ES2390243T3 - Agentes de unión biespecíficos específicos de especies cruzadas - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende un primer dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopode la cadena CD3ε humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que el epítopo formaparte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 ycomprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu, y un segundo dominio de unión capaz deunirse a EGFR, Her2/neu o IgE de un ser humano y/o de un primate distinto de chimpancé.

Description

Agentes de unión biespecíficos específicos de especies cruzadas

La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un primer dominio de unión humano que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de CD3 (épsilon) humana y de primate distinto de chimpancé y un segundo dominio de unión capaz de unirse a EGFR, Her2/neu o IgE de un ser humano y/o un primate distinto de chimpancé, así como a un procedimiento para la producción del polipéptido mencionado. La invención se refiere además a ácidos nucleicos que codifican el polipéptido, a vectores que lo comprenden y a células huésped que comprenden el vector. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido mencionado y usos médicos del polipéptido.

El reconocimiento de linfocitos T está mediado por receptores de linfocitos T (TcR) alfa, beta y gamma con distribución clonotípica que interaccionan con las moléculas cargadas con péptidos del péptido MHC (pMHC) (Davis y Bjorkman, Nature 334 (1988), 395-402). Las cadenas específicas de antígeno del TcR no poseen dominios de señalización sino que se acoplan al aparato de señalización multisubunidades conservado CD3 (Call, Cell 111 (2002), 967-979, Alarcon, Immunol. rev. 191 (2003), 38-46, Malissen Immunol. rev. 191 (2003), 7-27). El mecanismo por el cual la unión al TcR se comunica directamente al aparato de señalización sigue siendo una cuestión fundamental en la biología de los linfocitos T (Alarcon, loc. cit.; Davis, Cell 110 (2002), 285-287). Parece evidente que las respuestas de linfocitos T sostenidas implican la participación de un correceptor, la oligomerización del TcR y un ordenamiento de grado superior de complejos de TcR-pMHC en la sinapsis inmunológica (Davis & van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001), R289-R291, Davis, Nat. Immunol. 4 (2003), 217-224). Sin embargo, la señalización de TcR muy temprana se produce en ausencia de estos acontecimientos y puede implicar un cambio conformacional inducido por ligando en CD3 épsilon (Alarcon, loc. cit., Davis (2002), loc. cit., Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 1117411179, Gil, Cell 109 (2002), 901-912). Las subunidades épsilon, gamma, delta y zeta del complejo de señalización se asocian entre sí para formar un heterodímero de CD3 épsilon-gamma, un heterodímero de CD3 épsilon-delta y un homodímero de CD3 zeta-zeta (Call, loc. cit.). Diversos estudios han revelado que las moléculas CD3 son importantes para la expresión correcta en la superficie celular del TcR alfa beta y el desarrollo normal de los linfocitos T (Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528-8536, Wang, J. Exp. Med. 188 (1998), 1375-1380, Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 441-447). La resolución de la estructura de los fragmentos del ectodominio del heterodímero de CD3 épsilon gamma de ratón mostró que ambas subunidades épsilon gamma son dominios Ig de tipo C2 que interactúan entre sí para formar una configuración yuxtapuesta inusual del dímero (Sun, Cell 105 (2001), 913-923). Aunque parece que el tallo rico en cisteína desempeña un papel importante en el control de la dimerización de CD3 (Su, loc. cit., Borroto, J. Biol. Chem. 273 (1998), 12807-12816), la interacción por medio de los dominios extracelulares de CD3 épsilon y CD3 gamma es suficiente para el ensamblaje de estas proteínas con el TcR beta (Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84-92, Manolios y Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995), 532-536). Aunque todavía es controvertido, lo más probable es que la estequiometría dominante del TcR comprenda un TcR alfa beta, un heterodímero de CD3 épsilon gamma, un heterodímero de CD3 épsilon delta y un homodímero de CD3 zeta zeta (Call, loc. cit.). Dado el papel clave del heterodímero de CD3 épsilon gamma humana en la respuesta inmunitaria, se ha dilucidado recientemente la estructura cristalina de este complejo unido al anticuerpo terapéutico OKT3 (Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680).

Varias estrategias terapéuticas modulan la inmunidad de linfocitos T dirigiéndose a la señalización de TcR, en particular, los anticuerpos monoclonales (Acm) anti-CD3 humana que se usan ampliamente en el ámbito clínico en regímenes inmunosupresores. El Acm de ratón específico frente a CD3 OKT3 fue el primer Acm autorizado para su uso en seres humanos (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29) y se usa ampliamente en el ámbito clínico como agente inmunosupresor en trasplantes (Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993), 422-430, Chatenoud, Nat. Rev. Immunol. 3 (2003), 123-132, Kumar, Transplant. Proc. 30 (1998), 1351-1352), diabetes de tipo 1 (Chatenoud (2003), loc. cit) y psoriasis (Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907-1913). Además, los Acm anti-CD3 pueden inducir señalización de linfocitos T parcial y anergia clonal (Smith, J. Exp. Med. 185 (1997), 1413-1422). En la literatura se ha descrito el OKT3 como un potente mitógeno de linfocitos T (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) y como un potente destructor de linfocitos T (Wong, Transplantation 50 (1990), 683-9). El OKT3 presenta estas dos actividades de manera dependiente del tiempo; después de la activación temprana de linfocitos T que da lugar a la liberación citocinas, tras la administración adicional, el OKT3 bloquea posteriormente todas las funciones de linfocitos T conocidas. Es debido a este bloqueo posterior de la función de linfocitos T por lo que el OKT3 ha encontrado una aplicación tan amplia como inmunosupresor en regímenes terapéuticos para la reducción o incluso la eliminación del rechazo tisular de aloinjertos.

Lo más probable es que el OKT3 revierta el rechazo tisular de aloinjertos mediante el bloqueo de la función de todos los linfocitos T, que desempeñan un papel principal en el rechazo agudo. El OKT3 reacciona con y bloquea la función del complejo CD3 de la membrana de linfocitos T humanos, que se asocia con la estructura de reconocimiento de antígenos de los linfocitos T (TCR) y es esencial para la transducción de señales. A qué subunidad del TCR/CD3 se une el OKT3 ha sido objeto de múltiples estudios. Aunque algunas pruebas han apuntado a una especificidad del OKT3 por la subunidad épsilon del complejo de TCR/CD3 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680). Pruebas adicionales han mostrado que la unión del OKT3 al complejo de TCR/CD3 requiere que estén presentes otras subunidades de este complejo (Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52).

Otros anticuerpos bien conocidos específicos para la molécula CD3 se enumeran en Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50. Como se indica anteriormente, tales anticuerpos específicos frente a CD3 pueden inducir diversas respuestas de linfocitos T tales como producción de linfocinas (Von Wussow, J. Immunol. 127 (1981), 1197; Palacious, J. Immunol. 128 (1982), 337), proliferación (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) e inducción de linfocitos T supresores (Kunicka, en "Lymphocyte Typing II" 1 (1986), 223). Esto es, en función de las condiciones experimentales, el anticuerpo monoclonal específico frente a CD3 puede inhibir o inducir citotoxicidad (Leewenberg,

J. Immunol. 134 (1985), 3770; Phillips, J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987), 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135 (1985), 34; Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol. 31, 94-106; Xu (2000), Cell Immunol. 200, 16-26; Kimball (1995), Transpl. Immunol. 3, 212-221).

El documento WO 2007/033230 divulga anticuerpos frente a la secuencia EMGGITQTPYKVSISGT de CD3 que corresponde a los residuos 6-22 de la CD3épsilon humana.

Aunque se ha informado de que muchos de los anticuerpos frente a CD3 descritos en la técnica reconocen la subunidad CD3 épsilon del complejo CD3, la mayoría de ellos se unen en realidad a epítopos conformacionales y, por tanto, sólo reconocen la CD3 épsilon en el contexto nativo del TCR. Los epítopos conformacionales se caracterizan por la presencia de dos o más residuos de aminoácido distintos que están separados en la secuencia primaria, pero se juntan sobre la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega en la proteína/antígeno nativo (Sela, (1969) Science 166, 1365 y Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Los epítopos conformacionales unidos a anticuerpos frente a CD3 épsilon descritos en la técnica pueden separarse en dos grupos. En el grupo principal, dichos epítopos están formados por dos subunidades CD3, p. ej., por la cadena CD3 épsilon y la cadena CD3 gamma o CD3 delta. Por ejemplo, se ha descubierto en varios estudios que los anticuerpos monoclonales frente a CD3 épsilon de uso más extendido, OKT3, WT31, UCHT1, 7D6 y Leu-4, no se unían a células transfectadas únicamente con la cadena CD3-épsilon. Sin embargo, estos anticuerpos tiñeron células doblemente transfectadas con una combinación de CD3 épsilon más CD3 gamma o CD3 delta (Tunnacliffe, loc. cit.; Law, Int. Immunol. 14 (2002), 389-400; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52; Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 1703-9). En un segundo grupo más pequeño, el epítopo conformacional se forma dentro de la propia subunidad CD3 épsilon. Por ejemplo, un miembro de este grupo es el Acm APA 1/1 que se ha obtenido contra CD3 épsilon desnaturalizada (Risueno, Blood 106 (2005), 601-8). Tomados en conjunto, la mayoría de los anticuerpos frente a CD3 épsilon descritos en la técnica reconocen epítopos conformacionales situados sobre dos o más subunidades CD3. De este modo, los residuos de aminoácido distintos que forman la estructura tridimensional de estos epítopos pueden estar situados en la propia subunidad CD3 épsilon o en la subunidad CD3 épsilon y otras subunidades CD3 tales como CD3 gamma o CD3 delta.

Otro problema con respecto a los anticuerpos frente a CD3 es que se ha descubierto que muchos anticuerpos frente a CD3 son específicos de especie. Los anticuerpos monoclonales anti-CD3, como sucede en general con cualquier otro anticuerpo monoclonal, funcionan por medio de reconocimiento altamente específico de sus moléculas objetivo. Sólo reconocen un único sitio, o epítopo, sobre su molécula CD3 objetivo. Por ejemplo, uno de los anticuerpos monoclonales de uso más extendido y mejor caracterizados específicos para el complejo CD3 es el OKT-3. Este anticuerpo reacciona con CD3 de chimpancé pero no con el CD3 homólogo de otros primates, tales como macacos,

o con CD3 de perro (Sandusky et al., J. Med. Primatol. 15 (1986), 441-451). El anticuerpo monoclonal anti-CD3 UCHT-1 también reacciona con CD3 de chimpancé pero no con CD3 de macacos (datos propios). Por otro lado, también existen ejemplos de anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos de macaco, pero no sus correspondientes humanos. Un ejemplo de este grupo es el anticuerpo monoclonal FN-18 dirigido a CD3 de macacos (Uda et al., J. Med. Primatol. 30 (2001), 141-147). Es interesante el hecho de que se ha descubierto que los linfocitos periféricos de aproximadamente el 12 % de los monos cynomolgus carecen de reactividad con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 de mono rhesus (FN-18) debido a un polimorfismo del antígeno CD3 en macacos. Uda et al. describieron una sustitución de dos aminoácidos en la secuencia de CD3 de monos cynomolgus, que no reaccionan con anticuerpos FN-18, en comparación con CD3 derivados de animales que reaccionan con anticuerpos FN-18 (Uda et al., J Med Primatol. 32 (2003), 105-10; Uda et al., J Med Primatol. 33 (2004), 34-7).

Esta capacidad discriminatoria, es decir, la especificidad de especie, aunque inherente a los anticuerpos monoclonales frente a CD3 y sus fragmentos, es un impedimento significativo para su desarrollo como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades en seres humanos. Para obtener la autorización para su comercialización, cualquier medicación candidata nueva debe pasar por pruebas rigurosas. Estas pruebas pueden subdividirse en las fases preclínica y clínica. Mientras que esta última, dividida además en las fases clínicas I, II y III generalmente conocidas, se realiza en pacientes humanos, la anterior se realiza en animales. El objetivo de las pruebas preclínicas es demostrar que el fármaco candidato tiene la actividad deseada y, lo más importante, es seguro. Sólo cuando se han establecido la seguridad en animales y la posible eficacia del fármaco candidato en pruebas preclínicas, la autoridad reguladora correspondiente aprobará este fármaco candidato para pruebas clínicas en seres humanos. Puede probarse la seguridad de los fármacos candidatos en animales de las tres maneras siguientes: (i) en una especie pertinente, es decir, una especie en la que los fármacos candidatos puedan reconocer los antígenos ortólogos, (ii) en un animal transgénico que contenga los antígenos humanos y (iii) mediante el uso de un sustituto del fármaco candidato que pueda unirse a los antígenos ortólogos presentes en el animal. Las limitaciones de los animales transgénicos son que esta tecnología se limita normalmente a los roedores. Entre los roedores y el ser humano existen diferencias significativas en la fisiología y no pueden extrapolarse fácilmente los

resultados de seguridad a seres humanos. Las limitaciones de un sustituto para el fármaco candidato son la diferente composición de materia en comparación con el fármaco candidato real y que, a menudo, los animales usados son roedores con la limitación comentada anteriormente. Por lo tanto, los datos preclínicos generados en roedores tienen una potencia predictiva limitada con respecto al fármaco candidato. El enfoque de elección para las pruebas de seguridad es el uso de especies pertinentes, preferentemente un primate inferior. La limitación ahora de las moléculas de unión a CD3 adecuadas para intervención terapéutica en el ser humano descrita en la técnica es que las especies pertinentes son primates superiores, en particular chimpancés. Los chimpancés se consideran una especie en peligro de extinción y, debido a su naturaleza parecida a los seres humanos, se ha prohibido el uso de tales animales para pruebas de seguridad de fármacos en Europa y está altamente restringido en otros lugares.

La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un primer dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu, y un segundo dominio de unión capaz de unirse a EGFR, Her2/neu o IgE de un ser humano y/o de un primate distinto de chimpancé.

Las secuencias mostradas en las SEQ ID NO. 2, 4, 6 y 8 y sus fragmentos son epítopos de CD3 independientes del contexto.

La ventaja de la presente invención es la provisión de un polipéptido que comprende un dominio de unión preferentemente humano que es un anticuerpo que muestra especificidad de especie cruzada frente a la cadena CD3ε (épsilon) humana y de primate distinto de chimpancé, que puede usarse para la evaluación preclínica de la seguridad, la actividad y/o el perfil farmacocinético de estos dominios de unión preferentemente humanos en primates y, en una forma idéntica, como fármacos en seres humanos. Se puede usar la misma molécula en estudios preclínicos en animales, así como en estudios clínicos en seres humanos. Esto da lugar a resultados altamente comparables y a un gran aumento de la potencia predictiva de los estudios en animales en comparación con las moléculas sustitutas específicas de especie. En la presente invención, se identificó de forma sorprendente un fragmento polipeptídico N-terminal de 1-27 residuos de aminoácido del dominio extracelular de la CD3 épsilon que, en contraste con todos los demás epítopos de CD3 épsilon conocidos descritos en la técnica, mantiene su integridad estructural tridimensional cuando se saca de su entorno nativo en el complejo CD3 (y se fusiona con una secuencia de aminoácidos heteróloga tal como EpCAM o una porción Fc de inmunoglobulina).

La independencia del contexto del epítopo de CD3 proporcionado en la presente invención corresponde a los primeros 27 aminoácidos N-terminales de CD3 épsilon o fragmentos funcionales de este tramo de 27 aminoácidos. La expresión "independiente del contexto", como se usa en el presente documento en relación con el epítopo de CD3, quiere decir que la unión de las moléculas de unión/moléculas de anticuerpo de la invención descritas en el presente documento no da lugar a un cambio o modificación de la conformación, secuencia o estructura que rodea al determinante antigénico o epítopo. En contraste, el epítopo de CD3 reconocido por una molécula de unión a CD3 convencional (p. ej., como se divulga en los documentos WO 99/54440 o WO 04/106380) está situado en la cadena CD3 épsilon, en C-terminal con respecto a los aminoácidos 1-27 N-terminales del epítopo independiente del contexto, donde sólo adopta la conformación correcta si está incluido en el resto de la cadena épsilon y se mantiene en la posición adecuada mediante heterodimerización de la cadena épsilon con cualquiera de las cadenas CD3 gamma o delta.

Las moléculas de unión anti-CD3 como parte de una molécula de unión biespecífica proporcionadas en el presente documento y generadas (y dirigidas) contra un epítopo de CD3 independiente del contexto permiten una mejoría clínica sorprendente con respecto a la redistribución de linfocitos T y, por tanto, un perfil de seguridad más favorable. Sin comprometerse con ninguna teoría, dado que el epítopo de CD3 es independiente del contexto, la formación de un subdominio autónomo autosuficiente sin mucha influencia sobre el resto del complejo CD3, las moléculas de unión a CD3 proporcionadas en el presente documento inducen menos cambios alostéricos en la conformación de CD3 que las moléculas de unión a CD3 convencionales (como las moléculas proporcionadas en el documento WO 99/54440), que reconocen epítopos de CD3 dependientes del contexto.

La independencia del contexto del epítopo de CD3 de las moléculas de unión a CD3 de la invención como parte de una molécula de unión biespecífica se asocia con menos redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 de la invención, dando como resultado un mejor perfil de seguridad de las moléculas de unión a CD3 de la invención en comparación con las moléculas de unión a CD3 convencionales conocidas en la técnica, que reconocen epítopos de CD3 dependientes del contexto. En particular, debido a que la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 es un factor de riesgo principal para acontecimientos adversos en el SNC, las moléculas de unión a CD3 de la invención, mediante el reconocimiento de un epítopo de CD3 independiente del contexto en lugar de dependiente del contexto, tienen una ventaja de seguridad sustancial con respecto a las moléculas de unión a CD3 conocidas en la técnica. Los pacientes con tales acontecimientos adversos en el SNC relacionados con la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales suelen padecer confusión y desorientación, en algunos casos también incontinencia urinaria. La confusión es un cambio del estado mental en el que el paciente no es capaz de pensar con el nivel de claridad habitual. Habitualmente, el paciente tiene dificultades

para concentrarse y el pensamiento no sólo es confuso y poco claro, sino que a menudo se ralentiza significativamente. Los pacientes con acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales también pueden sufrir pérdida de memoria. Frecuentemente, la confusión da lugar a la pérdida de capacidad para reconocer personas y/o lugares o decir la hora y la fecha. En la confusión son frecuentes sensaciones de desorientación y se deteriora la capacidad de tomar decisiones. Los acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales pueden comprender además dificultad para hablar y/o dificultad para encontrar las palabras. Este trastorno puede deteriorar tanto la expresión como la comprensión del lenguaje, así como la lectura y la escritura. Además de la incontinencia urinaria, también el vértigo y mareos pueden acompañar a los acontecimientos adversos del SNC relacionados con la redistribución de linfocitos T durante la fase inicial del tratamiento con moléculas de unión a CD3 convencionales en algunos pacientes.

El mantenimiento de la estructura tridimensional dentro del fragmento polipeptídico N-terminal de 27 aminoácidos de CD3 épsilon mencionado puede usarse para generar dominios de unión preferentemente humanos que se unen al fragmento polipeptídico de CD3 épsilon N-terminal in vitro y al complejo CD3 nativo (su subunidad CD3 épsilon) en linfocitos T in vivo con la misma afinidad de unión. Estos datos indican claramente que el fragmento N-terminal descrito en el presente documento adopta una conformación terciaria, que es similar a su estructura existente normalmente in vivo. Se realizó una prueba muy sensible para determinar la importancia de la integridad estructural de los aminoácidos 1-27 del fragmento polipeptídico N-terminal de CD3 épsilon. Se cambiaron aminoácidos individuales de los aminoácidos 1-27 del fragmento polipeptídico N-terminal de CD3 épsilon por alanina (rastreo de alanina) para probar la sensibilidad de los aminoácidos 1-27 del fragmento polipeptídico N-terminal de CD3 épsilon a alteraciones menores. Se usaron moléculas de anticuerpo específico para CD3 como parte de una molécula de unión biespecífica de la invención para probar la unión a los mutantes de alanina de los aminoácidos 1-27 del fragmento polipeptídico N-terminal de CD3 épsilon (véase el ejemplo 5 adjunto). Los intercambios individuales de los primeros cinco residuos de aminoácido justo en el extremo N-terminal del fragmento y dos de los aminoácidos de las posiciones 23 y 25 de los aminoácidos 1-27 del fragmento polipeptídico N-terminal de CD3 épsilon fueron críticos para la unión de las moléculas de anticuerpo. La sustitución de residuos de aminoácido en la región de la posición 1-5 que comprende los residuos Q (glutamina en la posición 1), D (ácido aspártico en la posición 2), G (glicina en la posición 3), N (asparagina en la posición 4) y E (ácido glutámico en la posición 5) por alanina suprimió la unión de las moléculas de unión preferentemente humanas de la invención a dicho fragmento. Si bien, para al menos algunas de las moléculas de unión preferentemente humanas de la invención, dos residuos de aminoácido del extremo C-terminal de fragmento mencionado, T (treonina en la posición 23) e I (isoleucina en la posición 25), redujeron la energía de unión a las moléculas de unión preferentemente humanas de la invención.

Inesperadamente, se ha descubierto que las moléculas de unión preferentemente humanas aisladas de este modo no sólo reconocen el fragmento N-terminal de CD3 épsilon humana, sino también los fragmentos homólogos correspondientes de CD3 épsilon de diversos primates, incluidos monos del Nuevo Mundo (titíes, Callithrix jacchus; Saguinus oedipus; Saimiri sciureus) y monos del Viejo Mundo (Macaca fascicularis, también conocido como mono cynomolgus; o Macaca mulatta, también conocido como mono rhesus). Por tanto, se detectó especificidad multiprimate de las moléculas de unión a CD3 de la invención. Los análisis de secuencia siguientes confirmaron que los seres humanos y los primates comparten un tramo de secuencia altamente homóloga en en extremo N-terminal del dominio extracelular de CD3 épsilon.

Como se define en las reivindicaciones, se ha descubierto en la presente invención que es posible generar moléculas de unión preferentemente humanas específicas para CD3 épsilon en las que puede usarse la misma molécula en pruebas preclínicas en animales, así como en estudios clínicos e incluso en tratamiento en seres humanos. Esto se debe a la inesperada identificación de moléculas de unión preferentemente humanas que, además de unirse a CD3 épsilon humana (y probablemente debido a la similitud genética con la correspondiente de chimpancé), también se unen a los homólogos de dichos antígenos de primates distintos de chimpancé, incluidos monos del Nuevo Mundo y monos del Viejo Mundo. Como se muestra en los ejemplos siguientes, dichas moléculas de unión preferentemente humanas específicas de CD3 épsilon pueden integrarse en anticuerpos monocatenarios biespecíficos con el fin de generar agentes terapéuticos contra diversas enfermedades, incluidas, entre otras, el cáncer o trastornos inmunológicos. Por tanto, desaparece la necesidad de construir un dominio de unión a CD3 épsilon sustituto o un anticuerpo monocatenario biespecífico que lo incluya para probarlo en una especie filogenéticamente alejada (de los seres humanos). Como consecuencia, puede usarse exactamente la misma molécula en pruebas preclínicas en animales que la que se pretende administrar a seres humanos en pruebas clínicas, así como en la posterior aprobación para su comercialización y administración terapéutica de fármacos. La capacidad de usar la misma molécula para pruebas preclínicas en animales que en la administración posterior a seres humanos prácticamente elimina, o al menos reduce considerablemente, el peligro de que los datos obtenidos en pruebas preclínicas en animales tengan aplicabilidad limitada para el caso de seres humanos. En resumen, la obtención de datos de seguridad preclínicos en animales usando la misma molécula que se va a administrar realmente a seres humanos, contribuye mucho a garantizar la aplicabilidad de los datos en un escenario pertinente a seres humanos. En contraste, en los enfoques convencionales que usan moléculas sustitutas, se han de adaptar molecularmente dichas moléculas sustitutas al sistema de prueba en animales para la evaluación de la seguridad preclínica. Por tanto, la molécula que se va a usar en el tratamiento de seres humanos difiere de hecho en la

secuencia y probablemente también en la estructura de la molécula sustituta usada en las pruebas preclínicas de parámetros farmacocinéticos y/o actividad biológica, con la consecuencia de que los datos obtenidos en las pruebas preclínicas en animales tienen aplicabilidad / transferibilidad limitadas para el caso de los seres humanos. El uso de moléculas sustitutas requiere la construcción, producción, purificación y caracterización de una construcción totalmente nueva. Esto da lugar a costes y tiempo de desarrollo adicionales necesarios para obtener la molécula. En resumen, se tienen que desarrollar los sustitutos por separado además del fármaco real que se va a usar en el tratamiento de seres humanos, por lo que deben llevarse a cabo dos líneas de desarrollo para dos moléculas. Por lo tanto, una ventaja principal de la molécula de unión humana o una construcción a base de anticuerpo que presenta especificidad de especie cruzada descrita en el presente documento es que puede usarse la misma molécula para tratamientos en seres humanos y en pruebas preclínicas en animales.

Para el polipéptido de la invención se prefiere que el primer dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé sea de origen humano.

Además, debido al origen humano de las moléculas de unión humanas de la invención se excluye en la mayor medida posible la generación de una reacción inmunitaria contra dichas moléculas de unión tras la administración de las moléculas de unión a pacientes humanos.

Otra ventaja principal de las moléculas de unión humanas específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas como parte de una molécula de unión biespecífica de la invención es su aplicabilidad para pruebas preclínicas en diversos primates. Idealmente, el comportamiento de un fármaco candidato en animales debería ser indicativo del comportamiento esperado de este fármaco candidato tras la administración a seres humanos. Como consecuencia, los datos obtenidos a partir de tales pruebas preclínicas deberían, por lo tanto, tener una potencia predictiva alta para el caso de seres humanos. Sin embargo, como se aprendió del resultado trágico del reciente ensayo de fase I de TGN1412 (un anticuerpo monoclonal frente a CD28), un fármaco candidato puede actuar de forma diferente en una especie de primate y en seres humanos: aunque en las pruebas preclínicas de dicho anticuerpo no se habían observado efectos adversos o eran sólo limitados en estudios realizados con monos cynomolgus, seis pacientes humanos desarrollaron insuficiencia multiorgánica tras la administración de dicho anticuerpo (Lancet 368 (2006), 2206-7). Los resultados de estos acontecimiento negativos no deseados indican que puede no ser suficiente limitar las pruebas preclínicas a una sola especie (de primates). El hecho de que las moléculas de unión humanas específicas de CD3 épsilon de la invención se unan a una serie de monos del Nuevo Mundo y del Viejo Mundo puede ayudar a superar los problemas que se presentaron en el caso mencionado anteriormente. En consecuencia, la presente invención como se define en las reivindicaciones proporciona medios y procedimientos para reducir al mínimo las diferencias entre especies en los efectos cuando se desarrollan y se prueban fármacos para el tratamiento de seres humanos.

Con el dominio de unión a CD3 épsilon específico de especies cruzadas, preferentemente humano, como parte de una molécula de unión biespecífica de la invención también deja de ser necesario adaptar el animal de prueba al fármaco candidato que se pretende administrar a seres humanos, tal como, p. ej., la creación de animales transgénicos. Las moléculas de unión específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos que las contienen), que presentan especificidad de especie cruzada de acuerdo con los usos y los procedimientos de la invención pueden usarse directamente para realizar pruebas preclínicas en primates distintos de chimpancés, sin manipular genéticamente a los animales. Como bien saben los expertos en la técnica, los enfoques en los que se adapta el animal de prueba al fármaco candidato siempre conllevan el riesgo de que los resultados obtenidos en las pruebas de seguridad preclínicas sean menos representativas y predictivas para seres humanos debido a la modificación del animal. Por ejemplo, en animales transgénicos, las proteínas codificadas por los transgenes están frecuentemente muy sobreexpresadas. Por tanto, los datos obtenidos para la actividad biológica de un anticuerpo contra el antígeno de esta proteína pueden tener un valor predictivo limitado para seres humanos, en los que la proteína se expresa a niveles mucho menores, más fisiológicos.

Una ventaja adicional de los usos de las moléculas de unión específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos que las contienen) que presentan especificidad de especie cruzada es el hecho de que se evitan los chimpancés, como especie en peligro de extinción, para las pruebas en animales. Los chimpancés son los parientes más cercanos a los seres humanos y se agruparon recientemente en la familia de los homínidos, basándose en los datos de secuenciación del genoma (Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Por lo tanto, los datos obtenidos con los chimpancés se considera en general altamente predictivos para seres humanos. Sin embargo, debido a su condición de especie en peligro de extinción, el número de chimpancés que se pueden usar para experimentos médicos está altamente restringido. Por lo tanto, como se ha indicado anteriormente, el mantenimiento de chimpancés para realizar pruebas en animales es tanto costoso como éticamente problemático. Los usos de moléculas de unión específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas de la invención (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos que las contienen) evita tanto las objeciones éticas como la carga económica durante las pruebas preclínicas sin perjudicar a la calidad, es decir, la aplicabilidad, de los datos de las pruebas en animales obtenidos. En vista de esto, los usos de moléculas de unión específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos que las contienen) proporciona una alternativa razonable a los estudios en chimpancés.

Una ventaja adicional las moléculas de unión específicas de CD3 épsilon preferentemente humanas de la invención

(o anticuerpos monocatenarios biespecíficos que las contienen) es la capacidad de extraer varias muestras de sangre cuando se usa como parte de pruebas preclínicas en animales, por ejemplo, durante el curso de estudios farmacocinéticos en animales. Las extracciones de sangre múltiples se pueden obtener mucho más fácilmente con un primate distinto de chimpancé que con animales inferiores, p. ej., un ratón. La extracción de varias muestras de sangre permite probar parámetros sanguíneos de forma continua para la determinación de los efectos biológicos inducidos por la molécula de unión preferentemente humana de la invención (o anticuerpo monocatenario biespecífico que la contiene). Además, la extracción de varias muestras de sangre permite al investigador evaluar el perfil farmacocinético de la molécula de unión preferentemente humana (o anticuerpo monocatenario biespecífico) definida en el presente documento. Además, efectos secundarios potenciales, que puede inducir dicha molécula de unión preferentemente humana (o anticuerpo monocatenario biespecífico) reflejados en los parámetros sanguíneos, se pueden medir en diferentes muestras de sangre extraídas durante el curso de la administración de dicho anticuerpo. Esto permite la determinación del perfil de toxicidad potencial de la molécula de unión preferentemente humana (o anticuerpo monocatenario biespecífico) definida en el presente documento.

Las ventajas de la molécula de unión preferentemente humana (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos) definida en el presente documento que presenta especificidad de especie cruzada puede resumirse brevemente como sigue:

En primer lugar, las moléculas de unión preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos) definidas en el presente documento usadas en pruebas preclínicas son las mismas que se usan en el tratamiento de seres humanos. Por tanto, ya no es necesario desarrollar dos moléculas independientes, que pueden diferir en sus propiedades farmacocinéticas y su actividad biológica. Esto es altamente ventajoso en que, p. ej., los resultados farmacocinéticos pueden transferirse y aplicarse más directamente al entorno humano que, p. ej., en enfoques de sustitutos convencionales.

En segundo lugar, los usos de las moléculas de unión preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos) definidas en el presente documento para la preparación de tratamientos para seres humanos es menos costoso y laborioso que los enfoques de sustitutos.

En tercer lugar, las moléculas de unión preferentemente humanas (o anticuerpos monocatenarios biespecíficos) definidas en el presente documento pueden usarse para realizar pruebas preclínicas no sólo en una especie de primate, sino en una serie de especies de primates diferentes, limitando de este modo el riesgo de posibles diferencias de especie entre primates y seres humanos.

En cuarto lugar, se evita el chimpancé, como especie en peligro de extinción, para realizar pruebas en animales.

En quinto lugar, pueden extraerse varias muestras de sangre para estudios farmacocinéticos extensos.

En sexto lugar, debido al origen humano de las moléculas de unión preferentemente humanas de acuerdo con una realización preferida de la invención, se reduce al mínimo la generación de una reacción inmunitaria contra dichas moléculas de unión cuando se administra a pacientes humanos. Queda excluida la inducción de una respuesta inmunitaria con anticuerpos específicos frente a un fármaco candidato derivado de una especie no humana como, p. ej., un ratón que dé lugar al desarrollo de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) contra moléculas terapéuticas de origen murino.

El término "proteína" se conoce bien en la técnica y describe compuestos biológicos. Las proteínas comprenden una

o más cadenas de aminoácidos (polipéptidos), donde los aminoácidos se enlazan entre sí a través de un enlace peptídico. El término "polipéptido" como se usa en el presente documento describe un grupo de moléculas que consisten en más de 30 aminoácidos. De acuerdo con la invención, el grupo de polipéptidos comprende "proteínas" siempre que las proteínas consistan en un único polipéptido. También de acuerdo con la definición, el término "polipéptido" describe fragmentos de proteínas siempre que estos fragmentos consistan en más de 30 aminoácidos. Además, los polipéptidos pueden formar multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, que consisten en más de una molécula de polipéptido. Las moléculas de polipéptido que forman tales dímeros, trímeros etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las estructuras de orden superior correspondientes de tales multímeros se denominan, en consecuencia, homo-o heterodímeros, homo-o heterotrímeros etc. Un ejemplo de un heteromultímero es una molécula de anticuerpo que, en su forma natural, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos "polipéptido" y "proteína" también se refieren a polipéptidos/proteínas modificados de forma natural en los que la modificación se efectúa, p. ej., por modificaciones postraduccionales como glucosilación, acetilación, fosforilación y similares. Las modificaciones de este tipo se conocen bien en la técnica.

Como se usa en el presente documento, "humano" y "ser humano" se refiere a la especie Homo sapiens. Por lo que respecta a los usos médicos de las construcciones descritas en el presente documento, debe tratarse a los pacientes humanos con la misma molécula.

