EA013563B1 - Трансгенное животное, продуцирующее антитела с измененными углеводными цепями, способ получения антител и содержащее антитела лекарственное средство - Google Patents

Трансгенное животное, продуцирующее антитела с измененными углеводными цепями, способ получения антител и содержащее антитела лекарственное средство Download PDF

Info

Publication number
EA013563B1
EA013563B1 EA200600469A EA200600469A EA013563B1 EA 013563 B1 EA013563 B1 EA 013563B1 EA 200600469 A EA200600469 A EA 200600469A EA 200600469 A EA200600469 A EA 200600469A EA 013563 B1 EA013563 B1 EA 013563B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
carbohydrate
antibodies
cells
fucose
Prior art date
Application number
EA200600469A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600469A1 (ru
Inventor
Ютака Канда
Мицуо Сатох
Казуясу Накамура
Казухиса Утида
Тоехиде Синкава
Наоко Ямане
Еми Хосака
Казуя Ямано
Мотоо Ямасаки
Нобуо Ханай
Original Assignee
Киова Хакко Кирин Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=18788817&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA013563(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. filed Critical Киова Хакко Кирин Ко., Лтд.
Publication of EA200600469A1 publication Critical patent/EA200600469A1/ru
Publication of EA013563B1 publication Critical patent/EA013563B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к трансгенному животному, не являющемуся человеком, или его потомству, содержащим ген, кодирующий молекулу антитела, и продуцирующим композицию антител с модифицированными сложными углеводными цепями. Указанная композиция антител обладает более высокой антителозависимой клеточной цитотоксичностью, чем антитело, полученное из родительской клеточной линии. Также изобретение относится к способу получения указанной композиции антител и лекарственному средству, содержащему указанную композицию антител.

