TW202128767A - 抗ly6g6d抗體及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供抗 Ly6G6D (淋巴細胞抗原 6 複合物，基因座 G61) 抗體及其使用方法。

Description

抗　LY6G6D　抗體及其使用方法
本文提供抗 Ly6G6D (淋巴細胞抗原 6 複合物，基因座 G61) 抗體及其使用方法。
癌症仍然是對人類健康最致命的威脅之一。在美國，癌症每年影響超過 170 萬新病患，且是僅次於心臟病的第二大死因，約佔死亡的四分之一。尤其，大腸直腸癌 (Colorectal cancer，CRC) 是美國癌症死亡的第三大主要原因，而晚期 CRC 病患的五年存活率很低。例如 CRC 之癌症代表越來越多的社會威脅及負擔。
癌症治療的長期方法包括化學療法、放射療法及去除實性瘤的手術。近來，已開發基於雙特異性抗體的免疫療法。此類雙特異性抗體能夠同時結合細胞毒性細胞及腫瘤細胞上的細胞表面抗原，以使結合的細胞毒性細胞破壞結合的腫瘤細胞。
在該領域中，對於開發用於癌症 (例如 CRC) 治療的有效的基於雙特異性抗體免疫療法 (例如基於雙特異性抗 LY6G6D 抗體的免疫療法) 的需求尚未得到滿足。
本發明提供用於治療癌症的組成物。亦提供調配物及其使用方法。
在第一方面，本發明的特徵在於與抗淋巴細胞抗原 6 家族成員 G6D (LY6G6D) 結合的單離抗體，其中，該抗體包含含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域，其中，H1 包含含有以下互補決定區 (complementarity determining region，CDR) 的重鏈變異 (VH) 域 (VH1)：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：4 或 SEQ ID NO：111 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：112 或 SEQ ID No：113 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；且 L1 包含含有以下 CDR 的輕鏈變異 (VL) 域 (VL1)：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 或任何 SEQ ID NOs: 99-107 之胺基酸序列。在一些方面，抗體包含含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域，其中，H1 包含含有以下互補決定區 (CDR) 的重鏈變異 (VH) 域 (VH1)：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID No：5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；且 L1 包含含有以下 CDR 的輕鏈變異 (VL) 域 (VL1)：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。在一些方面，抗體包含含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域，其中，H1 包含含有以下互補決定區 (CDR) 的重鏈變異 (VH) 域 (VH1)：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID No：5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；且 L1 包含含有以下 CDR 的輕鏈變異 (VL) 域 (VL1)：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含任一 SEQ ID NOs: 99-107 之胺基酸序列。在一些方面，抗體包含含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域，其中，H1 包含含有以下互補決定區 (CDR) 的重鏈變異 (VH) 域 (VH1)：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：111 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID No：5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；且 L1 包含含有以下 CDR 的輕鏈變異 (VL) 域 (VL1)：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。在一些方面，抗體包含含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域，其中，H1 包含含有以下互補決定區 (CDR) 的重鏈變異 (VH) 域 (VH1)：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：112 或 SEQ ID No：113 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；且 L1 包含含有以下 CDR 的輕鏈變異 (VL) 域 (VL1)：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些方面，(a) 該 VH1 包含與 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性之胺基序列；(b) 該 VL1 包含與 SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列具有至少 95% 同一性之胺基酸序列；或 (c) 該抗體包含如 (a) 中的 VH1 及如 (b) 中的 VL1。
在一些方面，VH1 包含以下骨架區 (framework region，FR)：(a) FR-H1 包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；(b) FR-H2 包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；(c) FR-H3 包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4 包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列。在一些方面，該 VH1 包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列。
在一些方面，VH1 包含以下 FR：(a) FR-H1 包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；(b) FR-H2 包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；(c) FR-H3 包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4 包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列。在一些方面，該 VH1 包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。
在一些方面，VL1 包含以下 FR：(a) FR-L1 包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列；(b) FR-L2 包含 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列；(c) FR-L3 包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4 包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列。在一些方面，該 VL1 包含 SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列。
在一些方面，VL1 包含以下 FR：(a) FR-L1 包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列；(b) FR-L2 包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列；(c) FR-L3 包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4 包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列。=  在一些方面，該 VL1 包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列。
在另一方面，本揭示的特徵在於一種單離抗體，其與 LY6G6D 結合，其中該抗體包含含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域，其中，該 H1 包含含有 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的的 VH 域 (VH1)，且該 L1 包含含有 SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列的 VL 域 (VL1)。
在另一方面，本揭示的特徵在於一種單離抗體，其與 LY6G6D 結合，其中該抗體包含含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域，其中，該 H1 包含含有 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列的的 VH 域 (VH1)，且該 L1 包含含有 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列的 VL 域 (VL1)。
在一些方面，該抗體結合人 LY6G6D 多肽，其在 37°C 下使用 BIAcore 測定法所量測之 KD 介於約 100 pM 至 10 nM 之間。在一些方面，該抗體以 6.0 nM 或更低；4 nM 或更低；或 2 nM 或更低之 KD 結合人 LY6G6D 多肽。
在一些方面，抗體是單株的、人類的、人源化的或嵌合的。
在一些方面，該抗體是結合 LY6G6D 的抗體片段。在一些方面，該抗體片段選自由 Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 及 (Fab')2 片段所組成之群組。
在一些方面，該抗體是全長抗體或 IgG 抗體。
在一些方面，該抗體是單特異性抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體。
在一些方面，雙特異性抗體與分化簇 3 (cluster of differentiation 3，CD3) 結合，並包含含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，其中，該 H2 包含 VH 域 (VH2)，且該 L2 包含 VL 域 (VL2)。
在一些方面，該 CD3 結合域能夠與人 CD3 多肽或食蟹獼猴 CD3 多肽結合。在一些方面，人 CD3 多肽或食蟹獼猴 CD3 多肽分別為人 CD3ε 多肽或食蟹獼猴 CD3ε多肽。在一些方面，人 CD3 多肽或食蟹獼猴 CD3 多肽分別為人 CD3γ 多肽或食蟹獼猴 CD3γ 多肽。
在一些方面，抗體以約 1 nM 至 500 nM 之間的 KD 結合人 CD3ε 多肽，其使用 BIAcore 測定法在 37℃ 下測量。在一些方面，CD3 結合域以 250 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。在一些方面，CD3 結合域以 100 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。在一些方面，CD3 結合域以 15 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。在一些方面，CD3 結合域以 10 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。在一些方面，CD3 結合域以 5 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
在一些方面，VH2 包含下列 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID No：16 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；且 VL2 包含以下 CDR：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列。
在一些方面，該 VH2 包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性之胺基序列；(b) 該 VL2 包含與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 95% 同一性之胺基酸序列；或 (c) 該抗體包含如 (a) 中的 VH2 及如 (b) 中的 VL2。在一些方面，該 VH2 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。在一些方面，該 VL2 包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列。
在一些方面，VH2 包含下列 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID No：16 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；且 VL2 包含以下 CDR：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列； (e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列；
在一些方面，(a) 該 VH2 包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性之胺基序列；(b) 該 VL2 包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列具有至少 95% 同一性之胺基酸序列；或 (c) 該抗體包含如 (a) 中的 VH2 及如 (b) 中的 VL2。在一些方面，該 VH2 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。在一些方面，該 VL2 包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列。
在一些方面，VH2 包含以下 FR：(a) FR-H1 包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；(b) FR-H2 包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列；(c) FR-H3 包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4 包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列。
在一些方面，VH2 包含以下 FR：(a) FR-H1 包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；(b) FR-H2 包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(c) FR-H3 包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4 包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列。
在一些方面，VL2 包含以下 FR：(a) FR-L1 包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列；(b) FR-L2 包含 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列；(c) FR-L3 包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4 包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列。
在一些方面，VL2 包含以下 FR：(a) FR-L1 包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列；(b) FR-L2 包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；(c) FR-L3 包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4 包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列。
在一些方面，H1 及 H2 各進一步包含重鏈恆定域 (CH1)，且 L1 及 L2 各進一步包含輕鏈恆定域 (CL)。在一些方面，H1 的 CH1 域包含 S183 (EU 編號) 處之胺基酸取代，並且 L1 的 CL 域包含 V133 (EU 編號) 處之胺基酸取代。在一些方面，H1 的 CH1 包含 S183K 突變，而 L1 的 CL 包含 V133E 突變。在一些方面，H2 的 CH1 包含 S183E 突變，而 L2 的 CL 包含 V133K 突變。在一些方面，H1 的 CH1 包含 S183E 突變，而 L1 的 CL 包含 V133K 突變。在一些方面，H2 的 CH1 包含 S183K 突變，而 L2 的 CL 包含 V133E 突變。
在另一方面，本揭示的特徵在於與 LY6G6D 及 CD3 結合的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域；以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，其中，每個 H1 及 H2 包含重鏈變異域 (VH) 及重鏈恆定域 (CH1)，且每個 L1 及 L2 包含輕鏈變異域 (VL) 及輕鏈恆定域 (CL)，其中：(a) 該 LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：4 或 SEQ ID NO：111 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：112 或 SEQ ID NO：113 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：1 之胺基酸序列；  (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：2 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：3 或任何 SEQ ID NOs：99-107 之胺基酸序列；(b) 該 CD3 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列；(v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：13 之胺基酸序列；(vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：14 之胺基酸序列；(c) H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代及/或 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，且 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代；(d) H1 的 VH 包含在位置 Q39 處的胺基酸取代，且 L1 的 VL 包含在位置 Q38 處的胺基酸取代及/或 H2 的 VH 包含在位置 Q39 處的胺基酸取代，且 L2 的 VL 包含在位置 Q38 處的胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。在一些方面，(a) LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：4 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：5 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：1 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：2 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：3 之胺基酸序列；(b) CD3 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列；(v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：13 之胺基酸序列；(vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：14 之胺基酸序列；(c) H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代及/或 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，且 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代；(d) H1 的 VH 包含在位置 Q39 處的胺基酸取代，且 L1 的 VL 包含在位置 Q38 處的胺基酸取代及/或 H2 的 VH 包含在位置 Q39 處的胺基酸取代，且 L2 的 VL 包含在位置 Q38 處的胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。
在一些方面，(a) LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：4 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：5 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：1 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：2 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含任何 SEQ ID NOs：99-107 之胺基酸序列；(b) 該 CD3 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列；(v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：13 之胺基酸序列；(vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：14 之胺基酸序列；(c) H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代及/或 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，且 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代；(d) H1 的 VH 包含在位置 Q39 處的胺基酸取代，且 L1 的 VL 包含在位置 Q38 處的胺基酸取代及/或 H2 的 VH 包含在位置 Q39 處的胺基酸取代，且 L2 的 VL 包含在位置 Q38 處的胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。
在一些方面，(a) LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：111 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：5 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：1 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：2 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：3 之胺基酸序列；(b) CD3 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列；(v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：13 之胺基酸序列；(vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：14 之胺基酸序列；(c) H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代及/或 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，且 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代；(d) H1 的 VH 包含在位置 Q39 處的胺基酸取代，且 L1 的 VL 包含在位置 Q38 處的胺基酸取代及/或 H2 的 VH 包含在位置 Q39 處的胺基酸取代，且 L2 的 VL 包含在位置 Q38 處的胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。在一些方面，(a) LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：4 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：112 或 SEQ ID NO：113 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：1 之胺基酸序列；  (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：2 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：3 之胺基酸序列；(b) 該 CD3 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列；(v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：13 之胺基酸序列；(vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：14 之胺基酸序列；(c) H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代及/或 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，且 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代；(d) H1 的 VH 包含在位置 Q39 處的胺基酸取代，且 L1 的 VL 包含在位置 Q38 處的胺基酸取代及/或 H2 的 VH 包含在位置 Q39 處的胺基酸取代，且 L2 的 VL 包含在位置 Q38 處的胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。
在另一方面，本發明的特徵在於與 LY6G6D 及 CD3 結合的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域；以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，其中，每個 H1 及 H2 包含重鏈變異域 (VH) 及重鏈恆定域 (CH1)，且每個 L1 及 L2 包含輕鏈變異域 (VL) 及輕鏈恆定域 (CL)，其中：(a) 該 LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：4 或 SEQ ID NO：111 之胺基酸序列；  (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：112 或 SEQ ID NO：113 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；(iv) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：1 之胺基酸序列；  (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：2 之胺基酸序列；及  (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：3 或任何 SEQ ID NOs：99-107 之胺基酸序列；(b) 該 CD3 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列； (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：50 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：51 之胺基酸序列； (c) H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代及/或 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，且 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代；且 (d) H1 的 VH 包含在 Q39 位置的胺基酸取代，且 L1 的 VL 包含在 Q38 位置的胺基酸取代及/或 H2 的 VH 包含在 Q39 位置的胺基酸取代，且 L2 的 VL 包含在 Q38 位置的胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。在一些方面，(a) LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：4 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：5 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；(iv) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：1 之胺基酸序列；  (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：2 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：3 之胺基酸序列； (b) CD3 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列； (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：50 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：51 之胺基酸序列； (c) H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代及/或 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，且 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代；且 (d) H1 的 VH 包含在 Q39 位置的胺基酸取代，且 L1 的 VL 包含在 Q38 位置的胺基酸取代及/或 H2 的 VH 包含在 Q39 位置的胺基酸取代，且 L2 的 VL 包含在 Q38 位置的胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。在一些方面，(a) LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：4 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：5 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；(iv) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：1 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：2 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含任一 SEQ ID NOs：99-107之胺基酸序列； (b) CD3 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列； (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：50 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：51 之胺基酸序列； (c) H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代及/或 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，且 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代；且 (d) H1 的 VH 包含在 Q39 位置的胺基酸取代，且 L1 的 VL 包含在 Q38 位置的胺基酸取代及/或 H2 的 VH 包含在 Q39 位置的胺基酸取代，且 L2 的 VL 包含在 Q38 位置的胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。
在一些方面，(a) LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：111 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：5 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；(iv) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：1 之胺基酸序列；  (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：2 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：3 之胺基酸序列； (b) CD3 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列； (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：50 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：51 之胺基酸序列； (c) H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代及/或 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，且 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代；且 (d) H1 的 VH 包含在 Q39 位置的胺基酸取代，且 L1 的 VL 包含在 Q38 位置的胺基酸取代及/或 H2 的 VH 包含在 Q39 位置的胺基酸取代，且 L2 的 VL 包含在 Q38 位置的胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。在一些方面，(a) LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：111 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：112 或 SEQ ID NO：113 之胺基酸序列；(iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：6 之胺基酸序列；(iv) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：1 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：2 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：3 之胺基酸序列； (b)該 CD3 結合域包含下列六個 CDR：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列； (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：50 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：51 之胺基酸序列； (c) H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代及/或 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處的胺基酸取代，且 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處的胺基酸取代；且 (d) H1 的 VH 包含在 Q39 位置的胺基酸取代，且 L1 的 VL 包含在 Q38 位置的胺基酸取代及/或 H2 的 VH 包含在 Q39 位置的胺基酸取代，且 L2 的 VL 包含在 Q38 位置的胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。
在一些方面，H1 的 VH 域包含 Q39 (Kabat 編號) 處之胺基酸取代，並且 L1 的 VL 域包含 Q38 (Kabat 編號) 處之胺基酸取代。在一些方面，H2 的 CH1 域包含 S183 (EU 編號) 處之胺基酸取代，並且 L2 的 CL 域包含 V133 (EU 編號) 處之胺基酸取代。在一些方面，該 H2 的 VH 進一步包含在位置 Q39 (Kabat 編號) 處之胺基酸取代，且該 L2 的 VL 包含在位置 Q38 (Kabat 編號) 處之胺基酸取代。在一些方面，該 H1 的 CH1 包含 S183K 突變 (EU 編號)，且該 L1 的 CL 包含 V133E 突變 (EU 編號)，及該 H2 的 CH1 包含 S183E 突變 (EU 編號)，且該 L2 的 CL 包含 V133K 突變 (EU 編號)。在一些方面，該 H1 的 VH 包含 Q39E 突變 (Kabat 編號)，該 L1 的 VL 包含 Q38K 突變 (Kabat 編號)，該 H2 的 VH 包含 Q39K 突變 (Kabat 編號)，且該 L2 的 VL 包含 Q38E 突變 (Kabat 編號)。在一些方面，該 H1 的 CH1 包含 S183E 突變 (EU 編號)，且該 L1 的 CL 包含 V133K 突變 (EU 編號)，及該 H2 的 CH1 包含 S183K 突變 (EU 編號)，且該 L2 的 CL 包含 V133E 突變 (EU 編號)。在一些方面， H1 的 VH 包含 Q39K 突變 (Kabat 編號)，L1 的 VL 包含 Q38E 突變 (Kabat 編號)，H2 的 VH 包含 Q39E 突變 (Kabat 編號)，且 L2 的 VL 包含 Q38K 突變 (Kabat 編號)。
在一些方面， H2 的 VH 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列及/或 L2 的 VL 包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列。在一些方面，H1 的 VH 包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列且 L1 的 VL 包含 SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列。
在一些方面， H2 的 VH 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列及/或 L2 的 VL 包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列。在一些方面，H1 的 VH 包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列且 L1 的 VL 包含 SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列。
在一些方面，該 H1 之 Fc 區的第一 CH3 域 (CH3 1 ) 及該 H2 之 Fc 區的第二 CH3 域 (CH3 2 ) 各自包含隆凸 (protuberance) 或腔窩 (cavity)，並且其中，該 CH3 1 中之隆凸或腔窩可分別定位在 CH3 2 中之腔窩或隆凸中。在一些方面，該 CH3 1 及該 CH3 2 在所述隆凸和腔窩之間的界面處相接。
在一些方面，H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含隆凸，且 H2 之 Fc區的 CH3 2 包含腔窩。在一些方面，(a) H1 之 Fc 區的CH3 1 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的隆凸；(b) H2 之 Fc 區的 CH3 2 包含含有 T366S、L368A 或 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 或其組合的腔窩；或 (c) (a) 與 (b) 二者。
在一些方面，(a) H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的隆凸；(b) H2 之 Fc區的 CH3 2 包含含有 T366S、L368A 及 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的腔窩；或 (c) (a) 與 (b) 二者。在一些方面，(a) H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的隆凸，且 (b) H2 之 Fc 區的 CH3 2 包含含有 T366S、L368A 及 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的腔窩。
在一些方面，H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含腔窩，且 H2 之 Fc區的 CH3 2 包含隆凸。在一些方面，(a) 該 H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含含有 T366S、L368A 或 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 或其組合的腔窩；(b) H2 之 Fc 區的 CH3 2 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號)的隆凸；或 (c) (a) 與 (b) 二者。在一些方面，(a) H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含含有 T366S、L368A 及 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的腔窩；(b) H2 之 Fc區的 CH3 2 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的隆凸；或 (c) (a) 與 (b) 二者。在一些方面，(a) H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含含有 T366S、L368A 及 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的腔窩，及 (b) 第二重鏈多肽之 Fc 區的 CH3 2 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的隆凸。
在一些方面，Fc 區是人 IgG 同型 Fc 區或其 Fc 區變體。在一些方面，Fc 區是人 IgG 同型 Fc 區變體。在一些方面，人 IgG 同型 Fc 區變體各自在胺基酸殘基 N297 (EU 編號) 處包含導致醣基化缺失的突變。在一些方面，胺基酸殘基 N297 處的突變是取代突變。在一些方面，胺基酸殘基 N297 處的突變降低 Fc 區的效用 (effector) 功能。
在一些方面，取代突變為 N297G 或 N297A 突變。在一些方面，人 IgG 同型 Fc 區變體各自包含 N297G 突變。在一些方面，人 IgG 同型 Fc 區變體各自包含降低 Fc 區之功效用功能的突變。
在一些方面，降低 Fc 區效用功能的突變是取代突變。在一些方面，取代突變位於胺基酸殘基 E233、L234、L235、D265 及/或 P329 (EU 編號) 處。在一些方面，該取代突變是 E233P、L234A、L234V、L235A、D265A 或 P329G 突變。在一些方面，人 IgG 同型 Fc 區變體各自包含 P329G 突變。在一些方面，人 IgG 同型 Fc 區變體各自包含 N297G 及 P329G 突變。
在一些方面，人 IgG 同型 Fc 區變體是人 IgG1 或 IgG3 同型 Fc 區變體，各進一步包含 L234A 或 L235A 突變。在一些方面，人 IgG 同型 Fc 區變體是人 IgG1 或 IgG3 同型 Fc 區變體，各進一步包含 L234A 及 L235A 突變。
在一些方面，人 IgG 同型 Fc 區變體是人 IgG1 或 IgG3 同型 Fc 區變體，各進一步包含下列取代突變 E233P、L234V 及 L235A (Eu 編號) 及殘基 G236 的刪除 (EU 編號)。在一些方面，人 IgG 同型 Fc 區變體是人 IgG1 同型 Fc 區變體。
在一些方面，人 IgG 同型 Fc 區變體是人 IgG4 同型 Fc 區變體，各進一步包含下列取代突變 E233P、F234V 及 L235A (Eu 編號) 及殘基 G236 的刪除 (EU 編號)。
在一些方面，Fc 複合物的 Fc 區為無效應子 Fc 區。
在一些方面， H1 包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列且 L2 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列。在一些方面， H2 包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列且 L2 包含 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列。在一些方面， H2 包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列且 L2 包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列。
在另一方面，本揭示的特徵在於與 LY6G6D 與 CD3 結合的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中：(a) H1 包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列； (b) L1 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列； (c) H2 包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列；及 (d) L2 包含 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列。
在另一方面，本揭示的特徵在於與 LY6G6D 與 CD3 結合的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中：(a) H1 包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列；(b) L1 包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列；(c) H2 包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列；及 (d) L2 包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列。
在另一方面，本揭示的特徵在於與 LY6G6D 與 CD3 結合的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中：(a) H1 包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列； (b) L1 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列； (c) H2 包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 (d) L2 包含 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列。
在另一方面，本揭示的特徵在於與 LY6G6D 與 CD3 結合的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中：(a) H1 包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列； (b) L1 包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列； (c) H2 包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；及 (d) L2 包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列。
在另一方面，本揭示的特徵在於與 LY6G6D 與 CD3 結合的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中：(a) H1 包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列； (b) L1 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列； (c) H2 包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列；及 (d) L2 包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列。
在另一方面，本揭示的特徵在於與 LY6G6D 與 CD3 結合的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中：(a) H1 包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列； (b) L1 包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列； (c) H2 包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列；及 (d) L2 包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列。
在另一方面，本揭示的特徵在於與 LY6G6D 與 CD3 結合的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中：(a) H1 包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列； (b) L1 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列； (c) H2 包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 (d) L2 包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列。
在另一方面，本揭示的特徵在於與 LY6G6D 與 CD3 結合的雙特異性抗體，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中：(a) H1 包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列； (b) L1 包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列； (c) H2 包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；及 (d) L2 包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列。
在一些方面，該抗體在靜脈內注射後的清除率介於約 10 ml/kg/天至約 35 ml/kg/天之間。
在另一方面，本揭示的特徵在於一種或多種單離核酸，其編碼上述任一方面之抗體，或其包含與 LY6G6D 結合之結合域的部分。
在另一方面，本揭示的特徵在於一種或多種載體，其包含上述方面之一種或多種單離核酸。
在另一方面，本發明的特徵在於一種或多種宿主細胞，其包含上述方面之一種或多種載體。
在一些方面，一種或多種宿主細胞為一種或多種哺乳動物宿主細胞。在一些方面，一種或多種哺乳動物宿主細胞為一種或多種中華倉鼠卵巢 (Chinese hamster ovary，CHO) 宿主細胞。
在一些方面，一種或多種宿主細胞為一種或多種原核宿主細胞。在一些方面，一種或多種原核宿主細胞是一種或多種大腸桿菌(E. coli) 宿主細胞。
在另一方面，本揭示之特徵在於一種製造上述任一方面之抗體的方法，該方法包含在培養基中培養上述方面中的一種或多種宿主細胞。在一些方面，該方法進一步包括從一種或多種宿主細胞或培養基中回收抗 LY6G6D 抗體。
