競合ELISAアッセイを実施することができる。例えば、競合ELISAアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたDSG3タンパク質を候補の競合抗体の存在下又は非存在下でプレインキュベートした後に、ビオチン標識された本発明の抗DSG3抗体が添加される。ウェル中のDSG3タンパク質に結合した表紙機構DSG3抗体の量は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。抗体は放射標識又は蛍光標識など検出及び測定が可能な他の標識で標識することができる。DSG3タンパク質に結合した標識抗DSG3抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体(被検抗体)の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する被検抗体の親和性が大きくなればなる程、標識抗DSG3抗体のDSG3タンパク質をコートしたウェルへの結合活性は低下する。候補の競合抗体非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも20%、好ましくは少なくとも20-50%、さらに好ましくは少なくとも50%、抗DSG3抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体は本発明の抗DSG3抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体であると考えられる。
また、上記(1)から(62)に記載の抗体には、上述の通り、一価抗体だけでなく、二価以上の多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。
(7)、(16)、(19)、(22)、(31)、(34)、(37)、(40)および(43)に記載のH鎖とL鎖の対(以下、HL対と称する)から選択される、少なくとも2つのHL対を含む抗体。
(8)、(17)、(20)、(23)、(32)、(35)、(38)、(41)および(44)に記載のHL対から選択される、少なくとも2つのHL対を含む抗体。
(9)、(18)、(21)、(24)、(33)、(36)、(39)、(42)および(45)に記載のHL対から選択される、少なくとも2つのHL対を含む抗体。
(52)から(60)に記載のHL対から選択される、少なくとも2つのHL対を含む抗体。
本発明における細胞障害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞障害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ADCC)活性、補体依存性細胞障害(complement-dependent cytotoxicity:CDC)活性などを挙げることができる。本発明において、CDC活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞(免疫細胞等)がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
(1)エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(Invitrogen社製)中で脾臓細胞が分離される。10%ウシ胎児血清(FBS、HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。
(2)補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を10% FBS含有培地(Invitrogen社製)にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
(3)標的細胞の調製
DSG3タンパク質を発現する細胞(DSG3タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、食道癌細胞、胃癌細胞、膵癌細胞、皮膚癌細胞又は子宮癌細胞等)を0.2 mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)とともに、10% FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。放射性標識後、細胞を10% FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。
別の観点においては、本発明は、DSG3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を特徴とする。又、本発明はDSG3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤を特徴とする。本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、癌を罹患している対象または罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。本発明における対象としては、DSG3タンパク質を遺伝的に有する動物種であって、癌を罹患している動物種、または罹患している可能性がある動物種であればよく、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、マウス、イヌ、ネコ、ハムスター等の哺乳類が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
また、生体内で細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法として、上記記載の生体内において細胞障害活性を評価又は測定する方法と同じ方法を好適に用いることができる。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例1〕各癌種におけるDSG3のmRNA発現解析
DSG3遺伝子発現解析を行うためにGene chipが用いられた。癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索するために、表1、2に示す各種RNA及び各種摘出組織よりISOGEN(ニッポンジーン社製)を用い常法により調製した全RNAが用いられた。より具体的には、全RNAを各10 μgずつ用いて、GeneChip U-133A(アフィメトリクス社製)に供しExpression Analysis Technical Manual(アフィメトリクス社製)に準じて遺伝子発解析が実施された。なお、肺腺癌及び肝細胞癌の解析に際しては、肺腺癌12症例と肝細胞癌3症例の全RNAを合わせて合計10 μgとし、解析を実施した(表1)。
全遺伝子の発現スコアの平均値を100と設定し、各遺伝子の相対的な発現量を比較することによって、癌組織あるいは癌細胞において発現が亢進する遺伝子の探索を行った。その結果、DSG3 mRNA(プローブID:205595_at HG-U133A)の発現が、正常組織においては皮膚に限局する一方で、癌組織においては肺癌(肺扁平上皮癌)や大腸癌、また、癌細胞株においてはTE2(食道癌)、2M(胃癌)及びPK-1(膵癌)において亢進していた(図1、図2)。
以上より、DSG3遺伝子(プローブID:205595_at HG-U133A)は皮膚以外の正常組織でその発現が非常に低いのに対し、肺癌、大腸癌、食道癌、胃癌及び膵癌と広範な癌種でその発現が亢進していることが明らかとなった。以上の結果から、DSG3の発現を指標にすることによって、上記の癌の発生が診断できる可能性が高いことが示唆された。