El término "origen humano" como se usa en el contexto con las moléculas de la invención describe moléculas derivables de colecciones humanas o que tienen una estructura/secuencia correspondiente al equivalente humano. En consecuencia, se entiende que proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos correspondiente a la

secuencia humana análoga, p. ej., un fragmento de anticuerpo que tiene secuencias de aminoácidos en el marco correspondiente a las secuencias humanas de línea germinal, son moléculas de origen humano.

Como se usa en el presente documento, un "primate distinto de chimpancé" o "primate no-chimp." o sus variantes gramaticales, se refiere a cualquier primate distinto del chimpancé, es decir, distinto de un animal perteneciente al género Pan, e incluidas las especies Pan paniscus y Pan troglodytes, también conocidas como Anthropopithecus troglodytes o Simia satyrus. Un "primate", "especie de primate", "primates" o sus variantes gramaticales designa/n un orden de mamíferos euterios divididos en los dos subórdenes de prosimios y antropoides y que comprenden el ser humano, simios, monos y lemures. Específicamente, "primates" como se usa en el presente documento comprende el suborden Strepsirrhini (prosimios no tarseros), incluido el infraorden Lemuriformes (que incluye a su vez las superfamilias Cheirogoleidae y Lemuroidae), el infraorden Chiromyiformes (que incluye a su vez la familia Daubentoniidae) y el infraorden Lorisiformes (que incluye a su vez las familias Lorisidae y Galagidae). "Primates" como se usa en el presente documento comprende también el suborden Haplorrhini, incluido el infraorden Tarsiiformes (que incluye a su vez la familia Tarsiidae), el infraorden Simiiformes (que incluye a su vez los Platyrrhini

o monos del Nuevo Mundo, y los Catarrhini, incluidos los Cercopithecidae o monos del Viejo Mundo).

Dentro del significado de la invención, se puede entender que las especies de primates distintas del chimpancé son un lemur, un tarsero, un gibón, un tití (perteneciente a los monos del Nuevo Mundo de la familia Cebidae) o un mono del Viejo Mundo (perteneciente a la superfamilia Cercopithecoidae).

Como se usa en el presente documento, un "mono del Viejo Mundo" comprende cualquier mono que entre dentro de la superfamilia Cercopithecoidae, que se subdivide a su vez en las familias: Cercopithecinae, que son principalmente africanos pero incluyen los diversas géneros de macacos que son asiáticos y norteafricanos; y Colobinae, que incluyen la mayoría de los géneros asiáticos, pero también los monos colobos africanos.

Específicamente, dentro de la subfamilia Cercopithecinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser de la tribu Cercopithecini, dentro del género Allenopithecus (mono de Allen, Allenopithecus nigroviridis); dentro del género Miopithecus (talapoin angoleño, Miopithecus talapoin; talapoin de Gabón, Miopithecus ogouensis); dentro del género Erythrocebus (mono patas, Erythrocebus patas); dentro del género Chlorocebus (mono verde, Chlorocebus sabaceus; tota verde, Chlorocebus aethiops; mono verde de las montañas Bale, Chlorocebus djamdjamensis; mono tántalo, Chlorocebus tantalus; mono vervet, Chlorocebus pygerythrus; Malbrouck, Chlorocebus cynosuros); o dentro del género Cercopithecus (mono de Dryas o mono de Salongo, Cercopithecus dryas; mono diana, Cercopithecus diana; mono Roloway, Cercopithecus roloway, cercopiteco grande de nariz blanca, Cercopithecus nictitans; mono azul, Cercopithecus mitis; mono de plata, Cercopithecus doggetti; mono de oro, Cercopithecus kandti; mono de Sykes, Cercopithecus albogularis; cercopiteco mona, Cercopithecus mona; cercopiteco mona de Campbell, Cercopithecus campbelli; cercopiteco mona de Lowe, Cercopithecus lowei; cercopiteco mona coronado, Cercopithecus pogonias; cercopiteco mona de Wolf, Cercopithecus wolfi; cercopiteco mona de Dent, Cercopithecus denti; cercopiteco menor de nariz blanca, Cercopithecus petaurista; cercopiteco de garganta blanca, Cercopithecus erythrogaster, cercopiteco de Sclater, Cercopithecus sclateri; cercopiteco de orejas rojas, Cercopithecus erythrotis; mono de hocico azul, Cercopithecus cephus; cercopiteco de cola roja, Cercopithecus ascanius; cercopiteco de L'Hoest, Cercopithecus Ihoesti; cercopiteco de Preuss, Cercopithecus preussi; cercopiteco de Gabón, Cercopithecus solatus; cercopiteco de Hamlyn o cercopiteco de cara de búho, Cercopithecus hamlyni; cercopiteco de Brazza, Cercopithecus neglectus).

De forma alternativa, un primate distinto de chimpancé ventajoso, también dentro de la subfamilia Cercopithecinae pero dentro de la tribu Papionini, puede ser del género Macaca (macaco de Berbería, Macaca sylvanus; macaco de cola de león, Macaca silenus; macaco cola de cerdo sureño o Beruk, Macaca nemestrina; macaco cola de cerdo norteño, Macaca leonina; macaco de la isla Pagai o Bokkoi, Macaca pagensis; macaco de Siberut, Macaca siberu; macaco moro, Macaca maura; macaco calzado, Macaca ochreata; macaco de Togian, Macaca tonkeana; macaco de Heck, Macaca hecki; macaco de Gorontalo, Macaca nigriscens; macaco crestado de Célebes o "simio" negro, Macaca nigra; mono cynomolgus o macaco cangrejero o macaco de cola larga o Kera, Macaca fascicularis; macaco rabón o macaco oso, Macaca arctoides; macaco rhesus, Macaca mulatta; macaco de Formosa, Macaca cyclopis; macaco japonés, Macaca fuscata; macaco de cofia, Macaca sinica; macado coronado, Macaca radiata; macaco de Berbería, Macaca sylvanus; macaco de Assam, Macaca assamensis; macaco tibetano o macaco de Milne-Edwards, Macaca thibetana; macaco de Arunachal o munzala, Macaca munzala); dentro del género Lophocebus (mangabeye de mejillas grises, Lophocebus albigena; Lophocebus albigena albigena; Lophocebus albigena osmani; Lophocebus albigena johnstoni; mangabeye de cresta negra, Lophocebus aterrimus; mangabeye de Opdenbosch, Lophocebus opdenboschi; mangabeye de las tierras altas, Lophocebus kipunji); dentro del género Papio (papión sagrado, Papio hamadryas; papión de Guinea, Papio papio; papión oliva, Papio anubis; papión amarillo, Papio cynocephalus; papión chacma, Papio ursinus); dentro del género Theropithecus (Gelada, Theropithecus gelada); dentro del género Cercocebus (mangabeye gris, Cercocebus atys; Cercocebus atys atys; Cercocebus atys lunulatus; mangabeye de boina roja, Cercocebus torquatus; mangabeye ágil, Cercocebus agilis; mangabeye de vientre dorado, Cercocebus chrysogaster: mangabeye del río Tana, Cercocebus galeritus; mangabeye del río Sanje, Cercocebus sanjei); o dentro del género Mandrillus (mandril, Mandrillus sphinx; dril, Mandrillus leucophaeus).

El más preferido es el Macaca fascicularis (también conocido como mono cynomolgus y, por lo tanto, denominado en los ejemplos "cynomolgus") y el Macaca mulatta (mono rhesus, denominado "rhesus").

Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser del grupo africano, dentro del género Colobus (colobo negro, Colobus satanas; colobo angoleño, Colobus angolensis; colobo rey, Colobus polykomos; colobo ursino, Colobus vellerosus; colobo oriental negro y blanco, Colobus guereza); dentro del género Piliocolobus (colobo rojo occidental, Piliocolobus badius; Piliocolobus badius badius; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius waldronae; colobo de Pennant, Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii pennantii; Piliocolobus pennantii epieni; Piliocolobus pennantii bouvieri; colobo rojo de Preuss, Piliocolobus preussi; colobo rojo de Thollon, Piliocolobus tholloni, colobo rojo centroafricano, Piliocolobus foai; Piliocolobus foai foai; Piliocolobus foai ellioti; Piliocolobus foai oustaleti; Piliocolobus foai semlikiensis; Piliocolobus foai parmentierorum; colobo rojo ugandés, Piliocolobus tephrosceles; colobo rojo de Uzyngwa, Piliocolobus gordonorum; colobo rojo de Zanzíbar, Piliocolobus kirkii; colobo rojo del río Tana, Piliocolobus rufomitratus); o dentro del género Procolobus (colobo oliva, Procolobus verus).

Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate no chimpancé ventajoso puede ser, de forma alternativa, del grupo de los langures (mono de hoja), dentro del género Semnopithecus (langur gris de Nepal, Semnopithecus schistaceus; langur gris de Cachemira, Semnopithecus ajax; langur gris de Tarai, Semnopithecus hector; langur hanumán, Semnopithecus entellus; langur gris de pies negros, Semnopithecus hypoleucos; langur gris de las planicies del sur, Semnopithecus dussumieri; langur gris moñudo, Semnopithecus priam); dentro del grupo T. vetulus o el género Trachypithecus (langur de cara púrpura, Trachypithecus vetulus; langur de Nilgiri, Trachypithecus johnii); dentro del grupo T. cristatus del género Trachypithecus (langur javanés, Trachypithecus auratus; mono de hoja plateado o langur plateado, Trachypithecus cristatus; langur de Indochina, Trachypithecus germaini; langur de Tenasserim, Trachypithecus barbei); dentro del grupo T. obscurus del género Trachypithecus (langur oscuro o langur de anteojos, Trachypithecus obscurus; langur de Phayre, Trachypithecus phayrei); dentro del grupo T. pileatus del género Trachypithecus (langur de gorra, Trachypithecus pileatus; langur de Shortridge, Trachypithecus shortridgei; langur dorado de Gee, Trachypithecus geei); dentro del grupo T. francoisi del género Trachypithecus (langur de Francois, Trachypithecus francoisi; langur de Ha tinh, Trachypithecus hatinhensis; langur de cabeza blanca, Trachypithecus poliocephalus; langur laosiano, Trachypithecus laotum; langur de Delacour, Trachypithecus delacouri; langur negro de Indochina, Trachypithecus ebenus); o dentro del género Presbytis (surili de Sumatra, Presbytis melalophos; surili de bandas, Presbytis femoralis; surili de Sarawak, Presbytis chrysomelas; surili de muslos blancos, Presbytis siamensis; surili de frente blanca, Presbytis frontata; surili javanés, Presbytis comata; langur de Thomas, Presbytis thomasi; langur de Hose, Presbytis hosei; langur marrón, Presbytis rubicunda; langur de Mentawai o Joja, Presbytis potenziani; surili de la isla Natuna, Presbytis natunae).

Dentro de la subfamilia Colobinae, un primate distinto de chimpancé ventajoso puede ser, de forma alternativa, del grupo platirrino, dentro del género Pygathrix (duc de canillas rojas, Pygathrix nemaeus; duc de canillas negras, Pygathrix nigripes; duc de canillas grises, Pygathrix cinerea); dentro del género Rhinopithecus (langur chato dorado, Rhinopithecus roxellana; langur negro de nariz chata, Rhinopithecus bieti; langur gris de nariz chata, Rhinopithecus brelichi; langur de nariz chata de Tonkin, Rhinopithecus avunculus); dentro del género Nasalis (mono narigudo, Nasalis larvatus); o dentro del género Simias (langur cola de cerdo, Simias concolor).

Como se usa en el presente documento, el término "tití" designa cualquier mono del Nuevo Mundo del género Callithrix, por ejemplo, perteneciente a los titíes atlánticos del subgénero Callithrix (¡sic!) (tití común, Callithrix (Callithrix) jacchus; tití de pincel negro, Callithrix (Callithrix) penicillata; tití de orejas negras, Callithrix (Callithrix) kuhlii; tití de cabeza blanca, Callithrix (Callithrix) geoffroyi; tití de cabeza beige, Callithrix (Callithrix) flaviceps; tití de orejas blancas, Callithrix (Callithrix) aurita); pertenecientes a los titíes amazónicos del subgéneros Mico (tití del río Acarí, Callithrix (Mico) acariensis; tití de Manicoré, Callithrix (Mico) manicorensis; tití plateado, Callithrix (Mico) argentata; tití blanco, Callithrix (Mico) leucippe; tití de Snethlage, Callithrix (Mico) emiliae; tití de cabeza negra, Callithrix (Mico) nigriceps; tití de Marca, Callithrix (Mico)marcai; tití de cola negra, Callithrix (Mico) melanura; tití oreja de borla, Callithrix (Mico) humeralifera; tití de Maues, Callithrix (Mico) mauesi; tití dorado y blanco, Callithrix (Mico) chrysoleuca; tití de Aripuana, Callithrix (Mico) intermedia; tití de cara blanca, Callithrix (Mico) saterei; tití enano de Roosmalens perteneciente al subgénero Callibella (Callithrix (Callibella) humilis); o el tití pigmeo perteneciente al subgénero Cebuella (Callithrix (Cebuella) pygmaea).

Otros géneros de monos del Nuevo Mundo comprenden tamarinos del género Saguinus (que comprende el grupo S. oedipus, el grupo S. midas, el grupo S. nigricollis, el grupo S. mystax, el grupo S. bicolor y el grupo S. inustus) y monos ardilla del género Saimiri (p. ej. Saimiri sciureus, Saimiri oerstedii, Saimiri ustus, Saimiri boliviensis, Saimiri vanzolini).

En relación con la presente invención, el término "dominio de unión" caracteriza un dominio de un polipéptido que se une/interacciona específicamente con un antígeno/estructura/epítopo dado. Por tanto, el dominio de unión es un "sitio de interacción con antígeno". El término "sitio de interacción con antígeno" define, de acuerdo con la presente invención, un motivo de un polipéptido, que es capaz de interaccionar específicamente con un antígeno específico o un grupo de antígenos específico, p. ej., el mismo antígenos en diferentes especies. Se entiende que dicha unión/interacción también define un "reconocimiento específico". La expresión "que reconoce específicamente" significa, de acuerdo con la presente invención, que la molécula de anticuerpo es capaz de interaccionar específicamente con y/o unirse a al menos dos, preferentemente al menos tres, más preferentemente al menos cuatro, aminoácidos de un antígeno, p. ej., el antígeno de CD3 humana como se define en el presente documento. Tal unión se puede ejemplificar mediante la especificidad de un "principio de cerradura y llave". Por tanto, motivos

específicos de la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno se unen entre sí como resultado de su estructura primaria, secundaria o terciaria, y como consecuencia de las modificaciones secundarias de dicha estructura. La interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar lugar también a una unión sencilla de dicho sitio al antígeno. Además, de forma alternativa, la interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno específico puede dar como resultado la iniciación de una señal, p. ej., debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc. Un ejemplo preferido de un dominio de unión de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo. El dominio de unión puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal o derivado de un anticuerpo monoclonal o policlonal.

El término "anticuerpo" comprende derivados o fragmentos funcionales de él que aún mantienen la especificidad de unión. En la técnica se conocen bien técnicas para la producción de anticuerpos y se describen, p. ej., en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y en Harlow y Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. El término "anticuerpo" también comprende inmunoglobulinas (Ig) de diferentes clases (es decir, IgA, IgG, IgM, IgD e IgE) y subclases (tales como lgG1, lgG2, etc.). Pueden usarse estos anticuerpos, por ejemplo, para la inmunoprecipitación, la purificación por afinidad y la inmunolocalización de los polipéptidos o proteínas de fusión de la invención, así como para controlar la presencia y la cantidad de dichos polipéptidos, por ejemplo, en cultivos de células u organismos procariotas o eucariotas recombinantes.

La definición del término "anticuerpo" también incluye realizaciones tales como anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados, así como fragmentos de anticuerpo como, entre otros, fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpo o derivados comprenden además fragmentos F(ab')2, Fv, scFv o anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio variable único o dominio variable único de inmunoglobulina que comprende sólo un dominio variable, que puede ser VH o VL, que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V; véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) y (1999), loc. cit. Tal dominio variable único de inmunoglobulina comprende no sólo un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo aislado, sino también polipéptidos más grandes que comprenden uno o más monómeros de una secuencia polipeptídica de dominio variable único de anticuerpo.

Se conocen en la técnica diversos procedimientos y pueden usarse para la producción de tales anticuerpos y/o fragmentos. Por tanto, pueden producirse los derivados (de anticuerpo) mediante peptidomiméticos. Además, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véase, entre otras, la patente de EE. UU. 4.946.778) para producir anticuerpos monocatenarios específicos para polipéptido(s) elegido(s). Asimismo, pueden usarse animales transgénicos para expresar anticuerpos humanizados específicos para polipéptidos y proteínas de fusión de la presente invención. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos de línea celular continua. Los ejemplos de técnicas de este tipo incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein Nature 256 (1975), 495497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica de hibridoma-VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). Puede usarse la resonancia de plasmón superficial como se emplea en el sistema BIAcore para aumentar la eficacia de anticuerpos en fagos que se unen a un epítopo de un polipéptido objetivo, tal como CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). También se contempla en el contexto de la presente invención que el término "anticuerpo" comprenda construcciones de anticuerpos, que pueden expresarse en un huésped como se describe en el presente documento más adelante, p. ej., construcciones de anticuerpos que se pueden transfectar y/o transducir a través de, entre otros, virus o vectores plasmídicos.

El término "interacción específica" como se usa de acuerdo con la presente invención significa que la molécula de unión (dominio) no presenta reactividad cruzada, o no es significativa, con polipéptidos que tienen estructura similar a la de los unidos por la molécula de unión, y que se podría expresar por las mismas células que el polipéptido de interés. Puede probarse la reactividad cruzada de un conjunto de moléculas de unión en investigación, por ejemplo, evaluando la unión de dicho conjunto de moléculas de unión bajo condiciones convencionales (véase, p. ej., Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Los ejemplos de la interacción de un dominio de unión con un antígeno específico comprenden la especificidad de un ligando por su receptor. Dicha definición comprende, en particular, la interacción de ligandos, que inducen una señal tras la unión a su receptor específico. Un ejemplo de dicha interacción, comprendida también en particular por dicha definición, es la interacción de un determinante antigénico (epítopo) con el dominio de unión (sitio de unión antigénico) de un anticuerpo.

El término "especificidad de especie cruzada" o "especificidad interespecies" como se usa en el presente documento significa la unión de un dominio de unión descrito en el presente documento a la misma molécula objetivo en seres humanos y en primates distintos de chimpancé. Por tanto, debe entenderse "especificidad de especie cruzada" o "especificidad interespecies" como una reactividad interespecies por la misma molécula X expresada en especies diferentes, pero no por una molécula distinta de X. La especificidad de especie cruzada de un anticuerpo monoclonal que reconoce, p. ej., CD3 épsilon humana, por la CD3 épsilon de un primate distinto de chimpancé, p. ej., CD3 épsilon de macaco, se puede determinar, por ejemplo, mediante análisis FACS. El análisis FACS se lleva a cabo de manera que se prueba la unión del anticuerpo monoclonal correspondiente a células

humanas y de primate distinto de chimpancé, p. ej., células de macaco, que expresan dichos antígenos de CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, respectivamente. En los ejemplos siguientes se muestra un ensayo apropiado.

Como se usa en el presente documento, CD3 épsilon designa una molécula expresada como parte del receptor de linfocitos T y tiene el significado que se le atribuye normalmente en la técnica anterior. En seres humanos engloba de forma individual o combinada independientemente, todas las subunidades CD3 conocidas, por ejemplo CD3 épsilon, CD3 delta, CD3 gamma, CD3 zeta, CD3 alfa y CD3 beta. Los antígenos de CD3 de primate distinto de chimpancé a los que se hace referencia en el presente documento son, por ejemplo, CD3 de Macaca fascicularis y CD3 de Macaca mulatta. En Macaca fascicularis, engloba CD3 épsilon negativa para FN-18 y CD3 épsilon positiva para FN-18, CD3 gamma y CD3 delta. En Macaca mulatta, engloba CD3 épsilon, CD3 gamma y CD3 delta. Preferentemente, dicha CD3 como se usa en el presente documento es CD3 épsilon.

La CD3 épsilon humana se indica en el número de acceso de GenBank NM_000733 y comprende la SEQ ID NO. 1. La CD3 gamma humana se indica en el número de acceso de GenBank NM_000073. La CD3 delta humana se indica en el número de acceso de GenBank NM_000732.

La CD3 épsilon "negativa para FN-18" de Macaca fascicularis (es decir, CD3 épsilon no reconocida por el anticuerpo monoclonal FN-18 debido a un polimorfismo, como se expone anteriormente) se indica en el número de acceso de GenBank AB073994.

La CD3 épsilon "positiva para FN-18" de Macaca fascicularis (es decir, la CD3 épsilon reconocida por el anticuerpo monoclonal FN-18) se indica en el número de acceso de GenBank AB073993. La CD3 gamma de Macaca fascicularis se indica en el número de acceso de GenBank AB073992. La CD3 delta de Macaca fascicularis se indica en el número de acceso de GenBank AB073991.

Las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias de aminoácidos de los homólogos correspondientes de CD3 épsilon, gamma y delta de Macaca mulatta se pueden identificar y aislar mediante técnicas recombinantes descritas en la técnica (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición 2001). Esto es aplicable, con los cambios oportunos, a los homólogos de CD3 épsilon, gamma y delta de otros primates distintos de chimpancé definidos en el presente documento. En los ejemplos adjuntos se describe la identificación de la secuencia de aminoácidos de Callithrix jacchus, Saimiri sciureus y Saguinus oedipus. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la CD3 épsilon de Callithrix jacchus se representa en la SEQ ID NO: 3, la de Saguinus oedipus se representa en la SEQ ID NO: 5 y la de Saimiri sciureus se representa en la SEQ ID NO: 7.

De acuerdo con lo anterior, el término "epítopo" define un determinante antigénico, al que se une/lo identifica específicamente una molécula de unión como se define anteriormente. El dominio o las moléculas de unión pueden unirse a/interaccionar específicamente con epítopos conformacionales o continuos, que son exclusivos para la estructura objetivo, p. ej., la cadena CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé. Un epítopo conformacional o discontinuo se caracteriza para antígenos polipeptídicos por la presencia de dos o más residuos de aminoácido distintos que están separados en la secuencia primaria, pero se juntan sobre la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega en la proteína/antígeno nativo (Sela, (1969) Science 166, 1365 y Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Los dos o más residuos de aminoácido distintos que constituyen el epítopo están presentes en secciones separadas de una o más cadena(s) polipeptídica(s). Estos residuos se juntan sobre la superficie de la molécula cuando la(s) cadena(s) polipeptídica(s) se pliegan(n) en una estructura tridimensional para constituir el epítopo. En contraste, un epítopo lineal o continuo consiste en dos o más residuos de aminoácido distintos, que están presentes en un único segmento lineal de una cadena polipeptídica. Dentro de la presente invención, un epítopo de CD3 "dependiente del contexto" se refiere a la conformación de dicho epítopo. Un epítopo dependiente del contexto de este tipo, situado en la cadena épsilon de CD3, sólo puede desarrollar su conformación correcta si se incluye en el resto de la cadena épsilon y se mantiene en la posición adecuada mediante heterodimerización de la cadena épsilon con la cadena CD3 gamma o delta. En contraste, un epítopo de CD3 independiente del contexto como se proporciona en el presente documento se refiere a un polipéptido N-terminal de 1-27 residuos de aminoácido o uno de sus fragmentos funcionales de CD3 épsilon. Este polipéptido N-terminal de 1-27 residuos de aminoácido o uno de sus fragmentos funcionales mantiene su integridad estructural tridimensional y la conformación correcta cuando se saca de su entorno nativo en el complejo CD3. La independencia del contexto del polipéptido Nterminal de 1-27 residuos de aminoácido o uno de sus fragmentos funcionales, que forma parte del dominio extracelular de CD3 épsilon representa, por tanto, un epítopo que es completamente diferente de los epítopos de CD3 épsilon descritos en relación con un procedimiento para la preparación de moléculas de unión humanas en el documento WO 2004/106380. Dicho procedimiento usaba CD3 épsilon recombinante expresada exclusivamente. La conformación de esta CD3 épsilon recombinante expresada exclusivamente difería de la adoptada en su forma natural, es decir, la forma en que la subunidad CD3-épsilon del complejo TCR/CD3 existe como parte de un complejo no covalente con la subunidad CD3-delta o la CD3-gamma del complejo TCR/CD3. Cuando se usa dicha proteína CD3-épsilon recombinante expresada exclusivamente como antígeno para la selección de anticuerpos a partir de una colección de anticuerpos, se identifican anticuerpos específicos para este antígeno a partir de la colección, aunque tal colección no contenga anticuerpos con especificidad por antígenos propios/autoantígenos. Esto se debe al hecho de que la proteína CD3-épsilon recombinante expresada exclusivamente no existe in vivo; no

es un autoantígeno. En consecuencia, no han disminuido las subpoblaciones de linfocitos B que expresan anticuerpos específicos para esta proteína in vivo; una colección de anticuerpos construida a partir de tales linfocitos B contendría material genético para anticuerpos específicos para la proteína CD3-épsilon recombinada expresada exclusivamente.

Sin embargo, dado que el polipéptido de N-terminal de 1-27 residuos de aminoácido independiente del contexto o uno de sus fragmentos funcionales es un epítopo, que se pliega en su forma nativa, no se pueden identificar dominios de unión de acuerdo con la presente invención mediante procedimientos basados en el enfoque descrito en el documento WO 04/106380. Por lo tanto, podría verificarse en pruebas que las moléculas de unión divulgadas en el documento WO 04/106380 no pueden unirse a los residuos de aminoácido 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon. Por tanto, las moléculas de unión anti-CD3 o las moléculas de anticuerpo anti-CD3 convencionales (p. ej., las divulgadas en el documento WO 99/54440) se unen a la cadena CD3 épsilon en una posición que se sitúa más cerca del extremo C-terminal que el polipéptido N-terminal de 1-27 residuos de aminoácido o uno de sus fragmentos funcionales proporcionados en el presente documento. Las moléculas de anticuerpo de la técnica anterior OKT3 y UCHT-1 también tienen una especificidad por la subunidad épsilon del complejo TCR/CD3 entre los residuos de aminoácido 35 y 85 y, en consecuencia, el epítopo de estos anticuerpos también se sitúa más cerca del extremo C-terminal. Además, el UCHT-1 se une a la cadena CD3 épsilon en una región entre los residuos de aminoácido de 43 a 77 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52). Por lo tanto, las moléculas anti-CD3 de la técnica anterior no se unen a y no se dirigen contra el epítopo de los residuos de aminoácido 1-27 N-terminales independiente de contexto definido en el presente documento (o uno de sus fragmentos funcionales).

Para generar un dominio de unión preferentemente humano comprendido en un polipéptido de la invención, p. ej., en un anticuerpo monocatenario biespecífico como se define en el presente documento, pueden usarse, p. ej., anticuerpos monoclonales que se unan a CD3 épsilon tanto humana como de primate distinto de chimpancé (p. ej., CD3 épsilon de macaco).

En una realización preferida del polipéptido de la invención, el primate distinto de chimpancé es un mono del Viejo Mundo. En una realización más preferida del polipéptido, el mono del Viejo Mundo es un mono del género Papio o del género macaco. Lo más preferentemente, el mono del género macaco es un macaco de Assam (Macaca assamensis), macaco de Berbería (Macaca sylvanus), macaco coronado (Macaca radiata), macaco calzado o calzado de Sulawesi (Macaca ochreata), macaco crestado de Célebes (Macaca nigra), macaco de Formosa (Macaca cyclopsis), macaco japonés o macaco de cara roja (Macaca fuscata), mono cynomologus o macaco cangrejero o macaco de cola larga o macaco de Java (Macaca fascicularis), macaco de cola de león (Macaca silenus), macaco cola de cerdo (Macaca nemestrina), macaco rhesus (Macaca mulatta), macaco tibetano (Macaca thibetana), macaco de Togian (Macaca tonkeana), macaco de cofia (Macaca sinica), macaco rabón o macaco de cara roja o macaco oso (Macaca arctoides), o macaco moro (Macaca maurus). Lo más preferentemente, el mono del género Papio es papión sagrado, Papio hamadryas; papión de Guinea, Papio papio; papión oliva, Papio anubis; papión amarillo, Papio cynocephalus; papión chacma, Papio ursinus.

En una realización preferida de forma alternativa del polipéptido de la invención, el primate distinto de chimpancé es un mono del Nuevo Mundo. En una realización más preferida del polipéptido, el mono del Nuevo Mundo es un mono del género Callithrix (tití), del género Saguinus o del género Saimiri. Lo más preferentemente, el mono del género Callithrix es Callithrix jacchus, el mono del género Saguinus es Saguinus oedipus y el mono del género Saimiri es Saimiri sciureus.

Como se describe anteriormente en el presente documento, el polipéptido de la invención se une con el primer dominio de unión a un epítopo de la cadena CD3ε (épsilon) humana y de primate distinto de chimpancé, en la que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en 27 residuos de aminoácido como se representa en las SEQ ID NO. 2, 4, 6 u 8. De acuerdo con la presente invención, se prefiere para el polipéptido de la invención que dicho epítopo forme parte de una secuencia de aminoácidos que comprenda 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 aminoácidos. Más preferentemente, en la que dicho epítopo comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (Q-D-G-N-E-D).

Dentro de la presente invención, un "fragmento funcional de los residuos de aminoácido 1-27 N-terminales" significa que dicho fragmento funcional sigue siendo un epítopo independiente del contexto que mantiene su integridad estructural tridimensional cuando se saca de su entorno nativo en el complejo CD3 (y se fusiona con una secuencia de aminoácidos heteróloga tal como EpCAM o una porción Fc de inmunoglobulina, p. ej., como se muestra en el ejemplo 3.1). El mantenimiento de la estructura tridimensional dentro del fragmento polipeptídico N-terminal de 27 aminoácidos de CD3 épsilon o uno de sus fragmentos funcionales puede usarse para generar dominios de unión que se unen al fragmento polipeptídico de CD3 épsilon N-terminal in vitro y al complejo CD3 nativo (su subunidad CD3 épsilon) en linfocitos T in vivo con la misma afinidad de unión. Dentro de la presente invención, un fragmento funcional de los 1-27 residuos de aminoácido N-terminales significa que las moléculas de unión a CD3 proporcionadas en el presente documento todavía pueden unirse a tales fragmentos funcionales de manera independiente del contexto. El experto en la técnica conoce los procedimientos de mapeo de epítopos para determinar qué residuos de aminoácido de un epítopo reconocen tales moléculas de unión anti-CD3 (p. ej., rastreo de alanina o análisis PepSpot).

En una realización preferida de la invención, el polipéptido de la invención comprende un (primer) dominio de unión como se define en el presente documento y un segundo dominio de unión capaz de unirse a un antígeno de superficie celular.

El término "antígeno de superficie celular" como se usa en el presente documento designa una molécula que se presenta en la superficie de una célula. En la mayoría de los casos, esta molécula estará situada en o sobre la membrana plasmática de la célula, de forma que al menos parte de esta molécula sigue siendo accesible desde fuera de la célula en forma terciaria. Un ejemplo no limitante de una molécula de superficie celular que está situada en la membrana plasmática es una proteína transmembranaria que comprende, en su conformación terciaria, regiones de hidrofilicidad e hidrofobicidad. En este caso, al menos una región hidrófoba permite que la molécula de superficie celular esté incluida o insertada en la membrana plasmática hidrófoba de la célula mientras que las regiones hidrófilas se extienden en ambos lados de la membrana plasmática en el citoplasma y el espacio extracelular, respectivamente. Ejemplos no limitantes de moléculas de superficie celular que están situadas sobre la membrana plasmática son proteínas que se han modificado en un residuo de cisteína para que porten un grupo palmitoílo, proteínas modificadas en un residuo de cisteína C-terminal para que porten un grupo farnesilo o proteínas que se han modificado en el extremo C-terminal para que porten un anclaje glucosil fosfatidil inositol ("GPI"). Estos grupos permiten la unión covalente de proteínas a la superficie externa de la membrana plasmática, donde permanecen accesibles para que las reconozcan moléculas extracelulares tales como anticuerpos. Los ejemplos de antígenos de superficie celular incluyen EGFR, EGFRvlll, MCSP, anhidrasa carbónica IX (CAIX), CD30, CD33, Her2/neu, IgE, CD44v6 y Muc-1. Adicionalmente, los ejemplos de antígenos de superficie celular correspondientes comprenden antígenos que son característicos de una enfermedad o dolencia específica, es decir, cáncer, enfermedades autoinmunitarias o enfermedades infecciosas, incluidas las infecciones víricas. En consecuencia, el término "antígenos de superficie celular" incluye explícitamente proteínas víricas tales como proteínas víricas no procesadas nativas expuestas sobre la superficie de células infectadas (descrito, entre otras, para proteínas de la envoltura del virus de la hepatitis B y C y el VIH-1).

Una función de defensa de los linfocitos T citotóxicos es la destrucción de células infectadas por virus, por lo tanto, la propiedad exclusiva de las moléculas de unión biespecíficas de la invención de activar y redirigir los linfocitos T citotóxicos independientemente de su especificidad autóctona tiene un gran impacto sobre el amplio campo de las infecciones víricas crónicas. Para la mayoría de estas infecciones, la única oportunidad de curación es la eliminación de células infectadas de forma persistente. Actualmente, se están desarrollando tratamientos de linfocitos T adoptivos contra infecciones crónicas por CMV y VEB (Rooney, CM., et al., Use of gene-modified virusspecific T lymphocytes to control Epstein-Barr-virus-related lymphoproliferation. Lancet, 1995. 345 (8941): pág. 9-13; Walter, E.A., et al., Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med, 1995. 333 (16): pág. 1038-44).