在另一方面，本揭示之特徵在於一種包含上述任一方面之抗體的組成物。在一些方面，該組成物進一步包含醫藥上可接受之賦形劑或稀釋劑。在一些方面，醫藥上可接受之賦形劑是緩沖劑、載劑、穩定劑或防腐劑。在一些態樣中，該組成物為醫藥組成物。
在另一方面，本揭示之特徵在於用作藥物的上述任一方面之抗體。
在另一方面，本揭示之特徵在於上述任一方面的抗體或上述任一方面的組成物用於治療或延緩有此需要之受試者中 LY6G6D 陽性癌症的進展。在一些方面，LY6G6D 陽性癌症為大腸直腸癌。在一些方面，LY6G6D 陽性癌症具有的微衛星不穩定性 (microsatellite instability，MSI) 狀態為微衛星穩定型 (microsatellite stable，MSS) 或微衛星不穩定性低 (MSI-L)。
在另一方面，本揭示之特徵在於上述任一方面的抗體或上述任一方面的組成物在製造用於治療或延緩受試者中 LY6G6D 陽性癌症的進展之藥物中之用途。在一些方面，LY6G6D 陽性癌症為大腸直腸癌。在一些方面，LY6G6D 陽性癌症具有的 MSI 狀態為 MSS 或 MSI-L。
在另一方面，本揭示之特徵在於一種治療或延遲有此需要之受試者中 LY6G6D 陽性癌症的進展之方法，該方法包含向該受試者投予上述任一方面之抗體或述任一方面之組成物。在一些方面，LY6G6D 陽性癌症為大腸直腸癌。在一些方面，LY6G6D 陽性癌症具有的 MSI 狀態為 MSS 或 MSI-L。
在另一方面，本揭示之特徵在於一種套組，其包含上述任一方面之抗體及藥品說明書，該藥品說明書包含有關使用該抗體治療或延緩受試者中 LY6G6D 陽性癌症的進展之說明。在一些方面，LY6G6D 陽性癌症為大腸直腸癌。在一些方面，LY6G6D 陽性癌症具有的 MSI 狀態為 MSS 或 MSI-L。在一些方面，該受試者為人類。
在另一方面，本揭示之特徵在於與 CD3 結合的單離抗體，其中該抗體包含含有以下 CDR 的結合域：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列。在一些方面，該抗體包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性之胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 95% 同一性之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些方面，VH 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。在一些方面，VL 包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列。
在另一方面，本揭示之特徵在於與 CD3 結合的單離抗體，其中該抗體包含含有以下 CDR 的結合域：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列。在一些方面，該抗體包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基序列具有至少 95% 序列同一性之胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列具有至少 95% 同一性之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些方面，VH 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。在一些方面，VL 包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列。
在一些方面，VH 包含下列 FR：(a) FR-H1 包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；(b) FR-H2 包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列；(c) FR-H3 包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4 包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列。
在一些方面，VH 包含下列 FR：(a) FR-H1 包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列；(b) FR-H2 包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(c) FR-H3 包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4 包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列。
在一些方面，VL 包含下列 FR：(a) FR-L1 包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列；(b) FR-L2 包含 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列；(c) FR-L3 包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4 包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列。
在一些方面，VL 包含下列 FR：(a) FR-L1 包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列；(b) FR-L2 包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；(c) FR-L3 包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4 包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列。
在一些方面，抗體以約 1 nM 至 500 nM 之間的 KD 結合人 CD3ε 多肽，其使用 BIAcore 測定法在 37℃ 下測量。在一些方面，該抗體以 250 nM 或更低；100 nM 或更低；15 nM 或更低；10 nM 或更低；或 5 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
在一些方面，抗體是單株的、人類的、人源化的或嵌合的。
在一些方面，該抗體是結合 CD3 的抗體片段。在一些方面，該抗體片段選自由 Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 及 (Fab')2 片段所組成之群組。
在一些方面，抗體為全長抗體。
在一些方面，該抗體為 IgG 抗體。
在一些方面，抗 CD3 抗體為單株抗體。
在另一方面，本揭示之特徵在於與 LY6G6D 結合的單離抗體，其中該抗體包含含有下列互補決定區 (CDR) 的結合域：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 29 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。
在一些方面，該抗體包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 32 之胺基序列具有至少 95% 序列同一性之胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列具有至少 95% 同一性之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。在一些方面，VH 包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列。在一些方面，VL 包含 SEQ ID NO: 33 之胺基酸序列。
在另一方面，本揭示的特徵在於一種單離抗體，其與 LY6G6D 結合，其中，該抗體包含含有 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列之重鏈及含有 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列之輕鏈。 【圖式簡要說明】
本申請文件中包含至少一張彩色附圖。專利局將根據要求提供帶有彩色附圖的本專利或專利申請的副本並收取必要的費用。圖 1A 為一圖，其顯示癌症基因組圖譜 (The Cancer Genome Atlas，TCGA) 中正常 (黑色) 組織及腫瘤 (紅色) 組織中，每 LY6G6D 和 LY6G6F 的表現的 nRPKM (normalized reads per kilobase million)。LY6G6D 在結腸腫瘤組織中顯著過表現。圖 1B 為顯示在公共 GTEx 項目數據中 nRPKM 中正常組織中的 LY6G6D 和 LY6G6F 表現的圖。圖 1C 是一組盒狀圖，顯示 LY6G6D 在 nRPKM 中具有微衛星穩定型 (MSS) 之微衛星不穩定性 (MSI) 狀態、微衛星不穩定性低 (MSI-L) 或微衛星不穩定性高 (MSI-H)。指出 CRC 的 MSI 狀態與預後之間的關聯。圖 2A 為正常結腸組織的顯微照片，顯示 LY6G6D 的免疫組織化學 (IHC) 染色。圖 2B 為原發性結腸腫瘤的顯微照片，顯示 LY6G6D 的 IHC 染色較弱 (1+)。圖 2C 為原發性結腸腫瘤的顯微照片，顯示 LY6G6D 的中等 (2+) IHC 染色。圖 2D 為原發性結腸腫瘤的顯微照片，顯示 LY6G6D 的強 (3+) IHC 染色。圖 3A 為一對圖，其顯示藉由包含抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂之 LY6G6D T 細胞依賴性雙特異性抗體 (TDB)，活體外 殺傷補充有來自供體 ＃1 或供體 ＃2 的 10X 人類 PBMC 的 HT55 細胞 (人類結腸癌細胞株)。列出各 TDB 的 EC50 值。圖 3B 為一組圖，其顯示在以包含抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 40G5c 或 38E4v1 臂的 LY6G6D TDB 治療後，在 NSGTM 小鼠中異種移植 HT55 腫瘤的腫瘤體積 (mm2 )。以健康的供體 PBMC 人源化小鼠。將包含遞送載體和 PMBC 或包含 LY6G6D TDB 但不含 PMBC 的治療提供作為對照。圖 3C 為一圖式，其顯示藉由包含嵌合或人源化的抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 38E4v1 臂的 LY6G6D TDB，活體外 殺傷補充有人類 PBMC 的 HT55 細胞，以及顯示在 BIAcore 測定法中嵌合或人源化 1G4 臂的親和力的表。圖 3D 為一組圖式，其顯示以包含嵌合或人源化抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 38E4v1 臂的 LY6G6D TDB 治療後，在 NSGTM 小鼠中異種移植 HT55 腫瘤的腫瘤體積 (mm2 )。以健康的供體 PBMC 人源化小鼠。將包含遞送載體和 PMBC 或包含 LY6G6D TDB 但不含 PMBC 的治療提供作為對照。圖 4A 為帶狀圖，其顯示 LY6G6D 多肽的結構同源性模型中，工程化醣基化位點 (紅色、粉紅色、綠色和藍色圓圈) 的位置。醣基化位點是基於其對抗體結合的作用進行顏色編碼。紅色圓圈標記的位點處醣基化破壞了 1G4 的結合。粉色圓圈標記的位點處醣基化破壞了 16D7 的結合。藍色圓圈標記的位點處醣基化不會破壞 1G4 或 16D7 的結合。綠色圓圈標誌著對於 Fc 的連接子中的工程化醣基化位點。圖 4B 為一圖表，顯示候選抗 LY6G6D 抗體與在所示殘基處結合包含工程化醣基化位點的 LY6G6D 多肽。標有 X 的格子表示未檢測到結合。標有 W 的格子表示結合顯著降低。圖 4C 為一對圖，顯示 LY6G6D 多肽的結構同源性模型中，工程化醣基化位點在已經旋轉 180° 的第一方向和第二方向上的位置。破壞圖 4A 的筐 (Bin) 1、2、3 和 4 的抗體結合的醣基化位點分別藉由綠色、紫色、藍色和橙色圓圈指出。圖 4D 為經註釋的 LY6G6D 多肽序列，其中受醣基化突變影響的胺基酸殘基如圖 4C 所示是彩色編碼的，且圖 4A 的筐 1、2、3 和 4 以底線表示。圖 4E 為一圖，顯示置於四個不同表位筐中的兔抗 LY6G6D 抗體殖株。筐 1包括三組序列且包括 20A12、rf.1G4、6E10 和 4H7。筐 2 包括六組序列且包括 f.16D7。筐 3 和 4 各包括三組序列。圖 4F 為一圖表，其顯示包含來自圖 4E 的筐 1、2、3 或 4 的所示抗 LY6G6D 臂和抗 CD3 40G5c 臂的兔抗人類 LY6G6D TDB 與 HT55 細胞 (人類結腸癌細胞株) 的結合。以平均螢光強度 (mean fluorescence intensity，MFI) 測量結合。圖 4G 為一圖，其顯示藉由包含來自圖 4E 的筐 1、2、3 或 4 的抗 LY6G6D 臂和抗 CD3 40G5c 臂的 LY6G6D TDB 在活體外 殺傷補充有人類 PBMC 的 HT55 細胞。圖 4H 為一組圖，其顯示使用 BIAcore 測定法所測量的 1G4 和兔抗 LY6G6D 抗體 6E10、20A12 和 4H7 與 Ly6G6D 多肽的結合。兔抗體被表現為具有兔變異域和人恆定域的嵌合抗原結合片段 (Fabs)。Ly6G6D-Fc 直接固定於晶片上，Fab 在 37o C 下流過。KD 顯示在每個圖的下方。圖 5A 為一圖，其顯示根據 Kabat 編號系統的 20A12.QNTv12 (兩種細胞) 的重鏈變異域之胺基酸序列 (SEQ ID NO：22)。指出互補決定區 (CDR) CDR H1、CDR H2 和 CDR H3。根據 Kabat 編號系統的 CDR 序列以底線表示。圖 5B 為一圖，其顯示根據 Kabat 編號系統的 20A12.QNTv12 (兩種細胞) 的輕鏈變異域之胺基酸序列 (SEQ ID NO：23)。指出CDR CDR H1、CDR H2 和 CDR H3。根據 Kabat 定義的 CDR 序列以底線表示。圖 5C 為一圖，其顯示在骨架區 (FR) 2 中，包含 Q39E 胺基酸取代突變 (加框) 的 20A12.QNTv12 (單種細胞) 的重鏈變異域之胺基酸序列 (SEQ ID NO：10)。此重鏈變異域序列對於 TDB 的單種細胞製造特別有用。根據接觸、Chothia 和 Kabat 定義指出互補決定區 (CDR) CDR H1、DR H2 和 CDR H3。根據 Kabat 定義的 CDR 序列以底線表示。圖 5D 為一圖，其顯示在 FR2 中包含 Q38K 突變 (加框) 的 20A12.QNTv12 (單種細胞) 的輕鏈變異域之胺基酸序列 (SEQ ID NO：11)。此輕鏈變異域序列對於 TDB 的單細胞製造特別有用。根據接觸、Chothia 和 Kabat 定義指出互補決定區 (CDR) CDR H1、DR H2 和 CDR H3。根據 Kabat 定義的 CDR 序列以底線表示。圖 6A 為蛋白質結構模型，其顯示與包含 LY6G6D 的胺基酸殘基 94-103 (RDCYLGDLCN；SEQ ID NO：78) 的多肽結合的 20A12.QNTv12 抗體的片段抗原結合區 (Fab)。圖 6B 為蛋白質結構模型的區域，其顯示十個重疊的複合物，其包含與 LY6G6D 的胺基酸殘基 94-103 結合的 20A12.QNTv12 抗體的 Fab。20A12.QNTv12 顯示為帶狀圖。包含 LY6G6D 殘基 94-103 的多肽顯示為棒狀圖，並標記胺基酸殘基。圖 6C 為蛋白質結構模型的區域，其顯示與 LY6G6D 的胺基酸殘基 94-103 結合的 20A12.QNTv12 抗體的重鏈 (HC；粉紅色) 和輕鏈 (LC；綠色)。包含 LY6G6D 殘基 94-103 的多肽顯示為棒狀圖，並標記胺基酸殘基。圖 6D 為蛋白質結構模型的區域，其顯示與 LY6G6D 的胺基酸殘基 94-103 結合的 20A12.QNTv12 抗體的 HC (粉紅色) 和 LC (綠色)。包含 LY6G6D 殘基 94-103 的多肽被顯示為棒狀圖，其 2Fo-Fc 電子密度圖的輪廓為 1.0σ (藍色)。圖 6E 為蛋白質結構模型的區域，其顯示與 LY6G6D 的胺基酸殘基 94-103 結合的 20A12.QNTv12 抗體。20A12 QNTv12 的重鏈變異域的 CDR H1、CDR H2 和 CDR H3 (分別為 H1、H2 和 H3)和 20A12.QNTv12 的輕鏈變異域的 CDR L1、CDR L2 和 CDR L3 (分別為 L1、L2 和 L3) 在帶狀模型中標記並用顏色表示。包含 LY6G6D 殘基 94-103 的多肽顯示為棒狀圖。圖 6F 為蛋白質結構模型的區域，其顯示與 LY6G6D 的胺基酸殘基 94-103 結合的 20A12.QNTv12 抗體。20A12.QNTv12 顯示為空間填充模型。標記 20A12 QNTv12 的重鏈變異域的 CDR H1、CDR H2 和 CDR H3 (分別為 H1、H2 和 H3)和 20A12.QNTv12 的輕鏈變異域的 CDR L1、CDR L2 和 CDR L3 (分別為 L1、L2 和 L3)。標記 20A12.QNTv12 的選定殘基，以紅色虛線表示 20A12.QNTv12 與 LY6G6D 多肽之間的相互作用。包含 LY6G6D 殘基 94-103 的多肽顯示為棒狀圖。圖 7A 為蛋白質結構模型的區域，其顯示與 LY6G6D 的胺基酸殘基 94-103 結合的 1G4 抗體。1G4 的重鏈變異域的 CDR H1、CDR H2 和 CDR H3 以及 1G4 的輕鏈變異域的 CDR L1、CDR L2 和 CDR L3 在帶狀模型中標記並用顏色表示。包含 LY6G6D 殘基 94-103 的多肽顯示為棒狀圖。圖 7B 為蛋白質結構模型的區域，其顯示與 LY6G6D 的胺基酸殘基 94-103 結合的 20A12.QNTv12 抗體。20A12.QNTv12 的重鏈變異域的 CDR H1、CDR H2 和 CDR H3 以及 20A12.QNTv12 的輕鏈變異域的 CDR L1、CDR L2 和 CDR L3 在帶狀模型中標記並用顏色表示。包含 LY6G6D 殘基 94-103 的多肽顯示為棒狀圖。圖 7C 為蛋白質結構模型，其顯示 20A12.QNTv12 抗體的片段抗原結合區 (Fab) 的重鏈 (SEQ ID NO：96) 和輕鏈 (SEQ ID NO：97) 結合至包含 LY6G6D 的胺基酸殘基 93-104 (HRDCYLGDLCNS； SEQ ID NO：87) 的多肽，及 LY6G6D 殘基 93-104 的序列圖，其顯示與 20A12.QNTv12 相互作用的特定殘基 (橙色和劃底線者)。這些殘基中的每一個都位於 Fab 的 5 Å 之內。圖 7D 為蛋白質結構模型，其顯示 20A12.QNTv12 抗體的片段抗原結合區 (Fab) 的重鏈 (SEQ ID NO：96) 和輕鏈 (SEQ ID NO：97) 結合至包含 LY6G6D 的胺基酸殘基 93-104 (HRDCYLGDLCNS； SEQ ID NO：87) 的多肽。標記 20A12.QNTv12 中與 LY6G6D 多肽相互作用的殘基。HC 表示殘基在 20A12.QNTv12 重鏈中；LC 表示殘基在 20A12.QNTv12 輕鏈中。圖 7E 為蛋白質結構模型，其顯示 1G4 抗體的片段抗原結合區 (Fab) 的重鏈 (SEQ ID NO：94) 和輕鏈 (SEQ ID NO：95) 結合至包含 LY6G6D 的胺基酸殘基 93-104 (HRDCYLGDLCNS； SEQ ID NO：87) 的多肽，及 LY6G6D 殘基 93-104 的序列圖，其顯示與 1G4 相互作用的特定殘基 (橙色和劃底線者)。這些殘基中的每一個都位於 Fab 的 5 Å 之內。圖 7F 為蛋白質結構模型，其顯示 1G4 抗體的片段抗原結合區 (Fab) 的重鏈 (SEQ ID NO：94) 和輕鏈 (SEQ ID NO：95) 結合至包含 LY6G6D 的胺基酸殘基 93-104 (HRDCYLGDLCNS； SEQ ID NO：87) 的多肽。標記 1G4 中與 LY6G6D 多肽相互作用的殘基。HC 表示殘基在 1G4 重鏈中；LC 表示殘基在 1G4 輕鏈中。圖 8A 為顯示具有抗 CD3 38E4v1 臂的 LY6G6D TDB 的製備的示意圖，該抗 CD3 38E4v1 臂包含具有形成「臼狀物 (hole)」區的 T366S、L368A 和 Y407V 胺基酸取代突變和 N297G 突變的 Fc 區，並與抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞)配對，該抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂包含具有形成「杵狀物 (knob)」區的 T366W 胺基酸取代突變和 N297G 突變的 Fc 區，其中抗 CD3 臂和抗 LY6G6D 臂形成全長 IgG1K TDB。圖 8B 為顯示使用兩種宿主細胞株 (二種細胞技術) 製造雙特異性抗體的工作流程示意圖。包含臼狀物區的抗體的第一臂在第一宿主細胞株中產生，而包含杵狀物區的抗體的第二臂在第二宿主細胞株中產生。從宿主細胞株中純化出抗體的臂，並在活體外 組裝。圖 8C 為顯示使用單種宿主細胞株 (單種細胞技術) 製造雙特異性抗體的工作流程示意圖。在單種宿主細胞株中產生並純化包含臼狀物區的抗體的第一臂和包含杵狀物區的抗體的第二臂。抗體的第一臂和第二臂包含胺基酸取代突變，如圖 8D 或圖 8E 所示。圖 8D 為顯示使用單種細胞株產生的 雙特異性抗體的圖。指出引入電荷對的胺基酸取代突變。電荷對包含在第一臂的 VH 中的 Q39K 取代突變和在第一臂的 VL 中的 Q38E 取代突變；第一臂的 CH1 中的 S183E 取代突變和第一臂的 CL 中的 V133K 取代突變；第二臂的 VH 中的 Q39E 取代突變和第二臂的 VL 中的 Q38K 取代突變；第二臂的 CH1 中的 S183K 取代突變，第二臂的 CL 中的 V133E 取代突變。圖 8E 為顯示使用單種細胞株產生的 雙特異性抗體的圖。指出胺基酸取代突變。指出引入電荷對的胺基酸取代突變。電荷對包含在第一臂的 VH 中的 Q39E 取代突變和在第一臂的 VL 中的 Q38E 取代突變；第二臂的 VH 中的 Q39K 取代突變和第二臂的 VL 中的 Q38E 取代突變；第二臂的 CH1 中的 S183E 取代突變和第二臂的 CL 中的 V133K 取代突變。該抗體亦包含第一臂的 CH1 中的 Rosetta YT65 突變 A141I、F170S、S181M、S183A 和 V185A 突變，以及第一臂的 CL 中的 F116A、L135V、S174A、S176F 和 T178V 突變。圖 9A 為顯示藉由 LY6G6D TDB 在活體外 殺傷 HT55 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂。在 CELLTITER-GLO® 測定中，殺傷定量為細胞毒性百分比。提供的 TDB 濃度介於 0.01 至 10,000 ng/mL 之間。圖 9B 為一圖，其顯示藉由包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂的 LY6G6D TDB，在活體外 活化CD4+ T 細胞。使用螢光激活細胞分選技術 (FACS) 測量 CD4+ T 細胞活化。圖 9C 為一圖，其顯示藉由包含抗 LY6G6D 臂 20A12.QNTv12 (兩種細胞) 和抗 CD3 臂 38E4v1 或 40G5c 的 LY6G6D TDB，在活體外 活化CD8+ T 細胞。使用 FACS 測量 CD8+ T 細胞活化。圖 10A 為顯示 LY6G6D TDB 在活體外 殺傷 HT55 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.v1 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂，抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂，或抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂。在 CELLTITER-GLO® 測定中，殺傷定量為細胞毒性百分比。提供的 TDB 濃度介於 0.01 至 10,000 ng/mL 之間。圖 10B 為顯示藉由 LY6G6D TDB 在活體外 活化 CD4+ T 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.v1 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂，抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂，或抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂。使用 FACS 測量 CD4+ T 細胞活化。圖 10C 為顯示 LY6G6D TDB 在活體外 活化 CD8+ T 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.v1 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂，抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂，或抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂。使用 FACS 測量 CD8+ T 細胞活化。圖 10D 為顯示 LY6G6D TDB 在活體外 殺傷 HT55 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂，抗 LY6G6D 20A12.SNVv12 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂，或抗 LY6G6D 6E10.v23 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂。在 CELLTITER-GLO® 測定中，殺傷定量為細胞毒性百分比。圖 11A 為顯示 LY6G6D TDB 在活體外 殺傷 Colo320DM、HT55 和 LS1034 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1臂。在 CELLTITER-GLO® 測定中，殺傷定量為細胞毒性百分比。圖 11B 為一組圖，其顯示藉由 FACS 測量的 LY6G6D TDB 對於 Colo320DM、HT55 和 LS1034 細胞的抗原結合能力，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 臂。圖 11C 為一組顯微照片，其顯示細胞團塊和異種移植腫瘤樣品中的 IHC 染色。圖 11D 為顯示藉由 LY6G6D TDB 在活體外 殺傷來自健康供體的補充有人類 PBMC 的 HT55 細胞的 24 小時後的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂或抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂。圖 11E 為顯示藉由 LY6G6D TDB 在活體外 殺傷來自健康供體的補充有人類 PBMC 的 HT55 細胞的 48 小時後的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂或抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂。各 TDB 的 KD 在括號中指出。圖 11F 為顯示藉由 LY6G6D TDB 在活體外 殺傷補充有來自十個供體的人類 PBMC 的 HT55 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 臂。圖 11G 為顯示由包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 臂的 LY6G6D TDB 在活體外 活化 CD8+ T 細胞的圖。使用 FACS 測量 CD8+ T 細胞活化。圖 11H 為顯示對於十個 PBMC 供體的細胞殺傷和 CD8+ T 細胞活化的 EC50 值的表。圖 11I 為顯示在 Colo320DM、HT55 和 LS1034 中藉由包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 臂的 LY6G6D TDB 在活體外 活化 CD8+ T 細胞的圖。使用 FACS 測量 CD8+ T 細胞活化。圖 12 為一圖，其顯示在以包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 -CD3 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 治療後，在小鼠中異種移植 COLO320DM 腫瘤的腫瘤體積 (mm2 )。用健康供體周邊血液單核細胞 (PBMC) 將小鼠人源化。將包含遞送載體和 PMBC 或包含 TDB 但不含 PMBC 的治療提供作為對照。圖 13A 為顯示藉由 LY6G6D TDB活體外 活化 CD4+ T 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 臂 rb6E、rb11A11、rb5D3、rb7F2、rb20F12、rb20A12、rb5E4、rb3A4、rb17F11、rb4H7、rb3D3 或人源化 1G4 及抗 CD3 40G5c 臂。使用 FACS 測量 CD4+ T 細胞活化。圖 13B 為顯示藉由 LY6G6D TDB活體外 活化 CD8+ T 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 臂 rb6E、rb11A11、rb5D3、rb7F2、rb20F12、rb20A12、rb5E4、rb3A4、rb17F11、rb4H7、rb3D3 或人源化 1G4 及抗 CD3 40G5c 臂。使用 FACS 測量 CD8+ T 細胞活化。圖 13C 為顯示藉由 LY6G6D TDB活體外 殺傷包含補充有來自供體 ＃2 的 PMBC 的 HT55 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 臂 rb6E、rb11A11、rb5D3、rb7F2、rb20F12、rb20A12、rb5E4、rb3A4、rb17F11、rb4H7、rb3D3 或人源化 1G4 和抗 CD3 40G5c 臂。在 CELLTITER-GLO® 測定中，殺傷定量為細胞毒性百分比。圖 13D 為顯示藉由 LY6G6D TDB活體外 活化CD4+ T 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 臂 rb6E、rb11A11、rb5D3、rb7F2、rb20F12、rb20A12、rb5E4、rb3A4、rb17F11、rb4H7、rb3D3 或人源化 1G4 及抗 CD3 40G5c 臂。使用 FACS 測量 CD4+ T 細胞活化。圖 13E 為顯示藉由 LY6G6D TDB活體外 活化CD8+ T 細胞的圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 臂 rb6E、rb11A11、rb5D3、rb7F2、rb20F12、rb20A12、rb5E4、rb3A4、rb17F11、rb4H7、rb3D3 或人源化 1G4 及抗 CD3 臂 40G5c。使用 FACS 測量 CD8+ T 細胞活化。圖 14A 為一圖，其顯示藉由 LY6G6D TDB 及藉由 TDB活體外 殺傷補充有來自供體 #1 的 PMBC 的 HT55 細胞，該 LY6G6D TDB使用二種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (二種細胞) 及抗 CD3 臂 38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3 或 38E4.v1 (WT) 且該 TDB 使用單種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (單種細胞) 及抗 CD3 臂 38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4 或 38E4.v1 (WT).  括號中指出相對於 WT 38E4.v1 序列的已突變 MD2、MD3 和 MD4 中的特定殘基。在 CELLTITER-GLO® 測定中，殺傷定量為細胞毒性百分比。圖 14B 為一圖，其顯示藉由 LY6G6D TDB 或藉由 TDB 在活體外 活化 CD4+ T 細胞，該 LY6G6D TDB 使用兩種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 臂 38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3 或 38E4.v1 (Wt)，且該 TDB 使用單種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (單種細胞) 和抗 CD3 臂 38E4 v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4 或 38E4.v1 (WT)。使用 FACS 測量 CD4+ T 細胞活化。圖 14C 為一圖，其顯示藉由 LY6G6D TDB在活體外 活化 CD8+ T 細胞，該 LY6G6D TDB 使用兩種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 臂 38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3 或 38E4.v1 (WT)，且該 LY6G6D TDB 使用單種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (單種細胞) 和抗 CD3 臂 38E4 v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4 或 38E4.v1 (WT)。使用 FACS 測量 CD8+ T 細胞活化。圖 15A 為一圖，其顯示藉由 LY6G6D TDB 及藉由 TDB活體外 殺傷補充有來自供體 #2 的 PMBC 的 HT55 細胞，該 LY6G6D TDB 使用二種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (二種細胞) 及抗 CD3 臂 38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3 或 38E4.v1 (WT) 且該TDB使用單種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (單種細胞) 及抗 CD3 臂 38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4 或 38E4.v1 (WT).  在 CELLTITER-GLO® 測定中，殺傷定量為細胞毒性百分比。圖 15B 為一圖，顯示藉由使用 LY6G6D TDB 在活體外 活化 CD4+ T 細胞，該 LY6G6D TDB 使用兩種細胞系統組裝並包含抗LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 臂 38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3 或 38E4.v1 (Wt)，且該 LY6G6DTDB 使用單種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (單種細胞)和抗 CD3 臂 38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4 或 38E4.v1 (WT)。使用 FACS 測量 CD4+ T 細胞活化。圖 15C 為一圖，其顯示藉由 LY6G6D TDB在活體外 活化 CD8+ T 細胞，該 LY6G6D TDB 使用兩種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 臂 38E4.v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3 或 38E4.v1 (WT)，且該 LY6G6D TDB 使用單種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (單種細胞) 和抗 CD3 臂 38E4 v1 MD1、38E4.v1 MD2、38E4.v1 MD3、38E4.v1 MD4 或 38E4.v1 (WT)。使用 FACS 測量 CD8+ T 細胞活化。圖 16A 為一圖，其顯示在以包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 40G5c 或 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 治療後，在 NSGTM 小鼠中異種移植 LS1034 腫瘤的腫瘤體積 (mm2 )。用健康供體周邊血液單核細胞 (PBMC) 將小鼠人源化。將包含遞送載體和 PMBC 或包含 LY6G6D TDB 但不含 PMBC 的治療提供作為對照。「3+」指示細胞株的 LY6G6D IHC 得分。圖 16B 為一圖，其顯示在投予單一劑量 TDB 後，在 LS1034 NSGTM 小鼠中的包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 40G5c 或 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 的血清濃度 (μg/mL)。圖 16C 為顯示圖 16A 中所示的腫瘤體積測定的原始數據的一組圖。圖 17A 為一圖，其顯示以包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 40G5c 或 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB治療後，在 NSGTM 小鼠中異種移植 HT55 腫瘤的腫瘤體積 (mm2 )。以健康的供體 PBMC 人源化小鼠。將包含遞送載體和 PMBC 或包含 TDB 但不含 PMBC 的治療提供作為對照。「2+」指示細胞株的 LY6G6D IHC 得分。圖 17B 為顯示圖 17A 所示的腫瘤體積測定的原始數據的一組圖。圖 17C 為一圖，其顯示在投予單一劑量後，在 HTT55 NSGTM 小鼠中，包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 40G5c 或 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 的血清濃度 (μg/mL)，其使用通用免疫球蛋白藥代動力學 (GRIP) ELISA測量。圖 18 為顯示在靜脈內投予單劑量 5 mg/kg 抗體後，在嚴重合併免疫缺陷 (severe combined immunodeficient，SCID) 小鼠中，包含抗 LY6G6D 臂 20A12.QNTv12 (兩種細胞) 和抗 CD3 臂 40G5c 或 38E4.v1 的 LY6G6D TDB 及抗 gD B56抗體的血清濃度 (μg/ mL) 的圖和表。Cmax ：最大血清濃度； AUC0-28 ：曲線下面積；CL：清除率；t1/2 ：半衰期。圖 19 為示意圖，顯示包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 在食蟹獼猴 (cyno) 中的毒性研究。圖 20A 為一圖，其顯示在投予指示劑量的單一劑量 TDB 後，在食蟹獼猴中的包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 的血清濃度 (μg/mL)。圖 20B 為一圖及表，其顯示在靜脈內投予單一 1 mg/kg 劑量的 TDB 後，在食蟹獼猴中，包含與抗 CD3 38E4v1 或 405Gc 臂配對的多種腫瘤靶向臂的 TDB 的血清濃度 (μg/mL) 和清除率 (CL)。圖 21 為一組顯微照片，其顯示動物編號 6003 的腦中血管周圍/血管單核浸潤，該動物被投予 15 毫克/公斤的具有抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4 v1 臂的 LY6G6D TDB。左上圖顯示對照 (正常) 腦膜血管。左下圖顯示 6003 號動物的異常腦膜血管。右圖顯示異常的腦膜血管的放大視圖。圖 . 22A i一組圖，其顯示以指定劑量的單劑量的 LY6G6D TDB 治療食蟹獼猴後及對照 (未處理) 食蟹獼猴的細胞因子 G-CSF、IL-1Ra、MCP-1、TNF-a、IL-13 和 IL-8 的濃度 (pg/mL)，該 LY6G6DTDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂(兩種細胞) 和抗 CD3 38E4.v1 臂 的包含 LY6G6D 。圖 22B 為顯示以指定劑量的單一劑量 LY6G6D TDB 治療食蟹獼猴後及對照 (未處理) 食蟹獼猴的 C 反應蛋白 (CRP；pg/mL) 的濃度散佈圖，該 LY6G6D TDB 含有抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 及抗 CD3 38E4.v1 臂。圖 23A 為一對圖，其顯示在流式細胞儀測定中，被選為表現 CD3+/CD4+/CD5+CD25 的 T 輔助 (Th) 淋巴細胞和表現CD3+/CD8+/CD5+ CD25 的T 細胞毒性 (Tc) 淋巴細胞的百分比 (右圖)，該食蟹獼猴以指定劑量的單一劑量 LY6G6D TDB 治療，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4.v1 臂，該對照食蟹獼猴未經治療。在治療前 7 天 (第-7天) 和治療當天 (第 1 天前) 進行測量，然後取平均值 (給藥前平均值)。輸液 (EOI) 結束後，分別在 2 小時、6 小時、24 小時和 168 小時進行測量。箭頭顯示了顯示輕度 T 細胞活化的峰值。圖 23B 為一圖，其顯示在以指示劑量的單一劑量 LY6G6D TDB 治療的食蟹獼猴和在對照 (未處理) 食蟹獼猴中，在流式細胞測定中被選為 CD45+/CD3+ T 淋巴細胞的細胞百分比，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4.v1 臂。箭頭表示顯示 T 細胞恢復的峰值。圖 23C 為一圖，其顯示在以指示劑量的單一劑量 LY6G6D TDB 治療的食蟹獼猴和在對照 (未處理) 食蟹獼猴中，在流式細胞測定中被選為 CD45+/CD20+ B 淋巴細胞的細胞百分比，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4.v1臂。箭頭表示顯示 B 細胞恢復的峰值。圖 23D 為一圖，其顯示在以指示劑量的單一劑量 LY6G6D TDB 治療的食蟹獼猴和在對照 (未處理) 食蟹獼猴中，在流式細胞測定中被選為 CD45+/CD16+ 天然殺手細胞的細胞百分比，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4.v1 臂。圖 24A 為一對圖，其顯示使用 BIAcore 測定法量測包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 對人類 (左圖) 和食蟹獼猴 (右圖) Ly6G6D 多肽的結合。Ly6G6D-Fc 直接固定在晶片上，且 TDB 在 37° C 流過。圖 24B 為一對圖，其顯示使用 BIAcore 測定法量測包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 40G5c 臂的 LY6G6D TDB 對人類 (左圖) 和食蟹獼猴 (右圖) Ly6G6D 多肽的結合。Ly6G6D-Fc 直接固定在晶片上，且 TDB 在 37° C 流過。圖 24C 為一對圖，其顯示使用 BIAcore 測定法測量包含抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 對人 (左圖) 和食蟹獼猴 (右圖) Ly6G6D 多肽的結合。Ly6G6D-Fc 直接固定在晶片上，且 TDB 在 37° C 流過。圖 24D 為一對圖，其顯示使用 BIAcore 測定法測量包含抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 40G5c 臂的 LY6G6D TDB 對人 (左圖) 和食蟹獼猴 (右圖) Ly6G6D 多肽的結合。Ly6G6D-Fc 直接固定在晶片上，且 TDB 在 37° C 流過。圖 25 為一組圖，其顯示使用 BIAcore 測定法測量 LY6G6D TDB 對於人 Ly6G6D 多肽的結合，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 臂 38E4.v1 (左圖)、抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (單種細胞) 及抗 CD3 臂 38E4.v1 MD1 (中間圖)，或抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (單種細胞) 和抗 CD3 臂 38E4.v1 MD4 (右圖)。Ly6G6D-Fc 直接固定在晶片上，且 TDB 在 37° C 流過。圖 26A 為一圖，其顯示以 LY6G6D TDB 治療 NSGTM 小鼠後，異種移植 HT55 腫瘤的腫瘤體積 (mm2 )，該 LY6G6D TDB 單種細胞系統組裝而成，並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (單種細胞) 及抗 CD3 臂 38E4v1 MD1、38E4v1 MD4 或 38E4v1 (Wt)，且 LY6G6D TDB 使用兩種細胞系統組裝而成，並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 (WT) 臂。將包含遞送載體和 PMBC 或包含 TDB 但不含 PMBC 的治療提供作為對照。圖 26B 為顯示圖 26A 所示的腫瘤體積測定的原始數據的一組圖。圖 27 為一圖，其顯示 LY6G6D TDB 的血清濃度 (μg/ mL)，該 LY6G6D TDB 使用兩種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 (WT) 臂，且 LY6G6D TDB 使用單種細胞系統組裝而成，並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (單種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 MD1 或 38E4v1 MD4 臂。圖 28 為一圖及表，其顯示 LY6G6D TDB 的血清濃度 (μg/ mL)，該 LY6G6D TDB 使用單種細胞系統組裝，包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (單種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 MD1 或 38E4v1 MD4 臂，且 LY6G6D TDB 使用兩種細胞系統組裝而成，並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂 (兩種細胞) 和抗 CD3 38E4v1 (WT) 臂。圖 29A 為顯示抗 CD3 殖株 38E4v1、40G5c、38E4v1 MD1 (MD1) 和 38E4v1 MD4 (MD4) 的 VL 之胺基酸序列的序列比對。根據接觸、Chothia 和 Kabat 定義指出互補決定區 (CDR) CDR L1、DR L2 和 CDR L3。根據 Kabat 定義的 CDR 序列以底線表示。圖 29B 為顯示抗 CD3 殖株 38E4v1、40G5c、38E4v1 MD1 (MD1) 和 38E4v1 MD4 (MD4) 的 VH 之胺基酸序列的序列比對。根據接觸、Chothia 和 Kabat 定義指出互補決定區 (CDR) CDR L1、DR L2 和 CDR L3。根據 Kabat 定義的 CDR 序列以底線表示。圖 29C 是顯示包括抗 CD3 38E4v1、MD1、38E4v1.S43P、38E4v1.T51A、38E4v1.K55E 和 38E4v1.K89T 臂的瞬時轉染生產測定法的結果圖。圖 29D 為顯示以不同比例的目標臂輕鏈 (LC) DNA 與抗 CD3 臂 DNA (目標臂 LC：CD3 LC)，對於 LY6G6D TDB 產生的正確配對的雙特異性抗體的百分比圖，該 LY6G6D TDB 包含抗 LY6G6D 臂或抗 FcRH5 臂和抗 CD3 臂 38E4v1 (WT)、MD1 或具有單一胺基酸取代 (在括號中表示) 的變體 38E4v1 臂。圖 29E 顯示在投予單一 5mg/kg 劑量的單特異性，二價抗 CD3 抗體至 CB-17 SCID 小鼠 (每時間點 n = 3)後的血清濃度 (μg/mL) 的圖，該抗體包含抗 CD3 臂 38E4v1、40G5c、MD1、MD4 或 38E4v1 K55E 。抗 gD 抗體顯示為對照。個別數據點 (符號) 與連接的平均值 (實線) 一起顯示。圖 29F 顯示在骨架區 (FR) 2中，包含 Q38E 胺基酸取代突變的抗 CD3 殖株 38E4v1、40G5c、MD1 和 MD4 的 VL 之胺基酸序列的序列比對。此輕鏈變異域序列對於 TDB 的單細胞製造特別有用。根據接觸、Chothia 和 Kabat 定義指出互補決定區 (CDR) CDR L1、DR L2 和 CDR L3。根據 Kabat 定義的 CDR 序列以底線表示。圖 29G 顯示在骨架區 (FR) 2中，包含 Q39K 胺基酸取代突變的抗 CD3 殖株 38E4v1、40G5c、MD1 和 MD4 的 VH 之胺基酸序列的序列比對。此重鏈變異域序列對於 TDB 的單種細胞製造特別有用。根據接觸、Chothia 和 Kabat 定義指出互補決定區 (CDR) CDR L1、DR L2 和 CDR L3。根據 Kabat 定義的 CDR 序列以底線表示。圖 30 為顯示對於抗 LY6G6D 1G4 臂的兩個製造複製物的瞬時轉染生產測定法的結果圖。抗 CD3 臂 38E4v1 和抗 GFR1 臂提供作為對照。圖 31A 為兔殖株 20A12 的輕鏈 (LC) 和重鏈 (HC) 的圖，其顯示CDR-L3 處的醣基化位點以及 CDR-H1 和 CDR-L2 的兩個半胱胺酸殘基之間的二硫鍵。圖 31B 為一組圖，其顯示使用 BIAcore 測定法量測包含兔 20A12 CDR 和人輕鏈骨架區 hIGKV.1-5、hIGKV.1-39 和 hIGKV.4-1 的抗 LY6G6D 臂 20A12 的變體及人重鏈骨架區 hIGHV.3-23 和 hIGHV.3-30 的結合。顯示人類種系序列對於 rb.20A12 序列的同一性百分比及每個變體中游標位 (Vernier position) 的數目。圖 31C 為顯示各種人類 VL 種系序列對於 rb.20A12 序列的同一性百分比表；在每個人類種系序列中游標的位數目；以及在人類中種系序列的盛行率。圖 31D 為顯示各種人類 VH 種系序列對於 rb.20A12 序列的同一性百分比表；在每個人類種系序列中游標的位數目；以及在人類中種系序列的盛行率。圖 32A 為兔殖株 20A12 的輕鏈 (LC) 和重鏈 (HC) 的圖，其顯示CDR-L3 處的醣基化位點以及 CDR-H1 和 CDR-L2 的兩個半胱胺酸殘基之間的二硫鍵。圖 32B 為人源化 20A12 變體 20A12.v1 的 LC 和 HC 的圖，其顯示 CDR-L3 上的醣基化位點，及消除 CDR-H1 和 CDR-L2 的兩個半胱胺酸殘基之間的二硫鍵的 C35S 和 C50A 胺基酸取代突變。20A12.v1 包含 hIGHV.3-23 的 VH 骨架區和 hIGKV.1-39 的 VL 骨架區。人類骨架區已在九個位置 (圓圈) 處修飾，以包含衍生自 20A12 兔序列的游標殘基。圖 32C 為完善的人源化 20A12 變體 的 LC 和 HC 的圖，其顯示 CDR-L3 上的醣基化位點，及消除 CDR-H1 和 CDR-L2 的兩個半胱胺酸殘基之間的二硫鍵的 C35S 和 C50A 胺基酸取代突變。完善的 20A12 變體包含 hIGHV.3-23 的 VH 骨架區和 hIGKV.1-5 的 VL 骨架區。人類骨架區已在四個位置 (圓圈) 處修飾，以包含衍生自 20A12 兔序列的游標殘基。圖 32D 為一對圖及表格，其顯示 rb.20A12 及其各種人源化變體的 KD。中心柱指出相對於 hIGHV.3-23 的人類骨架區重鏈 (H) 序列和人類骨架區輕鏈 (L) 序列的胺基酸取代突變，其將胺基酸位置還原為兔游標殘基。圖 33A 為顯示各種人類 VL 種系序列對於 rb.6E10 序列的同一性百分比表；在每個人類種系序列中游標的位數目；以及在人類中種系序列的盛行率。圖 33B 為顯示各種人類 VH 種系序列對於 rb.6E10 序列的同一性百分比表；在每個人類種系序列中游標的位數目；以及在人類中種系序列的盛行率。圖 34A 為一組圖，其顯示使用 BIAcore 測定法量測 rb.20A12 和具有 rb.20A12 變異結構域和人類恆定區的多種嵌合 Fab 結合 Ly6G6D多肽。每個嵌合 Fab 各在 CDR-H1 的 C35 和 CDR-H2 的 C50 處包含胺基酸突變，如下所示：C35S-C50A (SA)、C35S-C50S (SS)、C35I-C50A (IA)、C35I-C50S (IS) 和 C35I-C50I (II)。指出對於各嵌合 Fab 的 KD。圖 34B 為顯示使用 BIAcore 測定法量測結合至 LY6G6D，在具有序列 NNT 的 rb.20A12 之 CDR-L3 處的醣基化位點的序列圖，以及顯示在醣基化位點處具有胺基酸取代突變的上述完善的人源化 20A12 輕鏈序列的變體的KD之表。圖 34C 為一組圖，其顯示兔 20A12、含 C35I 和 C50A (IA) 突變的兔 20A12 的 Fab 變體及在圖 34B 的醣基化位點具有 QNT 胺基酸取代突變的完善人源化 20A12 與 LY6G6D 的結合，如使用 BIAcore 測定法進行測量。Ly6G6D-Fc 在 Protein A 晶片上被捕獲，且 Fab 在37o C 下流過。圖 34D 為一組圖，其顯示在圖 34B 的醣基化位點具有 QNV、SNV、GNT 和 SNA 胺基酸取代突變的完善的人源化 20A12 輕鏈序列的 Fab 變體結合至 Ly6G6D 多肽，如使用 BIAcore 測定法進行測量。Ly6G6D-Fc 在 Protein A 晶片上被捕獲，且 Fab 在37o C 下流過。圖 35A 為一圖，其顯示圖 32A 的兔 20A12，以及顯示使用 BIAcore 測定法量測圖示抗體結合至 LY6G6D的圖。 圖 35B 為一圖，其顯示完善人源化 20A12 變體 20A12.QNTv12，以及顯示使用 BIAcore 測定法量測圖示抗體結合至 LY6G6D 的圖。 圖 36 為一組曲線圖，顯示 20A12.QNTv12、6E10.v114 和 1G4 結合至人和食蟹獼猴 LY6G6D 多肽的結合，以及總結各測定的 KD 的表，如使用 BIAcore 測定法測量。 Ly6G6D-Fc 直接固定在晶片上，且 TDB 在 37° C 流過。圖 37 為顯示對於抗 LY6G6D 20A12.QNTv.1 和 20A12.QNTv12 臂的瞬時轉染生產測定法的結果的圖。抗 CD3 臂 38E4v1 和抗 FGFR1 臂提供作為對照。圖 38 為顯示對於抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 (20A12.ver1. 完善的) 臂的非特異性清除的桿狀病毒 (BV) ELISA 測定結果表。圖 39 為顯示包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂的 TDB 的分子評估 (MA) 分析結果表。綠色表示未發現明顯問題的測定法。圖 40A 為顯示 20A12 的人源化變體之胺基酸序列的序列比對，該 20A12 包含 rb.20A12 的 CDR 和人類種系序列 hIGHV.3-23 或 hIGHV.3-30 的 VH 骨架區以及人類種系序列 hIGHV.1-5、hIGKV.1-39 或 hIGKV.4-1 的 VL 骨架區序列，各具有兔游標殘基。指出互補決定區 (CDR) CDR L1、CDR L2 和 CDR L3。將序列中不同的殘基突出顯示。圖 40B 為顯示 rb.20A12 和人源化變體 20A12.QNTv.1 和 20A12.QNTv12 之胺基酸序列的序列比對。指出互補決定區 (CDR) CDR L1、CDR L2 和 CDR L3。將序列中不同的殘基突出顯示。圖 40C 為序列比對，其顯示人種系序列 hIGHV.3-23 的 VH、人種系序列 hIGHV.1-5 的 VL 以及人源化 20A12 變體 20A12.QNTv.1 和 20A12.QNTv12 的 VH 和 VL 之胺基酸序列。橢圓形表示存在於 20A12.QNTv.1 和 20A12.QNTv12 中的兔游標殘基。指出互補決定區 (CDR) CDR L1、CDR L2 和 CDR L3。將序列中不同的殘基突出顯示。圖 41 為顯示 6E10v1 Fab 的分子評估 (MA) 分析結果表。綠色表示未發現明顯問題的測定法；紅色表示已確定問題。圖 42 為一組圖，其顯示抗 LY6G6D 臂 6E10 之變體的結合，該抗 LY6G6D 臂 6E10 包含兔 6E10 CDR 和人類種系序列 hIGHV.3-53、hIGHV.4-4 或 hIGHV.3-48 的 VH 骨架區以及人類種系序列 hIGHV.1-5、hIGKV.3-20 或 hIGKV.4-1 的 VL 骨架區，如使用 BIAcore 測定法量測。顯示每個變體中游標的位的數量。圖 43A 為顯示 6E10 的人源化變體之胺基酸序列的序列比對，該 6E10 包含 rb.6E10 的 CDR 和人類種系序列 hIGHV.3-53、hIGHV.4-4 或 hIGHV.3-48 的 VH 骨架區以及人類種系序列 hIGHV.1-5、hIGKV.3-20 或 hIGKV.4-1 的 VL 骨架區。指出互補決定區 (CDR) CDR L1、CDR L2 和 CDR L3。將序列中不同的殘基突出顯示。圖 43B 為顯示 rb.6E10 和人源化變體 6E10.v23 和 6E10.v114 之胺基酸序列的序列比對。指出互補決定區 (CDR) CDR L1、CDR L2 和 CDR L3。將序列中不同的殘基突出顯示。圖 43C 為顯示人類種系序列 hIGHV.3-53 * 01 的 VH 以及人類種系序列 hIGHV.3-20*01 的 VL 和 rb.6E10 的 VH 和 VL 和人源化 6E10 變體 6E10.v114 之胺基酸序列的序列比對。橢圓形表示存在於 rb.6E10 和 6E10.v114 中的兔游標殘基。指出互補決定區 (CDR) CDR L1、CDR L2 和 CDR L3。將序列中不同的殘基突出顯示。圖 43D 為顯示人類種系序列 hIGHV.3-48 * 01 的 VH 以及人類種系序列 hIGHV.1-5*01 的 VL 和 rb.6E10 的 VH 和 VL 和人源化 6E10 變體 6E10.v23 之胺基酸序列的序列比對。橢圓形表示存在於 rb.6E10 和 6E10.v23 中的兔游標殘基。指出互補決定區 (CDR) CDR L1、CDR L2 和 CDR L3。將序列中不同的殘基突出顯示。序列表
