RS52492B - Molekuli koji se interspecijski specifično bispecifično vezuju - Google Patents

Abstract

Polipeptid koji sadrži prvi vezivni domen, koji je antitelo sposobno da se veže za epitop CD3ε lanca čoveka i Callithrix jacchusa, Saguinus oedipusa ili Saimiri sciureusa, naznačen time, stoje taj epitop deo aminokiselinske sekvence sadržane u grupi koju čine SEQ ID br:2, 4, 6, ili 8 i sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu, i drugi vezivni domen koji je u stanju da se veže za EGFR, Her2/neu ili IgE čoveka i/ili primata koji nisu šimpanze.Prijava sadrži još 17 patentnih zahteva.

Description

MOLEKULI KOJI SE

INTERSPECIJSKI SPECIFIČNO

BISPECIFIČNO VEZUJU

[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na popipeptide koji sadrže prvi humani vezivni domen koji predstavlja antitelo sposobno da se veže za epitop CD3 (epsilon) čoveka i primata osim šimpanze i drugi vezivni domen sposoban da se veže za EGFR, Her2/neu ili IgE čoveka i/ili primata osim šimpanze, kao i na procese za dobijanje navedenih polipeptida. Pronalazak se dalje odnosi na nukleinske kiseline koje se kodiraju za polipeptide, na vektore koji ih sadrže i na ćelije domaćina koje sadrže vektor. U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže navedene polipeptide i medicinsku upotrebu polipeptida.

[0002]Prepoznavanje T ćelija je posredovano klonotipiski raspoređenim receptorima alfa beta i gama delta T ćelija (TcR) koji reaguju sa peptidnim delom molekula peptida MHC (pMHC)

(Daviš & Bjorkman, Nature 334 (1988), 395 - 402). Antigen-specifićni lanci TcR nemaju signalizacione domene, već su kuplovani za konzervisani multipodjedinični signalizacioni aparat CD3 (Call, Cell 111 (2002), 967 - 979, Alarcon, Immunol. Rev. 191 (2003), 38 - 46, Malissen Immunol. Rev. 191 (2003), 7 - 27). Mehanizam kojim TcR povezivanje direktno komunicira sa signalizacionim aparatom ostaje fundamentalno pitanje u bilogiji T ćelija (Alarcon, loc. cit.; Daviš, Cell 110 (2002), 285 - 287). Izvesno je da trajni odgovori T ćelija uključuju angažovanje koreceptora, TcR oligomerizaciju, i aranžman višeg reda TcR-pMHC kompleksa u imunološkoj sinapsi (Daviš & van der Mervve, Curr. Biol. 11 (2001), R289 - R291, Daviš, Nat. Immunol. 4

(2003), 217 - 224). Međutim, vrlo rana TcR signalizacija nastaje u odsustvu ovih događaja i može da izazove ligandom indukovano konformacionu pramenu u CD3 epsilon (Alarcon, loc. cit., Daviš (2002), loc. cit, Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 11174 - 11179, Gil, Cell 109 (2002), 901-912). Eepsilon, gama, delta i zeta podjedinice signalizacionog kompleksa povezuju se jedna sa drugom da stvore CD3 epsilon-gama heterodimer, CD3 epsilon-delta, heterodimer, i CD3 zeta-zeta homodimer (Call, loc. cit.). Razna ispitivanja su pokazala da su CD3 molekuli važni za odgovarajuću ekspresiju površine ćelija alfa-beta TcR i normalni razvoj T ćelija

(Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528 - 8536, Wang, J. Exp. Med. 188 (1998), 1375 - 1380, Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 441 -447). Rešena struktura ektodomenskih

fragmenata mišjih CD3 epsilon gama heterodimera pokazala je da su epsilon gama podjedinice C2-set Ig domeni koji reaguju jedan sa drugim da izgrade neobičnu bočnu (engl. side-to side) - konfiguraciju dimera (Sun, Cell 105 (2001), 913-923). Mada izgleda da cisteinom bogata grana ima važnu ulogu u pokretanju CD3 dimerizacije (Su, loc. cit., Borroto, J. Biol. Chem. 273 (1998), 12807 -12816), interakcija pomoću ekstracelularnih domena CD3 epsilon i CD3 gama je dovoljna da poveže ove proteine sa TcR beta (Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84-92, Manolios & Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995), 532 - 536). lako još uvek kontroverzna, dominantna stehiometrija TcR najverovatnije sadrži jedan alfa beta TcR, jedan CD3 epsilon gama heterodimer, jedan CD3 epsilon delta heterodimer i jedan CD3 zeta homodimer (Call, loc. cit.).S obzirom na centralnu ulogu humanog CD3 epsilon gama heterodimera u imunom odgovoru, kristalna struktura ovog kompleksa vezanog za terapeutsko antitelo OKT3 je nedavno razjašnjena (Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675 - 7680).

[0003]Brojne terapeutske strategije moduliraju imunitet T ćelija ciljajući na signalizaciju TcR, posebno anti-humana CD3 monoklonalna antitela (mAbs) koja se velikoj meri upotrebljavaju u imunosupresivnim režimima. CD3-specifična mišja mAb OKT3 su prva mAb licencirana za upotrebu kod čoveka (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23 - 29) i široko se upotrebljava klinički kao imunosupresivno sredstvo u transplantaciji (Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993), 422 - 430, Chatenoud, Nat. Rev. Immunol. 3 (2003), 123 -132, Kumar, Transplant. Proc. 30 (1998), 1351 - 1352), tipu 1 dijabetesa (Chatenoud (2003), ioc. cit), i psorijazi (Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907 -1913). Štaviše, anti-CD3 mAbs mogu da indukuju parcijalnu signalizaciju T ćelija i klonalnu anergiju (Smith, J. Exp. Med. 185 (1997), 1413-1422). OKT3 je opisan u literaturi kao potentni mitogen T ćelija (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708 -18) kao i potentni ubica T ćelija (Wong, Transplantation 50 (1990), 683 - 9). OKT3 ispoljava obe ove aktivnosti na način koji zavisi od vremena, prateći ranu aktivaciju T ćelija što dovodi do oslobađanja citokina; posle dalje primene OKT3 kasnije blokira sve poznate funkcije T ćelija. Usled ovog kasnijeg blokiranja finkcije T ćelija, OKT3 je našao široku primenu kao imunosupresant u režimima terapije za redukciju ili čak aboliciju odbacivanja alograft tkiva .

[0004]OKT3 utiče na odbacivanje alograft tkiva najverovatnije tako što blokira fumkciju svih T ćelija, koje imaju važnu ulogu u akutnom odbacivanju. OKT3 reaguje sa i blokira funkciju CD3 kompleksa u membrani humanih T ćelija, što je povezano sa strukturom prepoznavanja antigena T ćelija (TCR) i bitno je za transdukciju signala. Koja je podjedinica TCR/CD3 vezana sa OKT3 je bilo predmet mnogih ispitivanja. Ipak, istaknuta je neka evidencija o specifičnosti 0KT3 za epsilon-podjedinicu TCR/CD3 kompleksa (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546 - 50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680). Dalja evidencija jepokazala da OKT3 vezivanje TCR/CD3 kompleksa zahteva prisutnost drugih podjedinica ovog kompleksa (Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047 - 52).

[0005]Druga poznata antitela specifična za CD3 molekul su navedena u Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546 - 50. Kako je ranije naznačeno, takva CD3 specifična antitela su sposobna da izazovu različite odgovore T ćelija, kao što je proizvodnja limfokina (Von Wussow, J. Immunol. 127(1981), 1197; Palacious, J. Immunol. 128(1982), 337), proliferacija (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) i indukcija supresor-T ćelija (Kunicka, in "Lymphocyte Tvping II" 1 (1986), 223). To jest, u zavisnosti od eksperimentalnih uslova, CD3 specifično monoklonalno antitelo može da inhibira ili izazove citotoksučnost (Leevvenberg, J. Immunol. 134

(1985), 3770; Phillips, J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78

(1981), 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987), 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135 (1985), 34; Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol. 31, 94 -106; Xu

(2000), Cell Immunol. 200, 16-26; Kimball (1995), Transpl. Immunol. 3, 212 - 221).

[0006]Mada je objavljeno da mnoga CD3 antitela opisana u tehnici prepoznaju CD3 epsilon podjedinicu CD3 kompleksa, većina njih vezuje se u stvari za konformacione epitope i, tako, samo prepoznaje CD3 epsilon u nativnom kontekstu TCR. Konformacione epitope se karakterišu prisustvom dva ili više odvojenih ostataka aminokiselina koji su azdvojeni u primarnoj sekvenci, ali dolaze zajedno na površinu molekula kad se polipeptid savija u nativni protein/antigen (Sela, (1969) Science 166,1365 and Laver, (1990) Cell 61, 553 - 6). Konformacioni epitopi vezani sa CD3 epsilon antitelima koji su opisani u literaturi mogu se odvojiti u dve grupe. U većoj grupi, navedeni epitopi su stvoreni od dve CD3 podjedinice, npr. od CD3 epsilon lanca i CD3 gama ili

[0007]WO 2007/033230 opisuje antitela prema sekvenci EMGGITQTPYKVSISGT CD3 koja odgovara ostatku 6-22 humanog CD3 epsilon

[0008]CD3 delta lanca. Na primer, u više ispitivanja nađeno je da najčešće korišćena CD3 epsilon monoklonalna antitela OKT3, WT31, UCHT1, 7D6 i Leu-4 nisu se vezala za ćelije koje su pojedinačno transfektovane sa CD3-epsilon lancem. Međutim, ove obojene ćelije antitela su dvostruko transfektovane sa kombinacijom CD3 epsilon plus ili CD3 gama ili CD3 delta (Tunnacliffe, loc. cit.; Law, Int. Immunol. 14(2002), 389-400; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52; Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 1703-9). U drugoj, manjoj grupi, konformacioni epitop je stvorena unutar same CD3 epsilon podjedinice. Član ove grupe je na primer, Ab APA 1/1 koji je stvoren prema denaturisanom CD3 epsilon (Risueno, Blood 106 (2005), 601-8). Ukupno, većina CD3 epsilon antitela opisana u tehnici prepoznaje konformacione epitope koji su locirani na dve ili više podjedinica CD3. Odvojeni ostaci aminio kiselina koji grade trodimeznionalnu strukturu ovih epitopa mogu tako biti locirani bilo na samoj CD3 epsilon podjedinici ili na CD3 epsilon podjedinici i na drugim CD3 podjedinicama kao što su CD3 gama ili CD3 delta.

[0009]Drugi problem u vezi sa CD3 antitelima je da je nađeno da su mnoga CD3 antitela specijski specifična. Anti-CD3 monoklonalna antitela - što je generalno tačno za bilo koja druga monoklonalna antitela - funkcionišu putem vrlo specifičnog prepoznavanja njihovih ciljnih molekula. Ona prepoznaju samo jedno mesto, ili epitop, na njihovom ciljnom CD3 molekulu. Na primer, jedna od najviše korišćenih i najbolje okarakterisanih monoklonalnih antitela, specifičnih za CD3 kompleks, su OKT-3. Ovo antitelo reaguje sa CD3 šimpanze ali ne sa CD3 homologom drugih primata, kao što su makaki, ili CDR3 psa (Sanduskv et al., J. Med. Primatol. 15 (1986), 441 - 451). Anti-CD3 monoklonalno antitelo UCHT-1 takođe reaguje sa CD3 šimpanze, ali ne sa CD3 makakija (sopstveni podaci). Sa druge strane, postoje takođe primeri monoklonalnih antitela koja prepoznaju makaki antigene, ali ne i njihove humane parnjake. Jedan primer ove grupe je monoklonalno antitelo FN-18, usmereno ka CD3 makakija (Uda et al., J. Med. Primatol. 30 (2001), 141 -147). Interesantno, nađeno je da periferni limfociti od oko 12% cinomolgus majmuna nisu reagovali sa monoklonalnim antitelom (FN-18) anti-rezus majmuna CD3 usled polimorfizma CD3 antigena kod makakija. Uda et al. opisali su supstituciju dve amino kiseline u CD3 sekvenci cinomolgus majmuna, koje ne reaguju sa FN-18 antitelima, u poređenju sa CD3 izvedenoj iz životinja, koja reaguje sa FN-18 antitelima (Uda et al., J Med Primatol. 32 (2003), 105 - 10; Uda et al., J Med Primatol. 33 (2004), 34 - 7).

[0010]Ova diskriminaciona sposobnost, tj. interspecijska specifičnost, svojstvena CD3 monoklonalnim antitelima i njihovim fragmentima, značajna je prepreka njihovom razvoju kao terapeutskih sredstava za lečenje oboljenja kod ljudi. Da bi se dobila upotrebna dozvola, svaki novi kandidat za lek mora da prođe kroz rigorozno testiranje. Ovo testiranje se može podeliti u prekliničke i kliničke faze. Dok se ova druga - podeljena dalje u opše poznate kliničke faze I, II and III - izvodi na pacijentima ljudima, prva se izvodi na životinjama. Svrha prekliničkog testiranja je da potvrdi da kandidat za lek ima željenu aktivnost i što je najvažnije, da je bezbedan. Samo kad je u prekliničkom testiranju utvrđena bezbednost kod životinja i moguća efikasnost kandidata za lek, odgovarajući regulatorni organ će ga odobriti za kliničko testiranje kod ljudi. Kandidat za lek se može testirati na bezbednost kod životinja na tri sledeća načina, (i) kod relevantnih vrsta, tj vrsta gde kandidat za lek može da prepozna ortologe antigene, (ii) kod transgenskih životinja koje sadrže humane antigene i (iii) korišćenjem surogata za kandidata za lek koji može da veže ortologe antigene prisutne kod životinja. Ograničenja transgenskih životinja su da je ova tehnologija obično ograničena na glodare. Između glodara i čoveka postoje znatne razlike u fiziologiji i rezultati bezbednosti se ne mogu lako ekstrapolirati na ljude. Ograničenja surogata za kandidata za lek su različite kompozicije materijala u poređenju sa aktuelnim kandidatom za lek i često su upotrebljene životinje glodari sa ranije navedenim ograničenimja.. Prema tome, preklinički podaci dobijeni na glodarima su od ograničene prediktivne važnosti što se tiče ispitivanog potencijalnog leka. Prilaz izboru za testiranje bezbednosti je upotreba relevantnih vrsta, poželjno nižeg primata. Ograničenje opisano u tehnici koje se sada postavlja za CD3 vezivne molekule pogodne za terapeutsku intervenciju kod čoveka je da su relevantne vrste viši primati, posebno šimpanze. Šimpanze se smatraju ugroženom vrstom i zbog njihove sličnosti sa čovekim, korišćenje takvih životinja za testiranje bezbednosti leka je zabranjeno u Evropi i svuda je vrlo ograničeno.

[0011]Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptide koji sadrže prvi vezivni domen koji je antitelo sposobno da se veže za epitop CD3e lanca čoveka i Callithrix jacchus, Saguinus

oedipus ili Saimiri sciureus, pri čemu je epitop deo sekvenci aminokiselina koja se nalazi u grupi koja se sastoji od SEQ ID NO:2, 4, 6, ili 8 i sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu, i drugi vezivni domen sposoban za vezivanje za EGFR, Her2/neu ili IgE čoveka ili primata osim šimšanze. Sekvence kako su navedene u SEQ ID Br. 2, 4, 6 i 8 njihovi fragmenti su CD3 epitopi koji ne zavise od konteksta (engl. context-independent).

[0012]Prednost predmetnog pronalaska je obezbeđivanje polipetida koji sadrži prvi humani vezivni domen koji predstavlja antitelo koje ispoljava interspecijsku specifičnost za CD3e (epsilon) lanac čoveka i primata osim šimpanze, koji se može upotrebiti kako za prekliničko određivanje bezbednosti, aktivnosti i/ili farmakokinetičkog profila ovih, prvenstveno humanih vezivnih domena kod primata, tako i -u identičnom obliku- kao lek za ljude. Isti molekul se može upotrebiti u prekliničkim ispitivanjima na životinjama kao i u kliničkim ispitivanjima na ljudima. Ovo daje visoko uporedlve rezultate i vrlo povećanu prediktivnu moć ispitivanja na životinjama u poređenju sa specijski specifičnim surogat molekulima. U predmetnom pronalasku, N-terminalni 1-27 aminokiselinski ostatak polipeptidnog fragmenta ekstracelularnog domena CD3 epsilon je na iznenađujući način identifikovan i - nasuprot svim drugim poznatim epitopima CD3 epsilon opisanim u tehnici - on zadržava svoju trodimenzionalni strukturni integritet kad se izvadi iz njegovog prirodnog okruženja u CD3 kompleksu (i spoji sa heterolognom aminokiselinskom sekvencom kao što je EpCAM ili Fc fragment imunoglobulina).

[0013]CD3 epitop koji ne zavisi od konteksta obezbeđen u ovom pronalasku odgovara prvim 27 N-terminalnim aminokiselinama CD3 epsilon ili nizu funkcionalnih fragmenata ovih 27 aminokiselina. Fraza "koji ne zavisi od konteksta," kako je ovde upotrebljena u vezi sa CD3 epitopom označava da vezivanje ovde opisanog vezivanja molekula/molekula antitela ne dovodi do promene ili modifikacije konformacije, sekvence, ili strukture koja opkoljava antigensku determinantu ili epitop. Nasuprot ovome. CD3 epitop koji prepoznaje konvencionalni CD3 vezivni molekul (npr. kao što je opisano u WO 99/54440 ili WO 04/106380) je lokalizovan na CD3 epsilon C-terminalnom lancu za N-terminalne 1-27 aminokiseline epitopa koji ne zavisi od konteksta, pri čemu on ima korektnu konformaciju ako je ugrađen unutar ostatka epsilon lanca i držan u ispravmom položaju heterodimerizacijom epsilon lanca bilo sa CD3 gama ili delta lancem.

[0014]Anti-CD3 vezivni molekuli kao deo bispecifičnog vezivnog molekula kako su ovde obezbeđem i generisani (i usmereni) prema CD3 epitopu koji ne zavisi od konteksta dali su iznenađujuće kliničko poboljšanje u odnosu na redistribuciju T ćelija i, na taj način, povoljniji profil bezbednosti. Ne vezujući se za teoriju, pošto je CD3 epitop nezavisan od konteksta, stvarajući autonomni samodovoljni subdomen bez mnogo uticaja na ostatak CD3 kompleksa, CD3 vezivni molekul koji su ovde obezbeđeni indukuju manje alosternih promena u konformaciji CD3 nego konvencionalni CD3 vezivni molekuli (kao što su molekuli obezbeđeni u WO 99/54440), koji prepoznaju CD3 epitope koji zavise od konteksta.

[0015]Nezavisnost od konteksta CD3 epitopa CD3 vezivnih molekula pronalaska kao dela bispecifičnog vezivnog molekula je povezana sa manjom redistribucijom T ćelija tokom početne faze lečenja sa CD3 vezivnim molekulima pronalaska što dovodi do boljeg profila bezbednosti CD3 vezivnih molekula pronalaska u poređenju sa konvencionalnim CD3 vezivnim molekulima poznatim u tehnici, koji prepoznaju CD3 epitope koji zavise od konteksta. Posebno, pošto je redistribucija T ćelija tokom početne faze lečenja sa CD3 vezivnim molekulima glavni faktor rizika za štetne pojave CNS, CD3 vezivni molekuli pronalaska prepoznavanjem pre nazvisnog od konteksta nego zavisnog od konteksta CD3 epitopa imaju suštinsku bezbedonosnu prednost u odnosu na CD3 vezivne molekule poznate u tehnici. Pacijenti sa takvim CNS štetnim pojavama povezanim sa redestribucijom T ćelija tokom početne faze lečenja sa konvencionalnim CD3 vezivnim molekulima pate od konfuzije i dezorijentacije, u nekim slučajevima od urinarne inkontinencije. Konfuzija je promena u mentalnom statusu u kome pacijent nije sposoban da misli na svom uobičajenom nivou jasnoće. Pacijent obično ima teškoće da se koncentriše i njegovo razmišljanje nije samo zamagljeno i nejasno, već često značajno usporeno. Pacijenti sa štetnim pojavama CNS povezanim sa redestribucijom T ćelija tokom početne faze lečenja sa konvencionalnim CD3 vezivnim molekulima mogu takođe da pate od gubitka memorije. Često, konfuzija dovodi do gubitka sposobnosti prepoznavanja ljudi i/ili mesta, ili navođenja vremena ili datuma.. Osećaji dezorijentacije su uobičajeni kod konfuzija, i sposobnost donošenja odluka je pogoršana. Štetne pojave CNS povezane sa redestribucijom T ćelija tokom početne faze lečenja sa konvencionalnim CD3 vezivnim molekulima mogu dodatno da sadrže nejasan govor i/ili teškoće nalaženja reći. Ovaj poremećaj može da pogorša i izražavanje i razumevanje jezika, kao i čitanje i pisanje. Osim urinarne inkontinencije, vrtoglavica i nesvestica takođe mogu da prate štetne pojave CNS povezane sa redestribucijom T ćelija tokom početne faze lečenja sa konvencionalnim CD3 vezivnim molekulima kod nekih pacijenata

[0016]Održavanje trodimenzionalne strukture unutar pomenutog fragmenta N-terminalnog polipeptida 27 aminokiselina CD3 epsilon može se upotrebiti za stvaranje vezivnih domena, prvenstveno humanih, koji se vezuju za fragment N-terminog polipeptida CD3 epsilonin vitroi za nativnu (CD3 epsilon podjedinicu) CD3 kompleksa naT ćelijamain vivosa istim afinitetpm vezivanja. Ovi podaci jasno ukazuju da N-terminalni fragment, kako je ovde opisan, gradi tercijarnu konformaciju, koja je slična strukturi koja normalno postojiin vivo.Izveden je vrlo osetljiv test za važnost strukturnog integriteta aminokiselina 1-27 fragmenta N-terminalog polipeptida CD3 epsilon. Individualne aminokiseline aminokiselina 1-27 N-terminalnog fragmenta polipeptida CD3 epsilon su izmenjene u alanin (skeniranje alanina) da bi se testirala osetljivost aminokiselina 1-27 N-terminalnog polipeptidnog fragmenta CD3 epsilon na manje prekide. Molekuli CD3 specifičnog antitela kao deo bispecifičnog vezivnog molekula pronalaska upotrebljeni su za testiranje vezivanja za alaninskemutante aminokiselina 1-27 N-terminalnog polipeptidnog fragmenta CD3 epsilon (vidi priloženi Primer 5). Individualne izmene prvih pet ostataka aminokiselina na samom N-terminalnom kraju fragmenta i dve aminokiseline na položajima 23 i 25 aminokiselinas 1-27 N-terminalnog polipeptidnog fragmenta CD3 epsilon su bile kritične za vezivanje molekula antitela. Supstitucija aminokiselinskih ostataka u oblasti položaja 1-5 koji sadrže ostatke Q (glutamin na položaju 1), D (aspartična kiselina na položaju 2), G (glicin na položaju 3), N (asparagin na položaju 4), i E (glutamnska kiselina na položaju 5) do alanina poništila je vezivanje, prvenstveno humanih, vezivnih molekula pronalaska za pomenuti fragment. Tako, bar za neko vreme, prvenstveno humani, vezivni molekuli pronalaska, dva ostatka aminokiseline na C-terminusu pomenutog fragmenta (treonin na položaju 23) i izoleucin na položaju 25) redukovala su energiju vezivanja za, prvenstveno humane, vezivne molekule pronalaska.

[0017]Neočekivano, nađeno je da tako izolovani, prvenstveno humani, vezivni molekuli ne samo da prepoznaju humani N-terminalni fragment CD3 epsilon, već takođe i odgovarajuće homologne fragmente CD3 epsilon raznih primata, uključujući majmune Novog sveta

(Marmozet, Callithrix jacchus; Saguinus oedipus; Saimiri sciureus) i majmune Starog sveta (Macaca fascicularis, takođe poznat kao Cinomolgus majmun, ili Macaca mulatta, takođe poznat kao Rhesus majmun). Na taj način, detektovana je multi-primatna specifičnost CD3-vezivnih molekula. Analize sekvenci koje slede potvrdile su da čovek i primati dele niz visoko homolognih sekvenci na N-kraju ekstracelularnog domena CD3 epsilon.

[0018]U predmetnom pronalasku, kako je definisano u zahtevima, nađeno je da je moguće generisati, prvenstveno humane, vezivne molekule specifične za CD3 epsilon pri čemu identični molekul se može upotrebiti u prekliničkom testiranju na životinjama, kao i u kliničkim ispitivanjima, ili čak u terapiji kod ljudi.. Ovo je posledica neočekivane identifikacije, prvenstveno humanih, vezivnih molekula, koji, osim što se vezuju za humani CD3 epsilon (i zbog genetičke sličnosti verovatno i za parnjake šimpanze), takođe se vezuju za homologe navedenih antigena non-shimpanzee primata, uključujući majmune Novog sveta i majmune Starog sveta. Kako je pokazano u Primerima koji slede, pomenuti CD3 epsilon specifični, prvenstveno humani, vezivni molekuli mogu se integrisati u jednollančana bispecifična antitela da bi se generisala terapeutska sredstva protiv raznih oboljenja, uključujući, bez ograničenja, kancer i imunološke poremećaje. Na taj način, nestaje potreba da se izgradi surogat CD3 epsilon vezivnog domena ili bispecifično jednolančano antiteo, uključujući one za testiranje u filogenetski udaljenim (od ljudi) vrstama. Kao rezultat, taj isti molekul se može upotrebiti u prekliničkom testiranju na životinjama kao što je namenjem za primenu kod ljudi u kliničkom testiranju, kao i za dobijenja upotrebne dozvole koja sledi i za terapeutsku administraciju leka. Sposobnost da se upotrebi isti molekul za prekliničko testiranje na životinjama kao u kasnijoj primeni kod ljudi, praktično eliminiše, ili bar u velikoj meri smanjuje, opasnost da podaci dobijeni u prekliničkom testiranju na životinjama imaju ograničenu primenljivost na slučajeve kod ljudi..Ukratko, dobijanje prekliničkih podataka o bezbednosti kod životinja korišćenjem istog molekula kao što će stvarno biti primenjen kod ljudi, čini mnogo da se osigura primenljivost podataka na relevantni scenario kod ljudi. Nasuprot ovome, u konvencionalnom pristupu kad se koriste surogat molekuli, pomenuti surogat molekuli poraju biti podešeni za sistem testiranja na životinjama koji se koristi sa prekliničko ocenjivanje bezbednosti. Na taj način, molekul koji će se upotrebiti u terapiji kod ljudi razlikuje se u sekvenci i verovatno u strukturi od surogat molekula koji je upotrebljen u prekliničkoml testiranju, u farmkokinetičkim parametrima i/ili biološkoj aktivnosti; posledica toga je da podaci dobijeni u prekliničkom testiranju na životinjama imaju ograničeno primenljivost / prenosivost na slučaj kod. Upotreba surogat molekula zahteva konstrukciju, proizvodnju, prečišćavanje i karakterizaciju potpuno novog konstrukta. Ovo dovodi do dodatnih troškova razvoja i dodatnog vremena koje je potrebno da se dobije taj molekul. U globalu, surogati moraju biti razvijeni odvojeno, pored aktelnog leka koji će se koristiti u terapiji kod ljudi, tako da se moraju izvesti dve linije razvoja za dva molekula. Prema tome, glavna prednost ovde opisanog humanog vezivnog molekula ili konstrukta baziranog na antitelu koji pokazuje interspecijsku specifičnost je u tome da se identični molekul može upotrebiti za terapiju kod ljudi i prekliničkom testiranju na životinjama.