La infección crónica por hepatitis B es claramente una de las indicaciones más interesantes y gratificantes. En todo el mundo hay entre 350 y 400 millones de personas infectadas con el VHB. El tratamiento actual de la hepatitis crónica por VHB se basa en interferón γ y análogos de nucleósidos o nucleótidos, un tratamiento de larga duración con considerables efectos secundarios tales como la inducción de reagudizaciones de la hepatitis, fiebre, mialgias, trombocitopenia y depresión. Aunque ahora existen más de 4 regímenes de tratamiento aprobados, rara vez se consigue eliminar el virus. Una inflamación persistente en la hepatitis B crónica conduce a la cirrosis hepática y al carcinoma hepatocelular en más del 25 % de los pacientes. Además, hasta el 40 % de los pacientes con hepatitis B crónica morirán por complicaciones graves, que suponen de 0,6 a 1,0 millones de muertes al año en todo el mundo.

El VHB, el prototipo de los hepadnavirus es un virus con envoltura cuyo genoma circular relajado (cr) se transcribe de forma inversa a un pregenoma de ARN. Después de la infección, se importa el ADN cr al núcleo del hepatocito donde se completa hasta obtener un ADN circular cerrado covalentemente (ADNccc) que contiene cuatro marcos de lectura solapados. Sirve como molde de transcripción para el ARN pregenómico y tres ARN subgenómicos. El pregenoma de ARN funciona como ARNm para la traducción de la proteína del núcleo y la polimerasa víricas. Las células infectadas producen de forma continua proteína de superficie del VHB (HBsAg) a partir de ADNccc incluso cuando se detiene la duplicación del VHB. El HBsAg consiste en las proteínas de superficie pequeñas (S) con muy pocas porciones de proteínas de superficie medianas y grandes (L). Tanto las VHB S como las L se dirigen a la membrana del retículo endoplásmico (RE), desde donde se transportan en vesículas de membrana a través de la cara trans del aparato de Golgi hasta la membrana plasmática (Gorelick, F.S. y C. Shugrue, Exiting the endoplasmic reticulum. Mol Cell Endocrinol, 2001. 177 (1-2): pág. 13-8). Las proteínas S y L se expresan permanentemente sobre la superficie de hepatocitos en los que se duplica el VHB como se mostró recientemente (Chu, CM. y Y.F. Liaw, Membrane staining for hepatitis B surface antigen on hepatocytes: a sensitive and specific marker of active viral replication in hepatitis B. J Clin Pathol, 1995. 48(5): pág. 470-3).

Prototipos de virus que exponen proteínas de la envoltura en la superficie celular son el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC) y el VIH-1, todos los cuales suponen una enorme carga de enfermedad en todo el mundo. Para la indicación del virus VIH-1, se ha mostrado recientemente que los linfocitos T modificados por un TCR quimérico con una construcción de anticuerpo Fv dirigida a la proteína de la envoltura gp120 pueden destruir células objetivo infectadas (Masiero, S., et al., T-cell engineering by a chimeric T-cell receptor with antibodytype specificity for the HIV-1 gp120. Gene Ther, 2005. 12 (4): pág. 299-310). De los hepadnavirus, el virus de la hepatitis B (VHB) expresa el complejo proteico de la envoltura HBsAg, producido continuamente a partir de ADNccc

episómico incluso cuando disminuye la duplicación del VHB.

La expresión como proteínas S y L de VHB intactas sobre la superficie celular las hace accesibles para anticuerpos que son la característica fundamental de la seroconversión cuando los pacientes se recuperan de la fase aguda de las infecciones y cambian de HBsAg en circulación a antiHBs. Si no se produce la seroconversión, hasta el 30 % de los hepatocitos continúan expresando la proteína S del HVB también después de un tratamiento antivírico altamente activo de larga duración. Por tanto, además de que los linfocitos T reconocen específicamente péptidos del VHB procesados intracelularmente y presentados por moléculas MHC en la superficie celular, son factibles otras formas de unión de linfocitos T dirigidas a proteínas de superficie intactas tales como antígenos S y L accesibles en la membrana celular externa. Usando fragmentos de anticuerpos monocatenarios que reconocen proteínas de la envoltura del virus de la hepatitis B pequeñas (S) y grandes (L), se han generado receptores de linfocitos T artificiales que permiten dirigir linfocitos T injertados a hepatocitos infectados y, tras el contacto con el antígeno, activar estos linfocitos T para secretar citocinas y destruir los hepatocitos infectados.

La limitación de este enfoque es, (i) que es necesario modificar los linfocitos T in vitro, (ii) los retrovirus usados para transferir los receptores de linfocitos T pueden provocar mutagénesis de inserción en los linfocitos T y (iii) que una vez que se han transferido los linfocitos T, no puede limitarse la respuesta citotóxica.

Para superar estas limitaciones, pueden generarse moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico que comprenden un primer dominio con una especificidad de unión por el antígeno de CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé (como se proporciona en el presente documento en el contexto de la presente invención) así como un segundo dominio con una especificidad de unión por proteínas de la envoltura del VHB o el VHC de hepatocitos infectados, y están dentro del alcance de la presente invención.

Dentro de la presente invención también se prefiere que el segundo dominio de unión se una al antígeno de superficie celular humano y/o a los equivalentes de primate distinto de chimpancé de los antígenos de superficie celular humanos seleccionados de EGFR, Her2/neu o IgE.

Para la generación del segundo dominio de unión del polipéptido de la invención, p. ej., anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se definen en el presente documento, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales que se unen a ambos de los respectivos antígenos de superficie celular humanos y/o de primate distinto de chimpancé. Pueden derivarse dominios de unión apropiados para el polipéptido biespecífico definido en el presente documento, p. ej., a partir de anticuerpos monoclonales específicos de especies cruzadas mediante procedimientos recombinantes descritos en la técnica. Un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno de superficie celular humano y al homólogo de dicho antígeno de superficie celular en un primate distinto de chimpancé se puede probar mediante ensayos FACS como se expone anteriormente. Es evidente para los expertos en la técnica que también pueden generarse anticuerpos específicos de especies cruzadas mediante técnicas de hibridoma descritas en la literatura (Kohler y Milstein, Nature 256 (1975), 495-7). Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones de forma alternativa con CD33 humana y de primate distinto de chimpancé. A partir de estos ratones, se aíslan células de hibridoma productoras de anticuerpos específicos de especies cruzadas por medio de tecnología de hibridoma y se analizan por FACS como se expone anteriormente. En los ejemplos siguientes se muestra la generación y el análisis de polipéptidos biespecíficos tales como anticuerpos monocatenarios biespecíficos que presentan especificidad de especie cruzada como se describe en el presente documento. Las ventajas de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos que presentan especificidad de especie cruzada incluyen los puntos que se enumeran a continuación.

Se prefiere particularmente para el polipéptido de la invención que el primer dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé comprenda una región VL que comprenda CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:

(a)

CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO. 27, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO. 28 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO. 29;

(b)

CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO. 117, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO. 118 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO. 119; y

(c)

CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO. 153, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO. 154 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO. 155.

En la técnica se entiende que las regiones variables, es decir, la cadena ligera variable ("L" o "VL") y la cadena pesada variable ("H" o "VH"), proporcionan el dominio de unión de un anticuerpo. Estas regiones variables albergan las regiones determinantes de complementariedad. El término "región determinante de la complementariedad" (CDR) es bien conocido en la técnica para determinar la especificidad de antígeno de un anticuerpo. El término "CDR-L" o "CDR L" se refiere a CDR de la VL, mientras que el término "CDR-H" o "CDR H" se refiere a las CDR de la VH.

En una realización preferida de forma alternativa del polipéptido de la invención el primer dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé comprende una región VL que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:

(a)

CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO. 12, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO. 13 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO. 14;

(b)

CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO. 30, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO. 31 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO. 32;

(c)

CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO. 48, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO. 49 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO. 50;

(d)

CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO. 66, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO. 67 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO. 68;

(e)

CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO. 84, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO. 85 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO. 86;

(f)

CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO. 102, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO. 103 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO. 104;

(g)

CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO. 120, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO. 121 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO. 122;

(h)

CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO. 138, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO. 139 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO. 140;

(i)

CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO. 156, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO. 157 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO. 158; y

(j)

CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO. 174, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO. 175 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO. 176.

Se prefiere además que el primer dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé comprenda una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se representa en las SEQ ID NO. 35, 39, 125, 129, 161 o 165.

Se prefiere de forma alternativa que el primer dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé comprenda una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en las SEQ ID NO. 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181.

Más preferentemente, el polipéptido de la invención se caracteriza por el primer dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé, que comprende una región VL y una región VH seleccionadas del grupo que consiste en:

(a)

una región VL como se representa en las SEQ ID NO. 17 o 21 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO. 15 o 19;

(b)

una región VL como se representa en las SEQ ID NO. 35 o 39 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO. 33 o 37;

(c)

una región VL como se representa en las SEQ ID NO. 53 o 57 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO. 51 o 55;

(d)

una región VL como se representa en las SEQ ID NO. 71 o 75 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO. 69 o 73;

(e)

una región VL como se representa en las SEQ ID NO. 89 o 93 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO. 87 o 91;

(f)

una región VL como se representa en las SEQ ID NO. 107 o 111 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO. 105 o 109;

(g)

una región VL como se representa en las SEQ ID NO. 125 o 129 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO. 123 o 127;

(h)

una región VL como se representa en las SEQ ID NO. 143 o 147 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO. 141 o 145;

(i)

una región VL como se representa en las SEQ ID NO. 161 o 165 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO. 159 o 163; y

(j)

una región VL como se representa en las SEQ ID NO. 179 o 183 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO. 177 o 181.

De acuerdo con una realización preferida del polipéptido de la invención, los pares de regiones VH y regiones VL están en formato de un anticuerpo monocatenario (scFv). Las regiones VH y VL se disponen en el orden VH-VL o VL-VH. Se prefiere que la región VH se sitúe en posición N-terminal con respecto a una secuencia enlazadora. La región VL se sitúa en posición C-terminal con respecto a la secuencia enlazadora.

Una realización preferida del polipéptido descrito anteriormente de la invención se caracteriza por el primer dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187.

La invención se refiere además a un polipéptido descrito anteriormente en el que el segundo dominio de unión se une a un antígeno de superficie celular que, preferentemente, es un antígeno tumoral.

El término "antígeno tumoral" como se usa en el presente documento puede entenderse como los antígenos que están presentes en las células tumorales. Estos antígenos pueden presentarse en la superficie celular con una porción extracelular, que a menudo se combina con una porción transmembranaria y citoplásmica de la molécula. A veces, estos antígenos pueden presentarse sólo por células tumorales y nunca por las normales. Los antígenos tumorales pueden expresarse exclusivamente en células tumorales o pueden representar una mutación específica de tumor en comparación con células normales. En este caso, se denominan antígenos específicos de tumor. Son más frecuentes los antígenos presentados por células tumorales y células normales, y se denominan antígenos asociados a tumores. Estos antígenos asociados a tumores pueden estar sobreexpresados en comparación con células normales o son accesibles para la unión del anticuerpo en células tumorales debido a la estructura menos compacta del tejido tumoral en comparación con el tejido normal. Ejemplos no limitantes de antígenos tumorales como se usan en el presente documento son EGFR (Liu, Br. J. Cancer 82/12 (2000), 1991-1999; Bonner, Semin. Radiat. Oncol. 12 (2002), 11-20; Kiyota, Oncology 63/1 (2002), 92-98; Kuan, Brain Tumor Pathol. 17/2 (2000), 7178).

El EGFR (también conocido como c-erb1 o HER1) pertenece a la familia erbB de receptores tirosina cinasa. Cuando se activa por la unión de un ligando de la familia de factores de crecimiento EGF, el EGFR homodimeriza o heterodimeriza con un segundo EGFR u otro miembro de la familia de receptores erbB, respectivamente, iniciando una cascada de señalización a través de proteínas cinasas activadas por mitógenos y otros factores de transcripción que da lugar a la proliferación, diferenciación y reparación (Olayioye, EMBO J. 19 (2000), 3159-67). El EGFR está sobreexpresado en muchos cánceres epiteliales, incluidos el cáncer colorrectal, de mama, de pulmón y de cabeza y cuello (Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 21 (2003), 2787-99; Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 20 (18, supl.)(2002), 1S-13S; Prewett, Clin. Cancer Res. 8 (2002), 994-1003). La sobreexpresión y/o la mutación del EGFR en células malignas da lugar a la activación constitutiva de la actividad cinasa, dando como resultado proliferación, angiogénesis, invasión, metástasis e inhibición de la apoptosis (Mendelsohn (2003, loc. cit.; Ciardiello, Clin. Cancer Res. 7 (2001), 2958-70; Perez-Soler, Oncologist 9 (2004), 58-67). Se ha mostrado la eficacia de anticuerpos monoclonales que se dirigen al dominio de unión a ligando extracelular o la cascada de señalización de tirosina cinasas intracelular del EGFR como objetivo antitumoral (Laskin, Cancer Treat. Review 30 (2004), 1-17). Por ejemplo, el cetuximab (Erbitux), un anticuerpo monoclonal humanizado frente al EGFR, que inhibe de forma competitiva el dominio extracelular del EGFR para inhibir la activación de ligando del receptor, fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) en 2004 para el tratamiento de cáncer de colon metastásico en combinación con el inhibidor de topoisomerasa irinotecán.

En una realización preferida de la invención el polipéptido es una molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico.

Los problemas descritos anteriormente en el presente documento con respecto al desarrollo de moléculas sustitutas para estudios preclínicos se agravan adicionalmente si el fármaco candidato en un anticuerpo biespecífico, p. ej., un anticuerpo monocatenario biespecífico. Un anticuerpo biespecífico de este tipo requiere que ambos antígenos reconocidos sean específicos de especies cruzadas con una especie animal dada para permitir que las pruebas en dicho animal sean seguras.

Como también se destaca anteriormente en el presente documento, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden un primer dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé y un segundo dominio de unión capaz de unirse a un antígeno de superficie celular seleccionado de EGFR, Her2/neu o IgE, en el que el segundo dominio de unión preferentemente también se une a un antígeno de superficie celular humano y/o de primate distinto de chimpancé. La ventaja de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico como fármacos candidatos que cumplen los requisitos del polipéptido preferido de la invención es el uso de tales moléculas en pruebas preclínicas en animales, así como en estudios clínicos e incluso para el tratamiento de seres humanos. En una realización preferida de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de la invención, el segundo dominio de unión capaz de unirse a un antígeno de superficie celular es de origen humano. En una molécula biespecífica específica de

especies cruzadas de acuerdo con la invención el dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé está situado en el orden VH-VL o VH-VL en el extremo Nterminal o en el extremo C-terminal de la molécula biespecífica. En los ejemplos adjuntos se describen ejemplos de moléculas biespecíficas específicas de especies cruzadas de acuerdo con la invención en diferentes disposiciones de la cadena VH y VL en el primer y el segundo dominio de unión.

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo monocatenario biespecífico" designa a una sola cadena polipeptídica que comprende dos dominios de unión. Cada dominio de unión comprende una región variable de una cadena pesada de anticuerpo ("región VH"), en el que la región VH del primer dominio de unión se une específicamente a la molécula CD3ε, y la región VH del segundo dominio de unión se une específicamente a un antígeno de superficie celular, como se define con más detalle a continuación. Opcionalmente, los dos dominios de unión están enlazados entre sí por un espaciador polipeptídico corto. Un ejemplo no limitante de espaciador polipeptídico es Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-S) y sus repeticiones. Adicionalmente, cada dominio de unión puede comprender una región variable de una cadena ligera de anticuerpo ("región VL"), la región VH y la región VL dentro de cada uno de los dominios de unión primero y segundo que se enlazan entre sí a través de un enlazador polipeptídico, por ejemplo del tipo divulgado y reivindicado en el documento EP 623679 B1, pero en cualquier caso suficientemente largo para permitir que se apareen entre sí la región VH y la región VL del primer dominio de unión y la región VH y la región VL del segundo dominio de unión de forma que, juntos, son capaces de unirse específicamente a la primera y la segunda moléculas correspondientes.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, una molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico caracterizada anteriormente comprende un grupo de las siguientes secuencias como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en el segundo dominio de unión seleccionadas las SEQ ID NO: 441 -446, SEQ ID NO: 453 -458, SEQ ID NO: 463 -468, SEQ ID NO: 481 -486.

Una realización particularmente preferida de la invención se refiere a un polipéptido caracterizado anteriormente, en el que la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico comprende una secuencia seleccionada de:

(a)

una secuencia de aminoácidos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 389, 391, 393, 395, 397, 399, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 447, 449, 451, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 495, 497, 499, 501, 503 y 505; y

(b)

una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 390, 392, 394, 396, 398, 400, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 448, 450, 452, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 496, 498, 500, 502, 504 y 506.

En una realización preferida de la invención, los anticuerpos monocatenarios biespecíficos son específicos de especies cruzadas para CD3 épsilon y para el antígeno tumoral reconocido por su segundo dominio de unión.

En una realización alternativa, la presente invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la invención descrito anteriormente.

La presente invención también se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención.

Los expertos en biología molecular conocen muchos vectores adecuados, cuya elección dependerá de la función deseada e incluyen plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores usados convencionalmente en ingeniería genética. Pueden usarse procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica para construir diversos plásmidos y vectores; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (loc cit.) y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). De forma alternativa, pueden reconstituirse los polinucleótidos y vectores de la invención en liposomas para su administración a las células objetivo. Como se analiza con más detalle a continuación, se usó un vector de clonación para aislar secuencias individuales de ADN. Pueden transferirse secuencias pertinentes en vectores de expresión cuando sea necesaria la expresión de un polipéptido en particular. Los vectores de clonación típicos incluyen pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 y pGBT9. Los vectores de expresión típicos incluyen pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT.

Preferentemente, dicho vector comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es una secuencia reguladora enlazada de forma funcional a dicha secuencia de ácidos nucleicos definida en el presente documento.

El término "secuencia reguladora" se refiere a secuencias de ADN que son necesarias para llevar a cabo la expresión de secuencias codificantes a las que están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control varía en función del organismo huésped. En procariotas, las secuencias de control suelen incluir un promotor, un sitio de unión del ribosoma y terminadores. En eucariotas las secuencias de control generalmente incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores, transactivadores o factores de transcripción. Se pretende que el término "secuencia de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes ventajosos adicionales.

El término "enlazado de forma funcional" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. Una secuencia de control "enlazada de forma funcional" a una secuencia codificante está ligada de tal forma que se logra la expresión de la secuencia codificante bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. En el caso de que la secuencia de control sea un promotor, resulta evidente para un experto que, preferentemente, se usa un ácido nucleico bicatenario.

Por tanto, el mencionado vector es, preferentemente, un vector de expresión. Un "vector de expresión" es una construcción que puede usarse para transformar un huésped seleccionado y permite la expresión de una secuencia codificante en el huésped seleccionado. Los vectores de expresión pueden ser, por ejemplo, vectores de clonación, vectores binarios o vectores de integración. La expresión comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico, preferentemente en un ARNm traducible. Los expertos en la técnica conocen bien elementos reguladores garantizar que garantizan la expresión en células procariotas y/o eucariotas. En el caso de las células eucariotas, normalmente comprenden promotores que garantizan la iniciación de la transcripción y, opcionalmente, señales de poli-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped procariotas comprenden, p. ej., el promotor PL, lac, trp o tac promotor de E. coli, y son ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas los promotores AOX1 o GAL1 de levaduras o el promotor del CMV, del SV40 o del VSR (virus del sarcoma de Rous), el potenciador de CMV, el potenciador de SV40 o un intrón de la globina de células de mamífero y otras células animales.

Además de los elementos que son responsables de la iniciación de la transcripción, tales elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sito SV40-poli-A o el sitio tkpoli-A, corriente abajo del polinucleótido.

Además, en función del sistema de expresión usado, pueden añadirse a la secuencia codificante de la mencionada secuencia de ácido nucleicos secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido a un compartimiento celular o secretarlo al medio y se conocen bien en la técnica; véanse también los ejemplos adjuntos. La(s) secuencia(s) líder se ensambla(n) en una fase apropiada con secuencias de iniciación y terminación de la traducción y, preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida, o una parte de ella, al espacio periplásmico o al medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que confiere características deseadas, p. ej., estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado; véase anteriormente En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados tales como el vector de expresión de ADNc pcDV1 de Okayama-Berg (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-DHFR, pEF-ADA o pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025 y Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141150) o pSPORTI (GIBCO BRL).

Preferentemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas, pero también pueden usarse secuencias de control para huéspedes procariotas. Una vez que se ha incorporado el vector en el huésped apropiado, el huésped se mantiene bajo condiciones adecuadas para la expresión de altos niveles de las secuencias de nucleótidos y si se desea, a continuación se puede recoger y purificar el polipéptido de la invención; véanse, p. ej., los ejemplos adjuntos.

Un sistema de expresión alternativo que se puede usar para expresar una proteína que interacciona con el ciclo celular es un sistema de insecto. En un sistema de este tipo se usa el virus de la poliedrosis nuclear de Autographs californica (AcNPV) como vector para expresar genes exógenos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Se puede clonar la secuencia codificante de una de las molécula de ácido nucleico mencionadas en una región no esencial del virus, tal como el gen de la poliedrina, y colocarla bajo el control del promotor de la poliedrina. La inserción exitosa de dicha secuencia de codificación hará que se inactive el gen de la poliedrina y se producirán virus recombinantes que carecen de recubrimiento de proteína de recubrimiento. Los virus recombinantes se usan después para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa la proteína de la invención (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227).

Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales, así como traduccionales. De forma ventajosa, los vectores de la invención descritos anteriormente comprenden un marcador que se puede seleccionar y/o valorar.

Los genes marcadores seleccionables útiles para la selección de células transformadas y, p. ej., tejido vegetal y plantas, son bien conocidos por los expertos en la técnica y comprenden, por ejemplo, la resistencia antimetabolito como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Se han descrito genes seleccionables adicionales, a saber, trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manosa-6-fosfato isomerasa que permite que las células utilicen manosa (en el

documento WO 94/20627) y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o la desaminasa de Aspergillus terreus, que confiere resistencia a la blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).

Los expertos en la técnica también conocen marcadores que se pueden valorar, útiles y están comercialmente disponibles. De forma ventajosa, dicho marcador es un gen que codifica la luciferasa (Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), la proteína verde fluorescente (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o la β-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Esta realización es particularmente útil para el rastreo rápido y sencillo de células, tejidos y organismos que contienen uno de los vectores mencionados.

Como se describe anteriormente, la molécula de ácido nucleico mencionada se puede usar sola o como parte de un vector para expresar el polipéptido de la invención en células, p. ej., para purificación, pero también para propósitos de tratamiento génico. Las moléculas de ácido nucleico o los vectores que contienen la(s) secuencia(s) de ADN que codifican cualquiera de los polipéptidos de la invención descritos anteriormente se introducen en las células, que a su vez producen el polipéptido de interés. El tratamiento génico, que se basa en la introducción de genes terapéuticos en células mediante técnicas ex vivo o in vivo es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia génica. Vectores, procedimientos o sistemas de administración de genes adecuados para tratamiento génico in vitro o in vivo se describen en la literatura y son conocidos por los expertos en la técnica; véanse, p. ej., Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; los documentos WO 94/29469, WO 97/00957, US 5.580.859, US 5,589,466; o Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Las moléculas de ácido nucleico y los vectores mencionados se pueden diseñar para su introducción directa o para su introducción por medio de liposomas o vectores víricos (p. ej., adenovíricos, retrovíricos) en la célula. Preferentemente, dicha célula es una célula de línea germinal, una célula embrionaria o un óvulo o una derivada de ellas, lo más preferentemente dicha célula es una célula madre. Un ejemplo de célula madre embrionaria pueden ser, entre otras, una célula madre como se describe en Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428.

La invención también proporciona una célula huésped transformada o transfectada con un vector de la invención. Dicha célula huésped se puede producir introduciendo el vector de la invención descrito anteriormente o la molécula de ácido nucleico de la invención descrita anteriormente en la célula huésped. La presencia de al menos un vector o al menos una molécula de ácido nucleico en la célula huésped puede mediar la expresión de un gen que codifica las construcciones de anticuerpo monocatenario descritas anteriormente.

La molécula de ácido nucleico o el vector de la invención descritos anteriormente, que se introducen en la célula huésped, pueden integrarse en el genoma de la célula huésped o pueden mantenerse fuera de los cromosomas.

La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota.

Se pretende que el término "procariota" incluya todas las bacterias que se pueden transformar o transfectar con moléculas de ADN o ARN para la expresión de una proteína de la invención. Las células huésped procariotas pueden incluir bacterias gramnegativas, así como bacterias grampositivas, tales como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Se pretende que el término "eucariota" incluya células de levaduras, plantas superiores, insectos y, preferentemente, de mamíferos. En función de la célula huésped empleada en un procedimiento de producción recombinante, la proteína codificada por el polinucleótido de la presente invención puede ser glucosilada o puede ser no glucosilada. Se prefiere especialmente el uso de un plásmido o un virus que contenga la secuencia codificante del polipéptido de la invención y, genéticamente fusionado a ella, una marca FLAG N-terminal y/o una marca His C-terminal. Preferentemente, la longitud de dicha marca FLAG es de aproximadamente 4 a 8 aminoácidos, lo más preferentemente de 8 aminoácidos. Puede usarse un polinucleótido descrito anteriormente para transformar o transfectar el huésped usando cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas por los expertos en la técnica. Además, se conocen bien en la técnica procedimientos para preparar genes enlazados de forma funcional condensados y expresarlos, p. ej., en células de mamífero y bacterias (Sambrook, loc cit.).

Preferentemente, la célula huésped es una bacteria o una célula de insecto, fúngica, vegetal o animal.

En particular, se contempla que el huésped mencionado pueda ser una célula de mamífero. La células huésped particularmente preferidas comprenden células CHO, células COS, líneas celulares de mieloma como SP2/0 o NS/0. Como se ilustra en los ejemplos adjuntos, se prefieren particularmente las células CHO como huéspedes.

Más preferentemente, dicha célula huésped es una célula humana o línea celular humana, p. ej., per.c6 (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163-168).

En una realización adicional, la presente invención se refiere por tanto a un procedimiento para la producción de un polipéptido de la invención, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped de la invención bajo

condiciones que permitan la expresión del polipéptido de la invención y recuperar el polipéptido producido del cultivo.

Las células huésped transformadas pueden hacerse crecer en fermentadores y cultivarse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica para lograr un crecimiento celular óptimo. El polipéptido de la invención se puede aislar después a partir del medio de cultivo, lisados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y la purificación de los polipéptidos de la invención expresados, p. ej., en microbios, se pueden realizar por cualquiera medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como las que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, p. ej., contra una marca del polipéptido de la invención o como se describe en los ejemplos adjuntos.

En la técnica se sabe que las condiciones para el cultivo de una célula huésped que permiten la expresión dependen del sistema celular huésped y del sistema/vector de expresión usado en tal procedimiento. Los parámetros que han de modificarse para lograr condiciones que permitan la expresión de un polipéptido recombinante se conocen en la técnica. Por tanto, el experto en la técnica puede determinar las condiciones adecuadas en ausencia de contribuciones adicionales de la invención.

Una vez expresado, puede purificarse el polipéptido de la invención de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluidos precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares; véase, Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982). Para usos farmacéuticos se prefieren polipéptidos sustancialmente puros con una homogeneidad de al menos aproximadamente el 90 al 95 %, y los más preferidos son con una homogeneidad del 98 al 99 % o más. Una vez purificado, parcialmente o hasta la homogeneidad deseada, el polipéptido de la invención pueden usarse después terapéuticamente (incluyendo extracorpóreamente) o en el desarrollo y la realización de procedimientos de ensayo. Además, en los ejemplos adjuntos se describen con detalle ejemplo de procedimientos para la recuperación del polipéptido de la invención de un cultivo.

Además, la invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención o un polipéptido producido mediante el procedimiento divulgado anteriormente. Preferentemente, dicha composición es una composición farmacéutica.

De acuerdo con la invención, el término "composición farmacéutica" se refiere a una composición para su administración a un paciente, preferentemente un paciente humano. La composición farmacéutica particularmente preferida de esta invención comprende moléculas de unión dirigidas contra y generadas contra epítopos de CD3 independientes del contexto. Preferentemente, la composición farmacéutica comprende formulaciones adecuadas de vehículos, estabilizantes y/o excipientes. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal y/o intranasal o mediante inyección directa en el tejido. Se contempla en particular que dicha composición se administre a un paciente a través de infusión o inyección. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse de diferentes maneras, p. ej., mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. En particular, la presente invención proporciona la composición adecuada para una administración ininterrumpida. Como ejemplo no limitante la administración ininterrumpida, es decir, continua, se puede realizar mediante un sistema de bomba pequeño que lleva el paciente para medir el flujo de entrada de agente terapéutico en el organismo del paciente. La composición farmacéutica que comprende las moléculas de unión dirigidas contra y generadas contra epítopos de CD3 independientes del contexto de la invención se puede administrar mediante el uso de dichos sistemas de bomba. En la técnica se conocen de forma general tales sistemas de bomba y comúnmente se basan en el intercambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico que se va a infundir. Al intercambiar el cartucho en un sistema de bomba de este tipo, puede producirse una interrupción temporal del flujo de otro modo ininterrumpido del agente terapéutico en el organismo del paciente. En tal caso, la fase de administración anterior al reemplazo del cartucho y la fase de administración posterior al reemplazo del cartucho seguirían incluyéndose en el significado de los medios y procedimientos farmacéuticos de la invención, que constituyen conjuntamente una "administración ininterrumpida" de tal agente terapéutico.

La administración continua o ininterrumpida de estas moléculas de unión dirigidas contra y generadas contra epítopos de CD3 independientes del contexto de la presente invención puede ser intravenosa o subcutánea por medio de un dispositivo de administración de líquidos o un sistema de bomba pequeño que incluya un mecanismo de dirección para dirigir los líquidos hacia dentro y hacia fuera de un depósito y un mecanismo de control para controlar el mecanismo de dirección. Los sistemas de bomba para administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para atravesar la piel de un paciente y administrar la composición adecuada al organismo del paciente. Dichos sistemas de bomba pueden fijarse o unirse directamente a la piel del paciente independientemente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, permitiendo de este modo un contacto directo entre el sistema de bomba y la piel del paciente. El sistema de bomba puede estar unido a la piel del paciente durante de 24 horas hasta varios días. El sistema de bomba puede ser de tamaño pequeño con un depósito para volúmenes pequeños. Como ejemplo no limitante, el volumen del depósito para la composición farmacéutica adecuada que se va a administrar puede ser de entre 0,1 y 50 ml.

La administración continua puede ser transdérmica por medio de un parche que se coloca sobre la piel y se

reemplaza a intervalos. Un experto en la técnica conoce sistemas de parche para administración de fármacos adecuados para este propósito. Cabe destacar que la administración transdérmica es especialmente adecuada para la administración ininterrumpida, ya que el intercambio de un primer parche agotado se puede llevar a cabo de forma ventajosa simultáneamente con la colocación de un segundo parche nuevo, por ejemplo, en la superficie de la piel inmediatamente adyacente al primera parche agotado e inmediatamente antes de la retirada del primer parche agotado. No surgen problemas de interrupción del flujo o de insuficiencia del suministro celular.

La composición de la presente invención, que comprende, en particular, moléculas de unión dirigidas contra y generadas contra epítopos de CD3 independientes del contexto, puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones, p. ej., soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, liposomas, etc. Pueden formularse composiciones que comprenden tales vehículos por procedimientos convencionales bien conocidos. Las formulaciones pueden comprender hidratos de carbono, soluciones tampón, aminoácidos y/o tensioactivos. Los hidratos de carbono pueden ser azúcares no reductores, preferentemente trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol. Tales formulaciones se pueden usar para administraciones continuas que pueden ser intravenosas o subcutáneas con y/o sin sistemas de bomba. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos cargados, preferentemente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato y/o histidina. Los tensioactivos pueden ser detergentes, preferentemente con un peso molecular de >1,2 KD y/o un poliéter, preferentemente con un peso molecular de >3 KD. Son ejemplos no limitantes de detergentes preferidos Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 o Tween 85. Son ejemplos no limitantes de poliéteres preferidos PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 o PEG 5000. Los sistemas de tampón usados en la presente invención pueden tener un pH preferido de 5-9 y pueden comprender citrato, succinato, fosfato, histidina y acetato. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar al sujeto a una dosis adecuada que se puede determinar, p. ej., mediante estudios de dosis crecientes mediante la administración de dosis crecientes del polipéptido de la invención que muestra especificidad de especie cruzada descrito en el presente documento a primates distintos de chimpancé, por ejemplo, macacos. Como se expone anteriormente, el polipéptido de la invención que muestra especificidad de especie cruzada descrito en el presente documento se puede usar ventajosamente en la misma forma en pruebas preclínicas en primates distintos de chimpancé y como fármaco en seres humanos. Estas composiciones también se pueden administrar en combinación con otros fármacos proteináceos y no proteináceos. Estos fármacos se pueden administrar simultáneamente con la composición que comprende el polipéptido de la invención definido en el presente documento o por separado antes

o después de la administración de dicho polipéptido en intervalos definidos y dosis definidos oportunamente. El régimen de dosificación será determinado por el médico encargado y los factores clínicos. Como se conoce bien en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluidos la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto concreto que se ha de administrar, el sexo, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente. Las preparaciones para administración parenteral incluyen emulsiones, suspensiones y soluciones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluidos medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrolitos (tales como los basados en la dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Además, la composición de la presente invención puede comprender vehículos proteináceos, como, p. ej., seroalbúmina o inmunoglobulina, preferentemente de origen humano. Se contempla que la composición de la invención puede comprender, además del polipéptido de la invención definido en el presente documento, agentes biológicamente activos adicionales, en función del uso previsto de la composición. Tales agentes pueden ser fármacos que actúan en el aparato gastrointestinal, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que evita la hiperuricemia, fármacos que inhiben inmunorreacciones (p. ej., corticoesteroides), fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o agentes tales como citocinas conocidos en la técnica.