本申請包含序列表，該序列表已經以 ASCII 格式以電子方式提交，並以引用方式以其全部內容併入本文。該 ASCII 複本創建於 2020 年 12 月 7 日，命名為 50474-184TW2_Sequence_Listing_12_7_20_ST25，且大小為 146,127 位元組。
I. 界定
如本文所用，術語「約」係指本技術領域技術人員易於知曉的各個值的通常誤差範圍。在本文中，涉及「約」的值或參數包括 (並描述) 指向該值或參數本身之態樣 。
應當理解，本文所述之本發明的態樣和實施例包括「包含」、「由……組成」、和「基本上由……組成」。
如本文所用，術語「Ly6G6D」或「淋巴細胞抗原 6 複合物，基因座 G61」涉及來自任何脊椎動物來源的任何天然 Ly6G6D，包括哺乳動物，例如靈長類動物 (例如人類) 及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)，除非除另有說明外，其包括「全長」未處理的 Ly6G6D，以及因在細胞中處理所產生之任何形式的 Ly6G6D。該術語亦涵蓋天然生成之 Ly6G6D 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。Ly6G6D 亦稱為 G6D、Ly6-D、C6orf23、巨核細胞增強基因轉錄本 1 (MEGT1) 及 NG25，並在美國專利號 7,951,546 中揭示，該專利案藉由引用以其全文的方式併入本文，如 TAT201，具有 SEQ ID NO：75 之胺基酸序列，及 SEQ ID NO：76 的核苷酸序列，DNA234441。Ly6G6D 包括例如人類 Ly6G6D 蛋白 (NCBI RefSeq No.NP_067079.2)，其長度為 133 個胺基酸。
術語「抗 LY6G6D 抗體」及「結合至 LY6G6D 之抗體」是指能夠以足夠親和力結合 LY6G6D，從而使得該抗體可用作靶向 LY6G6D 之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，抗 LY6G6D 拮抗劑抗體與無關、非 LY6G6D 蛋白質結合之程度低於該抗體與 LY6G6D 結合約 10%，其藉由例如放射免疫測定 (RIA) 所量測。在某些實施例中，與 LY6G6D 結合之抗體具有之解離常數 (KD ) 為 ≤ 1 μM、≤ 250 nM、≤ 100 nM、≤ 15 nM、≤ 10 nM、≤ 6 nM、≤ 4 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或 ≤ 0.001 nM (例如 10-8 M 或更低，例如 10-8 M 至 10-13 M，例如 10-9 M 至 10-13 M)。在某些實施例中，抗 LY6G6D 拮抗劑抗體結合至 LY6G6D 之抗原決定位，其在不同物種之 LY6G6D 是保守性。
如本文所用，術語「分化簇 3」或「CD3」涉及來自任何脊椎動物來源的任何天然 CD3，包括哺乳動物，例如靈長類動物 (例如人類) 和囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)，除非另有說明，包括例如 CD3ε、CD3γ、CD3α 及 CD3β 鏈。該術語涵蓋「全長」、未處理之 CD3 (例如未處理或未修飾之 CD3ε 或 CD3γ) 以及在細胞處理中得到的任何形式的 CD3。該術語亦涵蓋天然生成之 CD3 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。CD3 包括例如長度為 207 個胺基酸的人類 CD3ε 蛋白 (NCBI RefSeq No. NP_000724) 及長度為 182 個胺基酸的人類 CD3γ 蛋白 (NCBI RefSeq No. NP_000064)。
術語「抗 CD3 抗體」及「結合至 CD3 之抗體」是指能夠以足夠親和力結合 CD3，從而使得該抗體可用作靶向 CD3 之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，抗 CD3 拮抗劑抗體與無關、非 CD3 蛋白質結合之程度低於該抗體與 CD3 結合約 10%，其藉由例如放射免疫測定 (RIA) 所量測。在某些實施例中，與 CD3 結合之抗體具有之解離常數 (KD ) 為  ≤ 1 μM、≤ 250 nM、≤ 100 nM、≤ 15 nM、≤ 10 nM、≤ 5 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或  ≤ 0.001 nM (例如 10-8 M 或更低，例如 10-8 M 至 10-13 M，例如 10-9 M 至 10-13 M)。在某些實施例中，抗 CD3 拮抗劑抗體結合至 CD3 之抗原決定位，其在不同物種之 CD3 是保守性。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）及抗體片段，只要其等展示出預期抗原結合活性即可。
「親和力」係指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合搭配物 (例如抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」，係指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對於其搭配物 Y 之親和力通常可藉由解離常數 (KD ) 來表示。可以藉由本領域已知的常規方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。下面描述了用於測量結合親和性的具體的說明性和示例性態樣。
術語「親和力成熟」之抗體是指在一或多個互補決定區 (HVR) 中具有一或多種變化之抗體，與不具有此等變化之親本抗體相比，此類變化引起該抗體對抗原之親和力的改善。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構或具有含有如本文中所定義的 Fc 區域的重鏈之抗體。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 (例如，scFv、ScFab) 抗原片段形成的多特異性抗體。
單域抗體為包含抗體之重鏈變異域之全部或部分或抗體之輕鏈變異域之全部或部分之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人單域抗體 (參見 例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。單域 (single-domain) 抗體的實例包括但不限於 VHH。
「Fab」片段是藉由木瓜蛋白酶消化抗體產生的抗原結合片段，並完整的 L 鏈以及 H 鏈的變異區域 (VH) 及一個重鏈的第一恆定域 (CH1) 組成。抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的 Fab 片段。胃蛋白酶對抗體的處理產生單一大的 F(ab')2 片段，該片段大致對應於兩個具有兩價抗原結合活性並且仍能夠交聯抗原的雙硫鍵連接的 Fab 片段。Fab' 片段與 Fab 片段的不同之處在於，在 CH1 域的羧基末端具有額外的少數殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab'-SH 是指恆定域之半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基的 Fab'。F(ab')2 抗體片段最初作爲成對 Fab' 片段產生，其具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學耦聯也是已知的。
「Fv」由緊密、非共價結合的一個重鏈變異區域和一個輕鏈變異區域的二聚體組成。從這兩個域的折疊中，產生六個高度變異環圈 (每個來自 H 和 L 鏈的 3 個環圈)，其貢獻用於抗原結合的胺基酸殘基，並賦予抗原與抗體的結合特異性。然而，即使單一變異域 (或僅包含三個針對抗原的 CDR 的半個 Fv) 也具有辨識和結合抗原的能力，儘管親和力低於整個結合位點。
本文中術語「Fc 區域」用於定義免疫球蛋白重鏈之 C 端區域，包括天然序列 Fc 區域及變異 Fc 區域。儘管免疫球蛋白重鏈之 Fc 區域之邊界可能略有變化，但通常將人 IgG 重鏈之 Fc 區域定義爲從 Cys226 或 Pro230 位置之胺基酸殘基延伸至其羧基端。例如，在抗體生產或純化過程中，或藉由重組工程化編碼抗體重鏈之核酸，可去除 Fc 區域之 C 端離胺酸 (根據 EU 編號系統之殘基 447)。因此，完整抗體之組成物可包含去除所有 Lys447 殘基之抗體群體、未去除 Lys447 殘基之抗體群體及具有含及不包含 Lys447 殘基之抗體混合物之抗體群體。
「功能性 Fc 區」具有天然序列 Fc 區的「效用功能」。例示性的「效用功能」包括 C1q 結合；CDC；Fc 受體結合；ADCC；吞噬作用；細胞表面受體 (例如 B 細胞受體；BCR) 的下調等，此類效用功能通常需要將 Fc 區與結合域 (例如 ，抗體變異域) 結合，且可使用例如在本文中定義的已揭示的各種測定法進行評估。
「天然序列 Fc 區」包含與自然界中發現的 Fc 區的胺基酸序列具有同一性的胺基酸序列。天然序列人 Fc 區包括但不限於天然序列人 IgG1 Fc 區（非 A 和 A 同種異型）；天然序列人 IgG2 Fc 區；天然序列人 IgG3 Fc 區；和天然序列人 IgG4 Fc 區，以及其天然生成之變異體。
「變異體 Fc 區」包含由於至少一種胺基酸修飾，較佳一個或多個胺基酸置換，而不同於天然序列 Fc 區的胺基酸序列。較佳地，與天然序列 Fc 區或親本多肽的 Fc 區相比，變異體 Fc 區具有至少一個胺基酸置換，例如 ，天然序列 Fc 區或親本多肽的 Fc 區中約一個至約十個胺基酸置換，較佳地約一個至約五個胺基酸置換。本文的變異體 Fc 區較佳地與天然序列 Fc 區和/或親本多肽的 Fc 區具有至少約 80％ 的同源性，最佳地與其具有至少約 90％ 的同源性，較佳地具有至少約 95％ 的同源性。
如本文所用，「Fc 複合物」涉及兩個 Fc 區的 CH3 域一起相互作用以形成二聚體，或者在某些方面，兩個 Fc 區相互作用以形成二聚體，其中在鉸鏈區及/或 CH3 域的半胱胺酸殘基經由鍵及/或力 (例如 ，凡得瓦力 (Van der Waals)、疏水力、氫鍵、靜電力或二硫鍵) 相互作用。
如本文所用，「Fc 成分」涉及 Fc 區的鉸鏈區、CH2 域或 CH3 域。
「鉸鏈區」通常定義為從 IgG 的約殘基 216 延伸至 230 (EU 編號)、從 IgG 的約殘基 226 延伸至 243 (Kabat 編號) 或從 IgG 的約殘基 1 延伸至 15 (IMGT 唯一編號)。
Fc 區的「下部鉸鏈區」通常定義為緊接在鉸鏈區 C 端的殘基延伸，即，Fc 區的殘基 233 至 239 (EU 編號)。
「變異體 Fc 區」包含由於至少一種胺基酸修飾，較佳一個或多個胺基酸置換，而不同於天然序列 Fc 區的胺基酸序列。較佳地，與天然序列 Fc 區或親本多肽的 Fc 區相比，變異體 Fc 區具有至少一個胺基酸置換，例如，天然序列 Fc 區或親本多肽的 Fc 區中約一個至約十個胺基酸置換，較佳地約一個至約五個胺基酸置換。本文的變異體 Fc 區較佳地與天然序列 Fc 區和/或親本多肽的 Fc 區具有至少約 80％ 的同源性，最佳地與其具有至少約 90％ 的同源性，更佳地具有至少約 95％ 的同源性。
「Fc 受體」或「FcR」係指與抗體之 Fc 區域結合之受體。較佳 FcR 為天然序列人 FcR。再者，較佳的 FcR 是結合 IgG 抗體 (γ 受體) 並且包括 FcγRI、FcγRII 及 FcγRIII 次類的受體者，包括這些受體的等位基因變異體及剪接形式。FcγRII 受體包括 FcγRIIA (「活化受體」) 和 FcγRIIB (「抑制受體」)，它們具有相似的胺基酸序列，其主要區別在於其胞質域。活化受體 FcγRIIA 在其胞質結構域中包含基於免疫受體酪胺酸的活化基序 (ITAM)。抑制受體 FcγRIIB 在其胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸的抑制模體 (ITIM) (參見綜述 M. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。FcR 綜述於：Ravetch 和 Kinet，Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)；Capel等人 ，Immunomethods 4:25-34 (1994)；及 de Haas等人 ，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。本文中術語「FcR」涵蓋其他 FcR，包括將來要鑑定的那些。該術語亦包括新生兒受體 FcRn，其負責將母體 IgG 轉移至胎兒 (Guyer等人 ，J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim等人 ，J. Immunol. 24:249 (1994))。
如本文中所提及，術語「杵和臼 (knob-into-hole)」或「KnH」技術涉及藉由將隆凸 (杵狀物) 導入一個多肽並將腔窩 (臼狀物) 在其等相互作用的界面處引入其他多肽，在活體外 或活體內 指導兩個多肽的配對在一起的技術。例如，KnHs 已被導入抗體的 Fc:Fc 相互作用界面、CL：CH1 界面或 VH/VL 界面中 (例如 ，US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431 及 Zhuet al . (1997) Protein Science 6:781-788)。在多特異性抗體的製造中，這對於驅動兩個不同重鏈配對在一起特別有用。例如，在其等 Fc 區中具有 KnH 的多特異性抗體可進一步包含與各 Fc 區連接的單個變異域，或進一步包含與相同、相似或不同輕鏈變異域配對的不同重鏈變異域。KnH 技術亦可用於將兩個不同的受體胞外域或包含不同目標識別序列的任何其他多肽序列配對在一起。
「骨架 (framework)」或「FR」係指除高度變異區 (hypervariable region) (HVR) 殘基之外的變異域殘基。變異域之 FR 通常由四個 FR 域組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，HVR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「CH1 區」或「CH1 域」包含從 IgG 的約殘基 118 至殘基 215 (EU 編號)、從 IgG 的約殘基 114 至 223 (Kabat 編號) 或 IgG 的約殘基 1.4 至殘基 121 的殘基延伸 (IMGT 唯一編號) (Lefranc M-P, Giudicelli V, Duroux P, Jabado-Michaloud J, Folch G, Aouinti S, Carillon E, Duvergey H, Houles A, Paysan-Lafosse T, Hadi-Saljoqi S, Sasorith S, Lefranc G, Kossida S. IMGT®，the international ImMunoGeneTics information system® 25 years on.Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(Database issue):D413-22)。IL-15 多肽或 IL-15Rα 多肽可被直接共價連接至 CH1 域的第一殘基，或者可被共價連接至 CH1 的第一殘基的 C 端位置處的殘基。在替代方面，IL-15 多肽或 IL-15Rα 多肽可經由本文所定義之連接子 (linker) 共價連接至 CH1。
人 IgG Fc 區的「CH2 域」通常從 IgG 的約殘基 244 延伸至約 360 (Kabat 編號)、從 IgG 的約殘基 231 延伸至約 340 (EU 編號) 或從 IgG 的約殘基 1.6 延伸至約殘基 125 (IGMT 唯一編號)。CH2 域的獨特之處在於其沒有與另一域緊密配對。而是，兩個 N-連接的分支碳水化合物鏈插入完整的天然 IgG 分子的兩個 CH2 域之間。經推測，碳水化合物可提供該域-域配對的替代物，並有助於穩定 CH2 域。Burton, Molec. Immunol.22: 161-206 (1985)。
「CH3 域」包含 Fc 區中 CH2 域的 C 端殘基延伸 (即，從 IgG 的約胺基酸殘基 361 至約胺基酸殘基 478 (Kabat 編號)、從 IgG 的約胺基酸殘基 341 至約胺基酸殘基 447 (EU 編號) 或 IgG 的約胺基酸殘基 1.4 至約胺基酸殘基 130 (IGMT 唯一編號))。
「CL 域」或「輕鏈恆定域 (constant light domain)」包含輕鏈變異結構域 (VL) 的 C 端殘基延伸。抗體的輕鏈可為卡帕 (kappa，κ) (「Cκ」) 或拉目達 (lambda，λ) (「Cλ」) 輕鏈區。Cκ 區通常從 IgG 的約殘基 108 延伸至殘基 214 (Kabat 或 EU 編號) 或從 IgG 的約殘基 1.4 延伸至殘基 126 (IMGT 唯一編號)。Cλ 殘基通常從約殘基 107a 延伸至殘基 215 (Kabat 編號) 或從約殘基 1.5 延伸至殘基 127 (IMGT 唯一編號) (Lefranc M-P, Giudicelli V, Duroux P, Jabado-Michaloud J, Folch G, Aouinti S, Carillon E, Duvergey H, Houles A, Paysan-Lafosse T, Hadi-Saljoqi S, Sasorith S, Lefranc G, Kossida S. IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® 25 years on.Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(Database issue):D413-22)。
基於其恆定域之胺基酸序列，來自任何脊椎動物的輕鏈 (LC) 可歸類為兩種明顯不同的類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。根據其重鏈恆定域 (CH) 之胺基酸序列，免疫球蛋白可歸類爲不同的類別或同型。有五大類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM，其分別具有名為 α、δ、γ、ε 和 µ 的重鏈。基於 CH 序列和功能的相對較小的差異，γ 和 α 類進一步分為子類，例如 ，人類表現以下子類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和 IgA2。
如本文所使用，術語「帶電區」涉及包括一個或多個 (例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10 個) 的鹼性或酸性胺基酸的多肽 (例如抗體) 位置，當帶電區及其同源帶電區具有相反的整體相對電荷時，該胺基酸能夠與具有一個或多個 (例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個) 或鹼性或酸性胺基酸形成電荷對。
如本文所使用，術語「電荷對」涉及在兩個具有相反的整體電荷的帶電區之間形成的鍵。
術語"嵌合"抗體是指其中重鏈和/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG、及 IgM，且彼等中的幾種可進一步分為次類 (同型 (isotype))，例如 IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及 IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及μ。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。人抗體可使用本領域中已知的各種技術 (包括噬菌體顯示庫) 來生產。Hoogenboom and Winter.J. Mol. Biol. 227:381，1991；Marks 等人J. Mol. Biol. 222:581，1991。可用於製備人單株抗體之方法也描述於：Cole等人 ，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ，Alan R. Liss，第 77 頁 (1985)；Boerner 等人，J. Immunol. ，147(1): 86-95,1991。另請參見 van Dijk and van de Winkel.Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74, 2001.可藉由將抗原投予轉基因動物來製備人抗體，該轉基因動物已被改造以反應予抗原攻擊而產生此等抗體，但其內源基因座已失去功能，例如 ，異源小鼠 (參見例如 關於 XENOMOUSETM 技術之美國第 6,075,181 和 6,150,584 號專利)。參見，例如，Li et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA .103:3557-3562，2006 regarding human antibodies generated via a human B-cell hybridoma technology。
「人共有骨架」是代表一系列人免疫球蛋白 VL 或 VH 骨架序列中最常見的胺基酸殘基的骨架。通常，人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的選擇來自變異域序列的次群組。通常，序列的亞組是如 Kabat 等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest (第 5 版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 1-3 卷) 中所述之亞組。 在一個方面，對於 VL，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 κ I。在一個態樣中，對於 VH，次群組是次群組 III，如上文 Kabat等人 。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 HVR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 變異域，其中所有或實質上所有 HVR (例如 CDR) 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。在某些方面，其中人源化抗體的所有或實質上所有 FR 都對應於人類抗體的那些 FR，該人源化抗體的任何 FR 可包含來自非人類 FR 的一個或多個胺基酸殘基 (例如，FR 的一個或多個游標位殘基)。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」係指已經歷人源化之抗體。
術語「變異區 (variable region)」或「變異域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈（分別為 VH 及 VL）之變異域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性骨架區 (FR) 及三個高度變異區 (HVR)。(參見，例如，Kindt 等人，Kuby Immunology ，6th ed.，W.H. Freeman 及 Co.，第 91 頁 (2007)。) 單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見，例如，Portolano 等人，J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 等人，Nature 352:624-628 (1991)。
如本文所用，術語「高度變異區域 (hypervariable region)」或「HVR」是指抗體變異域的序列中高度變異的每個區域 (「互補決定區域」或「CDR」)。一般而言，抗體包含六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，及三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本文中，例示性 CDR 包括： (a) 出現在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2) 及 96-101 (H3) 處的CDR (Chothia and Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987)； (b) CDR 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、及 95-102 (H3)處 (Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991))； (c) 抗原接觸存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及 93-101 (H3) 處 (MacCallum 等人J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))。
除非另有說明，否則變異域中之 HVR 殘基及其他殘基 (例如 FR 殘基) 在本文中係根據 Kabat 等人 (同上文 ) 編號。
「單鏈 Fv」也簡稱為「sFv」或「scFv」，是包含連接到單一多肽鏈中的 VH 和 VL 抗體域的抗體片段。較佳地，scFv 多肽在 VH 及 VL 域之間進一步包含多肽連接子，其使 scFv 能夠形成用於抗原結合的所需結構。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269 頁至第 315 頁 (1994)；亦可參見 Malmborg 等人，J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995。
「靶向域」意指與目標表位、抗原、配體或受體特異性結合的化合物或分子的一部分。靶向域包括但不限於抗體 (例如，單株、多株、重組、人源化及嵌合抗體)、抗體片段或其部分 (例如，雙 Fab 片段、Fab 片段，F(ab')2 、scFab、scFv 抗體、SMIP、單域抗體、雙抗體、微抗體、scFv-Fc、親合體 (affibody)、奈米抗體及抗體之 VH 及/或 VL 域)、受體、配體、適體、靶向域之肽 (例如半胱胺酸結蛋白 (cysteine knot protein，CKP)) 及具有確定的結合伴侶的其他分子。靶向域可靶向、阻斷、激動或拮抗與其結合的抗原。
如本文所用的術語「單株抗體」係指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即群體中包含的受試者抗體係相同的且/或結合相同抗原決定基，但不包括，例如，含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變異體抗體，此等變異體通常係以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，意欲根據本發明使用的單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
術語「多特異性抗體」以最廣義使用，並特別涵蓋具有多表位特異性的抗體。在一方面，多特異性抗體結合兩個不同的目標 (例如，雙特異性抗體)。此類多特異性抗體包括但不限於包含重鏈變異域 (VH) 及輕鏈變異域 (VL) 的抗體，其中 VH/VL 單元具有多表位特異性、具有兩個或更多個 VL 及 VH 域的抗體，各 VH/VL 單元結合不同表位、具有兩個或多個單一變異域的抗體，各單一變異域結合不同表位、全長抗體、抗體片段，例如 Fab、Fv、dsFv、scFv、雙抗體、雙特異性雙抗體及三抗體，已經共價或非共價連接的抗體片段。「多表位特異性 (polyepitopic specificity)」是指與相同或不同靶標上的兩或更多個不同表位特異性結合的能力。「單特異性」涉及僅結合一個抗原的能力。在一方面，單特異性雙表位抗體結合同一目標/抗原上的兩個不同表位。在一方面，單特異性多表位抗體結合相同目標/抗原的多個不同表位。根據一方面，多特異性抗體為 IgG 抗體，其以 5 μM 至 0.001 pM、3 μM 至 0.001 pM、1 μM 至 0.001 pM、0.5 μM 至 0.001 pM 或 0.1 μM 至 0.001 pM 的親和力與各表位結合。
「裸抗體」係指未與異源部分 (例如，細胞毒性部分) 或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥製劑中。
「天然抗體」係指具有不同結構的天然生成之免疫球蛋白分子。例如，Ig 天然 IgG 抗體為約 150,000 道耳頓、由二條相同的輕鏈及二條相同的重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體糖蛋白。從 N 端至 C 端，每條重鏈具有變異區 (VH)，亦稱為變異重鏈域或重鏈變異域，接著係三個恆定域（CH1、CH2 及 CH3）。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有變異區 (VL)，亦稱為變異輕鏈域或輕鏈變異域，接著係輕鏈恆定 (CL) 域。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
如本文所使用，術語「免疫黏附素」表明結合異源蛋白 (「黏附素」) 的結合特異性與免疫球蛋白恆定域的效用功能的分子。在結構上，免疫黏附素包含具有所需結合特異性之胺基酸序列的融合體，該胺基酸序列不同於抗體的抗原識別及結合位點 (即 與抗體的恆定區相比是「異源的」)，及包含免疫球蛋白恆定域序列 (例如 ，IgG 的 CH2 及/或 CH3 序列)。黏附素及免疫球蛋白恆定域視情況被胺基酸間隔區分開。例示性黏附素序列包括連續之胺基酸序列，其包含與所關注蛋白結合的受體或配體的一部分。黏附素序列亦可為結合所關注蛋白質的序列，但不是受體或配體序列 (例如 肽體 (peptibody) 的黏附素序列)。可藉由各種方法選擇或鑑定此類多肽序列，包括噬菌體展示技術和高通量分選方法。免疫黏附素中的免疫球蛋白恆定域序列可以獲自任何免疫球蛋白，諸如 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 亞型、IgA（包括 IgA1 和 IgA2）、IgE、IgD 或 IgM。
「化學治療劑」包括可用於治療癌症的化合物。化學治療劑的實例包括：厄洛替尼 (TARCEVA®，Genentech / OSI Pharm.)；硼替佐米 (VELCADE®，Millennium Pharm.)；雙硫崙；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；鹽孢子醯胺 A；卡非佐米；17-AAG (格爾德黴素)；根赤殼菌素；乳酸脫氫酶 (LDH-A)；氟司特芬 (FASLODEX®，AstraZeneca)；舒尼替尼 (SUTENT®，Pfizer/Sugen)；來曲唑 (FEMARA®，Novartis)；甲磺酸伊馬替尼 (GLEEVEC®，Novartis)；非那沙酸酯 (VATALANIB®，Novartis)；奧沙利鉑 (ELOXATIN®，Sanofi)；5-FU (5-氟尿嘧啶)；甲醯四氫葉酸；雷帕黴素 (Sirolimus，RAPAMUNE®，Wyeth)；拉帕替尼 (TYKERB®，GSK572016，Glaxo Smith Kline)；羅納非單抗 (SCH 66336)；索拉非尼 (NEXAVAR®，Bayer Labs)；吉非替尼 (IRESSA®，AstraZeneca)；AG1478；烷基化劑，諸如噻替派和 CYTOXAN® 環磷醯胺；烷基磺酸鹽，諸如環丁碸、次硫丹和吡磺碸；氮丙啶，諸如 Benzodopa、卡波醌和 Uredop；乙烯亞胺和甲基三聚氰胺，包括奧曲胺、三亞乙基三聚氰胺、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫代磷醯胺和三甲基三聚氰胺；番荔枝內酯（尤其是布洛他辛和布洛他辛酮）；喜樹鹼（包括托泊替康和伊立替康）；草苔蟲素；Callystatin；CC-1065 (包括其 Adozelesin、Carzelesin 和 Bizelesin 合成類似物)；念珠藻素 (特別是念珠藻素 1 和念珠藻素 8)；腎上腺皮質類固醇 (包括強體松和腎上腺皮質酮)；醋酸環丙孕酮；5α-還原酶(包括非那雄胺和度他雄胺)；伏立諾他、羅帕地他汀、丙戊酸、Mocetinostat Dolastatin；阿地白介素，Talc Duocarmycin (包括合成類似物 KW-2189 和 CB1-TM1)；Eleutherobin；水鬼蕉鹼；Sarcodictyin；Spongistatin；氮芥，諸如氯丁酸苯丙胺、氯丁草胺、Chlomaphazine、Chlorophosphamide、Estramustine、依弗醯胺、甲基二(氯乙基)胺、鹽酸甲氧氮芥、黴法蘭、新恩比興、苯芥膽固醇、潑尼莫司汀、曲洛磷胺、烏拉莫司汀；亞硝基尿素，諸如卡莫斯汀、氯脲黴素、福莫汀、洛莫斯汀、尼莫斯汀和拉尼莫司汀；抗生素，諸如烯二炔抗生素 (例如，加利車黴素，尤其是加利車黴素 γ1I 和加利車黴素 ω1I (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 1994 33: 183-186)；強力黴素，包括達尼黴素A；雙膦酸鹽，諸如氯膦酸鹽；埃斯佩拉黴素；以及新制癌菌素生色團及相關的色蛋白烯二炔抗生素生色團)、紫膠菌素、放線菌素 (Actinomycin)、Authromycin、Azaserine、博來黴素、放線菌素 (Cactinomycin)、Carzinophilin、Chromomycinis、放線菌素 (Dactinomycin)、道諾黴素，地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN® (阿黴素)、嗎啉代-阿黴素、氰基嗎啉代-阿黴素、2-吡咯烷-阿黴素和脫氧阿黴素、表柔比星、埃索比星、伊達比星、馬賽黴素、絲裂黴素諸如絲裂黴素 C、黴酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、培洛黴素、泊非黴素、嘌呤黴素、Quelamycin、羅多比星、鏈黴黑素、鏈脲菌素、殺結核菌素、烏苯美司、淨司他丁、佐柔比星；抗代謝物，諸如甲胺蝶呤和 5-氟尿嘧啶 (5-FU)；葉酸類似物，諸如美蝶呤、甲胺蝶呤、蝶呤素、三甲蝶呤；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、噻蟲嘌呤、硫代鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿嘧啶、卡莫呋、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿嘧啶；雄激素，諸如卡蘆睾酮、屈他雄酮丙酸酯、環硫雄醇、美雄烷、睾內酯；抗腎上腺素，諸如胺基麩醯胺酸、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑諸如葉酸；醋葡醛內酯；醛糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；Bestrabucil；比生群；Edatraxate；Defofamine；秋水仙胺；地美可辛；地嗪酮；依洛美丁；依利醋銨；埃博黴素；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣；Lonidainine；Maytansinoids 諸如美登素和安神黴素；米托胍腙；米托蒽醌；Mopidamnol；Nitraerine；噴司他丁；Phenamet；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙醯肼；丙卡巴肼；PSK® 多醣複合物 (JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；Razoxane；Rhizoxin；Sizofuran；鍺螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴烯 (尤其是 T-2 毒素、Verracurin A、Roridin A 和 Anguidine)；尿烷；長春地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷；胞嘧啶；阿拉伯糖苷 (Ara-C)；環磷醯胺；噻替哌；紫杉烷類，例如，TAXOL (紫杉醇；Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANE® (Cremophor-Free)、紫杉醇之白蛋白工程化奈米顆粒製劑 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.) 和 TAXOTERE® (多西他賽，多烯紫杉醇；Sanofi-Aventis)；苯丁酸氮芥；GEMZAR® (吉西他濱)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長春鹼；依托泊苷 (VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼；NAVELBINE® (長春瑞濱)；米托蒽醌；替尼泊苷；依達曲沙；卡培他濱 (XELODA®)；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑 RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸 (DMFO)；類維生素 A，諸如視黃酸；以及上述任何一者的醫藥上可接受之鹽類、酸和衍生物。
化學治療劑還包括 (i) 對腫瘤具有調節或抑制激素作用的抗激素劑，諸如抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑 (SERM)，包括例如他莫昔芬 (包括 NOLVADEX®；他莫昔芬檸檬酸鹽)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、Iodoxyfene、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛西芬、LY117018、奧那司酮和 FARESTON® (檸檬酸托瑞米芬)；(ii) 抑制酶芳香化酶的芳香化酶抑制劑，其酶調節腎上腺的雌激素生成，例如，4(5)-咪唑、胺基戊二醯亞胺、MEGASE® (醋酸甲地孕酮)、AROMASIN® (依西美坦；Pfizer)、Formestanie、Fadrozole、RIVISOR® (伏洛唑)、FEMARA® (來曲唑；Novartis) 和 ARIMIDEX® (阿那曲唑；AstraZeneca)；(iii) 抗雄激素，諸如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；布舍瑞林、Tripterelin、甲羥孕酮醋酸酯、己二烯雌酚、普力馬、氟甲孕酮、所有反式維甲酸、芬太尼以及曲沙西他濱 (1,3-二氧嘧啶核苷)；(iv) 蛋白激酶抑制劑；(v) 脂質激酶抑制劑；(vi) 反義寡核苷酸，特別是那些抑制與異常細胞增殖有關的信號路徑中的基因表現的寡核苷酸，諸如 PKC-Alpha、Ralf 和 H-Ras；(vii) 核酶，諸如 VEGF 表現抑制劑 (例如，ANGIOZYME®) 和 HER2 表現抑制劑；(viii) 疫苗，諸如基因治療疫苗，例如 ALLOVECTIN®、LEUVECTIN® 和 VAXID®；PROLEUKIN®，rIL-2；拓撲異構酶 1 抑制劑，諸如 LURTOTECAN®；ABARELIX® rmRH；以及 (ix) 上述任何一者的醫藥上可接受之鹽類、酸和衍生物。
化學治療劑還包括抗體、諸如阿崙單抗 (alemtuzumab) (Campath)、貝伐單抗 (bevacizumab) (AVASTIN®, Genentech)、西妥昔單抗 (cetuximab) (ERBITUX®, Imclone)、帕尼單抗 (panitumumab) (VECTIBIX®, Amgen)、利妥昔單抗 (rituximab) (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec)、帕妥珠單抗 (pertuzumab) (OMNITARG®, 2C4, Genentech)、曲妥單抗 (trastuzumab) (HERCEPTIN®, Genentech)、托西莫單抗(tositumomab) (Bexxar, Corixia) 和抗體藥物共軛體、吉妥單抗 (gemtuzumab ozogamicin) (MYLOTARG®, Wyeth)。與本發明所述之化合物相結合的具有治療潛力的其他人源化單株抗體包括：阿波珠單抗 (apolizumab)、阿塞珠單抗 (aselizumab)、阿替珠單抗 (atlizumab)、巴匹珠單抗 (bapineuzumab)、比伐單抗美登醇 (bivatuzumab mertansine)、坎珠單抗美登醇 (cantuzumab mertansine)、西利珠單抗 (cedelizumab)、塞妥珠單抗聚乙二醇 (certolizumab pegol)、西弗絲妥珠單抗 (cidfusituzumab)、西地妥珠單抗 (cidtuzumab)、達利珠單抗 (daclizumab)、依庫珠單抗 (eculizumab)、依法利珠單抗 (efalizumab)、依帕珠單抗 (epratuzumab)、厄利珠單抗 (erlizumab)、泛維珠單抗 (felvizumab)、芳妥珠單抗 (fontolizumab)、吉妥單抗奧佐米星 (gemtuzumab ozogamicin)、伊珠單抗奧佐米星 (inotuzumab ozogamicin)、伊匹木單抗 (ipilimumab)、伊妥木單抗 (labetuzumab)、林妥珠單抗 (lintuzumab)、馬妥珠單抗 (matuzumab)、美泊珠單抗 (mepolizumab)、莫維珠單抗 (motavizumab)、motovizumab、那他珠單抗 (natalizumab)、尼妥珠單抗 (nimotuzumab)、諾維珠單抗 (nolovizumab)、努維珠單抗 (numavizumab)、奧卡利珠單抗 (ocrelizumab)、奧馬佐單抗 (omalizumab)、帕利珠單抗 (palivizumab)、帕考珠單抗 (pascolizumab)、派弗西妥珠單抗 (pecfusituzumab)、派妥珠單抗 (pectuzumab)、培克珠單抗 (pexelizumab)、來利珠單抗 (ralivizumab)、蘭尼單抗 (ranibizumab)、來絲利維珠單抗 (reslivizumab)、來絲利珠單抗 (reslizumab)、來西維珠單抗 (resyvizumab)、羅維珠單抗 (rovelizumab)、盧利珠單抗 (ruplizumab)、西羅珠單抗 (sibrotuzumab)、希普利珠單抗 (siplizumab)、索土珠單抗 (sontuzumab)、他珠單抗四西坦 (tacatuzumab tetraxetan)、他西珠單抗 (tadocizumab)、他利珠單抗 (talizumab)、特菲巴珠單抗 (tefibazumab)、托珠單抗 (tocilizumab)、托利珠單抗 (toralizumab)、土考妥珠單抗西莫白介素 (tucotuzumab celmoleukin)、土庫西妥珠單抗 (tucusituzumab)、恩維珠單抗 (umavizumab)、烏珠單抗 (urtoxazumab)、烏司奴單抗 (ustekinumab)、維西珠單抗 (visilizumab)、和抗介白素 12 (ABT-874/J695, Wyeth Research and Abbott Laboratories)，一種經過基因改造以識別介白素 12 p40 蛋白的專門用於人序列的全長 IgG1 λ 抗體。
化學治療劑還包括「EGFR 抑制劑」，其係指與 EGFR 結合或直接交互作用並阻止或降低其信號傳導活性的化合物，或者稱為「EGFR 拮抗劑」。此等藥劑的實例包括抗體以及與 EGFR 結合之小分子。與 EGFR 結合之抗體的實例包括 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506)、MAb 455 (ATCC CRL HB8507)、MAb 225 (ATCC CRL 8508)、MAb 528 (ATCC CRL 8509) (參見，美國第 4,943,533 號專利，Mendelsohn 等人) 及其變異體，諸如嵌合 225 (C225 或西妥昔單抗；ERBUTIX®) 和重塑的人 225 (H225) (參見，WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，一種完整的人 EGFR 靶向抗體 (Imclone)；與 II 型突變體 EGFR 結合之抗體 (美國第 5,212,290 號專利)；如美國第 5,891,996 號專利中所述之與 EGFR 結合的人源化和嵌合抗體；以及與 EGFR 結合之人抗體，諸如 ABX-EGF 或帕尼單抗 (參見 WO98/50433，Abgenix/Amgen)；EMD 55900 (Stragliotto 等人，Eur. J. Cancer 32A: 636-640 (1996))；EMD7200 (馬妥珠單抗)，一種針對 EGFR 的人源化 EGFR 抗體，可與 EGF 和 TGF-alpha 競爭與 EGFR 之結合 (EMD/Merck)；人 EGFR 抗體，HuMax-EGFR (GenMab)；全人抗體，稱為 E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3 和 E7.6.3，並在 US 6,235,883 中有所描述； MDX-447 (Medarex Inc)；以及 mAb 806 或人源化 mAb 806 (Johns 等人，J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004))。抗 EGFR 抗體可與細胞毒性劑共軛，從而產生免疫共軛物 (參見例如 EP659,439A2，Merck Patent GmbH)。EGFR 拮抗劑包括小分子，例如以下美國專利中所述的那些：5,616,582、5,457,105、5,475,001、5,654,307、5,679,683、6,084,095、6,265,410、6,455,534、6,521,620、6,596,726、6,713,484、5,770,599、6,140,332、5,866,572、6,399,602、6,344,459、6,602,863、6,391,874、6,344,455、5,760,041、6,002,008 和 5,747,498，以及以下 PCT 揭示中所述的那些：WO98/14451、WO98/50038、WO99/09016 和 WO99/24037。特定的小分子 EGFR 拮抗劑包括 OSI-774 (CP-358774，厄洛替尼，TARCEVA ® Genentech/OSI Pharmaceuticals)；PD 183805 (CI 1033，2-丙烯醯胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-7-[3-(4-嗎啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-二鹽酸鹽，Pfizer Inc.)；ZD1839，(吉非替尼 (IRESSA®)， 4-(3'-氯-4'-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180 (6-胺基-4-(3-甲基苯基-胺基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382 (N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-苯乙基)胺基]-1H-吡咯並[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羥苯基)-4-[(1-苯基乙基)胺基]-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶；CL-387785 (N-[4-[(3-溴苯基) 胺基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔醯胺)；EKB-569 (N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基胺基)-2-丁烯醯胺) (Wyeth)；AG1478 (Pfizer)；AG1571 (SU 5271；Pfizer)；雙重 EGFR/HER2 酪胺酸激酶抑制劑諸如拉匹替尼 (TYKERB®，GSK572016 或 N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[(2-磺醯基)乙基]胺基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺)。
化學治療劑亦包括「酪胺酸激酶抑制劑」，包括前段落中所提及的 EGFR 靶向藥物；小分子 HER2 酪胺酸激酶抑制劑，例如可從 Takeda 獲得的 TAK165；CP-724,714，其為 ErbB2 受體酪胺酸激酶的口服選擇性抑制劑 (Pfizer 及 OSI)；優先結合 EGFR 但抑制 HER2 及 EGFR 過表達細胞二者的雙重 HER 抑制劑，例如 EKB-569 (可從 Wyeth 獲得)；拉帕替尼 (lapatinib) (GSK572016，可從 Glaxo-SmithKline 獲得)，其為口服 HER2 及 EGFR 酪胺酸激酶抑制劑；PKI-166 (可從 Novartis)；泛 HER 抑制劑，例如卡奈替尼 (canertinib) (CI-1033，Pharmacia)；Raf-1 抑制劑，例如抑制 Raf-1 信號傳導的反義藥劑 ISIS-5132，可從 ISIS Pharmaceuticals 獲得；非 HER 靶向的 TK 抑制劑，例如甲磺酸伊馬替尼(imatinib) (GLEEVEC®，可從 Glaxo SmithKline 獲得)；多靶向酪胺酸激酶抑制劑，例如舒尼替尼 (sunitinib) (SUTENT®，可從 Pfizer 獲得)；VEGF 受體酪胺酸激酶抑制劑，例如瓦他拉尼 (vatalanib) (PTK787/ZK222584，可從 Novartis/Schering AG 獲得)；MAPK 胞外調控激酶 I 抑制劑 CI-1040 (可從 Pharmacia 獲得)；喹唑啉類，例如 PD 153035,4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶類；嘧啶并嘧啶類；吡咯并嘧啶類，例如 CGP 59326、CGP 60261 及 CGP 62706；吡唑并嘧啶類，4-(苯基胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶類；薑黃素 (二阿魏醯基甲烷、4,5-雙(4-氟苯胺基)-酞醯亞胺)；含硝基噻吩部分的酪弗斯汀 (tyrphostine)；PD-0183805 (Warner-Lamber)；反義分子 (例如與編碼 HER 的核酸結合的那些)；喹喔啉類 (美國專利號 5,804,396) ；tryphostin (美國專利號 5,804,396) ；ZD6474 (AstraZeneca)；PTK-787 (Novartis/Schering AG)；泛 HER 抑制劑，例如 CI-1033 (Pfizer)；Affinitac (ISIS 3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊馬替尼 (GLEEVEC®)；PKI 166 (Novartis)；GW2016 (Glaxo SmithKline)；CI-1033 (Pfizer)；EKB-569 (Wyeth)；Semaxinib (Pfizer)；ZD6474 (AstraZeneca)；PTK-787 (Novartis/Schering AG)；INC-1C11 (Imclone)，雷帕黴素 (rapamycin) (sirolimus，RAPAMUNE®) ；或如任何下列專利公佈中所描述：美國專利第 5,804,396 號；WO 1999/09016 (American Cyanamid)；WO 1998/43960 (American Cyanamid)；WO 1997/38983 (Warner Lambert)；WO 1999/06378 (Warner Lambert)；WO 1999/06396 (Warner Lambert)；WO 1996/30347 (Pfizer, Inc)；WO 1996/33978 (Zeneca)；WO 1996/3397 (Zeneca) 及 WO 1996/33980 (Zeneca)。