[0019]Poželjno je za polipeptid pronalaska da je prvi vezivni domen koji predstavlja antitelo sposobno da se veže za epitop CD3 epsilon lanca čoveka i primata osim šimpanze, humanog porekla.

[0020]Osim toga, usled humanog porekla vezivnih humanih molekula pronalaska, stvaranje imune reakcije prema navedenim vezivnim molekulima je isključeno u najvećoj mogućoj meri posle administracije vezivnih molekula ljudima.

[0021]Druga velika prednost, prvenstveno humanih, CD3 epsilon specifičnih humanih vezivnih molekula, kao dela bispecifičnih vezivnih molekula pronalaska, je što se mogu primeniti za prekliničko testiranje na različitim primatima. Ponašanje kandidata za lek kod životinja trebalo bi u idealnom slučaju da bude indikativno za očekivano ponašanje ovog leka pri administriranju ljudima. Kao rezultat, podaci dobijeni takvim prekliničkim testiranjem trebali bi, prema tome, da budu vrlo prediktivni za slučajeve kad su u pitanju ljudi. Međutim, kako je naučeno iz tragičnog ishoda nedavne Faze I kliničke probe na TGN1412 (CD28 monoklonalno antitelo), kandidat za lek može da deluje različito kod vrste primata nego kod ljudi. Dok u prekliničkom testiranju navedenog antitela nisu primećeni štetni efekti, ili su primećeni samo ograničeni štetni efekti, kod ispitivanja na životinjama izvedenim na cinomolgus majmunima, kod šest ljudi nastalo je oštećenje više organa pri administraciji navedenog antitela (Lancet 368 (2006), 2206-7). Rezultati ovi neželjenih negativnih pojava sugerišu da možda nije dovoljno ograničiti preklinička ispitivanja na samo jednu vrstu (primata). Činjenica da se CD3 epsilon specifični humani vezivni molekuli pronalaska vezuju za serije majmuna Novog i Starog sveta može da pomogne prevazilaženju problema sa kojima je suočeno u prethodno navedenom slučaju. Prema tome, predmetni pronalazak, kako je definisan u zahtevima, obezbeđuje načine i metode za minimiziranje razlika kod vrsta koje se javljaju kad se lekovi za humanu terapiju razvijaju i testiraju.

[0022]Sa prvenstveno humanim, interspecijski specifičnim CD3 epsilon vezivnim domenima kao delom bispecifičnih vezivnih molekula pronalaska, takođe nije više potrebno da se testovi na životinjama prilagode kandidatu za lek koji je namenjen administraciji kod ljudi, kao što je, npr. kreacija transgenskih životinja. CD3 epsilon specifični, prvenstveno humani, vezivni molekuli (ili bispecifična jednolančana antitela koji ih sadrže), koji ispoljavaju interspecijsku specifičnost prema korišćenju i metodama pronalaska mogu se direktno upotrebiti za prekliničko testiranje kod primata osim šimpanze, bez ikakve genetske manipulacije životinjama. Kako je dobro poznato prosečnom stručnjaku, pristupi u kojima je testirana životinja prilagođena kandidatu za lek uvek nosi rizik da su rezultati dobijeni u prekliničkom testiranju bezbednosti manje reprezantivni i prediktvini za ljude zbog modifikacije životinja. Na primer, kod transgenskih životinja, proteini kodirani transgenima su često prekomerno eksprimirani. Stoga, podaci dobijeni za biološku aktivnost antigena prema ovom proteinu antigena mogu biti ograničeni u njihovim prediktivnim vrednostima za ljude u kojima je protein eksprimiran na mnogo nižem, više fiziološkom nivou..

[0023]Dalja prednost upotrebe CD3 epsilon specifičnih, prvenstveno humanih, vezivnih molekula (ili bispecifičnih jednolančanih antitela koji ih sadrže) koji ispoljavaju interspecijsku specifičnost je činjenica da se šimpanze kao ugrožena vrsta izbegavaju za testiranje na životinjama. Šimpanze su najbliži srodnici ljudi i nedavno su grupisani u porodicu hominida na osnovu podataka sekvenci genoma (VVildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Prema tome, podaci dobijeni na šimpanzama smatraju se u opštem slučaju kao vrlo prediktivni za ljude. Međutim, usled njihovog statusa kao ugrožene vrste, broj šimpanzi koji se može upotrebiti za medicinske eksperimente je vrlo ograničen. Kako je ranije naznačeno, održavanje šimpanzi za testiranje na životinjama je takođe i skupo i etički problematično. Upotrebom CD3 epsilon specifičnih, prvenstveno humanih, vezivnih molekula (ili bispecifičnih jednostrukih lanaca antitela koji ih sadrže) izbegavaju se kako etički prigovori, tako i teret flnansijskog prekliničkog testiranja, a da se pritom ne prejudicira kvalitet, tj. primenljivost.podataka koji su dobijeni testiranjem na životinjama. U svetlu ovog, upotreba CD3 epsilon specifičnih, prvenstveno humanih, vezivnih molekula (ili bispecifičnih jednolančanih antitela koji ih sadrže) obezbeđuje razumnu alternativu za ispitivanja na šimpanzama.

[0024]Druga prednost CD3 epsilon specifičnih, prvenstveno humanih, vezivnih molekula (ili bispecifičnih jednolančanih antitela koji ih sadrže) je mogućnost vađenja više uzoraka krvi kad se koriste kao deo prekliničkog testiranja na životinjama, na primer, tokom farmakokinetičkih ispitivanja. Vađenje više uzoraka krvi je lakše kod primata koji nisu šimpanze nego kod nižih životinja, npr. miševa.. Vađenje višestrukih uzoraka krvi omogućava kontinualno testiranje parametara krvi za određivanje bioloških efekata izazvanih uvođenjem, prvenstveno humanih, vezivnih molekula (ili bispecifičnih jednolančanih antitela) pronalaska. Osim toga, vađenje višestrukih uzoraka krvi omogućava istraživaču da odredi farmakokinetički profil nprvenstveno humanih, vezivnih molekula (ili bispecifičnih jednolančanih antitela) kako su ovde definisani. Dalje, potencijalne nuspojave, koje mogu biti izazvane prvenstveno humanim, vezivnim molekulima (ili bispecifičnim jednolančanim antitelima), a koje se reflektuju u parametriima krvi mogu se meriti u različitim uzorcima krvi izvađenim tokom administracije navedenog antitela. Ovo omogućava određivanje profila potencijalne toksičnosti prvenstveno humanih, vezivnih molekula (ili bispecifičnih jednolančanih antitela) kako su ovde definisani.

[0025]Prednosti prvenstveno humanih, vezivnih molekula (ili bispecifičnih jednolančanih antitela) kako su ovde definisani, a koji ispoljavaju interspecijsku specifičnost može se ukratko sumirati na sledeći način: Prvo, prvenstveno humani, vezivni molekuli (ili bispecifična jednolančana antitela), kako su ovde definisani, upotrebljeni u prekliničkom testu su isti oni koji su upotrebljeni u terapiji kod ljudi. Stoga, nije više potrebno da se razviju dva nezavisna molekula, koja se mogu razlikovati u farmakokinetičkim osobinama i biološkoj akivnosti. To je vrlo velika prednost jer se, npr. farmakokinetički rezultati mogu direktnije preneti i primeniti na ljude nego što je to slučaj sa npr. konvencionalnim prilazom sa surogatom.

Drugo, upotreba prvenstveno humanih, vezivnih molekula (ili bispecifičnih jednolančanih antitela), kako su ovde definisani, za dobijanje terapeutika za ljude košta manje i zahteva manje napora nego kad je u pitanju surogat.

Treće, prvenstveno humani, vezivni molekuli (ili bispecifična jednolančana antitela), kako su ovde definisani, mogu se upotrebiti za prekliničko testiranje ne samo kod jedne vrste primata, već kod serije različitih vrsta primata, čime se ograničava rizik potencijalnih razlika između primata i Ijudia.

Četvrto, izbegnuta je upotreba šimpanzi kao ugrožene vrste za testiranje na životinjama.

Peto, moguće je vađenje više uzoraka krvi za ekstenzivna farmakokinetička ispitivanja.

Šesto, usled humanog porekla, prvenstveno humanih, vezivnih molekuli prema prioritetnoj realizaciji pronalaska, stvaranje imune reakcije prema navedenim vezivnim molekulima je minimizirano kad se aministriraju čoveku. Izazivanje imunog odgovora sa antitelima specifičnim za kandidata za lek izvedeno na vrstama koje nisu čovek, npr na mišu, što dovodi do razvoja humanih-anti-humanih antitela (HAMAs) prema terapeutskim molekulima mišjeg porekla, je isključeno.

[0026] Izraz "protein" je dobro poznat u tehnici i opisuje biološka jedinjenja. Proteini sadrže jedan ili više lanaca aminokiselina (polipeptidi), pri čemu su aminokiseline međusobno vezane peptidnom vezom. Izraz "polipeptid" kako je ovde korišćen, opisuje grupu molekula koji se sastoje od više od 30 aminokiselina. Prema pronalasku, grupa polipeptida sadrži "proteine" tako dugo dok se proteini sastoje od jednog polipeptida. Takođe saglasno definiciji izraz "polipeptid" opisuje fragmente proteina sve dok se ovi fragmenti sastoje od više od 30 aminokiselina. Polipeptidi mogu dalje da grade multimere kao što su dimeri, trimeri i viši oligomeri, tj. one koji se sastoje od više od jednog molekula polipeptida. Molekuli polipeptida koji grade takve dimere, trimere itd. mogu biti identični ili različiti. Odgovarajuće strukture višeg reda ovih multimera su, zbog toga, nazvane homo- ili heterodimeri, homo- ili heterotrimeri itd. Primer za heteromultimer je molekul antitela, koji se, u svom prirodnom obliku, sastoji od dva identična laka polipeptidna lanca i dva identična teška polipeptidna lanca. Izraz "polipeptid" i "protein" takođe se odnose na prirodno modifikovane polipeptide/proteine pri čemu je modifikacija izazvana npr. post-translacionim modifikacijama kao što su glikozilovanje, acetilovanje, fosforilovanje i slično. Takve modifikacie su dobro poznate u tehnici.

[0027]Kako je ovde korišćeno, "humani" and "čovek" odnosi se na vrstuHomo sapiens.Što se tiče medicinske upotrebe konstrukata koji su ovde opisani, pacijent čovek će se tretirati istim molekulom.

[0028]Izraz "humanog porekla" kako je korišćen u kontekstu sa molekulima pronalaska opisuje molekule koji se izvode iz biblioteka čoveka ili imaju strukturu/sekvencu koja odgovata humanom ekvivalentu. Prema tome, proteini koji imaju sekvencu aminokiseline koja odgovara analognoj sekvenci kod čoveka, npr fragment antitela koji ima sekvence aminokiseline u sklopu koji odgovara sekvenci zametka čoveka, smatra se kao molekul humanog porekla.

[0029]Kako je ovde koriščeno, "primat osim šimpanze" (engl. "non-chimpanzee primate" ili "non-chimp primate" ili njihove gramatičke varijante) odnose se na bilo koji primat koji nije šimpanza, tj. životinje koje ne pripadaju genusuPan,i uključuju vrstePan paniscus i Pan troglodytes,takođe poznate kaoAnthropopithecus troglodytesiliSimia satyrus."Primat", "vrste primata", "primati" ili njihove gramatičke vatijante označavaju red placentalnih sisara koji su podeljeni u dva podreda prosimijana i antropoida i sadrže čoveka, čovekolike majmune, majmune i lemure. Posebno, izraz "primati", kako je ovde korišćen, sadrži podredStrepsirrhini(ne-tarsijerni prosimijani), uključujući podredLemuriformes(koji uključuje nadporodice Cheirogoleidae iLemuroidge),podredChiromyiformes(koji uključuje porodicuDaubentoniidae)i podredLorisiformes(koji uključuje porodiceLorisidaeiGalagidae)."Primati",kako su ovde korišćeni, takođe sadrže podredHaplorrhini,uključujući podredTarsiiformes(koji uključuje porodicuTarsiidae),podredSimiiformes(koji uključujePlatyrrhini,ili majmune Novog sveta, iCatarrhini,uključujućiCercopithecidae,ili majmune Starog sveta).

[0030]Vrste koje nisu šimpanze mogu se razumeti unutar značenja pronalaska kao lemur, tarzijer, gibon, marmozet (koji pripada majmunima Novog sveta porodiceCebidae)ili majmun Starog sveta (koji pripada nadporodiciCercopithecoidea).

[0031]Kako je ovde korišćeno "majmun starog sveta, (uskonosi majmun)" obuhvata bilo kog majmuna iz nadporodiceCercopithecoidea,koja je sama podeljena u porodice:Cercopithecinae,koje su uglavnom afričke ali uključuju razne vrste makakija koji su azijski i severno-afrički, iColobinae,koji obuhvataju azijske rodove ali takođe i afričke colobus majmune.

[0032]Posebno iz nadporodiceCercopithecinae,pogodni primat koji nije šimpanza može biti iz plemenaCercopithecini,iz rodaAllenopithecus(Allen-ov močvarni majmun,Allenopithecus nigroviridis) ;iz rodaMiopithecus(angoliski talapoin,Miopithecus talapoin;gabonski talapoin,Miopithecus ogouensis) ;iz rodaErythrocebus(Patas majmun,Erythrocebus patas) ;iz rodaChlorocebus(zeleni majmun,Chlorocebus sabaceus;grivet,Chlorocebus aethiops;majmun veverica sa Bale planina,Chlorocebus djamdjamensis;tantalus majmun,Chlorocebus tantalus;veverica majmun,Chlorocebus pygerythrus;malbruk,Chlorocebus cinosuros) ;ili iz rodaCercopithecus(drijas majmun ili salongo majmun,Cercopithecus dryas;diana majmun,Cercopithecus diana;roloway majmun,Cercopithecus roloway,veći belonosi majmun,Cercopithecus nictitans;plavi majmun,Cercopithecus mitis;srebrni majmun,Cercopithecus doggetti;zlatni majmun,Cercopithecus kandti;Sykes majmun,Cercopithecus albogularis;Mona majmun,Cercopithecus mona;Campbell-ov mona majmun,Cercopithecus campbelli;Lowe-ov mona majmun,Cercopithecus lowei;ćubasti mona majmun,Cercopithecus pogonias;Wolf-ov mona majmun,Cercopithecus vvolfi;Dent-ov mona majmun,Cercopithecus denti;manji belonosi majmun,Cercopithecus petaurista;belogrli gvenon,Cercopithecus erythrogaster,Sclater-ov gvenon,Cercopithecus sclateri;crvenouhi gvenon,Cercopithecus erythrotis;brkati gvenon,Cercopithecus cephus;crvenorepi majmun,Cercopithecus ascanius;L'Hoest-ov majmun,Cercopithecus Ihoesti;Preuss-ov majmun,Cercopithecus preussi;sunčanorepi majmun,Cercopithecus solatus;Hamlyn-ov majmun ili majmun sovljeg lica,Cercopithecus hamlyni;De Brazza majmun,Cercopithecus neglectus).

[0033]Alternativno, pogodni primati koji nisu šimpanze, takođe iz nadporodiceCercopithecinaeali iz plemenaPapionini,mogu biti iz rodaMacaca(Barbarski makaki,Macaca sylvanus;makaki lavljeg repa,Macaca silenus;južni svinjorepi makaki ili Beruk,Macaca nemestrina;severni svinjorepi makaki,Macaca leonina;pagajski makaki ili Bokkoi,Macaca pagensis;siberutski makaki,Macaca siberu;crni makaki,Macaca maura;čizmasti makaki Macaque,Macaca ochreata;tonkeanski makaki,Macaca tonkeana;Hekov makaki,Macaca hecki;Gorontalo makaki,Macaca nigriscens;celebeski krestastii makaki ili crni "čovekoliki majmun".Macaca nigra;cinomolgus majmun makaki rakojed ili dugorepi makaki ili kera,Macaca fascicularis;kratkorepi makaki ili medveđi makaki,Macaca arctoides;rezus makaki,Macaca mulatta;tajvanski makaki,Macaca cyclopis;japanski makaki,Macaca fuscata;šrilankanski makaki,Macaca sinica;indijski makaki,Macaca radiata;barbarskiv makaki,Macaca sylvanus;asanski makaki,Macaca assamensis;tibetanski makaki ili Milne-Edwardsov makaki,Macaca thibetana;arunačalski makaki ili munzala,Macaca munzala) ;iz rodaLophocebus(sivolici mangabi,

Lophocebus albigena; Lophocebus albigena albigena; Lophocebus albigena osmani;

Lophocebus albigena johnstoni;crnokresti mangabi,Lophocebus aterrimus;Opdenbosch-ov mangabi,Lophocebus opdenboschi; Lophocebus kipunji) ;iz rodaPapio(grivasti pavijan,Papio hamadryas;gvinejski pavijan,Papio papio;maslinasti pavijan,Papio anubis;žuti pavijan,Papio cinocephalus;medveđi pavijan,Papio ursinus) ;iz rodaTheropithecus(Gelada pavijan,Theropithecus gelada) ;iz rodaCercocebus(čađavi mangabi,Cercocebus atys; Cercocebus atys atys; Cercocebus. atys lunulatus;belovrati mangabi,Cercocebus torquatus;Agile mangabi,Cercocebus agilis;zlatogrudi mangabi,Cercocebus chrysogaster,tanski mangabi,Cercocebus galeritus;sanješki mangabi,Cercocebus sanjei) ;ili iz rodaMandrillus(mandrili,Mandrillus sphinx;drili,Mandrillus leucophaeus).

[0034]Najpoželjniji suMacaca fascicularis(takođe poznati kao cinomolgus majmun i, prema tome, u Primerima nazvan "cinomolgus") iMacaca mulatta(rezus majmun, nazvan "rezus").

[0035]Iz nadporodiceColobinae,pogodni primat osim šompanze može biti iz afričke grupe, iz rodaColobus(crni kolubus,Colobus satanas;angolski kolobus,Colobus angolensis;kraljevski kolobus,Colobus polykomos;medveđi kolobus,Colobus vellerosus;severni crni.beli gvereza,Colobus guereza) ;iz rodaPiliocolobus(zapadni crveni kolobus,Piliocolobus badius;

Piliocolobus badius badius; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius vvaldronae;

Pennant's Colobus,Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii pennantii; Piliocolobus pennantii epieni; Piliocolobus pennantii bouvieri;Preuss-ov crveni kolobus,Piliocolobus preussi;Thollon-ov crveni kolobus,Piliocolobus tholioni,centralnoafrički crveni kolobus,Piliocolobus

foai; Piliocolobus foai foai; Piliocolobus foai elliott, Piliocolobus foai oustaleti; Piliocolobus foai

semlikiensis; Piliocolobus foai parmentierorum;ugandski crveni kolobus,Piliocolobus tephrosceles;uzungvanski crveni kolobus,Piliocolobus gordonorum;zanzibarski crveni kolobus,Piliocolobus kirkii;tanski crveni kolobus,Piliocolobus rufomitratus) ;ili iz rodaProcolobus(maslinasti kolobus,Procolobus verus).Iz nadporodiceColobinae,pogodni primati koji nisu

šimpanze mogu alternativno biti iz grupe Langur( engl. leaf majmun),iz rodaSemnopithecus(nepalski sivi langur,Semnopithecus schistaceus;kašmirski sivi langur,Semnopithecus ajax;Tarajev sivi langur,Semnopithecus hector,Hanumanov langur,Semnopithecus entellus;crnonogi sivi langur,Semnopithecus hypoleucos;sivi langur Južnih ravnica,Semnopithecus dussumieri;čupavi sivi langur,Semnopithecus priam) ;izT. vetulusgrupe ili rodaTrachypithecus(Ijubičastolici langur,Trachypithecus vetulus;Nilgiri langur,Trachypithecus johnh) ;izT. cristatusgrupe rodaTrachypithecus(javanski lutung,Trachypithecus auratus;srebrnastiLeaf majmunili srebrnasti lutung,Trachypithecus cristatus;Indokineski lutung,Trachypithecus germaini;Tenasserim lutung,Trachypithecus barbel) ;iz7. obscurusgrupe roda

Trachypithecus ( engl. Dusky Leafmajmuniliengl. SpectacIed Leaf'majmun, Trachypithecus

obscurus;Phayre-ov Leaf Majmun,Trachypithecus phayrei) ;izT. pileatusgrupe rodaTrachypithecus(Capped langur,Trachypithecus pileatus;Shortridge-ov langur,Trachypithecus shortridgei;Gee-ov zlatni langur,Trachypithecus gee,) ;iz grupeT. francoisi roda Trachypithecus(Francois-ov langur,Trachypithecus francoisi;Hatinh langur,Trachypithecus hatinhensis;beloglavi langur,Trachypithecus potiocephalus;laoski langur,Trachypithecus laotum;Delacour-ov langur,Trachypithecus delacouri;indokineski crni langur,Trachypithecus ebenus) ;ili iz rodaPresbytis(sumatranski surili,Presbytis melalophos;Banded surili,Presbytis femoralis;saravaški surili,Presbytis chrysomelas;VVhite-thighed Surili,Presbytis siamensis;VVhite-fronted Surili,Presbytis frontata;javanski surili,Presbytis comata;Thomas-ov langur,Presbytis thomasi;Hose-ov langur,Presbytis hosei;Maroon Leaf majmun,Presbytis rubicunda;Mentavvai Langur ili joja,Presbytis potenziani;Natuna Island surili,Presbytis natunae).

[0036]Iz nadfamilijeColobinae,pogodni primat osim šimpanze može biti alternativno iz grupe majmuna specifičnih noseva, iz rodaPygathrix(Red-shanked Douc,Pygathrix nemaeus;Black-shanked Douc,Pygathrix nigripes;Gray-shanked Douc,Pygathrix cinerea) ;iz rodaRhinopithecus(zlatni kratkonosi majmun,Rhinopithecus roxellana;eri kratkonosi majmun,Rhinopithecus bieti;sivi kratkonosi majmun,Rhinopithecus brelicht,tonkinški kratkonosi langur,Rhinopithecus avunculus) ;iz rodaNašališ(Proboscis Majmun,Našališ larvatus) ;ili iz rodaSimias(svinjorepi langur,Simias concolor).

[0037]Kako je ovde korišćeno, izraz "marmozet" označava bilo koje majmune Novog sveta (širokonose majmune) rodasCallithrix,na primer one koji pripadaju atlantskim marmozetima podrodaCallithrix(sic!) (obični marmozet,Callithrix ( Callithrix) jacehus;crni vunasti marmozet,Callithrix ( Callithrix) penicillata;Wied-ov marmozet,Callithrix ( Callithrix) kuhlii;beloglavi marmozet,Callithrix ( Callithrix) geoffroyi; engl. Buffy- headedmarmozet,Callithrix ( Callithrix) flaviceps; engl. Buffy- tufted Marmozet, Callithrix ( Callithrix) aurita) ;oni koji pripadaju amazonskim marmozetima iz reda (Rio Acari Marmozet,Callithrix ( Mico) acariensis;Manicore Marmozet,Callithrix ( Mico) manicorensis;srebrnasti marmozet,Callithrix ( Mico) argentata;beli marmozet,Callithrix ( Mico) leucippe;Emilijin marmozet,Callithrix ( Mico) emiliae;crnoglavi marmozet,Callithrix ( Mico) nigriceps;Marca-ov marmozet,Callithrix ( Mico) marcai;crnorepi marmozet,Callithrix ( Mico) melanura;Santarem marmozet,Callithrix ( Mico) humeralifera;Maues Marmozet,Caliithrix ( Mico) mauesi;zlatni-beli marmozet,Callithrix ( Mico) chrysoleuca;Hershkovitzev marmozet,Callithrix ( Mico) intermedia;Satere marmozet,Callithrix ( Mico) sateret) ;Roosmalen-ov patuljasti marmozet koji pripada podredu Callibella( Callithrix ( Callibelia) humilis) ; ilipigmejski marmozet koji pripada podredu. Cebuella( Callithrix ( Cebuella) pygmaea).

[0038]Drugi rodovi majmuna Novog sveta sadrže tamarine rodaSaguinus(koji sadrže S.oedipus- grupu, S. midas grupu,S.nighcollis grupu,S.mystax grupu,S.bicolor grupui S.inustus grupu)i veveričasti majmuni roda Saimiri (npr.Saimiri sciureus, Saimiri oerstedii, Saimiri

ustus, Saimiri boliviensis, Saimiri vanzolini)

[0039]Izraz "vezivni domen" karakteriše u vezi sa predmetnim pronalaskom domen polipeptida koji se specifično vezuje/intereaguje sa navedenom ciljnom strukturom/antigenom/epitopom. Tako, vezivni domen je "mesto interakcije antigena". Izraz "mesto interakcije antigena" definiše, u saglasnosti sa predmetnim pronalaskom, motiv polipeptida, koji je u stanju da specifično reaguje sa specifičngim antigenom ili specifičnom grupom antigena, npr. identičnim antigenom u različitim vrstama. Navedeno vezivanje/interakcija takođe definiše "specifično prepoznavanje". Izraz "specifično prepoznavanje" označava u skladu sa pronalaskom, da je molekul antitela u stanju da specifično interreaguje sa i/ili da se vezuje za najmanje dva, poželjno najmanje tri, još pošeljnije najmanje četiri, aminokiseline antigena, npr. CD3 antigena čoveka, kako je ovde definisano. Primer takvog vezivanja je specifičnost "princip brave i ključa". Tako, specifični motivi u sekvenci aminokiseline vezivnog domena i antigena vezuju se jedan za drugi kao rezultat njihove primarne, sekundarne ili tercijarne strukture, i kao rezultata sekundarnih modifikacija pomenute strukture. Specifična interakcija mesta interakcije antigena sa njegovim specifičnim antigenom može dovesti takođe do prostog vezivanja ovog mesta za antigen. Štaviše, specifična interakcija mesta interakcije antigena sa njegovim specifičnim antigenom može alternativelno dovesti do inicijacije signala, npr. usled izazivanja promene konformacije antigena, ogomerizacije antigena, itd. Poželjni primer vezivnog domena u skladu sa predmetnim pronalaskom je antitelo. Vezivni domen može biti monoklonalno ili poliklonalno antitelo ili izveden iz monoklonalnog ili poliklonalnog antiteka.

[0040]Izraz "antitelo" obuhvata derivate ili njegove funkcionalne fragmente koji još uvek zadržavaju specifičnost vezivanja. Tehnike za dobijanje antitela su dobro poznate u tehnici i opisane su, npr. u Harlow and Lane "Antitela, A Laboratorv Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 and Harlow and Lane "Using Antitela: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1999. Izraz "antitelo" takođe obuhvata imunogiobuline (ig's) različitih klasa (tj. IgA, IgG, IgM, IgD i IgE) i podklasa (kao što su lgG1, lgG2 etc). Ova antitela se mogu upotrebiti, npr. za imunoprecipitaciju, prečišćavanje afiniteta i imunolokalizaciju polipepdida ili fuzionih proteina pronalaska, kao i za praćenje prisustva i količine takvih polipeptida, na primer, u kulturama rekombinantnih prokariotskih ili eukariotskih ćelija organizama.