Description

Настоящее изобретение относится к клеткам, продуцирующим молекулы антител, применимые при различных заболеваниях, фрагменты антител и слитые белки с Ес-областями антител или подобным, способу получения композиции антител с использованием таких клеток, композиции антител и ее применению.
Уровень техники
Так как антитела обладают высокой активностью связывания, специфичностью связывания и высокой устойчивостью в крови, предпринимаются попытки их применения для диагностики, профилактики и лечения различных болезней у людей [Мопос1опа1 ЛийЬоЛек: Ρπποίρίοδ апб Аррйсайопк, УПеу-Шк, 1пс., Сйар1ег 2.1 (1995)]. Также предпринимаются попытки получения гуманизированных антител, таких как человеческие химерные антитела или человеческие антитела с привитым гипервариабельным участком (называемым далее в описании СОК), из антител, полученных от животных, но не человека, используя методы генетической рекомбинации. Человеческое химерное антитело представляет собой антитело, в котором его вариабельная область (называемая далее в описании У-областью) образуется от антитела животного, но не человека, а его константная область (называемая далее в описании Собластью) образуется от человеческого антитела. Человеческое СЭК-привитое антитело представляет собой антитело, в котором СОК человеческого антитела заменена на СОК антитела, полученного от животного, но не человека.
Показано, что среди антител, полученных от млекопитающих, присутствуют пять классов антител, а именно 1дМ, 1дЭ, 1§С. 1дЛ и 1дЕ. Антитела класса человеческого 1дС используют, главным образом, для диагностики, профилактики и лечения различных болезней человека, поскольку они обладают функциональными характеристиками, такими как длительное время полужизни в крови, различными эффекторными функциями и т.п. [Мопос1опа1 АпИЬоб1е8: Рппс1р1е8 апб Аррйсайопк, УПеу-Шк, 1пс., Сйар1ег 1 (1995)]. Человеческие антитела класса 1дС далее подразделяются на следующие 4 подкласса: 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. До настоящего времени проводится большое число исследований по антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активности (далее называемой АЭСС-активностью) и комплементзависимой цитотоксической активности (далее называемой СЭС-активностью) как эффекторным функциям антител класса 1дС, и сообщается, что среди антител класса человеческого 1дС подкласс 1дС1 имеет наивысшую АЭСС-активность и СЭС-активность [Сйеш1са1 1тшипо1оду, 65, 88 (1997)]. В свете изложенного выше большинство противоопухолевых гуманизированных антител, включая коммерчески доступные ритуксан и герцептин, требующих высоких эффекторных функций для проявления своего действия, являются антителами подкласса человеческого 1дС1.
Проявление АЭСС-активности и СЭС-активности антител подкласса человеческого 1дС 1 требует связывания Ес-области антитела с рецептором антитела, существующим на поверхности эффекторной клетки, такой как киллерная клетка, натуральная киллерная клетка, активированный макрофаг или подобная клетка (называемая далее ЕсуК), и связываются различные компоненты комплемента. Что касается связывания, предполагается, что важными являются некоторые аминокислотные остатки в шарнирной области и второй домен С-области (называемый далее Су2-доменом) антитела [Еиг. 1. 1ттипо1оду, 23, 1098 (1993), 1ттипо1оду, 86, 319 (1995), Сйет1са1 1ттипо1оду, 65, 88 (1997)] и что связывание цепи сахаров с Су2-доменом [Сйет1са1 1ттипо1оду, 65, 88 (1997)] также является важным.
Что касается углеводной цепи, то Воуаб е! а1. проверили влияние углеводной цепи на АЭССактивность и СЭС-активность, обрабатывая человеческие СЭК-привитые антитела САМРАТН-1Н (подкласс человеческого 1§С1), продуцированные клетками яичника китайского хомячка (клетки СНО) или клетками миеломы мыши N80 (клетки N80), различными ферментами, гидролизующими сахара, и сообщили, что удаление салициловой кислоты нередуцирующего конца не оказывает влияния на обе активности, но на одну СЭС-активность влияет дополнительное удаление галактозного остатка, и активность снижается примерно на 50%, и что полное удаление углеводной цепи вызывает исчезновение обеих активностей [Мо1еси1аг 1тшипо1оду, 32, 1311 (1995)]. Ь1£е1у е! а1. также анализировали углеводные цепи, связанные с СЭК-привитыми антителами САМРАТН-1Н (подкласс человеческого 1§С1), продуцированными клетками СНО, клетками N80 или клетками миеломы крысы ΥΟ, измеряли их АЭСС-активность и сообщили, что САМРАТН-1Н, продуцированные клетками ΥΟ, показывают наивысшую АЭССактивность, причем приходят к мысли, что для такой активности важен Ν-ацетилглюкозамин (далее называемый в данном описании также С1сNАс) в позиции посередине [С1усоЬю1оду, 5, 813 (1995); УО 99/54342]. Такие сообщения показывают, что строение углеводной цепи играет важную роль в эффекторных функциях человеческих антител подкласса 1дС1 и что возможно получение антител с более высокой эффекторной функцией путем изменения строения углеводной цепи. Однако в действительности структуры углеводных цепей разнообразные и сложные и нельзя сказать, что идентифицирована структура, действительно важная для эффекторной функции.
Углеводные цепи гликопротеинов на основании формы связывания с белковой группой грубо подразделяют на два типа, а именно углеводные цепи, которые связываются с аспарагином (углеводные цепи, присоединенные через Ν-гликозидные связи), и углеводные цепи, которые связываются с другими
- 1 013563 аминокислотами, такими как серин, треонин (углеводные цепи, присоединенные через О-гликозидные связи). Углеводные цепи, присоединенные через Ν-гликозидные связи, имеют различное строение [ΒΐοсКеписа! Ехрепшеп1а1юп Ме11юс1 23 - Ме11юс1 Гог ΉικΙνιιιμ О1усорго1ет Зидаг СКат (СакщШзи Зйиррап Сеп1ег), ес1Иес1 Ъу Ке1ко ТакаказЫ (1989)], но известно, что они имеют обычную основную коровую структуру, показанную приведенной далее структурной формулой (I)
Мапа1
Мал а 1
^46ΙοΝΑο01
Структурная формула (1)
Конец углеводной цепи, который связывается с аспарагином, называют редуцирующим концом, а противоположный - нередуцирующим концом. Известно, что углеводная цепь, присоединяемая через Νгликозидную связь, относится к чисто выраженному маннозному типу, в котором только манноза связывается с нередуцирующим концом коровой структуры; комплексному типу, в котором со стороны нередуцирующего конца коровой структуры имеется по меньшей мере одна боковая цепь галактозо-Νацетилглюкозамина (называемого далее Θа1-Θ1сNΑс), и сторона нередуцирующего конца Θа1-Θ1сNΑс имеет структуру сиаловой кислоты, срединного Ν-ацетилглюкозамина или подобную структуру; гибридному типу, в котором со стороны нередуцирующего конца коровой структуры имеются ветвления как чисто маннозного типа, так и комплексного типа; и т.п.
В Ес-области антитела типа 1μ6 присутствуют два сайта связывания углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. В сывороточном 1дО к сайту связывания углеводной цепи, как правило, присоединяется цепь сахаров комплексного типа со множеством ветвлений, в которой содержание сиаловой кислоты или срединного Ν-ацетилглюкозамина низкое. Известно, что существуют различные точки зрения на присоединение галактозы к нередуцирующему концу углеводной цепи комплексного типа и присоединение фукозы к Ν-ацетилглюкозамину на редуцирующем конце [Вюсйешшйу, 36, 130 (1997)].
Предполагается, что такая структура углеводной цепи определяется генами углеводной цепи, а именно геном гликозилтрансферазы, синтезирующей углеводную цепь, и геном гликолитического фермента, гидролизующего углеводную цепь.
Синтез углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, описывается ниже.
Гликопротеины модифицируются углеводной цепью в просвете эндоплазматического ретикулума (далее называемого ЕК). Во время стадии биосинтеза углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, относительно большая углеводная цепь переносится к полипептидной цепи, которая наращивается в просвете ЕК. При трансформации углеводная цепь сначала присоединяется последовательно к фосфатным группам длинноцепного липидного носителя, содержащего примерно 20 аизопреновых звеньев, который называют долихолфосфатом (далее в данном описании также называется Ρ-Όο1). Иными словами, Ν-ацетилглюкозамин переносится к долихолфосфату, образуя таким образом ΘΚΝΑ^Ρ-Ρ-Όο1, и затем переносится еще один Θ1сNΑс с образованием Θ1сNΑс-Θ1сNΑс-Ρ-Ρ-^ο1. Затем переносятся пять манноз (далее манноза также называется Мап) с образованием посредством этого (Маη)5-(Θ1сNΑс)2-Ρ-Ρ-^ο1, и затем переносятся четыре Мап и три глюкозы (далее глюкоза также называется С1с). Таким образом, формируется предшественник углеводной цепи (Θ1с)3-(Маη)9-(Θ1сNΑс)2-Ρ-ΡΌο1, называемый коровым олигосахаридом. Предшественник углеводной цепи, содержащий 14 сахаров, переносится как масса к полипептиду с последовательностью аспарагин-Х-серин или аспарагин-Хтреонин в просвете ЕК. При реакции высвобождается долихолфосфат (Ρ-Ρ-Όο1), связанный с коровым олигосахаридом, но снова становится долихолфосфатом при гидролизе пирофосфатазой и возвращается в цикл. Подгонка углеводной цепи начинается сразу же после присодинения углеводной цепи к полипептиду. Т.е. удаляются 3 С1с и 1 или 2 Мап на ЕК и известно, что к удалению имеют отношение а-1,2глюкозидаза I, а-1,3-глюкозидаза II и а-1,2-маннозидаза.
Гликопротеин, подвергшийся подгонке на ЕК, переносится к комплексу Гольджи и модифицируется различным образом. В цис-части комплекса Гольджи присутствуют Ν-ацетилглюкозаминфосфотрансфераза, имеющая отношение к присоединению маннозафосфата, Ν-ацетилглюкозамин-Е фосфодиэфир-а-И-ацетилглюкозаминидаза и α-маннозидаза I и снижают число остатков Мап до 5. В средней части комплекса Гольджи присутствуют Ν-ацетилглюкозаминтрансфераза I (СпТТ), имеющая отношение к присоединению первого внешнего Θ1сNΑс присоединяемой через Ν-гликозидную связь углеводной цепи комплексного типа, α-маннозидаза II, имеющая отношение к удалению 2 Мап, Νацетилглюкозаминтрансфераза II (СпТП), имеющая отношение к присоединению второго Θ1сNΑс с внешней стороны, и а-1,6-фукозилтрансфераза, имеющая отношение к присоединению фукозы к редуцирующему концу Ν-ацетилглюкозамина. В транс-части комплекса Гольджи присутствует галактозотрансфераза, имеющая отношение к присоединению сиаловой кислоты, такой как Ν
- 2 013563 ацетилнейраминовая кислота, или подобной кислоты. Известно, что присоединенная через Νгликозидную связь углеводная цепь формируется за счет активностей таких различных ферментов.
Вообще, большинство гуманизированных антител, для которых рассматривается применение в лекарственных средствах, получают с использованием методов генной рекомбинации, и их получают с использованием в качестве клеток-хозяев клеток СНО, происходящих из тканей яичника китайского хомячка. Но, как описано выше, так как строение углеводной цепи играет весьма важную роль в эффекторной функции антител, и наблюдаются различия в структуре углеводной цепи гликопротеинов, экспрессированных клетками-хозяевами, желательна разработка клетки-хозяина, которую можно использовать для продукции антител с более высокой эффекторной функцией.
Для того чтобы модифицировать структуру углеводной цепи полученного гликопротеина, предприняты попытки использовать различные способы, такие как 1) применение ингибитора против фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, 2) отбор мутанта, 3) введение гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, и подобные способы. Конкретные примеры приводятся ниже.
Примерами ингибитора против фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, являются туникамицин, селективно ингибирующий образование ΟΙοΝΛο-Ρ-Ρ-ΟοΙ. что является первой стадией образования корового олигосахарида, являющегося предшественником присоединенной через Νгликозидную связь углеводной цепи, кастаноспермин и Ν-метилН-дезоксинойиримицин, представляющие собой ингибиторы гликозидазы I, бромкондулит, являющийся ингибитором гликозидазы II, 1дезоксинойиримицин и 1,4-диокси-1,4-имино-О-маннит, являющиеся ингибиторами маннозидазы I, свайнсонин, являющийся ингибитором маннозидазы II, и подобные соединения. Примерами ингибиторов, специфических для гликозилтрансферазы, являются дезоксипроизводные субстратов против Νацетилглюкозаминтрансферазы V (СпТУ), и подобные соединения [С1усоЫо1оду 8епе5 2 - Иекйпу οί 8идат Сйаш ίη Се11 (Кобапкйа 8аеп!Шс), ебйеб Ьу Ка!§и!ака 8епе1нго Накотап апб Акйа КоЬа!а (1993)]. Также известно, что 1-дезоксинойиримицин ингибирует синтез углеводной цепи комплексного типа и повышает соотношение углеводных цепей чисто маннозного типа и гибридного типа. Действительно, сообщается, что изменили структуру углеводной цепи ^С, и изменились свойства, такие как антигенсвязывающая активность и подобные, когда в среду добавили ингибиторы [Мо1еси1аг !ттипо1., 26, 1113 (1989)].
Мутанты в связи с активностью фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, главным образом отбирают и получают в виде лектинневосприимчивой клеточной линии. Например, мутанты клеток СНО с различными структурами углеводной цепи получают как лектинневосприимчивую клеточную линию с использованием такого лектина, как \УСА (агглютинин зерна пшеницы, полученный из Т. уи1дат15), СопА (конканавалин А, полученный из С. еп511огт15), К1С (токсин, полученный из К. соттишк), Ь-РНА (лейкоагглютинин, полученный из Р. уи1дат15), ЬСА (лентилагглютинин, полученный из Ь. сийпапк), Р8А (лектин гороха, полученный из Р. кайуит), или подобного [8ота!ю Се11 Мо1. Сепе!., 12, 51 (1986)].
Примером модификации структуры углеводной цепи продукта, полученного введением в клеткухозяина гена фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, является сообщение о том, что белок, в котором к нередуцирующему концу углеводной цепи присоединено некоторое количество сиаловой кислоты, можно получить путем введения крысиной в-галактозид-а-2,6сиалилтрансферазы в клетку СНО [1. Бю1. С1ет., 261, 13848 (1989)].
Также подтверждается, что Н-антиген (Риса1-2Са1в1-), в котором фукоза (называемая далее также Рис) присоединена к нередуцирующему концу углеводной цепи, экспрессируется путем введения человеческой в-галактозид-2-а-фукозилтрансферазы в мышиную Ь-клетку [8с1епсе, 252, 1668 (1991)]. Кроме того, на основывании знаний о том, что присоединение расположенного посередине Νацетилглюкозамина углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, важно для АЭССактивности, Итапа е! а1. получили клетки СНО, экспрессирующие в-1,4-№ацетилглюкозаминтрансферазу III (СпТШ), и сравнили их с родительской клеточной линией на экспрессию СпТШ.
Подтвердилось, что экспрессии СпТШ не отмечается в родительской клеточной линии клеток СНО [1. Бю1. С1ет., 261, 13370 (1984)] и что антитела, экспрессированные с использованием полученных экспрессирующих СпТШ клеток СНО, имеют АЭСС-активность в 16 раз более высокую, чем антитела, экспрессированные с использованием родительской клеточной линии [С1усоЬю1оду, 5, 813 (1995); XVО 99/54342]. В то же время Итапа е! а1. также получили клетки СНО, в которые введена β-1,4-Νацетилглюкозаминтрансфераза V (СпЕУ), и сообщили, что избыточная экспрессия СпТШ или Сп^ показывает токсичность для клеток СНО.
Описание изобретения
Таким образом, для того чтобы модифицировать структуру углеводной цепи гликопротеина, который получают, предпринята попытка регулирования активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи в клетке-хозяине, но в действительности структуры углеводных цепей разнообразные и сложные, и определение физиологических ролей углеводных цепей может быть недоста
- 3 013563 точным, так что испытания и ошибки повторяются. В частности, хотя понемногу обнаруживается, что на эффекторную функцию антител в значительной степени влияет структура углеводной цепи, действительно важная структура углеводной цепи пока не конкретизирована. Соответственно, для разработки лечебных средств ожидается идентификация углеводной цепи, влияющей на эффекторную функцию антител, и разработка клетки-хозяина, к которой можно добавлять такую углеводную цепь.
Целью настоящего изобретения является клетка-хозяин, которая продуцирует композицию антител и может регулировать структуру углеводной цепи, связанной с молекулой антитела, клетка, которая может продуцировать композицию антител с высокой ЛОСС-активностью, способ получения композиции антител с использованием таких клеток, и композиция антител, полученная таким способом получения. Настоящее изобретение относится к изложенному далее в разделах (1)-(14).
(1) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство, содержащие ген, кодирующий молекулу антитела, и продуцирующие композицию антител со сложными углеводными цепями, присоединенными через Ν-гликозидные связи к Ре-области, где в композиции среди всех углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи к Рс-области, доля цепей, в которых фукоза по первому положению не связана посредством α-связи с Νацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, составляет 20% или более, причем указанная композиция антител обладает более высокой антителозависимой клеточной цитотоксичностью, чем антитело, полученное из родительской клеточной линии, а геном животного или его потомства модифицирован таким образом, что активность фермента, ответственного за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, и/или активность фермента, ответственного за модификацию углеводных цепей, в которых фукоза по первому положению связана посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, уменьшена.
(2) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (1), в котором «нокаутирован» ген, кодирующий фермент, ответственный за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, и/или ген, кодирующий фермент, ответственный за модификацию углеводных цепей, в которых фукоза по первому положению связана посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь.
(3) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (1) или (2), в котором фермент, ответственный за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, представляет собой фермент, выбранный из группы, включающей:
(a) ΟΜΌ (СПР-маннозо-4,6-дегидратаза);
(b) Рх (СПР-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимераза,4-редуктаза);
(c) СРРР (ΟΌΡ-бета-Ь-фукозопирофосфорилаза).
(4) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (3), где ΟΜΌ представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, включающей:
(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ:65;
(b) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ:65, и кодирующую белок, обладающий ΟΜΌ-активностью.
(5) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (3), где Рх представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, включающей:
(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ:48;
(b) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ:48, и кодирующую белок, обладающий Рх-активностью.
(6) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (3), где ΟРΡΡ представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, включающей:
(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ:51;
(b) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ:51, и кодирующую белок, обладающий ΟРΡΡ-активностью.
(7) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (1) или (2), где фермент, ответственный за модификацию углеводных цепей, в которых фукоза по первому положению связана посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, представляет собой α-1,6фукозилтрансферазу.
(8) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (7), где α-1,6фукозилтрансфераза кодируется ДНК, выбранной из группы, включающей:
(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ:1;
(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ:2;
(c) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последователь
- 4 013563 ность 8ЕО Ш N0:1, и кодирующую белок, обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(ά) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8Е0 Ш N0:2, и кодирующую белок, обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью.
(9) Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство согласно (1)-(8), где трансгенное животное, не являющееся человеком, представляет собой животное, выбранное из группы, включающей крупный рогатый скот, овец, коз, свиней, лошадей, мышей, крыс, домашнюю птицу, обезьян и кроликов.
(10) Способ получения композиции антител со сложными углеводными цепями, присоединенными через Ν-гликозидные связи к Те-области, где в композиции среди всех углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи к Те-области, доля цепей, в которых фукоза по первому положению не связана посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, составляет 20% или более, причем указанная композиция антител обладает более высокой антителозависимой клеточной цитотоксичностью, чем антитело, полученное из родительской клеточной линии, который предусматривает выращивание трансгенного животного по согласно (1)(9), получение из выращенного животного или растения ткани или биологической жидкости, содержащей указанную композицию антител, и выделение композиции антител из полученной ткани или биологической жидкости.
(11) Способ согласно (10), где молекула антитела принадлежит классу 1дС.
(12) Композиция антител, полученная с использованием способа согласно (10) или (11).
(13) Лекарственное средство, обладающее высокой антителозависимой клеточной цитотоксичностью, содержащее в качестве активного ингредиента композицию антител согласно (12).
(14) Лекарственное средство согласно (13), где лекарственное средство является диагностическим лекарственным средством, профилактическим лекарственным средством или лечебным лекарственным средством против болезней, связанных с опухолями, болезней, связанных с аллергией, болезней, связанных с воспалением, аутоиммунных заболеваний, болезней органов кровообращения, болезней, связанных с вирусными инфекциями, или болезней, связанных с бактериальными инфекциями.
Клетка СН0 ткани яичника китайского хомячка, в которую согласно настоящему изобретению введен ген, кодирующий молекулу антитела, может представлять собой любую клетку СН0 до тех пор, пока она является клеткой СН0, полученной из ткани яичника китайского хомячка, в которую введен ген, кодирующий молекулу антитела, продуцирующую композицию антител, содержащих сложные углеводные цепи, присоединенные через Ν-гликозидную связь, связанные с Те-областью молекулы антитела, где среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидную связь, связанных с Тсобластью, в композиции доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет 20% или более.
В настоящем изобретении молекула антитела является любой молекулой до тех пор, пока она содержит Тс-область антитела. Примерами являются антитело, фрагмент антитела, слитый белок, содержащий Тс-область, и т. п.
Антитело представляет собой белок, продуцируемый в живом организме путем иммунной реакции как результат экзогенной стимуляции антигена, и обладает активностью специфического связывания с антигеном. Примерами антител являются антитела, секретируемые гибридомными клетками, полученными из клеток селезенки животного, иммунизированного антигеном; антитела, полученные методом генетической рекомбинации, а именно антитела, полученные введением в клетку-хозяина экспрессирующего вектора антитела со встроенным геном антитела; и т.п. Конкретными примерами являются антитела, продуцируемые гибридомами, гуманизированные антитела, человеческие антитела и т. п.
Гибридома представляет собой клетку, полученную слиянием В-клетки, полученной иммунизацией антигеном млекопитающего, но не человека, и миелоидной клетки, полученной от мыши, или подобной клетки, которая может продуцировать моноклональные антитела с нужной антигенной специфичностью.
Примерами гуманизированного антитела являются человеческое химерное антитело, человеческое антитело с привитым СЭЯ и т.п.
Человеческое химерное антитело представляет собой антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи антитела (называемую далее НУ или УН, причем тяжелая цепь является Н-цепью) и вариабельную область легкой цепи антитела (называемую далее ЬУ или УЪ, причем легкая цепь является Ь-цепью), обе от животного, но не человека, константную область тяжелой цепи человеческого антитела (также называемую далее СН) и константную область легкой цепи человеческого антитела (также называемую далее СЬ). В качестве животного, но не человека, можно использовать любое животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик или подобное, до тех пор, пока от него можно получить гибридому.
Человеческое химерное антитело можно получить, получая кДНК, кодирующие УН и УЪ, из гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела, встраивая их в экспрессирующий вектор для клетки-хозяина, имеющей гены, кодирующие СН человеческого антитела и СЬ человеческого антитела, чтобы посредством этого сконструировать экспрессирующий вектор человеческого химерного антитела, и
- 5 013563 затем вводя вектор в клетку-хозяина для экспрессии антител.
В качестве СН человеческого химерного антитела можно использовать любую СН до тех пор, пока она принадлежит к человеческому иммуноглобулину (обозначаемому далее Ыд). Но предпочтительны СН, принадлежащие к классу МдС, и можно использовать любой подкласс, принадлежащий к классу МдС, такой как МдС1, МдС2, МдС3 и МдС4. Также в качестве СЬ человеческого химерного антитела можно использовать любую СЬ до тех пор, пока она принадлежит к классу Ыд, и также можно использовать СЬ, принадлежащие к классу к или классу λ.
Человеческое антитело с привитым СЭЯ представляет собой антитело, в котором аминокислотные последовательности СЭЯ УН и УЬ антитела, полученного от животного, но не человека, привиты в соответствующих позициях УН и УЪ человеческого антитела.
Человеческое антитело с привитым СЭЯ можно получить путем конструирования кДНК, кодирующих У-области, в которых СЭЯ УН и УЬ антитела, полученного от животного, но не человека, привиты в СЭЯ УН и УЬ человеческого антитела, встраивания их в экспрессирующий вектор для клеткихозяина, имеющей гены, кодирующие СН человеческого антитела и СЬ человеческого антитела, чтобы посредством этого сконструировать экспрессирующий вектор человеческого СЭЯ-привитого антитела, и последующего введения вектора в клетку-хозяина для эксперссии человеческих СЭЯ-привитых антител.
В качестве СН человеческого антитела с привитым СЭЯ можно использовать любую СН до тех пор, пока она принадлежит к классу Ыд, но предпочтительны СН класса ЫдС, и можно использовать любой подкласс, принадлежащий к классу ЫдС, такой как ЫдС1, ЫдС2, ЫдС3 и ЫдС4. Также в качестве СЬ человеческого СЭЯ-привитого антитела можно использовать любую СЬ до тех пор, пока она принадлежит к классу Ыд, и также можно использовать СЬ, принадлежащие к классу к или классу λ.
Человеческое антитело по происхождению является природным антителом, существующим в организме человека, но к нему также относятся антитела, полученные из фаговой библиотеки человеческих антител, человеческие антитела, продуцируемые трансгенным животным, и человеческие антитела, продуцируемые трансгенным растением, которые получают, основываясь на последних достижениях генной инженерии, клеточной инженерии и развитии методов инженерии.
Что касается антител, существующих в организме человека, то можно культивировать лимфоциты, способные продуцировать антитела, путем выделения лимфоцитов периферийной крови человека, иммортализации их путем заражения вирусом ЕВ или подобным и последующего клонирования, и можно выделить антитела из культуры в чистом виде.
Фаговая библиотека человеческих антител представляет собой библиотеку, в которой фрагменты антител, такие как ЕаЬ, одноцепочечные антитела и подобные экспрессируются на поверхности фага путем встраивания гена, кодирующего антитело, полученное из В-клетки человека, в фаговый ген. Фаги, экспрессирующие фрагменты антител с нужной антигенсвязывающей активностью, можно выделить из библиотеки, используя их активность в отношении связывания с антигениммобилизованным субстратом в качестве маркера. Затем методами генной инженерии фрагмент антитела можно превратить в молекулу человеческого антитела, содержащую две полные Н-цепи и две полные Ь-цепи.
Трансгенное животное, не являющееся человеком, продуцирующее человеческие антитела, представляет собой животное, в клетки которого введен ген человеческого антитела. Конкретно, трансгенное животное, продуцирующее человеческие антитела, можно получить путем введения гена человеческого антитела в клетки Е8 мыши, трансплантированием клеток Е8 в эмбрион на ранней стадии развития другой мыши и последующего его выращивания. Трансгенное животное также можно получить путем введения гена человеческого химерного антитела в оплодотворенную яйцеклетку и выращивания ее. Что касается способа получения человеческих антител от трансгенного животного, продуцирующего человеческие антитела, то человеческие антитела можно получать и накапливать в культуре посредством получения продуцирующих человеческие антитела гибридом методом получения гибридом, осуществляемым, как правило, на млекопитающих, не являющихся людьми, и последующего их культивирования.
Примеры трансгенных не являющихся людьми животных являются крупный рогатый скот, овцы, козы, свиньи, лошади, мыши, крысы, домашняя птица, обезьяны, кролики и т.п.
В настоящем изобретении также предпочтительно, что антитело представляет собой антитело, узнающее связанный с опухолью антиген, антитело, узнающее антиген, связанный с аллергией или воспалением, антитело, узнающее антиген, связанный с аутоиммунным заболеванием, или антитело, узнающее антиген, связанный с вирусной или бактериальной инфекцией, и предпочтительно человеческое антитело, принадлежащее к классу 1дС.
Фрагмент антитела представляет собой фрагмент, содержащий Ее-область антитела. Примерами фрагмента антитела являются мономер Н-цепи, димер Н-цепи и т. п.
Слитый белок, содержащий Ес-область, представляет собой композицию, в которой антитело, содержащее Ес-область антитела или фрагмент антитела, слито с белком, таким как фермент, цитокин или подобный белок.
В настоящем изобретении примером углеводной цепи, связывающейся с Ес-областью молекулы антитела, является углеводная цепь, присоединенная через Ν-гликозидную связь. Примерами углеводной
- 6 013563 цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, является цепь комплексного типа, в которой со стороны нередуцирующего конца коровой структуры имеется одно или несколько параллельных ветвлений галактозо-Ы-ацетилглюкозамина (называемого далее ΟαΙ-ΟΙοΝΑο”). и со стороны нередуцирующего конца 6α1-61οΝΑο имеется такая структура, как сиаловая кислота, расположенный посередине Νацетилглюкозамин или подобная структура.
В одном из вариантов антитела Ре-область имеет позиции, с которыми связывается углеводная цепь, присоединенная через Ν-гликозидную связь, что будет описано далее. Соответственно, связываются две углеводные цепи на одну молекулу антитела. Так как углеводная цепь, присоединенная через Νгликозидную связь, связывающаяся с антителом, включает любую углеводную цепь, имеющую коровую структуру, представленную структурной формулой (I), возможен ряд комбинаций углеводных цепей для двух углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидную связь, которые связываются с молекулой антитела. Соответственно, идентичность веществ можно установить с точки зрения углеводной структуры, связанной с Рс-областью.
В настоящем изобретении композиция, содержащая молекулы антитела, имеющего в Рс-области сложные углеводные цепи, присоединенные через Ν-гликозидные связи (называемая далее композиция антител настоящего изобретения), может содержать антитела с одной и той же структурой углеводной цепи или антитела с разными структурами углеводных цепей до тех пор, пока от композиции получают эффект настоящего изобретения.
В настоящем изобретении доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Νацетилглюкозамином на редуцирующем конце углеводной цепи, среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи, соединенных с Рс-областью, содержащихся в композиции антител, представляет собой отношение числа углеводных цепей, в которых фукоза не связана с Νацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, к общему числу сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи, соединенных с Рс-областью, содержащихся в композиции.
В настоящем изобретении углеводная цепь, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, представляет собой углеводную цепь, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином через α-связь на редуцирующем конце углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примером является сложная углеводная цепь, присоединенная через Ν-гликозидную связь, в которой положение 1 фукозы не связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина.
Композиция антител показывает высокую АЭСС-активность, когда доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи, соединяющихся с Рсобластью, содержащихся в композиции антител настоящего изобретения, составляет предпочтительно 20% или более, предпочтительнее 25% или более, еще предпочтительнее 30% или более, более предпочтительно 40% или более и наиболее предпочтительно 50% или более. Когда концентрация антител снижается, снижается АЭСС-активность, но высокую АЭСС-активность можно получить даже в том случае, когда концентрация антител низкая, до тех пор, пока доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет 20% или более.
Долю углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, содержащейся в композиции, которая содержит молекулу антитела, имеющую в Рс-области сложные углеводные цепи, присоединенные через Ν-гликозидные связи, можно определить, высвобождая углеводную цепь из молекулы антитела с использованием известного способа, такого как гидразинолиз, ферментативное расщепление или подобный способ [ВюсЬст1са1 ЕхрсптсШабоп МсИобе 23 - Мс11юб Гог 81ибутд С1усорго1ст 8идаг СЬаш (1арап 8с1сп11Пс 8ос1с11се Ргсее), сб11сб Ьу Рс1ко ТакаЬаеЫ (1989)], помечая флуоресцентной меткой или радиоизотопом высвобожденную углеводную цепь и затем выделяя помеченную углеводную цепь хроматографией. Высвобожденную углеводную цепь также можно установить, анализируя ее методом НРАЕЭ-РАЭ [1. Εις. С1гота1одг., 6, 1557 (1983)].
В настоящем изобретении клетка СНО, полученная из ткани яичников китайского хомячка, включает любую клетку, которая представляет собой клеточную линию, полученную из ткани яичников китайского хомячка (Спссибие дпесие). Примерами являются клетки СНО, описанные в таких публикациях, как 1ошпа1 оГ Ехрсптсп1а1 Мсбюшс, 108, 945 (1958); Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А, 60, 1275 (1968); Сспсбсе, 55, 513 (1968); Сйготоеота, 41, 129 (1973); МсИобе ίη Сс11 8с1спсс, 18, 115 (1996); К.аб1а1юп К.сесагсЬ, 148, 260 (1997); Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А, 77, 4216 (1980); Сс11, 6, 121 (1975); Мо1сси1аг Сс11 Сспсбсе, Аррспб1х I, II (рр. 883-900); и т.п. Кроме того, в качестве примеров можно также назвать СНО-К1 (АТСС ССЬ-61), ЭИХВ11 (АТСС ССЬ-9096) и Рго-5 (АТСС ССЬ-1781), зарегистрированные в АТСС (Американская коллекция типовых культур), и коммерчески доступные СНО-8 (Ьбс ТссЬпо1од1с5, кат. № 11619) или клеточные сублинии, полученные адаптацией клеток с использованием различных сред.
В настоящем изобретении фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы, может представлять собой любой фермент до тех пор, пока он представляет
- 7 013563 собой фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, как источник поставки фукозы для углеводной цепи. Фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, представляет собой фермент, влияющий на синтез внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы.
Внутриклеточный углеводонуклеотид ΟΌΡ-фукоза поставляется каскадом реакций синтеза бе ηονο или каскадом реакций реутилизационного синтеза. Таким образом, все ферменты, имеющие отношение к таким каскадам реакций синтеза, относятся к ферментам, имеющим отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы.
Примерами фермента, имеющего отношение к каскаду реакций синтеза бе ηονο внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, являются ^^Ρ-маннозо-4,6-дегидратаза (далее называемая ΟΜΌ), ^ΌΡ-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимеразо-4,6-редуктаза (далее называемая Рх) и подобные ферменты.
Примерами фермента, имеющего отношение к каскаду реакций реутилизационного синтеза внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, являются ΟΌΡ-бета-Ь-фукозопирофосфорилаза (далее называемая 6ΡΡΡ), фукокиназа и подобные ферменты.
К ферментам, влияющим на синтез внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, также относятся фермент, влияющий на активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, и фермент, влияющий на структуру веществ как субстратов фермента. В настоящем изобретении примерами ΟΜΌ являются белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕО ΙΌ N0:65;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:65, и кодирующая белок, обладающий ΟΜΌ-активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:71;
(б) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:71, и обладающий ΟΜΌ-активностью;
(е) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 ΙΌ N0:71, и обладающий 0ΜΌактивностью, и подобные белки.
Также примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность 0ΜΌ, являются ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:65, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:65, и кодирующая аминокислотную последовательность с ΟΜΌ-активностью.
В настоящем изобретении примерами Рх являются белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:48;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:48, и кодирующая белок, обладающий Рх-активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:72;
(б) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:72, и обладающий Рх-активностью;
(е) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 ΙΌ N0:72, и обладающий Рхактивностью, и подобные белки.
Также примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность Рх, являются ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:48, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:48, и кодирующая аминокислотную последовательность с Рх-активностью.
В настоящем изобретении примерами ΟΕΡΡ являются белок, кодированный ДНК из числа приведенных далее (а) или (Ь):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:51;
(b) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:51, и кодирующая белок, обладающий ^РΡΡ-активностью;
(c) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:73;
(б) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:73, и обладающий ^РΡΡ-активностью;
(е) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 ΙΌ N0:73, и обладающий СРЕЕактивностью, и подобные белки.
Также примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность ^РΡΡ, являются ДНК,
- 8 013563 содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕО ΙΌ N0:51, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:51, и кодирующая аминокислотную последовательность с Рх-активностью.
В настоящем изобретении ферментом, имеющим отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы через α-связь связано с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, является любой фермент до тех пор, пока он представляет собой фермент, имеющий отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Ферментом, имеющим отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, называют фермент, влияющий на реакцию связывания положения 1 фукозы через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь.
Примерами фермента, имеющего отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через αсвязь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются α-1,6-фукозилтрансфераза, α-Ь-фукозидаза и подобные ферменты.
Примерами также являются фермент, влияющий на активность фермента, имеющего отношение к реакции связывания положения 1 фукозы через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, и фермент, влияющий на структуру веществ как субстратов фермента.
В настоящем изобретении примером α-1,6-фукозилтрансферазы является белок, кодированный ДНК, выбранной из числа приведенных далее (а), (Ь), (с) или (б):
(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:1;
(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:2;
(c) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:1, и кодирующая белок, обладающий α-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(б) ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:2, и кодирующая белок, обладающий α-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(е) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:23;
(Р) белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:24;
(д) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:23, и обладающий α-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(11) белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена, заменена, встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:24, и обладающий α-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
(ί) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 ΙΌ Ν0:23, и обладающий α-1,6фукозилтрансферазной активностью;
(ί) белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% гомологию с аминокислотной последовательностью, представленной 8Е0 ΙΌ Ν0:24, и обладающий α-1,6фукозилтрансферазной активностью, и подобные белки.
Также примерами ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность 1,6-фукозилтрансферазы, являются ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:1 или 2, и ДНК, гибридизующаяся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:1 или 2, и кодирующая аминокислотную последовательность с 1,6фукозилтрансферазной активностью.
В настоящем изобретении ДНК, которая гибридизирует в строгих условиях, получают, например, таким способом, как гибридизация колоний, гибридизация в бляшках или Саузерн-блоттинг, с использованием в качестве зонда ДНК, такой как ДНК с нуклеотидной последовательностью, представленной 8Е0 ΙΌ Ν0:1, 2, 48, 51 или 65, или ее частичного фрагмента, и конкретно включает ДНК, которую можно идентифицировать путем осуществления гибридизации при 65°С в присутствии 0,7-1,0 М хлорида натрия с использованием фильтра, на котором иммобилизуют колоние- или бляшкообразованные фрагменты ДНК, с последующим промыванием фильтра при 65°С с использованием раствора 0,1-2х88С (причем композиция раствора 1х88С содержит 150 мМ хлорида натрия и 15 мМ цитрата натрия). Гибридизацию можно осуществить согласно способам, описанным, например, в Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2пб Еб., Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз (1989) (далее данная публикация упоминается как Мо1еси1аг
- 9 013563
Οοπίπβ. 8есопб Εάίΐίοη). СштеШ Рго1осок ίη Мо1еси1аг Βίοίο^ν. ίοΐιη XVПсу & δοηκ. 1987-1997 (далее данная публикация упоминается как СиггеШ Ρτοΐο^ίδ ίη ΜοΚαιΕίΓ Βίο1οβ\'); ΌΝΆ Οοηίη§ 1: ί’οΐΌ ТесПпк|ис5. А Ртас11са1 АрргоасП. Зетопб Εάίΐίοη. 0χίοτά Ишуегайу (1995); и т.п. Примерами ДНК. способной к гибридизации. являются ДНК. имеющие по меньшей мере 60% или большую. предпочтительно 70% или большую. предпочтительнее 80% или большую. еще предпочтительнее 90% или большую. более предпочтительно 95% или большую и наиболее предпочтительно 98% или большую гомологию с нуклеотидной последовательностью. представленной 8ΕΟ ΙΌ N0:1. 2. 48. 51 или 65.
В настоящем изобретении белок. содержащий аминокислотную последовательность. в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена. заменена. встроена и/или добавлена в аминокислотную последовательность. представленную 8Ε0 ΙΌ N0:23. 24. 71. 72 или 73. и обладающий α-1.6фукозилтрансферазную активностью. ΟΜΌ-активностью. Εχ-активностью или ОЕРР-активностью. можно получить. например. путем введения сайт-направленной мутации в ДНК. кодирующую белок. обладающий аминокислотной последовательностью. представленной 8Ε0 ΙΌ N0:1. 2. 65. 48 или 51. соответственно. с использованием сайт-направленного мутагенеза. описанного. например. в ΜοΚ^Ε-π ί.Ίοηίη§. Зетопб Εάίΐίοη; СиггеЩ Ρ^οΐοсο18 ίη ΜοΚαιΕπ Βίο1οβ\·; ШсГОс Ααάδ Векеатсй. 10. 6487 (1982); Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8οΐ. И8А. 79. 6409 (1982); Оепе. 34. 315 (1985); №с1ею Αοΐάδ Векеатсй. 13. 4431 (1985); Ргос. №6. Асаб. 8с1. И8А. 82. 488 (1985); и т.п. Число удаленных. замененных. встроенных и/или добавленных аминокислот равно единице или большему числу. и оно конкретно не лимитируется. но является числом аминокислот. которые можно удалить. заменить или добавить известным методом. таким как сайтнаправленный мутагенез. например. оно составляет от 1 до нескольких десятков. предпочтительно 1-20. предпочтительнее 1-10 и наиболее предпочтительно 1-5.
Также. в настоящем изобретении для того. чтобы сохранилась а-1.6-фукозилтрансферазная активность. ΟΜΌ-активность. Ех-активность или ОЕРР-активность белка. он имеет по меньшей мере 80% или большую. предпочтительно 85% или большую. предпочтительнее 90% или большую. еще предпочтительнее 95% или большую. более предпочтительно 97% или большую и наиболее предпочтительно 99% или большую гомологию с аминокислотной последовательностью. представленной 8Ε0 ΙΌ N0:23. 24. 71. 72 или 73. вычисленную с использованием аналитической программы. такой как ВЬА8Т [1. Μο1. Βίο1.. 215. 403 (1990)]. ЕА8ТА |Ме11юб5 ίη Εηζутο1ο§у. 183. 63 (1990)] или подобной программы.
Примерами клеток СН0 настоящего изобретения являются клетки. в которых ферментативная активность уменьшена или устранена.
Клетки. в которых ферментативная активность уменьшена или устранена. включают клетки. в которых уменьшена или устранена активность фермента. имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы. или активность фермента. имеющего отношение к модификации углеводной цепи. где положение 1 фукозы через α-связь связано с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи. присоединенной через ^гликозидную связь. В качестве способа получения таких клеток можно использовать любой метод до тех пор. пока с его помощью можно уменьшить или устранить ферментативную активность. представляющую интерес. Примерами метода уменьшения или устранения ферментативной активности являются:
(a) метод прерывания гена. имеющий целью ген. кодирующий фермент.
(b) метод введения доминантотрицательного мутанта гена. кодирующего фермент.
(c) метод введения мутации в фермент.
(ά) метод ингибирования транскрипции и/или трансляции гена. кодирующего фермент.
(е) метод отбора клеточной линии. невосприимчивой к лектину. узнающему углеводную цепь. в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи. присоединенной через ^гликозидную связь. и подобные методы.
В данном случае лектинневосприимчивую клеточную линию можно получить культивированием клеточной линии в среде. содержащей предварительно установленную концентрацию лектина. и последующим отбором клеточной линии. которая приобретает такое свойство. что степень ее выживания становится выше по меньшей мере в 2 раза. предпочтительно в 3 раза и предпочтительнее в 5 раз или более. чем у родительской клеточной линии. со статистической значимостью. Такую линию также можно получить путем культивирования клеточной линии в среде. содержащей лектин. и последующего отбора клеточной линии. которую можно культивировать при определенной степени выживания. например степени выживания 80%. при концентрации лектина выше по меньшей мере в 2 раза. предпочтительно в 5 раз. предпочтительнее в 10 раз и наиболее предпочтительно в 20 раз или более. чем в случае родительской клеточной линии.
В качестве лектина. узнающего структуру углеводной цепи. в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 №ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи. присоединенной через ^гликозидную связь. можно использовать любой лектин. узнающий углеводную цепь. Примерами являются лектин Ьепк сийпапк ЬСА (лентилагглютинин. полученный из Ьепк сийпатщ). лектин гороха Р8А (лектин гороха. полученный из Рщиш кабуиш). лектин кормовых бобов УЕА
- 10 013563 (агглютинин, полученный из У1с1а £аЬа), лектин Л1еипа аигапба АЛЬ (лектин, полученный из Л1еипа аигаийа) и т.п.
Клетки СНО настоящего изобретения могут продуцировать композицию антител с более высокой АЭСС-активностью. чем у композиции антител, продуцированной родительской линией СНО перед применением способа уменьшения или устранения ферментативной активности, представляющей интерес.
Также клетки СНО настоящего изобретения могут продуцировать композицию антител с более высокой ЛЭСС-активностью, чем ЛЭСС-активность композиции антител, в которой среди всех сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи, соединяющихся с Рс-областью, содержащихся в композиции антител настоящего изобретения, доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет менее 20%.
Примером родительской клеточной линии, используемой в настоящем изобретении, являются клетки, в которых не снижена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Конкретно, используют клетки, не обработанные с целью снижения или устранения активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через αсвязь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
В настоящем изобретении ЛЭСС-активность является цитотоксической активностью, при которой антитело, связанное с антигеном клеточной поверхности опухолевой клетки в живом организме, активирует эффекторную клетку через Рс-рецептор, существующий в Рс-области антитела, и поверхность эффекторной клетки, и посредством этого блокирует опухолевую клетку и т.п. [Мопос1опа1 Лп11Ьоб1е8: Рг1пс1р1е5 аиб Лррйсабопк, ^Пеу-Шк, 1ис., СЕар1ег 2.1 (1955)]. Примерами эффекторной клетки являются киллерная клетка, природная киллерная клетка, активированный макрофаг и подобные клетки.
Настоящее изобретение также относится к клетке, в которой методом генной инженерии уменьшена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡфукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь (далее называемой клетка-хозяин настоящего изобретения). Клетка-хозяин настоящего изобретения полезна в качестве клетки-хозяина для продукции композиции антител с высокой ЛОСС-активностью.
Клетка-хозяин настоящего изобретения может представлять собой любую клетку до тех пор, пока она может экспрессировать молекулу антитела. Примерами являются дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого, растительная клетка и т. п.
Примерами таких клеток являются клетки, которые будут рассматриваться далее в разделе 3. Среди животных клеток предпочтительными примерами являются клетки СНО, полученные из ткани яичника китайского хомячка, клетки клеточной линии миеломы крысы УВ2/3НЬ.Р2.О11.16Лд20, клетки клеточной линии миеломы мыши Ν80, мышиные миелоидные клетки 8Р2/0-Лд14, клетки ВНК, полученные из ткани почек сирийского хомячка, продуцирующие антитела гибридомные клетки, клетки клеточной линии лейкоза человека Nата1\νа. эмбриональные стволовые клетки, оплодотворенные яйцеклетки и т.п.
Ниже настоящее изобретение описано подробнее.
1. Получение клетки-хозяина настоящего изобретения.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить методами, описанными далее.
(1) Метод прерывания гена, имеющий целью ген, кодирующий фермент.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить с использованием метода прерывания гена, имея целью фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡфукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, являются ΟΜΌ, Рх, ΟΡΡΡ, фукокиназа и подобные белки. Примерами фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются α-1,6фукозилтрансфераза, α-Ь-фукозидаза и т.п.
Ген, используемый в данном случае, включает ДНК и РНК.
Способ прерывания гена может представлять собой любой способ до тех пор, пока он может привести к прерыванию гена фермента-мишени. Примерами являются антисмысловой способ, рибосомный способ, способ гомологических рекомбинаций, способ ВЭО, способ ЯNА^. способ с использованием рет
- 11 013563 ровирусов, способ с использованием транспозонов и подобные способы. Ниже способы описываются конкретно.
(а) Получение клетки-хозяина настоящего изобретения антисмысловым способом или рибосомным способом.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить рибосомным способом, описанным в Се11 Тесйио1о§у, 12, 239 (1993); ВЮ/ТЕСНКЮЬОбУ, 17, 1097 (1999); Нит. Мо1. Сепе!., 5, 1083 (1995); Се11 Тесйио1о§у, 13, 255 (1994); Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1. ϋδΆ, 96, 1886 (1999), или подобным способом, например, имея целью фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭРфукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Получают кДНК или геномную ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь.
Определяют нуклеотидную последовательность полученной кДНК или геномной ДНК.
На основе определенной последовательности ДНК задают соответствующую длину антисмысловой генной или рибосомной конструкции, содержащей часть ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы. или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, часть ее нетранслируемой области или интрон.
Для того чтобы экспрессировать антисмысловой ген или рибосому в клетке, получают рекомбинантный вектор, вводя фрагмент или полноразмерную полученную ДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора.
Получают трансформант путем введения рекомбинантного вектора в клетку-хозяина, подходящую для экспрессирующего вектора.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить отбором трансформанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭРфукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Клетку-хозяина настоящего изобретения также можно получить отбором трансформанта на основании структуры углеводной цепи гликопротеина на клеточной мембране или структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела.
В качестве клетки-хозяина, используемой для получения клетки-хозяина настоящего изобретения, можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она имеет ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются клетки-хозяева, которые будут описаны далее в разделе 3.
В качестве экспрессирующего вектора используют вектор, который может автономно реплицироваться в клетке-хозяине или который можно интегрировать в хромосому, содержащий промотор в такой позиции, что создаваемые антисмысловой ген или рибосому можно переносить. Примерами являются экспрессирующие векторы, которые будут описаны далее в разделе 3.
Что касается способа введения гена в различные клетки-хозяева, то можно использовать способы введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, описанные далее в разделе 3.
Описанный далее способ может служить примером способа отбора трансформанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭРфукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Способ отбора трансформанта
Примерами способа отбора клеток, в которых уменьшена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются биохимические способы или методы генной инженерии, описанные в Νονν Вюсйетюа! ЕхрептеШабои 8епе8 3 - Зассйапбек I, С1усорго1ет (Токуо Кадаки ПоДи), еб
- 12 013563 йсб Ьу 1арапс5С Вюсйстюа1 5ОС1с1у (1988); Се11 Епдспссппд. 8ирр1стсп1. Е.хрептсп1а1 Рго!осо1 8епсз. 61усоЬю1оду Е.хрептсп1а1 РгоЮсо1. 61усорго1сш. 61усо11р1б апб Рго!сод1усап (ЫшщшЬа). сбйсб Ьу Ыаоуик1 ТашдисЫ. Акст1 8ихик|. КлуозЫ Ригика^а апб Кахиуик! 8ида^ага (1996); Мо1сси1аг С1опшд. 8ссопб Еб1Ьоп; Сиггсп! Рго!осок ш Мо1сси1аг Вю1оду; и подобные способы. Примеры биохимических способов включают способ. при котором ферментативную активность оценивают с использованием ферментспецифического субстрата и т.п.
Примерами методов генной инженерии являются анализ методом Нозерн-блоттинга. РТ-РСР и подобные. при которых измеряют количество мРНК гена. кодирующего фермент.
Примерами способа отбора трансформанта на основании структуры углеводной цепи гликопротеина на клеточной мембране являются способы. которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбора трансформанта на основании структуры углеводной цепи продуцируемых молекул антител являются способы. которые будут описаны далее в разделах 5 и 6.
Примером способа получения кДНК. кодирующей фермент. имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы. или фермент. имеющий отношение к модификации углеводной цепи. в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи сахаров. присоединенной через Ν-гликозидную связь. является способ. описанный далее.
Получение кДНК
Получают полную РНК или мРНК из ткани или клеток человека или животного. не являющегося человеком.
Из полученных полных РНК или мРНК получают библиотеку кДНК.
Получают вырожденные праймеры на основе аминокислотной последовательности фермента. имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы. или фермента. имеющего отношение к модификации углеводной цепи. в которой положение 1 фукозы связано через αсвязь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи. присоединенной через Ν-гликозидную связь. или методом ПЦР (РСК) с использованием в качестве матрицы полученной бибилиотеки кДНК получают фрагмент гена. кодирующего фермент. имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы. или фермент. имеющий отношение к модификации углеводной цепи. в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи. присоединенной через Νгликозидную связь.
ДНК. кодирующую фермент. имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы. или фермент. имеющий отношение к модификации углеводной цепи. в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи. присоединенной через Ν-гликозидную связь. можно получить путем скрининга библиотеки кДНК с использованием полученного фрагмента гена в качестве зонда.
Что касается мРНК человеческих или отличных от человеческих ткани или клетки. то можно использовать коммерчески доступный продукт (например. произведенный С1оп1ссЬ). или ее можно получить из тканей или клеток человека или животного. не являющегося человеком. как в примерах. Примеры способа получения полной РНК из тканей или клеток человека или животного. не являющегося человеком. включают способ с гуанидинтиоцианатом и трифторацетатом церия [Мс1обз ш Епхуто1оду. 154. 3 (1987)]. кислотный способ с гуанидинтиоцианатом. фенолом и хлороформом (А6РС) [Апа1убса1 ВюсйстШгу. 162. 156 (1987); Ехрсптсп1а1 Мебюше. 9. 1937 (19 91)] и подобные способы.
Также примерами способа получения мРНК из полной РНК. например. РНК поли(А)+. является колоночный способ с олиго(бТ). иммобилизованным на целлюлозе (Мо1еси1аг С1ошпд. 8ссопб Ебйюп). и подобные способы.
Кроме того. мРНК можно получить с использованием набора. такого как набор Раз! Тгаск ιηΡΝΛ ЕокШоп (производимый 1пуйгодеп). набор Ошск Ргер тКЫА РипПсаЬоп (производимый РЬагтааа). или подобного набора.
Из полученной мРНК тканей или клеток человека или животного. не являющегося человеком. получают библиотеку кДНК. Примерами способа получения библиотек кДНК являются способы. описанные в Мо1еси1аг С1ошпд. 8ссопб Ебйюп; Сипсп! Рго1осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду; А ЬаЬога1огу Мапиа1. 8ссопб Ебйюп (1989); и подобные способы. или способы с использованием коммерчески доступных наборов. таких как набор 8ирсг5спр1 Р1азт1б 8уз1ст £ог сЭНА 8уп111С515 апб Р1азт1б С1ошпд (производимый Ы1с ТссЬпо1од1с8). набор ЛАР-сЭКА ЗуШйсзЦ (производимый 8ТΒΛТΛСЕNЕ). и подобные наборы.
В качестве клонирующего вектора для применения при получении библиотеки кДНК можно использовать любой вектор. такой как фаговый вектор. плазмидный вектор или подобный. до тех пор. пока он может автономно реплицироваться в ЕзсЬсгюЫа сой К12. Примерами являются 2АР Ехргсзз [производимый БТИ-АТАСЕНЕ. 81га1сд1сз. 5. 58 (1992)]. рВЫезспр! II 8К(+) |М1с1с1с Аабз КезсагсЬ. 17. 9494 (1989)]. ЬатЬба 2АР II (производимый 8ТΒΛТΛСЕNЕ). /д!10 и лд111 ЩКА С1ошпд. А Ргасйса1 Арргоасй. 1. 49 (1985)]. /.Тпр1Е.х (изготовленный С1оп1ссЬ). /.Е.хСс11 (производимый Рйагташа). рсЭ2 [Мо1.
- 13 013563
Се11. ΒίοΙ., 3, 280 (1983)], рИС18 [Сепе, 33, 103 (1985)] и подобные векторы.
В качестве микроорганизма-хозяина можно использовать любой микроорганизм, но предпочтительно используют ЕбсйейсЫа сой. Примерами являются ЕбсйейсЫа сой ХЬ1-В1ие МНЕ' [производимая 8ТЯАТАСЕ№, 8йа!ед1еб, 5, 81 (1992)], ЕбсйейсЫа сой С600 [Сепейсб, 39, 440 (1954)], ЕбсйейсЫа сой Υ1088 [8с1епсе, 222, 778 (1983)], ЕбсйейсЫа сой Υ1090 [8с1епсе, 222, 778 (1983)], ЕбсйейсЫа сой N4522 [1. Мо1. Вю1., 166, 1 (1983)], ЕбсйейсЫа сой К802 [1. Мо1. Вю1., 16, 118 (1966)], ЕбсйейсЫа сой ДМ105 [Сепе, 38, 275 (1985)] и т.п.
Библиотеку кДНК можно использовать как таковую при последующих анализах и для того, чтобы получить полноразмерную кДНК настолько рационально, насколько возможно, путем уменьшения доли неполной кДНК, и библиотеку кДНК, полученную с использованием олигокэпового метода, разработанного 8идапо е! а1. [Сепе, 138, 171 (1994); Сепе, 200, 149 (1997); Рго!ет, ШсШс Ас1й апй Рго!ет, 41, 603 (1996); Ехрейтеп!а1 Мейюте, 11, 2491 (1993); с^NА С1ошпд (Уойо-бйа) (1996); Ме!йойб £ог Ргераппд Сепе ЫЬгапеб (Аойо-бйа) (1994)], можно использовать в описанном далее анализе.
Получают вырожденные праймеры для 5'-концевых и 3'-концевых нуклеотидных последовательностей, предполагаемых для кодирования аминокислотной последовательности, на основе аминокислотной последовательности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы. или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, и ДНК амплифицируют ПЦР [РСЯ Рго!осо1б, Асайепйс Ргебб (1990)] с использованием полученной библиотеки кДНК в качестве матрицы, и получают фрагмент гена, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Можно подтвердить, что полученный фрагмент гена представляет собой ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через αсвязь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи сахаров, присоединенной через Ν-гликозидную связь, способом, используемым, как правило, для анализа нуклеотидов, такого как дидезокси-способ 8апдег е! а1. [Ргос. №111. Асай. 8ст И8А, 74 5463 (1977)], с помощью анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК АВ1РЯ18М 377 (производимый РЕ Вюбуб!ет), или подобного устройства.
ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно получить, осуществляя гибридизацию колоний или гибридизацию в бляшках (Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопй Еййюп) для кДНК или библиотеки кДНК, синтезированных из мРНК, содержащейся в тканях или клетках человека или животного, не являющегося человеком, с использованием фрагмента гена в качестве ДНК-зонда.
Также ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно получить, осуществляя скрининг методом ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК или библиотеки кДНК, синтезированных из мРНК, содержащейся в тканях или клетках человека или животного, не являющегося человеком, и с использованием праймеров, используемых для получения фрагмента гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Нуклеотидную последовательность полученной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, анализируют от ее конца и определяют способом, используемым, как правило, для анализа нуклеотидов, таким как дидезокси-способ 8апдег е! а1. [Ргос. Νη11. Асай. 8ск И8А, 74, 5463 (1977)], с помощью анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК АВ1РЯ18М 377 (производимый РЕ Вюбуб!ет), или подобного устройства.
Ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в слож
- 14 013563 ной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, также можно определить из генов в базах данных путем поиска в таких базах данных нуклеотидных последовательностей, как СеиБапк, ЕМВЬ, ББВ1, и подобных, с использованием поисковой программы, такой как ВЬА8Т, на основе определенной нуклеотидной последовательности кДНК.
Примерами нуклеотидной последовательности гена, полученного таким способом, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СБР-фукозы, являются нуклеотидные последовательности, представленные 8ЕО 1Б N0:48, 51 или 65. Примерами нуклеотидной последовательности гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются нуклеотидные последовательности, представленные 8Е0 1Б N0:1 или 2.
Также кДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СБР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно получить методом химического синтеза с помощью синтезатора ДНК, такого как синтезатор ДНК модели 392, производимый Регкщ Е1тег, или подобного синтезатора, с использованием фосфорамидитного способа, на основании определенной нуклеотидной последовательности ДНК.
В качестве примера способа получения геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СБР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, приводится способ, описанный ниже.
Получение геномной ДНК
Примеры способа получения геномной ДНК включают известные способы, описанные в Мо1еси1аг С1ошпд, 8ееопб Εάίΐίοη; Сштеп! РгоЮеой ш Мо1еси1аг Вю1о§у; и подобные. Кроме того, геномную ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СБРфукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, также можно выделить с использованием такого набора, как Сепоте ΩΝΑ ЫЬгагу 8егеешпд 8у§1ет (производимого Сепоте 8у§1ет5), наборов итуегаа1 Сепоте Уа1кег™ (производимых СЬОЭТЕСН) или подобных наборов.
Примерами нуклеотидной последовательности полученной таким способом геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СБР-фукозы, являются нуклеотидные последовательности, представленные 8Е0 1Б Ν0:67 или 70. Примером нуклеотидной последовательности геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, является нуклеотидная последовательность, представленная 8Е0 1Б Ν0:3.
Кроме того, клетку-хозяина настоящего изобретения также можно получить без использования экспрессирующего вектора путем непосредственного введения в клетку-хозяина антисмыслового олигонуклеотида или рибосомы, которые создаются на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СБР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Антисмысловой олигонуклеотид или рибосому можно получить обычным способом или с использованием синтезатора ДНК. Конкретно, их можно получить на основе сведений о последовательности олигонуклеотида с соответствующей последовательностью из 5-150 оснований, предпочтительно 5-60 оснований и предпочтительнее 10-40 оснований, из числа нуклеотидных последовательностей кДНК и геномной ДНК, кодирующих фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СБР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, путем синтеза олигонуклеотида, соответствующего последовательности, комплементарной олигонуклеотиду (антисмысловому олигонуклеотиду) или рибосоме, соответствующей последовательности олигонуклеотида.
Примерами олигонуклеотида являются олиго-РНК и производные олигонуклеотидов (называемые далее в данном описании производными олигонуклеотидов).
Примерами производных олигонуклеотидов являются производные олигонуклеотидов, в которых фосфодиэфирная связь в олигонуклеотиде превращается в фосфоротиоатную связь, производное олигонуклеотида, в котором фосфодиэфирная связь в олигонуклеотиде превращается в №'-Р5'
- 15 013563 фосфоамидатную связь, производное олигонуклеотида, в котором рибоза и фосфодиэфирная связь в олигонуклеотиде превращаются в связь пептид-нуклеиновая кислота, производное олигонуклеотида, в котором урацил в олигонуклеотиде замещается С-5-пропинилурацилом, производное олигонуклеотида, в котором урацил в олигонуклеотиде замещается С-5-тиазолурацилом, производное олигонуклеотида, в котором цитозин в олигонуклеотиде замещается С-5-пропинилцитозином, производное олигонуклеотида, в котором цитозин в олигонуклеотиде замещается цитозином, модифицированным феноксазином, производное олигонуклеотида, в котором рибоза в олигонуклеотиде замещается 2'-О-пропилрибозой, и производное олигонуклеотида, в котором рибоза в олигонуклеотиде замещается 2'-метоксиэтоксирибозой [Се11 ТесНпо1о§у, 16, 1463 (1997)].
(Ь) Получение клетки-хозяина настоящего изобретения методом гомологичных рекомбинаций.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить путем модификации гена-мишени в хромосоме методом гомологичных рекомбинаций с использованием в качестве гена-мишени гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Ген-мишень в хромосоме можно модифицировать, используя способ, описанный в Машри1айпд 1Пе Мойке ЕтЬгуо, А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Зесопб ЕбЖоп, Со1б Зргтд НагЬог ЬаЬога1огу Ρι-екк (1994) (далее в описании упоминается как Машри1а1тд 1Пе Мойке ЕтЬгуо, А ЬаЬогаФгу Мапиа1); Оепе Тагдейпд, А Ггас11са1 Арргоасй, ЖЬ Ггекк о£ ΟχίοΦ Ишуегкйу Ггекк (1993); Вютапиа1 Зепек 8, Оепе Тагдебпд. ГгерагаЦоп о£ Ми1ап1 М1се икшд ЕЗ Се11к, Уобо-кНа (1995) (далее в описании упоминается как Ρ^ера^аΐ^οη о£ Ми1ап1 М1се икшд ЕЗ Се11к); или подобный способ, например следующий.
Получают геномную ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
На основе нуклеотидной последовательности геномной ДНК получают вектор-мишень для гомологичной рекомбинации гена-мишени, который модифицируют (например, структурного гена фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через αсвязь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, или гена промотора).
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить введением полученного вектора-мишени в клетку-хозяина и отбором клеток, в которых произошла рекомбинация между геном-мишенью и вектором-мишенью.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она имеет ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются клетки-хозяева, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примеры способа получения геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, включают способы, описанные при получении геномной ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы.
Примерами нуклеотидной последовательности геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, являются нуклеотидные последовательности, представленные ЗЕО ΙΌ ΝΟ:67 или 70. Примером нуклеотидной последовательности геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, является нуклеотидная последовательность, представленная ЗЕО ΙΌ ΝΟ:3.
Вектор-мишень для использования при гомологичной рекомбинации гена-мишени можно получить согласно способу, описанному в Οеηе Тагдейпд, А Ρ^асΐ^са1 АрргоасН, ЖЬ Ρι-екк о£ ΟχίοΦ ЬшуегкЦу Ρι-екк (1993); В1отапиа1 Зепек 8, Οепе Тагдебпд. Ρ^ера^аΐ^οп о£ Ми1ап1 М1се иктд ЕЗ Се11к, Уобо-кНа (1995), или подобным способом. Вектор-мишень можно использовать или по типу замещения, или по типу встраивания.
Для того чтобы ввести вектор-мишень в различные клетки-хозяева, можно использовать способы
- 16 013563 введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примерами способа эффективного отбора гомологичного рекомбинанта являются такие способы, как положительный отбор, промоторный отбор, отрицательный отбор или отбор по поли-А, описанные в Сепе Тагдейпд, А РгасЕса1 АрргоасЕ, 1ЯЬ Ргс55 о£ Οχίοτά Ишуегайу Ргс55 (1993); Вютапиа1 8епе5 8, Сепе Тагдейпд, Ргерагайоп о£ Ми1ап1 Мкс иапд Е8 Сс115. Υοάο-δΐιη (1995), или подобные способы. Примерами способа отбора из отобранных клеточных линий гомологичного рекомбинанта, представляющего интерес, являются способ гибридизации по Саузерну для геномной ДНК (Мо1сси1аг С1ошпд, 8есопб Ебйкп), ПЦР [РСЯ РгоксоЦ Асабетк Рге§8 (1990)] и подобные способы.
(с) Получение клетки-хозяина настоящего изобретения способом ЯЭ0.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить способом ЯЭ0 (РНК-ДНКолигонуклеотид), имея целью ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, например, следующим образом.
Получают кДНК или геномную ДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь.
Определяют нуклеотидную последовательность полученной кДНК или геномной ДНК.
На основании определенной последовательности ДНК создают и синтезируют конструкцию ЯЭ0 соответствующей длины, содержащую часть ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, или часть ее нетранслируемой области или интрон.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить введением синтезированной ЯЭ0 в клетку-хозяина и последующим отбором трансформанта, в котором произошла мутация в ферменте-мишени, а именно ферменте, имеющем отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или ферменте, имеющем отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭРфукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются клеткихозяева, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примерами способа введения ЯЭ0 в различные клетки-хозяева являются способы введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примеры способа получения ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, включают способы, описанные при получении ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы.
Примеры способа получения геномной ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, включают способы, описанные при получении геномной ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы.
Нуклеотидную последовательность ДНК можно определить, расщепляя ее соответствующими рестрикционными ферментами, клонируя фрагменты в плазмиду, такую как рВ1ие5спр1 8К(-) (производимую 81га1адепе), или подобную, подвергая клоны реакции, обычно используемой в качестве способа анализа нуклеотидной последовательности, такой как в дидезокси-способе [Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А, 74, 5463 (1977)], 8аидег с1 а1., или подобному взаимодействию, и затем анализируя клоны с использованием автоматического анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК А.Ь.Т.
- 17 013563 (производимый Рйагтас1а), или подобного устройства.
КОО можно получить обычным способом или с использованием синтезатора ДНК.
Примерами способа отбора клеток, в которых за счет введения КОЭ в клетки-хозяева произошла мутация в гене, кодирующем фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются способы прямого обнаружения мутаций в хромосомных генах, описанные в Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб Ебйюп, Сиггеп! РгоЮсоК 1п Мо1еси1аг Вю1оду, и подобные способы; способы, описанные в разделе 1(1)(а) для отбора трансформанта через оценку активности введенного фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь; способ отбора трансформанта с использованием углеводной структуры гликопротеина на клеточной мембране, который будет описан далее в разделе 1(5); и способ отбора трансформанта на основе углеводной структуры полученной молекулы антитела, который будет описан далее в разделе 5 или 6, и подобные способы.
Конструкцию КОЭ можно создать согласно способам, описанным в 8с1епсе, 273, 1386 (1996); №Иие МебШпе, 4, 285 (1998); Нера1о1оду, 25, 1462 (1997); Сепе Тйегару, 5, 1960 (1999); 1. Мо1. Меб., 75, 829 (1997); Ргос. Νίώ. Асаб. 8ск И8А, 96, 8774 (1999); Ргос. Νίώ. Асаб. 8ск И8А, 96, 8768 (1999); Νκ. Ас1бк. Кек., 27, 1323 (1999); 1пуек1. Эета1о1., 111, 1172 (1998); №1иге Вю!есй., 16, 1343 (1998); №11иге В1о1есН., 18, 43 (2000); №11иге Вю!есй., 18, 555 (2000); и подобными способами.
(б) Получение клетки-хозяина настоящего изобретения способом ΡΝΛί.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить способом КНА! (интерференции РНК), имея целью ген фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭРфукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, например, следующим образом.
Получают кДНК, кодирующую фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Определяют нуклеотидную последовательность полученной кДНК.
На основе определенной последовательности ДНК создают генную конструкцию ИХА! соответствующей длины, содержащую кодирующую часть ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, или часть ее нетранслируемой области.
Для того чтобы в клетке экспрессировался ген КNА^, получают рекомбинантный вектор, встраивая фрагмент или полноразмерную полученную ДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора.
Получают трансформант, вводя рекомбинантный вектор в клетку-хозяина, подходящую для экспрессирующего вектора.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить отбором трансформанта на основе активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭР-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, или структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране или продуцируемой молекуле антитела.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭРфукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются клеткихозяева, которые будут описаны далее в разделе 3.
В качестве экспрессирующего вектора используют вектор, который может автономно реплицироваться в клетке-хозяине, или который можно интегрировать в хромосому, и содержащий промотор в такой позиции, что создаваемый ген КЫА1 можно переносить. Примерами являются экспрессирующие векторы, которые будут описаны далее в разделе 3.
- 18 013563
Что касается способа введения гена в различные клетки-хозяева, то можно использовать способы введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, описанные далее в разделе 3.
Примерами способа отбора трансформанта на основе активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а).
Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы, которые будут описаны далее в разделе 5 или 6.
Примеры способа получения ДНК, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, включают способы, описанные при получении ДНК в разделе 1(1)(а), и подобные способы.
Кроме того, клетку-хозяина настоящего изобретения также можно получить без использования экспрессирующего вектора непосредственным введением гена ΚΝΑί, созданного на основе нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Ген ΚΝΑί можно получить обычным способом или с использованием синтезатора ДНК.
Конструкцию гена ΚΝΑί можно создать согласно способам, описанным в №11иге. 391, 806 (1998); Ρϊοο. №ίί. Αсаά. δα. υδΑ, 95, 15502 (1998); №1иге, 395, 854 (1998); Ρϊος. №ίί. Αсаά. δα. υδΑ, 96, 5049 (1999); Се11, 95, 1017 (1998); Ριοο. №11. Αсаά. δοΐ. υδΑ, 96, 1451 (1999); Ρϊος. №11. Αсаά. δα. υδΑ, 95, 13959 (1998); №1иге Се11 Βίο1., 2, 70 (2000); и подобными способами.
(е) Получение клетки-хозяина настоящего изобретения способом с использованием транспозонов.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить, вызывая мутацию с использованием системы транспозонов, описанной в №1иге Сепе1., 25, 35 (2000), или подобной системы, с последующим отбором мутанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида С^Ρ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, или структуры углеводной цепи гликопротеина продуцируемой молекулы антитела или в клеточной мембране.
Система транспозонов представляет собой систему, в которую вводят мутацию случайным встраиванием в хромосому экзогенного гена, где экзогенный ген, расположенный между транспозонами, обычно используют в качестве вектора для индуцирования мутации, и в то же время в клетку вводят вектор, экспрессирующий транспозазу, для случайного встраивания гена в хромосому.
Можно использовать любую транспозазу до тех пор, пока она подходит для последовательности используемого транспозона.
В качестве экзогенного гена можно использовать любой ген до тех пор, пока он может индуцировать мутацию в ДНК клетки-хозяина.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭбфукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются клеткихозяева, которые будут описаны далее в разделе 3. Для введения гена в различные клетки-хозяева можно использовать способ введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примерами способа отбора мутанта на основе активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОЕ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а).
Примерами способа отбора мутанта на основе структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбо
- 19 013563 ра мутанта на основе структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы, которые будут описаны далее в разделе 5 или 6.
(2) Способ введения доминантотрицательного мутанта гена, кодирующего фермент.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить, имея целью ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через αсвязь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, с использованием метода введения доминантотрицательного мутанта гена, кодирующего фермент. Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, являются ΟΜΌ, Ех, ΟΕΡΡ, фукокиназа и подобные ферменты. Примерами фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются а-1,6-фукозилтрансфераза, α-Ьфукозидаза и подобные ферменты.
Ферменты катализируют специфические реакции со специфичностью к субстрату, и доминантотрицательные мутанты ферментов можно получить, разрушая активный центр ферментов, катализирующих каталитическую активность со специфичностью к субстрату. Способ получения доминантотрицательного мутанта конкретно описывается ниже с выбором среди мишеней-ферментов ΟΜΌ.
В результате анализа трехмерной структуры ΟΜΌ, полученного из Е. со11, показано, что 4 аминокислоты (треонин в позиции 133, глутаминовая кислота в позиции 135, тирозин в позиции 157 и лизин в позиции 161) важны для ферментативной активности (§1гис1иге, 8, 2, 2000). Иными словами, когда получали мутантов заменой 4 аминокислот на другие аминокислоты на основании информации о трехмерной структуре, ферментативная активность всех мутантов существенно понижалась. С другой стороны, изменения способности ΟΜΌ связываться с коферментом ΟΜΌ ΝΆΌΡ и его субстратом ΟΌΡ-маннозой в мутантах едва отмечались. Соответственно, доминантотрицательный мутант можно получить, заменяя 4 аминокислоты, регулирующие ферментативную активность ΟΜΌ. Например, в ΟΜΌ (8ЕС Ш ΝΟ:65), полученном из клеток СНО, доминантотрицательный мутант можно получить, заменяя треонин в позиции 155, глутаминовую кислоту в позиции 157, тирозин в позиции 179 и лизин в позиции 183 на другие аминокислоты, сравнивая гомологию и предсказывая трехмерную структуру с использованием информации об аминокислотной последовательности, основанной на результатах для ΟΜΌ, полученного из Е. со11. Так, ген, в который введена замена аминокислоты, можно получить методом сайт-направленного мутагенеза, описанным в Мо1еси1аг С1ошид, §есоиб Ебйюп, Сиггеи! Гго1осо15 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, или подобным методом.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить согласно способу, описанному в Мо1еси1аг С1ошпд, Зесопб Ебйюп, СиггеШ Гго1осо15 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, или подобному способу, с использованием полученного гена доминантотрицательного мутанта фермента-мишени, например, следующим образом.
Получают ген, кодирующий доминантотрицательный мутант (называемый далее геном доминантотрицательного мутанта) фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
На основе полученной полноразмерной ДНК гена доминантотрицательного мутанта получают, при необходимости, фрагмент ДНК соответствующей длины, содержащий часть, кодирующую белок.
Получают рекомбинантный вектор, встраивая фрагмент ДНК или полноразмерную ДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора.
Получают трансформант, вводя рекомбинантный вектор в клетку-хозяина, подходящую для экспрессирующего вектора.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить отбором трансформанта на основании активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡфукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, или структуры углеводной цепи гликопротеина продуцируемой молекулы антитела или в клеточной мембране.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого или растительная клетка, до тех пор, пока она содержит ген, кодирующий фермент-мишень, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡфукозы, или фермент-мишень, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются клеткихозяева, которые будут описаны далее в разделе 3.
- 20 013563
В качестве экспрессирующего вектора можно использовать вектор, который может автономно реплицироваться в клетке-хозяине или может интегрироваться в хромосому и содержит промотор в позиции, где можно осуществить транскрипцию ДНК, кодирующей доминантотрицательный мутант, представляющий интерес. Примерами являются экспрессирующие векторы, которые будут описаны далее в разделе 3.
Для введения гена в различные клетки-хозяева можно использовать способ введения рекомбинантных векторов, подходящих для различных клеток-хозяев, которые будут описаны далее в разделе 3.
Примерами способа отбора трансформанта на основе активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а).
Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе 1(5). Примерами способа отбора трансформанта на основе структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы, которые будут описаны далее в разделе 5 или 6.
(3) Способ введения мутации в фермент.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить введением мутации в ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, и последующим отбором клеточной линии, представляющий интерес, в которой произошла мутация в ферменте.
Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, являются ΟΜΌ, Рх, 6ΡΡΡ, фукокиназа и подобные ферменты. Примерами фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через αсвязь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются α-1,6-фукозилтрансфераза, α-Ь-фукозидаза и подобные ферменты.
Примерами способа являются 1) способ, при котором нужную клеточную линию отбирают среди мутантов, полученных индуцирующей мутацию обработкой родительской клеточной линии мутагеном, или спонтанно образующихся мутантов, основываясь на активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, 2) способ, при котором нужную клеточную линию отбирают среди мутантов, полученных индуцирующей мутацию обработкой родительской клеточной линии мутагеном, или спонтанно образующихся мутантов, основываясь на структуре углеводной цепи продуцированной молекулы антитела, и 3) способ, при котором нужную клеточную линию отбирают среди мутантов, полученных индуцирующей мутацию обработкой родительской клеточной линии мутагеном, или спонтанно образующихся мутантов, основываясь на структуре углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране.
В качестве индуцирующей мутацию обработки можно использовать любую обработку до тех пор, пока она может вызывать точечную мутацию или делецию или мутацию со сдвигом рамки в ДНК клеток родительской клеточной линии.
Примерами являются обработка этилнитрозомочевиной, нитрозогуанидином, бензопиреном или акридиновым пигментом и обработка излучением. В качестве мутагенов также можно использовать различные алкилирующие агенты и канцерогены. Примерами способа, позволяющего мутагену воздействовать на клетки, являются способы, описанные в Т188ие СиЕиге ТесЕшдцек, 3гб ебЮоп (Лкакига 8Ео1еп), ебЕеб Ьу 1арапе§е ТЦкие СиЕиге ЛккоааДоп (1996), №11иге Сенек, 24, 314 (2000), и подобные способы.
Примерами спонтанно образующихся мутантов являются мутанты, спонтанно образованные непрерывным субкультивированием в обычных условиях культивирования клеток без применения специальной обработки, вызывающей мутации.
Примерами способа измерения активности фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активности фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, являются способы, описанные в разделе 1(1)(а). Примерами способа выяснения структуры углеводной цепи продуцируемой молекулы антитела являются способы, которые будут описаны далее в разделе 5 или 6. Примерами способа выяснения структуры углеводной цепи гликопротеина в клеточной мембране являются способы, которые будут описаны далее в разделе (5).
(4) Способ ингибирования транскрипции и/или трансляции гена, кодирующего фермент.
- 21 013563
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить ингибированием транскрипции и/или трансляции гена-мишени методом антисмысловой РНК/ДНК [Вюкаепсе апб Ι аби^гу, 50, 322 (1992); СНетМгу. 46, 681 (1991); Вю1есЬпо1оду, 9, 358 (1992); Тгепбк ш Вю1есЬпо1оду, 10, 87 (1992); Тгепбк ш Вю1есЬпо1оду, 10, 152 (1992); Се11 Епдепееппд, 16, 1463 (1997)], методом тройной спирали [Тгепбк ш В1о1есЬпо1оду, 10, 132 (1992)] или подобным методом, с использованием в качестве мишени гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Примерами фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, являются СМО, Рх, СРРР, фукокиназа и подобные ферменты. Примерами фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через αсвязь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, являются α-1,6-фукозилтрансфераза, α-Ь-фукозидаза и подобные ферменты.
(5) Способ отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Клетку-хозяина настоящего изобретения можно получить с использованием способа отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
Примерами способа отбора клеточной линии, невосприимчивой к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Νацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Νгликозидную связь, являются способы, описанные в 8отабс Се11 Мо1. Сепе1., 12, 51 (1986), и подобные способы. В качестве лектина можно использовать любой лектин до тех пор, пока он представляет собой лектин, узнающий структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются лектин Ьепк сиНпапк ЬСА (лентилагглютинин, полученный из Ьепк сиНпапк), лектин гороха Р8А (лектин гороха, полученный из Р18ит кабуит), лектин кормовых бобов УРА (агглютинин, полученный из УШа РаЬа), лектин А1ешта аигаиба ААЬ (лектин, полученный из А1ешта аигапба) и т.п.
Конкретно, клеточную линию, невосприимчивую к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, можно отобрать путем культивирования клеток в течение 1 суток-2 недель, предпочтительно от 1 суток до 1 недели, с использованием среды, содержащей лектин в концентрации от 1 мкг/мл до 1 мг/мл, субкультивирования выживших клеток или пикирования колонии и переноса их в сосуд для культивирования клеток и последующего непрерывного культивирования с использованием лектинсодержащей среды. Примером клеточной линии, полученной таким способом, является СН0/ССВ4-ЬСА №да-13 (РЕЕМ ВР-7756), полученная в примере 14(2), описанном далее.
2. Получение трансгенного, не являющегося человеком животного или растения либо их потомств по настоящему изобретению.
Трансгенное, не являющееся человеком животное или растение либо их потомства по настоящему изобретению представляют собой трансгенное, не являющееся человеком животное или растение либо их потомства, в которых геномный ген модифицирован таким образом, что можно регулировать активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи молекулы антитела, и их можно получить согласно способу, подобному способу в разделе 1, с использованием в качестве мишени гена, кодирующего фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СЭРфукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь.
В трансгенном животном, не являющемся человеком, можно получить эмбриональные стволовые клетки настоящего изобретения, в которых регулируется активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида СОР-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, применяя способ, подобный способу раздела 1, к эмбриональным стволовым клеткам предназначенного для этого животного, не являющегося человеком, такого как крупный рогатый скот, овца, коза, свинья, лошадь, мышь, крыса, домашняя птица, обезьяна, кролик, или подобного
- 22 013563 животного.
Конкретно, получают клон мутантов, в котором ген, кодирующий фермент, имеющий отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 N ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N гликозидную связь, инактивирован или заменен любой последовательностью известным методом гомологичной рекомбинации [например, описанным в №11иге. 326, 6110, 295 (1987); Се11, 51, 3, 503 (1987); или подобным]. С использованием полученного клона мутантов методом инъекции химер в бластоцисту оплодотворенной яйцеклетки животного или методом агрегации химер можно получить химерную особь, содержащую клон эмбриональных стволовых клеток и обычные клетки. Химерную особь скрещивают с обычной особью, так что можно получить трасгенное, не являющееся человеком животное, у которого во всех клетках организма уменьшена или устранена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 N ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N гликозидную связь.