La actividad biológica de la composición farmacéutica definida en el presente documento se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos de citotoxicidad, como se describe en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440 o por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 -12). "Eficacia" o "eficacia in vivo" como se usa en el presente documento se refiere a la respuesta al tratamiento por la composición farmacéutica de la invención, usando, p. ej., criterios de respuesta normalizados del NCI. El éxito o la eficacia in vivo del tratamiento usando una composición farmacéutica de la invención se refiere a la eficacia de la composición para su propósito deseado, es decir, la capacidad de la composición para provocar su efecto deseado, es decir, la disminución de células patológicas, p. ej., células tumorales. La eficacia in vivo puede monitorizarse mediante procedimientos estándar establecidos para las entidades patológicas correspondientes que incluyen, entre otras, recuentos de leucocitos, diferenciales, separación de células activadas por fluorescencia, aspirado de médula ósea. Además, pueden usarse diversos parámetros de bioquímica clínica específicos de diversas enfermedades y otros procedimientos estándar establecidos. Además, se pueden usar tomografía asistida por ordenador, rayos X, tomografía de resonancia magnética nuclear (p. ej., para la evaluación de la respuesta basada en los criterios del

National Cancer Institute [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher Rl, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Informe de un seminario internacional de normalización de los criterios de respuesta para linfomas no hodgkinianos. Grupo de trabajo internacional patrocinado por el NCI. J Clin Oncol. 1999 abr; 17(4): 1244] ), escáner de tomografía de emisión de positrones, recuentos de leucocitos, diferenciales, separación de células activadas por fluorescencia, aspirado de médula ósea, biopsias/histologías de ganglio linfático y diversos parámetros de bioquímica clínica específicos del linfoma (p. ej., lactato deshidrogenasa) y otros procedimientos estándar establecidos.

Otro gran reto en el desarrollo de fármacos tales como la composición farmacéutica de la invención es el modulación predecible de las propiedades farmacocinéticas. Con este fin, se establece un perfil farmacocinético del fármaco candidato, es decir, un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan a la capacidad de un fármaco concreto para tratar una afección dada. Los parámetros farmacocinéticos del fármaco que influyen sobre la capacidad de un fármaco para tratar una entidad patológica en particular incluyen, entre otros: la vida media, el volumen de distribución, el metabolismo hepático de primer paso y el grado de unión a suero sanguíneo. La eficacia de un agente farmacológico dado puede estar influenciada por cada uno de los parámetros mencionados anteriormente.

"Vida media" significa el tiempo en el que el 50 % de un fármaco administrado se elimina a través de procesos biológicos, p. ej., metabolismo, excreción, etc.

Con "metabolismo hepático de primer paso" quiere decirse la propensión de un fármaco a ser metabolizado tras el primer contacto con el hígado, es decir, durante su primer paso a través del hígado. "Volumen de distribución" significa el grado de retención de un fármaco a lo largo de los diversos compartimentos del organismo como, p. ej., espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc. y la distribución del fármaco dentro de estos compartimentos "Grado de unión a suero sanguíneo" significa la propensión de un fármaco a interaccionar con y unirse a proteínas del suero sanguíneo, tales como albúmina, dando lugar a una disminución o pérdida de la actividad biológica del fármaco.

Los parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, tiempo de demora (Tlag), Tmáx, velocidades de absorción, más aparición y/o Cmáx para una cantidad dada de fármaco administrada. "Biodisponibilidad" significa la cantidad de un fármaco en el compartimento sanguíneo. "Tiempo de demora" significa el lapso de tiempo entre la administración del fármaco y su detección y posibilidad de medirlo en la sangre o el plasma.

"Tmáx" es el tiempo después del cual se alcanza la concentración sanguínea máxima del fármaco y "Cmáx" es la concentración sanguínea máxima que puede obtenerse con un fármaco dado. El tiempo para alcanzar una concentración sanguínea o tisular del fármaco necesaria para su efecto biológico está influenciado por todos los parámetros. Parámetros farmacocinéticos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos, una realización preferida del polipéptido de la invención, que presentan especificidad de especie cruzada, que se pueden determinar en pruebas preclínicas en animales en primates distintos de chimpancé, como se resume anteriormente, se exponen también, p. ej., en la publicación por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

El término "toxicidad" como se usa en el presente documento se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco manifestados en acontecimientos adversos o acontecimientos adversos graves. Estos acontecimientos adversos se pueden referir a la falta de tolerabilidad del fármaco en general y/o a la falta de tolerancia local después de la administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratogénicos o carcinogénicos provocados por el fármaco.

El término "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerabilidad" como se usa en el presente documento define la administración de un fármaco sin inducir acontecimientos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un periodo de tiempo más largo de aplicación del fármaco. La "seguridad", la "seguridad in vivo" o la "tolerabilidad" se pueden evaluar, p. ej., a intervalos regulares durante el tratamiento y el periodo de seguimiento. La medidas incluyen evaluación clínica, p. ej., manifestaciones orgánicas, y rastreo de anomalías analíticas. Se puede llevar a cabo la evaluación clínica y registrar/codificar las desviaciones de los resultados normales de acuerdo con los estándares del NCI-CTC y/o el MedDRA. Las manifestaciones orgánicas pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardíaca, coagulación y similares, como se expone, p. ej., en la versión 3.0 de los criterios terminológicos comunes para acontecimientos adversos (CTCAE, por sus siglas en inglés). Los parámetros analíticos que se pueden probar, incluyen, por ejemplo, hematología, bioquímica clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y examen de otros líquidos corporales, tales como suero, plasma, líquido linfático o cefalorraquídeo, líquidos y similares. Así, puede evaluarse la seguridad, p. ej., mediante exploración física, técnicas de formación de imágenes (es decir, ultrasonidos, rayos x, escáneres de TC, formación de imágenes de resonancia magnética (RMN), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir, electrocardiograma), constantes vitales, midiendo parámetros analíticos y registrando acontecimientos adversos. Por ejemplo, los acontecimientos adversos en primates distintos de chimpancé en los usos y procedimientos de acuerdo con la invención se pueden examinar mediante procedimientos histopatológicos y/o histoquímicos.

El término "dosis eficaz y no tóxica" como se usa en el presente documento se refiere a un dosis tolerable del anticuerpo monocatenario biespecífico definido en el presente documento que es lo suficientemente alta como para provocar la disminución de células patológicas, la eliminación del tumor, la reducción del tumor o la estabilización de la enfermedad sin o esencialmente sin grandes efectos tóxicos. Tales dosis eficaces y no tóxicas se pueden determinar. p. ej., mediante estudios de dosis crecientes descritos en la técnica y deberían estar por debajo de la dosis que induce acontecimientos secundarios graves (toxicidad limitante de la dosis, TLD).

También se hace referencia a los términos anteriores, p. ej., en la evaluación preclínica de la seguridad de agentes farmacéuticos de origen biotecnológico S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; reunión del ICH Steering Committee del 16 de julio de 1997.

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la presente invención (es decir, un polipéptido que comprende al menos un dominio de unión capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, en la que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO. 2, 4, 6 o 8 de acuerdo con la presente invención o producida de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invención) para evitar, tratar o mejorar una enfermedad seleccionada de entre una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico. Preferentemente, dicha composición farmacéutica comprende además formulaciones adecuadas de vehículos, estabilizantes y/o excipientes.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un uso de un polipéptido definido anteriormente o producido de acuerdo con un procedimiento definido anteriormente en el presente documento, para la preparación de una composición farmacéutica para evitar, tratar o mejorar una enfermedad. Preferentemente, dicha enfermedad es una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico. Se prefiere además que dicha enfermedad tumoral sea una enfermedad maligna, preferentemente cáncer.

En otra realización preferida del uso del polipéptido de la invención dicha composición farmacéutica es adecuada para su administración en combinación con un fármaco adicional, es decir, como parte de un cotratamiento. En dicho cotratamiento, se puede incluir opcionalmente un agente activo en la misma composición farmacéutica que el polipéptido de la invención o se puede incluir en una composición farmacéutica diferente. En este último caso, dicha composición farmacéutica diferente es adecuada para su administración antes de, simultáneamente o después de la administración de dicha composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención. El fármaco o la composición farmacéutica adicional puede ser un compuesto no proteináceo o un compuesto proteináceo. En el caso de que el fármaco adicional sea un compuesto proteináceo, es ventajoso que el compuesto proteináceo sea capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunitarias.

Preferentemente, dicho compuesto proteináceo o compuesto no proteináceo se puede administrar simultáneamente

o no simultáneamente con el polipéptido de la invención, una molécula de ácido nucleico definida anteriormente en el presente documento, un vector definido anteriormente en el presente documento o un huésped definido anteriormente en el presente documento.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica de la invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento o la mejora de una enfermedad en un sujeto que lo necesita. Preferentemente, dicha enfermedad es una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico. Incluso más preferido, dicha enfermedad tumoral es una enfermedad maligna, preferentemente cáncer.

En otra realización preferida dicha composición farmacéutica es adecuada para su administración en combinación con un fármaco adicional, es decir, como parte de un cotratamiento. En dicho cotratamiento, se puede incluir opcionalmente un agente activo en la misma composición farmacéutica que el polipéptido de la invención o se puede incluir en una composición farmacéutica diferente. En este último caso, dicha composición farmacéutica diferente es adecuada para su administración antes de, simultáneamente o después de la administración de dicha composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención. El fármaco o la composición farmacéutica adicional puede ser un compuesto no proteináceo o un compuesto proteináceo. En el caso de que el fármaco adicional sea un compuesto proteináceo, es ventajoso que el compuesto proteináceo sea capaz de proporcionar una señal de activación para células efectoras inmunitarias.

Preferentemente, dicho compuesto proteináceo o compuesto no proteináceo se puede administrar simultáneamente

o no simultáneamente con el polipéptido de la invención, una molécula de ácido nucleico definida anteriormente en el presente documento, un vector definido anteriormente en el presente documento o un huésped definido anteriormente en el presente documento.

Para el procedimiento de la invención descrito anteriormente se prefiere que dicho sujeto sea un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit que comprende un polipéptido de la invención, una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector de la invención o un huésped de la invención.

La presente divulgación proporciona además la siguiente lista de puntos:

Punto 1. Un procedimiento para la identificación de (un) polipéptido(s) que comprende un dominio de unión específico de especies cruzadas capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3 épsilon (CD3ε) humana y de primate distinto de chimpancé, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a)

poner en contacto el/los polipéptido(s) con un fragmento N-terminal del dominio extracelular de CD3ε de 27 aminoácidos como máximo que comprende la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 381) o Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly (SEQ ID NO. 382), fijado a través de su extremo Cterminal a una fase sólida;

(b)

eluir el/los polipéptido(s) unido(s) de dicho fragmento; y

(c)

aislar el/los polipéptido(s) a partir del eluato de (b).

Se prefiere que el/los polipéptido(s) identificados mediante el procedimiento anterior de la invención sean de origen humano.

El presente "procedimiento para la identificación de (un) polipéptido(s)" se entiende como un procedimiento para el aislamiento de uno o más polipéptidos diferentes con la misma especificidad por el fragmento del dominio extracelular de CD3ε que comprende en su extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 381) o Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly (SEQ ID NO. 382) a partir de una pluralidad de polipéptidos candidatos así como un procedimiento para la purificación de un polipéptido a partir de una solución. Las realizaciones no limitantes de un procedimiento del aislamiento de uno o más polipéptidos diferentes con la misma especificidad por el fragmento del dominio extracelular de CD3ε comprenden procedimientos para la selección de entidades de unión específicas de antígeno, p. ej., procedimientos de fijación como los usados comúnmente para el rastreo de hibridomas, el rastreo de clones transfectados de forma transitoria/estable de células huésped eucariotas o en procedimientos de presentación en fagos. Un ejemplo no limitante del último procedimiento para la purificación de un polipéptido a partir de una solución es, p. ej., la purificación de un polipéptido expresado de forma recombinante a partir de un sobrenadante de cultivo o una preparación a partir de dicho cultivo.

Como se ha indicado anteriormente el fragmento usado en este procedimiento es un fragmento N-terminal del dominio extracelular de la molécula CD3ε de primate. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la moléculas CD3ε de diferentes primates se representa en las SEQ ID NO: 1, 3, 5 y 7. Las dos formas del octámero N-terminal se representan en las SEQ ID NO: 381 y 382. Se prefiere que este extremo N-terminal esté libremente disponible para la unión de los polipéptidos se quieren identificar mediante el procedimiento de la invención. El término "libremente disponible" se entiende en el contexto de la invención como sin motivos adicionales tales como una marca His. La interferencia de una marca His de este tipo con una molécula de unión identificada mediante este procedimiento se describe en el ejemplo 6 adjunto.

De acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente dicho fragmento se fija a través de su extremo Cterminal a una fase sólida. El experto en la técnica elegirá fácilmente y sin más actividad inventiva un soporte en fase sólida adecuado en función de la realización usada del procedimiento de la invención. Los ejemplos de soporte sólido comprenden, entre otros, matrices como perlas (p. ej., perlas de agarosa, perlas de sefarosa, perlas de poliestirol, perlas de dextrano), placas (placas de cultivo o placas multipocillo) así como chips conocidos, p.ej., de Biacore®. La selección de los medios y procedimientos para la fijación/inmovilización del fragmento a dicho soporte sólido dependen de la elección del soporte sólido. Un procedimiento usado comúnmente para la fijación/inmovilización es un acoplamiento a través de un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS). El experto en la técnica conoce la química subyacente a este acoplamiento, así como procedimientos alternativos para la fijación/inmovilización, p. ej., a partir de Hermanson "Bioconjugate Techniques", Academic Press, Inc. (1996). Para la fijación a/inmovilización sobre soportes cromatográficos se usan comúnmente los siguientes medios: sefarosa activada con NHS (p. ej., HiTrap-NHS de GE Life Science -Amersham), sefarosa activada con CnBr (p. ej., GE Life Science -Amersham), perlas de dextrano activadas con NHS (Sigma) o polimetacrilato activado. Estos reactivos también se pueden en un enfoque de lotes. Además, se pueden usar perlas de dextrano que comprende óxido de hierro (p. ej., disponibles de Miltenyi) en un enfoque de lotes. Estas perlas se pueden usar en combinación con un imán para la separación de las perlas a partir de una solución. Los polipéptidos se pueden inmovilizar sobre un chip de Biacore (p. ej., chips CM5) mediante el uso de carboximetildextrano activado con NHS. Ejemplos adicionales de un soporte sólido apropiado son las placas multipocillo reactivas de amina (p. ej., placas Nunc Immobilizer™).

De acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente dicho fragmento del dominio extracelular de CD3 épsilon se puede acoplar directamente al soporte sólido o por medio de un tramo de aminoácidos, que podría ser un enlazador u otro resto de proteína/polipéptido. De forma alternativa, el dominio extracelular de CD3 épsilon se puede acoplar indirectamente a través de una o más molécula adaptadoras.

En la técnica se conocen bien medios y procedimientos para la elución de un péptido unido a un epítopo inmovilizado. Lo mismo se mantiene para procedimientos para el aislamiento del/de los polipéptido(s) identificado(s) a partir del eluato.

En consonancia con la divulgación de un procedimiento para el aislamiento de uno o más polipéptidos diferentes

con la misma especificidad por el fragmento del dominio extracelular de CD3ε que comprende en su extremo Nterminal la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly a partir de una pluralidad de polipéptido candidatos pueden comprender una o más etapas de los procedimientos siguientes para la selección de entidades específicas de antígeno:

Se pueden seleccionar moléculas de unión específicas de CD3ε a partir de repertorios derivados de anticuerpo. Se pueden construir colecciones de presentación en fago basándose en procedimientos estándar, como se divulga, por ejemplo, en "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott y Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. El formato de los fragmentos de anticuerpo de la colección de anticuerpos puede ser scFv, pero en general también puede ser un fragmento Fab o incluso un fragmento de anticuerpo de dominio único. Para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos se pueden usar colecciones de fragmentos de anticuerpos indiferenciados. Para la selección de entidades de unión potencialmente poco inmunogénicas en el uso terapéutico posterior, pueden ser favorables colecciones de fragmentos de anticuerpos humanos para la selección directa de fragmentos de anticuerpo humano. En algunos casos pueden constituir la base para colecciones de anticuerpos sintéticos (Knappik, et al. J Mol. Biol. 2000, 296:57 ff). El formato correspondiente puede ser Fab, scFv (como se describe a continuación) o anticuerpos de dominio (Acd, como se revisó en Holt et al., Trends Biotechnol. 2003,

21:484 ff).

También se conoce en la técnica que en muchos casos no existe ninguna fuente inmunitaria de anticuerpos humanos disponible contra el antígeno objetivo. Por lo tanto, se inmunizan animales con el antígeno objetivo y las correspondientes colecciones de anticuerpos aisladas a partir de tejido animal como, p. ej., el bazo o PBMC. El fragmento N-terminal puede estar biotinilado o enlazado covalentemente a proteínas como KLH o seroalbúmina bovina (BSA). De acuerdo con enfoques comunes, se usan roedores para la inmunización. Algunos repertorios inmunitarios de anticuerpos de origen no humano pueden ser especialmente favorables por otros motivos, p. ej., por la presencia de anticuerpos de dominio único (VHH) derivados de especies de camélidos (como se describe en Muyldermans, J Biotechnol. 74:277; De Genst et al. Dev Como Immunol. 2006, 30:187 ff). Por lo tanto, un formato correspondiente de la colección de anticuerpos puede ser Fab, scFv (como se describe a continuación) o anticuerpos de dominio único (VHH).

En un posible enfoque, se pueden inmunizar ratones F1 a partir de cruces de balb/c x C57black de diez semanas de edad con células completas, p. ej., que expresan EpCAM transmembranaria que presenta en el extremo N-terminal como fusión traduccional los aminoácidos 1 a 27 N-terminales de la cadena CD3ε madura. De forma alternativa, se pueden inmunizar ratones con la proteína de fusión 1-27 CD3 épsilon-Fc (se describe un enfoque correspondiente en el ejemplo 2 adjunto). Después de inmunización(es) de refuerzo, se pueden extraer muestras de sangre y se puede probar la valoración sérica de anticuerpos contra los linfocitos T positivos para CD3, p. ej., en análisis FACS. Habitualmente, las valoraciones séricas son significativamente más altas en animales inmunizados que en no inmunizados. Los animales inmunizados pueden constituir la base para la construcción de colecciones inmunitarias de anticuerpos. Los ejemplos de tales colecciones comprenden colecciones de presentación en fago. En general, se pueden construir colecciones de este tipo basándose en procedimientos estándar, como se divulga, por ejemplo, en "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott y Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Los anticuerpos no humanos también se pueden humanizar a través de presentación en fagos debido a la generación de colecciones de anticuerpos más variables que se pueden enriquecer posteriormente para agentes de unión durante la selección.

En un enfoque de presentación en fagos, cualquiera de los conjuntos de fagos que presentan las colecciones de anticuerpos constituye una base para seleccionar entidades usando el antígeno correspondiente como molécula objetivo. La etapa central en la que se aíslan los fagos unidos a antígeno, específicos de antígeno, se denomina fijación. Debido a la presentación de los fragmentos de anticuerpo en la superficie de los fagos, este procedimiento general se denomina presentación en fagos. Un procedimiento de selección preferido es el uso de proteínas pequeñas tales como el dominio N2 del fago filamentoso traduccionalmente fusionado al extremo N-terminal del scFv presentado por el fago. Otro procedimiento de presentación conocido en la técnica, que se puede usar para aislar entidades de unión es el procedimiento de presentación en ribosomas (revisado en Groves y Osbourn, Expert Opin Biol Ther. 2005, 5:125 ff; Lipovsek y Pluckthun, J Immunol Methods 2004, 290:52 ff).

Con el fin de demostrar la unión de partículas de fagos de scFv a una proteína de fusión 1-27 CD3ε-Fc se puede recoger una colección de fagos portadores del repertorio scFv clonado del sobrenadante de cultivo correspondiente mediante PEG (polietilenglicol). Se pueden incubar partículas de fagos de scFv con proteína de fusión CD3ε Fc inmovilizada. La proteína de fusión CD3CD3ε Fc inmovilizada se puede recubrir sobre una fase sólida. Se pueden eluir entidades de unión y usar el eluato para la infección de huéspedes bacterianos no infectados nuevos. Los huéspedes bacterianos transducidos exitosamente con una copia de fagémido, que codifica un fragmento scFv humano, se pueden seleccionar de nuevo por su resistencia a carbenicilina e infectarse posteriormente con, p. ej., el fago colaborador VCMS 13 para iniciar el segundo ciclo de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente, se llevan a cabo un total de 4 a 5 ciclos de selección.

La unión de entidades de unión aisladas se puede probar en células Jurkat positivas para CD3épsilon, células HPBall, PBMC o células eucariotas transfectadas portadoras de la secuencia N-terminal de CD3ε fusionada a la EpCAM presentada en superficie usando un ensayo de citometría de flujo (véase el ejemplo 4 adjunto).

Punto 2. El procedimiento del punto 1, en el que el/los polipéptido(s) comprende(n) el dominio de unión identificado como el primer dominio de unión y un segundo dominio de unión capaz de unirse a un antígeno de superficie celular.

Para la generación del segundo dominio de unión del polipéptido identificado mediante el procedimiento mencionado anteriormente, p. ej., anticuerpos monocatenarios biespecíficos como se definen en el presente documento, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales que se unen a ambos de los respectivos antígenos de superficie celular humanos y/o de primate distinto de chimpancé. Pueden derivarse dominios de unión apropiados para el polipéptido biespecífico definido en el presente documento, p. ej., a partir de anticuerpos monoclonales específicos de especies cruzadas mediante procedimientos recombinantes descritos en la técnica. Un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno de superficie celular humano y al homólogo de dicho antígeno de superficie celular en un primate distinto de chimpancé se puede probar mediante ensayos FACS como se expone anteriormente. También se pueden usar técnicas de hibridoma descritas en la literatura (Kohler y Milstein, Nature 256 (1975), 495-7) para la generación de anticuerpos específicos de especies cruzadas. Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones de forma alternativa con CD33 humana y de primate distinto de chimpancé. A partir de estos ratones, se pueden aislar células de hibridoma productoras de anticuerpos específicos de especies cruzadas por medio de tecnología de hibridoma y analizarlos por FACS como se expone anteriormente. En los ejemplos siguientes se muestra la generación y el análisis de polipéptidos biespecíficos tales como anticuerpos monocatenarios biespecíficos que presentan especificidad de especie cruzada descritos en el presente documento. Las ventajas de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos que presentan especificidad de especie cruzada incluyen los puntos que se enumeran a continuación.

Punto 3. El procedimiento del punto 2, en el que el segundo dominio de unión se une a un antígeno de superficie celular humano y/o de un primate distinto de chimpancé.

Punto 4. El procedimiento de cualquiera de los puntos 1 a 3, en el que el primer dominio de unión es un anticuerpo.

Punto 5. El procedimiento del punto 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.

Punto 6. El procedimiento de cualquiera de los puntos 2 a 5, en el que el segundo dominio de unión es un anticuerpo.

Punto 7. El procedimiento de cualquiera de los puntos 1 a 6, en el que el fragmento del dominio extracelular de CD3ε consiste en uno o más fragmentos de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera representada en la SEQ ID NO. 2, 4, 6 u 8.

Punto 8. El procedimiento del punto 7, en el que dicho fragmento tiene 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 residuos de aminoácido de longitud.

Punto 9. El procedimiento de cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que el procedimiento de identificación es un procedimiento de rastreo de una pluralidad de polipéptidos que comprenden un dominio de unión específico de especies cruzadas capaz de unirse a un epítopo de CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé.

Punto 10. El procedimiento de cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que el procedimiento de identificación es un procedimiento de purificación/aislamiento de un polipéptidos que comprenden un dominio de unión específico de especies cruzadas capaz de unirse a un epítopo de CD3ε humana y de primate distinto de chimpancé.

Punto 11. El uso de un fragmento N-terminal del dominio extracelular de CD3ε de 27 aminoácidos como máximo que comprende la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 381) o Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly (SEQ ID NO. 382) para la generación de un dominio de unión específico de especies cruzadas. De conformidad con dicho uso de la invención, se prefiere que el dominio de unión específico de especies cruzadas sea de origen humano.

Punto 12. El uso de acuerdo con el punto 11, en el que el dominio de unión específico de especies cruzadas es un anticuerpo.

Punto 13. El uso de acuerdo con el punto 12, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monocatenario.

Punto 14. El uso de acuerdo con el punto 12 a 13, en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

En la descripción y los ejemplos de la presente invención se divulgan y se engloban estas y otras realizaciones. Técnicas recombinantes y procedimientos en inmunología se describen, p. ej., en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002. Se puede recuperar literatura

adicional concerniente a cualquier de los anticuerpos, procedimientos, usos y compuestos que han de emplearse de acuerdo con la presente invención de bibliotecas y bases de datos públicas usando, por ejemplo, dispositivos electrónicos. Por ejemplo, se puede utilizar la base de datos pública "Medline", disponible en Internet, por ejemplo, en http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. El experto en la técnica conoce bases de datos y direcciones adicionales tales como http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/o enumeradas en la página de inicio de los servicios del EMBL http:// www.embl.de/services/index.html y también se pueden obtener usando, p. ej., http:// www.google.com.

Las figuras muestran:

Figura 1

Fusión de los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de primate a una proteína soluble heteróloga.

Figura 2

La figura muestra los valores de absorción promedio de muestras por cuadruplicado medidos en un ensayo ELISA de detección de la presencia de una construcción que consiste en los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura fusionados con la porción de bisagra y gamma Fc de lgG1 humana y una marca Cterminal de 6 histidinas en un sobrenadante de células 293 transfectadas de forma transitoria. La primera columna etiquetada "27 aa huCD3Ε" muestra el valor promedio de la absorción para la construcción, la segunda columna etiquetada "SN no pert." muestra el valor promedio para un sobrenadante de células 293 transfectadas con una construcción no pertinente como control negativo. La comparación de los valores obtenidos para la construcción con los valores obtenidos para el control negativo demuestra claramente la presencia de la construcción recombinante.

Figura 3

La figura muestra los valores de absorción promedio de muestras por cuadruplicado medidos en un ensayo ELISA de detección de la unión de las moléculas de unión anti-CD3 específicas de especies cruzadas en forma de preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios expresados en el periplasma frente a una construcción que comprende los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura fusionados a la porción de bisagra y gamma Fc de la IgG1 humana y una marca His6 C-terminal. Las columnas muestran, de izquierda a derecha, los valores de absorción promedio para las especificidades denominadas A2J HLP, I2C HLP, E2M HLP, F7O HLP, G4H HLP, H2C HLP, E1L HLP, F12Q HLP, F6A HLP y H1E HLP. La columna del extremo de la derecha etiquetada "contr. neg." muestra el valor de absorción promedio para la preparación de anticuerpo monocatenario de un anticuerpo murino anti-CD3 humana como control negativo. La comparación de los valores obtenidos para las especificidades anti-CD3 con los valores obtenidos para el control negativo demuestra claramente la unión fuerte de las especificidades anti-CD3 a los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura.

Figura 4

Fusión de los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de primate a una proteína unida a membrana heteróloga.

Figura 5

Superposiciones de gráficas de diferentes transfectantes probados en un ensayo FACS de detección de la presencia de proteínas de fusión transmembranarias recombinantes que consisten en EpCAM de cynomolgus y los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, tamarino, mono ardilla y cerdo doméstico, respectivamente. Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan las construcciones que comprenden el 27 mero humano, el 27 mero de tití, el 27 mero de tamarino, el 27 mero de mono ardilla y el 27 mero de cerdo, respectivamente. En las superposiciones individuales, la línea fina representa una muestra incubada con PBS con FCS al 2 % en lugar de anticuerpo anti-Flag M2 como control negativo y la línea gruesa representa una muestra incubada con el anticuerpo anti-Flag M2. Para cada construcción, la superposición de las gráficas muestra la unión del anticuerpo anti-Flag M2 a los transfectantes, lo que demuestra claramente la expresión de las construcciones recombinantes en los transfectantes.

Figura 6

Superposiciones de gráficas de diferentes transfectantes probados en un ensayo FACS de detección de la unión de moléculas de unión anti-CD3 específicas de especies cruzadas en forma de preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios expresados en el periplasma frente a los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, tamarino y mono ardilla, respectivamente, fusionados a EpCAM de cynomolgus.

Figura 6A:

Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero humano probada con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.

Figura 6B:

Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de tití probada con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.

Figura 6C:

Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de tamarino probada con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.

Figura 6D:

Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de mono ardilla probada con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.

Figura 6E:

Las superposiciones de gráficas, de izquierda a derecha y de arriba a abajo, muestran los resultados para los transfectantes que expresan la 1-27 CD3-EpCAM que comprende el 27 mero de cerdo probada con las moléculas de unión específicas de CD3 designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP y G4H HLP, respectivamente.

En las superposiciones individuales la línea fina representa una muestra incubada con una preparación monocatenaria de un anticuerpo murino anti-CD3 humana como control negativo y la línea gruesa muestra una muestra incubada con las moléculas de unión anti-CD3 correspondientes indicadas. Teniendo en cuenta la falta de unión a los transfectantes con 27 mero de cerdo y los niveles de expresión de las construcciones mostrados en la figura 5, las superposiciones de las gráficas muestran unión específica y fuerte de las especificidades anti-CD3 probadas de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos humanos totalmente específicos de especies cruzadas a células que expresan las proteínas de fusión transmembranarias recombinantes que comprenden los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, tamarino y mono ardilla, respectivamente, fusionados a EpCAM de cynomolgus y, por lo tanto, muestran las especificidad de especies cruzadas multiprimate de las moléculas de unión anti-CD3.

Figura 7

Ensayo FACS para la detección de CD3 épsilon humana en linfocitos T EL4 murinos transfectados. El análisis gráfico muestra una superposición de gráficas. La línea gruesa muestra células transfectadas incubadas con el anticuerpo anti-CD3 humana UCHT-1. La línea fina representa células incubadas con un control de isotipo de IgG1 murina. La unión del anticuerpo anti-CD3 UCHT1 muestra claramente la expresión de la cadena CD3 épsilon humana en la superficie celular de linfocitos T EL4 murinos transfectados.

Figura 8

Unión de anticuerpos anti-CD3 específicos de especies cruzadas a mutantes de alanina en un experimento de rastreo de alanina. En las figuras individuales, las columnas muestran, de izquierda a derecha, los valores de unión calculados en unidades arbitrarias de escala logarítmica para el transfectante natural (WT) y para todos los mutantes de alanina, de la posición 1 a la 27. Los valores de unión se calculan usando la fórmula siguiente:

Muestra(x,y) -Contr._neg(x)

valor_muestra(x,y) = WT(y) -Contr._neg(wt)

(UCHT -1(x) -Contr._neg(x))*

UCHT -1(wt) -Contr._neg(wt)

En esta ecuación valor_muestra significa el valor en unidades arbitrarias de unión que representa el grado de unión de un anticuerpo anti-CD3 específico a un mutante de alanina específico mostrado en la figura, Muestra significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico ensayado en un transfectante de rastreo de alanina específico, Contr._neg significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el control negativo ensayado en un mutante de alanina específico, UCTH-1 significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el anticuerpo UCHT-1 ensayado en un mutante de alanina específico, WT significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico ensayado en el transfectante natural, x especifica el transfectante correspondiente, y especifica el anticuerpo anti-CD3 correspondiente y wt especifica que el transfectante correspondiente es el natural. Las posiciones de mutantes de alanina individuales se etiquetan con el código de una sola letra del aminoácido natural y el número de la posición.

Figura 8A:

La figura muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico de especies cruzadas A2J HLP expresado como molécula de IgG quimérica. Se observa una disminución de la actividad de unión para mutaciones de alanina en la posición 4 (asparagina), en la posición 23 (treonina) y en la posición 25 (isoleucina). Se observa una pérdida total de unión para mutaciones de alanina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).

Figura 8B:

La figura muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico de especies cruzadas E2M HLP expresado como molécula de IgG quimérica. Se observa una disminución de la actividad de unión para mutaciones de alanina en la posición 4 (asparagina), en la posición 23 (treonina) y en la posición 25 (isoleucina). Se observa una pérdida total de unión para mutaciones de alanina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).

Figura 8C:

La figura muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico de especies cruzadas H2C HLP expresado como molécula de IgG quimérica. Se observa una disminución de la actividad de unión para mutaciones de alanina en la posición 4 (asparagina). Se observa una pérdida total de unión para mutaciones de alanina glutamina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).

Figura 8D:

Muestra los resultados para el anticuerpo anti-CD3 específico de especies cruzadas F12Q HLP, probado como anticuerpo monocatenario expresado en el periplasma. Se observa una pérdida total de unión para mutaciones de alanina en la posición 1 (glutamina), en la posición 2 (aspartato), en la posición 3 (glicina) y en la posición 5 (glutamato).