[0041]Definicija izraza "antitelo" takođe uključuje realizacije kao što su himerna, jednolančana anitela i humanizovana antitela, kao i fragmente antitela, kao što su, između ostalih, Fab fragmenti. Fragmenti antitela ili derivati dalje obuhvataju F(ab')2, Fv, scFv fragmente ili antitela jednog domena, antitela jednog varijabilnog domena ili imunoglobulin jednog varijabilnog domena koji sadrži samo jedan varijabilni domen, koji može biti VH ili VL, koji specifično vezuje antigen ili epitop nezavisno od drugih V regiona ili domena, videti npr. Harlow and Lane (1988) i

(1999), loc. cit. Takvi immunoglobulini jednog varijabilnog domena sadrže ne samo izolovani polipeptid antitela jednog varijabilnog domena, već takođe i veće polipeptide koji sadrže jedno ili više monomera antitela jednog varijabilnog domena sekvence polipeptida.

[0042]U tehnici su poznati različiti postupci i mogu se upotrebiti za dobijanje takvih antitela i/ili fragmenata. Tako, (antitelo) derivati se mogu dobiti na peptidomimetični način. Dalje, tehnike opisane za dobijanje jednolančanih antitela (videti, između ostalog, US Patent 4,946,778) mogu sa adaptirati za dobijanje jednolančanih antitela za izabrani polipeptid(e). Takođe, transgenske životinje se mogu upotrebiti da eksprimuju humanizirana antitela specifična za polipeptide i fuzione proteine ovog pronalaska. Za dobijanje monoklonalnih antitela, može se upotrebiti bilo koja tehnika koja obezbeđuje antitela dobijena kulturom kontinualne linije ćelija. Primeri takvih tehnika uključuju hibridoma tehniku (Kohler and Milstein Nature 256 (1975), 495-497), trioma tehniku, hibridoma tehniku humanih B-ćelija (Kozbor, Immunologv Today 4 (1983), 72) i EBV-hibridoma tehniku za dobijanje humanih monoklonalnih antitela (Cole et al., Monoclonal Antitela and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77 - 96). Merenje rezonance površinskih plazmona kako se koristi u BlAcore sistemu može se upotrebiti da se poveća efikasnost fag antitela koji se vezuju za epitope ciljnog poliypeptida, kao što je CD3 epsilon (Schier, Human Antitela Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Takođe je predviđeno u kontekstu ovog pronalaska, da izraz "antitelo" obuhvata konstrukte antitela, koji se mogu eksprimovati u domaćinu kao što je definisano u tekstu koji sledi, npr. konstrukti antitela koji se mogu transfektovati i/ili transdukovati preko, između ostalog, virusa ili vektora plazmida.

[0043]Izraz "specifična interakcija", kako je ovde upotrebljen u saglasnosti sa predmetnim pronalaskom, označava da vezivni (domen) molekul ne reguje ili ne reaguje značajno unakrsno sa polipeptidima koji imaju sličnu strukturu kao što su oni vezani za vezivni molekul, i koji mogu biti eksprimirani istim ćelijama kao polipeptid od interesa. Unakrsna reaktivnost panela vezivnih molekula koji se ispituju može se testirati, na primer, ispitivanjem vezivanja pomenutog panela vezivnih molekula pod konvencionalnim uslovima (videt, npr., Harlovv and Lane, Antitela: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1988 i Using Antitela: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1999). Primeri specifične interakcije vezivnog domena sa specifičnim antigenom obuhvataju specifičnost liganda za njegov receptor. Navedena definicija naročito obuhvata interakciju liganada, koji indukuju signal posle vezivanja za njegov specifični receptor. Primer ove interakcije, koja je naročito obuhvaćena pomenutom definicijom, je interakcija antigenske determinante (epitopa) sa vezivnim domenom (mesto antigenskog vezivanja) antitela.

[0044]Izraz "interspecijska specifičnost (engl. cross-specijski specificitv)" ili "međuvrsna specifičnost (engl. interspecijski specificitv)" kako je ovde korišćen označava vezivanje ovde opisanog vezivnog domena za isti ciljni molekul kod čoveka i primata osim šimpanze. Tako, "interspecijsku specifičnost" ili "međuvrsnu specifičnost" treba razumeti kao interspecijsku reaktivnost za isti molekul X eksprimiran u različitim vrstama, ali ne za molekul koji nije X. Interspecijska specifičnost monoklonalnog antitela koje prepoznaje npr. CD3 epsilon čoveka, i CD3 epsilon primata osim šimpanze, npr. CD3 epsilon makakija, može se odrediti, na primer FACS analizom. FACS analiza je izvedena na način da je odgovarajuće monoklonalno antitelo testirano na vezivanje za humane ćelije i ćelije primata osim šimpanze, npr. ćelije makakija, koje eksprimiraju pomenute CD3 epsilon antigene čoveka i primata osim šimpanze. Odgovarajuća proba je prikazana u primerima koji slede.

[0045]Kako je ovde korišćeno, CD3 epsilon označava molekul koji je eksprimiran kao deo receptora T ćelija i ima značenje kakvo mu je obično pripisano u tehnici. Kod ljudi, on obuhvata u pojedinačnom ili nezavisno kombinovanom obliku sve poznate CD3 podjedinices, na primer CD3 epsilon, CD3 delta, CD3 gama, CD3 zeta, CD3 alfa i CD3 beta. CD3 antigeni primata osim šimpanze kako je ovde navedeno su, na primer,Macaca fascicularisCD3 iMacaca mulattaCD3. KodMacaca fascicularis,on obuhvata CD3 epsilon FN-18 negativni i CD3 epsilon FN-18 pozitivni, CD3 gama i CD3 delta. KodMacaca mulatta,on obuhvata CD3 epsilon, CD3 gama i CD3 delta. Poželjno, navedeni CD3 kako je ovde korišćen, je CD3 epsilon.

[0046]Humani CD3 epsilon ja naveden u GenBank Accession No.NM_000733 i obuhvata SEQ ID BR. 1. The humani CD3 gama je naznačen u GenBank Accession NO. NM_000073. Human CD3 delta je naveden u GenBank Accession No. NM_000732.

[0047]CD3 epsilon "FN-18 negativni"Macaca fascicularis- a(tj. CD3 epsilon koje ne prepoznaje monoklonalno antitelo FN-18 zbog polimorfizma kako je ranije pomenuto) je naveden u GenBank Accession No. AB073994.

[0048]CD3 epsilon "FN-18 pozitivni"Macaca fascicularis- a(tj. CD3 epsilon koje prepoznaje monoklonalno antitelo FN-18) je naveden u GenBank Accession No. AB073993. CD3 gamaMacaca fascicularis- aje naveden GenBank Accession No. AB073992. CD3 deltaMacaca fascicularis-a je naveden GenBank Accession No. AB073991.

[0049]Sekvence nukleinskih kiselina i sekvence aminokiselina odgovarajućih CD3 epsilon, gama i delta homologaMacaca mulattamogu se identifikovati i izolovati rekombinantnim tehnikama koje su opisane u literaturi (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual; Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 3 rd edition 2001). Ovo se primenjujemutatis mutandisna CD3 epsilon, gama i delta homologe drugih primata osim šimpanze kako je ovde definisano. Identifikacija sekvence amino kiseline kodCallithrix jacchus, Saimiri sciureusiSaguinus oedipus\ eopisana u priloženim primerima. Sekvenca aminokiseline ekstracelularnog domena CD3 epsilon kodCallithrix jacchus jeopisana u SEQ ID NO: 3, ona kodSaguinus oedipus jeopisana u SEQ ID NO: 5 i ona kodSaimiri sciureus jeopisana u SEQ ID NO: 7.

[0050]U saglasnosti sa već navedenim, izraz "epitop" definiše antigensku determinantu, koja je specifično vezana/identifikovana vezivnim molekulom kao što je ranije definisano. Vezivni domeni ili molekuli mogu se specifično vezati ili reagovati sa konformacionim ili kontinualnim epitopima, koji su jedinstveni za ciljnu strukuturu, npr. CD3 epsilon lanac čoveka i primata osim šimpanze. Konformacioni ili diskontinualni epitop se karakteriše za polipeptide antigena prisustvom dva ili više odvojenih ostataka aminokiselina koji su razdvojeni u primarnoj sekvenci, ali dolaze zajedno na površinu molekula kad se polipeptid savija u nativni protein/antigen (Sela,

(1969) Science 166, 1365 and Laver, (1990) Cell 61, 553 - 6). Dva ili više odvojenih ostataka aminokiselina koji imaju udela u epitopu prisutni su na odvojenim sekcijama jednog ili više polipeptidnih lanaca. Ovi ostaci dolaze zajedno na površinu molekula kad se polipeptidni lanac (lanci) savija(ju) u trodimenzionalnu strukturu da bi stvorili epitop. Nasuprot ovome, kontinualni ili linearni epitop se saastoji od dva ili više odvojenih ostataka aminokiselina, koji su prisutni u jednom linearnom segmentu polipeptidnog lanca. U okviru predmetnog pronalaska CD3 epitop "koji ne zavisi od konteksta" odnosi se na konformaciju pomenutog epitopa. Takav epitop, koji ne zavisi od konteksta, lokalizovan na CD3 epsilon lancu, može razviti svoju korektnu konformaciju samo ako je ugrađen unutar ostatka epsilon lanca i držan u pravom položaju heterodimerizacijom epsilon lanca ili sa CD3 gama ili sa delta lancem. Nasuprot ovome, ovde obezbeđeni CD3 epitop kojji ne zavisi od konteksta odnosi se na N-terminalni ostatak 1-27 aminokiselina polipeptida ili njegov funkcionalni fragment CD3 epsilon. Ovaj N-terminalni ostatak 1-27 aminokiselina polipeptida ili njegov funkcionalni fragment održava integritet svoje trodimenzionalne i ispravne konformacije kad se odvoji od svog nativnog okruženja u CD3 kompleksu. Nezavisnos od konteksta N-terminalnog ostatka 1-27 aminokiselina polipeptida ili njegovog funkcionalnog fragmenta, koji je deo ekstracelularnog domena CD3 epsilon, predstavlja, tako, epitop koji je potpuno različit od epitopa CD3 epsilon opisanog u vezi sa metodom za dobijanje humanih vezivnih molekula u WO 2004/106380. Kod upotrebe navedene metode, je isključivo rekombinantni CD3 epsilon. Konformacija ovog eksprimiranog rekombinantog CD3 epsilon razlikovala se od one koju ima u njegovom nativnom obliku, to jest, u obliku u kome CD3-epsilon podejedinica TCR/CD3 kompleksa postoji kao deo nekovalentnoig kompleksa ili sa CD3-delta ili sa CD3-gama podjedinicom TCR/CD3 kompleksa. Kada je takav eksprimirani rekombinantni protein CD3-epsilon upotrebljen kao antigen za izbor antitela iz biblioteke antitela, antitela specifična za ovaj antigen su identifikovana u biblioteci, mada takva bibilioteka ne sadrži antitela specifična za autoantigene. Ovo je posledica činjenice da isključivo eksprimirani rekombinantni CD3-epsilon protein ne postojiin vivo;on nije autoantigen. Zbog toga, subpopulacija B ćelija koja ekprimira antitela specifična za ovaj protein nije iscrpljenain vivo;biblioteka antitela napravljena od takvih B ćelija neće sadržati genetski materijal za antitela specifična za jedino eksprimirani rekombinantni CD3-epsilon protein.

[0051]Međutim, pošto N-terminalni ostatak 1-27 aminokiselina polipeptida ili njegov funkcionalni fragment je epitop, koji se savija u svoj prirodni oblik, vezivni domeni u saglasnosti sa predmetni pronalaskom ne mogu se identifikovati metodama baziranim na prilazu koji je opisan u WO 04/106380. Prema tome, testovima se mora verifikovati da vezivni molekuli kao što su oni opisani u WO 04/106380 nisu sposobni da se vežu za N-terminalne ostatke 1-27 aminokiselina CD3 epsilon lanca. Dakle, konvencionalni anti-CD3 vezivni molekuli ili molekuli anti-CD3 antitela (npr. kao što su opisani un WO 99/54440) vezuju CD3 epsilon lanac na položaju koji je više C-terminalno lociran nego N-terminalni ostatak 1-27 aminokiselina polipeptida kojji ne zavisi od konteksta ili njegov ovde obezbeđeni funkcionalni fragment. Odranije poznati molekuli antitela OKT3 i UCHT-1 takođe su specifični za epsilon-podjedinicu TCR/CD3 kompleksa između ostataka aminokiselina 35 do 85 i, prema tome, epitop ovih antitela je takođe više C-terminalno lociran. Osim roga, UCHT-1 se vezuje za CD3 epsilon lanac u regionu između ostataka aminokiselina 43 do 77 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546 - 50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675 - 7680; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047 - 52). Prema tome, ranije poznati anti-CD3 molekuli se ne vezuju za, i nisu usmereni prema ovde definisanom epitopu N-terminalnom ostatku 1-27 aminokiselina kojji ne zavisi od konteksta (ili njegovom funkcionalnom fragmentu).

[0052]Za stvaranje, prvenstveno humanog, vezivnog domena koji sadrži polipeptid pronalaska, npr. u bispecifičnom jednolančanom antitelu kako je ovde definisano, mogu se upotrebiti npr. monoklonalna antitela koja se vezuju kako za humani tako i za primata osim šimpanze CD3 epsilon (npr. makaki CD3 epsilon).

[0053]U poželjnoj realizaciji polipetida pronalaska, primat osim šimpanze je majmun Starog sveta. U još poželjnijoj realizaciji polipeptida, majmun Starog sveta je majmun iz roda Papio rod Macaca. Najpoželjnije, majmun roda makaki je asamski makaki( Macaca assamensis),barbarski makaki{ Macaca sylvanus) ;indijski makaki( Macaca radiata),čizmasti ili Sulavezi čizmasti makaki( Macaca ochreata),celebeski krestastii makaki( Macaca nigra),makaki planina Formoze( Macaca cyclopsis),japanski snežni makaki ili japanski makaki( Macaca fuscata),Cinomolgus majmun, makaki rakojed ili dugorepi makaki ili Java makaki( Macaca fascicularis),makaki lavljeg repa( Macaca silenus) ;svinjorepi makaki( Macaca nemestrina) ;rezus makaki,( Macaca mulatta),tibetanski makaki( Macaca thibetana),tonkeanski makaki( Macaca tonkeana),šrilanski makaki( Macaca sinica),kratkorepi makaki ili crvenolici ili medveđi makaki( Macaca arctoidesili crni makaki( Macaca maura).Najpoželjnije, majmun iz roda Papio genus je

Hamadryas Baboon, Papio hamadryas\Guinea Baboon, Papio papio; Olive Baboon, Papio

anubis; Yellow Baboon, Papio cinocephalus; Chacma Baboon, Papio ursinus.

[0054]U jednoj alternativno poželjnoj realizaciji polipeptida pronalaska, primat osim šimpanze je majmun Novog sveta. U poželjnijoj realizaciji polipeptida, majmun Novog sveta je majmun iz roda Callithrix (marmozet), rod Saguinus ili rod Saimiri. Najprioritetnije, majmun Novog sveta iz roda Callithrix jeCallithrix jacchus,majmun iz roda Saguinus jeSaguinus oedipusi majmun iz roda Saimiri jeSaimiri sciureus.

[0055]Kako je ovde ranije definisano, popipeptid pronalaska se vezuje prvim vezivnim domenom za epitop CD3£(epsilon) lanca čoveka i primata osim šimpanze, pri čemu je epitop deo sekvence aminiokiselina sadržanoj u grupi koja se sastoji od ostataka 27 aminokiselina kako je navedeno u SEQ ID Br. 2, 4, 6, ili 8.

[0056]U saglasnosti sa predmetnim pronalaskom poželjno je za polipeptid pronalaska da je pomenuti epitop deo sekvence aminokiselina koja sadrži 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18,17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 aminokiselina.

[0057]Još poželjnije, pomenuti epitop sadrži sekvencu aminokiselina Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (Q-D-G-N-E-D).

[0058]U okviru predmetnog pronalaska, "funkcionalni fragment N-terminalnih ostataka 1-27 aminokiselina" označava da je pomenuti funkcionalni fragment još uvek epitop koji ne zavisi od konteksta, a koji održava integritet svoje trodimenzionalne strukture kad je izvan svog prirodnog okruženja u CD3 kompleksu (i spojen sa heterolognom sekvencom aminokiselina kao što je EpCAM ili deo imunoglobulina Fc, npr. kao što je prikazano u Primeru 3.1). Održavanje trodimenzionalne strukture unutar N-terminalnog polipeptida 27 aminokiselina ili njegov funkcionalni fragment CD3 epsilon može se upotrebiti za stvaranje vezivnih domena koji se vezuju za fragment N-terminalnog CD3 epsilon polipeptidain vitroi za prirodni (CD3 epsilon podjedinicu) CD3 kompleks za T ćelijein vivosa istim vezivnim afinitetom. U okviru predmetnog pronalaska, funkcionalni fragment N-terminalnih ostataka 1-27 aminokiselina označava da CD3 vezivni molekuli koji su ovde obezbeđeni mogu još uvek da se vežu za takve funkcionalne fragmente na način koji ne zavisi od kontteksta. Prosećni stručnjak je svestan metoda za mapiranje epitopa da bi se odredilo koje ostatke aminokiselina epitopa prepoznaju takvi anti-CD3 vezivni molekuli (npr. skeniranje alanina ilipep spotanaliza).

[0059]U poželjnoj realizaciji pronalaska, polipeptid pronalaska sadrži (prvit) vezivni domen kako je ovde definisan i drugi vezivni domen sposoban za vezivanje za antigen površine ćelije

.[0060]Izraz "antigen površine ćelije" kako je ovde korišćen označava molekul izložen na površini ćelije. U većini slučajeva, ovaj molekul će biti lociran u ili na plazma membrani ćelije tako da bar deo ovog molekula ostaje dostupan sa spoljne strane ćelije u tercijarnom obliku. Primer molekula površine ćelije, bez ograničenja, koji je lociran u plazma membrani je transmembranski protein, koji sadrži, u svojo tercijarnoj konformaciji, regione hidrofilnosti i hidrofobnosti. Ovde, najmanje jedan hidrofobni region omogućava molekulu površine ćelije da se ugradi, ili ubaci u hidrofobnu plazma membranu ćelije, dok se hidrofilni regioni pružaju na obe strane plazma membrane u citoplazmu i ekstracelularni prostor. Primeri, bez ograničenja, površine ćelie molekula koji su locirani na plazma membrani su proteini koji su modifikovani na ostatku cisteina da bi nosili palmitoil groupu, proteini modifikovani na C-terminalnom ostatku cisteina da bi nosili famesil grupu ili proteini koji su modifikovani na C-terminusu da bi nosili glikozil fosfatidil inozitol ("GPI") sidro. Ove grupe omogućavaju kovalentno pripajanje proteina za spoljnu površinu plazma membrane, gde ostaju dostupne za prepoznavanje ensktracelularnim molekulima kao što su antitela. Primeri antigena površine ćelije uključuju EGFR, EGFRvlll, , MCSP, karbonsku anhidrazu IX (CAIX), CD30, CD33, Her2/neu, IgE, CD44v6 i Muc-1. Osim toga, primeri odgovarajućih antitela površine ćelije sadrže antigene koji

su karakteristični za specifičnu bolest ili slabost, tj. kancer, autoimuna oboljenja ili infekciona oboljenja uključujući virusne infekcije. Shodno tome, izraz "antigen površine ćelije" eksplicitno obuhvata virusne proteine kao što su nativni, neprocesuirani virusni proteini koji se nalaze na površini inficirane ćelije (opisani između ostalog za proteinske omotače virusa hepatitisa B, C i HIV-1).

[0061]Jedna odbranbena funkcija citotoksičnih T ćelija je destrukcija virusom inficiranih ćelija, prema tome, jedinstvena osobina bispecifičnih vezivnih molekula pronalaska da aktiviraju i preusmere citotoksične T ćelija bez obzira na njihovu autohtonu specifičnost, ima veliki uticaj na široko polje hroničnih virusnih infekcija. Za većinu ovih slučajeva eliminacija stalno inficiranih ćelija je jedina šansa za lečenje. Trenutno, prilagodljive terapije T ćelijama su razvijene protiv hroničnih CMV i EBV infekcija (Roonev, C.M., et al., Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr-virus-related Ivmphoproliferation. Lancet, 1995. 345 (8941): p. 9-13; VValter, E.A., et al., Reconstitution of cellular immunity against cvtomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrovv by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med, 1995. 333(16): p. 1038-44).

[0062]Hronična infekcija hepatitisom B je očigledno jedna indikacija koja izaziva veliku pažnju. Širom sveta između 350 i 400 miliona ljudi inficirano je sa HBV. Sadašnje lečenje hroničnog HBV hepatitisa počiva na interferonu y i nukleozidnim ili nukleotidnim analozima, to je dugotrajna terapija sa znatnim nuspojavama kao što su izazivanje akutnog hepatitisa( engl. hepatitis flares),groznica, mialgija, trombocitopenija i depresija..Mada sada postoji više od 4 odobrena terapeutska režima, eliminacija virusa se retko postiže. Trajna inflamacija kod hroničnog hepatitisa B dovodi do ciroze jetre i hepatocelularnog karcinoma u više od 25% pacijenata. Štaviše, do 40 % pacijenata sa hroničnim hepatitisom će umreti od ozbiljnih komplikacija, što širom sveta čini broj od 0.6 do 1.0 milliona smrtnih slučajeva

[0063]HBV, prototip Hepadna virusa je omotani virus čiji je relaksirani cirkularni (rc) genom reversno transkribovan u RNKpregenom. Posle infekcije rc DNKje ubačen u nukleus hepatocita gde je kompletiran sa kovalentno zatvorenom cirkularnom DNK (cccDNK) koja sadrži 4 preklapajuća okvira čitanja. On služi kao transkripcioni templat za pregenomsku RNK i tri subgenomske RNK. RNK pregenom funkcioniše kao iRNK za premeštanje jezgra virusa i proteina polimeraze. Inficirane ćelije stvaraju kontinualno HBV površinski protein (HBsAg) od cccDNA čak i kad je replikacija HBV zaustavljena. HBsAg se sastoji od malih površinskih proteina (S) sa vrlo malim udelom srednjih i veliki (L) površinskih proteina. I HBV S i L targeted su ciljani na membrane endoplazmatičnog retikuluma (ER) iz koje su transportovani u membrane vezikule preko trans golgi organela do plazma membrane (Gorelick, F.S. and C. Shugrue, Exiting the endoplasmic reticulum. Mol Cell Endocrinol, 2001. 177 (1-2): p. 13 - 8). S i L proteini su permanentno eksprimirani na površini HBV replicirajućih hepatocita kako je nedavno pokazano (Chu, CM. and Y.F. Liaw, Membrane staining for hepatitis B surface antigen on hepatocvtes: a sensitive and specific marker of active viral replication in hepatitis B. J Clin Pathol, 1995. 48(5): p. 470 - 3).

[0064]Prototipi virusa koje izlažu omotači proteina na površini ćelije su virus hepatitisa B (HBV), virus hepatitisa C (HCV) i HIV-1. i oni globalno predstavljaju veliko breme bolesti. Za indikaciju HIV-1 virusa, nedavno je pokazano da T ćelije modifikovane himernim TCR sa konstruktom Fv antitela usmerenim na gp120 omotač proteina mogu da ubiju ciljne ćelije inficirane sa HIV-1 (Masiero, S., et al., T-cell engineering by a chimeric T-cell receptor with antitelo-type specificity for the HIV-1 gp120. Gene Ther, 2005.12 (4): p. 299 - 310). Od hepadna virusa, hepatitis virus B (HBV) eksprimira kompleks omotača proteina HBsAg koji se kontinualno stvara od epizomalne cccDNK čak i kad se replikacija HBV smiri.

[0065]Ekspresija nedirnutih S i L HBV proteina na površini ćelije čini ih dostupnim za antitela koja su zaštitni znak serokonverzije kad se pacijenti oporavljaju od akutne faze infekcije i kad se ona menja od cirkulišuće HBsAg do antiHBs. Ako serokonverzija ne nastane, do 30 % hepatocita nastavlja da eksprimira HBV S protein i posle vrlo aktivne i dugotrajne antivirusne terapije. Tako, osim T limfocita koji prepoznaju specifično intracelularno obrađene HBV peptide i predstavljene MHC molekulima na površini ćelije, angažovanje drugih oblika T ćelija je izvodljivo na netaknutoj površini proteina kao što su S i L antigeni dostupni na spoljnoj membrani ćelije. Uporebom fragmenta jednolančanog antitela koji prepoznaje male (S) i velike omotače (L) proteina virusa hepatitis B, stvoreni su veštački receptori T-ćelija koji omogućavaju usmeravanje graftovanih T-ćelija ka inficiranim hepatocitima i, posle aktivacije ovih T-čelija kontaktom sa antigenom, izdvajanje citokina i ubijanje inficiranih hepatocita.

[0066]Ograničenje ovog prilaza je, (i) da se T-čelijama treba da manipuliše in vitro, (ii) retrovirusi upotrebljeni za transfer receptora T-ćelija mogu da izazovu insercionu mutagenezu u T-ćelijama, i (iii) kad se jedanput izvrši transfer T-ćelija, citotoksični odgovor se ne može ograničiti..

[0067]Da bi se prevazišla ova ograničenja, bispecifični molekuli jednolančanih antitela koji sadrže prvi domen sa vezivanjem specifičnim za CD3 epsilon antigen čoveka i primata osim šimpanze (kako je ovde obezbeđeno u kontekstu ovog pronalaska), kao i drugi domen sa vezivanjem specifičnim za HBV ili HCV, omotači proteina inficiranih hepatocita mogu se generisati i spadaju u okvir ovog pronalaska. U okviru ovog pronalaska je takođe poželjno da se drugi vezivni domen vezuje za površinu antigena humanih ćelija i/ili njihove parnjake kod primata osim šimpanze, izabrane od EGFR, Her2/neu ili IgE.

[0068] Za stvaranje drugog vezujućeg domena polipeptida pronalaska, npr. bispecifičnog jednolančanog antitela, kako je ovde definisano, mogu se upotrebiti monoklonalna antitela koja se vezuju za antigene površine, kako humanih ćelija, tako i ćelija primata osim šimpanze. Pogodni vezivni domeni za bispecifični polipeptid kako je ovde definisano, može npr. biti izveden od interspecijski specifičnih monoklonalnih antitela rekombinantnim metodama opisanim u literaturi. Monoklonalno antitelo koje se vezuje za antigen površine humanih ćelija i za homolog navedenog antigena površine ćelije kod primata osim šimpanze može se testirati FACS probama kako je ranije navedeno. Prosečnom stručnjaku je jasno je da interspecijski specifična antitela mogu se takođe generisati hibridoma tehnikama opisanim u literaturi (Milstein and Kohler, Nature 256 (1975), 495 - 7). Na primer, miševi se mogu naizmenično imunizirati sa humanim i primata osim šimpanze CD33. Iz ovih miševa, izolovane su hibridoma ćelije koje proizvode interspecijski specifično antitelo tehnikom hibridoma i analizirane sa FACS kako je ranije navedeno. Stvaranje i analiza bispecifičnih polipeptida, kao što su bispecifična jednolančana antitela lanca koja ispoljavaju interspecijsku specifičnost, kako je ovde definisano, prokazani su u primerima koji slede. Prednosti bispecifičnih jednolančanih antitela koja ispoljavaju interspecijsku specifičnost obuhvataju niže pobrojane tačke..