DSG3遺伝子の転写が癌細胞、特に肺扁平上皮癌細胞で亢進していることから、DSG3タンパク質の発現の確認をするために免疫組織染色解析が実施された。
各検体は固定パラフィン包埋標本として調製され、4 μmに薄切されたその切片がスライドガラスに張り付けられた後に、37℃で16時間程度静置され充分乾燥させられた。該切片は100%キシレンに5分間漬けることを3回繰り返すことによって脱パラフィン化され、100%エタノールに5分間漬けることを3回繰り返し、更に70%エタノールで5分間漬けることにより親水化された。その後、50 mM TBS緩衝液を用いて5分間の洗浄を3回繰り返した後に、該切片をクエン酸バッファー(10 mM, pH 7.0)中で120℃、10分間で処理することによって、切片中の抗原が賦活化された。抗原が賦活化処理された該切片はTBS緩衝液による5分間の洗浄が3回実施された後に、最終濃度50 μg/mlに希釈された抗DSG3抗体(5G11)(ザイメッド社)を含むTBS緩衝液中で室温にて1時間処理された。内在性のペルオキシダーゼを失活させるために、抗DSG3抗体を結合させた切片が0.3%の過酸化水素で室温にて15分間処理された。さらにTBS緩衝液による3回の洗浄の後、二次抗体であるENVISION+キット/HRP(DAKO社)により上記切片が室温にて1時間処理された。TBS緩衝液による5分間の洗浄を3回実施した後、発色基質としてDAB(3, 3’-ジアミノベンザミド テトラハイドロクロライド)を加えることにより切片が染色された。また、核の対比染色にはヘマトキシリンが染色剤として用いられた。
その結果、5例の肺扁平上皮癌に羅患したがん患者由来の組織切片中、5例全てが抗DSG3抗体(5G11)によって染色される陽性反応を示した(図3)。肺癌特異的な染色像が得られたことにより、DSG3が肺癌においてタンパクレベルにおいても発現亢進することが明らかとなった。抗DSG3抗体を使用することにより、肺癌の発生が検出できることが示された。
3−1)ヒトDSG3をコードする全長cDNAのクローニング
ヒトDSG3をコードする全長cDNAが、Human Small Intestine Marathon-Ready cDNA(CLONTECH社)を鋳型としたPCR増幅により取得された。すなわち、2 μlのcDNA、1 μlのセンスプライマー(配列番号:37)、1 μlのアンチセンスプライマー(配列番号:38)、5 μlの10 x KOD-Plus buffer、5 μlの2 mM dNTPs、2 μlの25 mM MgSO4、1 μlのKOD-Plusを含む50 μlの反応液中で、94 ℃にて15秒、70℃にて2分の反応からなる反応サイクルを5回、94 ℃にて15秒、68℃にて2分の反応からなる反応サイクルを5回、94 ℃にて15秒、66℃にて2分の反応からなる反応サイクル28回を続けて行うPCR反応が実施された。上記のPCR反応により得られた増幅産物がpGEM‐T Easy Vector System I(Promega社)を用いてpGEM-T easyに挿入された。ABI3730 DNAシーケンサーを用いたシークエンシングによって、ヒトDSG3をコードするcDNA配列の成功裏のクローニングが確認された。配列番号:39で表される配列はヒトDSG3遺伝子の塩基配列を、配列番号:40で表される配列はヒトDSG3タンパク質のアミノ酸配列を示す。
全長ヒトDSG3 cDNAを哺乳細胞発現用ベクター(pMCN)にクローニングした(pMCN/hDSG3)。pMCNは、mouse CMVプロモータ(ACCESSION No. U68299)による制御下で誘導発現が可能で、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。pMCN/hDSG3をCHO細胞DG44株(Invitrogen社)へエレクトロポレーションにより導入し、500 μg/mlのGeneticin での選抜により、全長ヒトDSG3を定常的に発現するCHO細胞株が樹立された。同様に、DSG3を発現していないヒト肺上皮癌細胞株であるA549細胞へpMCN/hDSG3を導入し、1000 μg/mlのGeneticin での選抜により、全長ヒトDSG3を定常的に発現するA549細胞株が樹立された。
抗DSG3抗体作製のための免疫抗原として可溶型ヒトDSG3/マウスIgG2a Fc融合タンパク質(以下、shDSG3_mIgG2aFc)が作製された。発現ベクターpMCNにDHFR遺伝子を組み込んだpMCDNベクターに、ヒトDSG3細胞外領域(Met1-Leu616)とマウスIgG2a定常領域をヒンジ部位のCpoI認識配列で連結したshDSG3_mIgG2aFcがクローニングされた(pMCDN/shDSG3_mIgG2aFc)。配列番号:41で表される配列はshDSG3_mIgG2aFc遺伝子の塩基配列を、配列番号:42で表される配列はshDSG3_mIgG2aFcのアミノ酸配列を示す。pMCDN/shDSG3_mIgG2aFcをDG44細胞へエレクトロポレーションにより導入し、500 μg/ml Geneticin で選抜することにより、shDSG3_mIgG2aFcを定常的に発現するCHO細胞株が樹立された。次に樹立された該shDSG3_mIgG2aFc発現CHO細胞株の培養上清よりshDSG3_mIgG2aFcの精製が実施された。培養上清がHi Trap ProteinG HP(GEヘルスケアバイオサイエンス社)カラムにアプライされ、結合バッファー(20mM リン酸ナトリウム (pH 7.0))にて洗浄後、溶出バッファー(0.1M グリシン-HCl (pH 2.7))で溶出された。溶出液は中和バッファー(1M Tris-HCl (pH 9.0))を加えたチューブに溶出することにより直ちに中和された。該溶出液はSuperdex 200 HR 10/30(GEヘルスケアバイオサイエンス社)によるゲルろ過に供されることにより、所望の抗体を含有する溶液の溶媒がPBSバッファーに置換された。精製タンパク質はDC protein assay kit(BIO-RAD社)を用いて、該キットに添付されたウシIgGを標準試料とした濃度に換算され定量された。
Balb/cマウス、もしくはMRL/MpJUmmCrj-lpr/lprマウス(以下、MRL/lprマウス、日本チャールズ・リバーより購入)が免疫動物として用いられた。7週齢、又は8週齢より免疫が開始され、初回免疫に際してはshDSG3_mIgG2aFcを一頭当たり100 μg含むようにPBSバッファーを用いて調製され、フロイント完全アジュバント(ベクトンディッキンソン社)を用いてエマルジョン化された抗原が皮下に投与された。2週間後に一頭当たり50 μg含むようにPBSバッファーを用いて調製されたものをフロイント不完全アジュバント(ベクトンディッキンソン社)でエマルジョン化された抗原が皮下に投与された。以降1週間間隔で追加免疫が2から4回行われて、最終免疫として一頭当たり50 μgとなるようにPBSで希釈され尾静脈内に投与された。最終免疫の4日後、脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞P3-X63Ag8U1(P3U1、ATCCより購入)と2:1になるように混合し、PEG1500(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を徐々に加える事により細胞融合が実施された。続いて慎重にRPMI1640培地(Invitrogen社)を加えることによりPEG1500が希釈された後に、遠心分離で上清を除くことによりPEG1500が除去された。10%FBS入りRPMI1640にて懸濁した融合細胞群が100 μl/wellとなるように96穴培養プレート中に播種された。翌日、100 μl/wellとなるように10%FBS、1 x HAT media supplement (SIGMA社)、0.5 x BM-Condimed H1 Hybridoma cloning supplement (ロシュ・ダイアグノスティックス社)を含むRPMI1640(以下、HAT培地と称する。)を添加した。2、3日後に培養液の半分がHAT培地に置き換えられ、7日後の培養上清を用いてDSG3分子に対する結合活性を指標としたスクリーニングが実施された。該スクリーニングは全長ヒトDSG3を定常的に発現するCHO細胞への結合を検出するFlowcytometry解析によって実施された。該解析で得られた陽性クローンが限界希釈法によりモノクローン化された。即ち、DSG3に特異的に結合する抗体として、DF120、DF122、DF148、DF151、DF153、DF168、DF331、DF364、DF366が樹立された。