Figura 9

Ensayo FACS de detección de la unión de la molécula de unión anti-CD3 específica de especies cruzadas H2C HLP a CD3 humana con y sin marca His6 N-terminal. Se realizan superposiciones de gráficas de la línea celular EL4 transfectada con la cadena CD3 épsilon humana natural (gráfica de la izquierda) o la cadena CD3 épsilon humana con una marca His6 N-terminal (gráfica de la derecha) probada en un ensayo FACS de detección de la unión de la molécula de unión específica de especies cruzadas H2C HLP. Las muestras se incuban con un control de isotipo apropiado como control negativo (línea fina), con el anticuerpo anti-CD3 humana UCHT-1 como control positivo (línea discontinua) y con el anticuerpo anti-CD3 específico de especies cruzadas H2C HLP en forma de molécula de IgG quimérica (línea gruesa).

Las superposiciones de gráficas muestran una unión comparable del anticuerpo UCHT-1 a ambos transfectantes en comparación con el control de isotipo, lo que demuestra la expresión de ambas construcciones recombinantes. Las superposiciones de gráficas también muestran la unión de la molécula de unión anti-CD3 H2C HLP sólo a la cadena CD3 épsilon humana natural, pero no a la cadena CD3 épsilon humana con His6. Estos resultados demuestran que un extremo N-terminal libre es esencial para la unión de la molécula de unión anti-CD3 específica de especies cruzadas H2C HLP.

Figura 10

Unión saturante de EGFR-21-63 LH x H2C sobre PBMC positivos para CD3 humana para determinar el valor de la KD de la unión de CD3 sobre células por análisis FACS. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 7.

Figura 11

Análisis de unión FACS de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con EGFR humano, la línea de linfocitos T positivos para CD3 humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus y una línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx. La tinción FACS se realiza cabo como se describe en el ejemplo 12. La línea gruesa representa células incubadas con 2 μg/ml proteína purificada que después se incuban con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea fina de la gráfica refleja el control negativo: células incubadas sólo con el anticuerpos anti-His y el anticuerpo de detección.

Figura 12

Actividad de citotoxicidad inducida por construcciones monocatenarias específicas de EGFR específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) y B) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56-estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con EGFR humano como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 13.

Figura 13

Actividad de citotoxicidad inducida por construcciones monocatenarias específicas de EGFR específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) y B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con EGFR humano como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 13.

Figura 14

Análisis de unión FACS de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con MCSP D3 humana, la línea de linfocitos T positivos para CD3 humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con EGFR de cynomolgus y una línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx. La tinción FACS se realiza cabo como se describe en el ejemplo 17. La línea gruesa representa células incubadas con 2 μg/ml proteína purificada que después se incuban con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea fina de la gráfica refleja el control negativo: células incubadas sólo con el anticuerpos anti-His y el anticuerpo de detección.

Figura 15

Análisis de unión FACS de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con el MCSP D3 humana, la línea de linfocitos T positivos para CD3 humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cynomolgus y una línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx. La tinción FACS se realiza cabo como se describe en el ejemplo 17. La línea gruesa representa células incubadas con 2 μg/ml proteína purificada que después se incuban con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea fina de la gráfica refleja el control negativo: células incubadas sólo con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección.

Figura 16

Análisis de unión FACS de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con MCSP D3 humana, la línea de linfocitos T positivos para CD3 humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cynomolgus y una línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx. La tinción FACS se realiza cabo como se describe en el ejemplo 17. La línea gruesa representa células incubadas con 2 μg/ml proteína monomérica purificada que después se incuban con el anticuerpo anti-His y el anticuerpo de detección marcado con PE. La línea fina de la gráfica refleja el control negativo: células incubadas sólo con el anticuerpos anti-His y el anticuerpo de detección.

Figura 17

Actividad de citotoxicidad inducida por construcciones monocatenarias específicas de MCSP específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4/CD56-estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células objetivo. B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 18.

Figura 18

Actividad de citotoxicidad inducida por construcciones monocatenarias específicas de MCSP específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) y B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 de cynomolgus como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 18.

Figura 19

Actividad de citotoxicidad inducida por construcciones monocatenarias específicas de MCSP específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) y B) Se usan PBMC humanas CD4-/CD56-estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 18.

Figura 20

Actividad de citotoxicidad inducida por construcciones monocatenarias específicas de MCSP específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4/CD56-estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células objetivo. B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 18.

Figura 21

Actividad de citotoxicidad inducida por construcciones monocatenarias específicas de MCSP específicas de especies cruzadas designadas redirigidas a líneas celulares objetivo indicadas. A) Se usan PBMC humanas CD4

/CD56-estimuladas como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células objetivo. B) Se usa la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx como células efectoras, células CHO transfectadas con MCSP D3 humana como células objetivo. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 18.

Figura 22

Estabilidad en plasma de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de MCSP y CD3 probada mediante la medida de la actividad de citotoxicidad inducida por muestras de las construcciones monocatenarias designadas incubadas con plasma humano al 50 % a 3 7°C y a 4°C durante 24 horas, respectivamente, o con la adición de plasma humano al 50 % inmediatamente antes de probar la citotoxicidad o sin la adición de plasma. Se usan células CHO transfectadas con MCSP humana como línea celular objetivo y se usan PBMC humanas CD4-/CD56-como células efectoras. El ensayo se realiza como se describe en el ejemplo 19.

Figura 23

Análisis de unión FACS de construcciones monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas designadas a células CHO transfectadas con HER2 humano, la línea de linfocitos T positivos para CD3 humana HPB-ALL, células CHO transfectadas con EGFR de macaco y la línea de linfocitos T de macaco 4119 LnPx, respectivamente. La tinción FACS se realiza como se describe en el ejemplo 23.4. Las líneas gruesas representan células incubadas con 2 μg/ml de construcción monocatenaria biespecífica purificada. Las líneas finas reflejan los controles negativos. Se usó PBS con FCS al 2 % FCS como control negativo. Para cada construcción monocatenaria biespecífica específica de especies cruzadas, la superposición de las gráficas muestra la unión específica de la construcción a HER2 humano y de macaco y a CD3 humana y de macaco.

Figura 24

Los diagramas muestran los resultados de ensayos de liberación de cromo para medir la actividad citotóxica inducida por construcciones monocatenarias específicas de HER2 específicas de especies cruzadas redirigidas a las líneas celulares objetivo indicadas. También se usaron células efectoras como se indica. Los ensayos se realizan como se describe en el ejemplo 23.5. Los diagramas demuestran claramente para cada construcción el potente reclutamiento de actividad citotóxica de células efectoras humanas y de macaco contra células CHO transfectadas con HER2 humano y de macaco, respectivamente.

Figura 25

Análisis ELISA específico de CD3 de preparaciones periplásmicas que contienen fragmentos de proteína scFv marcados con Flag de clones seleccionados. Se añadieron preparaciones periplásmicas de fragmentos de proteína scFv soluble a pocillos de una placa de ELISA, que habían recubierto con proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc y, adicionalmente, se habían bloqueado con PBS con BSA al 3 %. Se realizó la detección mediante un anticuerpo monoclonal anti-Flag marcado con biotina seguido de estreptavidina conjugada con peroxidasa. El ELISA se desarrolló mediante una solución de sustrato ABTS. Los valores de DO (eje y) se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA. En el eje x se presentan los nombres de los clones.

Figura 26

Análisis ELISA de preparaciones periplásmicas que contienen fragmentos de proteína scFv marcados con Flag de clones seleccionados. Se añadieron las mismas preparaciones periplásmicas de fragmentos de scFv soluble que en la figura 25 a pocillos de una placa de ELISA que no se habían recubierto con proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc sino con hulgG1 (Sigma) y bloqueados con PBS con BSA al 3 %.

Se realizó la detección mediante un anticuerpo monoclonal anti-Flag marcado con biotina seguido de estreptavidina conjugada con peroxidasa. El ELISA se desarrolló mediante una solución de sustrato ABTS. Los valores de DO (eje y) se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA. En el eje x se presentan los nombres de los clones.

La presente invención se describe adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos ilustrativos no limitantes que permiten una mejor comprensión de la presente invención y de sus muchas ventajas.

Ejemplos

1. Identificación de secuencias de CD3épsilon a partir de muestras de sangre de primates no humanos

Se usaron muestras de sangre de los siguientes primates no humanos para la identificación de CD3épsilon: Callithrix jacchus, Saguinus oedipus y Saimiris sciureus. Se prepararon muestras de sangre completa tratadas con heparina recién preparada para aislar el ARN celular total de acuerdo con el protocolo del fabricante (QIAamp RNA Blood Mini Kit, Qiagen). El ARNm extraído se transcribió en ADNc de acuerdo con protocolos publicados. Brevemente, se incubaron 10 μl de ARN precipitado con 1,2 μl de mezcla de hexanucleótidos 10x (Roche) a 70 °C durante 10 minutos y se almacenaron en hielo. Se añadió una mezcla de reacción que consistía en 4 μl de tampón Superscript II 5x, 0,2 μl de ditiotreitol 0,1 M, 0,8 μl de Superscript II (Invitrogen), 1,2 μl de desoxirribonucleósidos trifosfato (25 μM), 0,8 μl de inhibidor de RNasa (Roche) y 1,8 μl de agua sin DNasa y RNasa (Roth). La mezcla de

reacción se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos seguido de incubación a 42 °C durante 50 minutos y después a 90 °C durante 5 minutos. La reacción se enfrió en hielo antes de añadir 0,8 μl de RNasaH (1 U/μl, Roche) y se incubó durante 20 minutos a 37 °C.

Se sometieron los ADNc de la primera hebra de cada especie a reacciones en cadena de la polimerasa de 35 ciclos por separados usando la polimerasa de ADN Taq (Sigma) y las siguientes combinaciones de cebadores diseñados de acuerdo con la búsqueda en bases de datos: cebador directo 5'-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3' (SEQ ID NO: 377); cebador inverso 5'-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3' (SEQ ID NO: 378);. Las bandas amplificadas de 550 pb se purificaron en gel (kit de extracción en gel, Qiagen) y se secuenciaron (Sequiserve, Vaterstetten/Alemania, véase el listado de secuencias).

CD3épsilon de Callithrix jacchus

Nucleótidos

CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTCGTAAATA GTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGACTTTTCGGAAATGGAGCAA AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

Aminoácidos

QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ SGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD

CD3épsilon de Saguinus oedipus

Nucleótidos

CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTTGTAAATA GTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGATTTTTCGGAAATGGAGCAA AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

Aminoácidos

QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ SGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD

CD3épsilon de Saimiris sciureus

Nucleótidos

CAGGACGGTAATGAAGAGATTGGTGATACTACCCAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACAGGAAATAAAATGGCTCGTAAATG ATCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAAGATTTTTCAGAAATGGAACAA AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACCCCCACAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

Aminoácidos

QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGQEIKWLVNDQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ SGYYACLSKETPTEEASHYLYLKARVCENCVEVD

2. Generación de fragmentos de anticuerpos monocatenarios (scFv) específicos de especies cruzadas que se unen a los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3épsilon humana y de diferentes primates distintos de chimpancé

2.1. Inmunización de ratones usando el extremo N-terminal de CD3épsilon separado de su contexto de CD3 nativo mediante fusión a una proteína soluble heteróloga

Se inmunizaron ratones F1 a partir de cruces balb/c x C57black de diez semanas de edad con la proteína de fusión CD3épsilon-Fc portadora de los aminoácidos 1-27 más próximos al extremo N-terminal de la cadena CD3épsilon madura (1-27 CD3-Fc) humana y/o de Saimiris sciureus. Con este fin, se inyectaron 40 μg por ratón de la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc con 10 nmol de un CpG-oligonucleótido modificado con tioato (5'-tccatgacgttcctgatgct-3') en 300 μl de PBS por vía intraperitoneal. Los ratones reciben inmunizaciones de refuerzo después de 21, 42 y, opcionalmente, 63 días de la misma manera. Diez días después de la primera inmunización de refuerzo, se tomaron

muestras de sangre y se probaron las valoraciones séricas de anticuerpo contra la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc mediante ELISA. Adicionalmente, se probó la valoración contra la línea de linfocitos T positiva para CD3 humana HPBall en citometría de flujo de acuerdo con protocolos estándar. Las valoraciones séricas fueron significativamente más altas en animales inmunizados que en no inmunizados.

2.2. Generación de una colección inmunitaria de scFv de anticuerpos murinos: Construcción de una colección de anticuerpos combinatoria y presentación en fagos

Tres días después de la última inyección se recogieron las células de bazo murinas para la preparación de ARN total de acuerdo con protocolos estándar.

Se construyó una colección de fragmentos de ADN de región variable de cadena ligera (kappa) (VK) de inmunoglobulina (Ig) y de región variable de cadena pesada (VH) de Ig murinos por RT-PCR sobre ARN de bazo murino usando cebadores específicos de VK y VH. Se sintetizó ADNc de acuerdo con protocolos estándar.

Los cebadores se diseñaron de manera que dieran lugar a un sitio de reconocimiento 5'-Xhol y uno 3'-BstEII para los fragmentos V de cadena pesada amplificados y a un sitio de reconocimiento 5'-Sacl y uno 3'-Spel para fragmentos de ADN VK amplificados.

Para la amplificación por PCR de los fragmentos de ADN VH se combinaron cada uno de ocho cebadores específicos de la familia 5'-VH diferentes (MVHI(GC)AG GTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT; MVH2 GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT; MVH3 CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT; MVH4 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA; MVH5 GA(AG) GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA; MVH6 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT; MVH7 GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA; MVH8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT) con un cebador de 3'-VH (3'MuVHBstEII tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca g); para la amplificación por PCR de los fragmentos de cadena VK se combinaron cada uno de siete cebadores específicos de la familia 5'-VK diferentes (MUVK1 CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT; MUVK2 CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC; MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA; MUVK4 CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA; MUVK5 CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA; MUVK6 CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA; MUVK7 CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA) con un cebador de 3'-VK (3'MuVkHindlll/BsiW1 tgg tgc act agt cgt acg ttt gat etc aag ctt ggt ccc).

Se usó el programa de PCR siguiente para la amplificación: desnaturalización a 94 °C durante 20 s; alineación de cebadores a 52 °C durante 50 s y extensión de cebadores a 72 °C durante 60 s y 40 ciclos, seguido de una extensión final de 10 minutos a 72 °C.

Se ligaron 450 ng de los fragmentos de cadena ligera kappa (digeridos con Sacl-Spel) con 1400 ng del fagémido pComb3H5Bhis (digerido con Sacl-Spel; fragmento grande). La colección de anticuerpos combinatoria resultante se transformó después en 300 μl de células de Escherichia coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm, Biorad Gen Pulser) dando como resultado un tamaño de colección de más de 107 clones independientes. Después de una hora de expresión del fenotipo, se seleccionaron los transformantes positivos por su resistencia a carbenicilina codificada por el vector pComb3H5BHis en 100 ml cultivo en super broth líquido (SB) durante la noche. Después, se recogieron las células por centrifugación y se llevó a cabo la preparación de plásmidos usando un kit de preparación de plásmidos comercialmente disponible (Qiagen).

Se ligaron 2800 ng de este ADN plasmídico que contenía la colección VK (digerido con Xhol-BstEII; fragmento grande) con 900 ng de los fragmentos V de cadena pesada (digeridos con Xhol-BstEII) y se transformaron de nuevo en dos alícuotas de 300 ul de células de E. coli XL1 Blue electrocompetentes por electroporación (2,5 kV, cubeta de 0,2 cm de paso, 25 uFD, 200 Ohm) dando como resultado un tamaño total de colección de scFv VH-VK (fragmento variable monocatenario) de más de 107 clones independientes.

Después de la expresión del fenotipo y la adaptación lenta a la carbenicilina, se transfirieron las células de E. coli que contenían la colección de anticuerpos a medio de selección SB-carbenicilina (50 ug/ml). Después, se infectaron las células de E. coli que contenían la colección de anticuerpos con una dosis infecciosa de 1012 partículas de fago colaborador VCSM13, dando como resultado la producción y secreción de fagos filamentosos M13, en el que la partícula de fago contiene ADN de pComb3H5BHis monocatenario que codifica un fragmento scFv murino y presentaba la proteína scFv correspondiente como una fusión traduccional a la proteína de cubierta III del fago. Este conjunto de fagos que presentaban la colección de anticuerpos se usó posteriormente para la selección de entidades de unión a antígeno.

2.3. Selección de agentes de unión específicos de CD3 basada en presentación en fagos

Se recogió la colección de fagos portadores del repertorio de scFv clonado del correspondiente sobrenadante de cultivo mediante precipitación con PEG8000/NaCI y centrifugación. Se resuspendieron de aproximadamente 1011 a 1012 partículas scFv de fagos en 0,4 ml de PBS/BSA al 0,1 % y se incubaron con de 105 a 107 células Jurkat (una línea de linfocitos T positiva para CD3 humana) durante 1 hora en hielo bajo agitación lenta. Estas células Jurkat se hicieron crecer previamente en medio RPMI enriquecido con suero bovino fetal (al 10 %), glutamina y

penicilina/estreptomicina, se recogieron por centrifugación, se lavaron en PBS y se resuspendieron en PBS/FCS al 1 % (que contenía azida de Na). Los fagos scFv que no se unieron específicamente a las células Jurkat se eliminaron mediante cinco etapas de lavado con PBS/FCS al 1 % (que contenía azida de Na). Después del lavado, se eluyeron entidades de unión de las células resuspendiendo las células en HCI-glicina a pH 2,2 (10 min de incubación con agitación en vórtex posterior) y tras la neutralización con Tris 2 M a pH 12, se usó el eluato para la infección un cultivo recién preparado de células de E. coli XL1 Blue no infectadas (DO600 > 0,5). El cultivo de E. coli que contenía células de E. coli transducidas exitosamente con una copia de fagémido, que codifica un fragmento scFv humano, se seleccionaron de nuevo por su resistencia a carbenicilina y se infectaron posteriormente con fago colaborador VCMS 13 para iniciar el segundo ciclo de presentación de anticuerpos y selección in vitro. Normalmente, se llevaron a cabo un total de 4 a 5 ciclos de selección.

2.4. Rastreo de agentes de unión específicos de CD3

Se aisló ADN plasmídico correspondiente a 4 y 5 ciclos de fijación a partir de cultivos de E. coli después de la selección. Para la producción de proteína scFv soluble, se escindieron fragmentos de ADN VH-VL de los plásmidos (Xhol-Spel). Estos fragmentos se clonaron por medio de los mismos sitios de restricción en el plásmido pComb3H5BFlag/His que difería del pComb3H5BHis original en que la construcción de expresión (p. ej., scFv) incluye una marca Flag (TGD YKDDDDK) entre el scFv y la marca His6 y las proteínas de fago adicionales se eliminaron. Después de la ligación, se transformó cada conjunto (distintos ciclos de fijación) de ADN plasmídico en 100 μl de E. coli TG1 o XLI Blue competentes para choque térmico y carbenicilina y se plaquearon sobre LB-agar. Se tomaron colonias individuales en 100 μl de LB carb (50 ug/ml).

Las E. coli transformadas con pComb3H5BHis que contenían un segmento VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes después de la escisión del fragmento del gen III y la inducción con IPTG 1 mM. Debido a una secuencia señal adecuada, se exportó la cadena scFv al periplasma, donde se pliega en una conformación funcional.

Se tomaron colonias individuales bacterianas de E. coli TG1 de las placas de transformación para preparaciones periplásmicas a pequeña escala y se hicieron crecer en medio SB (p. ej., 10 ml) suplementado con MgCl2 20 mM y 50 μg/ml de carbenicilina (y se redisolvieron en PBS (p. ej., 1 ml) después de recogerlas. Mediante cuatro ciclos de congelación a -70 °C y descongelación a 37 °C, se destruyó la membrana externa de las bacterias por choque de temperatura y se liberaron las proteínas solubles periplásmicas, incluidas los scFv, al sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y los residuos celulares por centrifugación, se recogió el sobrenadante que contenía los scFv humanos anti-CD3 humana y se usó para examinarlo adicionalmente.

2.5. Identificación de agentes de unión específicos de CD3

La unión de los scFv aislados se probó mediante citometría de flujo en células eucariotas, que en su superficie expresan una proteína heteróloga que presenta en su extremo N-terminal los primeros 27 aminoácidos N-terminales de CD3épsilon.

Como se describe en el ejemplo 4, los primeros aminoácidos 1-27 de la secuencia N-terminal de la cadena CD3 épsilon madura del complejo receptor de linfocitos T humanos (secuencia de aminoácidos: QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT) se fusionaron al extremo N-terminal de la proteína transmembranaria EpCAM de forma que el extremo N-terminal se situó en la superficie exterior de la célula. Adicionalmente, se insertó un epítopo FLAG entre la secuencia 1-27 N-terminal de CD3épsilon y la secuencia de EpCAM. Este producto de fusión se expresó en células de riñón embrionario humano (HEK) y de ovario de hámster chino (CHO).

Se prepararon de la misma manera células eucariotas que presentaban los 27 aminoácidos más próximos al extremo N-terminal de CD3épsilon madura de otras especies de primates para Saimiri sciureus (mono ardilla) (secuencia de aminoácidos N-terminal de CD3épsilon: QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT), para Callithrix jacchus (secuencia de aminoácidos N-terminal de CD3épsilon: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT), para Saguinus oedipus (secuencia de aminoácidos N-terminal de CD3épsilon: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT).

Para citometría de flujo se incuban 2,5x105 con 50 ul de sobrenadante o con 5 μg/ml de las construcciones purificadas en 50 μl de PBS con FCS al 2 %. Se detectó la unión de las construcciones con un anticuerpo anti-His (anticuerpo Penta-His, sin BSA, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 μg/ml en 50 μl de PBS con FCS al 2 %. Como reactivo de segunda etapa se usó un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón (específico de fragmento Fc-gamma), diluido 1:100 en 50 μl de PBS con FCS al 2 % (Dianova, Hamburgo, RFA). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA).

La unión se confirmó siempre por citometría de flujo como se describe en el párrafo anterior en linfocitos T primarios humanos y de diferentes primates (p. ej., Saimiris sciureus, Callithrix jacchus, Saguinus oedipus).

2.6. Generación de equivalentes humanos/humanizados de scFv específicos de CD3épsilon no humanos

Se alineó la región VH del scFv anti-CD3 murino contra secuencias de aminoácidos de línea germinal de anticuerpos humanos. Se escogió la secuencia VH de línea germinal de anticuerpos humanos que tenía la mayor

homología con la VH no humana y se realizó una alineación directa de las dos secuencias de aminoácidos. Se observaron una serie de residuos estructurales de la VH no humana que diferían de las regiones estructurales de la VH humana ("diferentes posiciones estructurales"). Algunos de estos residuos pueden contribuir a la unión y la actividad del anticuerpo frente a su objetivo.

Para construir una colección que contiene las CDR murinas y, en cada posición estructural que difiere de la secuencia de VH humana elegida, ambas posibilidades (el residuo de aminoácido humano y murino materno), se sintetizaron oligonucleótidos degenerados. Estos oligonucleótidos incorporan en las posiciones que difieren el residuo humano con una probabilidad de 75 % y el residuo murino con una probabilidad del 25 %. Para una VH humana, p. ej., se tuvieron que sintetizar seis de estos oligonucleótidos que solapaban en un tramo final de aproximadamente 20 nucleótidos. Con este fin cada segundo cebador era un cebador antisentido. Se eliminaron los sitios de restricción necesarios para la clonación posterior del interior de los oligonucleótidos.

Estos cebadores pueden tener una longitud de 60 a 90 nucleótidos, en función del número de cebadores que se necesitaran para abarcar toda la secuencia V.

Estos seis cebadores, p. ej., se mezclaron en cantidades iguales (p. ej., 1 μl de cada cebador (soluciones madre de cebador de 20 a 100 μM) a una reacción de PCR de 20 μl) y se añadieron a una mezcla de PCR que consistía en tampón de PCR, nucleótidos y polimerasa Taq. Esta mezcla se incubó a 94 °C durante 3 minutos, a 65 °C durante 1 minuto, a 62 °C durante 1 minuto, a 59 °C durante 1 minuto, a 56 °C durante 1 minuto, a 52 °C durante 1 minuto, a 50 °C durante 1 minuto y a 72 °C durante 10 minutos en un ciclador de PCR. Posteriormente se hizo correr el producto en una electroforesis en gel de agarosa y se aisló el producto de una tamaño de 200 a 400 a partir del gel de acuerdo con procedimientos estándar.

Este producto de PCR se usó después como molde para una reacción de PCR estándar usando cebadores que incorporan sitios de restricción N-terminales y C-terminales adecuados. El fragmento de ADN del tamaño correcto (para una VH, aproximadamente 350 nucleótidos) se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con procedimientos estándar. De este modo, se amplificó suficiente fragmento de ADN de VH. Este fragmento de VH era en ese momento un conjunto de fragmentos de VH, cada uno con una cantidad diferente de residuos humanos y murinos en las correspondientes posiciones estructurales (conjunto de VH humanizadas). Se realizó el mismo procedimiento para la región VL de los scFv murinos anti-CD3 (conjunto de VL humanizadas).

El conjunto de VH humanizadas se combinó después con el conjunto de VL humanizadas en el vector de presentación en fagos pComb3H5Bhis para constituir una colección de scFv funcionales a partir del cual, después de la presentación en fagos filamentosos, se seleccionaron, rastrearon, identificaron y confirmaron agentes de unión anti-CD3 como se describe anteriormente para los scFv anti-CD3 no humanos (murinos) originales. Después, se analizaron clones individuales para detectar propiedades y secuencias de aminoácidos favorables. Se prefieren aquellos scFv que se encontraban más próximos en homología de secuencia de aminoácidos a los segmentos V de línea germinal humana, particularmente aquellos en los que al menos una CDR entre las CDR I y II de VH y las CDR I y II de VLkappa o las CDR I y II de VLIambda muestra más del 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la CDR más próxima correspondiente de todos los segmentos V de línea germinal humana. Se convirtieron los scFv anti-CD3 en anticuerpos monocatenarios biespecíficos recombinantes como se describe en los ejemplos 10 y 16 siguientes y se caracterizaron adicionalmente.

3. Generación de una proteína de fusión recombinante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana fusionados con la porción Fc de una lgG1 (1-27 CD3-Fc).

3.1. Clonación y expresión de 1-27 CD3-Fc

La secuencia codificante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana fusionados a la región de bisagra y la Fc gamma de la inmunoglobulina humana lgG1, así como una marca de 6 histidinas, se obtuvieron mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión recombinante se enumeran en las SEQ ID NO. 350 y 349). El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera un primer sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de los primeros 27 aminoácidos de la porción extracelular de la cadena CD3 épsilon humana madura, seguido en fase por la secuencia codificante de la región bisagra y la porción Fc gamma de la lgG1 humana, seguido en fase por la secuencia codificante de a una marca de 6 histidinas y un codón de detención (figura 1). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SaiI en el extremo 3', se utilizan en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de EcoRI y SaiI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) siguiendo protocolos estándar. Se usó un plásmido de secuencia comprobada para la transfección en el sistema de expresión Freestyle 293 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 3 días se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular de los transfectantes y se probó la presencia de la construcción recombinante en un ensayo ELISA. Se diluyó un anticuerpo de cabra anti-IgG humana específico de fragmento Fc-gamma (obtenido de Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,

Newmarket, Suffolk, RU) en PBS hasta 5 μg/ml y se recubrió con 100 μl por pocillo en una placa de ELISA de 96 pocillos MaxiSorp (Nunc GmbH y Co. KG, Wiesbaden, Alemania) durante la noche a 4 °C. Se lavaron los pocillos con PBS con Tween 20 al 0,05 % (PBS/Tween y se bloquearon con BSA en PBS al 3 % (albúmina bovina, fracción V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) durante 60 minutos a temperatura ambiente (TA). Posteriormente, se lavaron los pocillos de nuevo con PBS/Tween y después se incubaron con sobrenadantes de cultivo celular durante 60 minutos a TA. Después del lavado, se incubaron los pocillos con un anticuerpo anti-His6 conjugado con peroxidasa (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) diluido 1:500 en PBS con BSA al 1 % durante 60 minutos a TA. Posteriormente, se lavaron los pocillos con 200 μl de PBS/Tween y se añadieron 100 μl de OPD SIGMAFAST (solución de sustrato de OPD [diclorhidrato de o-fenilendiamina] SIGMAFAST (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 μl de H2SO4 1 M. Se midió la reacción de color en un espectrofotómetro para microplacas PowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, EE. UU.) a 490 nm y restando la absorción de fondo a 620 nm. Como se muestra en la figura 2, la presencia de la construcción en comparación con el sobrenadante no pertinente de células HEK 293 con transfección simulada usadas como control negativo era claramente detectable.

3.2. Ensayo de unión de anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas a 1-27 CD3-Fc.

Se probó la unión de preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas expresados en el periplasma específicos para CD3 épsilon a 1-27 CD3-Fc en un ensayo ELISA. Se diluyó un anticuerpo de cabra anti-IgG humana específico de fragmento Fc-gamma (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU) en PBS hasta 5 μg/ml y se recubrió con 100 μl por pocillo en una placa de ELISA de 96 pocillos MaxiSorp (Nunc GmbH y Co. KG, Wiesbaden, Alemania) durante la noche a 4 °C. Se lavaron los pocillos con PBS con Tween 20 al 0,05 % (PBS/Tween y se bloquearon con PBS con BSA al 3 % (albúmina bovina, fracción V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) durante 60 minutos a TA. Posteriormente, se lavaron los pocillos con PBS/Tween y se incubaron con sobrenadantes de células que expresaban la construcción de 1-27 CD3-Fc durante 60 minutos a TA. Se lavaron los pocillos con PBS/Tween y se incubaron con preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas expresados en el periplasma descritos anteriormente durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS/Tween, se incubaron los pocillos con anticuerpo anti-Flag M2 conjugado con peroxidasa (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) diluido 1:10000 en PBS con BSA al 1 % durante 60 minutos a TA. Se lavaron los pocillos con PBS/Tween y se incubaron con 100 μl de OPD SIGMAFAST (solución de sustrato de OPD [diclorhidrato de o-fenilendiamina] (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se detuvo la reacción de color con 100 μl de H2SO4 1 M y se midió en un espectrofotómetro para microplacas PowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, EE. UU.) a 490 nm y restando la absorción de fondo a 620 nm. Se observó una unión fuerte anticuerpos monocatenarios humanos específicos de especies cruzadas específicos para CD3 épsilon a la construcción de 1-27 CD3-Fc en comparación con un anticuerpo monocatenario anti-CD3 murino (figura 3).

4. Generación de proteínas de fusión transmembranarias recombinantes de los aminoácidos 1-27 Nterminales de CD3 épsilon de diferentes primates distintos de chimpancé fusionados a EpCAM de mono cynomolgus (1-27 CD3-EpCAM).

4.1. Clonación y expresión de 1-27 CD3-EpCAM

Se aisló la CD3 épsilon de diferentes primates distintos de chimpancé (tití, tamarino, mono ardilla) y de cerdo. Las secuencias codificantes de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana madura, de tití común (Callithrix jacchus), de tamarino cabeza de algodón (Saguinus oedipus), de mono ardilla común (Saimiri sciureus) y de cerdo doméstico (Sus scrofa; usado como control negativo) fusionadas al extremo N-terminal de EpCAM de cynomolgus marcada con Tag se obtuvieron mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. La secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión recombinantes se enumeran bajo las SEQ ID NO. 351 a 360). Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron como para que contuvieran en primer lugar un sitio BsrGI para permitir la fusión en el marco de lectura correcto con la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos ya presente en el vector de expresión objetivo, que va seguido en fase por la secuencia codificante de los aminoácidos 1-27 N-terminales de la porción extracelular de las cadenas CD3 épsilon maduras, que va seguida en fase por la secuencia codificante de una marca Flag y seguida en fase por la secuencia codificante de la proteína EpCAM transmembranaria de cynomolgus madura (figura 4). Los fragmentos de síntesis génica también se diseñaron para introducir un sitio de restricción al final del ADNc que codifica la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, BsrGI en el extremo 5' y SaiI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. Los fragmentos de síntesis génica se clonaron después a través de BsrGI y SaiI en un derivado del plásmido denominado pEF DHFR (pEF-DHFR se describe en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025), que ya contenía la secuencia codificante del péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos siguiendo protocolos estándar. Se usaron plásmidos de secuencia comprobada para transfectar de forma transitoria células HEK-293 usando el reactivo MATra-A (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) y 12 μg de ADN plasmídico para células HEK-293 adherentes en matraces de cultivo celular de 175 ml de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 3 días de cultivo celular, se probaron los transfectantes para determinar la expresión en la superficie celular de la proteína transmembranaria recombinante

por medio de un ensayo FACS de acuerdo con protocolos estándar. Con ese propósito, se incubó una cantidad de 2,5x105 células con el anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a 5 μg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se detectó el anticuerpo unido con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). La expresión de las proteínas de fusión transmembranarias recombinantes marcadas con Flag que consistían en EpCAM de cynomolgus y los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino, de mono ardilla y de cerdo, respectivamente, en células transfectadas era claramente detectable (figura 5).