[0069] Naročito je poželjno za polipeptid pronalaska da prvi vezivni domen koji je u stanju da se veže za epitop čoveka i primata osim šimpanze CD3e lanca sadrži VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabran od: 1. (a) CDR-L1 kako je naveden u SEQ ID BR. 27, CDR-L2 kako je naveden u SEQ ID BR. 28 i CDR-L3 kako je naveden u SEQ ID BR. 29; 2. (b) CDR-L1 kako je naveden u SEQ ID BR. 117, CDR-L2 kako je naveden u SEQ ID BR. 118 i CDR-L3 kako je naveden u SEQ ID BR. 119; i 3. (c) CDR-L1 kako je naveden u SEQ ID BR. 153, CDR-L2 kako jenaveden u SEQ ID BR. 154 i CDR-L3 kako je naveden u SEQ ID BR. 155.

[0070] U tehnici se smatra da varijabilni regioni, tj varijabilni laki lanac ("L" iz "VL") i varijabilni teški lanac ("H" iz "VH") obezbeđuju vezivne domene antitela. Prvi varijabilni regioni su utočište regiona koji određuju komplementarnost.

[0071] Izraz "regioni koji određuju komplementarnost (CDR) (od engl complementarv determining region)" je dobro poznat u tehnici i on diktira antigensku specifičnost antitela. Izraz "CDR-L" ili "L CDR" odnose se na CDRs u VL, dok se izraz "CDR-H" ili "H CDR" odnosi na CDRs u VH.

[0072]U alternativno poželjnoj realizaciji polipeptida pronalaska prvi vezivni domen sposoban za vezivanje za CD3e lanac čoveka i primata osim šimpanze sadrži VH region koji sadrži CDR-H 1, CDR-H2 i CDR-H3 izabran od: 1. (a) CDR-H 1 kako je naveden u SEQ ID BR. 12, CDR-H2 kako je naveden u SEQ ID BR. 13 and CDR-H3 kako je naveden u SEQ ID BR. 14; 2. (b) CDR-H 1 kako je naveden u SEQ ID BR. 30, CDR-H2 kako je naveden u SEQ ID BR. 31 and CDR-H3 kako je naveden u SEQ ID BR. 32; 3. (c) CDR-H 1 kako je naveden u SEQ ID BR. 48, CDR-H2 kako je naveden u SEQ ID BR. 49 and CDR-H3 kako je naveden u SEQ ID BR. 50; 4. (d) CDR-H 1 kako je naveden u SEQ ID BR. 66, CDR-H2 kako je naveden u SEQ ID BR. 67 and CDR-H3 kako je naveden u SEQ ID BR. 68; 5. (e) CDR-H 1 kako je naveden u SEQ ID BR. 84, CDR-H2 kako je naveden u SEQ ID BR. 85 and CDR-H3 kako je naveden u SEQ ID BR. 86; 6. (f) CDR-H 1 kako je naveden u SEQ ID BR. 102, CDR-H2 kako je naveden u SEQ ID BR. 103 i CDR-H3 kako je naveden u SEQ ID BR. 104; 7. (g) CDR-H 1 kako je naveden u SEQ ID BR. 120, CDR-H2 kako je naveden u SEQ ID BR. 121 i CDR-H3 kako je naveden u SEQ ID BR. 122; 8. (h) CDR-H 1 kako je naveden u SEQ ID BR. 138, CDR-H2 kako je naveden u SEQ ID BR. 139 i CDR-H3 kako je naveden u SEQ ID BR. 140; 9. (i) CDR-H 1 kako je naveden u SEQ ID BR. 156, CDR-H2 kako je naveden u SEQ ID BR. 157 i CDR-H3 kako je naveden u SEQ ID BR. 158; i 10. (j) CDR-H 1 kako je naveden u SEQ ID BR. 174, CDR-H2 kako je naveden u SEQ ID BR. 175 i CDR-H3 kako je naveden u SEQ IDBR.176.

[0073]Dalje je poželjno da prvi vezivni domen sposoban za vezivanje za epitop CD3e lanca čoveka i primata osim šimpanze sadrži VL region izabran iz grupe koja se sastoji od VL regiona kako je naveden u SEQ ID BR. 35, 39, 125, 129, 161 ili 165.

[0074]Alternativno je poželjno da prvi vezivni domen sposoban za vezivanje za epitop čoveka i primata osim šimpanze CD3e lanca sadrži VH region izabran iz grupe koja se sastoji od VH regiona kako je naveden u SEQ ID BR. 15,19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ili 181.

[0075] Još poželjnije, polipeptid pronalaska je okarakterisan prvim vezivnim domenom sposobnim za vezivanje za epitop CD3e lanca čoveka i primata osim šimpanze koji sadrži VL region i VH region izabran iz grupe koja se sastoji od: 1. (a) VL region kako je naveden u SEQ ID BR. 17 ili 21 i VH region kako je naveden u

SEO.IDBR. 15 ili 19;

2. (b) VL region kako je naveden u SEQ ID BR. 35 ili 39 i VH region kako je naveden u

SEQ ID BR. 33 ili 37;

3. (c) VL region kako je naveden u SEQ ID BR. 53 ili 57 i VH region kako je naveden u

SEQ ID BR. 51 ili 55;

4. (d) VL region kako je naveden u SEQ ID BR. 71 ili 75 i VH region kako je naveden u

SEQ ID BR. 69 ili 73;

5. (e) VL region kako je naveden u SEQ ID BR. 89 ili 93 i VH region kako je naveden u

SEOIDBR. 87 ili 91;

6. (f) VL region kako je naveden u SEQ ID BR. 107 ili 111 i VH region kako je naveden u

SEOIDBR. 105 ili 109;

7. (g) VL region kako je naveden u SEQ ID BR. 125 ili 129 i VH region kako je naveden u

SEQ ID BR. 123 ili 127;

8. (h) VL region kako je naveden u SEQ ID BR. 143 ili 147 i VH region kako je naveden u

SEOIDBR. 141 ili 145;

9. (i) VL region kako je naveden u SEQ ID BR. 161 ili 165 i VH region kako je naveden u

SEOIDBR. 159 ili 163; i

10. (j) VL region kako je naveden u SEQ ID BR. 179 ili 183 i VH region kako je naveden u SEOIDBR. 177 ili 181.

[0076] Prema poželjnoj realizaciji polipeptida pronalaska, parovi VH-regiona i VL-regiona su u formatu jednolančanog antitela (scFv). VH i VL regioni su razvrstani po redu VH-VL ili VL-VH. Poželjno je da je VH-region smešten N-terminalno prema spojnici sekvence. VL-region je smešten C-terminalno prema spojnici sekvence.

[0077] Poželjna realizacija prethodno opisanog polipeptida pronalaska je okarakterisana prvim vezivnim domenom sposobnim za vezivanje za epitop CD3e lanca čoveka i primata osim šimpanze koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz gtupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 23, 25, 41,43, 59,61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187.

[0078]Pronalazak se dalje odnosi na ranije opisani polipeptid, gde se drugi vezivni domen vezuje za antigen površine ćelije, koji je prvenstveno antigen tumora

[0079]Izraz" tumorski antigen " kako je ovde korišćen može se razumeti kao oni antigeni koji se javljaju na ćelijama tumora. Ovi antigeni se mogu javiti na površini ćelije ekstracelularnim delom koji je često kombinovan sa transmembranom i citoplazmičnim delom molekula. Ovi antigeni mogu nekad da se jave samo na ćelijama tumora i nikad na normalnim ćelijama. Tumorski antigeni mogu ekskluzivno biti eksprimirani na ćelijama tumora ili mogu da predstavljaju specifičnu mutaciju tumora u poređenju sa normalnim ćelijama. U ovom slučaju, oni se nazivaju antigeni specifični za tumor. Češći su antigeni koji su predstavljeni ćelijama tumora i normalnim ćelijama, i oni se nazivaju antigeni vezani za tumor. Ovi antigeni vezani za tumor mogu biti pretereno eksprimirani u poređenju sa normalnim ćelijama ili su dostupni za vezivanje antitela u ćelijama tumora usled manje kompaktne strukture tkiva tumora u poređenju sa normalnim tkivom. Neograničavajući primeri antigena tumora, kako su ovde korišćeni, su EGFR (Liu, Br. J. Cancer 82/12 (2000), 1991 -1999; Bonner, Semin. Radiat. Oncol. 12 (2002), 11-20; Kivota, Oncology 63/1 (2002), 92 - 98; Kuan, Brain Tumor Pathol. 17/2 (2000), 71 - 78),.

[0080]EGFR (takođe poznat kao c-erb1 ili HER1) pripada porodici erbB receptora tirozin kinaze. Kad se aktivira vezivanjem liganda iz EGF porodice faktora rasta, EGFR se homodimerizuje ili heterodimerizuje sa drugim EGFR ili sa drugim članom porodice erbB inicirajući signalizacionu kaskadu kroz mitogen-aktivirani protein kinaze i druge transkripcione faktore dovodeći do proliferacije, diferencijacije i obnove (Olayioye, EMBO J. 19 (2000), 3159 - 67). EGFR je prekomerno eksprimiran kod mnogih epitelijalnih kancera, uključujući kolorektalni, kancer, kancere dojke, pluća, glave i vrata (Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 21 (2003), 2787 - 99; Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 20 (18, Suppl.) (2002), 1S - 13S; Prewett, Clin. Cancer Res. 8

(2002), 994-1003). Prekomerna ekspresija i/ili mutacija EGFR-a u malignim ćelijama dovodi do konstitutivne aktivacije kinaze, kao rezultat ovoga javlja se proliferacija, angiogeneza, invazija, metastaza i inhibicija apoptoze (Mendelsohn (2003, loc. cit.; Ciardiello, Clin. Cancer Res. 7

(2001), 2958 - 70; Perez-Soler, Oncologist 9 (2004), 58 - 67). Monoklonalna antitela koja ciljaju ekstracelularni ligand vezivnog domena ili intracelularnu kaskadu signalizacije tirozin kinaze EGFR-a pokazala su efikasnost kao antitumorna meta (Laskin, Cancer Treat. Revievv 30

(2004), 1 - 17). Na primer, cetuximab (Erbitux) humanizovano monoklonalno antitelo za EGFR, koje kompetitivno inhibira ekstracelularni domen EGFR-a da bi inhbirao aktivaciju liganda receptora, odobrila je Food and Drug Administration (FDA) 2004. za lečenje metastatičnog kancera kolona u kombinaciji sa inhibitorom topoizomeraze irinotecanom.

[0081]U poželjnoj realizaciji pronalaska polipeptid je bispecifični molekul jednolančanog antitela. Ovde opisani problemi u vezi sa razvojem surogat molekula za preklinička ispitivanja su dodatno otežani ako je kandida za lek bispecifično antitelo, npr bispecifično jednolančano antitelo. Takvo biispecifično antitelo zahteva da su oba prepoznata antigena interspecijski specifična za navedenu vrstu životinje, da bi se omogućilo testiranje bezbednosti leka kod takvih životinja.

[0082]Kako je ovde ranije navedeno, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptide koji sadrže prvi vezivni domen koji je antitelo sposobno da se veže za epitop CD3e lanca čoveka i primata osim šimpanze i drugi vezivni domen sposoban za vezivanje za antigen površine ćelije izabran od EGFR, Her2/neu ili IgE, pri čemu se drugi vezivni domen poželjno vezuje takođe za antigen površine ćelije ljudi i primata osim šimpanze. Prednost bispecifičnog jednolančanog antitela kao kandidata za lek, koji ispunjava zahteve poželjnog polipetida pronalaska, je upotreba takvog molekula u prekliničkom testiranju na životinjama, kao i u kliničkim ispitivanjima i čak za terapiju kod ljudi..U poželjnoj realizaciji interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanog antitela pronalaska, drugi vezivni domen sposoban da se veže za antigen površine ćelije je humanog porekla. U interspecijski specifičnom bispecifičnom molekulu prema pronalasku, vezivni domen sposoban da se veže za epitop CD3 epsilon lanca čoveka i primata osim šimpanze je lociran po redu VH-VL ili VL-VH na N-terminusu ili C-terminusu bispecifičnog molekula. Primeri interspecijski specifičnih bispecifičnih molekula prema pronalasku u različitim rasporedima VH- i VL-lanca prvog i drugog vezivnog domena su opisani u priloženim primerima.

[0083]Kako je ovde korišćeno, "bispecifično jednolančano antitelo" označava jedan lanac polipeptida koji sadrži dva vezivna domena. Svaki vezivni domen sadrži jedan varijabilni domen teškog lanca antitela ("VH region"), pri čemu se VH region prvog vezivnog domena specifično vezuje za CD3e molekul, i VH region drugog vezivnog domena specifično se vezuje za antigen površine ćelije, kako je detaljnije definisano u tekstu koji sledi. Dva vezivna domena su opciono povezana jedan sa drugim kratkim polipeptidnim spejserom. Neograničavajući primer za polipeptidni spejser je Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-S) i njegova ponavljanja. Svaki vezivni domen može dodano da sadrži jedan varijabilni domen lakog lanca antitela ("VL region"), pri čemu su VH region i VL region unutar i prvog i drugog vezivnog domena povezani jedan sa drugim polipeptidnom spojnicom na primerom, tipa onog koji je opisan i zaštićen u EP 623679 B1, ali je u svakom slučaju dovoljne dužine da omogući VH regionu i VL regionu prvog vezivnog domena i VH regionu i VL regionu drugog vezivnog domena da se međusobno spare tako da su, zajedno, u stanju da se specifično vežu za odgovarajuće prve i druge molekule.

[0084]Prema poželjnoj realizaciji pronalaska ranije okarakterisani molekul bispecifičnog jednolančanog antitela sadrži grupu sledećih sekvenci kao što je CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 i CDR L3 u drugom vezivnom domenu izabranu od SEQ ID NO: 441 - 446, SEQ ID NO: 453 - 458, SEQ ID NO: 463 - 468, SEQ ID NO: 481 - 486.

[0085]Posebno poželjna realizacija pronalaska odnosi se na ranije definisani popipeptid, gde molekul bispecifičnog jednolančanog antitela sadrži sekvence izabrane od: 1. (a) aminokiselinske sekvence kako je naveden u bilo kojoj od SEQ ID NOs:389, 391, 393, 395, 397, 399, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 447, 449, 451, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 495, 497, 499, 501, 503 i 505; i 2. (b) aminokiselinske sekvence kodirane sekvencom nukleinske kiseline kako je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 390, 392, 394, 396, 398, 400, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 448, 450, 452, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 496, 498, 500, 502, 504 i 506.

[0086]U poželjnoj realizaciji pronalaska, bispecifično jednolančano antitelo je interspecijski specifično za CD3 epsilon i za antigen tumora prepoznat njegovim drugim vezivnim domenom.

[0087]U alternativnoj realizaciji predmetni pronalazak obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prethodno opisani polipeptid pronalaska.

[0088]Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska..

[0089]Mnogi pogodni vektori su poznati prosečnom stručnjaku molekularne biologije, izbor nekog od njih će zavisiti od željene funkcije i obuhvata plazmide, kozmide, viruse, bakteriofage i druge vektore koji se obično koriste u genetskom inžinjeringu. Metode koje su dobro poznate prosečnom stručnjaku mogu se koristiti da se izgrade razni plazmidi i vektori; videti, na primer tehnike opisane u Sambrook et al. (loc cit.) i Ausubel, Current Protocols in Molecular Biologv, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativno, polinukleotidi i vektori pronalaska se mogu rekonstituisati u lipozome za isporuku do ciljnih ćelija. Kako će kasnije biti detaljno razmatrano, klonirajući vektor je upotrebljen da bi se izolovale pojedinačne sekvence DNA. Relevantne sekvence se mogu preneti u ekspresione vektore kad je potrebna ekspresija posebnog polipeptida. Tipični klonirajući vektori obuhvataju pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 i pGBT9. Tipični ekspresioni vektori obuhvataju pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT. Poželjno, navedeni vektori sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja je regulatorna sekvenca operativno vezana za ovde definisanu sekvencu nukleinske kiseline.

[0090]Izraz "regulatorna sekvenca" odnosi se na sekvence DNK, koje su potrebne da utiču na ekspresiju kodirajućih sekvenci za koje su ligirani. Priroda takvih kontrolnih sekvenci se razlikuje u zavisnosti od organizma domaćina. Kod prokariota, kontrolne sekvence generalno uključuju promoter, vezno mesto ribozoma, i terminatore. Kod eukariota kontrolne sekvence genaralno uključuju promotere, terminatore i, u nekim slučajevima, pojačivače, transaktivatore ili transkripcione faktore. Izraz "kontrolna sekvenca" namenjen je da uključi, u najmanju ruku, sve komponente čjie prisustvo je potrebno za ekspresiju, i može takođe da uključuje dodatne pogodne komponente.

[0091]Izraz" operativno vezan" odnosi se na pozicije gde su ovako opisane komponente u odnosu koji im dozvoljava da funkcionišu na način koji im je namenjen Kontrolna sekvenca je "operativno vezana" za kodirajuću sekvencu na takav način da je ekspresija postignuta pod uslovima koji su kompatibilni sa kontrolnom sekvencom. U slučaju kad je kontrolna sekvenca promoter, očigledno je prosečnom stručnjaku da se prvenstveno koristi nukleinska kiselina.

[0092]Tako, navedeni vektor je prvenstveno ekspresioni vektor. "Ekspresioni vektor" je konstrukt koji se može upotrebiti da transformiše izabranog domaćina i obezbedi ekspresiju kodirajuće sekvence u njemu. Ekspresioni vektori mogu na primer, biti vektori za kloniranje, binarni vektori ili integratvni vektori. Ekspresija podrazumevai transkripciju molekula nukleinske kiseline prvenstveno u iRNK koja se može prevesti. Regulatorni elementi koji osiguravaju ekspresiju u prokariotimskim i/ili eukariotskim ćelijama su dobro poznati prosečnom stručnjaku. Kad su u pitanju eukarotske ćelije one sadrže normalne promotore koji obezbeđuju inicijaciju transkripcije i opciono poli-A signale koji obezbeđuju završetak transkripcije i stabilizaciju transkripta. Mogući regilatorni elementi koji omogućavaju ekspresiju u prokariotskim ćelijama domaćina sadrže, nor., the PL,lac, trpili tac promoter uE. coli,i primeri regulatornih elemenata koji omogćavaju ekspresiju u eukariotskim ćelijama domaćina suAOX1iliGAL1promoter u kvascu ili CMV-, SV40-, RSV-promoter (Rous sarcoma virus), CMV-pojačivač, SV40-pojačivač ili globin intron u ćelijama sisara i drugih životinja.

[0093]Osim elementa, koji su odgovorni za transkripciju, takvi regulatorni elementi mogu takođe da sadrže signale završetka transkriptcije, kao što su SV40-poli-A mesto ili tk-poli-A mesto, nizvodno od polinukleotida. Osim toga, u zavisnosti od sistema ekspresije, korišćene čeone sekvence koje su sposobne da usmeravaju polipeptid ka celularnom kompartmentu ili da ga izlučuju u medijum, mogu se dodati kodirajućoj sekvenci navedene sekvence nukleinske kiseline i dobro su poznate u tehnici, videti takođe priložene Primere. Jedna ili više čeonih sekvenci je okupljeno u odgovarajućoj fazi sa sekvence za translaciju, inicijaciju i terminaciju, i poželjno, čeonom sekvencom koja je u stanju da usmeri sekreciju sintetisanog proteina, ili njegovog dela, u periplazmični prostor ili ekstracelularni medijum. Opciono, heterologna sekvenca može da kodira fuzioni protein uključujući identifikacion peptid na kraju koji mu daje željene karakteristike, npr, stabilizaciju ili uporošćeno prečišćavanje eksprimiranog rekombinantnog produkta; videtisupra.U ovom konetksti, pogodni ekspresioni vektori su poznati u tehnici, kao što je Okayama-Berg cDNA ekspresioni vektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-vitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA ili pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021 - 7025 and Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141 -150) ili pSPORTI (GIBCO BRL).

[0094]Poželjno, kontrolne sekvence ekspresije će biti sistemi eukariotskih promotera u vektorima koji su sposobni za transfprmaciju ili transfekciju eukariptskih ćelija domaćina, ali se takođe mogu upotrebiti i kontrolne sekvence za prokariotiske domaćine. Kad je jedanput vektor ugrađen u odgovarajućeg domaćina, ovaj se održava pod uslovima pogodnim za visoki nivo ekspresije nukleotidnih sekvenci i, po želji, može da sledi sakupljanje i prečišćavanje polipeptida pronalaska, videti npr priložene primere.

[0095]Alternativni ekspresioni sistem, koji se može upotrebiti da ekprimira interreagujući protein ćelijskog ciklusa, je sistem insekta. U jednom takvom sistemu,Autographa californicavirus nuklearne polihedroze (AcNPV) je upotrebljen kao vektor za ekspresiju stranih gena uSpodoptera frugiperdaćelijama iliTrichoplusialarvama. Kodirajuća sekvenca navedevog molekula nukleinske kiseline može biti klonirana u nebitni region virusa, kao što je polihedrinski gen, i stavljen pod kontrolu polihedrinskog promotera. Uspešno ubacivanje navedene kodirajuće sekvence će održati polihedrinski gen neaktivnim i proizvesti rekombinantni virus koji nema proteinski omotač. Rekombinantni virusi su zatim epotrebljeni za infekciju S.frugiperdaćelija iliTrichoplusialarvi u kojima je eksprimiran protein pronalaska (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224 - 3227).

[0096]Dodatni regulatorni elementi mogu da uključe transkripcione kao i translacione pojačivače. Pogodno je što ranije opisani vektori preonalaska sadrže markere koji se mogu izabrati i detektovati.

[0097]Markeri gena od korsiti za izbor transformisanih ćelija i, npr., biljnih tkiva i biiljaka su dobro poznati prosečnom stručnjaku i sadrže, na primer, antimetabolitsku rezistenciju kao bazu selekcije za dhfr, koji daju rezistenciju metotreksatu (Reiss, Plant Phvsiol. (Life Sci. Adv.) 13

(1994), 143-149); npt, koji daje rezistenciju aminoglicozid neomicinu, kanamicinu i paromicini (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) i higro, koji daje rezistenciju higromicinu (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Opisani su dodatni geni koji se mogu izabrati, naime trpB, koji omogućava ćelijama da koriste indol umesto triptofana; hisD, koji omogućava ćelijama da koriste histinol umesto histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manoza-6-fosfat izomeraza koji omogućava ćelijama da koriste manozu (WO 94/20627) i ODC (ornitin dekarboksilazu) koja daje rezistenciju inhibitoru ornitin dekarboksilaze, 2-(difluorometil)-DL-omithin, DFMO (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biologv, Cold Spring Harbor Laboratorv ed.) ili deaminaza iz Aspergillus terreus koja daje rezistenciju

Blasticidin-u S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336 - 2338).

[0098]Korisni detektabilni markeri su takođe poznati prosečnom stručnjaku i komercijalno su dostupni. Povoljno je to, što je pomenuti marker gen koji kodira luciferazu (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), zeleni fluorescentni protein (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44 - 47) ili fi-glukuronidaza (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901 - 3907). Ova realizacija je naročito korisna za jednostavan i brzi skrining ćelija, tkiva i otganizama koji sadrže pomenuti vektor.

[0099]Kako je ranije opisano, navedeni molekul nukleinske kiseline može se upotrebiti sam ili kao deo vektora da ekprimira polipeptid pronalaska u ćelijama, za, na primer, prečišćavanje, ali takođe i u svrhu genske terapije. Molekuli nukleinske kiseline ili vektori koji sadrže jednu ili više DNK sekvenci koje kodiraju bilo koji ranije opisani polipeptid pronalaska, uvedeni su u ćelije koje zauzvrat proizvode polipeptid od interesa. Genska terapija, koja je zasnovana na uvođenju terapeutskih gena u ćelije ex-vivo ili in-vivo tehnikama je jedna od najvažnijih primena transfera gena. Pogodni vektori, metode ili sistemi za isporuku gena za in-vitro ili in-vivo gensku terapiju su opisani u literaturi i poznati su prosečnom stručnjaku, videti, npr. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534 - 539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911 - 919; Anderson, Science 256 (1992), 808 - 813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370 - 374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077 -1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5

(1998), 692 - 699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289 - 292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243 - 51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; US 5,589,466; ili Schaper, Current Opinion in Biotechnologv 7 (1996), 63 56 - 0. Navedeni molekuli nukleinske kiselime i vektori mogu biti oblikovani za direktno uvođenje ili za uvođenje u ćeliju preko lipozoma, ili virusnih vektora (npr. adenoviral, retroviral). Poželjno, navedena ćelija je ćelijska linija zametka, embrionska ćelija, ili jajna ćelija ili izvedena od ovih, najpoželjnije ova ćelija je matična ćelija. Primer embrionske matične ćelije može biti, između ostalog, matična ćelija opisana u Nagy, Proc. Mati. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424 - 8428.

[0100] Pronalazak takođe obezbeđuje kao domaćina ćeliju transformisanu ili transfektovanu sa vektorom pronalaska. Takva ćelija se može dobiti uvođenjem ranije opisanog vektora pronalaska ili ranije opisanog molekula nukleinske kiseline pronalaska u ćeliju domaćina. Prisustvo najmanje jednog vektora ili najmanje jednog molekula nukleinske kiseline u ćeliji domaćina može da posreduje ekspresiju gena koji kodira ranije opisani konstrukt jednoćelijskog antitela

[0101]Opisani molekul nukleinske kiseline ili vektor pronalaska, koji je uveden u ćeliju domaćina može se ili integrisati u genom ćelije domaćina ili može biti održan ekstrahromozomalno.

[0102]Ćelija domaćina može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija.

[0103]Izraz "prokariot" je namenjen da obuhvati sve bakterije, koje mogu biti transformisane ili transfektovane sa DNK ili RNK molekulima za ekspresija proteina pronalaska. Prokariotske ćelije domaćina mogu da uključuju gram negativne kao i gram pozitivne bakterije kao što su, na primer, E. coli, S. tvphimurium, Serratia marcescens i Bacillus subtilis. Izraz "eukariotski" je namenjen da pbihvati kvasac, više biljke, insekte i prvenstveno ćelije sisara. U zavisnosti od ćelije domaćina koje su korišćene u proceduri produkcije rekombinanta, protein kodiran polinukleotidom predmetnog pronalaska može biti glikozilovan ili može biti ne-glikozilovan. Naroč<:>to poželjna je upotreba plazmida ili virusa koji sadrži kodirajuće sekvence polipeptida pronalaska i genetski je fuzionisan za N-terminalni FLAG-tag i/ili C-terminalni His-tag. Poželjno, dižina navedenog FLAG-taga je oko 4 do 8 aminokiselina, najpoželjnije 8 aminokiselina. Ranije opisani polinukleotid može biti upotrebljen za transformaciju ili transfekciju ćelija domaćina korišćenjem bilo koje od tehnika koje su obično poznate prosečnom stručnjaku. Štaviše, metode za dobijanje fuzionisanih, operaciono vezanih gena i njihovo ekksprimovanje u, npr. ćelijama sisara i bakterijama su dobro poznate u tehnici (Sambrook, loc cit.).

[0104]Poželjno, ćelija domaćina je bakterija ili ćelija insekta, gljive, biljke ili životinje.