FBS(Ultra low IgG)(Invitrogen社)を血清として用いたHAT培地にて培養したハイブリドーマの培養上清から、該モノクローナル抗体の精製がshDSG3_mIgG2aFc と同様にHi Trap ProteinG HPカラムを用いて実施された。溶出画分は、PD-10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を用いてその溶液の溶媒をPBSに置換した後に、4℃にて保管された。精製抗体はDC protein assay kit(BIO-RAD社)を用いて、該キットに添付のウシIgGを標準試料とした濃度に換算されることによって定量された。
取得した抗体を用い、全長ヒトDSG3を定常的に発現するCHO細胞に対するその結合がFlowcytometryにより評価された。5 x 105 cells/mlになるようにFACS Buffer(1% FBS/PBS)に懸濁しMultiscreen - HV Filter Plates(ミリポア社)に分注した細胞懸濁液から、遠心分離によって上清が除去された。上清が除去された細胞に対してFACS Bufferによって適当な濃度(3 μg/ml)に希釈された抗DSG3モノクローナル抗体を含むFACS Bufferを添加した後に氷上に30分間静置させることによって、該細胞を該モノクローナル抗体と反応させた。遠心分離によって該反応液から上清を除去した後に細胞はFACS Bufferによって一回洗浄された。次に、二次抗体としてFITC標識抗マウスIgG抗体を含むFACS Bufferによって細胞を懸濁させることによって、細胞を該二次抗体と氷上にて30分間反応させた。反応終了後、遠心分離により上清が除去された細胞はFACS Buffer 100 μlに懸濁後、フローサイトメトリー解析に供された。フローサイトメーターはFACS Calibur(ベクトンディッキンソン社)が用いられた。前方散乱光(forward scatter)及び側方散乱光(side scatter)のヒストグラムにて生細胞集団にゲートが設定された。図4に示すように3 μg/mlの抗DSG3モノクローナル抗体(DF120, DF122, DF148, DF151, DF153, DF168, DF331, DF364, DF366)がDSG3を発現したCHO細胞に強く結合し、親株であるCHO細胞には結合しなかった事から、該抗DSG3モノクローナル抗体が細胞膜上に提示されたDSG3に特異的に結合する事が判明した。
4−1)抗DSG3抗体のcomplement-dependent cytotoxicity(CDC)活性の測定
標的細胞として全長ヒトDSG3を定常的に発現するCHO(DSG3-CHO、実施例3−2)に記載されている)細胞株を用いた。DSG3-CHO細胞株の培養には500 μg/ml Geneticin(Invitrogen社)、HT supplement (Invitrogen社)、penicillin/streptomycin(Invitrogen社)を含むCHO-S-SFM II培地(Invitrogen社)(以下、「培地」と称する)を用いた。DSG3-CHO細胞株5 x 105細胞を4℃にて5分間遠心分離(1000 rpm)することにより得られた細胞ペレットは3.7 MBqのChromium-51 (GEヘルスケアバイオサイエンス社)を含有する約200 μlの培地に懸濁された後に、5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて1時間培養された。この細胞を培地で3回洗浄した後、培地にて細胞密度が1 x 105 cells/mlに調製された後に、96ウェル平底プレートに100 μlずつ分注された。次に、培地にて希釈した抗DSG3抗体及びコントロールマウスIgG2a抗体(BD Biosciences Pharmingen社)が各ウェルに50 μlずつ添加された。抗体は終濃度10 μg/mlになるように調製された。続いて、培地にて5倍希釈した幼令ウサギ補体(Cederlane社)が各ウェルに50μlずつ添加された後に、プレートは5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて1.5時間静置された。静置後4℃にて5分間、遠心(1000 rpm)したプレートの各ウェルから上清が100 μlずつ回収され、ガンマカウンター(1480 WIZARD 3"、Wallac社)にて放射活性が測定された。下式に基づいて特異的クロム遊離率が決定された。
特異的クロム遊離率(%) = (A-C)×100/(B-C)
Aは各ウェルにおける放射活性(cpm)、Bは100 μlの細胞と100 μlの2% Nonidet P-40溶液(ナカライテスク社)を添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Cは100 μlの細胞と100 μlの培地を添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値を示す。測定はduplicateにて行われ、特異的クロム遊離率の平均値及び標準偏差が算出された。
実験に用いた全ての抗DSG3抗体がCDC活性を有することが確認された(図5)。一方コントロールマウスIgG2a抗体は同濃度でCDC活性を示さなかった。
次に、ヒト皮膚上皮癌細胞株A431(ATCCより購入)、ヒト肺上皮癌細胞株A549(ATCCより購入)、および全長ヒトDSG3を定常発現させたA549細胞株(DSG3-A549、実施例3−2)に記載されている)が標的細胞として用いられ該抗体のCDC活性の有無が検討された。A431及びDSG3-A549は細胞膜上にDSG3を発現する。A431、A549の培養には10% fetal bovine serum(Invitrogen社)、penicillin/streptomycinを含むDulbecco’s Modified Eagle Medium培地(Invitrogen社)(以下、DMEM培地と称する)を用いた。DSG3-A549細胞株の培養には1 mg/ml Geneticinを含むDMEM培地が使用された。A431、A549、DSG3-A549細胞が96ウェル平底プレートの各ウエルに2 x 103細胞(A549、DSG3-A549)または4 x 103細胞(A431)ずつ添加され、5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて3日間培養された。培養後Chromium-51が終濃度1.85 MBq/mlにて添加され、さらに1時間培養が継続された。各ウェルが300 μlのDMEM培地で洗浄された後、100 μlのDMEM培地が添加された。次に抗DSG3抗体および幼令ウサギ補体がDSG3-CHO細胞株を用いた試験で用いられた条件と同様に添加されることにより特異的クロム遊離率が決定された。