Также можно получить оплодотворенную яйцеклетку настоящего изобретения, в которой уменьшена или устранена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 ^ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через №гликозидную связь, применяя способ, подобный способу раздела 1, к оплодотворенной яйцеклетке представляющего интерес животного, не являющегося человеком, такого как крупный рогатый скот, овца, коза, свинья, лошадь, мышь, крыса, домашняя птица, обезьяна, кролик, или подобного животного.
Трансгенное, не являющееся человеком животное, у которого уменьшена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 ^ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через №гликозидную связь, можно получить путем трансплантации полученной оплодотворенной яйцеклетки в яйцевод или матку псевдобеременной самки с использованием способа трансплантации эмбрионов, описанного в Μαηίρι.ι1αΙίη§ Μοи8е ЕтЬгуо, 8есопб Ε6ίΙίοη, или подобного способа, с последующим рождением животным детенышей.
В трансгенном растении каллюс настоящего изобретения, в котором активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 ^ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через №гликозидную связь, можно получить, применяя способ, подобный способу, описанному в разделе 1, к каллюсу или клеткам растения, представляющего интерес.
Трансгенное растение, в котором уменьшена активность фермента, имеющего отношение к синтезу внутриклеточного углеводонуклеотида ΟΌΡ-фукозы, или активность фермента, имеющего отношение к модификации углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано через α-связь с положением 6 N ацетилглюкозамина на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через N гликозидную связь, можно получить культивированием полученного каллюса с использованием среды, содержащей ауксин и цитокинин, и редифференцировать его согласно известному способу [Т188ие Си1!иге, 20 (1994); Т188ие СиЙиге, 21, (1995); Тгембк ίη Β^οΐесЬηο1ο§у, 15, 45 (1997)].
3. Способ получения композиции антител.
Композицию антител можно получить экспрессированием ее в клетках-хозяевах способом, описанным в Μο^αιΕ-ΐΓ Οοηίη& 8есог1б Ε6ίίίοη; СиггегИ ΡιόΙο^Χ ίη Μο^αιΕ-ΐΓ Βίοίοβν; А^Ьобхек, А ЬаЬога!огу Μαηυαΐ, Со1б 8ρπη§ НагЬог ЬаЬога!огу, 1988 (публикация далее упоминается как Лг1иЬоб1е8); Μοηοс1οηа1 Аг1ЦЬоб1е5: Ρπηάρ^κ апб ΡπκΙ^, ТЫгб Е6йюп, Асаб. Ρκ88, 1993 (публикация далее упоминается как Μοηοс1οηа1 Лг1ЦЬоб1е8); и АпЦЬо6у Е^е^ект^, А ОглсНсе Арргоасй, ΙΒΌ ΡΐΌ88 а! 0х&гб ШитегкИу ΡΐΌ88 (публикация далее упоминается как АпЦЬо6у Еηдеηее^^ηд), например, следующим образом.
Получают полноразмерную кДНК, кодирующую молекулу антитела, и получают фрагмент ДНК соответствующей длины, содержащий часть, кодирующую молекулу антитела.
Получают рекомбинантный вектор, встраивая фрагмент ДНК или полноразмерную кДНК в прямом направлении промотора соответствующего экспрессирующего вектора.
Трансформант, продуцирующий молекулы антител, можно получить, вводя рекомбинантный вектор в клетки-хозяева, подходящие для экспрессирующего вектора.
В качестве клетки-хозяина можно использовать любую дрожжевую клетку, животную клетку, клетку насекомого, растительную клетку или подобную, до тех пор, пока она может экспрессировать ген, представляющий интерес.
- 23 013563
Клетку, такую как дрожжевая клетка, животная клетка, клетка насекомого, растительная клетка или подобная, в которую методом генной инженерии введен фермент, имеющий отношение к модификации углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь, связанную с Рс-областью молекулы антитела, также можно использовать в качестве клетки-хозяина.
В качестве экспрессирующего вектора используют вектор, который может автономно реплицироваться в клетке-хозяине или может интегрироваться в хромосому и содержит промотор в такой позиции, что можно переносить ДНК, кодирующую молекулу антитела.
Из ткани или клеток человека или животного, не являющегося человеком, можно получить кДНК с использованием, например, зонда-праймера, специфического для молекулы антитела, представляющей интерес, согласно способам, описанным при получении ДНК в разделе 1(1)(а).
Когда в качестве клетки-хозяина используют дрожжевую клетку, примерами экспрессирующего вектора являются УЕР13 (АТСС 37115), ΥΕρ24 (АТСС 37051), УСр50 (АТСС 37419) и подобные векторы.
Можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в дрожжах. Примерами являются промотор гена гликолитического метаболического пути, такой как ген гексозокиназы, и т.п., промотор РН05, промотор РСК, промотор САР, промотор ЛЭН, промотор да1 1, промотор да1 10, промотор белков теплового шока, промотор МР α1, промотор СИР 1 и подобные.
Примерами клеток-хозяев являются микроорганизмы, принадлежащие к роду 8ассйаготусек, роду 8сЫ/окассйаготусек, роду К1иууеготусек, роду Тпсйокрогоп, роду 8сйгапшотусек и подобным, такие как 8ассйаготусек сегеу1к1ае, 8с1нхокасс11аготусек ротЬе, К1иууеготусек 1асбк, Тпсйокрогоп ри11и1апк и 8сйгапшотусек а11иушк и т.п.
В качестве способа введения рекомбинантного вектора можно использовать любой способ до тех пор, пока он позволяет вводить ДНК в дрожжи. Примерами являются электропорация [Ме!1обк ш Епхуто1оду, 194, 182 (1990)], сферопластовый способ [Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ И8А, 84, 1929 (1978)], литийацетатный способ [1. Вас!егю1., 153, 163 (1983)], способ, описанный в Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ И8А, 75, 1929 (1978), и подобные способы.
Когда в качестве клетки-хозяина используют животную клетку, примерами экспрессирующего вектора являются рсиНА!, рсИМ8 (доступные от РипакокЫ), рАСЕ107 [опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 22979/91; Су!о!ес1по1оду, 3, 133 (1990)], рА83-3 (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 227075/90), рСИМ8 [№!иге, 329, 840 (1987)], ρс^NАI/Атρ (производимый Шуйгодеп), рКЕР4 (производимый Шуйгодеп), рАСЕ103 |б. В1осйет1к!гу, 101, 1307 (1987)], рАСЕ210 и подобные векторы.
Можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в животной клетке. Примерами являются промотор ГЕ (немедленно-раннего) гена цитомегаловируса (СМV), ранний промотор 8ν40, промотор ретровируса, промотор металлотионеина, промотор теплового шока, промотор 8К</. и т.п. Также вместе с промотором можно использовать энхансер Ш гена СМV человека.
Примерами клетки-хозяина являются клетки человека, такие как клетки Nата1\νа. клетки обезьяны, такие как клетки СО8, клетки китайского хомячка, такие как клетки СНО или НВТ5637 (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 299/88), клетки миеломы крысы, клетки миеломы мыши, клетки, полученные из почек сирийского хомячка, эмбриональные стволовые клетки, оплодотворенные яйцеклетки и т. п.
В качестве способа введения рекомбинантного вектора можно использовать любой способ до тех пор, пока он позволяет вводить ДНК в животную клетку. Примерами являются электропорация [Су!о!ес1по1оду, 3, 133 (1990)], кальцийфосфатный способ (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 227075/90), способ липофекции [Ргос. №111. Асаб. δα. И8А, 84, 7413 (1987)], инъекционный способ [Машри1абпд !1е Мойке ЕтЬгуо, А ЬаЬога!огу Мапиа1], способ с использованием инжектора частиц (генная пушка) (патент Японии № 2606856, патент Японии № 2517813), ^ЕЛЕ-декстрановый способ [В1отапиа1 8епек 4 - Сепе ТгапкГег апб Ехргеккюп Апа1ук1к (Уобо-кйа), ебйеб Ьу ТакакЫ Уоко1а апб Кеп1сЫ Ага1 (1994)], способ с вирусным вектором (Машри1а!шд Мойке ЕтЬгуо, 8есопб Ебйюп) и подобные способы.
Когда в качестве клетки-хозяина используют клетку насекомого, белок можно экспрессировать способом, описанным в Сштеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Васи1оуник Ехргеккюп Vес!ο^к, А ЬаЬога!огу Мапиа1, №.Н. Ргеетап апб Сотрапу, №\ν Уогк (1992), Вю/Тесйпо1оду, 6, 47 (1988), или подобным способом.
Иными словами, белок можно экспрессировать путем одновременного введения в клетку насекомого вектора, вводящего рекомбинантный ген, и бакуловируса, получить в супернатанте культуры клеток насекомого рекомбинантный вирус и затем инфицировать клетку насекомого рекомбинантным вирусом.
Примерами вводящего ген вектора, используемого в таком способе, являются ρV^1392, ρV^1393, рВ1иеВасШ (все производятся !пу11годеп) и подобные векторы.
Примерами бакуловируса являются вирус ядерного полиэдроза Аи!одгарйа саШогшса, которым заражено насекомое семейства Вага!1га.
- 24 013563
Примерами клеток насекомого являются ооциты 8Г19 и 8Г21 8робор1сга Ггищрсгба [Сиггсп! Рго1осо1е ίη Мо1сси1аг Вю1оду, Васи1оу1гие Ехргсееюп УссЮге, А ЬаЬога!огу Мапиа1, XV.Н. Ргсстап апб Сотрапу, №\ν Уогк (1992)], ооциты Н1дй 5 Тпсйорйыа ηί (производимые [пуйгодсп) и подобные клетки.
Примерами способа одновременного введения вектора, вводящего рекомбинантный ген, и бакуловируса для получения рекомбинантного вируса являются кальцийфосфатный способ (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 227075/90), способ липофекции [Ргос. №И. Асаб. 8сй И8А, 84, 7413 (1987)] и подобные способы.
Когда в качестве клетки-хозяина используют растительную клетку, примерами экспрессирующего вектора являются Т1-плазмида, вирус табачной мозаики и подобные векторы.
В качестве промотора можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в растительной клетке. Примерами являются промотор 358 вируса мозаики цветной капусты (СаМУ), промотор актина 1 риса и подобные промоторы.
Примерами клеток-хозяев являются клетки таких растений, как табак, картофель, томат, морковь, соя, рапс, люцерна, рис, пшеница, ячмень и т.д., и подобные клетки.
В качестве способа введения рекомбинантного вектора можно использовать любой способ до тех пор, пока он позволяет вводить ДНК в растительную клетку. Примерами являются способ с использованием АдгоЬасВгшт (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 140885/84, опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 70080/85, ^№О 94/00977), электропорация (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 251887/85), способ с использованием инжектора частиц (генная пушка) (патент Японии № 2606856, патент Японии № 2517813) и подобные способы.
В качестве способа экспрессии гена, выделение продукции, экспрессию слитого белка Рс-области с другим белком и т.п. можно осуществлять согласно способу, описанному в Мо1сси1аг С1ошпд, 8ссопб Ебйюп, или подобным способом, в дополнение к способу прямой экспрессии.
Когда ген экспрессируется бактерией, дрожжами, животной клеткой, клеткой насекомого или растительной клеткой, в которые введен ген, имеющий отношение к синтезу углеводной цепи, можно получить молекулу антитела, к которой с помощью введенного гена добавлена углеводная цепь.
Композицию антител можно получить культивированием полученного трансформанта в среде для продукции и накопления молекул антител в культуре и последующим выделением их из полученной культуры. Способ культивирования трансформанта с использованием среды можно осуществить согласно общему способу, который используют для культивирования клеток-хозяев.
Средой для культивирования полученного трансформанта с использованием в качестве клетокхозяев прокариот, таких как ЕесйспсЫа сой и т.п., или эукариот, таких как дрожжевые клетки и т.п., может быть или природная среда, или синтетическая среда до тех пор, пока она содержит вещества, такие как источник углерода, источник азота, неорганические соли и т.п., которые могут ассимилироваться организмом, и в ней может эффективно осуществляться культивирование трансформанта.
В качестве источника углерода можно использовать источники, которые могут усваиваться организмом. Примерами являются углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, содержащая их меласса, крахмал, гидролизат крахмала и т.п.; органические кислоты, такие как уксусная кислота, пропионовая кислота и т.п.; спирты, такие как этанол, пропанол и т.п.; и подобные вещества.
Примерами источника азота являются аммиак, аммониевые соли неорганических кислот или органических кислот, такие как хлорид аммония, сульфат аммония, ацетат аммония, фосфат аммония и т.п.; другие азотсодержащие соединения; пептон; мясной экстракт; дрожжевой экстракт; кукурузный настой; гидролизат казеина; соевая мука; гидролизат соевой муки; различные ферментированные клетки и их гидролизаты и подобные источники.
Примерами неорганических веществ являются дигидрофосфат калия, дикалийгидрофосфат, фосфат магния, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, сульфат меди, карбонат кальция и подобные вещества.
Культивирование обычно осуществляют в аэробных условиях, таких как при культивировании при встряхивании, глубинном культивировании при аэрации с перемешиванием или подобных условиях. Температура культивирования составляет предпочтительно 15-40°С и время культивирования, как правило, составляет от 16 ч до 7 суток. Во время культивирования поддерживают рН на уровне 3,0-9,0. Регулируют рН с использованием неорганической или органической кислоты, раствора щелочи, мочевины, карбоната кальция, аммиака или подобных веществ.
При необходимости в среду во время культивирования можно добавить антибиотик, такой как ампициллин, тетрациклин или подобный.
Когда культивируют микроорганизм, трансформированный рекомбинантным вектором, полученным с использованием в качестве промотора индуцируемого промотора, в среду при необходимости можно добавлять индуктор. Например, когда культивируют микроорганизм, трансформированный рекомбинантным вектором, полученным с использованием 1ас-промотора, в среду можно добавить изопропил-в-Э-тиогалактопиранозид, а когда культивируют микроорганизм, трансформированный рекомбинантным вектором, полученным с использованием ΐιρ-промотора, в среду можно добавить индолакриловую кислоту.
- 25 013563
Когда культивируют трансформант. полученный с использованием в качестве клеток-хозяев животных клеток. примерами среды являются обычно используемые среда ВРМ1 1640 [ТНе ίοπΓπη1 οί (Не Атепсап Меб1са1 А88οс^аΐ^οη. 199. 519 (1967)]. среда Игла ΜΕΜ [8с1епсе. 122. 501 (1952)]. модифицированная по Дульбекко среда ΜΕΜ [Упю^ду. 8. 396 (1959)]. среда 199 [Ргосеебтд οί (Не 8οс^еΐу ίοτ (Не Βίο1οβχη1 Μеά^с^ηе. 73. 1 (1950)] и среда Уиттена [^еνе1ορтеηΐа1 Εηдеηее^^ηд Εxρе^^теηΐаΐ^οη Μаηиа1 - Ргераηΐίοη οί Тгашкдешс Μ^ (Κοάη-δΗη). ебНеб Ьу Μ. КайНиИ (1987)]. среды. в которые добавлена фетальная телячья сыворотка. и подобные среды.
Культивирование. как правило. осуществляют при рН 6-8 и 30-40°С в течение 1-7 суток в присутствии 5% СО2. При необходимости в среду во время культивирования можно добавить антибиотик. такой как канамицин. пенициллин или подобный.
Примерами среды для применения при культивировании трансформанта. полученного с использованием в качестве клеток-хозяев клеток насекомых. являются обычно используемые среда ТNΜ-ЕН (производимая РНагтшдеп). среда δί-900 II 8ΕΜ (производимая Ьйе ТесНгю^^е^). ΕxСе11 400 и ΕxСе11 405 (обе производятся ЖН Вю5с1епсе5). среда Грейса для клеток насекомых ^аШге. 195. 788 (1962)] и подобные среды.
Культивирование. как правило. осуществляют при рН среды 6-7 и 25-30°С в течение 1-5 суток.
Кроме того. если в данном случае требуется. в среду во время культивирования можно добавить антибиотики. такие как гентамицин.
Трансформант. полученный с использованием в качестве клеток-хозяев растительных клеток. можно культивировать как клетки или путем дифференциации их в клетках или органе растения. Примерами среды для культивирования трансформанта являются обычно используемые среда ΜπίΏδΗΐ^ и 81<οοβ (Μ8) и среда Уайта. среды. в которые добавлены растительные гормоны. такие как ауксин. цитокинин и т.п.. и подобные среды.
Культивирование. как правило. осуществляют при рН 5-9 и 20-40°С в течение 3-60 суток.
При необходимости в среду во время культивирования можно добавить антибиотик. такой как канамицин. гигромицин или подобный.
Соответственно. композицию антител можно получить культивированием трансформанта. полученного из микроорганизма. животных клеток или растительных клеток. содержащих рекомбинантный вектор. в который встроена ДНК. кодирующая молекулу антитела. согласно общему способу культивирования. посредством которого получают и накапливают композицию антител. и последующим выделением композиции антител из культуры.
В качестве способа экспрессии гена выделение продукции. экспрессию слитого белка и т.п. можно осуществить согласно способу. описанному в ΜοΚ^Η!· Οοηίη§. Зетошб Εάίΐίοη. в добавление к способу прямой экспрессии.
Примерами способа получения композиции антител являются способ внутриклеточной экспрессии в клетках-хозяевах. способ внеклеточной секреции от клеток-хозяев и способ получения на внешней оболочке мембраны клеток-хозяев. Способ можно выбрать. заменяя используемую клетку-хозяина или структуру получаемой композиции антител.
Когда композицию антител настоящего изобретения получают в клетках-хозяевах или на внешней оболочке мембраны клеток-хозяев. ее можно положительно секретировать вне клеток согласно способу Ра^топ е( а1. [1. Βίο1. СНет.. 264. 17619 (1989)]. способу Ηο\\Ό е( а1. [Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А. 86. 8227 (1989). Сепе Эеге^р.. 4. 1288 (1990)]. способам. описанным в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 336963/93 и в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 823021/94. и подобным способом.
Иными словами. молекулы антитела. представляющие интерес. можно секретировать из клетокхозяев вне клеток. встраивая ДНК. кодирующую молекулу антитела. и ДНК. кодирующую сигнальный пептид. подходящий для экспрессии молекулы антитела. в экспрессирующий вектор с использованием метода генетической рекомбинации. вводя экспрессирующий вектор в клетки-хозяева с последующей экспрессией молекул антитела.
Также продуцируемое количество можно увеличить согласно способу. описанному в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 227075/90. с использованием системы амплификации гена. использующей ген дигидрофолатредуктазы.
Кроме того. композицию антител также можно получить с использованием отдельного животного с введенным геном (трансгенного животного. не являющегося человеком) или отдельного растения (трансгенного растения). сконструированного редифференциацией животной или растительной клетки. в которую введен ген.
Когда трансформант представляет собой отдельное животное или отдельное растение. композицию антител можно получить согласно общему способу его выращивания или культивирования для продукции и накапливания посредством этого композиции антител с последующим выделением композиции антител из отдельного животного или растения.
Примером способа получения композиции антител с использованием животной особи является способ. при котором композицию антител. представляющую интерес. получают в животном. созданном пу
- 26 013563 тем введения гена согласно известному способу [Атепсап 1оита1 о£ С11шса1 №1пйоп, 63, 6278 (1996); Вю/Тескпо1оду, 9, 830 (1991)].
В случае животной особи композицию антител можно получить, выращивая трансгенное животное, не являющееся человеком, в которое введена ДНК, кодирующая молекулу антитела, для продуцирования и накапливания посредством этого композиции антител в животном, с последующим выделением композиции антител из животного. Примерами места в организме животного, где продуцируется и накапливается композиция, являются молоко (опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 309192/88) и яйца животного. В качестве промотора, используемого в таком случае, можно использовать любой промотор до тех пор, пока он может функционировать в организме животного. Предпочтительными примерами являются специфические промоторы клеток молочной железы, такие как промотор α-казеина, промотор β-казеина, промотор β-лактоглобулина, промотор кислого белка молочной сыворотки и подобные промоторы.
Примером способа получения композиции антител с использованием отдельного растения является способ, при котором композицию антител получают, культивируя трансгенное растение, в которое известным способом введена ДНК, кодирующая молекулу антитела [Тккие СиНиге, 20 (1994); Тккие Си11иге, 21 (1995); Тгепбк ш Вю1есйпо1оду, 15, 45 (1997)], для продуцирования и накапливания композиции антител в растении, и извлекая затем композицию антител из растения.
Что касается очистки композиции антител, продуцированной трансформантом, в который введен ген, кодирующий молекулу антитела, например, когда композиция антител экспрессируется внутри клетки в растворенном состоянии, то клетки после культивирования извлекают центрифугированием, суспендируют в водном буферном растворе и затем разрушают с использованием ультразвукового генератора, пресса Френча, гомогенизатора Мап!оп Саи1т, бупотШ или подобного устройства, и получают бесклеточный экстракт. Очищенный продукт композиции антител можно получить из супернатанта, полученного центрифугированием бесклеточного экстракта, используя общие методы выделения ферментов в чистом виде, такие как экстракция растворителями; высаливание; обессоливание с помощью сульфата аммония и т.п.; осаждение органическим растворителем; анионообменная хроматография с использованием такой смолы, как диэтиламиноэтилсефароза (ΌΕΑΕ-сефароза), ΌΙΑΙΟΝ НРА-75 (производимая ΜίΙδιώίδΙιί Сйетюа1), и т.п.; катионообменная хроматография с использованием такой смолы, как 8сефароза ЕЕ (производимая Рйагтас1а), и т.п.; гидрофобная хроматография с использованием такой смолы, как бутилсефароза, фенилсефароза и т.п.; гель-фильтрация с использованием молекулярных сит; аффинная хроматография; хроматофокусирование; электрофорез, такой как изоэлектрическое фокусирование, и т.п.; и подобные методы, которые можно использовать одни или в комбинации.
Также, когда композиция антител экспрессируется внутри клеток путем образования нерастворимых включений, клетки извлекают, разрушают и центрифугируют теми же способами, и нерастворимую массу композиции антител извлекают в виде осажденной фракции. Выделенную нерастворимую массу композиции антител солюбилизируют с использованием агента, денатурирующего белки. Композицию антител переводят в нормальную трехмерную структуру, растворяя или диализуя солюбилизированный раствор, и затем получают очищенную композицию антител тем же способом выделения в чистом виде.
Когда композиция антител секретируется вне клеток, композицию антител или их производные можно выделить из культурального супернатанта. Иными словами, культуру обрабатывают таким методом, как центрифугирование, или подобным методом, и получают растворимую фракцию, и очищенный препарат композиции антител можно получить из растворимой фракции тем же способом выделения в чистом виде.
Примеры полученной таким образом композиции антител включают в себя антитело, фрагмент антитела, слитый белок, содержащий Ес-фрагмент антитела и т.п.
В качестве примера получения композиции антител ниже подробно описывается способ получения композиции гуманизированных антител, но композиции других антител также можно получать способом, подобным описанному.
(1) Конструирование вектора для экспрессии гуманизированных антител.
Вектор для экспрессии гуманизированных антител представляет собой экспрессирующий вектор для животной клетки, в который встроены гены, кодирующие С-области тяжелой цепи (Н-цепи) и легкой цепи (Ъ-цепи) человеческого антитела, который можно сконструировать клонированием каждого из генов, кодирующих С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела, в экспрессирующий вектор для животной клетки.
С-области человеческого антитела могут представлять собой Н-цепь и Ь-цепь любого человеческого антитела. Примерами являются С-область, принадлежащая к подклассу 1дС1 в Н-цепи человеческого антитела (называемая далее ’ЪСу1), С-область, принадлежащая к классу к в Ь-цепи человеческого антитела (называемая далее ’ЪСк), и подобные С-области.
В качестве генов, кодирующих С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела, можно использовать хромосомную ДНК, содержащую экзон и интрон, или также можно использовать кДНК.
В качестве экспрессирующего вектора для животной клетки можно использовать любой вектор до
- 27 013563 тех пор, пока ген, кодирующий С-область человеческого антитела, можно встроить в него и экспрессировать в нем. Примерами являются рАСЕ107 [Су1о1есйпо1оду, 3, 133 (1990)], рАСЕ103 [I. Вюсйет., 101, 1307 (1987)], РН8С274 [Сепе, 27, 223 (1984)], рКСК [Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 78, 1527 (1981)], р8С1 β б2-4 [Су1о1есйпо1оду, 4, 173 (1990)] и подобные векторы. Примерами промотора и энхансера в экспрессирующем векторе для животной клетки являются ранний промотор и энхансер 8У40 [I. Вюсйет., 101, 1307 (1987)], промотор ЬТК вируса лейкоза Молони мыши [Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип., 149, 960 (1987)], промотор Н-цепи иммуноглобулина [Се11, 41, 479 (1985)] и энхансер [Се11, 33, 717 (1983)] и т.п.
Экспрессирующий вектор гуманизированного антитела может быть или типа, в котором гены, кодирующие Н-цепь и Ь-цепь антитела, существуют на отдельных векторах, или типа, в котором оба гена существуют на одном и том же векторе (тандемный тип). Что касается легкости конструирования экспрессирующего вектора гуманизированных антител, легкости введения в животные клетки и баланса между количествами экспрессии Н- и Ь-цепей антитела в животных клетках, более предпочтителен тандемный тип экспрессирующего вектора гуманизированного антитела [Э. 1ттипо1. МеДюбк, 167, 271 (1994)].
Сконструированный экспрессирующий вектор гуманизированных антител можно использовать для экспрессии в животных клетках человеческих химерных антител и человеческих СЭК-привитых антител.
(2) Получение кДНК, кодирующей У-область антитела, полученного от животного, не являющегося человеком.
кДНК, кодирующую У-области Н-цепи и Ь-цепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком, такого как мышиное антитело, можно получить следующим образом.
Синтезируют кДНК, экстрагируя мРНК из гибридомных клеток, продуцирующих представляющие интерес мышиные антитела. Синтезированную кДНК клонируют в вектор, такой как фаг или плазмида, и получают библиотеку кДНК. Каждые рекомбинантный фаг или рекомбинантную плазмиду, содержащие кДНК, кодирующую У-область Н-цепи, и рекомбинантный фаг или рекомбинантную плазмиду, содержащие кДНК, кодирующую У-область Ь-цепи, выделяют из библиотеки с использованием части Собласти или части У-области существующего мышиного антитела в качестве зонда. Определяют полные нуклеотидные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи представляющего интерес мышиного антитела на рекомбинантном фаге или рекомбинантной плазмиде, и из нуклеотидных последовательностей расшифровывают полные аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи.
В качестве животного, но не человека, можно использовать любое животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик, или подобное животное до тех пор, пока в нем можно получить гибридомные клетки.
Примерами способа получения полной РНК из гибридомных клеток являются способ с гуанидинтиоцианатом и трифторацетатом цезия [Ме1йобк ш Еп7уто1оду, 154, 3 (1987)] и подобные способы, и примерами способа получения мРНК из полной РНК являются колоночный способ с олиго(бТ), иммобилизованным на целлюлозе (Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб Ебйюп), и подобные способы. Кроме того, примерами набора для получения мРНК из гибридомных клеток являются набор Еак! Тгаск тКЫА 1ко1а1юп (производимый 1пуйгодеп), набор Цшск Ргер тКЫА РцпДсаДоп (производимый Рйагтааа) и подобные наборы.
Примерами способа синтеза кДНК и получения библиотеки кДНК являются обычные способы (Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб Ебйюп, Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 8ирр1етеп! 1-34), способы с использованием коммерчески доступных наборов, таких как 8ИРЕК8СК1РТ™, Р1акт1б 8ук!ет £ог сЭКА 8уп111ек1к апб Р1акт1б С1ошпд (производимые С1ВСО ВКЬ) или набор ΖΛР-с^NА 8уп1Ьек1к (производимый 81га!адепе), и подобные наборы.
При получении библиотеки кДНК вектор, в который в качестве матрицы встраивают кДНК, синтезированную с использованием мРНК, экстрагированной из гибридомных клеток, может представлять собой любой вектор до тех пор, пока можно встроить кДНК. Примерами являются ΖΛР Ехргекк [81га!ещек, 5, 58 (1992)], рВ1иексг1р1 II 8К(+) [Мис1е1с Ас1бк Кекеагсй, 17, 9494 (1989)], λ/арИ (производимый 81га1адепе), λ§110 и λ§ΐ 11 [^NА С1ошпд, А РгасДса1 Арргоасй, I, 49 (1985)], ЬВ1иеМ1б (производимый С1оп1есй), ЛЕхСе11, рТ7Т3 18И (производимые РйагтаДа), рсЭ2 [Мо1. Се11. Вю1., 3, 280 (1983)], рИС18 [Сепе, 33, 103 (1985)], и подобные векторы.
В качестве ЕксйепсЫа сой, в которую вводят библиотеку кДНК, сконструированную из фагового или плазмидного вектора, можно использовать любую ЕксйепсЫа сой до тех пор, пока можно вводить, экспрессировать и поддерживать библиотеку кДНК. Примерами являются ХЬ1-В1ие МКЕ' [81га1ед1ек, 5, 81 (1992)], С600 [СепеДск, 39, 440 (1954)], Υ1088 и Υ1090 [8аепсе, 222, 778 (1983)], ЫМ522 [I. Мо1. Вю1., 166, 1 (1983)], К802 [I. Мо1. Вю1., 16, 118 (1966)], 1М105 [Сепе, 38, 275 (1985)], и т.п.
В качестве способа отбора из библиотеки кДНК клона кДНК, кодирующей У-области Н-цепи и Ьцепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком, можно использовать гибридизацию колоний или гибридизацию в бляшках с использованием зонда, меченного изотопом или флуоресцентной меткой (Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб Ебйюп). Кодирующую У-области Н-цепи и Ь-цепи кДНК также можно получить, получая праймеры и осуществляя полимеразную цепную реакцию (далее называемую ПЦР, Мо1еси1аг С1ошпд, 8есопб Ебйюп; Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 8ирр1етеп! 1-34)
- 28 013563 с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной из мРНК, или библиотеки кДНК.
Нуклеотидные последовательности кДНК можно определить, расщепляя отобранные кДНК соответствущими рестрикционными ферментами, клонируя фрагменты в плазмиду, такую как рВ1ие5спр1 δΚ(-) (производимую 81га!адепе) или подобную, осуществляя взаимодействие обычно используемого способа анализа нуклеотидных последовательностей, такое как в дидезокси-способе ртос. ИаИ. Лсаб. δα. И8Л, 74, 5463 (1977)], 8апдег е1 а1., или подобное взаимодействие, и затем анализируя клоны с использованием автоматического анализатора нуклеотидных последовательностей, такого как секвенатор ДНК Л.Ь.Р. (производимый Ρйа^тас^а), или подобное устройство. Кодируют или нет полученные кДНК полные аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи антитела, содержащего секреторную сигнальную последовательность, можно подтвердить, расшифровывая полные аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи из определенных нуклеотидных последовательностей и сравнивая их с полными аминокислотными последовательностями У-областей Н-цепей и Ь-цепей известных антител |8ес.|иепсе5 о£ ΡΐΌΕίΐ'ΐδ о£ [ттипо1ощса1 [ЩегеБк υδ Ьер. НеаЕЕ апб 8егу1се§ (1991)].
(3) Анализ аминокислотной последовательности У-области антитела, полученного от животного, не являющегося человеком.
Что касается полных аминокислотных последовательностей У-областей Н-цепи и Ь-цепи антитела, содержащего секреторную сигнальную последовательность, то можно установить длину секреторной сигнальной последовательности и Ν-концевых аминокислотных последовательностей, и также можно найти подгруппы, к которым они принадлежат, сравнивая их с полными аминокислотными последовательностями У-областей Н-цепей и Ь-цепей известных антител |8ес.|иепсе5 о£ ΡΐΌ^ίιΐδ о£ 1ттипо1о§1са1 1п1еге81, υδ Ьер. НеаНЕ апб Нитап 8егу1се§ (1991)]. Кроме того, также можно найти аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи каждого СОВ, сравнивая их с полными аминокислотными последовательностями У-областей Н-цепей и Ь-цепей известных антител |8ес.|иепсе5 о£ Ρ^оΐе^пδ о£ 1ттипо1ощса1 [ЩегеБк И8 Ьер. НеаЕЕ апб Нитап 8егу1се§ (1991)].
(4) Конструирование вектора для экспрессии человеческих химерных антител.
Вектор для экспрессии человеческих химерных антител можно сконструировать путем клонирования кДНК, кодирующих У-области Н-цепи и Ь-цепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком, перед генами, кодирующими С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела, в векторе для экспрессии гуманизированных антител, сконструированном в разделе 3(1). Например, вектор для экспрессии человеческих химерных антител можно сконструировать, соединяя каждую из кДНК, кодирующих У-области Н-цепи и Ь-цепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком, с синтетической ДНК, содержащей нуклеотидные последовательности в 3'-концах У-областей Нцепи и Ь-цепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком, и нуклеотидными последовательностями в 5'-концах С-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела, и имеющей также в обоих концах последовательность, узнаваемую соответствующим рестрикционным ферментом, и клонируя их перед генами, кодирующими С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела, содержащимися в сконструированном векторе для экспрессии гуманизированных антител, описанном в разделе 3(1).
(5) Конструирование кДНК, кодирующей У-область человеческого антитела с привитым СОВ.
кДНК, кодирующие У-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела с привитым СОВ, можно получить следующим образом. Сначала отбирают аминокислотные последовательности каркасных участков (называемых далее РВ) У-областей Н-цепи и Ь-цепи антитела, полученного от животного, не являющегося человеком. В качестве аминокислотных последовательностей РВ У-областей Н-цепи и Ьцепи человеческого антитела можно использовать любые аминокислотные последовательности до тех пор, пока они получены из человеческого антитела. Примерами являются аминокислотные последовательности РВ У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческих антител, зарегистрированные в базе данных, такой как ΡΐΌ^ίπ Ьа1а Вапк, и т.п., аминокислотные последовательности, обычные в каждой подгруппе РВ У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческих антител РесщепсеБ о£ ΡΐΌΕίΒδ о£ [ттипо1ощса1 [ЩегсБк υδ Оер. Неа1111 апб Нитап δе^ν^сеδ (1991)], и подобные аминокислотные последовательности. Но для того, чтобы получить человеческое антитело с привитым СОВ, обладающее сильной активностью, предпочтительно отобрать аминокислотную последовательность с максимально возможной гомологией (по меньшей мере 60% или большей) с аминокислотными последовательностями У-областей Н-цепи и Ь-цепи антитела, представляющего интерес, полученного от животного, не являющегося человеком.
Затем аминокислотные последовательности СОВ У-областей Н-цепи и Ь-цепи антитела, представляющего интерес, полученного от животного, не являющегося человеком, прививают к отобранным аминокислотным последовательностям У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела для создания аминокислотных последовательностей У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела с привитым СОВ. Созданные аминокислотные последовательности превращают в последовательности ДНК, учитывая частоту применения кодона, обнаруженного в нуклеотидных последовательностях генов антитела РесщепсеБ о£ ΡΐΌΕίΐ'ΐδ о£ 1ттипо1од1са1 1п1еге81, υδ Ьер. Неа1Ш апб Нитап δе^ν^сеδ (1991)], и создают последовательности ДНК, кодирующие аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела с привитым СОВ. На основе созданных последовательностей ДНК синтезируют
- 29 013563 некоторые синтетические фрагменты ДНК длиной примерно в 100 оснований, и осуществляют ПЦР с использованием их. В таком случае предпочтительно создавать 6 синтетических ДНК в каждой Н-цепи и Ь-цепи с точки зрения эффективности реакции ПЦР и длин ДНК, которые можно синтезировать.
Также их можно легко клонировать в вектор для экспрессии гуманизированных человеческих антител, сконструированный в разделе 3(1), вводя последовательности для узнавания соответствующей рестриктазой в 5'-концы синтетической ДНК, присутствующие на обоих концах. После ПЦР амплифицированный продукт клонируют в плазмиду, такую как рВ1ие8СГ1р! 8К(-) (производимую 8!га!адепе) или подобную, и определяют нуклеотидные последовательности способом, описанным в разделе 3(2), и посредством этого получают плазмиду с последовательностями ДНК, кодирующими аминокислотные последовательности У-областей Н-цепи и Ь-цепи нужного человеческого антитела с привитым СБК.
(6) Конструирование вектора для экспрессии человеческих антител с привитыми СБК.
Вектор для экспрессии человеческих антител с привитыми СБК можно сконструировать, клонируя кДНК, кодирующие У-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела с привитым СБК, сконструированные в разделе 3(5), перед генами, кодирующими С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела в векторе для экспрессии гуманизированных антител, описанном в разделе 3(1). Например, вектор для экспрессии человеческих антител с привитыми СБК можно сконструировать, вводя последовательности узнавания соответствующей рестриктазой в 5'-концы обоих концов фрагмента синтетической ДНК из числа фрагментов синтетической ДНК, используемых при осуществлении ПЦР в разделе 3(5) для конструирования У-областей Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела с привитым СБК, с тем, чтобы клонировать их перед генами, кодирующими С-области Н-цепи и Ь-цепи человеческого антитела в векторе для экспрессии гуманизированных антител, описанном в разделе 3(1), таким образом, что они могут экспрессироваться в подходящей форме.
(7) Устойчивое продуцирование гуманизированных антител.
Трансформант, способный устойчиво продуцировать человеческие химерные антитела и человеческие антитела с привитыми СБК (те и другие далее называются гуманизированными антителами), можно получить, вводя векторы для экспрессии гуманизированных антител, описанные в разделах 3(4) и (6), в соответствующие животные клетки.
Примерами способа введения вектора для экспрессии гуманизированных антител в животную клетку являются электропорация [опубликованная рассмотренная заявка на патент Японии № 257891/90, Су!о!есЬпо1о§у, 3, 133 (1990)] и подобные способы.
В качестве животной клетки, в которую вводят вектор для экспрессии гуманизированных антител, можно использовать любую клетку до тех пор, пока она представляет собой животную клетку, которая может продуцировать гуманизированные антитела.
Примерами являются клетки миеломы мыши, такие как клетка Ν80 и клетка 8Р2/0, клетки яичников китайского хомячка, такие как клетка СН0/б11Гг- и клетка СН0/БС44, клетки миеломы крысы, такие как клетка УВ2/0 и клетка ΙΚ983Ε, клетки ВНК, полученные из почек сирийского хомячка, клетки миеломы человека, такие как клетка Штайга, и подобные клетки, и предпочтительны клетки яичников китайского хомячка СН0/БС44, клетки миеломы крысы УВ2/0 и клетки-хозяева настоящего изобретения, описанные в разделе 5.
После введения вектора для экспрессии гуманизированных антител трансформант, способный устойчиво продуцировать гуманизированные антитела, можно отобрать, используя среду для культивирования животных клеток, содержащую такое вещество, как сульфат С418 (называемый далее С418; производится 81СМА), и подобные вещества, согласно способу, описанному в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 257891/90. Примерами среды для культивирования животных клеток являются среда КРМ1 (производимая Νίδδΐιί Рйагтасеибса1), среда С1Т (производимая №1юп РЬагтасеибса1), среда ЕХ-СЕЬЬ 302 (производимая 1КН), среда 1МБМ (производимая С1ВС0 ВКЬ), среда Н1Ьг1бота-8ЕМ (производимая С1ВС0 ВКЬ), среды, полученные добавлением к указанным средам различных добавок, таких как сыворотка плода коровы (называемая далее ЕВ8), и подобные среды. Гуманизированные антитела можно получать и накапливать в культуральном супернатанте, культивируя полученный трансформант в среде. Уровень экспрессии и антигенсвязывающую активность гуманизированных антител в культуральном супернатанте можно определить таким способом, как твердофазный иммуноферментный анализ [далее называемый ЕЫ8А; АпйЬоФек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу. СЬар!ег 14 (1998), Мопос1опа1 АпйЬоФек: Ргтар1е8 апб Ргасбсе, Асабеиис Рге§8 Ытйеб (1996)], или подобными способами. Также можно повысить уровень экспрессии гуманизированных антител трансформантом, используя систему амплификации генов БНЕК согласно способу, описанному в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 257891/90.
Гуманизированные антитела можно очистить от культурального супернатанта с использованием колонки для протеина А [АпбЬоб1е8: А ЬаЪога!огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЪога!огу, СЬар!ег 14 (1998), Мопос1опа1 АпбЬоб1е8: Рг1пс1р1ез апб Ргасбсе, Асабеиис Рге§8 Ытйеб (1996)]. Кроме того, можно также использовать способы очистки, обычно применяемые для очистки белков. Например, очистку можно осуществить, сочетая гель-фильтрацию, ионнобменную хроматографию и ультрафильтрацию. Молекулярную массу Н-цепи, Ь-цепи или молекулы антитела в целом очищенных гуманизированных
- 30 013563 антител можно измерить, например, методом электрофореза в полиакриламидном геле [называемым далее 808-РАСЕ; ^Ыге, 227, 680 (1970)], методом Вестерн-блоттинга [Ап!1Ьой1еб: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Сйар!ег 14 (1998), Мопос1опа1 Ап!1Ьой1еб: Ргтар1еб апй Ргасйсе, Асайетю Ргебб Ытйей (1996)], или подобным методом.
Таким образом, описаны способы получения композиции антител с использованием животных клеток в качестве клеток-хозяев, но, как описано выше, композицию антител также можно получить с помощью дрожжевых клеток, клеток насекомых, растительных клеток, отдельного животного или отдельного растения теми же способами, что и в случае животных клеток.
Когда клетка-хозяин обладает от природы способностью экспрессировать молекулы антител, композицию антител настоящего изобретения можно получить с использованием способа, описанного в разделе 1, культивируя клетки, и затем выделяя из полученной культуры в чистом виде композицию антител, представляющих интерес.
4. Оценка активности композиции антител.
В качестве способа измерения количества очищенной композиции антител, активности связывания с антителами и эффекторной функции очищенной композиции антител можно использовать известный способ, описанный в Мопос1опа1 Ап!1Ьой1еб, АпЕЬойу Епдепееппд, и подобные способы.
Например, когда композиция антител является гуманизированными антителами, активность связывания с положительной на антиген культивированной клеточной линией можно измерить способами, такими как ЕЫ8А, иммунофлуоресцентный способ [Сапсег 1ттипо1. 1ттипо!йег., 36, 373 (1993)], и подобными способами. Цитотоксическую активность против положительной на антиген культивированной клеточной линии можно оценить, измеряя СОС-активность, АОСС-активность [Сапсег 1ттипо1. 1ттипо!йег., 36, 373 (1993)], и подобными способами.
Также безопасность и лечебное действие композиции антител на человека можно оценить с использованием соответствующего вида животной модели, относительно близкой человеку, такой как Масаса £абс1си1ап5, или подобного животного.
5. Анализ углеводных цепей, связывающихся с молекулами антител, экспрессированными в различных клетках.
Структуру углеводной цепи, связывающейся с молекулой антитела, экспрессированной в различных клетках, можно проанализировать согласно общему анализу строения углеводных цепей гликопротеинов. Например, углеводная цепь, связанная с молекулой 1дС, содержит нейтральный сахар, такой как галактоза, манноза, фукоза или подобный, аминосахар, такой как Ν-ацетилглюкозамин или подобный, и кислый углевод, такой как сиаловая кислота или подобный, и ее можно проанализировать способом, таким как анализ структуры углеводной цепи или подобным, с использованием анализа состава углевода, двухмерное картирование углеводной цепи, или подобного способа.
(1) Анализ составов нейтральных сахаров и аминосахаров.
Состав углеводной цепи, связывающейся с молекулой антитела, можно проанализировать, осуществляя кислотный гидролиз углеводных цепей с помощью кислоты, такой как трифторуксусная кислота или подобная, для высвобождения нейтрального сахара или аминосахара, и измеряя композиционное соотношение.
Примером является способ с использованием углеводного анализатора (ВюЬС), производимого Оюпех. ВюЬС представляет собой прибор, анализирующий состав углеводов методом НРАЕС-РАО (высокоэффективная анионообменная хроматография с амперометрической импульсной детекцией) [1. Ыд. Сйгота!одг., 6, 1577 (1983)].
Композиционное соотношение также можно анализировать методом с флуоресцентным мечением с использованием 2-аминопиридина. Конкретно, композиционное соотношение можно вычислить согласно известному способу [Адпс. Вю1. Сйет., 55(1), 283-284 (1991)], помечая подвергнутый кислотному гидролизу образец флуоресцентной меткой путем 2-аминопиридилирования и затем анализируя состав методом ВЭЖХ.
(2) Анализ структуры углеводной цепи.
Структуру углеводной цепи, связывающейся с молекулой антитела, можно проанализировать методом двухмерного картирования углеводной цепи [Апа1. Вюсйет., 171, 73 (1988), Вюсйетюа1 Ехрептеп!айоп Мейюйб 23 - Мейюйб £ог 8!ийутд С1усорго!ет 8идаг Сйатб (1арап 8аеп!1йс 8ос1ейеб Ргебб) еййей Ьу Яе1ко ТакайабЫ (1989)]. Способ двухмерного картирования углеводной цепи представляет собой способ расшифровки структуры углеводной цепи, например, откладывая время удерживания или позицию элюирования углеводной цепи при хроматографии с обращенной фазой по оси Х и время удерживания или позицию элюирования углеводной цепи при хроматографии с нормальной фазой по оси Υ, соответственно, и сравнивая их с такими же результатами для известных углеводных цепей.
Конкретно, углеводные цепи высвобождают из антител, подвергая антитела гидразинолизу, и подвергают высвобожденные углеводные цепи флуоресцентному мечению 2-аминопиридином (называемым далее РА) [1. Вюсйет., 95, 197 (1984)], и затем углеводные цепи отделяют от избытка реагента для обработки РА гель-фильтрацией и подвергают хроматографии с обращенной фазой.
Затем каждый пик отделенных углеводных цепей подвергают хроматографии с нормальной фазой.
- 31 013563
Структуру углеводной цепи можно расшифровать, строя графики результатов двухмерного картирования углеводной цепи и сравнивая их с зонами эталона углеводной цепи (производимого Такага δΐιιιζο) или литературными данными [Α^1. В^сНет., 171, 73 (1988)].
Структуру, расшифрованную способом двухмерного картирования углеводной цепи, можно подтвердить, осуществляя также масс-спектрометрию, например МЛ^^I-ТОΕ-Мδ, каждой углеводной цепи, или подобным способом.
6. Способ иммунологического определения для распознавания структуры углеводной цепи молекулы антитела.
Композиция антител содержит молекулы антител, в которых углеводные цепи, связывающиеся с Ес-областью антитела, различаются по структуре. Композиция антител, в которой доля углеводной цепи, в которой фукоза не связана с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в углеводной цепи, составляет 20% или более всех сложных углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи, связывающиеся с Ес-областью, в композиции антител, обладает сильной ЛЭСС-активностью. Композицию антител можно идентифицировать, используя способ анализа структуры углеводной цепи молекулы антител, описанный в разделе 6. Ее также можно идентифицировать способом иммунологического определения с использованием лектина.
Структуру углеводной цепи молекулы антитела можно идентифицировать способом иммунологического определения с использованием лектина согласно известному способу иммунологического определения, такому как окрашивание по Вестерну, ΓΚΑ (радиоиммуноанализ), νΊΑ (вироиммуноанализ), Е№ (иммуноферментный анализ), Е№ (иммунофлуоресцентный анализ), МП (металлоиммуноанализ), и т.п., описанным в Мοηοс1οηа1 ΑπΙ^ο^^: 001^113^8 апб Αрр1^саΐ^οπ8, ^беу-Шз, Ечс. (1995); Iттипοа88ау, 3гб Еб., ^аки^т (1987); Епζуте Απΐ^Ъοбу Мебюб, Кеубеб Ебйюп, Сакиза К1каки (1985); и подобным способам.
Помечают лектин, узнающий структуру углеводной цепи молекулы антитела, содержащуюся в композиции антител, и меченый лектин взаимодействует с композицией антител, являющейся образцом. Затем измеряют количество комплекса меченого лектина с молекулами антитела.
Примерами лектина, используемого для идентификации структуры углеводной цепи молекулы антитела, являются \VСЛ (агглютинин зерна пшеницы, полученный из Т. уи1даг18), ΤομΑ (конканавалин А, полученный из С. е^^птв), ШС (токсин, полученный из К. сοттиπ^5). Ь-ΡΗΑ (лейкоагглютинин, полученный из Ρ. уи1даг18), БСА (лентилагглютинин, полученный из Ь. сиНпабз), ΡδΑ (лектин гороха, полученный из Ρ. забуит), ΑΑΣ (лектин ΑΠί-ΐππ аигапба), ΑΟΈ (лектин Αта^аπίЬи8 саибаШз), ΒΡΕ (лектин ВаиЫша ригригеа), ΌδΕ (лектин Эа1ига 8ί^атοшит), ΌΒΑ (агглютинин Όο1ίΛοδ ΜΓ1οιυ8), ЕВЬ (лектин плодов черной бузины), ЕСЬ (лектин Егубшпа сб81адаШ), ЕЕЬ (лектин Е1юпути5 еο^οраеи8), СМ (лектин Са1ап1Ьи8 шуаШ), Сδ^ (лектин СпПоша 8^тр1^с^Гο1^а), ΗΡΑ (агглютинин Не11х рοтаΐ^а), ННЬ (лектин гибрида Шрреазбит), басаНп, ЬТЬ (лектин ΕοΙιΐδ ΐеΐ^адοπο1οЪи8), ЬЕЬ (лектин ^усοре^8^сοπ езсикпШт), МΑ^ (лектин Мааск1а атигепзщ), МБЕ (лектин Мабига рοт^Гега). ΝΡΕ (лектин Nа^с^88и8 р8еибοπа^с^88и8), ΡΝΑ (агглютинин арахиса), Е-ΡΗΑ (эритроагглютинин ΡЬа8еο1и8 уи1даб8), ЬТЕ (лектин Ρ8οрЬοса^ри8 1е(^адοπο1οЪи8), ЕСА (агглютинин Кюшиз сοттиη^8), δТ^ (лектин δο1аπит ШЪегозит), δΙΑ (агглютинин δοр11ο^а ^арοη^са), δΒΑ (агглютинин сои), ^Α (агглютинин Ыех еигораеиз), УУЪ (лектин УШа νί11ο53) и ^ΕΑ (агглютинин \Уб1епа Ποπ^ι^η).
Предпочтительно использовать лектин, специфически узнающий структуру углеводной цепи, где фукоза связывается с Ν-ацетилглюкозамином на редуцирующем конце в сложной углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Примерами являются лектин Ьепз си11паг18 БСА (лентилагглютинин, полученный из Ьепз сиНпабз), лектин гороха ΡδΑ (лектин гороха, полученный из Ρίδΐιιη забуит), лектин кормовых бобов νΕΑ (агглютинин, полученный из УШа ГаЪа) и лектин ΑΕί-ΐππ аигапба ΑΑΕ (лектин, полученный из ΑΠί-ΐππ аигапба).
7. Применение молекул антител настоящего изобретения.
Композиция антител настоящего изобретения обладает сильной антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксической активностью. Антитела с сильной антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксической активностью полезны для предупреждения и лечения различных заболеваний, в том числе раковых заболеваний, воспалительных заболеваний, иммунных болезней, таких как аутоиммунные заболевания, аллергии и т.п., болезней органов системы кровообращения и вирусных и бактериальных инфекций.
В случае злокачественных опухолей наблюдается рост злокачественных клеток. Обычные противоопухолевые средства ингибируют рост злокачественных клеток. Напротив, антитела с сильной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью могут лечить злокачественные опухоли, повреждая злокачественные клетки через свое убивающее действие на клетки, и поэтому являются более эффективными в качестве лечебного средства, чем обычные противоопухолевые средства. В настоящее время в лечебном средстве против злокачественных опухолей действие одного лечебного средства на основе антител является недостаточным, так что осуществляют комбинированную терапию с химиотерапией ^аепсе, 280, 1197 (1998)]. Если обнаружится более сильное противоопухолевое действие одной композиции антител настоящего изобретения, зависимость от химиотерапии будет снижаться и
- 32 013563 будет ослабевать побочное действие.
При иммунных болезнях, таких как воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, аллергии и т.п., болезненные реакции ш у1уо индуцируются высвобождением иммуноцитами молекул медиаторов, так что аллергическую реакцию можно ингибировать удалением иммуноцитов с использованием антител с сильной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью.
Примерами заболеваний системы кровообращения являются артериосклероз и подобные заболевания. Артериосклероз в настоящее время лечат с использованием катетера-баллона, но заболевания органов системы кровообращения можно предотвращать и лечить путем ингибирования роста артериальных клеток при перестройке после лечения с использованием антител с сильной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью.
Различные заболевания, в том числе вирусные и бактериальные инфекции, можно предупреждать и лечить, ингибируя пролиферацию клеток, зараженных вирусом или батериями, с использованием антител с сильной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью.
Примеры антигена, распознающего антиген, связанный с опухолью, антигена, распознающего антиген, связанный с аллергией и воспалением, антигена, распознающего антиген, связанный с заболеванием органов кровообращения, антигена, распознающего антиген, связанный с вирусной или бактериальной инфекцией, приведены ниже.
Примерами антител, узнающих связанный с опухолью антиген, являются антитела против ΟΌ2 (ΟΙιΙη е! а1., Апйсапсег Век., 13, 331-336, 1993), антитела против ΟΌ3 (ΟΙιΙη е! а1., Сапсег 1ттипо1. 1ттипоФег.. 36, 260-266, 1993), антитела против ΟΜ2 (Иакатига е! а1., Сапсег Век., 54, 1511-1516, 1994), антитела против НЕВ-2 (Сайег е! а1., Ργόο. ИаИ. Асаб. Зс1. ИЗА, 89, 4285-4289, 1992), антитела против СЭ52 (Сайег е! а1., ΡΐΌα №ΐ1. Асаб. Зс1. ИЗА, 89, 4285-4289, 1992), антитела против ΜАΟЕ (1ипдЬ1и!й е! а1., ВгШкй 1. Сапсег, 83, 493-497, 2000), антитела против НМ1.24 Юпо е! а1., Мо1еси1аг 1ттипо1., 36, 387-395,
1999) , антитела против белка, родственного паратиреоидному гормону (ΡΊΉγΡ) (ΟβηΙη е! а1., Сапсег, 88, 2909-2911, 2000), антитела против фактора роста основных фибробластов и антитела против РΟР8 (Ма1кихак| е! а1., ΡΐΌα №ΐ1. Асаб. Зск ИЗА, 86, 9911-9915, 1989), антитела против рецептора фактора роста основных фибробластов и антитела против рецептора РΟР8 (Кио е! а1., 1. Вю1. СНет., 265, 16455-16463, 1990), антитела против инсулиноподобного фактора роста (Уао е! а1., 1. Хеигокс). Век., 40, 647-659, 1995), антитела против рецептора инсулиноподобного фактора роста (Уао е1 а1., 1. Неигокс!. Век., 40, 647-659, 1995), антитела против ΡΜЗА (Мигрйу е! а1., 1. Иго1о§у, 160, 2396-2401, 1998), антитела против фактора роста сосудистых эндотелиальных клеток (Ггек1а е! а1., Сапсег Век., 57, 4593-4599, 1997), антитела против рецептора фактора роста сосудистых эндотелиальных клеток (Каппо е! а1., Οηсοдеηе, 19, 2138-2146,
2000) , и подобные антитела.
Примерами антител, узнающих антиген, связанный с аллергиями или воспалением, являются антитела против интерлейкина 6 (АЬгатк е! а1., 1ттипо1. Веу., 127, 5-24, 1992), антитела против рецептора интерлейкина 6 (За!о е! а1., Мо1еси1аг 1ттипо1., 31, 371-381, 1994), антитела против интерлейкина 5 (АЬгатк е1 а1., 1ттипо1. Веу., 127, 5-24, 1992), антитела против рецептора интерлейкина 5 и антитела против интерлейкина 4 (Вюгб е! а1., Су!окше, 3, 562-567, 1991), антитела против фактора некроза опухоли (Тетрек! е! а1., НуЬпбота, 13, 183-190, 1994), антитела против рецептора фактора некроза опухоли (Атгап е! а1., Мо1еси1аг ΡНа^тасο1.. 58, 237-245, 2000), антитела против ССВ-4 (СатрЬе11 е! а1., №!иге, 400, 776-780, 1999), антитела против хемокинов (Геп е! а1., 1. 1ттипо. МеФ.. 174, 249-257, 1994), антитела против рецепторов хемокинов (^и е! а1., 1. Ехр. Меб., 186, 1373-1381, 1997) и подобные антитела. Примерами антител, узнающих антиген, связанный с заболеванием органов системы кровообращения, являются антитела против ΟрIIЬ/IIIа (Со е! а1., 1. 1ттипо1., 152, 2968-2976, 1994), антитела против тромбоцитарного фактора роста (Регпк е! а1., Зс1епсе, 253, 1129-1132, 1991), антитела против рецептора тромбоцитарного фактора роста (ЗНи1тап е! а1., 1. Вю1. СНет., 272, 17400-17404, 1997) и антитела против фактора свертывания крови (Ρ^γ е! а1., С1гси1айоп, 101, 1158-1164, 2000), и подобные антитела.
Примерами антител, узнающих антиген, связанный с вирусной или бактериальной инфекцией, являются антитела против др120 (Тидаппоу е! а1., З1гис!иге, 8, 385-395, 2000), антитела против СЭ4 (ЗНи1хеКоорк е! а1., 1. Вйеита!о1о§у, 25, 2065-2076, 1998), антитела против ССВ4 и антитела против веротоксина (Катай е! а1., 1. С1т. МюгоЬю1., 37, 396-399, 1999) и подобные антитела.
Указанные антитела можно получить от государственных организаций, таких как АТСС (Американская коллекция типовых культур), ВГКЕМ Οеηе Вапк при Институте физических и химических исследований, Национальный институт биологических наук и технологий человека, Агентство по техническим наукам и технологии (настоящее название Международный депозитарий патентованных микроорганизмов, Национальный институт современных технических наук и технологий) и подобных организаций, или частных компаний, торгующих реагентами, таких как Оайирроп Ρйа^тасеи!^са1, В&И ЗУЗТЕМЗ, ΡНа^Μ^пβеп. Сокто Вю, РипакокЫ и подобных.
Лекарственный препарат, содержащий композицию антител настоящего изобретения, можно вводить как отдельный лекарственный препарат, но, как правило, предпочтительно предоставлять ее в виде фармацевтической композиции, полученной соответствующим способом, хорошо известным в области фармации, смешивая ее по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем.
- 33 013563
Желательно выбирать способ введения, наиболее эффективный при лечении. Примерами являются пероральное введение и парентеральное введение, такое как буккальное, трахеальное, ректальное, подкожное, внутримышечное, внутривенное или подобное. Для препарата антител предпочтительно внутривенное введение.
Лекарственными формами являются спреи, капсулы, таблетки, гранулы, сиропы, эмульсии, суппозитории, инъекции, мази, пластыри и т.п.
Примерами фармацевтического препарата, подходящего для перорального введения, являются эмульсии, сиропы, капсулы, таблетки, порошки, гранулы и т.п.
Жидкие препараты, такие как эмульсии и сиропы, можно получить с использованием в качестве добавок воды; сахаридов, таких как сахароза, сорбит, фруктоза и т.п.; гликолей, таких как полиэтиленгликоль, пропиленгликоль и т.п.; масел, таких как сезамовое масло, оливковое масло, соевое масло и т.п.; антисептиков, таких как эфиры п-оксибензойной кислоты и т.п.; отдушек, таких как земляничная отдушка, перечная мята и т.п.; и подобных добавок.
Капсулы, таблетки, порошки, гранулы и т.п. можно получить с использованием в качестве добавок наполнителей, таких как лактоза, глюкоза, сахароза, маннит и т.п.; веществ, способствующих рассыпанию, таких как крахмал, альгинат натрия и т.п.; смазывающих веществ, таких как стеарат магния, тальк и т.п.; связующих веществ, таких как поливиниловый спирт, гидроксипропилцеллюллоза, желатин и т.п.; поверхностно-активных веществ, таких как эфиры жирных кислот и т.п.; пластификаторов, таких как глицерин и т.п.; и подобных веществ.
Примерами фармацевтического препарата, подходящего для парентерального введения, являются инъекции, суппозитории, спреи и т.п.
Инъекции можно получить с использованием носителя, такого как солевой раствор, раствор глюкозы, смесь того и другого или подобного раствора. Также можно получить инъекции в виде порошка лиофилизацией композиции антител обычным способом, и затем добавляя к порошку хлорид натрия.
Суппозитории можно получить с использованием носителя, такого как масло какао, гидрогенизированный жир, карбоновая кислота, или подобного носителя.
Также можно получить спреи с использованием композиции антител как таковой или с использованием носителя, который не раздражает слизистые оболочки щеки или дыхательных путей пациента и может облегчить поглощение композиции антител за счет диспергирования ее на мелкие частицы.
Примерами носителя являются лактоза, глицерин и т.п. В зависимости от свойств композиции антител и носителя, возможно получение таких фармацевтических препаратов, как аэрозоли, сухие порошки и т.п. Кроме того, в парентеральные препараты также можно добавлять компоненты, указанные в качестве примеров добавок для пероральных препаратов.
Хотя лечебная доза или частота введения изменяются в зависимости от объективного лечебного действия, способа введения, периода лечения, возраста, массы тела и подобных факторов, как правило, она составляет от 10 до 20 мкг/кг в сутки для взрослого человека.
Также в качестве способа проверки противоопухолевого действия композиции антител против различных опухолевых клеток испытания т νίΐΐΌ включают способ измерения СЭС-активности, способ измерения АЭСС-активности и т.п., и испытания т νινί) включают эксперименты на противоопухолевое действие с использованием системы опухолей в подопытном животном, таком как мышь, и т.п., и подобные способы.
Измерения СЭС-активности и АЭСС-активности и эксперименты на противоопухолевое действие можно осуществлять согласно способам, описанным в Сапсег 1ттипо1оду 1ттипоФегару, 36, 373 (1993); Сапсег Кезеагск, 54, 1511 (1994), и подобными способами.
Настоящее изобретение ниже будет описано подробнее на основе примеров, однако примеры являются только простым пояснением и не ограничивают объем настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает картины электрофореза 8Э8-РАСЕ пяти очищенных химерных антител против СЭ3 (с использованием градиентного геля от 4 до 15%). Фиг. 1А и 1В показывают результаты электрофореза в условиях невосстановления и условиях восстановления соответственно. Полосы 1-7 показывают картины электрофореза высокомолекулярных маркеров, химерных антител ΥВ2/0-С^3, химерных антител СН0/ЭС44-СЭ3, химерных антител 8Р2/0-СЭ3, химерных антител Ν80-6Ι)3 (302), химерных антител Ν80-('ιΙ)3 (С1Т) и низкомолекулярных маркеров соответственно.
Фиг. 2 показывает активности связывания с СЭ3 пяти очищенных химерных антител против СЭ3, измеренные с изменением концентрации антител. Ордината и абсцисса показывают активность связывания с ОЭЗ и концентрацию антител соответственно. ° ' ' Ώ > и Δ показывают активности химерных антител ΥВ2/0-С^3, химерных антител СН0/ЭС44-СЭ3, химерных антител 8Р2/0СЭ3, химерных антител Ν80-6Ι)3 (302) и химерных антител Ν80-6Ι)3 (С1Т) соответственно.
Фиг. 3 показывает АЭСС-активности пяти очищенных химерных антител против СЭ3 в отношении клеточной линии меланомы человека С-361. Ордината и абсцисса показывают соответственно цитотоксическую активность и концентрацию антител.
14 Δ,/ показывают активность
- 34 013563 химерных антител ΥΒ2/0-ΟΏ3. химерных антител СН0/ОО44-ОО3. химерных антител 8Р2/0-ОО3. химерных антител N80-003 (302) и химерных антител N80-003 (О1Т) соответственно.
Фиг. 4 показывает картины электрофореза 8^8-ΡАОΕ трех очищенных антител с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка (с использованием градиентного геля от 4 до 15%). Фиг. 4А и 4В показывают результаты электрофореза в условиях невосстановления и условиях восстановления соответственно. Полосы 1-5 показывают картины электрофореза высокомолекулярных маркеров. антител с СОК ΥΒ2/0-ΗΙΕ-5Κ. антител с СОК СН0/б-Н1Ь-5К. антител с СОК №0-Н1Ь-5К и низкомолекулярных маркеров соответственно.
Фиг. 5 показывает активности связывания с Н1Ь-5Ка трех очищенных антител с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка. измеренные с изменением концентрации антител. Ордината и абсцисса показывают активность связывания с Н1Ь-5Ка и концентрацию антител соответственно. ° ' *. и α показывают активности антител с СОК ΥΒ2/0-ΗI^-5Κ. антител с СОК СН0/б-Н1Ь-5К и антител с СОК Ж0-Н1Ь-5К соответственно.
Фиг. 6 показывает АОСС-активности трех очищенных антител с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка в отношении мышиной Т-клеточной линии СТЬЬ-2(Н5К). экспрессирующей Н1Ь-5К. Ордината и абсцисса показывают соответственно цитотоксическую активность и концентрацию антител. °' и ПЛ показывают активность антител с СОК ΥΒ2/0-ΗI^-5Κ. антител с СОК СН0/б-Н1Ь-5К и антител с СОК ^0-Н1Ь-5К соответственно.
Фиг. 7 показывает ингибирование активностей трех очищенных антител с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка на модели вызванного Н1Ь-5 повышения концентрации эозинофилов у Масаса ίа8е^си1а^^8. Ордината и абсцисса показывают соответственно число эозинофилов в периферической крови и число дней (день начала введения антител и Н1Ь-5 принимают за день 0). 101 и 102. 301. 302 и 303. 401. 402 и 403 и 501. 502 и 503 показывают результаты в группе. которой антитела не вводили. в группе. которой вводили антитела с СОК ΥΒ2/0-ΗI^-5Κ. в группе. которой вводили антитела с СОК СН0/б-Н1Ь-5К. и в группе. которой вводили антитела с СОК ^0-Н1Ь-5К соответственно.
Фиг. 8 показывает картины элюирования при ВЭЖХ с обращенной фазой РА-обработанной углеводной цепи (слева) и картины элюирования. полученные при обработке РА-обработанной углеводной цепи α-Ь-фукозидазой и последующем анализе методом ВЭЖХ с обращенной фазой (справа). очищенных антител с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка. продуцированных ΥΒ2/0 (фиг. 8А). и очищенных антител с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка. продуцированных N80 (фиг. 8В). Ординаты и абсциссы показывают соответственно относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования.
Фиг. 9 показывает картину элюирования. полученную при обработке РА-обработанной углеводной цепи из очищенных антител с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка. продуцированных клеточной линией СН0/б. и анализа ее ВЭЖХ с обращенной фазой. Ордината и абсцисса показывают соответственно относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования.
На фиг. 10 фиг. 10А показывает активности связывания с ОО3 неадсорбированной фракции и части адсорбированной фракции. измеренные при изменении концентрации антител. Ордината и абсцисса показывают соответственно активность связывания с ООЗ и концентрацию антител. в// и показывают неадсорбированную фракцию и часть адсорбированной фракции соответственно. Фиг. 10В показывает АОСС-активность неадсорбированной фракции и части адсорбированной фракции в отношении линии меланомы человека 0-361. Ордината и абсцисса показывают соответственно цитотоксическую активность и концентрацию антител. · и о показывают неадсорбированную фракцию и часть адсорбированной фракции соответственно.
Фиг. 11 показывает картины элюирования. полученные при анализе методом ВЭЖХ с обращенной фазой РА-обработанных углеводных цепей из неадсорбированной фракции и части адсорбированной фракции. Фиг. 11 А и 11Β показывают картину элюирования неадсорбированной фракции и картину элюирования части адсорбированной фракции соответственно. Ординаты и абсциссы показывают соответственно относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования.
Фиг. 12 показывает картины элюирования РА-обработанных углеводных цепей. полученных из 6 химерных антител против ОО3 (фиг. 12А-12Е). полученные при их анализе методом ВЭЖХ с обращенной фазой. Ординаты и абсциссы показывают соответственно относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования.
Фиг. 13 показывает активность связывания с ОО3 6 химерных антител против ОО3 с различным содержанием углеводных цепей без а-1.6-фукозы. измеренную при изменении концентрации антител. Ордината и абсцисса показывают соответственно активность связывания с ОО3 и концентрацию антител.
* ' п ' к и х показывают активность химерных антител против ОО3 (50%). химерных антител против ОО3 (45%). химерных антител против ОО3 (29%). химерных антител против ОО3 (24%). химерных антител против ОО3 (13%) и химерных антител против ОО3 (7%) соответственно.
Фиг. 14 показывает АОСС-активность шести видов химерных антител против ОО3 с различным содержанием углеводных цепей без а-1.6-фукозы против клеточной линии меланомы человека О-361 с использованием эффекторных клеток донора А. Ордината и абсцисса показывают соответственно цито- 35 013563 токсическую активность и концентрацию антител. п' А' к и х показывают активность химерных антител против 61)3 (50%), химерных антител против 61)3 (45%), химерных антител против 61)3 (29%), химерных антител против 61)3 (24%), химерных антител против 61)3 (13%) и химерных антител против 61)3 (7%) соответственно.
Фиг. 15 показывает АЭСС-активность шести видов химерных антител против 61)3 с различным содержанием углеводных цепей без а-1,6-фукозы против клеточной линии меланомы человека С-361, с использованием эффекторных клеток донора В. Ордината и абсцисса показывают соответственно цитотоксическую активность и концентрацию антител. а' и х показывают активность химерных антител против 61)3 (50%), химерных антител против 61)3 (45%), химерных антител против 61)3 (29%), химерных антител против 61)3 (24%), химерных антител против 61)3 (13%) и химерных антител против 61)3 (7%) соответственно.
Фиг. 16 показывает картины элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из шести видов химерных антител против 61)3, полученные при анализе их ВЭЖХ с обращенной фазой. Ординаты и абсциссы показывают соответственно относительную интенсивность флуоресценции и вре мя элюирования.
Фиг. 17 показывает активности связывания с ССК4 шести видов химерных антител против ССК4 с различным содержанием углеводных цепей без а-1,6-фукозы, измеренные при изменении концентрации антител. Ордината и абсцисса показывают соответственно активность связывания с ССК4 и концентрацию антител. а„' А ' Δ, · и о показывают активности химерных антител против
ССК4 (46%), химерных антител против ССК4 (39%), химерных антител против ССК4 (27%), химерных антител против ССК4 (18%), химерных антител против ССК4 (9%) и химерных антител против ССК4 (8%) соответственно.
Фиг. 18 показывает АЭСС-активности химерных антител против ССК4 с различным содержанием углеводных цепей без а-1,6-фукозы против клеток ССК4/ЕЬ-4, с использованием эффекторных клеток донора А. Ордината и абсцисса показывают соответственно цитотоксическую активность и концентрацию антител. ' п ' А ' Δ ' * и ° показывают активности химерных антител против ССК4 (46%), химерных антител против ССК4 (39%), химерных антител против ССК4 (27%), химерных антител против ССК4 (18%), химерных антител против ССК4 (9%) и химерных антител против ССК4 (8%) соответственно. Также фиг. 18А и 18В показывают результаты, полученные с использованием эффекторных клеток донора А и донора В соответственно.
Фиг. 19 показывает АЭСС-активности химерных антител против ССК4 с различным содержанием углеводных цепей без а-1,6-фукозы против клеток ССК4/ЕЬ-4, с использованием эффекторных клеток донора В. Ордината и абсцисса показывают соответственно цитотоксическую активность и концентрацию антител. г п’ Δ„' показывают активности химерных антител против ССК4 (46%), химерных антител против ССК4 (39%), химерных антител против ССК4 (27%), химерных антител против ССК4 (18%), химерных антител против ССК4 (9%) и химерных антител против ССК4 (8%) соответственно.
Фиг. 20 показывает конструирование плазмид СНРТ8-рСК2.1 и УВРТ8-рСК2.1.
Фиг. 21 показывает конструирование плазмид СНАс-рВ8 и УВАс-рВ8.
Фиг. 22 показывает конструирование плазмид СНРТ8б-рСК2.1 и УВРТ8б-рСК2.1.
Фиг. 23 показывает конструирование плазмид СНАсб-рВ8 и УВАсб-рВ8.
Фиг. 24 показывает результаты определения продукта транскрипции РИТ8 в каждой линии клетокхозяев с использованием конкурентной КТ-РСК. Показано количество продукта транскрипции РИТ8 в каждой линии клеток-хозяев, когда в качестве эталона и внутреннего стандарта используют последовательность крысиной РиТ8. и показывают результаты, когда в качестве клеток-хозяев используют клеточную лнию СНО и клеточную линию УВ2/0 соответственно.
Фиг. 25 показывает конструирование плазмиды тГРИТ8-рСК2.1.
Фиг. 26 показывает конструирование плазмиды рВ8тГРИТ8.
Фиг. 27 показывает конструирование плазмиды рАСЕтГРИТ8.
Фиг. 28 показывает результаты анализа, с использованием конкурентной КТ-РСК, уровней экспрессии гена РИТ8 клеточной линией, сверхэкспрессирующей ген. Ордината показывает величины отношения количеств продукта транскрипции РИТ8 к количествам продукта транскрипции β-актина.
Фиг. 29 показывает АЭСС-активности химерных антител против 61)3, выделенных в чистом виде из клеточной линии, сверэкспрессирующей ген РИТ8, против клеточной линии меланомы человека С361. Ордината и абсцисса показывают соответственно цитотоксическую активность и концентрацию ан тител.
Фиг. 30 показывает картины элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из антител, продуцированных клеточными линиями с введенными тГРИТ8-6 и рАСЕ249, полученные их анализом ВЭЖХ с обращенной фазой. Фиг. 30А и 30В показывают картины элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из антител, продуцированных клеточной линией с введенной тГРИТ8-6,
- 36 013563 и РА-обработанных углеводных цепей, полученных из антител, продуцированных клеточной линией с введенной рАСЕ249 соответственно. Ордината и абсцисса показывают соответственно относительную интенсивность флуоресценции и концентрацию антител.
Фиг. 31 показывает картину элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из герцептина, полученную их анализом ВЭЖХ с обращенной фазой. Ордината и абсцисса показывают соответственно относительную интенсивность флуоресценции и концентрацию антител.
Фиг. 32 показывает конструирование плазмиды СНПРЬТ8-рСЕ2.1.
Фиг. 33 показывает конструирование плазмиды р1охРРиго.
Фиг. 34 показывает конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-1.
Фиг. 35 показывает конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-2.
Фиг. 36 показывает конструирование плазмиды р5сРИТ8дЕ2-3.
Фиг. 37 показывает конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-3.
Фиг. 38 показывает конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-4.
Фиг. 39 показывает конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-5.
Фиг. 40 показывает конструирование плазмиды рК0РИТ8Риго.
Фиг. 41 показывает результаты геномных анализов по Саузерну 151.АРЬТ8 2-46-1 и 181.ДРИТ8 2-46 как клеточных линий СН0, разрушенных α-1,6-фукозилтрансферазой.
Фиг. 42 показывает АЭСС-активности химерных антител против ССЕ4, выделенных в чистом виде из клеточной линии, разорванной аллельным геном РИТ8. Ордината и абсцисса показывают цитотоксическую активность и концентрацию антител. * и показывают активность очищенных антител, полученных из клеток СН0 5-03, продуцирующих химерные антитела против ССЕ4, и очищенных антител, полученных из 151.ДРЬТ8 2-46-1 соответственно.
Фиг. 43 показывает АЭСС-активности человеческих химерных антител против ССЕ4, продуцированных невосприимчивыми к лектину клеточными линиями. Ордината и абсцисса показывают цитотоксическую активность и концентрацию антител. п' и А показывают активность антител, продуцированных штаммом 5-03, СН0/ССК4-БСА, СН0/ССВ4-ААЬ и СН0/ССЕ4-РНА соответственно.
Фиг. 44 показывает АЭСС-активности человеческих химерных антител против ССЕ4, продуцированных невосприимчивыми к лектину клеточными линиями. Ордината и абсцисса показывают цитотоксическую активность и концентрацию антител. · показывают активность антител, продуцированных УВ2/0 (КМ2760 # 58-35-16), 5-03 и СН0/ССК4-БСА соответственно.
Фиг. 45 показывает картины элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из очищенных человеческих химерных антител против ССЕ4, полученные их анализом ВЭЖХ с обращенной фазой. Ордината и абсцисса показывают соответственно относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования. Фиг. 45А-45Э показывают результаты анализов антител, продуцированных штаммом 5-03, антител, продуцированных СН0/ССВ4-ЬСА, антител, продуцированных СН0/ССЕ4ААЬ, и антител, продуцированных СН0/ССЕ4-РНА соответственно.
Фиг. 46 показывает 1-ю стадию конструирования экспрессирующего вектора СМЭ, полученного из клеток СН0 (всего 6 стадий).
Фиг. 47 показывает 2-ю стадию конструирования экспрессирующего вектора СМЭ, полученного из клеток СН0 (всего 6 стадий).
Фиг. 48 показывает 3-ю стадию конструирования экспрессирующего вектора СМЭ, полученного из клеток СН0 (всего 6 стадий).
Фиг. 49 показывает 4-ю стадию конструирования экспрессирующего вектора СМЭ, полученного из клеток СН0 (всего 6 стадий).
Фиг. 50 показывает 5-ю стадию конструирования экспрессирующего вектора СМЭ, полученного из клеток СН0 (всего 6 стадий).
Фиг. 51 показывает 6-ю стадию конструирования экспрессирующего вектора СМЭ, полученного из клеток СН0 (всего 6 стадий).
Фиг. 52 показывает невосприимчивость СН0/ССЕ4-ЬСА с экспрессированной СМЭ в отношении лектина ЬСА. Измерения осуществляют дважды, принимая уровень выживаемости группы клеток, культивированных без добавления лектина ЬСА, за 100%. На чертеже 249 показывает уровень выживаемости СН0/ССЕ4-ЬСА, введенных экспрессирующим вектором рАСЕ249, в отношении лектина ЬСА. СМИ показывают невосприимчивость СН0/ССВ4-ЬСА, введенных экспрессирующим вектором для СМЭ рАСЕ249, в отношении лектина ЬСА.
Фиг. 53 показывает АЭСС-активности химерных антител против ССЕ4, продуцированных клетками экспрессированных СМЭ клеточных линий СН0/ССЕ4-ЬСА с экспрессированной СМЭ. Ордината и абсцисса показывают цитотоксическую активность и концентрацию антител.
Фиг. 54 показывает стадию получения плазмиды СН0-СМЭ, на которой 5'-конец клона 34-2 вводят в 5'-конец клона 22-8 кДНК СМЭ, полученного из клеток СН0.
Фиг. 55 показывает картину элюирования РА-обработанных углеводных цепей, полученных из че
- 37 013563 ловеческих химерных антител против ССВ4, выделенных в чистом виде СНО/ССВ4-ЬСА с экспрессированным геном 0ΜΌ, полученную их анализом ВЭЖХ с обращенной фазой. Ордината и абсцисса показывают соответственно относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования.
Пример 1. Получение человеческих химерных антител против ганглиозида 0Ό3.
1. Конструирование тандемного экспрессирующего вектора рСЫЬН0М4 для человеческих химерных антител против ганглиозида 0Ό3.
Конструируют плазмиду рСЫ641Ь0М40, лигируя фрагмент примерно в 4,03 т.п.о., содержащий кДНК Ь-цепи, полученный расщеплением экспрессирующего вектора для Ь-цепи рСЫ641Ь0М4 |б. 1ттипо1. МеЛобз, 167, 271 (1994)] для человеческого химерного антитела против 0Ό3 (называемого далее химерное антитело против 0Ό3) рестриктазами М1и1 (производимой Такага 81шхо) и За11 (производимой Такага ЗНихо), с фрагментом примерно в 3,40 т.п.о., содержащим ген невосприимчивости к 0418 и сплайсинг-сигнал, полученный расщеплением экспрессирующего вектора рЛОЕ107 [Су1о1есйпо1о§у, 3, 133 (1990)] для животной клетки, рестриктазами М1и1 (производимой Такага 81шхо) и За11 (производимой Такага ЗИи/о), с использованием набора ΌΝΆ Ьщайоп (производимого Такага ЗНихо), и затем трансформируя Е. со11 НВ101 (Мо1еси1аг С1ошпд, Зесопб ЕбШоп) лигированным продуктом.
Затем фрагмент примерно в 5,68 т.п.о., содержащий кДНК Ь-цепи, полученный расщеплением сконструированной плазмиды рСЫ641Ь0М40 рестриктазой С1а1 (производимой Такага ЗНихо), затуплением его концов с использованием набора ΌΝΆ В1ипбпд (производимого Такага 81шхо) и последующим его расщеплением М1и1 (производимой Такага ЗНихо), лигируют с фрагментом примерно в 8,40 т.п.о., содержащим кДНК Н-цепи, полученным расщеплением экспрессирующего вектора для Н-цепи химерного антитела против 0Ό3 рСЫ641Н0М4 |б. 1ттипо1. МеЛобз, 167, 271 (1994)] рестриктазой ХИо1 (производимой Такага ЗИи/о), затуплением его концов с использованием набора ΌΝΆ В1ипбпд (производимого Такага ЗНихо) и последующим его расщеплением М1и1 (производимой Такага ЗНихо), с использованием набора ΌΝΆ Ыдабоп (производимого Такага ЗНихо), и затем трансформируют Е. со11 НВ101 (Мо1еси1аг С1ошпд, Зесопб Ебйюп) лигированным продуктом, и посредством этого получают тандемный экспрессирующий вектор рСЫ641ЬН0М4 для человеческих химерных антител против ганглиозида 0Ό3.
2. Получение клеток, устойчиво продуцирующих химерные антитела против 0Ό3.
Клетки, способные устойчиво продуцировать химерные антитела против 0Ό3, получают так, как описано ниже, с использованием тандемного экспрессирующего вектора рСЫ641ЬН0М4 для химерных антител против ганглиозида 0Ό3, сконструированного в разделе 1 примера 1.
(1) Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток миеломы крысы УВ2/0.
После введение 5 мкг экспрессирующего вектора рСЫ641ЬН0М4 для химерных антител против ганглиозида 0Ό3 в 4х106 клеток миеломы крысы УВ2/0 [АТСС СВЬ-1662, IV. КПтапп е1 а1., Ь Се11. Вю1., 93, 576-582 (1982)] электропорацией [Су1о1есйпо1оду, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 40 мл ВЕМ11640-ЕВ8(10) (среда ΒΡΜΙ1640, содержащая 10% ЕВЗ (производится О1ВСО ВВЬ)) и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого Зитйото Ваке111е) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 добавляют 0418 до концентрации 0,5 мг/мл с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых образуются колонии трансформантов, показывающих невосприимчивость к 0418, и отмечается рост колоний, извлекают культуральный супернатант, и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против 0Ό3 методом ЕЫЗА, описанным в разделе 3 примера 1.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против 0Ό3, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ЭНЕВ, каждый из них суспендируют в среде ВΡΜI1640-ЕВЗ(10), содержащей 0,5 мг/мл 0418 и 50 нМ ингибитора ЭНЕВ метотрексата (называемого далее МТХ; производит З10МА), и получают плотность 1-2х105 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого Огетег) по 2 мл на лунку. Трансформанты, показывающие невосприимчивость к 50 нМ МТХ, подвергают культивированию при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2. В культуральных супернатантах в лунках, в которых отмечают рост трансформантов, измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против ΟΌ3 методом ЕЫЗА, описанным в разделе 3 примера 1. Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против ΟΌ3, то повышают концентрацию МТХ до 100 нМ и затем до 200 нМ, и наконец тем же способом, какой описан выше, получают трансформанты, способные расти в среде ВΡΜI1640-ЕВЗ(10), содержащей 0,5 мг/мл 0418 и 200 нМ МТХ, и продуцировать химерные антитела против 0Ό3 в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают подходящие клеточные линии, и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена α-1,6-фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
Полученный клон 7-9-51 трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против
- 38 013563
СЭ3, депонирован 5 апреля 1999 г. как ЕЕЯМ ВР-6691 в №11юпа1 1п5(11и(е о£ Вюзшепсе апб Нитап Тескпо1оду, Адепсу о£ 1пби8гка1 8с1епсе апб Тескпо1оду (ШдазЫ 1-1-3, ТзикиЬа, 1Ьагак1, 1арап, настоящее название 1п(егпа(1па1 Ра1еп1 Огдапкт Оерозкагу, №1Нопа1 1п8111и(е о£ Абуапсеб 1пби8гка1 8аепсе апб Тескпо1оду (А18Т ТзикиЬа Сеп!га1 6, 1-1, Н1да§Ы 1-Скоте ТкикиЬа-кЫ, 1Ьагак1-кеп, 1арап)).
(2) Получение клеток, продуцирующих антитела, с использованием клеток СНО/ЭС44.
После введение 4 мкг экспрессирующего вектора рСЫ641ЬНСМ4 для химерных антител против СЬ3 в 1,6х106 клеток С110/1)644 [С. Иг1аиЬ апб Ь.А. Скайп, Ргос. №11. Асаб. 8сг, 77, 4216-4220 (1980)] электропорацией [Су1о1ескпо1оду, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 10 мл 1МОМ-ЕВ8(10) [среда ΙΜΌΜ, содержащая 10% ЕВ8 и добавку НТ в концентрации 1х (производится С1ВСО ВРЬ)| и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого ΙνηΚί С1а§8) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 добавляют С418 для получения концентрации 0,5 мг/мл с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых образуются колонии трансформантов, показывающих невосприимчивость к С418, и отмечается рост колоний, извлекают культуральный супернатант, и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против СЭ3 методом ЕЫ8А, описанным в разделе 3 примера 1.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против СЭ3, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ОНЕЯ, каждый из них суспендируют в среде 1МОМ-бЕВ8(10) [среда 1МОМ, содержащая 10% диализованной сыворотки плода коровы (называемой далее 6ЕВ8; производится С1ВСО ВЯЬ)], содержащей 0,5 мг/мл С418 и 10 нМ МТХ, и получают плотность 1-2х105 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого ΙνηΚί С1а§8) по 0,5 мл на лунку. Трансформанты, показывающие невосприимчивость к 10 нМ МТХ, подвергают культивированию при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2. Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают их рост, то повышают концентрацию МТХ до 100 нМ, и наконец тем же способом, какой описан выше, получают трансформанты, способные расти в среде 1МОМ-бЕВ8(10), содержащей 0,5 мг/мл С418 и 100 нМ МТХ, и продуцировать химерные антитела против СЭ3 в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают подходящие клеточные линии, и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена (α1,6-фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
(3) Получение клеток, продуцирующих антитела, с использованием клеток миеломы мыши Ν80.
После введение 5 мкг экспрессирующего вектора рСЫ641ЬНСМ4 для химерных антител против СЭ3 в 4х106 клеток миеломы мыши Ν80 электропорацией [Су1о1ескио1оду, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 40 мл среды ЕХ-СЕЬЬ302-ЕВ8(10) (среда ЕХ-СЕЬЬ302, содержащая 10% ЕВ8 и 2 мМ Ьглутамина [далее называемого Ь-С1п; производится С1ВСО ВЯЬ]) и распределяют в лунки 96луночного культурального планшета (производимого 8иткото Ваке1йе) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 добавляют С418 для получения концентрации 0,5 мг/мл с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых образуются колонии трансформантов, показывающих невосприимчивость к С418, и отмечается рост колоний, извлекают культуральный супернатант, и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против СЭ3 методом ЕЫ8А, описанным в разделе 3 примера 1.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против СЭ3, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ЭНЕЯ каждый из них суспендируют в среде ЕХСЕЬЬ302-бЕВ8(10) (среда ЕХ-СЕЬЬ302, содержащая 10% бЕВ8 и 2 мМ Ь-С1п), содержащей 0,5 мг/мл С418 и 50 нМ МТХ, и получают плотность 1-2х105 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 24луночного планшета (производимого Сгешег) по 2 мл на лунку. Трансформанты, показывающие невосприимчивость к 50 нМ МТХ, подвергают культивированию при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2. В культуральных супернатантах в лунках, в которых отмечают рост трансформантов, измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против СЭ3 методом ЕЫ8А, описанным в разделе 3 примера 1. Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против СЭ3, то повышают концентрацию МТХ до 100 нМ и затем до 200 нМ, и наконец тем же способом, какой описан выше, получают трансформанты, способные расти в среде ЕХ-СЕЬЬ302-бЕВ8(10), содержащей 0,5 мг/мл С418 и 200 нМ МТХ, и продуцировать химерные антитела против СЭ3 в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают элитные клеточные линии, и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена α-1,6фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
- 39 013563
3. Измерение активности связывания антител с ΟΌ3 (ЕЫ8А).
Активность связывания антител с ΟΌ3 измеряют так, как описано ниже.
В 2 мл этанольного раствора, содержащего 10 мкг дипальмитоилфосфатидилхолина (производимого 8I0ΜА) и 5 мкг холестерина (производимого 8IΟΜА), растворяют 4 нмоль ΟΌ3. В каждую лунку 96луночного планшета для ЕЫ8А (производимого Огетег) распределяют 20 мкл раствора (в конечной концентрации 40 пмоль/лунку) с последующей сушкой на воздухе, добавляют 100 мкл/лунку ΡΒ8, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (называемого далее В8А, производит 8IΟΜА) (такая смесь далее называется 1% В8А-ГВ8), и затем осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 ч для блокирования оставшихся активных групп. После удаления 1% Β8Λ-ΡΒ8 культуральный супернатант трасформанта или разведенный раствор человеческих химерных антител распределяют по 50 мкл/лунку, и осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 ч. После реакции каждую лунку промывают ΡΒ8, содержащим 0,05% твина 20 (производимого \Уако Ριιιό Скет1са1 ШбикШек) (такая смесь далее называется твин-ΡΒδ), добавляют в качестве раствора второго антитела 50 мкл/лунку раствора меченных пероксидазой козьих антител против человеческого ΙβΟ (Н & Ь) (производимого Атенсам Оиа1ех), разведенного в 3000 раз 1% Β8А-ΡΒ8, и затем осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 ч. После реакции и последующей промывки твин-ΡΒδ добавляют 50 мкл/лунку раствора субстрата ΛΒΤδ [раствор, полученный растворением 0,55 г аммониевой соли 2,2'-азино-бис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) в 1 л 0,1 Μ цитратного буфера (рН 4,2) и добавлением к раствору перед применением 1 мкл/мл пероксида водорода (далее используют такой же раствор)] для проявления окраски, и затем измеряют поглощение при 415 нм (далее называется 00415).
4. Очистка химерных антител против ΟΌ3.
(1) Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток ΥΒ2/0, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против ΟΌ3, полученный в разделе 2(1) примера 1, суспендируют в среде НуЬ^^бοта-δРΜ, содержащей 0,2% ΒδА, 200 нМ ΜΤΧ и 100 нМ трииодтиронина (называемого далее Т3; производит δIΟΜА), получают плотность клеток 3х105 клеток/мл, и клетки культивируют с использованием бутыли емкостью 2,0 л, содержимое которой перемешивается при вращении (производимой Гетак1 ОИкк), при перемешивании со скоростью 50 об/мин. После культивирования при 37°С в течение 10 суток в камере с регулируемой температурой извлекают культуральный супернатант. Химерные антитела против ΟΌ3 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки с ΡΐΌ^ρ^ (производимой Β^ορ^οсекк^ηд) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против ΟΌ3 называют химерными антителами ΥΒ2/0-ΟΌ3.
(2) Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток ΟΗ0/ΟΟ44, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против ΟΌ3, полученный в разделе 2(2) примера 1, суспендируют в среде ЕХ-СЕЬЬ302, содержащей 3 мМ Ε-Ο1η, 0,5% концентрированного раствора жирной кислоты (называемого далее СОЬС; производит ΟΙΒί,Ό ΒΒΕ) и 0,3% плюроника Р68 (называемого далее '^68; производит ΟΙΒί,Ό ΒΚΕ), получают плотность клеток 1 х 106 клеток/мл, и суспензию распределяют по 50 мл на 175-мм2 матрасы (производимые Огетег). После культивирования при 37°С в течение 4 суток в инкубаторе с 5% СО2 извлекают культуральный супернатант. Химерные антитела против ΟΌ3 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки с Ρτο^ρ^ (производимой Β^ορ^οсекк^ηд) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против ΟΌ3 называют химерными антителами СН0/0044-003.
(3) Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток N80, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против ΟΌ3, полученный в разделе 2(3) примера 1, суспендируют в среде ЕХ-СЕЕЬ302, содержащей 2 мМ Ε-Ο1η, 0,5 мг/мл Ο418, 200 нМ ΜΤΧ и 1% РΒ8, получают плотность клеток 1х106 клеток/мл, и суспензию распределяют по 200 мл на 175-мм2 матрасы (производимые Огешег). После культивирования при 37°С в течение 4 суток в инкубаторе с 5% СО2 извлекают культуральный супернатант. Химерные антитела против ΟΌ3 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки с Ρτο^ρ^ (производимой Β^ορ^οсекк^ηд) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против ΟΌ3 называют химерными антителами N80-003 (302).
Также клон трансформированных клеток суспендируют в среде ΟΙΤ, содержащей 0,5 мг/мл Ο418 и 200 нМ ΜΤΧ, получают плотность клеток 3х105 клеток/мл, и суспензию распределяют по 200 мл на 175мм2 матрасы (производимые Огешег). После культивирования при 37°С в течение 10 суток в инкубаторе с 5% С02 извлекают культуральный супернатант. Химерные антитела против ΟΌ3 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки Ρτο^ρ^ (производимой Β^ορ^οсекк^ηд) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против ΟΌ3 называют химерными антителами N80-003 (ΟΙΤ).
- 40 013563 (4) Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток δΡ2/0, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против ΟΌ3 (КМ-871, РЕВМ ВР-3512), описанный в опубликованной, не прошедшей экспертизу заявке на патент Японии № 304989/93 (ΕΡ 533199), суспендируют в среде С1Т, содержащей 0,5 мг/мл С418 и 200 нМ МТХ, получают плотность клеток 3х105 клеток/мл, и суспензию распределяют по 200 мл на 175-мм2 матрасы (производимые Огетег). После культивирования при 37°С в течение 8 суток в инкубаторе с 5% СО2 извлекают культуральный супернатант. Химерные антитела против ΟΌ3 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки Ρ^оδер-Л (производимой ВюргосеББтд) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против ΟΌ3 называют химерными антителами δΡ2/0-ΟΌ3.