[0105]Naročito je predviđeno da navedena ćelija domaćina može biti ćelija sisara. Naročito poželjne ćelije domaćina sadrže CHO ćelije, COS ćelije, linije mijeloma ćelija kao što su SP2/0 ili NS/0. Kako je ilustrovano u priloženim zahtevima, kao domaćini su naročito poželjne ćelije CHO-ćelije.

[0106]Poželjnija ćelija domaćina je humana ćelija ili linija humanih ćelija, npr.c6 (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163 - 168).

[0107^ U daljoj realizaciji, predmetni pronalazak se tako odnosi na proces za dobijanje polipeptida pronalaska, pri čemu navedeni proces sadrži gajenje ćelije domaćina pronalaska pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju polipeptida pronalaska i povraćaj dobijanog polipeptida iz kulture.

[0108] Transformisane ćelije domaćina mogu da rastu u fermentorima i da se gaje u saglasnosti sa tehnikama poznatim u tehnici da bi se postigla optimalna veličina ćelije. Polipeptid pronalaska se tada može izolovati iz medijuma rasta celularnih lizata ili celularnih membranskih frakcija. Izdvajanje i prečišćavanje npr polipeptida pronalaska eksprimiranih u mikroorganizmima može biti izvedena bilo kojim konvencionalnim načinima, kao što su, na primer, preparativno hromatografsko razdvajanje i imunološko razdvajanje, kao što je ono koje uključuje korišćenje monoklonalnih ili poliklonalnih antitela usmerenih, npr. prema tagu polipeptida pronalaska ili kao što je opisano u priloženim primerima.

[0109] U tehnici je poznato da uslovi gajenja ćelija domaćina, koji omogućavaju ekspresiju zavise od sistema ćelije domaćina i sistema ekspresije /vektora koji je upotrebljen u takvom procesu. Parametri, koje treba modifikovati da bi se postigli uslovi koji omogućavaju ekspresiju rekombinantnog polipetida, poznati su u tehnici. Tako, pogodne uslove može da odredi prosečni stručnjak u odsustvu dodatnih inventivnih izazova.

[0110] Jedanput eksprimiran, polipeptid pronalaska se može prečistiti prema standardnim procedurama tehnike, uključujući taloženje amonijum sulfatom, afinitivne kolone, hromatografiju na koloni, gel elektroforezu u si. videti Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y.

(1982). Za farmaceutsku upotrebu, poželjni su suštinski čusti polipeptidi od najmanje oko 90 do 95% homogenosti, i najpoželjniji su sa 98 do 99% ili više homogenosti. Jedanput prečišćen, parcijalno ili do željene homogenosti, polipeptid pronalaska može se tada upotrebiti terapeutski (uključujući ekstrakorporalno) ili u procedurama proba razvoja i izvođenja. Osim toga, primeri metoda za izdvajanje polipeptida pronalaska iz kulture su opisani detaljno u priloženim primerima.

[0111] Osim toga,<p>ronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptid pronalaska ili polipeotid proizveden ranije opisanim procesom. Poželjno, navedena kompozicija je farmaceutska kompozicija.

[0112] U saglasnosti sa pronalaskom, izraz "farmaceutska kompozicija" odnosi se na kompoziciju za administraciju kod pacijenta, poželjno čoveka. Naročito poželjna farmaceutska kompozicija ovog pronalaska sadrži vezujuće molekule usmerene prema i generisane prema CD3 epitopima koji ne zavise od konteksta. Poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži pogodne<f>ormu!acije nosača, stabilizatora i/ili ekscipijenata. U poželjnoj realizaciji, farmaceutska kom<p>ozicija sadrži kompoziciju za parenteralnu, transdermalnu, intraluminalnu, intraarterijsku, intratekalnu i/ili intranazalnu primenu ili direktnom injekcijom u tkivo. Naročito je predviđeno administracija navedene kompozicije pacijentu infuzijom ili injekcijom. Administracija pogodnih kom<p>ozicija može biti izvedena na različite načine, npr. intravenozno, intraperitonalno, supkutano, intramuskularno, topikalno ili intradermalno. Posebno, predmetni pronalazak obezbeđuje kompozicije pogodne za neprekidnu administraciju. Kao neograničavajući primer neprekidna, tj. kontinualna administracija može se realizovati malim pumpnim sistemom, koji nosi pacijent, za odmeravanje influksa terapeutskog agensa u telo pacijenta. Farmaceutska kompozicija koja sadrži vezujuće molekule usmerene prema i generisane prema CD3 epitopu koji ne zavisi od konteksta pronalaska može se administrirati korišćenjem navedenog pumpnog sistema. Takvi pumpni sistemi su generalno poznati u tehnici, i obično se odnose na periodičnu promenu kartridža koji sadrže terapeutsko sredstvo koje treba da se da infuzijom. Pri izmeni kartridža u takvom pumpnom sistemu, može se dogoditi privremeni prekid inače neprekidnog toka terapeutskog sredstva u telo pacijenta U takvom slučaju, smatraće se da faza administracije pre zamene kartridža i faza administracije posle zamene kartridža zajedno u okviru farmaceutskog značenja i metoda pronalaska together čine jednu "neprekidnu administraciju" takvog terapeutskog sredstva.

[0113]Kontinualna ili neprekidna administracija ovih vezivnih molekula usmerenih prema i generisanih prema CD3 epitopu koji ne zavisi od konteksta ovog pronalaska može biti intravenozna ili supkutana putem uređaja za isporuku tečnosti ili malim pumpnim sistemom koji ukljčuie mehanizam za pokretanje tečnosti iz rezervoara i mehanizmom za pokretanje ovog mehanizma. Pumpni sistemi za supkutanu administraciju mogu uključivati iglu ili kanulu za proboj kože<p>acijenta i isporuku pogodne kompozicije u telo pacijenta. Ovi pumpni sistemi mogu biti pričvršćeni ili pripojeni za kožu pacijenta nezavisno od vene, arterije ili krvnog suda, što omogućava direktni kontakt između pumpnog sistema i kože pacijenta. Pumpni sistem može biti pripojen za kožu pacijenta tokom od 24 sata pa donekoliko dana. Pumpni sistem može biti male veličine sa rezervoarom male zapremine. Kao neograničavajući primer, zapremina rezervoara za pogodnu farmaceutsku kompoziciju koja će se administrirati može biti između 0.1 i 50 ml.

[0114]Kontinualna administracija može biti transdermalna putem flastera na koži, koji se zamenjuje u intervalima. Prosečni stručnjak poznaje sisteme flastera za isporuku leka koji su pogodni za ovu namenu. Treba napomenuti da je transdermalna administracija naročito pogodna za neprekidnu administraciju, pošto se zamena istrošenog flastera može izvesti istovremeno sa postavljanjem novog, drugog flastera, na primer, na površini kože odmah pored prvog istrošenog flastera i neposredno pre uklanjanja prvog istrošenog flastera. Neće doći do prekida toka ili oada moći ćelije. [01^5? Kompozicija predmetnog pronalaska koja sadrži vezivne molekule usmerene prema i geriisane premav CD3 epitopu koji ne zavisi od konteksta mogu dodatno da sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača su dobro poznati prosečnom stručnjaku i obuhvataju rastvore, npr. rastvore solane puferisane fosfatom, vodu, emulzije, kao što su emulzije voda/ulje, razne tipove sredstava za kvašenje, sterilne rastvore, lipozome, itd. Kompozicije koje sadrže takve nosače mogu se formulisati dobro poznatim konvencionalnim metodama. Formulacije mogu da sadrže ugljovodonike, puferne rastvore, aminokiseline i/ili površinski aktivne materije. Ugljovodonici mogu biti neredukući šećeri, poželjno trehaloza, saharoza, oktasulfat, sorbitol ili ksilitol. Takve formulacije se mogu upotrebiti za kontinualnu administraciju, koja može biti intravenozna ili supkutana sa i/ili bez pumpnog sistema. Aminokiseline mogu biti naelektrisane aminokiseline, poželjno lizin, lizin acetat, arginin, glutamat i/ili histidin. Površinski aktivne materije mogu biti deterdženti, poželjno molekulske težine od >1.2 KD i/ili polietar, poželjno sa molekulskom težiom od >3 KD. Neograničavajući primeri poželjnih deterdženata su Tvveen 20, Tvveen 40, Tween 60, Tween 80 ili Tvveen 85. Neograničavajući primeri poželjnih polietara su PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 ili PEG 5000. Puferni sistemi upotrebljeni u premetnom pronalsku mogu imati poželjni pH od 5 - 9 i mogu da sadrže citrat, sukcinat, fosfat, histidin i acetat. Kompozicije predmetnog pronalska mogu se administrirati subjektu sa pogodnom dozom koja može biti određena npr. ispitivanjem delovanja povećanih doza, administracijom povećanih doza polipeptida pronalaska koji pokazuje ovde opisanu interspecijsku specifičnost za primate osim šimpanze, na primer makake. Kako je ranije navedeno, polipeptid pronalaska koji pokazuje ovde opisanu interspecijsku specifičnost može se pogodno upotrebiti u identičnom obliku u prekliničkom testiranju primata osim šimpanze i kao lek kod ljudi. Ove kompozicije se takođe mogu administrirati sa drugim proteinskim i neproteinskim lekovima. Ovi lekovi se mogu administrirati istovremeno sa kompozicijama koje sadrže polipeptid pronalaska kako je ovde definisan, ili odvojeno pre ili posle administracije navedenog polipeptida u vremenski definisanim intervalima i dozama. Dozmi režim će odrediti prisutni lekar i kliničku faktori. Kako je dobro poznato u medecini, doze za bilo koga pacijenta zavise od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, posebno jedinjenje koje će biti administrirano, pol, vreme i način administracije, opšte stanje zdravlja, i druge lekove koji se istovremeno uzimaju. Preparati za parenteralnu administraciju obuhvataju sterilne vodene i nevodene rastvore, suspenzije, i emulzije. Primeri nevodenih rastvora su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje, i organski estri koji se mogu injektirati, kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili susoenzije, uključujući solanu i puferneme sredine Parenteralni nosači uključuju rastvore natrijum hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, i Ringerlaktat ili određena ulja. Intravenozbi nosači uključuju tečnosti i dodatke nutrijentima, dodatke elektrolitima (kao što su oni zasnovani na Ringerovoj dekstrozi), i slično. Konzervansi i drugi aditivi mogu takođe biti prisutni, kao štosu, na primer, antimikrobi, anti-oksidanti, helaciona sredstva, inertni gasovi i slično. Osim toga, kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži proteinske nosače, kao što su, na primer, albuminski serum ili immunoglobulin, poželjno humanog porekla. Predviđeno je da kompozicija pronalaska može da sadrži, osim ovde definisanog polipeptida pronalaska, dodatna biološki aktivna sredstva, u zavisnosti od namene upotrebe kompozicije. Takva sredstva mogu biti lekovi koji deluju na gastro-intestinalni sistem, lekovi koji deluju kao citostatici, lekovi koji sprečavaju hiperurikemiju, lekovi koji inhibiraju imunoreakcije (npr kortikosteroidi), lekovi koji moduliraju inflamatorni odgovor, lekovi koji deluju na cirkulacioni sistem i/ili sredstv akao što su citokini poznati u tehnici.

[0116]Biološka aktivnost ovde definisanih farmaceutskih kompozicija može se odrediti, na primer, probama citotoksičnosti, kao što je opisano u primerima koji slede, u WO 99/54440 ili Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12). "Efkasnost" ili "in vivo efikasnost" kako je ovde korišćeno, odnosi se na odgovor na terapiju farmaceutskom kompozicijom pronalaska, koristeći, npr.standardizovane NCI kriterijume odgovora. Uspeh ili efikasnostin vivoterapije korišćenjem farmaceutske kompozicije pronalaska odnosi se na efikasnost kompozicije za namenjenu svrhu, tj sposobnost kompozicije da izazove željeni efekat, ti. deoleciju patogenih ćelija, npr ćelija tumora. Efikasnostin vivomože biti kontrolisana utvrđenim standardnim metodama za odgovarajuće entitete bolesti uključujući, bez ograničenja, brojanje belih krvnih ćelija, diferencijalno brojanje ćelija, razvrstavanje fluorescentnih ćelija (engl.Fluorescence Activated Cell Sorting),aspiraciju kostne srži. Osim toga, mogu se koristiti speciifični parametri kliničke hernije različitih bolesti i druge utvrđene standardne metode. Štaviše, mogu se upotrebiti kompjuterska tomografija, rendgen, nuklearna magnetna rezonantna tomografija (npr. određivanje odgovora bazirano na kriterijumima za National Cancer Institute [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher Rl, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-l.opez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D. Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Čarter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's Ivmphomas. NCI Sponsored International VVorking Group. J Clin Oncol. 1999 Apr; 17(4): 1244]), skeniranje positron-emisionom tomografijom, brojanje belih krvnih ćelija, diferencijalno brojanje ćelija, razvrstavanje fluorescentnih ćelija (engl.Fluorescence Activated Cell Sorting),aspiracija kostne srži, biopsija/nisto'ogija limfnih čvorova, i razni parametri kliničke hernije specifični za limfom (npr. iaktat dshidrogenaza) i druge utvrđene s<t>andardne metode.

[0117]Drugi veliki izazov u razvoju lekova, kao što su farmaceutske kompozicije pronalaska, je predvidljiva modulacija farmakokinetičkih osobina. Do sada, utvrđen je farmakokinetički profil leka kandidata, tj. profil fharmakokinetičkih parametara koji utiču na sposobnost posebnog leka da leči navedeno stanje. Farmakokinetički parametri leka koji utiču na sposobnost leka za lečenje nekih oboljenja uključuju, bez ograničenja: poluživot, obim distribucije, hepatički presistemski metabolizam i stepen vezivanja krvnog seruma. Na efikasnost datog lekovitog sredstva može se uticati svakim od navedenih parametara.

[0118]"Poluživot" označava vreme za koje je 50% administriranog leka eliminisano biološkim procesima, npr. metabolizmom, izlučivanjem, itd.

[0119]"Hepatilčni presistemski metabolizam" (engl. hepatic first-pass metabolism) iznačava sklonost leka da bude metabolizovan pri prvom kontaktu sa jetrom, tj. prilikom prvog njegovog prolaska kroz jetru. "Obim distribucije" označava stepen zadržavanja leka u raznim delovima tela, kao što su, npr. intracelularni i ekstracelularni prostori, tkiva i organi, itd. i raspodela leka u ovim delovima.

[0120]"Stepen vezivanja krvnog seruma" označava sklonost leka da reaguje sa i veže se za proteine krvnog seruma, kao što je albumin, što dovodi do smanjenja ili gubljenja biološkog delovanja leka.

[0121]Farmakokinetički parametri takođe uključuju bioraspoloživost, kašnjenje (Tlag), Tmax, brzine apsorpcije, i još početak i/ili Cmax za datu količinu administriranog leka. "Bioraspoloživost" označava količinu leka u delovima krvi.

[0122]"Kašnjenje" označava odlaganje vremena između administracije leka i njegove detekcije i mogućnosti merenja u krvi ili plazmi.

[0123]"Tmax" je vreme posle koga je postignuta maksimalna koncentracija leka u krvi, i "Cmax" je maksimalna koncentracija krvi dobijena datim lekom. Na vreme, potrebno da se postigne koncentracija leka u krvi ili tkivu za njegovo biloško delovanje, utiču svi parametri. Farmakokinetički parametri bispecifičnih jednolančanih antitela, poželjna realizacija polipeptida pronalaska koji ispoljava interspecijski specifičnost, a koja se može odrediti u prekliničkom testiranju na životinjama koje nisu šimpanze, kako je prikazano u pretnodnom tekstu , takođe su dati npr. u publikaciji Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 -12). [01241 Izraz "toksičnost" kako je ovde korišćen odnosi se na toksične efekte leka manifestovane u neželjenim pojavama ili ozbiljnim štetnim pojavama. Ove nuspojave mogu se odnositi na gubitak podnošljivosti na lek uopšte i/ili gubitak lokalne podnošljivosti posle administracije. Toksičnost takođe može da uključuje teratogenske ili karcinogenske efekte izazvane lekom.

[0125]Izraz "bezbednost", "in vivo bezbednost" ili "podnošljivost" kako su ovde korišćeni definišu administraciju leka bez izazivanja ozbiljnih štetnih pojava posle administracije (lokalna podnošljivost) i tokom dužeg perioda primene leka. "Bezbednost", "in vivo bezbednost" ili "podnošljivost" mogu se proceniti npr u pravilnim intervalima tokom lečenja i tokom perioda koji sledi.. Merenja uključuj kliničku procenu, npr. manifestacije organa, i skeniranje laboratorijskih abnormalnosti. Klinička procena se može izvesti i odrediti odstupanje od normalnih nalaza određenih/kodiranih prema NCI-CTC i/ili MedDRA standardima. Manifestacije organa mogu uključiti kriterijume kao što su alergija/imunologija, krv/kostna srž, srčana aritmija, koagulacija i slično, kako je navedeno npr. u Common Terminologv Criteria for adverse events v3.0 (CTCAE). Laboratorijski patametri koji se mogu testirati uključuju, na primer, hematologiju, kliničku herniju, profil kogaulacije i analizu urina i ispitivanje drugih fluida tela kao što su serum, plazma, limpfidna ili spinalna tečnost, likvor i slično. Bezbednost se tako može oceniti npr. fizičkim ispitivanjem, tehnikama snimanja (tj, ultrazvuk, rendgen, CT skeniranje, snimanje magnetnom rezonancom (MRI), drugim merenjima tehničkim uređajima (tj. elektrokardiogram), vitalnim znacima, merenjem laboratoriskih parametara i određivanjem štetnih pojava. Na primer, štetne pojave kod primata osim šimpanze pri upotrebi i metodama prema pronalasku mogu se ispitivati histopatološkim i/ili histohemijskim metodama.

[0126] Izraz "delotvorna i netoksična doza" kako je ovde korišćen odnosi se na podnošljivu dozu bispecifičnog jednolančanog antitela kako je ovde definisano, koja je dovoljno visoka da izazove depleciju patoloških ćelija, eliminaciju tumora, smanjenje tumora ili stabilizaciju oboljenja bez, ili suštinski bez, većih štetnih efekata. Takve delotvorne i netoksične doze mogu se odrediti npr. ispitivanjima povećanja doze koja su opisana u literuturi i treba da budu ispod doze koja izaziva ozbiljne štetne nuspojave (doza granična za toksičnost, DLT, od engl dose limiting toxicity). [01271 Prethodno navedeni izrazi razmatrani su u npr Preclinical safety evaluation of biotechnologv-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997.

[0128] Štaviše, pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže polipeptid oovog pronalaska (tj. polipeptid koji sadrži bar jedan vezivni domen sposoban da se veže za epitop CD3 epsilon lanca čoveka i primata osim šimpanze, pri čemu epitop je deo aminokiselinske sekvence koja se nalazi u grupi koja se sastoji od SEQ ID Br. 2, 4, 6, ili 8 u saglasnosti sa ovim proizvodom ili proizveden procesom prema ovom pronalasku za prevenciju, lečenje i poboljšanje bolesti izabrane od proliferativne bolesti, tumorske bolesti ili imunološkog poremećaja. Poželjno, navedena farmaceutska kompozicija dodatno sadrži pogodne formulacije nosača, stabilizatora i/ili ekscipijenata.

[0129] Drugi as<p>ekt, pronalaska odnosi se na upotrebu polipeptida kako je ovde definisan ili proizveden prema ovde definisanom procesu, za pripremu farmaceutske kompozicije za prevenciju, lečenje ili pobošanje bolesti. Prvenstveno, navedena bolest je proliferativna bolest, tumorska bolest ili imunološki poremećaj. Dalje je poželjno da je navedena tumorska bolest maligno oboljenje, prvenstveno kancer.

[0130]U još jednoj poželjnoj realizaciji upotrebe polipeptida pronalaska navedena farmaceutska kompzicija je pogodna za administraciju u kombinaciji sa dodatnim lekom, tj. kao deo ko-terapije. U toj ko-terapiji, aktvno sredstvo može opciono da bude uključeno u istu farmaceutsku kompoziciju kao i polipeptid pronalaska, ili može biti uključeno kao posebna farmaceutska kompozicija. U ovom drugom slučaju, navedena posebna farmaceutska kompozicija je pogodna za administraciju pre, istovremeno sa, ili posle admnistracije farmaceutske kompozicije koja sadrži polipeptid pronalaska. Dodatni lek ili farmaceutska kompozicija može biti neproteinsko jedinjenje ili proteinsko jedinjenje..U slučaju kada je dodatni lek proteinsko jedinjenje, pogodno je da proteinsko jedinjenje bude sposobno da obezbedi aktivacioni signal za ćelije efektora imunog sistema.

[0131]Poželjno, navedeno proteinsko jedinjenje ili neproteinsko jedinjenje može biti administrirano istovremeno ili neistovremeno sa polipeptidom pronalaska, nukleinskom kiselinom kako je ovde ranije definisano, vektorom kako je ovde ranije definisano, ili domaćinom kako je ovde ranije definisano.

[0132] Još jedan aspekt pronalaska odnosi se na farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu u metodi za lečenje ili pobošanje bolesti subjekta kome je to potrebno, pri čemo navedena metoda sadrži korak administracije delotvorne količine farmaceutske kompozicije pronalaska. Prvenstveno, pomenuta bolest je bolest je proliferativna bolest, tumorska bolest ili imunološki poremećaj. Još je poželjnije da je navedena tumorska bolest maligno oboljenje, prvenstveno kancer..

[0133] U drugoj poželjnoj realizaciji navedeba farmaceutska kompozicija je pogodna za administraciju u kombinaciji sa dodatnim lekom, tj. kao deo ko-terapije. U toj ko-terapiji, aktvno sredstvo može opciono da bude uključeno u istu farmaceutsku kompoziciju kao i polipeptid pronalaska, ili može biti uključeno kao posebna frmaceutska kompozicija. U ovom drugom slučaju, navedena posebna farmaceutska kompozicija je pogodna za administraciju pre, istovremeno sa, ili posle admnistracije farmaceutske kompozicije koja sadrži polipeptid pronalaska. Dodatni lek ili farmaceutska kompozicija može biti neproteinsko jedinjenje ili prote'nsko jedinjenje..U slučaju kada je dodatni lek proteinsko jedinjenje, pogodno je da proteinsko jedinjenje bude sposobno da obezbedi aktivacioni signal za ćelije efektora imunog sistema.

[0134]Poželjno, navedeno proteinsko jedinjenje ili neproteinsko jedinjenje može biti administrirano istovremeno ili neistovremeno sa polipeptidom pronalaska, nukleinskom kiselinom kako je ovde ranije definisano, vektorom kako je ovde ranije definisano, ili domaćinom kako je ovde ranije definisano.

[0135]Poželjno je za prethodno opisanu metodu pronalaska daje navedeni subjekt, čovek.

[0136]U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na pribor koji sadrži polipeptid pronalaska, molekul nukleinske kiseline pronalaska, vektor pronalaska, ili domaćina pronalaska.

[0137J Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje sledeču listu tačaka:

Tačka 1. Metoda za identifikaciju jednog ili više polipeptida koji sadrže interspecijski specifični vezni domen sposoban da se veže za epitop CD3 epsilon (CD3e) čoveka i primata osim šimpanze, metoda koja sadrži korake: 1. (a) dovođemje u kontakt jednog ili više polipeptida sa N-terminalnim fragmentom ekstracelularnog domena CD3e od maksimalno 27 aminokiselina koje sadrže aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID BR. 381) ili Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly (SEQ ID BR. 382), pričvršćenu preko njegovog C-kraja za čvrstu fazu;

2. (b) eluiranje vezanog (vezanih) polipeptida iz ovog fragmenta, i

3. (c) izdvajanje jednog ili više polipeptida iz eluata pod (b).

Poželjno je da su polipeptid (polipeptidi), koji su identifikovani navedenom metodom pronalaska, humanog porekla.

Ova "metoda za identifikaciju polipeptida" se razume kao metoda za izdvajanje jednog ili više različitih polipeptida sa istom specifičnošću za fragment ekstracelularnog domena CD3s koji sadrži na njegovom N-kraju aminokiselinske sekvence Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Met-Gly (SEQ ID BR. 381) ili Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly (SEQ ID BR. 382) iz mnoštva kandidata polipeptida, kao i metoda za prečišćavanje polipeptida iz rastvora. Neograničavajuća realizacija metode za izdvajanje jednog ili više različitih polipeptida sa istom specifičnošću za fragment ekstracelularnog domena CD3e sadrži metode za selekciju antigen-specifičnih vezivnih entiteta, npr. paning metode (engl. panning methods) kako se obično koriste za skrining hibrodoma, skrining prolazno/stabilno transfektovanih klona eukariotskih ćelija domaćina ili u metodama sa fagama. Neograničavajući primer za ovu drugu metodu za prečišćavanje polipeptida iz rastvora je npr. prečišćavanje rekombinantnog eksprimiranog polipeptida iz kulture supernatanta ili priprema takve kulture.

Kako je ranije navedeno fragment koji je upotrebljen u ovoj metodi je N-terminalni fragment ekstracelularnog domena CD3e molekula primata. Aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena CD3£molekula različitih primata je navedena u SEQ ID NOs: 1, 3, 5 i7. Dva oblika N-terminalnog oktamera su navedena u SEQ ID NOs: 381 i 382. Poželjno je da je ovaj N-kraj slobodno dostupan za vezivanje polipeptida koji treba da bude identifikovan metodom pronalaska. Izraz "slobodno dostupan" se shvata u kontekstu pronalaska kao slobodan od dodatnih motiva kao što je His-tag. Interferencija takvog His-taga sa vezivnim molekulima identifikovanim ovom metodom je opisana u priloženom Primeru 6.

Prema ranije pomenutoj metodi navedeni fragment je pričvršćen preko svoga C-kraja za čvrstu fazu. Prosečni stručnjak će lako i bez dvoumljenja izabrati pogodnu podlogu čvrste faze u zavisnosti od korišćene realizacije metode pronalaska. Primeri čvrste podloge obuhvataju, bez ograničenja, matrice u vidu koglica (npr. kuglice agaroze, kuglice sefaroze, kuglice polistirola, kuglice dekstrana), ploče (ploče za kulture ili MultiVVell ploče) kao i čipove poznate npr. od Biacore<®>. Selekcija načina i metoda za pričvršćivanje/imobilizaciju fragmenta za navedenu čvrstu podlogu zavisi od izbora čvrste podloget. Metoda koja se obično koristi za pričvršćivanje/imobilizaciju je kuplovanje preko N-hidroksisukcinimid (NHS) estra. Hernija koja je osnova ovog kuplovanja kao i alternativne metode za pričvršćivanje/imobilizaciju su poznate prosečnom stručnjaku, npr. iz Hermanson "Bioconjugate Techniques", Academic Press, Inc.