抗DSG3抗体DF151はDSG3を発現するA431およびDSG3-A549細胞株に対して濃度依存的にCDCを誘導したが、DSG3を発現しないA549細胞株に対してはCDC活性を示さなかった(図6)。以上の結果より、抗DSG3抗体が抗原特異的にCDC活性を発揮することが示された。
ADCC活性の測定にはDSG3-A549細胞株およびA431細胞株が使用された。CDC活性の測定の場合と同様に96ウェル平底プレートにて上記細胞を培養しChromium-51と反応させた。その後、各ウェルは10% fetal bovine serum、penicillin/streptomycinを含むRPMI1640培地(Invitrogen社)(以下、RPMI培地と称する)にて洗浄後、100 μlのRPMI培地が添加された。次に、RPMI培地にて希釈された抗DSG3抗体およびコントロールマウスIgG2a抗体が各ウェルに50 μlずつ添加された。抗体は終濃度10 μg/ml(骨髄由来エフェクター細胞)または1 μg/ml(脾臓由来エフェクター細胞)になるように調製された。続いて、後述するエフェクター細胞溶液(1 x 107細胞/ml)を各ウェルに50 μlずつ添加した後に、5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて4時間静置したプレートを用いて測定された各ウェルの放射活性から特異的クロム遊離率が決定された。エフェクター細胞としては、Balb/cマウス(日本チャールス・リバー社)の脾臓細胞を50 ng/mlリコンビナントヒトinterleukin-2(Peprotech社)を含むRPMI培地で5日間培養した細胞、もしくは同マウスの骨髄細胞を50 ng/mlリコンビナントヒトinterleukin-2および10 ng/mlリコンビナントマウスGM-CSF(Peprotech社)を含むRPMI培地で6日間培養した細胞を用いた。
抗DSG3抗体DF151、DF364及びDF366はDSG3-A549細胞株およびA431細胞株に対してADCCを誘導した(図7)。以上の結果より抗DSG3抗体はADCC活性を通じてDSG3タンパク質を発現する細胞に対して細胞障害を発揮することが示された。
DSG3発現細胞に対しADCC活性、CDC活性を示したモノクローナル抗体DF151、DF364及びDF366を産生するハイブリドーマより、抗体可変領域遺伝子がクローニングされその配列が決定された。抗DSG3抗体産生ハイブリドーマより抽出した全RNAを用いて、モノクローナル抗体DF151、DF364及びDF366をコードする抗体遺伝子がRT−PCR法によって増幅された。全RNAが、RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN社)を用いて1 x 107細胞のハイブリドーマより抽出された。1μgの全RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社)、マウスIgG2b定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG2b(配列番号:43)、マウスIgG1定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1(配列番号:100)またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドkappa(配列番号:44)を用い、5´末端側遺伝子断片が増幅された。逆転写反応は42℃で1時間30分間行われた。5 μlの10 x Advantage 2 PCR Buffer、5 μlの10 x Universal Primer A Mix、0.2 mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1μlのAdvantage 2 Polymerase Mix(以上、CLONTECH社製)、2.5 μlの逆転写反応産物、10 pmolの合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG2b、MHC-IgG1またはkappaを含有する50 μlのPCR反応液中でPCR反応が実施された。反応条件としては、94℃の初期温度にて30秒間反応後、94℃にて5秒、72℃にて3分の反応からなる反応サイクルを5回、94℃にて5秒、70℃にて10秒、72℃にて3分の反応からなる反応サイクルを5回反復、さらに94℃にて5秒、68℃にて10秒、72℃にて3分の反応からなる反応サイクルを25回反復するPCR反応が実施された。最後に反応産物は72℃で7分間加熱された。各PCR産物がQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、アガロースゲルから精製された後、pGEM-T Easyベクター(Promega社製)へクローニングされ、該クローンの塩基配列が決定された。
DF151のH鎖のCDR1の塩基配列を配列番号:1、アミノ酸配列を配列番号:2、CDR2の塩基配列を配列番号:3、アミノ酸配列を配列番号:4、CDR3の塩基配列を配列番号:5、アミノ酸配列を配列番号:6に示す。また、DF151のL鎖のCDR1の塩基配列を配列番号:11、アミノ酸配列を配列番号:12、CDR2の塩基配列を配列番号:13、アミノ酸配列を配列番号:14、CDR3の塩基配列を配列番号:15、アミノ酸配列を配列番号:16に示す。
DF364のH鎖のCDR1の塩基配列を配列番号:21、アミノ酸配列を配列番号:22、CDR2の塩基配列を配列番号:23、アミノ酸配列を配列番号:24、CDR3の塩基配列を配列番号:25、アミノ酸配列を配列番号:26に示す。また、DF364のL鎖のCDR1の塩基配列を配列番号:29、アミノ酸配列を配列番号:30、CDR2の塩基配列を配列番号:31、アミノ酸配列を配列番号:32、CDR3の塩基配列を配列番号:33、アミノ酸配列を配列番号:34に示す。
DF366のH鎖のCDR1の塩基配列を配列番号:80、アミノ酸配列を配列番号:81、CDR2の塩基配列を配列番号:82、アミノ酸配列を配列番号:83、CDR3の塩基配列を配列番号:84、アミノ酸配列を配列番号:85に示す。また、DF366のL鎖のCDR1の塩基配列を配列番号:86、アミノ酸配列を配列番号:87、CDR2の塩基配列を配列番号:88、アミノ酸配列を配列番号:89、CDR3の塩基配列を配列番号:90、アミノ酸配列を配列番号:91に示す。
DF151のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:45、アミノ酸配列を配列番号:46、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:47、アミノ酸配列を配列番号:48に示す。また、DF364のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:49、アミノ酸配列を配列番号:50、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:51、アミノ酸配列を配列番号:52に示す。また、DF366のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:92、アミノ酸配列を配列番号:93、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:94、アミノ酸配列を配列番号:95に示す。