化學治療劑還包括地塞米松、干擾素、秋水仙鹼、氯苯胺啶、環孢菌素、兩性黴素、甲硝唑、阿侖單抗、阿利維 A 酸、別嘌呤醇、胺磷汀、三氧化二砷、天冬醯胺酶、活 BCG、貝伐單抗、克拉屈濱、氯法拉濱、阿法達貝泊汀、Denileukin、右雷佐生、阿法依泊汀、Elotinib、非格司亭、醋酸組胺瑞林，Ibritumomab、干擾素 alfa-2a、干擾素 alfa-2b、來那度胺、左旋咪唑、美司鈉、甲氧沙林、諾龍、奈拉濱、Nofetumomab、奧普瑞白介素、帕利夫明、帕米磷酸二鈉、培加酶、培門冬酶、培非格司亭、培美曲塞二鈉、普卡黴素、卟吩姆鈉、奎納克林、拉布立酶、沙格司亭、替莫唑胺、VM-26、6-TG、托瑞米芬、維甲酸、ATRA、纈沙星、唑來膦酸鹽和唑來膦酸及其醫藥上可接受之鹽類。
化學治療劑亦包括氫化可體松、醋酸氫化可體松、醋酸可體松、特戊酸巰基氫化可體松 (tixocortol pivalate)、丙酮特安皮質醇 (triamcinolone acetonide)、乙醇特安皮質醇、莫米松 (mometasone)、安西奈德 (amcinonide)、布地奈德 (budesonide)、地松奈德 (desonide)、氟輕松 (fluocinonide)、氟輕松醋酸酯、倍他米松 (betamethasone)、倍他米松磷酸鈉、地塞米松 (dexamethasone)、地塞米松磷酸鈉、氟可龍 (fluocortolone)、氫化可體松-17-丁酸鹽、氫化可體松-17-戊酸鹽、二丙酸阿氯米松 (dipropionate)、戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、潑尼卡酯 (prednicarbate)、氯倍他松 (clobetasone)-17-丁酸鹽、氯倍他松-17-丙酸鹽、己酸氟可龍、特戊酸氟可龍及醋酸氟潑尼定 (fluprednidene acetate)；免疫選擇性抗炎肽 (ImSAID)，例如苯丙胺酸-谷胺醯胺-甘胺酸 (FEG) 及其 D-異構體形式 (feG) (IMULAN BioTherapeutics, LLC)；抗風濕藥物，例如硫唑嘌呤 (azathioprine)、環孢素 (環孢黴素 A)、D-青黴素、金鹽、羥氯喹 (hydroxychloroquine)、來氟米特米諾環素 (leflunomideminocycline)、柳氮磺吡啶 (sulfasalazine)、腫瘤壞死因子 α (TNFα) 阻斷劑，例如依那西普 (etanercept，Enbrel)、英夫利昔單抗 (infliximab，Remicade)、阿達木單抗 (adalimumab，Humira)、賽妥珠單抗 (certolizumab pegol，Cimzia)、高利單抗 (golimumab，Simponi)、白介素-1 (IL-1) 阻斷劑，例如阿那白滯素 (anakinra，Kineret)、T 細胞共刺激阻斷劑，例如阿巴西普 (abatacept，Orencia)、白介素-6 (IL-6) 阻斷劑，例如托珠單抗 (tocilizumab，ACTEMERA®)；白介素-13 (IL-13) 阻斷劑，例如利比克株單抗 (lebrikizumab)；干擾素 α (IFN) 阻斷劑，例如羅利珠單抗 (Rontalizumab)；β 7-整聯蛋白阻斷劑，例如 rhuMAb β 7；IgE 途徑阻斷劑，例如抗 M1 prime；分泌型同三聚 LTa3 及膜結合型異三聚 LTa1/β2 阻斷劑，例如抗淋巴毒素 α (LTa)；放射性同位素 (例如At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 和 Lu 的放射性同位素)；混雜調查性藥劑，例如 硫普汀(thioplatin)、PS-341、丁酸苯酯、ET-18- OCH3 或法呢基轉移酶抑制劑 (L-739749，L-744832)；多酚，例如槲皮素，白藜蘆醇，白皮杉醇，沒食子酸表沒食子兒茶精，茶黃素，黃烷醇，原花青素，樺木酸及其衍生物；自噬抑制劑，例如氯喹；δ-9-四氫大麻酚 (屈大麻酚 (dronabinol)，MARINOL®)；β-拉帕醌 (beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素類；白樺脂脂酸 (betulinic acid)；乙醯喜樹鹼，東莨菪亭 (scopolectin) 及 9-胺基喜樹鹼)；鬼臼毒素；替加氟 (tegafur，UFTORAL®)；貝沙羅汀 (bexarotene，TARGRETIN®)；二膦酸鹽類，例如氯膦酸鹽 (例如，BONEFOS® 或 OSTAC®)、依替膦酸鈉 (etidronate，DIDROCAL®)、NE-58095、唑來膦酸 (zoledronic acid)/唑來膦酸鹽 (ZOMETA®)、阿崙膦酸鹽 (alendronate，FOSAMAX®)、帕米膦酸鹽 (pamidronate，AREDIA®)、替魯膦酸鹽 (tiludronate，SKELID®) 或利塞膦酸鹽 (risedronate，ACTONEL®)；及表皮生長因子受體 (EGF-R)；疫苗，例如 THERATOPE® 疫苗；哌立福辛 (perifosine)、COX-2 抑制劑 (例如，塞來昔布 (celecoxib) 或依托昔布 (etoricoxib))，蛋白體抑制劑 (例如，PS341)；CCI-779；替吡法尼 (tipifarnib，R11577)；歐拉菲尼 (orafenib)、ABT510；Bcl-2 抑制劑，例如奥利默森鈉 (oblimersen sodium，GENASENSE®)、匹杉瓊 (pixantrone)；法呢基轉移酶抑制劑，例如洛那法尼 (lonafarnib) (SCH 6636，SARASARTM)；和上述任一項的醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物；以及上述兩項或多項的組合，例如 CHOP (環磷醯胺、多柔比星 (doxorubicin)、長春新鹼和潑尼松龍聯合療法的縮寫) 和 FOLFOX (奧沙利鉑 (oxaliplatin) (ELOXATINTM )聯合 5-FU 和亞葉酸 (leucovorin) 的治療方案的縮寫)。
化學治療劑還包括具有鎮痛、退熱和抗炎作用之非類固醇抗炎藥。NSAID 包括環氧化酶之非選擇性抑制劑。NSAID 的具體實例包括：阿司匹林；丙酸衍生物，諸如布洛芬、芬諾洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奧沙普嗪和萘普生；乙酸衍生物，諸如吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、雙氯芬酸；烯醇酸衍生物，諸如吡羅昔康、美洛昔康、氯諾昔康和伊索昔康；苯甲酸衍生物，諸如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟苯那酸、甲苯磺那酸；以及 COX-2 抑制劑，諸如塞來昔布、依托考昔、魯美昔布、帕瑞昔布、羅非昔布和伐地昔布。NSAID 適用於緩解症狀，諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、發炎性關節炎、強直性脊柱炎、銀屑病關節炎、Reiter 氏症候群、急性痛風、經痛、轉移性骨痛、頭痛和偏頭痛、術後疼痛、發炎症和組織損傷引起的輕度至中度疼痛、發熱、腸梗阻和腎絞痛。
如本文所用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素 (例如，At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 和 Lu 的放射性同位素)；化學治療劑或藥物 (例如，甲胺蝶呤、阿黴素、長春花生物鹼 (長春新鹼、長春鹼、依托泊苷)，多柔比星、黴法蘭、絲裂黴素 C、氯芥苯丁酸、道諾黴素或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核酸酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變異體；以及下文所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。
「病症」是將從治療中受益的任何疾病，包括但不限於慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳動物易患所述疾病的病理性症狀。在一方面，該疾病為癌症，例如大腸直腸癌。
術語「細胞增殖性病症」及「增殖性病症」涉及與某種程度的異常細胞增殖相關的病症。在一方面，該細胞增殖性病症為癌症。在一方面，該細胞增殖性病症為腫瘤。
如本文所使用，術語「腫瘤」係指所有贅生性細胞的生長和增殖，包括惡性與良性以及所有癌前及癌性細胞和組織。術語「癌症」、「癌性」、「細胞增生性疾病」、「增生性疾病」和「腫瘤」在本文中並不互相排斥。
術語「癌症」和「癌性」係指或描述哺乳動物中通常以不受調控的細胞生長為特徵的生理狀況。癌症方面包括實體瘤癌症和非實體瘤癌症。實體癌腫瘤包括，但不限於，大腸直腸癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌或其之轉移形式。該癌症可為 LY6G6D 陽性癌症。
在一方面，該癌症為大腸直腸癌。如本文所使用，術語「大腸直腸癌」、「CRC」、「大腸癌」或「腸癌」涉及從例如結腸或直腸之大腸所發展成的癌症。在一些方面，CRC 是左側腫瘤，即發生在遠端結腸 (例如，橫向結腸的遠端三分之一、脾彎曲、下降結腸，乙狀結腸或直腸) 中的腫瘤。在其他方面，CRC 是右側腫瘤，即發生在近端結腸 (例如，例如，橫結腸的近端三分之二、升結腸和盲腸) 中的腫瘤。右側腫瘤可能與 OS 降低有關。在一些方面，CRC 是轉移性的。在一些方面，CRC 具有微衛星穩定型 (「MSS」) 的微衛星不穩定性 (「MSI」) 狀態或微衛星不穩定性低 (「MSI-L」)。在其他方面，CRC 具有「微衛星不穩定性高」(「MSI-H」) 的微衛星不穩定性狀態。在一些方面，CRC 是 LY6G6D 陽性 (LY6G6D+) CRC。
如本文所用，「微衛星不穩定性狀態」或「MSI 狀態」涉及病患腫瘤組織中微衛星穩定性的特徵化。病患的腫瘤組織可被特徵化為「微衛星不穩定性高」(「MSI-H」)、「微衛星不穩定性低」(「MSI-L」) 或「微衛星穩定型」 (「MSS」)。例如，可使用基於 PCR 的方法 (例如 MSI 分析系統 (Promega, Madison, WI)) 評估 MSI 狀態，該系統由 5 個假單態單核苷酸重複序列 (BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24 及 MONO-27) 組成，來檢測 MSI 及 2 個五核苷酸基因座 (PentaC 和 PendaD)，以確認正常樣品與腫瘤樣品之間的同一性。可例如藉由凝膠電泳確定各微衛星基因座的鹼基大小，且若兩個或多個單核苷酸基因座的長度與種系 DNA 相比有變化，則可將腫瘤稱為 MSI-H。參見例如 Le 等人，NEJM 372:2509-2520, 2015。
在一些方面，根據美國癌症聯合委員會 (American Joint Committee on Cancer，AJCC)/國際癌症控制聯合會 (Union for International Cancer Control，UICC) TNM惡性腫瘤分類 (TNM) 分類系統評估 CRC 的階段。在 TNM 系統中，將癌症標記為字母 T (腫瘤大小)，N (可觸及的結節) 及/或 M (轉移)。T1、T2、T3 及 T4 描述原發病灶增大的大小。T1、T2、T3 及 T4 另可分類為 a 或 b (例如 T4a 或 T4b) 以提供有關癌症狀態 (例如局部進展) 的更多訊息。N0、N1、N2、N3 表示逐漸推進節點涉入；M0 及 M1 反映了遠處轉移的存在與否。在一些方面，個體的 CRC 為第 I 期；第 II 期或第 III 期 CRC，例如第 I 期、第 II 期或第 III 期大腸癌。在一些方面，個體並無第 IV 期 CRC。在一些方面，個體不具有轉移性 CRC。在一些方面，參考人群中的個體的 CRC 是第 I 期、第 II 期、第 III 期或第 IV 期 CRC，例如第 I 期、第 II 期、第 III 期或第 IV 期大腸癌。
在一些方面，該癌症為乳癌。乳癌的其他方面包括激素受體陽性 (HR+) 乳癌，例如雌激素受體陽性 (ER+) 乳癌、助孕酮受體陽性 (PR+) 乳癌或 ER+/PR+ 乳癌。乳癌的其他方面包括 HER2 陽性 (HER2+) 乳癌。乳癌的其他方面包括三陰性乳癌 (TNBC)。在一些方面，乳癌是早期乳癌。在一些方面，該癌症為肺癌。肺癌的其他方面包括表皮生長因子受體陽性 (EGFR+) 肺癌。肺癌的其他方面包括表皮生長因子受體陰性 (EGFR-) 肺癌。肺癌的另外其他方面包括非小細胞肺癌，例如鱗狀肺癌或非鱗狀肺癌。肺癌的其他方面包括小細胞肺癌。在一些方面，該癌症是頭頸癌。頭頸癌的其他方面包括頭頸鱗狀細胞癌 (SCCHN)。在一些方面，該癌症為膀胱癌。膀胱癌的另外其他方面包括尿路上皮膀胱癌 (urothelial bladder cancer，UBC)、肌肉浸潤性膀胱癌 (muscle invasive bladder cancer，MIBC)或非肌肉浸潤性膀胱癌 (NMIBC)。在一些方面，該癌症為腎癌。腎癌的另外其他方面包括腎細胞癌 (renal cell carcinoma，RCC)。在一些方面，該癌症為肝癌。肝癌的另外其他方面包括肝細胞癌。在一些方面，該癌症為前列腺癌。前列腺癌的另外其他方面包括去勢抗性前列腺癌 (castration-resistant prostate cancer，CRPC)。在一些方面，癌症是實體瘤的轉移形式。在一些方面，實體瘤的轉移形式是黑素瘤、乳癌、大腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。在某些方面，該癌症是非實體瘤癌症。非實體瘤癌症包括，但不限於，血液學癌症，例如 B 細胞淋巴瘤。B 細胞淋巴瘤的另外其他方面包括，例如慢性淋巴細胞性白血病 (chronic lymphocytic leukemia，CLL)、瀰漫性大 B 細胞淋巴瘤 (diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)、濾泡性淋巴瘤，骨髓化生不良症候群 (myelodysplastic syndrome，MDS)，非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin lymphoma，NHL)、急性淋巴細胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia，ALL)、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病 (acute myeloid leukemia，AML) 或蕈狀肉芽腫 (mycosis fungoides，MF)。
「效用功能 (effector function)」，係指歸因於抗體的 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同種型而變化。抗體效用功能的實例包括：C1q 結合和補體依賴性細胞毒性 (CDC)；Fc 受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體 (例如 B 細胞受體) 的下調；以及 B 細胞活化。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」涉及在補體存在下目標細胞的裂解。典型補體途徑的活化是藉由將補體系統的第一個組分 (C1q) 結合至與其相關抗原結合的抗體 (適當的次類別)而開始的。為了評估補體的活化，可進行 CDC 測定，例如 描述於 Gazzano-Santoroet al ., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)。
「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)」或「ADCC」涉及細胞毒性的一種形式，其中分泌的 Ig 結合到某些細胞毒性細胞 (例如 ，自然殺手 (NK) 細胞、嗜中性球及巨噬細胞) 上的 Fc 受體 (FcR) 上，使這些細胞毒性效應細胞能特異性結合至帶有抗原的目標細胞，並隨後用細胞毒素殺傷目標細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞對於這種殺傷是絕對必需的。介導 ADCC 的主要細胞 NK 細胞僅表現 FcγRIII，而單核球表現 FcγRI、FcγRII、和 FcγRIII。FcR 在造血細胞上之表達匯總於 Ravetch 和 Kinet 的論文之第 464 頁的表 3 中。Annu. Rev. Immunol. 9:457-92, 1991。為了評估所關注分子的 ADCC 活性，可進行活體外 ADCC 測定，例如美國專利號 5,500,362 或 5,821,337 中所述。用於此等分析的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在活體內 評估所關注分子的 ADCC 活性，例如 在動物模型中，例如揭示於 Clynes等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 95:652-656, 1998。
如本文所使用，「複合物」或「複合的」涉及兩個或多個分子不是經由肽鍵的鍵及/或力 (例如 ，凡得瓦力、疏水力、親水力) 相互作用的締合。在一方面，複合物是異源多聚體。應理解，如本文所使用，術語「蛋白質複合物」或「多肽複合物」包括具有與蛋白質複合物中之蛋白質共軛的非蛋白質實體的複合物 (例如 ，包括，但不限於，例如毒素或檢測劑的化學分子)。
如本文所使用，病症或疾病的「延遲進展」意旨延緩、阻礙、減緩、延遲、穩定及/或推遲疾病或病症 (例如細胞增殖性病症，例如癌症) 的發展。該遲滯可具有不同之時間長度，取決於癌症及/或被治療之患者的病史。如本領域技術人員所顯而易見者，充分或顯著之延緩實際上可涵蓋預防，蓋因該受試者未發展出疾病。例如，例如轉移發展的晚期癌症可能被延遲。
化合物 (例如本發明的抗 LY6G6D 抗體) 或其組成物 (例如醫藥組成物) 的「有效量」至少是達成所需治療或預防結果所需要的最小數量，例如特定病症 (例如細胞增殖性疾病，例如癌症) 的可測量的改善或預防。本文之有效量可根據諸如疾病狀態、患者年齡、性別及體重、以及該抗體該患者體內引起所欲反應之因素而改變。有效量亦係該治療之任意毒性或有害效應被治療有益效應超過的量。對於預防性使用，有益或期望的結果諸如：消除或降低風險、減輕嚴重程度或延遲疾病發作，包括疾病的生化、組織學及/或行為症狀、其併發症以及疾病發展過程中出現的中間病理表型。對於治療用途，有益或期望的結果包括臨床結果，諸如減少由疾病引起的一種或多種症狀、提高受累於疾病者的生活品質、減少治療該疾病所需的其他藥物的劑量、增強另一藥物 (諸如經由靶向治療) 的效果、延緩疾病進展、和/或延長生存期。就癌症或腫瘤而言，有效量之藥物可具有以下效果：減少癌細胞數；減小腫瘤尺寸；抑制 (亦即 ，在一定程度上減緩或在理想情況下終止) 癌細胞浸潤入周邊器官中；抑制 (亦即 ，在一定程度上減緩或在理想情況下終止) 腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上減輕與該病變相關之症狀中的一者或多者。有效量可於一次或多次給藥中投予。出於本發明的目的，藥物、化合物或藥物組成物的有效量為足以直接或間接完成預防或治療的量。如在臨床語境中理解者，藥物、化合物或藥物組成物之有效量可與或不與另一藥物、化合物或藥物組成物聯合而達成。因此，在投予一種或多種治療劑之語境中可慮及「有效量」，若單個劑與一種或多種其他劑聯合而可達成或已經達成所欲結果，則該單個劑可視為以有效量給出。
術語「表位」涉及抗體結合的抗原分子上的特定位點。在一些方面，抗體結合的抗原分子上的特定位點藉由羥基自由基足跡分析確定。在一些方面，藉由結晶學確定抗體結合的抗原分子上的特定位點。
當用於本文時，「生長抑制劑」涉及在活體外 或活體內 抑制細胞生長的化合物或組成物。在一方面，生長抑製劑是生長抑制抗體，其防止或減少表現該抗體所結合之抗原的細胞的增殖。在另一方面，生長抑製劑可為一種顯著降低 S 期細胞百分比的抑製劑。生長抑製劑的方面包括阻斷細胞週期進程 (在 S 期以外的地方) 的藥劑，例如誘導 G1 停滯及 M 期停滯的藥劑。典型 M 期阻滯劑包括長春花 (vincas) (長春新鹼和長春鹼)、紫杉烷類及拓撲異構酶II抑製劑，例如多柔比星、表柔比星 (epirubicin)、道諾黴素 (daunorubicin)、依托泊苷 (etoposide) 及博來黴素 (bleomycin)。阻滯 G1 的那些藥劑也會湧入 S 期阻滯中，例如 DNA 烷化劑，例如他莫昔芬 (tamoxifen)、強體松 (prednisone)、達卡巴嗪 (dacarbazine)、氮芥、順鉑、甲胺蝶呤 (methotrexate)、5-氟尿嘧啶及 ara-C，更多資訊可見於 Mendelsohn 及 Israel 編，The Molecular Basis of Cancer，第 1 章，標題為「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」，Murakami 等人 (W.B.Saunders, Philadelphia, 1995)，例如，第 13 頁。紫杉烷類 (紫杉醇和多西紫杉醇) 都是抗癌藥，均來源於紫杉。多西紫杉醇 (TAXOTERE®，Rhone-Poulenc Rorer) 源自歐洲紫杉，是紫杉醇的半合成類似物 (TAXOL®，Bristol-Myers Squibb)。紫杉醇和多西紫杉醇促進微管蛋白二聚體的微管組裝，並藉由防止解聚作用穩定微管，從而抑制細胞的有絲分裂。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」和「宿主細胞培養物」可互換使用，係指已向其中引入外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉形體」和「轉形細胞」，其包括原代轉形細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉形細胞中篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變子代細胞。
如本文所用，術語「載體」係指能夠繁殖與其連接的另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。此等載體在本文稱為「表現載體」。
「免疫共軛物」是與一個或多個異源分子複合之抗體，其包括但不限於細胞毒性劑。
術語「免疫調節劑」涉及修飾免疫系統反應或免疫系統功能的一類分子。免疫調節劑包括，但不限於，PD-1 軸結合拮抗劑、T 細胞依賴性雙特異性抗體及基於 mRNA 的個人化癌症疫苗，及沙利多邁 (thalidomide) (α-N-酞醯亞胺基-戊二醯亞胺) 及其類似物、OTEZLA® (阿米司特 (apremilast))、REVLIMID® (來那度胺 (lenalidomide)) 及 ACTI-MID™ (波馬利度 (pomalidomide)) 及其醫藥上可接受之鹽類或酸類。
「受試者」或「個體」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。在某些方面，個體或受試者為人類。
「單離的」蛋白質或多肽是從其自然環境的組分中分離出來的蛋白質或多肽。在一些方面，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電位聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 來測定。
「分離的」核酸係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
術語「PD-1 軸結合拮抗劑」係指一種分子，其抑制 PD-1 軸結合伴侶與其一個或多個結合伴侶的交互作用，從而消除由 PD-1 信號軸傳導引起的 T 細胞功能障礙，其結果是恢復或增強 T 細胞功能 (例如，增殖、細胞因子產生、靶細胞殺除)。如本文所用，PD-1 軸結合拮抗劑包括 PD-1 結合拮抗劑、PD-L1 結合拮抗劑和 PD-L2 結合拮抗劑。
術語「PD-1 結合拮抗劑」係指一種分子，其減少、阻斷、抑制、消除或干擾由 PD-1 與其一種或多種結合伴侶 (例如 PD-L1 或 PD-L2) 之交互作用引起的訊息轉導。在一些方面，PD-1 結合拮抗劑為抑制 PD-1 與其一種或多種結合伴侶之結合的分子。在一個具體態樣，PD-1 結合拮抗劑抑制 PD-1 與 PD-L1 和/或 PD-L2 之結合。例如，PD-1 結合拮抗劑包括抗 PD-1 抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽以及減少、阻斷、抑制、消除或干擾由 PD-1 與 PD-L1 和/或 PD-L2 之交互作用引起的訊息轉導的其他分子。在一個實施例中，PD-1 結合拮抗劑減少了由 T 淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白所介導或藉由其表現的負共刺激信號 (藉由 PD-1 介導的信號)，從而減輕了功能障礙 T 細胞的功能障礙 (例如，增強效應子對抗原識別的反應)。在一些方面，PD-1 結合拮抗劑為抗 PD-1 拮抗劑抗體。在具體方面，PD-1 結合拮抗劑為 MDX-1106 (納武單抗 (nivolumab))。在另一具體方面，PD-1 結合拮抗劑為 MK-3475 (帕博利珠單抗 (pembrolizumab))。在另一具體方面，PD-1 結合拮抗劑為 AMP-224。在另一具體方面，PD-1 結合拮抗劑為 MED1-0680。在另一具體方面，PD-1 結合拮抗劑為 PDR001。在另一具體方面，PD-1 結合拮抗劑為 REGN2810。在另一具體方面，PD-1 結合拮抗劑為 BGB-108。
術語「PD-L1 結合拮抗劑」係指一種分子，其減少、阻斷、抑制、消除或干擾由 PD-L1 與其一種或多種結合伴侶 (例如 PD-1 或 B7-1) 之交互作用引起的訊息轉導。在一些方面，PD-L1 結合拮抗劑為抑制 PD-L1 與其結合伴侶之結合的分子。在一個具體態樣，PD-L1 結合拮抗劑抑制 PD-L1 與 PD-1 和/或 B7-1 之結合。在一些方面，PD-L1 結合拮抗劑包括抗 PD-L1 抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽以及減少、阻斷、抑制、消除或干擾由 PD-L1 與其一種或多種結合伴侶 (例如 PD-1 或 B7-1) 之交互作用引起的訊息轉導的其他分子。在一個實施例中，PD-L1 結合拮抗劑減少了由 T 淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白所介導或藉由其表現的負共刺激信號 (藉由 PD-L1 介導的信號)，從而減輕了功能障礙 T 細胞的功能障礙 (例如，增強效應子對抗原識別的反應)。在一些方面，PD-L1 結合拮抗劑為抗 PD-L1 拮抗劑抗體。在另一具體態樣，抗 PD-L1 拮抗劑抗體為 MPDL3280A (阿托珠單抗)，以商品名 TECENTRIQ™ 進行銷售，其 WHO 藥物資訊 (國際非專利藥物名稱) 見：Recommended INN: List 74，第 29 卷第 3 期，2015 (見第 387 頁)。在另一具體態樣，抗 PD-L1 拮抗劑抗體為 YW243.55.S70。在另一具體態樣，抗 PD-L1 拮抗劑抗體為 MDX-1105。在另一具體態樣，抗 PD-L1 拮抗劑抗體為 MSB0015718C。在又一具體態樣，抗 PD-L1 拮抗劑抗體為 MEDI4736。
術語「PD-L2 結合拮抗劑」係指一種分子，其減少、阻斷、抑制、消除或干擾由 PD-L2 與其一種或多種結合伴侶 (例如 PD-1) 之交互作用引起的訊息轉導。在一些方面，PD-L2 結合拮抗劑為抑制 PD-L2 與其一種或多種結合伴侶之結合的分子。在一個具體態樣，PD-L2 結合拮抗劑抑制 PD-L2 與 PD-1 之結合。在一些方面，PD-L2 結合拮抗劑包括抗 PD-L2 抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽以及減少、阻斷、抑制、消除或干擾由 PD-L2 與其一種或多種結合伴侶 (例如 PD-1) 之交互作用引起的訊息轉導的其他分子。在一個實施例中，PD-L2 結合拮抗劑減少了由 T 淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白所介導或藉由其表現的負共刺激信號 (藉由 PD-L2 介導的信號)，從而減輕了功能障礙 T 細胞的功能障礙 (例如，增強效應子對抗原識別的反應)。在一些方面，PD-L2 結合拮抗劑為免疫黏附素。
除非另有說明，否則如本文所使用之術語「蛋白質」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然蛋白質，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如，人) 和囓齒動物 (例如，小鼠和大鼠)。該術語涵蓋「全長」未經加工的蛋白質以及在細胞中加工產生的任何形式的蛋白質。該術語亦涵蓋天然生成之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。
相對於參考多肽序列所述之「百分比 (%) 胺基酸序列同一性」，是指候選序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守性替換作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸百分比序列同一性之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公眾可取得的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN 或 Megalign (DNASTAR) 軟件。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 產生 ％ 胺基酸序列同一值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由 Genentech，Inc. 編寫，原始程式碼已與用戶文檔一起存檔於美國版權局，華盛頓特區，20559，並以美國版權註冊號 TXU510087 進行註冊。ALIGN-2 程式可從加利福尼亞南三藩市的 Genentech，Inc. 公眾可取得，亦可以從原始程式碼進行編譯。ALIGN-2 程式應編譯為在 UNIX 作業系統（包括數位 UNIX V4.0D）上使用。所有序列比較參數均由 ALIGN-2 程式設置，並且沒有變化。
在使用 ALIGN-2 進行胺基酸序列比較的情況下，既定胺基酸序列 A 對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 的 % 胺基酸序列同一性（其視情況表述為既定胺基酸序列 A，其對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 具有或包含一定 % 的胺基酸序列同一性）計算如下： 100 乘以分數 X/Y 其中 X 是序列比對程式 ALIGN-2 在 A 與 B 程式比對中評分為同一匹配的胺基酸殘基數，Y 是 B 中胺基酸殘基的總數。應當理解的是，在胺基酸序列 A 的長度不等於胺基酸序列 B 的長度的情況下，A 與 B 的 ％ 胺基酸序列同一性將不等於 B 與 A 的 ％ 胺基酸序列同一性。除非另有特別說明，否則如前一段所述，使用 ALIGN-2 電腦程式獲得本文使用的所有 ％ 胺基酸序列同一值。
術語「藥物製劑」係指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不包含對製劑將投予之受試者具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥製劑中除對受試者無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載體包括但不限於載劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
「放射療法」意指使用定向的伽馬射線或 β 射線來誘導對細胞的充分損害，從而限制其正常功能的能力或完全破壞細胞。將理解的是，在本技術領域中將有許多方法可確定治療的劑量和持續時間。典型治療為一次投用，且典型劑量範圍為為每天 10 至 200 單位 (Grays)。
如本文中所使用的「治療 (treatment)」（及其語法變體，諸如「治療 (treat)」或「治療 (treating)」），係指試圖改變受治療受試者之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。在一些方面，本發明之抗體 (例如，本發明之抗 LY6G6D 抗體) 用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
「降低或抑制」意指引起總體減少的能力，較佳為 20％ 或更大、更佳為 50％ 或更大、最佳為 75％、85％、90％、95％ 或更大。在某些方面，減少或抑制可涉及經抗體 Fc 區介導的抗體效用功能，此類效用功能具體包括補體依賴性細胞毒性 (CDC)、抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 及抗體-依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)。
根據本發明，術語「疫苗」涉及藥物製劑 (醫藥組成物) 或產品，在投予該藥物製劑或產品後誘導免疫反應，特別是細胞免疫反應，其識別並攻擊病原體或患病細胞例如癌細胞。疫苗可用於預防或治療疾病。疫苗可為癌症疫苗。如本文所使用，「癌症疫苗」是一種刺激受試者針對癌症產生免疫反應的組成物。癌症疫苗通常由與癌症有關的物質或細胞 (抗原) 來源所組成，其對於受試者可能是自體的 (來自自身) 或同種異體的 (來自別處)，以及包含其他成分 (例如 佐劑)，以進一步刺激和增強腫瘤對抗原的免疫反應。癌症疫苗可刺激受試者的免疫系統，以產生針對一種或幾種特定抗原的抗體，及/或產生殺手 T 細胞來攻擊具有那些抗原的癌細胞。
術語「個人化癌症疫苗」 (「PVC」) 涉及適合個別癌症病患的需要或特殊情況的癌症疫苗。在一些方面，PCV 刺激針對病患癌細胞中所存在的一種或多種癌症特異性體細胞突變的免疫反應，例如在PCT 公開號 WO2014/082729 及 WO2012/159754。癌症特異性體細胞突變可以存在於病患的任何癌細胞中，例如腫瘤細胞，例如循環中的腫瘤細胞。在一些方面，使用次世代定序發現癌症特異性的體細胞突變。在一些方面，將包含該癌症特異性體細胞突變的多肽或編碼包含所述癌症特異性體細胞突變之多肽的核酸 (例如，RNA，例如活體外 轉錄的 RNA) 投予該病患以刺激該病患的免疫反應。
如本文所使用，「投予」意指給予受試者化合物 (例如，本發明的抗 LY6G6D 抗體) 劑量的方法。在一些方面，在本文的方法中所使用的組成物是靜脈內投予的。例如，本文所述之方法中所用的組成物可藉由例如肌內、靜脈內、皮內、經皮、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、外用、腫瘤內、腹膜、皮下、結膜下、囊內、黏膜、心包內、臍內、眼內、口服、外用、局部、經吸入、經注射、經輸注、經連續輸注、經局部直接灌注浴靶細胞、經導管、經灌洗、經乳脂或脂質組成物進行投予。投予方法可以根據多種因素而變化（例如，投予之化合物或組成物以及待治療之病狀、疾病或病症的嚴重程度）。
II. 組成物及方法
在一方面，本發明部分基於抗淋巴細胞抗原 6 複合物，基因座 G61 (抗 LY6G6D) 抗體。在某些實施例中，抗 LY6G6D 抗體是多特異性的 (例如，雙特異性的)，且除 LY6G6D 或其片段外還結合第二生物分子，例如 T 細胞的表面抗原，例如分化簇 3 (CD3)。本發明的抗體例如可用於治療或延緩細胞增殖性疾病，例如癌症，例如大腸直腸癌 (CRC) (例如，LY6G6D 陽性 CRC) 的進展，或用於增強患有這種病症之受試者的免疫功能。
A. 例示性抗 LY6G6D 抗體
在一個方面，本發明提供了與 LY6G6D 結合之抗體。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體結合人 LY6G6D 多肽 (SEQ ID NO：75) 或食蟹獼猴 (cyno) LY6G6D 多肽 (SEQ ID NO：77)。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體結合至包含或在下列 LY6G6D 之胺基酸內的表位：胺基酸 93-104 (SEQ ID NO：87)、94-103 (SEQ ID NO：78) 或 99-101 (SEQ ID NO：79) (例如，人類 LY6G6D)。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體結合至 LY6G6D 的殘基 Arg94、Leu101、Cys102 及 Asn103 中的一個、兩個、三個或全部四個。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體結合至包含下列殘基的表位：LY6G6D 的殘基 Arg94、Asp95、Cys96、Tyr97、Leu98、Gly99、Asp100、Leu101、Cys102 及 Asn103。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體結合至由 LY6G6D 之殘基 Arg94、Asp95、Cys96、Tyr97、Leu98、Gly99、Asp100、Leu101、Cys102 及 Asn103 所組成的表位。
LY6G6D 表位可藉由與表位的肽片段結合的抗 LY6G6D 抗體的 LY6G6D 結合域來確定。LY6G6D 表位亦可藉由丙胺酸掃描誘變來確定。在一個實施例中，LY6G6D 結合域與突變的 LY6G6D 的結合減少 20%、30%、50%、80% 或更多表明在丙胺酸掃描誘變測定中突變的 LY6G6D 的胺基酸殘基是對於 LY6G6D 結合域的表位殘基。或者，可藉由質譜法確定 LY6G6D 表位。在一些實施例中，藉由晶體學 (例如晶體學方法) 確定表位。
在一些實施例中，LY6G6D 表位可藉由結晶學方法確定，其藉由合併溶於特定條件 (例如 0.15 M NaCl，25 mM tris，pH 7.5，10 mg/ml) 中的抗 LY6G6D 抗體 Fab 與莫耳過量 (例如，2 倍莫耳過量) 的 LY6G6D 肽，並最初以坐式或懸滴蒸汽擴散形式篩選沉澱劑基質。優化的晶體可例如從含 70% v/v 甲基-戊二醇之儲備溶液與 pH 7.5 之 0.1 M HEPES 緩衝液的 1:1 混合物中生長出來。儲備溶液可用作防凍劑。藉由突然浸入液氮中可將晶體轉移至低溫。
晶體的衍射數據可在光束線上收集。可使用程式 (例如 HKL2000) 對所記錄的衍射進行積分和縮放。
該結構可例如使用如 Phaser 的程式藉由分子置換 (MR) 來定相。例如，MR 搜索模型是自 HGFA/Fab 複合物的晶體結構所導出的 Fab 次單元 (PDB 代碼：2R0L).  基於 Fo-Fc 圖，將 LY6G6D 肽構建到結構中。隨後可以程序 REFMAC5 及 PHENIX 使用最大概似目標函數 ( likelihood target function)、各向異性個體 B 因子精化法及 TLS 精化法對結構進行精化，以實現收斂。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含選自以下項的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列或任何 SEQ ID NOs: 99-107 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 112 或 SEQ ID NO: 113 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列或任何 SEQ ID NOs: 99-107 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 99 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 100 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 101 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 102 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 103 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 104 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 107 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 113 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在一些方面，抗 LY6G6D 抗體具有：VH 結構域，其包含序列 SEQ ID NO: 10 或與該序列具有至少約 90% 序列同一性 (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性) 之胺基酸序列；及/或 VL 結構域，其包含序列 SEQ ID NO: 11 或與該序列具有至少約 90% 序列同一性 (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性) 之胺基酸序列。在特定情況下，抗 LY6G6D 抗體可為 20A12.QNTv12 (包括單細胞及兩細胞製造變體)，或其衍生物或選殖親本。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體包含：VH 結構域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；以及 VL 結構域，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體包含：VH 結構域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；以及 VL 結構域，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列。
在一些方面，抗 LY6G6D 抗體可包含下列至少一者 (例如 1、2、3 或 4 者)：(a) FR-H1 包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；(b) FR-H2 包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列；(c) FR-H3 包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4 包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體可包含下列至少一者 (例如 1、2、3 或 4 者)：(a) FR-L1 包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列；(b) FR-L2 包含 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列；(c) FR-L3 包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4 包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列。
在一些方面，該抗 LY6G6D 抗體包含所有下列四者：(a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO：34 之胺基酸序列；(b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO：35 之胺基酸序列；(c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO：36 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO：37 之胺基酸序列，及/或包含所有下列四者：(a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO：38之胺基酸序列；(b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO：39 之胺基酸序列；(c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO：40 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO：41 之胺基酸序列。在一些方面，抗 LY6G6D 拮抗劑抗體包含：VH 結構域，其包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列；及/或 VL 結構域，其包含 SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列。
在一些方面，抗 LY6G6D 抗體可包含下列至少一者 (例如 1、2、3 或 4 者)：(a) FR-H1 包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列；(b) FR-H2 包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；(c) FR-H3 包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4 包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體可包含下列至少一者 (例如 1、2、3 或 4 者)：(a) FR-L1 包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列；(b) FR-L2 包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列；(c) FR-L3 包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4 包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列。
在一些方面，抗 LY6G6D 抗體包含所有下列四者：(a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO：34 之胺基酸序列；(b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO：58 之胺基酸序列；(c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO：36 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO：37之胺基酸序列，及/或包含所有下列四者：(a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO：38 之胺基酸序列；(b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO：61 之胺基酸序列；(c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO：40 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO：41 之胺基酸序列。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體包含：VH 結構域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；以及 VL 結構域，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列。
在任何上述方面，抗 LY6G6D 抗體可被人源化。在一個實施例中，該抗體包含如上述任一實施例所述的抗 LY6G6D 抗體，並且進一步包含人受體骨架，例如人免疫球蛋白骨架或人共有骨架。
在本發明的又一方面，根據以上方面之任一項所述之抗 LY6G6D 抗體為單克隆抗體。在一些方面，該抗 LY6G6D 抗體為嵌合抗體或人抗體。在一個方面，抗 LY6G6D 抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab'、scFv、雙抗體或 F(ab')2 片段。在另一方面，抗體為全長抗體，例如本文所定義之完整 IgG 抗體 (例如完整 IgG1 抗體) 或其他抗體類別或同型。
在另一方面，如以下 1-8 部分所述，根據以上方面之任一項所述之抗 LY6G6D 抗體可單獨或組合地結合任何特徵。
B. 例示性抗 CD3 抗體
在另一方面，本發明提供與分化簇 3 (CD3) (例如，CD3ε 及/或 CD3γ) 結合的單離抗體，並具有下列六個 CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：13 或 SEQ ID NO：50 之胺基酸序列；(f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：14 或 SEQ ID NO：51 之胺基酸序列，含 SEQ ID NO：21、55、90 或 92 的 VL 序列、各含 SEQ ID NO：21 或 55 及 20 的 VL 和 VH 序列，或各含 SEQ ID NOs：90 或 92 及 89 之 VL 和 VH 序列。在一些方面，抗 CD3 抗體結合人 CD3 多肽或食蟹獼猴 (cyno) CD3 多肽。在一些情況下，人 CD3 多肽或食蟹獼猴 CD3 多肽分別為人 CD3ε 多肽 (SEQ ID NO：80) 或食蟹獼猴 CD3ε 多肽 (SEQ ID NO：81)。在一些情況下，人 CD3 多肽或食蟹獼猴 CD3 多肽分別為人 CD3γ 多肽 (SEQ ID NO：82) 或食蟹獼猴 CD3γ 多肽 (SEQ ID NO：83)。在一些情況下，抗 CD3 抗體結合至由人類 CD3ε 的胺基酸 1-26 (SEQ ID NO：84) 或 1-27 (SEQ ID NO：85) 組成的 CD3 (例如人類 CD3ε) 片段內的表位。
在一些方面，本發明提供了一種抗 CD3 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 CD3 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗 CD3 抗體包含：VH 結構域，其包含 SEQ ID NO: 20 或 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；以及 VL 結構域，其包含SEQ ID NO: 21 或 SEQ ID NO: 90 之胺基酸序列。在特定情況下，抗 CD3 抗體可為 38E4.v1 MD1 或其衍生物或選殖親本。
在一些實施例中，抗 CD3 抗體包含：VH 結構域，其包含 SEQ ID NO: 20 或 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；以及 VL 結構域，其包含 SEQ ID NO: 55 或 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列。在特定情況下，抗 CD3 抗體可為 38E4.v1 MD4 或其衍生物或選殖親本。
在一些方面，抗 CD3 抗體可包含下列至少一者 (例如，1、2、3 或 4)：(a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO：42 之胺基酸序列；(b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO：43 或 SEQ ID NO：62 之胺基酸序列；(c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO：44 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO：45 之胺基酸序列，及/或下列至少一者 (例如，1、2、3 或 4)：(a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO：46 之胺基酸序列；(b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO：47 或 SEQ ID NO：63 胺基酸序列；(c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO：48 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO：49 之胺基酸序列。
在一些方面，抗 CD3 抗體包含所有下列四者：(a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO：42 之胺基酸序列；(b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO：43 之胺基酸序列；(c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO：44 之胺基酸序列；(d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO：45 之胺基酸序列，及/或包含所有下列四者：(a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO：46 之胺基酸序列；(b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO：47 之胺基酸序列；(c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO：48 之胺基酸序列；(d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO：49 之胺基酸序列。