5. Анализ очищенных химерных антител против ΟΌ3.
Каждый из пяти видов химерных антител против ΟΌ3 (4 мкг), продуцированных разными животными клетками и выделенных из них в чистом виде, полученных в разделе 4 примера 1, подвергают δΌδΡЛ6Ε согласно известному способу |Ха1иге, 227, 680 (1970)] и анализируют на молекулярную массу и степень очистки, результаты приводятся на фиг. 1. Как видно на фиг. 1, в каждом из очищенных химерных антител против ΟΌ3 отмечают одну полосу, соответствующую молекулярной массе примерно в 150 килоДальтон (далее обозначаются кДа), в условиях невосстановления, и в условиях восстановления отмечают две полосы примерно в 50 и 25 кДа. Молекулярные массы почти сопадают с молекулярными массами, установленными из нуклеотидных последовательностей кДНК Н-цепи и Ь-цепи антитела (Н-цепь примерно 49 кДа, Ь-цепь примерно 23 кДа, вся молекула примерно 144 кДа), и также совпадают с сообщениями, утверждающими, что антитело типа [дС имеет молекулярную массу примерно 150 кДа в условиях невосстановления и распадается до Н-цепей с молекулярной массой примерно 50 кДа и Ьцепей с молекулярной массой примерно 25 кДа в условиях восстановления из-за разрушения в молекуле дисульфидной связи (называемой далее связь 8-8) [ЛпйЬоб1еБ: Л ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б δр^^ηд НагЬог ЬаЬогаФгу, СНар1ег 14 (1998); Мопос1опа1 ЛпДЬоб1еБ: Ρ^^ηс^р1еδ апб Ρπια^, Лсабетю ΡϊΌδδ ЫтЕеб (1996)], так что подтверждается, что каждое химерное антитело против ΟΌ3 экспрессируется и очищается как молекула антитела с правильной структурой.
Пример 2. Оценка активности химерных антител против ΟΌ3.
1. Активность связывания химерных антител против ΟΌ3 с ΟΌ3 (ЕЬРЛ).
Активность пяти видов очищенных химерных антител против ΟΌ3, полученных в разделе 4 примера 1 в отношении связывания с ΟΌ3 (производимым δ пои Вгапб М11к Ρ^обисΐδ) измеряют методом ЕЬРЛ, описанным в разделе 3 примера 1. Фиг. 2 показывает результаты проверки активности связывания, измеренной при изменении концентрации добавляемых химерных антител против ΟΌ3. Как видно на фиг. 2, пять видов химерных антител против ΟΌ3 показывают почти одинаковую активность связывания с ΟΌ3. Результаты показывают, что антигенсвязывающие активности указанных антител постоянны, независимо от животных клеток, продуцирующих антитела, и способов их культивирования. Также из сравнения химерных антител Νδ0-ΟΌ3 (302) с химерными антителами Νδ0-ΟΌ3 (С1Т) предполагается, что активности связывания постоянны независимо от среды, используемой при культивировании.
2. Цитотоксическая активность (ЛОСС-активность) ш νίΐΐΌ химерных антител против ΟΌ3.
Для того чтобы оценить ш νίΙΐΌ цитотоксическую активность пяти видов очищенных химерных антител против ΟΌ3, полученных в разделе 4 примера 1, измеряют ЛИСС-активность согласно способу, описанному далее.
(1) Получение раствора клеток-мишеней.
Культивированную клеточную линию меланомы человека С-361 (ЛТСС СВЬ 1424) культивируют с использованием среды ВΡΜΗ640-РВδ(10), получают 1х106 клеток, и клетки метят радиоактивным изотопом путем взаимодействия их с эквивалентом 3,7 МБк радиоактивного вещества Ха251СгО.4 при 37°С в течение 1 ч. По завершении реакции клетки три раза промывают, суспендируя их в среде ВΡΜΗ640РВδ(10) и центрифугируя, ресуспендируют в среде и затем инкубируют при 4°С в течение 30 мин на льду для спонтанного растворения радиоактивного вещества. После центрифугирования осадок доводят до содержания клеток 2х 105 клеток/мл, добавляя 5 мл среды ВΡΜΗ640-РВδ(10), и используют в качестве раствора клеток-мишеней.
(2) Получение раствора эффекторных клеток.
У здорового человека берут 50 мл венозной крови и осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого Такеба Ρйа^тасеиΐ^са1). Смесь центрифугируют для выделения слоя одноядерных клеток с использованием ЬушрНоргер (производимого Жсотеб ΡΕηταη Лδ) согласно инструкциям изготовителя. После промывки средой ВΡΜΗ640-РВδ(10) путем трехкратного центрифугирования полученный осадок снова суспендируют, и с использованием среды получают раствор с плотностью клеток 2х106 клеток/мл и используют в качестве раствора эффекторных клеток.
(3) Измерение ЛИСС-активности.
В каждую лунку 96-луночного планшета с υ-образными лунками (производимого Ра1соп) помещают 50 мкл раствора клеток-мишеней, полученного выше в (1) (1 х 104 клеток/лунку). Затем добавляют 100
- 41 013563 мкл раствора эффекторных клеток, полученного выше в (2) (2х105 клеток/лунку, отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням становится равным 20:1). Затем добавляют каждое из химерных антител против СЭ3, получают конечную концентрацию от 0,0025 до 2,5 мкг/мл, и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 4 ч. По завершении реакции планшет центрифугируют, и измеряют количество 51Сг в супернатанте с использованием счетчика γ-квантов. Количество спонтанно высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же операции, используя только одну среду вместо раствора эффекторных клеток и раствора антител, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. Количество всего высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же операции, используя только одну среду вместо раствора антител, и добавляя 1н. соляную кислоту вместо раствора эффекторных клеток, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. АЭСС-активность вычисляют из следующего уравнения (II):
51Сг в образце супернатанта - спонтанно высвободившийся 51Сг
АЭСС-активность (%) =------------------;------------------------------------------------------------------х 100 (II) общий высвободившийся 51Сг - спонтанно высвободившийся 51Сг
Результаты приводятся на фиг. 3. Как видно из фиг. 3, из пяти видов химерных антител против СЭ3 химерные антитела Υβ2/0^Ο3 показывают наиболее сильную АЭСС-активность, за ними следуют химерные антитела 8Р2/0-СЭ3, химерные антитела Ν80-Ο33 и химерные антитела СНО-СЭ3 в указанном порядке. Не обнаружено различия в АЭСС-активности между химерными антителами Ν80-Ο33 (302) и химерными антителами Ν80-Ο33 (С!Т), полученными с использованием разных сред при культивировании. Вышеприведенные результаты показывают, что АЭСС-активность антител сильно изменяется в зависимости от вида животных клеток, используемых при их получении. Так как их антигенсвязывающие активности идентичны, считается, что механизм такого явления состоит в том, что оно вызывается различиями в структурах, связывающихся с Ес-областью антитела.
Пример 3. Получение человеческих антител с привитыми СЭК против α-цепи рецептора интерлейкина 5 человека.
1. Получение клеток, устойчиво продуцирующих человеческие антитела с привитыми СЭК против α-цепи рецептора интерлейкина 5 человека.
(1) Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток миеломы крысы ΥВ2/0.
С использованием экспрессирующего вектора для человеческих антител с привитыми СЭК против α-цепи рецептора интерлейкина 5 человека (называемых далее антитела с привитыми СЭК против ЫЬ5Ка) рКАNТЕX1259НУ3^У0, описанного в УО 97/10354, получают, как описано ниже, клетки, способные устойчиво продуцировать антитела с привитыми СЭК против ЫЬ-5Ка.
После введения 5 мкг экспрессирующего вектора рКАNТЕX1259НУ3^У0 для антител с привитыми СЭК против ЫЬ-5Ко в 4х106 клеток миеломы крысы ΥВ2/0 электропорацией [Су1о1есйпо1о§у, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 40 мл КРМИ640-РВ8(10) и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого 8ипЩото Ваке111е) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 добавляют 0418 до концентрации 0,5 мг/мл с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых образуются колонии трансформантов, показывающих невосприимчивость к С418, и отмечается рост колоний, извлекают культуральный супернатант, и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность антител с привитыми СЭК против МЬюКа методом ЕЬКА, описанным в разделе 2 примера 3.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование антител с привитыми СЭК против ЫЕ-5Ко, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ЭНРК, каждый из них суспендируют в среде КРМИ640-РВ8(10), содержащей 0,5 мг/мл С418 и 50 нМ МТХ, и получают плотность 1-2х105 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого Стешет) по 2 мл на лунку. Трансформанты, показывающие невосприимчивость к 50 нМ МТХ, подвергают культивированию при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2. В культуральных супернатантах в лунках, в которых отмечают рост трансформантов, измеряют антигенсвязывающую активность антител с привитыми СЭК против ЫЬ-5Ка методом ЕЬКА, описанным в разделе 2 примера 3. Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование антител с привитыми СЭК против ЫЕ-5Ко, то повышают концентрацию МТХ до 100 нМ и затем до 200 нМ, и наконец тем же способом, какой описан выше, получают трансформанты, способные расти в среде КРМИ640-РВ8(10), содержащей 0,5 мг/мл С418 и 200 нМ МТХ, и продуцировать антитела с привитыми СЭК против ЫЬ-5Ка в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают элитные клеточные линии, и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена α-1,6фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию. Полученный клон № 3 трансформированных клеток, продуцирующих антитела с привитыми СЭК против ЫЕ-5Ко, депонирован 5 апреля 1999 г. как РЕКМ ВР-6690 в №1юпа1 !пк111и1е о£ Вюкслепсе апб Нитап
- 42 013563
ТссЬпо1оду. Адспсу оГ [пби8П1а1 Ес1спсс апб ТссНпо1оду (ШдазЫ 1-1-3. ТзикиЬа. !Ьагак1. 1арап) (настоящее название !п1сгпа(1па1 Ра1сп1 Отдалит Осрозйагу. №1Нопа1 [п8(11и1с оГ Абуапсеб [пби8гПа1 Ес1спсс апб ТесНпо1оду (АКТ ТзикиЬа Ссп!га1 6. 1-1. ШдазЫ 1-СНотс ТзикиЬа-зЫ. [Ьагак|-ксп. 1арап)).
(2) Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток СНО/бНГг-.
После введения 4 мкг экспрессирующего вектора рКΛNТЕX1259НV3^V0 для антител с привитыми СОК против ЫЬ-5Ка. описанного в νθ 97/10354. в 1.6х106 клеток СНО/бНГг- электропорацией [Су!о!ссйио1оду. 3. 133 (1990)] клетки суспендируют в 10 мл IМ^М-РВЕ(10) и распределяют в лунки 96луночного культурального планшета (производимого ГОак1 61а§8) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 добавляют 6418 до получения концентрации 0.5 мг/мл с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок. в которых образуются колонии трансформантов. показывающих невосприимчивость к 6418. и отмечается рост колоний. извлекают культуральный супернатант. и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность антител с привитыми СОК против ЫЬ-5Ка методом ЕМЕА. описанным в разделе 2 примера 3.
Что касается трансформантов в лунках. в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование антител с привитыми СОК против ЫЬ-5Ка. то для того. чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ΌΗΡΚ. каждый из них суспендируют в среде ШОМ-бРВЕ (10). содержащей 0.5 мг/мл 6418 и 10 нМ МТХ. и получают плотность клеток 1-2х105 клеток/мл. и суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого ΕνηΕί 61аз8) по 0.5 мл на лунку. Трансформанты. показывающие невосприимчивость к 10 нМ МТХ. подвергают культивированию при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2. Что касается трансформантов в лунках. в которых отмечают их рост. то повышают концентрацию МТХ до 100 нМ и затем до 500 нМ. и наконец тем же способом. какой описан выше. получают трансформанты. способные расти в среде IМ^М-бРВЕ(10). содержащей 0.5 мг/мл 6418 и 500 нМ МТХ. и продуцировать антитела с привитыми СОК против ЫЬ-5Ка в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают элитные клеточные линии. и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена α-1.6фукозилтрансферазы. описанного в примере 9. отбирают клеточную линию. продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции. и используют как подходящую клеточную линию.
(3) Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток миеломы мыши Ν80.
Получают экспрессирующий вектор для антител с привитыми СЭК против ЫЬ-5Ка согласно способу УаггапЮп с! а1. [ВIО/ТЕСΗNО^О6Υ. 10. 169 (1992)] и с использованием кДНК Н-цепи и кДНК Ьцепи на экспрессирующем векторе рКАкТЕХ 1259НУ3БУ0 для антител с привитыми СОК против ЫЬ5Ка. описанном в \УО 97/10354. и трансформируют клетки Ν80 для получения трансформантов. способных продуцировать антитела с привитыми СЭК против ЫЬ-5Ка в большом количестве. Из полученных трансформантов отбирают элитные клеточные линии. и получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением. Также с использованием способа определения продукта транскрипции гена а-1.6-фукозилтрансферазы. описанного в примере 9. отбирают клеточную линию. продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции. и используют как подходящую клеточную линию.
2. Измерение активности связывания антител с ЫЬ-5Ка (ЕМЕА).
Активность связывания антител с ЫЬ-5Ка измеряют так. как описано ниже.
Получают раствор. разводя в РВЕ мышиные антитела против ЫЬ-5Ка КМ1257. описанные в XVО 97/10354. получают концентрацию 10 мкг/мл. и по 50 мкл полученного раствора распределяют в каждую лунку 96-луночного планшета для ЕМЕА (производимого бтетег). и затем осуществляют взаимодействие при 4°С в течение 20 ч. По завершении реакции добавляют 100 мкл/лунку 1% ВЕА-РВЕ. и затем осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 ч для блокирования оставшихся активных групп. После удаления 1% ВЕА-РВЕ раствор. полученный разведением 1% ВЕА-РВЕ растворимого ЫЬ-5Ка. описанного в VО 97/10354. с получением концентрации 0.5 мкг/мл. распределяют по 50 мкл/лунку. и осуществляют взаимодействие при 4°С в течение 20 ч. По завершении реакции каждую лунку промывают твин-РВЕ. культуральные супернатанты трансформантов или разбавленные растворы очищенных человеческих антител с привитыми СЭК распределяют 50 мкл/лунку и осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 2 ч. По завершении реакции каждую лунку промывают твин-РВЕ. добавляют в качестве раствора второго антитела 50 мкл/лунку раствора меченных пероксидазой козьих антител против человеческого Цб (Н & Ь) (производимого Атенсам 6иа1сх). разведенного в 3000 раз 1% ВЕА-РВЕ. и затем осуществляют взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 ч. По завершении реакции и после последующей промывки твин-РВЕ добавляют 50 мкл/лунку раствора субстрата АВТЕ для проявления окраски и затем измеряют поглощение ОЭ415.
3. Очистка антител с привитыми СЭК против ЫЬ-5Ка.
(1) Культивирование продуцирующих антитела клеток. полученных из клеток УВ2/0. и очистка антител.
Клон трансформированных клеток. продуцирующих антитела с привитыми СЭК против ЫЬ-5Ка.
- 43 013563 полученный в разделе 1(1) примера 3, суспендируют в среде С1Т, содержащей 0,5 мг/мл С418 и 200 нМ МТХ, получают плотность клеток 3х105 клеток/лунку, и распределяют по 200 мл на 175-мм2 матрасы (производимые Сгешег). После культивирования клеток при 37°С в течение 8 суток в инкубаторе с 5% СО2 извлекают культуральный супернатант. Антитела с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα очищают от культурального супернатанта с использованием ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Очищенные антитела с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα называют антителами ΥΒ2/0-Ы^-5Я СОЯ.
(2) Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток СНО/йЫг-, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих антитела с привитыми СОЯ против Ы^-5Яα, полученный в разделе 1(2) примера 3, суспендируют в среде ЕХ-СЕЬЬ302, содержащей 3 мМ Ь-С1п, 0,5% СОЬС и 0,3% РЕ68, получают плотность клеток 3х106 клеток/мл, и культивируют с использованием бутыли емкостью 4 л, содержимое которой перемешивается при ее вращении (производимой Ι\νη1<ί С1абб), при перемешивании со скоростью 100 об/мин. После культивирования клеток при 37°С в течение 10 суток в камере с регулируемой температурой извлекают культуральный супернатант. Антитела с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα очищают от культурального супернатанта с использованием ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Очищенные антитела с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα называют антителами СНО/й-ЫЬ-5Я СОЯ.
(3) Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток Ν80, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих антитела с привитыми СОЯ против Ы^-5Яα, полученный в разделе 1(3) примера 3, культивируют согласно способу Υа^^аη!οη е! а1. [ΒЮ/ТЕСНNО^ОСΥ, 10, 169 (1992)], и затем извлекают культуральный супернатант. Антитела с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα очищают от культурального супернатанта с использованием ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Очищенные антитела с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα называют антителами Ν80-11ΙΕ-5Π СОЯ.
4. Анализ очищенных антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα.
Согласно известному способу [№!иге, 227, 680 (1970)], по 4 мкг каждого из трех видов антител с привитыми СОЯ против Ы^-5Яα, продуцированных каждым из видов животных клеток и выделенных из них в чистом виде, полученных в разделе 3 примера 3, подвергают 8Э8-РАСЕ для анализа на молекулярную массу и степень очистки. Результаты приводятся на фиг. 4. Как видно из фиг. 4, в молекулярной массе обнаруживаются одна полоса примерно в 150 кДа в условиях невосстановления и две полосы примерно в 50 кДа и примерно в 25 кДа в условиях восстановления в каждом образце очищенных антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα. Молекулярные массы почти сопадают с молекулярными массами, установленными из нуклеотидных последовательностей кДНК Н-цепи и Ь-цепи антитела (Н-цепь примерно 49 кДа, Ь-цепь примерно 23 кДа, вся молекула примерно 144 кДа), и также совпадает с сообщениями, утверждающими, что антитело ΙβΟ имеет молекулярную массу примерно 150 кДа в условиях невосстановления и распадается до Н-цепей с молекулярной массой примерно 50 кДа и Ь-цепей с молекулярной массой примерно 25 кДа в условиях восстановления из-за разрушения в молекуле дисульфидной связи 88 [Ап!1Ьой1еб: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, Сйар!ег 14 (1998); Мопос1опа1 АпйЬой1е§: Ргтс1р1еб апй Ргасйсе, Асайетю Ргебб Ытйей (1996)], так что подтверждается, что каждое антитело с привитым СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα экспрессируется и очищается как молекула антитела с правильной структурой.
Пример 4. Оценка активности антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα.
1. Активность связывания антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα с 1ιΙΕ-5Πα (ЕЫ8А).
Активность трех видов очищенных антител с привитыми СОЯ против Ы^-5Яα, полученных в разделе 3 примера 3, в отношении связывания с 1ιΙΕ-5Πα измеряют методом ЕЫ8А, описанным в разделе 2 примера 3. Фиг. 5 показывает результаты проверки активности связывания, измеренной при изменении концентрации добавляемых антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα. Как видно на фиг. 5, три вида антител с привитыми СОЯ против 1ιΙΕ-5Πα показывают почти одну и ту же активность связывания с ЫЬ5Яα. Результаты показывают, что антигенсвязывающие активности указанных антител постоянны, независимо от животных клеток, продуцирующих антитела, и способов их культивирования, что схоже с результатами, полученными в разделе 1 примера 2.
2. Цитотоксическая активность (АОСС-активность) ш νίΙΐΌ антител с привитыми СОЯ против ЫЬ5Яα.
Для того чтобы оценить ш νίΙΐΌ цитотоксическую активность трех видов очищенных антител с привитыми СОЯ против Ы^-5Яα, полученных в разделе 3 примера 3, измеряют АОСС-активность согласно способу, описанному далее.
(1) Получение раствора клеток-мишеней.
Мышиную Т-клеточную линию СТЬЬ-2(й5Я), экспрессирующую цепь 1ιΙΕ-5Πα и β-цепь, описанную в \УО 97/10354, культивируют с использованием среды ЯРМП640-ЕВ8 (10), получают плотность
- 44 013563 клеток 1х 106 клеток/0,5 мл, и клетки метят радиоактивным изотопом путем взаимодействия их с эквивалентами 3,7 МБк радиоактивного вещества №251СгО4 при 37°С в течение 1,5 ч. По завершении реакции клетки три раза промывают, суспендируя их в среде РРМП640-РВ§(10) и центрифугируя, ресуспендируют в среде и затем инкубируют при 4°С в течение 30 мин на льду для спонтанного растворения радиоактивного вещества. После центрифугирования осадок доводят до содержания клеток 2х105 клеток/мл, добавляя 5 мл среды РРМП640-РВ§(10), и используют в качестве раствора клеток-мишеней.
(2) Получение раствора эффекторных клеток.
У здорового человека берут 50 мл венозной крови и осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого Такеба РЬагтасеи!юа1). Смесь центрифугируют для отделения слоя одноядерных клеток с использованием Ро1уторгрйргер (производимого Шусотеб РНагта А§) согласно инструкциям изготовителя. После промывки средой РРМП640-РВ§(10) путем трехкратного центрифугирования полученные клетки снова суспендируют, и с использованием среды получают раствор с плотностью клеток 9х106 клеток/мл и используют в качестве раствора эффекторных клеток.
(3) Измерение АЭСС-активности.
В каждую лунку 96-луночного планшета с И-образными лунками (производимого Ра1соп) помещают 50 мкл раствора клеток-мишеней, полученного выше в (1) (1х104 клеток/лунку). Затем добавляют 100 мкл раствора эффекторных клеток, полученного выше в (2) (9х105 клеток/лунку, отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням становится равным 90:1). Затем добавляют каждое из антител с привитыми СИР. против ЫЬ-5Ра, получают конечную концентрацию от 0,001 до 0,1 мкг/мл, и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 4 ч. По завершении реакции планшет центрифугируют и измеряют количество 51Сг в супернатанте с использованием счетчика γ-квантов. Количество спонтанно высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же операции, используя только одну среду вместо раствора эффекторных клеток и раствора антител, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. Количество общего высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же операции, используя только одну среду вместо раствора антител, и добавляя 1н. соляную кислоту вместо раствора эффекторных клеток, и измеряя количество 51Сг в супернатанте.
АОСС-активность вычисляют из приведенного выше уравнения (II).
Результаты приводятся на фиг. 6. Как видно из фиг. 6, из трех видов антител с привитыми СЭР против ЫЬ-5Ра антитела УВ2/0-ЫЬ-5Р СИР показывают наиболее сильную АОСС-активность, за ними следуют антитела СНО/б-ЫЬ-5Р СИР и антитела Ν§0-1ΣΕ-5Ρ СИР в указанном порядке. Подобно результатам, полученным в разделе 2 примера 2, вышеприведенные результаты показывают, что АЭССактивность антител сильно изменяется в зависимости от вида животных клеток, используемых при их получении. Кроме того, так как антитела, продуцированные клетками УВ2/0, показывают самую сильную АИСС-активность в обоих случаях двух видов гуманизированных антител, показано, что антитела с сильной АОСС-активностью можно получить с использованием клеток УВ2/0.
3. Оценка ш у1уо активности антител с привитыми СИР против ЫЬ-5Ра.
Для того чтобы оценить ш у1уо активность трех видов очищенных антител с привитыми СИР против ЫЬ-5Ра, полученных в разделе 3 примера 3, проверяют, согласно описанному далее способу, ингибирующую активность на модели Масаса £акеюи1апк с нарастанием эозинонофилии, вызванной ЫЬ-5.
Масаса £акеюи1апк под кожу на спине вводят ЫЬ-5 (способ получения описан в VО 97/19354) в дозе 1 мкг/кг, начиная в первый день и один раз в день всего 14 раз. Каждый вид антител с привитыми СИР против ЫЬ-5Ра вводят внутривенно в дозе 0,3 мг/кг за один час до введения ЫЬ-5 в день ноль. Группу, которой антитела не вводят, используют как контроль. В каждой из групп, которым вводят антитела, используют трех животных Масаса £акеюи1апк (№ 301, 302, 303, 401, 402, 403, 501, 502 и 503), и двух животных (№ 101 и 102) используют в группе, которой антитела не вводят. Начиная со времени за 7 дней до начала введения и до 42 дня после введения периодически берут примерно 1 мл крови из подкожной вены задней конечности или бедренной вены, и измеряют число эозинофилов в 1 мкл периферической крови. Результаты приводятся на фиг. 7. Как видно из фиг. 7, повышение числа эозинофилов в крови полностью ингибируется в группе, которой вводили антитела УВ2/0-ЫЬ-5Р СИР. С другой стороны, отмечают полную ингибирующую активность у одного животного в группе, которой вводили антитела СНО/б-ЫЬ5Р СИР, но у двух животных ингибирующая активность недостаточная. В группе, которой вводили антитела Н80-11[Р-5Р СИР, полную ингибирующую активность не отмечают, и их действие является недостаточным.
Приведенные выше результаты показывают, что активность ш у1уо антител сильно изменяется в зависимости от животных клеток, используемых при их получении. Кроме того, так как между степенью активности ш у1уо антител с привитыми СИР против ЫЬ-5Ра и степенью их АЭСС-активности, описанной в разделе 2 примера 4, обнаруживается положительная корреляция, это указывает, что степень АИСС-активности заметно важна для выражения их активности.
На основании приведенных выше результатов ожидается, что антитела с сильной АИССактивностью также полезны в клинической области в случае различных заболеваний человека.
Пример 5. Анализ углеводной цепи, усиливающей АИСС-активность.
- 45 013563
1. Получение углеводных цепей. меченных 2-аминопиридином (РА-обработанных углеводных цепей).
Гуманизированные антитела настоящего изобретения подвергают кислотному гидролизу с соляной кислотой для удаления сиаловой кислоты. После полного удаления соляной кислоты углеводные цепи отщепляют от белка гидразинолизом [ΜеΐΗοά οί Εηζутο1οду. 83. 263 (1982)]. Гидразин удаляют и осуществляют ^ацетилирование. добавляя водный раствор ацетата аммония и уксусный ангидрид. После лиофилизации присоединяют флуоресцентную метку 2-аминопиридин [I. Β^οсΗет.. 95. 197 (1984)]. Углеводные цепи с флуоресцентными метками (РА-обработанные углеводные цепи) отделяют от примесей с использованием колонки с 8игрегбех Рерйбе НК 10/30 (производимым РНагтаФа). Фракцию углеводных цепей сушат с использованием центробежного концентратора и используют в качестве очищенных РА-обработанных углеводных цепей.
2. Анализ ВЭЖХ с обращенной фазой РА-обработанных углеводных цепей антител с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка.
Согласно способу. описанному в разделе 1 примера 5. различные антитела с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка. полученные в примере 3. подвергают обработке для получения РА-обработанных углеводных цепей и осуществляют анализ методом ВЭЖХ с обращенной фазой с колонкой с СЬС-008 (производимым 8Н1таб/и). Избыточное количество α-Ь-фукозидазы (полученной из почек коровы. производится 8IОΜА) добавляют к РА-обработанным углеводным цепям для расщепления (37°С. 15 ч). и затем анализируют продукты реакции ВЭЖХ с обращенной фазой (фиг. 8). С использованием эталонов РАобработанных углеводных цепей. производимых Такага 8Ηиζο. подтверждают. что соединенные с аспарагином углеводные цепи элюируются за время от 30 до 80 мин. Вычисляют долю углеводных цепей. у которых сдвигаются позиции элюирования при ВЭЖХ с обращенной фазой (углеводных цепей. элюированных за 48-78 мин) за счет расщепления α-Ь-фукозидазой. Результаты приводятся в табл. 1.
Таблица 1
Клетки, продуцирующие антитела Углеводные цепи с присоединенной а-1,6-фукозой (%)
ΥΒ2/0 47
N30 73
Примерно 47% антител с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка. продуцированных клетками ΥΒ2/0. и примерно 73% антител с привитыми СОК против НП.-5Ка. продуцированных клетками N80. представляют собой углеводные цепи. в которых положение 1 фукозы связано с положением 6 N ацетилглюкозамина на редуцирующем конце через α-связь в присоединенной через ^гликозидную связь углеводной цепи (далее называются углеводные цепи с а-1.6-фукозой). Таким образом. доля углеводных цепей. в которых положение 1 фукозы не связано с положением 6 ^ацетилглюкозамина на редуцирующем конце через α-связь в присоединенной через ^гликозидную связь углеводной цепи (называемых далее углеводными цепями без а-1.6-фукозы). выше в антителах. продуцированных клетками ΥΒ2/0. чем в антителах. продуцированных клетками N80.
3. Анализ моносахаридного состава очищенных антител с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка.
Углеводные цепи антител с привитьми СБК против Н1Ь-5Ка. продуцированных клетками ΥΒ2/0. клетками N80 и клетками СН0/б. гидролизуют до моносахаридов кислотным гидролизом с трифторуксусной кислотой и осуществляют анализ моносахаридного состава с использованием ΒίοΙ-С (производимого Бюпех).
В углеводных цепях. присоединенных через ^гликозидную связь. имеются 3 маннозных звена в одной углеводной цепи в присоединенной через ^гликозидную связь углеводной цепи комплексного типа. Относительные доли каждого моносахарида. полученные вычислением с числом для маннозы 3. приводятся в табл. 2.
Таблица 2
Клетки, продуцирующие антитела Гис ΟΙοΝΑο Зз 1 Мап АОССактивность (%) *
ΥΒ2/0 0,60 4,98 0,30 3,00 42,27
N30 1,06 3,94 0,66 3,00 16,22
СНО/сИ1Ег- 0,85 3,59 0,49 3,00 25, 73
сно/аькг- 0,91 3,80 0,27 3,00 25, 73
* Концентрация антител 0.01 мкг/мл.
Так как относительные доли фукозы возрастают в ряду ΥΒ2/0<СН0/ά<N80. углеводные цепи. полученные в антителах. продуцированных клетками ΥΒ2/0. показывают наименьшее содержание фукозы. как видно из представленных результатов.
4. Анализ углеводных цепей антител. продуцированных клетками СН0/бН£г-.
Из очищенных антител с привитыми СОК против Н1Ь-5Ка. продуцированных клетками СНО/бНй·-. получают РА-обработанные углеводные цепи и осуществляют анализ методом ВЭЖХ с обращенной фа
- 46 013563 зой с использованием колонки СЬС-0Э8 (производимой 81ιίιηηάζιι) (фиг. 9). На фиг. 9 время элюирования от 35 до 45 мин соответствует углеводным цепям без фукозы, и время элюирования от 45 до 60 мин соответствует углеводным цепям с фукозой. Подобно случаю с антителами, продуцированными клетками миеломы мыши Ν80, антитела с привитыми СОЯ против ΗΣΕ-5Κα, продуцированные клетками СН0/бЫг-, имеют меньшее содержание цепей без фукозы, чем антитела, продуцированные клетками миеломы крысы ΥΒ2/0.
Пример 6. Выделение антител с сильной АЭСС-активностью.
Антитела с привитыми СОЯ против Ы^-5Яα, продуцированные клетками миеломы крысы ΥΒ2/0, отделяют с использованием колонки с лектином, связывающимся с углеводными цепями с фукозой. Осуществляют ВЭЖХ с использованием ЬС-6А, производимого 8Ытаάζи, при скорости потока 1 мл/мин и при комнатной температуре как температуре колонки. После уравновешивания 50 мМ трис-сульфатным буфером (рН 7,3) впрыскивают очищенные антитела с привитыми СЭЯ против Ы^-5Яα, и затем элюируют с линейным градиентом плотности (60 мин) 0,2 М α-метилманнозида (производимого №1са1а1 Теэдие). Антитела с привитыми СЭЯ против 1ιΙΕ-5Εα выделяются в неадсорбированную фракцию и адсорбированную фракцию. Когда берут образцы неадсорбированной фракции и части адсорбированной фракции и определяют их активность связывания с Ы^-5Яα, они показывают подобные активности связывания (фиг. 10А). Когда измеряют АЭСС-активность, неадсорбированная фракция показывает более сильную АЭСС-активность (в 100-1000 раз), чем часть адсорбированной фракции (фиг. 10В). Кроме того, из неадсорбированной фракции и части адсорбированной фракции получают РА-обработанные углеводные цепи, и осуществляют анализ методом ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием колонки СЬС-0Э8 (производимой 81ιίιηηάζιι) (фиг. 11). В неадсорбированной фракции имеет место, главным образом, связывание антител с углеводными цепями без фукозы, а в части адсорбированной фракции имеет место, главным образом, связывание антител с углеводными цепями с фукозой.
Пример 7. Оценка активности химерных антител против СЭ3 с различной долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы.
1. Получение химерных антител против СЭ3 с различной долей углеводных цепей без α-1,6фукозы.
Согласно способу, описанному в разделе 2(1) примера 1, получают трансформированные клоны, происходящие от клеток ΥΒ2/0, способных продуцировать химерные антитела против СЭ3. Антитела получают из трансформированных клонов, полученных из клеток ΥΒ2/0, и называют их серией 1, серией 2 и серией 3. Каждую углеводную цепь, связанную с химерными антителами против СЭ3 серии 1, серии 2 и серии 3, анализируют согласно способу, описанному в примере 11(6), и обнаруживают, что доли углеводных цепей без α-1,6-фукозы составляют 50, 45 и 29% соответственно. В данном случае указанные образцы называют химерными антителами против СЭ3 (50%), химерными антителами против СЭ3 (45%) и химерными антителами против СЭ3 (29%).
Также углеводные цепи химерных антител против СЭ3, продуцированных клетками СН0/ЭС44, полученных в разделе 2(2) примера 1, анализируют согласно способу примера 11(6), и обнаруживают, что доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы составляет 7%. В данном случае образец называют химерными антителами против СЭ3 (7%).
Химерные антитела против СЭ3 (45%) и химерные антитела против СЭ3 (7%) смешивают в соотношении [химерные антитела против СЭ3 (45%)]:[химерные антитела против СЭ3 (7%)]=5:3 или 1:7. Углеводные цепи образцов анализируют согласно способу, описанному в примере 10(6), и обнаруживают, что получают образцы с долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы 24% и 13% (вычисленная величина). В данном случае их называют химерными антителами против СЭ3 (24%) и химерными антителами против СЭ3 (13%).
Результаты анализа углеводных цепей каждого образца показаны на фиг. 12. Доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы показана в виде среднего значения результатов двух анализов углеводных цепей.
2. Оценка активности связывания с СЭ3 (ЕЬ18А).
Активность связывания шести видов химерных антител против СЭ3 с различной долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы, полученных в разделе 1 примера 7, с СЭ3 (производимым 8по\у Вгапб М11к Ргобиск), измеряют ЕЬ18А, описанным в разделе 3 примера 1. В результате все шесть видов химерных антител против СЭ3 показывают почти одну и ту же активность связывания с СЭ3, как видно из фиг. 13, и обнаруживают, что доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы не влияет на антигенсвязывающую активность антител.
3. Оценка АЭСС-активности на клеточной линии меланомы человека.
АЭСС-активность химерных антител против СЭ3 измеряют на клеточной линии меланомы человека С-361 (АТСС СЯЬ 1424) так, как описано далее.
(1) Получение суспензии клеток-мишеней.
Получают 1х106 клеток клеточной линии меланомы человека С-361, добавляют к ним эквивалент 3,7 МБк радиоактивного вещества №251Сг04, смесь вводят во взаимодействие при 37°С в течение 1 ч и клетки метятся радиоизотопом. По завершении реакции клетки три раза промывают, суспендируя их в
- 47 013563 среде с последующим центрифугированием, ресуспендируют в среде и затем инкубируют при 4°С в течение 30 мин на льду для осуществления спонтанного отделения радиоактивного вещества. После центрифугирования клетки доводят до содержания 2х105 клеток/мл, добавляя 5 мл среды, и используют в качестве суспензии клеток-мишеней.
(2) Получение суспензии человеческих эффекторных клеток.
У здорового человека берут 50 мл периферической крови и осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого ЗЫтабхи Рйагтасеи!1са1). С использованием Ьутрйоргер (производимого АХ18 8Н1ЕЬБ) смесь центрифугируют (800 д, 20 мин) согласно инструкциям изготовителя для отделения слоя одноядерных клеток. Клетки промывают трехкратным центрифугированием (1200 об/мин, 5 мин) с использованием среды и снова суспендируют в среде, получают суспензию с плотностью клеток 2х106 клеток/мл и используют в качестве суспензии человеческих эффекторных клеток.
(3) Измерение АБСС-активности.
Суспензию клеток-мишеней, полученную в (1), распределяют по 50 мкл (1х 104 клеток/лунку) в каждую лунку 96-луночного планшета с И-образными лунками (производимого Еа1соп). Затем в лунки добавляют 100 мкл суспензии человеческих эффекторных клеток, полученной в (2) (2х105 клеток/лунку, отношение человеческих эффекторных клеток к клеткам-мишеням составляет 20:1). Затем добавляют каждое из химерных антител против СБ-3, получают конечную концентрацию от 0,0005 до 5 мкг/мл и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 4 ч. По завершении реакции планшет центрифугируют и измеряют количество 51Сг в супернатанте с использованием счетчика γ-квантов. Количество спонтанно высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же процедуры, используя одну среду вместо суспензии человеческих эффекторных клеток и раствора антител и измеряя количество 51 Сг в супернатанте. Количество общего высвободившегося 51Сг вычисляют с помощью той же процедуры, используя одну среду вместо раствора антител, и добавляя 1 моль/л соляную кислоту вместо суспензии человеческих эффекторных клеток, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. Цитотоксическую активность (%) вычисляют с использованием уравнения (II).
Фиг. 14 и 15 показывают результаты измерения АБСС-активности шести видов химерных антител против СБ3 с различной долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы в разных концентрациях (0,0005-5 мкг/мл) с использованием эффекторных клеток двух здоровых доноров (А и В) соответственно. Как видно на фиг. 14 и 15, АБСС-активность химерных антител против СБ3 проявляет тенденцию повышаться пропорционально доле углеводных цепей без α-1,6-фукозы при каждой концентрации антител. АБСС-активность снижается, когда концентрация антител низкая. При концентрации антител 0,05 мкг/мл антитела, в которых доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы составляет 24, 29, 45 или 50%, показывают почти одинаковую сильную АБСС-активность, но АБСС-активность низкая у антител (13%) или (7%), в которых доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы менее 20%. Получают такие же результаты, когда заменяют донора эффекторных клеток.
Пример 8. Оценка активности химерных антител против ССК4 с различной долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы.
1. Получение клеток, устойчиво продуцирующих химерные антитела против ССК4.
Клетки, способные устойчиво продуцировать химерные антитела против ССК4, получают так, как описано далее, с использованием экспрессирующего вектора тандемного типа рКА№ТЕХ2160 для химерных антител против ССК4, описанного в \У0 01/64754.
(1) Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток миеломы крысы УВ2/0.
После введения 10 мкг экспрессирующего вектора рКА№ТЕХ2160 для химерных антител против ССК4 в 4х106 клеток миеломы крысы УВ2/0 (АТСС СКЬ 1662) электропорацией [Су!о!есйпо1оду, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 40 мл НуЬпбота-8ЕМ-ЕВ8(5) [среда НуЬг1бота-8ЕМ (производимая 1пу1!годеп), содержащая 5% ЕВ 8 (производимой РАА ЕпЬогаЮпеЩ и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого 8итйото Ваке1йе) по 200 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% С02 добавляют С418, получая концентрацию 0,5 мг/мл, и затем осуществляют культивирование в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых образуются колонии трансформантов, показывающих невосприимчивость к С418, и отмечается образование колоний, извлекают культуральный супернатант, и в супернатанте измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против ССК4 методом ЕЬ18А, описанным в разделе 2 примера 8.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против ССК4, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена БНЕК, каждый из них суспендируют в среде НуЬг1бота-8ЕМ-ЕВ8(5), содержащей 1 мг/мл С418 и 50 нМ ингибитора БНЕК МТХ (производимого 81СМА), и получают плотность клеток 1-2х105 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 24луночного планшета (производимого Сгешег) по 1 мл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% С02 стимулируют трансформанты, показывающие невостриимчивость к 50 нМ МТХ. В культуральных супернатантах в лунках, в которых отмечают рост трансформантов, измеряют антигенсвязывающую активность химерных антител против ССК4 методом ЕЫ8А, описанным в
- 48 013563 разделе 2 примера 8.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против ССК4, то повышают концентрацию МТХ тем же способом, и получают, наконец, трансформанты, способные расти в среде НуЬпбота-8РМ-РВ8(5), содержащей 200 нМ МТХ, и продуцировать химерные антитела против ССК4 в большом количестве. Из полученных трансформантов получают отдельную клеточную линию (клонируют) двукратным ограничивающим разведением, и полученную клонированную клеточную линию называют КМ2760 № 58-35-16. В данном случае с использованием способа определения продукта транскрипции гена о-1,6-фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
(2) Получение продуцирующих антитела клеток с использованием клеток СНО/ЭС44.
После введения 4 мкг экспрессирующего вектора рКА№ГЕХ2160 для химерных антител против ССК4 в 1,6х106 клеток СНО/ЭС44 электропорацией [Су1о1есЬпо1оду, 3, 133 (1990)] клетки суспендируют в 10 мл [МЭМ-бРВ8(1<))-НТ(1) [среда !МЭМ (производимая Шуйгодеп), содержащая 10% бРВ8 (производимой Шуйгодеп) и добавку НТ концентрации 1х (производимой ^уйю^ей)] и распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого Гетак1 С1акк) по 100 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2 среду заменяют на IМ^М-бРВ8(10) (среда ЕМОМ, содержащая 10% диализованной РВ8) с последующим культивированием в течение 1-2 недель. Из лунок, в которых отмечается рост из-за образования трансформанта, показывающего рост, независимый от НТ, извлекают культуральный супернатант, и в супернатанте измеряют уровень экспрессии химерных антител против ССК4 методом ЕЫ8А, описанным в разделе 2 примера 8.
Что касается трансформантов в лунках, в которых в культуральных супернатантах отмечают продуцирование химерных антител против ССК4, то для того, чтобы увеличить количество продуцированных антител с использованием системы амплификации гена ЭНРК, каждый из них суспендируют в среде IМ^М-бРВ8(10), содержащей 50 нМ МТХ, получают плотность клеток 1-2х105 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 24-луночного планшета (производимого ΕνηΕί С1акк) по 0,5 мл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 1-2 недель в инкубаторе с 5% СО2 стимулируют трансформанты, показывающие невосприимчивость к 50 нМ МТХ. Что касается трансформантов в лунках, в которых отмечают их рост, то повышают концентрацию МТХ до 200 нМ тем же способом, и получают, наконец, трансформант, способный расти в среде IМ^М-бРВ8(10), содержащей 200 нМ МТХ, и продуцировать химерные антитела против ССК4 в большом количестве. Полученный трансформант называют 5-03. В данном случае с использованием способа определения продукта транскрипции гена α-1,6фукозилтрансферазы, описанного в примере 9, отбирают клеточную линию, продуцирующую относительно небольшое количество продукта транскрипции, и используют как подходящую клеточную линию.
2. Антигенсвязывающая активность в отношении неполного пептида ССК4 (ЕЫ8А).
Соединение 1 (8ЕЦ Ш NΟ:25) отбирают как человеческий пептид внеклеточной области ССК4, способный к взаимодействию с химерными антителами против ССК4. Для того чтобы использовать его при измерении активности методом ЕЬ^А, получают конъюгат с В8А (бычий сывороточный альбумин) (производимым №1са1а1 Тексще) способом, описанным далее, и используют в качестве антигена. Итак, 100 мл ДМСО-раствора, содержащего 25 мг/мл 8МСС [Ν-гидроксисукцинимидный эфир 4-(Νмалеимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты (производимый 81дта)], при перемешивании при встряхивании добавляют по каплям к 900 мл раствора РВ8, содержащего 10 мг В8А, и затем осторожно перемешивают в течение 30 мин. Загружают 1 мл реакционного раствора в колонку для гельфильтрации, такую как колонка NΛР-10, или подобную, уравновешенную 25 мл РВ8, и затем элюируют 1,5 мл РВ8, и полученный элюат используют в качестве раствора В8А-8МСС (концентрацию В8А вычисляют на основе измерений А280). Затем добавляют 250 мл РВ8 к 0,5 мг соединения 1 и затем полностью растворяют, добавляя 250 мл ДМФА, и к полученному раствору при встряхивании добавляют раствор В8А-8МСС с последующим осторожным перемешиванием в течение 3 ч. Реакционный раствор диализуют против РВ8 при 4°С в течение ночи, добавляют азид натрия, получают конечную концентрацию 0,05%, и смесь фильтруют через фильтр 0,22 мм и используют в качестве раствора конъюгата В8Асоединение 1.
Полученный конъюгат распределяют при концентрации 0,05 мкг/мл по 50 мкл/лунку в 96-луночный планшет для ЕМ (производимый Сгешег) и инкубируют для прилипания при 4°С в течение ночи. После промывки каждой лунки РВ8 в них добавляют 1% В8А-РВ8 по 100 мкл/лунку, и оставляют для взаимодействия при комнатной температуре для блокирования оставшихся активных групп. После промывки каждой лунки РВ8, содержащим 0,05% твина 20 (называемым далее твин-РВ8) добавляют культуральный супернатант трансформанта по 50 мкл/лунку, и оставляют для взаимодействия при комнатной температуре на 1 ч. По завершении реакции каждую лунку промывают твин-РВ8, и затем добавляют по 50 мкл/лунку раствор меченных пероксидазой козьих антител против человеческого ^СО (производимый Атепсап Эиа1ех), разведенный 6000 раз 1% В8А-РВ8, и оставляют для взаимодействия при комнатной температуре на 1 ч. По завершении реакции и последующей промывки твин-РВ8 добавляют по 50
- 49 013563 мкл/лунку раствор субстрата АВТ8 для проявления окрашивания и через 20 мин реакцию останавливают, добавляя 5% раствор δΌδ по 50 мкл/лунку. Затем измеряют поглощение 0Ό4ι5. Химерные антитела против ССЕ4, полученные в разделе 1 примера 8, показывают активность связывания с ССЕ4.
3. Очистка химерных антител против ССЕ4.
(1) Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток УВ2/0, и очистка антител.
Клон трансформированных клеток, продуцирующих химерные антитела против ССЕ4 КМ2760 # 58-35-16, полученный в разделе 1(1) примера 8, суспендируют в среде НуЬпбота-8РМ (производимой Луйгодепе), содержащей 200 нМ МТХ и 5% Эа^о СР21 (производимого Уако Риге СЬетка1 ЛбиЛтек), получают плотность клеток 2х105 клеток/мл, и подвергают клетки культивированию с подпиткой при встряхивании с использованием бутыли, содержимое которой перемешивается при вращении (производимой Гетак1 С1а§8), при постоянной температуре в камере 37°С. После культивирования в течение 8-10 суток химерные антитела против ССЕ4 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки с Ргокер-А (производимой М1Шроге) и гель-фильтрацией. Очищенные химерные антитела против ССЕ4 называют химерными антителами КМ2760-1.
(2) Культивирование продуцирующих антитела клеток, полученных из клеток СН0/ОС44, и очистка антител.
Клеточную линию трансформанта 5-03, продуцирующую химерные антитела против ССЕ4, полученную в разделе 1(2) примера 8, культивируют при 37°С в инкубаторе с 5% С02 с использованием среды IМ^М-бРВδ(10) на 182-мм2 матрасе (производимом Сгешег). Когда плотность клеток через несколько дней достигнет уровня слияния, культуральный супернатант отбрасывают, клетки промывают 25 мл РВ8 и затем смешивают с 35 мл среды ЕХСЕЬЬ 301 (производимой ШН). После культивирования при 37°С в течение 7 суток в инкубаторе с 5% С02 культуральный супернатант извлекают. Химерные антитела против ССЕ4 очищают от культурального супернатанта с использованием колонки с Ргокер-А (производимой М1Шроге) согласно инструкциям изготовителя. Очищенные химерные антитела против ССЕ4 называют химерными антителами КМ3060.
Когда методом ЕЫ8А измеряют активность связывания КМ2760-1 и КМ3060 с ССЕ4, они показывают эквивалентную активность связывания.
4. Анализ очищенных химерных антител против ССЕ4.
Каждый из двух видов химерных антител против ССЕ4 (4 мкг), продуцированных разными животными клетками и выделенных из них в чистом виде, полученных в разделе 1 данного примера, подвергают δΌδ-РАСЕ согласно известному способу [№1иге, 227, 680 (1970)] и анализируют на молекулярную массу и степень очистки. В каждом из очищенных химерных антител против ССЕ4 обнаруживают в условиях невосстановления одну полосу, соответствующую молекулярной массе примерно 150 кДа, и в условиях восстановления две полосы примерно в 50 и 25 кДа. Молекулярные массы почти сопадают с молекулярными массами, установленными из нуклеотидных последовательностей кДНК Н-цепи и Ьцепи антитела (Н-цепь примерно 49 кДа, Ь-цепь примерно 23 кДа, вся молекула примерно 144 кДа), и совпадает с сообщениями, утверждающими, что антитело типа ΙβΟ имеет молекулярную массу примерно 150 кДа в условиях невосстановления и распадается до Н-цепей с молекулярной массой примерно 50 кДа и Ь-цепей с молекулярной массой примерно 25 кДа в условиях восстановления из-за разрушения в молекуле дисульфидной связи (называемой далее связь δ-δ) [АпбЬоб1е8: А ЬаЬогаХогу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаЛгу, СЬарХег 14 (1998); Мопос1опа1 АпбЬоб1е8: Рг1пс1р1ез апб Ргасбсе, Асабетк Ргекк ЫтЦеб (1996)], причем таким образом подтверждается, что каждое химерное антитело против ССЕ4 экспрессируется и очищается как молекула антитела с правильной структурой.
5. Получение химерных антител против ССЕ4 с разной долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы.
Углеводные цепи, соединенные с химерными антителами против ССЕ4 КМ2760-1, полученными из клеток УВ2/0, полученными в разделе 3(1) примера 8, и с химерными антителами против ССЕ4 КМ3060, полученными из клеток СН0/ЭС44, полученными в разделе 3(2) примера 8, анализируют согласно способу примера 10(6). Доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы составляет 87% и 8% в КМ2760 и КМ3060 соответственно. Далее такие образцы называются химерными антителами против ССЕ4 (87%) и химерными антителами против ССЕ4 (8%).
Химерные антитела против ССЕ4 (87%) и химерные антитела против ССЕ4 (8%) смешивают в соотношении [химерные антитела против ССЕ4 (87%)]:[химерные антитела против ССЕ4 (8%)]=1:39, 16:67, 22:57, 32:47 или 42:37. Углеводные цепи указанных образцов анализируют согласно способу примера 10(6). Доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы составляет 9, 18, 27, 39 и 46% соответственно. Далее такие образцы называются химерными антителами против ССЕ4 (9%), химерными антителами против ССЕ4 (18%), химерными антителами против ССЕ4 (27%), химерными антителами против ССЕ4 (39%) и химерными антителами против ССЕ4 (46%).
Результаты анализа углеводных цепей каждого образца приводятся на фиг. 16. Доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы показана как среднее значение результатов двух анализов углеводных цепей.
6. Оценка активности связывания с неполным пептидом ССЕ4 (ЕЬЛА).
- 50 013563
Активность связывания с неполным пептидом ССВ4 шести видов различных химерных антител против ССВ4 с разной долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы, полученных в разделе 5 примера 8, измеряют согласно способу, описанному в разделе 2 примера 8.
В результате обнаружено, как видно на фиг. 17, что шесть видов химерных антител против ССВ4 показывают почти одинаковую активность связывания с ССВ4, и что доля углеводных цепей без α-1,6фукозы не влияет на антигенсвязывающую активность антител.
7. Оценка АОСС-активности в отношении клеточной линии, хорошо экспрессирующей человеческий ССВ4.
АОСС-активность химерных антител против ССВ4 против хорошо экспрессирующей человеческий ССВ4 клеточной линии ССВ4/ЕЬ-4 (νΟ 01/64754) измеряют так, как описано далее.
(1) Получение суспензии клеток-мишеней.
Получают клетки (1,5х106) экспрессирующей человеческий ССВ4 клеточной линии ССВ4/ЕЬ-4, описанной в νΟ 01/64754, и добавляют к ним эквивалент 5,55 МБк радиоактивного вещества №251СЮ4, с последующим взаимодействием при 37°С в течение 1,5 ч, посредством чего клетки метятся радиоизотопом. По завершении реакции клетки три раза промывают, суспендируя их в среде с последующим центрифугированием, ресуспендируют в среде и затем инкубируют при 4°С в течение 30 мин на льду для осуществления спонтанного отделения радиоактивного вещества. После центрифугирования клетки доводят до содержания 2х105 клеток/мл, добавляя 7,5 мл среды, и используют в качестве суспензии клетокмишеней.
(2) Получение суспензии человеческих эффекторных клеток.
У здорового человека берут 60 мл периферической крови, добавляют к ним 0,6 мл гепариннатрия (производимого З1ит1/и Ρйа^тасеиΐ^са1) и затем осторожно перемешивают. С использованием Ьутрйоргер (производимого АХ1З ЗН1ЕЬО) смесь центрифугируют (800 д, 20 мин) согласно инструкциям изготовителя для отделения слоя одноядерных клеток. Клетки промывают трехкратным центрифугированием (1400 об/мин, 5 мин) с использованием среды и затем снова суспендируют в среде, получают суспензию с плотностью клеток 5х106 клеток/мл и используют в качестве суспензии человеческих эффекторных клеток.
(3) Измерение АОСС-активности.
Суспензию клеток-мишеней, полученную в (1), распределяют по 50 мкл (1х104 клеток/лунку) в каждую лунку 96-луночного планшета с И-образными лунками (производимого Ра1соп). Затем в лунки добавляют 100 мкл суспензии человеческих эффекторных клеток, полученной в (2) (5х105 клеток/лунку, отношение человеческих эффекторных клеток к клеткам-мишеням составляет 50:1). Затем добавляют каждое из химерных антител против ССВ4, получают конечную концентрацию от 0,0001 до 10 мкг/мл и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 4 ч. По завершении реакции планшет центрифугируют и измеряют количество 51Сг в супернатанте с использованием счетчика γ-квантов. Количество спонтанно отделившегося 51Сг вычисляют с помощью той же процедуры, используя одну среду вместо суспензии человеческих эффекторных клеток и раствора антител, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. Количество общего отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя ту же процедуру с использованием 1 моль/л соляной кислоты вместо раствора антител и суспензии человеческих эффекторных клеток, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. АОСС-активность (%) вычисляют на основании уравнения (II).
Фиг. 18 и 19 показывают результаты измерения АОСС-активности химерных антител против ССВ4 с различной долей углеводных цепей без α-1,6-фукозы в разных концентрациях (0,001-10 мкг/мл) с использованием эффекторных клеток двух здоровых доноров (А и В) соответственно. Как видно на фиг. 18 и 19, АОСС-активность химерных антител против ССВ4 проявляет тенденцию повышаться пропорционально доле углеводных цепей без α-1,6-фукозы при каждой концентрации антител. АЭСС-активность снижается, когда концентрация антител низкая. При концентрации антител 0,01 мкг/мл антитела, в которых доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы составляет 27, 39 или 46%, показывают почти одинаковую сильную АОСС-активность, но АЭСС-активность низкая у антител, в которых доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы менее 20%. Получают такие же результаты, когда заменяют донора эффекторных клеток.
Пример 9. Определение продукта транскрипции гена α-1,6-фукозилтрансферазы в линии клетокхозяев.
(1) Получение одноцепочечной кДНК из различных клеточных линий.
Образцы одноцепочечной кДНК получают из клеток ί.ΉΟ/ΌΟ44 с устраненным геном дигидрофолатредуктазы (бНГг), полученных из яичника китайского хомячка, и клеток миеломы крысы УВ2/0 процедурой, описанной далее.
Клетки ί.ΉΟ/ΌΟ44 суспендируют в среде 1МОМ (производимой Ь1Ге ТесНпо1од1ек) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (производимой Ь1Ге ТесНпо1од1ек) и добавки НТ концентрации ^(производимой ЫГе ТесНпо1о§1ек). и 15 мл суспензии инокулируют в колбу Т75 для адгезионного культивирования клеток (производимую Οιόι^γ) при плотности 2х105 клеток/мл. Также клетки УВ2/0 суспендируют в среде ВГМ1 1640 (производимой Ь1Ге ТесНпо1од1ек) с добавлением 10% сыворотки плода коровы
- 51 013563 (производимой ЫГе ТесЕпо1ощеБ) и 4 ммоль/л Ь-СБ-Ν (производимого ЫГе ТесЕηо1оβ^еδ). и 15 мл суспензии инокулируют в колбу Т75 для суспензионного культивирования клеток (производимую Сгетег) при плотности 2х 105 клеток/мл.
Клетки культивируют при 37°С в инкубаторе с 5% СО2, и 1х107 соответствующих клеток-хозяев извлекают в 1-й, 2-й, 3-й, 4-й и 5-й день культивирования, и экстрагируют полную РНК с использованием ВNЛδеаδу (производит О[ЛСЕН) согласно инструкциям изготовителя.
Полную РНК растворяют в 45 мкл стеоильной воды, добавляют к раствору 1 мкл В01 ВпаБе-Ргее Э№1Бе (производимой Ρ^отеда), 5 мкл приложенного 10х буфера для ДНКазы и 0,5 мкл ингибитора рибонуклеазы ВЫаБт (производимого Ρ^отеда), и затем проводят взаимодействие при 37°С в течение 30 мин для разрушения геномной ДНК в образце как примеси. По завершении реакции полную РНК очищают вновь с использованием ВNЛеаδу (производимой ΟΜΟΕΝ) и растворяют в 50 мкл стерильной воды.
В 20 мкл реакционной смеси с использованием олиго(бТ) в качестве праймера синтезируют одноцепочечную кДНК из 3 мкг образца каждой полученной полной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием системы предварительной амплификации δυΡΕВδСВIΡТ™ для синтеза первой цепи кДНК (производимой ЫГе ТесЕпо1од1еБ) и согласно инструкциям изготовителя. Реакционный раствор концентрации 1х используют для клонирования α-1,6-фукозилтрансферазы (иногда называемой далее РиТ8) и β-актина, полученных из соответствующих клеток-хозяев, и водный раствор разведенного в 50 раз реакционного раствора используют для определения уровня транскрипции каждого гена методом конкурентной ПЦР, и раствор хранят до применения при -80°С.
(2) Получение неполных фрагментов кДНК РиТ8 китайского хомячка и крысиной РиТ8.
Каждый неполный фрагмент кДНК РиТ8 китайского хомячка и крысиной РиТ8 получают следующей процедурой (фиг. 20).
Сначала создают праймеры (показанные в δΕΟ ГО NО:4 и 5), специфические для нуклеотидных последовательностей, обычных для кДНК РиТ8 человека [1. ВюсЕет., 121, 626 (1997)] и кДНК РиТ8 свиньи [1. Вю1. СЕет., 271, 27810 (1995)].
Затем получают 25 мкл реакционного раствора [буфер Е.хТац (производимый Такага δЕиζо), 0,2 ммоль/л άΝΊΡ и 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (δΕΟ ГО NО:4 и 5)], содержащего 1 мкл каждой кДНК, полученной из клеток СНО, и кДНК, полученной из клеток ΥΒ2/0 - обе получены в разделе (1) через 2 дня после культивирования, и осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием ДНК-полимеразы Е.хТас.| (производимой Такага δЕиζо). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин как едином цикле, и заключительном нагреванием при 72°С в течение 10 мин.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и очищают специфический амплифицированный фрагмент в 979 п.о. с использованием набора СЕНЕСкЕЛН δμω (производимого В[О 101) и элюируют 10 мкл стерильной воды (далее указанный способ используют для очистки фрагментов ДНК из агарозного геля). Используют 4 мкл амплифицированного фрагмента для встраивания в плазмиду рСВ2.1 согласно инструкциям изготовителя набора ТОΡО ТА С1ошпд (производимого 1№Йгодеп), и трансформируют реакционным раствором Е. соЕ ХЬ1-В1ие согласно способу СоЕеп е1 а1. Ргос. №111. Лсаб. δα. ^Л, 69, 2110 (1972)] (далее для трансформации Е. соЕ используют такой способ). Образцы плазмидной ДНК выделяют из 6 клонов со встроенной кДНК из числа полученных невосприимчивых к канамицину колоний согласно известному способу [Мис1е1с ЛабБ ВеБеагсЕ, 7, 1513 (1979)] (далее для выделения плазмиды используют указанный способ).
Нуклеотидную последовательность каждой кДНК, встроенной в плазмиду, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Ρе^к^η Е1тег) и набора ВщЭуе ТегпнпаЮг Сус1е δе^иеπαπд Рδ Веабу Веасйоп (производимого Ρе^к^η Е1тег) согласно способу, изложенному в инструкциях изготовителей. Подтверждается, что все встроенные кДНК, последовательности которых определяют указанным способом, кодируют неполные последовательности открытой рамки считывания (ОВР) РиТ8 китайского хомячка и крысиной РиТ8 (показанные в δΕ^ ГО NО:6 и 7). Из них отбирают образцы плазмидных ДНК, совершенно не содержащих в последовательностях ошибок считывания ПЦР. В данном случае такие плазмиды называют СНРиТ8-рСВ2.1 и УВРиТ8-рСВ2.1.
(3) Получение кДНК β-актина китайского хомячка и крысиного β-актина.
Получают кДНК β-актина китайского хомячка и крысиного β-актина процедурой, описанной далее (фиг. 21).
Сначала из геномной последовательности β-актина китайского хомячка (СепВапк, υ20114) и геномной последовательности крысиного β-актина [№с1ею ЛабБ ВеБеагсЕ, 11, 1759 (1983)] создают прямой праймер, специфический для обычной последовательности, содержащей кодон инициации трансляции (показана в δΕ^ ГО NО:8), и обратные праймеры, специфические для соотвествующих последовательностей, содержащих кодон терминации трансляции (показаны в δΕ^ ГО NО:9 и 10).
Затем получают 25 мкл реакционного раствора [буфер КОО #1 (производимый ТоуоЬо),
- 52 013563
0,2 ммоль/л бХГР, 1 ммоль/л МдС12, 0,4 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕО Ш NО:8 и 9 или 8ЕО ГО ΝΌ:8 и 10) и 5% ДМСО], содержащего 1 мкл каждой кДНК, полученной из клеток СНО, и кДНК, полученной из клеток УВ2/0 - обе получены в разделе (1) через 2 дня после культивирования, и осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы КОЭ (производимой ТоуоЬо). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 25 циклами нагревания при 98°С в течение 15 с, 65°С в течение 2 с и 74°С в течение 30 с как едином цикле.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и очищают специфический амплифицированный фрагмент в 1128 п.о. Фрагмент ДНК подвергают 5'-концевому фосфорилированию ДНК с использованием МЕСАЬАВЕЬ (производит Такага 8Нихо) согласно инструкциям изготовителя. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора с использованием способа осаждения этанолом и растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Отдельно 3 мкг плазмиды рВ1исеспр1 II К8(+) (производимой 81га1:адспс) растворяют в 35 мкл №ЕВиГГсг 2 (производимого Епд1апб Вю1аЬе), и добавляют к раствору 16 единиц рестриктазы ЕсоКУ (производимой Такага 81шхо) для осуществления реакции расщепления при 37°С в течение 3 ч. К реакционному раствору добавляют 35 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,5 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. со11 С15 (производимой Такага 8йи7о), и затем осуществляют взаимодействие при 65°С в течение 30 мин для дефосфорилирования посредством этого конца ДНК. Реакционный раствор экстрагируют смесью фенол/хлороформ, затем осаждают этанолом, и извлеченный фрагмент ДНК растворяют в 100 мкл стерильной воды.
Каждые 4 мкл амплифицированного фрагмента, полученного из кДНК китайского хомячка, или амплифицированного фрагмента (1192 п.о.), полученного из кДНК крысы, смешивают с 1 мкл фрагмента ЕсоКУ-ЕсоКУ (примерно 3,0 т.п.о.), полученного из плазмиды рВ1исесг1р( II К8(+), и 5 мкл ЫдаЕоп Н1д1 (производимого ТоуоЬо) для реакции лигирования, осуществляемой при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. со11 ХЫ-ВЫс, и из полученных невосприимчивых к ампициллину клонов соответственно выделяют образцы плазмидной ДНК известным способом.
Нуклеотидную последовательность каждой кДНК, встроенной в плазмиду, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Рсгкт Е1тсг) и набора В1дЭус ТсгттаЮг Сус1с 8сс.|испстд Р8 Ксабу Ксасйоп (производимого Рсгкт Е1тсг) согласно способу, изложенному в инструкциях изготовителей. Подтверждается, что все встроенные кДНК, последовательности которых определяют указанным способом, кодируют полные последовательности ОКР β-актина китайского хомячка или β-актина крысы. Из них отбирают образцы плазмидных ДНК, совершенно не содержащих в последовательностях ошибок считывания оснований методом ПЦР. В данном случае такие плазмиды называют СНАс-рВ8 и УВАс-рВ8.
(4) Получение эталона РИТ8 и внутреннего стандарта.
Для того чтобы измерить уровень транскрипции мРНК гена РИТ8 в каждом виде клеток, СНРТ8рСК2.1 и УВРТ8-рСК2.1 как плазмиды, в которых в рСК2.1 встроены, соответственно, полученные в разделе (2) неполные фрагменты РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8, расщепляют рестриктазой ЕсоВЕ и полученные линейные ДНК используют в качестве эталонов для получения калибровочной кривой. СНРТ8б-рСК2.1 и УВРТ8б-рСК2.1, полученные из СНРТ8-рСК2.1 и УВРТ8-рСК2.1 делецией 203 п.о. между 8саI и НтбШ - внутренние нуклеотидные последовательности РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8, соответственно, расщепляют рестриктазой ЕсоВЕ и полученные линейные ДНК используют в качестве внутренних стандартов для определения количества РИТ8. Подробности описаны ниже.
Эталоны РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8 получают следующим образом. В 40 мкл НЕВиГГсг 2 (производимого Епд1апб Вю1аЬе) растворяют 2 мкг плазмиды СНРТ8-рСК2.1, добавляют к раствору 24 единицы рестриктазы ЕсоК (производимой Такага 8йи7о), и затем осуществляют расщепление при 37°С в течение 3 ч. Отдельно 2 мкг плазмиды УВРТ8-рСК2.1 растворяют в 40 мкл ХЕВиЕГсг 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и добавляют к раствору 24 единицы рестриктазы ЕсоШ (производимой Такага 8йи7о), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Когда часть каждого реакционного раствора подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле, подтверждается, что фрагмент ЕсоКЕЕсоШ (примерно 1 т.п.о.), содержащий каждый из неполных фрагментов кДНК РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8, отделен от плазмид СНРТ8-рСК2.1 и УВРТ8-рСК2.1 реакциями расщепления рестриктазами. Каждый из реакционных растворов разбавляют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой 8ЮМА), и получают концентрацию 0,02 фг/мкл, 0,2 фг/мкл, 1 фг/мкл, 2 фг/мкл, 10 фг/мкл, 20 фг/мкл и 100 фг/мкл, и используют в качестве эталонов РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8.
Внутренние стандарты РИТ8 китайского хомячка и крысиной РИТ8 получают следующим образом (фиг. 22). Получают реакционный раствор [буфер КОЭ #1 (производимый ТоуоЬо), 0,2 ммоль/л бХГР, 1 ммоль/л МдС12, 0,4 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕО Ш NО:11 и 12) и 5% ДМСО], содержащий 5 нг СНРТ8-рСК2.1 или УВРТ8-рСК2.1, и осуществляют ПЦР с использованием ДНКполимеразы КОЭ (производимой ТоуоЬо). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 4 мин с последующими 25 циклами нагревания при 98°С в течение 15 с, 65°С в течение 2 с и 74°С в течение 30 с как едином цикле. После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле, и
- 53 013563 очищают специфический амплифицированный фрагмент в 4,7 т.п.о. Фосфорилируют 5'-конец ДНК с использованием МЕСАЬАВЕЬ (производит Такага 81шхо) согласно инструкциям изготовителя, и затем фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора с использованием способа осаждения этанолом и растворяют в 50 мкл стерильной воды. Полученный фрагмент ДНК (5 мкл, примерно 4,7 т.п.о.) и 5 мкл Ыдайоп Н1дк (производит ТоуоЬо) смешивают, и затем проводят реакцию самоциклизации при 16°С в течение 30 мин.
С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ОН5'7„ и из полученных невосприимчивых к ампициллину клонов выделяют образцы плазмидной ДНК согласно известному способу. Нуклеотидную последовательность каждой плазмидной ДНК определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) и набора В1дОуе ТегттаЮг Сус1е 8ес.|иепстд Е8 Яеабу Яеасйоп (производимого Регкт Е1тег), и подтверждается, что внутренняя нкулеотидная последовательность в 203 п.о. между 8са1 и НтбШ ЕИТ8 китайского хомячка крысиной ЕИТ8 удалена. Полученные плазмиды называют СНЕТ8б-рСЯ2.1 или УВЕТ8б-рСЯ2.1 соответственно.
Затем 2 мкг плазмиды СНЕТ8б-рСЯ2.1 растворяют в 40 мкл ИЕВийег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и добавляют к раствору 24 единицы рестриктазы ЕсоЯ1 (производимой Такага 8ки/о), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Отдельно 2 мкг плазмиды УВЕТ8брСЯ2.1 растворяют в 40 мкл НЕВиГГег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и добавляют к раствору 24 единицы рестриктазы ЕсоЯ1 (производимой Такага 8ки/о), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Когда часть каждого реакционного раствора подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле, подтверждается, что фрагмент ЕсоЯ1-ЕсоЯ1 (примерно 800 п.о.), содержащий фрагмент, из которого удалены 203 п.о. внутренних нуклеотидных последовательностей неполных фрагментов ЕИТ8 китайского хомячка или крысиной ЕИТ8, отделен от плазмид СНЕТ8б-рСЯ2.1 или УВЕТ8б-рСЯ2.1 реакциями расщепления рестриктазами. Из реакционных растворов получают разведения 2 фг/мл с использованием 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой 81СМА) и используют в качестве внутренних стандартов ЕИТ8 китайского хомячка или крысиной ЕИТ8.
(5) Получение эталона и внутреннего стандарта β-актина.
Для того чтобы измерить уровень транскрипции мРНК гена β-актина в разных клетках-хозяевах, СНАс-рВ8 и УВАс-рВ8 как плазмиды, в которых в рВ1ие5спр1 II К8(+) встроены полноразмерные ОЯЕ каждой кДНК β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, соответственно, полученные в разделе (3), расщепляют рестриктазами НшбШ и РШ и рестриктазами НшбШ и Крп1, соответственно, и расщепленные линейные ДНК используют в качестве эталонов для получения калибровочной кривой. СНАсб-рВ8 и УВАсб-рВ8, полученные из СНАс-рВ8 и УВАс-рВ8 делецией 180 п.о. между ОгаШ и ОгаШ внутренней нуклеотидной последовательности β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, расщепляют рестриктазами НшбШ и РШ и рестриктазами НшбШ и Крп1, соответственно, и расщепленные линейные ДНК используют в качестве внутренних стандартов для определения количества β-актина. Подробности описаны ниже.
Эталоны β-актина китайского хомячка и β-актина крысы получают следующим образом. В 40 мкл ИЕВиГГег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) растворяют 2 мкг плазмиды СНАс-рВ8, добавляют к раствору 25 единиц рестриктазы НтбШ (производимой Такага 8кихо) и 20 единиц рестриктазы РШ (производимой Такага 8ки/о), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Отдельно 2 мкг плазмиды УВАс-рВ8 растворяют в 40 мкл ИЕВиГГег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬз), и к раствору добавляют 25 единиц рестриктазы НтбШ (производимой Такага 81шхо) и 25 единиц рестриктазы Крп1 (производимой Такага 8ки/о), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Часть каждого реакционного раствора подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и подтверждается, что фрагмент НтбШ-РШ и фрагмент Нтб111-Крп1 (примерно 1,2 т.п.о.), содержащие полноразмерную ОЯР каждой кДНК β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, отделены от плазмид СНАс-рВ8 и УВАс-рВ8 реакциями расщепления рестриктазами. Каждый из реакционных растворов разбавляют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой 81СМА), и получают концентрации 2 пг/мкл, 1 пг/мкл, 200 фг/мкл, 100 фг/мкл и 20 фг/мкл, и используют в качестве эталонов β-актина китайского хомячка и β-актина крысы.
Внутренние стандарты β-актина китайского хомячка и β-актина крысы получают следующим образом (фиг. 23). В 100 мкл ИЕВиГГег 3 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), содержащего 100 нг/мкл В8А (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), растворяют 2 мкг СНАс-рВ8, добавляют к раствору 10 единиц рестриктазы ОгаШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Осаждением этанолом из реакционного раствора извлекают фрагменты ДНК, и концы ДНК заменяют на затупленные концы с использованием набора ЭХА В1ипйпд (производимого Такага 81шхо) согласно инструкциям изготовителя, и затем реакционный раствор делят на две равные части. Сначала к одной части реакционного раствора добавляют 35 мкл 1 мол/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,5 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. сой С15 (производимой Такага 8ки/о), и затем осуществляют взаимодействие при 65°С в течение 30 мин для дефосфорилирования концов ДНК. Фрагмент ДНК извлекают, осуществляя обработку дефосфорилированием, экстрагирование смесью фе- 54 013563 нол/хлороформ и обработку осаждением этанолом, и затем растворяют его в 10 мкл стерильной воды. Остальную часть реакционного раствора подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле для очистки фрагмента ДНК примерно в 1,1 т.п.о., содержащего неполный фрагмент ОКЕ β-актина китайского хомячка.
Дефосфорилированный фрагмент ОгаШ-ОгаШ (4,5 мкл), 4,5 мкл фрагмента ОгаШ-ОгаШ в примерно 1,1 т.п.о. и 5 мкл Ыдакюп Нщ11 (производит ТοуοЪο) смешивают, и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. Используя реакционный раствор, трансформируют Е. отк 045(/., и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидные ДНК согласно известному способу. Определяют нуклеотидную последовательность каждой плазмидной ДНК с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Гегк|п Е1тег) и набора Β^д^уе ТегттаШг Сус1е δе^иеπстд Εδ Кеабу Кеас1юп (производимого Гегк|п Е1тег), и подтверждается, что 180 п.о. ОгаШ-ОгаШ β-актина китайского хомячка, встроенного в плазмиду, удалены. Плазмиду называют СΗΑсб-рΒδ.
Также плазмиду, из которой удален ОгаШ-ОгаШ в 180 п.о. β-актина крысы, получают через те же стадии получения СΗΑсб-рΒδ. Плазмиду называют ΥΒΑсб-рΒδ.
Далее, 2 мкг плазмиды СΗΑсб-рΒδ растворяют в 40 мкл ΝΟΒγιΕογ 2 (производимого №\ν Епд1апб Βΐο^δ), и добавляют к раствору 25 единиц рестриктазы НшбШ (производимой Такага δΐιιιζο), и 20 единиц рестриктазы Ρδϋ (производимой Такага δΐιιιζο), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Отдельно 2 мкг плазмиды ΥΒΑсб-рΒδ растворяют в 40 мкл ΝΟΒγιΕογ 2 (производимого №\ν Епд1апб ΒίοΕώδ), и добавляют к раствору 25 единиц рестриктазы НшбШ (производимой Такага δΐιιιζο), и 24 единицы рестриктазы Кри! (производимой Такага δΐιιιζο), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 3 ч. Часть каждого реакционного раствора подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле, и подтверждается, что фрагмент Н^бт-ГкП и фрагмент Н^бт-Кр^ (примерно 1,0 т.п.о.), содержащие фрагмент, в котором удалены 180 п.о. внутренней нуклеотидной последовательности полноразмерной ОКЕ каждой кДНК β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, отделены от плазмид СΗΑсб-рΒδ и ΥΒΑсб-рΒδ реакциями расщепления рестриктазами. Из реакционных растворов получают разведения 200 фг/мл с использованием 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой δIСМΑ), и используют в качестве внутренних стандартов β-актина китайского хомячка и β-актина крысы.
(6) Определение уровня транскрипции методом конкурентной ПЦР.
Конкурентную ПЦР осуществляют с использованием в качестве матриц ДНК внутреннего стандарта ЕОТ8, полученного в разделе (4), и кДНК, полученной от клетки-хозяина, полученной в разделе (1), определяемое содержание продукта транскрипции ΕυТ8 в линии клеток-хозяев вычисляют из относительного содержания продукта амплификации, полученного с каждой матрицы. С другой стороны, так как считается, что ген β-актина непрерывно транскрибируется в каждой клетке, и уровень его транскрипции в клетках приблизительно одинаковый, уровень транскрипции гена β-актина определяют как меру эффективности реакции синтеза кДНК в каждой линии клеток-хозяев. Иными словами, ПЦР осуществляют с использованием в качестве матриц ДНК внутреннего стандарта β-актина, полученного в разделе (5), и кДНК, полученной от клетки-хозяина, полученной в разделе (1), определяемое содержание продукта транскрипции β-актина в линии клеток-хозяев вычисляют из относительного содержания продукта амплификации, полученного с каждой матрицы. Подробности описаны ниже.
Продукт транскрипции ЕОТ8 определяют следующей процедурой. Сначала создают набор специфических к последовательностям праймеров (показаны в δΞΟ ГО ΝΟ:13 и 14), обычных для внутренних последовательностей неполных последовательностей ОКЕ ΕυТ8 китайского хомячка и крысиной ΕυТ8, полученных в разделе (2).
Затем осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага δΐιιιζο) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер ЕхТас.| (производимый Такага δΐιιιζο), 0,2 ммоль/л 6ΝΓΡ, 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (ЪЕО ГО NΟ:13 и 14) и 5% ДМСО], содержащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК, полученной из каждой соответствующей клеточной линии в разделе (1), и 5 мкл (10 фг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 32 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин как едином цикле.
Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов, где вместо кДНК, полученной из каждой линии клеток-хозяев, добавляют 5 мкл (0,1, 1, 5, 10, 50, 100, 500 фг или 1 пг) плазмиды эталона ΕυТ8, полученной в разделе (4), и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции ЕПГ8.
Продукт транскрипции β-актина определяют следующей процедурой. Сначала создают два набора соответствующих генспецифических праймеров, обычных для внутренних последовательностей полноразмерных ОКЕ β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, полученных в разделе (3) (первые показаны δΟΟ ГО NΟ:15 и 16, и последние показаны δΞρ ГО NΟ:17 и 18).
Затем осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага δΐιιιζο) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер ЕхТад (производимый Такага δΐιιιζο), 0,2 ммоль/л
- 55 013563
6ΚΤΡ, 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (8Е^ ΙΌ N0:15 и 16 или 8Е^ ΙΌ N0:17 и 18) и 5% ДМСО], содержащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК, полученной из соответствующей клеточной линии в разделе (1), и 5 мкл (1 пг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 17 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин как едином цикле.
Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов, где вместо кДНК, полученной из каждой линии клеток-хозяев, добавляют 5 мкл (10, 5, 1 пг, 500 фг или 100 фг) плазмиды эталона β-актина, полученной в разделе (5), и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции βактина.
Таблица 3
Ген-мишень Набор праймеров* Размер (п.о.) продукта амплификации ПЦР
Мишень Конкурент
гит 8 Е: 5'-СТССАТСОТСАТССТССАСТСТСС-3' К: 5' -САССААТОАТАТСТССАССТТСС-3' 638 431
β-актин (кит.х) Е: 5'-САТАТСССТССССТССТТСТССАС-З' К: 5'-САССААОСААСССТССААААСАСС-3' 789 609
β-актин (крыса) Е: 5'-САТАТСССТССССТС6ТС6ТС&АС-3' В: 5'-САССАА6СААСССТССАА6АСАСС-3' 789 609
*Р: прямой праймер, К: обратный праймер.
Путем осуществления ПЦР с использованием набора праймеров, описанного в табл. 3, можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Мишень табл. 3, из каждого продукта транскрипции гена и каждого эталона, и можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Конкурент табл. 3, из каждого внутреннего стандарта.
Каждый раствор (7 мкл) после ПЦР подвергают электрофорезу в 1,75% агарозном геле, и затем гель окрашивают, замачивая его в течение 30 мин в 8ΥΒΚ Огест Ι Нис1е1с Ас1б Οе1 8!ат (производит ИоНси1аг ΡγοΙοο'κ) концентрации 1х. Количество амплифицированного фрагмента ДНК измеряют, вычисляя интенсивность люминесценции каждой амплифицированной ДНК с использованием формирователя флуороизображения (ИиоНтадег 8Ι; производится Μο^π^ί Оу^тю).
Количество амплифицированного продукта, полученного ПЦР с использованием плазмиды эталона в качестве матрицы, измеряют тем же способом, и получают калибровочную кривую, откладывая измеренные количества против количества плазмиды эталона. С использованием калибровочной кривой из количества амплифицированного продукта, когда в качестве матрицы используют каждую кДНК, полученную из экспрессирующей клеточной линии, вычисляют количество кДНК гена, представляющего интерес, в каждой клеточной линии, и полученное количество определяют как уровень транскрипции мРНК в каждой клеточной линии.
Количество продукта транскрипции ΡυΤ8 в каждой линии клеток-хозяев, когда в эталоне и внутреннем стандарте используют последовательность крысиной ΡυΤ8, показано на фиг. 24. На протяжении периода культивирования клеточная линия СН0 показывает уровень транскрипции в 10 или более раз более высокий, чем уровень транскрипции для клеточной линии ΥΒ2/0. Такая тенденция также отмечается, когда в эталоне и внутреннем стандарте используют последовательность ΡυΤ8 китайского хомячка.
Также уровни транскрипции ΡυΤ8 приводятся в табл. 4 как относительные величины количества продукта транскрипции β-актина. На протяжении периода культивирования уровень транскрипции ΡυΤ8 в клеточной линии ΥΕ2/0 составляет примерно 0,1% уровня β-актина, в то время как в клеточной линии СН0 он составляет 0,5-2%.
Результаты показывают, что количество продукта транскрипции в клеточной линии ΥΒ2/0 существенно меньше, чем количество продукта транскрипции в клеточной линии СН0.
___________________Таблица 4 ,
Дни культивирования
Клеточная линия 1-ий 2-ой 3-ий 4-ый 5-ый
СНО 1,95 0, 90 0,57 0,52 0,54
ΥΒ2/0 0,12 0,11 0,14 0,08 0,07
Пример 10. Определение продукта транскрипции гена α-1,6-фукозилтрансферазы (ΡυΤ8) в клеточной линии, продуцирующей химерные антитела против ганглиозида ΟΌ3.
(1) Получение одноцепочечной кДНК из различных клеточных линий, продуцирующих антитела.
Одноцепочечную кДНК получают из продуцирующих химерные антитела против ганглиозида ΟΌ3 клеточных линий ΌΟΗΙ01-20 и 61-33 следующим образом. ΌΟΗΙ01-20 представляет собой клон трансформанта, полученный из клеток СΗ0/^044, описанный в разделе 2(2) примера 1. Также клон 61-33 представляет собой клон, полученный осуществлением бессывороточной адаптации клеточного транс
- 56 013563 форманта 7-9-51. полученного из ΥΒ2/0 (ЕΕΚΜ ΒΡ-6691. 1п1егпа11па1 Ра1еп1 0гдаш§т ^ерο8^ΐа^у. №11юпа1 1п5111и1е οί Абуапсеб 1пби8Г1а1 8аепсе апб ТесНгю^ду (А18Т ТкикиЬа СеШга1 6. 1-1. ШдакЫ ЬС^те ТкикиЬа-8Н1. 1Ьагак1-кеп 305-8566. 1арап)). с последующим осуществлением выделения отдельной клеточной линии двумя ограничивающими разведениями.
Клетки 0СН101-20 суспендируют в среде ΕΧί'ΈΕΕ 302 (производимой ДКН ΒI08СIΕNСΕ8) с добавлением 3 ммоль/л ^-О^N (производимого Ьйе ТесΗπο1οβ^е5). 0.3% плюроника Е-68 (производимого Ьйе ТесΗπο1οβ^е5) и 0.5% концентрата жирной кислоты (производимого Б-бе ТесΗπο1οβ^е5). и 15 мл суспензии инокулируют в колбу Т75 для суспензионного культивирования клеток (производимую Огетег) при плотности клеток 2х105 клеток/мл. Также клетки 61-33 суспендируют в среде НуЬ^^бοта-8ЕΜ (производимой Ьйе ТесН^^^ек) с добавлением 0.2% бычьего сывороточного альбумина (производимого Ьйе ТесНгю^^е^) (называемого далее Β8А). и 15 мл суспензии инокулируют в колбу Т75 для суспензионного культивирования клеток (производимую Огетег) при плотности клеток 2х105 клеток/мл. Клетки культивируют при 37°С в инкубаторе с 5% СО2. и в 1. 2. 3. 4 и 5 дни культивирования извлекают 1х107 соответствующих клеток-хозяев. и экстрагируют полную РНК с использованием ΚNАеа8у (производит ^IАОΕN) согласно инструкциям изготовителя.
Полную РНК растворяют в 45 мкл стерильной воды. и к раствору добавляют 1 мкл КО1 К№15е-Егее0№15е (производимой Рготеда). 5 мкл прилагаемого буфера для ДНКазы 10х и 0.5 мкл ингибитора рибонуклеазы КУ1$т (производимого Рготеда). и затем проводят взаимодействие при 37°С в течение 30 мин для разрушения геномной ДНК. являющейся примесью в образце. По завершении реакции полную РНК очищают снова с использованием ΚNАеа8у (производит ^IАОΕN) и растворяют в 50 мкл стерильной воды.
В 20 мкл реакционной смеси с использованием олиго(бТ) в качестве праймера синтезируют одноцепочечную кДНК из 3 мкг образца каждой полученной полной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием системы предварительной амплификации 8υΡΕΚ8СΚIΡТ™ для синтеза первой цепи кДНК (производимой Бке ТесНгю^^е^) и согласно инструкциям изготовителя. Реакционный раствор разводят в 50 раз водой и хранят до применения при -80°С.
(2) Определение уровней транскрипции каждого гена конкурентной ПЦР.
Уровень транскрипции каждого гена в кДНК. полученной из клеточной линии. продуцирующей антитела. полученной в разделе (1). определяют конкурентной ПЦР согласно примеру 9(6).
Уровень транскрипции мРНК. полученной из гена ЕИТ8. в каждой клеточной линии. продуцирующей антитела. определяют следующей процедурой.
СНЕТ8-рСК2.1 и ΥΒЕТ8-рСΚ2.1 как плазмиды. в которых в рСК2.1 встроены неполные фрагменты кДНК. полученные в примере 9(2) из ЕИТ8 китайского хомячка и крысиной ЕИТ8. соответственно. расщепляют рестриктазой Ε^Μ. и полученные линейные ДНК используют в качестве эталонов при получении калибровочной кривой для определения уровня транскрипции ЕИТ8.
СНЕТ8б-рСК2.1 и ΥΒЕТ8б-рСΚ2.1. полученные в примере 9(4) делецией 203 п.о. между 8ас1 и НтάΙΙΙ внутренней нуклеотидной последовательности ЕИТ8 китайского хомячка и крысиной ЕИТ8. соответственно. расщепляют рестриктазой Ε^Μ. и полученные линейные ДНК используют в качестве внутренних стандартов при получении калибровочной кривой для определения количества ЕИТ8.
ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы БхТад (производимой Такага 8Ηиζο) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер БхТац (производимый Такага 8Ηиζο). 0.2 ммоль/л бПТР. 0.5 мкмоль/л праймеров. специфических для гена ЕИТ8 (8ΕΟ ГО N0:13 и 14) и 5% ДМСО]. содержащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК. полученной из каждой клеточной линии. продуцирующей антитела. полученной в разделе (1). и 5 мкл (10 фг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 32 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин. 60°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин как едином цикле.
Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов. где вместо кДНК. полученной из каждой клеточной линии. продуцирующей антитела. добавляют 5 мкл (0.1. 1. 5. 10. 50. 100. 500 фг или 1 пг) плазмиды эталона ЕИТ8. и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции ЕИТ8. В данном случае для разведения эталонной плазмиды используют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимую 8IОΜА).
С другой стороны. так как считается. что ген β-актина постоянно транскрибируется в каждой клетки. и уровень его транскрипции в клетках приблизительно одинаковый. уровень транскрипции β-актина определяют как показатель эффективности реакции синтеза кДНК в каждой клеточной линии. продуцирующей антитела.
СНАс-рΒ8 и ΥΒАс-рΒ8 как плазмиды. полученные в примере 9(3). в которых в рΒ1ие8С^^рΐ ΙΙ К8(+) встроены полноразмерные 0КЕ каждой кДНК β-актина китайского хомячка и β-актина крысы. соответственно. расщепляют рестриктазами НшбШ и Крн! и рестриктазами НшбШ и Крн!. и образцы полученных линейных ДНК используют в качестве эталонов при получения калибровочной кривой для определения уровня транскрипции β-актина.
СНАсб-рΒ8 и ΥΒАсб-рΒ8. полученные в примере 9(5) делецией 180 п.о. между Ога! и 0га! внут
- 57 013563 ренней нуклеотидной последовательности β-актина китайского хомячка и β-актина крысы, соответственно, расщепляют рестриктазами НтбШ и Крп1, и полученные линейные ДНК используют в качестве внутренних стандартов для определения количества β-актина.
ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас] (производимой Такага ЗИи/о) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер ЕхТас] (производимый Такага Зки/о), 0,2 ммоль/л άΝ'ΓΡ, 0,5 мкмоль/л праймеров, специфических для β-актина (ЗЕС ΙΌ ΝΟ:17 и 18) и 5% ДМСО], содержащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК, полученной из каждой клеточной линии, продуцирующей антитела, и 5 мкл (1 пг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 17 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин как едином цикле. Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов, где вместо кДНК, полученной из каждой клеточной линии, продуцирующей антитела, добавляют 10 пг, 5 пг, 1 пг, 500 фг или 100 фг эталонной плазмиды β-актина и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции β-актина. В данном случае для разведения эталонной плазмиды используют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой З10МА).
Путем осуществления ПЦР с использованием набора праймеров, описанного в табл. 3, можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Мишень табл. 3, из каждого продукта транскрипции гена и каждого эталона, и можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Конкурент табл. 3, из каждого внутреннего стандарта.
Каждый раствор (7 мкл) после ПЦР подвергают электрофорезу в 1,75% агарозном геле, и затем гель окрашивают, замачивая его в течение 30 мин в ЗУВВ 0гееп I ЫисЫс Ас1б 0е1 З1ат (производит Мо1еси1аг ₽гоЬез) концентрации 1х. Количество амплифицированного фрагмента ДНК измеряют, вычисляя интенсивность люминесценции каждой амплифицированной ДНК с использованием формирователя флуороизображения (Е1иог1та§ег 3Ι; производится Мо1еси1аг Эупат1с).
Количество амплифицированного продукта, полученного ПЦР с использованием эталонной плазмиды в качестве матрицы, измеряют тем же способом, и получают калибровочную кривую, откладывая измеренные количества против количества эталонной плазмиды. С использованием калибровочной кривой из количества амплифицированного продукта, когда в качестве матрицы используют каждую кДНК, полученную из экспрессирующей клеточной линии, вычисляют количество кДНК гена, представляющего интерес, в каждой клеточной линии, и полученную величину определяют как уровень транскрипции мРНК в каждой клеточной линии.
Уровни транскрипции ЕИТ8 приводятся в табл. 5 как относительные величины количества продукта транскрипции β-актина. На протяжении периода культивирования уровень транскрипции ЕИТ8 в продуцирующей антитела клеточной линии 61-33, полученной из клеток УВ2/0, составляет примерно 0,3% или меньше от уровня β-актина, в то время как в клетках, продуцирующих антитела, полученных из клеток СНО, он составляет 0,7-1,5%.
Результаты показывают, что количество продукта транскрипции в продуцирующей антитела клеточной линии, полученной из клеток УВ2/0, существенно меньше, чем количество продукта транскрипции в клетках, продуцирующих антитела, полученных из клеток СНО.
Таблица 5
Клеточная линия Дни культивирования
1-ий 2-ой 3-ий 4-ый 5-ый
ОСНЮ1-20 0,75 0,73 0,99 1,31 1,36
61-33 0,16 0,19 0,24 0,38 <0,10
Пример 11. Получение клеточной линии, сверхэкспрессирующей ген мышиной α-1,6-фукозилтрансферазы (ЕИТ8).
(1) Конструирование экспрессирующей плазмиды для мышиной α-1,6-фукозилтрансферазы (ЕИТ8).
Экстрагируют полную РНК из 1 х 107 клеток миеломы мыши Ν30 (ВСВ0213, Се11 Вапк, ТИе 1пз111и1е оГ ΡΙίιι46'β1 апб С1ет1са1 ВезеагсИ), субкультивированных с использованием среды ΙΜΏΜ (производимой 1эГе Тес1по1о§1е8), содержащей 10% сыворотки плода коровы (производимой кИ'е ТескпоЬддез), с использованием ВЫАеазу (производит ΟΙΛ0ΗΝ) согласно инструкциям изготовителя. Полную РНК растворяют в 45 мкл стерильной воды, и к раствору добавляют 1 мкл ΚΟΙ ВКазе-Егее-ПЫазе (производимой Ρ^отеβа), 5 мкл прилагаемого буфера для ДНКазы 10 и 0,5 мкл ингибитора рибонуклеазы В№з1п (производимого Ρ^отеβа), и затем проводят взаимодействие при 37°С в течение 30 мин для разрушения геномной ДНК, являющейся примесью в образце. По завершении реакции полную РНК очищают снова с использованием ВЫАеазу (производит ΟΙΛ0ΗΝ) и растворяют в 50 мкл стерильной воды. В 20 мкл реакционной смеси с использованием олиго(бТ) в качестве праймера синтезируют одноцепочечную кДНК из 3 мкг образца каждой полученной полной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием системы предварительной амплификации 8υΡЕΒ8СΚIΡТ™ для синтеза первой цепи кДНК (производимой 1чГе Тес1по1о§1е8) и согласно инструкциям изготовителя.
Получают кДНК мышиной ЕИТ8 следующей процедурой (фиг. 25).
- 58 013563
Сначала из последовательности кДНК мышиной РИТ8 (бепВапк. АВ025198) создают прямой праймер. специфический для последовательности. содержащей кодон инициации трансляции (показан ЕЕО ГО NО:19). и обратный праймер. специфический для последовательности. содержащей кодон терминации трансляции (показан ЕЕО ГО NО:20).
Затем получают 25 мкл реакционного раствора [буфер Е.хТас.| (производимый Такага ЕНихо). 0.2 ммоль/л б№ТР. 4% ДМСО и 0.5 мкмоль/л специфических праймеров (ЕЕО ГО NО:19 и ЕЕО ГО NО:20)]. содержащего 1 мкл кДНК. полученной из клеток №0. и осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага ЕНихо). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с. 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин как едином цикле. и заключительном нагревании при 72°С в течение 10 мин.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0.8% агарозном геле. и очищают специфический амплифицированный фрагмент в 1728 п.о. Используют 4 мкл фрагмента ДНК для встраивания в плазмиду рСК2.1 согласно инструкциям изготовителя. приложенным к набору ТОРО ТА С1ошид (производимому Iην^!^одсη). и реакционным раствором трансформируют Е. сой ΌΗ5α. Плазмидные ДНК выделяют согласно известному способу из 6 клонов со встроенными кДНК из числа полученных колоний. невосприимчивых к канамицину.