DF151、DF364およびDF366の可変領域遺伝子配列が決定される際に、可変領域に隣接する定常領域の遺伝子配列も決定された。この配列と同じ配列を有する遺伝子をNational Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)のBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)を用いて検索することにより、定常領域の全域の塩基配列を得ることができる。得られた定常領域の塩基配列に可変領域塩基配列を結合することにより全長塩基配列を決定することができる。このようにしてDF151のH鎖定常領域の塩基配列(配列番号:53)、DF151、DF364およびDF366のL鎖定常領域の塩基配列(配列番号:54)、DF364およびDF366のH鎖定常領域の塩基配列(配列番号:55)から、それぞれマウスIgG2b塩基配列(DDBJ Accession#: BC025447)、マウスkappa light chain塩基配列(DDBJ Accession#: AY704179)、マウスIgG1塩基配列(DDBJ Accession#: BC057688)を得ることができる。
なお、DF151(マウスIgG2bκ)、DF364(マウスIgG1κ)およびDF366(マウスIgG1κ)のアイソタイプはIsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (ROCHE社)を用いて予め決定された。予想されるDF151のH鎖全長の塩基配列を配列番号:56、アミノ酸配列を配列番号:57、L鎖全長の塩基配列を配列番号:58、アミノ酸配列を配列番号:59に示す。また、予想されるDF364のH鎖全長の塩基配列を配列番号:60、アミノ酸配列を配列番号:61、L鎖全長の塩基配列を配列番号:62、アミノ酸配列を配列番号:63に示す。また、予想されるDF366のH鎖全長の塩基配列を配列番号:101、アミノ酸配列を配列番号:102、L鎖全長の塩基配列を配列番号:103、アミノ酸配列を配列番号:104に示す。また、DF151のH鎖定常領域の塩基配列を配列番号:7、アミノ酸配列を配列番号:8、L鎖定常領域の塩基配列を配列番号:17、アミノ酸配列を配列番号:18に示す。また、DF364およびDF366のH鎖定常領域の塩基配列を配列番号:27、アミノ酸配列を配列番号:28、L鎖定常領域の塩基配列を配列番号:35、アミノ酸配列を配列番号:36に示す。
各抗体のH鎖およびL鎖可変領域配列がヒトH鎖およびヒトL鎖定常領域配列にインフレームで連結された。H鎖可変領域をコードする塩基配列の5´末端にコザック配列の相補配列とEcoRI部位を有する合成オリゴヌクレオチド、および3´末端塩基配列に相補的であってその配列中にNheI部位を挿入した合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRが実施された。L鎖可変領域をコードする塩基配列の5´末端にコザック配列の相補配列とBamHI部位を有する合成オリゴヌクレオチド、および3´末端側塩基配列に相補的であってその配列中にBsiWI部位を有する合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRが実施された。得られたPCR産物が抗体発現プラスミドであるpMCDN_G1kにクローニングされた。pMCDN_G1kは、pMCDNベクターにヒトIgG1定常領域(塩基配列を配列番号:9、アミノ酸配列を配列番号:10に示す)がクローニングされており、NheI部位によりマウスH鎖可変領域とヒトH鎖(γ1鎖)定常領域が連結される構造を持つ。また、もう一つのmouse CMVプロモータを含む発現ユニット、及びヒトκ定常領域(塩基配列を配列番号:19、アミノ酸配列を配列番号:20に示す)が挿入されており、BsiWI部位によりマウスL鎖可変領域とヒトL鎖(κ鎖)定常領域が連結される構造を持つ。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、抗DSG3マウス−ヒトキメラ抗体遺伝子を発現する。
上記のように作成されたpMCDN_G1k_DF151、pMCDN_G1k_DF364及びpMCDN_G1k_DF366がDG44細胞へエレクトロポレーションにより導入された。500 μg/mL Geneticinでの選抜により、DF151マウス−ヒトキメラ抗体(以下、DF151cと称する)、DF364マウス−ヒトキメラ抗体(以下、DF364cと称する)及びDF366マウス−ヒトキメラ抗体(以下、DF366cと称する)を定常的に発現するCHO細胞が樹立された。次に、該CHO細胞の培養上清よりHi Trap rProtein Aカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を用いて抗DSG3マウス−ヒトキメラ抗体が精製された。精製抗体はPD-10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社)にてPBSバッファーにバッファー交換され、DC Protein Assayにより定量後、4℃で保管された。精製した抗DSG3マウス−ヒトキメラ抗体は、Flowcytometry解析によりマウス抗体と同様にDSG3に特異的に結合することが確認された。なお、DF151cのH鎖全長の塩基配列を配列番号:64、アミノ酸配列を配列番号:65、L鎖全長の塩基配列を配列番号:66、アミノ酸配列を配列番号:67に示す。また、DF364cのH鎖全長の塩基配列を配列番号:68、アミノ酸配列を配列番号:69、L鎖全長の塩基配列を配列番号:70、アミノ酸配列を配列番号:71に示す。また、DF366cのH鎖全長の塩基配列を配列番号:96、アミノ酸配列を配列番号:97、L鎖全長の塩基配列を配列番号:98、アミノ酸配列を配列番号:99に示す。
抗体のADCC活性を増強する方法としては、抗体の糖鎖を改変する方法が知られている。例えば、WO 99/54342には、抗体のグリコシル化を修飾することによりADCC活性を改良することが記載されている。また、WO 00/61739には、抗体の糖鎖におけるフコースの存否によりADCC活性を調節することが記載されている。WO 02/31140には、YB2/0細胞株において抗体を産生せしめることにより、α-1,6コアフコースを含まない糖鎖を有する抗体を調製することが記載されている。抗DSG3抗体が上記に挙げたADCC改良技術によりその活性が増強されるか検討された。まず、宿主細胞としてYB2/0細胞株(ATCCより購入)が10%FBSを含むRPMI1640培地にて培養された。実施例7で作製された抗DSG3マウス−ヒトキメラ抗体発現ベクターがYB2/0細胞株へエレクトロポレーション法で1.4 kV、25 μFの条件で導入された。500 μg/ml Geneticin での選抜により、低フコース型DF151マウス−ヒトキメラ抗体(以下、YB-DF151cと称する)、低フコース型DF364マウス−ヒトキメラ抗体(以下、YB-DF364cと称する)及び低フコース型DF366マウス−ヒトキメラ抗体(以下、YB-DF366cと称する)を定常的に発現するYB2/0細胞株が樹立された。次に、低フコース型抗DSG3マウス−ヒトキメラ抗体が培養上清よりHi Trap rProtein Aカラムを用いて精製された。精製抗体はPD-10カラムにてPBSバッファーにバッファー交換され、 DC Protein Assayにより定量後、4℃で保管された。精製された低フコース型抗DSG3マウス−ヒトキメラ抗体は、Flowcytometry解析により抗DSG3マウス−ヒトキメラ抗体と同様にDSG3に特異的に結合することが確認された。