在一些方面，抗 CD3 抗體包含所有下列四者：(a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO：42 之胺基酸序列；(b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO：62 之胺基酸序列；(c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO：44 之胺基酸序列；(d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO：45 之胺基酸序列，及/或包含所有下列四者：(a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO：46 之胺基酸序列；(b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO：63 之胺基酸序列；(c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO：48 之胺基酸序列；(d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO：49 之胺基酸序列。
在以上任何實施例中，抗 CD3 抗體可為人源化的。在一個實施例中，抗 CD3 抗體包含如上述任一實施例所述的 CDR，並且進一步包含人受體骨架，例如人免疫球蛋白骨架或人共有骨架。
在另一態樣，提供了抗 CD3 抗體，其中，抗體包含如上文所提供之任何實例中的 VH 以及如上文所提供之任何實例中的 VL，其中，恆定域序列中的一個或兩個均包括轉譯後修飾。
在又一方面，本發明提供了一種與本文提供之抗 CD3 抗體結合至同一抗原決定基的抗體。例如，在某些方面，提供了一種與本文提供之抗 CD3 抗體結合至同一抗原決定基的抗體，其包含 SEQ ID NO: 20 之 VH 序列 和 SEQ ID NO: 21 之 VL 序列或抗 CD3 抗體包含 SEQ ID NO: 20 之 VH 序列 和 SEQ ID NO: 55 之 VL 序列  在某些實施例中，提供結合至 CD3 (例如人類 CD3ε) 片段內的表位的抗體，該 CD3 由人 CD3ε 的胺基酸 1-26 (SEQ ID NO: 84) 或 1-27 (SEQ ID NO: 85) 所組成。
在本發明的又一方面，根據以上方面之任一項所述之抗 CD3 抗體為單克隆抗體。在其他實施例中，該抗 CD3 抗體為嵌合抗體或人抗體。在一個實施例中，抗 CD3 抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab'、scFv、雙抗體或 F(ab')2 片段。在另一實施例中，抗體為全長抗體，例如本文所定義之完整 IgG 抗體 (例如完整 IgG1 抗體) 或其他抗體類別或同型。
在另一方面，如以下 1-8 部分所述，根據以上方面之任一項所述之抗 CD3 抗體可單獨或組合地結合任何特徵。
1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文提供的抗體具有之解離常數 (KD ) 為  ≤ 1 μM、≤ 250 nM、≤ 100 nM、≤ 15 nM、≤ 10 nM、≤ 6 nM、≤ 4 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或 ≤ 0.001 nM (例如 10-8 M 或更低，例如 10-8 M 至 10-13 M，例如 10-9 M 至 10-13 M)。
在一實施例中，KD 是藉由放射性標記的抗原結合測定 (adiolabeled antigen binding assay，RIA) 來測量。在一個態樣中，RIA 是用所關注的抗體的 Fab 形式及其抗原來進行。例如，通過在滴定系列之無標記抗原的存在下用最小濃度的 (125 I) 標記的抗原平衡 Fab，然後用抗 Fab 抗體塗布之平板捕獲結合抗原，來測量 Fab 對抗原之溶液結合親和性 (參見例如 Chen 等人，J. Mol. Biol. 293:865-881(1999))。為確定測定的條件，用溶於 50 mM 碳酸鈉 (pH 9.6) 中的 5 μg/ml 捕獲抗 Fab 抗體 (Cappel Labs) 將 MICROTITER® 多孔板 (Thermo Scientific) 塗布隔夜，然後在室溫 (約 23°C) 下用溶於 PBS 中的 2% (w/v) 牛血清白蛋白封閉二至五小時。在非吸附板 (Nunc #269620) 中，將 100 pM 或 26 pM [125 I]-抗原與目標 Fab 的系列稀釋液混合 (例如，與 Presta 等人在Cancer Res. 57:4593-4599 (1997) 中所述之抗 VEGF 抗體 Fab-12 的評估結果一致)。然後將目標 Fab 過夜孵育；但是，可繼續孵育更長時間 (例如約 65 小時)，以確保達到平衡。此後，將混合物轉移之捕獲板上，在室溫下進行孵育 (例如，孵育一小時)。然後除去溶液，用溶於 PBS 中的 0.1% 聚山梨糖醇酯 20 (TWEEN-20® ) 將板洗滌八次。當平盤乾燥後，添加 150 μl/孔的閃爍劑 (MICROSCINT-20TM ；Packard)，並將平盤在 TOPCOUNTTM 伽瑪計數器 (Packard) 上計數十分鐘。選擇提供小於或等於最大結合濃度的 20% 的各種 Fab 的濃度以用於競爭性結合測定中。
根據另一實例，KD 使用 BIACORE® 表面電漿子共振測定法測得。例如，使用 BIACORE® -2000 或 BIACORE® -3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway，NJ) 在 37°C 下用固定化抗原 CM5 晶片以約 10 反應單位 (RU) 進行測定。在一個態樣中，根據供應商的說明，用N -乙基-N' -(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC) 和N -羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 活化羧甲基化葡聚醣生物感測器晶片 (CM5，BIACORE, Inc.)。用 10 mM 乙酸鈉 (pH 4.8) 將抗原稀釋至 5 μg/ml (~0.2 μM)，然後以 5 μl/分鐘的流速注入，以獲得大約 10 反應單位 (RU) 的偶合蛋白。注入抗原後，注入 1 M 乙醇胺以封閉未反應的基團。在動力學測量中，將 Fab 之兩倍連續稀釋液 (0.78 nM 至 500 nM) 在 37°C 下以約 25 μl/min 的流速注入含 0.05% 聚山梨糖醇酯 20 (TWEEN-20TM ) 界面活性劑 (PBST) 的 PBS 中。透過同時擬合結合和解離感測圖，使用簡單的一對一 Langmuir 結合模型 (BIACORE® 評估軟體版本 3.2) 計算結合速率 (kon 或 ka ) 和解離速率 (koff 或 kd )。平衡解離常數 (KD ) 透過 koff /kon 比率計算得出。參見例如：Chen 等人，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。如果藉由上述表面電漿子共振測定法測得的結合率 (on-rate) 超過 106 M-1 s-1 ，則可以使用螢光淬滅技術測定結合率，該技術可測量 37°C 下 PBS (pH 7.2) 中的 20 nM 抗原抗體 (Fab 形式) 在存在濃度升高的抗原的情況下螢光發射強度的增加或減少 (激發波長 = 295 nm；發射波長 = 340 nm，帶通 16 nm)，該抗原濃度可藉由分光光度計諸如停流分光光度計 (Aviv Instruments) 或帶有攪拌比色皿的 8000 系列 SLM-AMINCOTM 分光光度計 (ThermoSpectronic) 測得。
在一些實施例中，本文提供的抗 LY6G6D 抗體以介於約 1 nM 至 500 nM之間的 KD 結合人 LY6G6D 多肽，其在 37°C 使用 BIAcore 測定法量測，例如以  ≤ 1μM、≤ 250 nM、≤ 100 nM、≤ 40 nM、≤ 30 nM、≤ 15 nM、≤ 10 nM、≤ 6 nM、≤ 4 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或  ≤ 0.001 nM 的 KD 結合人 LY6G6D。在一些實施例中，本文所提供的抗 LY6G6D 抗體以約 100 nM 至 0.01 nM 之間；約 50 nM 至 5 nM 之間；約 40 nM 至 10 nM 之間；約 35 nM 至 15 nM 之間；或約 30 nM 至 20 nM之間的 KD 結合人 LY6G6D 多肽。
在一些實施例中，本文提供的抗 CD3 抗體以介於約 100 pM 至 10 nM 之間的 KD 結合人 CD3 多肽，其在 37°C 使用 BIAcore 測定法量測，例如以  ≤ 1 μM、≤ 250 nM、≤ 100 nM、≤ 40 nM、≤ 30 nM、≤ 15 nM、≤ 10 nM、≤ 5 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或  ≤ 0.001 nM 的 KD 結合人 CD3。在一些實施例中，本文所提供的抗 CD3 抗體以約 100 nM 至 0.01 nM 之間；約 50 nM 至 5 nM 之間；約 40 nM 至 10 nM 之間；約 35 nM 至 15 nM 之間；或約 30 nM 至 20 nM之間的 KD 結合人 CD3 多肽。
2. 抗體片段
在某些實施例中，本文提供之抗體 (例如，抗 LY6G6D 抗體或抗 CD3 抗體) 為抗體片段。抗體片段包括但不限於 Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、Fv 和 scFv 片段以及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段的綜述，參見 Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第 113卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269-315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。關於包含補救受體結合抗原決定位殘基且具有增加的體內半衰期之 Fab 及 F(ab')2 片段的論述，參見美國第 5,869,046 號專利 。
雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點 (其可係二價或雙特異性的) 之抗體片段。參見例如 EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。Hudson 等人 (Nat. Med. 9:129-134，2003) 中亦描述了三功能抗體及四功能抗體。
單域抗體為包含抗體之重鏈變異域之全部或部分或抗體之輕鏈變異域之全部或部分之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌 或噬菌體) 之產生。
3. 嵌合和人源化抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體 (例如，抗 LY6G6D 抗體或抗 CD3 抗體) 為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國第 4,816,567 號專利；及 Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，81:6851-6855，1984。在一個實例中，嵌合抗體包含非人變異區 (例如，來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物如猴的變異區) 及人恆定區。在又一個實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類或子類相比於其親代抗體已發生變更。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些態樣中，嵌合抗體為人源化抗體。通常，非人抗體為人源化抗體以降低對人的免疫原性，同時保留親代非人抗體之特異性及親和力。一般而言，人源化抗體包含一個或多個變異域，其中 HVR (或其部分) 例如源自於非人類抗體，且 FR (或其部分) 源自於人類抗體序列。人源化抗體視情況將包含人恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體中的一些 FR 殘基經來自非人抗體 (例如衍生 HVR 殘基之抗體) 之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法綜述於例如 Almagro 和 Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 中，並且進一步描述於例如：Riechmann 等人， Nature 332:323-329 (1988)；Queen 等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；US 專利號 5,821,337、7,527,791、6,982,321 和 7,087,409；Kashmiri等人 ，Methods 36:25-34 (2005) (具體描述了決定區 (SDR) 接枝)；Padlan，Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述了「表面重塑」)；Dall'Acqua 等人，Methods 36:43-60 (2005) (描述了「FR 改組」)；Osbourn 等人，Methods 36:61-68 (2005)；及 Klimka 等人，Br. J. Cancer ，83:252-260 (2000) (描述了 FR 改組的「導向選擇」法)。
可以用於人源化的人抗體骨架區包括但不限於：使用「最佳匹配」方法選擇的骨架區 (參見例如 Sims 等人J. Immunol. 151:2296 (1993))；來源於輕鏈或重鏈變異區的特定亞組的人抗體的共有序列的骨架區 (參見例如：Carter 等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，89:4285 (1992)；及 Presta 等人J. Immunol. ，151:2623 (1993))；人成熟的 (體細胞突變) 骨架區或人種系骨架區 (參見例如 Almagro 和 Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；以及來源於篩選 FR 庫的骨架區 (參見例如：Baca 等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)；及 Rosok 等人，J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。
4. 人抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體 (例如，抗 LY6G6D 抗體或抗 CD3 抗體) 為人類抗體。可使用此領域中所公知的各種技術生產人抗體。人抗體一般性描述於：van Dijk 和 van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)；及 Lonberg，Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)。
可透過對轉基因動物給予免疫原來製備人抗體，該轉基因動物已被修飾以響應於抗原攻擊而產生完整的人抗體或具有人變異區的完整抗體。此等動物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合到動物的染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已被滅活。有關從轉基因動物中獲得人抗體的方法的綜述，參見 Lonberg，Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。另見例如：美國專利號 6,075,181 和 6,150,584 (描述了 XENOMOUSETM 技術)；美國專利號 5,770,429 (描述了 HuMab® 技術)；美國專利號 7,041,870 (描述了 K-M MOUSE® 技術)；及美國專利申請公開號 US 2007/0061900 (描述了 VelociMouse® 技術)。由此等動物產生的來源於完整抗體的人變異區可被進一步修飾，例如透過與不同的人恆定區結合來修飾。
人抗體也可透過基於融合瘤的方法進行製備。用於生產人單株抗體的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤細胞系已有描述。(參見例如：KozborJ. Immunol. ，133: 3001 (1984)；Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications ，pp. 51-63 (Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；及 Boerner 等人，J. Immunol .，147: 86 (1991)。)  透過人 B 細胞雜交瘤技術產生的人抗體也描述於 Li 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，103: 3557-3562，2006。其他方法包括描述於例如以下文獻中的那些：美國第 7,189,826 號專利 (描述了由雜交瘤細胞系生產單克隆人 IgM 抗體)，及 Ni，Xiandai Mianyixue ，26(4): 265-268，2006 (描述了人-人雜交瘤)。人融合瘤技術 (Trioma 技術) 也描述於以下文獻中：Vollmers 和 Brandlein，Histology and Histopathology ，20(3):927-937 (2005)；及 Vollmers 和 Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology ，27(3):185-91 (2005)。
人抗體也可以藉由分離選自人源性噬菌體展示庫的 Fv 選殖株變異域序列來產生。然後可以將此等變異域序列與所需的人恆定域結合。下文描述了從抗體庫中選擇人抗體的技術。
5. 來源於文庫之抗體
本發明之抗體 (例如，抗 LY6G6D 抗體或抗 CD3 抗體) 可藉由篩選組合文庫中具有所需活性或具有活性的抗體來分離。例如，此領域中所公知的多種方法用於產生噬菌體展示庫並篩選此等庫中具有所需之結合特性的抗體。此等方法綜述於例如：Hoogenboom 等人，收錄於Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 等人主編，Human Press，Totowa，NJ，2001) 中，並且進一步描述於例如：McCafferty 等人Nature 348:552-554；Clackson 等人Nature 352: 624-628 (1991)；Marks 等人J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks 和 Bradbury，收錄於Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo 主編，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu 等人J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee 等人J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及 Lee 等人J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)。
在某些噬菌體展示方法中，透過聚合酶鏈鎖反應 (PCR) 分別選殖 VH 和 VL 基因庫，並在噬菌體庫中隨機重組，然後可按照以下文獻所述之方法篩選抗原結合噬菌體：Winter 等人，Ann. Rev. Immunol. ，12: 433-455 (1994)。噬菌體通常以單鏈 Fv (scFv) 片段或 Fab 片段展示抗體片段。來自免疫源的庫無需構建融合瘤即可向免疫原提供高親和力抗體。可替代地，可以在不進行任何免疫的情況下選殖天然譜系 (例如，來自人) 以向各種非自身以及自身抗原提供抗體的單一來源，如 Griffiths 等人在EMBO J. 12: 725-734 (1993) 中所述。最後，還可以透過選殖幹細胞中未重排的 V 基因片段，並使用包含隨機序列的 PCR 引子來編碼高變異性 CDR3 區域並在體外 完成重排，由此合成天然庫，如 Hoogenboom 和 Winter 在J. Mol. Biol. ，227: 381-388 (1992) 中所述。描述人抗體噬菌體庫的專利公開包括例如：美國第 5,750,373 號專利及美國專利公開號 2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936 和 2009/0002360。
從人抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中被視作人抗體或人抗體片段。
6. 多特異性抗體
在上述任一方面，本文所提供的抗 LY6G6D 或抗 CD3 抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位點具有結合特異性的單株抗體 (例如單株抗體)。在一些方面，雙特異性抗體可與 LY6G6D 的兩個不同表位結合。在一些方面，結合特異性之一者是針對 LY6G6D，而另一者則針對任何其他抗原 (例如，第二生物分子，例如 T 細胞表面抗原，例如 CD3)。在一些方面，結合特異性之一者是針對 CD3，而另一者則針對對任何其他抗原 (例如，第二生物分子，例如細胞表面抗原，例如腫瘤抗原)。在某些方面，結合特異性之一為對 LY6G6D 的結合特異性，而其他特異性則為針對 CD3。
在一些方面，抗 LY6G6D 抗體包含 (a) LY6G6D 結合域，其包含含有重鏈變異 (VH) 域 (VH1) 的重鏈多肽 (H1) 與含有輕鏈變異 (VL) 域 (VL1) 的輕鏈多肽 (L1)，及 (b) CD3 結合域，其包含含有重鏈變異 (VH) 域 (VH2) 的重鏈多肽 (H2) 及包含輕鏈變異 (VL) 域 (VL2) 的輕鏈多肽 (L2)。
在一些方面，抗 CD3 抗體具有包含下列的第一結合域：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO：15 之胺基酸序列； (b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO：16 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO：17 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO：12 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO：13 或 SEQ ID NO：50 之胺基酸序列；(f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO：14 或 SEQ ID NO：51 之胺基酸序列，例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4，該抗體可具有第二結合域，其結合至免疫效應子細胞以外的目標細胞上的細胞表面抗原 (例如腫瘤抗原，例如 LY6G6D)。
在一些方面，細胞表面抗原可以低拷貝數在目標細胞上表現。例如，在一些方面，細胞表面抗原以每一目標細胞少於 35,000 個拷貝數被表現或存在。在一些實施例中，低拷貝數細胞表面抗原以每一目標細胞存在 100 至 35,000 個拷貝之間；每個目標細胞 100 至 30,000 個拷貝之間；每個目標細胞有 100 到 25,000 個拷貝之間；每個目標細胞有 100 至 20,000 個拷貝之間；每個目標細胞有 100 到 15,000 個拷貝之間；每個目標細胞有 100 到 10,000 個拷貝之間；每個目標細胞有 100 至 5,000 個拷貝之間；每個目標細胞有 100 至 2,000 個拷貝之間；每個目標細胞有 100 到 1,000 個拷貝之間；或每個目標細胞 100 到 500 個拷貝之間。細胞表面抗原的拷貝數可例如使用標準的 Scatchard 圖示來確定。
例如，在一些方面，抗 LY6G6D 抗體具有結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列可具有結合 CD3 的第二結合域。在一些方面，結合 LY6G6D 的第一結合域包含分別含有 SEQ ID NO：34-37 之序列的重鏈骨架區 FR-H1、FR-H2、FR-H3 和 FR-H4 中的至少一者 (例如 1、2、3 或 4 者)，及/或分別含有 SEQ ID NOs：38-41 之序列的輕鏈骨架區 FR-L1，FR-L2，FR-L3 和 FR-L4 中的至少一者 (例如 1、2、3 或 4 者)。在其他方面，結合 LY6G6D 的第一結合域包含分別含有 SEQ ID NO：34、58、36 及 37 之序列的重鏈骨架區 FR-H1、FR-H2、FR-H3 和 FR-H4 中的至少一者 (例如 1、2、3 或 4 者)，及/或分別含有 SEQ ID NOs：38、61、40 及 41 之序列的輕鏈骨架區 FR-L1，FR-L2，FR-L3 和 FR-L4 中的至少一者 (例如 1、2、3 或 4 者)。在一些方面，與 LY6G6D 結合的第一結合域可包含，例如 (a) VH1 結構域，其包含序列 SEQ ID NO: 10 或與該序列具有至少約 90% 序列同一性 (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性) 之胺基酸序列；及 (b) VL1 結構域，其包含序列 SEQ ID NO: 11 或與該序列具有至少約 90% 序列同一性 (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性) 之胺基酸序列 (例如本文所述抗 LY6G6D 抗體 20A12.QNTv12)。在一些方面，與 LY6G6D 結合的第一結合域包含 (a) VH1 域，其包含具有 SEQ ID NO：59 之序列的胺基酸序列，及 (b) VL1 域，其包含具有SEQ ID NO：60 之序列的胺基酸序列。
在一些方面，本發明提供了一種抗 LY6G6D 抗體，該抗體具有結合 CD3 的第二結合域，結合 CD3 的第二結合域包含選自以下項的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 14 或 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列。
在一些方面，與 CD3 結合的第二結構域包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列。
在一些方面，與 CD3 結合的第二結構域可具有第二結合域，其包含以下六項：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列。
在一些實例中，與 CD3 結合的第二結構域可具有 VH2 結構域，其包含序列 SEQ ID NO: 20 或與該序列具有至少約 90% 序列同一性 (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性) 之胺基酸序列；及/或 VL2 結構域，其包含序列 SEQ ID NO: 21 或與該序列具有至少約 90% 序列同一性 (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性) 之胺基酸序列。在特定情況下，抗 CD3 抗體可為 38E4.v1 MD1 或其衍生物或選殖親本。
在一些實例中，與 CD3 結合的第二結構域可具有 VH2 結構域，其包含序列 SEQ ID NO: 20 或與該序列具有至少約 90% 序列同一性 (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性) 之胺基酸序列；及/或 VL2 結構域，其包含序列 SEQ ID NO: 55 或與該序列具有至少約 90% 序列同一性 (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性) 之胺基酸序列。在特定情況下，抗 CD3 抗體可為 38E4.v1 MD4 或其衍生物或選殖親本。
在一些方面，與 CD3 結合的第二結構域可包含下列至少一者 (例如 1、2、3 或 4 者)：(a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO：42 之胺基酸序列；(b) FR-H2，其包含SEQ ID NO：43 或 SEQ ID NO：62 之胺基酸序列；(c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO：44 之胺基酸序列；(d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO：45 之胺基酸序列；及/或下列至少一者 (例如 1、2、3 或 4 者)：(a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO：46 之胺基酸序列；(b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO：47 或 SEQ ID NO：63 之胺基酸序列；(c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO：48 之胺基酸序列；(d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO：49 之胺基酸序列。
在一些方面，抗 CD3 抗體包含所有下列四者：(a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO：42 之胺基酸序列；(b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO：43 之胺基酸序列；(c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO：44 之胺基酸序列；(d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO：45 之胺基酸序列，及/或包含所有下列四者：(a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO：46 之胺基酸序列；(b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO：47 之胺基酸序列；(c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO：48 之胺基酸序列；(d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO：49 之胺基酸序列。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體可包含：VH2 結構域，其包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列；及/或 VL2 結構域，其包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列。在一些實施例中，抗 LY6G6D 可抗體包含：VH2 結構域，其包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列；及/或 VL2 結構域，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列。
在一些方面，抗 CD3 抗體包含所有下列四者：(a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO：42 之胺基酸序列；(b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO：62 之胺基酸序列；(c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO：44 之胺基酸序列；(d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO：45 之胺基酸序列，及/或包含所有下列四者：(a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO：46 之胺基酸序列；(b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO：63 之胺基酸序列；(c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO：48 之胺基酸序列；(d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO：49 之胺基酸序列。
在一些實施例中，雙特異性抗體可用於將細胞毒性劑定位於表現腫瘤抗原 (例如 Ly6G6D) 的細胞。多特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。
製備多特異性抗體的技術包括但不限於具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現 (參見：Milstein 等人，Nature 305: 537，1983；WO 93/08829；及 Traunecker 等人，EMBO J. 10: 3655，1991) 和「杵臼」工程化 (參見例如美國第 5,731,168 號專利)。多特異性抗體的「杵和臼 (Knob-in-hole)」工程可用於產生包含杵狀物 (Knob) 的第一臂以及包含第一臂之杵狀物可結合於其中的臼狀物 (hole) 的第二臂。在一個實施例中，本發明的多特異性抗體的杵狀物可為抗 CD3 臂。或者，在一個實施例中，本發明的多特異性抗體的杵狀物可為抗-目標/抗原臂。在一個實施例中，本發明的多特異性抗體的臼狀物可為抗 CD3 臂。或者，在一個實施例中，本發明的多特異性抗體的臼狀物可為抗-目標/抗原臂。多特異性抗體亦可使用免疫球蛋白交叉 (immunoglobulin crossover) (亦稱為 Fab 域交換或 CrossMab 型式) 技術進行工程化 (參見，例如 WO2009/080253；Schaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 108:11187-11192 (2011))。多特異性抗體也可透過以下方法進行製備：用於製備抗體 Fc-異二聚體分子的工程靜電轉向效應 (WO 2009/089004A1)；交聯兩個或更多個抗體或片段 (參見例如美國第 4,676,980 號專利；及 Brennan 等人，Science ，229: 81，1985)；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體 (參見例如，Kostelny等人 ，J. Immunol. ，148(5):1547-1553 (1992))；使用「雙抗體」技術製備雙鏈抗體片段 (參見例如，Hollinger 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體 (參見例如Gruber 等人， J. Immunol. ，152:5368 (1994))；以及按照例如 Tutt 等人 (J. Immunol. 147: 60 (1991)) 所述之方法製備三特異性抗體。
本文還包括具有三個或更多個抗原結合位點之工程化抗體，包括「章魚抗體」(Octopus antibodies) (參見例如 US 2006/0025576A1)。
雙特異性抗體或其抗原結合片段還包括「雙重作用 FAb」或「DAF」，其包含與 CD3 以及另一種不同抗原 (例如第二生物分子) 結合之抗原結合位點 (參見例如 US 2008/0069820)。
7. 抗體變體
在一些方面，考慮本發明的抗 LY6G6D 及/或抗 CD3 抗體之胺基酸序列變體 (例如以高親和力結合 LY6G6D 及例如 CD3 的第二生物分子的本發明雙特異性抗 LY6G6D 抗體 (例如 20A12.QNTv12))，例如本發明的 TDB 抗體或其變體。例如，可能希望改善抗體的結合親和力及/或其他生物學特性。可藉由將適當的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變體。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵，例如抗原結合特徵。
a. 取代、插入和刪除變體
在某些態樣中，提供了具有一個或多個胺基酸取代的抗體變體。取代誘變的目標位點包括 CDR 和 FR。保守性替換列於表 1 之「較佳取代」標題下。表 1 中之「例示性取代」標題下提供了更多實質性變更，並且下文將參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。可將胺基酸取代引入目標抗體中，並篩選具有所需活性之產物，例如，保留/改善的抗原結合特徵、降低的免疫原性或改善的 ADCC 或 CDC。
表 1. 例示性和較佳胺基酸取代
原始殘基 例示性取代 較佳 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守性替換需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
一種類型的取代變體涉及取代一個或多個親代抗體 (例如，人源化或人抗體) 之超變異區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變體將相對於親代抗體在某些生物學特性 (例如提高親和性、降低免疫原性) 上具有修飾 (例如，改善) 及/或基本上保留親代抗體之某些生物學特性。例示性取代變體是親和力成熟的抗體，其可以方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術，例如本文所述的那些。簡言之，一個或多個 CDR 殘基發生突變，並且變體抗體在噬菌體上展示並篩選出特定的生物學活性 (例如，結合親和力)。
可以在 CDR 中進行更改 (例如，取代)，以改善抗體親和性。此等修改可以在 CDR 「熱點」中進行，即由密碼子編碼的殘基在體細胞成熟過程中經歷發生突變 (參見例如 Chowdhury，Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) 及/或與抗原接觸的殘基，並測試所得變異體 VH 或 VL 之結合親和力。透過構建並從二級文庫中重新選擇以實現親和力成熟，例如 Hoogenboom 等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 等人主編，Human Press，Totowa，NJ，(2001)) 中所述。在親和力成熟的一些實施方案中，透過多種方法（例如，易錯 PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變）中的任一種將多樣性引入選擇用於成熟的變異基因中。然後創建第二庫。然後篩選該庫，以識別具有所需之親和力的任何抗體變體。引入多樣性的另一種方法是 CDR 定向方法，其中將若干 CDR 殘基 (例如，每次 4-6 個殘基) 隨機化。可藉由例如丙胺酸掃描誘變或建模以特異性識別參與抗原結合的 CDR 殘基。特別地，CDR-H3 和 CDR-L3 經常成為靶點。
在某些方面，在一個或多個 CDR 內可能發生取代、插入或缺失，只要此等修改不顯著降低抗體以結合抗原的能力即可。例如，可在 CDR 中進行實質上不降低結合親和力的保守性改變 (例如，本文所提供之保守性取代)。例如，此等修改可能在 CDR 中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之 VH 和 VL 序列變體的某些態樣中，每個 CDR 均未改變，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
如 Cunningham 和 Wells (1989) (Science ，244:1081-1085) 所述，用於識別可能誘變的抗體殘基或區域的一種有用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在該方法中，識別殘基或目標殘基組 (例如，帶電荷的殘基，如 arg、asp、his、lys 和 glu)，並用中性或帶負電荷的胺基酸 (例如，丙胺酸或聚丙胺酸) 取代以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在胺基酸位置引入更多取代，表明對初始取代具有良好的功能敏感性。可替代地或另外地，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基和鄰近殘基可靶向或消除為取代的候選物。可篩選變體以確定它們是否包含所需之特性。
胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之序列，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子之其他插入變體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酶 (例如，對於 ADEPT) 或提高抗體血清半衰期之多肽。
b. 醣基化變體
在某些實施例中，本發明的抗 LY6G6D 及/或抗 CD3 抗體 (例如，較佳以高親和力 (例如 20A12.QNTv12) 結合至 LY6G6D 及例如 CD3 的第二生物分子的本發明雙特異性抗 LY6G6D 抗體) 可被改變以增加或減少抗體醣基化的程度。本發明的抗 LY6G6D 抗體中添加或缺失糖基化位點可透過改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地實現。
當抗體包含 Fc 區域時，可改變與其相連的碳水化合物。哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含支化的雙天線型寡糖，其通常透過 N 鍵連接至 Fc 區域 CH2 域之 Asn297。參見例如 Wright 等人TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺 (GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及在雙天線型寡糖結構之「莖」中連接至 GlcNAc 的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗體中的寡糖進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變體。
在一個態樣中，提供了具有缺少 (直接或間接地) 連接至 Fc 區域的岩藻糖的碳水化合物結構之抗 LY6G6D 及/或抗 CD3 抗體變體。例如，此等抗體中的岩藻糖含量可為 1% 至 80%、1% 至 65%、5% 至 65% 或 20% 至 40%。透過計算 Asn297 糖鏈中岩藻糖的平均含量來測定岩藻糖相對於透過 MALDI-TOF 質譜測得的連接至 Asn 297 的所有糖結構 (例如復合物、雜合和高甘露糖結構) 的總和之含量，例如 WO 2008/077546 中所述。Asn297 係指位於 Fc 區位置 297 附近之天冬醯胺殘基 (Fc 區殘基的 EU 編號)；但是，Asn297 也可以位於位置 297 上游或下游大約 ±3 個胺基酸處，即由於抗體之微小序列變化而介於位置 294 和 300 之間。此類岩藻糖基化變體可具有改善的 ADCC 功能。參見例如美國專利公開號 US 2003/0157108 (Presta, L.)；US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺乏」抗體變異體相關的出版物示例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki 等人J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki 等人Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請號 US 2003/0157108 A1，Presta, L；及 WO 2004/056312 A1，Adams等人 ，尤其是在實例 11 中)；和敲除細胞株，諸如敲除 α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8 的 CHO 細胞 (參見例如 Yamane-Ohnuki 等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. 等人，Biotechnol. Bioeng ，94(4):680-688 (2006)；及 WO2003/085107)。
進一步提供了具有二等分之寡糖的抗 LY6G6D 及/或抗 CD3 抗體，例如，其中連接至抗體之 Fc 區域的雙天線型寡糖被 GlcNAc 平分。此等抗體變體可具有減少的岩藻糖基化和/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變體的實例描述於例如：WO 2003/011878 (Jean-Mairet 等人)；美國第 6,602,684 號專利 (Umana 等人)；及 US 2005/0123546 (Umana等人 )。還提供了在寡糖上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變體。此等抗體變體可具有改善的 CDC 功能。此等抗體變體描述於例如 WO 1997/30087 (Patel 等人)、WO 1998/58964 (Raju, S.) 及 WO 1999/22764 (Raju, S.) 中。
c.      Fc 區域變體
在某些實施例中，可將一種或多種胺基酸修飾引入本發明的抗 LY6G6D 及/或抗 CD3 抗體的 Fc 區 (例如，本發明的較佳以高親和力 (例如 20A12.QNTv12) 與 LY6G6D 及第二生物分子 (例如 CD3) 結合的雙特異性抗 LY6G6D 抗體，從而產生 Fc 區變體 (參見例如 US 2012/0251531)。Fc 區域變體可包含人 Fc 區域序列 (例如 ，人 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如 ，取代)。
在某些態樣中，本發明考慮了一种具有一部分但非全部效用功能的抗 LY6G6D 及/或抗 CD3 抗體，使其成為以下應用中所需之候選抗體：其中抗體體內 半衰期很重要，但某些效用功能 (例如補體和 ADCC) 是不必要或有害的。可實施體外 及/或體內 細胞毒性測定，以確認 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。例如，可實施 Fc 受體 (FcR) 結合測定，以確保抗體缺乏 FcγR 結合 (因此可能缺乏 ADCC 活性)，但保留 FcRn 結合能力。介導 ADCC 之原代細胞 NK 細胞僅表達 Fc(RIII，而單核細胞則表達 Fc(RI、Fc(RII 及 Fc(RIII。FcR 在造血細胞上之表達匯總於 Ravetch 和 Kinet 的論文 (Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)) 之第 464 頁的表 3 中。用於評估目標分子之 ADCC 活性的體外 分析方法的非限制性實例描述於美國專利號 5,500,362 中 (參見例如 Hellstrom, I. 等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) 和 Hellstrom, I 等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見 Bruggemann, M. 等人，J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))。可替代地，可采用非放射性分析方法 (參見例如：用於流式細胞術的 ACTI™ 非放射性細胞毒性測定 (CellTechnology，Inc. Mountain View，CA)；及 CytoTox 96® 非放射性細胞毒性測定 (Promega，Madison，WI))。用於此等分析的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地 ，可在例如 Clynes等人 在Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) 中揭示的動物模型中在體內評估目標分子之 ADCC 活性。還可實施 C1q 結合測定以確認該抗體無法結合 C1q 並因此缺乏 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可執行 CDC 測定 (參見例如 Gazzano-Santoro等人 J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. 等人Blood. 101:1045-1052 (2003)；及 Cragg, M.S. 和 M.J. GlennieBlood. 103:2738-2743 (2004))。FcRn 結合和體內 清除率/半衰期測定也可使用本領域中已知的方法進行 (參見例如 Petkova, S.B. 等人Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769，2006)。
效用功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國第 6,737,056 號和第 8,219,149 號專利)。此等 Fc 變異體包括在胺基酸位置 265、269、270、297 和 327 中的兩個或更多個取代的 Fc 變異體，包括所謂的「DANA」 Fc 變異體，其中殘基 265 和 297 被丙胺酸取代 (美國第 7,332,581 號和第 8,219,149 號專利)。
在某些實例中，抗體中野生型人 Fc 區域 329 位的脯胺酸被甘胺酸或精胺酸或胺基酸殘基取代，足以破壞脯胺酸在 Fc/Fc.γ 受體界面內的脯胺酸夾心結構，該界面形成於 Fc 的脯胺酸 329 和 FcgRIII 的色胺酸殘基 Trp 87 和 Trp 110 之間 (Sondermann 等人：Nature. 406, 267-273, 2000)。在某些實例中，抗體包含至少一個更多胺基酸取代。在一個實例中，更多胺基酸取代為 S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D 或 P331S，並且在另一個實例中，至少一個更多胺基酸取代為 IgG1 Fc 區域的 L234A 和 L235A 或人 IgG4 Fc 區域的 S228P 和 L235E (參見如 US 2012/0251531)；並且在另一個實例中，至少一個更多胺基酸取代為人 IgG1 Fc 區域的 L234A 和 L235A 及 P329G。
其中描述了某些與 FcR 的結合能力得到改善或減弱的抗體變體。(參見例如美國專利號 6,737,056；WO 2004/056312 及 Shields 等人，J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。)
在某些態樣中，抗體變體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代改善了 ADCC，例如 Fc 區域的位置 298、333 及/或 334 (殘基的 EU 編號) 處之取代。
在某些方面，在 Fc 區域中進行修改，得到修改 (即 改善或減少) 之 C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如美國專利號 6,194,551、WO 99/51642 及 Idusogie 等人J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) 所述。
具有更長半衰期並改善了與新生兒 Fc 受體 (FcRn) (其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，見 Guyer 等人J. Immunol. 117:587 (1976) 和 Kim 等人J. Immunol. 24:249 (1994)) 之結合的抗體描述於 US2005/0014934A1 (Hinton 等人) 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此等 Fc 變體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如，Fc 區殘基 434 的置換（美國專利號 7,371,826）。
另參見 Duncan & Winter,Nature 322:738-40 (1988)；美國專利號 5,648,260；美國專利號 5,624,821；及 WO 94/29351 涉及 Fc 區變異體的其他實例。
在一些方面，抗 LY6G6D 及/或抗 CD3 抗體 (例如，雙特異性抗 LY6G6D 抗體) 包含含有 N297G 突變的 Fc 區。在一些實施例中，含有 N297G 突變的抗 LY6G6D 抗體包含含有第一結合域的抗 LY6G6D 臂，該第一結合域包含下列六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 4；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列及抗 CD3 臂。
在一些實施例中，含有 N297G 突變的抗 LY6G6D 抗體包含含有第一結合域的抗 CD3 臂，該第一結合域包含 (a) VH 域，其包含SEQ ID NO：10 之胺基酸序列，及 (b) VL 域，其包含 SEQ ID NO：11 之胺基酸序列及抗 CD3 臂。在其他實施例中，含有 N297G 突變的抗 LY6G6D 抗體包含含有第一結合域的抗 CD3 臂，該第一結合域包含 (a) VH 域，其包含SEQ ID NO：59 之胺基酸序列，及 (b) VL 域，其包含 SEQ ID NO：60 之胺基酸序列及抗 CD3 臂。
在一些實例中，含有 N297G 突變的抗 LY6G6D 抗體包含一個或多個重鏈恆定域，其中，所述一個或多個重鏈恆定域選自：第一 CH1 (CH1 1 ) 結構域、第一 CH2 (CH2 1 ) 結構域、第一 CH3 (CH3 1 ) 結構域、第二 CH1 (CH1 2 ) 結構域、第二 CH2 (CH2 2 ) 結構域及第二 CH3 (CH3 2 ) 結構域。在一些方面，所述一個或多個重鏈恆定域中的至少一個與另一個重鏈恆定域配對。在一些方面，CH3 1 和 CH3 2 結構域分別包含一個隆凸或腔窩，其中，CH3 1 結構域中的隆凸或腔窩分別位於 CH3 2 結構域的腔窩或隆凸中。在一些方面，該 CH3 1 及該 CH3 2 結構域在所述隆凸和腔窩之間的界面處相接。在一些方面，CH2 1 和 CH2 2 結構域分別包含一個隆凸或腔窩，其中，CH2 1 結構域中的隆凸或腔窩分別位於 CH2 2 結構域的腔窩或隆凸中。在其他實例中，該 CH2 1 及該 CH2 2 結構域在所述隆凸和腔窩之間的界面處相接。在一些方面，抗 LY6G6D 抗體是 IgG1 抗體。
在一些實施例中，含有 N297G 突變的抗 CD3 抗體包含含有第一結合域的抗 LY6G6D 臂，該第一結合域包含 (a) VH 域，其包含 SEQ ID NO：10 或 SEQ ID NO：59 之胺基酸序列，及( b) VL 域，其包含 SEQ ID NO：11 或 SEQ ID NO; 60 胺基酸序列及抗 CD3 臂，其中 (a) 該抗 LY6G6D 臂包含 T366S、L368A、Y407V 及 N297G 取代突變，且 (b) 抗 CD3 臂包含 T366W 及 N297G 取代突變。