Нуклеотидную последовательность каждой кДНК. встроенной в плазмиду. определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Рсгкт Е1тсг) и набора В1дОус ТсгттаЮг Сус1с Есс.|испстд РЕ Ксабу Ксас!1оп (производимого Регкт Е1тсг) согласно инструкциям изготовителя. Подтверждается. что все встроенные кДНК. последовательности которых определены. кодируют полную последовательность ОКР мышиной РИТ8. Из них отбирают плазмидную кДНК совершенно без ошибок считывания оснований ПЦР в последовательностях (ее последовательнось ДНК и аминокислотная последовательность показаны в ЕЕО ГО NО:2 и 24 соответственно). В последовательности также отмечают несоответствие в 3 основания из-за замены аминокислоты. когда проводят сравнение с последовательностью мышиной ЕИТ8. зарегистрированной в бепБапк. В данном случае плазмиду называют тГЕИТ8-рСК2.1.
Затем конструируют плазмиду рВЕтГЕИТ8. содержащую полную последовательность ОКР мышиной ЕИТ8. как следует далее (фиг. 26). Сначала 1 мкг плазмиды рВШсзспр! II КЕ(+) растворяют в 35 мкл МЕВиГГсг 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬз). и добавляют к раствору 20 единиц рестриктазы ЕсоШ (производимой Такага ЕНихо). и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. К реакционному раствору добавляют 35 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8.0) и 3.5 мкл щелочной фосфатазы. полученной из Е. соН С15 (производимой Такага ЕНихо). и затем проводят реакцию при 65°С в течение 30 мин для дефосфорилирования концов ДНК. Реакционный раствор экстрагируют смесью фенол/хлороформ и затем осаждают этанолом. и извлеченный фрагмент ДНК растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Отдельно 1 мкг плазмиды тГЕиТ8-рСК2.1 растворяют в 35 мкл ХЕВийсг 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬз). и добавляют к раствору 20 единиц рестриктазы ЕсоШ (производимой Такага ЕНихо). и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0.8% агарозном геле. и очищают фрагмент ДНК примерно в 1.7 т.п.о.. содержащий полную последовательность ОКР кДНК мышиной РИТ8.
Полученный фрагмент ЕсоШ-ЕсоШ (1 мкл. 2.9 т.п.о.). полученный из плазмиды рВЫезспр! II КЕ(+). 4 мкл фрагмента ЕсоМ-ЕсоК (1.7 т.п.о.). полученного из плазмиды тГРиТ8-рСК2.1. и 5 мкл Ыда1юп ШдН (производит ТоуоЬо) смешивают. и проводят реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ЭН5а. и из полученных клонов. невосприимчивых к ампициллину. выделяют плазмидные ДНК согласно известному способу. В данном описании плазмиду называют рВЕтГЕИТ8.
С использованием рВЕтГЕИТ8 и рА6Е249 конструируют экспрессирующий вектор для мышиной РИТ8 следующей процедурой (фиг. 27). рА6Е249 представляет собой производное рА6Е248 [I. Вю1. СНет.. 269. 14730 (1994)] как вектор. в котором из рА6Е248 удален фрагмент ЕрЫ-ЕрЫ (2.7 т.п.о.). содержащий экспрессирующее звено для гена дигидрофолатредуктазы (бНГг).
В 50 мкл универсального буфера Н (производимого Такага ЕНихо) растворяют 1 мкг рА6Е249. и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы Еа11 (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬз). и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом и растворяют в 35 мкл буфера МЕВийсг 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬз). и добавляют к раствору 20 единиц рестриктазы ВатШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬз). и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления к реакционному раствору добавляют 35 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8.0) и 3.5 мкл щелочной фосфатазы. полученной из Е. соБ С15 (производимой Такага ЕНихо). и затем проводят реакцию при 65°С в течение 30 мин для дефосфорилирования концов ДНК. Реакционный раствор экстрагируют смесью фенол/хлороформ и затем осаждают этанолом. и извлеченный фрагмент ДНК растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Отдельно 1 мкг рВЕтГЕИТ8 растворяют в 50 мкл универсального буфера Н (производимого Такага
- 59 013563 ^Ни/о), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы 8аП (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬк), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом и растворяют в 35 мкл буфера ИЕВиПсг 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬк), и добавляют к раствору 20 единиц рестриктазы ВатШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬк), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,7 т.п.о., содержащий полную последовательность ОРР кДНК мышиной РИТ8.
Полученный фрагмент ВатШ-ЗаП (1 мкл, 6,5 т.п.о.), полученный из плазмиды рАСЕ249, 4 мкл фрагмента ВашНЕЗаН (1,7 т.п.о.), полученного из плазмиды рВ8тПРиТ8, и 5 мкл Ыдайоп Нщ11 (производит ТоуоЬо) смешивают, и затем проводят реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ИН5а, и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном описании плазмиду называют рАСЕтПЕиТ8.
(2) Получение клеточной линии, сверхэкспрессирующей ген мышиной а-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8).
Устойчивую экспрессирующую ген РИТ8 клеточную линию получают введением экспрессирующего вектора для мышиной РИТ8 рАСЕтПЕиТ8, сконструированного в разделе (1), в 61-33. 61-33 представляет собой клон, полученный осуществлением бессывороточной адаптации трансформированных клеток 7-9-51, РЕРМ ВР-6691, ШегпайпаГ Ра!еп! Огдашкт Иерокйагу, №Шопа1 ^кИШе оП Абуапсеб 8аепсе апб ТесНпо1оду, полученных из клетки УВ2/0, с высоким выходом продуцирующей химерное антитело против СИ3, с последующим выделением отдельной клетки по методу двойных лимитирующих разведений.
Плазмиду рАСЕшПЕИТ8 переносят в 61-33 описанной далее процедурой согласно методу электропорации [Су!о!есНпо1оду, 3, 133 (1990)]. Сначала 30 мкг плазмиды рАСЕшПЕИТ8 растворяют в 600 мкл буфера ИЕВиГГег 4 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬк), и добавляют к раствору 100 единиц рестриктазы Р^ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬк), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Реакционный раствор осаждают этанолом, и извлеченную линейную плазмиду переводят в водный раствор концентрации 1 мкг/мл. Затем 61-33 суспендируют в буфере К-РВ8 (137 моль/л КС1, 2,7 моль/л №С1, 8,1 моль/л №2НРО4, 1,5 моль/л КН2РО4, 4,0 моль/л МдС12), получают плотность клеток 2х107 клеток/мл, и 200 мкл клеточной суспензии (4х106 клеток) смешивают с 10 мкл (10 мкг) линейной плазмиды. Смесь клетки-ДНК переносят в кювету Сепе Ри1кег (межэлектродное расстояние 2 мм) (производимую ВЮ-РАО), и затем осуществляют электропорацию с использованием устройства для гибридизации Сепе Ри1кег (производимого ВЮ-РАО) при напряжении импульса 0,2 кВ и емкости 250 мкФ. Клеточную суспензию смешивают с 10 мл среды НуЬпбота-8РМ (производимой ЫПе ТесНпо1од1ек) с добавлением 5% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫПе ТесНпо1од1ек) и 0,2% В8А (производимого ЫПе ТесНпо1од1ек), и распределяют в лунки 96-луночного планшета для применения для суспензии клеток (производимого Сгешег) по 100 мкл на лунку. После культивирования при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% СО2 извлекают 50 мкл клеточного супернатанта, и в лунки добавляют по 100 мкл среды НуЬпбота-8РМ (производимой ЫПе ТесНпо1од1ек) с добавлением 0,5 мг/мл гигромицина В (производимого Vакο Риге СНениса1 ШбикМек), 5% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫПе ТесНпо1од1ек) и 0,2% В8А (производимого ЫПе ТесНпо1од1ек). Клетки культивируют в течение 3 недель, повторяя стадию замены среды с интервалами в 3-4 дня, и получают 14 клеточных линий, показывающих невосприимчивость к гигромицину.
С другой стороны, получают клеточную линию отрицательного контроля, вводя в 61-33 плазмиду рАСЕ249 как исходный вектор рАСЕш^С^. Согласно описанной выше процедуре, 10 мкг плазмиды рАСЕ249, превращенной в линейную форму рестриктазой РкрЕ вводят в 4х106 клеток 61-33 с использованием электропорации. Клетки смешивают с 15 мл среды НуЬпбота-8РМ (производимой ЫПе ТесНпо1од1ек) с добавлением 5% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫПе ТесНпо1од1ек) и 0,2% В8А (производимого ЫПе ТесНпо1од1ек), переносят в колбу Т75 для суспензии клеток (производимую Сгешег) и затем культивируют при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% СО2. После культивирования половину культурального супернатанта (7,5 мл) удаляют центрифугированием при 800 об/мин в течение 4 мин, и клетки суспендируют в 7,5 мл среды НуЬпбота-8РМ (производимой ЫПе ТесНпо1од1ек) с добавлением 0,5 мг/мл гигромицина В (производимого Vакο Риге СНениса1 НгбикШек), 5% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЫПе ТесНпо1од1ек) и 0,2% В8А (производимого ЫПе ТесНпо1од1ек), и переносят в колбу Т75 для суспензии клеток (производимую Сгешег). Клетки культивируют в течение 3 недель, повторяя стадию замены среды с интервалами в 3-4 дня, и получают клеточную линию, невосприимчивую к гигромицину.
(3) Анализ уровня экспрессии гена а-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8) в клеточных линиях, сверхэкспрессирующих ген.
С использованием 6 клеточных линий, произвольно отобранных среди 14 клеточных линий, сверхэкспрессирующих РИТ8, полученных из 61-33 в разделе (2), и клеточной линии отрицательного контроля
- 60 013563 сравнивают уровни экспрессии РИТ8 с использованием конкурентной КТ-РСК.
Каждую из таких сверхэкспрессирующих клеточных линий суспендируют в среде НуЬпбота-8РМ (производимой Ь1£е ТесЬпо1од1ек) с добавлением 0,5 мг/мл гигромицина В (производимого Уако Риге С11етюа1 Мик^аек), 5% диализованной сыворотки плода коровы (производимой Ь1£е ТесЬпо1од1ек) и 0,2% В8А (производимого Ь1£е Тес1по1од1ек), получают плотность клеток 3х105 клеток/мл, и затем клетки переносят в колбу Т75 для применения для суспензии клеток (производимую Сгешег). После культивирования при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% СО2 1 х 107 интактных клеток извлекают, и экстрагируют полную РНК с использованием КNАеаку (производит ^IАСЕN) согласно инструкциям изготовителя. Полную РНК растворяют в 45 мкл стерильной воды, и к раствору добавляют 0,5 Е/мкл К^I К№кеРгее-Э№ке (производимой Рготеда), 5 мкл прилагаемого буфера для ДНКазы 10х и 0,5 мкл ингибитора рибонуклеазы К№кт (производимого Рготеда), и затем проводят взаимодействие при 37°С в течение 30 мин для разрушения геномной ДНК, являющейся примесью в образце. По завершении реакции полную РНК очищают снова с использованием КЫАеаку (производит ^IАСЕN) и растворяют в 50 мкл стерильной воды.
В 20 мкл реакционной смеси с использованием олиго(бТ) в качестве праймера синтезируют одноцепочечную кДНК из 2,5 мкг полученной полной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием системы предварительной амплификации 8υРЕК8СКIРТ™ для синтеза первой цепи кДНК (производимой Ь1£е Тес1по1од1ек) и согласно инструкциям изготовителя. Реакционный раствор разбавляют в 50 раз водой, и определяют уровень транскрипции каждого гена конкурентной ПЦР согласно примеру 9(6).
Уровень транскрипции мРНК, полученной из гена РИТ8, в каждой экспрессирующей клеточной линии определяют следующим образом.
ΥВРТ8-рСК2.1 как плазмиду, в которой в рСК2.1 встроен неполный фрагмент кДНК крысиной РИТ8, полученный в примере 9(2), расщепляют рестриктазой ЕсоШ, и полученную линейную ДНК используют в качестве эталона при получении калибровочной кривой для определения уровня транскрипции РИТ8.
Из ΥВРТ8-рСК2.1, полученных в примере 9(4), ΥВРТ8б-рСК2.1, полученную делецией 203 п.о. между 8саI и НшбШ внутренней нуклеотидной последовательности РИТ8, расщепляют рестриктазой ЕсоШ, и полученную линейную ДНК используют в качестве внутреннего стандарта для определения РИТ8.
ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81шхо) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8йи7о), 0,2 ммоль/л бЭТР, 0,5 мкмоль/л праймеров, специфических для гена РИТ8 (8ЕЦ Ю NΟ:13 и 14) и 5% ДМСО], содержащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК, полученной из соответствующей экспрессирующей клеточной линии, полученной выше, и 5 мкл (10 фг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 32 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин как едином цикле.
Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов, где вместо кДНК, полученной из каждой экспрессирующей клеточной линии, добавляют 5 мкл (0,1, 1, 5, 10, 50, 100, 500 фг или 1 пг) эталонной плазмиды РИТ8 и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции РИТ8. В данном случае для разведения эталонной плазмиды используют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой 8ЮМА).
С другой стороны, так как считается, что ген β-актина постоянно транскрибируется в каждой клетке и уровень его транскрипции в клетках приблизительно одинаковый, уровень транскрипции β-актина определяют как показатель эффективности реакции синтеза кДНК в каждой экспрессирующей клеточной линии.
ΥВАс-рВ8 как плазмиду, в которой в рВ1иексг1р( II К8(+) встроена полная последовательность ОКЕ кДНК β-актина крысы, полученная в примере 9(3), расщепляют рестриктазами НшбШ и КрпЕ и полученную линейную ДНК используют в качестве эталона при получении калибровочной кривой для определения уровня транскрипции β-актина.
ΥВАсб-рВ8, полученную из ΥВАс-рВ8 делецией 180 п.о. между ЭпИ и ЭпИ внутренней нуклеотидной последовательности β-актина крысы, расщепляют рестриктазами НшбШ и КрпЕ и полученную линейную ДНК используют в качестве внутренних стандартов при получении калибровочной кривой для определения количества β-актина.
ПЦР осуществляют с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81шхо) в общем объеме реакционного раствора 20 мкл [буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8йи7о), 0,2 ммоль/л бЭТР, 0,5 мкмоль/л праймеров, специфических для β-актина (8ЕЦ Ю NΟ:17 и 18) и 5% ДМСО], содержащего 5 мкл разведенного в 50 раз раствора кДНК, полученной из каждой экспрессирующей клеточной линии, и 5 мкл (1 пг) плазмиды для внутреннего стандарта. ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 17 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин как едином цикле.
Также осуществляют ПЦР в ряде реакционных растворов, где вместо кДНК, полученной из каждой
- 61 013563 экспрессирующей клеточной линии, добавляют 10, 5, 1 пг, 500 фг или 100 фг эталонной плазмиды βактина и используют при получении калибровочной кривой для уровня транскрипции β-актина. В данном случае для разведения эталонной плазмиды используют 1 мкг/мл тРНК хлебопекарных дрожжей (производимой δIСΜЛ).
Путем осуществления ПЦР с использованием набора праймеров, описанного в табл. 3, можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Мишень табл. 3, из каждого продукта транскрипции гена и каждого эталона, и можно амплифицировать фрагмент ДНК размера, указанного в колонке Конкурент табл. 3, из каждого внутреннего стандарта.
Каждый раствор (7 мкл) после ПЦР подвергают электрофорезу в 1,75% агарозном геле, и затем гель окрашивают, замачивая его в течение 30 мин в δΥΒВ Сгееп I №1с1ею Лс1б Се1 δΙηΐΒ (производит Мо1еси1аг Ρ^оЬеδ) концентрации 1 х. Количество амплифицированного фрагмента ДНК измеряют, вычисляя интенсивность люминесценции каждого амплифицированного фрагмента ДНК с использованием формирователя флуороизображения (Р1иог1шадег δΐ; производится Мо1еси1аг Оупатю).
Количество амплифицированного продукта, полученного ПЦР с использованием эталонной плазмиды в качестве матрицы, измеряют тем же способом, и получают калибровочную кривую, откладывая измеренные величины против количества эталонной плазмиды. С использованием калибровочной кривой из количества амплифицированного продукта, когда в качестве матрицы используют каждую кДНК, полученную из экспрессирующей клеточной линии, вычисляют количество кДНК гена, представляющего интерес, в каждой клеточной линии, и полученную величину определяют как уровень транскрипции мРНК в каждой клеточной линии.
Фиг. 28 показывает уровни транскрипции РυТ8 как относительные величины от количества продукта транскрипции β-актина. Три клеточные линии тГΕυТ8-1, тГΕυТ8-2 и тГΕυТ8-4 и клеточная линия с введенной рЛСЕ249 являются клеточными линиями с относительно небольшим уровнем транскрипции РОТ^, эквивалентным 0,3-10% уровня транскрипции β-актина. С другой стороны, три другие клеточные линии тГΕυТ8-3, ωΓΕυ^^ и тГ^Ш^-? являются клеточными линиями с относительно высоким уровнем транскрипции РυТ8, эквивалентным 20-40% уровня транскрипции β-актина.
(4) Очистка антител, продуцированных клеточной линией, сверхэкспрессирующей ген α-1,6фукозилтрансферазы (ШТ8).
Каждую из шести клеточных линий, сверхэкспрессирующих ген РυТ8, и одну клеточную линию отрицательного контроля, полученные в разделе (2), суспендируют в среде НуЬпбошаРРМ (производимой ЫГе Тес11по1ощеБ) с добавлением 200 нмоль/л МТХ, 0,5 мг/мл гигромицина В (производимого \Уако Ριιιό СЕетка1 1пбиБ(г1еБ) и 0,2% ΒδЛ (производимого ЫГе Тесйпо^дхеБ), и получают плотность клеток 2х 105 клеток/мл, и затем 100 мл всей суспензии инокулируют в три колбы Т225 для применения при культивировании клеток в суспензии (производимые 1^ЛК1). После культивирования при 37°С в течение 7-9 суток в инкубаторе с 5% СО2 подсчитывают число интактных клеток, и подтверждают, что их жизнеспособность почти одинаковая (у каждой 30% или менее), и затем извлекают каждую клеточную суспензию. Каждую клеточную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин при 4°С в течение 10 мин, и извлеченный супернатант центрифугируют при 10000 об/мин при 4°С в течение 1 ч и затем фильтруют с использованием блока для фильтрации ΡΕδ (производимого NА^СΕNΕ) с диаметром пор 0,22 мкм и емкостью 150 мл.
В колонку диаметром 0,8 см помещают Ρ^оБер-Л ШдЕСарасйу (производит Ь^оΡВОСΕδδINС) на высоту 2 см и промывают 10 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,0) и 10 мл буфера 1 моль/л глицин/ШОН - 0,15 моль/л глицин/№1С1 (рН 8,6) для того, чтобы уравновесить носитель. Затем через такую колонку пропускают 100 мл каждого культурального супернатанта и промывают 50 мл буфера 1 моль/л глицин/№1ОН - 0,15 моль/л ΝηΟ (рН 8,6). После промывки элюируют антитела, адсорбированные на Ρ^оБер-Λ, с использованием 2,5 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,0), элюат фракционируют на фракции по 500 мкл, и каждую фракцию нейтрализуют, смешивая ее с 100 мкл 2 моль/л трис-НС1 (рН 8,5). Две фракции, содержащие антитела в высокой концентрации (всего 1,2 мл), отбирают ВСАспособом [Лпа1. ВюсЕет., 150, 76 (1985)], объединяют и затем диализуют против 10 моль/л цитратного буфера (рН 6,0) при 4°С в течение всего дня и ночи. После диализа раствор антител извлекают и подвергают стерилизации фильтрованием с использованием фильтра с размером пор 0,22 мкм МШех СУ (производимого ΜI^^IΡОВΕ).
(5) Цитотоксическая активность (ЛПСС-активность) ш νίΙΐΌ антител, продуцированных клеточной линией, сверхэкспрессирующих ген мышиной α-1,6-фукозилτрансферазы (ΈυΓΈ).
Для того чтобы оценить 1п νίΙΐΌ цитотоксическую активность антител против СЭ3, полученных в чистом виде в разделе (4), измеряют ЛОСС-активность с использованием ΟΟδ-положительных клеток культивированной клеточной линии меланомы человека С-361 (ВСВ0991, Се11 Вапк, ТЕе 1пБ111и1е оГ ΡЕуБ^са1 апб СЕетюа1 ВеБеагсЕ).
Клетки С-361, субкультивированные в среде ΚΡΜI1640 (производимой ЫГе ТесЕпо1од1еБ), содержащей 10% сыворотки плода коровы (производимой ЫГе Тес11по1од1еБ) (называемой далее ΚΡΜI1640РΒδ(10)), суспендируют в 500 мкл ВΡΜI1640-РΒδ(10) при плотности клеток 1 х 106 клеток, и добавляют
- 62 013563 к ним эквивалент 3,7 МБк ^^СгО^ и затем культивируют при 37°С в течение 30 мин для мечения клеток радиоизотопом. После центрифугирования при 1200 об/мин в течение 5 мин супернатант отбрасывают, и клетки-мишени суспендируют в 5 мл среды ЯРМП640-ЕВ8(10). Повторяют три раза стадию промывки, и затем суспензию клеток инкубируют в течение 30 мин на льду для осуществления спонтанного отделения радиоактивного вещества. Снова дважды повторяют стадию промывки, и затем клетки суспендируют в 5 мл среды КРМН640-ЕВ8(10), и посредством этого получают суспензию клеток-мишеней 2х105 клеток/мл.
С другой стороны, у здорового человека берут 30 мл периферической крови и осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого 81ιίιηίζι.ι Рйагтасеийса1) и затем смешивают с 30 мл физиологического раствора (производимого О!бика Рйагтасеийса1). После смешивания 10 мл смеси осторожно нагружают на 4 мл Ьутрйоргер (производит NΥСОМЕ^ РНАЯМА А8) и центрифугируют при комнатной температуре при 2000 об/мин в течение 30 мин. Отделившиеся фракции одноядерных клеток собирают из центрифужных пробирок, объединяют и затем суспендируют в 30 мл ЯРМП640-ЕВ8(10). После центрифугирования при комнатной температуре при 1200 об/мин в течение 5 мин супернатант отбрасывают, и клетки-мишени суспендируют в 20 мл КРМН640-ЕВ8(10). Дважды повторяют стадию промывки, и затем с использованием КРМН640-ЕВ8(10) клетки получают суспензию эффекторных клеток 2х 106 клеток/мл.
Суспензию клеток-мишеней распределяют по 50 мкл (1х104 клеток/лунку) в каждую лунку 96луночного планшета с И-образными лунками (производимого Еа1соп). Затем в каждую лунку добавляют 100 мкл суспензии эффекторных клеток (2х105 клеток/лунку), и посредством этого доводят отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням до 20:1. Затем с использованием 10 М цитратного буфера (рН 6,0) получают ряд разведенных растворов - 0,01, 0,1, 1 и 10 мкг/мл - каждого из антител против СЭ3, полученных в разделе (4), и по 50 мкл разведенных растворов добавляют в лунки, получая конечные концентрации 0,0025 мкг/мл, 0,025 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 2,5 мкг/мл соответственно. После осуществления взаимодействия при 37°С в течение 4 ч в атмосфере с 5% СО2 планшет центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин. Переносят 50 мкл супернатанта из каждой лунки в пробирку для ΠΙΛ диаметром 12 мм (производимую I^VΛКI). и измеряют количество 51Сг в супернатанте с использованием автоматического счетчика гамма-квантов МШАХ-у 5550 (производимого РАСКАЯО).
Также количество спонтанно отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя такое же взаимодействие в реакционной смеси, в которую вместо суспензии эффекторных клеток и раствора антител добавляют 150 мкл КРМН640-ЕВ8(10). Количество общего отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя такое же взаимодействие в реакционной смеси, в которую вместо суспензии эффекторных клеток и раствора антител добавляют 100 мкл 1 моль/л соляной кислоты и 50 мкл КРМН640-ЕВ8(10). С использованием полученных величин вычисляют АОСС-активность (%) на основании формулы (ΙΙ), приведенной в разделе 2(3) примера 2.
Фиг. 29 показывает АОСС-активность каждого вида антител против СО3 в отношении клеток С361. Три клеточные линии тГЕиТ8-1, тГЕЬТ8-2 и тГЕЬТ8-4 с низким уровнем экспрессии ЕИТ8, как видно на фиг. 28, демонстрируют сильную АОСС-активность, эквивалентную АОСС-активности клеточной линии с введенной рАСЕ249 отрицательного контроля. С другой стороны, три другие клеточные линии тГЕиТ8-3, тГЕИТ8-6 и тГЕИТ8-7 с высоким уровнем экспрессии ЕИТ8, как видно на фиг. 28, демонстрируют низкую АОСС-активность, эквивалентную АОСС-активности антител против СО3, полученных из клеток СНО. На основании полученных результатов показано, что АОСС-активность полученных антител можно регулировать, регулируя уровень экспрессии ЕИТ8 в клетках-хозяевах.
(6) Анализ углеводных цепей антител, продуцированных клеточной линией, сверхэкспрессирующих ген мышиной α-1,6-фукозилтрансферазы (ЕИТ8).
Анализируют углеводные цепи антител против СО3, очищенных в разделе (4). Углеводные цепи, связывающиеся с антителами, продуцированными клеточными линиями с введенными тГЕИТ8-6 и рАСЕ249, отщепляют от белков, подвергая антитела гидразинолизу [Ме!йой о Г Еπζутο1οду, 83, 263 (1982)]. После удаления гидразина выпариванием при пониженном давлении осуществляют Νацетилирование, добавляя водный раствор ацетата аммония и уксусный ангидрид. После сушки вымораживанием осуществляют флуоресцентное мечение 2-аминопиридином [1. Вюсйет., 95, 197 (1984)]. Группу углеводных цепей с флуоресцентной меткой (группу РА-обработанных углеводных цепей) отделяют от избытка реагентов с использованием колонки с 8ирегйех Рерййе НЯ 10/30 (производимым Рйагтас1а). Фракции углеводных цепей сушат с использованием центробежного концентратора и используют как группу очищенных РА-обработанных углеводных цепей. Затем группу очищенных РА-обработанных углеводных цепей подвергают анализу методом ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием колонки с СЬС-ОО8 (производимым 8Ытайζи) (фиг. 30). При вычислении по площади пика содержание углеводных цепей без α-1,6-фукозы в тГЕИТ8-6 составляет 10%, и содержание углеводных цепей, связанных с α-1,6-фукозой, составляет 90%. Содержание углеводных цепей без α-1,6-фукозы в рАСЕ249 составляет 20%, и содержание углеводных цепей, связанных с α-1,6-фукозой, составляет 80%. На основании полученных результатов обнаружено, что содержание углеводных цепей, связанных с α-1,6-фукозой, в полу
- 63 013563 ченных антителах возрастает за счет сверхэкспрессии гена ЕИТ8.
Фиг. 30 показывает картины элюирования, полученные при осуществлении анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой каждого вида РА-обработанных углеводных цепей, полученных из антител, продуцированных клеточными линиями с введенными шГЕИТ8-6 и рАСЕ249. Фиг. 30А и 30В показывают картины элюирования для шГЕИТ8-6 и рАСЕ249 соответственно. Относительную интенсивность флуоресценции и время элюирования размещают как ординаты и абсциссы соответственно. С использованием натрийфосфатного буфера (рН 3,8) как буфера А и натрийфосфатного буфера (рН 3,8)+0,5% 1-бутанола как буфера В, осуществляют анализ с градиентом, указанным далее.____________________
Время (минуты) 0 80 90 90,1 120
Буфер В (%) 0 60 60 0 0
Пики (ΐ)-(ΐχ) на фиг. 30 и 31 показывают структуры, приведенные далее.
(ί) ΠοΝΑοβΙ-ΣΜιηαΙ
МащЗ 1 —401οΝΑο β 1 -4С1сНАс-РА /3 αοΝΑοβ1-2Μ3ηα1' (И) Са1 β 1 -4О1сКАс β 1 -2Мап а 1 '6 Мап£ 1 -4С1сШс β 1 -401οΝΑϋ-ΡΑ /3
О1сМАс01-2Мапа1' (ΐϋ) (ίν)
Ο1οΝΑο/Π—2МапаГ '6 Мал β 1 -461сКАс β 1 -40οΝΑο-ΡΑ /3 θ31β1-4αοΝΑοβ1-2ΜιηαΤ (Ш1-чдаад1-2М1псИ
Мт β 1 -ОсКАсЗ 1 -ЖЙсЫАс-РА /3
Са! β 1 -«ΝΆο β 1 -2Мап а?Г
- 64 013563 (ν) а<ЖсЗ 1-2№ηα1
Риса
Мал β 1 —401οΝΑο β 1 -461сШс-РА /3
ΟΙοΝΑοβΙ—2Мапа1' (νϊ)
РисЯ1\
Μηβ 1-4αοΝΑοβ 1 -ΟοΝΑο-ΡΑ /3 αοΝΜ1-2№ιαΓ
6а1£1-Мас№с£1-2Ш1а1 (νΐϊ) αοΝΑοβ1--2Μιη αΐ
Γιιοαΐ^
Μχιβ 1 —4ОсМАс β 1 -4С1сХАс-РА /3
ΟΑβ 1-4βοΝΑο31—2Мапаг (νίϋ)
Са1 β 1 —ΌοΝΑο β 1 -2Мап οι 1
Гиса1\ №ηβ 1 —ΟοΝΆοβ 1 —ΟόΝΑο—ΡΑ /3
6а1 β 1 ~4αοΝΑο β 1 -2Мап (X Γ (ίχ)
Риса
01οΝΑοΘ1-4 Μ3π31~4αοΝΑο81-4(31οΝΑβ-ΡΑ асЫАс01-2№па1 (ЭсЬ1Ас/И—2Мапа1'
С1сNАс, Са1, Мап, Рис и РА обозначают Ν-ацетилглюкозамин, галактозу, маннозу, фукозу и группу пиридиламино соответственно. На фиг. 30 и 31 долю группы углеводных цепей без α-1,6-фукозы вычисляют из площади, занимаемой пиками (ϊ)-(ϊν) из числа (ΐ)-(ΐχ), и долю группы углеводных цепей, связанных с α-1,6-фукозой, вычисляют из площади, занимаемой пиками (ν)-(ΐχ) из числа (ΐ)-(ΐχ).
Пример 12. Получение гена α-1,6-фукозилтрансферазы (ТиТ8) клеток СН0.
(1) Получение последовательности кДНК α-1,6-фукозилтрансферазы (ТиТ8) клеток СН0.
Из одноцепочечной кДНК, полученной в примере 9(1) из клеток СН0/ЭС44 на 2-ой день культивирования, получают кДНК ТиТ8 китайского хомячка следующим образом (фиг. 32).
Сначала из последовательности кДНК мышиной ТиТ8 (СепВапк, АВ025198) создают прямой праймер, специфический для 5'-концевой нетранслируемой области (показан в 8Е4) ΙΌ Ν0:21), и обратный праймер, специфический для 3'-концевой нетранслируемой области (показан в 8Е4) ΙΌ Ν0:22).
Затем получают 25 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТац (производимый Такага 811шо), 0,2 ммоль/л с!\ТР, 4% ДМСО и 0,5 мкмоль/л специфических праймеров (8ЕР ΙΌ Ν0:21 и 22)], содержащего 1 мкл кДНК, полученной из клеток СН0/ЭС44, и осуществляют ПЦР с использованием ДНКполимеразы ЕхТац (производимой Такага 811шо). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 2 мин как едином цикле, и заключительным нагреванием при 72°С в течение 10 мин.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0,8% агарозном геле и очищают специфический амплифицированный фрагмент примерно в 2 т.п.о. Используют 4 мкл фрагмента ДНК для встраивания в плазмиду рСЯ2.1 согласно инструкциям изготовителя, приложенным к набору Т0Р0 ТА С1ошп§ (производимому РтИ'оцсч)), и реакционным раствором трансформируют Е. соН 1)115α. Плазмидные ДНК выделяют согласно известному способу из 8 клонов со встроенной кДНК из числа полученных колоний, невосприимчивых к канамицину.
Нуклеотидную последовательность каждой кДНК, встроенной в плазмиду, определяют с использо- 65 013563 ванием секвенатора ДНК 377 (производимого Ρе^к^η Е1тег) и набора В1дОуе Тегтта!ог Сус1е Зесщепстд РЗ Веабу Веасйоп (производимого Ρе^к^п Е1тег) согласно инструкциям изготовителя. Подтверждается, что все встроенные кДНК кодируют последовательность, содержащую полную ΟΚΤ РИТ8 клеток ίΉΟ. Из них отбирают плазмидную ДНК совершенно без ошибок считывания оснований ПЦР в последовательностях. В данном случае плазмиду называют СНГЕиТ8-рСК2.1. Определенная нуклеотидная последовательное и аминокислотная последовательность кДНК РИТ8 ίΉΟ показаны в ЗЕО ГО ΝΟ:1 и 23 соответственно.
(2) Получение геномной последовательности α-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8) клеток ί'ΉΟ.
С использованием в качестве зонда фрагмента ΟΒΕ полноразмерной кДНК РИТ8 клеток ΟΉΟ, полученной в разделе (1), получают геномный клон РИТ8 клеток ίΉΟ согласно известному способу скрининга генома, описанному, например, в Мо1еси1аг С1ошпд, Зесопб Ебйюп, Сштеп! Гго1осо1к ш Мо1еси1аг Вю1о1ду, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Зесопб Ебйюп (1989). Затем после расщепления полученного геномного клона с использованием рестриктаз осуществляют гибридизацию по Саузерну с использованием в качестве зонда фрагмента АГа1-Заи3А1 (примерно 280 п.о.), содержащего кодон инициации кДНК РИТ8 клеток СИ©, и затем из фрагментов рестриктаз, показывающих положительную реакцию, отбирают фрагмент ХЬа1-ХЬа1 (примерно 2,5 т.п.о.) и фрагмент Зас1-Зас1 (примерно 6,5 т.п.о.), встроенные в рВ1иекспр! II КЗ(+) (производимую З!га!одепе) соответственно.
Нуклеотидную последовательность каждого полученного геномного фрагмента определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Гегк|п Е1тег) и набора В|дЭуе Тегтша!ог Сус1е Зес.|иепстд РЗ Веабу Веасйоп (производимого Гегк|п Е1тег) согласно инструкциям изготовителя. Посредством этого подтверждается, что фрагмент ХЬаВХЬа! кодирует последовательность предыдущего интрона примерно в 2,5 т.п.о., содержащего экзон 2 РИТ8 клеток ΟΉΟ, и фрагмент ЗасВЗаФ кодирует последовательность последующего интрона примерно в 6,5 т.п.о., содержащего экзон 2 РИТ8 клеток ί'ΉΟ. В данном случае плазмиду, содержащую фрагмент ХЬаВХЬа!, называют рРИТ8£дЕ2-2, и плазмиду, содержащую фрагмент ЗасВЗасф называют рРИТ8ГдЕ2-4. Определенная нуклеотидная последовательнось (примерно 9,0 т.п.о.) области генома, содержащей экзон 2 РИТ8 клеток ΟΉΟ, показана в ЗЕО ГО ΝΟ:3.
Пример 13. Получение клеток ΟΈΟ, в которых ген α-1,6-фукозилтрансферазы разорван, и получение антител с использованием таких клеток.
Получают клетки ΟΈΟ, из которых удалена геномная область, содержащая экзон 2 гена α-1,6фукозилтрансферазы (РИТ8) клеток ΟΈΟ, и оценивают АОСС-активность антител, продуцированных такими клетками.
1. Конструирование векторной плазмиды рКΟРυТ8Ρи^ο, обеспечивающей локализацию экзона 2 гена α-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8) китайского хомячка.
(1) Конструирование плазмиды р^ГГиго.
Плазмиду р^ккиго конструируют следующей процедурой (фиг. 33).
В 35 мкл ИЕВийег 4 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬк) растворяют 1,0 мкг плазмиды рКΟЗеВсЖиго (производимой Ьехюоп), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы АкФ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬк), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,5 т.п.о., содержащий экспрессирующий элемент гена невосприимчивости к пуромицину.
С другой стороны, 1,0 мкг плазмиды р1οxΡ, описанной в опубликованной рассмотренной заявке на патент Японии № 314512/99, растворяют в 35 мкл ИЕВиГГег 4 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬк), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы АкФ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬк), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 2,0 т.п.о.
Полученный фрагмент АксВАкФ (4,5 мкл, примерно 1,5 т.п.о.), образованный от плазмиды рКΟЗе1есίΡи^ο, 0,5 мкл фрагмента АксВАкФ (примерно 2,0 т.п.о.), образованного от плазмиды р1οxΡ, и 5,0 мкл Ыдайоп Н1дп (производимого ТоуоЬо) смешивают, и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой 045(/., и из полученнных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют р1οxΡΡи^ο.
(2) Конструирование плазмиды рКΟРυТ8дЕ2-1.
Плазмиду рКΟРυТ8дЕ2-1 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 34), с использованием плазмиды рРиТ8ГдЕ2-2, полученной в примере 12(2), содержащей участок генома РИТ8 китайского хомячка, содержащий экзон 2.
В 35 мкл ИЕВиГГег 1 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬк), содержащего 100 мкг/мл ВЗА (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬк), растворяют 2,0 мкг плазмиды рРИТ8£дЕ2-2, и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ЗаФ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬк), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 35 мкл ИЕВиГГег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬк), содержащего 100 мкг/мл
- 66 013563
В8А (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ЕсоКУ (производимой Епд1апб Вю1аЬе), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч.
По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,5 т.п.о.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды ЫТМИ828 (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬе) растворяют в 35 мкл НЕВиГГсг 1 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬе), содержащего 100 мкг/мл В8А (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы 8аО (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 35 мкл НЕВиГГсг 2 (производимого Ν&ν Епд1апб Вю1аЬе), содержащего 100 мкг/мл В8А (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ЕсоКУ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 2,8 т.п.о.
Полученный фрагмент ЕсоКУ-8ай (4,5 мкл, примерно 1,5 т.п.о.), образованный от плазмиды рРИТ8£дЕ2-2, 0,5 мкл фрагмента ЕсоКУ-8а^ (примерно 2,8 т.п.о.), образованного от плазмиды ЬГГМИ828, и 5,0 мкл Ыдайоп Н1д1 (производимого ТоуоЬо) смешивают, и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. со11 ЭН5а, и из полученнных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рКОРИТ8дЕ2-1.
(3) Конструирование плазмиды рКОРИТ8дЕ2-2.
Плазмиду рКОРИТ8дЕ2-2 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 35), с использованием плазмиды рКОРИТ8дЕ2-1, полученной в разделе (2).
В 30 мкл ХЕВцЕГсг 2 (производимого Епд1апб Вю1аЬе), содержащего 100 мкг/мл В8А (производимого Епд1апб Вю1аЬе), растворяют 2,0 мкг плазмиды рКОРИТ8дЕ2-1, и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ЕсоКУ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 30 мкл ХЕВцЕГсг 1 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬе), содержащего 100 мкг/мл В8А (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы Кргб (производимой Епд1апб Вю1аЬе), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,5 т.п.о.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды р1охРРиго растворяют в 30 мкл ХЕВцЕГсг 4 (производимого Епд1апб Вю1аЬе), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы НраI (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 30 мкл ХЕВцГГсг 1 (производимого Епд1апб Вю1аЬе), содержащего 100 мкг/мл В8А (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы Кргб (производимой Ν&ν Епд1апб Вю1аЬе), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 3,5 т.п.о.
Часть (4,0 мкл) полученного фрагмента ЕсоКУ-Крй (примерно 1,5 т.п.о.), образованного от плазмиды рКОРИТ8дЕ2-1, 1,0 мкл фрагмента НраЕКргб (примерно 3,5 т.п.о.), образованного от плазмиды р1охРРиго, и 5,0 мкл Ыдайоп Н1д1 (производимого ТоуоЬо) смешивают, и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. со11 ЭН5а, и из полученнных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рКОРИТ8дЕ2-2.
(4) Конструирование плазмиды ресРИТ8дЕ2-3.
Плазмиду ресРИТ8дЕ2-3 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 36), с использованием плазмиды рРИТ8£дЕ2-4, полученной в примере 12(2), содержащей участок генома РИТ8 китайского хомячка, содержащий экзон 2.
В 35 мкл ХЕВцЕГсг 1 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬе), растворяют 2,0 мкг плазмиды рРИТ8£дЕ2-4, и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы НраП (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом, и затем концы ДНК заменяют на тупые концы с использованием В1цпйпд Н1д1 (производимого ТоуоЬо) согласно инструкциям изготовителя. Извлекают фрагмент ДНК, осуществляя экстрагирование смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и растворяют в 35 мкл НЕВиГГсг 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы НшбШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 3,5 т.п.о.
С другой стороны, 1,0 мкг плазмиды ЫТМИ839 (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬе) растворяют в 35 мкл НЕВиГГсг 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬе), и раствор смешивают с 20 единицами рестрик
- 67 013563 тазы ЕсоКУ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и 20 единицами рестриктазы НшбШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 2,8 т.п.о.
Полученный фрагмент НраП-НтбШ (4,0 мкл примерно 3,5 т.п.о.), образованный от плазмиды рРИТ8ПдЕ2-4, 1,0 мкл фрагмента ЕсоКУ-НшбШ (примерно 2,8 т.п.о.), образованного от плазмиды ЫТМШ39, и 5,0 мкл Ыдайоп Н1дй (производимого ТоуоЬо) смешивают, и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. со11 ОН5о., и из полученнных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рксРиТ8дЕ2-3.
(5) Конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-3.
Плазмиду рК0РИТ8дЕ2-3 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 37), с использованием плазмиды рРИТ8ПдЕ2-4, полученной в примере 12(2), содержащей участок гена РИТ8 китайского хомячка, содержащий экзон 2.
В 35 мкл №ВиППег для ЕсоК! (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), растворяют 2,0 мкг плазмиды рРИТ8ПдЕ2-4, и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ЕсоК! (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и 20 единиц рестриктазы НшбШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,8 т.п.о.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды рВ1ие5спр1 ΙΙ 1<δ(+) (производимой δί^аίадеηе) растворяют в 35 мкл NΕВиППе^ для ЕсоК (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ЕсоК (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) и 20 единиц рестриктазы НшбШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (м./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 3,0 т.п.о.
Полученный фрагмент НтбШ-ЕсоШ (4,0 мкл примерно 1,8 т.п.о.), образованный от плазмиды рРИТ8ПдЕ2-4, 1,0 мкл фрагмента НтбШ-ЕсоК! (примерно 3,0 т.п.о.), образованного от плазмиды рВ1ие5спр1 ΙΙ КВ(+), и 5,0 мкл Ыдайоп Н1дй (производимого ТоуоЬо) смешивают, и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. со11 ОН5/, и из полученнных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рК0РИТ8дЕ2-3.
(6) Конструирование плазмиды рК0РИТ8дЕ2-4.
Плазмиду рК0РИТ8дЕ2-4 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 38), с использованием плазмид р5сРИТ8ПдЕ2-3 и рК0РИТ8дЕ2-3, полученных в разделах (4) и (5).
В 35 мкл NΕВиΓΓе^ для δа1I (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), содержащего 100 мкг/мл ВδА (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), растворяют 1,0 мкг плазмиды р5сРИТ8дЕ2-3, и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы δа1I (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 30 мкл №ВиППег 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), содержащего 100 мкг/мл ВδА (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы НшбШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 3,6 т.п.о.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды рК0РИТ8дЕ2-3 растворяют в 35 мкл NΕВиΓΓе^ для δа1I (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы δа1I (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом и растворяют в 35 мкл NΕВиППе^ 2 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы НшбШ (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления к раствору добавляют 35 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,5 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. сой С15 (производимой Такага δйиζо), и затем осуществляют взаимодействие при 65°С в течение 30 мин для дефосфорилирования концов ДНК. Фрагмент ДНК извлекают, осуществляя экстрагирование смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Полученный фрагмент δа1I-Н^ηбШ (4,0 мкл примерно 3,1 т.п.о.), образованный от плазмиды р8сРИТ8дЕ2-3, 1,0 мкл фрагмента δа1I-Н^ηбШ (примерно 4,8 т.п.о.), образованного от плазмиды рК0РИТ8дЕ2-3, и 5,0 мкл Ыдайоп Шдй (производимого ТоуоЬо) смешивают, и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ОН5/, и из полученнных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рК0РИТ8дЕ2-4.
- 68 013563 (7) Конструирование плазмиды рКΟΕυТ8дЕ2-5.
Плазмиду рКОЕЕТ8§Е2-5 конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 39), с использованием плазмид рКОЕЕТ8Г§Е2-2 и рКΟΕυТ8дЕ2-4, полученных в разделах (3) и (6).
В 30 мкл NЕΒиГГе^ 4 (производимого №\ν Епд1апб ΒίοΕιΜ) растворяют 1,0 мкг плазмиды рКОΕυТ8дЕ2-2, и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы δтаI (производимой №\ν Епд1апб ΒίοΕι^), и затем осуществляют реакцию расщепления при 25°С в течение 2 ч. Из реакционного раствора извлекают фрагмент ДНК осаждением этанолом и растворяют в 30 мкл ^Β^^γ 2 (производимого Νον Епд1апб Βΐο^δ), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ΒатΗI (производимой №\ν Епд1апб ΒίοΕι^), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления к раствору добавляют 30 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,0 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. ток С15 (производимой Такага δίπιζο), и затем осуществляют взаимодействие при 65°С в течение 1 ч для дефосфорилирования концов ДНК. По завершении дефосфорилирования фрагмент ДНК извлекают, осуществляя экстрагирование смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды рКОЕЕТ8§Е2-4 растворяют в 30 мкл ^Β^^γ 4 (производимого №\ν Епд1апб ΒίοΕι^), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы δтаI (производимой №\ν Епд1апб Βίο1аЪз), и осуществляют реакцию расщепления при 25°С в течение 2 ч. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом и растворяют в 30 мкл ΝεΒ^^ί 2 (производимого №\ν Епд1апб Βΐο^δ), и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ΒатΗI (производимой №\ν Епд1апб ΒίοΕώδ), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 5,2 т.п.о.
Полученный фрагмент δтаI-ΒатΗI (0,5 мкл примерно 5,0 т.п.о.), образованный от плазмиды рКОΕυТ8дЕ2-2, 4,5 мкл фрагмента δта1-ΒатΗI (примерно 5,4 т.п.о.), образованного от плазмиды рКОЕЕТ8дЕ2-4, и 5,0 мкл Еща1юп Н1дН (производимого ТοуοЪο) смешивают, и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 15 ч. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. ток ОН5'7„ и из полученнных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рКОЕЕТ8дЕ2-5.
(8) Конструирование плазмиды рКΟΕυТ8Ρи^ο.
Плазмиду рКΟΕυТ8Ρи^ο конструируют процедурой, описанной далее (фиг. 40), с использованием плазмиды рКΟΕυТ8дЕ2-5, полученной в разделе (7).
В 50 мкл ^Β^^γ 4 (производимого №\ν Епд1апб ΒίοΕιΜ) растворяют 1,0 мкг плазмиды рКΟδе1есГОТ (производимой Еех1топ), и к раствору добавляют 16 единиц рестриктазы КзгП (производимой №\ν Епд1апб ΒίοΕώδ), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле, и очищают фрагмент ДНК примерно в 1,2 т.п.о., содержащий экспрессирующий элемент дифтерийного токсина.
Отдельно 1,0 мкг плазмиды рКОЕЕТ8§Е2-5 растворяют в 50 мкл ^Β^^γ 4 (производимого №\ν Епд1апб ΒίοΗ^), и к раствору добавляют 16 единиц рестриктазы КзгП (производимой №\ν Епд1апб Βίο1аЪз), и осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 2 ч. По завершении реакции расщепления к раствору добавляют 30 мкл 1 моль/л буфера трис-НС1 (рН 8,0) и 3,0 мкл щелочной фосфатазы, полученной из Е. сο1^ С15 (производимой Такага δίυζο), и затем осуществляют взаимодействие при 65°С в течение 1 ч для дефосфорилирования концов ДНК. По завершении дефосфорилирования фрагмент ДНК извлекают, осуществляя экстрагирование смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и растворяют в 10 мкл стерильной воды.
Полученный фрагмент КзгП-КзгП (1,0 мкл примерно 1,2 т.п.о.), образованный от плазмиды рКΟδе1есГОТ, 1,0 мкл фрагмента КзгП-КзгП (примерно 10,4 т.п.о.), образованного от плазмиды рКΟΕυТ8дЕ2-5, 3,0 мкл стерильной воды и 5,0 мкл Ь1да1юп Нщк (производимого ТοуοЪο) смешивают, и затем осуществляют реакцию лигирования при 16°С в течение 30 мин. С использованием реакционного раствора трансформируют Е. сο1^ ΟΜα, и из полученных клонов, невосприимчивых к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК согласно известному способу. В данном случае плазмиду называют рКΟΕυТ8Ρи^ο.
2. Получение клеток СНО, в которых разорвана одна копия геномной области, содержащей экзон 2 гена α-1,6-фукозилтрансферазы (ЕОТ8).
(1) Введение вектора, обеспечивающего локализацию.
Обеспечивающий локализацию участка генома ΕυТ8 китайского хомячка вектор рКΟΕυТ8Ρи^ο, сконструированный в разделе 1 данного примера, вводят в штамм 5-03, полученный в разделе 1(2) примера 8.
Ген плазмиды рКΟΕυТ8Ρи^ο вводят в штамм 5-03 так, как описано ниже, согласно способу электропорации [Су^ескш^^у, 3, 133 (1990)]. Сначала 150 мкг плазмиды рКΟΕυТ8Ρи^ο растворяют в 1,8 мл ^Β^^γ для δа1I (производимого №\ν Епд1апб ΒίοΕι^), и к раствору добавляют 600 единиц рестриктазы δа1I (производимой №\ν Епд1апб ΒίοΕώδ), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение 5 ч, и получают линейный фрагмент. Реакционный раствор экстрагируют смесью фе
- 69 013563 нол/хлороформ. затем осаждают этанолом. и извлеченную линейную плазмиду переводят в водный раствор концентрации 1 мкг/мкл. Отдельно штамм 5-03 суспендируют в буфере Κ^Β8 (137 ммоль/л КС1. 2.7 ммоль/л №С1. 8.1 ммоль/л №-ьНР0+ 1.5 ммоль/л КН2Р04. 4.0 ммоль/л Μ§012). и получают плотность клеток 8х107 клеток/мл. После смешивания 200 мкл клеточной суспензии (1.6 х106 клеток) с 4 мкл (4 мкг) линейной плазмиды весь объем смеси клетки-ДНК переносят в кювету Оеше Ри1кег (межэлектродное расстояние 2 мм) (производимую ΒI0-ΚА^). и затем осуществляют электропорацию с использованием устройства для гибридизации Оеше Рикег (производимого ΒI0-ΚА^) при напряжении импульса 350 В и емкости 250 мкФ. После осуществления таким образом электропорации с использованием 30 кювет клеточную суспензию суспендируют в среде ΙΜΌΜ (производимой Бйе ТесНгю^щек) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (производимой Ьйе ТесΗπο1οβ^е8) и добавки НТ (производимой Ьйе ТесНм^щек) в концентрации 1х. и инокулируют в 30 чашек для адгезионных культур диаметром 10 см (производимых Еа^-). После культивирования при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% СО2 культуральные супернатанты удаляют. и добавляют по 10 мл среды ΙΜΌΜ (производимой БДе ТесΗηο1οд^е8) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 8IОΜА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой Ьйе ТесΗηο1οд^е8). После культивирования в течение 10 суток с повторением стадии замены среды с интервалами в 3-4 дня получают клеточные линии. невосприимчивые к пуромицину.
(2) Получение клеточных линий с введенным вектором. обеспечивающим локализацию.
Из невосприимчивых к пуромицину клеточных линий. полученных в разделе (1). получают произвольно 900 колоний так. как описано далее.
Сначала из 10-см чашки. в которой образовалась колония невосприимчивых к пуромицину клеточных линий. удаляют культуральный супернатант. и в чашку добавляют 7 мл фосфатного буфера. и затем чашку помещают под стереоскопический микроскоп. Затем каждую колонию соскребают. отсасывают с использованием Р1рейетап (производимой 0I^80N) и переносят в 96-луночный планшет с круглодонными лунками (производимый Еакюп). После обработки трипсином каждый клон инокулируют в 96луночный планшет с плоскодонными лунками для применения для адгезионных культур (производимый Гетак1 О1акк) и культивируют в течение 1 недели с использованием среды ΙΜΌΜ (производимой БДе ТесΗηο1οд^е8) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 8IОΜА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой Ьйе ТесΗπο1οβ^е8).
После культивирования каждый клон в планшете подвергают обработке трипсином и затем смешивают с двумя объемами среды для сушки вымораживанием (20% ДМСО. 40% сыворотки плода коровы. 40% ΙΜΌΜ). Половину смеси инокулируют в 96-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионных культур (производимый ΕνηΕί О1акк) как планшет-реплику. в то время как оставшуюся половину смеси подвергают криоконсервации как планшет-основу. Планшет-реплику культивируют в течение 1 недели с использованием среды ΙΜΌΜ (производимой Ьйе ТесΗηο1οд^е8) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 8IОΜА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой Ьйе ТесНи-юк^ек).
(3) Диагностика гомологичной рекомбинации геномной ПЦР.
Диагностику гомологичной рекомбинации в 900 клонах. полученных в разделе (2). осуществляют геномной ПЦР.
Сначала из планшета-реплики. полученного в разделе (2). получают геномную ДНК каждого клона согласно известному способу [Аша1Шса1 Β^οсΗет^8ΐ^у. 201. 331 (1992)] и растворяют в течение ночи в 30 мкл ТЕ-РНКазного буфера (рН 8.0) (10 ммоль/л трис-НС1. 1 ммоль/л ЭДТК. 200 мкг/мл РНКазы А). Также создают праймер (показанный в 8ΕΟ ΙΌ N0:26). связывающийся с последовательностью вне гомологичного участка. обеспечивающего локализацию вектора из геномного участка ЕИТ8. полученного в примере 12. и праймер (показанный в 8ΕΟ ΙΌ N0:27). связывающийся с последовательностью «хР в векторе.
С использованием ДНК-полимеразы НхТад (производимой Такага 8Ηиζο) получают 25 мкл реакционного раствора [буфер БхТац (производимый Такага 8Ηиζο). 0.2 ммоль/л бПТР и 0.5 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ΕΟ ΙΌ N0:26 и 27)]. содержащего 10 мкл раствора каждой полученной выше геномной ДНК. и осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 3 мин с последующими 38 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин. 60°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин как едином цикле.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 0.8% (мас./об.) агарозном геле. и специфически амплифицированный фрагмент примерно в 1.7 т.п.о.. содержащий пограничный участок между геномным участком клетки СН0 и гомологичным участком вектора. обеспечивающего локализацию. идентифицируют как положительный клон. Таким способом обнаруживают один положительный клон.
(4) Диагностика гомологочной рекомбинации геномным блоттингом по Саузерну.
Диагностику гомологочной рекомбинации в 1 клоне. положительный сигнал которого подтвержден в разделе (3). осуществляют геномным блоттингом по Саузерну.
Из планшетов-основ. криоконсервированных в разделе (2). отбирают 96-луночный планшет. содер
- 70 013563 жащий положительный клон, обнаруженный в разделе (3), и инкубируют при 37°С в течение 10 мин в атмосфере с 5% СО2. После инкубации клетки из лунки, соответствующей положительному клону, собирают и инокулируют в 24-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионной культуры (производимый Сгешег). После культивирования в течение 1 недели с использованием среды IМ^М (производимой Ь1£е Тес1по1од1ек) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 8ЮМА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой Ь1£е Тес1по1од1ек) клетки инокулируют в 6луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионной культуры (производимый Сгешег). Геномную ДНК получают из клона в планшете согласно известному способу [№с1ею Ас1бк Кекеагсй, 3, 2303 (1976)] и растворяют в течение ночи в 150 мкл ТЕ-РНКазного буфера (рН 8,0) (10 ммоль/л трисНС1, 1 ммоль/л ЭДТК, 200 мкг/мл РНКазы А).
В 120 мкл NЕВиΓΓе^ 3 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬк), растворяют 12 мкг полученной геномной ДНК, и к раствору добавляют 25 единиц рестриктазы РкП (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬк), и осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение ночи. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом, растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера (рН 8,0) (10 ммоль/л трис-НС1, 1 ммоль/л ЭДТК), и затем раствор подвергают электрофорезу в 0,8% (мас./об.) агарозном геле. После электрофореза геномную ДНК переносят на нейлоновую мембрану согласно известному способу [Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 76, 3683 (1979)]. По завершении переноса нейлоновую мембрану греют при 80°С в течение 2 ч.
Отдельно получают зонд, используемый при блоттинге по Саузерну, как описано далее. Сначала создают праймеры (8ЕЦ ГО NΟ:28 и 29), связывающиеся с последовательностью вне участка обеспечивающего локализацию вектора, гомологичного геномному участку РИТ8, полученного в примере 12. Затем с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага 81шхо) получают 20 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТас.| (производимый Такага 8йи7о), 0,2 ммоль/л 6ΝΕ₽ и 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕЦ ГО NΟ:28 и 29)], содержащего 4 нг плазмиды рРиТ8£дЕ2-2, полученной в примере 12(2), и осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 25 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 74°С в течение 1 мин как едином цикле. После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 1,75% (мас./об.) агарозном геле, и очищают зондовый фрагмент ДНК примерно в 230 п.о. Раствор полученного зондового фрагмента ДНК (5 мкл) метят радиоизотопом с использованием 1,75 МБк [о-32Р] бСТР и Медарпте ^NА ЬаЬеШпд 8ук!ет, бСТР (производимой Атегкйат РНагтааа Вю!есй).
Гибридизацию осуществляют следующим образом. Сначала нейлоновую мембрану помещают в герметично закрывающийся роллер-флакон, и осуществляют предварительную гибридизацию при 65°С в течение 3 ч, добавив 15 мл раствора для гибридизации [5х 88РЕ, 50х раствора Денхардта, 0,5% (мас./об.) 8Ό8, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося]. Затем зондовую ДНК, меченную 32Р, денатурируют нагреванием и помещают во флакон. Затем нейлоновую мембрану греют при 65°С в течение ночи.
После гибридизации нейлоновую мембрану смачивают в 50 мл 2х 88С-0,1% (мас./об.) 8Ό8 и греют при 65°С в течение 15 мин. После двукратного повторения стадии промывки мембрану смачивают в 50 мл 0,2х 88С-0,1% (мас./об.) 8Ό8 и греют при 65°С в течение 15 мин. После промывки нейлоновую мембрану помещают на рентгеновскую пленку при -80°С на двое суток для проявления.
Обработкой рестриктазой РкД из аллеля РИТ8 дикого типа получают фрагмент ДНК примерно в 4,4 т.п.о. С другой стороны, фрагмент ДНК примерно в 6,0 т.п.о. получают из аллеля, в котором образуется гомологичная рекомбинация с вектором, обеспечивающим локализацию.
Таким способом находят такие специфические фрагменты примерно в 4,4 т.п.о. и примерно в 6,0 т.п.о. из геномной ДНК положительного клона в разделе (3). Так как количественное соотношение фрагментов составляет 1:1, подтверждается, что клон представляет собой клон, в котором 1 копия аллеля РИТ8 разорвана. Далее такой клон называется штаммом 1к1.АРиТ8 2-46.
3. Делеция гена невосприимчивости к лекарственному средству из клеток СНО, в которых 1 копия гена о-1,6-фукозилтрансферазы (РИТ8) разрушена.
(1) Введение экспрессирующего вектора рекомбиназы Сге.
Экспрессирующий вектор рекомбиназы Сге рВ8185 (производимый Ь1£е Тес1по1од1ек) вводят в штамм 1к1.АРиТ8 2-46, полученный в разделе 2 данного примера.
Ген плазмиды рВ8185 вводят в штамм 1к1.АРиТ8 2-46, как описано далее согласно способу электропорации [Су1о1есйпо1оду, 3, 133 (1990)]. Сначала штамм 1к1.АРиТ8 2-46 суспендируют в буфере КРВ8 (137 ммоль/л КС1, 2,7 ммоль/л №С1, 8,1 ммоль/л №2НРО4, 1,5 ммоль/л КН2РО4, 4,0 ммоль/л МдС12), и получают плотность клеток 8х107 клеток/мл. После смешивания 200 мкл клеточной суспензии (1,6 х106 клеток) с 4 мкг плазмиды рВ8185 весь объем смеси клетки-ДНК переносят в кювету Сепе Ри1кег (межэлектродное расстояние 2 мм) (производимую ВЮ-КАЭ), и затем осуществляют перенос гена с использованием устройства для гибридизации Сепе Ри1кег (производимого ВЮ-КАЭ) при напряжении импульса 350 В и емкости 250 мкФ. После переноса гена клеточную суспензию суспендируют в 10 мл среды (производимой Ь1£е Тес1по1од1ек) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (производимой
- 71 013563
Ь1£е Тескпо1од1е5) и добавки НТ (производимой Ь1£е Тескпо1од1е5) в концентрации 1х, и затем разводят 20000 раз с использованием той же среды. Клетки инокулируют в 7 чашек для адгезионных культур диаметром 10 см (производимых Еа1соп) и культивируют при 37°С в течение 24 ч в атмосфере с 5% СО2. После культивирования культуральные супернатанты удаляют, и добавляют по 10 мл среды ГМЭМ (производимой ЬгГе Тескпо1од1е5) с добавлением 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЬгГе Тескпо1од1е5). Культивирование осуществляют в течение 10 суток с повторением замены среды с интервалами в 3-4 дня.
(2) Получение клеточных линий с введенным экспрессирующим вектором рекомбиназы Сге.
Из клеточной линии, полученной в разделе (1), получают произвольно 400 колоний так, как описано далее.
Сначала из 10-см чашки удаляют культуральный супернатант, и в чашку добавляют 7 мл фосфатного буфера, и затем чашку помещают под стереоскопический микроскоп. Затем каждую колонию соскребают, отсасывают с использованием Р1ре11етап (производимой С1Ь8ОН) и переносят в 96-луночный планшет с круглодонными лунками (производимый Еа1соп). После обработки трипсином каждый клон инокулируют в 96-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионных культур (производимый Ι\νη1<ί С1а§8) и культивируют в течение 1 недели с использованием среды ГМЭМ (производимой ЬгГе Тескпокэдхез) с добавлением 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЬгГе Тескпо1оё/е§).
После культивирования каждый клон в планшете подвергают обработке трипсином и затем смешивают с двумя объемами среды для сушки вымораживанием (20% ДМСО, 40% сыворотки плода коровы, 40% ГМЭМ). Половину смеси инокулируют в 96-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионных культур (производимый Ι\νη1<ί С1а§8), и получают планшет-реплику, в то время как оставшуюся половину смеси подвергают криоконсервации как планшет-основу.
Затем планшет-реплику культивируют в течение 6 суток с использованием среды ГМЭМ (производимой ЬгГе Тескпо1од1е5) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 81СМА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЬгГе Тескпо1од1е5). Положительный клон, из которого ген невосприимчивости к пуромицину, помещенный между последовательностями 1охР, удален экспрессией рекомбиназы Сге, погибает в присутствии пуромицина. Методом отбора обнаруживают 91 положительный клон.
(3) Диагностика удаления гена невосприимчивости к лекарственному средству геномным блоттингом по Саузерну.
Диагностику удаления гена невосприимчивости к лекарственному средству геномным блоттингом по Саузерну осуществляют для 6 произвольных клонов из числа положительных клонов, обнаруженных в разделе (2).
Из планшетов-основ, криоконсервированных в разделе (2), отбирают 96-луночные планшеты, содержащие 6 положительных клонов и инкубируют при 37°С в течение 10 мин в атмосфере с 5% СО2. После инкубации клетки из лунок, соответствующих каждому положительному клону, собирают и инокулируют в 24-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионной культуры (производимый Сгетег). После культивирования в течение 1 недели с использованием среды ГМЭМ (производимой ЬгГе Тескпокэдхез) с добавлением 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой ЬгГе Тескпо1од1е§) клетки инокулируют в 6-луночный планшет с плоскодонными лунками для адгезионной культуры (производимый Сгетег). Геномную ДНК получают из каждого клона в планшете согласно известному способу [№с1ею Ас1б8 Яезеагск, 3, 2303 (1976)] и растворяют в течение ночи в 150 мкл ТЕ-РНКазного буфера (рН 8,0) (10 ммоль/л трис-НС1, 1 ммоль/л ЭДТК, 200 мкг/мл РНКазы А).
В 120 мкл ИЕВийег для ВатН1 (производимого №\ν Епд1апб Вю1аЬ§) растворяют 12 мкг полученной геномной ДНК, и к раствору добавляют 20 единиц рестриктазы ВатН1 (производимой №\ν Епд1апб Вю1аЬ§), и затем осуществляют реакцию расщепления при 37°С в течение ночи. Фрагмент ДНК извлекают из реакционного раствора осаждением этанолом, растворяют в 20 мкл ТЕ-буфера (рН 8,0) (10 ммоль/л трис-НС1, 1 ммоль/л ЭДТК), и затем раствор подвергают электрофорезу в 0,4% (мас./об.) агарозном геле. После электрофореза геномную ДНК переносят на нейлоновую мембрану согласно известному способу [Ргос. №11. Асаб. 8сг И8А, 76, 3683 (1979)]. По завершении переноса нейлоновую мембрану греют при 80°С в течение 2 ч.
С другой стороны, получают зонд, используемый при блоттинге по Саузерну, как описано далее. Сначала создают праймеры (8ЕО ΙΌ NΟ:30 и 31), связывающиеся с последовательностью вне участка обеспечивающего локализацию вектора, гомологичного геномному участку ЕИТ8, полученного в примере 12. Затем осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием ДНК-полимеразы Е.хТас.| (производимой Такага 8ки/о), приготовив 20 мкл реакционного раствора [буфер Е.хТас.| (производимый Такага 8кц/о), 0,2 ммоль/л бNТР и 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров (8ЕО ΙΌ NΟ:30 и 31)], содержащего 4 нг плазмиды рЕИТ8£дЕ2-2, полученной в примере 12(2). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 1 мин с последующими 25 циклами нагревания при 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 74°С в течение 1 мин как едином цикле. После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 1,75% (мас./об.) агарозном геле, и очищают зондовый фрагмент ДНК примерно в
- 72 013563
230 п.о. Часть полученного раствора зондовой ДНК (5 мкл) метят радиоизотопом с использованием 1,75 МБк [α-32Γ] бСТГ и Μедаρ^^те ЭКА ЬаЬе11шд 8ук!ет, бСГТ (производимой Атегкйат Ρΐιηηηηαη Β^οίесй).
Гибридизацию осуществляют следующим образом. Сначала нейлоновую мембрану помещают в роллер-флакон, и осуществляют предварительную гибридизацию при 65°С в течение 3 ч, добавив 15 мл раствора для гибридизации [5х 88ΡΕ, 50х раствора Денхардта, 0,5% (мас./об.) 8Ό8, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося]. Затем зондовую ДНК, меченную 32Ρ, денатурируют нагреванием и помещают во флакон, и нейлоновую мембрану греют при 65°С в течение ночи.
После гибридизации нейлоновую мембрану смачивают в 50 мл 2х 88С-0,1% (мас./об.) 8Ό8 и греют при 65°С в течение 15 мин. После двукратного повторения стадии промывки мембрану смачивают в 50 мл 0,2х 88С-0,1% (мас./об.) 8Ό8 и греют при 65°С в течение 15 мин. После промывки нейлоновую мембрану помещают на рентгеновскую пленку при -80°С на двое суток для проявления.
Обработкой рестриктазой ΒатΗI из аллеля РυΤ8 дикого типа получают фрагмент ДНК примерно в 19,0 т.п.о. Также фрагмент ДНК примерно в 12,5 т.п.о. получают из аллеля, в котором образуется гомологичная рекомбинация с вектором, обеспечивающим локализацию. Кроме того, когда ген невосприимчивости к пуромицину (примерно 1,5 т.п.о.) удален из аллеля, в котором образуется гомологичная рекомбинация, при той же обработке образуется фрагмент ДНК примерно в 11,0 т.п.о.
Таким способом находят такие специфические фрагменты примерно в 19,0 т.п.о. и примерно в 11,0 т.п. о. из геномной ДНК 5 клонов из 6. Так как количественное соотношение указанных фрагментов составляет 1:1, подтверждается, что ген невосприимчивости к пуромицину удален из клеточных линий, в которых 1 копия геномного участка РυΤ8 разорвана. Далее один из таких клонов называется 1κί.ΔΓυΤ8 2-46-1. Результаты геномного блоттинга по Саузерну штамма 18ΐ.ΔΡ'υΤ8 2-46-1, 18ΐ.ΔΡ'υΤ8 2-46 и 5-03 также показаны на фиг. 41. Также штамм 1кί.ΔРυΤ8 2-46-1 под названием 2-46-1 депонирован 26 сентября 2001 г. как РЕКΜ ΒΡ-7755 в ΙηΝΓη;·ιΙίη;·ι1 Ρаίеηί 0гдашкт ^еροк^ίа^у, №11юг1а1 ΙηκΙίΙιιΝ οΓ Абνаηсеб Ιηбик!па1 8с1ег1се апб Τесйηο1οду ^ΙδΤ Τκιιίαιόη Сеηί^а1 6, 1-1, Н1дакЫ 1-СНоте ^и^Ьа-кЫ, IЬа^ак^-кеη 3058566 Γιρ;·ιη).
4. Очистка антител, продуцированных клеточной линий с разорванным геном α-1,6фукозилтрансферазы (РОТ8).
1кί.ΔРυΤ8 2-46-1, полученный в разделе 3 данного примера разрывом одной копии аллеля РТО^, суспендируют в среде ΙΜΌΜ (производимой Ь1Ге ΤесЬηο1οд^ек) с добавлением 15 мкг/мл пуромицина (производимого 8IΟΜА) и 10% диализованной сыворотки плода коровы (производимой Ь1Ге ΤесЬηο1ο§1ек), получают плотность клеток 2х105 клеток/мл, и затем 60 мл всей суспензии инокулируют в 2 колбы Т182 для адгезионного культивирования клеток (производимые Οκί^τ). После культивирования в течение 3 суток супернатант отбрасывают и заменяют в целом на 60 мл среды ЕХСЕЬЬ301 (производимой ЖН Βίοκ^ι^κ).
После культивирования при 37°С в течение 7 суток в инкубаторе с 5% СО2 подсчитывают число интактных клеток, и подтверждается, что их жизнеспособность почти одинаковая (у всех 30% или менее), и затем извлекают все клеточные суспензии. Клеточную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин при 4°С в течение 10 мин, и извлеченный супернатант центрифугируют при 10000 об/мин при 4°С в течение 1 ч и затем фильтруют с использованием блока для фильтрации ΡΕ8 (производимого НАГ-бЕНЕ) емкостью 150 мл с диаметром пор 0,22 мкм.
В колонку диаметром 0,8 см помещают Ρτο^ρ^ Η^дйСаρас^ίу (производит Ь^οΡКΟСЕ88INС) на высоту 2 см и промывают 10 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,0) и 10 мл буфера 1 моль/л глицин/Ыа0Н-0,15 моль/л №1С1 (рН 8,6) для того, чтобы уравновесить носитель. Затем через такую колонку пропускают 100 мл каждого культурального супернатанта и промывают 50 мл буфера 1 моль/л глицин/Ыа0Н-0,15 моль/л №С1 (рН 8,6). После промывки элюируют антитела, адсорбированные на Ρ^οкеρ-Λ, с использованием 2,5 мл 0,1 моль/л цитратного буфера (рН 3,0), элюат фракционируют на фракции по 500 мкл, и каждую фракцию нейтрализуют, смешивая ее со 100 мкл 2 моль/л трис-НС1 (рН 8,5). Две фракции, содержащие антитела в высокой концентрации (всего 1,2 мл), отбирают ВСАспособом [Апз1. ΒίοΟκιη., 150, 76 (1985)], объединяют и затем диализуют против буфера (10 моль/л цитрата)-0,15 моль/л №1С1 (рН 6,0) при 4°С в течение суток. После диализа раствор антител извлекают и подвергают стерилизации фильтрованием с использованием фильтра с размером пор 0,22 мкм Μί1Κ.\ Ον (производимого ΜΙΓΓΙΡ0ΡΓ).
5. Цитотоксическая активность (АОСС-активность) ίη νίίτο антител, продуцированных клеточной линией с разорванным геном α-1,6-фукозилтрансферазы (ΕυΤ8).
Для того чтобы оценить ίη νίίτο цитотоксическую активность антител, полученных в чистом виде в разделе 4 данного примера, измеряют АОСС-активность с использованием ССК4-положительной клеточной линии ССВ4/ЕЕ-4, описанной в примере 8.
Клетки ССК4/ЕЕ-4, субкультивированные в среде ΚΡΜΙ1640 (производимой Ь1Ге ΤесЬηο1οд^ек), содержащей 10% сыворотки плода коровы (производимой ЫГе ΤесЬηο1οд^ек) (называемой далее ΒΡΜI1640-РΒ8(10)), суспендируют в 500 мкл КΡΜΗ640-РΒ8(10) при плотности 1 х 106 клеток, и добав
- 73 013563 ляют к ним 3,7 МБк №2 51СгО4, и затем культивируют при 37°С в течение 90 мин для мечения клеток радиоизотопом. После центрифугирования при 1200 об/мин в течение 5 мин супернатант отбрасывают, и клетки-мишени суспендируют в 5 мл среды ВΡΜI1640-РΒδ(10). Повторяют три раза стадию промывки, и затем клеточную суспензию инкубируют в течение 30 мин на льду для спонтанного отделения радиоактивного вещества. Снова дважды повторяют стадию промывки, и затем клетки суспендируют в 5 мл среды ВΡΜI1640-РΒδ(10), и посредством этого получают суспензию клеток-мишеней 2х 105 клеток/мл.
Отдельно у здорового человека берут 30 мл периферической крови, осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого δΐιίιηίζιι ΡЕа^тасеиΐ^са1) и затем смешивают с 30 мл физиологического раствора (производимого О(Бика ΡЕа^тасеиΐ^са1). После их смешивания 10 мл смеси осторожно нагружают на 4 мл ЬутрЕоргер (производит ИУСОМЕП ΡНЛВΜЛ Лδ) и центрифугируют при комнатной температуре при 2000 об/мин в течение 30 мин. Отделившиеся фракции одноядерных клеток собирают из центрифужных пробирок, объединяют и затем суспендируют в 30 мл ΚΡΜI1640-РΒδ(10). После центрифугирования при комнатной температуре при 1200 об/мин в течение 15 мин супернатант отбрасывают, и клетки суспендируют в 20 мл ΚΡΜI1640-РΒδ(10). Дважды повторяют стадию промывки, и затем с использованием ВΡΜI1640-РΒδ (10) получают суспензию эффекторных клеток плотностью 2,5х106 клеток/мл.
Суспензию клеток-мишеней распределяют по 50 мкл (1х104 клеток/лунку) в каждую лунку 96луночного планшета с υ-образными лунками (производимого Ра1соп). Затем в каждую лунку добавляют 100 мкл суспензии эффекторных клеток (2,5х105 клеток/лунку), и посредством этого доводят отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням до 25:1. Затем с использованием ΚΡΜI1640-РΒδ(10) получают ряд разведенных растворов - 0,01, 0,1, 1 и 10 мкг/мл - каждого из антител против ССВ4, полученных в разделе 5 примера 13, и по 50 мкл разведенных растворов добавляют в лунки, получая конечные концентрации 0,0025, 0,025, 0,25 и 2,5 мкг/мл соответственно. После осуществления взаимодействия при 37°С в течение 4 ч в атмосфере с 5% СО2 планшет центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин. Переносят 75 мкл супернатанта из каждой лунки в пробирку для В1Л диаметром 12 мм (производимую Г^ЛКГ), и измеряют количество отделившегося 51Сг с использованием автоматического счетчика гамма-квантов МГЫЛХ-γ 5550 (производимого ΡЛСКАВ^).
Также вычисляют количество спонтанно отделившегося 51Сг, осуществляя такое же взаимодействие в реакционной смеси, в которую вместо суспензии эффекторных клеток и раствора антител добавляют 150 мкл ВΡΜI1640-РΒδ(10). Количество общего отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя такое же взаимодействие в реакционной смеси, в которую вместо суспензии эффекторных клеток и раствора антител добавляют 100 мкл 1н. соляной кислоты и 50 мкл ВΡΜI1640-РΒδ(10). С использованием полученных величин вычисляют ЛОСС-активность на основании уравнения (II).
Фиг. 42 показывает ЛОСС-активность каждого вида антител против ССВ4. Антитела, полученные из штамма 1Бΐ.ΔРυТ8 2-46-1, в котором 1 копия аллеля ЕТЬ8 разорвана, демонстрируют значительно более сильную ЛПСС-активность, чем антитела, продуцированные штаммом 5-03, представляющим собой клеточную линию СНО до разрыва гена. Также не отмечают изменений в антигенсвязывающей активности указанных антител. Такие результаты подтверждают, что ЛОСС-активность полученных антител можно улучшить путем разрыва аллеля ЕТЬ8 в клетках-хозяевах.
Пример 14. Получение клеток СНО/ЭС44, невосприимчивых к лектину, и получение антител с использованием таких клеток.
(1) Получение клеток СНО/ЭС44, невосприимчивых к лектину.
Клетки СНО/ЭС44 выращивают до тех пор, пока они не достигнут стадии, непосредственно предшествующей слиянию, культивируя их на 75-см2 матрасе для адгезионных культур (производимом Сгешег) с использованием среды IΜ^Μ-РΒδ(10) [среда 1МОМ, содержащая 10% сыворотки плода коровы (РΒδ) и добавки НТ (производимой С1ВСО ВКЕ) в концентрации 1х]. После промывки клеток 5 мл ΡΒδ по Дульбекко (производимым [пуЦгодеп) к ним добавляют 1,5 мл 0,05% трипсина (производимого 1№Йгодеп), разбавленного ΡΒδ по Дульбекко, и инкубируют при 37°С в течение 5 мин для отделения клеток от дна матраса.
Отделившиеся клетки извлекают операцией центрифугирования, обычно используемой при культивировании клеток, и суспендируют в среде IΜ^Μ-РΒδ(10), получают плотность клеток 1х 105 клеток/мл, и затем к клеткам добавляют 0,1 мкг/мл алкилирующего агента №метил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидина (называемого далее МИИС, производит δίβαη), или его не добавляют. После инкубации при 37°С в течение 3 суток в инкубаторе с 5% СО2 (производимом ТЛВЛЦ культуральный супернатант отбрасывают, и клетки снова промывают, отслаивают и извлекают теми же операциями, суспендируют в среде IΜ^Μ-РΒδ(10) и затем инокулируют в 96-луночный культуральный планшет для адгезионных культур (производимый [ХУЛЮ С1аББ), и получают плотность клеток 1000 клеток/лунку. В каждую лунку добавляют, в конечной концентрации в среде, 1 мг/мл агглютинина ЬепБ си1тапБ (далее называется ЬСЛ, производится Уес!ог), 1 мг/мл агглютинина Л1еипа аигапЕа (лектин Л1еипа аигапДа; далее называется ЛЛЬ, производится Уес!ог) или 1 мг/мл агглютинина фасоли обыкновенной (лейкоагглютинин ΡЕаБео1иБ уи1даг1Б; далее называется ^-ΡНЛ, производится Уес!ог). После культивирования при 37°С в течение
- 74 013563 недель в инкубаторе с 5% СО2 получают видимые колонии как невосприимчивые к лектину СНО/Э044. Что касается полученных СНО/Э044, то ЬСА-устойчивую клеточную линию называют СНО-ЬСА, ААЬ-устойчивую клеточную линию называют СНО-ААЬ, и Ь-БНА-устойчивую клеточную линию называют СНО-ГНА. Когда проверяют невосприимчивость указанных клеточных линий к различным видам лектина, обнаруживается, что СНО-ЬСА невосприимчива также к ААЬ, а СНО-ААЬ невосприимчива также к ЬСА. Кроме того, СНО-ЬСА и СНО-ААЬ также показывают невосприимчивость к лектину, узнающему структуру углеводной цепи, идентичную структуре углеводной цепи, узнаваемой ЬСА и ААЬ, а именно лектину, узнающему структуру углеводной цепи, в которой положение 1 фукозы связано с положением 6 остатка Ν-ацетилглюкозамина на редуцирующем конце через α-связь в углеводной цепи, присоединенной через Ν-гликозидную связь. Конкретно, обнаружено, что СНО-ЬСА и СНОААЬ могут демонстрировать невосприимчивость и выживание даже в среде с добавлением 1 мг/мл, в конечной концентрации, агглютинина гороха (агглютинин Ρίδΐιιη зайуит; далее называется ΡδΛ, производится Vесΐо^). Кроме того, даже когда алкилирующий агент ΜΝΝ0 не добавляют, возможно получение клеточных линий, невосприимчивых к лектину, увеличением числа обрабатываемых клеток. Далее указанные клеточные линии используют при анализах.
(2) Получение клеток, продуцирующих человеческие химерные антитела против ССВ4.
Экспрессирующую плазмиду для человеческих химерных антител против ССВ4 рКАNТЕX2160 вводят в три клеточные линии, невосприимчивые к лектину, полученные в (1), способом, описанным в примере 8, осуществляют амплификацию гена с помощью лекарственного средства ΜТX, и получают клеточную линию, продуцирующую человеческие химерные антитела против ССВ4. Измеряя количество синтезированных антител методом ЕЫЗА, описанным в примере 8-2, из каждой линии СНО-ЬСА, СНОААЬ и СНО-₽НА получают трансформанты, экспрессирующие антитела. Что касается каждого полученного трансформанта, то трансформант, полученный из СНО-ЬСА, называют СНО/ССВ4-БСА, трансформант, полученный из СНО-ААБ, называют СНΟ/ССВ4-АΛ^, и трансформант, полученный из СНОСНА, называют СНΟ/ССВ4-ΡНА. Также СНО/ССВ4-БСА под названием Хеда-13 депонирован 26 сентября 2001 г. как ЕЕΚΜ ВР-7756 в !п1егпа(1па1 Ρаΐеηΐ Огдашзт Оерозйагу, №1Нопа1 [п8111и1е о£ Абуапсеб [пбиз1па1 Заепсе апб Тес1по1оду (АКТ ТзикиЬа Сеп1га1 6, 1-1, ШдазЫ 1-СИоте ТзикиЬа-зЫ, КагакЕкеп 3058566 1арап).
(3) Продуцирование антител с сильной АОСС-активностью клетками СНО, невосприимчивыми к лектину.
С использованием трех трансформантов, полученных в (2), получают очищенные антитела с использованием способа, описанного в примере 8-3. Антигенсвязывающую активность каждого типа очищенных человеческих химерных антител против ССВ4 оценивают с использованием ЕЬКА, описанного в примере 8-2. Антитела, продуцированные всеми трансформантами, показывают антигенсвязывающую активность, подобную активности антител, продуцированных рекомбинантной клеточной линией (штамм 5-03), полученной в примере 8 с использованием обычных клеток СНО/Э044 в качестве хозяев. С использованием таких очищенных антител АОСС-активность каждого типа человеческих химерных антител против ССВ4 оценивают согласно способу, описанному в примере 8-7. Результаты приводятся на фиг. 43. При сравнении с антителами, продуцированными штаммом 5-03, в антителах, продуцированных СНО/ССВ4-БСА и СНΟ/ССВ4-АΛ^, наблюдают АЭСС-активность выше примерно в 100 раз. С другой стороны, не отмечают существенного повышения АОСС-активности в антителах, продуцированных СНО/ССВ4ФНА. Также, когда АЭСС-активности антител, продуцированных СНО/ССВ4-БСА и УВ2/0 сравнивают согласно способу, описанному в примере 8-7, обнаруживают, что антитела, продуцированные СНО/ССВ4-БСА, показывают более сильную АОСС-активность, чем антитела, продуцированные 5-03, подобно случаю с антителами ΚΜ2760-1, продуцированными клеточной линией УВ2/0, полученными в примере 8-1 (фиг. 44).
(4) Анализ углеводных цепей антител, продуцированных клетками СНО, невосприимчивыми к лек тину.
Анализируют углеводные цепи человеческих химерных антител против ССВ4, очищенных в (3). Раствор очищенных антител каждого типа обменивают на 10 мМ раствор КН2ΡΟ4 с использованием Ь11га Егее 0,5-10К (производимого Μ^Шро^е). Обмен осуществляют таким способом, что коэффициент обмена становится 80 крат или больше. Концентрацию антител после обмена раствора измеряют с использованием υν-1600 (производимого ЗЫтабхи). Коэффициент молярного поглощения вычисляют из аминокислотной последовательности каждого антитела на основании приведенного далее уравнения (ΙΙΙ) [Абуапсез ш ΡΐΌΚίπ СйетИйу, 12, 303 (1962)], и определяют концентрацию, принимая поглощение при 280 нм за 1,38 мг/мл.
Е1 моль/л=Ахп1+Вхп2+Схп3 (ΙΙΙ)
Е1 моль/мл Е1 моль/л/Μ^;
Е1 моль/л - коэффициент поглощения при 280 нм (мг-1-мл-см-1);
Е1 моль/мл - коэффициент молярного поглощения при 280 нм (Μ^-см-1);
А - коэффициент молярного поглощения триптофана при 280 нм=5550 (Μ^-см-1);
- 75 013563
В - коэффициент молярного поглощения тирозина при 280 нм=1340 (М-1-см-1);
С - коэффициент молярного поглощения цистина при 280 нм=200 (М-1-см-1);
п1 - число триптофана на 1 молекулу антитела;
п2 - число тирозина на 1 молекулу антитела;
п3 - число цистина на 1 молекулу антитела;
- молекулярная масса антитела (г/моль).
В пробирку Нубгас1иЬ Е-204 помещают 100 мкг каждого антитела и сушат с использованием центробежного испарителя.
Высушенный образец в пробирке подвергают гидразинолизу с использованием Нубгас1иЬ. производимого НоНпсп. Образец вводят во взаимодействие с гидразином при 110°С в течение 1 ч с использованием реагента гидразинолиза. производимого НоНпсп [Мс!Ноб оГ Епхуто1оду. 83. 263 (1982)]. По завершении реакции гидразин выпаривают при пониженном давлении. и в пробирке восстанавливают комнатную температуру. оставляя ее на 30 мин. Затем добавляют 250 мкл агента ацетилирования. производимого НоНпсп. и 25 мкл уксусного ангидрида. и затем все тщательно перемешивают для взаимодействия при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем добавляют еще 250 мкл агента ацетилирования и 25 мкл уксусного ангидрида. и затем тщательно перемешивают для взаимодействия при комнатной температуре в течение 1 ч. Образец замораживают при -80°С в лиофильной сушилке и проводят сушку вымораживанием в течение примерно 17 ч. Углеводные цепи извлекают из лиофилизованного образца с использованием набора Сс11и1о8с Сайпбде 61усап Ргерагайоп. производимого Такага ЕНихо Со.. Ь!б. Раствор образца углеводной цепи сушат с использованием центробежного испарителя и затем подвергают флуоресцентному мечению 2-аминопиридином [I. ВюсНст.. 95. 197 (1984)]. Раствор 2-аминопиридина получают. добавляя 760 мкл НС1 на 1 г 2-аминопиридина (раствор 1хРА) и разбавляя раствор в 10 раз водой. очищенной обратным осмосом (10-кратно разведенный раствор РА). Получают раствор цианоборогидрида натрия. добавляя 20 мкл раствора 1х РА и 430 мкл воды. очищенной обратным осмосом. на 10 г цианоборогидрида натрия. К образцу добавляют 67 мкл 10-кратно разведенного раствора РА. и затем осуществляют взаимодействие при 100°С в течение 15 мин. реакционная смесь охлаждается спонтанно. и затем к ней добавляют еще 2 мкл раствора цианоборогидрида натрия. и затем осуществляют взаимодействие при 90°С в течение 12 ч для флуоресцентного мечения образца углеводных цепей. Группу углеводных цепей с флуоресцентной меткой (РА-обработанная группа углеводных цепей) отделяют от избытка реагента с использованием колонки с Еирсгбсх Рерйбе НК 10/30 (производимым РНагтас1а). Данную стадию осуществляют с использованием 10 мМ раствора бикарбоната аммония как элюента при скорости потока 0.5 мл/мин и при температуре колонки. равной комнатной температуре. и с использованием детектора флуоресценции с длиной волны возбуждения 320 нм и длиной волны флуоресценции 400 нм. Элюат извлекают через 20-30 мин после добавления образца и сушат с использованием центробежного испарителя. и используют как очищенные РА-обработанные углеводные цепи. Затем осуществляют анализ очищенных РА-обработанных углеводных цепей методом ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием колонки с СЬС-ООЕ (производимым ЕНипабхи. 06.0 нмх159 нм). Данную стадию осуществляют при температуре колонки 55°С и скорости потока 1 мл/мин с использованием детектора флуоресценции с длиной волны возбуждения 320 нм и длиной волны флуоресценции 400 нм. Колонку уравновешивают 10 мМ натрийфосфатным буфером (рН 3.8). и осуществляют элюирование в течение 80 мин 0.5% 1-бутанолом с линейным градиентом плотности. Каждую РА-обработанную углеводную цепь идентифицируют анализом после затухания источника каждого пика выделенных РА-обработанных углеводных цепей с использованием времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с участием матрицы (анализ методом МА^^I-ТОР-МЕ). сравнивая позиции элюирования с эталонами РА-обработанных углеводных цепей. производимыми Такага ЕНихо. и анализом ВЭЖХ с обращенной фазой после расщепления каждой РА-обработанной углеводной цепи с использованием различных ферментов (фиг. 45). Содержание каждой углеводной цепи вычисляют по площади пика РА-обработанной углеводной цепи при анализе методом ВЭЖХ с обращенной фазой. РА-обработанные углеводные цепи. чьи редуцирующие концы не являются Ν-ацетилглюкозамином. исключают из вычисления площади пика. поскольку они являются примесями или побочными продуктами при получении РА-обработанных углеводных цепей.
Анализ осуществляют так же. как в примере 11(6). с использованием натрийфосфатного буфера (рН 3.8) как буфера А и натрийфосфатного буфера (рН 3.8)+0.5% 1-бутанола как буфера В.
На фиг. 45 вычислены доля группы углеводных цепей без а-1.6-фукозы из площади. занимаемой пиками (ί)-(ίν) из числа пиков (ί)-(νίίί) и доля группы углеводных цепей. связанных с а-1.6-фукозой. из площади. занимаемой пиками (ν)-(νίίί) из числа пиков (ί)-(νίίί).
Результаты анализа структуры углеводных цепей очищенных человеческих химерных антител против ССК4. продуцированных клеточными линиями. невосприимчивыми к лектину. приводятся в табл. 6. Результаты показывают анализ углеводных цепей очищенных человеческих химерных антител против ССК4. продуцированных клеточными линиями. невосприимчивыми к лектину. В таблице показана доля углеводных цепей без а-1.6-фукозы (%). вычисленная из площадей пиков путем анализа по способу. описанному в примере б(4).
- 76 013563
Таблица 6
Клетки, продуцирующие антитела Сложные двухцепочечные углеводные цепи без а-1,6-фукозы (%)
Штамм 5-03 9
Штамм СНО/ССК4-ЦСА 48
Штамм СНО/ССК4-ААЦ 27
Штамм СНО/ССК4-РНА 8
При сравнении с антителами, продуцированными штаммом 5-03, доля углеводных цепей без α-1,6фукозы повышается с 9 до 48% в антителах, продуцированных СНО/ССЯ4-ЬСА, при вычислении по площади анализируемых пиков. Доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы повышается с 9 до 27% в антителах, продуцированных СНО/ССЯ4-ААЬ. С другой стороны, изменения в характере углеводных цепей и доле углеводных цепей без α-1,6-фукозы в клеточной линии, невосприимчивой к РНА, при сравнении со штаммом 5-03 обнаруживаются с трудом.
Пример 15. Анализ клеточной линии СНО, невосприимчивой к лектину.
1. Анализ уровня экспрессии фермента СМЭ в клеточной линии СНО/ССЯ4-ЬСА, продуцирующей человеческие химерные антитела против ССЯ4.
Уровень экспрессии каждого из генов СМЭ (СПР-маннозо-4,6-дегидратазы), СЕРР (СЭР-кето-6дезоксиманнозо-3,5-эпимеразы,4-редуктазы) и ЕХ (СПР-бета-Е-фукозопирофосфорилазы), известных как ферменты биосинтеза фукозы, и ЕИТ8 (α-1,6-фукозилтрансферазы) как фукозотрансферазы в клеточной линии СНО/ССЯ4-ЬСА, продуцирующей человеческие химерные антитела против ССЯ4, полученной в примере 14, анализируют с использованием метода ЯТ-РСЯ.
(1) Получение РНК из различных клеточных линий.
Каждый вид клеток СНО/ЭС44, клеточную линию 5-03, полученную в примере 8-1(2), и клеточную линию СНО/ССЯ4-ЬСА, продуцирующую человеческие химерные антитела против ССЯ4, полученную в примере 14(2), субкультивируют при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 и затем культивируют в течение 4 суток. После культивирования из 1 х 107 клеток каждой клеточной линии получают полную РНК с использованием набора ЯЫеазу Рго1ес1 М1ш (производимого ^ГАСЕN) согласно инструкциям изготовителя. Затем синтезируют одноцепочечную кДНК из 5 мкг каждой РНК в 20 мкл реакционного раствора с использованием системы для синтеза первой цепи 8ИРЕЯ 8СКТРТ для ЯТ-РСЯ (производимой СГОСО ВКЬ) согласно инструкциям изготовителя.
(2) Анализ уровня экспрессии гена СМЭ с использованием ЯТ-РСЯ.
Для того чтобы амплифицировать кДНК СМЭ методом РСЯ, на основе последовательности кДНК СМЭ, полученной из клеток СНО, показанной в примере 17-1, получают 24-мерный синтетический ДНК-праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕО ГО NО:32, и 26-мерный синтетический ДНК-праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е9 ГО NО:33.
Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер ЕхТац (производимый Такага 81нмо), 0,2 мМ йКГР, 0,5 единиц полимеразы ЕхТац (производимой Такага 81н^о) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8ЕО ГО NО:32 и 33], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из каждой клеточной линии в разделе (1), и осуществляют ПЦР с использованием ГЖА Тйегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После осуществления электрофореза в агарозном геле 10 мкл реакционного раствора ПЦР фрагменты ДНК окрашивают с использованием СуЬег Сгееп (производимого ВМА), и затем определяют количество фрагмента ДНК примерно в 350 п.о. с использованием Е1иог ^адет 8Ι (производимого Мо1еси1аг Пупаткх).
(3) Анализ уровня экспрессии гена СЕРР с использованием ЯТ-РСЯ.
Для того чтобы амплифицировать кДНК СЕРР методом ПЦР, на основе последовательности кДНК СЕРР, полученной из клеток СНО, показанной в примере 16-2, получают 27-мерный синтетический ДНК-праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕО ГО NО:34, и 23-мерный синтетический ДНК-праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8Е^ ГО NО:35.
Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер ЕхТац (производимый Такага 81нмо), 0,2 мМ йКГР, 0,5 единиц полимеразы ЕхТац (производимой Такага 81н^о) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8ЕО ГО NО:34 и 35], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из каждой клеточной линии в разделе (1), и осуществляют ПЦР с использованием ГЖА Тйегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 24 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После осуществления электрофореза в агарозном геле 10 мкл реакционного раствора ПЦР фрагменты ДНК окрашивают с использованием СуЬег Сгееп (производного ВМА), и затем определяют количество фрагмента ДНК примерно в 600 п.о. с использованием Е1иог ^адет 8Ι (производимого Мо1еси1аг Пупаткх).
(4) Анализ уровня экспрессии гена ЕХ с использованием ЯТ-РСЯ.
Для того чтобы амплифицировать кДНК ЕХ методом РСЯ, на основе последовательности кДНК ЕХ,
- 77 013563 полученной из клеток СН0. показанной в примере 16-1. получают 28-мерный синтетический ДНКпраймер с нуклеотидной последовательностью. показанной в 8НС) ГО N0:36. и 28-мерный синтетический ДНК-праймер с нуклеотидной последовательностью. показанной в 8ΕΟ ГО N0:37.
Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1 х буфер НхТас] (производимый Такага 8Ηиζο). 0.2 мМ бКГР. 0.5 единиц полимеразы НхТас] (производимой Такага 8Ηиζο) и 0.5 мкМ синтетических ДНКпраймеров 8ΕΟ ГО N0:36 и 8ΕΟ ГО N0:37]. содержащего в качестве матрицы 0.5 мкл одноцепочечной кДНК. полученной из каждой клеточной линии в разделе (1). и осуществляют ПЦР с использованием ^NА ТНегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Ε1те^) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 22 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После осуществления электрофореза в агарозном геле 10 мкл реакционного раствора ПЦР фрагменты ДНК окрашивают с использованием СуЬег Огееп (производимого ΒΜА). и затем определяют количество фрагмента ДНК примерно в 300 п.о. с использованием ΕίυοΓ Iтаде^ 8Ι (производимого Μοίесиίа^ Эупат1ск).
(5) Анализ уровня экспрессии гена ЕИТ8 с использованием КТ-РСК.
Для того чтобы амплифицировать кДНК ЕИТ8 методом ПЦР. получают 20 мкл реакционного раствора [1 х буфер НхТас] (производимый Такага 8Ηиζο). 0.2 мМ бКГР. 0.5 единиц полимеразы НхТас] (производимой Такага 8Ηиζο) и 0.5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8Ε9 ГО N0:13 и 14]. содержащего в качестве матрицы 0.5 мкл одноцепочечной кДНК. полученной из каждой клеточной линии в разделе (1). и осуществляют ПЦР с использованием ^NА ТНегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Είте^) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 20 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После осуществления электрофореза в агарозном геле 10 мкл реакционного раствора ПЦР фрагменты ДНК окрашивают с использованием СуЬег Огееп (производного ΒΜА). и затем определяют количество фрагмента ДНК примерно в 600 п.о. с использованием Τ1υοΓ Iтаде^ 8Ι (производимого Μοίесиίа^ Г)упат1ск).
(6) Анализ уровня экспрессии гена β-актина с использованием КТ-РСК.
Для того чтобы амплифицировать кДНК β-актина методом ПЦР. получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер НхТас] (производимый Такага 8Ηиζο). 0.2 мМ бОТР. 0.5 единиц полимеразы НхТас] (производимой Такага 8Ηиζο) и 0.5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8Ε9 ГО N0:15 и 16]. содержащего в качестве матрицы 0.5 мкл одноцепочечной кДНК. полученной из каждой клеточной линии в разделе (1) . и осуществляют ПЦР с использованием ^NА ТНегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Είте^) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 14 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После осуществления электрофореза в агарозном геле 10 мкл реакционного раствора ПЦР фрагменты ДНК окрашивают с использованием СуЬег Огееп (производимого ΒΜА). и затем определяют количество фрагмента ДНК примерно в 800 п.о. с использованием Τ1υοΓ ГОадет 8Ι (производимого Μοίесиίа^ Г)упат1ск).
(7) Уровни экспрессии генов ОΜ^. ОЕРР. ЕХ и ЕИТ8 в каждой клеточной линии.
Количество ПЦР-амплифицированного фрагмента каждого гена в штамме 5-03 и СН0/ССК4-ЙСА вычисляют путем деления величин. соответствующих количествам ПЦР-амплифицированных фрагментов. полученных из кДНК ОΜ^. ОЕРР. ЕХ и ЕИТ8 в каждой клеточной линии. определенных в разделах (2) -(6). на величину. соответствующую количеству ПЦР-амплифицированного фрагмента. полученного из кДНК β-актина в каждой клеточной линии. и принимая количество ПЦР-амплифицированных фрагментов в клетках СН0/ЭО44 за 1. Результаты приводятся в табл. 7.
Таблица 7
смо ОЕРР ЕХ ΕϋΤ8
Штамм СНО/ОС44 1 1 1 1
Штамм 5-03 1,107 0,793 1,093 0,901