9−1)全長ヒトDSG3を定常的に発現する細胞株の樹立
全長ヒトDSG3のcDNAが哺乳細胞発現用ベクター(pMCDN)にクローニングされた(pMCDN/hDSG3)。pMCDNは、mouse CMVプロモータ(ACCESSION No.U68299)下で誘導発現が可能で、ネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子が組み込まれたベクターである。pMCDN/hDSG3がBa/F3細胞(理化学研究所バイオリソースセンターより購入)へエレクトロポレーションにより導入され、500 μg/ml Geneticin(Invitrogen社)での選抜により、全長ヒトDSG3を定常的に発現するBa/F3細胞株(DSG3-Ba/F3)が樹立された。DSG3-Ba/F3細胞の培養には500 μg/ml Geneticin、penicillin/streptomycin(Invitrogen社)、recombinant mouse interleukin-3(R&D Systems社)、10% fetal bovine serum(Invitrogen社)を含むRPMI1640培地(Invitrogen社)が用いられた。
全長ヒトCD16(RefSeq ID、NM_000569)がpMCDNにクローニングされた後に、NK-92細胞(ATCCより購入)へエレクトロポレーションにより導入され、500 μg/ml Geneticinでの選抜により、全長ヒトCD16を定常的に発現するNK-92細胞株(CD16-NK92)が樹立された。CD16-NK92細胞株の培養には500 μg/ml Geneticin、penicillin/streptomycin、0.2 mM inositol(Sigma社)、0.1 mM 2-mercaptoethanol(Invitrogen社)、0.02 mM folic acid(Sigma社)、100 U/ml recombinant human interleukin-2(Peprotech社)、12.5% horse serum(Invitrogen社)、12.5% fetal bovine serumを含むAlpha minimum essential medium without ribonucleosides and deoxyribonucleosides with L-glutamine培地(Invitrogen社)が用いられた。
5×105細胞のDSG3-Ba/F3細胞懸濁液が遠心分離(1000 rpm、5分間、4℃)され、細胞ペレットが約200 μlの10% fetal bovine serum、penicillin/streptomycin及び3.7 MBqのChromium-51(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を含有するRPMI1640培地(以下、培地と称する)に懸濁され、5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて1時間培養された。この細胞が培地による3回の洗浄後、2×105細胞/mlに調製され、96ウェル丸底プレートの各ウェルに50 μlずつ添加された。次に、DF151c, DF364c及びDF366cおよびコントロールヒトIgG抗体(Zymed社)が各ウェル当たり50 μlずつ添加された。抗体は終濃度10 μg/mlとなるよう調製された。続いて、幼令ウサギ補体(Cederlane社)が培地にて5倍に希釈された後に100 μlずつ添加された。該プレートは5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて4時間静置された。培養後、該プレートは遠心分離(1000 rpm、5分間、4℃)され、上清100 μlの放射活性がガンマカウンター(1480 WIZARD 3"、Wallac社)にて測定された。下式に基づいて特異的クロム遊離率が決定された。
特異的クロム遊離率(%) = (A-C)×100/(B-C)
Aは各ウェルの放射活性(cpm)、Bは50 μlの細胞と150 μl の2% Nonidet P-40溶液(ナカライテスク社)を添加したウェルの放射活性(cpm)の平均値、Cは50 μlの細胞と150 μlの培地を添加したウェルの放射活性(cpm)の平均値を示す。試験はduplicateにて行われ、特異的クロム遊離率の平均値及び標準偏差が算出された。DF151c, DF364c及びDF366cがCDC活性を有することが示された(図8)。
DSG3-Ba/F3細胞がChromium-51で標識された後、96ウェル丸底プレートの各ウェル当たり50 μlずつ添加された。次に、DF364c, DF366c, YB-DF364c, YB-DF366cおよびコントロールヒトIgG抗体が各ウェル当たり50 μlずつ添加された。抗体の終濃度は1 μg/mlから公比10にて4段階の連続希釈により調製された。続いて、2×105細胞/mlのCD16-NK92細胞が各ウェル当たり100 μlずつ添加された。該プレートは5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて4時間静置された後、8−3)と同様の方法により特異的クロム遊離率が決定された。
いずれの抗体も抗体濃度依存的にADCC活性を示した(図9)。特に低フコース型抗体であるYB-DF364c及びYB-DF366cは強いADCC活性を示した。
DSG3が肺扁平上皮癌においてタンパクレベルで発現亢進していた(実施例2参照)。そこで新たに、皮膚癌、子宮癌、および肺癌の中でも罹患数の多い肺腺癌について、DSG3タンパク質の発現を確認するために、免疫組織染色解析を実施した。まず各検体より4% paraformaldehyde (PFA)またはperiodate-lysine-paraformaldehyde (PLP)固定AMeX包埋パラフィンブロック及び10% neutral buffer formaldehyde (NBF)固定パラフィン包埋ブロックを作製し、3 μmの薄切切片を作製した。脱パラフィン後これらの切片についてVentana HX Discovery System (Ventana Medical Systems, Inc., Arizona, USA)を用いて下記のように免疫組織化学的に染色した。各標本は脱パラフィン後に水洗を行い、内因性peroxidaseの除去のため、室温にて4分間3.0% hydrogen peroxide solution (Inhibitor D)で反応させた。洗浄後、非特異的反応の除去のためprotein blockを加え、室温にて30分間反応をさせた。次に、洗浄を行い、一次抗体としてマウス抗ヒトDesmoglein抗体(Clone 5G11, ZYMED Laboratories Inc., California, USA)を加え室温にて1時間反応させた。洗浄後二次抗体(Ventana Universal Secondary Antibody, Ventana Medical Systems) を加え、室温にて30分反応させた。洗浄後Blocker Dにて非特異的反応の除去のため室温で2分間反応をさせ、続いてstreptavidin horseradish peroxidase (SA-HRP, Ventana Medical Systems)を加え、37℃にて16分間反応させた。洗浄後 diaminobenzidine (DAB map solution, Ventana Medical Systems)とhydrogen peroxide solution (DAB map solution, Ventana Medical Systems)を混和させて加え、基質の発色のため37℃にて8分間反応をさせた。次にCopper sulfate solution (Ventana Medical Systems)にて発色の増感を行った。洗浄後ヘマトキシリンにて核染を行い、脱水、透徹、封入を行った。