4.2. Unión de anticuerpos monocatenarios anti-CD3 específicos de especies cruzadas a la 1-27 CD3-EpCAM.

Se probó la unión de preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios anti-CD3 específicos de especies cruzadas expresados en el periplasma a los aminoácidos 1-27 N-terminales de las cadenas CD3 humana, de tití, de tamarino y de mono ardilla, respectivamente fusionados con EpCAM de cynomolgus en un ensayo FACS de acuerdo con protocolos estándar. Con ese propósito, se incubó una cantidad de 2,5x105 células con preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios anti-CD3 específicos de especies cruzadas expresados en el periplasma (la preparación se realizó como se describe anteriormente y de acuerdo con protocolos estándar) y un anticuerpo monocatenario murino anti-CD3 humana como control negativo. Como anticuerpo secundario se usó el anticuerpo Penta-His (Qiagen GmbH, Hildesheim, Alemania) a 5 μg/ml en 50 μl de PBS con FCS al 2 %. Se detectó la unión del anticuerpo con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra antiratón específica de fragmento Fc-gamma 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). Como se muestra en las figuras 6 (A a E), se observó unión de anticuerpos monocatenarios a los transfectantes que expresaban las proteínas de fusión transmembranarias recombinantes consistentes en los aminoácidos 1-27 Nterminales de CD3 épsilon humana, de tití, de tamarino o de mono ardilla fusionados a EpCAM de cynomolgus. No se observó unión de anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas a una proteína de fusión consistente en los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon de cerdo fusionados a EpCAM de cynomolgus usada como control negativo. Se mostró la especificidad de especie cruzada multiprimate de los anticuerpos monocatenarios anti-CD3. Las señales obtenidas con el anticuerpo anti-Flag M2 y los anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas eran comparables, lo que indica una fuerte actividad de unión de los anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas a los aminoácidos 1-27 N-terminales de CD3 épsilon.

5. Análisis de la unión de anticuerpos monocatenarios anti-CD3 específicos de especies cruzadas mediante rastreo de alanina de células de ratón transfectadas con la cadena CD3 épsilon humana y de sus mutantes de alanina

5.1. Clonación y expresión de CD3 épsilon humana natural

Se obtuvo la secuencia codificante de la cadena CD3 épsilon humana mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de la cadena CD3 épsilon humana se enumeran en las SEC ID NO. 362 y 361). El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción y sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica la CD3 épsilon humana. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SaiI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó después por medio de EcoRI y SaiI en un plásmido denominado pEF NEO siguiendo protocolos estándar. pEF NEO se derivó de pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) reemplazando el ADNc del DHFR con el ADNc de la resistencia a neomicina por clonación molecular convencional. Se usó un plásmido de secuencia comprobada para transfectar la línea de linfocitos T murina EL4 (N.º de la ATCC TIB-39) cultivada en RPMI con Lglutamina estabilizada suplementado con FCS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % HEPES al 1 %, piruvato al 1 %, aminoácidos no esenciales al 1 % (todos de Biochrom AG Berlin, Alemania) a 37 °C, 95 % de humedad y 7 % de CO2. La transfección se realizó con el reactivo de transfección SuperFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y 2 μg de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 24 horas, se lavaron las células con PBS y se cultivaron de nuevo en el medio de cultivo celular mencionado anteriormente con 600 μg/ml de G418 para selección (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria). De 16 a 20 días después de la transfección, se observó el crecimiento de células resistentes. Después otros 7 a 14 días se probaron las células para determinar la expresión de CD3 épsilon humana por análisis FACS de acuerdo con protocolos estándar. Se incubaron 2,5x105 células con anticuerpo anti-CD3 humana UCHT-1 (BD biosciences, Heidelberg, Alemania) a 5 μg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se detectó la unión del anticuerpo con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). La expresión CD3 natural humana en células EL4 transfectadas se muestra en la figura 7.

5.2. Clonación y expresión de los anticuerpos monocatenarios anti-CD3 específicos de especies cruzadas anticuerpos lgG1

Con el fin de proporcionar mejores medios de detección de la unión de los anticuerpos anti-CD3 monocatenarios

específicos de especies cruzadas H2C HLP, A2J HLP y HLP E2M, se convirtieron en anticuerpos lgG1 con lgG1 murina y regiones constantes lambda humanas. Se obtuvieron las secuencias de ADNc que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos IgG correspondientes mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. Los fragmentos de síntesis génica para cada especificidad se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para permitir la expresión eucariota de la construcción, que va seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos (SEQ ID NO. 364 y 363), que va seguido en fase por la secuencia codificante de la correspondiente región variable de cadena pesada o la correspondiente región variable de cadena ligera, seguida en fase por la secuencia codificante de la región constante de cadena pesada de IgG1 murina (SEQ ID N.º 366 y 365) o la secuencia codificante de la región constante de cadena ligera lambda humana (SEQ ID N.º 368 y 367), respectivamente. Se introdujeron sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica la proteína de fusión. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SaiI en el extremo 3', se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. Los fragmentos de síntesis génica se clonaron mediante EcoRI y SaiI en un plásmido denominado pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) para las construcciones de cadena pesada y pEF ADA (pEF ADA se describe en Raum et al., Cancer Immunol lmmunother., 50(3), (2001), 141-50) para las construcciones de cadena ligera) de acuerdo con protocolos estándar. Se usaron plásmidos de secuencia comprobada para la cotransfección de las correspondientes construcciones de cadena ligera y cadena pesada en el sistema de expresión Freestyle 293 (invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 3 días, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular de los transfectantes y se usaron para el experimento de rastreo de alanina.

5.3. Clonación y expresión de mutantes de alanina de CD3 épsilon humana para rastreo de alanina

Se obtuvieron por síntesis génica 27 fragmentos de ADNc que codifica la cadena CD3 épsilon humana con un intercambio de un codón de la secuencia natural de CD3 épsilon humana por un codón que codifica alanina (GCC) para cada aminoácido de los aminoácidos 1-27 del dominio extracelular de la cadena CD3 épsilon humana madura, respectivamente. Excepto por el codón intercambiado, los fragmentos de ADNc eran idénticos al fragmento de ADNc de CD3 natural humana mencionado anteriormente. Sólo se reemplazó un codón en cada construcción en comparación con el fragmento de ADNc de CD3 natural humana descrito anteriormente. Se introdujeron los sitios de restricción EcoRI y SaiI en los fragmentos de ADNc en posiciones idénticas en comparación con la construcción natural. Se clonaron todas las construcciones de rastreo de alanina en pEF NEO y se transfectaron plásmidos de secuencia comprobada en células EL4. La transfección y la selección de los transfectantes se realizó como se describe anteriormente. Como resultado, se obtuvo un grupo de construcciones expresadas en las que el primer aminoácido de la cadena CD3 épsilon humana, glutamina (Q, Gln) en la posición 1, se reemplazó con alanina. El último aminoácido reemplazado por alanina fue la treonina (T, Thr) en la posición 27 de la CD3 épsilon natural humana madura. Para cada aminoácido entre la glutamina 1 y la treonina 27, se generaron los transfectantes correspondientes con un intercambio del aminoácido natural por alanina.

5.4. Experimento de rastreo de alanina

Se probaron anticuerpos IgG quiméricos descritos en 2) y anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas específicos para CD3 épsilon en un experimento de rastreo de alanina. La unión de los anticuerpos a las líneas celulares EL4 transfectadas con las construcciones mutantes de alanina de CD3 épsilon humana descritas en 3) se probó mediante un ensayo FACS de acuerdo con protocolos estándar. Se incubaron 2,5x105 células de los transfectantes correspondientes con 50 μl de sobrenadante de cultivo celular que contenían los anticuerpos IgG quiméricos o con 50 μl de preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios expresados en el periplasma. Para las muestras incubadas con preparaciones en bruto de anticuerpos monocatenarios expresados en el periplasma se usó como anticuerpo secundario el anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a 5 μg/ml en 50 μl de PBS con FCS al 2 %. Para las muestras incubadas con el anticuerpo IgG quimérico no fue necesario un anticuerpo secundario. Para todas las muestras, se detectó la unión de las moléculas de anticuerpo con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). Se detectó una unión diferente de las moléculas de IgG quiméricas o los anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas a las líneas celulares EL4 transfectadas con mutantes de alanina de CD3 épsilon humana. Como control negativo se usaron, respectivamente, un control de isotipo o una preparación en bruto de un anticuerpo monocatenario expresado en el periplasma de especificidad no pertinente. Se usó anticuerpo UCHT-1 como control positivo para el nivel de expresión de los mutantes de alanina de CD3 épsilon humana. Las líneas celulares EL4 transfectadas con los mutantes de alanina de los aminoácidos tirosina en la posición 15, valina en la posición 17, isoleucina en la posición 19, valina en la posición 24 o leucina en la posición 26 de la cadena CD3 épsilon madura no se evaluaron debido a niveles de expresión muy bajos (datos no mostrados). En la figura 8 (A-D) se muestra la unión de los anticuerpos monocatenarios específicos de especies cruzadas y los anticuerpos monocatenarios en formato IgG a las líneas celulares EL4 transfectadas con mutantes de alanina de la CD3 épsilon humana como unión relativa en unidades arbitrarias con la media geométrica de los valores de fluorescencia de los correspondientes controles negativos restada de todas las medias geométricas de los valores de fluorescencia correspondientes. Para compensar los diferentes niveles de expresión, después se dividieron todos los valores de la muestra para un transfectante determinado entre la media geométrica del valor de fluorescencia del anticuerpo UCHT-1 para el transfectante correspondiente. Para la comparación con el valor de la muestra natural de una

38 5

especificidad, finalmente se dividieron todos los valores de las muestras de las especificidades correspondiente entre el valor de la muestra natural, fijando de este modo el valor de la muestra natural en 1 unidad arbitraria de unión.

Los cálculos usados se muestran con detalle en la fórmula siguiente:

Muestra(x,y) -Contr._neg(x)

valor_muestra(x,y) = WT(y) -Contr._neg(wt)

(UCHT -1(x) -Contr._neg(x))*

UCHT -1(wt) -Contr._neg(wt)

En esta ecuación valor_muestra significa el valor en unidades arbitrarias de unión que representa el grado de unión de un anticuerpo anti-CD3 específico a un mutante de alanina específico mostrado en la figura 8 (A-D), Muestra significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico ensayado en un transfectante de rastreo de alanina específico, Contr._neg significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el control negativo ensayado en un mutante de alanina específico, UCTH-1 significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para el anticuerpo UCHT-1 ensayado en un mutante de alanina específico, WT significa la media geométrica del valor de fluorescencia obtenido para un anticuerpo anti-CD3 específico ensayado en el transfectante natural, x especifica el transfectante correspondiente, y especifica el anticuerpo anti-CD3 correspondiente y wt especifica que el transfectante correspondiente es el natural.

Como se puede observar en la figura 8 (A-D), el anticuerpo IgG A2J HLP mostró una pérdida de unión pronunciada para los aminoácidos asparagina en la posición 4, treonina en la posición 23 e isoleucina en la posición 25 de la cadena CD3 épsilon madura. Se observó una pérdida total de la unión del anticuerpo IgG A2J HLP para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en la posición 3 y glutamato en la posición 5 de la cadena épsilon CD3 madura. El anticuerpo IgG E2M HLP mostró una pérdida de unión pronunciada para los aminoácidos asparagina en la posición 4, treonina en la posición 23 e isoleucina en la posición 25 de la cadena CD3 épsilon madura. El anticuerpo IgG E2M HLP mostró una pérdida total de unión para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en la posición 3 y glutamato en la posición 5 de la cadena épsilon CD3 madura. El anticuerpo IgG H2C HLP mostró una pérdida de unión intermedia para el aminoácido asparagina en la posición 4 de la cadena épsilon CD3 madura y mostró una pérdida total de la unión para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en posición 3 y glutamato en la posición 5 de la cadena épsilon CD3 madura. El anticuerpo monocatenario F12Q HLP mostró una pérdida de unión esencialmente total para los aminoácidos glutamina en la posición 1, aspartato en la posición 2, glicina en la posición 3 de la cadena épsilon CD3 madura y glutamato en la posición 5 de la cadena CD3 épsilon madura.

6. Análisis de unión de la molécula de unión anti-CD3 específica de especies cruzadas H2C HLP a la cadena CD3 épsilon humana con y sin marca His6 N-terminal transfectada en la línea de linfocitos T murina EL4.

6.1. Clonación y expresión de la cadena CD3 épsilon humana con marca de seis histidinas (marca His6) Nterminal

Se obtuvo un fragmento de ADNc que codifica la cadena CD3 épsilon humana con una marca His6 N-terminal mediante síntesis génica. El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, que va seguido en fase por la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, que va seguida en fase por la secuencia codificante de una marca His6 que va seguida en fase por la secuencia codificante de la cadena CD3 épsilon humana madura (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran como SEQ ID NO. 380 y 379). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera sitios de restricción al principio y al final del ADNc. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SaiI en el extremo 3', se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó después por medio de EcoRI y SaiI en un plásmido denominado pEF-NEO (descrito anteriormente) siguiendo protocolos estándar. Se usó un plásmido de secuencia comprobada para transfectar la línea de linfocitos T murina EL4. La transfección y la selección de los transfectantes se realizaron como se describe anteriormente. Después de 34 días de cultivo celular, se usaron los transfectantes para el ensayo descrito a continuación.

6.2. Ensayo de unión de la molécula de unión anti-CD3 específica de especies cruzadas H2C HLP a la cadena CD3 épsilon humana con y sin marca His6 N-terminal.

Se probó un anticuerpo IgG quimérico con la especificidad de unión H2C HLP específica para CD3 épsilon para determinar la unión a CD3 épsilon humana con y sin marca His6 N-terminal. La unión del anticuerpo a las líneas celulares EL4 transfectadas con la CD3 épsilon-His6 humana y CD3 épsilon natural, respectivamente, se probó mediante un ensayo FACS de acuerdo con protocolos estándar. Se incubaron 2,5x105 células de los transfectantes con 50 μl de sobrenadante de cultivo celular que contenían los anticuerpos IgG quiméricos o 50 μl de los anticuerpos de control correspondientes a 5 μg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se usaron respectivamente, como control negativo, un control de isotipo apropiado y como control positivo de la expresión de las construcciones, el anticuerpo específico de CD3 UCHT-1. Se detectó la unión de los anticuerpos con un fragmento F(ab')2 purificado

por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania). En comparación con la línea celular EL4 transfectada con CD3 épsilon humana natural, se detectó una clara pérdida de unión de la IgG quimérica con especificidad de unión H2C HLP a CD3 épsilon humana con una marca His6 N-terminal. Estos resultados mostraron que un extremo N-terminal libre de CD3 épsilon es esencial para la unión de la especificidad de unión H2C HLP anti-CD3 específica de especies cruzadas a la cadena CD3 épsilon humana (figura 9).

7. Determinación de la constante de unión KD de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas para EGFR de primate y CD3 de primate (EGFR LH x H2C HLP) a la proteína de fusión 127 CD3-Fc por medidas de resonancia de plasmón superficial en comparación con la unión a PBMC que expresan CD3 medida con un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS)

7.1. Medidas de resonancia de plasmón superficial

Para determinar la afinidad de unión del anticuerpo monocatenario biespecífico totalmente específico de especies cruzadas EGFR-21-63 LH x H2C HLP a los aminoácidos 1-27 del extremo N-terminal de la cadena CD3 épsilon humana se realizó una medida de resonancia de plasmón superficial con una proteína de fusión recombinante que consistía en los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 humana madura fusionados a la porción Fc de IgG1 humana (1-27 CD3-Fc). Con este fin se instaló un chip CM5 de carboximetildextrano de Biacore (Biacore, Uppsala, Suecia) en un sistema Biacore 2000® (Biacore, Uppsala, Suecia). Se activó una célula de flujo mediante una solución de clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida de acuerdo con procedimientos estándar. Posteriormente, se añadió una solución de la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc, dando como resultado el enlace covalente estable de la proteína a la capa de dextrano del chip de Biacore. Se retiró la proteína no unida mediante un lavado exhaustivo seguido del bloqueo de los grupos carboxilo activados con NHS que quedaban sin reaccionar mediante la adición de una solución de etanolamina. Se confirmó el éxito del acoplamiento de la proteína por medio de una señal más elevada medida como unidades de respuesta en comparación con la señal antes del acoplamiento. Se preparó una célula de referencia como se describe, pero sin añadir una solución de proteína.

El anticuerpo biespecífico EGFR-21-63 LH x H2C HLP purificado se dializó exhaustivamente contra tampón HBS-EP (Biacore, Uppsala, Suecia) en una miniunidad de diálisis Slide-A-Lyzer® (Pierce, Rockford-M, EE. UU.). La concentración de proteína después de la diálisis se determinó mediante absorción UV a 280 nm, dando como resultado una concentración de 43 μg/ml.

La solución de proteína se transfirió a una placa de 96 pocillos y se realizó una dilución seriada con tampón HBS-EP en una proporción de 1:1 a 10 pocillos más.

Las medidas de resonancia de plasmón superficial se realizaron por separado tomando muestras de los 11 pocillos. Las células de flujo se regeneraron con tampón acetato entre las medidas para liberar la proteína unida.

Se obtuvieron señales de unión de moléculas de anticuerpo biespecífico restando la señal de la célula de referencia de la señal de la célula de medida conjugada con la proteína 1-27 CD3-Fc. Se midieron curvas de asociación y disociación como unidades de respuesta y se registraron. Las constantes de unión se calcularon usando el programa informático de ajuste de curvas de Biacore® basado en el modelo de Langmuir. Se determinó que la constante de unión KD calculada a lo largo de las primeras cinco concentraciones era de 1,52x10-7 M.

7.2. Determinación de la constante de unión a CD3 mediante medidas FACS

Con el fin de probar la afinidad de las moléculas de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la fuerza de unión a CD3 humana nativa, se realizó un análisis de unión adicional por FACS. Se usó la molécula de anticuerpo biespecífica elegida, EGFR-21-63 LH x H2C HLP, para establecer una serie de dilución con un factor de 1:1,5 una concentración de partida de 63,3 μg/ml. Se incubó la molécula de anticuerpo biespecífico a estas concentraciones diferentes con 1,25 x 105 PBMC humanas en cada caso durante 1 hora a 4 °C seguido de dos etapas de lavado en PBS a 4 °C. La detección de las moléculas de anticuerpo específico unidas se llevó a cabo usando un anticuerpo Penta-His (Qiagen GmbH, Hildesheim, Alemania) a 5 μg/ml en 50 μl de PBS con FCS al 2 %. Tras la incubación durante 45 minutos a 4 °C y dos etapas de lavado, se detectó la unión del anticuerpo Penta-His con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Canto II, se usó el programa informático FACS Diva para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002). Los valores medios de la intensidad de fluorescencia adquiridos se representaron gráficamente como una función de la concentración de molécula de anticuerpo biespecífico y se analizaron mediante el programa informático biomatemático Prism en un análisis de unión de un lado (hipérbola). El programa informático calculó el valor de KD correspondiente que describía la unión de un ligando (la molécula de anticuerpo biespecífico) a un receptor (la subfracción de PBMC positiva para CD3)

que sigue la ley de acción de masas. La fórmula subyacente es la siguiente: Y = Bmáx x X / (Kd+X) siendo Bmáx la unión máxima. KD es la concentración de ligando necesaria para alcanzar la unión semimáxima. La tinción FACS se llevó a cabo en duplicados, los valores de R2 fueron mejores de 0,95.

La unión semimáxima determinada para la molécula de anticuerpo biespecífico EGFR-21-63 LH x H2C HLP se alcanzó a una concentración de 8472 ng/ml, que corresponde a 154 nM (1,54 x 10-7 M) a un masa molecular dada de 55000 Dalton (figura 10).

Por tanto, la afinidad de EGFR-21-63 LH x H2C HLP a los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 épsilon humana separados de su contexto de CD3 nativo resultó ser igual a las afinidad de EGFR-21-63 LH x H2C HLP por CD3 nativa sobre linfocitos T intactos.

8. Generación de células CHO transfectadas con EGFR humano

Se usó la línea celular positiva para EGFR humano, A431 (línea celular de carcinoma epidermoide, CRL-1555, American Type Culture Collection, Rockville, MD) para obtener el RNA total que se aisló de acuerdo con las instrucciones del manual del kit (Qiagen, RNeasy Mini Kit, Hilden, Alemania). El ARN obtenido se usó para síntesis de ADNc mediante transcripción inversa cebada aleatoriamente. Para la clonación de la secuencia de longitud completa del antígeno de EGFR humano se usaron los oligonucleótidos siguientes:

5' EGFR AG Xbal 5'-GGTCTAGAGCATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGG-3'

3' EGFR AG SaiI 5'-TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT-3'

La secuencia codificante se amplificó por PCR (desnaturalización a 94 °C durante 5 min, alineación a 58 °C durante 1 min, elongación a 72 °C durante 2 min durante el primero ciclo; desnaturalización a 94 °C durante 1 min, alineación a 58 °C durante 1 min, elongación a 72 °C durante 2 min durante 30 ciclos; extensión final a 72 °C durante 5 min). El producto de PCR se digirió posteriormente con Xbal y SaiI, se ligó en el vector de expresión digerido de forma apropiada pEF-DHFR (Raum et al., Cancer Immunol. Immunother. 2001; 50: 141-150) y se transformaron E. coli. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon con secuencia nucleotídica comprobada (SEQ ID 370, secuencia de aminoácidos SEQ ID 369) en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se indujo mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.

9. Generación de células CHO que expresan el dominio extracelular de EGFR de cynomolgus

Se obtuvo la secuencia de ADNc del dominio extracelular del EGFR de cynomolgus mediante un conjunto de dos PCR sobre ADNc de colon de mono cynomolgus (n.º de Cat.: C1534090-Cy-BC; obtenido de BioCat GmbH, Heidelberg, Alemania) usando las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94 °C durante 3 minutos seguido por 35 ciclos con 94 °C durante 1 minuto, 53 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 2 minutos, seguidos de un ciclo final de 72 °C durante 3 minutos. Se utilizaron los siguientes cebadores:

1.

cebador directo: 5'-CGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGC -3'

2.

cebador directo: 5'-ACATCCGGAGGTGACAGATCACGGCTCGTGC -3'

cebador inverso: 5'-CCGTCTTCCTCCATCTCATAGC -3'

cebador inverso: 5'-CAGGATATCCGAACGATGTGGCGCCTTCGC -3'

Esos fragmentos de PCR generaron dos fragmentos solapantes (A: 1-869, B: 848-1923), que se aislaron y se secuenciaron de acuerdo con protocolos estándar usando los cebadores de PCR y, de este modo, proporcionaron una porción de 1923 pb de la secuencia de ADNc de EGFR de cynomolgus desde el tercer nucleótido del codón +1 de la proteína madura hasta el 21er codón del dominio transmembranario. Para generar una construcción para la expresión de EGFR de cynomolgus se obtuvo un fragmento de ADNc mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO. 372 y 371). En esta construcción se fusionó la secuencia que codifica el EGFR de cynomolgus desde el aminoácido +2 hasta el +641 de la proteína EGFR madura en la secuencia codificante de EGFR humano, reemplazando la secuencia codificante de los aminoácidos +2 a +641. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción y sitios de restricción al principio y al final del ADNc que codifica esencialmente el dominio extracelular de EGFR de cynomolgus fusionado a los dominios transmembranario e intracelular del EGFR humano. Además, se introdujo una mutación conservadora en el aminoácido 627 (4º aminoácido del dominio transmembranario), mutando la valina a leucina para generar un sitio de restricción (SphI) para propósitos de clonación. Los sitios de restricción introducidos, XbaI en el extremo 5' y SaiI en el extremo 3', se utilizaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clonó

después a través de XbaI y SaiI en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). Se usó un clon de secuencia comprobada de este plásmido para transfectar células CHO/dhfr-como se describe anteriormente.

10. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de EGFR y 5 CD3

10.1. Clonación de moléculas de unión específicas de especies cruzadas

En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión de especie cruzada por CD3épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio con una especificidad de unión de especie cruzada por EGFR humano y de primate distinto de

10 chimpancé, como se expone en la siguiente tabla 1:

Tabla 1: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-EGFR

SEQ ID (nucl/prot)

Formatos de construcciones proteicas (N • C)

294 / 293

EGFR-21-63LH x H2CHL

296 / 295

EGFR-21-63 LH x H2C HLP

302 / 301

EGFR-21-63LH x A2JHLP

298 / 297

EGFR-21-63 LH x H1E HLP

306 / 305

EGFR-21-63 LH x E2M HLP

308 / 307

EGFR-21-63 LH x F7O HLP

390 / 389

EGFR1 HL x I2C HL

392 / 391

EGFR1 LH x I2C HL

394 / 393

EGFR1 HL x F12QHL

396 / 395

EGFR1 LH x F12QHL

398 / 397

EGFR1 HL x H2CHL

400 / 399

EGFR1 LH x H2C HL

448 / 447

EGFR1 HL x H2CHL

450 / 449

EGFR1 HL x F12QLH

452 / 451

EGFR1 HL x l2CHL

410 / 409

EGFR2 HL x I2C HL

412 / 411

EGFR2 LH x I2C HL

414 / 413

EGFR2HL x F12QHL

416 / 415

EGFR2LH x F12QHL

418 / 417

EGFR2 HL x H2C HL

420 / 419

EGFR2 LH x H2C HL

Las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable

15 de cadena pesada (H) específicos de especies cruzadas para EGFR humano y de cynomolgus se obtuvieron mediante síntesis génica. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de

20 detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados N-y Cterminales. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfectó un clon de secuencia

25 nucleotídica comprobada en células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) para la expresión eucariota de la construcción.

Las construcciones se transfectaron de forma estable o transitoria en células CHO deficientes en DHFR (N.º de la ATCC: CRL 9096) por electroporación o, de forma alternativa, en células HEK 293 (células de riñón embrionario

humano, número de la ATCC: CRL-1573) de manera transitoria de acuerdo con protocolos estándar.

10.2. Expresión y purificación de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico

Las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO). La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de las construcciones se indujo mediante el aumento de las concentraciones finales de MTX hasta 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F -68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y se almacenó el sobrenadante que contenía la proteína expresada a -20 °C. De forma alternativa, las construcciones se expresaron de forma transitoria en células HEK 293. La transfección se realizó con reactivo 293fectin (Invitrogen, N.º 12347-019) de acuerdo con el protocolo de fabricante.

Para la cromatografía se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCI2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:

Etapa 1: tampón al 20 % en 6 volúmenes de columna

Etapa 2: tampón al 100 % en 6 volúmenes de columna

Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos eran de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).

La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y análisis de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.

La proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE bajo condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con estándar proteico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE. El anticuerpo monocatenario biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.

El análisis de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se usaron anticuerpos dirigidos contra la marca His (Penta His, Qiagen) e Ig de cabra anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y BCIP/NBT (Sigma) como sustrato. Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo monocatenario biespecífico purificado.

11. Determinación de la constante de unión KD de anticuerpos monocatenarios biespecíficos totalmente específicos de especies cruzadas a la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc por medidas de resonancia de plasmón superficial

Para determinar las afinidades de unión de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de EGFR de primate y CD3 de primate a los aminoácidos 1-27 del extremo N-terminal de la cadena CD3 épsilon humana madura se realizó una medida de resonancia de plasmón superficial con una proteína de fusión recombinante que consistía en los aminoácidos 1-27 N-terminales de la cadena CD3 humana fusionados a la porción Fc de IgG1 humana (1-27 CD3-Fc). Con este fin se instaló un chip CM5 de carboximetildextrano de Biacore (Biacore, Uppsala, Suecia) en un sistema Biacore 2000® (Biacore, Uppsala, Suecia). Se activó una célula de flujo mediante una solución de clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida de acuerdo con procedimientos estándar. Posteriormente, se añadió una solución de la proteína de fusión 1-27 CD3-Fc, dando como resultado el enlace covalente estable de la proteína a la capa de dextrano del chip de Biacore. Se retiró la proteína no unida mediante un lavado exhaustivo seguido del bloqueo de los grupos carboxilo activados con NHS que quedaban sin reaccionar mediante la adición de una solución de etanolamina. Se confirmó el éxito del acoplamiento de la proteína mediante la detección de una señal más elevada medida como unidades de respuesta en comparación con la señal antes del acoplamiento. Se preparó una célula de referencia como se describe, pero sin añadir la solución de proteína.

43 5

Los anticuerpos monocatenarios biespecíficos purificados enumerados a continuación se ajustaron a 5 μg/ml con tampón HBS-EP (Biacore, Uppsala, Suecia) y se transfirieron a una placa de 96 pocillos, cada uno a un volumen de 150 μl.

Se realizaron medidas de resonancia de plasmón superficial para todas las muestras y se regeneraron las células de flujo con tampón acetato entre las medidas para liberar la proteína unida (todo de acuerdo con protocolos estándar).

Se obtuvieron señales de unión de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico restando la señal de la célula de referencia de la señal de la célula de medida conjugada con la proteína 1-27 CD3-Fc.

Se midieron curvas de asociación y disociación como unidades de respuesta y se registraron. Las constantes de unión se calcularon usando el programa informático de ajuste de curvas de Biacore® basado en el modelo de Langmuir. Las afinidades calculadas para las moléculas monocatenarias biespecíficas totalmente específicas de especies cruzadas probadas por los aminoácidos 1-27 N-terminales de la CD3 épsilon humana se dan como valores de KD por debajo y en el intervalo de 2,54x10-6 M a 2,49x10-7 M. "LH" se refiere a una disposición de dominios variables en el orden VL-VH. "HL" se refiere a una disposición de dominios variables en el orden VH-VL. G4H, F7O, A2J, E1L, E2M, H1E y F6A se refieren a diferentes moléculas de unión a CD3 específicas de especies cruzadas.

Molécula de anticuerpo biespecífico

KD(M)

EGFR LH x F7O HLP

1,01x10-6

EGFR LH x A2J HLP

2,49x10-7

EGFR LH x E2M HLP

2,46x10-6

EGFR LH x H1E HLP

2,54x10-6

12. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de EGFR y CD3

Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a EGFR y CD3 humanos y de cynomolgus, respectivamente, se llevó a cabo un análisis FACS. Para este propósito se usaron células CHO transfectadas con EGFR humano como se describe en el ejemplo 8 y la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión frente a antígenos de cynomolgus se probó usando el transfectante de EGFR de cynomolgus generado descrito en el ejemplo 9 y una línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se incubaron 200.000 células de las respectivas poblaciones celulares durante 30 min en hielo con 50 μl de la proteína purificada de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas (2 μg/ml). De forma alternativa, se usó el sobrenadante del cultivo celular de proteínas producidas de forma transitoria. Se lavaron las células dos veces en PBS y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo Penta His murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 μl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. Como control negativo se usó medio de cultivo recién preparado.

Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur, se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).

La capacidad de unión de varias moléculas monocatenarias biespecíficas que son específicas para EGFR y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de primate distinto de chimpancé era claramente detectable como se muestra en la figura 11. En el análisis FACS, todas las construcciones mostraron unión a CD3 y EGFR en comparación con el medio de cultivo y el primer y el segundo anticuerpo de detección como controles negativos. Se demostró la especificidad de especies cruzadas del anticuerpo biespecífico frente a antígenos de CD3 y EGFR humanos y de cynomolgus.

13. Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de EGFR y CD3

La bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados se analizó mediante ensayos de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para EGFR descritas en los ejemplos 8 y 9. Como células efectoras, se usaron linfocitos T positivos para CD8 humanos o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx, respectivamente.

La generación de los linfocitos T CD8+ estimulados se realizó como sigue:

Se recubrió previamente una placa de Petri (145 mm de diámetro, Greiner) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible en una concentración final de 1 μg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retiró mediante una etapa de lavado con PBS. Se aislaron las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 -50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añadieron 3 -5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 120 ml de RPMI 1640 / FCS al 10 % / IL-2 20 U/ml (Proleukin, Chiron) y se estimularon durante 2 días. En el tercer día se recogieron las células, se lavaron una vez con RPMI 1640, se añadió IL-2 a un concentración final de 20 U/ml y se cultivaron de nuevo durante un día. Se aislaron linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+ por disminución de linfocitos T CD4+ y linfocitos NK CD56+.

Las células objetivo se lavaron dos veces con PBS y se marcaron con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 μl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, se lavaron las células objetivo marcadas 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usaron en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realizó en una placa de 96 pocillos en un volumen total de 250 μl de RPMI suplementado (como anteriormente) con una proporción E:O de

10:1. Se aplicaron 1 μg/ml de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas y 20 diluciones de tres veces de ellas. De forma alternativa, el sobrenadante de cultivo celular de proteínas producidas de forma transitoria se diluyó en serie en etapas de 1:2. El tiempo de ensayo es de 18 horas y la citotoxicidad se midió como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizaron en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realizó con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realizó con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Normalmente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tenían valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usaron para la comparación de la bioactividad.

Como se muestra en las figuras 12 y 13, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas revelaron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para EGFR humano provocada por linfocitos CD8+ humanos y células objetivo positivas para EGFR de cynomolgus provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx. Como control negativo se usó un anticuerpo monocatenario biespecífico con diferente especificidad de objetivo.

14. Clonación y expresión de los dominios C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP humana

Se obtuvo la secuencia codificante del dominio C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP humana (aminoácidos 1538 -2322) mediante síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de la construcción recombinante para la expresión del dominio C-terminal transmembranario y extracelular truncado de MCSP humana (denominado D3 humana) se enumeran en las SEQ ID NO. 374 y 373). El fragmento de síntesis génica se diseñó para que contuviera en primer lugar un sitio de Kozak para permitir la expresión eucariota de la construcción seguido por la secuencia codificante de un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos seguida en fase por una marca FLAG, seguida en fase por una secuencia que contiene varios sitios de restricción para propósitos de clonación y que codifica un enlazador artificial de 9 aminoácidos (SRTRSGSQL), seguida en fase por la secuencia codificante del dominio C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP humana y un codón de detención. Se introdujeron sitios de restricción al principio y al final del fragmento de ADN. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SaiI en el extremo 3', se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento se digirió con EcoRI y SaiI y se clonó en pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 70217025) siguiendo protocolos estándar. Se usó un plásmido de secuencia comprobada para transfectar células CHO/dhfr-(N.º de la ATCC: CRL 9096). Las células se cultivaron en RPMI 1640 con glutamina estabilizada, suplementado con FCS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % (todos obtenidos de Biochrom AG Berlin, Alemania) y nucleósidos de una solución madre de reactivos de calidad para cultivo celular (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a una concentración final de 10 μg/ml de adenosina, 10 μg/ml de desoxiadenosina y 10 μg/ml de timidina, en un incubador a 37 °C, al 95 % de humedad y CO2 al 7 %. La transfección se realizó usando el reactivo de transfección PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y 5 μg de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de cultivarlas durante 24 horas, se lavaron las células una vez con PBS y se cultivaron de nuevo en RPMI 1640 con glutamina estabilizada y penicilina/estreptomicina al 1 %. Por tanto, el medio de cultivo celular no contenía nucleósidos y, de este modo, se aplicó la selección en las células transfectadas. Aproximadamente de 14 a 20 días después de la transfección, se observó el crecimiento de células resistentes. Después de otros 7 a 14 días, se probaron los transfectantes para determinar la expresión de la construcción por análisis FACS. Se incubaron 2,5x105 células con 50 μl de un anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) diluido a 5 μg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se detectó la unión del anticuerpo con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fc-gamma 1:100 en PBS con FCS al 2 % (ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania).