Клетки СНО/ССК4-ЬСА, невосприимчивые к ЪСА, полученные из штамма 5-03 0,160 0,886 0,920 0,875
Как видно из табл. 7. уровень экспрессии гена в СН0/ССК4-ЙСА снижается до примерно 1/10 по сравнению с другими клеточными линиями. В данном случае осуществляют два независимых испытания. и используют средние величины.
2. Анализ с использованием продуцирующих человеческие химерные антитела против ССК4 СН0/ССК4-ЬСА. в которых усилена экспрессия ОΜ^.
(1) Конструирование экспрессирующего вектора рАОΕ249ОΜ^ для гена ОΜ^. полученного из клеток СН0.
На основе последовательности кДНК ОΜ^. полученной из клеток СН0 в примере 17-1. получают 28-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью. показанной в 8ΕΗ) ГО N0:38. и 29-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью. показанной в 8ΕΗ) ГО N0:39. Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1 х буфер НхТас] (производимый Такага 8Ηиζο). 0.2 мМ бКГР. 0.5 единиц полимеразы НхТас] (производимой Такага 8Ηиζο) и 0.5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8ΕΗ) ГО N0:38 и 39].
- 78 013563 содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК СМИ, полученной из СНО в разделе 1(1) данного примера, и осуществляют ПЦР с использованием ЭИА ТНеппа1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 8 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 58°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин как едином цикле, и затем 22 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. По завершении реакции реакционный раствор ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 600 п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент ДНК соединяют с вектором рТ7В1ие(Р) (производимым Nονадеη) с использованием набора ЭИА Ыдайоп (производимого Такага 8йц/о), и с использованием полученной рекомбинантной плазмиды трансформируют Е. сой ИН5а (производимую ТоуоЬо), и получают плазмиду т!-С (см. фиг. 46).
Затем на основе полученной из клеток СНО последовательности кДНК СМИ, полученной в примере 17-1, получают 45-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕО ГО NО:40, и 31-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, показанной в 8ЕО ГО NО:41. Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер Е.хТас.| (производимый Такага 8йц/о), 0,2 мМ б№ТР, 0,5 единиц полимеразы Е.хТас.| (производимой Такага 81шхо) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров 8ЕО ГО NО:40 и 41], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК СМИ, полученной из клеток СНО в разделе 1(1) данного примера, и осуществляют ПЦР с использованием ЭИА ТНеппа1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 8 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 57°С в течение 1 мин и 72°С в течение 1 мин как едином цикле, и затем 22 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. По завершении реакции реакционный раствор ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 150 п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент ДНК соединяют с вектором рТ7В1ие(Р) (производимым Nονадеη) с использованием набора ЭИА Ыдайоп (производимого Такага 8йц/о), и с использованием полученной рекомбинантной плазмиды трансформируют Е. сой ИН5а (производимую ТоуоЬо), и получают плазмиду АТС (см. фиг. 47).
Затем 3 мкг плазмиды СНО-СМИ, полученной в примере 17-1, вводят во взаимодействие с рестриктазой 8аЫ (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсοΡI (производимой Такага 811ихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат ДНК фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и извлекают фрагмент ДНК примерно в 900 п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Плазмиду т!-С (1,4 мкг) вводят во взаимодействие с рестриктазой 8ай (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсοΡI (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и извлекают фрагмент ДНК примерно в 3,1 т.п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные фрагменты ДНК лигируют с использованием набора ЭИА Ыдайоп (производимого Такага 8йц/о), и с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ИН5а, и получают плазмиду ν^Ν/-) (см. фиг. 48).
Затем 2 мкг плазмиды νΓ-Ν(-) вводят во взаимодействие с рестриктазой ВатШ (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсоР (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 1 т.п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Плазмиду рВ1иексйр! 8К(-) (3 мкг; производит 81га1адепе) вводят во взаимодействие с рестриктазой ВатШ (производимой Такага 811ихо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсοΡI (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и извлекают фрагмент ДНК примерно в 3 т.п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные фрагменты ДНК лигируют с использованием набора ЭИА Ыдайоп (производимого Такага 8йц/о), и с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ИН5а, и получают плазмиду νΓ-Ν (-) в РВ8 (см. фиг. 49).
Затем 2 мкг плазмиды ν^Ν^) в РВ8 вводят во взаимодействие с рестриктазой НтбШ (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсοΡI (производимой Такага 811ихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 4 т.п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Часть плазмиды АСТ (2 мкг) вводят во взаимодейст
- 79 013563 вие с рестриктазой НшбШ (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, ДНК извлекают, осуществляя экстракцию смесью фенол/хлороформ и осаждение этанолом, и вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсоИ (производимой Такага 81шхо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и извлекают фрагмент ДНК примерно в 150 п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные соответствующие фрагменты ДНК лигируют с использованием набора ΌΝΑ ЫдаДоп (производимого Такага 8кц7о), и с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. со11 ЭН5о, и получают плазмиду УТ в РВ8 (см. фиг. 50).
Затем 2 мкг плазмиды рАСЕ249 вводят во взаимодействие с рестриктазами НшбШ и ВатН1 (обе производятся Такага 811ихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 6,5 т.п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Плазмиду УТ (2 мкг) в РВ8 вводят во взаимодействие с рестриктазами НшбШ и ВатШ (обе производятся Такага 8Нихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и извлекают фрагмент ДНК примерно в 1,2 т.п.о. с использованием набора Сепе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные соответствующие фрагменты ДНК лигируют с использованием набора ΌΝΑ ЫдаДоп (производимого Такага 8кц7о), и с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. со11 ЭН5о, и получают плазмиду рАСЕ249СМЭ (см. фиг. 51).
(2) Устойчивая экспрессия гена СМЭ в СНО/ССК4-ьСа.
Экспрессирующий вектор рАСЕ249СМЭ (5 мкг) для гена СМЭ, полученного из клеток СНО, переводят в линейную форму расщеплением его рестриктазой Р^ (производимой NЕУ εΝ^Ε-ΑΝΩ ВЮЬАВ8) и вводят в 1,6х106 клеток СНО/ССК4-ЬСА электропорацией [Су1о1есЬпо1оду, 3, 133 (1990)]. Затем клетки суспендируют в 30 мкл среды IМ^М-бРВ8(10) [среда IМ^М (производимая СШСО ВКЬ) с добавлением 10% бРВ8], содержащей 200 нМ МТХ (производимого 8ЮМА), и культивируют с использованием 182-см2 матраса (производимого Сгешег) при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% СО2. После культивирования среду заменяют на среду IМ^М-бРВ8 (10), содержащую 0,5 мг/мл гигромицина и 200 нМ МТХ (производимого 8ЮМА), и затем культивируют в течение 19 суток, и получают колонии трансформантов, невосприимчивых к гигромицину.
Тем же способом в СНО/ССК4-ЬСА вводят вектор рАСЕ249, и получают колонии трансформантов, невосприимчивых к гигромицину.
(3) Культивирование СНО/ССК4-ЬСА с экспрессированным геном СМЭ и очистка антител.
С использованием среды IМ^М-бРВ8(10), содержащей 200 нМ МТХ (производимого 8ЮМА), культивируют трансформированные клетки, экспрессирующие СМЭ, с использованием 182-см2 матраса (производимого Сгешег) при 37°С в инкубаторе с 5% СО2. Через несколько суток, когда плотность клеток достигнет стадии слияния, культуральный супернатант отбрасывают, и клетки промывают 25 мл буфера РВ8 (производимого СШСО ВКЬ) и смешивают с 35 мл среды ЕХСЕЕЬ301 (производимой 1КН). После культивирования при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 в течение 7 суток культуральный супернатант извлекают. Химерные антитела против ССК4 очищают с использованием Ргокер-А (производимого М11йроге) согласно инструкциям изготовителя.
Тем же способом культивируют трансформированные клетки с введенным вектором рАСЕ249, и затем извлекают химерные антитела против ССК4, очищенные от культурального супернатанта.
(4) Измерение невосприимчивости к лектину в трансформированных клетках.
Трансформированные клетки, экспрессирующие СМЭ, полученные в разделе (2), суспендируют в среде IМ^М-бРВ8(10), содержащей 200 нМ МТХ (производимого 8ЮМА) и 0,5 мг/мл гигромицина, получают плотность клеток 6х104 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 96-луночного культурального планшета (производимого ΕνηΕί С1акк) по 50 мкл/лунку. Затем в планшет добавляют среду, полученную суспендированием ЬСА (агглютинин Ьепк сиНпапк; производится УесЮг ЬаЬога1опек) в концентрациях 0 мг/мл, 0,4 мг/мл, 1,6 мг/мл или 4 мг/мл в среде IМ^М-бРВ8(10), содержащей 200 нМ МТХ (производимого 8ЮМА) и 0,5 мг/мл гигромицина, по 50 мкл/лунку, и затем осуществляют культивирование при 37°С в течение 96 ч в инкубаторе с 5% СО2. После культивирования добавляют У8ТЧ (производится ВоеЬппдег) по 10 мкл/лунку и инкубируют при 37°С в течение 30 мин в инкубаторе с 5% СО2 для появления окраски, и затем измеряют поглощение при 450 нм и 595 нм (обозначаемое далее ОЭ450 и ОЭ595, соответственно). Таким же способом проводят измерения с трансформированными клетками с введенным вектором рАСЕ249. Осуществляют два независимых испытания.
Фиг. 52 показывает число выживших клеток в каждой лунке в процентах, когда величину, вычисленную вычитанием ОЭ595 из ОЭ450, измеренных выше, используют как число выживших клеток каждой группы клеток, и число выживших клеток в каждой лунке без ЬСА принимают за 100%. Как видно на фиг. 52, падение невосприимчивости к ЬСА отмечают в СНО/ССК4-ЬСА с экспрессированным СМЭ, и уровень выживаемости в присутствии 0,8 мг/мл ЬСА составляет примерно 20%. С другой стороны, в СНО/ССК4-ЬСА с введенным вектором рАСЕ249 уровень выживаемости в присутствии 0,2 мг/мл ЬСА составляет 100%, уровень выживаемости составляет 80% даже в присутствии 0,8 мг/мл ЬСА. На основа
- 80 013563 нии таких результатов предполагается, что уровень экспрессии гена СМБ в СН0/ССК4-ЬСА падает, и в результате получают невосприимчивость к ЬСА.
(5) Цитотоксическая активность (АБСС-активность) ш гйго химерных антител против ССК4, полученных из СН0/ССК4-ЬСА с экспрессированным СМБ.
Для того чтобы оценить ш гйго цитотоксическую активность очищенных химерных антител против ССК4, полученных в разделе (3), АБСС-активность измеряют согласно способам, описанным далее.
ί) Получение суспензии клеток-мишеней.
Добавляют эквивалент 3,7 МБк радиоактивного вещества Ш2 51Сг04 к 1х 106 клеткам ССК4/ЕЬ-4 (ср. пример 8-7), культивированным с использованием среды, полученной добавлением 500 мкг/мл сульфата С418 (производимого Шса1а1 Теэдие) к среде КРМЛ640-ЕВ8(10), и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 90 мин, посредством чего клетки метят радиоизотопом. По завершении реакции клетки три раза промывают, суспендируя их в среде КРМП640-ЕВ8(10) с последующим центрифугированием, ресуспендируют в среде и затем инкубируют при 4°С в течение 30 мин на льду для осуществления спонтанного отделения радиоактивного вещества. После центрифугирования клетки доводят до содержания 2х105 клеток/мл, добавляя 5 мл среды КРМП640-ЕВ8(10), и используют в качестве суспензии клеток-мишеней.
(ίί) Получение суспензии эффекторных клеток.
У здорового человека берут 50 мл венозной крови и осторожно смешивают с 0,5 мл гепариннатрия (производимого Такеба Рйагтасеийса1). С использованием Ьутрйоргер (производит Цгсотеб Рйагта А8) смесь центрифугируют согласно инструкциям изготовителя для отделения слоя одноядерных клеток. Клетки промывают трехкратным центрифугированием с использованием среды КРМП640-ЕВ8(10) и затем снова суспендируют в среде, получают суспензию с плотностью клеток 2х106 клеток/мл и используют в качестве суспензии эффекторных клеток.
(ίίί) Измерение АБСС-активности.
Суспензию клеток-мишеней, полученную в (ί), распределяют по 50 мкл (1х 104 клеток/лунку) в каждую лунку 96-луночного планшета с И-образными лунками (производимого Еа1соп). Затем в лунки добавляют 100 мкл суспензии эффекторных клеток, полученной в (ίί) (2х105 клеток/лунку, отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням составляет 25:1). Затем добавляют каждое из химерных антител против ССК4 (химерные антитела против ССК4, очищенные в разделе (3), и КМ2760-1 и КМ3060), получают конечную концентрацию от 0,0025 до 2,5 мкг/мл, и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 4 ч. По завершении реакции планшет центрифугируют, и измеряют количество 51Сг в супернатанте с использованием счетчика γ-квантов. Количество спонтанно отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя ту же процедуру с использованием одной среды вместо суспензии эффекторных клеток и раствора антител, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. Количество общего отделившегося 51Сг вычисляют, осуществляя ту же процедуру с использованием одной среды вместо раствора антител и добавляя 1н. соляную кислоту вместо суспензии эффекторных клеток, и измеряя количество 51Сг в супернатанте. АБСС-активность вычисляют на основании уравнения (II).
Результаты измерения АБСС-активности приводятся на фиг. 53. Как видно на фиг. 53, АБССактивность очищенных химерных антител против ССК4, полученных из СН0/ССК4-ЬСА с экспрессированным СМБ, снижается так же, как в случае КМ3060, полученных в примере 8. С другой стороны, АБСС-активность очищенных химерных антител против ССК4, полученных из СН0/ССК4-ЬСА с введенным вектором рАСЕ249, имеет уровень, подобный АБСС-активности очищенных химерных антител против ССК4, полученных из СН0/ССК4-ЬСА. На основании таких результатов предполагается, что уровень экспрессии гена СМБ в СН0/ССК4-ЬСА падает, и в результате можно получить антитела с сильной АБСС-активностью.
(6) Анализ углеводных цепей химерных антител против ССК4, полученных из СН0/ССК4-ЬСА с экспрессированным СМБ.
Углеводные цепи, связывающиеся с очищенными химерными антителами против ССК4, полученными в разделе (3), анализируют согласно способу, описанному в примере 14(4), и результаты анализа приводятся на фиг. 55. По сравнению с очищенными химерными антителами против ССК4, полученными из СН0/ССК4-ЬСА в примере 14, доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы в очищенных химерных антителах, полученных из СН0/ССК4-ЬСА с экспрессированным СМБ, снижается до 9% при вычислении из площади пиков. Таким образом, видно, что доля углеводных цепей без α-1,6-фукозы в антителах, продуцированных клетками, снижается до уровня, подобного уровню в антителах, продуцированных 503, за счет экспрессии гена СМБ в СН0/ССК4-ЬСА.
Пример 16. Получение различных генов, кодирующих ферменты, имеющие отношение в синтезу углеводных цепей в клетках СН0.
1. Определение последовательности кДНК ЕХ, полученной из клеток СН0.
(1) Экстрагирование полной РНК из клеток СН0/БС44.
Клетки СН0/БС44 суспендируют в среде IМ^М, содержащей 10% сыворотки плода коровы (производимой ЬгГе Тес11по1од1е5) и добавки НТ концентрации 1х (производимой ЫГе Тесйпо1од1е8), и 15 мл
- 81 013563 суспензии инокулируют в колбу Т75 для адгезионных культур (производимую Сгешег), и получают плотность клеток 2х105 клеток/лунку. На другой день после культивирования при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 1 х 107 клеток извлекают, и из них экстрагируют полную РНК с использованием ВНАеаБу (производится ОМСЕН) согласно инструкциям изготовителя.
(2) Получение полной одноцепочечной кДНК из клеток СНО/ОС44.
Полную РНК, полученную в (1), растворяют в 45 мкл стерильной воды, и к раствору добавляют 1 мкл КЦ1 ВЫаБе-Ргее Э№Бе (производимой Ρ^отеда), 5 мкл 10х прилагаемого буфера для ДНКазы и 0,5 мкл ингибитора рибонуклеазы ВЫаБШ (производимого Ρ^отеда), и затем осуществляют взаимодействие при 37°С в течение 30 мин для разрушения геномной ДНК, загрязняющей образец. По завершении реакции полную РНК очищают с использованием ВЫЛеаБу (производится рЫСЕН) и растворяют в 50 мкл стерильной воды.
В 20 мкл реакционной смеси с использованием в качестве праймера олиго(бТ) синтезируют одноцепочечную кДНК из 3 мкг образцов полученной полной РНК, осуществляя реакцию обратной транскрипции с использованием системы предварительной амплификации для синтеза первой цепи кДНК δυΡΕВδСВIΡТ™ (производимой ЫГе Тесйпо1од1еБ) согласно инструкциям изготовителя. При клонировании СРΡΡ и РХ используют 50-кратно разведенный водный раствор реакционного раствора. Его хранят до применения при -80°С.
(3) Получение неполного фрагмента кДНК РХ, полученной от китайского хомячка.
Неполный фрагмент кДНК РХ, полученной от китайского хомячка, получают следующей процедурой.
Сначала создают праймеры (показанные в δΕ^ ГО NО:42 и 43), специфические для обычных нуклеотидных последовательностей, зарегистрированных в доступной базе данных, а именно кДНК РХ человека (СеиΒаик, инвентарный № υ58766) и мышиной кДНК (СеиΒаик, инвентарный № М30127).
Затем получают 25 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТас.| (производимый Такага δЕиζо), 0,2 ммоль/л 6ΝΊΡ и 0,5 мкмоль/л генспецифических праймеров РЕЦ ГО NО:42 и 43)], содержащего 1 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из СНОГОС44, полученной в разделе (2), и осуществляют ПЦР с использованием ДНК-полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага δЕиζо). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 58°С в течение 2 мин и 72°С в течение 3 мин как едином цикле, и заключительным нагреванием при 72°С в течение 10 мин.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле, и амплифицированный фрагмент в 301 п.о. очищают с использованием набора ОнаехП Се1 ЕхГгасйоп (производимого 01адеп) и элюируют 20 мкл стерильной воды (далее для очистки фрагментов ДНК из агарозного геля используют такой способ). Для встраивания в плазмиду рСВ2.1 используют 4 мкл амплифицированного фрагмента согласно инструкциям, приложенным к набору ТОΡО ТА С1ошпд (производимому [^йгодеп), и реакционным раствором трансформируют Е. сой ОН5« способом по СоЕеп е! а1. Ргос. №11. Лсаб. δα. ШЛ, 69, 2110 (1972)] (далее для трансформации Е. сой используют указанный способ). Плазмидную ДНК выделяют из нескольких полученных невосприимчивых к канамицину колоний согласно известному способу [№с1е1с ЛабБ ВеБеагсЕ, 7, 1513 (1979)] (далее для выделения плазмиды используют указанный способ), и получают 2 колонии, в которые встроены, соответственно, неполные фрагменты кДНК РХ. Их называют клоном 8 рСВРХ и клоном 12 рСВРХ.
Нуклеотидную последовательность кДНК, встроенной в каждый клон 8 РХ и клон 12 РХ, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Ρе^к^п Е1тег) и набора В|дЭуе Тегтша1ог Сус1е δе^иепс^пд Рδ Веабу Веасйоп (производимого Ρе^к^п Е1тег) согласно инструкциям изготовителя. Подтверждается, что каждая встроенная кДНК, последовательность которой определена, кодирует неполную последовательность открытой рамки считывания (ОВР) РХ китайского хомячка.
(4) Синтез одноцепочечной кДНК для ВЛСЕ.
Образцы одноцепочечной кДНК для 5'- и 3'-ВЛСЕ получают из полной РНК СНОГОС44, экстрагированной в разделе (1), с использованием набора для амплификации кДНК δΜАВТ™ ВЛСЕ (производимого ΟΕΘΝΊΈίΉ) согласно инструкциям изготовителя. В данном случае в качестве обратной транскриптазы используют обратную транскриптазу Ρоие^δс^^рΐ™ (производимую СкОХТЕСН).
Каждую одноцепочечную кДНК после получения разводят в 10 раз буфером трицин-ЭДТК, прилагаемым к набору, и используют в качестве матрицы при ПЦР.
(5) Определение методом ВЛСЕ полноразмерной кДНК РХ, полученной от китайского хомячка.
На основе неполной последовательности РХ, полученной от китайского хомячка, определенной в разделе (3), создают праймеры РXСδΡ1-1 РЕЦ ГО NО:44) и РXСδΡ1-2 РЕЦ ГО NО:45) для РХспецифической 5'-ВЛСЕ китайского хомячка и праймеры РXСδΡ2-1 РЕЦ ГО NО:46) и РXСδΡ2-2 РЕЦ ГО NО:47) для РХ-специфической 3'-ВЛСЕ китайского хомячка.
Затем осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием набора Лбνаиΐаде2 ΡСВ (производимого С^ОNТΈСН), приготовив 50 мкл реакционного раствора [буфер Лбνаиΐаде2 ΡСВ (производимый СГО^ЕСН), 0,2 мМ άNТΡ, 0,2 мкмоль/л РХ-специфических праймеров для ВЛСЕ и 1х
- 82 013563 концентрация обычных праймеров (производимых СЬОКГЕСН)], содержащего 1 мкл полученной из С11()/1)644 одноцепочечной кДНК для КАСЕ, полученной в разделе (4).
ПЦР осуществляют, повторяя 20 циклов нагревания при 94°С в течение 5 с, 68°С в течение 10 с и 72°С в течение 2 мин как в едином цикле.
По завершении реакции 1 мкл реакционного раствора разводят в 50 раз буфером трицин-ЭДТК, и 1 мкл разведенного раствора используют в качестве матрицы. Снова получают реакционный раствор, и осуществляют ПЦР в тех же условиях. Матрицы, комбинация праймеров, используемых при первой и второй ПЦР, и длина фрагментов ДНК, амплифицированных ПЦР, приводятся в табл. 8.
Таблица 8 Комбинация праймеров, используемых при ПЦР КАСЕ кДНК РХ китайского хомячка, и размер продуктов ПЦР
5'-КАСЕ Ех-специф. праймеры Обычные праймеры Размер амплифиц. ПЦРпродукта
Первая Вторая ЕХС5Р1-1 ΓΧΘ5Ρ1-2 ϋΡΜ (универе, прайм, смесь) ΝϋΡ (внутрипраймерный универе, праймер) 300 в [. о.
3'-КАСЕ Ех-специф. праймеры Обычные праймеры Размер амплифиц. ПЦРпродукта
Первая Вторая ЕХСЗР1-1 ЕХС5Р1-2 ϋΡΜ (универе, прайм, смесь) ΝυΡ (внутрипраймерный универе, праймер) 1100 ΐ п.о.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 1% агарозном геле, и представляющий интерес специфический амплифицированный фрагмент очищают с использованием набора СйасхП Сс1 Ехйасйоп (производимого Сйадсп) и элюируют 20 мкл стерильной воды. В плазмиду рСК2.1 встраивают 4 мкл амплифицированного фрагмента, и с использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ОН5а согласно инструкциям, приложенным к набору ТОРО ТА С1ошпд (производимому ^11годсп).
Из оказавшихся невосприимчивыми к канамицину нескольких колоний выделяют плазмидные ДНК, и получают 5 клонов кДНК, содержащих 5'-область РХ китайского хомячка. Их называют клон 25 РХ5', клон 26 РХ5', клон 27 РХ5', клон 28 РХ5', клон 31 РХ5' и клон 32 РХ5'.
Таким же способом получают 5 клонов кДНК, содержащих 3'-область РХ китайского хомячка. Такие клоны РХ3' называют клон 1 РХ3', клон 3 РХ3', клон 6 РХ3', клон 8 РХ3' и клон 9 РХ3'.
Нуклеотидную последовательность части кДНК каждого клона, полученного 5'- и 3'-КАСЕ, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Рсгкт Е1тсг) способом, описанным в инструкциях изготовителя. Сравнивая нуклеотидные последовательности кДНК, определенные таким способом, исключают ошибки считывания нуклеотидных оснований из-за ПЦР, и определяют полноразмерную нуклеотидную последовательность кДНК РХ китайского хомячка. Установленная последовательность показана в 8Е6 ГО ΝΌ:48.
2. Определение последовательности кДНК СРРР, полученной из клеток СНО.
(1) Получение неполного фрагмента кДНК СРРР, полученной от китайского хомячка.
Неполный фрагмент кДНК СРРР, полученной от китайского хомячка, получают следующей процедурой.
Сначала сравнивают нуклеотидные последовательности кДНК СРРР человека (СспВапк, инвентарный № АР017445), последовательности мышиной Е8Т, обладающие высокой гомологией с этой последовательностью (СспВапк, инвентарные № АИ67195, АА422658, ВЕ304325 и АИ66474), и последовательности крысиной Е8Т (СспВапк, инвентарные № ВР546372, АЮ58400 и ΑV144783), зарегистрированные в общей базе данных, и создают праймеры СРРР РУ9 и СРРР КУ9 (8ЕО ГО ЫО:49 и 50), специфические для крысиной СРРР, на хорошо сохранившейся области среди трех указанных видов.
Затем осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием ДНК-полимеразы ЕхТац (производимой Такага 81и7о), приготовив 25 мкл реакционного раствора [буфер ЕхТац (производимый Такага 81и7о), 0,2 мМ ιΙΝ'ΙΡ и 0,5 мкмоль/л СРРР-специфических праймеров СРРР РУ9 и СРРР КУ9 (8ЕО ГО ΝΌ:49 и 50)], содержащего 1 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из СНОГОС44, полученной в разделе (2). ПЦР осуществляют нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 58°С в течение 2 мин и 72°С в течение 3 мин как едином цикле, и заключительным нагреванием при 72°С в течение 10 мин.
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 2% агарозном геле, и амплифицированный фрагмент в 1,4 т.п.о. очищают с использованием набора ОшасхП Сс1 Ехйасйоп (производимого СЯадсп) и элюируют 20 мкл стерильной воды. Для встраивания в плазмиду рСК2.1 используют 4 мкл амплифицированного фрагмента согласно инструкциям, приложенным к набору ТОРО ТА С1ошпд (производимому Ριγ·!^^!!), и с использованием реакционного раствора трансформируют Е. сой ОН5а.
- 83 013563
Плазмидную ДНК выделяют из нескольких оказавшихся невосприимчивыми к канамицину колоний, и получают 3 колонии, в которые интегрированы, соответственно, неполные фрагменты кДНК СРРР. Их называют клоном 8 СРРР, клоном 11 СРРР и клоном 12 СРРР.
Нуклеотидную последовательность кДНК, встроенной в каждый клон 8 СРРР, клон 11 СРРР и клон 12 СРРР, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) и набора В1§Нуе Тегтта1ог Сус1е δе^иеηс^ηд Εδ Кеабу КеасИоп (производимого Регкт Е1тег) согласно инструкциям изготовителя. Подтверждается, что каждая встроенная кДНК, последовательность которой определена, кодирует неполную последовательность открытой рамки считывания (0КР) СРРР китайского хомячка.
(2) Определение методом КАСЕ полноразмерной кДНК СРРР, полученной от китайского хомячка.
На основе неполной последовательности СРРР, полученной от китайского хомячка, определенной в разделе 2(1), создают праймеры СРРР СδΡ1-1 (δΕ^ ГО Ν0:52) и СРРР СδΡ1-2 (δΕ^ ГО Ν0:53) для РХспецифической 5'-КАСЕ китайского хомячка и праймеры СРРР СδΡ2-1 (δΕ^ ГО Ν0:54) и СРРР СδΡ2-2 (δΕ^ ГО Ν0:55) для СРРР-специфической 3'-КАСЕ китайского хомячка.
Затем осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием набора Абуап1а§е2 РСК (производимого СЕСЖТЕСЧI), приготовив 50 мкл реакционного раствора [буфер Абуап1а§е2 РСК (производимый С^ΟNТΕСН), 0,2 мМ άNТΡ, 0,2 мкмоль/л СРРР-специфических праймеров для КАСЕ и 1х концентрация обычных праймеров (производимых СКЖТЕСЧ 1)|, содержащего 1 мкл полученной из СН0ГОС44 одноцепочечной кДНК для КАСЕ, полученной в разделе (4).
ПЦР осуществляют, повторяя 20 циклов нагревания при 94°С в течение 5 с, 68°С в течение 10 с и 72°С в течение 2 мин как единый цикл.
По завершении реакции 1 мкл реакционного раствора разводят в 50 раз буфером трицин-ЭДТК, и 1 мкл разведенного раствора используют в качестве матрицы. Снова получают реакционный раствор, и осуществляют ПЦР в тех же условиях. Матрицы, комбинация праймеров, используемых при первой и второй ПЦР, и длина фрагментов ДНК, амплифицированных ПЦР, приводятся в табл. 9.
Таблица 9
Комбинация праймеров, используемых при ПЦР КАСЕ кДНК СРРР __________китайского хомячка, и размер продуктов ПЦР_________ 5'- ОГРР-специф. Обычные праймеры Размер ПЦРКАСЕ_____праймеры__амплифиц. продукта
Первая ОЕРРСЗР1-1 ϋΡΜ (универе, прайм.
смесь)
Вторая ОЕРРОЗР1-2 ΝϋΡ (внутрипраймерный универе, праймер)1100 п.о.
З'-ЕАСЕ ОГРР-специф. Обычные праймеры Размер ПЦР___________праймеры__амплифиц. продукта Первая ОГРРСЗР2-1 иРМ (универе, прайм.
смесь)
Вторая СГРРСЗР2-2 ΝϋΡ (внутрипраймерный __________________________универе, праймер)_________1400 п.о.______
После ПЦР реакционный раствор подвергают электрофорезу в 1% агарозном геле, и представляющий интерес специфический амплифицированный фрагмент очищают с использованием набора ^^аеxΠ Се1 Ех1гас1юп (производимого ^^адеη) и элюируют 20 мкл стерильной воды. В плазмиду рСК2.1 встраивают 4 мкл амплифицированного фрагмента, и с использованием реакционного раствора трансформируют Е. со11 ΕΙΕα согласно инструкциям, приложенным к набору Т0Р0 ТА С1ошп§ (производимому Шух1го§еп).
Из полученных невосприимчивых к канамицину нескольких колоний выделяют плазмидные ДНК, и получают 4 клона кДНК, содержащих 5'-область СРРР китайского хомячка. Их называют клон 1 СРРР5', клон 2 СРРР5', клон 3 СРРР5' и клон 4 СРРР5'.
Таким же способом получают 5 клонов кДНК, содержащих 3'-область СРРР китайского хомячка. Их называют клоном 10 СРРР3', клоном 16 СРРР3' и клоном 20 СРРР3'.
Нуклеотидную последовательность кДНК, каждого клона, полученного 5'- и 3'-КАСЕ, определяют с использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) согласно способу, описанному в инструкциях изготовителя. Сравнивая нуклеотидные последовательности кДНК после определенния нуклеотидных последовательностей, исключают ошибки считывания нуклеотидных оснований из-за ПЦР, и определяют полноразмерную нуклеотидную последовательность кДНК СРРР китайского хомячка. Установленная последовательность показана в δΕ^ ГО Ν0:51.
Пример 17. Получение гена СМБ, получаемого из клеток СН0.
1. Определение последовательности кДНК СМН, получаемого из клеток СН0.
(1) Получение кДНК гена СМН, получаемого из клеток СН0 (получение неполной кДНК с исключением 5'- и 3'-концевых последовательностей).
Проводят в порядке запроса поиск кДНК СМН, происходящей от грызунов, в общей базе данных ^ΕΆδΈ) с использованием последовательности кДНК СМБ человека (СепВапк, инвентарный № АР042377), зарегистрированной в СепВапк, и получают три вида последовательностей мышиной ΕδТ
- 84 013563 (ΟеηВаηк, инвентарные № ВЕ986856, ВР158988 и ВЕ284785). Путем лигирования указанных последовательностей ЕЗТ получают расшифрованную последовательность кДНК мышиной ΟΙΗΩ.
На основе последовательности кДНК мышиной ΟΙΗΩ получают 28-мерный праймер с последовательностью, представленной ЗЕО ГО ΝΟ:56, 27-мерный праймер с последовательностью, представленной ЗЕО ГО ΝΟ:57, 25-мерный праймер с последовательностью, представленной ЗЕО ГО ΝΟ:58, 24-мерный праймер с последовательностью, представленной ЗЕО ГО ΝΟ:59, и 25-мерный праймер с последовательностью, представленной ЗЕО ГО ΝΟ:60.
Затем, для того чтобы амплифицировать кДНК ΟΙΗΩ, полученной из клеток СНΟ, осуществляют ПЦР следующим способом. Получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер ЕхТас.| (производимый Такага ЗНихо), 0,2 мМ 6ΝΓΡ, 0,5 единиц полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага ЗНихо) и 0,5 мкМ двух синтетических ДНК-праймеров], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК, полученной из клеток СНΟ, полученной в примере 15-1(1). В данном случае в качестве синтетических ДНКпраймеров используют комбинации ЗЕО ГО ΝΟ:56 с ЗЕО ГО ΝΟ:57, ЗЕО ГО ΝΟ:58 с ЗЕО ГО ΝΟ:57, ЗЕО ГО ΝΟ:56 с ЗЕО ГО ΝΟ:59 и ЗЕО ГО ΝΟ:56 с ЗЕО ГО ΝΟ:60. Реакцию осуществляют с использованием ΩΝΛ ТНегта1 Сус1ег 480 (производимого Ρе^к^η Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле.
Раствор после ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и обнаруживают, что в продукте ПЦР амплифицированным является фрагмент ДНК примерно в 1,2 т.п.о., когда используют синтетические ДНК-праймеры ЗЕО ГО ΝΟ:56 и 57, в продукте ПЦР амплифицированным является фрагмент примерно в 1,1 т.п.о., когда используют синтетические ДНК-праймеры ЗЕО ГО ΝΟ:57 и 59, в продукте ПЦР амплифицированным является фрагмент примерно в 350 п.о., когда используют синтетические ДНК-праймеры ЗЕО ГО ΝΟ:56 и 59, и в продукте ПЦР амплифицированным является фрагмент примерно в 1 т.п.о., когда используют синтетические ДНК-праймеры ЗЕО ГО ΝΟ:56 и 60. Фрагменты ДНК извлекают с использованием набора Οеηе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные фрагменты ДНК лигируют с вектором рТ7В1ие(В) (производимым №уадеп) с использованием набора ЭКА Ыдайоп (производимого Такага ЗНихо), и с использованием полученных образцов рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ОН (производимую ТоуоЬо), посредством чего получают плазмиды 22-8 (имея фрагмент ДНК примерно в 1,2 т.п.о., амплифицированный из синтетических ДНК-праймеров ЗЕО ГО ΝΟ:56 и ЗЕО ГО ΝΟ:57), 23-3 (имея фрагмент ДНК примерно в 1,1 т.п.о., амплифицированный из синтетических ДНК-праймеров ЗЕО ГО ΝΟ:58 и ЗЕО ГО ΝΟ:57), 31-5 (имея фрагмент ДНК примерно в 350 п.о., амплифицированный из синтетических ДНК-праймеров ЗЕО ГО ΝΟ:56 и ЗЕО ГО ΝΟ:59) и 34-2 (имея фрагмент ДНК примерно в 1 т.п.о., амплифицированный из синтетических ДНК-праймеров ЗЕО ГО ΝΟ:56 и ЗЕО ГО ΝΟ:60). Последовательность кДНК ΟΙΗΩ из клеток СНΟ, содержащуюся в указанных плазмидах, определяют обычным способом с использованием секвенатора ДНК АВI ΡВIЗΜ 377 (производимого Ρе^к^η Е1тег) (так как последовательность из 28 оснований после кодона инициации метионина со стороны 5'-конца и последовательность из 27 оснований перед кодоном инициации со стороны 3'-конца происходят от последовательностей синтетических олиго-ДНК, они являются последовательностями кДНК мышиной ΟΙΗΟ).
Кроме того, для того чтобы получить плазмиду, в которой фрагменты кДНК ΟΙΗΩ из клеток СНΟ, содержащиеся в плазмидах 22-8 и 34-2, соединяются, осуществляют следующие стадии. Плазмиду 22-8 (1 мкг) вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсοВI (производимой Такага ЗНихо) при 37°С в течение 16 ч, гидролизат подвергают электрофорезу в агарозном геле, и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 4 т.п.о. с использованием набора Οеηе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Плазмиду 34-2 (2 мкг) вводят во взаимодействие с рестриктазой ЕсοВI при 37°С в течение 16 ч, гидролизат подвергают электрофорезу в агарозном геле, и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 150 п.о. с использованием набора Οеηе С1еап II (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченные фрагменты ДНК, соответственно, подвергают дефосфорилированию концов с использованием Са1Г [п1екНпе А1кайпе ННо^Ь-Иаке (производимой Такага ЗНихо) и затем лигируют с использованием набора ^NА Ыдайоп (производимого Такага ЗНихо), и с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сой ОН5(/. (производимую ТоуоЬо), и получают плазмиду ΟΈΟ-ΟΙ^Ω (см. фиг. 54).
(2) Определение 5'-концевой последовательности кДНК ΟΙΗΩ, полученной из клеток СНΟ.
Из нуклеотидных последовательностей некодирующей области со стороны 5'-конца кДНК ΟΙΗΩ человека и мыши, полученных в клетках СНΟ, получают 24-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной ЗЕО ГО ΝΟ:61, и из последовательности кДНК ΟΙΗΩ, полученной в клетках СНΟ, получают 32-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной ЗЕО ГО ΝΟ:62, и для амплификации кДНК осуществляют ПЦР следующим способом. Итак, получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер ЕхТас.| (производимый Такага ЗНихо), 0,2 мМ 6ΝΓΡ, 0,5 единиц полимеразы ЕхТас.| (производимой Такага ЗНихо) и 0,5 мкМ синтетических ДНК-праймеров ЗЕО ГО ΝΟ:61 и ЗЕО ГО ΝΟ:62], содержащего в качестве матрицы 0,5 мкл одноцепочечной кДНК, полученной в примере 15-1(1), и в нем осуществляют реакцию с использованием ^NА ТНегта1 Сус1ег 480 (производимого
- 85 013563
Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 20 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин и 72°С в течение 2 мин как едином цикле, и еще 18 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. После фракционирования электрофорезом в агарозном геле извлекают фрагмент ДНК примерно в 300 п.о. с использованием набора Сепе С1еап ΙΙ (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент лигируют с вектором рТ7В1ие(Я) (производимым №гадеп) с использованием набора ЭНА Ыдабоп (производимого Такага 8ки/о), и с использованием полученных образцов рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сок Оши. (производимую ТоуоЬо), и посредством этого получают плазмиду 5'СМЭ. С использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) определяют нуклеотидную последовательность из 28 оснований после инициирующего метионина кДНК СМЭ, полученной из клеток СНО, содержащейся в плазмиде.
(3) Определение 3'-концевой последовательности кДНК СМЭ, полученной из клеток СНО.
Для того чтобы получить 3'-концевую последовательность кДНК СМЭ, полученной из клеток СНО, осуществляют способ ЯАСЕ следующим образом. Из РНК, полученной в примере 15-1(1), с использованием набора для амплификации кДНК 8МАЯТ™ ЯАСЕ (производимого СЬОкТЕСН) получают одноцепочечную кДНК для 3'-ЯАСЕ согласно инструкциям изготовителя. В данном случае в качестве обратной транскриптазы используют обратную транскриптазу Ро\уег8спр1т™ (производимую СЬОКТЕСН).
Одноцепочечную кДНК после получения разводят в 10 раз буфером трицин-ЭДТК, прилагаемым к набору, и используют в качестве матрицы при ПЦР.
Затем получают 20 мкл реакционного раствора [буфер Е.хТас.| (производимый Такага 8ки/о), 0,2 мМ бЫТР, 0,5 единиц полимеразы Е.хТас.| (производимой Такага 8ки/о), 0,5 мкМ 25-мерного синтетического ДНК-праймера, показанного в 8ЕО ΙΌ NΟ:63, полученного на основе последовательности кДНК СМО, полученной в клетках СНО, определенной в разделе (1)] и 1х концентрация универсальной праймерной смеси (прилагаемой к набору для амплификации кДНК 8МАЯТ™ ЯАСЕ; производит С^ΟNТΕСН), содержащего 1 мкл кДНК для 3'-ЯАСЕ в качестве матрицы, и осуществляют ПЦР с использованием ^NΑ Ткегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле.
По завершении реакции 1 мкл реакционного раствора ПЦР разводят в 20 раз буфером трицинЭДТК (производимым СЬО№ТЕСН). Затем получают 20 мкл реакционного раствора [буфер Е.хТас.| (производимый Такага 8ки/о), 0,2 мМ б№ТР, 0,5 единиц полимеразы Е.хТас.| (производимой Такага 8ки/о), 0,5 мкМ 25-мерного синтетического ДНК-праймера, показанного в 8ЕО ΙΌ NΟ:64, полученного на основе последовательности кДНК СМЭ, полученной в клетках СНО, определенной в разделе (1)] и 0,5 мкМ универсального внутрипраймерного праймера (прилагаемого к набору для амплификации кДНК 8МАЯТ™ ЯАСЕ; производит С^ΟNТΕСН), содержащего 1 мкл разведенного в 20 раз водного раствора в качестве матрицы, и осуществляют реакцию с использованием ^NΑ Ткегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Е1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле.
По завершении реакции реакционный раствор ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле, и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 700 п.о. с использованием набора Сепе С1еап ΙΙ (производимого ВЮ 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент лигируют с вектором рТ7В1ие(Я) (производимым №гадеп) с использованием набора Ыдайоп (производимого Такага
8ки/о), и с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Е. сок ОН5(/. (производимую ТоуоЬо), причем посредством этого получают плазмиду 3'СМЭ. С использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Е1тег) определяют нуклеотидную последовательность из 27 оснований перед кодоном терминации кДНК СМЭ, полученной из клеток СНО, содержащейся в плазмиде.
Последовательность полноразмерной кДНК гена СМЭ, полученной в СНО, определенная в разделах (1), (2) и (3), и соответствующая аминокислотная последовательность представлены 8ЕО ΙΌ NΟ:65 и 71 соответственно.
2. Определение геномной последовательности, содержащей ген СМЭ, полученной из клеток СНО/СЭ44.
Из последовательности кДНК мышиной СМЭ, определенной в примере 17-1, получают 25-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью, представленной 8ЕО ΙΌ NΟ:66. Затем получают геномную ДНК, происходящую из клеток СНО, следующим способом. КС861, полученную из клеток СНО/СО44, суспендируют в среде ШПМ-бЕВ8(10)-НТ(1) [среда IΜ^Μ-бЕВ8(10), содержащая добавку НТ концентрации 1х (производимую куйгодец)], получают плотность клеток 3х105 клеток/мл, и суспензию распределяют в лунки 6-луночного планшета с плоскодонными лунками для адгезионных культур (производимого Сгетег) по 2 мл/лунку. После культивирования клеток при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 до тех пор, пока клетки на планшете не начинают сливаться, геномную ДНК из клеток на планшете получают известным способом [№с1ею Ас1б§ Яезеагск, 3, 2303 (1976)] и растворяют в течение ночи в 150 мкл буфера ТЕ-Я№§е (рН 8,0) (10 ммоль/л трис-НС1, 1 ммоль/л ЭДТК, 200 мкг/мл РНКазы А).
- 86 013563
Получают реакционный раствор (20 мкл) [1х буфер БхТац (производимый Такага 8Ηиζο). 0.2 мМ бПТР. 0.5 единиц полимеразы БхТац (производимой Такага 8Ηиζο) и 0.5 мкМ синтетических ДНКпраймеров 8ΕΟ ΙΌ N0:59 и 8Ε0 ΙΌ N0:66]. содержащий 100 нг геномной ДНК. полученной из клеток СН0/ЭО44. и осуществляют ПЦР с использованием ^NА ТНегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкт Б1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле. По завершении реакции реакционный раствор ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле. и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 100 п.о. с использованием набора Оеше С1еаш ΙΙ (производимого ΒΙ0 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент ДНК лигируют с вектором рТ7Β1ие(Κ) (производимым №уадеп) с использованием набора ^NА Εί§;·ιΙίοη (производимого Такага 8Ηиζο). и с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Ε. той ЭН5а (производимую ТοуοЬο). причем посредством этого получают плазмиду ех3. С использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Б1тег) определяют нуклеотидную последовательность геномной ДНК. полученной из клеток СН0. содержащейся в плазмиде. Результат показан в 8ΕΟ ΙΌ N0:67.
Затем на основе последовательности кДНК ОΜ^. полученной из клеток СН0. определенной в примере 17-1. получают 25-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью. представленной 8Ε0 ΙΌ N0:68. и 25-мерный праймер с нуклеотидной последовательностью. представленной 8Ε0 ΙΌ N0:69. Затем получают 20 мкл реакционного раствора [1х буфер БхТац (производимый Такага 8Ηиζο). 0.2 мМ бПТР. 0.5 единиц полимеразы БхТац (производимой Такага 8Ηиζο) и 0.5 мкМ синтетических ДНКпраймеров 8Ε0 ΙΌ N0:68 и 8Ε0 ΙΌ N0:69]. содержащего 100 нг геномной ДНК. полученной из СН0/ЭО44. и осуществляют ПЦР с использованием ^NА ТНегта1 Сус1ег 480 (производимого Регкш Б1тег) нагреванием при 94°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами нагревания при 94°С в течение 1 мин и 68°С в течение 2 мин как едином цикле.
По завершении реакции реакционный раствор ПЦР фракционируют электрофорезом в агарозном геле. и затем извлекают фрагмент ДНК примерно в 200 п.о. с использованием набора Оеше С1еаш ΙΙ (производимого ΒΙ0 101) согласно инструкциям изготовителя. Извлеченный фрагмент ДНК лигируют с вектором рТ7Β1ие(Κ) (производимым №у;щеп) с использованием набора ^NА ΕίβηΙίοπ (производимого Такага 8Ηиζο). и с использованием полученной рекомбинантной плазмидной ДНК трансформируют Ε. той ЭН5а (производимую ТοуοЬο). причем посредством этого получают плазмиду ех4. С использованием секвенатора ДНК 377 (производимого Регкт Б1тег) определяют нуклеотидную последовательность геномной ДНК. полученной из клеток СН0. содержащейся в плазмиде. Результат показан в 8Ε0 ΙΌ N0:70.
Пример 18. Анализ углеводных цепей обычных доступных антител.
Углеводные цепи обычных доступных антител против НВГО/пеи герцептина (производимого ОΕNΕNТΕСН и ГОсНе). продуцированных клетками СН0 как клетками-хозяевами. анализируют согласно способу примера 10(6) (фиг. 31). При вычислении из площади пика диаграммы элюирования содержание углеводных цепей герцептина без а-1.6-фукозы составляет 16%. и содержание углеводных цепей. связанных с а-1.6-фукозой. составляет 84%. Осуществляют такой же анализ для других коммерчески доступных антител ритуксана (производимого ОΕNΕNТΕСН. КзсНе и ГОБС) и зенапакса (производимого ^сНе и РОБ). и в них содержание углеводных цепей без а-1.6-фукозы меньше. чем в герцептине.
Фиг. 31 представляет собой график. показывающий картину элюирования РА-обработанных углеводных цепей. полученных из герцептина. полученный при их анализе ВЭЖХ с обращенной фазой.
Относительная интенсивность флуоресценции и время элюирования откладывают по осям ординат и абсцисс соответственно. Условия анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой такие же. как в примере 11(6). и анализ структуры углеводных цепей и вычисление доли группы углеводных цепей. не содержащих а-1.6-фукозу. осуществляют так же. как в примере 11(6).
Промышленная применимость
Настоящее изобретение относится к клеткам. способным продуцировать композицию антител. способу получения композиции антител с использованием таких клеток. композиции антител и ее применению.
- 87 013563
Текст на естественном языке списка последовательностей
ЗЕО Ю N0:4 · - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0 :5 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0 :8 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0 :9 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО 10 N0 : 10 - пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0 : 11 - пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0 : 12 - пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0 : 13 - пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0 : 14 - пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0 : 15 - пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0 : 16 - пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК
ЗЕО Ιϋ N0 : 17 - пояснение к синтетической последовательности синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 18 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 19 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 20 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 21 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 22 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 26 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО 10 N0: 27 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 28 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 29 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 30 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 31 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 32 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 33 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 34 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 35 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 36 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ю N0: 37 - пояснение к синтетической последовательности: синтетическая ДНК
ЗЕО ΙΟ N0:38 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:39 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:40 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:41 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:42 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:43 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:44 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:45 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:46 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:47 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:49 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО 10 N0:50 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:52 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:53 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:54 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:55 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:56 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:57 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО 10 N0:58 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:59 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:60 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:61 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:62 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:63 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:64 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:66 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:68 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
ЗЕО Ю N0:69 - пояснение к синтетической последовательности:
синтетическая ДНК
- 89 013563
Список последовательностей <110> ЮТА НАККО Κ06Υ0 СО., Ш.
<120> Клетки, продуцирующие композицию антител <130> р-38524 <150> }Р 2000-308526 <151> 2000-10-06 <160> 73 <170> РаЬепЫп Уег. 2. 1 <210> 1 <211> 2008 <212> ДНК <213> Сг1се1и1и5 дгхзеиз <400> 1
аасадааас! 1а11Нсс1£ 1д1д§с1аас 1а§аасса§а §1асаа1е11 кссааЫсИ 60
1§а£с1сс§а даадасадаа дддадПдаа ас!с1даааа 1дсд£§са1£ §ас1д§исс 120
-ЬёёсдПдда 11а1§с1са1; ΐοΐΐΐΐΐ^οο Гдддддасс-Ь Ьа1аёё1е§Ь 180
даеаСаакда ссассскдас са11с1а§са даеааскскс саадаИсП 240
£сааадс1е§ адсдсИааа асаасаааа! §аа§ас11да б§аеаа1§ес ГдадксЬсТс 300
сдаакассад а১ссс!а1 1§а1саддее асадсЕасад даададкссв 1£1111адаа 360
даасадсИд Наадессаа адаасадаИ дааааКаса а®ааасаа§с 1аедаа1£аЬ 420
с1ее§ааад§ а1са1§ааа1 сИааддаее аддаИдааа аЬееаес1аа а£а£С1с1е§ 480
1ШНс1ас ааа§1§аа11 дааеаааНа ааяаааНае ааддааасда аскссааада 540
са1£са£а1£ аааНсПН ддаШадда са1са1дааа ееьстса-е £асада1с1а 600
Тас1асс1са §1саааса§а Тддаисадд! ааааадааес сааа§а!с1§ 660
- 90 013563
асаёа§с1ёё Ьсса§с££а§ ааГаасаГак с£§са§аа1с ссаа§£ас1§ са§сааа§сс 720
аёаааёсЪёё ГаГ^ааГа·! саасаааёёс ь^еесШё еаФ^ФсаасС сса£са1е1£ 780
ϋοεΐββΐΐβο 44а4е^сасс са§сдаасас 1са1с1;1яеа аЪсЪсаёаа1 840
Ϊ£§Ο£ΟΪ3ΪΒ с1ас^ёё^ёё аЪёёёаёасг с!§1аае4еа §аса1дсаса 900
ёасаЕйГсГи ёсс£с1;ссас 1ёё^сас1ёё Ъсаёё^ёааё 1£аа££асаа ааа£§Ксаа 960
ё^ёё^сёаёс ГссссаккёГ аяаса§сс4с са£сс£с£1с οΐοοΐίθοΐΐ асссНёёа 1020
§£асса£аа£ асс£12са§а Гсеас1ссГ§ а§ае4сса4§ βΐββΐοοΐβσ аё^ё^ёё^ёё 1080
йкаГсссаек 4Ге4сааа4а οΐΐββΐοοβφ ссасаассН еесЪееааае иезаака^аа 1140
§ааассасса аёаа§с££ея сЫсааасаГ ссаё£1а££§ §а§1сса£§1 са§ас§сас1: 1200
ёасаааё^ёё ёаасаёааёс аессШсса! ссса££§аёё ааЪасаЪёёЬ асас§Н#аа 1260
ВаасаИИс а§с1;1с4с§а асёсаёаа^ё аааёЪёёгЛа аааааа§ае£ й£а4с4§§сс 1320
ас£§а£§асс σΐΐοΐϊΐβΐΊ; аааёёаёёса аа§асааа§4 аскссаакка ΐδθθΐΐΐβΐΐ 1380
а§1;£а1аас1: θί3ΪΐΈθΐΐ§ §1саес£е§а скасасаасс яакасасаеа ааа£4сас£4 1440
сёеёёсё^ёа Гсс£££а1а£ асасЪНсбс £ссса££с£е βοΐΐοοίίβί; §4ё4асШ1; 1500
СсаГсссаёё ΐθΐ§ΐ&8§§ΐ 4§с41а42аа аСсаС§сааа сасГёсаГсс С§а1ёссГсС 1560
§сааасШсс аИсНкада 1;§асаГсГас 1а1-иГ§§а§ §ссаааа4§с ссасаасса® 1620
а£1§са§-Ш; аГссХсасса асс4е'§аас£ ааа§аяеааа 1сссса1§§а ассЬнёаеа! 1680
а!са£1§ё£§ 1§ёс£в§ааа ссаГкёЯаак е§44ас1с4а ааевкексаа са§аааас4а 1740
ёёааааасаё есске'Ьассс КссЕасааа ёкссеаеаеа аеака^ааас аексааакас 1800
ссЬасаЕаЪс с1;£ааес1;еа даааГа§а§а Ь§£а§1§1аа §а£а11ааса асаёааГИа 1860
ёИсаёасса ЪсЛсаёссаа §са^аа§асс са§ас£ааса 1а£§§1Гса1 Г§аса£аса1; 1920
ёс^ссёсасс аа&а§сааеФ §§£аасссГс аёа^ё^ёса с^ёё^-ёёаас £θθΐθΐΐΐ6ΐ 1980
- 91 013563 даадддсРдс 1д!дссс!са адсссафд
2008 <210> 2 <211> 1728 <212> ДНК <213> Миз шизсиТиз <400> 2
аРдсдддса! ддасРддИс с1ддсд!1дд а11а1дс1са ΐΐοΐΐΐΐΐβσ сРдддддасс 60
ΐίβΐΐθΐΐΐΐ аРакаддРдд 1са111дд11 сдадаРааРд ассасссРда РсасРссадс 120
ададаасРс! ссаадаИс! РдсааадсИ даасдсИаа аасадсаааа РдаадасПд 180
১сёаа1ёё с1дад1с1с! ссдааРасса дааддсссса Пдассаддд дасадсРаса 240
ддаададРсс д!дШ1ада адаасадсИ дИааддсса аадаасада! РдааааНас 300
аадааасаад сРадаааРдд РсРддддаад даРсаРдааа РсИаадаад даддаНдаа 360
аа!ддадс1а аададсРсРд д111111с1а сааадсдаас 1даадааа11 ааадсаШа 420
дааддаааРд аасРссааад асардсада! даааШсШ!; РддаШадд асассаРдаа 480
адд!с1а1са РдасадаРс! акасРассРс адРсааасад аРддадсадд ддаИддсд! 540
дааааададд ссааадаРсР дасададскд дРссадсдда даа1ааса1а 1с1ссадаа1 600
ссРааддас! дсадсааадс саддаадсРд дрдрдрааса РсааРааадд сРдРддсРа! 660
дд11д1саас РссаРсасдР дд1с1ас1д! 11са1да11д с11а!ддсас ссадсдааса 720
с!са1с11дд ааРсРсадаа ПддсдсРа! дсРасРддРд даРдддадас РдРдШада 780
ссРдРаадРд адаса1,д!ас адасадаРс! ддссРсРсса с!ддасас1д дРсаддРдаа 840
дРааэРдаса аааасаИса адрддксдад сРссссаИд РадасадссР ссаРссксдд 900
сс1сс11ас! 1ассас1ддс РдИссадаа дассИдсад ассдасксс! аададРсса! 960
ддрдассскд садрдкддрд ддрдрсссад ИРдРсаааР асПдаШсд Рссасаасс! 1020
- 92 013563
ГддсГддааа ав§ааа1;ава адаадссасс ааваавс-Щ ВсГГсаааса 1сса§БГаГГ 1080
§да§Гсса1£ Ьсадасдсас адасааадГ§ ддаасадаад садссГГсса ссссаксвав 1140
дад1аса1ё§ 1асасдИёа адаасаШН саёс11с1сё сасдса§аа1 ВсаадГвваГ 1200
ааааааадад ГаГаксГвяс ГасГваГеаГ οοΐβοΐΐΐβΐ Гааавваввс ааа§асааа§ 1260
ГасЬссааЬБ аЬвааЫЛаГ 1а§Ь§а1аас ГсГатсГГ ВВ^савсГвЕ аскасасааБ 1320
сеёкасасад ааааГГсасГ ΐϋΒΒΒ&ΐεΐΒ аГссГввака ГасасЕГГсГ с4сасаввс1 1380
§асШс1а§ ГдГдГасТГГ ГГсаГсссав НёсИаЪда ааксаГдсаа 1440
асссГдсаГс сЬйаГёссЬс ЬдсваасГГс саГГсГЫвв а1§аса1с1а сГаЬГЫв&а 1500
ддссаааа1§ сссасааГса £3ΪΪ£0ΪΒΪΐ ГаГссГсаса аассксдаас Гваававваа 1560
аИссаа1д§ аассГееада Шса-ЩвЬ вГв§сГ§§аа ассаГГ§£§а ГввЬБаЬГсГ 1620
ааавв^акса асадаааас! Ьвваааааса ВВсГГа4а4с ссГссГасаа адЪссдадад 1680
аадаГадааа садГсаадГа ГсссасаГак сскваавсГв аааааГав 1728
<210> 3 <211> 9196 <212> ДНК <213> Сг1сеБи1из §г1зеиз <400> 3
ГсГавассав ВсГв^сГсв аасГсасава ваассассГв ссГсБдссас сквав^есГв 60
еваГГааавв Гв^есассас сассвсссвв свГаааакса ГаГЫПваа гаПвЕвага 120
аГЫасаЫа 1аа11д1аа§ Ϊ3Β388ΪΪΪΪ савссФаШ ΐΒΐ^θ^οβΐ ППвсвГаа 180
аВ1а1ВсШ ШвааавП ИёИёЬсса ЬааЪа§1с1а ВВВааасаГа аавНаГааГ 240
ЫЛ4§ГсГаЕ вГаГШвса! аБаГаГсГа! ШааГсГсск ааГв^ссавв ааакааакав 300
вв^акв^аак авсЫсааса ΐΒΐβ§ΐ3ΪΒ3 ГавааЕГГГГ сав£всЬаГа ГаавГГвПа 360
- 93 013563
са§сааа§Г§ ЦаЫааИс а£а1§1сса-Ь аШсааЬЫ ШакеааЫ аЬЪаааШеа 420
аГссГЬаадс £§ссадаас1 а§ааШ11;а1 ШааЪсаее аадссссааа ΐοΐ^ΐΐοθΐΐ 480
οΐΐΐοΐθΐθΐ аЬдГ§дааад §£ад§сс£са сТаасСеаШ сШсасс1£1 £1ка§ааса1; 540
дд-Сссаадаа Гааддддаа! £асаа§Гд£д адаааасксс йадаааасаа 600
да£еа§£с41 еЪдассПае К-ЬсШкааа аасасаааа! 1с1Ьд§аа1§ ΐ§ΐΐΐΐο3ΐ8 660
£Гсс£ссса£ дГдда^адда £1даеШа1 ££са§а££а£ Ша£1асаас ΐ££θΐ£ΐΐ£ΐ 720
ΐβΟΐΐβΐΐΐΟ ЕакдксГк-Ьа кадаааааса ΐβΐΐΐΐΐΐΐΐ дссаса^дса £0ΪΪ5Ϊ00Ϊί 780
аГдакк^ка! асГГдкдГда с£с£1аас£с ксададкака ааНё^сЪда кдскакдаак 840
ааадЫддсГ аШеЬаФеай асНсаессс аскГсааШа ЩесНсак ΐοΐοίοαβαί 900
сссассассГ ссаеадЬдд-Ь ааасаасШд аассаГкааа са§асК1а§ ΐοΐΐίβΐΐΐβ 960
ааГеакадак ддддакакса даШкакадд сасаддд-ЫЛ кдадааадяЕ адааддкааа 1020
саекадад!! каасаасаас ааааадкаГа сШЬеЬааас дЬааааска! Ша11ааа§1 1080
адЬадасаад асаШааака Ь1сс1£ддда ΐΐββΐδοΐΐΐ; ЕЬеааПГГд скШсаааЪа 1140
а1аеЬсае£д адГа1:асссс Ьссссса11с гакаШШае садаааксае аакааакдд-Ь 1200
са11с1ГГ1§ Гададаа-иЪ а!ШсШе β£ΐΐΐΐΐ£ΐ§ са!ГГааа§1 1260
сааЬаааааГ ^ааеё^сае ГааГадаааа аааас!с£да ΐΐΐΐΐΚ^ΐ οοοοΐΐΐοΐΐ 1320
садсШкс! аГШааксГс 11аа1£а£аа ΐΐΐ33ΐΐΐ£ΐ ддссаШёё 1сааад£а£а 1380
каессЬЬдка каГдТазакд ШЛаассаа сскдссГкЕа садкаасГак аГаакИГак 1440
•ЬсЬаЬааЬаЬ аЬеасШШс •ЬГсса1:а§с1 «аеаеПес ссадГсасГГ СааеЫасаЬ 1500
ΐΐΐΟδΐβΐθΐ £ίΐθΐΐΐ£ί£ 8£аееада1:а а1ШаШс 1ааеа&аа1;с скаа&са!;ас 1560
•ЬдакГдадаа аГддсаааса ааасасаГаа Иааадс1да 1ааадаасда асаЪИёёад 1620
- 94 013563
Н1аааа£ас а£адссассс асЬбИеШа βοοΐΐοΐΐΐΐ ееаа£1£££а 1680
Ща§£1са£а 1а£ааааа1£ £§аса£££сс а£а£а£§£а£ 1740
£аса£са£а£ ссасс£ё£аа ЫаббавбИб Ниааа-Ьаб аШёааааа а1аа£е§£с£ 1800
аШб^аасс! ΐΐΐ^ΐδΐΐΐ §εΐεΐε§ΐΐ§ ссааШ^б! £3ΐδδΐΐ3ΐ£ 1860
а£аасс1££§ сГТсГс£аа§ еПсаа^са §Шеа§ааГ а1е£сс£с£а аааа£иаса§ 1920
ёПесааеН ааё^аё^ёвё а£^аса§с§а ёаЪёёаёЬёа 1ё^ёаа1Иё ЪаёаааЛёаа 1980
ИсасИа^а с£§а§аас££ £ΐΐΐΐ£θΐΐΐ £а§а1аа£еа аса£аШа§с с1£аа§£аса 2040
1а§сс§ааГ£ ёаШааШа! ТсаааеаГа! аа^сЫНаа £ссс1а£ааа аёаеёЪаТТа 2100
сасаасааН саайаааеа1; аеааШавас Шсса^аИ йёае^еаасс а££1§1:1;а1с 2160
аё^а^аасс с1аас§1ё^ё ΐ^ΐΐ^εΐΐ ааа^ЪдИЪа сШИасс1 ёаЪасЪёёё'Ь 2220
ансЪааЪТеЪ с1£1са§сс1 ссЬёёссааа §а£асса£еа аа§1саасТ1 3θ£ΐΐ£ΐβΐΐ 2280
οΐβΐδΐοΐοβ аасаас£са§ Ββΐβΐΐΐοΐΐ ас£с£££сса са§са£§га§ аёсссаёёаа 2340
ясасаёваса аеаааесТес οΐοοΐΐ^ΐαΐ сасс১аа§ βΐοΐΐΐΐΐ^ΐ аа§ае£са!с 2400
аса§1а£асс а§а§а&асГа θίΐΐΐβΐοΐ^ аа§са£са!§ £ё!1ёаааса асазааасШ 2460
3ΐΐΐΐοεΐ£ΐ §£еес£аас£ аёаассаёаё 1асаа1ёШ ссааНсНЪ ёаес1ссёаё 2520
аанаса§аа£ ееаеШеааа с£с£§аааа£ §сяееса£е§ βοΐββΐίοοΐ 2580
1а1;2с1саШ οΐΐΐΐΐ§οο£ евевеассп а-Щ-ЩШа! а£ае(Цё£1с θΐΐΐ§§ΐΐθ§ 2640
аеа-Ьаа£еас сасссЪёасс аШсРаесаз а^аасТсТсс ааеаШсЩ саааесТяёа 2700
дс§с££аааа саасаааа^ё аа§ас-Ща§ ёаёааЪёёа &ае1с1с1сс ёёЪаёёШ'ё 2760
ааа£ас£саа ееаШваТе аааГасГкЬё с££§асс1£1 а§е1аФае2е ГсГсаеГсЦе 2820
сГеШ^аааа а£а£аа£11с Ъасааассд! οΐΐΐβΐΗαθθ ШШаа£1а1 1££а§саеас 2880
•ШНааааи Гса£1£а1ас а£с£а£а£а§ £саа£а£а§§ ££1аса£а§£ ΐ^ΟΒβΐείΐθ 2940
- 95 013563
кккквсакак вааксавкак акаваавсав квёсакккак аквскхаквк квсакккаса 3000
аккакдккка дасдаасаса ааскккак§к вакккввакк авквсксакк аааккккккк 3060
аккскаквва скасаасава Васакааакк ккваааввск кавккаскск каааккскка 3120
квакваааав саааааИса ккдккааака ваасадквса кссввааквк Вёё'Ьааккак 3180
квссакаккк скавкскаск аааааккдкв всакаасквк ксааавксак садкквкккв 3240
вааавссааа дкскдаккка ааквваааас акааасаакв акакскаккк скавакасск 3300
ккаасккдса Вккаскдавк Иасаад^ё ксквасааск кквваккскс ккаскксака 3360
кскааваакв аксаквквка садквсккас кдксасккка ааааасквса ВВёскадаса 3420
кдсавакакв аавасккк§а сакка§аквк 8Вкаакк§вс аскассавса авквёкакка 3480
адакасавск ваакакакка сккккквавё аасакааккс аквааквваа авквеавсак 3540
1ададаёёа1 ёСсИс1д§с ЬсРсссасас саскдккквс акссакквса ккксасаскв 3600
сШ*а{-йас ксадаквккк СакакВё'Ьак аккдквкаас ксассаксав ккккаксккк 3660
ааакдкскак вваквакаак Вккдкакдкк аасаскккка сааааасааа кваавссака 3720
кссксве^ё'Ь ваекквквак В£к§вкаакк Вксасаакав ваккакксав сааввааска 3780
ад1саёёё^с аа§аад1ёёё сдаЪасНЪд ИддаНааа ксаккккаск вваавкксак 3840
саввёаёёёЕ каквааадкк ВкВВкскккВ ааскдааакк акак§квакк саккаккскк 3900
вакккавёсс ккескаакав кааскаксак ккаккдвёаа ккквЕсакак вквссааккк 3960
Вксаквёёсс авасавсдкв ккккаскваа кккскадака кскккаквав аккскадкас 4020
квкккксадс саккккасав акваадаакс ккаааааакв ккааакаакк кавккквссс 4080
аадаккакас Вккаасааак ВВкаваасск кскккдаакк скввсавкак Вёскасасад 4140
кссвааскск какскксска авскваааас адааааадса аквасссава аааккккакк 4200
- 96 013563
ЬаааадйсЬс аддададаск 4ссса1ссЬ§ адаада!с4с ΐΐΐΐοοοΐΐΐ ЬаЬааЬЬЬад 4260
дсЬссЬдааЬ ааЬсаскдаа ΐΐΐΐοΐοοεΐ £11сса1с1а ЪадЬасЬдЬЬ 8ΐΐΐθΐ§ΐΐΐ 4320
ΐοοΐΐΐΐΐΦο Шассасааа §ΐβΐοΐΐ§ΐΐ ΐΐΐ§θΐ8ΐ8ΐ дааадаааа! ёЬдШа-Щ! 4380
ааЬдкдаааЬ ЬсЬсЬдЬссс Ьдсадддксс сасайссдсс ЬсааЬсссаа акааасасас 4440
адаёдсЬдЬа 41аа11а1§а ааскдЬЬддЬ садШддска еедсИсИа ььеесьаесь 4500
скяЬсЫааЬ ЬаШааасса ЬаасЬасЬаЬ ЬдЬаайЬаЬЬ ЬссаЦЦддЬ сЬЬаЬсЫас 4560
саа£дааа§£ §Ьсс১£ас сЬсШасЬсс ΐθΐ£§0£ΐ£ΐ •ЬддсайЬдаа даддададад 4620
•ЫЦдЬсХсЬд сЬЬаШЬсЬ даЫсЬдсЬс а§сЬаТ,§1са сШссЬвссЬ 4680
ддссааксае ссааксадЬд ЬШаШса! 1адссаа1аа аадааасаП Ьасасадаад 4740
дасЬЬссссс аксайдШа! ЫеЬаЬеадЬ £с£1саеааа аксаЬадЬак сЫЬЬааЬас 4800
ЬааЬЬЬЬЬаЬ ааааааШаа ШеЬаШдаа ааЬЬаЬдЬдЬ а1а£й1.£1с£ §1§4н1сда4 4860
ЬЬдЬдсЬсаЬ аадЬадсакд еадкдсадаа даеддааЬса 8а1сШШ Ьаадддасаа 4920
ададШаЫ садаШасаТ Ша১6§а ЬааЬдЬаЬда Щсаае§П аЬсаасаЬдд 4980
са£ааа£§1;£ аадааесЬде ЬсасаЬЬаса ЬссададЬса аеаеЬадаеа есаа£§аа££ 5040
дакдсакдса ΐΐοοΐ§ΐ§οΐ саясксасЬк Ксскддадс Ьдадс£еа1г дйаадссаЬс 5100
ΐ§βΐ§ΐοΐΐΐ дсЬеееаас! аас£саа১ саадЫсааа асс£д!£с££ аадЬаЬаадс 5160
саЬсксЬсса дЬсссЬсаЬа ЬдексЬсШа аеасасЬЫс ΐΐΐ3ΐ3.ΐΐθΐ Ьейасакада 5220
ааз+дааШс сЬаасаасйе саШсаааЫ асааааЬа§4 ИНааааес Ьёа1аЬааЬа 5280
ааЬдЬаааЬа сааксЬадаа саЬЫШаЬа аайаадсаЬа ШаасЬсанЬ ааааакаааЬ 5340
дсаЬддШаЬ ШссИсак ЬадддаадЬа 1§4с4сссса £§θΐ§ίΐθΐθ ЬадаЬЬсЬас 5400
1аё1аа1&сЬ дНЬёЬасас саЬссасадд ддКШаНЬ ЬааадсЬаад аса1§аа4да 5460
1ддаса£ясЬ ЬдЫадсаЬЬ Ьадас-ШШ 1сс41ас1а4 ааШЕадска βΐ3ΐΐΐΐΐβΐ 5520
- 97 013563 §с1са§111§ аБаБс1',§Иа а11са8а1аа а1§1аа1а§1 ১1аа111с Ш§!§а!аа 5580 а22са1а1аа аИ^аа^Ие §аааасаааа 2сс12ааа12 аса^ИШа а§а11са§аа 5640 саа!аа1111 саааа§са§1 1асссаас11 1ссааа1аса а1с12саг11 11с112а1а1 5700 812а1ааа11 Ра§асааа§а аа1а2саса! 111аааа1а2 с!а111ас1с ИдаШШ 5760 ШсаааШ а22с!а211с аскаеН^кё 121аа2211а 12&с12сааа са1с111£ас 5820 1с11££11а£ ££аа1сса££ а1£а111асе 1£111§§сса ааа1с11§11 сса11с122§ 5880 111с11с1с1 а1с1ав§1а§ с1а£сасаа£ 11ааа22121 £§1а£1а11£ £аа£§с1с1с 5940 а££1а1а1а! 11с1а1а11с 121а111111 1сс1с1£1са 1а1а111§с1 11с121111а 6000 11§а111с1а ск^Иа^И! £а1ас11ас1 11с11асас1 11с111,22§а 161а1111§с 6060 1£11с1аа§а ШсИадса а£11са1а1с ас1еа1111а аса§11,5С11 с1111£1аа1 6120 а1а§ас1£аа 1§сссс11а1 11£ааа1£с! 1§§£а1са£а аас1са§а11 12аас1111с 6180 111111аа1а 111сса1саа §111асса§с 1£аа1£1сс1 £а1ссаа§аа 1а1£ааа1с1 6240 2ааа1£с111 £ааа1с1£аа асИИа^ае 1£а1ааа£с1 1ссс111ааа НааШ®!® 6300 11с1а1а111 161§асаа1£ 1саасс111с а11£11а1сс аа1£а£1§аа са1а!111са 6360 а1111111§1 11£а1с1§11 а1а1111§а1 с1®асса1а1 11а1аааа11 11а111аа11 6420 1§аа1§1121 2с1§11ас11 а1с!11а11а ИаШИес 11а1111с1а §ссааа!§аа 6480 а11а!а11с1 §1а11а1111 а§111§аа11 11ас11121£ £С11а£1аас 1§сс1111§1 6540 1£§1£аа1£С 11аа§ааааа с£1§1£§1с1 ас1£а1а11§ §11с1аа1с1 1а1а1а£са1 6600 811§111211 а221а211ёа 11а12с12&1 са2а1121с! 12Э2Ша12 сааа121ааа 6660 а1а111аеа1 2011211112 1121с1аа2а асааа21а12 с112С121с! οοΐβΐοβ^^ 6720 οίΗεΐΉΐΐο са!1са1с1с 11саа2с121 ίίΐ2ΐ£ΐεΐΐ 2аа1ас1аас 1сс21ас1а1 6780
- 98 013563
Οΐΐ£ΐΐΐΐθΐ д-ЬдааШаас ссскШсаа аддШксШ ΐοΐΐΐΐΐΐΐΐ Шаадддас 6840
аасаадШа НсадаНас аШШаадсЪ да1аа1д£а£ даПдсаадд ЫаЪсаасаФ 6900
§§садааа£е 1§аадаадс1 аддсасаНа са1ссаса£д дадксаадад садададсад 6960
1дааГ1аа1д са^есаШсс 6д1дд1хадс ксасШХсс ГаШсИада ЬадГс-Ьадда 7020
1са1ааасск ддддаабадк дскассасаа бдддсабакс сасПасШс ад££са£дса 7080
абсаассаад дсасаЪссас аддаааааск даШбадаса ассГсГсаШ дадас1с£1с 7140
ссадакдакк адасХд-Ьдкс аа^И^асаа £1аааас1а£ сасасскдаа дссаксаска 7200
дкааакаГаа ГдааааГдШ даШаксасс а£аа££са£с Φ^ΐβΐοοοΐΐ кд'ЫаГкдка 7260
да1111д£да адИссГаШ саадкссскд ΐΐοοΐίοοΐΐ ааааассГдк •ЬШШадШа 7320
аабаддШЪ! (ЛаеТдШсс 1д1с1д1ааа 1ас1£££££а аадИадака ШаШШсаа 7380
дОа^дШсбс сса§1с£61д δΟΐΐ^ΐθΐΐΐ 1са£ссс1£с ааЪасаЪака ΐΐΐΐΐ^ΐΗβΐ 7440
ΐΐβΐΐΐΐΐΐΐ ΐβΐΐΐββθΐΐ а§ааасааа§ θΐ§θΐΐΐΐ8θ а1ё1саё1с1 садкГссскс 7500
ХсссГсссс! сс£сссс1§с ЬссссассГа адссссааН ссаасассШ ЬсШсГсссс 7560
аееааеед-Ьз аддсссГсса 188ёееааа-Ь сЫсаа£д£с 1д£са1;а£са Шддадсад 7620
ддссЪадасс с£ссссад1§ 1д1с1аддс6 дадададка! ссс6с1;а1;д1 ддададддс! 7680
сссааадШс аШдкдбас £адддд1ааа Гаскдаксса скаОсадкдд ссссакада! 7740
1д6ссддасс Гссаааскда οΐΐοοίοοΐΐ саеееад-ес! ддаасадКс ΐθΐβΟΐ^δΐΐ 7800
1сссада£а£ сад1с£§нёЯ кссакдадса ассссИдШ садд1сад!1 δΐΐΐοΐβΐβδ 7860
дШссссад сссддксКд асссскИдс ΐοβΐοεοΐΐο 1ссс£с£с£д сааскддакк 7920
ссададИса дс-иад-ЬёИ 1адс!д1;ддд кдбскдсакс кдсбкссакс адсбаскдда 7980
1еа§££с1с1 аддакддсак а1аадд£ад£ са£сад£с1с аШа1садад аадддсЫЛ! 8040
аадд1;адсс1 дсШадаШд ΐΐ8£ΐΐ£££§ (хаассНдк аддбскскдд 8100
- 99 013563
асадЕдасад ааЕЕсЕсЕЕЕ ааассЕаЕаа ЕддсЕсссЕс ЕдЕддЕддЕа ЕсссЕЕЕЕсЕ 8160
ЕдсЕсЕсаЕс сдЕЕссЕссс сЕдасЕадаЕ сЕЕссЕдсЕс ссЕсаЕдЕсс ЕссЕсЕсссс 8220
ЕссссЕЕсЕс сссЕЕсЕсЕЕ ЕсЕЕсЕаасЕ сссЕсЕсссс Ессасссасд аЕссссаЕЕа 8280
дсЕЕаЕдада ЕсЕЕдЬссЕЕ аЕЕЕЕадсаа аассЕЕЕЕЕд дсЕаЕааааЕ ЕааЕЕааЕЕЕ 8340
ааЕаЕдсЕЕа ЕаЕсаддЕЕЕ аЕЕЕЕддсЕа дЕаЕЕЕдЕаЕ дЕдЕЕЕддЕЕ адЕдЕЕЕЕЕа 8400
ассЕЕааЕЕд асаЕдЬаЕсс ЕЕаЕаЕЕЕад асасадаЕЕЕ аааЕаЕЕЕда адЕЕЕЕЕЕЕЕ 8460
ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ ЕЕааадаЕЕЕ аЕЕЕаЕЕЕЕЕ ЕаЕдЕсЕЕсЕ дссЕдсаЕдс садаададдд 8520
сассадаЕсЕ саЕЕсааддЕ ддЕЕдЕдадс сассаЕдЕдд ЕЕдсЕдддаа ЕЕдаасЕсад 8580
дассЕсЕдда адаасадЕса дЕдсЕсЕЕаа ссдсЕдадсс аЕсЕсЕссад ссссЕдаадЕ 8640
дЕЕЕсЕЕЕЕа аададдаЕад садЕдсаЕса ЕЕЕЕЕсссЕЕ ЕдассааЕда сЕссЕассЕЕ 8700
асЕдааЕЕдЕ ЕЕЕадссаЕЕ ЕаЕаЕдЕааЕ дсЕдЕЕасса ддЕЕЕасаЕЕ ЕЕсЕЕЕЕаЕс 8760
ЕЕдсЕаааЕЕ ЕсЕЕсссЕдЕ ЕЕдЕсЕсаЕс ЕсЕЕаЕЕЕЕЕ дЕсЕдЕЕдда ЕЕаЕаЕаддс 8820
ЕЕЕЕаЕЕЕЕЕ сЕдЕЕЕЕЕас адЕаадЕЕаЕ аЕсаааЕЕаа ааЕЕаЕЕЕЕа ЕддааЕдддЕ 8880
дЕдЕЕдасЕа саЕдЕаЕдЕс ЕдЕдсассаЕ дЕдсЕдассЕ ддЕсЕЕддсс адаадааддЕ 8940
дЕсаЕаЕЕсЕ сЕдааасЕдд ЕаЕЕдЕддаЕ дЕЕасдаасЕ дссаЕадддЕ дсЕаддааЕс 9000
ааассссадс ЕссЕсЕддаа аадсадссас ЕдсЕсЕдадс сасЕдадЕсс ЕсЕсЕЕсаад 9060
саддЕдаЕдс саасЕЕЕЕаа ЕддЕЕассад ЕддаЕаадад ЕдсЕЕдЕаЕс ЕсЕадсассс 9120
аЕдааааЕЕЕ аЕдсаЕЕдсЕ аЕаЕдддсЕЕ дЕсасЕЕсад саЕЕдЕдЕда сададасадд 9180
аддаЕсссаа дадсЕс 9196
<210> 4 <211> 25 <212> ДНК
- 100 013563 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 4 ас1са£сГ4е даа4с4сада аЬГдд 25 <210> 5 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 5 сИдассдИ ΐοΐβίοΐΐοΐ с1сд 24 <210> 6 <211> 979 <212> ДНК <213> Сгтсе1и1из еггзеиз <400> 6
ас1са£с11§ §аа1с!сада аи§ес£с-(;а •еес1асгееа ёВаНдддада сШдШад 60
асскдГааёЬ еавасаЬеса саёасаеёЬс £§ЕСс4с£сс асГёеасасН едгсавеНёа 120
адгдааддас ааааа1д11с аад1§§1сда дскссссаИ еЪаеасадсс ЬссаГссЬсд 180
1сс1сс1Ьас ЬЬасссИещ с1£1ассада адассИдса §а4сдасЬсс •Ьдадад-Ьсса 240
ЬдёЬдаЬссЬ дсаеЬдЬддг дд§1а£ссса дКЬд-Ьсааа 1ас11да1сс д1ссасаасс 300
гГддсГдиаа адддаааГад аадааассас саадаадсН ддсИсааас аЬссаеЬ-ЬаЬ 360
£§§а§1ссаН дГса^асдса сЬдасааая! дддаасадаа §са§сс11сс а1сссаЫ§а 420
ддааЕасаЬё дФасасд-Щ аадаасаШ 1садс11с1с даасесадаа £вааа§4ееа 480
- 101 013563
£ааааааа§а И-ЬдЬакс-Ьёё ссаск^аХеа οοοΐΐοΐΐΐβ 11ааа£да£§ сааадасааа 540
§£ас£ссаа1 1а1даа11Ьа ££аё^а1аа οΐοΐθίΐΐοΐ £ёёЪса%сЪё дасЬасасаа 600
ссдакасаса дааааШсас Псдеддсё!: да-ЬссЬддак акасасШФс Ьсксссад^с 660
£§ас££сс££ §1д-Ь§1асП Шсакссса дд1скв1ае§ ааэксаТдса 720
аасаскдсак сс1£а1:£сс1 скдсааасИ сса11с111а дакеасаЬс! аскаШШде 780
аддссааааЬ Ясссасаасс а§аМ§са§-Ь 11а1сс1сас саассЬсдаа сЬааа§а§§а 840
ааЬссссакд даасс'Ьддад аЬа-ЬсаЪШ кд-Ьддскдда аассаНёёа акдеккасЬс 900
ЬааавдкйФс аасадаааас каддааааас аддсскдЬас соЫхскаса аадЬссдада 960
даа§а1аеаа асе§1саа§ 979 <210> 7 <211> 979 <212> ДНК <213> Каккиз погуедхсиз <400> 7 асЬсагсШе дааЬсгсада аиддсдс-Ьа г§с1ас1дд1 ееакдёдада οΐ§ΐ§ΐΐΐ3§ 60 ассЬ§1аа§1 дадасакдса садасадакс ΐβ^οοΐοΐοο аскееасаск дд^саддЕда 120 аеЬеааЬдас ааааакаккс аадкедкдда дсЬссссаЬк вкадасадсс ИсаЬссксе 180 дссЬссИас (ЛассасЕдд скдИссаеа аяассПдса даксдасЬсд каададЬсса 240
1££1£а1;сс1 §саё1^ё§^ §ё§1£1ссса §Ис§£сааа 1а£И§аИс §1ссасаасс 300
11Е£с1а§аа ааддаааЬад аадаадссас саадаадсК ёдскксааас акссаеЬса! 360 кддадксса! д-Ьсадасдса садасаааёк ддёаасадад дсадссИсс аксссаксеа 420 ададЬасакд дкасаЬдШд аадаасакН 1са§с1Ьс!с дсасдсаеаа кдсаадкеда 480 кааааааада §ΐ3ΐεΐοΐ£§ с1ассда1§а сссФёсф-Щ Иаааёеаве сааадасааа 540
102 013563 §Ьас4ссааБ ТаБеааШа 11а§1§а1аа οΐσϋβΐΐΐοΐ 1д§1садс1§ даскасасаа600
1с§§1асаса дааааББсас ΐΐθ££§§ο§ΐ даБсс^ддаБ аБасасЖБс БсБсксаддс660 ΐ£3οΐΐοοΐ3 дЕд-ЬдГасИ 111са1ссса £§ΐοΐ£ΐο££ ёНёсЫаЪё аааксаБдса720 аасссБдсаб сс-ЬдаБдссБ скдсааасБб ссас£сШа даБдасаксб ас£а£БЫ§£780 аддссааааг дсссасаасс адаКдссдт гтатсстсас ааассгсдаа стдагдадда840 аа££ссаа£§ даассЛддад аТаБсаИде Ьдбддсбдда аассаТБддд аТддЖаббс900
4аа১Б§4с аасадаааас Шедааааас ১сБ1аБаТ сссСссБаса аадГссдада960 §аа§аТа§аа асддксаад979 <210> 8 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 8 аадБаТаадс БТасаБддаБ дасдаБа£.сд οΐ£θ£θ·£ο£ΐ; 40 <210> 9 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 9 аШаасб^с ае§аа§са« БдсддБддас ё^ёё^ёёёё 40 <210> 10 <211> 40
- 103 013563 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 10 аШааёека ссдаадсаИ 1дсдв1§сас дафддадддд 40 <210> 11 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 11 с1ссаа11а! еааШаНа 23 <210> 12 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 12 ддакдШда адссаадсИ 25 <210> 13 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 13
- 104 013563 дрссарддрд аРссРдсадР 24 <210> 14 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 14 сассааРдаР аРсЬссаддР Рсс 23 <210> 15 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 15 даРаРсдсРд сдсРсдРРдР сдас 24 <210> 16 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 16 саддааддаа ддсрддаааа дадс 24 <210> 17 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 105 013563 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 17 §а1а1с§с1§ с§с£сд1сн£ сдас 24 <210> 18 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 18 саёёааёёаа ёёс1ёё^ёа &адс 24 <210> 19 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 19 а£ес§§§са£ §дас1ёёИс 24 <210> 20 <211> 27 <212> ДНК ' <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 20 οΐθΐΐΐΐΦοβ дсНсаеяа! 27
- 106 013563 <210> 21 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 21 £1с1£аа§са 11а1еЬеИё аа§с 24 <210> 22 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 22
21§а21аса1 1са11£1ас1 23 <210> 23 <211> 575 <212> РКТ <213> Сг1се1и1из §г1зеиз <400> 23
МеЬ Аге А1а Тгр ТЬг 61у Зег Тгр Аге Тгр Не Ме1 Ьеи Пе Ьеи РЬе
5 10 15
А1а Тгр 61у ТЬг Ьеи Ьеи РЬе Туг Не С1у С1у ΗΪ5 Ьеи Уа1 Аге Азр
20 25 30
Азп Азр ΗΪ8 Рго Азр Шз 5ег Зег Аге С1и Ьеи 8ег Ьуз Пе Ьеи А1а
35 40 45
Ьуз Ьеи 61и Аг§ Ьеи Ьуз 01п 61п Азп С1и Азр Ьеи Аге Аге Ме1 А1а
50 55 60
61и 8ег Ьеи Аг§ Пе Рго 61и С1у Рго Пе Азр С1п 61у ТЬг А1а ТЬг
- 107 013563
65 70 75 80
С1у Агд Уа1 Агд Уа1 Ьеи 61и 61и С1п Ьеи Уа1 Ьуз А1а Ьуз С1и 61п
85 90 95
Не С1и Азп Туг Ьуз Ьуз С1п А1а Агд Азп Азр Ьеи С1у Ьуз Азр Н1з
100 105 110
С1и Не Ьеи Агд Агд Агд Не С1и Азп С1у А1а Ьуз 61 и Ьеи Тгр РЬе
115 120 125
РЬе Ьеи С1п Зег (11и Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи 61и С1у Азп С1и
130 135 140
Ьеи С1п Агд ΗΪ3 А1а Азр С1и Не Ьеи Ьеи Азр Ьеи 01у ΗΪ3 Н1з 61и
145 150 155 160
Агд Зег Не Μθΐ 'ГЬг Азр Ьеи Туг Туг Ьеи Зег С1п ТЬг Азр С1у А1а
165 170 175
С1у С1и Тгр Агд С1и Ьуз С1и А1а Ьуз Азр Ьеи ТЬг 61и Ьеи Уа1 С1п
180 185 190
Агд Агд Не ТЬг Туг Ьеи С1п Азп Рго Ьуз Азр Суз Зег Ьуз А1а Агд
195 200 205
Ьуз Ьеи Уа1 Суз Азп Не Азп Ьуз С1у Суз 61у Туг 01у Суз С1п Ьеи
210 215 220
ΗΪ3 Н1з Уа1 Уа1 Туг Суз РЬе Мер Не А1а Туг С1у ТЬг С1п Агд ТЬг
225 230 235 240
Ьеи Не Ьеи С1и Зег С1п Азп Тгр Агд Туг А1а ТЬг 61у С1у Тгр 61и
245 250 255
ТЬг Уа1 РЬе Агд Рго Уа1 Зег С1и ТЬг Суз ТЬг Азр Агд Зег 01у Ьеи
260 265 270
Зег ТЬг С1у ΗΪ8 Тгр Зег 61у С1и Уа1 Ьуз Азр Ьуз Азп Уа1 С1п Уа1
275 280 285
Уа1 С1и Ьеи Рго Не Уа1 Азр Зег Ьеи Н1з Рго Агд Рго Рго Туг Ьеи
290 295 300
- 108 013563
Рго Ьеи А1а Уа1 Рго С1и Азр Ьеи АХа Азр Агв 315 Ьеи Ьеи Агв УаХ Шз 320
305 310
СХу Азр Рго АХа УаХ Тгр Тгр УаХ Зег ОХп Рке УаХ Ьуз Туг Ьеи 1Хе
325 330 335
Аге Рго ОХп Рго Тгр Ьеи 01и Агв 01и 11е ОХи СХи Ткг Ткг Ьуз Ьуз
340 345 350
Ьеи СХу Рке Ьуз Шз Рго УаХ Пе ОХу УаХ Шз УаХ Агв Агв Ткг Азр
355 360 365
Ьуз УаХ СХу Ткг ОХи АХа АХа Рке Шз Рго 11е ОХи С1и Туг Мек УаХ
370 375 380
Н1з УаХ 01и 01 и Н1з Рке ОХп Ьеи Ьеи ОХи Агв Агв Мек Ьуз Уа1 Азр
385 390 395 400
Ьуз Ьуз Агв Уа1 Туг Ьеи А1а Ткг Азр Азр Рго Зег Ьеи Ьеи Ьуз СХи
405 410 415
АХа Ьуз Ткг Ьуз Туг Зег Азп Туг С1и РЬе 11е Зег Азр Азп Зег 11е
420 425 430
5ег Тгр Зег АХа ОХу Ьеи ΗΪ3 Азп Агд Туг Ткг ОХи Азп Зег Ьеи Агв
435 440 445
01 у Уа1 Пе Ьеи Азр 11е Шз Рке Ьеи Зег ОХп АХа Азр Рке Ьеи УаХ
450 455 460
Суз Ткг Рке Зег Зег С1п УаХ Суз Агв УаХ АХа Туг 01и Не МеЬ ОХп
465 470 475 480
Ткг Ьеи Н1з Рго Азр АХа Зег АХа Азп Рке ΗΪ3 Зег Ьеи Азр Азр 11е
485 490 495
Туг Туг Рке С1у С1у 01п Азп АХа Шз Азп С1п 11е А1а Уа1 Туг Рго
500 505 510
ΗΪ5 СХп Рго Агв Ткг Ьуз ОХи ОХи Не Рго МеГ ОХи Рго 01у Азр Не
515 520 525
- 109 013563
Не (Лу Уа1 А1а (Лу Азп ΗΪ3 Тгр Азп (Лу Туг Зег Ьуз (Лу Уа! Азп
530 535 540
Агд Ьуз Ьеи (Лу Ьуз ТЬг (Лу Ьеи Туг Рго 8ег Туг Ьуз Уа1 Агд (Ли
545 550 555 560
Ьуз Не С1и ТЬг Уа1 Ьуз Туг Рго ТЬг Туг Рго (Ли А1а (Ли Ьуз
565 570 575
<210> 24 <211> 575 <212> РКТ <213> Миз тизси1из
<400> 24
МеЬ Агд А1а Тгр ТЬг 01у Зег Тгр Агд Тгр Пе МеЬ Ьеи 11е Ьеи РЬе
1 5 10 15
А1а Тгр С1у ТЬг Ьеи Ьеи РЬе Туг Пе (Лу (Лу Н15 Ьеи Уа1 Агд Азр
20 25 30
Азп Азр Н1з Рго Азр ΗΪ3 Зег Зег Агд (Ли Ьеи Зег Ьуз Пе Ьеи А1а
35 40 45
Ьуз Ьеи (Ли Агд Ьеи Ьуз (Лп (Лп Азп (Ли Азр Ьеи Агд Агд МеЬ А1а
50 55 60
(Ли Зег Ьеи Агд Пе Рго (Ли (Лу Рго Пе Азр (Лп (Л у ТЬг А1а ТЬг
65 70 75 80
(Лу Агд Уа1 Агд Уа1 Ьеи (Ли (Ли (Лп Ьеи Уа1 Ьуз А1а Ьуз (Ли (Лп
85 90 95
Не (Ли Азп Туг Ьуз Ьуз (Лп А1а Агд Азп (Лу Ьеи (Лу Ьуз Азр ΗΪ5
100 105 110
(Ли Пе Ьеи Агд Агд Агд Пе (Ли Азп С1у А1а Ьуз (Ли Ьеи Тгр РЬе
115 120 125
РЬе Ьеи (Лп Зег (Ли Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи Ьуз ΗΪ3 Ьеи (Ли (Лу Азп (Ли
130 135 140
- 110 013563
Ьеи 61п Аге Ηίδ А1а Азр 61и Не Ьеи Ьеи Азр Ьеи С1у Н1з Η13 С1и
145 150 155 160
Агд Зег Не МеЕ ТЬг Азр Ьеи Туг Туг Ьеи Зег 61п ТЬг Азр 61у А1а
165 170 175
С1у Азр Тгр Аге С1и Ьуз С1и А1а Ьуз Азр Ьеи ТЬг С1и Ьеи Уа1 С1п
180 185 190
Аге Аге Не ТЬг Туг Ьеи 61 п Азп Рго Ьуз Азр Суз Зег Ьуз А1а Аге
195 200 205
Ьуз Ьеи Уа1 Суз Азп 11е Азп Ьуз С1у Суз С1у Туг 61у Суз 61п Ьеи
210 215 220
Н13 НЁз Уа1 Уа1 Туг Суз РЬе МеЕ Не А1а Туг 61у ТЬг С1п Агд ТЬг
225 230 235 240
Ьеи Не Ьеи С1и Зег 61п Азп Тгр Аге Туг А1а ТЬг 61у С1у Тгр 61и
245 250 255
ТЬг Уа1 РЬе Агд Рго Уа1 Зег С1и ТЬг Суз ТЬг Азр Агд Зег 61у Ьеи
260 265 270
Зег ТЬг 01у ΗΪ5 Тгр Зег 61у 61и Уа1 Азп Азр Ьуз Азп 11е 61п Уа1
275 280 285
Уа1 С1и Ьеи Рго Не Уа1 Азр Зег Ьеи ΗΪ5 Рго Агд Рго Рго Туг Ьеи
290 295 300
Рго Ьеи А1а Уа1 Рго 61и Азр Ьеи А1а Азр Аге Ьеи Ьеи Агд Уа1 ΗΪ5
305 310 315 320
61у Азр Рго А1а Уа1 Тгр Тгр Уа1 Зег 61п РЬе Уа1 Ьуз Туг Ьеи Не
325 330 335
Аге Рго С1п Рго Тгр Ьеи 61и Ьуз 61и Не 61и С1и А1а ТЬг Ьуз Ьуз
340 345 350
Ьеи С1у РЬе Ьуз ΗΪ3 Рго Уа1 Не 61у Уа1 Ηίε Уа1 Агд Агд ТЬг Азр
355 360 365
- 111 013563
Ьуз Уа1 О1у ТЬг С1и А1а А1а РЬе ΗΪ3 Рго Пе С1и С1и Туг Ме1 Уа1
370 375 380
ΗΪ3 Уа1 01и 01и ΗΪ8 РЬе 61п Ьеи Ьеи А1а Агд Агд Ме1 С1п Уа1 Азр
385 390 395 400
Ьуз Ьуз Агд Уа1 Туг Ьеи А1а ТЬг Азр Азр Рго ТЬг Ьеи Ьеи Ьуз С1и
405 410 415
А1а Ьуз ТЬг Ьуз Туг Зег Азп Туг С1и РЬе Пе Зег Азр Азп Зег Пе
420 425 430
Зег Тгр Зег А1а С1у Ьеи ΗΪ3 Азп Агд Туг ТЬг С1и Азп Зег Ьеи Агд
435 440 445
С1у Уа1 Пе Ьеи Азр Пе Н18 РЬе Ьеи Зег С1п А1а Азр РЬе Ьеи Уа1
450 455 460
Суз ТЬг РЬе Зег Зег С1п Уа1 Суз Агд Уа1 А1а Туг С1и Пе Μβΐ С1п
465 470 475 480
ТЬг Ьеи Из Рго Азр А1а Зег А1а Азп РЬе Шз Зег Ьеи Азр Азр Пе
485 490 495
Туг Туг РЬе 61у С1у 61п Азп А1а ΗΪ3 Азп С1п Пе А1а Уа1 Туг Рго
500 505 510
Н1з Ьуз Рго Агд ТЬг С1и С1и С1и Пе Рго МеЬ С1и Рго С1у Азр Пе
515 520 525
Не С1у Уа1 А1а 61у Азп ΗΪ3 Тгр Азр С1у Туг Зег Ьуз 61у Пе Азп
530 535 540
Агд Ьуз Ьеи С1у Ьуз ТЬг С1у Ьеи Туг Рго Зег Туг Ьуз Уа! Агд 61и
545 550 555 560
Ьуз Не С1и ТЬг Уа1 Ьуз Туг Рго ТЬг Туг Рго С1и А1а С1и Ьуз
565 570 575
<210> 25 <211> 18 <212> РКТ
- 112 013563 <213> Ното зар^епз <400> 25
Азр С1и Зег Не Туг Зег Азп Туг Туг Ьеи Туг С1и Зег Не Рго Ьуз 15 Ю 15
Рго Суз <210> 26 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 26 с11д1;д1дас 1с41аас£с1 са§а§ 25 <210> 27 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 27 сссЬсдадаЬ аасЫсдЬаЬ аде 23 <210> 28 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 28
- 113 013563
2§1ае2сс1с ас1аас1® 18 <210> 29 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 29 са!а§аааса а®1аасааса £сса& 25 <210> 30 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 30 еаеасПсае сссасПсаа 11а11е§с 28 <210> 31 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 31 §ае§ссас11 §1£1,а£С£сс аৱё 25 <210> 32 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 114 013563 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 32 сдсБсаБсас дддс 24 <210> 33 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 33
Бааддссаса адксИааН дсаБсс 26 <210> 34 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 34 οβδδδεΐβΐΐ сссЖдадда ддБееаа 27 <210> 35 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 35 ссссБсасдс а1даа§сс1§ дад 23
- 115 013563 <210> 36 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 36 ёёсаёёа%ас сассП^с^а §1§сссас 28 <210> 37 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 37
82с§с1ё£с1 -Ьасссиваеа 22аа1§£§ 28 <210> 38 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 38 ааааёёсс1с аяПа^Ьнаа с1£1а1£§ 28 <210> 39 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 116 013563 <223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 39 сдсддаЬсс! саадсдИдд ддПддксс 29 <210> 40 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 40 сссааёсИё ссассакддс 1сасёс1ссс дс!адс1дсс сдадс 45 <210> 41 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 41 ссддааНс! §ссаад1а1д адсса!сс1д д 31 <210> 42 <211> 17 .
<212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 42 дссаЬссада аддЬдд! 17 <210> 43
- 117 013563 <211> 17 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 43 §кскк§ксав вваа§ак 17 <210> 44 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 44
В§сав§а§ас сассккдсда §к§сссас 28 <210> 45 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 45 ёёйЕёёёскв кассЫсквё аасавввс 28 <210> 46 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК
- 118 013563 <400> 46
8§θβοΐ££θΐ касссдеана §еаа1дд§ 28 <210> 47 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 47 дяааФдедТд ΐΐΐ^ΐοΐοοΐο сааада1;дс 28 <210> 48 <211> 1316 <212> ДНК <213> Сг1се1и1из дНзеиз <400> 48
дссссдсссс с1ссасс1§£ ассдададЬа дсгддаеаа! £ё^ёсассёё аад1адс1ск 60
даассс1£с§ саёё^ё^аёс аасаа1££§1; ёаёссссаёё еагсса^ае 120
дакссЬадЬд с1еёас1яё! дедсададс! акссадаадд 180
ЬддсдсЬедс Шасссддад аддаа!ёё§1 §ΐΐΐ£ΐθΐθθ Ьссааэдакд садаксЬдас 240
ддаЬёсадса сааасссаад ссскдкбсса дааддЬасаё сссасссаТ§ ЬсаЬссаЬсЬ 300
ЬдсЬдсааЬе дЬаддаддсс ЬЬЫссееаа 1а1сааа1;ас аасИддаЫ ЬсЬддаддаа 360
ЕааЬЕЬясас аЬсааЬдаса асеЪссЪкса сксаесШс еаееЬеееса сЬсесааегк 420
ддксЬсскдс сЬ§1ссасс! дкаксИссс Ьдасаадасс ассЬакссЬа Т1да1§ааас 480
аакдаЬссас аа!д§1ссас сссаса&са§ сааЬи1д£§ 1ас1с§Ьа1;ё ссаададдак 540
еаИеас81§ саёаасаёёё сскасЬЬсса дсаесакддс 1§сасс!1са с1дс1дЬсаЬ 600
сссТассаа! βΐσΐΐΐβββο сксакдасаа сШсаасаИ ёааёШёёсс а1д1дс1дсс 660
- 119 013563
1§§сс1са1с са!,а১1§с аГсГввссаа вавГааГввЬ ГсавссБГва с1ёШ§ёёё 720
Гаса§ввааа ссас§§аввс адТХсаГсГа сГсасГввас сГавсссввс ГсГГсаГсГв 780
§§ЬссГ§с§§ вавЬасааГв аавПвавсс саГсаБссБс ГсавГввясв аввааваГва 840
адГсГссаГГ аавваввсав сГвавесГвЬ авквеаввсс аГввасЫсГ вГвеёёаавк 900
ΟΘΟΐΐΐΐβθΐ ГсаасааавБ саваЕвввса В1а4ааваав асавссавса аГвясаавсГ 960
ЬсвяЕссЬас ΐΐβΟΟΐββΐΐ ЬссяШЬсас асссПхаав са§вс1;вЬва аввавассЕв 1020
ΐβΟΟΐββΐΐΟ ассвасаасГ аГвавсавес ссвяаав-Ьва аясаЬвевас аавсввеЬёс 1080
ГсавсГввса аГдсссаяГс авГавесГвс авГсГсаГса ΐΐΐβΟΐΐβΐΟ ааваасГвав 1140
дасадГаГсс адсаассГва ВСсасаГвсЬ ЯВГсГсГсГв ссаввввясЪ ГсаГвсавсс 1200
аГссавЬавв ВессаГвПЬ ВкссаЬссГс ввеёеааввс савассааса οοΐΐΒΐΐΐεΐ 1260
сГвсГГсБяс сссаассГса ЯГВсаЕсса! ВсГявЕссГв сГв^сссЫв Бскава 1316
<210> 49 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 49 ваГссГвсГв §§ассааааГ Гве 23 <210> 50 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК
- 120 013563 <400> 50 сКаасаЬсс саадддаБдс 22 <210> 51 <211> 1965 <212> ДНК <213> Сг1сеБи1из дгхзеиз <400> 51
ас£е££££С1 сссддаадс® ёёёасса1§ё ο^ΐοΐοΐβοβ сдаадсдадс сБёсддаайс 60
БдсддсдсП £1сс§ада1§ ададдсааас сБд-Ьддсаас кдддаааПс ЪёёёаЬёбаё 120
Ид1аа1аас адсадскдас ёааааёса^ё аесИдсББа саадсаасад Б1еБсд®аЕа 180
адсГдаадад аааддааНд ссссЖддад НаасБасса ΐ^ΐΐΐϋοθοΐ дакссБссБд 240
ёаассааааЪ Бддааабдда ддаксаасас ΐΐΐβΐΐοΐοΐ 1сад1§ссБд дааадссксБ 300
акнеадасаа Я1££аа1Бсс ИсасадСсс 1д£1аа1Бса θΐθΐε£ΐ£βθ 1аса§1саас 360
дасИсссаа Бдсаадсес! •Ыаддааааа 1с!1сас§£с ИБассасББ ёё^ёаёссса 420
Ь11а1садаБ ёЪбёёасЫа ааас1а§сса БББссссБса сдсакдаадс 480
е§1сасс1д1 ёса§а1ёа1а ШеаасБаЬа садсаШдёё §ас1с1да®Б 540
ссаЖесаЖ БдадсадссБ ££С1Нас1£ ссскадссса 1сса1с£а§1 с1вдс1д1а§ 600
дсассасаса ΐβδββΐβΐΐΐ £1а«£дас£ сбдссддЖс Ш§сааса1 8£1дасс£ад 660
адЪасаддса аБдссассд! Б1сс£сса1а адсссадса! 1§ааааса£§ сассасШа 720
акдссдБдса БадасБадда аасаёёасИ £3£ΐ£££££ΐ дасассасск 780
дБсаБсса!·! дсас1с1£а£ Ба1д£с1аса са£а1а£сс1 Ηΐΐΐίηοβΐ^ ЯаксаБааа! 840
садссааааа дсБасББда! Б-ЬсБаБдааа §Б§Бае§ссс асБдаасБдк даааБадаБд 900
ссШеегда с111с1дсад дсаскдддас сБддадсаас БдсададБас ассаадааса 960
- 121 013563
ссЬсасасд! сасДааадад даа!сасас£ 1дИддаса1 даддсадааа а£аБ1ссасс 1020
4сс1;сааддд аасасссскд аа^дНдНд ЬссНааЬаа сЬссаддНЬ ЬаБсасаНд 1080
даасаасдда ддадЬаЬскд сЬасаНЬса сИссааЬдд ШсдНасад дсададс£дд 1140
дсНдсааБс саЬадсИЬс ββΐβΐοΐΐΐο сааа£д4дсс Ьдаадасксс саЬдадааас 1200
ссйдДдБсаД ДсасадсаЬс сДдааШсад да£дс£д£д£ ддссссДддс 1сад£дд1ад 1260
аакаДДссад аДДаддассй дадд1;д1сса 1с1сддаааа сБдсаШаЬс адсддНсЬд 1320
Дса1;адаааа адсБдНсЬд сссссаДдН сШсд£д£д сЬсШаад! д£ддадаДаа 1380
а£ддасас1Б адааБаББса асБаБддЬдЬ ИддсаДдда адасаасНд аадаасадБд 1440
ДДаааассаД аксадаДаДа аадаДдсШс адНсДНдд адДсДдДНс с1£асШдШ 1500
ДаеаБаБШд даассШааа дсДаДддаад ааскаШЛс аддаадДаад асдсадсДда 1560
дссЬд-Ьддас ЬдсБсдааШ ЫсссБдДсБ дШсНсБс! дадДдад-Ьсд дШдсадсаБ 1620
сссПдддаЬ дНаааЬдсс аНсдааасс аНсдссаН садссЛдадс аасДЬсаадс 1680
•СдсЬдДссаД ссаддаааДд с££с£с£дса аада!д£адд адасакдсН дсПасаддд 1740
адсаасБсШ БсЬадаааБс адБДсааада даааасадДс 1даНсддад аааБсББааа 1800
ЬасааЬдда-Ь ДШдссДдда аасаддаНд саааЬдсадд саДаШсйаД адаксБсЬдд 1860
£ΐΐθΐΐθΐΐΐ сЬШсЬсссс ΐοΐοΐοοΐΐΐ οοΐΐΐοεοΐΐ £да£д£аа'Ьд асаааддДаа 1920
аааЬддссас ШсЬдакдда аааааааааа аааааааааа ааааа 1965
<210> 52 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК
- 122 013563 <400> 52 ссс-Пеаёёа ёё^ёёаа 27 <210> 53 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 53 сас4§а§сса еееессасас аёсаГсс 27 <210> 54 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 54 ссссГсасес а£еаа§сс1Е 23 <210> 55 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 55
4§ссассе44 ГссГссаГаа §ссса§с 27 <210> 56 <211> 28 <212> ДНК
- 123 013563 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 56 а12§с1саая с1ссс£с1аа £1£ссс£а <210> 57 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 57
<210> 58 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 58
1сс姧§а12 §сёа§а122§ саа§с 25 <210> 59 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 59 с-ЩасаЬее с1с1££§с1с саа§
- 124 013563 <210> 60 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 60 ссаскЬсад! сёё^сёёЪ&ё ФаШ! 25 <210> 61 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 61 сесЬсасссд сскдаддсда 24 <210> 62 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 62 §§саЕ§-Ьдсг ГсассаГадЬ §с 32 <210> 63 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 125 013563 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 63 ддддссакдс сааддаскак 24 <210> 64 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 64 акдкддскда кдккасаааа кдакд 25 <210> 65 <211> 1504 <212> ДНК <213> Сг1секи1из дНзеиз <220>
<221> СЬЗ <222> (1)..(1119) <400> 65
ак§ Мек 1 §οί А1а сас дек ссс Рго 5 дек аде А1а Зег к§с Суз ссд аде кос адд аас кек С1у 15 дас Азр 48
Н1з А1а Рго Зег 10 Зег Агд Азп Зег
ёёс да! аад ёёс аад ссс адд аад есд скс акс асд ёёс акс асе 96
01у Азр Ьуз 61у Ьуз Рго Агд Ьуз Уа1 А1а Ьеи Не ТЬг С1у Не ТЬг
20 25 30
ёёс сад дак ёёс кса кас ккд дса даа ккс скд скд ё^ё ааа ёёа кас 144
61у 61п Азр 61у Зег Туг Ьеи А1а С1и РЬе Ьеи Ьеи 61и Ьуз 61у Туг
35 40 45
ё&ё дкк сак ёёа акк §ка Сёё еда ксс адк кса ккк аак аса ддк еда 192
С1и Уа1 ΗΪ5 С1у Не Уа1 Агд Агд Зег Зег Зег РЬе Азп ТЬг С1у Агд
- 126 013563
50 55 60
акк ёаа сак кка как аад аак сса сад ёск сак акк ёаа ёёа аас акв 240
Не (Ии ΗΪ3 Ьеи Туг Ьуз Азп Рго (Ип А1а Н1з Пе (Ии (Иу Азп Мек
65 70 75 80
аа§ кк§ сас как ёё* §ас скс асе ёас аде асе кде ска ёСа ааа акс 288
Ьуз Ьеи ΗΪ3 Туг (Ну Азр Ьеи ТЬг Азр Зег ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз Пе
85 90 95 100
акс аак ёаа ёкс ааа сск аса ёаё акс кас аак екк ёё'Ь ёсс сав авс 336
Не Азп (Ии Уа1 Ьуз Рго ТЬг (Ии Пе Туг Азп Ьеи (Иу А1а 01п Зег
105 110 115
сак Εΐο аав акк ксс ккк ёас кка вса ёаё кас аск ёса ёак εΐί ёак 384
Н1з Уа1 Ьуз Пе Зег РЬе Азр Ьеи А1а (Ии Туг ТЬг А1а Азр Уа1 Азр
120 125 130
ёёа §кк ёёс асе кк§ сёё екк скв ёак ёса акк аав аск квк ёёс екк 432
01у Уа1 (Иу ТЬг Ьеи Аг в Ьеи Ьеи Азр А1а Пе Ьуз ТЬг Суз (Иу Ьеи
135 140 145
ака аак кек аав ккс кас сав дсс кса аск адк ёаа скв как ёёа 480
Не Азп Зег Уа1 Ьуз РЬе Туг (Ип А1а Зег ТЬг Зег 01 и Ьеи Туг С1у
150 155 160
ааа ёЬё саа §аа ака ссс сав ааа ёаё асе асе сск ккс как сса аёё 528
Ьуз Уа1 (Ип (Ии Не Рго (Ип Ьуз (Ии ТЬг ТЬг Рго РЬе Туг Рго Агв
165 170 175 180
кс§ ссс как ёёа ёса вес ааа екк как ЯСС как акк В^а ё^ё аас 576
Зег Рго Туг С1у А1а А1а Ьуз Ьеи Туг А1а Туг Тгр Пе Уа1 Уа1 Азп
185 190 195
ккк с§а ёаё §ск как аак скс ккк ёСё ёЬё аас ёёс акк скс ккс аак 624
РЬе Агд (Ии А1а Туг Азп Ьеи РЬе А1а Уа1 Азп (Иу Пе Ьеи РЬе Азп
200 205 210
сак ёав а§к сск а§а ава ёёа ёск аак ккк ёЬЬ аск с§а ааа акк авс 672
Н1з (Ии Зег Рго Агв Агв (Иу А1а Азп РЬе Уа1 ТЬг Агв Ьуз Пе Зег
215 220 225
сее кса £кй §ск аав акк кас екк ёёа саа скв ёаа ЬёЬ ккс авк ккв 720
- 127 013563
Агв Зег 230 Уа1 А1а Ьуз Не Туг Ьеи 235 01у С1п Ьеи (Ии 240 Суз РЬе Зег Ьеи
ёёа ааХ сбв Вас Ясс ааа сяа вас ^вя ВВС саЬ Ясс аав Вас ЬаЬ вЬс 768
61у Азп Ьеи Азр А1а Ьуз Аг я Азр Тгр (Ну ΗΪ8 А1а Ьуз Азр Туг Уа1
245 250 255 260
вав ВСЬ аЬв Рев сЬй аЬя На саа ааЬ каЬ ваа сса как вас ЫН вЬс 816
61и А1а МеЬ Тгр Ьеи МеЬ Ьеи 01п Азп Азр С1и Рго (Ии Азр РЬе Уа1
265 270 275
аЬа ВсЬ асЬ ввв Яаа βΐΐ са! аяЬ ВЪс св* Ваа ΐΐΐ βΐΐ вая ааа Ьса 864
Не А1а ТЬг 61у С1и Уа1 ΗΪ5 Зег Уа1 Аг в С1и РЬе Уа1 (Ии Ьуз Зег
280 285 290
Нс а££ сас аЬЬ ВВа аа§ асе аЫ ΒΐΒ ΐΒΒ Ваа ВВа аав аа£ яаа аа£ 912
РЬе МеЬ ΗΪ3 Не С1у Ьуз ТЬг Не Уа1 Тгр С1и 01у Ьуз Азп (Ии Азп
295 300 305
§аа В^В ВВС аеа ьяь ааа яая асе ВВС ааа а£Ь саЬ 8ΐε асЬ ΒΐΒ ваЬ 960
С1и Уа1 С1у Аг § Суз Ьуз С1и ТЬг 01у Ьуз Не ΗΪ3 Уа1 ТЬг Уа1 Азр
310 315 320
сЬв ааа Ьас £ас сяа сса асЬ Яаа ΒΐΒ вас Нс С1в сав ВВа. вас £вс 1008
Ьеи Ьуз Туг Туг Аге Рго ТЬг 61и Уа1 Азр РЬе Ьеи (Ил 61у Азр Суз
325 330 335 340
Ьсс аав ВОВ сав сав ааа сЬя аас ΪΒΒ аав ссс сяс βΐΐ вес ЫН Вас 1056
Зег Ьуз А1а С1п С1п Ьуз Ьеи Азп Тгр Ьуз Рго Агв Уа1 А1а РЬе Азр
345 350 355
Ва§ с£§ ΒΪΒ аёё Вая аЬя Βΐ£ саа \ Ясс ВаЬ ΒΪΒ вая сЬс аЬв ава асе 1104
С1и Ьеи Уа1 Агв С1и Ме£ Уа1 С1п А1а Азр Уа1 (Ии Ьеи МеЬ Агв ТЬг
360 365 370
аас ссс аас §сс Ьва всассЬсЬас аааааааЫс всвавасаЬв васЬаЬввЬв 1159 Азп Рго Азп А1а
375 са£а£сса§с саасса^а^ ссавссасЕс сЬвавассаЬ свассаЬааа сссЕсвасЬв1219 οοΐ§ΐ§ΐο§ΐ ссссасаясЬ аававсЬввв ссасаввЫН в^ВВЕсасса ввасвяввас1279 асЬссававс ЬааввссасЬ ΐο§οΐΐΐΐβΐ саааввс£сс ЬсЬсааЬваЬ ЫЬвВВаааЬ1339 сааваавЫН ааааЬсасаЬ асЕсаЫЫа сЩаааШа ЬвТсасЬава саасЬЬаааЬ1399
- 128 013563
11115а§1с1 1§а2а11§Ы ΐΐΐοΐοΐΐΐΐ сПаПааа! §а1сШ;с1а 1£ассса§са 1459 аааааааааа аааааа£££а 1а1ааааааа аааааааааа ааааа 1504 <210> 66 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 66 а1даа£П£С ас1а1§§12а сс!са 25 <210> 67 <211> 59 <212> ДНК <213> Сг1се-Ьи1из 2Г1зеиз <400> 67 сс£аса§сас с1§сс1а£1а аааа!са1са а12аа§1саа ассЬаса^а^ а1с1асаа! 59 <210> 68 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 68 <210> 69 <211> 25
<212> <213> ДНК Искусственная последовательность
<220>
- 129 013563 <223> Описание искусственной последовательности: синтетическая ДНК <400> 69 асс-Щёа4а 25 <210> 70 <211> 125 <212> ДНК <213> Сг1се4и1из §г1зеиз <400> 70
ЬЕёсассПЕ сеесНсЬе6 аЬЕсааЫаа ΕβοΐΐΕΐΕδο сЬ4аЬаааЫ 60 с4§4еаа§11 с1асс১сс 4саас1ае£е аас4§£а4§£ аааа§£§саа §ааа£асссс 120 аеааа 125 <210> 71 <211> 376 <212> РКТ <213> Сг1сеЬи1из §г1зеиз <400> 71
Ме£ А1а Н1з А1а Рго А1а Бег Суз Рго Зег Зет Аге Азп Зег С1у Азр
1 5 10 15
С1у Азр Ьуз 61у Ьуз Рго Аге Ьуз Уа1 А1а Ьеи Пе ТЬг С1у Пе ТЬг
20 25 30
С1у С1п Азр 61у Зег Туг Ьеи А1а С1и РЬе Ьеи Ьеи С1и Ьуз С1у Туг
35 40 45
61и Уа1 Η15 01 у Не Уа1 Аг§ Аг§ Зег Зег Зег РЬе Азп ТЬг С1у Аге
50 55 60
Не С1и ΗΪ3 Ьеи Туг Ьуз Азп Рго С1п А1а ΗΪ5 Пе (Ли С1у Азп МеЬ
65 70 75 80
Ьуз Ьеи ΗΪ3 Туг 01у Азр Ьеи ТЬг Азр Зег ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз Пе
85 90 95 100
Не Азп С1и Уа1 Ьуз Рго ТЬг С1и Не Туг Азп Ьеи С1у А1а С1п Зег
105 110 115
- 130 013563
Н13 Уа1 Ьуз Не 120 Зег РЬе Азр Ьеи А1а (Ии Туг 125 . ТЬг А1а Азр Уа1 130 Азр
01у Уа1 С1у ТЬг Ьеи Агд Ьеи Ьеи Азр А1а Не Ьуз ТЬг Суз (Ну Ьеи
135 140 145
Не Азп Зег Уа1 Ьуз РЬе Туг 61п А1а Зег ТЬг Зег (Ли Ьеи Туг 61 у
150 155 160
Ьуз Уа1 С1п (Ли Не Рго С1п Ьуз (Ли ТЬг ТЬг Рго РЬе Туг Рго Агд
165 170 175 180
8ег Рго Туг С1у А1а А1а Ьуз Ьеи Туг А1а Туг Тгр Не Уа1 Уа1 Азп
185 190 195
РЬе Агд С1и А1а Туг Азп Ьеи РЬе А1а Уа1 Азп С1у Не Ьеи РЬе Азп
200 205 210
Н1з (Ни Зег Рго Агд Агд С1у А1а Азп РЬе Уа1 ТЬг Агд Ьуз Не Зег
215 220 225
Агд Зег Уа1 А1а Ьуз Не Туг Ьеи С1у 61п Ьеи (Ли Суз РЬе Зег Ьеи
230 235 240
61у Азп Ьеи Азр А1а Ьуз Агд Азр Тгр (Ну ΗΪ5 А1а Ьуз Азр Туг Уа1
245 250 255 260
С1и А1а Мек Тгр Ьеи Ме! Ьеи С1п Азп Азр (Ли Рго 61 и Азр РЬе Уа1
265 270 275
Не А1а ТЬг С1у (Ни Уа1 Нхз 5ег Уа1 Агд 61и РЬе Уа1 (Ии Ьуз Зег
280 285 290
РЬе Ме! ΗΪ3 Г1е (Ну Ьуз ТЬг Не Уа1 Тгр (Ли С1у Ьуз Азп 61и Азп
295 300 305
С1и Уа1 С1у Агд Суз Ьуз С1и ТЬг 61у Ьуз Не ΗΪ3 Уа.1 ТЬг Уа1 Азр
310 315 320
Ьеи Ьуз Туг Туг Агд Рго ТЬг С1и Уа1 Азр РЬе Ьеи С1п 61у Азр Суз
325 330 335 340
- 131 013563
Зег Ьуз А1а С1п 61п Ьуз Ьеи Азп Тгр Ьуз Рго Агд Уа1 А1а РЬе Азр
345 350 355
61и Ьеи Уа1 Аг§ 01и МеЕ Уа1 61п А1а Азр Уа1 61и Ьеи МеЕ Агд ТЬг
360 365 370
Азп Рго Азп А1а
375 <210> 72 <211> 321 <212> РКТ <213> Сг1сеЕи1из дгхзеиз <400> 72
МеЕ С-1 у 61 и Рго С-1п Г.Ьг 8вг Йггг Лг’ГГ Не £,@ц Уа1 ΤΗν Г. 1м /21»,
ч. Д. , “*· 6 ί хх 6 л .ш. мл 7 мл у
1 5 10 15
С1у Ьеи Уа1 61у Агд А1а Не 61п Ьуз Уа1 Уа1 А1а Азр 61у А1а 61у
20 25 30
Ьеи Рго 61у С1и 61и Тгр Уа1 РЬе Уа1 Зег Зег Ьуз Азр А1а Азр Ьеи
35 40 45
ПМ. ... А 1
1ΩΓ Азр та А1а 61п Тпг 61п А1а Ьеи РЬе 1ИП Ьуз Уа1 61п Рго ТЬг
50 55 60
ΗΪ3 Уа1 Не Н1з Ьеи А1а А1а МеЕ Уа1 61у 61у Ьеи РЬе Агд Азп Не
65 70 75 80
Ьуз Туг Азп Ьеи Азр РЬе Тгр Агд Ьуз Азп Уа1 ΗΪ3 Не Азп Азр Азп
85 90 95
Уа1 Ьеи ΗΪ3 Зег А1а РЬе 61и Уа1 61у ТЬг Агд Ьуз Уа1 Уа1 Зег Суз
100 105 110
Ьеи Зег ТЬг Суз Не РЬе Рго Азр Ьуз ТЬг ТЬг Туг Рго Не Азр 61и
115 120 125
ТЬг МеЕ Не ΗΪ3 Азп 61у Рго Рго Н1з Зег Зег Азп РЬе 61у Туг Зег
130 135 140
- 132 013563
Туг А1а Ьуз Агд МеЬ Не Азр Уа1 (Ип Азп Агд А1а Туг РЬе С1п (Ип
145 150 155 160
ΗΪ8 (Иу Суз ТЬг РЬе ТЬг А1а Уа1 Не Рго ТЬг Азп Уа1 РЬе (Иу Рго
165 170 175
Н18 Азр Азп РЬе Азп Не (Ии Азр (Иу ΗΪ8 Уа1 Ьеи Рго С1у Ьеи 11е
180 185 190
Н13 Ьуз Уа1 ΗΪ8 Ьеи А1а Ьуз Зег Азп (Иу Зег А1а Ьеи ТЬг Уа1 Тгр
195 200 205
01 у ТЬг (Иу Ьуз Рго Агд Агд (Ип РЬе Не Туг Зег Ьеи Азр Ьеи А1а
210 215 220
Агд Ьеи РЬе Не Тгр Уа1 Ьеи Агд С1и Туг Азп (Ии Уа1 (Ии Рго Не
225 230 235 240
Не Ьеи Зег Уа1 (Иу (Ии (Ии Азр (Ии Уа1 Зег Не Ьуз (Ии А1а А1а
245 250 255
(Ии А1а Уа1 Уа1 (Ии А1а Ме1 Азр РЬе Суз (Иу (Ии Уа1 ТЬг РЬе Азр
260 265 270
Зег ТЬг Ьуз Зег Азр (Иу (Ип Туг Ьуз Ьуз ТЬг А1а Зег Азп (Иу Ьуз
275 280 285
Ьеи Агд А1а Туг Ьеи Рго Азр РЬе Агд РЬе ТЬг Рго РЬе Ьуз (Ип А1а
290 295 300
Уа1 Ьуз С1и ТЬг Суз А1а Тгр РЬе ТЬг Азр Азп Туг (Ии (Ип А1а Агд
305 310 315 320
ЬуЗ <210> 73 <211> 590 <212> РКТ <213> Сг1сеЬи1из дНзеиз <400> 73
МеЬ А1а Зег Ьеи Агд (Ии А1а Зег Ьеи Агд Ьуз Ьеи Агд Агд РЬе Зег
- 133 013563
1 5 10 15
С1и МеЬ Аг§ С1у Ьуз Рго Уа1 А1а ТЬг С1у Ьуз РЬе Тгр Азр Уа1 Уа1
20 25 30
Уа1 Не ТЬг А1а А1а Азр С1и Ьуз 61п С1и Ьеи А1а Туг Ьуз С1п С1п
35 40 45
Ьеи 8ег С1и Ьуз Ьеи Ьуз Аге Ьуз С1и Ьеи Рго Ьеи (И у Уа1 Азп Туг
50 55 60
ΗΪ3 Уа1 РЬе ТЬг Азр Рго Рго С1у ТЬг Ьуз Пе 61у Азп С1у 01у Зег
65 70 75 80
ТЬг Ьеи Суз Зег Ьеи С1п Суз Ьеи С1и Зег Ьеи Туг С1у Азр Ьуз Тгр
85 90 95
Азп Зег РЬе ТЬг Уа1 Ьеи Ьеи Пе Шз Зег С1у С1у Туг Зег С1п Аге
100 105 110
Ьеи Рго Азп А1а 8ег А1а Ьеи 61у Ьуз Пе РЬе ТЬг А1а Ьеи Рго Ьеи
115 120 125
С1у С1и Рго Не Туг С1п МеЬ Ьеи Азр Ьеи Ьуз Ьеи А1а МеЬ Туг Мек
130 135 140
Азр РЬе Рго Зег Агд МеС Ьуз Рго 61у Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг Суз А1а Азр
145 150 155 160
Азр Пе 61и Ьеи Туг 8ег Пе 61у Азр Зег С1и Зег Пе А1а РЬе (Ии
165 170 175
С1п Рго 01 у РЬе ТЬг А1а Ьеи А1а Ηΐβ Рго Зег Зег Ьеи А1а Уа1 01у
180 185 190
ТЬг ТЬг ΗΪ3 01у Уа1 РЬе Уа1 Ьеи Азр Зег А1а 61у Зег Ьеи 61п Н15
195 200 205
С1у Азр Ьеи 61и Туг Аге С1п Суз ΗΪ5 Аге РЬе Ьеи ΗΪ8 Ьуз Рго Зег
210 215 220
Не С1и Азп МеЬ ΗΪ8 ΗΪ3 РЬе Азп А1а Уа1 ΗΪ3 Аге Ьеи С1у Зег РЬе
225 230 235 240
- 134 013563
С1у С1п 61п Азр Ьеи 245 Зег С1у 61у Азр ТЬг ТЬг Суз Η18 250 Рго Ьеи 255 Н18
Зег (Ии Туг Уа1 Туг ТЬг Азр Зег Ьеи РЬе Туг МеЬ Азр ΗΪ3 Ьуз Зег
260 265 270
А1а Ьуз Ьуз Ьеи Ьеи Азр РЬе Туг (Ли Зег Уа1 (Лу Рго Ьеи Азп Суз
275 280 285
(Ии Пе Азр А1а Туг С1у Азр РЬе Ьеи (Лп А1а Ьеи 01 у Рго (Иу А1а
290 295 300
ТЬг А1а (Ии Туг ТЬг Ьуз Азп ТЬг Зег Н1з Уа1 ТЬг Ьуз (Ли (Ли Зег
305 310 315 320
Н1з Ьеи Ьеи Азр МеЬ Агд (Лп Ьуз Пе РЬе ΗΪ3 Ьеи Ьеи Ьуз 01у ТЬг
325 330 335
Рго Ьеи Азп Уа1 Уа1 Уа1 Ьеи Азп Азп Зег Агд РЬе Туг Шз Пе (Лу
340 345 350
ТЬг ТЬг (Ии С1и Туг Ьеи Ьеи Н1з РЬе ТЬг Зег Азп 01 у Зег Ьеи (Лп
355 360 365
А1а (Ии Ьеи 61у Ьеи С1п Зег Пе А1а РЬе Зег Уа1 РЬе Рго Азп Уа1
370 375 380
Рго С1и Азр Зег ΗΪ3 (Ли Ьуз Рго Суз Уа1 Пе ΗΪ3 Зег Пе Ьеи Азп
385 390 395 400
Зег С1у Суз Суз Уа1 А1а Рго С1у Зег Уа1 Уа1 (Ли Туг Зег Агд Ьеи
405 410 415
01у Рго (Ии Уа1 Зег Пе Зег (Ии Азп Суз Пе Пе Зег (Иу Зег Уа1
420 425 430
Пе С1и Ьуз А1а Уа1 Ьеи Рго Рго Суз Зег РЬе Уа1 Суз Зег Ьеи Зег
435 440 445
Уа1 01и Пе Азп 01у ΗΪ8 Ьеи (Ли Туг Зег ТЬг МеЬ Уа1 РЬе С1у МеЬ
450 455 460
- 135 013563
(Ии Азр Азп Ьеи Ьуз Азп Зег Уа1 Ьуз ТЬг Пе Зег Азр 11е Ьуз Мег
465 470 475 480
Ьеи 61п РЬе РЬе С1у Уа1 Суз РЬе Ьеи ТЬг Суз Ьеи Азр Пе Тгр Азп
485 490 495
Ьеи Ьуз А1а Ме1 (Ли (Ли Ьеи РЬе Зег С1у Зег Ьуз ТЬг (Лп Ьеи Зег
500 505 510
Ьеи Тгр ТЬг А1а Агд Пе РЬе Рго Уа1 Суз Зег Зег Ьеи Зег С1и Зег
515 520 525
Уа1 А1а А1а Зег Ьеи С1у Μβΐ Ьеи Азп А1а Не Агд Азп ΗΪ3 Зег Рго
530 535 540
РЬе Зег Ьеи Зег Азп РЬе Ьуз Ьеи Ьеи Зег 11е 01п (Ии Мег Ьеи Ьеи
545 550 555 560
Суз Ьуз Азр Уа1 С1у Азр Мег Ьеи А1а Туг Агд С1и 61η Ьеи РЬе Ьеи
565 570 575
(Ли Пе -Зег Зег Ьуз Агд Ьуз С1п Зег Азр Зег (Ли Ьуз Зег
580 585 590