その結果、肺扁平上皮癌では3例中2例、肺腺癌では9例中1例、皮膚扁平上皮癌では2例中2例、皮膚basal cell carcinomaでは1例中1例、子宮扁平上皮癌では1例中1例でDSG3の発現が確認された(表3)。
b) tissue type
c) grade of cancer (1, well-differentiated; 2, moderately-differentiated; 3, poorly-differentiated)
d) case number
e) 1, faint; 2, weak; 3, moderate; 4, strong
f) 1, rare (less than 10%); 2, occasional (10% and above, less than 50%); 3, frequent (50% and above, less than 90%); 4, constant (90% and above)
11−1) マウスIgG2aキメラDF366抗体(DF366m)の作製
DF366抗体のH鎖可変領域遺伝子の塩基配列をマウスIgG2aのH鎖定常領域遺伝子の塩基配列にインフレームで連結した。まず、H鎖可変領域遺伝子の5’末端塩基配列とコザック配列と制限酵素EcoRI配列を有するプライマー(配列番号:105)、および3’末端塩基配列の相補配列にc残基を付加したアンチセンスプライマー(配列番号:106)を用いてPCRを実施した。得られた増幅産物を制限酵素EcoRIで処理し、マウスIgG2aキメラH鎖発現プラスミド(pMCD/G2a)のEcoRI-NruIサイトに組み込むことによりマウスIgG2aキメラDF366抗体H鎖発現ベクターを構築した(pMCD/G2a-DF366)。pMCD/G2aは、哺乳細胞発現用プラスミドpMCDにマウスIgG2aのH鎖定常領域遺伝子(塩基配列: 配列番号:107、アミノ酸配列: 配列番号:108)がクローニングされており、H鎖可変領域にH鎖定常領域の制限酵素NruI配列が連結される。pMCDベクターは、mouse CMVプロモータ(ACCESSION No. U68299)による制御下で誘導発現が可能で、DHFR遺伝子が組み込まれたベクターである。
DF366抗体のL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をマウスIgG2aのL鎖(κ鎖)定常領域遺伝子の塩基配列にインフレームで連結した。まず、L鎖可変領域遺伝子の5’末端塩基配列とコザック配列と制限酵素EcoRI配列を有するプライマー(配列番号:109)、および3’末端塩基配列の相補配列にgcccg残基を付加したアンチセンスプライマー(配列番号:110)を用いてPCRを実施した。得られた増幅産物を制限酵素EcoRIで処理し、マウスIgG2aキメラL鎖(κ鎖)発現プラスミド(pMCN/k)のEcoRI-NruIサイトに組み込むことによりマウスIgG2aキメラDF366抗体L鎖発現ベクターを構築した(pMCN/k-DF366)。pMCN/kは、プラスミドpMCNにマウスIgG2aのL鎖(κ鎖)定常領域遺伝子(塩基配列: 配列番号:111、アミノ酸配列: 配列番号:112)がクローニングされており、L鎖可変領域にL鎖(κ鎖)定常領域の制限酵素NruI配列が連結される。
プラスミドpMCD/G2a-DF366およびプラスミドpMCN/k-DF366をDG44細胞へエレクトロポレーションにより導入した。500 μg/ml Geneticinおよび核酸(HT supplement)不含培地での選抜により、マウスIgG2aキメラDF366抗体(DF366m)を定常的に発現するCHO細胞(DF366m-DG44)を樹立した。次に、このDF366m-DG44の培養上清よりHi Trap ProteinG HPカラムを用いてDF366m抗体を精製した。PD-10カラムを用いて溶媒をPBSに置換した。精製したDF366m抗体の濃度はDC Protein Assay kitを用いて定量した。DF366m抗体は、フローサイトメトリー解析によりDF366抗体(実施例3−5に記載されている)と同様にDSG3に特異的に結合することを確認した。DF366m抗体のH鎖遺伝子全長の塩基配列を配列番号:113、アミノ酸配列を配列番号:114、L鎖遺伝子全長の塩基配列を配列番号:115、アミノ酸配列を配列番号:116に示す。
プラスミドpMCD/G2a-DF366およびプラスミドpMCN/k-DF366をフコーストランスポーターノックアウトCHO細胞(FTPKO-DXB11細胞、国際公開公報WO2006/067913、国際公開公報WO2006/067847)へエレクトロポレーションにより導入した。500 μg/ml Geneticinおよび核酸(HT supplement)不含培地での選抜により、低フコースマウスIgG2aキメラDF366抗体(低フコースDF366m)を定常的に発現するCHO細胞(DF366m-DXB11)を樹立した。次に、このDF366m-DXB11の培養上清よりHi Trap ProteinG HPカラムを用いて低フコースDF366m抗体を精製した。PD-10カラムを用いて溶媒をPBSに置換し、DC Protein Assay kitにより抗体濃度を定量した。
実験にはpenicillin/streptomycin、10% fetal bovine serumを含むRPMI1640培地(Invitrogen社) (以下、RPMI培地と称する)を用いた。DSG3-Ba/F3細胞1 x 106個を3.7 MBqのChromium-51 (GEヘルスケアバイオサイエンス社)を含む約200 μlのRPMI培地に懸濁した後に、5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて1時間培養した。洗浄後、細胞密度を2 x 105 cells/mlに調製し、96ウェルU底プレートに50 μlずつ分注した。次に、抗体溶液を各ウェルに50 μlずつ添加した。室温で15分間静置後、エフェクター細胞(後述)を100 μlずつ添加した。プレートは5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて6時間静置した。その後、各ウェルから上清を100 μlずつ回収し、ガンマカウンター (1480 WIZARD 3"、Wallac社)にて放射活性を測定した。下式に基づいて特異的クロム遊離率を算出した。
特異的クロム遊離率(%) = (A-C)×100/(B-C)
エフェクター細胞としてはC3Hマウス(日本チャールス・リバー社)から調製した脾臓細胞に50 ng/mlリコンビナントヒトinterleukin-2 (Peprotech社)を添加した細胞(以下、SPLと称する)、もしくは脾臓細胞を50 ng/mlリコンビナントヒトinterleukin-2存在下で4日間培養した細胞(以下、SPL-LAKと称する)を用いた。ウェルあたりのエフェクター細胞数は5 x 105個(SPL)もしくは2 x 105個(SPL-LAK)とした。陰性対照としてマウスIgG2a (Cat. No. 553453、Becton Dickinson社)およびヒトIgG1 (Cat. No. PHP010、Serotec社)を用いた。