(1996). Za pričvršćivanje za. i imobilizaciju na hromatografskim podlogama obično se koriste sledeća sredstva: NHS-aktivirana sefaroza (npr. HiTrap-NHS od GE Life Science - Amersham), CnBr- aktivirana sefaroza (npr GE Life Science Amersham), NHS-aktivirane dekstranske kuglice (Sigma) ili aktivirani polimetakrilat. Ovi reagensi se takođe mogu upotrebiti u jednostepenom postupku. Štaviše, kuglice dekstrana koje sadrže oksid gvožđa (npr mogu se kupiti od Miltenvi) mogu se upotrebiti u jednostepenom postupku. Ove kuglice se mogu koristiti u kombinaciji sa magnetom za izdvajanje kuglica iz rastvora. Polipeptidi se mogu imobilizovati na Biacore čipu (npr. CMS čipovi) upotrebom NHS aktiviranog karboksimetildekstrana. Dalji primeri odgovarajuće čvrste podloge su amin reaktivne MultiVVell ploče (npr. Nunc Immobiiizer™ ploče). Prema gore pomenutim metodama navedeni fragment ekstracelularnog domena CD3 epsilon može se direktno kuplovati za čvrstu podlogu ili preko niza amino kiselina, koje mogu biti spojnice ili druga protein/polipeptid grupa. Alternativno, ekstracelularni domen CD3 epsilon može biti indirektno kuplovan preko jednog ili više adapterskih molekula. Načini i metode za eluiranje peptida vezanog za imobilizovani epitop su dobro poznati u tehnici, isto važi za metode za izdvajanje identifikovanog (identifikovanih) polipeptida iz eluata. U saglasnosti sa pronalaskom, metoda za izdvajanje jednog ili više različitin polipeptida sa istom specifičnošću za fragment ekstracelularnog domena CD3£koji sadrži na svom N-kraju aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly iz mnoštva polipeptidnih kandidata, može da sadrži jedan ili više koraka sledećih metoda za selekciju antigen-specifičnih entitita: CD3e specifični vezivni molekuli mogu biti izabrani iz repertoara antitela. biblioteka sa eksponiranim fazima ( engl. phage display) može se stvoriti na osnovu standardnih procedura, kao što je, na primer, opisano u "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Format fragmenta antitelo u biblioteci antitela može biti scFv, ali generalno takođe može biti i Fab fragment ili čak fragment antitela jednog domena. Za izdvajanje fragmenta antitela mogu se koristiti biblioteke fragmenata naivnih antitela. Za izbor entiteta sa potencijalno niskim imunogenskim vezivanjem za kasniju upotrebu u terapeutici, biblioteka fragmenta antitela čoveka može biti pogodna za direktnu selekciju fragmenta antitela čoveka. U nekim slučajevima, ona mogu da čine bazu za bibilioteke sintetičkih antitela (Knappik et al. J Mol. Biol. 2000, 296:57 ff). Odgovarajući format može biti Fab, scFv (kako je opisano u tekstu koji sledi) ili domenu antitela (dAbs, pregled je dat u Ho!t et al., Trends Biotechnol. 2003, 21:484 ff).

Takođe je u tehnici poznato da u mnogim slučajevima nema dostupnog izvora imunog humanog antitela na ciljni antigen. Prema tome, imunizovane su životinje sa ciljnim antigenom i biblioteke odgovarajuih antitela izolovane iz životinjskog tkiva kao što je npr. slezina ili PBMCs. N-terminalni fragment može bitie biotinilizovan ili kovalentno vezan za proteine kao što su KLH ili albumin goveđeg seruma (BSA). Prema uobičajenom pristupu, za imunizaciju se koriste glodari. Repertoari nekih imunih antitela koja ne pripadaju čoveku mogu naročito biti pogodni zbog drugih razloga, npr. zbog prisustva antitela sa jednim domenom (VHH) izvedenih od kameloidnih vrsta (kao što je opisano u Muvldermans, J Biotechnol. 74:277; De Genst et al. Dev Como Immunol. 2006, 30:187 ff). Prema tome, odgovarajući format biblioteke antitela može biti Fab, scFv (kako je opisano u tekstu koji sledi) ili antitela sa jednim domenom (VHH).

U jednom mogućem pristupu, 10 nedelja stari F1 miševi iz balb/c x C57black ukrštanja mogu se imunizovati ceiim ćelijama npr. orim koje eksprimiraju N-terminalnu transmembranu EpCAM N.koja se javlja kao translaciona fuzija N-terminalnih aminokiselina 1 do 27 zrelog CD3 epsilon lanca. Alternativno, miševi se mogu imunizovati sa 1-27 CD3 epsilon-Fc fuzionim proteinom (odgovarajući pristup je opisan u priloženom Primeru 2). Posle buster imunizacije (imunizacija), mogu se uzeti uzorci krvi i može se testirati titar seruma antitela na CD3-pozitivne T ćelije, npr FACS analizom. Obično, titri seruma su znatno viši u imunizovani nego u neimunizovanim živorinjama. Imunizovane životinje mogu da stvore bazu za konstrukciju biblioteka imunih antitela. Primeri takvih podataka sadrže biblioteke sa eksponiranim fazima. Takve biblioteke mogu se stvoriti na osnovu standardnih procedura, kako je, na primer, opisano u "Phage Displav: A Laboratorv Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 2001.

Antitela koja ne pripadaju čoveku mogu se takođe humanizovatih pomoću eksponiranih faga blagodareći stvaranju biblioteka sa raznovrsijimm antitelima koje se mogu zatim tokom selelkcije mgu obogatiti molekulima koji se vezuju.U pristupu eksponiranih faga bilo koji od skupova faga koji eksponiraju biblioteke antitela formiraju osnovu za selektovanje vezivnih elemenata odgovarajućeg antigena kao ciljnog molekula.. Centralni korak u kome su izolovani fazi specifični za dati antigen i vezani za njega označeni su kao paning. Zbog eksponiranih fragmenata antitela na površini faga, ova opšta metoda se naziva eksponiranje faga. Jedna poželjna metoda selekcije je upotreba malih proteina kao što su filamentozni domen faga N2 koji je translaciono fuzionisan za N-kraj scFv koji eksponira fag. Još jedna metoda eksponiranja poznata u tehnici, koja se može koristiti za izdvajanje veznih entiteta je metoda eksponiranja ribozoma (pregled dat u Groves & Osboum, Expert Opin Biol Ther. 2005, 5:125 ff; Lipovsek & Pluckthun, J Immunol Methods 2004, 290:52 ff).

Da bi se prikazalo vezivanje scFv čestica faga za 1-27 CD3e-Fc fuzioni protein, fagna biblioteka koja sadrži klonirani repertoar scFv može se pokupiti iz odgovarajuće kulture supetnatanta sa PEG (polietilenglikol). ScFv čestice faga mogu se inkubirati sa imunobilizovanim CD3e Fc fuzionim proteinom. Imunobilizovani CD3e Fc fuzioni protein može se naneti na čvrstu fazu. Vezivni entiteti se mogu eluirati i eluat se može upotrebiti za infekciju svežih neinficiranih bakterijskih domaćina. Bakterijski domaćini uspešno transdukovani sa kopijom fagemida, koja kodira scFv-fragment čoveka, mogu se ponovo selektovatii na rezistenciju na karbenicilin i zatim inficirati sa npr. VCMS 13 pomoćničkim fagom, da bi se započela druga runda eksponiranja antitela i selekcijain vitro.Normalno je izvedeno ukupno 4 do 5 rundi selekcije Vezivanje izolovanih vezivnih entiteta se može testirati na CD3epsilon pozitivne Jurkat ćelije, HPBall ćelije, PBMCs ili transfektovane eukariotske ćelije koje nose N-terminalnu CD3e sekvencu fuzionisanu sa EpCAM ekcponiranim na površini koristeći protočnu citometriju (videti priloženi Primer 4).

Tačka 2. Metoda iz tačke 1, gde polipeptid (polipeptidi) sadrže identifikovani vezivni domen kao prvi vezivni domen i drugi vezivni domen sposoban za vezivanje na površinu

ćelije antigena.

Za stvaranje drugog vezivnog domena poliipeptida koji je identifikovan prethodno navedenom metodom, npr. bispecifičnog jednolančanog antitela kako je ovde definisano, mogu se upotrebiti monoklonalna antitela koja se vezuju za površinu ćelije antigena i čoveka i primata osim šimpanze. Odgovarajući vezivni domeni za bispecifični polipeptid kako je ovde definisan, može, npr. biti izveden od interspecijski specifičnih monoklonalnih antitela rekombinantnim metodama opisanim u tehnici. Monoklonalno antitelo koje se vezuje za površinu ćelije antigena kod čoveka i za homolog površine ćelije antigena kod primata osim šimpanze može biti testiran FACS probama kako je ranije navedeno. Hibridoma tehnike kako su opisane u literaturi (Milstein and Kohler, Nature 256 (1975), 495 - 7) takođe se mogu upotrebiti za stvaranje interspecijski specifičnih antitela. Na primer, miševi se alternativno mogu imunizovati sa CD33 čoveka i primata osim šimpanze. Iz ovih miševa, mogu se tehnikom hibridoma izolovati hibridoma ćelije koje proizvode interspecijski specifično antitelo i analizirati sa FACS kako je ranije navedeno. Stvaranje i analiza bispecifičnih polipeptida, kao što su bispecifična jednolančana antitela koja ispoljavaju interspecijsku specifičnost kako je ovde opisano, prikazana su u Primerima koji slede. Prednosti bispecifičnih jednolančanih antitela koja ispoljavaju interspecijsku specifičnost uključuju tačke koje su nabrojane u takstu koji sledi.

Tačka 3. Metoda iz tačke 2, gde se drugi vezivni domen vezuje za površinu ćelije antigena čoveka i/ili primata osim šimpanze.

Tačka 4. Metoda iz bilo koje tačke 1 do 3, gde je prvi vezivni domen antitelo.

Tačka 5. Metoda iz tačke 4, gde je antitelo, jednolančano antitelo.

Tačka 6. Metoda iz bilo koje tačke 2 do 5, gde je drugi vezivni domen antitelo.

Tačka 7. Metoda iz bilo koje tačke 1 do 6, gde fragment ekstracelularnog domena CD3e sadrži jedan ili više fragmenaat polipeptida koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo koju od cn'h navedenih u SEQ ID Br.2, 4, 6 ili 8.

Tačk;. 3. Metoda iz tačke 7, gde navedeni fragment ima ostatsk 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 aminokiselina.

Tačka 9. Metoda iz bilo koje tačke 1 do 8, gde metoda identifikacije je metoda skrininga više polipetida koji sadrže interspecijskii specifilni vezivni domen sposoban za vezivanje za epitop CD3e čoveka i primata osim šimpanze.

Tačka 10. Metoda iz bilo koje tačke 1 do 8, gde metoda identifikacije je metoda prečišćavanja/izdvajanja polipeptida koji sadrži interspecijski specifični vezivni domen sposoban da se veže za epitop CD3e čoveka i primata osim šimpanze.

Tačka 11. Upotreba N-terminalnog fragmenta ekstracelularnog domena CD3e od maksimalno 27 aminokiselina koje sadrže aminokiselinsku sekvencu Gin-Asp-Gly-Asn-Giu-Glu-Met-Gly (SEQ ID BR. 381) ili Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly (SEQ ID BR. 382) za stvaranje interspeces specifičnog vezivnog domena.

U saglasnosti sa navedenom upotrebom pronalaska poželjno je da generisani interspecijski specifični vezivni domen je domen humanog porekla.

Tačka 12. Upztreba prema tački 11, gde interspecijskii specifični vezivni domen je antitelo.

Tačka 13. Upotreba prema tački 12, gde antitelo je jednolančano antitelo.

Tačka 14. Upotreba prema tački 12 do 13, gde antitelo je bispecifično antitelo.

[0138]Ove i druge realizacije su opisane i obuhvaćene opisom i Primerima predmetnog pronalaska. Rekombinantne tenike i metode u imunologiji su opisane npr. u Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition 2001; Lefkovits; lmmunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002. Dodatna literatura koja se tiče bilo čega od antitela, metoda, upotreba i jedinjenja koje će se upotrebiti u saglasnosti sa predmetnim pronalaskom može se pronaćivjavnim bibliotekma i bazama podataka, korišćen>em, na primer, elektronskih uređaja Na p-imer može se koristiti javna baza podataka "Medline", dostupna na Internetu, na primer, pod htto://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Druge baze podataka i adrese kao što su hf'o://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ili izlistane na EMBL-services homepage pod http://www embl.de/services/index.html su poznate prosečnom stručnjaku i mogu se takođe dobiti korišćeniem, npr., http://www. google.com.

[0139] Slike prikazuju:

Slika 1

Fuzija N-terminalnih aminokiselina 1-27 CD3 epsilon primata sa heterolognim solubilnim proteinom

Slika 2

Slika prikazuje srednje vrednosti apsorpcije dobijene na po četiri paralelna uzorka merena ELISA probom koja detektuje prisustvo konstrukta sa N-terminalnim amino kiselinama od 1-27 zrelog humanog CD3 epsilon lanca fuzionisanim sa zglobnim regionom i Fc gama delom humanog lgG1 i C-terminalnim markerom sa 6 Histidina u supernatantu prolazno transfektovanih ćelija 293. Prva kolona, označena kao "27 aa huCD3E" prikazuje srednje vrednosti apsorpcije za konstrukt, druga kolona, označena kao "irrel. SN" prikazuje srednje vrednosti za supernatant ćelija 293, transfektovanih irelevantnim konstruktom, kao negativna kontrola. Poređenje vrednosti dobijenih za konstrukt sa vrednostima dobijenim za negativnu kontrolu jasno pokazuje prisustvo rekc-noinantnog konstrukta.

Slika 3

Slika prikazuje srednje vrednosti apsorpcije dobijene na po četiri paralelna uzorka merena ELISA probom koja detektuje vezivanje molekula koji se vezuju za anti-CD3 interspecijski specifično, u vidu sirovih preparata peripalazmatski eksprimiranih jednolančanih antitela, za konstrukt sa N-terminalnim amino kiselinama od 1-27 zrelog CD3 epsilon lanca čoveka fuzionisanog sa zglobnim regionom i Fc gama delom humanog lgG1 i C-terminalnim markerom His6. Sleva na desno, kolone prikazuju srednje vrednosti apsorpcije za specifičnosti označene kao A2J HLP, I2C HLP, E2M HLP, F70 HLP, G4H HLP, H2C HLP, E1L HLP, F12Q HLP, F6A HLP i H1E HLP. Krajni?desna kolona, označena kao "neg. contr." prikazuje srednje vrednosti apsorpcije za pre<p>arate mišjih jednolančanih antitela na CD3 čoveka kao negativne kontrole. Poređenje vrednosti dobijenih za anti-CD3 specifičnosti sa vrednostima dobijenim za negativnu kontrolu jasno pokazuje jako vezivanje anti-CD3 specificičnosti za N-*ermins!ne amino kisline od 1-27 zrelog humanog CD3 epsilon lanca. ;Slika 4;Fuzija N-terminalnih amino kiselina od 1-27 CD3 epsilon primata sa heterolognim proteinom vezanim za membanu. ;Slika 5;Histogrami različitih transfektanata testiranih FACS probom koja detektuje prisustvo rekombinantnog transmembranskog fuzionisanog proteina koji se sastoji od EpCAM cinomolgusa i N-terminalnih 1-27 amino kiselina CD3 epsilon lanca ljudi, majmuna marmoseta, tamarina, veverica majmuna, kao i domaćih svinja. Histogrami sleva nadesno i od vrha do kraja pokazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju konstrukte sa 27-merom čoveka, 27-merom marmoseta, 27-merom tamarina, 27-merom majmuna veverice, odnosno 27-merom svinje. U individualnim prikazima tanka linija predstavlja uzorak inkubiran u PBS sa 2% FCS, umesto sa anti-Flag M2 antitelom, kao negativna kontrola, a debela linija prikazuje uzorak inkubiran sa anti-Flag M2 antitelom. Za svaki konstrukt, histogrami prikazuju vezivanje anti-Flag M2 antitela za transfektante, što jasno pokazuje ekspresiju rekombinantnih konstrukata na transfektantima. ;Slika6 ;Histogram različitih transfektanata testiranih FACS probom koja detektuje vezivanje interspecijski specifičnih anti-CD3 vezivnih molekula u vidu sirovih preparata peripalazmatski eksprimiranih jednolančanih antitela za N-terminalne amino kiseline od 1-27 CD3 epsilon lanca čoveka, marmoseta, tamarina, odnosno majmuna veverice, fuzionisanog sa EpCAM cinomolgusa. ;Slika 6A: ;Histogrami sleva nadesno i od vrha do kraja pokazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju 1-27 CD3-EpCAM sa 27- merom čoveka testirane sa vezivnim molekulima specifičnim za CD3, označenih kao H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP, odnosno G4H ;HLP. ;Slika 6B: ;Histogrami sleva nadesno i od vrha do kraja pokazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju 1-27 CD3-EpCAM sa 27- merom marmoseta testirane sa vezivnim molekulima specifičnim za CD3, označenim kao H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP, odnosno G4H HLP. ;Slika 6C:;Histogrami sleva nadesno i od vrha do kraja pokazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju 1-27 CD3-EpCAM sa 27- merom tamarina testirane sa vezivnim molekulima specifičnim za CD3, označenim kao H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP, odnosno G4H HLP. ;Slika 6D:;Histogrami sleva nadesno i od vrha do kraja pokazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju 1-27 CD3-EpCAM sa 27- merom majmuna veverice testirane sa vezivnim molekulima specifičnim za CD3, označenim kao H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP, odnosno G4H HLP. ;Slika 6E:;Histogrami sleva nadesno i od vrha do kraja pokazuju rezultate za transfektante koji eksprimiraju 1-27 CD3-EpCAM sa 27- merom svinje testirane sa vezivnim molekulima specifičnim za CD3, označenim kao H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP, odnosno G4H ;HLP. ;U individualnim prikazima tanka linija predstavlja uzorak inkubiran sa preparatom mišjeg jednolančanog antitela na CD3 čoveka, kao negativna kontrola, a debela linija prikazuje uzorak inkubiran sa odgovarajućim naznačenim antitelom na CD3. Uzimajući u obzir izostanak vezivanja za transfektante sa 27-merom svinje, i nivoe ekspresije konstrukata prikazanih na Slici 5, histogrami pokazuju specifično i jako vezivanje testiranih anti-CD3 specifičnosti potpuno interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela čoveka na ćelije koje eksprimiraju rekombinantne transmembranske fuzionisane proteine koji sadrže N-terminalne amino kiseline 1-27 CD3 epsilon lanca čoveka, marmoseta, tamarina, majmuna veverice fuzionisane sa EpCAM cinomolgusa, te prema tome pokazuju interspecijsku specifičnost vezivnih molekula za anti-CD3 za više primata. ;Slika 7;FACS proba za detekciju CD3 epsilona čoveka na transfektovanim mišjim EL4 T ćelijama. Grafička analiza pokazuje histograme. Debela linija prikazuje transfektovane ćelije inkubirane sa anti-humanim CD3 antitelom UCHT-1. Tanka linija predstavlja ćelije inkubirane sa kontrolom koju čini lgG1 izotip miša. Veivanje anti CD3 antitela UCHT1 jasno pokazuje ekspresiju CD3 epsilon lanca čoveka na površini transfektovanih mišjih EL4 T ćelija. ;Slika 8;Vezivanje interspecijski specifičnih anti-CD3 antitela za alaninske mutante u eksperimentu gde je vršena pretraga alaninom. U individualnim slikama, kolone prikazuju, sdesna nalevo, izračunate vezivne vrednosti u arbitrarnim jedinicama na logaritamskoj skali za transfektante prirodnim tipom (WT, od engl. wild-type) i alaninskim mutantima od položaja 1 do 27. Vezivne vrednosti su izračunate iz sledeće formule: ;U ovoj jednačinivalue_ Sample(Uzorak) znači vrednost u arbitrarnim jedinicama vezivanja koje opisuju stepen vezivanja anti-CD3 antitela za specifičan alaninski mutant, kako je prikazano na ovoj slici. Uzorak predstavlja geometrijsku srednju vrednost fluorescencije dobijenu za specifično anti-CD3 antitelo testirano za specifičan transfektant pretragom alaninom.neg_ Contr.predstavlja geometrijsku srednju vrednost fluorescencije dobijenu za negativnu kontrolu testiranu za specifičan alaninski mutant,UCHT-*\predstavlja geometrijsku srednju vrednost fluorescencije dobijenu za UCHT-1 antitelo testirano za specifičan alaninski mutant,WTpredstavlja geometrijsku srednju vrednost fluorescencije dobijenu za specifično anti-CD3 antitelo testirano na transfektant prirodnim tipom, x specifikuje dati transfektant, y specifikuje odgovarajuće anti-CD3 antitelo awtspecifikuje da je dati transfektant prirodni tip. Pojedinačni položaji alanina u mutantu označeni su po jednim slovom koje predstavlja amino kiselinu u prirodnom tipu i brojem datog položaja.

Slika 8A:

Slika prikazuje rezultate za interspecijski specifično anti CD3 antitelo A2J HLP koje se eksprimira kao himerni molekul IgG. Smanjena vezivna aktivnost nalazi se za mutacije sa alaninom na položaju 4 (asparagin), na položaju 23 (treonin) i na položaju 25 (izoleucin). Potpun gubitak vezivanja nalazi se za mutacije u alanin na položaju 1 (glutamin), na položaju 2 (aspartat), na položaju 3 (glicin) i na položaju 5 (glutamat).

Slika 8B:

Slika prikazuje rezultate za interspecijski specifično anti CD3 antitelo E2M HLP, koje se eksprimira kao himerni molekul IgG. Smanjena vezivna aktivnost nalazi se za mutacije sa alaninom na položaju 4 (asparagin), na položaju 23 (treonin) i na položaju 25 (izoleucin). Potpun gubitak vezivanja nalazi se za mutacije u alanin na položaju 1 (glutamin), na položaju 2 (aspartat), na položaju 3 (glicin) i na položaju 5 (glutamat).

Slika 8C:

Slika prikazuje rezultate za interspecijski specifično anti CD3 antitelo H2C HLP, koje se eksprimira kao himerni molekul IgG. Smanjena vezivna aktivnost nalazi se za mutacije sa alaninom na položaju 4 (asparagin). Potpun gubitak vezivanja nalazi se za mutacije u alanin- glutamin na položaju 1 (glutamin), na položaju 2 (aspartat), na položaju 3 (glicin) i na položaju 5 (glutamat).

Slika8D:

prikazuje rezultate za interspecijski specifično anti CD3 antitelo F12Q HLP, testirano kao periplazmatski eksprimirano jednolančano antitelo. Potpun gubitak vezivanja nalazi se za mutacije u alanin na položaju 1 (glutamin), na položaju 2 (aspartat), na položaju 3 (glicin) i na položaju 5 (glutamat).

Slika 9

FACS proba koja detektuje vezivanje interspecijski specifičnog anti-CD3 vezivnog molekula H2C HLP za CD3 čoveka, sa i bez N-terminalnog His6 markera.

Histogrami su dobijeni na EL4 ćelijama, transfektovanih prirodnim tipom CD3 epsilon lanca čoveka (levi histogram) ili CD3 epsilon lancem sa N-terminalnim His6 markerom (desni histogram), testiranim FACS probom koja detektuje vezivanje interspecijski specifičnog vezivnog molekula H2C HLP. Uzorci su inkubirani sa odgovarajućim izotipom kao negativnom kontrolom (tanka linija), anti-CD3 antitelom čoveka UCHT-1 kao pozitivnom kontrolom (tačkasta linija) i interspecijski-specifičnim anti-CD3 antitelom H2C HLP u obliku himernog IgG molekula (debela linija).

Histogram pokazuje uporedivo vezivanje UCHT-1 antitela za oba transfektanta u poređenju sa kontrolnim izotipom, što pokazuje ekspresiju oba rekombinantna konstrukta. Histogram pokazuje takođe vezivanje anti-CD3 vezivnog molekula H2C HLP samo za prirodan CD3 epsilon lanac, ali ne i za His6-humani CD3 epsilon lanac. Ovi rezultati pokazuju da je slobodan N-kraj bitan za vezivanje interspecijski specifičnog anti-CD3 vezivnog molekula H2C HLP.

Slika 10

Vezivanje do zasićenja EGFR-21-63 LH x H2C za PBMC pozitivan na CD3 čoveka, da bi se FACS analizom odredila KD vrednost vezivanja CD3 za ćelije. Proba je izvedena kao što je opisano u Primeru 7.

Slikali

Analiza pomoću FACS vezivanja određenih interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata za CHO ćelije transfektovane humanim EGFR, humanu CD3+ T ćelijsku liniju HPB-ALL, CHO ćelije transfektovane EGFR cinomolgusa i T ćelijsku liniju makakija 4119 LnPx. Bojenje FACS vršeno je kao što je opisano u Primeru 12. Debela linija predstavlja ćelije inkubirane sa 2 ug/ml prečišćenog proteina, koje su zatim inkubirane sa anti-his antitelom i obeleženim PE antitelom za detektovanje. Tanka linija histograma predstavlja negativnu kontrolu: ćelije inkubirane samo sa anti-his antitelom i detekcionim antitelom.

Slika 12

Citotoksična aktivnost izazvana određenim interspecijski specifičnim jednolančanim konstruktom specifičnim za EGFR, preusmerena na navedene ćelijske linije. A) i B) Stimulisane CD4-/CD56- humane PBMC korišćene su kao efektorske ćelije, CHO ćelije, transfektovane humanim EGFR kao ciljne ćelije. Proba je vršena kao što je opisano u Primeru 13.

Slika 13

Citotoksična aktivnost izazvana određenim interspecijski specifičnim jednolančanim konstruktom specifičnim za EGFR, preusmerena na navedene ćelijske linije.A) i B) T-ćelijska linija 4119 LnPx makakija korišćena je kao efektorske ćelije, CHO ćelije, transfektovane EGFR cinomolgusa kao ciljne ćelije. Proba je vršena kao što je opisano u Primeru 13.

Slika 14

Analiza vezivanja pomoću FACS određenih interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata za CHO ćelije transfektovane humanim MCSP D3, humanu

CD3+ T ćelijsku liniju HPB-ALL, CHO ćelije transfektovane MCSP D3 cinomolgusa i T ćelijska linija makakija 4119 LnPx. Bojenje FACS vršeno je kao što je opisano u Primeru 17. Debela linija predstavlja ćelije inkubirane sa 2 ug/ml prečišćenog proteina, koje su zatim inkubirane sa anti-his antitelom i obeleženim PE antitelom za detektovanje. Tanka linija histograma predstavlja negativnu kontrolu: ćelija inkubiranih samo sa anti-his antitelom i detekcionim antitelom

Siika15Analiza vezivanja pomoću FACS određenih interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata za CHO ćelije transfektovane humanim MCSP D3, humanu CD3+ T ćelijsku liniju HPB-ALL, CHO ćelije transfektovane MCSP D3 cinomolgusa i T ćelijska linija makakija 4119 LnPx. Bojenje FACS vršeno je kao što je opisano u Primeru 17. Debela linija predstavlja ćelije inkubirane sa 2 ug/ml prečišćenog proteina, koje su zatim inkubirane sa anti-his antitelom i obeleženim PE antitelom za detektovanje. Tanka linija histograma predstavlja negativnu kontrolu: ćelija inkubiranih samo sa anti-his antitelom i detekcionim antitelom

Slika 16

Analiza vezivanja pomoću FACS određenih interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata za CHO ćelije transfektovane humanim MCSP D3, humanu CD3+ T ćelijsku liniju HPB-ALL, CHO ćelije transfektovane MCSP D3 cinomolgusa i T ćelijsku liniju makakija 4119 LnPx. Bojenje FACS vršeno je kao što je opisano u Primeru 17. Debela linija predstavlja ćelije inkubirane sa 2 ug/ml prečišćenog monomernog proteina, koje su zatim inkubirane sa anti-his antitelom i obeleženim PE antitelom za detektovanje. Tanka linija histograma predstavlja negativnu kontrolu: ćelija inkubiranih samo sa anti-his antitelom i detekcionim antitelom

Slika 17

Citotoksična aktivnost izazvana određenim interspecijski specifičnim jednolančanim konstruktima specifičnim za MCSP, preusmerena na navedene ciljne ćelijske linije. A) Stimulisane CD4-/CD56- humane PBMC korišćene su kao efektorske ćelije, CHO ćelije, transfektovane humanim MCSP D3 kao ciljne ćelije. B) T-ćelijska linija 4119 LnPx makakija korišćena je kao efektorske ćelije, CHO ćelije, transfektovane MCSP D3 cinomolgusa kao ciljne ćelije. Proba je vršena kao što je opisano u Primeru 18.