Claims (14)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство, содержащие ген, кодирующий молекулу антитела, и продуцирующие композицию антител со сложными углеводными цепями, присоединенными через Ν-гликозидные связи к Ес-области, где в композиции среди всех углеводных цепей, присоединенных через Ν-гликозидные связи к Ес-области, доля цепей, в которых фукоза по первому положению не связана посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, составляет 20% или более, причем указанная композиция антител обладает более высокой антителозависимой клеточной цитотоксичностью, чем антитело, полученное из родительской клеточной линии, а геном животного или его потомства модифицирован таким образом, что активность фермента, ответственного за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида С^Ρ-фукозы, и/или активность фермента, ответственного за модификацию углеводных цепей, в которых фукоза по первому положению связана посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, уменьшена.
  2. 2. Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство по п.1, в котором «нокаутирован» ген, кодирующий фермент, ответственный за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида С^Ρ-фукозы, и/или ген, кодирующий фермент, ответственный за модификацию углеводных цепей, в которых фукоза по первому положению связана посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи.
  3. 3. Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство по п.1 или 2, в котором фермент, ответственный за синтез внутриклеточного углеводонуклеотида С^Ρ-фукозы, представляет собой фермент, выбранный из группы, включающей:
    (a) 0ΜΌ (С^Ρ-маннозо-4,6-дегидратаза);
    (b) Ех (С^Ρ-кето-6-дезоксиманнозо-3,5-эпимераза,4-редуктаза);
    (c) ΟЕΡΡ (С^Ρ-бета-^-фукозопирофосфорилаза).
  4. 4. Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство по п.3, где 0ΜΌ представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, включающей:
    (a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность ЗЕО ΙΌ NΟ:65;
    (b) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность ЗЕО ΙΌ NΟ:65, и кодирующую белок, обладающий САЮ-активностыо.
  5. 5. Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство по п.3, где Ех представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, включающей:
    (a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность ЗЕО ΙΌ NΟ:48;
    (b) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность ЗЕО ГО NΟ:48, и кодирующую белок, обладающий Ех-активностью.
  6. 6. Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство по п.3, где СЕΡΡ представляет собой белок, кодируемый ДНК, выбранной из группы, включающей:
    - 136 013563 (a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность 8Ε^ ΙΌ N0:51;
    (b) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8Ε^ ΙΌ N0:51, и кодирующую белок, обладающий ОЕРР-активностью.
  7. 7. Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство по п.1 или 2, где фермент, ответственный за модификацию углеводных цепей, в которых фукоза по первому положению связана посредством α-связи с Ν-ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, представляет собой а-1,6-фукозилтрансферазу.
  8. 8. Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство по п.7, где α-1,6фукозилтрансфераза кодируется ДНК, выбранной из группы, включающей:
    (a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность 8Ε^ ΙΌ N0:1;
    (b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность 8Ε^ ΙΌ N0:2;
    (c) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8Ε^ ΙΌ N0:1, и кодирующую белок, обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью;
    (ά) ДНК, гибридизующуюся в жестких условиях с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность 8Ε^ ΙΌ N0:2, и кодирующую белок, обладающий а-1,6-фукозилтрансферазной активностью.
  9. 9. Трансгенное животное, не являющееся человеком, или его потомство по любому из пп.1-8, где трансгенное животное, не являющееся человеком, представляет собой животное, выбранное из группы, включающей крупный рогатый скот, овец, коз, свиней, лошадей, мышей, крыс, домашнюю птицу, обезьян и кроликов.
  10. 10. Способ получения композиции антител со сложными углеводными цепями, присоединенными через ^гликозидные связи к Ес-области, где в композиции среди всех углеводных цепей, присоединенных через ^гликозидные связи к Ес-области, доля цепей, в которых фукоза по первому положению не связана посредством α-связи с №ацетилглюкозамином в шестом положении на восстанавливающем конце сложной углеводной цепи, составляет 20% или более, причем указанная композиция антител обладает более высокой антителозависимой клеточной цитотоксичностью, чем антитело, полученное из родительской клеточной линии, который предусматривает выращивание трансгенного животного по любому из пп.1-9, получение из выращенного животного ткани или биологической жидкости, содержащей указанную композицию антител, и выделение композиции антител из полученной ткани или биологической жидкости.
  11. 11. Способ по п.10, где молекула антитела принадлежит классу Ι§Θ.
  12. 12. Композиция антител, полученная с использованием способа по п.10 или 11.
  13. 13. Лекарственное средство, обладающее высокой антителозависимой клеточной цитотоксичностью, содержащее в качестве активного ингредиента композицию антител по п.12.
  14. 14. Лекарственное средство по п.13, где лекарственное средство является диагностическим лекарственным средством, профилактическим лекарственным средством или лечебным лекарственным средством против болезней, связанных с опухолями, болезней, связанных с аллергией, болезней, связанных с воспалением, аутоиммунных заболеваний, болезней органов кровообращения, болезней, связанных с вирусными инфекциями, или болезней, связанных с бактериальными инфекциями.
EA200600469A 2000-10-06 2001-10-05 Трансгенное животное, продуцирующее антитела с измененными углеводными цепями, способ получения антител и содержащее антитела лекарственное средство EA013563B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000308526 2000-10-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600469A1 EA200600469A1 (ru) 2006-08-25
EA013563B1 true EA013563B1 (ru) 2010-06-30