在其他實施例中，含有 N297G 突變的抗 CD3 抗體包含含有第一結合域的抗 LY6G6D 臂，該第一結合域包含 (a) VH 域，其包含 SEQ ID NO：10 或 SEQ ID NO：59 之胺基酸序列，及 (b) VL 域，其包含 SEQ ID NO：11 或 SEQ ID NO：60 之胺基酸序列及抗 CD3 臂，其中 (a) 該抗 LY6G6D 臂包含 T366W 及 N297G 取代突變，且 (b) 該抗 CD3 臂包含 T366S、L368A、Y407V 及 N297G 突變。
d .半胱胺酸工程化抗體變體
在某些態樣中，可能希望創建胱胺酸工程化抗體，例如「thioMAb」，其中抗體之一個或多個殘基被胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，取代殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接子-藥物部分) 綴合，以形成免疫共軛物，如本文進一步所述。在某些態樣中，以下任何一個或多個殘基可被胱胺酸取代：輕鏈的 V205 (Kabat 編號)；重鏈的 A118 (EU 編號)；及重鏈 Fc 區的 S400 (EU 編號)。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國第 7,521,541 號專利所述之方法產生。
e. 抗體衍生物
在某些實施例中，本文所提供之本發明的抗 LY6G6D 抗體 (例如，本發明的雙特異性抗 LY6G6D 抗體較佳以高親和力 (例如 20A12.QNTv12) 與 LY6G6D 結合，以及與例如CD3的第二生物分子結合) 可進一步修飾以包含本領域已知且容易獲得的額外的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或無規共聚物) 以及右旋糖酐或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，並且可以為支鏈聚合物或非支鏈聚合物。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量和/或類型可基於以下考慮因素來確定，這些考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。
在另一態樣中，提供了可透過曝露於輻射而選擇性加熱之抗體和非蛋白質部分的複合體。在一個態樣中，非蛋白質部分為奈米碳管 (Kam 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605，2005)。輻射可具有任何波長，並且包括但不限於不損害普通細胞但是將非蛋白質部分加熱至接近抗體-非蛋白質部分的細胞被殺死之溫度的波長。
8. 帶電區
在一些方面，結合 LY6G6D 或 CD3 的結合域包含含有帶電區 (CR 1 ) 的 VH1 及含有帶電區 (CR 2 ) 的VL1，其中 VH1 中的CR 1 與 VL1 中的 CR 2 形成電荷對。在一些方面，CR 1 包含鹼性胺基酸殘基，且 CR 2 包含酸性胺基酸殘基。在一些方面，CR 1 包含 Q39K 取代突變 (Kabat 編號)。在一些方面，CR 1 由 Q39K 取代突變組成。在一些方面，CR 2 包含 Q38E 取代突變 (Kabat 編號)。在一些方面，CR 2 由 Q38E 取代突變組成。在一些方面，結合 CD3 的第二結合域包含含有帶電區 (CR 3 ) 的 VH2 及含有帶電區 (CR 4 ) 的 VL2，其中 VL2 中的 CR 4 與 VH2 中的 CR 3 形成電荷對。在一些方面，CR 4 包含鹼性胺基酸殘基，且 CR 3 包含酸性胺基酸殘基。在一些方面，CR 4 包含 Q38K 取代突變 (Kabat 編號)。在一些方面，CR 4 由 Q38K 取代突變組成。在一些方面，CR 3 包含 Q39E 取代突變 (Kabat 編號)。在一些方面，CR 3 由 Q39E 取代突變組成。在一些方面，VL1 域連接至輕鏈恆定域 (CL1) 結構域，而 VH1 連接至第一重鏈恆定域 (CH1)，其中 CL1 包含帶電區 (CR 5 )，而 CH1 包含電帶電區 (CR 6 )，並且其中，CL1 中的 CR 5 與 CH1 1 中的 CR 6 形成電荷對。在一些方面，CR 5 包含鹼性胺基酸殘基，且 CR 6 包含酸性殘基。在一些方面，CR 5 包含 V133K 取代突變 (EU 編號)。在一些方面，CR 5 由 V133K 取代突變組成。在一些方面，CR 6 包含 S183E 取代突變 (EU 編號)。在一些方面，CR 6 由 S183E 取代突變組成。
在其他方面，VL2 域連接至 CL 域 (CL2)，且 VH2 連接至 CH1 域 (CH1 2 )，其中，CL2 包含帶電區 (CR 7 )，且 CH1 2 包含帶區 (CR 8 )，並且其中，CH1 2 中的 CR 8 與 CL2 中 CR 7 形成電荷對。在一些方面，CR 8 包含鹼性胺基酸殘基，且 CR 7 包含酸性胺基酸殘基。在一些方面，CR 8 包含 S183K 取代突變 (EU 編號)。在一些方面，CR 8 由 S183K 取代突變組成。在一些方面，CR 7 包含 V133E 取代突變 (EU 編號)。在一些方面，CR 7 由 V133E 取代突變組成。
在其他方面，VL2 結構域連接至 CL 域 (CL2)，且 VH2 連接至 CH1 域 (CH1 2 )，其中 (a) CL2 在胺基酸殘基 F116、L135、S174、S176 及/或 T178 (EU 編號) 處包含一個或多個突變，及 (b) CH1 2 在胺基酸殘基 A141、F170、S181、S183 及/或 V185 (EU 編號) 處包含一個或多個突變。在一些方面，CL2 包含一個或多個下列取代突變：F116A、L135V、S174A、S176F 及/或 T178V。在一些方面，CL2 包含下列取代突變：F116A、L135V、S174A、S176F 及 T178V。在一些方面，CH1 2 包含一個或多個下列取代突變：A141I、F170S、S181M、S183A 及/或 V185A。在某些方面，CH1 2 包含下列取代突變：A141I、F170S、S181M、S183A 及 V185A。
在其他方面，結合 LY6G6D 或 CD3 的結合域包含含有帶電區 (CR 1 ) 的 VH 域 (VH1) 及含有帶電區 (CR2 ) 的 VL 域 (VL1)，其中 VL 1 中的 CR 2 與 VH1 中的 CR 1 形成電荷對。在一些方面，CR2 包含鹼性胺基酸殘基，且 CR 1 包含酸性胺基酸殘基。在一些方面，CR 2 包含 Q38K 取代突變 (Kabat 編號)。在一些方面，CR 2 由 Q38K 取代突變組成。在一些方面，CR 1 包含 Q39E 取代突變 (Kabat 編號)。在一些方面，CR 1 由 Q39E 取代突變組成。在一些方面，結合 CD3 的第二結合域包含含有帶電區 (CR 3 ) 的 VH 域 (VH2) 及含有帶電區 (CR 4 ) 的 VL 域 (VL2)，其中 VH2 中的 CR 3 與VL2中的 CR 4 形成電荷對。在一些方面，CR 3 包含鹼性胺基酸殘基，且 CR 4 包含酸性胺基酸殘基。在一些方面，CR 3 包含 Q39K 取代突變 (Kabat 編號)。在一些方面，CR 3 由 Q39K 取代突變組成。在一些方面，CR 4 包含 Q38E 取代突變 (Kabat 編號)。在一些方面，CR 4 由 Q38E 取代突變組成。在一些方面，VL1 域連接至輕鏈恆定域 (CL1) 且 VH1 連接至第一重鏈恆定域 (CH1 1 )，其中，CL1 包含帶電區 (CR 5 ) 而 CH1 1 包含帶電區 CR 6 ，並且其中，CH1 1 中的 CR 6 與 CL1 中的 CR 5 形成電荷對。在一些方面，CR 6 包含鹼性胺基酸殘基，且 CR5 包含酸性胺基酸殘基。在一些方面，CR 6 包含 S183K 取代突變 (EU 編號)。在一些方面，CR 6 由 S183K 取代突變組成。在一些方面，CR 5 包含 V133E 取代突變 (EU 編號)。在一些方面，CR 5 由 V133E 取代突變組成。
在其他方面，VL2 域連接至 CL 域 (CL2) 且 VH2 連接至 CH1 域 (CH1 2 )，其中 CL2 包含帶電區 (CR 7 )，且CH1 2 包含帶電區 (CR 8 )，並且其中， CL2 中的 CR 7 與 CH1 2 中的 CR 8 形成電荷對。在一些方面，CR 7 包含鹼性胺基酸殘基，且CR 8 包含酸性殘基。在一些方面，CR 7 包含 V133K 取代突變 (EU 編號)。在一些方面，CR 7 由 V133K 取代突變組成。在一些方面，CR 8 包含 S183E 取代突變 (EU 編號)。在一些方面，CR 8 由 S183E 取代突變組成。
在其他方面，VL2 結構域連接至 CL 域 (CL2)，且 VH2 連接至 CH1 域 (CH1 2 )，其中 (a) CL2 在胺基酸殘基 F116、L135、S174、S176 及/或 T178 (EU 編號) 處包含一個或多個突變，及 (b) CH1 2 在胺基酸殘基 A141、F170、S181、S183 及/或 V185 (EU 編號) 處包含一個或多個突變。在一些方面，CL2 包含一個或多個下列取代突變：F116A、L135V、S174A、S176F 及/或 T178V。在一些方面，CL2 包含下列取代突變：F116A、L135V、S174A、S176F 及 T178V。在一些方面，CH1 2 包含一個或多個下列取代突變：A141I、F170S、S181M、S183A 及/或 V185A。在某些方面，CH1 2 包含下列取代突變：A141I、F170S、S181M、S183A 及 V185A。在一些方面，抗 FcRH5 抗體包含一個或多個重鏈恆定域，其中該一個或多個重鏈恆定域選自第一 CH2 域 (CH2 1 )、第一 CH3 域 (CH3 1 )、第二 CH2 域 (CH2 2 )、及第二 CH3 域 (CH3 2 )。在一些方面，所述一個或多個重鏈恆定域中的至少一個與另一個重鏈恆定域配對。在一些方面，CH3 1 及 CH3 2 各自包含隆凸 (P 1 ) 或腔窩 (C 1 )，並且其中，該 CH3 1 中的 P 1 或 C 1 可分別定位在 CH3 2 中的 C 1 或 P 1 中。在一些方面，該 CH3 1 及該 CH3 2 在 P 1 與 C 1 之間的界面處相接。在一些方面，CH2 1 與 CH2 2 各自包含 (P 2 ) 或腔窩 (C 2 )，並且其中，該 CH2 1 中的 P 2 或 C 2 可分別定位在 CH2 2 中的 C 2 或 P 2 中。在一些方面，該 CH2 1 及該 CH2 2 在 P 2 與 C 2 之間的界面處相接。
B. 重組方法和組成物
本發明的抗 LY6G6D 抗體 (例如，本發明的雙特異性抗 LY6G6D 抗體，較佳以高親和力 (例如 20A12.QNTv12) 與 LY6G6D 結合，以及與例如 CD3 的第二生物分子結合) 及/或本發明的抗 CD3 抗體 (例如 38E4v1 MD1 (MD1) 及 38E4v1 MD4 (MD4)) 可使用重組方法及組成物產生，例如，如美國專利號 4,816,567 中所述。在一個實施例中，提供編碼如本文中抗 LY6G6D 抗體之經單離之核酸。此等核酸編碼包含 VL 之胺基酸序列及/或包含抗體之 VH 之胺基酸序列 (例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一個實施例中，提供編碼如本文中所述抗 CD3 抗體之經單離之核酸。此等核酸編碼包含 VL 之胺基酸序列及/或包含抗體之 VH 之胺基酸序列 (例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一進一步實施例中，提供一個或多個包含此核酸之載體 (例如，表現載體)。在一進一步實施例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在此實施例中，宿主細胞包含 (例如，已轉化)：(1) 包含核酸之載體編碼包含抗體之 VL 之胺基酸序列及包含抗體之 VH 之胺基酸序列，或 (2) 包含核酸之第一載體編碼包含抗體之 VL 之胺基酸序列及包含核酸之第二載體編碼包含抗體之 VL 之胺基酸序列。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。在一個方面，提供了一種製備抗 LY6G6D 抗體之方法，其中該方法包括在適合於抗體表現的條件下培養包含如上所述之編碼抗體的核酸的宿主細胞，並視情況從宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 中回收該抗體。
為了重組產生抗 LY6G6D 抗體及/或抗 CD3 抗體，分離編碼例如上述的抗體的核酸，並將其插入載體中，以在宿主細胞中進一步克隆及/或表達。此等核酸可藉由常規方法 (例如，使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並定序。
1. 製造雙特異性抗體的雙細胞法
在一些方面，使用包含兩種宿主細胞株的方法來製造本發明的抗體 (例如 LY6G6D TDB，例如具有抗 CD3 臂及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 LY6G6D TDB)。在一些方面，在第一宿主細胞株中產生抗體的第一臂 (例如，包含臼狀物區 (hole region) 的第一臂)，並在第二宿主細胞株中產生抗體的第二臂 (例如，包含杵狀物區 (knob region) 的第二臂)。從宿主細胞株中純化出抗體的臂並在活體外 組裝。
2. 製造雙特異性抗體的單種細胞方法
在一些方面，使用包含單種宿主細胞株的方法製造本發明的抗體 (例如 LY6G6D TDB，例如具有抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 LY6G6D TDB)。在一些方面，在單種宿主細胞株中產生並純化抗體的第一臂 (例如，包含臼狀物區的第一臂) 及抗體的第二臂 (例如，包含杵狀物區的第二臂)。較佳地，第一臂及第二臂在宿主細胞中以可比較的水平表現，例如在宿主細胞中均以高水平表現。相似的表現水平增加有效產生 TDB 的可能性，並降低 TDB 組件的輕鏈 (LC) 錯誤配對的可能性。抗體的第一臂及第二臂各可進一步包含導入電荷對的胺基酸取代突變，如本文於 IIB (8) 節所述。電荷對促進雙特異性抗體各臂的重鏈和輕鏈同源對的配對，從而使錯誤配對最小化。
3. 宿主細胞
適用於克隆或表達編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可能在細菌中產生，特別是在無需醣基化和 Fc 效用功能的情況下。有關抗體片段和多肽在細菌中之表現，參見例如美國第 5,648,237、5,789,199 和 5,840,523 號專利。(另見 Charlton，Methods in Molecular Biology ，第 248 卷 (B.K.C. Lo 主編，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第 245-254 頁，其中描述了抗體片段在大腸桿菌 中之表現。)  在表現後，抗體可與細菌細胞糊中的可溶性部分分離， 並可經過進一步純化。
除原核生物以外，真核微生物 (如絲狀真菌或酵母菌) 也為合適的抗體編碼載體的克隆或表現宿主，包括其醣基化途徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而導致具有部分或完全人糖基化模式的多肽的產生。參見：Gerngross，Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)；及 Li 等人，Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。
用於表現糖基化抗體的合適的宿主細胞也來源於多細胞生物 (無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物和昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特別是用於轉染草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda ) 細胞。
植物細胞培養物也可以用作宿主。參見 例如美國專利號 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978 及 6,417,429 (描述了在基因轉殖植物中生產抗體的 PLANTIBODIESTM 技術)。
脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞係。可用的哺乳動物宿主細胞株的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (如 Graham 等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977) 中所述之 293 或 293 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather，Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人子宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather 等人，Annals N.Y.Acad. Sci . 383:44-68 (1982) 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞系包括中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR- CHO 細胞 (Urlaub 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，例如 Y0、NS0 和 Sp2/0。有關某些適用於抗體生產的哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見例如：Yazaki 和 Wu，Methods in Molecular Biology ，第 248 卷 (B.K.C. Lo 主編，Humana Press，Totowa, NJ)，第 255-268 頁 (2003)。
C . 分析
本文提供的本發明的抗 LY6G6D 抗體 (例如，本發明的雙特異性抗 LY6G6D 抗體，較佳以高親和力結合至 LY6G6D (例如 20A12.QNTv12)，以及結合例如 CD3 之第二生物分子，例如本發明之TDB 抗體或其變體) 可藉由本技術領域已知的各種測定法鑑定、篩選或特徵化其等之物理/化學性質及/或生物活性。
1 . 結合分析及其他分析
在一個方面，利用已知方法諸如 ELISA、Western blot 等，檢測本發明之抗 LY6G6D 與抗 CD3 抗體的抗原結合活性。
在另一方面，競爭測定法可用於鑑定與本發明的抗 LY6G6D 抗體競爭結合 LY6G6D 的抗體，或鑑定與本發明的抗 CD3 抗體競爭結合 CD3 的抗體。
在一種例示性競爭測定中，將固定化 LY6G6D 置於包含與 LY6G6D 結合之第一標記抗體及第二標記抗體 (正在試驗其與第一抗體競爭與 LY6G6D 結合的能力) 的溶液中進行孵育。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，將固定化 LY6G6D 置於包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體的溶液中進行孵育。在允許第一抗體與 LY6G6D 結合的條件下孵育後，去除多餘的未結合抗體，並測量與固定化 LY6G6D 相關聯之標記物的量。如果試驗樣品中與固定化 LY6G6D 相關的標記物的數量相對於對照樣品而言明顯減少，則表明第二抗體正在與第一抗體競爭與 LY6G6D 的結合。參見例如 Harlow 和 Lane (1988)Antibodies:  A Laboratory Manual. Ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。另一例示性競爭測定法包含固定的 CD3 及與 CD3 結合的第一標記抗體，其中該測定如上所述執行。
2 . 活性分析
在一個方面，提供了鑒別抑制抗 LY6G6D 抗體之生物學活性的測定方法。生物活性可包括例如在活體內 、活體外 或離體 中與 LY6G6D (例如，腫瘤表面上的 LY6G6D) 或其肽片段結合。在本發明的多特異性 (例如雙特異性) 抗 LY6G6D 抗體的情況下 (例如 TDB 抗體，其具有一個抗 LY6G6D 臂，例如 20A12.QNTv12，及一個可識別第二生物分子 (例如細胞表面抗原 (例如 CD3)) 的臂)，生物活性亦可包括例如效應細胞活化 (例如 T 細胞 (例如 CD8+ 及/或 CD4+ T 細胞) 活化)、效應子細胞群體擴展 (即 T 細胞數增加)、目標細胞群體減少 (即，在其細胞表面上表現 LY6G6D 的細胞群體減少) 及/或目標細胞殺傷。還提供了在體內 及/或體外 具有此等生物學活性之抗體。在某些實施例中，如本文實施例中詳細描述的，測試本發明的抗體的此類生物學活性。
此外，可在含 10% FBS 的 RPMI 培養基中洗滌細胞，並補充 GlutaMax、青黴素及鏈黴素，然後將約 20 萬個懸浮細胞添加至 96 孔 U 型盤中。可在潮濕的標準細胞培養箱中，在 37ºC 下，於補充 10% FBS 的 RPMI1640 中培養細胞。對於 BJAB 細胞殺傷測定，可在不同濃度的 TDB 抗體存在下，將 20,000 個 BJAB 細胞與 huPBMC 或純化的 T 細胞 (如每一測定所示之比率) 一起與效應子細胞一起孵育 24 小時。
D . 免疫共軛物
本發明還提供了包含如本文所述之抗 LY6G6D 抗體及/或抗 CD3 抗體的免疫共軛物，其綴合 (化學鍵合) 至一種或多種治療劑，例如細胞毒性劑、化學治療劑、藥物、生長抑製劑、毒素 (例如來源於細菌、真菌、植物或動物之蛋白毒素、酶活性毒素或其片段) 或放射性同位素。
在一些實例中，免疫共軛物是一種抗體-藥物共軛體 (ADC)，其中抗體與一種或多種藥物共軛，該藥物包括但不限於美登木素生物鹼 (參見美國第 5,208,020 和 5,416,064 號專利及歐洲專利 EP 0 425 235 B1)；澳瑞他汀諸如單甲基澳瑞他汀藥物部分 DE 和 DF (MMAE 和 MMAF) (參見美國第 5,635,483、5,780,588 和 7,498,298 號專利)；尾海兔素；加利車黴素或其衍生物 (參見美國第 5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001 和 5,877,296 號專利；Hinman 等人,Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及 Lode 等人，Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；蒽環類藥物，諸如道諾黴素或阿黴素 (參見 Kratz 等人，Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey 等人，Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov 等人，Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik 等人，Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King 等人，J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及美國第 6,630,579 號專利)；甲胺蝶呤；長春地辛；紫杉烷類，諸如多西他賽、紫杉醇、拉洛紫杉醇、特賽紫杉醇及奧他紫杉醇；單端孢黴烯；及 CC1065。
在另一個實施例中，免疫共軛物包括綴合至酶活性毒素或其片段的本文所述之抗 LY6G6D 抗體及/或抗 CD3 抗體，該酶活性毒素或其片段包括但不限於白喉 A 鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素 A 鏈 (來源於銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白 A 鏈、相思子毒素 A 鏈、莫迪素 A 鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸蛋白 (PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜抑制因子、薑黃素、巴豆毒素、肥皂草抑製劑、白樹毒素、米托菌素、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素和單端孢黴烯族毒素。
在另一個實施例中，免疫共軛物 (immunoconjugate) 包含共軛至放射性原子以形成放射性共軛物的本文所述之抗 LY6G6D 抗體及/或抗 CD3 抗體。在另一個實施例中，多種放射性同位素可用於產生放射性共軛物。實例包括 At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 和 Lu 的放射性同位素。當放射性共軛物用於檢測時，它可能包含用於閃爍顯像研究之放射性原子，例如 tc99m 或 I123，或用於核磁共振 (NMR) 成像 (也稱為磁共振成像，mri) 之自旋標記物，例如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體和細胞毒性劑之共軛物可使用多種雙功能蛋白耦聯劑進行製備，該雙功能蛋白耦聯劑例如 N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯 (SMCC)、亞胺基硫烷 (IT)、亞胺基酸酯的雙功能衍生物 (例如己二酸二甲酯鹽酸鹽，HCl)、活性酯 (例如雙琥珀酰亞胺辛二酸)、醛 (例如戊二醛)、雙疊氮化合物 (例如雙(對疊氮基苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物 (例如雙-(對重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二異氰酸酯 (例如甲苯 2,6-二異氰酸酯) 和雙活性氟化合物 (例如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按照 Vitetta 等人 (Science 238:1098 (1987)) 所述的方法進行製備。用於將放射性核苷酸綴合至抗體的一種示例性螯合劑為碳-14 標記的 1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)。參見 WO94/11026。連接子可以為促進細胞中細胞毒性藥物釋放的「可切割連接子」。例如，可使用酸不穩定之連接子、對肽酶敏感之連接子、光不穩定之連接基、二甲基連接子或含二硫鍵之連接子 （Chari 等人，Cancer Res. 52:127-131 (1992)；美國第 5,208,020 號專利）。
本文之免疫共軛物或 ADC 明確考慮但不限於此等用交聯劑製得之共軛物，該交聯劑包括但不限於可商購獲得 (例如從 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL., U.S.A) 商購獲得) 之 BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC 和磺基-SMPB 以及 SVSB (琥珀酰亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)。
E. 用於診斷和檢測之方法及組成物
在某些實施例中，本發明的任何抗 LY6G6D 及/或抗 CD3 抗體 (例如本發明的雙特異性抗 LY6G6D 抗體，其較佳以高親和力 (例如 20A12.QNTv12) 結合至 LY6G6D，及結合至例如 CD3 的第二生物分子) 可用於檢測生物樣品中 LY6G6D 及/或 CD3 的存在。如本文所用的術語「檢測」，涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物樣品包括細胞或組織。
在一個實施例中，提供了一種用於診斷或檢測方法中的抗 LY6G6D 抗體。在另一方面，提供了一種檢測生物樣品中是否存在 LY6G6D 的方法。在某些實施例中，該方法包括在允許抗 LY6G6D 抗體與 LY6G6D 結合的條件下使生物樣品與本文所述之抗 LY6G6D 抗體接觸，並檢測抗 LY6G6D 抗體與 LY6G6D 之間是否形成複合物。此等方法可為體外 或體內 方法。
在一個實施例中，提供了一種用於診斷或檢測方法中的抗 CD3 抗體。在另一方面，提供了一種檢測生物樣品中是否存在 CD3 的方法。在某些實施例中，該方法包括在允許抗 CD3 抗體與 CD3 結合的條件下使生物樣品與本文所述之抗 CD3 抗體接觸，並檢測抗 CD3 抗體與 CD3 之間是否形成複合物。此等方法可為體外 或體內 方法。
在某些實施例中，提供了標記的抗 LY6G6D 或抗 CD3 抗體。標記包括但不限於直接檢測的標記或部分 (例如螢光、髮色、電子緻密、化學發光和放射性標記)，以及間接檢測 (例如，透過酶促反應或分子相互作用) 的部分，例如酶或配體。例示性標記包括但不限於：放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H 及131 I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；玫瑰紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (美國專利號 4,737,456)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；辣根過氧化物酶 (HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖 6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前體 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶結合使用；生物素/抗生物素蛋白；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基等。
F . 醫藥調配物
本發明的抗 LY6G6D 抗體及/或抗 CD3 抗體的醫藥調配物 (例如，本發明的雙特異性抗 LY6G6D 抗體，其較佳以高親和力 (例如 20A12. QNTv12) 與 LY6G6D 結合，以及結合例如 CD3 的第二生物製劑) 藉由混合具有所需純度的抗體與一種或多種可選擇的醫藥上可接受之載劑 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) 製備成凍乾調配物或水溶液的形式。醫藥上可接受之載體在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒，其包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋胺酸；防腐劑 (例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯化物；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (例如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，例如 鈉；金屬錯合物 (例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，例如聚乙二醇 (PEG)。本文中例示性醫藥上可接受之載體進一步包括間質藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白 (sHASEGP)，例如人類可溶性 PH-20 透明質酸酶糖蛋白，諸如 rHuPH20 (HYLENEX® ，Baxter International, Inc.)。某些例示性 sHASEGP 及用法 (包括 rHuPH20) 描述於美國專利公開號 2005/0260186 和 2006/0104968 中。在一個態樣，sHASEGP 與一種或多種附加的糖胺聚醣酶諸如軟骨素酶結合在一起。
例示性凍乾抗體製劑如美國第 6,267,958 號專利所述。水溶性抗體製劑包括美國第 6,171,586 號專利和 WO2006/044908 中所述的那些，後者所述之製劑包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文所述之製劑還可包含適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。例如，可能期望進一步提供附加治療劑 (例如，化學治療劑、細胞毒性劑、生長抑制劑及/或抗激素劑，諸如本文上文所述的那些)。此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences (第 16 版，Osol, A. 主編，1980)。
可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的適宜的實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式，例如膜或微囊。
用於體內 給藥的製劑通常是無菌的。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。
G . 治療方法和組成物
本發明的任何抗 LY6G6D 抗體及/或抗 CD3 抗體可用於治療方法 (例如，本發明的雙特異性抗 LY6G6D 抗體，其較佳以高親和力 (例如 20A12.QNTv12) 與 LY6G6D 結合，以及以較佳具有高親和力與例如 CD3 之第二生物分子結合)，例如具有抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 及抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 的 LY6G6D TDB 。
在一個方面，提供了一種用作藥物的抗 LY6G6D 抗體。在其他方面，提供抗 LY6G6D 抗體，例如具有抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 LY6G6D TDB 用於治療或延緩細胞增殖性病症 (例如，癌症，例如大腸直腸癌) 的進展。在一些實施例中，癌症為 LY6G6D 陽性癌症 (例如，LY6G6D 陽性大腸直腸癌)。在某些實施例，提供了一種用於治療方法中的抗 LY6G6D 抗體。在某些實施例中，本發明提供抗 LY6G6D 抗體 (例如，具有抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 LY6G6D TDB) 用於治療患有細胞增生性病症之個體的方法，該方法包含對該個體有效量的抗 LY6G6D 抗體。在此實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (如下文所述) 投予個體。在另外的實施例中，本發明提供抗 LY6G6D 抗體 (例如，具有抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或38E4.v1 MD4 ) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 LY6G6D TDB) 用於增強患有細胞增殖性病症之個體的免疫功能。在某些實施例中，本發明提供抗 LY6G6D 抗體，其用於在患有細胞增殖性病症之個體中增強免疫功能的方法，該方法包含投予該個體有效的抗 LY6G6D 抗體 (例如本發明之雙特異性抗 LY6G6D 抗體，其與第二生物分子，例如 CD3 結合)，(例如，活化效應子細胞 (例如，T 細胞，例如 CD8+ 及/或 CD4+ T 細胞)、擴展 (增加) 效應子細胞群體、減少目標細胞 (例如，表現被本發明的抗 LY6G6D 抗體識別的第二生物分子的細胞，例如本發明的雙特異性 TDB 抗體) 的群體及/或殺傷目標細胞 (例如，目標腫瘤細胞)。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。
本發明之另一方面提供了本發明之抗 LY6G6D 抗體在藥物的製造或製備中的用途。在一個實施例中，該藥物用於治療細胞增殖性病症 (例如癌症，例如大腸直腸癌)。在一些實施例中，癌症為 LY6G6D 陽性癌症 (例如，LY6G6D 陽性大腸直腸癌)。在另一個實施例中，藥物用於治療細胞增殖性病症的方法中，該方法包括向患有疾病的個體施用治療有效量的藥物。在此實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (如下文所述) 投予個體。在另一個實施例中，該藥物用於活化效應子細胞 (例如 T 細胞，例如 CD8+ 及/或 CD4+ T 細胞)、擴展 (增加) 效應子細胞群體、減少目標細胞群體 (例如表現 LY6G6D 之細胞群體) 及/或殺傷個體中的目標細胞 (例如目標腫瘤細胞)。在另一實施例中，該藥物用於在患有細胞增殖性病症的個體中增強免疫功能的方法，該方法包含向該個體投予有效藥物的量以活化效應子細胞 (例如T 細胞，例如 CD8+ 及/或 CD4+ T 細胞)、擴大 (增加) 效應子細胞群體、減少目標細胞群體 (例如，表現 LY6G6D 的細胞群) 及/或殺傷目標細胞 (例如，目標腫瘤細胞)。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。
在另一方面，本發明提供一種用於治療細胞增殖性病症 (例如癌症，例如大腸直腸癌) 的方法。在一些實施例中，癌症為 LY6G6D 陽性癌症 (例如，LY6G6D 陽性大腸直腸癌)。在一實施例中，該方法包含向患有此類細胞增殖性病症的個體投予有效量的抗 LY6G6D 抗體，例如具有抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 LY6G6D TDB。在此實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (如下文所述) 投予個體。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。
在另一方面，本發明提供一種用於在患有細胞增殖性病症之個體中增強免疫功能的方法。在一實施例中，該方法包含向該個體投予有效量的抗 LY6G6D 抗體 (例如，具有抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 LY6G6D TDB) 以活化效應子細胞 (例如 T 細胞，例如 CD8+ 及/或 CD4+ T 細胞)、擴展 (增加) 效應子細胞群體、減少目標細胞群體 (例如，表現 LY6G6D 的細胞群體) 及/或殺傷目標細胞 (例如目標腫瘤細胞)。在一個實施例中，「個體」為人。
在另一方面，本發明提供一種用於治療大腸直腸癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌或腺癌 (例如，大腸直腸腺癌、胃腺癌或胰腺腺癌) 的方法，該腺癌可為轉移性腺癌 (例如，轉移性大腸直腸腺癌、轉移性胃腺癌或轉移性胰腺腺癌)，藉由投予有效量的本發明的抗 LY6G6D 抗體，例如本發明的雙特異性 TDB 抗體，例如抗 Ly6G6D 靶向 TDB，例如具有高親和力的抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 Ly6G6D TDB。在某些方面，癌症具有「微衛星穩定型」 (「MSS」) 的微衛星不穩定性狀態或「微衛星不穩定性低」 (「MSI-L」)。在其他方面，癌症具有「微衛星不穩定性高」 (「MSI-H」) 的微衛星不穩定性狀態。在一些方面，該癌症為 LY6G6D 陽性。
在一些方面，本發明提供用於治療大腸直腸癌的方法，該大腸直腸癌例如為具有「微衛星穩定型」 (「MSS」) 的微衛星不穩定性狀態或「微衛星不穩定性低」 (「MSI-L」) 的結直腸癌，藉由投予有效量的本發明的抗 LY6G6D 抗體，例如本發明的雙特異性 TDB 抗體，例如抗 Ly6G6D 靶向 TDB，例如具有高親和力抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 Ly6G6D TDB。
在另一方面，本發明提供例如用於上述任何一種治療方法的醫藥調配物，其包含本文所提供之任何抗 LY6G6D 抗體 (例如，具有抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 LY6G6D TDB)。在一具體例，醫藥調配物包含本文所提供之任何抗 LY6G6D 抗體及醫藥上可接受之載劑。在另一方面，醫藥製劑包含本文所提供之任何抗 LY6G6D 抗體及至少一種另外治療劑 (如下文所述)。
本發明之抗體 (及任何其他治療劑) 可透過任何合適的方式給藥，包括腸胃外、肺內和鼻內給藥，並且如果需要局部治療，則可以採用病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。在一些實施例中，該抗體藉由靜脈內給藥投予。在其他實施例中，該抗體藉由皮下給藥投予。在一些實施例中，在病患中藉由皮下注射投予的抗 LY6G6D 抗體比藉由靜脈內注射投予相同抗 LY6G6D 抗體呈現出較小的毒性反應。給藥可透過任何合適的途徑進行，例如透過注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫給藥還是長期給藥。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次給藥、快速注射給藥和脈衝輸注。
本發明之抗體將按照與良好醫學實踐一致的方式進行配製、給藥和施用。此背景中考慮的因素包括待治療的具體障礙、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、施用方法、施用日程及醫療從業者已知的其他因素。該抗體並非必須、但可以視情況與一種或多種目前用於預防或治療所述疾病之藥劑一起配製。此等其他治療劑的有效量取決於存在於調製劑中存在的抗體量、病症或治療的類型以及上文討論的其他因素。這些通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任何劑量和藉由任何途徑使用。
對於疾病的預防或治療，本發明之抗體的適當劑量 (例如，抗 LY6G6D 抗體，例如，LY6G6D TDB 具有抗 CD3 臂 (例如，38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12)) 將取決於待治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重度和病程、為了預防或是治療的目的施用該抗體、之前的治療、患者的臨床病史和對該抗體的反應及主治醫師的判斷。在一次或一系列的治療中適宜地對患者施用抗體。
作為一般建議，被投予人類的治療有效量的抗 LY6G6D 抗體 (例如，具有抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 LY6G6D TDB) 將在約 0.01 至約 100 mg/kg 病患體重的範圍內，無論藉由一種或多種給藥方式。在一些實施例中，使用的抗體為約 0.01 至約 45 mg/kg、約 0.01 至約 40 mg/kg、約 0.01 至約 35 mg/kg、約 0.01 至約 30 mg/kg、約 0.01 至約 25 mg/kg、約 0.01 至約 20 mg/kg、約 0.01 至約 15 mg/kg、約 0.01 至約 10 mg/kg、約 0.01 至約 5 mg/kg 或約 0.01 至約 1 mg/kg，舉例而言。在一個實施例中，在 21 天週期的第 1 天，以約 100 mg、約 200 mg、約 300 mg、約 400 mg、約 500 mg、約 600 mg、約 700 mg、約 800 的、約 900 mg、約 1000 mg、約 1100 mg、約 1200 mg、約 1300 mg 或約 1400 mg 的劑量向人類投予本文所述之抗 LY6G6D 抗體。該劑量可以單劑量或以多劑量 (例如 2 或 3 劑量) 投予，例如輸注。對於在幾天或更長時間內重複給藥，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。抗體的一種例示性劑量將在從 0.05 mg/kg 至約 10 mg/kg 的範圍內。因此，可以對患者施用約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任意組合)。此等劑量可以間歇施用，例如每週或每三周施用 (例如，使得患者接受約 2 種至約 20 種或例如約六種劑量的抗 LY6G6D 抗體)。可以施用初始較高的負荷劑量，然後施用一種或多種較低的劑量。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。
H. 額外治療劑
本發明的抗體可單獨或與其他藥劑組合使用於治療。例如，本發明之抗體或雙特異性抗原結合分子可以與至少一種其他治療劑聯合施用。在某些實施例中，額外的治療劑是化學治療劑、生長抑製劑、細胞毒性劑、用於放射療法的藥劑、抗血管生成劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑或其他藥劑，例如表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor，EGFR) 拮抗劑 (例如 ，酪胺酸激酶抑製劑)、HER1/EGFR 抑製劑 (例如 ，厄洛替尼 (erlotinib) (TARCEVATM ))、血小板衍生生長因子抑制劑 (例如 ，GLEEVECTM (甲磺酸伊馬替尼 (Imatinib)))、COX-2 抑製劑 (例如 ，塞來昔布 (celecoxib))、干擾素、細胞因子、除本發明抗 CD3 抗體以外的抗體，例如與以下一種或多種目標結合的抗體：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA VEGF 或 VEGF 受體、TRAIL/Apo2、PD-1、PD-L1、PD-L2或其他生物活性或有機化學劑。
上面提到的此等聯合療法涵蓋聯合施用 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的醫藥組成物中)，以及單獨施用，在這種情況下，本發明之抗體的施用可在施用附加的一種或多種治療劑之前、同時和/或之後發生。在一個方面，投於本發明之一種或多種抗 LY6G6D 抗體及投於另外治療劑彼此發生在約一個月內，或發生在約一週、兩週或三週內，或發生在約一天、二天、三天、四天、五天、或六天內。本發明的抗 LY6G6D 抗體 (例如與第二生物分子 (例如 CD3) 結合的本發明雙特異性抗 LY6G6D 抗體) 亦可與放射療法組合使用。在一些實施例中，附加療法可為手術、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法，單株抗體療法或前述的組合。附加療法可為採取輔助療法或前輔助療法 (neoadjuvant therapy) 的形式。在一些實施例中，該附加療法為投予小分子酶抑製劑或抗轉移劑。在一些實施例中，附加療法為投予副作用限制劑 (例如，旨在減輕治療副作用的發生及/或嚴重性的藥劑，例如抗反胃劑等)。在一些實施例中，該附加療法為手術。在一些實施例中，該附加療法為放射療法與手術的組合。
在一些實施例中，Ly6G6D TDB (例如具有抗 CD3 臂 (例如 38E4.v1 MD1 或 38E4.v1 MD4) 及抗 Ly6G6D 臂 (例如 20A12.QNTv12) 的 LY6G6D TDB) 被共投予 (同時，作為單一或多種組成物 (例如，調配物)) 與一種或多種額外治療劑，例如下列之任何一種、二種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或全部十一種：FOLFOX (奧沙利鉑 (ELOXATINTM ) 合併 5-氟尿嘧啶及亞葉酸)、卡培他濱 (XELODA®)、5-氟尿嘧啶 (5-FU)、CapeOx (XELOX；卡培他濱與奧沙利鉑)、亞葉酸 (葉酸)、貝伐單抗 (AVASTIN®)、西妥昔單抗 (ERBITUX®)、帕尼單抗 (VECTIBIX®)、瑞格非尼 (STIVARGA®)、伊立替康 (CPT-11；CAMPTOSAR®) 及 FLOX (氟沙利鉑與 5-氟尿嘧啶)。在其他實施例中，在一種或多種額外的治療劑之前投予 Ly6G6D TDB，該額外的治療劑例如下列之任何一種、二種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或全部十一種：FOLFOX (奧沙利鉑 (ELOXATINTM ) 合併 5-氟尿嘧啶及亞葉酸)、卡培他濱 (XELODA®)、5-氟尿嘧啶 (5-FU)、CapeOx (XELOX；卡培他濱與奧沙利鉑)、亞葉酸 (葉酸)、貝伐單抗 (AVASTIN®)、西妥昔單抗 (ERBITUX®)、帕尼單抗 (VECTIBIX®)、瑞格非尼 (STIVARGA®)、伊立替康 (CPT-11；CAMPTOSAR®) 及 FLOX (氟沙利鉑與 5-氟尿嘧啶)。在其他實施例中， 在一種或多種額外的治療劑之後投予 Ly6G6D TDB，該額外的治療劑例如下列之任何一種、二種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或全部十一種：FOLFOX (奧沙利鉑 (ELOXATINTM ) 合併 5-氟尿嘧啶及亞葉酸)、卡培他濱 (XELODA®)、5-氟尿嘧啶 (5-FU)、CapeOx (XELOX；卡培他濱與奧沙利鉑)、亞葉酸 (葉酸)、貝伐單抗 (AVASTIN®)、西妥昔單抗 (ERBITUX®)、帕尼單抗 (VECTIBIX®)、瑞格非尼 (STIVARGA®)、伊立替康 (CPT-11；CAMPTOSAR®) 及 FLOX (氟沙利鉑與 5-氟尿嘧啶)。
i. 生長抑製劑
在一些方面，額外的治療劑為生長抑製劑。例示性的生長抑製劑包括在 S 期以外的地方阻斷細胞週期進程的藥劑，例如誘導 G1 阻滯的藥物 (例如 DNA 烷化劑，如他莫昔芬、強體松、達卡巴嗪、甲氧乙胺、順鉑、甲胺蝶呤、5-氟尿嘧啶或 ara-C) 或誘導 M 期阻滯的藥物 (例如長春新鹼、長春鹼、紫杉烷 (例如紫杉醇和多西紫杉醇)、多柔比星、表柔比星、道諾黴素、依托泊苷或博來黴素)。
ii. 放射療法
在一些方面，額外的治療劑是放射療法。放射療法包括使用定向 γ 射線或 β 射線對細胞造成足夠的損害，從而限制其正常發揮功能的能力或完全破壞細胞。典型治療為給予一次給藥，且典型劑量為每天 10 到 200 單位 (Grays (Gy) )。
iii. 細胞毒性劑
在一些方面，額外的治療劑是細胞毒性劑，例如抑製或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素 (例如，At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 和 Lu 的放射性同位素)；化學治療劑或藥物 (例如，甲胺蝶呤、阿黴素、長春花生物鹼 (長春新鹼、長春鹼、依托泊苷)，多柔比星、黴法蘭、絲裂黴素 C、氯芥苯丁酸、道諾黴素或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核酸酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變異體；以及抗腫瘤或抗癌劑。
iv. 免疫調節劑
在一些方面，額外的治療劑是免疫調節劑，例如 PD-L1 軸結合拮抗劑，其可以是 PD-1 結合拮抗劑、PD-L1 結合拮抗劑或 PD-L2 結合拮抗劑。PD-1 (程序性死亡 1) 在本技術領域中亦稱為「程序性細胞死亡 1」、「PDCD1」、「CD279」及「SLEB2」。例示性的人類 PD-1 顯示於 UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. Q15116。PD-L1 (程序性死亡配體 1) 在本領域中也稱為「程序性細胞死亡 1 配體 1」、「PDCD1LG1」、「CD274」、「B7-H」及「PDL1」。例示性的人類 PD-L1 顯示於 UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. Q9NZQ7.1。PD-L2 (程序性死亡配體 2) 在本領域中亦稱為「程序性細胞死亡 1 配體 2」、「PDCD1LG2」、「CD273」、「B7-DC」及「PDL2」。例示性的人類 PD-L2 顯示於 UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. Q9BQ51。在某些情況下，PD-1，、D-L1 及 PD-L2 為人類 PD-1、PD-L1 及 PD-L2。
在一些實施例中，PD-1 結合拮抗劑為抑制 PD-1 與其結合配體伴侶之結合的分子。在一個具體態樣，PD-1 結合配體伴侶為 PD-L1 及/或 PD-L2。在一些實施例中，PD-L1 結合拮抗劑為抑制 PD-L1 與其結合配體伴侶之結合的分子。在一個具體態樣，PD-L1 結合伴侶為 PD-1 及/或 B7-1。在一些實施例中，PD-L2 結合拮抗劑為抑制 PD-L2 與其結合配體伴侶之結合的分子。在具體方面，PD-L2 結合配體伴侶為 PD-1。拮抗劑可為抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
在一些方面，PD-1 結合拮抗劑為抗 PD-1 抗體 (例如，人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體)。
在一些方面，PD-L1 結合拮抗劑為抗 PD-L1 抗體，例如，如下所述。在一些方面，抗 PD-L1 拮抗劑抗體能夠抑制 PD-L1 和 PD-1 之間及/或 PD-L1 和 B7-1 之間的結合。在一些方面，抗 PD-L1 拮抗劑抗體為單株抗體。在一些方面，抗 PD-L1 拮抗劑抗體為抗體片段，其選自由下列所組成之群組：Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 和 (Fab')2 片段。在一些方面，抗 PD-L1 拮抗劑抗體為人源化抗體。在一些方面，抗 PD-L1 拮抗劑抗體為人抗體。
在一些方面，免疫檢查點抑製劑為 針對共抑制分子的拮抗劑 (例如，CTLA-4 拮抗劑 (例如抗 CTLA-4 抗體)、TIM-3 拮抗劑 (例如抗 TIM-3抗體) 或 LAG-3 拮抗劑 (例如抗 LAG-3 抗體))，或其任何組合。
在一些方面，免疫檢查點抑製劑為針對 TIGIT 的拮抗劑 (例如，抗 TIGIT 抗體)。
在某些方面，該額外的治療劑為 5-氟尿嘧啶 (5-FU)；伊立替康；卡培他濱；奧沙利鉑；西妥昔單抗、貝伐單抗；帕尼單抗；阿柏西普；雷戈非尼；雷莫昔單抗，TAS-102 (三氟吡啶及替吡西酯)；派姆單抗、尼伏魯單抗、納武單抗及伊匹單抗；威羅非尼；FOLFOXIRI 及貝伐單抗，一種 BRAF 及/或 MEK 抑製劑組合的抗 EGFR 治療，視情況包括細胞毒劑；FOLFOX/FOLFIRI 及抗 EGFR 治療；或 FOLFOX/FOLFIRI/FOLFOXIRI 及貝伐單抗。
I. 製成品
本發明的另一方面提供包含用於治療、預防和/或診斷上述疾病的製成品。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。容器可以由多種材料例如玻璃或塑膠形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防和/或診斷疾病的另一組成物結合使用，並可能具有無菌入口 (例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或藥品說明書指示該組成物用於治療所選擇的疾病。此外，該製品可以包括 (a) 其中包含有組成物的第一容器，其中，該組成物包含本發明之抗體；及 (b) 其中包含有組成物的第二容器，其中，組成物包含其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此實施例中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的藥品說明書。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