15. Clonación y expresión de los dominios C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP de macaco

45 5

Se obtuvo la secuencia de ADNc del dominio C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP de macaco (denominado D3 de macaco) mediante un conjunto de tres PCR sobre ADNc de piel de macaco (N.º de Cat. C1534218-Cy-BC; BioCat GmbH, Heidelberg, Alemania) usando las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94 °C, 3 min., 40 ciclos con 94 °C durante 0,5 min., 52 °C durante 0,5 min. y 72 °C durante 1,75 min., ciclo final de 72 °C durante 3 min. Se utilizaron los siguientes cebadores:

cebador directo: 5'-GATCTGGTCTACACCATCGAGC-3'

cebador inverso: 5'-GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG-3'

cebador directo: 5'-TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG-3'

cebador inverso: 5'-CGATCAGCATCTGGGCCCAGG-3'

cebador directo: 5'-GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC-3'

cebador inverso: 5'-GCCTTCACACCCAGTACTGGCC-3'

Esos fragmentos de PCR generaron tres fragmentos solapantes (A: 1-1329, B: 1229-2428, C: 1782-2547) que se aislaron y se secuenciaron de acuerdo con protocolos estándar usando los cebadores de PCR y, de este modo, proporcionaron una porción de 2547 pb de la secuencia del ADNc de MCSP de macaco (la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de esta porción de MCSP de macaco se enumeran en las SEQ ID NO. 376 y 375) desde 74 pb corriente arriba de la secuencia codificante del dominio C-terminal hasta 121 pb corriente abajo del codón de detención. Otra PCR usando las siguientes condiciones de reacción: 1 ciclo a 94 °C durante 3 min, 10 ciclos con 94 °C durante 1 min, 52 °C durante 1 min y 72 °C durante 2,5 min, ciclo final de 72 °C durante 3 min se usó para fusionar los productos de PCR de las reacciones Ay B mencionadas anteriormente. Se usan los siguientes cebadores:

cebador directo: 5'-tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg-3'

cebador inverso: 5'-agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg-3'

Los cebadores para esta PCR se diseñaron para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento de ADNc que codifica el dominio C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP de macaco. Los sitios de restricción introducidos, MfeI en el extremo 5' y SaiI en el extremo 3', se usaron en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de PCR se clonó después por medio de MfeI y SaiI en un plásmido Bluescript que contenían el fragmento EcoRI/MfeI del plásmido pEF-DHFR mencionado anteriormente (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) reemplazando el dominio C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP humana. El fragmento de síntesis génica contenía las secuencias codificantes del péptido líder de inmunoglobulina y la marca Flag, así como el enlazador artificial (SRTRSGSQL) en fase con el extremo 5' del fragmento de ADNc que codifica el dominio C-terminal, transmembranario y extracelular truncado de MCSP de macaco. Este vector se usó para transfectar células CHO/dhfr-(N.º de la ATCC: CRL 9096). Las células se cultivaron en RPMI 1640 con glutamina estabilizada, suplementado con FCS al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % (todos de Biochrom AG Berlin, Alemania) y nucleósidos de una solución madre de reactivos de calidad para cultivo celular (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a una concentración final de 10 μg/ml de adenosina, 10 μg/ml de desoxiadenosina y 10 μg/ml de timidina, en un incubador a 37 °C, al 95 % de humedad y CO2 al 7 %. La transfección se realizó con el reactivo de transfección PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y 5 μg de ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de cultivarlas durante 24 horas, se lavaron las células una vez con PBS y se cultivaron de nuevo en RPMI 1640 con glutamina estabilizada y penicilina/estreptomicina al 1 %. Por tanto, el medio de cultivo celular no contenía nucleósidos y, de este modo, se aplicó la selección en las células transfectadas. Aproximadamente 14 días después de la transfección, se observó el crecimiento de células resistentes. Después de otros 7 a 14 días, se probaron los transfectantes para determinar la expresión de la construcción recombinante por análisis FACS. Se incubaron 2,5x105 células con 50 μl de un anticuerpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) diluido a 5 μg/ml en PBS con FCS al 2 %. Se detectó el anticuerpo unido con un fragmento F(ab')2 purificado por afinidad conjugado con R-ficoeritrina de IgG de cabra anti-ratón específica de fragmento Fcgamma, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Las muestras se midieron en un FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Alemania).

16. Generación y caracterización de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de MCSP y CD3

Se diseñaron moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio de unión específico de especies cruzadas para CD3 épsilon humana y de primate distinto de chimpancé, así como un dominio de unión específico de especies cruzadas para MCSP humana y de primate distinto de chimpancé, como se expone en la siguiente tabla 2:

Tabla 2: Formatos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de MCSP y CD3

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30 (continuación)

SEQ ID (nucl/prot)

Formatos de construcciones proteicas (N • C)

310 / 309

MCSP-G4 HL x H2C HL

312 / 311

MCSP-G4HL x F12QHL

314 / 313

MCSP-G4 HL x I2C HL

316 / 315

MCSP-G4 HLP x F6A HLP

318 / 317

MCSP-G4 HLP x H2C HLP

322 / 321

MCSP-G4 HLP x G4H HLP

326 / 325

MCSP-G4HLP x E1LHLP

328 / 327

MCSP-G4 HLP x E2M HLP

332 / 331

MCSP-G4 HLP x F12Q HL

334 / 333

MCSP-G4 HLP x I2C HL

336 / 335

MCSP-D2 HL x H2C HL

338 / 337

MCSP-D2HL x F12QHL

340 / 339

MCSP-D2 HL x I2C HL

342 / 341

MCSP-D2 HLP x H2C HLP

344 / 343

MCSP-F9 HL x H2C HL

346 / 345

MCSP-F9 HLP x H2C HLP

348 / 347

MCSP-F9 HLP x G4H HLP

Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena pesada (VH) y variable de cadena ligera (VH) específicos de especies cruzadas para MCSP D3 humana y de macaco y los dominios VH y VL específicos de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados N-y C-terminales. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Las construcciones se transfectaron de forma estable o transitoria en células CHO deficientes en DHFR (N.º de la ATCC: CRL 9096) por electroporación o, de forma alternativa, en células HEK 293 (células de riñón embrionario humano, número de la ATCC: CRL-1573) de manera transitoria de acuerdo con protocolos estándar.

La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de las construcciones se indujo mediante la adición de concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) hasta concentraciones finales de MTX 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hicieron crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F -68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Se retiraron las células por centrifugación y el sobrenadante que contenía la proteína expresada se almacenó a -20 °C.

Para la cromatografía se usaron el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realizó una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se cargó con ZnCI2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibró la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplicó el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lavó con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluyó usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:

Etapa 1: tampón al 20 % en 6 volúmenes de columna

Etapa 2: tampón al 100 % en 6 volúmenes de columna

Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agruparon para su purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).

La cromatografía de filtración en gel se realizó en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal de 1 ml/min) se sometieron a SDS-PAGE estándar y análisis de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibró la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinaron usando la DO a 280 nm.

La proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico purificada se analizó en SDS PAGE bajo condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determinó el peso molecular con estándar proteico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada fue > 95 %, determinada por SDS-PAGE.

El anticuerpo monocatenario biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Todas las construcciones se purificaron de acuerdo con este procedimiento.

El análisis de bandas western se realizó usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para la detección de los anticuerpos de proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico se usó un anticuerpo anti-marca His (Penta His, Qiagen). Como anticuerpo secundario se usó un anticuerpo Ig de cabra anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y como sustrato, BCIP/NBT (Sigma). Se detectó una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo monocatenario biespecífico purificado.

De forma alternativa, las construcciones se expresaron de forma transitoria en células CHO deficientes en DHFR. Brevemente, se cultivaron 4 x 105 células por construcción en 3 ml de medio completo RPMI 1640 con glutamina estabilizada suplementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 % y nucleósidos de una solución madre de reactivos de calidad para cultivo celular (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemania) a una concentración final de 10 μg/ml de adenosina, 10 μg/ml de desoxiadenosina y 10 μg/ml de timidina, en un incubador a 37 °C, al 95 % de humedad y CO2 al 7 % un día antes de la transfección. La transfección se realizó con reactivo de transfección Fugene 6 (Roche, N.º 11815091001) de acuerdo con el protocolo de fabricante. Se mezclan 94 μl de medio OptiMEM (Invitrogen) y 6 μl de Fugene 6 y se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron 1,5 μg de ADN por construcción, se mezclaron y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, las células CHO deficientes en DHFR se lavaron 1x con PBS y se resuspendieron en 1,5 ml de medio completo RPMI 1640. Se diluyó la mezcla de transfección con 600 μl de medio completo RPMI 1640, se añadió a las células y se incubaron durante la noche a 37 °C, al 95 % de humedad y CO2 al 7 %. El día después de la transfección, se aumentó el volumen de incubación de cada enfoque hasta 5 ml de medio completo RPMI 1640. Después de 3 días de incubación, se recogió el sobrenadante.

17. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de MCSP y CD3

Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a MCSP D3 y CD3 humana y de cynomolgus, respectivamente, se llevó a cabo un análisis FACS. Para este propósito se usaron células CHO transfectadas con MCSP D3 humana (como se describe en el ejemplo 14) y la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a antígenos de macaco se probó usando el transfectante de MCSP D3 de macaco generado (descrito en el ejemplo 15) y una línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se incubaron 200.000 células de las respectivas poblaciones celulares durante 30 min en hielo con 50 μl de la proteína purificada de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas (2 μg/ml) o sobrenadante de cultivo celular de células transfectadas que expresan las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas. Se lavaron las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detectó la unión de la construcción con un anticuerpo anti-His murino (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 μl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectaron anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. El sobrenadante células CHO no transfectadas se usó como control negativo para la unión a las líneas de linfocitos T. Una construcción monocatenaria con especificidad de objetivo no pertinente se usó como control negativo para la unión a las células CHO transfectadas con MCSP-D3.

Se realizó una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usó el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizaron como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).

48 5

La unión biespecífica de las moléculas monocatenarias enumeradas anteriormente, que son específicas de especies cruzadas para MCSP D3 y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco era claramente detectable, como se muestra en las figuras 14, 15, 16 y 58. En el análisis FACS, todas las construcciones mostraron unión a CD3 y MCSP D3 en comparación con los correspondientes controles negativos. Se demostró la especificidad de especies cruzadas de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y MCSP D3 humana y de macaco.

18. Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de MCSP y CD3

Como se muestra en las figuras 17 a 21, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas revelaron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para MCSP humana provocada por linfocitos CD8+ humanos y células objetivo positivas para MCSP de cynomolgus provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx. Como control negativo se usa un anticuerpo monocatenario biespecífico con diferente especificidad de objetivo.

19. Estabilidad en plasma de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de MCSP y CD3

Se analizó la estabilidad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados en plasma humano mediante la incubación de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos en plasma humano al 50 % a 37 °C y a 4 °C durante 24 horas y la posterior realización de pruebas de bioactividad. Se estudió la bioactividad en un ensayo de citotoxicidad in vitro de liberación de cromo 51 (51Cr) usando una línea celular CHO positiva para MCSP (que expresa MCSP clonado de acuerdo con el ejemplo 14 o 15) como objetivo y linfocitos T humanos positivos para CD8 como células efectoras.

Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis descrito anteriormente se usan para la comparación de la bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos incubados con plasma humano al 50 % durante 24 horas a 37 °C y a 4 °C respectivamente con anticuerpos monocatenarios biespecíficos sin adición de plasma o mezclados con la misma cantidad de plasma inmediatamente antes del ensayo.

Como se muestra en la figura 22 y en la tabla 3, la bioactividad de los anticuerpos biespecíficos G4 H-L x I2C H-L, G4 H-L x H2C H-L y G4 H-L x F12Q H-L no disminuyó significativamente en comparación con los controles sin la adición de plasma o con la adición de plasma inmediatamente antes de realizar las pruebas de bioactividad.

Tabla 3: bioactividad de los anticuerpos biespecíficos sin o con la adición de plasma

Construcción

Sin plasma Con plasma Plasma a 37 °C Plasma a 4 °C

G4 H-L I2C H-L

X 300 796 902 867

G4 H-L H2C H-L

X 496 575 2363 1449

G4 H-L F12Q H-L

X 493 358 1521 1040

20. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de EGFR y CD3 humanos

Se diseñan moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico con un dominio de unión específico de especies cruzadas para CD3 humana y de cynomolgus, así como un dominio de unión específico de especies cruzadas para EGFR humano, como se expone en la siguiente tabla 4:

Tabla 4: Formatos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de EGFR y CD3

SEQ ID (nucl/prot)

Formatos de construcciones proteicas (N • C)

390 / 389

EGFR H-L x I2C H L

392 / 391

EGFR L-H x I2C H L

394 / 393

EGFR H-L x F12QHL

396 / 395

EGFR L-H x F12QHL

398 / 397

EGFR H-L x H2C H L

49 5

400 / 399

EGFR L-H x H2C H L

448 / 447

EGFR HL x H2C HL

450 / 449

EGFRHL x F12Q LH

452 / 451

EGFR HL x I2C HL

Las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicos de especies cruzadas para EGFR humano y de cynomolgus se obtuvieron mediante síntesis génica. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención.

El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados N-y C-terminales. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Las construcciones se transfectaron de forma estable en células CHO deficientes en DHFR (N.º de la ATCC: CRL 9096) y también se produjeron y se purificaron como se describe en el ejemplo 10.

21. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de EGFR y CD3 humanos

Se diseñan moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico con un dominio de unión específico de especies cruzadas para CD3 humana y de cynomolgus, así como un dominio de unión específico de especies cruzadas para EGFR humano, como se expone en la siguiente tabla 5:

Tabla 5: Formatos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de EGFR y CD3

SEQ ID (nucl/prot)

Formatos de construcciones proteicas (N • C)

410 / 4099

EGFR H-L x I2C H L

412 / 411

EGFR L-H x I2C H L

414 / 413

EGFR H-L x F12QHL

416 / 415

EGFR L-H x F12QH L

418 / 417

EGFR H-L x H2C H L

420 / 419

EGFR L-H x H2C H L

Las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicos de especies cruzadas para EGFR humano y de cynomolgus se obtuvieron mediante síntesis génica. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención.

El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados N-y C-terminales. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Las construcciones se transfectaron de forma estable en células CHO deficientes en DHFR (N.º de la ATCC: CRL 9096) y también se produjeron y se purificaron como se describe en el ejemplo 10.

22. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de Her2/neu y CD3 humanos

Se diseñan moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico con un dominio de unión específico de especies cruzadas para CD3 humana y de cynomolgus, así como un dominio de unión específico de especies cruzadas para

50 5

Her2/neu humano, como se expone en la siguiente tabla 6:

Tabla 6: Formatos de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de Her2/neu y CD3

SEQ ID (nucl/prot)

Formatos de construcciones proteicas (N • C)

430 / 439

HER2/neu VH-VL x I2C VH VL

432 / 431

HER2/neu VL-VH x I2C VH VL

434 / 433

HER2/neu VH-VL x F12Q VH VL

436 / 435

HER2/neu VL-VH x F12Q VH VL

438 / 437

HER2/neu VH-VL x H2C VH VL

440 / 439

HER2/neu VL-VH x H2C VH VL

Las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicos de especies cruzadas para HER2/neu humano y de cynomolgus se obtuvieron mediante síntesis génica. Los fragmentos de síntesis génica se diseñaron para que contuvieran en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención.

El fragmento de síntesis génica también se diseñó para introducir sitios de restricción adecuados N-y C-terminales. El fragmento de síntesis génica se clonó a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Las construcciones se transfectaron de forma estable en células CHO deficientes en DHFR (N.º de la ATCC: CRL 9096) y también se produjeron y se purificaron como se describe en el ejemplo 10.

23.1. Generación de células CHO que expresan HER2 humana

La secuencia codificante de HER2 humana publicada en GenBank (número de acceso X03363) se obtiene por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar. El fragmento de síntesis génica se diseña para que contenga la secuencia codificante de la proteína HER2 humana, incluido su péptido líder (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID NO. 459 y 460). El fragmento de síntesis génica también se diseña para introducir sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, XbaI en el extremo 5' y SaiI en el extremo 3', se utilizan en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clona a través de Xbal y SaiI en un plásmido denominado pEFDHFR (pEFDHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realiza como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se induce mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.

23.2. Generación de células CHO que expresan el dominio extracelular de Her 2 de macaco

La secuencia de codificación de Her2 humana descrita anteriormente se modifica para que codifique los aminoácidos 123 a 1038 de la proteína Her2 de macaco publicada en GenBank (número de acceso XP_001090430). La secuencia codificante de esta proteína quimérica se obtiene por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la construcción se enumeran en las SEQ ID N.º 461 y 462). El fragmento de síntesis génica también se diseña para que contenga un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción y sitios de restricción al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos, XbaI en el extremo 5' y SaiI en el extremo 3', se utilizan en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clona después a través de Xbal y SaiI en un plásmido denominado pEFDHFR (pEFDHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Se usa un clon de secuencia comprobada de este plásmido para transfectar células CHO/dhfr-como se describe anteriormente.

23.3. Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de HER2 y

51 5

CD3

3.1. Clonación de moléculas de unión específicas de especies cruzadas

En general, se diseñan moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión de especie cruzada específico para CD3épsilon humana y de macaco, así como un dominio con una especificidad de unión de especie cruzada específico para HER2 humana y de macaco, como se expone en la siguiente tabla 7:

Tabla 7: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-HER2

SEQ ID (nucl/prot)

Formatos de construcciones proteicas (N • C)

432 / 431

Her2 LH x I2C HL

436 / 435

Her2 LH x F12Q HL

440 / 439

Her2 LH x H2C HL

430 / 429

Her2 HL x I2C HL

434 / 433

Her2 HL x F12Q HL

438 / 437

Her2 HL x H2C HL

480/479

I2C HL x Her2 LH

478/477

F12QHL x Her2LH

476/475

H2C HL x Her2 LH

Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicas de especies cruzadas para HER2 humana y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas para CD3 específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñan para que contengan en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseña para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizan en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clona a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEFDHFR (pEFDHFR se describe en Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) siguiendo protocolos estándar. Los procedimientos mencionados anteriormente se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York (2001)). Se transfecta un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realiza como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se induce mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.

3.2. Expresión y purificación de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico

Las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico se expresan en células de ovario de hámster chino (CHO). La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realiza como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de las construcciones se induce mediante la adición de concentraciones crecientes de MTX hasta concentraciones finales de MTX 20 nM. Después de dos pasos de cultivo estacionario, las células se hacen crecer en frascos rotatorios con medio líquido de soja HyQ PF CHO sin nucleósidos (con L-glutamina 4,0 mM con Pluronic F -68 al 0,1 %; HyClone) durante 7 días antes de recogerlas. Las células se retiran por centrifugación y el sobrenadante que contiene la proteína expresada se almacena a -80 °C. La transfección se realiza con reactivo 293fectin (Invitrogen, N.º 12347-019) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Para la cromatografía se usan el sistema de exploración Äkta® (GE Health Systems) y el programa informático Unicorn®. Se realiza una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ("IMAC") usando un quelato Fractogel EMD® (Merck) que se carga con ZnCI2 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se equilibra la columna con tampón A (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M) y se aplica el sobrenadante de cultivo celular (500 ml) a la columna (10 ml) a una caudal de 3 ml/min. La columna se lava con tampón A para retirar la muestra no unida. La proteína unida se eluye usando un gradiente en dos etapas de tampón B (tampón de fosfato

de sodio 20 mM a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) de acuerdo con lo siguiente:

Etapa 1: tampón al 20 % en 6 volúmenes de columna

Etapa 2: tampón al 100 % en 6 volúmenes de columna

Las fracciones de proteína eluida a partir de la etapa 2 se agrupan para su purificación adicional. Todos los productos químicos son de calidad de investigación y comprados de Sigma (Deisenhofen) o Merck (Darmstadt).

La cromatografía de filtración en gel se realiza en una columna de calidad prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada con tampón de equilibrado (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol al 5 %, a pH 7,2). Las muestras de proteína eluidas (caudal 1 ml/min) se someten a SDS-PAGE estándar y análisis de bandas western para su detección. Antes de la purificación, se calibra la columna para la determinación del peso molecular (kit de marcadores de peso molecular, Sigma MW GF-200). Las concentraciones de proteína se determinan usando la DO a 280 nm.

La proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico purificada se analiza en SDS PAGE bajo condiciones reductoras realizada con geles bis-tris preformados al 4-12 % (Invitrogen). La preparación y la aplicación de las muestras se realizan de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Se determina el peso molecular con estándar proteico MultiMark (Invitrogen). El gel se tiñe con Coomassie coloidal (protocolo de Invitrogen). La pureza de la proteína aislada es > 95 %, determinada por SDS-PAGE.

El anticuerpo monocatenario biespecífico tiene un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en condiciones nativas, determinado por filtración en gel en PBS. Todas las construcciones se purifican de acuerdo con este procedimiento.

El análisis de bandas western se realiza usando una membrana Optitran® BA-S83 y el módulo de bandas de Invitrogen de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para la detección de los anticuerpos de proteína de anticuerpo monocatenario biespecífico se usa un anticuerpo anti-marca His (Penta His, Qiagen). Como anticuerpo secundario se usa un anticuerpo Ig de cabra anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (AP) (Sigma) y como sustrato, BCIP/NBT (Sigma). Se detecta una única banda a 52 kD correspondiente al anticuerpo monocatenario biespecífico purificado.

23.4. Análisis de unión por citometría de flujo de los anticuerpos biespecíficos específicos de especies cruzadas de HER2 y CD3

Con el fin de probar la funcionalidad de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas con respecto a la capacidad de unión a HER2 y CD3 humana y de macaco, respectivamente, se lleva a cabo un análisis FACS. Para este propósito se usan células CHO transfectadas con HER2 humana como se describe en el ejemplo 23.1 y la línea celular humana de leucemia de linfocitos T positivos para CD3 HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) para probar la unión a antígenos humanos. La reactividad de unión a antígenos de macaco se prueba usando el transfectante de HER2 de macaco generado descrito en el ejemplo 23.2 y una línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (proporcionada amablemente por el Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; publicado en Knappe A, et al., y Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Se incuban

200.000 células de las respectivas líneas celulares 30 min en hielo con 50 μl de la proteína purificada de las construcciones de anticuerpo biespecífico específico de especies cruzadas (2 μg/ml). Se lavan las células dos veces en PBS con FCS al 2 % y se detecta la unión de la construcción con un anticuerpo anti-His murino (anticuerpo Penta His; Qiagen; diluido 1:20 en 50 μl de PBS con FCS al 2 %). Después del lavado, se detectan anticuerpos anti-His unidos con un anticuerpo específico frente a Fc gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina, diluido 1:100 en PBS con FCS al 2 %. Se usa PBS con FCS al 2 % como control negativo para la unión a las líneas de linfocitos T, así como a las células CHO transfectadas con HER2.

Se realiza una citometría de flujo en un aparato FACS-Calibur; se usa el programa informático CellQuest para adquirir y analizar los datos (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). La tinción FACS y la medida de la intensidad de fluorescencia se realizan como se describe en Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-lnterscience, 2002).

La unión biespecífica de las moléculas monocatenarias enumeradas anteriormente, que son específicas de especies cruzadas para HER2 y específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de primate distinto de chimpancé es claramente detectable, como se muestra en la figura 23. En el análisis FACS, todas las construcciones muestran unión a CD3 y HER2 en comparación con los correspondientes controles negativos. Se demuestra la especificidad de especies cruzadas de los anticuerpos biespecíficos frente a antígenos de CD3 y HER2 humanos y de macaco.

23.5. Bioactividad de anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de HER2 y CD3

Se analiza la bioactividad de los anticuerpos monocatenarios biespecíficos generados mediante ensayos de citotoxicidad de liberación de cromo 51 (51Cr) usando las líneas celulares positivas para HER2 descritas en los ejemplos 23.1 y 23.2. Como células efectoras se usan PBMC con disminución de CD4/CD65 humanas estimuladas

o la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx, como se especifica en las respectivas figuras.

La generación de las PBMC con disminución de CD4/CD56 se realiza como sigue:

Se recubre previamente una placa de Petri (85 mm de diámetro, Nunc) con un anticuerpo específico anti-CD3 comercialmente disponible (p. ej., OKT3, Othoclone) en una concentración final de 1 μg/ml durante 1 hora a 37 °C. La proteína no unida se retira mediante una etapa de lavado con PBS. Se aíslan las PBMC recién obtenidas a partir de sangre periférica (30 -50 ml de sangre humana) por centrifugación en gradiente de Ficoll de acuerdo con protocolos estándar. Se añaden 3 -5 x 107 PBMC a la placa de Petri recubierta previamente en 50 ml de RPMI 1640 con glutamina estabilizada / FCS al 10 % / IL-2 20 U/ml (Proleukin, Chiron) y se estimulan durante 2 días. En el tercer día se recogen las células y se lavan una vez con RPMI 1640. Se añade IL-2 hasta una concentración final de 20 U/ml y se cultivan las células de nuevo durante un día en el mismo medio de cultivo celular que anteriormente. Mediante la disminución de linfocitos T CD4+ y linfocitos NK CD56+ de acuerdo con protocolos estándar, se enriquecen los linfocitos T citotóxicos (LTC) CD8+.

Las células objetivo se lavan dos veces con PBS y se marcan con 11,1 MBq de 51Cr en un volumen final de 100 μl de RPMI con FCS al 50 % durante 45 minutos a 37 °C. Posteriormente, se lavan las células objetivo marcadas 3 veces con 5 ml de RPMI y después se usan en el ensayo de citotoxicidad. El ensayo se realiza en una placa de 96 pocillos en a volumen total de 250 μl de RPMI suplementado (como anteriormente) con proporciones E:O de 1:1 o 10:1, que se especifican en las respectivas figuras. Se aplican 1 μg/ml de las moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas y 15-21 diluciones de cinco veces de ellas. El tiempo de ensayo es de 18 horas y la citotoxicidad se mide como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación con la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras). Todas las medidas se realizan en cuadruplicados. La medida de la actividad del cromo en los sobrenadantes se realiza con un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania). El análisis de los datos experimentales se realiza con Prism 4 para Windows (versión 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, EE. UU.). Normalmente, las curvas sigmoidales de respuesta a dosis tienen valores de R2 > 0,90, determinados por el programa informático. Los valores de CE50 calculados por el programa de análisis se usan para la comparación de la bioactividad.

Como se muestra en la figura 24, las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas demuestran actividad citotóxica contra células objetivo positivas para HER2 humana provocada por PBMC con disminución de CD4/CD56 humanas estimuladas y contra células objetivo positivas para HER2 de macaco provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx.

Ejemplo 24: Clonación y expresión de la forma de IgE unida a membrana humana y de macaco

Se usó la línea celular de ratón J558L (obtenida de Interlab Project, Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Génova, Italia, ECACC 88032902), una línea celular de mieloma espontánea de variante de pérdida de cadena pesada que sintetiza y secreta una cadena ligera lambda, para complementarla con una variante de cadena pesada unida a membrana de la IgE humana y de macaco, respectivamente. Con el fin de generar construcciones de este tipo se obtuvieron moléculas sintéticas por síntesis génica de acuerdo con protocolos estándar (las secuencias de nucleótidos de las construcciones se enumeran en las SEQ ID NO. 507 y 508). En estas construcciones, se fusionó la secuencia de codificación de c épsilon humana y de macaco, respectivamente, a la región transmembranaria de IgE humana. La especificidad incorporada en la cadena VH se dirige contra el hapteno (4-hidroxi-3-nitro-fenil)acetil) (NP). El fragmento de síntesis génica también se diseñó para que contuviera un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción y un líder de inmunoglobulina y sitios de restricción al principio y al final del ADN. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y SaiI en el extremo 3', se utilizaron durante la etapa de clonación en el plásmido de expresión denominado pEFDHFR. Después de comprobar la secuencia (macaco: XM_001116734 región C de Ig épsilon de macaca mulatta, ARNm; ser humano: NC_000014 cromosoma 14 de Homo sapiens, secuencia completa, National Center for Biotechnology Information, http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) se usaron los plásmidos para transfectar células CHO/dhfr-como se describe anteriormente. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realiza como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se induce mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM.

54 5

Ejemplo 25: Generación de moléculas monocatenarias biespecíficas específicas de especies cruzadas de IgE y CD3

En general, se diseñaron moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico, comprendiendo cada uno un dominio con una especificidad de unión por el antígeno de CD3 humana y de cynomolgus, así como un dominio con una especificidad de unión por el antígeno de IgE humana y de macaco, como se expone en la siguiente tabla 8:

Tabla 8: Formatos de moléculas de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas anti-CD3 y anti-IgE

SEQ ID (nucl/prot)

Formatos de construcciones proteicas (N • C)

496 / 495

lgEHL x H2CHL

498 / 497

lgEHL x F12QHL

500 / 499

lgEHL x l2CHL

502 / 501

IgE LH x H2C HL

504 / 503

lgELH x F12QHL

506 / 505

IgE LH x I2C HL

Se obtuvieron por síntesis génica las construcciones mencionadas anteriormente que contenían los dominios variable de cadena ligera (L) y variable de cadena pesada (H) específicas de especies cruzadas para IgE humana y de macaco y las combinaciones de VH y VL específicas para CD3 específicas de especies cruzadas para CD3 humana y de macaco. Los fragmentos de síntesis génica se diseñan para que contengan en primer lugar un sitio de Kozak para la expresión eucariota de la construcción, seguido por un péptido líder de inmunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido en fase por la secuencia codificante de la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico correspondiente, seguida en fase por la secuencia codificante de una marca de 6 histidinas y un codón de detención. El fragmento de síntesis génica también se diseña para introducir sitios de restricción adecuados al principio y al final del fragmento. Los sitios de restricción introducidos se utilizan en los procedimientos de clonación siguientes. El fragmento de síntesis génica se clona a través de estos sitios de restricción en un plásmido denominado pEFDHFR siguiendo protocolos estándar. Se transfecta un clon con secuencia nucleotídica comprobada en células CHO deficientes en DHFR para la expresión eucariota de la construcción. La expresión eucariota de proteínas en células CHO deficientes en DHFR se realiza como se describe por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. La amplificación de genes de la construcción se induce mediante el aumento de las concentraciones metotrexato (MTX) hasta una concentración final de hasta MTX 20 nM. De forma alternativa, las construcciones se transfectan en células CHO deficientes en DHFR de forma transitoria de acuerdo con protocolos estándar.

Los experimentos de unión FACS se realizaron con la línea celular humana J558L transfectada con IgE para evaluar la capacidad de unión a la IgE humana. La especificidad de especie cruzada para células positivas para IgE de macaco se probó desplegando las células J558L transfectadas con la IgE de macaco. Se aplican los mismos cambios en las líneas celulares a los ensayos de citotoxicidad realizados con los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de IgE y CD3. Aparte de esto, los ensayos se realizaron como se describe en los ejemplos 4 y 5.

Como se representa en la figura 23, los anticuerpos monocatenarios biespecíficos específicos de especies cruzadas de IgE y CD3 generados demostraron unión a los antígenos tanto humanos como de cynomolgus y resultaron ser totalmente específicos de especies cruzadas.

Como se muestra en la figura 24, todas las construcciones de anticuerpo monocatenario biespecífico específico de especies cruzadas generadas revelaron actividad citotóxica contra células objetivo positivas para IgE humana provocada por linfocitos CD8+ humanos y células objetivo positivas para IgE de macaco provocada por la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx. Como control negativo, se ha usado un anticuerpo monocatenario biespecífico no pertinente.

Ejemplo 26: Unión específica de clones de scFv al extremo N-terminal de CD3 épsilon humana

26.1. Expresión bacteriana de construcciones de scFv en E. coli XL1 Blue

Como se menciona anteriormente, las E. coli XL1 Blue transformadas con pComb3H5Bhis/Flag que contenían un

segmento VL y VH producen scFv soluble en cantidades suficientes después de la escisión del fragmento del gen III y la inducción con IPTG 1 mM. La cadena scFv se exporta al periplasma donde se pliega en una conformación funcional.

Para este experimento se escogieron los clones de scFv siguientes:

i) ScFv 4-10, 3-106, 3-114, 3-148, 4-48, 3-190 y 3-271 descritos en el documento WO 2004/106380.

ii) ScFv de los clones humanos de unión anti-CD3 épsilon H2C, F12Q e I2C descritos en el presente documento.