Slika 18

Citotoksična aktivnost izazvana određenim interspecijski specifičnim jednolančanim konstruktima specifičnim za MCSP, preusmerena na navedene ciljne ćelijske linije. A) i B) T-ćelijska linija 4119 LnPx makakija korišćena je kao efektorske ćelije, CHO ćelije, transfektovane MCSP D3 cinomolgusa kao ciljne ćelije. Proba je vršena kao što je opisano u Primeru 18.

Slika 19

Citotoksična aktivnost izazvana određenim interspecijski specifičnim jednolančanim konstruktima specifičnim za MCSP, preusmerena na navedene ciljne ćelijske linije.. A) i B) Stimulisane CD4-/CD56- humane PBMC korišćene su kao efektorske ćelije, CHO ćelije, transfektovane humanim MCSP D3 kao ciljne ćelije. Proba je vršena kao što je opisano u Primeru 18.

Slika 20

Citotoksična aktivnost izazvana određenim interspecijski specifičnim jednolančanim konstruktima specifičnim za MCSP, preusmerena na navedene ciljne ćelijske linije. A) Stimulisane CD4-/CD56- humane PBMC korišćene su kao efektorske ćelije, CHO ćelije, transfektovane humanim MCSP D3 kao ciljne ćelije. B) T-ćelijska linija 4119 LnPx makakija korišćena je kao efektorske ćelije, CHO ćelije, transfektovane MCSP D3 cinomolgusa kao ciljne ćelije. Proba je vršena kao što je opisano u Primeru 18.

Slika 21

Citotoksična aktivnost izazvana određenim interspecijski specifičnim jednolančanim konstruktima specifičnim za MCSP, preusmerena na navedene ciljne ćelijske linije. A) Stimulisane CD4-/CD56- humane PBMC korišćene su kao efektorske ćelije, CHO ćelije, transfektovane humanim MCSP D3 kao ciljne ćelije. B) T-ćelijska linija 4119 LnPx makakija korišćena je kao efektorske ćelije, CHO ćelije, transfektovane MCSP D3 cinomolgusa kao ciljne ćelije. Proba je vršena kao što je opisano u Primeru 18.

Slika 22

Stabilnost u plazmi MCSP i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela testirana merenjem citotoksične aktivnosti izazvane uzorcima određenih jednolančanih konstrukata inkubiranih sa 50% humanom plazmom na 37°C i 4°C tokom 24 sata ili uz dodavanje 50% humane plazme neposredno pred testiranje citotoksičnosti ili bez dodavanja plazme. CHO ćelije, transfektovane humanim MCSP korišćene su kao ciljna ćelijska linija, a stimulisane CD4-/CD56- humane PBMCs su korišćene kao efektorske ćelije.. Proba je vršena kao što je opisano u Primeru 19.

Slika 23

Analiza vezivanja pomoću FACS navedenih interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih konstrukata za CHO ćelije transfektovane humanim HER2, humanu CD3+ T ćelijsku liniju HPB-ALL, CHO ćelije transfektovane humanim HER2, i T ćelijsku liniju makakija 4119 LnPx. Bojenje FACS vršeno je kao što je opisano u Primeru 23.4. Debela linija predstavlja ćelije inkubirane sa 2 ug/ml prečišćenog bispecifičnog jednolančanog konstrukta. Tanka linija predstavlja negativne kontrole. Kao negativna kontrola korišćen je PBS sa 2% FCS. Za svaki interspecijski specifičan, bispecifičan jednolančani konstrukt histogrami pokazuju specifično vezivanje konstrukta za HER2 čoveka i makakija i CD3 čoveka i makakija

Slika 24

Dijagrami prikazuju rezultate testova oslobađanja hroma, čime se meri citotoksična aktivnost izazvana određenim interspecijski specifičnim jednolančanim konstrukima specifičnim za HER2, preusmerenim na navedene ciljne ćellijske linije. Korišćene su i navedene efektorske ćelije. Probe su vršene kao što je opisano u Primeru 23.5. Dijagrami jasno pokazuju za svaki prikazani konstrukt snažno regrutovanje citotoksične aktivnosti efektorskih ćelija prema CHO ćelijama transfektovanim sa HER2 čoveka, odnosno makakija.

Slika 25

Analiza periplazmatičnih preparata koji sadrže fragmente proteina scFv sa Flag markerom iz selektovanih klonova pomoću ELISA probe specifične za CD3. Periplazmatični preparati proteinskih fragmenata solubilnog scFv dodavani su u ležišta ELISA ploče, koja su bila prevučena solubilnim humanim CD3 epsilon (ak 1-27)-Fc fuzionisanim proteinom i koja su bila dodatno blokirana PBS-om sa 3% BSA. Detekcija je vršena monoklonskim obeleženim antitelom posle čega je dodavan streptavidin konjugovan sa peroksidazom. ELISA je razvijana rastvorom supstrata ABTS. Vrednosti OD (y osa) merene su na 405 nm pomoću ELISA čitača. Nazivi klonova predstavljeni su na x osi.

Slika 26

Analiza periplazmatičnih preparata koji sadrže fragmente proteina scFv sa Flag markerom iz selektovanih klonova pomoću ELISA probe. Isti periplazmatični preparati proteinskih fragmenata solubilnog scFv kao na slici 25 dodavani su u ležišta ELISA ploče, koja nisu bila prevučena humanim CD3 epsilon (ak 1-27)-Fcfuzionisanim proteinom, nego hulgGI (Sigma) i koja su bila blokirana 3% BSA u PBS-u. Detekcija je vršena monoklonskim obeleženim antitelom posle čega je dodavan streptavidin konjugovan sa peroksidazom. ELISA je razvijana rastvorom supstrata ABTS. Vrednosti OD (y osa) merene su na 405 nm pomoću ELISA čitača. Nazivi klonova predstavljeni su na x osi.

[0140]Ovaj pronalazak je dodatno opisan preko sledećih ilustrativnih, neograničavajućih primera koji omogućavaju bolje razumevanje ovog pronalaska i mnogih njegovih prednosti.

PRIMERI

1. Identifikacija CD3epsilon sekvenci iz uzoraka krvi primata, osim čoveka

[0141]Za identifikaciju CD3epsilon su uzeti uzorci krvi sledećih primata:Callithrixjacchus, Saguinus oedipusiSaimiris scivreus.Pripremljeni su uzorci sveže pune krvi tretirani heparinom za izolovanje ukupne ćelijske RNK prema proceduri poizvođača (OlAamp RNA Blood Mini Kit, Oiagen). Ekstrahovana iRNK je transkribovana u cDNK prema objavljenim procedurama. Ukratko, 10 ul staložene RNK inkubirano je 10 minuta sa 1,2 ul 10x smešom heksanukleotida (Roche) na 70 °C , i čuvano na ledu. Reakciona smeša koja se sastojala od 4 ul pufera 5x superscript II, 0,2 ul 0,1 M ditiotritola, 0,8 ul superscript II (Invitrogen), 1,2 ul dezoksiribonukleozid trifosfata (25 uM), 0,8 ul Inhibitora RNaze (Roche) i 1,8 ul vode bez DNaze i RNaze (Roth). Reakciona smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi 10 minuta, a zatim na 42 °C tokom 50 minuta i na 90 °C tokom 5 minuta. Reakcija je ohlađena na ledu pre dodavanja 0,8 ul RNazeH (1 U/ul, Roche) i inkubirana 20 minuta na 37 °C.

[0142]Prvi lanci cDNK iz svake vrste prošli su kroz 35 odvojenih ciklusa polimerazne lančane reakcije korišćenjem Taq DNK polimeraze (Sigma) i sledećih kombinacija graničnika (ili prajmera, od engl. primer) dizajniranih na osnovu istraživanja baza podataka, levi graničnik

(forvvard primer) 5'-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3' (SEQ ID NO: 377); desni graničnik (reverse primer) 5-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3' (SEQ ID NO: 378);. Umnožene trake od 550 bp prečišćene su na gelu (Gel Extraction Kit, Oiagen) i sekvencirane (Sekv iserve, Vaterstetten/Germanv, vidi listu sekvenci).

CD3epsilonCallithrix jacchus - a

Nukleotidi

[0143]

Amino kiseline

[0144]

CD3epsilonSa<g>uinus oedious - a

Nukleotidi

[0145]

Amino kiseline

[0146]

CD3epsilonSaimiris ciureus - a

Nukleotidi

[0147]

Amino kiseline

[0148]

2. Stvaranje fragmenata (scFv) interspecijski-specifičnog jednolančanog antitela koje se vezuje za N-terminalne amino kiseline 1-27 CD3epsilon čoveka i različitih primata koji nisu šimpanze

2.1. Imunizacija miševa korišćenjem N-terminusa CD3epsilon odvojenog od njegovog nativnog CD3-konteksta fuzionisanjem sa nekim solubilnim heterolognim proteinom

[0149]Deset nedelja stari F1 miševi, nastali ukrštanjem balb/c x C57cmi imunizovani su CD3epsilon-Fc fuzionisanim proteinom koji ima krajnjih N-terminalnih 1-27 amino kiselina zrelog CD3epsilon lanca (1-27 CD3-Fc) čoveka i/ilisaimirisa sciureusa(južnoamerički majmun veverica). U tom cilju, svaki mišje intraperitonealno injeciran sa 40 ug 1-27 CD3-Fc fuzionisanog proteina sa 10 nmol CpG-Oligonukleotida (5'-tccatgacgttcctgatgct-3') modifikovanih tioatom, u 300 ul PBS. Miševi su dobili buster imunizaciju na isti način posle 21, 42 i, opciono, 63 dana. Deset dana posle prve buster imunizacije uzeti su uzorci krvi i u serumu ELISA-om određen titar antitela na 1-27 CD3-Fc fuzionisanog proteina iwa. Pored toga, titar na CD3-pozitivnu humanu T ćelijsku liniju HPBall testiran je protočnom citometrijom (flovv cytometry) prema standardnim procedurama. Titri seruma bili su značajno veći u imunizovanim životinjama nego u neimunizovanim.

2.2. Stvaranje biblioteke imunih mišjih antitela scFv: Konstruisanje kombinatorijske

biblioteke antitela i eksponiranje faga

[0150]Tri dana posle poslednje injekcije, ćelije slezine miša su uzete za dobijanje ukupne RNK prema standardnim postupcima.

[0151]Biblioteka DNK-fragmenata imunoglobulinskog (Ig) varijabilnog regiona (VK) lakog lanca (kapa) i Ig varijabilnog regiona (VH) teškog lanca miša konstruisana je pomoću RT-PCR na RNK slezine miša upotrebom graničnika specifičnih za VK i VH. cDNK je sintetisana standardnim postupcima.

[0152]Graničnici su dizajnirani tako da naprave mesto prepoznavanja za 5'-Xhol i 3'-BstEII u umnoženim V-fragmentima teškog lanca i mesto prepoznavanja za 5'-Sacl i 3'-Spel u umnoženim fragmentima VK DNK.

[0153]Za PCR-umnožavanje VH DNK-fragmenata svaki od osam različitih graničnika specifičnih za 5'-VH-familiju (MVH1(GC)AG GTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT; MVH2

GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT; MVH3 CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT; MVH4 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA; MVH5 GA(AG) GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA; MVH6 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT; MVH7 GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA; MVH8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT) kombinovan je sa jednim 3'-VH graničnikom (3'MuVHBstEII tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cea g); za PCR umnožavanje fragmenata VK-lanca sedam različitih graničnika za 5'-VK-familiju (MUVK1 CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT; MUVK2 CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC; MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA; MUVK4 CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA; MUVK5 CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA; MUVK6 CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA; MUVK7 CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA) kombinovano je sa jednim 3'-VK graničnikom (3'MuVkHindlll/BsiW1 tgg tgc act agt cgt acg ttt gat ete aag ctt ggt ccc).

[0154]Za PCR amplifikaciju korišćen je sledeći program: denaturacija na 94°C tokom 20 sec; renaturacija graničnika na 52°C 50 sec, produženje graničnika na 72°C tokom 60 sec i 40 ciklusa, posle čega dolazi finalno produžavanje na 72<O0>C, 10 min.

[0155]450 ng fragmenata lakog kapa lanca (obrađenih Sacl-Spel) ligirani su sa 1400 ng fagemidnim pComb3H5Bhis (veliki fragment obrađen enzimima Sacl-Spel). Nastalom kombinatorijskom bibliotekom antitela transformisane su elektroporacijom elektrokompetentneEscherichia coli XL1Blue ćelije u 300 ul (2,5 kV, kiveta sarazmakom između elektroda 0,2 cm, 25 uFD, 200 Ohm, Biorad gene-pulser) dajući biblioteku sa više od 10<7>nezavisnih klonova. Posle jednog sata fenotipske ekspresije selektovani su pozitivni transfonmanti na rezistenciju na karbenicilin koju kodira vektor pComb3H5BHis, u 100 ml tečne kulture u super supi (SB, od super broth), preko noći. Ćelije su pokupljene centriugiranjem i plazmid je izolovan korišćenjem kupovnog kompleta za izolovanje plazmida (OJagen).

[0156]2800 ng ove plazmidne DNK koja sadrži VK-biblioteku (obrađenu enzimima Xhol-BstEII, veliki fragmenti) ligirano je sa 900 ng V-fragmentima teškog lanca (obrađenih enzimima Xhol-BstEII) i ponovo su njima transformisana dva alikvota od po 300 ul elektrokompetentnihE. coliXL1 Blue ćelija elektroporacijom (2,5 kV, kiveta sa rastojanjem između elektroda od 0,2 cm, 25 uFD, 200 Oma) čime se dobija ukupna biblioteka VH-VK scFv (jednolančani varijabilan fragment) veličine više od 10<7>nezavisnih klonova.

[0157]Posle fenotipske ekspresije i spore adaptacije na karbenicilin, ćelijeE. colikoje sadrže biblioteku antitela prenete su u selekcioni medijum SB- karbenicilin (50 ug/mL). ĆelijeE. colicells koje sadrže biblioteku antitela su zatim inficirane infektivnom dozom od 10<12>čestica pomoćničkog faga VCSM13, što je dovelo do proizvodnje i sekrecije filamentozng faga M13, gde čestice faga sadrže jednolančanu pComb3H5BHis-DNK koja kodira mišji scFv-fragment i ispoljava odgovarajući scFv-protein kao translacionu fuziju sa proteinom III omotača faga. Ovaj skup faga koji eksponira biblioteku antitela korišćen je kasnije za selekciju tela koja vezuju antigen.

2.3.Selekcija molekula koji se specifično vezuju za CD3 zasnovana na eksponiranima

fazi ma

[0158]Fagna biblioteka koja sadrži kloniran repertoar scFv sakupljena je iz supernatanta taloženjem pomoću PEG8000/NaCI i centrifugiranjem. Oko 10<11>do 10<12>scFv čestica faga resuspendovano je u 0,4 ml PBS/0,1% BSA i inkubirano sa 10<5>do 10<7>Jurkat ćelija (CD3-pozitivna T-ćelijska linija), 1 sat na ledu, uz sporo mešanje. Ove Jurkat ćelije su prethodno uzgajene u RPMI medijumu obogaćenom fetalnim goveđim serumom (10 %), glutaminom i penicilin/streptomcinom, prikupljene centrifugiranjem, oprane u PBS i resuspendovane u PBS/1 % FCS (koji sadrži Na azid). Fazi scFv koji se ne vezuju specifično za Jurkat ćelije elimisani su sa najviše pet pranja PBS/1 % FCS-om (koji sadrži Na azid). Posle pranja, vezane materije su eluirane sa ćelija resuspendovanjem ćelija u HCI-glicin pH 2,2 (10 min inkubianja, a zatim vorteksovanje) i posle neutralisana 2 M Tris-om pH 12, eluat je korišćen za inficiranje sveže, neinficirane kulture E. coli XL1 Blue (OD600> 0,5). KulturaE. colikoja sadrži ćelije E. coli uspešno transdukovane kopijom fagemida koja kodira scfv-fragment čoveka, ponovo je selektovana na rezistenciju na karbenicilin, a zatim inficirana VCMS 13 pomoćničkim fagom da bi se započela druga runda eksponiranja antitela iin vitroselekcija.Uglavnom, ukupno je izvođeno 4 do 5 tura selekcije.

2.4. Skrinovanje za nalaženje molekula koji se specifično vezuju za CD3-

[0159]Plazmidna DNK, koja odgovara 4. i 5. rundi paninga, izolovana je iz kulturaE. coli posleselekcije. Za dobijanje solubilnog scFv-proteina, fragmenti VH-VL-DNK su isecani iz plazmida (Xhol-Spel). Ovi fragmenti su klonirani preko istih restrikcionih mesta u plazmid pComb3H5BFIag/His koji se od ishodnog plazmida pComb3H5BHis razlikuju po tome što ekspresioni konstrukt (npr. scFv) uključuje Flag-tag (TGD YKDDDDK) između scFv i His6-tag, a dodatni proteini faga su deletirani. Posle ligacije, 100 ul E. coli TG1 ili XLI blue, kompetentnih za toplotni šok, transformirane su svakim skupom (različite runde paninga) plazmidnih DNK i zasejane LB-agar sa karbenicilinom. Pojedinačne kolonije su prebacivane u 100 ul LB karb (50 ug/ml).

[0160]£ coli transformisanepComb3H5BHis koji sadrži VL-and VH-segmente proizvode solubilan scFv u dovoljnim količinama posle isecanja fragmenta gena lili indukcije 1 mM IPTG-om. Blagodareći pogodnoj signalnoj sekvenci, scFv-lanac se eksportuje u periplazmu gde se pakuje u funkcionalnu konformaciju.

[0161]Sa transformacionih ploča uzimane su pojedinačne bakterijske kolonije E.coli TG1za peripalazmatične preparate na maloj skali i gajene u SB-medijumu (npr. 10 ml) kome su dodati 20 mM MgCI2i karbenicilin 50ug/ml i, posle sakupljanja, ponovo rastvoreni u PBS (npr. 1 ml). Posle četiri runde zamrzavanja na -70°C i otapanja na 37°C, spoljna membrana bakterija razorena temperaturnim šokom i solubilni periplazmatični proteini, uključujući cFv, oslobađani su u supernatant. Posle odstranjivanja celih ćelija i ćelijskih ostataka centrifugiranjem, supernatant koji sadrži antitela na CD3-scFv čoveka sakupljan je za dalja ispitivanja.

2.5. Identifikovanje molekula koji se specifično vezuju za CD3

[0162]Vezivanje izolovanih scFv proveravano je protočnom citometrijom na eukariotskim ćelijama koje na svojoj površini eksprimiraju heterologni protein koji na svom N-kraju eksponira prvih 27 N-terminalnih amino kiselina CD3epsilona.

[0163]Kao što je opisano u Primeru 4, prvih 1-27 amino kiselina N-kraja zrelog CD3 epsilon lanca receptornog kompleksa T ćelija čoveka (aminokiselinska sekvenca: QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT) fuzionisano je sa N-krajem transmembranskog proteina EpCAM tako da je N-kraj lociran na spoljnoj strani ćelijske površine. Osim toga, epitop FLAG umetnut je između N-kraja 1-27 CD3 epsilon sekvence i EpCAM sekvence. Ovaj fuzionisani proizvod eksprimira se u ćelijama bubrega embriona čoveka (HEK, od engl. human embvonic kidnev) i ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO).

[0164]Eukariotske ćelije koje eksponiraju prvih 27 amino kiselina N-kraja zrelog CD3epsilon drugih vrsta primata dobijene su na isti način zaSaimiri sciureus(majmun veverica) (N-terminalna aminokiselinska sekvenca CD3epsilon: QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT), zaCallithrix jacchus(N-terminalna aminokiselinska sekvenca CD3epsilon: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT) i zaSaguinus oedipus(N-terminalna aminokiselinska sekvenca CD3epsilon: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT).

[0165]Za protočnu citometriju inkubirano je 2,5x10<5>ćelija sa 50 ul supenatanta ili sa 5 ug/ml prečišćenih konstrukata u 50 ul PBS sa 2% FCS. Vezivanje konstrukata detektuje se pomoću anti-His antitela (Penta-His Antitelo, bez BSA, Oiagen GmbH, Hilden, FRG) u 2 ug/ml u 50 ul PBS sa 2% FCS. Kao reagens u drugom stupnju korišćen je F(ab')2 fragment prečišćen afinitivnom hromatografijom, konjugovan sa R-fikoeritrinom, kozji anti-mišji IgG (specifičan za Fc gama fragment), razblažen 1:100 u 50 ul PBS sa 2% FCS (Dianova, Hamburg, FRG). Uzorci su mereni na FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG).

[0166]Vezivanje je uvek potvrđivano protočnom citometrijom, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, na primarnim T-ćelijama čoveka i različitih primata (npr.saimiris sciureus, callithrix

jacchus, saguinus oedipus).

2.6. Stvaranje humanih/humanizovanih ekvivalenata scFvspecifičnihza CD3epsilon,

osim za čovečji

[0167]VH region mišjeg anti-CD3 scFv upoređen je sa sekvencama embrionskih antitela čoveka. Izabrana je sekvenca VH embrionskih antitela čoveka koja ima najveću homologiju sa drugim VH i izvršeno je direktno upoređivanje dve aminokiselinske sekvence. U tom okviru postoji čitav niz amino kiselina u drugim VH koje se razlikuju od amino kiselina regiona VH čoveka u tom okviru ("različiti okvirni položaji"). Neke od ovih amino kiselina mogu da doprinesu vezivanju i aktivnosti datog antitela za njegovu metu.

[0168]Da bi se konstruisala biblioteka koja sadrži mišje CDR i koja se razlikuje u svakom okvirnom položaju od odabrane VH sekvence čoveka, obe mogućnosti (i čovečja i maternalna mišja amino kiselina), sintetisani su izrođeni oligonukleotidi. Ovi oligonukleotidi se ugrađuju u različite položaje amino kiselina čoveka sa verovatnoćom od 75 % i kod miša sa verovatnoćom od 25 %. Za jedan VH čoveka, npr., mora se sintetisati šest ovih oligonukleotida koji će pokriti krajnji niz od oko 20 nukleotida. U tom cilju je svaki drugi graničnik bio antigraničnik (engl. antisense primer). Iz oligonukleotida su uklonjena restrikciona mesta potrebna za kasnije kloniranje.

[0169]Ovi graničnici mogu imati dužinu od 60 do 90 nukleotida, zavisno od broja graničnika potrebnih da pokriju celu V sekvencu.

[0170]Takvih, npr., šest graničnika pomešano je u jednakim količinama (npr. po 1 ul svakog graničnika (matični rastvori graničnika 20 to 100 uM) za 20 ul PCR reakcije) i dodato PCR smeši koja se sastoji od PCR pufera, nukleotida i Taq polimeraze. Ova smeša se inkubira u PCR aparatu 3 minuta na 94 °C, na 65 °C 1 minut, na 62°C 1 minut, na 59 °C 1 minut, na 56 °C 1 minut, na 52 °C 1 minut, na 50 °C 1 minut i na 72°C 10 minuta. Zatim se proizvod elektroforezira u agaroznom gelu i proizvodi dužine od 200 do 400 izoluju iz gela standardnim metodima.

[0171]Takav PCR proizvod se zatim koristi kao matrica za standardnu PCR reakciju korišćenjem graničnika koji obuhvataju N-terminalna i C-terminalna restrikciona mesta pogodna za kloniranje. Fragment DNK tačne veličine (za VH oko 350 nukleotida) izolovan je elektroforezom na agaroznom gelu standardnim metodima. Na taj način je umnoženo dovoljno VH DNK fragmenta. Ovaj fragment VH predstavlja sada skup fragmenata VH od kojih svaki ima različitu količinu mišjih i ljudskih amino kiselina na različitim okvirnim položajima (skup humanizovanih VH). Isti postupak je urađen i za VL region mišjeg anti-CD3 scFv (skup humanizovanih VL).

[0172]Skup humanizovanih VH se zatim kombinuje sa skupom humanizovanih VL u vektoru pComb3H5Bhis koji eksponira fage da bi se dobila biblioteka funkcionalnih scFv iz koje su, posle eksponiranja na filamentoznom fagu, selektovani molekuli koji se vezuju za CD3, skrinovani, identifikovani i potvrđeni kao što je već opisano za druge (mišje) ishodne anti-CD3 scFv. Pojedinačni klonovi su zatim analizirani na pogodne osobine i aminokiselinske sekvence. Birani su scFv koji su po aminokiselinskoj sekvenci imali najveću homologiju sa embrionskim V-segmentima čoveka, naročito oni gde bar jedan CDR od CDR I i II VH i CDR I i II VLkapa ili CDR I i II VLIambda ima više od 80% identične aminokiselinske sekvence sa najbližim CDR svih embrionskih V-segmenata čoveka. Anti-CD3 scFv su prevedeni u rekombinovana bispecifična jednolančana antitela, kao što je opisano u Primerima 10 i 16 koji slede, i dalje okarakterisana.

3.Stvaranje rekombinantnog fuzionog proteina sa 1-27 amino kiselina sa N-kraja CD3

epsilon lanca čoveka fuzionisanog sa Fc-delom nekog lgG1 (1-27 CD3-Fc).