III. 實例
以下為本發明之方法和組成物的實例。應理解，可鑒於上述所提供之一般說明來實踐各種其他方面，且該等實例不意欲限制申請專利範圍之範圍。
實例 1.  LY6G6D 為大腸直腸癌細胞的表面標記，且在正常組織中的表現有限
使用癌症基因組圖譜 (The Cancer Genome Atlas，TCGA) 及免疫組織化學 (IHC) 評估淋巴細胞抗原 6 家族成員 G6D (LY6G6D) (SEQ ID NO：75) 在人類正常及腫瘤組織中的表現 (Grossman 等人，New England Journal of Medicine ，375(12): 1109-1112) and Genotype-Tissue Expression Project (GTEx) data (Pierson 等人，PLoS Comput Biol, 11，e1004220，2015)。
A.     LY6G6D 的表現
圖 1A 在 TCGA 數據中顯示 LY6G6D 和淋巴細胞抗原 6 家族成員 G6F (LY6G6F) 在人組織中的正常組織及腫瘤組織中的表現。在腫瘤組織中，具有 LY6G6D 最高表現示值的是結腸，而 LY6G6D 僅在結腸腫瘤組織中明顯過表現。正常結腸組織顯示 LY6G6D 的一些表現，儘管其水平要低得多。值得注意的 LY6G6F 表現 (＞ 1 nRPKM) 主要發現於結腸腫瘤組織中。圖 1B 顯示在公共 GTEx Project 數據中正常組織中的 LY6G6D 及 LY6G6F 的表現。LY6G6D 在前列腺、睾丸、子宮頸和陰道組織中表現最高，在正常結腸組織及部分皮膚樣品中發現相當多的表現。LY6G6F 在血液中表現最高，其次是睾丸、脾臟、甲狀腺及肺組織。
B.     LY6G6D 在 MSS 及 MSI-L CRC 中的表現
LY6G6D 在具有微衛星穩定型 (MSS) 之微衛星不穩定性 (MSI) 狀態、微衛星不穩定性低 (MSI-L) 或微衛星不穩定性高 (MSI-H) 的大腸直腸癌 (CRC) 中表現最高；MSS CRC 與更差的預後相關 (圖 1C)。
C.     LY6G6D 的 IHC 染色
針對 LY6G6D 進行人類 CRC 腫瘤染色。藉由 IHC，約 20% 的原發性 CRC 病例被鑑定為 LY6G6D 陽性。評估 141 個組織微陣列 (Tissue MicroArray，TMA) 原發性結腸腫瘤。21 個腫瘤顯示弱的 (1+) IHC 染色 (14%)，5 個顯示中度 (2+) 染色，且 4 個顯示強的 (3+) 染色 (6-7% 結合) (圖 2A)。圖2B-2D 顯示在原發性結腸腫瘤組織中對於 LY6G6D 弱的 (1+)、中度 (2+) 和強的 (3+) IHC 染色。
實例 2. 在抗 LY6G6D 1G4 臂， 抗 LY6G6D 選殖生成、表位作圖及人源化的製造責任
A. 抗 LY6G6D 1G4 臂中的製造責任
包含嵌合抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 38E4.v1 臂的抗 LY6G6D TDB 證明在活體外 HT55 細胞 (人結腸癌細胞株) 的殺傷 (圖 3A) 及在NSGTM 小鼠中活體內 對抗異種移植 LS1034 和 HT55 腫瘤的活性 (圖3B)。1G4 為小鼠融合瘤抗體；嵌合 1G4 (ch1G4) 為小鼠/人類嵌合抗體，其中 1G4 的小鼠變異域 (VH 及 VL) 分別與在 CH2 中具有 N297G 胺基酸取代突變的人類重鏈恆定域 (CH1、CH2 及 CH3) 基因融合，並包含一個「臼狀物」區和一個人類輕鏈恆定域 (CL)。產生 1G4 臂的人源化型式，並顯示活體外 及活體內 功效 (圖3C 和 3D)
對於人源化 1G4 輕鏈 (LC) CDR2 (WASTRIS；SEQ ID NO：110) 的胺基酸殘基 W50，鑑定分子評估 (molecule assessment，MA) 責任。簡而言之，測試人源化 IG4 在以 AAPH (2,2-偶氮雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽) 之化學條件下的緊迫，AAPH 是一種已知會產生自由基的小分子 (參見，例如 Ji et al.,J. Pharm. Sci. 98 (12)：4485-4500，2009)，以及在不同 pH 的熱條件下的緊迫 (在 40°C，pH 5.5 的情況下進行為期兩週的熱應力測試)。輕鏈殘基 W50 被鑑定為在 AAPH 緊迫後具有增加的氧化 (72.0% 氧化)。
熱應力測定法模擬產品貨架期的穩定性。將樣品緩衝液交換成 20 mM His 乙酸鹽，240 mM 蔗糖，pH 5.5，並稀釋至 1 mg/mL 的濃度。將每個樣品 1 mL 在 40°C 受緊迫 2 週，第二個在 -70°C 下保存作為對照。然後使用胰蛋白酶消化兩個樣品，以產生可被用於液相層析 (LC)-質譜 (MS) 分析的肽。對樣品中的每種肽，皆獲得滯留時間 (如使用液相層析法測得) 以及高分辨率準確的質量及肽離子碎斷作用訊息 (胺基酸序列訊息)。從數據集中以 +/-10 ppm 的窗口對所關注的肽 (例如天然及修飾的肽離子) 生成萃取的離子層析圖 (XIC)，並對峰進行積分以確定面積。藉由將 (修飾的肽的面積) 除以 (修飾的肽的面積加上天然肽的面積) 乘以 100 得到的每個樣品的修飾相對百分比。
此外，1G4 臂未能通過瞬時轉染測定以進行生產 (圖30)。W50 被所有 18 個替代胺基酸 (不包括 Cys) 置換，但結合親和力似乎受到置換的影響。最後，如圖 3A 所示，僅當與高親和力 38E4.v1 臂配對時 1G4 臂才有效，而與低親和力 40G5c 配對則無效。因此進行針對 LY6G6D 抗體的新發現活動。
B . 兔抗 huLY6G6D mAbs 的產生
在兔中生成抗人類 LY6G6D (huLY6G6D) 單株抗體 (mAb)。以人類 Ly6G6D 免疫紐西蘭白兔，並使用 Offner et al.PLoS ONE, 9(2), 2014 中的改良協定，自免疫兔中分離單獨的 B 細胞。改善的工作流程包括直接 FACS 將 IgG + huLy6G6D + B 細胞分選到單個孔中。利用 ELISA 測定 B 細胞培養上清液與人 Ly6G6D 及無關對照蛋白之結合。裂解 Ly6G6D 特異性 B 細胞，並立即在 -80o C 下冷凍保存直至進行分子選殖。如先前所述 (Offner et al.PloS ONE ，9 (2)，2014)，將各兔 B 細胞單株抗體變異區 (VH 及 VL) 從萃取的 mRNA 選殖至表現載體中。個別的重組兔抗體在 Expi293 細胞中表現，然後用蛋白 A 純化，然後對純化的抗 Ly6G6D 抗體進行功能活性測定及動力學篩選。產生約 280 個抗 Ly6G6D ELISA+ 殖株。如下所述，隨後將 96 個殖株合聚類成四個不同的表位聚類 (Epitope Binning) 組。
C . 使用醣工程化的 LY6G6D 的動力學分析和抗 LY6G6D 表位聚類
將基於陣列的 SPR 成像系統 (Carterra ®, USA) 用於一組 96 種兔抗 huLY6G6D 單株抗體 (包括1G4) 的動力學測試和表位聚類。為了進行表位聚類，對 LY6G6D 多肽進行工程化，在整個分子表面導入醣基化位點 (圖4A 及 4B)。選擇位點是為了易於以對天然序列的破壞最小方式添加醣基化位點。測試候選抗 LY6G6D 抗體與醣工程化 LY6G6D 多肽的相互作用 (圖 4B)。將純化的抗體在 10 mM 乙酸鈉緩衝液 (pH 4.5) 中稀釋成 10 µg/ml。使用胺偶聯，使用SPRi-Continuous Flow MicrospotterTM (Carterra®, USA) 將抗體直接固定在 SPR sensorprism CMD 200M 晶片 (XanTec Bioanalytics，Germany) 上，以生成 96 種抗體的陣列。為了進行分析，使用 IBIS MX96 SPRi (Carterra®, USA) 評估結合於固定的配體的分析物。為了進行動力學分析，將人類 Ly6G6D 以 3 倍稀釋度從 0 到 300 nM 注射 3 分鐘，然後解離 10 分鐘。對於表位聚類，首先將人類 Ly6G6D 的每個醣基化突變體以 50 nM 注射 4 分鐘，然後以 10 µg/ml個別單株抗體注射第二個 4 分鐘。在循環之間用 10 mM 甘胺酸，pH 1.5 再生表面。實驗是在 25°C 的 HBS-T 緩衝液的電泳緩衝液 (0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，0.05% 表面活性劑 P20).中進行。使用 Scrubber 2.0 (BioLogic Software) 處理動力學數據，並使用 Wasatch binning 軟體工具 (Carterra®，USA) 處理表位聚類數據。
1G4 及兔抗 LY6G6D 抗體 20A12 與 LY6G6D 多肽的結合在具有 G99N.L101S 胺基酸取代突變的醣基化 LY6G6D 多肽中被破壞 (圖 4B)。其他兔抗 LY6G6D 抗體的結合被 P60A.P61S、A73N.H75S、V80S、V80N、T82N 或 D87N 胺基酸取代突變破壞 (圖 4B)。基於醣工程化測定的結果，將兔抗體殖株及和 1G4 置於四個不同的表位筐 (bin) 中 (圖4E)：筐 1 包括三組序列，且包括 1G4、20A12、6E10 及 4H7；筐 4 包括六組序列，並包括 f.16D7；而筐 3 及 4 各包括三組序列。在圖 4D 中，受醣基化突變影響的胺基酸殘基用顏色編碼，且筐 1、2、3 及 4 以下底線標出 (SEQ ID NO：88)。如圖 4C 所示，抗 LY6G6D 抗體 1G4 和 16D7 結合抗原相對側上的表位。
D. 基於細胞的細胞毒性測定
為了評估新的兔抗體組靶向 Ly6G6D 陽性腫瘤細胞株的能力，製備雙特異性T細胞依賴性抗體 (TDB)，該抗體包含與不同兔抗 LY6G6D 臂配對的抗 CD3 40G5c 臂。將來自每個表位筐 (筐 1、2、3 和 4) 的代表性兔抗體重新編排成具有含「杵狀物」區之 Fc 區、嵌合兔變異域及具有 N297G 和 T366W 突變的人恆定域的半抗體。純化後，將「杵狀物」抗 LY6G6D 臂與具有含「臼狀物」區之 Fc 區的抗 CD3 40G5c 臂退火，並測定其在活體外 結合並殺傷 HT55 細胞 (圖4F、4G 和 13A-13E)。來自筐 1 的兔抗體 (例如 20A12 和 6E10) (包括 1G4 的筐) 被發現最有效結合並殺死 HT55 細胞。
E. 動力學分析
使用 BIAcore™ T200 機器 (GE Healthcare Life Sciences) 確定抗 LY6G6D 兔抗體與 LY6G6D 的結合親和力。簡而言之，BIAcore™ 研究級 CM5 晶片已根據供應商的說明，以1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺 (EDC) 及 N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 試劑活化。為了進行動力學測量，將 Ly6G6D 蛋白質與晶片偶合，以在每個流通槽中獲得約 100 個反應單位 (RU)。未反應的偶聯基團被 1M 乙醇胺阻斷。兔抗體表現為具有兔變異域及人恆定域的嵌合抗原結合片段 (Fabs)。在 37°C 下，將 Fabs 之十倍系列稀釋液以 30 μL/min 的流速注入 HBS-P 緩衝劑中。結合率 (ka) 和解離率 (kd) 使用 1:1 Langmuir 結合模型 (BIAcore™ T200 評估軟體 2.0 版) 進行計算。平衡解離常數 (KD ) 通過比率 kd/ka 計算得出 (圖 4H)。
F. 兔抗體的人源化
如下所述，將筐 1 兔單株抗體 20A12 和 6E10 人源化。根據 Kabat 等人，Sequences of proteins of immunological interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1991) 進行殘基編號。
20A12 的人源化
兔抗體的人源化中的一個挑戰是兔和人類序列之間的差異大於囓齒動物與人類序列之間的差異。因此，將多個骨架應用於 20A12 的人類化。
每個兔抗體的高度變異區，即 VL 域中的位置 24-34 (L1)、50-56 (L2) 及 89-97 (L3)，以及 VH 域中的位置 26-35 (H1)、50-65 (H2) 及 95-102 (H3) 分別移植到兩個人類接受體骨架中。rb.20A12 輕鏈的變體是根據人類輕鏈種系序列 hIGHV.1-5、hIGKV.1-39 及 hIGKV.4-1生成的，rb.20A12 重鏈的變體是根據人類重鏈種系序列 hIGHV.3-23 及 hIGHV.3-30 生成的 (圖31B、31C 和 40A)。選擇這些種系序列是基於它們的高血清流行率及與 rb.20A12 的高度序列同一性 (圖31C 和 31D)  選擇 VL CDR KV1-5 * 01 和 VH CDR HV3-23 * 01 進行進一步分析。包含完全人骨架區的 20A12 序列在圖 32D 中顯示為 L2H10。
將人源化 20A12 變體評估為 Fab。在所有推定的兔游標位上修飾人類種系骨架 (VL 和 VH)，以使每個游標位均包含兔抗體序列中所存在的胺基酸 (即 rb20A12)。根據已知的囓齒動物游標位確定兔游標位。其中所有重鏈和輕鏈游標位都已回復為兔胺基酸的變體在圖 32D 中稱為 L1H1 (hu20A12.L1H1)。其中所有重鏈和輕鏈兔游標位均包含人類胺基酸的變體稱為 L2H10。為了評估每個兔游標位是否影響抗體或 huLY6G6D 的結合親和力，將兔游標位分別回復為對應的人類序列的胺基酸，即 KV1-5 * 01 或 HV3-23 * 01。製備一個輕鏈變體 L2，以八個額外的重鏈變體 H2-H9。L2 包含相對於 KV1-5 * 01 序列的 P43A 胺基酸取代突變。H2-H9 分別包含相對於 HV3-23 * 01 序列的 Q2V、I48V、A49S、K71R、S73N、V78L、F91Y 及 P105R 胺基酸取代突變。使用 BIAcore 測定法將變體抗體的結合親和力與包含完全人骨架序列 (L2H10) 的親本殖株的結合親和力進行比較 (圖 32D)。基於上述變體抗體的結合親和力評估，確定兔重鏈殘基 S73、T76、V78 和 P105 為關鍵的兔游標殘基。
圖 32C 顯示人源化 20A12 的完善型式 (polished version)，其包含兔重鏈殘基 S73、T76、V78 和 P105，以及在所有其他兔游標位的人類殘基。如下所述，亦修飾了完善的人源化 20A12 以包含 C35S 或 C35I 和 C50A 胺基酸取代。S73、V78 和 P105 兔游標殘基，額外的兔游標殘基 T76 以及 C35S 和 C50A 胺基酸取代也接枝至人類種系 HV3-30 * 1 上，從而生成 rb.20A12 的額外人源化、完善型式 。
約 20-40% 的兔抗體含有額外的半胱胺酸殘基。例如，兔 20A12 殖株在 CDR-H1 和 CDR-H2 中含有半胱胺酸對 (CDR-H1 處的 C35 和 CDR-H2 處的 C50) (圖 31A；圖 40B)。通常在這兩個位置發現半胱胺酸並被認為形成二硫鍵。為了去除可能是發展中的半胱胺酸對，將 rb.20A12 的 C35 和 C50 同時突變為 C35S-C50A、C35S-C50S、C35I-C50A、C35I-C50S、C35I-C50I 及 C35G-C50T，並評估變體與 LY6G6D 的結合。以具有兔變異域和人恆定區的嵌合 Fab 的形式評估每種變體。發現變體 rb20A12.IA (C35I-C50A) 保留親本的大部分親和力 (KD 0.86 nM) (圖34A 和 34C)。因此，C35I-C50A 突變包括於在上述的完善人源化 20A12 重鏈序列中。
另外，兔 20A12 輕鏈序列在 CDR3 中包含醣基化基序 (motif) (NNT) (圖 32A 和圖 40B)，並且證實此位點被醣基化。為了去除此醣基化位點，在兔/人類嵌合體主鏈中製造一系列變體：NNT 以 QNT、QNV、SNA、SNV、ANT、GNT、NNV 或 NNA 取代 (圖 34B)。將 QNT、QNV、SNV、GNT 和 SNA 取代基併入上述完善人源化 20A12 輕鏈序列中，並測定與 LY6G6D 的結合 (圖34B 至圖 34D)。
20A12.QNTv12
選擇 20A12.QNTv12 變體作為人源化 rb.20A12 抗體。20A12.QNTv12
包含 KV1-5 * 01 的 VL 骨架區；CDR HV3-23 * 01 的 VH 骨架區，經胺基酸取代 S73、T76、V78 和 P105 修飾 (來自兔游標位)；和 rb.20A12 的 CDR，分別用 I 和 A 取代 CDR-H1 和 CDR-H2 中的半胱胺酸殘基，並在 CDR-L3 的醣基化位點進行從 NNT 到 QNT 的突變 (圖32A、40B 和 40C)。對於 rb.20A12，KD 為 0.23 nM，對於 20A12.QNTv12 為 0.14 nM。
與 LY6G6D 結合
將人源化 rb.20A12 變體 20A12.QNTv12、人源化 rb.6E10 變體 6E10.v114 及抗 LY6G6D 1G4 臂與抗 CD3 38E4v1 或 40G5c 臂配對成為 TDB，並在 BIAcore® 測定中測試與人和食蟹獼猴 LY6G6D 的親和力。另外測定兔 20A12、兔 6E10 及人源化 20A12.QNTv12 及 20A12.SNVv12 作為抗原結合片段 (Fabs) 的結合。LY6G6D-Fc 直接固定在晶片上，TDB 在 37°C 下流過，除了 rb6E10 Fab外 (其在 25°C 下測定)，結果顯示在下表 2 中。
表 2.  20A12 和 6E10 Fab 和 TDB 變體的結合特性
樣本 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
rb20A12 Fab 4.12E +05 1.76E -04 4.26E -10
hu20A12.QNTv12 fab 1.67E +06 2.27E -04 1.36E -10
hu20A12.SNVv12 fab 2.18E +06 4.26E -05 1.95E -11
hu20A12.QNTv12/38E4v1 TDB 2.20E +05 4.44E -04 2.02E -09
hu20A12.QNTv12/40G5c TDB 8.06E +04 4.53E -04 5.62E -09
rb6E10 Fab (@25o C) 2.00E +05 6.37E -05 3.18E -10
hu6E10.v114/38E4v1 TDB 1.98E +05 3.12E -04 1.58E -09
hu6E10.v114/40G5c TDB 1.01E +05 2.92E -04 2.89E -09
瞬時轉染生產測定
在瞬時轉染生產測定中評估兩種人源化的 rb.20A12 變體 20A12.QNTv1 和 20A12.QNTv12。轉染到中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞的一天後，將生長培養基替換為專有的生產培養基。加入生產培養基一天後收集上清液，並使用 Fc 結合 ELISA 評估上清液的抗體力價。進行產量相對於 38E4v1 的標準化。提供 aFGFR1.nob 作為對照。20A12.QNTv.1 和 20A12.QNTv12 都具有可接受的產量 (圖 37)。
20A12.v1、完善的 20A12.v1 (20A12.QNTv12) 及 1G4 皆在 BV ELISA 測定 (一種用於非典型清除風險的活體外 測試；Hotzel et al.,MAbs ，4：753-760，2012) 中皆顯示良好的結果，當與 38E4v1 或 40G5c 抗 CD3 臂配對時 (圖 38)。將結果對於抗 Lye6E 進行標準化，抗 Lye6E 為一種在 BV ELISA 測定中用作高結合信號的對照的抗體。
使用熱應力和 AAPH 氧化緊迫測試評估包含抗 LY6G6D 臂 20A12.QNTv12 及抗 CD3 臂 38E4v1 或 40G5c 的 LY6G6D TDB 的分子評估責任。未鑑定出責任 (圖 39)。
將人源化的 rb.20A12 變體 20A12.QNTv12、人源化的 rb.6E10 變體 6E10.v114 及抗 LY6G6D 1G4 臂與抗 CD3 38E4v1 臂配對作為 TDB，並在 BIAcore® 測定中測試對人類及食蟹獼猴 LY6G6D 的親和力。LY6G6D-Fc 直接固定在晶片上，在37°C的溫度下將 TDB 流過，含 1G4 臂的 TDB 的 KD 實質上高於人類和食蟹獼猴 LY6G6D 的 20A12.QNTv12 臂或 6E10.v114 臂 (圖 36)。
rb.6E10 的人源化
將多個骨架應用於 6E10 的人源化。rb6E10 VL CDR 被接枝至人類種系序列 KV1-5 * 01 和 KV3-20 * 01，而 VH CDR 被接枝至人類種系序列 HV3-53 * 01 和 HV3-48 * 01 (圖 43A)。選擇這些種系序列是基於它們的高血清流行性及與 rb.6E10 的高度序列同一性 (圖 33A 和 33B)。另外，如上 20A12 所述，将來自兔抗體之所有 VL 及 VH 游標位置移植到其相应的人種系骨架中。在游標位具有所有兔胺基酸的移植物稱為型式 1 (KV1-5/HV3-53 為 hu.6E10.v1a；KV1-5/HV3-48 為 hu.6E10.v1b；K3-20/HV3-53 為 hu.6E10.v1c)。對於各種系製作五個額外的輕鏈變體 (KV1-5：L2-L6 和 KV3-20: L2-L6) 及十個額外的重鏈變體 (H2-H11) 用於 HV3-53。對於 KV1-5 輕鏈，基於上述變體抗體的結合親和力評估，Ala2、Phe36 和 Arg43 (L3) 被確定為關鍵的兔游標殘基 (數據未顯示)。相似地，對於 KV3-20 輕鏈，Ala2、Phe36 和 Val58 (L4) 被確定為關鍵的兔游標殘基。對於重鏈，發現 CDR 接枝至 HV3-53 * 01 (H11) 中足以維持對 huLy6G6D 的親和力，沒有兔游標位被包括在內。在種系 HV3-48 * 01 (3-48H2) 中製造額外的 CDR 移植物。重鏈 H11 與 KV3-20.L4 配對為 6E10v114。重鏈 HV3-48.H2 與 KV1-5.L3 配對為 6E10v23 (圖  43A 至圖 43D)。
對於 6E10v1 變體的分子評估 (MA) 測定的結果顯示於圖 41。發現 CDR-H2 中的 D(54)G 及 D(58)Y 不穩定，在兩週內異構化增加 30.2%。
實例 3.  LY6G6D 抗體 hu.20A12.QNTv12 的序列和晶體 結構
如實例 2 中所述，與 1G4 (實例 2) 具有重疊表位的人源化兔抗體 20A12.QNTv12 被鑑定為有效的抗 LY6G6D 抗體。20A12.QNTv12 在 37o C 時以 TDB 的形式對人類 Ly6G6D 呈現出高的結合親和力 (KD 約為 2 nM，而 1G4 約為 16 nM)，與人類和食蟹獼猴 LY6G6D 的結合親和力相當，並在 BV ELISA 測定、表現測試及分子評估 (MA) 熱及氧化測試中獲得良好結果。以下描述 20A12.QNTv12 之胺基酸序列，包括經修飾以包含用於單細胞製造的電荷對的變體，以及與 LY6G6D 結合的 20A12.QNTv12 的晶體結構。
A.     20A12.QNTv12 之胺基酸序列
20A12.QNTv12 的重鏈變異區和輕鏈變異區之胺基酸序列顯示於圖  5A 和 5B (SEQ ID NOs：22 和 23)。修飾為包含用於單細胞製造的電荷對的 20A12.QNTv12 變體的重鏈變異區和輕鏈變異區之胺基酸序列顯示在圖  5C 和 5D (SEQ ID NOs：10 和 11)。
B . 結合至 LY6G6D 的 20A12.QNTv12 抗體的晶體結構
為了確定結合至 LY6G6D 的 20A12.QNTv12 的晶體結構，將包含 LY6G6D 之胺基酸 93-104 (SEQ ID NO：78) 的多肽與 20A12.QNTv12 抗體的片段抗原結合區 (Fab) 共結晶 (圖  6A 至圖 6F)。20A12.QNTv12-LY6G6D 複合物的晶體結構解析為 2.2Å，R/Rfree 19.9/24.3%；P1 空間組：82、138、139、68、75、90。測試十個 20A12.QNTv12 Fab。LY6G6D 殘基 94-103 被解析為結合所有十個拷貝。Ly6G6D 94-103 多肽在抗 LY6G6D 1G4 的晶體結構中形成二聚體，並作為單體與 20A12.QNTv12 結合。
C.     20A12.QNTv12 與 1G4 的晶體結構
此外，將包含 LY6G6D 胺基酸 93-104 (SEQ ID NO: 87) 的多肽與 20A12.QNTv12 抗體的片段抗原結合區 (Fab) (SEQ ID NOs: 96-97) 或 1G4 的 Fab (SEQ ID NO: 94 和 95) 共結晶。由於二硫鍵，肽主鏈構象在 1G4 和 20A12.QNTv12 結構之間相似，而側鏈則顯示出顯著的構象遷移性 (圖7A 及 7B)。發現 20A12.QNTv12 和 1G4 結合 LY6G6D 肽的不同殘基，如顯示於圖  7C-7F 及表 3 和 4。
圖 7C 和 7D 顯示 20A12.QNTv12 與 LY6G6D 的相互作用。與 LY6G6D 相互作用的 20A12.QNTv12 中的殘基在圖 7D 中標記。表 3 總結 20A12.QNTv12 Fab 中的界面殘基：LY6G6D 複合物。人類 LY6G6D 上的 20A12.QNTv12 Fab 的表位由殘基 Arg94、Asp95、Cys96、Tyr97、Leu98、Gly99、Asp100、Leu101、Cys102 及 Asn103 (RDCYLGDLCN) 組成。這些殘基中的每一個都位於 Fab 的 5 Å 之內。20A12.QNTv12 Fab 利用 來自 CDRH1 的重鏈殘基 Asn31、Asn32、Ala33 和 Met34，來自 CDRH2 的 Ser52 及來自 CDRH3 的 Arg98、Gly99 及 Asp100 以及來自 CDRL3 的輕鏈殘基 Thr91、Ser92、Phe93 和 Arg94 與 LY6G6D 相互作用。
表 3.  20A12.QNTv12 Fab 中的界面殘基摘要： LY6G6D 複合物
20A12.QNTv12 Fab 重鏈中之界面殘基 (SEQ ID NO: 96) LY6G6D 中的界面殘基 (SEQ ID NO: 87) 20A12.QNTv12 Fab 輕鏈中之界面殘基 (SEQ ID NO: 97)
Asn 31 Arg 94 Thr 91
Asn 32 Asp 95 Ser 92
Ala 33 Cys 96 Phe 93
Met 34 Tyr 97 Arg 94
Ser 52 Leu 98
Arg 98 Gly 99
Gly 99 Asp 100
Asp 100 Leu 101
Cys 102
Asn 103
圖 7E 和 7F 顯示 1G4 與 LY6G6D 的相互作用。與 LY6G6D 相互作用的 1G4 中的殘基在圖 7F 中標記。表 4 總結 1G4 Fab 中的界面殘基：LY6G6D 複合物。在人類 LY6G6D 上的 1G4 Fab 之表位由殘基 His93、Asp95、Cys96、Tyr97、Leu98、Gly99 和 Asp100 組成；這些殘基中的每一個都位於 Fab 的 5 Å 之內。與 20A12.QNTv12 不同，未發現 1G4 與 LY6G6D 殘基 Arg94、Leu101、Cys102 或 Asn103 相互作用。因此，LY6G6D 殘基 Arg94、Leu101、Cys102 和 Asn103 是與 20A12.QNTv12 唯一結合的表位殘基。
1G4 Fab 利用來自 CDRH1 的重鏈殘基 Thr31、Tyr3 及 Val33 和來自 CDRH3 的 Arg99 及 Asn100，以及來自 CDRL3 的輕鏈殘基 Ser97、Tyr98、Ser99 和 Ala100 與 LY6G6D 相互作用。
表 4.  1G4 Fab 中的界面殘基摘要： LY6G6D 複合物
1G4 Fab 重鏈中之界面殘基 (SEQ ID NO: 147) LY6G6D 中的界面殘基 (SEQ ID NO: 87) 1G4 Fab 輕鏈中之界面殘基 (SEQ ID NO: 95)
Thr 31 His 93 Ser 97
Tyr 32 Asp 95 Tyr 98
Val 33 Cys 96 Ser 99
Arg 99 Tyr 97 Ala 100
Asn 100 Leu 98
Gly 99
Asp 100
實例 4. 活體外 TDB 活性測定
細胞毒性、細胞結合、 T 細胞活化和細胞殺傷
使用內源性表現中等水平的 LY6G6D 之 HT55 細胞 (人結腸癌細胞株) 測試與抗 CD3 臂 38E4v1 或 40G5c 配對的 LY6G6D TDB (例如，具有抗 LY6G6D 臂 20A12.QNTv12 或其變體的 LY6G6D TDB) 的活體外 活性 (圖  9A-9C、10A-10D 和 11F-11H)。40G5c 和 38E4v1 是人源化融合瘤抗體，其為從用跨越人 CD3ε N 端 27 個胺基酸的 KLH (鑰孔蟲戚血藍蛋白 (keyhole limpet hemocyanin)) 共軛肽免疫的小鼠中所獲得的抗體。先前已觀察到 40G5c 對 CD3 具有相對低的親和力，而觀察到 38E4v1 具有高親和力 (美國公開號 2015-0166661)。
藉由 Ficoll 梯度從健康供體的全血中分離出人類周邊血液單核細胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，並將其用作效應細胞。在不同濃度的 LY6G6D TDB 存在下，孵育人類 PBMC 和 HT55 細胞的共培養物 (E:T = 10:1)。孵育 72 小時後測量目標細胞的殺傷和 T 細胞活化。藉由在 CellTiter-GLO® 測定中測量發光強度 (RLU)，將目標細胞的殺傷定量為細胞毒性百分比。使用以下公式計算目標細胞殺傷的百分比： 目標細胞殺傷% = {(未處理的孔中的 RLU - 經 TDB 處理的孔中的 RLU) / (未處理的孔中的 RLU)} x 100。
使用螢光激活細胞分選技術 (fluorescence activated cell sorting，FACS) 測量 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞的活化。對於 CD8+ T 細胞，檢測 CD69 和 CD25 的表面表現，並將 CD69 + CD25+ 的 CD8+ T 細胞百分比報導為 CD8+ T 細胞活化。
包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 38E4v1 臂的 LY6G6D TDB 有效誘導 T 細胞活化 (圖  9B、9C、10B、10C、11G 和 11I) 和有效的目標細胞殺傷 (圖  9A、10A、10D、11D-11F 和 11H) 以劑量依賴的方式活體外抗 HT55。當與高親和力的抗 CD3 臂 38E4v1 配對時，20A12.QNTv12 具有與 1G4 相當的活體外 細胞殺傷力。當將 20A12.QNTv12 臂與低親和力抗 CD3 臂 40G5c 配對時，細胞殺傷力低於 38E4v1 臂；然而，包含20A12.QNTv12 和 40G5c 臂的 TDB 比包含 1G4 和 40G5c 臂的 TDB 具有更大的細胞殺傷力。(圖  11D 和圖 11E)兔 20A12 亦顯示出比 1G4 更高的對 HT55 細胞的結合親和力 (圖 4F)。
在使用來自十個健康人類供體的 PMBC 進行的測並中，藉由包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 38E4v1臂的 TDB 的平均細胞殺傷 EC50 約為 1.04 ng/ml (7 pM)；平均 CD8+ T 細胞活化 EC50 約為 87 ng/ml (583 pM) (圖  11F 和圖 11H).  亦測試在表現不同水平的 LY6G6D 的 Colo320DM (人類杜克氏 (Duke) C 型，大腸直腸腺癌細胞株) 和 LS1034 (人類杜克氏 C 型，大腸直腸腺癌細胞株) 細胞 (圖 11A) 中測試細胞殺傷和 CD8+ T 細胞活化 (圖  11B 和圖 11I)。
實例 5. 活體內 TDB 活性和清除率測定
A. 腫瘤體積
測試包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 40G5c 或 38E4.v1 臂的候選 LY6G6D TDB 在 NSGTM 小鼠中針對異種移植 LS1034 和 HT55 腫瘤的活體內 活性 (圖  16A-16C 17A-17C)。用健康供體周邊血液單核細胞 (PBMC) 將小鼠人源化。包含遞送載體和 PMBC 或包含 TDB 但不含 PMBC 的治療提供作為對照。在施用單劑量的TDB之後，使用通用免疫球蛋白藥代動力學 (Generic Immunoglobulin Pharmacokinetic，GRIP) ELISA測定法 (Yang 等人，J.Immunol.Methods ，8-20，2008) 來測量 TDB 的血清濃度。
建立包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 40G5c 或 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 對 LS1034 腫瘤 (LY6G6D IHC 得分 3+) 和 HT55 腫瘤 (LY6G6D IHC 得分 2+) 的活體內功效。關於 LS1034 和 HT55 腫瘤模型，對於包含高親和力抗 CD3 38E4.v1 臂 (1 mg/kg，單劑量，IV，D0) 的 TDB，觀察到更高的療效 (圖  16A 和圖 17A)。包含 38E4.v1 的 LY6G6D TDB 的功效和 PK 呈劑量依賴性，且觀察到在包含 38E4v1 的 LY6G6D TDB 與包含 40G5c 的LY6G6D TDB 之間的血清 PK 差異很小 (圖16A-16C 和圖 17A-17C)   亦測試包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 對 Colo320DM 腫瘤的活體內功效 (圖 11J)。
B.     SCID 小鼠的清除率
在嚴重聯合免疫缺陷 (severe combined immunodeficient，SCID) 小鼠中，靜脈內投予 5 mg/kg 劑量的抗體後，使用 GRIP ELISA 測定，測量包含抗 LY6G6D 臂 20A12.QNTv12 和抗 CD3 40G5c 或 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 的清除率 (圖 18)。清除率 (7.67 mL/天/kg) 與和 38E4v1 抗 CD3 臂配對的其他 TDB 相當。清除率範圍為 8.6 至 16 mL/kg/天。與對照抗體抗 gD 5B6 相比，包含 20A12.QNTv12 和 38E4v1 的 TDB 在 SCID 小鼠中具有可接受的藥物動力學 (PK)，並顯示全身性 CL 的差異小於兩倍。對於包含非結合物種中的 20A12.QNTv12 和 38E4v1 臂的 LY6G6D TDB，無 PK 責任 (非典型 PK) 明顯。所有劑量溶液的回收均在標稱劑量的 ±20% 之內。
實例 6. 食蟹獼猴安全性測定
A. 食蟹獼猴中的毒性研究
在食蟹獼猴 (cyno) 中對包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 進行毒性研究。該研究採用迭代和交錯劑量組的適應性設計 (圖 19)。第 2 組在第 1 天 (D1) 以 LY6G6D TDB 的單劑量 (1 mg/kg) IV 輸注治療。第 3、4 和 5 組以單劑量 (分別為 2、4 和 8 mg/kg) Iv輸注治療，第 6 組以單一劑量 (15 mg/kg) IV 輸注治療。在 D8 上進行末期屍檢以進行組織病理學評估 (圖 19)。該研究的目的是降低健康動物中 LY6G6D 目標的風險並測試劑量範圍。基於先前的 TDB 經驗，包括 PK/PD 和標準毒性終點。
使用 GRIP ELISA 測定評估所有治療組的靜脈 PK。結果顯示大於劑量比例的全身暴露 (劑量標準化的AUC0-7 )。清除率 (CL) 隨著 TDB 劑量 (4 mg/kg 及以上) 的增加而降低，表明在這些劑量下 (周邊血中 CD3 所介導的) 目標介導的藥物處置 (target-mediated drug disposition，TMDD) 的飽和度 (圖 20A；表 5)。在 1 mg/kg 劑量下的 PK 與食蟹獼猴 中其他 TDB 的歷史數據相當，例如 gD/38E4v1 TDB，其顯示 CL 約為 20 mL/kg/天 (圖  20A 及 20B)。調劑溶液的回收率在標稱值的 ±20% 範圍內
表 5. 靜脈 PK 用於以 TDB 治療食蟹獼猴
劑量 動物＃ Cmax (ug/mL) AUC0-7 ( 天 *ug/mL) AUC0-7 / 劑量 ( 天 *kg*ug/mL/mg) CL (mL/ 天 /kg) t1/2 ( 天 )
1 mg/kg 2001 23.5 35.1 35.1 25.9 2.24
2 mg/kg 3001 45.4 83.5 41.8 20.4 2.68
4 mg/kg 4001 115 246 61.5 12.8 3.20
8 mg/kg 5001 211 452 56.5 12.3 4.27
15 mg/kg 6001 344 926 61.7 12.5 3.40
15 mg/kg 6003 364 940 62.7 10.9 4.42
包含抗 LY6G6D 臂 20A12.QNTv12 和抗 CD3 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 的單劑量 IV 治療耐受劑量高達 15 mg/kg。臨床觀察結果包括未進行獸醫治療及對死亡率、體重或食物消耗均無影響。在 15 mg/kg 劑量下，僅在給藥後 4-5 小時，在 6001 號動物中觀察到嘔吐 (中度)，在 6003 號動物中觀察到臉色蒼白和震顫 (輕微)。臨床病理學上未顯示炎症或肝損傷及輕度的 C 反應蛋白 (C-reactive protein，CRP) 升高的證據 (圖 22B)。解剖病理學上一隻以 15 mg/kg 劑量的動物 (動物編號 6003，有輕微的震顫) 在大腦中發現血管周圍/血管單核浸潤 (圖 21)。
治療後測量細胞因子 G-CSF、IL-1Ra、MCP-1、TNF-α、IL-13、IL-8 和 C反應蛋白 (CRP) 的濃度 (圖  22A 及 22B)。在＞ 1mg/kg 的劑量下，一些細胞因子顯示輕微的濃度增加。沒有明顯的劑量反應關係。在＞ 4 mg/kg 時，觀察到 MCP-1 有輕度增加 (圖 22A)。治療後 24 小時，所有變化均恢復至基線。
表現 CD3+/CD4+/CD5+ CD25 的 T 輔助 (Th) 淋巴細胞、表現 CD3+/CD8+/CD5+ CD25 的 T 細胞毒性 (Tc) 淋巴細胞、CD45+/CD3+ T 淋巴細胞、CD45+/CD20+ B 淋巴細胞及 CD45+/CD16+ 的自然殺傷細胞的計數藉由流式細胞儀測量 (圖  23A-23D).  在治療前 7 天 (第-7天) 和治療當天 (第1天前) 進行測量，並取平均值以提供給藥前的平均值。輸注結束後，分別在 2 小時、6 小時、24 小時和 168 小時進行測量。觀察到顯示輕度 T 細胞活化 (圖 23A)、T 細胞恢復 (圖 23B) 和 B 細胞恢復 (圖 23C) 的峰值。
實例 7. 親和力的 BIAcore 測定法
使用 BIAcore 測定法測定包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 38E4.v1 臂 (圖 24A) 或 40G5C 臂 (圖 24B) 的 TDB 對人類和食蟹獼猴 Ly6G6D 多肽的親和力。Ly6G6D-Fc 直接固定在晶片上，且 TDB 在 37° C 流過。對包含抗 LY6G6D 1G4 臂和抗 CD3 38E4.v1 臂 (圖 24C) 或 40G5C 臂 (圖 24D) 的 TDB 進行類似測定。這些測定的結果提供於表 6 中。
表 6. 針對人類和食蟹獼猴 LY6G6D-Fc 的 TDB 之 BIAcore 分析
人 Ly6G6D 食蟹獼猴 Ly6G6D
Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M) Rmax Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M) Rmax
20A12.QNTv12/38E4v1 2.20E +05 44.4E -04 2.02E -09 60.085 1.66E +05 3.80E -04 2.29E -09 208
20A12.QNTv12/40G5c 8.06E +04 4.56E -04 5.62E -09 52.603 8.43E +04 4.13E -04 4.91E -09 171
1G4/38E4v1 5.44E +05 8.86E -03 1.63E -08 125.15 7.14E +05 9.36E -03 1.31E -08 314
1G4/40G5c 3.14E +05 9.83E -03 3.13E -08 91.745 2.93E +05 9.71E -03 3.31E -08 240
使用兩種細胞系統製造且包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 38E4.v1 臂的 LY6G6D TDB 對人類和食蟹獼猴 LY6G6D 多肽以及人類和食蟹獼猴 的 CD3 之胞外域 (ECD) 具有高結合親和力 (表 7)。
表 7. 針對人類和食蟹獼猴 LY6G6D-Fc 和 CD3 ECD 的 TDB 的 BIAcore 分析
分子 標靶 Biacore KD nM
20A12.QNTv12 huLY6G6D 2.02
cyLY6G6D 2.29
huCD3 20
CyCD3 15
將包含抗 LY6G6D 臂 20A12.QNTv12 和抗 CD3 38E4.v1 (左圖；使用兩種細胞製造系統生產)、38E4.v1 MD1 (中圖；使用單種細胞製造系統生產) 或 38E4.v1 MD4 臂 (右圖；使用單種細胞生產系統生產) 的 TDB 使用 BIAcore 測定法檢測與人 Ly6G6D 多肽的親和力 (圖 25)。這些測定的結果提供於表 8 中。
表 8. 針對人類和食蟹獼猴 LY6G6D-Fc 的 TDB 之 BIAcore 分析
樣本 配體 Rmax (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
20A12.QNTv12/38E4v1 hu Ly6G6D 57.9 2.99E +05 4.16E -04 1.39
食蟹獼猴 Ly6G6D 57.2 2.31E +05 4.44E -04 1.92
20A12.QNTv12.MD1/38E4v1 hu Ly6G6D 33.3 4.20E +05 7.96E -04 1.90
食蟹獼猴 Ly6G6D 34.9 1.41E +05 5.12E -04 3.63
20A12.QNTv12.MD4/38E4v1 hu Ly6G6D 56.2 2.96E +05 5.59E -04 1.89
食蟹獼猴 Ly6G6D 54.6 2.19E +05 5.74E -04 2.62
實例 8. 開發用於單種細胞製造的 MD1 和 MD4 抗 CD3 臂
A. 單種細胞和兩種細胞製造系統
如圖 8A 所示，抗 LY6G6D 抗體 (例如 20A12.QNTv12) 被製造為 LY6G6D T 細胞依賴性雙特異性抗體 (LY6G6D TDB)，其具有抗 LY6G6D 特異性的第一臂及具有抗 CD3 特異性的第二臂。使用兩種細胞系統 (圖 8B) 或單種細胞系統 (圖 8C) 製造 TDB。對於單種細胞製造，重要的是第一臂和第二臂在宿主細胞中以可比較的水平表現：表現水平的較大差異增加了輕鏈 (LC) 配對錯誤的可能性，並降低 TDB 正確配對的可能性。抗 CD3 38E4v1 臂的表現相對較弱，而抗 LY6G6D 臂 20A12.QNTv12 的表現較高 (圖 37)。在用於評估 TDB 裝配的瞬時轉染測定中，即使將編碼各臂的 DNA 的比例修改為 1:16 的比例，包含 38E4v1 臂和 20A12.QNTv12 臂的 LY6G6D TDB 也無法達到 80% 以上的正確配對 (圖 29D)。
抗 CD3 38E4v1 臂的兩個變體 38E4v1 MD1 (MD1) 和 38E4v1 MD4 (MD4) 被開發為具有比 38E4v1 更高的表現，因此能夠改進單種細胞格式 LY6G6D TDB (例如具有抗 LY6G6D 臂 20A12.QNTv12 的單細胞格式的 LY6G6D TDB) 的生產。發現 MD1 和 MD4 具有有利的雙特異性對 LC-錯配的雜質比率 (即，高純度的正確形成的 LY6G6D TDB)，並具有相當的活體外 效力與活體內 效力，和對於野生型 38E4v1 的 PK。
圖 8D 或 8E 所示及如本文所述，使用單種細胞系統製造的 TDB 被額外修飾以包含導入電荷對的胺基酸取代突變。
B.     20A12.QNTv12 的單種細胞變體
為了便於在單種細胞系統中進行製造，對 20A12.QNTv12 臂的重鏈和輕鏈序列進行了修飾，使其包含引入電荷對的胺基酸取代突變 (圖 5C、5D 和 8A-8E)。
C.     38E4v1 表現變體 MD1 和 MD4 的生成
為了產生適於在單種細胞系統中製造的表現改善的 38E4v1 變體，用來自 40G5c 的殘基修飾 38E4v1 的 VL 序列，該 40G5c 為一種具有比 38E4v1 更好的表現的抗 CD3 抗體，如下所述。兩種 38E4v1 變體 38E4v1 MD1 (MD1) 和 38E4v1 MD4 (MD4) 在小鼠中具有有利的雙特異性比 LC 錯配雜質比率，並具有相當的活體外 效力、活體內 效力和對於野生型 (WT) 38E4v1 的PK。
產生 38E4v1 輕鏈變異區 (VL) 的變體，其包含衍生自低親和力抗 CD3 抗體 40G5c 的一個或多個胺基酸取代的輕鏈序列 (圖29A)。38E4v1，相對於 38E4v1 的序列，MD1 VL 包含四個胺基酸取代：S43P、T51A、K55E 和 K89T (圖 29A)。MD4 VL 僅包含 S43P 和 T51A 替代 (圖 29A)。亦產生僅包含 S43P、T51A、K55E 或 K89T 胺基酸取代的變體。所有 38E4v1 變體均包含 38E4v1 的重鏈變異區 (VH) 序列 (圖 29B)。
C. 瞬時轉染測定
38E4v1、MD1 和僅包含 S43P、T51A、K55E 或 K89T 胺基酸取代的變體相對於 38E4v1 的表達水平在中華倉鼠卵巢 (CHO) 11-9 宿主細胞中的瞬時轉染測定中評估。
轉染後一天，將生長培養基替換為生產培養基。加入生產培養基一天後收集上清液，並使用 Fc 結合 ELISA 評估上清液的抗體力價。進行產量相對於 38E4v1 的標準化。38E4v1 輕鏈似乎限制了抗體表現的產量。出乎意料的是，以來自較低親和力的抗 CD3 抗體 40G5c (S43P、T51A 或 K89T) 的殘基替換 38E4v1 輕鏈中的個別位置會導致產量適度提高 (圖 29C)，並且當將這些變化組合到包含所有 S43P、T51A、K55E、K89T 胺基酸取代的 MD1 變體中時，觀察到產量更大實質的提高 (圖 29A 和 29C)。
在 TDB 組裝的瞬時轉染測定中，表現增強的 38E4v1 變體 MD1 和 MD4 以目標臂 (抗 LY6G6D) 輕鏈 (LC) DNA 與抗 CD3 臂為 1:4 比例達到完整抗體的 95% 組裝 DNA，而 38E4v1 甚至在 1:16 LC DNA 與抗 CD3 臂 DNA 之比例下也達不到 80%以上的正確配對 (圖 29D)。成功的細胞株發育殖株 xFcRH5 被提供作為對照。因此，MD1 和 MD4 允許製造高百分比正確配對的雙特異性抗體。
D. 結合動力學測定
38E4v1 MD1 和 MD4 臂的結合動力學顯示與高親和力野生型抗 CD3 38E4v1 臂 (WT) 相當的對人類及食蟹獼猴 CD3 配體的親和力 (表 9)。因此，MD1 和 MD4 變體保留了 38E4v1 的高親和力。使用 BIAcore T200 進行測定：將 27mer 人類和食蟹獼猴 CD3 多肽與生物素共軛結合，並固定於 SA CM5 晶片上，使 TDB 在 37o C 下以 100 µl/min 的流速通過。
表 9. 針對人類和食蟹獼猴 CD3 的 TDB 之 BIAcore 分析
樣本 配體 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU)
WT 二種細胞 HuCD3e 肽生物素 2.44E +06 4.29E -02 1.76E -08 27.8
2.22E +06 4.86E -02 2.19E -08 26.8
WT 二種細胞 CyCD3e 肽生物素 2.60E +06 3.37E -02 1.30E -08 32.6
2.21E +06 3.64E -02 1.65E -08 32.6
WT 單種細胞 HuCD3e 肽生物素 2.59E +06 5.16E -02 1.99E -08 29
2.34E +06 4.98E -02 2.13E -08 26.2
WT 單種細胞 CyCD3e 肽生物素 2.60E +06 3.99E -02 1.54E -08 34.8
2.65E +06 4.37E -02 1.65E -08 33
MD1 單種細胞 HuCD3e 肽生物素 1.54E +06 5.04E -02 3.28E -08 25.2
1.41E +06 4.56E -02 3.24E -08 21.2
MD1 單種細胞 CyCD3e 肽生物素 1.44E +06 3.83E -02 2.66E -08 31.9
1.47E +06 3.76E -02 2.56E -08 26.8
MD4 單種細胞 HuCD3e 肽生物素 2.89E +06 5.44E -02 1.88E -08 25.3
2.66E +06 4.95E -02 1.86E -08 26.1
MD4 單種細胞 CyCD3e 肽生物素 3.09E +06 4.33E -02 1.40E -08 30.6
2.89E +06 4.26E -02 1.47E -08 33.4
E. 藥物動力學測定
為了評估各種抗 CD3 臂的藥物動力學 (Pk)，在單劑量投予各種變體後，在 CB-17 SCID 小鼠中測量 38E4v1、40G5c，MD1，MD4 和 38E4v1 K55E 的 PK 輪廓。將抗 gD 抗體用作對照。抗 gD 抗體是一種靶向單純皰疹病毒 (herpes simplex virus) 糖蛋白D表位的非結合性對照 IgG。將所有抗體測試為具有人類 IgG1 同型且具有 N297G 突變以減弱 FcγR 介導的效用功能的單特異性、二價抗 CD3 抗體。
六組雌性 CB-17.SCID 小鼠 (每組 n = 12; Charles River Laboratories，251) 被投予單次 IV 劑量的各種抗體，劑量為 5 mg/kg。為了方便起見，使用雌性小鼠。從歷史上看，我們在使用雄性或雌性小鼠的 PK 研究中並未觀察到任何差異。在選定的時間點 (每個時間點重複3次)，經由股靜脈採集血液樣品，時間長達 21 天。藉由 GRIP ELISA (塗覆抗人類 IgG 的平盤並以抗人 IgG 進行檢測) 測定血清中的總抗體濃度，檢測極限為 15.6 ng/mL，並用於 PK 評估。對於抗 gD、38E4v1、40G5c、MD1、MD4 和 38E4v1.K55E，調劑溶液回收率分別為 111%、110%、106%、97.8%、103% 和 106%。調劑回收率在 20% 以內；因此，標稱劑量用於進一步分析。
在不同時間點從不同小鼠收集 PK 輪廓。標稱樣品收集時間和實際劑量溶液濃度用於數據分析。非隔室分析 ( Non-compartmental analysis，NCA) 參數是使用 Phoenix WinNonlin® 64 以稀疏採樣和 IV 推注輸入估算。提供標準誤差值。在以異氟烷 (5% 異氟烷和 2 L/min 的 O2 ) 麻醉後，對小鼠實施安樂死。所有程序均由 Genentech 機構動物護理和使用委員會 (Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC) 批准並符合其指導方針和原則，並在國際實驗室動物護理評估與認證協會認可的設施中進行。
抗 CD3 抗體變體並不會與小鼠 CD3 交叉反應；因此，包含抗 CD3 抗體變體的 TDB 的小鼠 PK 輪廓提供了一個機會，可在沒有目標標結合的情況下，比較變體的 PK 和非特異性消除率。評估抗 CD3 抗體變體的血清濃度-時間輪廓以及抗 gD 對照 (圖 29E)。各組的 PK 數據用 NCA 特徵化 (表 10)。
與投予抗 CD3 抗體變體的組別相比，投予抗 gD 的組別具有最高暴露。與抗 gD 給藥組相比，基於 40G5c 給藥組的 AUClast 值，其具有略低的暴露量，與其餘抗 CD3 抗體變體相比，其具有最高的暴露量。另一方面，與其他抗 CD3 抗體變體相比，基於其 AUClast 的 38E4v1 具有最低暴露量。
在三個變體 MD1、MD4 和 K55E 中，基於 AUClast ，MD1 具有最高的暴露量，其 PK 輪廓與 40G5c 給藥組相似。基於 AUClast ，在三個變體中，MD4 給藥組具有最低的暴露量，其 PK 輪廓與 38E4v1 給藥組相似。此外，基於 AUCinf ，在小鼠中，MD1 使 38E4v1 暴露提高約 3 倍。此外，抗 gD、40G5c 和 38E4v1.MD1 給藥組具有相當的 Vss 值，其比 38E4v1、MD4 和 K55E給藥組的 Vss 值低約 2 倍 (表 10)。
表 10. 抗 CD3ε 抗體變體的 PK 參數
組 n 劑量 (mg/kg) Cmax (μg/mL) AUClast (µg/mL* 天 ) AUCinf (μg/mL* 天 ) CL (mL/ 天 /kg) Vss (mL/kg) t1/2 ( 天 )
抗 gD 12 5 152 ± 1.30 1050 ± 25.1 2020 2.47 97.2 19
抗 CD3.38E4v1 12 5 70.8 ± 1.64 245 ± 10.7 279 17.9 226 9.62
抗 CD3.40G5c 12 5 155 ± 4.47 884 ± 28.5 1300 3.85 95.6 18.4
抗 CD3.38E4v1.MD1 12 5 117 ± 2.62 726 ± 15.8 938 5.33 101 11.7
抗 CD3.38E4v1.MD4 12 5 78.7 ± 3.55 274 ± 10.2 354 14.1 256 13
抗 CD3.38E4v1.K55E 12 5 72.5 ± 1.26 413 ± 14.2 629 7.95 204 18
標準誤差值在適用時提供。Cmax = 最大觀側血清濃度，AUClast = 從時間 0 到最後測量的時間點 (第 28 天) 的血清濃度時間曲線下的面積。AUCinf = 從時間 0 外推至無窮大的血清濃度時間曲線下的面積。CL = 清除。Vss = 穩定態分佈量。t1/2 = 最終半衰期。
鑑於 38E4v1 的暴露量低於 40G5c，因此接下來評估了 CD3 臂的特徵是否可能非特異性地導致了所觀察到的較低暴露量。我們使用電腦模擬 清除評估工具 (in silico Clearance Assessment Tool，iCAT) 估算 38E4v1 和 40G5c 的抗體變異區 (Fv) 電荷和疏水性，iCAT 是一種基於序列的計算工具，可提供食蟹獼猴抗體清除的理論風險評估 (Sharma 等人，Proc Natl Acad Sci USA ，111: 18601-6，2014)。該評估基於從 Fv 域序列計算得出的參數。評估抗 CD3 二價抗體的 iCAT 得分。38E4v1 的經計算的 Fv 電荷為 +7.6，超出可接受的活體內 清除率範圍 (可接受的範圍包括 Fv 電荷 ≥ 0 且 ≤ +6.2)，而 40G5c 的經計算的 Fv 電荷在 +5.6 的可接受範圍內。MD1 的經計算 Fv 電荷為 +4.7，MD4 的 Fv 電荷為 +7.6。因此，與 38E4v1 相比，MD1 具有改善的 Fv 電荷，且在食蟹獼猴中清除的理論風險是可接受的。