pMCDN/hDSG3を制限酵素PvuIで消化した後FuGENE (Roche社)を用いたトランスフェクションによりSK-HEP-1細胞 (ATCCより購入)へ導入し、1 mg/ml Geneticinでの選抜により、全長ヒトDSG3を定常的に発現するSK-HEP-1細胞株(以下、DSG3-SKと称する)を樹立した。DSG3-SK細胞の培養には1 mg/ml Geneticin、10% fetal bovine serumを含むD-MEM培地(Sigma社)を用いた。
DSG3-SK細胞をD-MEM培地とMATRIGEL (Cat. No. 354234、BD Bioscience社)を1:1で含む溶液にて1 x 108 cell/mlに調製し、前日に抗アシアロGM1抗体100 μl (和光純薬社、1バイアルを1 mlの注射用蒸留水で溶解後、4 mlの生理的食塩水を添加)を腹腔内投与したSCIDマウス(メス、9週齢、日本クレア社)の腹部皮下へ100 μl移植した。移植後19日目よりDF366mおよび低フコースDF366mを週に一回、4週間、尾静脈より投与した。抗体はPBSにて1 mg/ml (10 mg/kg投与群)または0.2 mg/ml (2 mg/kg投与群)に調製し10 ml/kgにて投与した。陰性対照としてPBS (vehicle)を同様に投与した。1群5匹にて試験を行った。抗腫瘍活性は腫瘍体積で評価した。腫瘍体積は下式に基づいて測定し、平均値および標準偏差を算出した。
腫瘍体積=長径×短径×短径/2
有意差検定にはノンパラメトリックDunnett 型多重比較を用い、P値0.05未満を有意とした。
試験の結果DF366mおよび低フコースDF366mは10 mg/kg投与群でvehicle投与群に対して有意に腫瘍増殖を抑制した(図12)。また有意ではないものの低フコースDF366mは2 mg/kgでも抑制する傾向を示した。以上から抗DSG3抗体が抗腫瘍活性を示すことが確認された。
また、本願発明に係る細胞障害活性を有する抗DSG3抗体は、DSG3タンパク質を発現する肺癌、大腸癌、食道癌、胃癌、膵癌、皮膚癌又は子宮癌などの各種の癌細胞の細胞障害剤又は細胞増殖抑制剤として使用することができる。
加えて、本願発明に係る抗体をコードする遺伝子及び当該遺伝子により形質転換された組換え細胞は上記記載の効果、及びより好適な効果を奏する組換え抗体を作製するために使用することができる。
Claims (3)
- DSG3タンパク質に結合し、かつDSG3タンパク質を発現する細胞に対して細胞障害活性を有する、以下(1)から(21)のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド;
(1)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:6に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、並びに、CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:14に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:16に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(2)(1)に記載の抗体であって、CHとして配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載の抗体であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(4)(1)に記載の抗体であって、CLとして配列番号:18に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(5)(1)に記載の抗体であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(6)(2)に記載のH鎖、および(4)に記載のL鎖を含む抗体、
(7)(3)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(8)CDR1として配列番号:22に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:24に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:26に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、並びに、CDR1として配列番号:30に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:32に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:34に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(9)(8)に記載の抗体であって、CHとして配列番号:28に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(10)(8)に記載の抗体であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(11)(8)に記載の抗体であって、CLとして配列番号:36に記載のアミノ酸配列
を有するL鎖を含む抗体、
(12)(8)に記載の抗体であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(13)(9)に記載のH鎖、および(11)に記載のL鎖を含む抗体、
(14)(10)に記載のH鎖、および(12)に記載のL鎖を含む抗体、
(15)CDR1として配列番号:81に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:83に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号:85に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、並びに、CDR1として配列番号:87に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:89に記載のアミノ酸配列、CDR3として配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(16)(15)に記載の抗体であって、CHとして配列番号:28に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(17)(15)に記載の抗体であって、CHとして配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(18)(15)に記載の抗体であって、CLとして配列番号:36に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(19)(15)に記載の抗体であって、CLとして配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(20)(16)に記載のH鎖、および(18)に記載のL鎖を含む抗体、
(21)(17)に記載のH鎖、および(19)に記載のL鎖を含む抗体。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクター。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドにより形質転換された組換え細胞。
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