Para las preparaciones periplásmicas, se hicieron crecer células bacterianas transformadas con los plásmidos que contenían los scFv correspondientes que permiten la expresión periplásmica en medio SB suplementado con MgCl2 20 mM y carbenicilina 50 μg/ml y se redisolvieron en PBS después de recogerlas. Mediante cuatro ciclos de congelación a -70 °C y descongelación a 37 °C, se destruyó la membrana externa de las bacterias por choque osmótico y se liberaron las proteínas solubles periplásmicas, incluidos los scFv, al sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y los residuos celulares por centrifugación, se recogió el sobrenadante que contenía los scFv humanos anti-CD3 humana y se usó para examinarlo adicionalmente. Estos sobrenadantes en bruto que contenían scFv se denominarán en lo sucesivo preparaciones periplásmicas (PPP).

26.2. Unión de scFv a la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc

Se llevaron a cabo experimentos ELISA recubriendo la proteína de fusión CD3 épsilon (aa 1-27)-Fc en los pocillos de placas de 96 pocillos de plástico (Nunc, maxisorb) normalmente a 4 °C durante la noche. Después, se retiró la solución de recubrimiento de antígenos, se lavaron los pocillos una vez con PBS/Tween 20 al 0,05 % y posteriormente se bloquearon con PBS/BSA al 3 % durante al menos una hora. Después de retirar la solución de bloqueo, se añadieron las PPP y las soluciones de control a los pocillos y se incubaron durante, normalmente, una hora a temperatura ambiente. Después, se lavaron los pocillos tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05 %. La detección de scFv unidos a antígenos inmovilizados se llevó a cabo usando un anticuerpo anti-marca FLAG marcado con biotina (M2 anti-Flag-Bio, Sigma, normalmente a un concentración final de 1 μg/ml de PBS) y se detectó con estreptavidina marcada con peroxidasa (Dianova, 1 μg/ml de PBS). La señal se desarrolló mediante la adición de solución de sustrato ABTS y se midió a una longitud de onda de 405 nm. La unión inespecífica de las muestras de prueba al agente de bloqueo y/o a la porción de IgG1 humana de la proteína de fusión CD3 épsilon (aa 1-27)-Fc se estudió llevando a cabo el mismo ensayo con los mismos reactivos y la misma secuencia temporal en placas de ELISA que se recubrieron con lgG1 humana (Sigma). Se usó PBS como control negativo.

Como se muestra en la figura 25, los scFv H2C, F12Q e I2C muestran fuertes señales de unión a la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc. Los scFv humanos 3-106, 3-114, 3-148, 3-190, 3-271, 4-10 y 4-48 (descritos en el documento WO 2004/106380) no muestran ninguna unión significativa por encima del nivel de control negativo.

Para excluir la posibilidad de que la unión positiva de los scFv H2C, F12Q e I2C a pocillos recubiertos con la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc pudiera deberse a la unión a BSA (usado como agente bloqueante) y/o la porción Fc-gamma de lgG1 humana de la proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc, se realizó un segundo experimento ELISA en paralelo. En este segundo experimento ELISA, todos los parámetros fueron idénticos a los del primer experimento ELISA, excepto que en el segundo experimento ELISA se recubrió lgG1 humana (Sigma) en lugar de proteína de fusión CD3 épsilon humana (aa 1-27)-Fc. Como se muestra en la figura 26, ninguno de los scFv probados mostró ninguna unión significativa a BSA y/o a lgG1 humana por encima del nivel de base.

Tomados conjuntamente, estos resultados permiten concluir que los scFv 4-10, 3-271, 3-148, 3-190, 4-48, 3-106 y 3-114 no se unen específicamente a la región CD3 épsilon humana (aa 1-27), mientras que los scFv H2C F12Q e I2C muestran claramente unión específica a los 27 aminoácidos N-terminales de la CD3 épsilon humana.

SEQ ID NO.

DENOMINACIÓN ORIGEN TIPO SECUENCIA

1

Dominio extracellularde CD3ε humana humano aa

2

CD3ε 1-27 humana humano aa

3

Dominio extracellularde CD3ε de Callithrix jacchus Callithrixjacchus aa

4

CD3ε 1-27 deCallithrix jacchus Callithrixjacchus aa

5

Dominio extracellularde CD3ε de Saguinus oedipus Saguinus oedipus aa

6

CD3ε 1-27 deSaguinus oedipus Saguinus oedipus aa

7

Dominio extracellularde CD3ε de Saimiri sciureus Saimiri sciureus aa

8

CD3ε 1-27 de Saimiri sciureus Saimiri sciureus aa

9

CDR-L1 de F6A artificial aa

10

CDR-L2 de F6A artificial aa

11

CDR-L3 de F6A artificial aa

12

CDR-H1 de F6A artificial aa

13

CDR-H2 de F6A artificial aa

14

CDR-H3 de F6A artificial aa

15

VH de F6A artificial aa

16

VH de F6A artificial nt

17

VL de F6A artificial aa

18

VL de F6A artificial nt

19

VH-P de F6A artificial aa

20

VH-P de F6A artificial nt

21

VL-P de F6A artificial aa

22

VL-P de F6A artificial nt

23

VH-VL de F6A artificial aa

24

VH-VL de F6A artificial nt

25

VH-VL-P de F6A artificial aa

26

VH-VL-P de F6A artificial nt

27

CDR-L1 de H2C artificial aa

28

CDR-L2 de H2C artificial aa

29

CDR-L3 de H2C artificial aa

30

CDR-H1 de H2C artificial aa

31

CDR-H2 de H2C artificial aa

32

CDR-H3 de H2C artificial aa

33

VH de H2C artificial aa

34

VH de H2C artificial nt

35

VL de H2C artificial aa

36

VL de H2C artificial nt

37

VH-P de H2C artificial aa

38

VH-P de H2C artificial nt

39

VL-P de H2C artificial aa

40

VL-P de H2C artificial nt

41

VH-VL de H2C artificial aa

42

VH-VL de H2C artificial nt

43

VH-VL-P de H2C artificial aa

44

VH-VL-P de H2C artificial nt

45

CDR-L1 de H1E artificial aa

46

CDR-L2 de H1E artificial aa

47

CDR-L3 de H1E artificial aa

48

CDR-H1 de H1E artificial aa

49

CDR-H2 de H1E artificial aa

50

CDR-H3 de H1E artificial aa

51

VH de H1E artificial aa

52

VH de H1E artificial nt

53

VL de H1E artificial aa

54

VL de H1E artificial nt

55

VH-P de H1E artificial aa

56

VH-P de H1E artificial nt

57

VL-P de H1E artificial aa

58

VL-P de H1E artificial nt

59

VH-VL de H1E artificial aa

60

VH-VL de H1E artificial nt

61

VH-VL-P de H1E artificial aa

62

VH-VL-P de H1E artificial nt

63

CDR-L1 de G4H artificial aa

64

CDR-L2 de G4H artificial aa

65

CDR-L3 de G4H artificial aa

66

CDR-H1 de G4H artificial aa

67

CDR-H2 de G4H artificial aa

68

CDR-H3 de G4H artificial aa

69

VH de G4H artificial aa

70

VH de G4H artificial nt

71

VL de G4H artificial aa

72

VL de G4H artificial nt

73

VH-P de G4H artificial aa

74

VH-P de G4H artificial nt

75

VL-P de G4H artificial aa

76

VL-P de G4H artificial nt

77

VH-VL de G4H artificial aa

78

VH-VL de G4H artificial nt

79

VH-VL-P de G4H artificial aa

80

VH-VL-P de G4H artificial nt

81

CDR-L1 de A2J artificial aa

82

CDR-L2 de A2J artificial aa

83

CDR-L3 de A2J artificial aa

84

CDR-H1 de A2J artificial aa

85

CDR-H2 de A2J artificial aa

86

CDR-H3 de A2J artificial aa

87

VH de A2J artificial aa

88

VH de A2J artificial nt

89

VL de A2J artificial aa

90

VL de A2J artificial nt

91

VH-P de A2J artificial aa

92

VH-P de A2J artificial nt

93

VL-P de A2J artificial aa

91

VL-P de A2J artificial nt

95

VH-VL de A2J artificial aa

96

VH-VL de A2J artificial nt

97

VH-VL-P de A2J artificial aa

98

VH-VL-P de A2J artificial nt

99

CDR-L1 de E1L artificial aa

100

CDR-L2 de E1L artificial aa

101

CDR-L3 de E1L artificial aa

102

CDR-H1 de E1L artificial aa

103

CDR-H2 de E1L artificial aa

104

CDR-H3 de E1L artificial aa

105

VH de E1L artificial aa

106

VH de E1L artificial nt

107

VL de E1L artificial aa

108

VL de E1L artificial nt

109

VH-P de E1L artificial aa

110

VH-P de E1L artificial nt

111

VL-P de E1L artificial aa

112

VL-P de E1L artificial nt

113

VH-VL de E1L artificial aa

114

VH-VL de E1L artificial nt

115

VH-VL-P de E1L artificial aa

116

VH-VL-P de E1L artificial nt

117

CDR-L1 de E2M artificial aa

118

CDR-L2 de E2M artificial aa

119

CDR-L3 de E2M artificial aa

120

CDR-H1 de E2M artificial aa

121

CDR-H2 de E2M artificial aa

122

CDR-H3 de E2M artificial aa

123

VH de E2M artificial aa

124

VH de E2M artificial nt

125

VL de E2M artificial aa

126

VL de E2M artificial nt

127

VH-P de E2M artificial aa

128

VH-P de E2M artificial nt

129

VL-P de E2M artificial aa

130

VL-P de E2M artificial nt

131

VH-VL de E2M artificial aa

132

VH-VL de E2M artificial nt

133

VH-VL-P de E2M artificial aa

134

VH-VL-P de E2M artificial nt

135

CDR-L1 de F7O artificial aa

136

CDR-L2 de F7O artificial aa

137

CDR-L3 de F7O artificial aa

138

CDR-H1 de F7O artificial aa

139

CDR-H2 de F7O artificial aa

140

CDR-H3 de F7O artificial aa

141

VH de F7O artificial aa

142

VH de F7O artificial nt

143

VL de F7O artificial aa

144

VL de F7O artificial nt

145

VH-P de F7O artificial aa

146

VH-P de F7O artificial nt

147

VL-P de F7O artificial aa

148

VL-P de F7O artificial nt

149

VH-VL de F7O artificial aa

150

VH-VL de F7O artificial nt

151

VH-VL-P de F7O artificial aa

152

VH-VL-P de F7O artificial nt

153

CDR-L1 de F12Q artificial aa

154

CDR-L2 de F12Q artificial aa

155

CDR-L3 de F12Q artificial aa

156

CDR-H1 de F12Q artificial aa

157

CDR-H2 de F12Q artificial aa

158

CDR-H3 de F12Q artificial aa

159

VH de F12Q artificial aa

160

VH de F12Q artificial nt

161

VL de F12Q artificial aa

162

VL de F12Q artificial nt

163

VH-P de F12Q artificial aa

164

VH-P de F12Q artificial nt

165

VL-P de F12Q artificial aa

166

VL-P de F12Q artificial nt

167

VH-VL de F12Q artificial aa

168

VH-VL de F12Q artificial nt

169

VH-VL-P de F12Q artificial aa

170

VH-VL-P de F12Q artificial nt

171

CDR-L1 de I2C artificial aa

172

CDR-L2 de I2C artificial aa

173

CDR-L3 de I2C artificial aa

174

CDR-H1 de l2C artificial aa

175

CDR-H2 de I2C artificial aa

176

CDR-H3 de I2C artificial aa

177

VH de I2C artificial aa

178

VH de I2C artificial nt

179

VL de I2C artificial aa

180

VL de I2C artificial nt

181

VH-P de I2C artificial aa

182

VH-P de I2C artificial nt

183

VL-P de I2C artificial aa

184

VL-P de I2C artificial nt

185

VH-VL de I2C artificial aa

186

VH-VL de I2C artificial nt

187

VH-VL-P de I2C artificial aa

188

VH-VL-P de I2C artificial nt

189

CDR-L1 de EGF-R 21-63 artificial aa

190

CDR-L2 de EGF-R 21-63 artificial aa

191

CDR-L3 de EGF-R 21-63 artificial aa

192

CDR-H1 de EGF-R 21-63 artificial aa

193

CDR-H2 de EGF-R 21-63 artificial aa

194

CDR-H3 de EGF-R 21-63 artificial aa

195

VH de EGF-R2163 artificial aa

196

VH de EGF-R2163 artificial nt

197

VL de EGF-R 2163 artificial aa

198

VL de EGF-R 2163 artificial nt

199

VL-VH de EGF-R21-63 artificial aa

200

VL-VH de EGF-R21-63 artificial nt

201

CDR-L1 deMCSP-G4 artificial aa

202

CDR-L2 deMCSP-G4 artificial aa

203

CDR-L3 deMCSP-G4 artificial aa

204

CDR-H1 deMCSP-G4 artificial aa

205

CDR-H2 deMCSP-G4 artificial aa

206

CDR-H3 deMCSP-G4 artificial aa

207

VH de MCSP-G4 artificial aa

208

VH de MCSP-G4 artificial nt

209

VL de MCSP-G4 artificial aa

210

VL de MCSP-G4 artificial nt

211

VH-P de MCSP-G4 artificial aa

212

VH-P de MCSP-G4 artificial nt

213

VL-P deMCSP-G4 artificial aa

214

VL-P deMCSP-G4 artificial nt

215

VH-VL deMCSP-G4 artificial aa

216

VH-VL deMCSP-G4 artificial nt

217

VH-VL-P deMCSP-G4 artificial aa

218

VH-VL-P deMCSP-G4 artificial nt

219

CDR-L1 deMCSP-D2 artificial aa

220

CDR-L2 deMCSP-D2 artificial aa

221

CDR-L3 deMCSP-D2 artificial aa

222

CDR-H1 deMCSP-D2 artificial aa

223

CDR-H2 deMCSP-D2 artificial aa

224

CDR-H3 deMCSP-D2 artificial aa

225

VH de MCSP-D2 artificial aa

226

VH de MCSP-D2 artificial nt

227

VL de MCSP-D2 artificial aa

228

VL de MCSP-D2 artificial nt

229

VH-P de MCSP-D2 artificial aa

230

VH-P de MCSP-D2 artificial nt

231

VL-P de MCSP-D2 artificial aa

232

VL-P de MCSP-D2 artificial nt

233

VH-VL de MCSP-D2 artificial aa

234

VH-VL de MCSP-D2 artificial nt

235

VH-VL-P deMCSP-D2 artificial aa

236

VH-VL-P deMCSP-D2 artificial nt

237

CDR-L1 de MCSP-F9 artificial aa

238

CDR-L2 de MCSP-F9 artificial aa

239

CDR-L3 de MCSP-F9 artificial aa

240

CDR-H1 de MCSP-F9 artificial aa

241

CDR-H2 de MCSP-F9 artificial aa

242

CDR-H3 deMCSP-F9 artificial aa

243

VH de MCSP-F9 artificial aa

244

VH de MCSP-F9 artificial nt

245

VL de MCSP-F9 artificial aa

246

VL de MCSP-F9 artificial nt

247

VH-P de MCSP-F9 artificial aa

248

VH-P de MCSP-F9 artificial nt

249

VL-P de MCSP-F9 artificial aa

250

VL-P de MCSP-F9 artificial nt

251

VH-VL de MCSP-F9 artificial aa

252

VH-VL de MCSP-F9 artificial nt

253

VH-VL-P deMCSP-F9 artificial aa

254

VH-VL-P deMCSP-F9 artificial nt

255

CDR-L1 de IgE-D4 artificial aa

256

CDR-L2 de IgE-D4 artificial aa

257

CDR-L3 de IgE-D4 artificial aa

258

CDR-H1 de lgE-D4 artificial aa

259

CDR-H2 de IgE-D4 artificial aa

260

CDR-H3 de IgE-D4 artificial aa

261

VH de lgE-D4 artificial aa

262

VH de lgE-D4 artificial nt

263

VL de lgE-D4 artificial aa

264

VL de lgE-D4 artificial nt

265

VH-P de lgE-D4 artificial aa

266

VH-P de lgE-D4 artificial nt

267

VL-P de lgE-D4 artificial aa

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VL-P de lgE-D4 artificial nt

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VH-VL de lgE-D4 artificial aa

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VH-VL de lgE-D4 artificial nt

271

VH-VL-P de IgE-D4 artificial aa

272

VH-VL-P de IgE-D4 artificial nt

273

CDR-L1 de IgE-G9 artificial aa

274

CDR-L2 de IgE-G9 artificial aa

275

CDR-L3 de IgE-G9 artificial aa

276

CDR-H1 de IgE-G9 artificial aa

277

CDR-H2 de IgE-G9 artificial aa

278

CDR-H3 de IgE-G9 artificial aa

279

VH de lgE-G9 artificial aa

280

VH de lgE-G9 artificial nt

281

VL de lgE-G9 artificial aa

282

VL de lgE-G9 artificial nt

283

VH-P de lgE-G9 artificial

284

VH-P de lgE-G9 artificial

285

VL-P de lgE-G9 artificial

286

VL-P de lgE-G9 artificial

287

VH-VL de lgE-G9 artificial aa

288

VH-VL de lgE-G9 artificial nt

289

VH-VL-P deIgE-G9 artificial aa

290

VH-VL-P deIgE-G9 artificial nt

291

EGF-R 21-63VL-VH x F6AVH-VL-P artificial aa

292

EGF-R 21-63VL-VH x F6AVH-VL-P artificial nt

293

EGF-R 21-63VL-VH x H2CVH-VL artificial aa

294

EGF-R 21-63VL-VH x H2CVH-VL artificial nt

295

EGF-R 21-63VL-VH x H2CVH-VL-P artificial aa

296

EGF-R 21-63VL-VH x H2CVH-VL-P artificial nt

297

EGF-R 21-63VL-VHxH1EVHVL-P artificial aa

298

EGF-R 21-63VL-VHxH1EVHVL-P artificial nt

299

EGF-R 21-63 VL-VH xG4H VH-VL-P artificial aa

300

EGF-R 21-63 VL-VH xG4H VH-VL-P artificial nt

301

EGF-R 21-63 VL-VH xA2J VH-VL-P artificial aa

302

EGF-R 21-63 VL-VH xA2J VH-VL-P artificial nt

303

EGF-R 21-63 VL-VHxE1LVH-VL-P artificial aa

304

EGF-R 21-63 VL-VHxEUVH-VL-P artificial nt

305

EGF-R 21-63 VL-VH xE2M VH-VL-P artificial aa

306

EGF-R 21-63 VL-VH xE2M VH-VL-P artificial nt

307

EGF-R 21-63 VL-VH xF7O VH-VL-P artificial aa

308

EGF-R 21-63 VL-VH xF7O VH-VL-P artificial nt

309

MCSP-G4 VH-VL xH2C VH-VL artificial aa

310

MCSP-G4 VH-VL xH2C VH-VL artificial nt

311

MCSP-G4 VH-VL xF12Q VH-VL artificial aa

312

MCSP-G4 VH-VL xF12QVH-VL artificial nt

313

MCSP-G4 VH-VL x I2CVH-VL artificial aa

314

MCSP-G4 VH-VL x I2CVH-VL artificial nt

315

MCSP-G4 VH-VL-P xF6A VH-VL-P artificial aa

316

MCSP-G4 VH-VL-P xF6A VH-VL-P artificial nt

317

MCSP-G4 VH-VL-P xH2C VH-VL-P artificial aa

318

MCSP-G4 VH-VL-P xH2C VH-VL-P artificial nt

319

MCSP-G4 VH-VL-P xH1EVH-VL-P artificial aa

320

MCSP-G4 VH-VL-P xH1EVH-VL-P artificial nt

321

MCSP-G4 VH-VL-P xG4H VH-VL-P artificial aa

322

MCSP-G4 VH-VL-P xG4H VH-VL-P artificial nt

323

MCSP-G4 VH-VL-P xA2J VH-VL-P artificial aa

324

MCSP-G4 VH-VL-P xA2J VH-VL-P artificial nt

325

MCSP-G4 VH-VL-P xEUVH-VL-P artificial aa

326

MCSP-G4 VH-VL-P xE1LVH-VL-P artificial nt

327

MCSP-G4 VH-VL-P xE2M VH-VL-P artificial aa

328

MCSP-G4 VH-VL-P xE2M VH-VL-P artificial nt

329

MCSP-G4 VH-VL-P xF7O VH-VL-P artificial aa

330

MCSP-G4 VH-VL-P xF7O VH-VL-P artificial nt

331

MCSP-G4 VH-VL-P xF12QVH-VL artificial aa

332

MCSP-G4 VH-VL-P xF12QVH-VL artificial nt

333

MCSP-G4 VH-VL-P xI2C VH-VL artificial aa

334

MCSP-G4 VH-VL-P xI2C VH-VL artificial nt

335

MCSP-D2 VH-VL xH2C VH-VL artificial aa

336

MCSP-D2 VH-VL xH2C VH-VL artificial nt

337

MCSP-D2 VH-VL xF12QVH-VL artificial aa

338

MCSP-D2 VH-VL xF12Q VH-VL artificial nt

339

MCSP-D2 VH-VL xI2C VH-VL artificial aa

340

MCSP-D2 VH-VL xl2CVH-VL artificial nt

341

MCSP-D2 VH-VL-P xH2C VH-VL-P artificial aa

342

MCSP-D2 VH-VL-P xH2C VH-VL-P artificial nt

343

MCSP-F9 VH-VL xH2C VH-VL artificial aa

344

MCSP-F9 VH-VL xH2C VH-VL artificial nt

345

MCSP-F9 VH-VL-P xH2C VH-VL-P artificial aa

346

MCSP-F9 VH-VL-P xH2C VH-VL-P artificial nt

347

MCSP-F9 VH-VL-P xG4H VH-VL-P artificial aa

348

MCSP-F9 VH-VL-P xG4H VH-VL-P artificial nt

349

1-27CD3ε-Fc artificial aa

350

1-27CD3ε-Fc artificial ADNc

351

CD3ε 1-27 humana -EpCAM artificial aa

352

CD3ε 1-27 humana -EpCAM artificial ADNc

353

CD3ε 1-27 de tití -EpCAM artificial aa

354

CD3ε 1-27 de tití -EpCAM artificial ADNc

355

CD3ε 1-27 de tamarino-EpCAM artificial aa

356

CD3ε 1-27 de tamarino-EpCAM artificial ADNc

357

CD3ε 1-27 de monoardilla -EpCAM artificial aa

358

CD3ε 1-27 de monoardilla -EpCAM artificial ADNc

359

CD3ε 1-27 de cerdo -EpCAM artificial aa

360

CD3ε 1-27 de cerdo -EpCAM artificial ADNc

361

cadena CD3 épsilonhumana artificial aa

362

cadena CD3 épsilonhumana artificial ADNc

363

peptido líder deinmunoglobulina de 19 aminoácidos artificial aa

364

peptido líder deinmunoglobulina de 19 aminoácidos artificial ADNc

365

región constante decadena pesada deIgG1 murina murino aa

366

región constante decadena pesada deIgG1 murina murino ADNc

367

región constante decadena ligera lambdahumana humano aa

368

región constante decadena ligera lambdahumana humano ADNc

369

EGFR humano humano aa

370

EGFR humano humano ADNc

371

dominio extracelularde EGF-R decunomolgus condominio intracelular ytransmembranario deEGF-R humano artificial aa

372

dominio extracelularde EGF-R decunomolgus condominio intracelular ytransmembranario deEGF-R humano artificial ADNc

373

construcción dedominio c-terminal deMCSP humana aa

374

construcción dedominio c-terminal deMCSP humana ADNc

375

secuencia parcial deMCSP de cynomolgus cynomolgus aa

376

secuencia parcial deMCSP de cynomolgus cynomolgus ADNc

377

cebador de PCR paracadena CD3ε cebador directo artificial DNA

378

cebador de PCR paracadena CD3ε cebador inverso artificial DNA

379

CD3ε humana-His6 artificial aa

380

CD3ε humana-His6 artificial ADNc

381

VH de EGFR artificial aa

382

VH de EGFR artificial nt

384

VL de EGFR artificial nt

385

VH-VL de EGFR artificial aa

386

VH-VL de EGFR artificial nt

387

VL-VH de EGFR artificial aa

388

VL-VH de EGFR artificial nt

389

EGFR VH-VL x I2CVH VL artificial aa

390

EGFR VH-VL x I2CVH VL artificial nt

391

EGFR VL-VH x I2C VHVL artificial aa

392

EGFR VL-VH x I2C VHVL artificial nt

393

EGFR VH-VL xF12QVHVL artificial aa

394

EGFR VH-VL x F12QVHVL artificial nt

395

EGFR VL-VH x F12QVHVL artificial aa

396

EGFR VL-VH x F12QVHVL artificial nt

397

EGFR VH-VL x H2C VH VL artificial aa

398

EGFR VH-VL x H2C VH VL artificial nt

399

EGFR VL-VH x H2C VHVL artificial aa

400

EGFR VL-VH x H2C VHVL artificial nt

401

VH de EGFR artificial aa

402

VH de EGFR artificial nt

403

VL de EGFR artificial aa

404

VL de EGFR artificial nt

405

VH-VL de EGFR artificial aa

406

VH-VL de EGFR artificial nt

407

VL-VH de EGFR artificial aa

408

VL-VH de EGFR artificial nt

409

EGFR VH-VL x I2C VH VL artificial aa

410

EGFR VH-VL x I2C VH VL artificial nt

411

EGFR VL-VH x I2C VHVL artificial aa

412

EGFR VL-VH x I2C VHVL artificial nt

413

EGFR VH-VL xF12QVHVL artificial aa

414

EGFR VH-VL x F12QVHVL artificial nt

415

EGFR VL-VH x F12QVHVL artificial aa

416

EGFR VL-VH x F12QVHVL artificial nt

417

EGFR VH-VL x H2C VH VL artificial aa

418

EGFR VH-VL x H2C VH VL artificial nt

419

EGFR VL-VH x H2C VHVL artificial aa

420

EGFR VL-VH x H2C VH VL artificial nt

421

VH de HER2/neu artificial aa

422

VH de Her2/neu artificial nt

423

VL de Her2/neu artificial aa

424

VL de Her2/neu artificial nt

425

VH-VL de Her2/neu artificial aa

426

VH-VL de Her2/neu artificial nt

427

VL-VH de Her2/neu artificial aa

428

VL-VH de Her2/neu artificial nt

429

Her2/neu VH-VL x I2CVH VL artificial aa

430

Her2/neu VH-VL x I2CVH VL artificial nt

431

Her2/neu VL-VH x I2CVH VL artificial aa

432

Her2/neu VL-VH x I2CVH VL artificial nt

433

Her2/neu VH-VLXF12QVHVL artificial aa

434

Her2/neu VH-VLxF12Q VHVL artificial nt

435

Her2/neu VL-VHXF12Q VHVL artificial aa

436

Her2/neu VL-VHxF12Q VHVL artificial nt

437

Her2/neu VH-VL x H2CVH VL artificial aa

438

Her2/neu VH-VL x H2CVH VL artificial nt

439

Her2/neu VL-VH x H2CVH VL artificial aa

440

Her2/neu VL-VH x H2CVH VL artificial nt

441

HCDR1 de EGFR artificial aa

442

HCDR2 de EGFR artificial aa

443

HCDR3 de EGFR artificial aa

444

LCDR1 de EGFR artificial aa

445

LCDR2 de EGFR artificial aa

446

LCDR3 de EGFR artificial aa

447

EGFR HL x H2C HL artificial aa

448

EGFR HL x H2C HL artificial nt

449

EGFRHL x F12Q LH artificial aa

450

EGFRHL x F12Q LH artificial nt

451

EGFR HL x I2C HL artificial aa

452

EGFR HL x I2C HL artificial nt

453

HCDR1 de EGFR artificial aa

454

HCDR2 de EGFR artificial aa

455

HCDR3 de EGFR artificial aa

456

LCDR1 de EGFR artificial aa

457

LCDR2 de EGFR artificial aa

458

LCDR3 de EGFR artificial aa

459

proteína HER2humana humano nt

460

proteína HER2humana humano aa

461

proteína HER2humana/de macaco quimérica artificial nt

462

proteína HER2humana/de macaco quimérica artificial aa

463

HCDR1 de Her2/neu artificial aa

464

HCDR2 de Her2/neu artificial aa

465

HCDR3 de Her2/neu artificial aa

466

LCDR1 de Her2/neu artificial aa

467

LCDR2 de Her2/neu artificial aa

468

LCDR3 de Her2/neu artificial aa

469

Her2/neu HL x H2CHL artificial aa

470

Her2/neu HL x H2CHL artificial nt

471

Her2/neu HL x F12QHL artificial aa

472

Her2/neu HL x F12QHL artificial nt

473

Her2/neu HL x I2CHL artificial aa

474

Her2/neu HL x I2CHL artificial nt

475

H2C HL x Her2/neu LH artificial aa

476

H2C HL x Her2/neu LH artificial nt

477

F12QHLX Her2/neu LH artificial aa

478

F12QHLX Her2/neu LH artificial nt

479

I2C HL x Her2/neu LH artificial aa

480

I2C HL x Her2/neu LH artificial nt

481

HCDR1 de IgE artificial aa

482

HCDR2 de IgE artificial aa

483

HCDR3 de IgE artificial aa

484

LCDR1 de IgE artificial aa

485

LCDR2 de IgE artificial aa

486

LCDR3 de IgE artificial aa

487

VH de IgE artificial aa

488

VH de IgE artificial nt

489

VL de IgE artificial aa

490

VL de IgE artificial nt

491

HL de IgE artificial aa

492

HL de IgE artificial nt

493

LH de IgE artificial aa

494

LH de IgE artificial nt

495

lgEHL x H2CHL artificial aa

496

IgE HL x H2C HL artificial nt

497

lgEHL x F12Q HL artificial aa

498

lgEHL x F12Q HL artificial nt

499

IgE HL x I2C HL artificial aa

500

IgE HL x I2C HL artificial nt

501

IgE LH x H2C HL artificial aa

502

IgE LH x H2C HL artificial nt

503

lgELH x F12Q HL artificial aa

504

lgELH x F12Q HL artificial nt

505

IgE LH x I2C HL artificial aa

506

IgE LH x I2C HL artificial nt

507

Ag de IgE rhesus nt

508

Ag de IgE humano nt

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polipéptido que comprende un primer dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu, y un segundo dominio de unión capaz de unirse a EGFR, Her2/neu o IgE de un ser humano y/o de un primate distinto de chimpancé.

2. 2.

   El polipéptido como se define en la reivindicación 1, en el que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu.

3. 3.

   El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el primer dominio de unión comprende una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:

   (a)

   CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 27, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 28 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 29;

   (b)

   CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 117, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 118 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 119; y

   (c)

   CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 153, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 154 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 155.

4. 4. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:

   (a)

   CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 12, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 13 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 14;

   (b)

   CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 30, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 31 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 32;

   (c)

   (c) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 48, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 49 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 50;

   (d)

   CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 66, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 67 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 68;

   (e)

   CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 84, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 85 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 86;

   (f)

   CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 102, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 103 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 104;

   (g)

   CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 120, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 121 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 122;

   (h)

   CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 138, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 139 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 140;

   (i)

   CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 156, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 157 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 158; y

   (j)

   CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 174, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 175 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 176.

5. 5.

   El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el primer dominio de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 o 165.

6. 6.

   El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el primer dominio de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181.

7. 7.

   El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el primer dominio de unión comprende una región VL y una región VH seleccionadas del grupo que consiste en:

   (a)

   una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 17 o 21 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 15 o 19;

   (b)

   una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 35 o 39 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 33 o 37;

   (c)

   una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 53 o 57 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 51 o 55;

   (d)

   una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 71 o 75 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 69 o 73;

   (e)

   una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 89 o 93 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 87 o 91;

   (f)

   una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 107 o 111 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 105 o 109;

   (g)

   una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 125 o 129 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 123 o 127;

   (h)

   una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 143 o 147 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 141 o 145;

   (i)

   una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 161 o 165 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 159 o 163; y

   (j)

   una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 179 o 183 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 177 o 181.

8. 8.

   El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25,41,43,59,61,77,79,95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187.

9. 9.

   El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho polipéptido es una molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico.

10. 10.

    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico comprende un grupo de las secuencias siguientes como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en el segundo dominio de unión seleccionadas de las SEQ ID NO: 441 -446, las SEQ ID NO: 453 -458, las SEQ ID NO: 463 -468, las SEQ ID NO: 481 -486.

11. 11.

    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico comprende una secuencia seleccionada de:

    (a)

    una secuencia de aminoácidos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 389, 391, 393, 395, 397, 399, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 447, 449, 451, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 495, 497, 499, 501, 503 y 505; y

    (b)

    una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 390, 392, 394, 396, 398, 400, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 448, 450, 452, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 496, 498, 500, 502, 504 y 506.

12. 12.

    Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. 13.

    Un vector, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos como se define en la reivindicación 12.

14. 14.

    Una célula huésped transformada o transfectada con un vector como se define en la reivindicación 13.

15. 15.

    Un procedimiento para la producción de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped como se define en la reivindicación 14 bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y recuperar el polipéptido producido del cultivo.

16. 16.

    Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o producido de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 15.

17. 17.

    El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o producido de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 15 para su uso en la prevención, el tratamiento o la mejora de una enfermedad seleccionada de entre una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico.

18. 18.

    Un kit que comprende un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula

    de ácido nucleico como se define en la reivindicación 12, un vector como se define en la reivindicación 13 o una célula huésped como se define en la reivindicación 14.

    Figura 1

    Figura 2

    196 197

    Figura 4

    Figura 5

    199 200 201 202 203 204

    Figura 7

    205 206 207 208 209 210

    Figura 10

    211 212 213 214 215

    Figura 12

    216 217 218 219

    Figura 13

    220 221 222 223

    Figura 17

    Figura 18

    Figura 19

    Figura 20

    Figura 21

    228 229 230 231 232 233 234 235

    Figura 25

    Figura 26