Family

ID=18788817

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300443A EA013224B1 (ru) 2000-10-06 2001-10-05 Клетки, продуцирующие композиции антител
EA200600469A EA013563B1 (ru) 2000-10-06 2001-10-05 Трансгенное животное, продуцирующее антитела с измененными углеводными цепями, способ получения антител и содержащее антитела лекарственное средство

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300443A EA013224B1 (ru) 2000-10-06 2001-10-05 Клетки, продуцирующие композиции антител

Country Status (14)

Country Link
EP (5) EP3690043A1 (ru)
JP (12) JP4290423B2 (ru)
KR (1) KR100877676B1 (ru)
CN (3) CN1894406A (ru)
AU (2) AU9419801A (ru)
BR (1) BR0114475A (ru)
CA (3) CA2953239A1 (ru)
DK (1) DK2314686T4 (ru)
EA (2) EA013224B1 (ru)
ES (3) ES2620359T3 (ru)
HU (2) HU231090B1 (ru)
MX (1) MXPA03002974A (ru)
PL (1) PL218428B1 (ru)
WO (1) WO2002031140A1 (ru)

Families Citing this family (913)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275541B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
EA013224B1 (ru) * 2000-10-06 2010-04-30 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Клетки, продуцирующие композиции антител
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7662925B2 (en) 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
WO2004022597A1 (ja) 2002-09-04 2004-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3の血中可溶化ｎ端ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞに対する抗体
EP1498490A4 (en) * 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
AU2003236017B2 (en) * 2002-04-09 2009-03-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition
ES2362419T3 (es) * 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
EP1498491A4 (en) * 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
JP4832719B2 (ja) * 2002-04-09 2011-12-07 協和発酵キリン株式会社 ＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する抗体組成物含有医薬
WO2003085107A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules à génome modifié
EP3502133A1 (en) 2002-09-27 2019-06-26 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
AR042145A1 (es) * 2002-11-27 2005-06-08 Dow Agrociences Llc Produccion de inmunoglobulinas en plantas con una fucocilacion reducida
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
WO2004081048A1 (ja) 2003-03-13 2004-09-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 変異受容体に対するアゴニスト活性を有するリガンド
JP2004298180A (ja) * 2003-03-18 2004-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ゲノムが改変されたマウス
JP2010220615A (ja) * 2003-03-18 2010-10-07 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd ゲノムが改変されたマウス
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
DE602004028249D1 (de) * 2003-06-18 2010-09-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fucosetransporter
FR2858235B1 (fr) 2003-07-31 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation d'anticorps optimises en adcc pour traiter les patients faibles repondeurs
EP2311468B1 (en) 2003-08-08 2014-01-15 Perseus Proteomics Inc. Gene overexpressed in cancer
EP1666501A4 (en) * 2003-08-11 2008-12-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-HM1.24 ANTIBODIES WITH MODIFIED SUGAR CHAIN
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8883147B2 (en) 2004-10-21 2014-11-11 Xencor, Inc. Immunoglobulins insertions, deletions, and substitutions
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
JPWO2005035583A1 (ja) * 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 Ｉｌ−５受容体に特異的に結合する抗体組成物
AU2004279739A1 (en) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Composition of antibody capable of specifically binding CCR4
EP1688439A4 (en) * 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk HYBRID PROTEIN COMPOSITION
WO2005035577A1 (ja) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ガングリオシドｇｄ３に特異的に結合する抗体組成物
JPWO2005035578A1 (ja) * 2003-10-09 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 ガングリオシドｇｍ２に特異的に結合する抗体組成物
AU2004280064A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genomically modified cell neutralized to serum-free system
US7691810B2 (en) * 2003-10-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Method of producing recombinant antithrombin III composition
EP1705251A4 (en) * 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
AU2004280066A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genomically modified cell
JP4263191B2 (ja) * 2003-10-09 2009-05-13 協和発酵キリン株式会社 アンチトロンビンｉｉｉ組成物の製造方法
JPWO2005035581A1 (ja) * 2003-10-09 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 ヒトＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ−１に特異的に結合する抗体組成物
FR2861395B1 (fr) 2003-10-23 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Facteur viii viralement securise a faible teneur en multimeres superieurs
JPWO2005053741A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 ケモカイン受容体ｃｃｒ４に対する遺伝子組換え抗体を含む医薬
WO2005053742A1 (ja) * 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
EP1697741A4 (en) 2003-12-04 2008-02-13 Xencor Inc PROCESS FOR PRODUCING PROTEIN VARIANTS WITH INCREASED HOST STRUCTURE CONTENT AND COMPOSITIONS THEREOF
US7329353B2 (en) 2004-01-23 2008-02-12 Amgen Inc. LC/MS method of analyzing high molecular weight proteins
EP1737890A2 (en) 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
UA94019C2 (ru) 2004-07-09 2011-04-11 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело, которое специфически связывается с глипиканом 3 (gpc3)
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
US20060223147A1 (en) * 2004-08-05 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Process for producing glycoprotein composition
WO2006022407A1 (ja) 2004-08-24 2006-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗グリピカン３抗体を用いたアジュバント療法
US7867734B2 (en) * 2004-10-26 2011-01-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody having modified sugar chain
EP2845865A1 (en) 2004-11-12 2015-03-11 Xencor Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
AU2006214121B9 (en) 2005-02-15 2013-02-14 Duke University Anti-CD19 antibodies and uses in oncology
WO2006109695A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換えハプトグロビン組成物
WO2006109696A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換え卵胞刺激ホルモン組成物
WO2006109698A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換えエリスロポイエチン組成物
JP5047947B2 (ja) 2005-05-05 2012-10-10 デューク ユニバーシティ 自己免疫疾患のための抗ｃｄ１９抗体治療
US8217147B2 (en) 2005-08-10 2012-07-10 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
CA2624189A1 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
EP1951757B1 (en) 2005-10-06 2014-05-14 Xencor, Inc. Optimized anti-cd30 antibodies
US20070087005A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Lazar Gregory A Anti-glypican-3 antibody
US8716557B2 (en) 2006-01-17 2014-05-06 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for inhibition of fucosyltransferase and xylosyltransferase expression in plants
EP2540741A1 (en) 2006-03-06 2013-01-02 Aeres Biomedical Limited Humanized anti-CD22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
US20080118978A1 (en) 2006-04-28 2008-05-22 Takashi Sato Anti-tumor agent
EP2044122B1 (en) 2006-07-18 2018-03-28 Sanofi Antagonist antibody against epha2 for the treatment of cancer
US20100092457A1 (en) 2006-08-14 2010-04-15 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and Treatment of Cancer Using Anti-Desmoglein-3 Antibodies
ES2402591T3 (es) 2006-08-14 2013-05-07 Xencor Inc. Anticuerpos optimizados que seleccionan como diana CD19
AU2007299843B2 (en) 2006-09-18 2012-03-08 Xencor, Inc Optimized antibodies that target HM1.24
RU2537245C2 (ru) 2006-10-12 2014-12-27 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Диагностика и лечение злокачественной опухоли с использованием антитела против ereg
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CA2666559A1 (en) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
CL2007003411A1 (es) * 2006-11-28 2008-07-04 Centelion Proteina fusion que consiste en una region fc de una inmunoglobulina con un fragmento o dominio soluble de un receptor para fgf; polinucleotido que la codifica y vector y celula que lo comprenden; composicion farmaceutica que comprende la proteina fu
CA2672581A1 (en) 2006-12-14 2008-06-19 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-claudin 3 monoclonal antibody and treatment and diagnosis of cancer using the same
WO2008077545A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Selection method
JP5618172B2 (ja) 2007-01-05 2014-11-05 国立大学法人東京大学 抗ｐｒｇ−３抗体を用いる癌の診断および治療
US7994290B2 (en) 2007-01-24 2011-08-09 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Effector function enhanced recombinant antibody composition
EP2107115A1 (en) 2007-01-24 2009-10-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genetically recombinant antibody composition capable of binding specifically to ganglioside gm2
AR065271A1 (es) 2007-02-09 2009-05-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-robo4 y sus usos
EP2447719B1 (en) 2007-02-26 2016-08-24 Oxford BioTherapeutics Ltd Proteins
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
CN101641115B (zh) 2007-03-08 2013-04-24 卡罗拜奥斯制药公司 用于实体瘤治疗的EphA3抗体
EP2138576A4 (en) 2007-03-16 2011-02-23 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd ANTI-CLAUDIN-4 ANTIBODY
CN101861168B (zh) 2007-05-07 2014-07-02 米迪缪尼有限公司 抗-icos抗体及其在治疗肿瘤、移植和自身免疫病中的应用
BRPI0811526A2 (pt) 2007-05-14 2017-05-16 Biowa Inc uso de um anticorpo monoclonal, quimérico, humanizado ou humano que liga o il-5r, anticorpo anti-il-5r isolado, e, epítopo isolado de il-5r alfa
EP2708557A1 (en) 2007-05-30 2014-03-19 Xencor, Inc. Method and compositions for inhibiting CD32B expressing cells
CN101821288A (zh) 2007-06-21 2010-09-01 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
WO2009001840A1 (ja) 2007-06-25 2008-12-31 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. ADCC活性又はCDC活性を有する抗Prominin-1抗体
KR101510778B1 (ko) * 2007-07-12 2015-04-10 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 알파 1,6 당전이효소(ｆｕｔ8) 유전자 발현을 비활성화시키기 위한 방법 및 조성물
WO2009018386A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
PT2199390T (pt) 2007-08-30 2017-03-15 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticorpo anti-epha2
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
AU2008321840B2 (en) 2007-11-14 2014-02-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-GPR49 antibody
TWI468417B (zh) 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
EP2245064B1 (en) 2007-12-21 2014-07-23 Medimmune Limited BINDING MEMBERS FOR INTERLEUKIN-4 RECEPTOR ALPHA (IL-4Ralpha)
EP3825329A1 (en) 2007-12-26 2021-05-26 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
CA2711557A1 (en) 2008-01-11 2009-07-16 The University Of Tokyo Anti-cldn6 antibody
BRPI0907046A2 (pt) 2008-01-18 2015-07-28 Medimmune Llc Anticorpo de cisteína engenheirada, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, conjugado de anticorpo, composição farmacêutica, métodos de detecção de câncer, doenças ou distúrbios autoimunes, inflamatórios ou infecciosos em um indivíduo e de inibição de proliferação de uma célula alvo
CN102046655B (zh) 2008-04-02 2016-09-14 宏观基因有限公司 Bcr-复合体-特异性抗体和其使用方法
MX2010010737A (es) 2008-04-02 2010-12-20 Macrogenics Inc Anticuerpos especificos para her2/neu y metodos para utilizar los mismos.
CL2009000647A1 (es) 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
LT2708559T (lt) 2008-04-11 2018-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigeną surišanti molekulė, galinti pakartotinai prisijungti prie dviejų ar daugiau antigeno molekulių
ES2828627T3 (es) 2008-04-25 2021-05-27 Kyowa Kirin Co Ltd Anticuerpo multivalente estable
JPWO2009142186A1 (ja) * 2008-05-20 2011-09-29 株式会社カネカ 細胞障害性組成物
EP2283862B1 (en) 2008-06-02 2018-08-08 The University of Tokyo Combination treatment of cancer comprising anti-mfg-e8 antibody
EP2282770B1 (en) 2008-06-04 2018-03-07 MacroGenics, Inc. Antibodies with altered binding to fcrn and methods of using same
WO2010001908A1 (ja) 2008-06-30 2010-01-07 協和発酵キリン株式会社 抗cd27抗体
CN102099468B (zh) 2008-07-17 2014-01-15 协和发酵麒麟株式会社 抗-系统asc氨基酸转运蛋白2(asct2)抗体
EP2311864A4 (en) 2008-08-13 2013-07-31 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd RECOMBINANT PROTEIN-S COMPOSITION
DK2796469T3 (da) 2008-09-17 2019-08-12 Xencor Inc Hidtil ukendte sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af IgE-medierede forstyrrelser
CA2735900A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune, Llc Antibodies directed to dll4 and uses thereof
WO2010036443A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Eureka Therapeutics, Inc. Cell lines and proteins with variant glycosylation pattern
JP5913980B2 (ja) 2008-10-14 2016-05-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
CA2743469C (en) 2008-11-12 2019-01-15 Medimmune, Llc Antibody formulation
KR20110104032A (ko) 2008-12-19 2011-09-21 마크로제닉스, 인크. 공유결합형 디아바디 및 이의 용도
EP2388320B1 (en) 2008-12-22 2017-02-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-hs6st2 antibodies and uses thereof
EP3318573A1 (en) 2008-12-23 2018-05-09 F. Hoffmann-La Roche AG Mmunoglobulin variants with altered binding to protein a
EP2385114A4 (en) 2008-12-25 2012-08-08 Univ Tokyo CANCER TREATMENT DIAGNOSIS WITH ANTI-TM4SF20 ANTIBODY
EP2377891B1 (en) 2008-12-26 2018-11-21 The University of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-lgr7 antibody
JP5511686B2 (ja) 2008-12-26 2014-06-04 協和発酵キリン株式会社 抗ｃｄ４抗体
WO2010084408A2 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Oxford Biotherapeutics Ltd. Pta089 protein
NZ594950A (en) 2009-03-06 2013-06-28 Kalobios Pharmaceuticals Inc Treatment of leukemias and chronic myeloproliferative diseases with antibodies to epha3
RU2504553C2 (ru) 2009-03-20 2014-01-20 Дженентек, Инк. Антитела к her
EP2233500A1 (en) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
MX2011010012A (es) 2009-03-25 2011-12-06 Genentech Inc NUEVOS ANTICUERPOS ANTI-A5ß1 Y SUS USOS.
PL2417156T3 (pl) 2009-04-07 2015-07-31 Roche Glycart Ag Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała
MY152033A (en) 2009-04-09 2014-08-15 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-siglec-15 antibody
JP5748653B2 (ja) 2009-04-10 2015-07-15 協和発酵キリン株式会社 抗ｔｉｍ−３抗体を用いた血液腫瘍治療法
US9079957B2 (en) 2009-04-16 2015-07-14 The University Of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-TMPRSS11E antibody
CA2759146C (en) 2009-04-20 2017-06-13 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Agonist anti-cd40 antibody
PL2426148T3 (pl) 2009-04-27 2016-01-29 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Przeciwciało anty-IL-3RA do stosowania w leczeniu nowotworu krwi
BRPI1011145A2 (pt) 2009-05-15 2016-03-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo anti-axl
EP2436397B1 (en) 2009-05-29 2017-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing antagonist of egf family ligand as component
HUE038596T2 (hu) 2009-06-02 2018-10-29 Regeneron Pharma Fukoziláció-hiányos sejtek
CA2765242C (en) 2009-06-11 2019-08-27 Inter-University Research Institute Corporation Research Organization Of Information And Systems Method for producing proteins comprising introducing tol1 or tol2 transposons into suspension cho cells
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
WO2011005481A1 (en) 2009-06-22 2011-01-13 Medimmune, Llc ENGINEERED Fc REGIONS FOR SITE-SPECIFIC CONJUGATION
AR077595A1 (es) 2009-07-27 2011-09-07 Genentech Inc Tratamientos de combinacion
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
BR112012002819B1 (pt) 2009-08-07 2022-11-22 Kyowa Kirin Co., Ltd Anticorpo humanizado antioligômero de amiloide-b, seus usos, e formulação farmacêutica
JP5692073B2 (ja) 2009-08-07 2015-04-01 協和発酵キリン株式会社 抗アミロイドβオリゴマーヒト化抗体
CN102574917A (zh) 2009-08-17 2012-07-11 株式会社未来创药研究所 含有抗hb-egf抗体作为有效成分的药物组合物
ES2599076T3 (es) 2009-09-02 2017-01-31 Genentech, Inc. Smoothened mutante y métodos de utilización del mismo
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
WO2011030841A1 (ja) 2009-09-10 2011-03-17 協和発酵キリン株式会社 ヒトｃｃケモカイン受容体４（ｃｃｒ４）に特異的に結合する抗体組成物を含む医薬
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
KR101545914B1 (ko) 2009-09-22 2015-08-20 프로바이오겐 아게 특수화된 글리칸 구조를 함유하는 분자의 생산 방법
EP2484697B1 (en) 2009-09-30 2016-09-14 Fujifilm RI Pharma Co., Ltd. Anti-podoplanin antibody, and pharmaceutical composition containing anti-podoplanin antibody
AR078470A1 (es) 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2
TR201804897T4 (tr) 2009-10-07 2018-06-21 Macrogenics Inc Fukosi̇lasyon ölçüsünün deği̇şi̇mleri̇nden dolayi geli̇şmi̇ş efektör i̇şlevi̇ sergi̇leyen fc bölgesi̇ni̇ i̇çeren poli̇pepti̇tler ve bunlarin kullanimlarina yöneli̇k yöntemler
WO2011054007A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Oxford Biotherapeutics Ltd. Ror1 as therapeutic and diagnostic target
DK3279215T3 (da) 2009-11-24 2020-04-27 Medimmune Ltd Målrettede bindemidler mod b7-h1
TWI505836B (zh) 2009-12-11 2015-11-01 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ－ｃ抗體及其使用方法
HUE027713T2 (en) 2009-12-23 2016-10-28 Hoffmann La Roche Anti-BV8 antibodies and their use
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
DK3342786T3 (en) 2010-01-29 2021-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dll3-antistof
WO2011097527A2 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Xencor, Inc. Immunoprotection of therapeutic moieties using enhanced fc regions
CN105001334A (zh) 2010-02-10 2015-10-28 伊缪诺金公司 Cd20抗体及其用途
BR112012020116B8 (pt) 2010-02-10 2023-01-10 Perseus Proteomics Inc Anticorpo anti-p-caderina marcado com metal radioativo, agente terapêutico contra o câncer e agente de diagnóstico de câncer que compreendem o dito anticorpo, hibridoma, bem como usos do mesmo para produzir um agente terapêutico contra o câncer e um agente de diagnóstico de câncer
SI2536748T1 (sl) 2010-02-18 2014-12-31 Genentech, Inc. Nevrogulinski antagonisti in njihova uporaba pri zdravljenju raka
WO2011105573A1 (ja) 2010-02-26 2011-09-01 株式会社未来創薬研究所 抗icam3抗体およびその用途
ES2602971T3 (es) 2010-03-02 2017-02-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Composición de anticuerpo modificado
GEP201706660B (en) 2010-03-04 2017-04-25 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
KR101899835B1 (ko) 2010-03-24 2018-09-19 제넨테크, 인크. 항-ｌｒｐ６ 항체
EP2554669B1 (en) 2010-03-26 2018-09-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Novel antibody having modification site introduced therein, and antibody fragment
JP2013523098A (ja) 2010-03-29 2013-06-17 ザイムワークス，インコーポレイテッド 強化又は抑制されたエフェクター機能を有する抗体
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
EP2576622A4 (en) 2010-06-01 2013-11-27 Univ Monash ANTIBODIES AGAINST RECEPTOR TYROSINE KINASE C-MET
ES2682078T3 (es) * 2010-06-11 2018-09-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anticuerpo anti-TIM-3
TW201204388A (en) 2010-06-18 2012-02-01 Genentech Inc Anti-Axl antibodies and methods of use
JP6029581B2 (ja) 2010-06-19 2016-11-24 メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センター 抗ｇｄ２抗体
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
WO2012005076A1 (ja) 2010-07-08 2012-01-12 本田技研工業株式会社 高周波加熱用コイル
CN103097418A (zh) 2010-07-09 2013-05-08 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗神经毡蛋白抗体及使用方法
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
AU2011286024B2 (en) 2010-08-02 2014-08-07 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
EP2600895A1 (en) 2010-08-03 2013-06-12 Hoffmann-La Roche AG Chronic lymphocytic leukemia (cll) biomarkers
WO2012019061A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
WO2012017003A1 (en) 2010-08-05 2012-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-mhc antibody anti-viral cytokine fusion protein
PT2603530T (pt) 2010-08-13 2018-01-09 Roche Glycart Ag Anticorpos anti-fap e métodos de utilização
CN103168049B (zh) 2010-08-13 2015-10-07 罗切格利卡特公司 抗生腱蛋白-c a2抗体及使用方法
WO2012025536A1 (en) 2010-08-25 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against il-18r1 and uses thereof
EP2608807A1 (en) 2010-08-27 2013-07-03 Stem Centrx, Inc. Notum protein modulators and methods of use
SG187886A1 (en) 2010-08-31 2013-04-30 Genentech Inc Biomarkers and methods of treatment
NZ608814A (en) 2010-09-03 2015-06-26 Stem Centrx Inc Novel modulators and methods of use
JP5843170B2 (ja) 2010-09-30 2016-01-13 国立研究開発法人理化学研究所 グリオーマの治療方法、グリオーマの検査方法、所望の物質をグリオーマに送達させる方法、及びそれらの方法に用いられる薬剤
WO2012045085A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Oxford Biotherapeutics Ltd. Anti-rori antibodies
ES2588981T3 (es) 2010-10-05 2016-11-08 Genentech, Inc. Smoothened mutante y métodos de uso de la misma
SI2636736T1 (sl) 2010-10-29 2016-09-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Novo anti-dr5 protitelesce
ES2607086T3 (es) 2010-11-10 2017-03-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Métodos y composiciones para la inmunoterapia de enfermedades neuronales
KR101398363B1 (ko) 2010-11-17 2014-05-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
SG10201601792UA (en) 2010-12-08 2016-04-28 Stemcentrx Inc Novel modulators and methods of use
CN107312796A (zh) 2010-12-15 2017-11-03 大学共同利用机关法人情报·系统研究机构 蛋白质的生产方法
ES2656079T3 (es) 2010-12-15 2018-02-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para producir proteínas
CA2817380C (en) 2010-12-16 2019-06-04 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to th2 inhibition
TWI589589B (zh) 2010-12-20 2017-07-01 建南德克公司 抗間皮素（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）抗體及免疫接合物
KR20130118925A (ko) 2010-12-22 2013-10-30 제넨테크, 인크. 항-pcsk9 항체 및 사용 방법
JP5883396B2 (ja) 2010-12-27 2016-03-15 国立大学法人名古屋大学 受容体型チロシンキナーゼが仲介する癌細胞の生存促進性シグナルを抑制する方法
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
FR2971250A1 (fr) 2011-02-07 2012-08-10 Univ Nantes Anticorps anti-gb3 utiles dans le traitement des maladies associees a l'angiogenese
SA112330278B1 (ar) 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
KR101638224B1 (ko) 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
CN103597073B (zh) * 2011-03-06 2019-06-07 默克雪兰诺有限公司 低岩藻糖细胞系及其应用
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
CN103596983B (zh) 2011-04-07 2016-10-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗fgfr4抗体及使用方法
WO2012144208A1 (ja) 2011-04-18 2012-10-26 国立大学法人東京大学 抗itm2a抗体を用いる癌の診断および治療
KR101517320B1 (ko) 2011-04-19 2015-05-28 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 단일특이적 및 이중특이적 항-igf-1r 및 항 erbb3 항체
SG194620A1 (en) 2011-04-25 2013-12-30 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-b7-h3 antibody
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
WO2012155019A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature pepides
PT2710035T (pt) 2011-05-16 2017-06-05 Hoffmann La Roche Agonistas do fgfr1 e métodos de utilização
CN104080804B (zh) 2011-05-21 2017-06-09 宏观基因有限公司 去免疫化的血清结合结构域及其延长血清半衰期的用途
WO2012176779A1 (ja) 2011-06-20 2012-12-27 協和発酵キリン株式会社 抗ｅｒｂＢ３抗体
PE20141212A1 (es) 2011-06-22 2014-09-19 Hoffmann La Roche Eliminacion de celulas diana por parte de celulas t citotoxicas especificas de virus utilizando complejos que comprenden mhc de clase 1
SI2726094T1 (sl) 2011-06-28 2017-04-26 Oxford Biotherapeutics Ltd Terapevtski in diagnostični cilj
KR20140045440A (ko) 2011-06-30 2014-04-16 제넨테크, 인크. 항-c-met 항체 제제
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
WO2013022855A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points and immunofiltering
KR20140057326A (ko) 2011-08-17 2014-05-12 제넨테크, 인크. 뉴레귤린 항체 및 그의 용도
CA2844141A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Anti-mcsp antibodies
JP2015527869A (ja) 2011-08-26 2015-09-24 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド タンデムＦｃ二重特異性抗体
CA2846083A1 (en) 2011-09-15 2013-03-21 Genentech, Inc. Methods of promoting differentiation
AU2012312515A1 (en) 2011-09-19 2014-03-13 Genentech, Inc. Combination treatments comprising c-met antagonists and B-raf antagonists
US20150050269A1 (en) 2011-09-30 2015-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
CA2850322C (en) 2011-09-30 2023-10-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule inducing immune response to target antigen
BR112014008212A2 (pt) 2011-10-05 2017-06-13 Genentech Inc método para tratar uma condição hepática, método de indução por diferenciação hepática e método de redução de proliferação anormal do ducto biliar
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
AU2012323287B2 (en) 2011-10-10 2018-02-01 Xencor, Inc. A method for purifying antibodies
TW201321414A (zh) 2011-10-14 2013-06-01 Genentech Inc 抗－ＨｔｒＡ１抗體及其使用方法
CA2850836A1 (en) 2011-10-15 2013-04-18 Genentech, Inc. Methods of using scd1 antagonists
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
MX2014004991A (es) 2011-10-28 2014-05-22 Genentech Inc Combinaciones terapeuticas y metodos para tratar el melanoma.
WO2013062083A1 (ja) 2011-10-28 2013-05-02 ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド 癌幹細胞特異的分子
JP6326371B2 (ja) 2011-11-04 2018-05-16 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメインにおける変異を有する安定なヘテロ二量体抗体デザイン
TW201326193A (zh) 2011-11-21 2013-07-01 Genentech Inc 抗－ｃ－ｍｅｔ抗體之純化
WO2013083497A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody formulation
WO2013087789A1 (en) 2011-12-13 2013-06-20 Glykos Finland Ltd. Antibody isoform arrays and methods thereof
JP2015503907A (ja) 2011-12-22 2015-02-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 真核細胞のための全長抗体提示システムおよびその使用
CN113896787A (zh) 2011-12-22 2022-01-07 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途
EP3816284A1 (en) 2011-12-22 2021-05-05 F. Hoffmann-La Roche AG Expression vector for antibody production in eukaryotic cells
JP2015502397A (ja) 2011-12-23 2015-01-22 ファイザー・インク 部位特異的コンジュゲーションのための操作された抗体定常領域、ならびにそのための方法および使用
WO2013096791A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Genentech, Inc. Process for making high concentration protein formulations
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
CN104168920A (zh) 2012-01-18 2014-11-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 使用fgf19调控剂的方法
SG11201404198TA (en) 2012-01-18 2014-08-28 Genentech Inc Anti-lrp5 antibodies and methods of use
BR112014018471A2 (pt) 2012-01-31 2017-07-04 Genentech Inc anticorpos anti-ige m1' e métodos para o seu uso
JP6226752B2 (ja) 2012-02-09 2017-11-08 中外製薬株式会社 抗体のＦｃ領域改変体
AU2013216753B2 (en) 2012-02-11 2017-09-21 Genentech, Inc. R-spondin translocations and methods using the same
ES2676031T3 (es) 2012-02-15 2018-07-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Cromatografía de afinidad basada en el receptor Fc
CN104394880B (zh) 2012-03-16 2020-08-28 大学保健网络 用于调节toso活性的方法和组合物
BR112014024017A8 (pt) 2012-03-27 2017-07-25 Genentech Inc Métodos de tratamento de um tipo de câncer, de tratamento do carcinoma, para selecionar uma terapia e para quantificação e inibidor de her3
JP6280031B2 (ja) 2012-03-29 2018-02-14 中外製薬株式会社 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
JPWO2013147212A1 (ja) 2012-03-30 2015-12-14 第一三共株式会社 新規抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
TW201343672A (zh) 2012-03-30 2013-11-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Ｃｄｒ經修飾之抗ｓｉｇｌｅｃ－１５抗體
US9714298B2 (en) 2012-04-09 2017-07-25 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-FGFR2 antibodies and methods of use thereof for treating cancer
US10385395B2 (en) 2012-04-11 2019-08-20 The Regents Of The University Of California Diagnostic tools for response to 6-thiopurine therapy
TWI606065B (zh) 2012-04-27 2017-11-21 第一三共股份有限公司 抗ｒｏｂｏ４抗體
AU2013256596A1 (en) 2012-05-01 2014-10-09 Genentech, Inc. Anti-PMEL17 antibodies and immunoconjugates
JP6351572B2 (ja) 2012-05-10 2018-07-04 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメインに突然変異を有する免疫グロブリン重鎖のヘテロ多量体構築物
CN104470950B (zh) 2012-05-11 2017-04-26 公益财团法人微生物化学研究会 抗cxadr抗体
WO2013170191A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Genentech, Inc. Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide
CA2870876C (en) 2012-05-23 2019-10-01 Genentech, Inc. Selection method for therapeutic agents
MX2014014678A (es) 2012-05-30 2015-02-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno especifico para el tejido objetivo.
KR101566539B1 (ko) 2012-06-08 2015-11-05 국립암센터 신규한 Ｔｈ2 세포 전환용 에피토프 및 이의 용도
MX2014014830A (es) 2012-06-15 2015-05-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-pcsk9, formulaciones, dosificacion y metodos de uso.
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
JP6298762B2 (ja) 2012-07-02 2018-03-20 協和発酵キリン株式会社 抗ｂｍｐ９抗体を有効成分とする、腎性貧血、がん性貧血などの貧血に対する治療剤
MX353951B (es) 2012-07-04 2018-02-07 Hoffmann La Roche Anticuerpos de anti-teofilina y metodos de uso.
EP3339328A1 (en) 2012-07-04 2018-06-27 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-biotin antibodies and methods of use
WO2014006124A1 (en) 2012-07-04 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked antigen-antibody conjugates
CN110042114B (zh) 2012-07-05 2024-09-10 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 表达和分泌系统
AU2013285970B2 (en) 2012-07-06 2017-11-30 Kyowa Kirin Co., Ltd. Therapeutic method and remedy for HTLV-1-associated myelopathy patients
SG11201500087VA (en) 2012-07-09 2015-02-27 Genentech Inc Immunoconjugates comprising anti-cd22 antibodies
AU2013288932A1 (en) 2012-07-09 2014-12-11 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti - CD79b antibodies
JP2015523380A (ja) 2012-07-09 2015-08-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｄ７９ｂ抗体を含む免疫複合体
MX2015000315A (es) 2012-07-09 2015-07-06 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd22 e inmunoconjugados.
PE20150361A1 (es) 2012-07-13 2015-03-14 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-vegf/anti-ang-2 y su utilizacion en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares
SG11201500489YA (en) 2012-07-25 2015-02-27 Kolltan Pharmaceuticals Inc Anti-kit antibodies and uses thereof
GB201213652D0 (en) 2012-08-01 2012-09-12 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
MX369550B (es) 2012-09-27 2019-11-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Gen de fusion del receptor de factor de crecimiento de fibroblastos 3 (fgfr3) y medicamentos farmaceutico para tratar el mismo.
JP6273205B2 (ja) 2012-10-05 2018-01-31 協和発酵キリン株式会社 ヘテロダイマータンパク質組成物
CN115960111A (zh) 2012-10-11 2023-04-14 第一三共株式会社 抗体－药物偶联物
US9872924B2 (en) 2012-10-19 2018-01-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate produced by binding through linker having hydrophilic structure
EP2914621B1 (en) 2012-11-05 2023-06-07 Foundation Medicine, Inc. Novel ntrk1 fusion molecules and uses thereof
CA2884431A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
CN104968367B (zh) 2012-11-13 2018-04-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗血凝素抗体和使用方法
WO2014088040A1 (ja) 2012-12-06 2014-06-12 国立大学法人 金沢大学 中皮腫の治療方法
KR20150094617A (ko) 2012-12-07 2015-08-19 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 항 ｆｏｌｒ１ 항체
EP4119947A1 (en) 2012-12-21 2023-01-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
SG11201504414UA (en) 2012-12-21 2015-07-30 Hoffmann La Roche Disulfide-linked multivalent mhc class i comprising multi-function proteins
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
WO2014108198A1 (en) 2013-01-10 2014-07-17 Genmab B.V. Human igg1 fc region variants and uses thereof
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10738132B2 (en) 2013-01-14 2020-08-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
WO2014113510A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
US10980804B2 (en) 2013-01-18 2021-04-20 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
WO2014116749A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Genentech, Inc. Anti-hcv antibodies and methods of using thereof
WO2014122143A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Engmab Ag Method for the selection of antibodies against bcma
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
US9932396B2 (en) 2013-02-08 2018-04-03 Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. Antibody against human NRG1 protein
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
CA2900097A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cancer and preventing drug resistance
EP2961772A1 (en) 2013-02-26 2016-01-06 Roche Glycart AG Anti-mcsp antibodies
KR20150123250A (ko) 2013-03-06 2015-11-03 제넨테크, 인크. 암 약물 내성의 치료 및 예방 방법
WO2014138449A1 (en) 2013-03-06 2014-09-12 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Anti-c-met tandem fc bispecific antibodies
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
WO2014152358A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Genentech, Inc. Combinations of a mek inhibitor compound with an her3/egfr inhibitor compound and methods of use
JP6436965B2 (ja) 2013-03-14 2018-12-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｂ７−ｈ４抗体及びイムノコンジュゲート
RU2015139054A (ru) 2013-03-14 2017-04-19 Дженентек, Инк. Способы лечения рака и профилактики лекарственной резистентности рака
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
JP6482525B2 (ja) 2013-03-15 2019-03-13 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 高親和性抗ｇｄ２抗体
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9598485B2 (en) 2013-03-15 2017-03-21 Ac Immune S.A. Anti-tau antibodies and methods of use
SG10201706210WA (en) 2013-03-15 2017-09-28 Genentech Inc Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
DK2970422T3 (en) 2013-03-15 2018-07-16 Hoffmann La Roche IL-22 POLYPEPTIDES AND IL-22 FC-FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE
US9260527B2 (en) 2013-03-15 2016-02-16 Sdix, Llc Anti-human CXCR4 antibodies and methods of making same
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
NZ712314A (en) 2013-03-15 2021-07-30 Genentech Inc Biomarkers and methods of treating pd-1 and pd-l1 related conditions
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CA2905123A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Genentech, Inc. Methods of treating cancer and preventing cancer drug resistance
CN105377889B (zh) 2013-03-15 2020-07-17 Xencor股份有限公司 异二聚体蛋白
EP2970471A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-crth2 antibodies and their use
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
WO2014174596A1 (ja) 2013-04-23 2014-10-30 株式会社医学生物学研究所 ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子に対する機能性モノクローナル抗体
SG10201800492PA (en) 2013-04-29 2018-03-28 Hoffmann La Roche Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use
AU2014261631B2 (en) 2013-04-29 2019-02-14 F. Hoffmann-La Roche Ag FcRn-binding abolished anti-IGF-1R antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
JP6618893B2 (ja) 2013-04-29 2019-12-11 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｆｃ受容体結合が変更された非対称抗体および使用方法
PE20151926A1 (es) 2013-05-20 2016-01-07 Genentech Inc Anticuerpos de receptores de antitransferrina y metodos de uso
JP6469094B2 (ja) 2013-05-31 2019-02-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗細胞壁タイコ酸抗体及びコンジュゲート
BR112015029754A2 (pt) 2013-05-31 2017-09-26 Genentech Inc anticorpos anti-teicoico da parede e conjugados
CN105517571A (zh) * 2013-06-24 2016-04-20 中外制药株式会社 含有人源化抗上皮调节蛋白抗体作为有效成分的腺癌以外的非小细胞肺癌的治疗药
PL3027651T3 (pl) 2013-08-01 2019-08-30 Five Prime Therapeutics, Inc. Afukozylowane przeciwciała anty-fgfr2iiib
CN105518027A (zh) 2013-09-17 2016-04-20 豪夫迈·罗氏有限公司 使用抗lgr5抗体的方法
CA2925897A1 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-lps o11 antibody
US9931401B2 (en) 2013-10-08 2018-04-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination comprising anti-fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) antibody and a tyrosine kinase inhibitor
JP6422956B2 (ja) 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
WO2015054691A2 (en) 2013-10-11 2015-04-16 The United States Of America, As Pepresented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Tem8 antibodies and their use
PT3055331T (pt) 2013-10-11 2021-04-05 Oxford Bio Therapeutics Ltd Anticorpos conjugados contra ly75 para o tratamento de cancro
CN105814078A (zh) 2013-10-11 2016-07-27 豪夫迈·罗氏有限公司 Nsp4抑制剂及其使用方法
CN105744954B (zh) 2013-10-18 2021-03-05 豪夫迈·罗氏有限公司 抗rspo2和/或抗rspo3抗体及其用途
KR20160068802A (ko) 2013-10-23 2016-06-15 제넨테크, 인크. 호산구성 장애를 진단 및 치료하는 방법
US20160264648A1 (en) 2013-11-06 2016-09-15 Osaka University Antibody having broad neutralization activity against group 1 influenza a viruses
EP3071597B1 (en) 2013-11-21 2020-07-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
EP3078744B1 (en) 2013-12-04 2020-08-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
PE20160712A1 (es) 2013-12-13 2016-07-26 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-cd33
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
CN106102774A (zh) 2013-12-17 2016-11-09 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
KR20160089531A (ko) 2013-12-17 2016-07-27 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 항-her2 항체를 사용하여 her2-양성 암을 치료하는 방법
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
DK3736292T3 (da) 2013-12-17 2024-07-22 Genentech Inc Anti-CD3-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse
RU2016128726A (ru) 2013-12-17 2018-01-23 Дженентек, Инк. Способы лечения злокачественных опухолей с использованием антагонистов связывания по оси pd-1 и антитела против cd20
TWI670283B (zh) 2013-12-23 2019-09-01 美商建南德克公司 抗體及使用方法
KR102088169B1 (ko) 2013-12-25 2020-03-12 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 trop2 항체-약물 컨쥬게이트
FI3088517T3 (fi) 2013-12-26 2023-11-30 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Ihmisen Anti-IL-33 neutraloiva monoklonaalinen vasta-aine
ES2756175T3 (es) 2013-12-27 2020-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Genes mutantes guardián de fgfr y fármacos que se dirigen a los mismos
CA2933384A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
BR112016014945A2 (pt) 2014-01-03 2018-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag conjugado, formulação farmacêutica e uso
CA2930154A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
EP3851452A1 (en) 2014-01-06 2021-07-21 F. Hoffmann-La Roche AG Monovalent blood brain barrier shuttle modules
CN105899534B (zh) 2014-01-15 2020-01-07 豪夫迈·罗氏有限公司 具有修饰的FCRN和保持的蛋白A结合性质的Fc区变体
CA2935393A1 (en) 2014-01-24 2015-07-30 Genentech, Inc. Methods of using anti-steap1 antibodies and immunoconjugates
JP5998289B2 (ja) 2014-01-31 2016-09-28 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ２抗体−薬物コンジュゲート
CA2937539A1 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
TWI705824B (zh) 2014-02-08 2020-10-01 美商建南德克公司 治療阿茲海默症之方法
SG10201901076WA (en) 2014-02-08 2019-03-28 Genentech Inc Methods of treating alzheimer's disease
EP3825332A1 (en) 2014-02-12 2021-05-26 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-jagged1 antibodies and methods of use
KR20160124165A (ko) 2014-02-21 2016-10-26 제넨테크, 인크. 항-il-13/il-17 이중특이적 항체 및 그의 용도
AU2015225867B2 (en) 2014-03-07 2020-02-06 University Health Network Methods and compositions for modifying the immune response
JP6644717B2 (ja) 2014-03-14 2020-02-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 異種ポリペプチドを分泌させるための方法及び組成物
WO2015140591A1 (en) 2014-03-21 2015-09-24 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
JP2017516458A (ja) 2014-03-24 2017-06-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド ｃ−ｍｅｔ拮抗剤による癌治療及びｃ−ｍｅｔ拮抗剤のＨＧＦ発現との相関
BR112016022385A2 (pt) 2014-03-28 2018-06-19 Xencor, Inc anticorpos específicos que se ligam a cd38 e cd3
PE20161571A1 (es) 2014-03-31 2017-02-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-ox40 y metodos de uso
EP3126386A1 (en) 2014-03-31 2017-02-08 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
WO2015155998A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her3 antibody-drug conjugate
WO2015164615A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 University Of Oslo Anti-gluten antibodies and uses thereof
AR100353A1 (es) 2014-05-08 2016-09-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Droga de direccionamiento a glipicano 3 (gpc3) que se administra a un paciente que responde a la terapia con drogas de direccionamiento a gpc3
CN106414499A (zh) 2014-05-22 2017-02-15 基因泰克公司 抗gpc3抗体和免疫偶联物
WO2015179835A2 (en) 2014-05-23 2015-11-26 Genentech, Inc. Mit biomarkers and methods using the same
NZ726911A (en) 2014-06-03 2023-01-27 Xbiotech Inc Compositions and methods for treating and preventing staphylococcus aureus infections
MX2016016233A (es) 2014-06-11 2017-03-31 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 y sus usos.
US20230190750A1 (en) 2014-06-13 2023-06-22 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
BR112016029935A2 (pt) 2014-06-26 2017-10-31 Hoffmann La Roche ?anticorpos anti-brdu, complexo, formulação farmacêutica e uso de anticorpo?
SG11201700207WA (en) 2014-07-11 2017-02-27 Genentech Inc Anti-pd-l1 antibodies and diagnostic uses thereof
JP2017526641A (ja) 2014-07-11 2017-09-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｎｏｔｃｈ経路阻害
US20160060360A1 (en) 2014-07-24 2016-03-03 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
CA2959141A1 (en) 2014-08-28 2016-03-03 Bioatla, Llc Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
TWI805109B (zh) 2014-08-28 2023-06-11 美商奇諾治療有限公司 對cd19具專一性之抗體及嵌合抗原受體
PT3191135T (pt) 2014-09-12 2020-11-12 Genentech Inc Anticorpos anti-her2 e imunoconjugados
AR101846A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-cll-1 e inmunoconjugados
EP3191518B1 (en) 2014-09-12 2020-01-15 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
JP6730261B2 (ja) 2014-09-17 2020-07-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｈｅｒ２抗体を含む免疫複合体
EP3689910A3 (en) 2014-09-23 2020-12-02 F. Hoffmann-La Roche AG Method of using anti-cd79b immunoconjugates
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
CN107074938A (zh) 2014-10-16 2017-08-18 豪夫迈·罗氏有限公司 抗‑α‑突触核蛋白抗体和使用方法
US10626176B2 (en) 2014-10-31 2020-04-21 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of treating conditions with antibodies that bind B7-H4
MX2017005751A (es) 2014-11-03 2018-04-10 Genentech Inc Métodos y biomarcadores para predecir la eficacia y evaluación de un tratamiento con agonista de ox40.
SG11201703448QA (en) 2014-11-03 2017-05-30 Genentech Inc Assays for detecting t cell immune subsets and methods of use thereof
ES2749383T3 (es) 2014-11-06 2020-03-20 Hoffmann La Roche Variantes de la región Fc con unión al FcRn modificada y procedimientos de uso
KR20170076697A (ko) 2014-11-06 2017-07-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 개질된 FCRN-결합 특성 및 단백질 A-결합 특성을 가진 Fc-영역 변이체
RU2017119428A (ru) 2014-11-06 2018-12-06 Дженентек, Инк. Комбинированная терапия, включающая применение агонистов, связывающихся с ох40, и ингибиторов tigit
EP3217787B1 (en) 2014-11-10 2019-04-17 F.Hoffmann-La Roche Ag Animal model for nephropathy and agents for treating the same
EA201791029A1 (ru) 2014-11-10 2017-12-29 Дженентек, Инк. Антитела против интерлейкина-33 и их применение
EP3875481A1 (en) 2014-11-14 2021-09-08 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
BR112017010198A2 (pt) 2014-11-17 2017-12-26 Genentech Inc terapia de combinação compreendendo agonistas de ligação a ox40 e antagonistas de ligação ao eixo de pd-1
EP3221362B1 (en) 2014-11-19 2019-07-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
EP3221364B1 (en) 2014-11-19 2020-12-16 Genentech, Inc. Antibodies against bace1 and use thereof for neural disease immunotherapy
EP3221361B1 (en) 2014-11-19 2021-04-21 Genentech, Inc. Anti-transferrin receptor / anti-bace1 multispecific antibodies and methods of use
DK3789402T3 (da) 2014-11-20 2022-09-19 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med T-celleaktiverende bispecifikke antigenbindende molekyler og PD-1-aksebindende antagonister
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
AU2015353416C1 (en) 2014-11-26 2022-01-27 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CD38
CN110894240B (zh) 2014-11-26 2022-04-15 森科股份有限公司 结合cd3和肿瘤抗原的异二聚体抗体
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
CN107249642A (zh) 2014-12-03 2017-10-13 豪夫迈·罗氏有限公司 抗金黄色葡萄球菌抗体利福霉素缀合物及其用途
CN107206102A (zh) 2014-12-03 2017-09-26 豪夫迈·罗氏有限公司 抗金黄色葡萄球菌抗体利福霉素缀合物及其用途
AR102918A1 (es) 2014-12-05 2017-04-05 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd79b y métodos de uso
MX2017007491A (es) 2014-12-10 2018-05-04 Genentech Inc Anticuerpos del receptor de la barrera hematoencefálica y métodos para su uso.
MY183415A (en) 2014-12-19 2021-02-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
SG11201700841QA (en) 2014-12-19 2017-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US20160200815A1 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
AU2016206457B2 (en) 2015-01-16 2021-11-11 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ROR1
WO2016117346A1 (en) 2015-01-22 2016-07-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A combination of two or more anti-c5 antibodies and methods of use
JP2018512597A (ja) 2015-02-04 2018-05-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 突然変異体スムースンド及びその使用方法
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
AU2016219534B2 (en) 2015-02-09 2021-07-01 Massachusetts Institute Of Technology Multi-specific antibodies with affinity for human A33 antigen and dota metal complex and uses thereof
US10301377B2 (en) 2015-02-24 2019-05-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
MX2017011486A (es) 2015-03-16 2018-06-15 Genentech Inc Métodos de detección y cuantificación de il-13 y sus usos en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades asociadas a th2.
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
HUE049081T2 (hu) 2015-03-20 2020-09-28 The United States Of America As GP120 elleni neutralizáló antitestek és alkalmazásuk
CN107530428B (zh) 2015-03-23 2022-05-13 震动疗法股份有限公司 Icos的抗体
EP3274368A1 (en) 2015-03-25 2018-01-31 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by the S Bispecific multivalent fusion proteins
EP3277314A4 (en) 2015-04-03 2018-08-29 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
EP3913052A1 (en) 2015-04-24 2021-11-24 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of identifying bacteria comprising binding polypeptides
PT3290441T (pt) 2015-04-28 2019-12-02 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Proteína de ligação a rgma e utilização da mesma
JP2018520642A (ja) 2015-05-01 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド マスク抗ｃｄ３抗体及びその使用方法
WO2016179194A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Jounce Therapeutics, Inc. Lilra3 and method of using the same
MY189692A (en) 2015-05-07 2022-02-26 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
EP3936524A3 (en) 2015-05-11 2022-06-15 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods of treating lupus nephritis
LT3294770T (lt) 2015-05-12 2020-12-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Vėžio gydymo ir diagnostikos būdai
US11267899B2 (en) * 2015-05-13 2022-03-08 Zumutor Biologics Inc. Afucosylated protein, cell expressing said protein and associated methods
ES2789500T5 (es) 2015-05-29 2023-09-20 Hoffmann La Roche Procedimientos terapéuticos y de diagnóstico para el cáncer
CN107771182A (zh) 2015-05-29 2018-03-06 豪夫迈·罗氏有限公司 人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗体和使用方法
EP3302552A1 (en) 2015-06-02 2018-04-11 H. Hoffnabb-La Roche Ag Compositions and methods for using anti-il-34 antibodies to treat neurological diseases
WO2016196975A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
RU2732122C2 (ru) 2015-06-05 2020-09-11 Дженентек, Инк. Антитела против тау-белка и способы их применения
MX2017014740A (es) 2015-06-08 2018-08-15 Genentech Inc Métodos de tratamiento del cáncer con anticuerpos anti-ox40.
MX2017015937A (es) 2015-06-08 2018-12-11 Genentech Inc Métodos de tratamiento del cáncer con anticuerpos anti-ox40 y antagonistas de unión al eje de pd-1.
US10017577B2 (en) 2015-06-15 2018-07-10 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
AR105026A1 (es) 2015-06-16 2017-08-30 Genentech Inc ANTICUERPOS MADURADOS POR AFINIDAD Y HUMANIZADOS PARA FcRH5 Y MÉTODOS PARA SU USO
US10501545B2 (en) 2015-06-16 2019-12-10 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and methods of use
EP3916018A1 (en) 2015-06-16 2021-12-01 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
KR20180012859A (ko) 2015-06-17 2018-02-06 제넨테크, 인크. 항-her2 항체 및 이용 방법
CA2986263A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Genentech, Inc. Methods of treating locally advanced or metastatic breast cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
HUE057952T2 (hu) 2015-06-24 2022-06-28 Hoffmann La Roche Anti-transzferrin receptor antitestek testreszabott affinitással
AU2016288461B2 (en) 2015-06-29 2021-10-07 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for performing histochemical assays for human pro-epiregulin and amphiregulin
JP6787890B2 (ja) 2015-06-29 2020-11-18 第一三共株式会社 抗体−薬物コンジュゲートの選択的製造方法
JP2018520153A (ja) 2015-06-29 2018-07-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 臓器移植における使用のためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体
HUE048939T2 (hu) 2015-08-03 2020-09-28 Engmab Sarl Human B sejt érési antigén elleni monoklonális antitestek (BCMA)
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
JP6914919B2 (ja) 2015-08-28 2021-08-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ヒプシン抗体及びその使用
PE20181336A1 (es) 2015-09-18 2018-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos
AU2016328357B2 (en) 2015-09-22 2023-03-02 Ventana Medical Systems, Inc. Anti-OX40 antibodies and diagnostic uses thereof
JP6959912B2 (ja) 2015-09-23 2021-11-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体の最適化変異体
CN115869398A (zh) 2015-09-24 2023-03-31 第一三共株式会社 抗garp抗体
MX2018003533A (es) 2015-09-24 2019-04-25 Abvitro Llc Composiciones de anticuerpo de virus de inmunodeficiencia humana (vih) y metodos de uso.
TWI811892B (zh) 2015-09-25 2023-08-11 美商建南德克公司 抗tigit抗體及使用方法
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
JP6657392B2 (ja) 2015-10-02 2020-03-04 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ヒトｃｄ２０／ヒトトランスフェリン受容体抗体及び使用方法
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
WO2017062748A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Il-7r-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
AU2016342269A1 (en) 2015-10-22 2018-03-29 Jounce Therapeutics, Inc. Gene signatures for determining icos expression
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
IL295756A (en) 2015-10-29 2022-10-01 Hoffmann La Roche Antibodies against fc-variable region and methods of use
WO2017075173A2 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Genentech, Inc. Anti-factor d antibodies and conjugates
CA3001362C (en) 2015-10-30 2020-10-13 Genentech, Inc. Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof
WO2017079479A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Neutralizing antibodies to hiv-1 gp41 and their use
WO2017079768A1 (en) 2015-11-08 2017-05-11 Genentech, Inc. Methods of screening for multispecific antibodies
EP3380523A1 (en) 2015-11-23 2018-10-03 Five Prime Therapeutics, Inc. Fgfr2 inhibitors alone or in combination with immune stimulating agents in cancer treatment
JP7058219B2 (ja) 2015-12-07 2022-04-21 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｐｓｍａに結合するヘテロ二量体抗体
CA3005592C (en) 2015-12-18 2024-01-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
AR107303A1 (es) 2016-01-08 2018-04-18 Hoffmann La Roche Métodos de tratamiento de cánceres positivos para ace utilizando antagonistas de unión a eje pd-1 y anticuerpos biespecíficos anti-ace / anti-cd3, uso, composición, kit
CA3011739A1 (en) 2016-01-20 2017-07-27 Genentech, Inc. High dose treatments for alzheimer's disease
CA3019952A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2017151502A1 (en) 2016-02-29 2017-09-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
CA3016552A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Genentech, Inc. Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-gpc3 antibodies
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
WO2017168726A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立大学法人東北大学 がん微小環境を標的とした抗ポドカリキシン抗体
WO2017180864A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Genentech, Inc. Anti-rspo3 antibodies and methods of use
KR20200087875A (ko) 2016-04-15 2020-07-21 바이오아트라, 엘엘씨 항 Axl항체 및 이의 면역접합체와 이것들의 용도
WO2017181111A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
AU2017248766A1 (en) 2016-04-15 2018-11-01 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
SG11201809620UA (en) 2016-05-02 2018-11-29 Hoffmann La Roche The contorsbody - a single chain target binder
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
CN109071640B (zh) 2016-05-11 2022-10-18 豪夫迈·罗氏有限公司 经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法
US11254742B2 (en) 2016-05-13 2022-02-22 Bioatla, Inc. Anti-Ror2 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
WO2017198731A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Genmab B.V. Antibodies and methods of use thereof in treatment of infectious disease
WO2017201449A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Genentech, Inc. Protac antibody conjugates and methods of use
CN109313200B (zh) 2016-05-27 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法
EP4371570A3 (en) 2016-06-08 2024-07-17 Xencor, Inc. Treatment of igg4-related diseases with anti-cd19 antibodies crossbinding to cd32b
CA3026151A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
WO2017223405A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
EP3475304B1 (en) 2016-06-28 2022-03-23 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
EP3484923A1 (en) 2016-07-15 2019-05-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods and materials for assessing response to plasmablast- and plasma cell-depleting therapies
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
CN117986372A (zh) 2016-07-29 2024-05-07 中外制药株式会社 显示增加的备选fviii辅因子功能活性的双特异性抗体
MA45784A (fr) 2016-07-29 2019-06-05 Juno Therapeutics Inc Anticorps anti-idiotypes dirigés contre anti-cd19 anticorps
NL2017270B1 (en) 2016-08-02 2018-02-09 Aduro Biotech Holdings Europe B V New anti-hCTLA-4 antibodies
MX2019001448A (es) 2016-08-05 2019-09-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion para profilaxis o tratamiento de enfermedades relacionadas con interleucina 8 (il-8).
EP3497129A1 (en) 2016-08-08 2019-06-19 H. Hoffnabb-La Roche Ag Therapeutic and diagnostic methods for cancer
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3510046A4 (en) 2016-09-07 2020-05-06 The Regents of the University of California ANTIBODIES AGAINST OXIDATION-SPECIFIC EPITOPES
EP3512883A1 (en) 2016-09-13 2019-07-24 Humanigen, Inc. Epha3 antibodies for the treatment of pulmonary fibrosis
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
EP3515932B1 (en) 2016-09-19 2023-11-22 F. Hoffmann-La Roche AG Complement factor based affinity chromatography
RS64550B1 (sr) 2016-09-23 2023-09-29 Hoffmann La Roche Upotreba il-13 antagonista za lečenje atopičnog dermatitisa
MX2019003768A (es) 2016-10-03 2019-06-24 Juno Therapeutics Inc Moleculas de enlace especificas de hpv.
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
CA3038712A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
US20190330368A1 (en) 2016-10-07 2019-10-31 Daiichi Sankyo Company, Limited Therapy for drug-resistant cancer by administration of anti-her2 antibody/drug conjugate
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
PE20191034A1 (es) 2016-10-14 2019-08-05 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas biespecificas que contienen proteinas de fusion fc il-15/il-15r y fragmentos de anticuerpo pd-1
EP3532091A2 (en) 2016-10-29 2019-09-04 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-mic antibidies and methods of use
BR112019008702A2 (pt) 2016-11-01 2019-07-16 Genmab B.V. polipeptídeo, método de diminuição de uma função fc efetora de um polipeptídeo, composição, método de tratamento, kit de partes, e, uso de um polipeptídeo ou composição.
CA3039992A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to pd-1 and uses thereof
KR102687833B1 (ko) 2016-11-02 2024-07-24 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 다발성 골수종 치료를 위한 bcma 및 cd3에 대응하는 이중 특이적 항체 및 면역학적 약물의 복합용도
MX2019005438A (es) 2016-11-15 2019-08-16 Genentech Inc Dosificacion para tratamiento con anticuerpos bispecificos anti-cd20 / anti-cd3.
CA3036983A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Cureab Gmbh Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
WO2018101448A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method of treating cancer using anti-ccr4 antibody and anti-pd-1 antibody
MX2019006334A (es) 2016-12-07 2019-08-01 Genentech Inc Anticuerpos antitau y métodos de uso.
CA3045294A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
JPWO2018110515A1 (ja) 2016-12-12 2019-10-24 第一三共株式会社 抗体−薬物コンジュゲートと免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせ
BR112019011199A2 (pt) 2016-12-12 2019-10-08 Genentech Inc método para tratar um indivíduo que tem um câncer de próstata e kits
IL311136A (en) 2016-12-22 2024-04-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-CD3 antibody for use in the treatment or prevention of cancer and molecules containing the antibody
JOP20190134A1 (ar) 2016-12-23 2019-06-02 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لنيوروبيلين وطرق استخدامها
JP7291339B2 (ja) 2016-12-26 2023-06-15 協和キリン株式会社 ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に結合する抗体
US20180230218A1 (en) 2017-01-04 2018-08-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
SG10201914064QA (en) 2017-01-06 2020-03-30 Eutilex Co Ltd Anti-human 4-1 bb antibodies and use thereof
WO2018132597A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting histone h3 peptide/mhc complexes and uses thereof
WO2018135501A1 (ja) 2017-01-17 2018-07-26 第一三共株式会社 抗ｇｐｒ２０抗体及び抗ｇｐｒ２０抗体－薬物コンジュゲート
JPWO2018139404A1 (ja) 2017-01-24 2019-11-14 協和キリン株式会社 放射線障害の治療又は予防剤並びに治療又は予防方法
TW201837174A (zh) 2017-02-07 2018-10-16 日商第一三共股份有限公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體及包含該抗體之分子
JP6995127B2 (ja) 2017-02-10 2022-02-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トリプターゼ抗体、その組成物、及びその使用
EP3580235B1 (en) 2017-02-10 2024-05-01 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
WO2018146549A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Eutilex Co., Ltd. IFN-γ-INDUCIBLE REGULATORY T CELL CONVERTIBLE ANTI-CANCER (IRTCA) ANTIBODY AND USES THEREOF
SG11201906961UA (en) 2017-02-10 2019-08-27 Genmab Bv Polypeptide variants and uses thereof
KR20240074000A (ko) 2017-02-28 2024-05-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 her3 항체-약물 콘주게이트 투여에 의한 egfr-tki 저항성의 비소세포 폐암의 치료 방법
AU2018228873A1 (en) 2017-03-01 2019-08-29 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
CA3054778A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 Kyowa Kirin Co., Ltd. Preventive or therapeutic agent for htlv-1 associated myelopathy using low-dose of anti-ccr4 antibody
PE20191758A1 (es) 2017-03-22 2019-12-12 Genentech Inc Composiciones de anticuerpo optimizadas para el tratamiento de trastornos oculares
CN110494446A (zh) 2017-03-28 2019-11-22 基因泰克公司 治疗神经退行性疾病的方法
EP3616720B1 (en) 2017-03-29 2021-02-17 Shionogi&Co., Ltd. Pharmaceutical composition for cancer treatment
JOP20190203A1 (ar) 2017-03-30 2019-09-03 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لـ tigit وطرق استخدامها
EP3674324A4 (en) 2017-03-30 2021-04-07 Tohoku University ANTI-PODOPLANIN ANTIBODIES
TW201839400A (zh) 2017-04-14 2018-11-01 美商建南德克公司 用於癌症之診斷及治療方法
CR20190480A (es) 2017-04-21 2019-11-20 Genentech Inc Uso de antagonistas de klk5 para el tratamiento de una enfermedad
MY201065A (en) 2017-04-26 2024-02-01 Eureka Therapeutics Inc Constructs specifically recognizing glypican 3 and uses thereof
EP3615572A1 (en) 2017-04-27 2020-03-04 Tesaro Inc. Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
US11116835B2 (en) 2017-05-10 2021-09-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Epstein Barr virus antibodies, vaccines, and uses of the same
TWI794230B (zh) 2017-05-15 2023-03-01 日商第一三共股份有限公司 抗ｃｄｈ６抗體及抗ｃｄｈ６抗體-藥物結合物、以及其製造方法
SG10202112636SA (en) 2017-05-16 2021-12-30 Five Prime Therapeutics Inc Anti-fgfr2 antibodies in combination with chemotherapy agents in cancer treatment
AU2018291497A1 (en) 2017-06-30 2020-01-16 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains
CN110959014B (zh) 2017-07-18 2024-01-16 协和麒麟株式会社 抗人ccr1单克隆抗体
MX2020000604A (es) 2017-07-21 2020-09-10 Genentech Inc Métodos terapéuticos y de diagnóstico para el cáncer.
BR112020001653A2 (pt) 2017-07-26 2020-07-21 Forty Seven, Inc. anticorpos anti-sirp-alfa e métodos relacionados
JP7271424B2 (ja) 2017-07-27 2023-05-11 第一三共株式会社 抗ｃｄ１４７抗体
CN118767159A (zh) 2017-08-23 2024-10-15 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物制剂及其冻干
UA128472C2 (uk) 2017-08-25 2024-07-24 Файв Прайм Терапеутікс Інк. B7-h4 антитіла і методи їх використання
KR20200041993A (ko) 2017-08-31 2020-04-22 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 개량 제조 방법
AU2018327170B2 (en) 2017-08-31 2021-03-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel method for producing antibody-drug conjugate
JP7382922B2 (ja) 2017-09-20 2023-11-17 中外製薬株式会社 Ｐｄ－１系結合アンタゴニストおよびｇｐｃ３標的化剤を使用する併用療法のための投与レジメン
KR20200061376A (ko) 2017-09-29 2020-06-02 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘쥬게이트
JP2020537515A (ja) 2017-10-03 2020-12-24 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｈｐｖ特異的結合分子
US20200262917A1 (en) 2017-10-05 2020-08-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Composition for cytotoxic t cell depletion
AU2018347521A1 (en) 2017-10-12 2020-05-07 Immunowake Inc. VEGFR-antibody light chain fusion protein
WO2019089969A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
WO2019090263A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
EP3706793A1 (en) 2017-11-08 2020-09-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
WO2019093342A1 (ja) 2017-11-08 2019-05-16 協和発酵キリン株式会社 ＣＤ４０とＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3717516A1 (en) 2017-12-01 2020-10-07 Pfizer Inc Anti-cxcr5 antibodies and compositions and uses thereof
EP3725804A4 (en) 2017-12-12 2021-10-06 Kyowa Kirin Co., Ltd. ANTI-BMP10 ANTIBODY AND THERAPEUTIC AGENT FOR HIGH BLOOD PRESSURE AND HIGH PRESSURE DISEASES, CONTAINING THE ANTIBODY AS AN ACTIVE SUBSTANCE
MA51184A (fr) 2017-12-15 2020-10-21 Juno Therapeutics Inc Molécules de liaison à l'anti-cct5 et procédés d'utilisation associés
JP2021506291A (ja) 2017-12-19 2021-02-22 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ−２ ｆｃ融合タンパク質
KR20200103706A (ko) 2017-12-22 2020-09-02 조운스 테라퓨틱스, 인크. Lilrb2에 대한 항체
WO2019126472A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Genentech, Inc. Use of pilra binding agents for treatment of a disease
CA3082280A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
TW201930350A (zh) 2017-12-28 2019-08-01 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對ｐｄ－ｌ１之抗體及其變異體
WO2019136029A1 (en) 2018-01-02 2019-07-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
SG11202006348VA (en) 2018-01-05 2020-07-29 Ac Immune Sa Misfolded tdp-43 binding molecules
EP3740507A4 (en) 2018-01-15 2022-08-24 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND VARIANTS THEREOF AGAINST PD-1
WO2019143636A1 (en) 2018-01-16 2019-07-25 Lakepharma, Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
TWI835772B (zh) 2018-01-26 2024-03-21 美商建南德克公司 Il-22fc融合蛋白及使用方法
KR20200125590A (ko) 2018-01-26 2020-11-04 제넨테크, 인크. 조성물 및 사용 방법
WO2019149269A1 (zh) 2018-02-01 2019-08-08 信达生物制药(苏州)有限公司 全人源的抗b细胞成熟抗原(bcma)单链抗体及其应用
AR115360A1 (es) 2018-02-08 2021-01-13 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno y métodos de uso
JP7418337B2 (ja) 2018-02-09 2024-01-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド マスト細胞媒介性炎症性疾患の治療法及び診断法
CA3091646A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 Abba Therapeutics Ag Anti-human pd-l2 antibodies
AU2019226009A1 (en) 2018-02-21 2020-09-03 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-H4 antibody dosing regimens
AU2019226034A1 (en) 2018-02-21 2020-10-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to HIV-1 Env and their use
SG11202007821WA (en) 2018-02-21 2020-09-29 Five Prime Therapeutics Inc B7-h4 antibody formulations
SG11202007694UA (en) 2018-02-21 2020-09-29 Genentech Inc DOSING FOR TREATMENT WITH IL-22 Fc FUSION PROTEINS
WO2019165434A1 (en) 2018-02-26 2019-08-29 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
KR20200144094A (ko) 2018-03-02 2020-12-28 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. B7-h4 항체 및 이의 사용 방법
SG11202008280TA (en) 2018-03-05 2020-09-29 Univ Saitama Medical Pharmaceutical composition for treating or preventing heterotopic ossification
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
AU2019235523A1 (en) 2018-03-14 2020-10-29 Novimmune Sa Anti-CD3 epsilon antibodies and methods of use thereof
CA3087423A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. Anti-claudin 18.2 antibodies
MX2020009296A (es) 2018-03-15 2020-11-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-virus del dengue que tienen reactividad cruzada con el virus zika y metodos de uso.
TW202003567A (zh) 2018-03-30 2020-01-16 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對lag-3之單一結構域抗體及其用途
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
KR20210019993A (ko) 2018-04-05 2021-02-23 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Τ 세포 수용체 및 이를 발현하는 조작된 세포
CN110373374B (zh) * 2018-04-12 2023-07-07 上海颢哲信息科技有限公司 一种降低抗体核心岩藻糖基化的方法和组合物
US11524991B2 (en) 2018-04-18 2022-12-13 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
CA3097741A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
EP3784274A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Fondazione Ebri Rita Levi-Montalcini Antibody directed against a tau-derived neurotoxic peptide and uses thereof
MX2020011552A (es) 2018-05-03 2020-11-24 Genmab Bv Combinaciones de variantes de anticuerpos y usos de las mismas.
IL278988B2 (en) 2018-05-28 2024-10-01 Daiichi Sankyo Company Ltd Anti-HER2 drug and antibody conjugates for use in the treatment of cancer with a HER2 mutation
WO2019230869A1 (ja) 2018-05-31 2019-12-05 第一三共株式会社 抗ヒトｔｌｒ７抗体
CN117442717A (zh) 2018-06-01 2024-01-26 大有华夏生物医药集团有限公司 治疗疾病或病况的组合物及其用途
WO2019235426A1 (ja) 2018-06-04 2019-12-12 中外製薬株式会社 細胞質内での半減期が変化した抗原結合分子
JP7268059B2 (ja) * 2018-06-07 2023-05-02 コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー アグリコシル化抗体生産用形質転換マウスおよびこれから生産されたアグリコシル化抗体の用途
SG11202012342WA (en) 2018-06-18 2021-01-28 Eureka Therapeutics Inc Constructs targeting prostate-specific membrane antigen (psma) and uses thereof
TWI819011B (zh) 2018-06-23 2023-10-21 美商建南德克公司 以pd-1 軸結合拮抗劑、鉑劑及拓撲異構酶ii 抑制劑治療肺癌之方法
CA3104997A1 (en) 2018-06-26 2020-01-02 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody binding to chondroitin sulfate proteoglycan 5
AU2019295279A1 (en) 2018-06-26 2021-01-21 Kagoshima University Antibody binding to cell adhesion molecule 3
MA53094A (fr) 2018-07-02 2021-05-12 Amgen Inc Protéine de liaison à l'antigène anti-steap1
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
TW202019518A (zh) 2018-07-13 2020-06-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 Ｃｄ３８抗體之變體及其用途
US20240254252A1 (en) 2018-07-13 2024-08-01 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
KR20210034622A (ko) 2018-07-18 2021-03-30 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제, 항 대사제, 및 백금 제제를 이용한 폐암 치료 방법
KR20210032488A (ko) 2018-07-20 2021-03-24 서피스 온콜로지, 인크. 항-cd112r 조성물 및 방법
US20210283269A1 (en) 2018-07-25 2021-09-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
SG11202100947SA (en) 2018-07-31 2021-03-30 Daiichi Sankyo Co Ltd Treatment of metastatic brain tumor by administration of antibody-drug conjugate
SG11202101152QA (en) 2018-08-03 2021-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule containing two antigen-binding domains that are linked to each other
KR20210042120A (ko) 2018-08-06 2021-04-16 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트와 튜불린 저해제의 조합
EP3608674A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing binding affinity of an antibody variant to the neonatal fc receptor
BR112021002037A2 (pt) 2018-08-10 2021-05-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha molécula de ligação de antígeno anti-cd137 e uso da mesma
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
US20210340628A1 (en) 2018-08-23 2021-11-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Sensitivity marker for antibody-drug conjugate
WO2020042015A1 (en) * 2018-08-29 2020-03-05 United Biopharma Inc Afucosylated antibodies and manufacture thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
US12097219B2 (en) 2018-09-10 2024-09-24 Legend Biotech Ireland Limited Single-domain antibodies against CLL1 and constructs thereof
EP3849565A4 (en) 2018-09-12 2022-12-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center REDUCING CD33 EXPRESSION FOR SELECTIVE PROTECTION OF THERAPEUTIC CELLS
JP2022501332A (ja) 2018-09-19 2022-01-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 膀胱がんの治療方法および診断方法
CA3113207A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of her3-mutated cancer by administration of anti-her3 antibody-drug conjugate
AU2019342133A1 (en) 2018-09-21 2021-04-22 Genentech, Inc. Diagnostic methods for triple-negative breast cancer
WO2020059847A1 (ja) 2018-09-21 2020-03-26 国立大学法人 東京医科歯科大学 ヒトｈｍｇｂ１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体、及びそれを含有するアルツハイマー病を治療又は予防するための医薬組成物
JP7529568B2 (ja) 2018-09-28 2024-08-06 協和キリン株式会社 抗体組成物
SG11202103192RA (en) 2018-10-03 2021-04-29 Xencor Inc Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
BR112021005204A2 (pt) 2018-10-05 2021-06-08 Five Prime Therapeutics, Inc. formulações farmacêuticas e método para tratar um tumor sólido
BR112021007134A2 (pt) 2018-10-15 2021-08-10 Five Prime Therapeutics, Inc. terapia combinada para câncer
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
CN113196061A (zh) 2018-10-18 2021-07-30 豪夫迈·罗氏有限公司 肉瘤样肾癌的诊断和治疗方法
WO2020089437A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Engmab Sàrl Combination therapy
JP7401456B2 (ja) 2018-11-14 2023-12-19 第一三共株式会社 抗ｃｄｈ６抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
EP3880714A4 (en) 2018-11-16 2022-07-20 Memorial Sloan Kettering Cancer Center ANTIBODIES TO MUCIN-16 AND METHODS OF USE THEREOF
CA3121265A1 (en) 2018-12-05 2020-06-11 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for cancer immunotherapy
AU2018451747A1 (en) 2018-12-06 2021-06-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of diffuse large B-cell lymphoma comprising an anti-CD79b immunoconjugates, an alkylating agent and an anti-CD20 antibody
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
TW202034959A (zh) 2018-12-11 2020-10-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物與parp抑制劑之組合
JP2022514290A (ja) 2018-12-20 2022-02-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド 改変抗体ｆｃおよび使用方法
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
US20220089694A1 (en) 2018-12-20 2022-03-24 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Ebola virus glycoprotein-specific monoclonal antibodies and uses thereof
CA3120474A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 23Andme, Inc. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
US20220040324A1 (en) 2018-12-21 2022-02-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and kinase inhibitor
SG11202106214YA (en) 2018-12-27 2021-07-29 Shionogi & Co Novel anti-ccr8 antibody
CA3125316A1 (en) 2018-12-28 2020-07-02 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to tfr
JP2022515543A (ja) 2018-12-30 2022-02-18 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 抗ウサギｃｄ１９抗体および使用方法
KR20210116525A (ko) 2019-01-14 2021-09-27 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 rna 백신으로 암을 치료하는 방법
CN113329770A (zh) 2019-01-24 2021-08-31 中外制药株式会社 新型癌抗原及所述抗原的抗体
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
PE20212198A1 (es) 2019-01-29 2021-11-16 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos y receptores quimericos de antigenos especificos para receptor 1 huerfano tipo receptor tirosina-cinasa (ror1)
CA3130695A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-cd20 or anti-cd38 antibodies
JP2022523946A (ja) 2019-03-01 2022-04-27 ゼンコア インコーポレイテッド Ｅｎｐｐ３およびｃｄ３に結合するヘテロ二量体抗体
CN113474653A (zh) 2019-03-08 2021-10-01 豪夫迈·罗氏有限公司 用于检测和定量细胞外囊泡上的膜相关蛋白的方法
EP3938403A1 (en) 2019-03-14 2022-01-19 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer with her2xcd3 bispecific antibodies in combination with anti-her2 mab
US20220153875A1 (en) 2019-03-19 2022-05-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing antigen-binding domain of which binding activity to antigen is changed depending on mta, and library for obtaining said antigen-binding domain
CA3134403A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
EP3950061A4 (en) 2019-03-25 2022-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTIBODY PYRROLOBENZODIAZEPINE DERIVATIVE CONJUGATE
EP3949988A4 (en) 2019-03-27 2022-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF AN ANTIBODY-DERIVATIVE CONJUGATE OF PYRROLOBENZODIAZEPINE AND A PARP INHIBITOR
US20220169706A1 (en) 2019-03-28 2022-06-02 Danisco Us Inc Engineered antibodies
KR20220002967A (ko) 2019-04-19 2022-01-07 제넨테크, 인크. 항 mertk 항체 및 이의 사용 방법
US20220227853A1 (en) 2019-05-03 2022-07-21 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
AU2020270376A1 (en) 2019-05-03 2021-10-07 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with an anti-PD-L1 antibody
AU2020275415A1 (en) 2019-05-14 2021-11-25 Genentech, Inc. Methods of using anti-CD79B immunoconjugates to treat follicular lymphoma
KR20220008820A (ko) 2019-05-15 2022-01-21 쿄와 기린 가부시키가이샤 Cd40과 fap에 결합하는 이중 특이적 항체
EP3971293A4 (en) 2019-05-15 2023-02-08 Kyowa Kirin Co., Ltd. BISPECIFIC ANTIBODIES CAPABLE OF BINDING TO CD40 AND GPC3
US20230085439A1 (en) 2019-05-21 2023-03-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Antibodies that bind human metapneumovirus fusion protein and their use
WO2020234473A1 (en) 2019-05-23 2020-11-26 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
EP3976113A1 (en) 2019-05-29 2022-04-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage of an antibody-drug conjugate
CA3142833A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind egfrviii and their use
US20220267453A1 (en) 2019-07-26 2022-08-25 Saitama Medical University Antibody recognizing extracellular region of alk2/acvr1
CA3148740A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Aprinoia Therapeutics Limited Antibodies that bind to pathological tau species and uses thereof
TW202118512A (zh) 2019-09-12 2021-05-16 美商建南德克公司 治療狼瘡性腎炎之組成物及方法
EP4056232A4 (en) 2019-09-13 2023-09-13 Kyowa Kirin Co., Ltd. DCR3 VARIANT
MX2022003266A (es) 2019-09-20 2022-04-11 Genentech Inc Dosis para anticuerpos anti-triptasa.
MX2022003610A (es) 2019-09-27 2022-04-20 Genentech Inc Administracion de dosis para tratamiento con anticuerpos antagonistas anti-tigit y anti-pd-l1.
MX2022004443A (es) 2019-10-18 2022-05-02 Genentech Inc Metodos para usar inmunoconjugados anti-cd79b para tratar linfoma difuso de linfocitos b grandes.
CN114630679A (zh) 2019-10-25 2022-06-14 第一三共株式会社 抗garp抗体和免疫调节剂的组合
WO2021092171A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for treatment of hematologic cancers
JP2023504736A (ja) 2019-12-06 2023-02-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｇｐｒｃ５ｄ標的結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体ならびに関連する組成物および方法
JP2023504740A (ja) 2019-12-06 2023-02-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｂｃｍａ標的結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体ならびに関連する組成物および方法
TW202128767A (zh) 2019-12-13 2021-08-01 美商建南德克公司 抗ly6g6d抗體及其使用方法
KR20220116255A (ko) 2019-12-20 2022-08-22 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 비-푸코실화 항체의 제조를 위한 푸코실화 억제제의 용도
AR120898A1 (es) 2019-12-26 2022-03-30 Univ Osaka Agente para tratar o prevenir neuromielitis óptica en fase aguda
IL294226A (en) 2019-12-27 2022-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-ctla-4 antibodies and their use
CN113045655A (zh) 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN110818795B (zh) 2020-01-10 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗tigit抗体和使用方法
US20230090965A1 (en) 2020-01-15 2023-03-23 Osaka University Prophylactic or therapeutic agent for dementia
US20230055626A1 (en) 2020-01-15 2023-02-23 Osaka University Agent for prevention or treatment of diabetic autonomic neuropathy
WO2021144457A1 (en) 2020-01-16 2021-07-22 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
WO2022050954A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
US20230078601A1 (en) 2020-01-31 2023-03-16 The Cleveland Clinic Foundation Anti-mullerian hormone receptor 2 antibodies and methods of use
CA3164559A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Lars Mueller Methods of inducing neoepitope-specific t cells with a pd-1 axis binding antagonist and an rna vaccine
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
TW202140561A (zh) 2020-02-14 2021-11-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd3結合之雙特異性抗體
CN117964757A (zh) 2020-02-14 2024-05-03 吉利德科学公司 与ccr8结合的抗体和融合蛋白及其用途
US20230348568A1 (en) 2020-02-20 2023-11-02 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Epstein-barr virus monoclonal antibodies and uses thereof
AU2021225920A1 (en) 2020-02-28 2022-09-15 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-CD137 construct and use thereof
KR20220145859A (ko) 2020-02-28 2022-10-31 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. 항cd137 작제물, 다중 특이적 항체 및 그 용도
IL296256A (en) 2020-03-13 2022-11-01 Genentech Inc Antibodies against interleukin-33 and uses thereof
KR20220156575A (ko) 2020-03-19 2022-11-25 제넨테크, 인크. 동종형 선택적 항-tgf-베타 항체 및 이용 방법
JP2023519213A (ja) 2020-03-24 2023-05-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｔｉｅ２結合剤および使用方法
CA3173263A1 (en) 2020-03-30 2021-10-07 Yasuhiro Matsumura Antibody drug conjugate
BR112022016695A2 (pt) 2020-03-30 2022-11-16 Univ Mie Anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação do mesmo, polinucleotídeo, vetor, composição farmacêutica, molécula que se liga especificamente ao hla/ny-eso humano, seus usos, e métodos de produção de um anticorpo ou de uma molécula
US20230159662A1 (en) 2020-04-01 2023-05-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody composition
EP4127724A1 (en) 2020-04-03 2023-02-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
CN115916822A (zh) 2020-04-24 2023-04-04 基因泰克公司 使用抗CD79b免疫缀合物的方法
CA3172880A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Sotirios Tsimikas Isoform-independent antibodies to lipoprotein(a)
WO2021222167A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Genentech, Inc. Methods and compositions for non-small cell lung cancer immunotherapy
KR20230087414A (ko) 2020-05-03 2023-06-16 레베나 (쑤저우) 바이오파마 컴퍼니 리미티드 항-Trop-2 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCS), 상기 ADCS를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 및 사용 방법
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
MX2022014422A (es) 2020-05-17 2022-12-07 Astrazeneca Uk Ltd Anticuerpos contra el sars-cov-2 y metodos de seleccion y uso de los mismos.
WO2021238886A1 (en) 2020-05-27 2021-12-02 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing nerve growth factor and uses thereof
CN116323665A (zh) 2020-05-29 2023-06-23 23和我公司 抗cd200r1抗体及其使用方法
CN116529260A (zh) 2020-06-02 2023-08-01 当康生物技术有限责任公司 抗cd93构建体及其用途
JP2023529842A (ja) 2020-06-02 2023-07-12 ダイナミキュア バイオテクノロジー エルエルシー 抗ｃｄ９３構築物およびその使用
JP2023529206A (ja) 2020-06-12 2023-07-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド がん免疫療法のための方法及び組成物
CA3181820A1 (en) 2020-06-16 2021-12-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating triple-negative breast cancer
TW202200616A (zh) 2020-06-18 2022-01-01 美商建南德克公司 使用抗tigit抗體及pd-1軸結合拮抗劑之治療
WO2021259880A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Almirall, S.A. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
KR20230027270A (ko) 2020-06-23 2023-02-27 지앙수 카니온 파마수티컬 씨오., 엘티디. 항-cd38 항체 및 그의 용도
JP2023542065A (ja) 2020-06-24 2023-10-05 アストラゼネカ ユーケー リミテッド 抗体－薬物複合物及びｃｄｋ９阻害剤の組み合わせ
WO2021260583A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
JP2023539715A (ja) 2020-06-24 2023-09-19 アストラゼネカ ユーケー リミテッド 抗体－薬物コンジュゲートとａｔｍ阻害剤との組合わせ
WO2021260579A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and atr inhibitor
WO2021260582A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
EP4173636A4 (en) 2020-06-30 2024-08-28 Shionogi & Co COMBINED USE OF ANTI-CCR8 ANTIBODY AND CHEMOTHERAPEUTIC
IL299803A (en) 2020-07-17 2023-03-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Production method for antibody-drug conjugate
WO2022019259A1 (ja) 2020-07-20 2022-01-27 第一三共株式会社 抗ｈｅｒ２抗体－薬物コンジュゲートとｈｅｒ二量体化阻害剤の組み合わせ
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
KR20230133832A (ko) 2020-07-29 2023-09-19 다이내믹큐어 바이오테크놀로지 엘엘씨 항-cd93 구축물 및 그의 용도
WO2022031749A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for lymphoma
KR20230095918A (ko) 2020-08-05 2023-06-29 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ror1-표적 결합 도메인에 대한 항이디오타입 항체 및 관련 조성물 및 방법
BR112023002123A2 (pt) 2020-08-07 2023-03-07 Genentech Inc Proteína de fusão fc, ácidos nucleicos isolados, método de produção da proteína de fusão fc, formulação farmacêutica, métodos para expandir o número de células dendríticas (dcs) em um indivíduo e para tratar um câncer, proteína fc sem efetora e anticorpo
BR112023002234A2 (pt) 2020-08-10 2023-03-07 Astrazeneca Uk Ltd Anticorpos sars-cov-2 para tratamento e prevenção de covid-19
JP2023537761A (ja) 2020-08-14 2023-09-05 エイシー イミューン ソシエテ アノニム ヒト化抗ｔｄｐ－４３結合分子およびその使用
JP2023538891A (ja) 2020-08-19 2023-09-12 ゼンコア インコーポレイテッド 抗ｃｄ２８組成物
WO2022043517A2 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Cureab Gmbh Anti-golph2 antibodies for macrophage and dendritic cell differentiation
IL301265A (en) 2020-09-12 2023-05-01 Astrazeneca Uk Ltd Scoring method for anti-HER2 antibody-drug conjugate therapy
MX2023002901A (es) 2020-09-14 2023-06-01 Ichnos Sciences SA Anticuerpos que se unen a la proteína auxiliar del receptor de interleucina-1 (il1rap) y usos de estos.
KR20230082632A (ko) 2020-10-05 2023-06-08 제넨테크, 인크. 항-fcrh5/항-cd3 이중특이성 항체를 사용한 치료를 위한 투약
BR112023006337A2 (pt) 2020-10-09 2023-05-09 Astrazeneca Uk Ltd Produto farmacêutico, uso de um conjugado anticorpo anti-her2-fármaco ou um inibidor seletivo de parp1, e, método de tratamento do câncer
JP2023545566A (ja) 2020-10-20 2023-10-30 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ－１軸結合アンタゴニストとｌｒｒｋ２阻害剤との併用療法
CA3192306A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Burkhard Ludewig Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to gremlin-1 and uses thereof
WO2022093981A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ptpn22 inhibitors and pd-l1 binding antagonists
KR20230100732A (ko) 2020-11-04 2023-07-05 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체의 피하 투여
KR20230095113A (ko) 2020-11-04 2023-06-28 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이적 항체들과 항-cd79b 항체 약물 접합체들을 이용한 치료를 위한 투약
CA3196539A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Chi-Chung Li Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
BR112023008845A2 (pt) 2020-11-11 2023-10-03 Daiichi Sankyo Co Ltd Composição farmacêutica, e, método de tratamento
US20230398230A1 (en) 2020-11-12 2023-12-14 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of mesothelioma by administration of anti-b7-h3 antibody-drug conjugate
KR20230114747A (ko) 2020-11-30 2023-08-01 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 Her2 표적화제
EP4260872A1 (en) 2020-12-09 2023-10-18 National University Corporation Tokyo Medical and Dental University Agent for preventing or treating frontotemporal lobar degeneration
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
WO2022132904A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
WO2022140797A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
WO2022153194A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
JP2024503658A (ja) 2021-01-13 2024-01-26 メモリアル スローン－ケタリング キャンサー センター 抗ｄｌｌ３抗体－薬物コンジュゲート
WO2022162203A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Vaccinvent Gmbh Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
CN117120084A (zh) 2021-01-28 2023-11-24 维肯芬特有限责任公司 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段
KR20230147099A (ko) 2021-01-28 2023-10-20 백신벤트 게엠베하 B 세포 매개 면역 반응을 조절하기 위한 방법 및 수단(method and means for modulating b-cell mediated immune responses)
JP2024506315A (ja) 2021-02-09 2024-02-13 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプリゼンテッド バイ ザ セクレタリー、デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ コロナウイルスのスパイクタンパク質を標的とする抗体
CA3210753A1 (en) 2021-02-09 2022-08-18 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Human monoclonal antibodies against pneumococcal antigens
CA3208365A1 (en) 2021-02-15 2022-08-18 Chantal KUHN Cell therapy compositions and methods for modulating tgf-b signaling
AR124914A1 (es) 2021-02-18 2023-05-17 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Nuevo anticuerpo anti-pad4
US20220378929A1 (en) 2021-02-25 2022-12-01 MediBoston Limted Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
EP4301418A1 (en) 2021-03-03 2024-01-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates comprising an anti-bcma antibody
WO2022187863A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
CA3211581A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Ellen WU Immunomodulatory molecules and uses thereof
MX2023010812A (es) 2021-03-15 2023-09-27 Genentech Inc Composiciones y metodos para tratar la nefritis lupica.
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
WO2022204724A1 (en) 2021-03-25 2022-09-29 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-igfbp7 constructs and uses thereof
US20240182569A1 (en) 2021-03-29 2024-06-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Stable multispecific molecule and use thereof
AR125344A1 (es) 2021-04-15 2023-07-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-c1s
AU2021443318A1 (en) 2021-04-30 2023-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
IL308351A (en) 2021-05-12 2024-01-01 Genentech Inc Methods for using anti-CD79B immunoconjugates to treat diffuse large B-cell lymphoma
WO2022241082A1 (en) 2021-05-14 2022-11-17 Genentech, Inc. Agonists of trem2
CN117480184A (zh) 2021-06-04 2024-01-30 中外制药株式会社 抗ddr2抗体及其用途
TW202313045A (zh) 2021-06-09 2023-04-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於癌症治療之組合療法
EP4355785A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
CA3221833A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-ctla-4 antibody
CA3220353A1 (en) 2021-06-25 2022-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of anti-ctla-4 antibody
CN118103397A (zh) 2021-07-08 2024-05-28 舒泰神(加州)生物科技有限公司 特异性识别tnfr2的抗体及其用途
JP2024525769A (ja) 2021-07-14 2024-07-12 舒泰神（北京）生物製薬股フン有限公司 Ｃｄ４０を特異的に認識する抗体およびその使用
WO2023004386A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Genentech, Inc. Brain targeting compositions and methods of use thereof
US20240336697A1 (en) 2021-08-07 2024-10-10 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
CN117897409A (zh) 2021-08-13 2024-04-16 基因泰克公司 抗类胰蛋白酶抗体的给药
JP2024534067A (ja) 2021-08-19 2024-09-18 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 多価抗バリアントｆｃ領域抗体および使用方法
KR20240049285A (ko) 2021-08-26 2024-04-16 쿄와 기린 가부시키가이샤 Cd116 및 cd131에 결합하는 이중 특이적 항체
AU2022332303A1 (en) 2021-08-27 2024-02-01 Genentech, Inc. Methods of treating tau pathologies
EP4396223A1 (en) 2021-08-30 2024-07-10 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
KR20240051280A (ko) 2021-09-06 2024-04-19 젠맵 에이/에스 Cd27과 결합할 수 있는 항체, 그의 변이체 및 그의 용도
EP4401791A1 (en) 2021-09-15 2024-07-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate for use in methods of treating chemotherapy-resistant cancer
KR20240058167A (ko) 2021-09-17 2024-05-03 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 Sars-cov-2 중화 항체 동정을 위한 합성 인간화 라마 나노바디 라이브러리 및 이의 용도
TW202321308A (zh) 2021-09-30 2023-06-01 美商建南德克公司 使用抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ３８抗體及ｐｄ—１軸結合拮抗劑治療血液癌症的方法
AR127269A1 (es) 2021-10-08 2024-01-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulación de anticuerpo anti-hla-dq2.5
TW202330041A (zh) 2021-10-18 2023-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗cd37抗體-藥物結合物
TW202342095A (zh) 2021-11-05 2023-11-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 用於治療和預防ｃｏｖｉｄ—１９之組成物
WO2023081818A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigens, and their uses
EP4430072A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
MX2024005876A (es) 2021-11-16 2024-05-29 Ac Immune Sa Moleculas novedosas para terapias y diagnostico.
EP4433506A1 (en) 2021-11-16 2024-09-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating systemic lupus erythematosus (sle) with mosunetuzumab
MX2024006039A (es) 2021-11-18 2024-06-04 Astrazeneca Uk Ltd Combinacion de conjugado de anticuerpo-farmaco e inhibidor selectivo de poli(adenosina-5'-difosfato-ribosa) polimerasa 1 (parp1).
KR20240113514A (ko) 2021-11-30 2024-07-22 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 프로테아제 분해성 마스크 항체
CN116829179A (zh) 2021-12-06 2023-09-29 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 特异性结合肺炎克雷伯菌o2抗原和o1抗原的双特异性抗体以及组合物
AU2022411573A1 (en) 2021-12-17 2024-06-27 Shanghai Henlius Biologics Co., Ltd. Anti-ox40 antibodies and methods of use
EP4448578A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies, multispecific antibodies and methods of use
TW202333800A (zh) 2021-12-28 2023-09-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及rasg12c抑制劑之組合
KR20240130087A (ko) 2021-12-28 2024-08-28 아스트라제네카 유케이 리미티드 항체-약물 접합체와 atr 저해제의 조합
KR20240130138A (ko) 2022-01-07 2024-08-28 존슨 앤드 존슨 엔터프라이즈 이노베이션 인코포레이티드 Il-1 베타 결합 단백질의 재료 및 방법
WO2023139292A1 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Cambridge Enterprise Limited Tau therapy
AU2023218678A1 (en) 2022-02-09 2024-08-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Environmentally responsive masked antibody and use thereof
MX2024009817A (es) 2022-02-09 2024-08-19 Nat Institutes Of Biomedical Innovation Health And Nutrition Anticuerpo o fragmento del mismo que se une a fcrl1.
KR20240142563A (ko) 2022-02-10 2024-09-30 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 코로나바이러스를 광범위하게 표적으로 하는 인간 모노클로날 항체
TW202342519A (zh) 2022-02-16 2023-11-01 瑞士商Ａｃ 免疫有限公司 人源化抗ｔｄｐ－４３結合分子及其用途
TW202342510A (zh) 2022-02-18 2023-11-01 英商Ｒｑ生物科技有限公司 抗體
WO2023159182A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Rakuten Medical, Inc. Anti-programmed death-ligand 1 (pd-l1) antibody molecules, encoding polynucleotides, and methods of use
WO2023173026A1 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2023175483A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Astrazeneca Uk Limited A scoring method for an anti-trop2 antibody‑drug conjugate therapy
WO2023180353A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
WO2023179740A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Shanghai Henlius Biotech , Inc. Anti-msln antibodies and methods of use
WO2023192827A1 (en) 2022-03-26 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023192881A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
AU2022450448A1 (en) 2022-04-01 2024-10-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023194565A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
TW202404637A (zh) 2022-04-13 2024-02-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體之醫藥組成物及使用方法
AR129062A1 (es) 2022-04-13 2024-07-10 Genentech Inc Composiciones farmacéuticas de proteínas terapéuticas y métodos de uso
AU2023258146A1 (en) 2022-04-20 2024-09-05 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof
AU2023262308A1 (en) 2022-04-27 2024-10-03 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate with ezh1 and/or ezh2 inhibitor
WO2023209177A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same
WO2023215737A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Genentech, Inc. Anti-ly6e antibodies, immunoconjugates, and uses thereof
WO2023219613A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023218378A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of an antibody specific for a tumor antigen and a cd47 inhibitor
WO2023228095A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage regimen of an anti-cdh6 antibody-drug conjugate
WO2023235699A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to lilrb4 and uses thereof
WO2023240058A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for cancer
WO2023237706A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Cross-specific antibodies, uses and methods for discovery thereof
TW202417042A (zh) 2022-07-13 2024-05-01 美商建南德克公司 用抗ｆｃｒｈ５／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
WO2024020432A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
TW202417503A (zh) 2022-07-19 2024-05-01 美商舒泰神（加州）生物科技有限公司 特異性識別ｂ和ｔ淋巴細胞衰減器（ｂｔｌａ）的抗體及其應用
WO2024020564A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024023750A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and bispecific checkpoint inhibitor
WO2024030829A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind to the underside of influenza viral neuraminidase
WO2024028731A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Transferrin receptor binding proteins for treating brain tumors
WO2024028732A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Cd98 binding constructs for treating brain tumors
WO2024037633A2 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd Formulations comprising g-csf and uses thereof
WO2024044779A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3)
WO2024049949A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
WO2024054929A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof
WO2024054822A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineered sars-cov-2 antibodies with increased neutralization breadth
WO2024064826A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
TW202426505A (zh) 2022-10-25 2024-07-01 美商建南德克公司 癌症之治療及診斷方法
WO2024097741A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Gilead Sciences, Inc. Anticancer therapies using anti-ccr8 antibody, chemo and immunotherapy combinations
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
WO2024100200A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Cis Pharma Ag Anti-l1-cam antibodies and their uses for diagnostic and therapeutic applications
WO2024108053A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof
WO2024116094A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugates and dnmt inhibitors
WO2024137381A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies for treating sars-cov-2 infection
CN116200329B (zh) * 2023-02-22 2023-08-29 洛阳赛奥生物工程技术有限公司 一种无血清昆虫培养基及应用
WO2024184494A1 (en) 2023-03-08 2024-09-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
WO2024211236A2 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2024211234A1 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2024211235A1 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997027303A1 (fr) * 1996-01-24 1997-07-31 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Alpha-1-6 fucosyltransferases
WO1997037683A1 (en) * 1996-04-10 1997-10-16 Cytel Corporation Nucleic acids encoding gdp-fucose pyrophosphorylase
US5728568A (en) * 1996-11-22 1998-03-17 Genetics Institute, Inc. Human GDP-mannose 4,6 dehydratase
WO1999054342A1 (en) * 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO1999064618A1 (en) * 1998-06-08 1999-12-16 Dcv, Inc., Doing Business As Bio-Technical Resources Vitamin c production in microorganisms and plants
WO2000061739A1 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5613352A (en) 1979-07-02 1981-02-09 Tokan Kogyo Co Ltd Easily openable container
DE3382838T2 (de) 1983-01-13 2004-04-15 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Transgene dicotyledone Pflanzenzellen und Pflanzen
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
JPS60123857A (ja) 1983-12-09 1985-07-02 Konishiroku Photo Ind Co Ltd 画像形成方法
ATE73845T1 (de) 1984-05-11 1992-04-15 Ciba Geigy Ag Transformation von pflanzenerbgut.
ZA872705B (en) 1986-04-22 1987-10-05 Immunex Corporation Human g-csf protein expression
IL84459A (en) 1986-12-05 1993-07-08 Agracetus Apparatus and method for the injection of carrier particles carrying genetic material into living cells
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
JP2928287B2 (ja) 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
JPH02257891A (ja) 1989-03-31 1990-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 組換え動物細胞による蛋白質の製造
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
JP3131322B2 (ja) 1991-12-17 2001-01-31 協和醗酵工業株式会社 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
EP0604662B1 (en) 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
JP3154564B2 (ja) * 1992-09-07 2001-04-09 科学技術振興事業団 モノクローナル抗体の改変方法
AU690474B2 (en) 1995-09-11 1998-04-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody againts alpha-chain of human interleukin 5 receptor
JP4550947B2 (ja) * 1997-03-19 2010-09-22 協和発酵キリン株式会社 ガングリオシドｇｍ２に対するヒト型相補性決定領域（ｃｄｒ）移植抗体
JP3991294B2 (ja) 1998-05-06 2007-10-17 株式会社ヴァレオサーマルシステムズ 自動車用空気調和装置のファンユニット
JP2000308526A (ja) 1999-04-28 2000-11-07 Yoshihiro Inomura 鐙型ブラシ
US6989145B2 (en) 2000-03-03 2006-01-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Recombinant antibody and antibody fragment
JP5623683B2 (ja) * 2000-03-22 2014-11-12 フィトン ホールディングス，リミティド ライアビリティ カンパニー 動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞
EA013224B1 (ru) * 2000-10-06 2010-04-30 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Клетки, продуцирующие композиции антител
JPWO2005035578A1 (ja) * 2003-10-09 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 ガングリオシドｇｍ２に特異的に結合する抗体組成物
JP6109648B2 (ja) * 2013-05-29 2017-04-05 株式会社ぐるなび 鉄道を利用した商品販売支援システム

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997027303A1 (fr) * 1996-01-24 1997-07-31 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Alpha-1-6 fucosyltransferases
WO1997037683A1 (en) * 1996-04-10 1997-10-16 Cytel Corporation Nucleic acids encoding gdp-fucose pyrophosphorylase
US5728568A (en) * 1996-11-22 1998-03-17 Genetics Institute, Inc. Human GDP-mannose 4,6 dehydratase
WO1999054342A1 (en) * 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO1999064618A1 (en) * 1998-06-08 1999-12-16 Dcv, Inc., Doing Business As Bio-Technical Resources Vitamin c production in microorganisms and plants
WO2000061739A1 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Furukawa Kiyoshi, Seitai ni okeru Totanpakushitsu Tousa no Kinou Kaiseki, Tanpakushitau Kakusan Kouso, 1998, vol. 43, No. 16, pp. 2309-2317 *
Shitara K. et al.: A new veator for the high level expression of chimeric antibodies in myeloma cells, Journal of Immunological Methods, 1994, Vol. 167, pp. 271-278 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001294198C1 (en) 2019-04-04
CN102311986B (zh) 2015-08-19
JP2015131807A (ja) 2015-07-23
JP5301525B2 (ja) 2013-09-25
EP2314686B1 (en) 2017-07-05
EP1331266A1 (en) 2003-07-30
HUP0402066A2 (hu) 2005-01-28
EP2314686A1 (en) 2011-04-27
JP2012085655A (ja) 2012-05-10
JP4290423B2 (ja) 2009-07-08
HUS2000035I1 (hu) 2022-11-28
KR100877676B1 (ko) 2009-01-09
ES2639222T5 (es) 2023-11-24
CN102311986A (zh) 2012-01-11
EP3263702A1 (en) 2018-01-03
JP2012087131A (ja) 2012-05-10
JP6270930B2 (ja) 2018-01-31
EP3690043A1 (en) 2020-08-05
JP5384677B2 (ja) 2014-01-08
EA200600469A1 (ru) 2006-08-25
AU2001294198B2 (en) 2007-11-29
CA2424602C (en) 2012-09-18
HUP0402066A3 (en) 2012-09-28
JP5770783B2 (ja) 2015-08-26
EP1331266A4 (en) 2005-07-13
CN1894406A (zh) 2007-01-10
CA2785941A1 (en) 2002-04-18
ES2639222T3 (es) 2017-10-25
EP2314686B2 (en) 2023-06-21
EA013224B1 (ru) 2010-04-30
CA2953239A1 (en) 2002-04-18
JP2013231032A (ja) 2013-11-14
EP1331266B1 (en) 2017-01-04
CN103333860B (zh) 2015-07-08
CA2785941C (en) 2017-01-10
AU9419801A (en) 2002-04-22
HU231090B1 (hu) 2020-07-28
ES2651952T3 (es) 2018-01-30
BR0114475A (pt) 2003-12-23
PL362520A1 (en) 2004-11-02
WO2002031140A1 (fr) 2002-04-18
PL218428B1 (pl) 2014-12-31
JP2012075441A (ja) 2012-04-19
JP2014043455A (ja) 2014-03-13
JP6523404B2 (ja) 2019-05-29
JP4740931B2 (ja) 2011-08-03
ES2620359T3 (es) 2017-06-28
JPWO2002031140A1 (ja) 2004-02-19
JP2009142288A (ja) 2009-07-02
JP2018078890A (ja) 2018-05-24
JP5384601B2 (ja) 2014-01-08
JP4741011B2 (ja) 2011-08-03
JP6010147B2 (ja) 2016-10-19
JP2008113663A (ja) 2008-05-22
MXPA03002974A (es) 2004-05-05
JP5547754B2 (ja) 2014-07-16
EA200300443A1 (ru) 2003-10-30
EP2314685B1 (en) 2017-09-20
EP2314685A1 (en) 2011-04-27
CA2424602A1 (en) 2003-04-02
DK2314686T3 (en) 2017-09-11
KR20030081312A (ko) 2003-10-17
JP5815641B2 (ja) 2015-11-17
CN103333860A (zh) 2013-10-02
JP2016185163A (ja) 2016-10-27
JP2011092203A (ja) 2011-05-12
DK2314686T4 (da) 2023-08-21
AU2001294198B9 (en) 2008-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013563B1 (ru) Трансгенное животное, продуцирующее антитела с измененными углеводными цепями, способ получения антител и содержащее антитела лекарственное средство
JP6944886B2 (ja) フコシル化オリゴ糖の生産における使用に適したアルファ（１，２）フコシルトランスフェラーゼ
JP4628679B2 (ja) Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
Goodman et al. Leukocyte infection by the granulocytic ehrlichiosis agent is linked to expression of a selectin ligand
CN111172220B (zh) 寡糖的发酵生产
JPH09509847A (ja) 人乳化乳
JPH08505041A (ja) 糖タンパク上もしくは糖脂質上のまたは遊離分子としてのオリゴ糖構造体の合成に用いるための、およびこれらの構造体を決定するクローン化遺伝子配列を単離するための方法および産物
US20090269802A1 (en) Alpha 1,4-galactosyltransferase and dna encoding thereof
WO2022127805A1 (en) Combination therapies of amuc_1100 and immune checkpoint modulators for use in treating cancers
CN105392883A (zh) 聚唾液酸、血型抗原以及糖蛋白表达
JP2021512647A (ja) Ｐｄ−ｌ１結合力が増大したｐｄ−１変異体
CN105229027A (zh) Nme抑制剂以及应用nme抑制剂的方法
CN106414726A (zh) 抗nme抗体
JPH05504480A (ja) 糖タンパク質、糖脂質上の、又は遊離分子としてのオリゴ糖構造の合成のための、並びにこれらの構造を決定するクローン化した遺伝配列の単離のための方法及び生成物
CN105087612A (zh) 黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因及其编码蛋白和应用
JP2017526384A (ja) 非フコシル化タンパク質および方法
Škodová-Sveráková et al. Unique dynamics of paramylon storage in the marine euglenozoan Diplonema papillatum
CN109748964B (zh) CD317单链抗体317scFv、其编码序列及制备方法和应用
WO2000006708A1 (fr) Nouveau polypeptide
TWI245048B (en) Methods and constructs for protein expression
CN114958791B (zh) 亚精胺衍生物糖基转移酶LbUGT62及其编码基因和应用
CN106536738A (zh) 抗体基因的表达‑分泌系统
JP2024502061A (ja) 組換えバチルス属微生物およびこれを用いた母乳オリゴ糖製造方法
EA028269B1 (ru) Биосинтетический ген uk-2 и способ улучшения продуктивности uk-2 с использованием такого гена
CN103848917B (zh) Survivin-MUC1融合蛋白及其编码基因与应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
MK4A Patent expired

Designated state(s): RU