此外，使用桿狀病毒 (BV) ELISA 測試抗 CD3 變體。BV ELISA 為一種活體外 工具，用於評估非特異性清除率 (Hotzel 等人，MAbs ，4: 753-760, 2012)。此評估基於對桿狀病毒顆粒的非特異性結合的 ELISA 檢測，並可鑑定對於快速清除具有風險增加的抗體。對於 38E4v1 的 BV ELISA 得分為 1.15，其超出預測的活體內 清除率的範圍 (BV ELISA得分 ＞ 1.0 表示快速清除的可能性很高)。相比之下，對於 MD1 的 BV ELISA 得分為 0.15，而對於 MD4 的 BV ELISA 的得分為 0.72；因此，MD1 和 MD4 二者都在可接受的範圍內。有趣的是，儘管 MD4 通過 BV ELISA 測試以進一步進行活體內 測試，該活體內 小鼠 PK 數據證實，與 MD1 相比，MD4 並未改善 38E4v1 的暴露。
實例 9. 對於單種細胞系統中產生的抗體的 TDB 活性測定
使用單種細胞系統組裝的候選 LY6G6D TDB (圖  8C-8E) 並測試包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 38E4v1 MD1 (MD1)、38E4v1 MD4 (MD4) 或 38E4v1 (WT) 臂 的活體外 活性、活體內 活性及對於 CD3 多肽的親和力。使用兩種細胞系統組裝的 TDB (圖 8B) 並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 38E4v1 臂作為對照。
A. 活體外細胞毒性、細胞結合及 T 細胞活化
將使用單種細胞系統組裝並包含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和抗 CD3 38E4v1 MD1、38E4v1 MD4 或 38E4v1臂 (WT) 的 LY6G6D TDB 在補充有來自健康供體的 PBMC 的 HT55 細胞中測試活體外 活性、CD4+ T 細胞的活化和 CD8+ T 細胞的活化 (圖 14A-14C 和圖 15A-15C)  如實例 2 中所述，在 CELLTITER-GLO® 測定中將殺傷量化為細胞毒性百分比，並使用螢光激活細胞分選技術 (FACS) 測量 CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞。所有 TDB 的劑量為 1mg/kg。包含變體 38E4v1 臂的 LY6G6D TDB 有效誘導 T 細胞活化 (圖 14B、14C、15B 和 15C) 和目標細胞殺傷 (圖 14A 和 15A) 在活體外對抗 HT55。因此，MD1 和 MD4 變體保留了 38E4v1 的高活體外 效能，同時在單種細胞系統中提供改進的可製造性。
B.     活體內活性
包含使用單種細胞株系統組裝的含抗 LY6G6D 20A12.QNTv12 臂和變體 38E4v1 抗 CD3 臂的 LY6G6D TDB 被測試在NSGTM 小鼠中針對異種移植 HT55 腫瘤的活體內 活性 (圖 26A 及 26B)。用健康供體周邊血液單核細胞 (PBMC) 將小鼠人源化。包含遞送載體和 PMBC 或包含 TDB 但不含 PMBC 的治療提供作為對照。該包含抗 CD3 38E4v1 MD1 或 38E4v1 MD4 臂的單種細胞變體顯示與兩種細胞 LY6G6D TDB 相當的腫瘤消退。
在靜脈內給予單劑量抗體後，使用 GRIP ELISA 測定法，在 HT55 腫瘤模型小鼠和 SCID 小鼠中測量 TDB 的清除率 (圖 27 和圖 28)。包含抗 CD3 38E4v1 MD1 或 38E4v1 MD4 臂的單種細胞變體的 Pk與兩種細胞與兩種細胞 TDB 的 PK 相當。沒有發現單種細胞 TDB 變異的 PK 責任 (例如非典型 PK)。調劑溶液的回收率在標稱值的 ±20% 之內。
C .與 CD3 的親和力測定
候選 LY6G6D TDB 使用單種細胞系統組裝並包含抗 CD3 38E4v1 MD1 或 38E4v1 MD4 臂，其顯示與 CD3 的親和力與使用單種細胞系統或兩種細胞系統組裝並包含抗 CD3 38E4v1 臂的 TDB 相當；因此，像 38E4v1一樣，MD1 和 MD4 是高親和力的抗 CD3 臂 (表 11)。使用 BIAcore T200 執行測定。將 27mer 人類和食蟹獼猴 CD3 多肽與生物素共軛連接，並固定在 SA CM5 晶片上。LY6G6D TDB 在37o C 下流過。
表 11. 針對人類和食蟹獼猴 CD3 的 TDB 之 BIAcore 分析
變異體 CD3 親和力 ( KD 以 nM 計 )
人 食蟹獼猴
二種細胞 WT 19.8 14.8
單種細胞 WT 20.6 15.9
單種細胞 MD1 32.6 26.1
單種細胞 MD4 18.7 14.4
儘管為了清楚理解起見，藉由圖示和實例的方式對上述發明進行了詳細描述，但是這些描述和實例不應被解釋為限製本發明的範圍。本文引用的所有專利和科學文獻的揭示內容均以引用的方式明確納入其全部內容。
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Claims (166)

  1. 一種單離抗體，其與抗淋巴細胞抗原 6 家族成員 G6D (LY6G6D) 結合，其中，該抗體包含含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域，其中，該 H1 包含含有下列互補決定區 (CDR) 的重鏈變異 (VH) 域 (VH1)： (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列； (b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；並且 該 L1 包含含有下列 CDR 的輕鏈變異 (VL) 域 (VL1)： (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列； (e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
  2. 如請求項 1 之抗體，其中，(a) 該 VH1 包含與 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性之胺基序列；(b) 該 VL1 包含與 SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列具有至少 95% 同一性之胺基酸序列；或 (c) 該抗體包含如 (a) 中的 VH1 及如 (b) 中的 VL1。
  3. 如請求項 1 或 2 之抗體，其中，該 VH1 包含下列骨架區 (FR)： (a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列； (b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 35 之胺基酸序列； (c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列。
  4. 如請求項 1 至 3 中任一項之抗體，其中，該 VH1 包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列。
  5. 如請求項 1 或 2 之抗體，其中，該 VH1 包含下列 FR： (a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 34 之胺基酸序列； (b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列； (c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 37 之胺基酸序列。
  6. 如請求項 1、2 及 5 中任一項之抗體，其中，該 VH1 包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。
  7. 如請求項 1 至 4 中任一項之抗體，其中，該 VL1 包含下列 FR： (a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列； (b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 39 之胺基酸序列； (c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列。
  8. 如請求項 1 至 4 及 7 中任一項之抗體，其中，該 VL1 包含 SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列。
  9. 如請求項 1、2、5 及 6 中任一項之抗體，其中，該 VL1 包含下列 FR： (a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 38 之胺基酸序列； (b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列； (c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 40 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 41 之胺基酸序列。
  10. 如請求項 1、2、5、6 及 9 中任一項之抗體，其中，該 VL1 包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列。
  11. 一種單離抗體，其與 LY6G6D 結合，其中，該抗體包含含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域，其中，該 H1 包含含有 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列的 VH 域 (VH1)，且該 L1 包含含有 SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列的 VL 域 (VL1)。
  12. 一種單離抗體，其與 LY6G6D 結合，其中，該抗體包含含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域，其中，該 H1 包含含有 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列的 VH 域 (VH1)，且該 L1 包含含有 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列的 VL 域 (VL1)。
  13. 如請求項 1 至 12 中任一項之抗體，其中，該抗體結合人 LY6G6D 多肽，其在 37°C 下使用 BIAcore 測定法所量測之 KD 介於約 100 pM 至 10 nM 之間。
  14. 如請求項 13 之抗體，其中，該抗體以 6.0 nM 或更低之 KD 結合人 LY6G6D 多肽。
  15. 如請求項 14 之抗體，其中，該抗體以 4 nM 或更低之 KD 結合人 LY6G6D 多肽。
  16. 如請求項 15 之抗體，其中，該抗體以 2 nM 或更低之 KD 結合人 LY6G6D 多肽。
  17. 如請求項 1 至 16 中任一項之抗體，其中，該抗體是單株的、人類的、人源化的或嵌合的。
  18. 如請求項 1 至 17 中任一項之抗體，其中，該抗體為結合 LY6G6D 的抗體片段。
  19. 如請求項 18 之抗體，其中，該抗體片段選自由 Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 及 (Fab')2 片段所組成之群組。
  20. 如請求項 1 至 17 中任一項之抗體，其中，該抗體為全長抗體。
  21. 如請求項 1 至 17 及 20 中任一項之抗體，其中，該抗體為 IgG 抗體。
  22. 如請求項 1 至 21 中任一項之抗體，其中，該抗體為單特異性抗體。
  23. 如請求項 1 至 21 中任一項之抗體，其中，該抗體為多特異性抗體。
  24. 如請求項 23 之抗體，其中，該抗體為雙特異性抗體。
  25. 如請求項 24 之抗體，其中，該雙特異性抗體與分化簇 3 (CD3) 結合，並包含含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，其中，該 H2 包含 VH 域 (VH2)，且該 L2 包含 VL 域 (VL2)。
  26. 如請求項 25 之抗體，其中，該 CD3 結合域能夠與人 CD3 多肽或食蟹獼猴 CD3 多肽結合。
  27. 如請求項 26 之抗體，其中，該人 CD3 多肽或該食蟹獼猴 CD3 多肽分別為人 CD3ε 多肽或食蟹獼猴 CD3ε 多肽。
  28. 如請求項 26 之抗體，其中，該人 CD3 多肽或該食蟹獼猴 CD3 多肽分別為人 CD3γ 多肽或食蟹獼猴 CD3γ 多肽。
  29. 如請求項 25 至 28 中任一項之抗體，其中，該抗體結合人 CD3ε 多肽，其在 37°C 下使用 BIAcore 測定法所量測之 KD 介於約 1 nM 至 500 nM 之間。
  30. 如請求項 29 之抗體，其中，該 CD3 結合域以 250 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
  31. 如請求項 30 之抗體，其中，該 CD3 結合域以 100 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
  32. 如請求項 31 之抗體，其中，該 CD3 結合域以 15 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
  33. 如請求項 32 之抗體，其中，該 CD3 結合域以 10 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
  34. 如請求項 33 之抗體，其中，該 CD3 結合域以 5 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
  35. 如請求項 25 至 34 中任一項之抗體，其中，該 VH2 包含下列 CDR： (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列； (b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；並且 該 VL2 包含下列 CDR： (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列； (e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列。
  36. 如請求項 35 之抗體，其中，(a) 該 VH2 包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性之胺基序列；(b) 該 VL2 包含與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 95% 同一性之胺基酸序列；或 (c) 該抗體包含如 (a) 中的 VH2 及如 (b) 中的 VL2。
  37. 如請求項 35 或 36 之抗體，其中，該 VH2 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。
  38. 如請求項 35 至 37 中任一項之抗體，其中，該 VL2 包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列。
  39. 如請求項 25 至 34 中任一項之抗體，其中，該 VH2 包含下列 CDR： (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列； (b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列；並且 該 VL2 包含下列 CDR： (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列； (e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列。
  40. 如請求項 39 之抗體，其中，(a) 該 VH2 包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性之胺基序列；(b) 該 VL2 包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列具有至少 95% 同一性之胺基酸序列；或 (c) 該抗體包含如 (a) 中的 VH2 及如 (b) 中的 VL2。
  41. 如請求項 39 或 40 之抗體，其中，該 VH2 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。
  42. 如請求項 39 至 41 中任一項之抗體，其中，該 VL2 包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列。
  43. 如請求項 35、36、39 及 40 中任一項之抗體，其中，該 VH2 包含下列 FR： (a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列； (b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列； (c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列。
  44. 如請求項 35、36、39 及 40 中任一項之抗體，其中，該 VH2 包含下列 FR： (a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列； (b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列； (c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列。
  45. 如請求項 35、36、39、40 及 43 中任一項之抗體，其中，該 VL2 包含下列 FR： (a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列； (b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列； (c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列。
  46. 如請求項 35、36、39、40 及 44 中任一項之抗體，其中，該 VL2 包含下列 FR： (a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列； (b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列； (c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列。
  47. 如請求項 25 至 46 中任一項之抗體，其中，該 H1 及 H2 各自進一步包含重鏈恆定域 (CH1)，且該 L1 及 L2 各自進一步包含輕鏈恆定域 (CL)。
  48. 如請求項 47 之抗體，其中，該 H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處之胺基酸取代，且該 L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處之胺基酸取代。
  49. 如請求項 47 或 48 之抗體，其中，該 H1 的 CH1 包含 S183K 突變，且該 L1 的 CL 包含 V133E 突變。
  50. 如請求項 49 之抗體，其中，該 H2 的 CH1 包含 S183E 突變，且該 L2 的 CL 包含 V133K 突變。
  51. 如請求項 47 或 48 之抗體，其中，該 H1 的 CH1 包含 S183E 突變，且該 L1 的 CL 包含 V133K 突變。
  52. 如請求項 51 之抗體，其中，該 H2 的 CH1 包含 S183K 突變，且該 L2 的 CL 包含 V133E 突變。
  53. 一種雙特異性抗體，其與 LY6G6D 及 CD3 結合，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，其中，每個 H1 及 H2 包含重鏈變異域 (VH) 及重鏈恆定域 (CH1)，且每個 L1 及 L2 包含輕鏈變異域 (VL) 及輕鏈恆定域 (CL)，其中： (a)     該 LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR： (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列； (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列； (iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列； (b)     該 CD3 結合域包含下列六個 CDR： (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列； (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列； (iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列； (c)     該 H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處之胺基酸取代，且該 L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處之胺基酸取代，及/或該 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處之胺基酸取代，且該 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處之胺基酸取代；並且 (d)     該 H1 的 VH 包含在位置 Q39 處之胺基酸取代，且該 L1 的 VL 包含在位置 Q38 處之胺基酸取代，及/或該 H2 的 VH 包含在位置 Q39 處之胺基酸取代，且該 L2 的 VL 包含在位置 Q38 處之胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。
  54. 一種雙特異性抗體，其與 LY6G6D 及 CD3 結合，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，其中，每個 H1 及 H2 包含重鏈變異域 (VH) 及重鏈恆定域 (CH1)，且每個 L1 及 L2 包含輕鏈變異域 (VL) 及輕鏈恆定域 (CL)，其中： (a)     該 LY6G6D 結合域包含下列六個 CDR： (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列； (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列； (iv) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列； (b)     該 CD3 結合域包含下列六個 CDR： (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列； (ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列； (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列； (iv) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列； (v) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (vi) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列； (c)     該 H1 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處之胺基酸取代，且該 L1 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處之胺基酸取代，及/或該 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處之胺基酸取代，且該 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處之胺基酸取代；並且 (d)     該 H1 的 VH 包含在位置 Q39 處之胺基酸取代，且該 L1 的 VL 包含在位置 Q38 處之胺基酸取代，及/或該 H2 的 VH 包含在位置 Q39 處之胺基酸取代，且該 L2 的 VL 包含在位置 Q38 處之胺基酸取代 (所有皆為 Kabat 編號)。
  55. 如請求項 53 或 54 之抗體，其中，該 H1 的 VH 包含在 Q39 (Kabat 編號) 處之胺基酸取代，且該 L1 的 VL 包含在 Q38 (Kabat 編號) 處之胺基酸取代。
  56. 如請求項 55 之抗體，其中，該 H2 的 CH1 包含在 S183 (EU 編號) 處之胺基酸取代，且該 L2 的 CL 包含在 V133 (EU 編號) 處之胺基酸取代。
  57. 如請求項 56 之抗體，其中，該 H2 的 VH 進一步包含在位置 Q39 (Kabat 編號) 處之胺基酸取代，且該 L2 的 VL 包含在位置 Q38 (Kabat 編號) 處之胺基酸取代。
  58. 如請求項 57 之抗體，其中，該 H1 的 CH1 包含 S183K 突變 (EU 編號)，且該 L1 的 CL 包含 V133E 突變 (EU 編號)，及該 H2 的 CH1 包含 S183E 突變 (EU 編號)，且該 L2 的 CL 包含 V133K 突變 (EU 編號)。
  59. 如請求項 58 之抗體，其中，該 H1 的 VH 包含 Q39E 突變 (Kabat 編號)，該 L1 的 VL 包含 Q38K 突變 (Kabat 編號)，該 H2 的 VH 包含 Q39K 突變 (Kabat 編號)，且該 L2 的 VL 包含 Q38E 突變 (Kabat 編號)。
  60. 如請求項 57 之抗體，其中，該 H1 的 CH1 包含 S183E 突變 (EU 編號)，且該 L1 的 CL 包含 V133K 突變 (EU 編號)，及該 H2 的 CH1 包含 S183K 突變 (EU 編號)，且該 L2 的 CL 包含 V133E 突變 (EU 編號)。
  61. 如請求項 60 之抗體，其中，該 H1 的 VH 包含 Q39K 突變 (Kabat 編號)，該 L1 的 VL 包含 Q38E 突變 (Kabat 編號)，該 H2 的 VH 包含 Q39E 突變 (Kabat 編號)，且該 L2 的 VL 包含 Q38K 突變 (Kabat 編號)。
  62. 如請求項 53 及 55 至 61 中任一項之抗體，其中，該 H2 的 VH 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列及/或該 L2 的 VL 包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列。
  63. 如請求項 62 之抗體，其中，該 H1 的 VH 包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列且該 L1 的 VL 包含 SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列。
  64. 如請求項 54 至 61 中任一項之抗體，其中，該 H2 的 VH 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列及/或該 L2 的 VL 包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列。
  65. 如請求項 64 之抗體，其中，該 H1 的 VH 包含 SEQ ID NO: 10 之胺基酸序列且該 L1 的 VL 包含 SEQ ID NO: 11 之胺基酸序列。
  66. 如請求項 25 至 65 中任一項之抗體，其中，該 H1 之 Fc 區的第一 CH3 域 (CH3 1 ) 及該 H2 之 Fc 區的第二 CH3 域 (CH3 2 ) 各自包含隆凸或腔窩，並且其中，該 CH3 1 中之隆凸或腔窩可分別定位在該 CH3 2 中之腔窩或隆凸中。
  67. 如請求項 66 之抗體，其中，該 CH3 1 及該 CH3 2 在該隆凸與腔窩之間的界面處相接。
  68. 如請求項 66 或 67 之抗體，其中，該 H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含隆凸且該 H2 之 Fc 區的 CH3 2 包含腔窩。
  69. 如請求項 66 至 68 中任一項之抗體，其中，(a) 該 H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的隆凸；(b) 該 H2 之 Fc 區的 CH3 2 包含含有 T366S、L368A 或 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 或其組合的腔窩；或 (c) (a) 及 (b) 二者。
  70. 如請求項 69 之抗體，其中，(a) 該 H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的隆凸；(b) 該 H2 之 Fc 區的 CH3 2 包含含有 T366S、L368A 及 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的腔窩；或 (c) (a) 及 (b) 二者。
  71. 如請求項 70 之抗體，其中，(a) 該 H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的隆凸；且 (b) 該 H2 之 Fc 區的 CH3 2 包含含有 T366S、L368A 及 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的腔窩。
  72. 如請求項 66 或 67 之抗體，其中，該 H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含腔窩且該 H2 之 Fc 區的 CH3 2 包含隆凸。
  73. 如請求項 66、67 或 72 中任一項之抗體，其中，(a) 該 H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含含有 T366S、L368A 或 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的腔窩；(b) 該 H2 之 Fc 區的 CH3 2 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的隆凸；或 (c) (a) 及 (b) 二者。
  74. 如請求項 73 之抗體，其中，(a) 該 H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含含有 T366S、L368A 及 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的腔窩；(b) 該 H2 之 Fc 區的 CH3 2 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的隆凸；或 (c) (a) 及 (b) 二者。
  75. 如請求項 74 之抗體，其中，(a) 該 H1 之 Fc 區的 CH3 1 包含含有 T366S、L368A 及 Y407V 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的腔窩；(b) 該第二重鏈多肽 之 Fc 區的 CH3 2 包含含有 T366W 胺基酸取代突變 (EU 編號) 的隆凸。
  76. 如請求項 66 至 75 中任一項之抗體，其中，該 Fc 區為人 IgG 同型 Fc 區或其 Fc 區變體。
  77. 如請求項 76 之抗體，其中，該 Fc 區為人 IgG 同型 Fc 區變體。
  78. 如請求項 77 之抗體，其中，該人 IgG 同型 Fc 區變體各自包含在胺基酸殘基 N297 (EU 編號) 處之突變，該突變導致醣基化缺失。
  79. 如請求項 78 之抗體，其中，在胺基酸殘基 N297 處之該突變為取代突變。
  80. 如請求項 78 或 79 之抗體，其中，該在胺基酸殘基 N297 處之突變降低 Fc 區的效用功能。
  81. 如請求項 79 或 80 之抗體，其中，該取代突變為 N297G 或 N297A 突變。
  82. 如請求項 81 之抗體，其中，該人 IgG 同型 Fc 區變體各自包含該 N297G 突變。
  83. 如請求項 77 至 82 中任一項之抗體，其中，該人 IgG 同型 Fc 區變體各自包含降低 Fc 區的效用功能的突變。
  84. 如請求項 83 之抗體，其中，該降低 Fc 區的效用功能的突變為取代突變。
  85. 如請求項 84 之抗體，其中，該取代突變位於胺基酸殘基 E233、L234、L235、D265 及/或 P329 (EU 編號)。
  86. 如請求項 85 之抗體，其中，該取代突變為 E233P、L234A、L234V、L235A、D265A 或 P329G 突變。
  87. 如請求項 86 之抗體，其中，該人 IgG 同型 Fc 區變體各自包含該 P329G 突變。
  88. 如請求項 82 至 87 中任一項之抗體，其中，該人 IgG 同型 Fc 區變體各自包含 N297G 及 P329G 突變。
  89. 如請求項 82 至 88 中任一項之抗體，其中，該人 IgG 同型 Fc 區變體為人 IgG1 或 IgG3 同型 Fc 區變體，其各自進一步包含 L234A 或 L235A 突變。
  90. 如請求項 89 之抗體，其中，該人 IgG 同型 Fc 區變體為人 IgG1 或 IgG3 同型 Fc 區變體，其各自進一步包含 L234A 及 L235A 突變。
  91. 如請求項 82 至 88 中任一項之抗體，其中，該人 IgG 同型 Fc 區變體為人 IgG1 或 IgG3 同型 Fc 區變體，其各自進一步包含下列取代突變 E233P、L234V 及 L235A (EU 編號) 與殘基 G236 (EU 編號) 之刪除。
  92. 如請求項 91 之抗體，其中，該人 IgG 同型 Fc 區變體為人 IgG1 同型 Fc 區變體。
  93. 如請求項 82 至 88 中任一項之抗體，其中，該人 IgG 同型 Fc 區變體為人 IgG4 同型 Fc 區變體，其各自進一步包含下列取代突變 E233P、F234V 及 L235A (EU 編號) 與殘基 G236 (EU 編號) 之刪除。
  94. 如請求項 89 至 93 中任一項之抗體，其中，Fc 複合物之該 Fc 區為無效應子 Fc 區。
  95. 如請求項 66 至 94 中任一項之抗體，其中，該 H1 包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列且該 L2 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列。
  96. 如請求項 95 之抗體，其中，該 H2 包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列且該 L2 包含 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列。
  97. 如請求項 95 之抗體，其中，該 H2 包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列且該 L2 包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列。
  98. 一種雙特異性抗體，其與 LY6G6D 及 CD3 結合，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中： (a)     H1 包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列； (b)     L1 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列； (c)     H2 包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列；及 (d)     L2 包含 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列。
  99. 一種雙特異性抗體，其與 LY6G6D 及 CD3 結合，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中： (a)       H1 包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列； (b)      L1 包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列； (c)       H2 包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列；及 (d)      L2 包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列。
  100. 一種雙特異性抗體，其與 LY6G6D 及 CD3 結合，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中： (a)        H1 包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列； (b)       L1 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列； (c)        H2 包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 (d)       L2 包含 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列。
  101. 一種雙特異性抗體，其與 LY6G6D 及 CD3 結合，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中： (a)        H1 包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列； (b)       L1 包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列； (c)        H2 包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；及 (d)       L2 包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列。
  102. 一種雙特異性抗體，其與 LY6G6D 及 CD3 結合，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中： (a)        H1 包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列； (b)       L1 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列； (c)        H2 包含 SEQ ID NO: 18 之胺基酸序列；及 (d)       L2 包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列。
  103. 一種雙特異性抗體，其與 LY6G6D 及 CD3 結合，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中： (a)        H1 包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列； (b)       L1 包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列； (c)        H2 包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列；及 (d)       L2 包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列。
  104. 一種雙特異性抗體，其與 LY6G6D 及 CD3 結合，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中： (a)        H1 包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列； (b)       L1 包含 SEQ ID NO: 9 之胺基酸序列； (c)        H2 包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 (d)       L2 包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列。
  105. 一種雙特異性抗體，其與 LY6G6D 及 CD3 結合，其中，該雙特異性抗體包含：含有重鏈多肽 (H1) 及輕鏈多肽 (L1) 的 LY6G6D 結合域以及含有重鏈多肽 (H2) 及輕鏈多肽 (L2) 的 CD3 結合域，並且其中： (a)        H1 包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列； (b)       L1 包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列； (c)        H2 包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；及 (d)       L2 包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列。
  106. 如請求項 1 至 105 中任一項之抗體，其中，該抗體在靜脈內注射後的清除率介於約 10 ml/kg/天至約 35 ml/kg/天之間。
  107. 一種或多種單離核酸，其編碼如請求項 1 至 106 中任一項之抗體或其包含與 LY6G6D 結合之結合域的部分。
  108. 一種或多種載體，其包含如請求項 107 之一種或多種單離核酸。
  109. 一種或多種宿主細胞，其包含如請求項 108 之一種或多種載體。
  110. 如請求項 109 之一種或多種宿主細胞，其中，該一種或多種宿主細胞為一種或多種哺乳動物宿主細胞。
  111. 如請求項 110 之一種或多種宿主細胞，其中，該一種或多種哺乳動物宿主細胞為一種或多種中華倉鼠卵巢 (CHO) 宿主細胞。
  112. 如請求項 109 之一種或多種宿主細胞，其中，該一種或多種宿主細胞為一種或多種原核宿主細胞。
  113. 如請求項 112 之一種或多種宿主細胞，其中，該一種或多種宿主細胞為一種或多種大腸桿菌 宿主細胞。
  114. 一種製造如請求項 1 至 106 中任一項之抗體的方法，該方法包含在培養基中培養如請求項 109 之一種或多種宿主細胞。
  115. 如請求項 114 之方法，其中，該方法進一步包含從該一種或多種宿主細胞或該培養基中回收抗 LY6G6D 抗體。
  116. 一種組成物，其包含如請求項 1 至 106 中任一項之抗體。
  117. 如請求項 116 之組成物，其進一步包含醫藥上可接受之賦形劑或稀釋劑。
  118. 如請求項 117 之組成物，其中，該醫藥上可接受之賦形劑為緩沖劑、載劑、穩定劑或防腐劑。
  119. 如請求項 118 之組成物，其中，該組成物為醫藥組成物。
  120. 如請求項 1 至 106 中任一項之抗體，其用作藥物。
  121. 如請求項 1 至 106 中任一項之抗體或如請求項 116 至 119 中任一項之組成物，其用於治療或延緩有此需要之受試者中 LY6G6D 陽性癌症的進展。
  122. 如請求項 121 所使用之抗體或組成物，其中，該 LY6G6D 陽性癌症為大腸直腸癌。
  123. 如請求項 122 所使用之抗體或組成物，其中，該 LY6G6D 陽性癌症具有的微衛星不穩定性 (MSI) 狀態為微衛星穩定型 (MSS) 或微衛星不穩定性低 (MSI-L)。
  124. 如請求項 1 至 106 及 120 中任一項之抗體或如請求項 116 至 119 中任一項之組成物在製造用於治療或延緩受試者中 LY6G6D 陽性癌症的進展之藥物中之用途。
  125. 如請求項 124 之用途，其中，該 LY6G6D 陽性癌症為大腸直腸癌。
  126. 如請求項 125 之用途，其中，該 LY6G6D 陽性癌症具有的 MSI 狀態為 MSS 或 MSI-L。
  127. 一種治療或延遲有此需要之受試者中 LY6G6D 陽性癌症的進展之方法，該方法包含向該受試者投予如請求項 1 至 106 中任一項之抗體或如請求項 116 至 119 中任一項之組成物。
  128. 如請求項 127 之方法，其中，該 LY6G6D 陽性癌症為大腸直腸癌。
  129. 如請求項 128 之方法，其中，該 LY6G6D 陽性癌症具有的 MSI 狀態為 MSS 或 MSI-L。
  130. 一種套組，其包含如請求項 1 至 106 中任一項之抗體及藥品說明書，該藥品說明書包含有關使用該抗體治療或延緩受試者中 LY6G6D 陽性癌症的進展之說明。
  131. 如請求項 130 之套組，其中，該 LY6G6D 陽性癌症為大腸直腸癌。
  132. 如請求項 131 之套組，其中，該 LY6G6D 陽性癌症具有的 MSI 狀態為 MSS 或 MSI-L。
  133. 如請求項 130 至 132 中任一項之套組，其中，該受試者為人。
  134. 一種單離抗體，其與 CD3 結合，其中，該抗體包含含有以下 CDR 之結合域： (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列； (b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列； (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列； (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列； (e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 13 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列。
  135. 如請求項 134 之抗體，其中，該抗體包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 95% 序列同一性之胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 95% 同一性之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。
  136. 如請求項 134 或 135 之抗體，其中，該 VH 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。
  137. 如請求項 134 至 136 中任一項之抗體，其中，該 VL 包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列。
  138. 一種單離抗體，其與 CD3 結合，其中，該抗體包含含有以下 CDR 之結合域： (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 15 之胺基酸序列； (b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 16 之胺基酸序列； (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 17 之胺基酸序列； (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 12 之胺基酸序列； (e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 50 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 51 之胺基酸序列。
  139. 如請求項 138 之抗體，其中，該抗體包含：(a) VH，其包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基序列具有至少 95% 序列同一性之胺基酸序列；(b) VL，其包含與 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列具有至少 95% 同一性之胺基酸序列；或 (c) 如 (a) 中之 VH 及如 (b) 中之 VL。
  140. 如請求項 138 或 139 之抗體，其中，該 VH 包含 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。
  141. 如請求項 138 至 140 中任一項之抗體，其中，該 VL 包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列。
  142. 如請求項 134、135、138 及 139 中任一項之抗體，其中，該 VH 包含下列 FR： (a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列； (b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列； (c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列。
  143. 如請求項 134、135、138 及 139 中任一項之抗體，其中，該 VH 包含下列 FR： (a) FR-H1，其包含 SEQ ID NO: 42 之胺基酸序列； (b) FR-H2，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列； (c) FR-H3，其包含 SEQ ID NO: 44 之胺基酸序列；及 (d) FR-H4，其包含 SEQ ID NO: 45 之胺基酸序列。
  144. 如請求項 134、135、138、139 及 142 中任一項之抗體，其中，該 VL 包含下列 FR： (a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列； (b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列； (c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列。
  145. 如請求項 134、135、138、139 及 143 中任一項之抗體，其中，該 VL 包含下列 FR： (a) FR-L1，其包含 SEQ ID NO: 46 之胺基酸序列； (b) FR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列； (c) FR-L3，其包含 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列；及 (d) FR-L4，其包含 SEQ ID NO: 49 之胺基酸序列。
  146. 如請求項 134 至 145 中任一項之抗體，其中，該抗體結合人 CD3ε 多肽，其在 37°C 下使用 BIAcore 測定法所量測之 KD 介於約 1 nM 至 500 nM 之間。
  147. 如請求項 146 之抗體，其中，該抗體以 250 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
  148. 如請求項 147 之抗體，其中，該抗體以 100 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
  149. 如請求項 148 之抗體，其中，該抗體以 15 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
  150. 如請求項 149 之抗體，其中，該抗體以 10 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
  151. 如請求項 150 之抗體，其中，該抗體以 5 nM 或更低之 KD 結合人 CD3ε 多肽。
  152. 如請求項 134 至 151 中任一項之抗體，其中，該抗體為單株的、人類的、人源化的或嵌合的。
  153. 如請求項 134 至 152 中任一項之抗體，其中，該抗體為結合 CD3 之抗體片段。
  154. 如請求項 153 之抗體，其中，該抗體片段選自由 Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 及 (Fab')2 片段所組成之群組。
  155. 如請求項 134 至 152 中任一項之抗體，其中，該抗體為全長抗體。
  156. 如請求項 134 至 155 中任一項之抗體，其中，該抗體為 IgG 抗體。
  157. 如請求項 134 至 156 中任一項之抗體，其中，該抗 CD3 抗體為單特異性抗體。
  158. 一種單離核酸，其編碼如請求項 134 至 157 中任一項之抗體或其包含與 CD3 結合之結合域的部分。
  159. 一種載體，其包含如請求項 158 之單離核酸。
  160. 一種宿主細胞，其包含如請求項 159 之載體。
  161. 如請求項 160 之宿主細胞，其中，該宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
  162. 如請求項 161 之宿主細胞，其中，該哺乳動物宿主細胞為中華倉鼠卵巢 (CHO) 宿主細胞。
  163. 如請求項 160 之宿主細胞，其中，該宿主細胞為原核宿主細胞。
  164. 如請求項 163 之宿主細胞，其中，該宿主細胞為大腸桿菌 宿主細胞。
  165. 一種製造如請求項 134 至 157 中任一項之抗體的方法，該方法包含在培養基中培養如請求項 160 之宿主細胞。
  166. 如請求項 165 之方法，其中，該方法進一步包含從該宿主細胞或該培養基中回收抗 LY6G6D 抗體。
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