3.1. Kloniranje i ekspresija 1-27 CD3-Fc

[0173]Kodirajuća sekvenca za amino kiseline od 1-27. N-kraja CD3 epsilon lanca čoveka, fuzionisana sa zglobnim regionom i Fc gama regionom imunoglobulina lgG1 čoveka, kao i sa markerom 6 Histidin Tag dobijena je sintezom gena standardnim postupcima (cDNK sekvence i aminokiselinske sekvence rekombinantnog fuzionisanog proteina navedene su kao SEQ ID br. 350 i 349). Sinteza genskog fragmenta bila je dizajnirana tako da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta, posle čega sledi 19 amino kiselina čeonog peptida imunoglobulina, a zatim slede, u pravilnom okviru čitanja, kodirajuća sekvenca prvih 27 amino kiselina ekstracelularnog dela zrelog CD3 epsilon lanca čoveka, pa kodirajuća sekvenca zglobnog regiona i Fc gama deo lgG1 čoveka, pa kodirajuća sekvenca markera 6 Histidin i stop kodon (Slika 1). Sinteza genskog fragmenta bila je takođe dizajnirana tako da uvede restrikciona mesta na početak i kraj cDNK koja kodira fuzionisani protein. Uvođenje restrikcionih mesta, EcoRI na 5' kraju i Sali na 3'kraju, koristi se za naredne postupke u kloniranju: Sintetisani genski fragment kloniran je preko EcoRI i Sali mesta u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) standardnim postupcima. Plazmid, čija je sekvenca proverena, korišćen je za transfekciju FreeStvle 293 Expression Svstem (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germanv) prema proceduri proizvođača. Posle 3 dana gajenja CD38 kulture, sakupljeni su supernatanti transfektanata i provereni na prisustvo rekombinovanog konstrukta ELISA probom. Kozje antitelo na IgG čoveka, antitelo specifično za Fc-gama fragment (nabavljeno od Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK) razblaženo je u PBS do 5 pg/ml i njime prevučena ležišta u MaxiSorp ELISA ploči sa 96 ležišta (Nunc GmbH & Co. KG, VViesbaden, Germanv). Za svako ležište korišćeno je po 100 ul, preko noći, na 4 °C. Ležišta su oprana PBS-om sa 0,05 % Tvveen 20 (PBS/Tween) i blokirana sa 3 % BSA u PBS (goveđi albumin, frakcija V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi (RT). Zatim su ležišta ponovo oprana sa PBS/Tvveen i inkubirana sa ćelijskim supernatantima 60 minuta na RT. Posle pranja, ležišta su inkubirana sa anti-His6 antitelom (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheim, Germanv) konjugovanim sa peroksidazom, razblaženim 1:500 uPBS sa 1 % BSA, 60 minuta na RT. Ležišta su zatim oprana sa 200 ul PBS/Tvveen i dodato je 100 pl SIGMAFAST OPD (SIGMAFAST OPD [o-fenilendiamin dihidrohlorid] supstratnog rastvora (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) prema uputstvu proizvođača. Reakcija je prekinuta dodavanjem 100 pl 1 M H2S04. Bojena reakcija je merena na PowerWaveX spektrofotometru za mikroploče (BioTek Instruments, Inc., VVinooski, Vermont, USA) na 490 nm i oduzimana je vrednost apsorpcije fona na 620 nm. Kao što je pokazano na Slici 2, prisustvo konstrukta, u poređenju sa irelevantnim supernatantima lažno transfektovanih HEK 293 ćelija, korišćenih kao negaarivne kontrole, bilo je jasno uočljivo.

3.2. Proba za vezivanje intraspecijski specifičnih jednolančanih antitela za 1-27 CD3-Fc.

[0174]Vezivanje sirovih preparata interspecijski specifičnih jednolančanih antitela specifičnih za CD3 epsilon koja se eksprimuju u periplazmi, za 1-27 CD3-Fc proveravano je ELISA probom.

Kozje antitelo na IgG čoveka, antitelo specifično za Fc-gama fragment (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK) razblaženo je u PBS do 5 pg/ml i njime prevučena ležišta u MaxiSorp ELISA ploči sa 96 ležišta (Nunc GmbH & Co. KG, VViesbaden, Germanv). Za svako ležište korišćeno je po 100 ul, preko noći, na 4 °C. Ležišta su oprana PBS-om sa 0,05 % Tvveen 20 (PBS/Tvveen) i blokirana sa 3 % BSA u PBS (goveđi albumin, frakcija V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) tokom 60 minuta na RT. Zatim su ležišta oprana sa PBS/Tvveen i inkubirana sa sirovim preparatima interspecijski specifičnih jednolančanih antitela koja se eksprimuju u periplazmi, kao što je gore opisano, tokom 60 minuta na RT. Posle pranja sa PBS/Tvveen, ležišta su inkubirana sa anti-Flag M2 antitelom (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) konjugovanim sa peroksidazom, razblaženim 1:10 000 u PBS sa 1 % BSA, 60 minuta na RT. Ležišta su zatim oprana sa PBS/Tvveen i inkubirana sa 100 ul SIGMAFAST OPD (SIGMAFAST OPD [o-fenilendiamin dihidrohlorid] supstratnog rastvora (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) prema uputstvu proizvođača. Bojena reakcija je prekinuta dodavanjem 100 ul 1 M H2S04. i merena na PowerWaveX spektrofotometru za mikroploče (BioTek Instruments, Inc., vVinooski, Vermont, USA) na 490 nm i oduzimana je vrednost apsorpcije fona na 620 nm. U poređenju sa mišjim jednolančanim antitelom anti CD3, nađeno je jako vezivanje interspecijski specifičnih jednolančanih antitela čoveka, specifičnih za CD3 epsilon, za 1-27 CD3-Fc konstrukt (Slika 3).

4. Stvaranje rekombinovanih transmembranskih fuzionisanih proteina od 1-27. amino

kiseline sa N-kraja CD3 epsilon iz različitih primata, osim šimpanza, fuzionisanih sa

EpCAM cinomolgus majmuna (1-27 CD3-EpCAM).

4.1. Kloniranjeiekspresija 1-27 CD3-EpCAM

[0175]CD3 epsilon izolovan je iz različitih primata, osim šimpanza (marmoset, tamarin, majmun veverica) i iz svinje. Kodirajuće sekvence 1-27 N-krajnjih amino kiselina CD3 epsilon lanca odraslog čoveka, običnog marmoseta( Callithrix jacchus),tamarina sa perikom( Saguinusoedipus),običnog majmuna veverice( Saimiri sciureus)i domaće svinje( Sus scrofa;koja se koristi kao negativna kontrola) fuzionisane sa N-krajem EpCAM cinomolgusa, obeleženim Flag markerom, dobijene su sintezom gena standardnim postupcima. cDNK sekvence i aminokiselinske sekvence rekombinovanih fuzionisanih proteina navedene su kao SEQ ID br. 351 do 360). Genske sinteze fragmenata dizajnirane su tako da sadrže prvo mesto za BsrGI, koje omogućuje fuziju u pravilnom okviru čitanja kodirajuće sekvence za 19 amino kiselina čeonog peptida imunoglobulina, koji je već prisutan u ciljnom ekspresionom vektoru, posle čega ide, u istom okviru čitanja, kodirajuća sekvenca prvih N-terminalnih 1-27 amino kiselina ekstracelularnog dela zrelih CD3 epsilon lanaca, pa, u istom okviru čitanja, kodirajuća sekvenca Flag markera i, u istom okviru čitanja, kodirajuća sekvenca EpCAM transmembranskog proteina cinomolgusa (Slika 4). Genske sinteze fragmenata su dizajnirane takođe i da uvedu restrikciono mesto na kraju cDNK koja kodira fuzioni protein. Uvedena restrikciona mesta BsrGI na 5' kraju i Sali na 3' kraju iskorišćena su u sledećim postupcima kloniranja. Fragmenti dobijeni genskom sintezom klonirani su preko BsrGI i Sali u derivat plazmida označenog kao pEF DHFR (pEF-DHFR je opisan u Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025), koji već sadrži kodirajuću sekvencu za 19 amino kiselina čeonog peptida imunoglobulina, standardnim postupcima. Plazmidi, čije su sekvence proverene, upotrebljene su za tranzijentnu transfekciju 293-HEK ćelija korišćenjem MATra-A Reagent (IBA GmbH, Gottingen, Germany) i 12 ug plazmidne DNK za adherovane 293-HEK ćelije u bocama za kulture od 175 ml, prema uputstvima proizvođača. Posle 3 dana gajenja u kulturi transfektanti su testirani na ekspresiju rekombinantnog transmembranskog proteina na površini ćelija pomoću FACS, prema standardnim postupcima. U tom cilju inkubirano je 2,5x10<5>ćelija sa anti-Flag M2 antitelom (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv), 5 ug/ml, u PBS sa 2% FCS. Vezano antitelo detektovano je F(ab')2 fragmentom, prečišćenim afinitivnom hromatografijom, kozjeg anti-mišjeg IgG, specifičnim za Fc-gama fragment, konjugovanim sa R-fikoeritrinom, 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany). Jasno je uočena ekspresija fuzionog rekombinantnog transmembranskog proteina, markiranog Flag-om, koji se sastoji od EpCAM cinomolgusa i 1.-27. N-terminalnih amino kiselina CD3 epsilon lanca čoveka, marmoseta, tamarina, majmuna veverice, odnosno svinje na transfektovanim ćelijama (Slika 5).

4.2. Vezivanje interspecijski specifičnih jednolančanih antitela anti-CD3 za 1-27 CD3-EpCAM

[0176]Vezivanje sirovih preparata periplazmatski eksprimovanih interspecijski specifičnih jednolančanih antitela anti CD3 za 1-27 N-terminalnih amino kiselina CD3 epsilon lanaca čoveka, marmoseta, tamarina, odnosno majmuna veverice, fuzionisanih sa Ep-CAM cinomolgusa testirano je FACS probom prema standardnim postupcima. U tom cilju inkubirano je 2,5x10<5>ćelija sa sirovim preparatima periplazmatski eksprimovanih interspecijski specifičnih jednolančanih antitela naCD3 (preparati su dobijeni kao što je gore opisano i standardnim procedurama) i jednolančanim mišjim antitelom na- CD3 čoveka, kao negativnom kontrolom. Kao sekundarno antitelo korišćeno je Penta-His antitelo (Oiagen GmbH, Hildesheim, Germany), 5 ug/ml u 50 ul PBS sa 2% FCS. Vezivanje antitela detektovano je F(ab')2 fragmentom, prečišćenim afinitivnom hromatografijom, kozjeg anti-mišjeg IgG, specifičnim za Fc-gama fragment, konjugovanim sa R-fikoeritrinom 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany). Kao što je prikazano na Slici 6 (A to E) nađeno je vezivanje jednolančanih antitela za transfektante koji eksprimuju rekombinantne transmembranske fuzione proteine koji se sastoje od 1-27 N-terminalnih amino kiselina CD3 epsilon čoveka, marmoseta, tamarina ili majmuna veverice, fuzionisanih sa EpCAM cinomolgusa. Nije nađeno vezivanje interspecijski specifičnih jednolančanih antitela za fuzioni protein koji se sastoji od 1-27 N-kraja CD3 epsilona svinje fuzionisanog sa EpCAM cinomolgusa, upotrebljenog kao negativna kontrola. Pokazana je multi primatna interspecijska specifičnost jednolančanih anti-CD3 antitela. Signali dobijeni sa anti Flag M2 antitelom i interspecijski specifičnim jednolančanim antitelima bili su uporedivi, što ukazuje na jaku vezivnu aktivnost interspecijski specifičnih jednolančanih antitela za N-terminalne amino kiselinae1-27 CD3 epsilona.

5. Analiza vezivanja interspecijski specifičnih anti-CD3 jednolančanih antitela pretragom

alaninom mišjih ćelija transfektovanih CD3 epsilon lancem čoveka i njegovim alaninskim

mutantima

5.1. Kloniranje i ekspresija humanog prirodnog CD3 epsilona

[0177]Kodirajuća sekvenca CD3 epsilon lanca čoveka dobijena je genskom sintezom standardnim postupcima (cDNK sekvence i aminokiselinska sekvence CD3 epsilon lanca čoveka navedene su kao SEQ ID br. 362 i 361). Sinteza genskog fragmenta bila je dizajnirana tako da ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta i restrikciona mesta na početku i kraju cDNK koja kodira CD3 epsilon čoveka. Uvedena restrikciona mesta EcoRI na 5' kraju i Sali na 3' kraju korišćena su u narednim postupcima kloniranja. Sintetisani genski fragment je zatim kloniran standardnim postupcima, preko EcoRI i Sali u plazmid označen kao pEF NEO. pEF NEO je izveden od pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) zamenom cDNK za DHFR sa cDNK za otpornost na neomicin, uobičajenim molekulskim kloniranjem. Plazmd proverene sekvence upotrebljen je za transfekciju mišje T ćelijske linije EL4 (ATCC No. TIB-39) gajene u RPMI sa stabilizovanim L-glutaminom, uz dodatak 10 % FCS, 1% penicilin/streptomicin, 1% HEPES, 1% piruvata, 1 neesencijalnih amino kiselina (sve od Biochrom AG Berlin, Germanv) na 37 °C, 95 %vlažnosti i 7 % C02. Transfekcija je obavljena pomoću SuperFect Transfection Reagent (Qiagen GmbH, Hilden, Germanv) i 2 ug plazmidne DNK prema uputstvu proizvođača. Posle 24 sata, ćelije su oprane sa PBS i ponovo gajene u navedenom medijumu za kulture, sa 600 ug/ml G418 za selekciju (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria). 16 do 20 dana posle transfekcije vidi se da preovlađuju otporne ćelije. Posle dodatnih 7 do 14 dana, ćelije su testirane na ekspresiju CD3 epsilon čoveka FACS analizom, prema standardnim postupcima. Inkubirano je 2,5x10<5>ćelija sa UCHT-1 (BD biosciences, Heidelberg, Germanv), antitelom na CD3 čoveka, 5 ug/ml u PBS sa 2% FCS. Vezivanje antitela detektovano je F(ab')2 fragmentom, prečišćenim afinitivnom hromatografijom, kozjeg anti-mišjeg IgG, specifičnim za Fc-gama fragment, konjugovanim sa R-fikoeritrinom razblaženim 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germanv). Na Slici 7 prikazana je ekspresija prirodnog CD3 čoveka na transfektovanim EL4 ćelijama.

5.2. Kloniranje i ekspresija interspecijski specifičnih jednolančanih antitela na CD3 kao lgG1 antitela.

[0178] Da bi se poboljšali načini detekcije vezivanja interspecijski specifičnih jednolančanih anti-CD3 antitela, H2C HLP, A2J HLP i E2M HLP su prevedeni u lgG1 antitela sa mišjim lgG1 i konstantnim regionima lambda čoveka. Sekvence. cDNK koje kodiraju teške i lake lance odgovarajućih IgG antitela dobijeni su genskom sintezom prema standardnim postupcima. Sinteza genskog fragmenta bila je dizajnirana tako da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta, posle čega sledi 19 amino kiselina čeonog peptida imunoglobulina (SEQ ID br. 364 i 363), a zatim, u pravilnom okviru čitanja, kodirajuća sekvenca odgovarajućeg varijabilnog regiona teškog lanca ili odgovarajućeg varijabilnog regiona lakog lanca, posle čega sledi, u istom okviru čitanja kodirajuća sekvenca konstantnog regiona mišjeg lgG1 (SEQ ID br. 366 i 365) ili kodirajuća sekvenca konstantnog regiona lakog lambda lanca čoveka (SEQ ID br. 368 i 367). Uvedena su restrikciona mesta na početku i kraju cDNK za fuzioni protein. Restrikciona mesta EcoRI na 5' kraju i Sali na 3' kraju, korišćena su za naredne postupke u kloniranju: Sintetisani genski fragmenti klonirani su preko EcoRI i Sali mesta u plazmid označen kao pEF-DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) za konstrukte teškog lanca i pEF ADA (pEF ADA je opisan u Raum et al., Cancer immunoi immunother., 50(3), (2001), 141-50) za konstrukte lakog lanca, standardnim postupcima. Plazmidi, čija je sekvenca proverena, korišćeni su za transfekciju u FreeStvle 293 Expression Svstem (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germanv) prema uputstvu proizvođača. Posle 3 dana gajenja kulture, sakupljeni su supernatanti transfektanata i korišćeni za eksperiment pretrage alaninom.

5.3. Kloniranjeiekspresija alaninskih mutanata CD3 epsilon čoveka za pretragu alaninom

[0179]Genskom sintezom dobijeno je 27 cDNK fragmenata koji kodiraju CD3 epsilon lanac čoveka, sa izmenom po jednog kodona u odnosu na prirodnu sekvencu CD3 epsilon čoveka u kodon za alanin (GCC), za svaku od 1-27 amino kiselina ekstracelularnog domena zrelog GD3 epsilon lanca čoveka. Osim za taj izmenjeni kodon, cDNK fragmenti su bili identični navedenom fragmentu cDNK za prirodni CD3 čoveka. U svakom konstruktu bio je zamenjen samo po jedan kodon u odnosu na opisani cDNK fragment za prirodni CD3 čoveka. Restrikciona mesta EcoRI i Sali uvedena su u cDNK fragmente na identičnim mestima kao i u konstrukt sa prirodnim fragmentom. Svi konstrukti za pretragu alaninom klonirani su u pEF NEO i plazmidima sa proverenim sekvencama transfektovane ćelije EL4. Transfekcija i selekcija transfektanata izvršena je kao što je opisano. Kao rezultat toga, dobijen je panel ekspresionih konstrukata u kome je prva amino kiselina CD3 epsilon lanca čoveka, glutamin (Q, Gln) na položaju 1 zamenjena alaninom. Poslednja amino kiselina zamenjena alaninom bila je treonin (T, Thr) na položaju 27 zrelog, prirodnog CD3 epsilon čoveka. Za svaku amino kiselinu između glutamina 1 i treonina 27 stvoreni su odgovarajući transfektanti sa zamenom amino kiseline u prirodnom tipu u alanin.

5.4. Eksperiment pretragealaninom

[0180] Himerna IgG antitela, opisana u 2) i interspecijski specifična jednolančana antitela specifična za CD3 epsilon testirana su u eksperimentu sa pretragom alaninom. Vezivanje antitela za EL4 ćelijske linije transfektovane konstruktima sa alaninskim mutantima CD3 epsilon čoveka, opisanih u 3) provereno je FACS probom prema standardnim postupcima. 2,5x10<5>ćelija odgovarajućih transfektanata inkubirano je sa 50 ul supernatanta ćelijske kulture koja sadrži himerna IgG antitela ili sa 50 ul sirovih preparata periplazmatično eksprimovanih jednolančanih antitela. Za uzorke inkubirane sa sirovim preparatima periplazmatično eksprimovanih jednolančanih antitela, kao sekundarno antitelo korišćeno je anti-Flag M2 antitelo (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv), 5 ug/ml u50 ul PBS sa 2% FCS. Za uzorke inkubirane sa himernim IgG antitelima, sekundarno antitelo nije bilo potrebno. Za sve uzorke, vezivanje molekula antitela detektovano je F(ab')2 fragmentom, prečišćenim afinitivnom hromatografijom, kozjeg anti-mišjeg IgG, specifičnog za Fc-gama fragment, konjugovanim sa R-fikoeritrinom 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germanv). Detektovano je diferencijalno vezivanje himernih IgG molekula ili interspecijski specifičnih jednolančanih antitela za ćelijske linije EL4 transfektovane alaninskim mutantima CD3 epsilon čoveka. Kao negativna kontrola korišćena je ili izotipska kontrola ili sirov preparat periplazmatski eksprimovanog jednolančanog antitela irelevantne specifičnosti. Antitelo UCHT-1 korišćeno je kao pozitivna kontrola nivoa ekspresije alaninskih mutanata CD3 epsilon čoveka. Ćelijske linije EL4 transfektovane alaninskim mutantima za amino kiseline tirozin, na položaju 15, valin na položaju 17, izoleucin na položaju 19, valin na položaju 24 ili leucin na položaju 26 zrelog CD3 epsilon lanca nisu evaluirane zbog niskih nivoa ekspresije (podaci nisu prikazani). Vezivanje interspecijski specifičnih jednolančanih antitela i jednolančanih antitela u vidu himernih IgG za EL4 ćelijske linije transfektovane alaninskim mutantima CD3 epsilon čoveka prikazano je na Slici 8 (A-D) kao relativno vezivanje u arbitrarnim jedinicama gde su geometrijske srednje vrednosti flurescencije odgovarajućih negativnih kontrola oduzete od svake geometrijske srednje vrednosti fluorescencije uzorka. Da bi se kompenzovale razlike u nivoima ekspresije sve vrednosti uzoraka nekih transfektanata deljene su zatim geometrijski srednjim vrednostima UCHT-1 antitela za odgovarajuće transfektante. Za poređenje specifičnosti sa vrednošću prirodnog (wild-type) uzorka, sve vrednosti uzoraka odgovarajućih specifičnosti na kraju su deljene vrednošću za prirodni uzorak. Time je vrednost prirodnog uzorka arbitrarno uzeta kao 1 arbitrarna jedinica vezivanja.

[0181]Korišćena su izračunavanja prema sledećoj formuli:

[0182]U ovoj jednačinivalue_ Sampleoznačava vrednost u arbitrarnim jedinicama vezivanja koje označavaju stepen vezivanja specifičnog anti-CD3 antitlela za specifični alaninski mutant kao što je prikazano na Slici 8 (A-D),Sampleoznačava geometrijsku sredinu vrednosti fluorescenije koja je dobijena za specifično anti-CD3 antitelo testirano (analizirano) na specifilnom alanin-skenirajućem transfektantu,neg_ contr.označava geometrijsku sredinu vrednosti fluorscencije koja je dobijena za negativno kontrolno testiranjena specifičnom alanin-mutantu,UCHT- 1označava geometrijsku sredinu vrednosti fluorscencije koja je dobijena za UCHT-1 antitelo testirano za specifičan alaninsk mutant,WT označavageometrijsku sredinu vrednosti fluorscencije koja je dobijena za specifično anti-CD3 antitelo testirano na transfektantu divljeg tipa,xoznačava odgovarajući transfektant, y označava odgovarajuće anti-CD3 antitelo iwtoznačava da je odgovarajući transfektant divljeg tipa.

[0183]Kao što se vidi na Slici 8 (A-D), IgG antitelo A2J HLP pokazuje potpuni gubitak vezivanja za amino kiseline, asparagin na položaju 4, treonin na položaju 23 i izoleucin na položaju 25 zrelog CD3 epsilon lanca. Poptun gubitak vezivanja IgG antitela A2J HLP je zapaženo za amino kiseline, glutamin na položaju 1, aspartat na položaju 2, glicin na položaju 3 i glutamat na položaju 5 zrelog CD3 epsilon lanca. IgG antitelo E2M HLP pokazuje potpun gubitak vezivanja za amino kiseline, asparagin na položaju 4, treonin na položaju 23 i izoleucin na položaju 25 zrelog CD3 epsilon lanca. IgG antitelo E2M HLP pokazuje potpuni gubitak vezivanja za amino kiseline glutamin na položaju 1, aspartat na položaju 2, glicin na položaju 3 i glutamat na položaju 5 zrelog CD3 epsilon lanca. IgG antitelo H2C HLP pokazuje umeren gubitak vezivanja za amino kiseline asparagin na položaju 4 zrelog CD3 epsilon lanca i pokazuje potpuni gubitak vezivanja za amino kiseline glutamin na položaju 1, aspartat na položaju 2, glicin na položaju 3 i glutamat na položaju 5 zrelog CD3 epsilon lanca. Jednolančano antitelo F12Q HLP pokazuje potpuni gubitak vezivanja za amino kiseline glutamin na položaju 1, aspartat na položaju 2, glicin na položaju 3 zrelog CD3 epsilon lanca u glutamata na položaju 5 zrelog CD3 epsilon lanca.

6. Analiza vezivanja interpscies specifičnih anti-CD3 vezivnih molekula H2C HLP za

humani CD3 epsilon lanac sa i bez N-terminalnog His6 taga koji je transfektovan u T-ćelijsku liniju EL4 miša

6.1. Kloniranje i eksprimiranje humanog CDS epsilon lanca sa N-terminalnim šest

histidinskim tagom (His6 tag)

[0184]Fragment cDNK koji kodira humani CD3 epsilon lanac sa N-terminal His6 tag -om je dobijen sintezom gena. Sinteza genskog fragmenta je označen tako da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta, nakon čega sledi u pravilnom okviru čitanja kodirajuća skevencačeonog peptida imunoglobulina od 19 amino kiselina, pa zatim sledi u pravilnom okviru čitanja, kodirajuća sekvenca His6 taga nakon čega sledi u pravilnom okviru čitanja, kodirajuća sekvenca zrelog humanog CD3 epsilon lanca (cDNK i amino kiselinske sekvence konstrukta su date kao SEQ ID NOs 380 i 379). Sinteza genskog fragmenta je takođe dizajnirana tako da sadrži restrikciona mestđna početku i na kraju cDNK. Uvedena restrikciona mesta EcoRI na 5' kraju i Sali na 3" kraju, su upotrebljena u sledećim procedurama kloniranja. Sinteza genskog fragmenta je zatim klorian via EcoRI i Sali u plazmid označen kao pEF-NEO (kao što ke prethodno opisano) prema standardnim protokolima. Plazmid potvrđene sekvence je upotrebljen za transfekciju T ćelijske linije EL4 miša. Transfekcija i odabir transfektanata su izvedeni kao što je prethodno opisano. Posle 34 dana gajenaj ćelija, transfektanti su upotrebljeni za test/probu opisanu daljem tekstu.

6.2. Vezivanje interspecijski specifičnog anti-CD3 vezivnog molekula H2C HLP za humani CD3 epsilon lanac sa i bez N-terminalnog His6 taga

[0185] Himerno IgG antitelo sa specifičnošću vezivanja za H2C HLP specifičnog za CD3 epsilon je testirano za vezivanje za humani CD3 epsilon sa ili bez N-terminalnog His6 taga. Vezivanje antitela za EL4 ćelijsku liniju transfektovanu sa His6-humanim CD3 epsilonom i humanim CD3 epsilonom divljeg tipa respektivno je testirano pomoću FACS probe prema standardnim protokolima. 2,5x10<5>ćelija transfektanata je inkubirano sa 50 ul ćelijske kulture supernatanta koji sadrži himerno IgG antitelo ili 50 ul odgovarajućeg kontrolnih antitela u koncentraciji od 5ug/ml u PBS -u sa 2% FCS. Kao negativna kontrola korišćena je odgovarajuća izotip kontrola, a kao pozitivna kontrola za eksprimiranje konstrukta, CD3 specifično antitelo UCHT-1. Vezano antitelo detektovano je F(ab')2 fragmentom, prečišćenim afinitivnom hromatografijom, kozjeg anti-mišjeg IgG, specifičnim za Fc-gama fragment, konjugovanim sa R-fikoeritrinom 1:100 u PBS-u sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na a FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germanv). Poređenje je izvršeno sa EL4 ćelijskom linijom koja je transfektovana sa humanim CD3 epsilonom divljeg tipa , pri čemu je detektovan jasan gubitak vezivanja himernog igG sa specifičnošću vezivanja za H2C HLP za humani -CD3 epsilon sa N-terminalnim His6 tagom. Ovi rezultati pokazuju da je slobodan N-terminus CD3 epsilona ključan za vezivanje interspecijski specifičnih anti-CD3 sa specifičnošću vezivanja H2C HLP za CD3 epsilon lanac čoveka (Slika 9).

7. Određivanje konstante vezivanja KD bispecifičnog jednolančanog antitela

interspecijski specifičnih za EGFR primataiCD3 (EGFR LH x H2C HLP) primata za fuzioni

protein 1-27 CD3-Fc pomoćuPlasmon Surface Resonancemerenja u odnosu na

vezivanje za CD3 koji eksprimira PBMC merenjem pomoću razvrstavanja fluorescentnih

ćelija( eng. Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)

7.1. Merenje rezonance površinskih plazmona (engl.Plasmon Surface Resonance

Measurement)

[0186]Za određivanje afiniteta vezivanja potpuno interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela EGFR-21-63 LH x H2C HLP za amino kiseline 1-27 N-terminusa humanog CD3 epsilon lanca, izvršeno je merenje rezonance površinskih plazmona (SPR-gijanostika) sa rekombinantnim fuzionim proteinom koji se sastoji od N-terminalnih amino kiselina 1-27 zrelog humanog CD3 epsilon lanca koji je fuzionisan sa Fc-delom lgG1 čoveka (1-27 CD3-Fc). Na ovom kraju čipBiacore Carboxymethyl- DextranCM5 (Biacore, Uppsala, Svveden) je instaliran na Biacore 2000® sistemu (Biacore, Uppsala, Sweden). Jedna protočna ćelija je aktivirana dodatkom rastvora A/-(3-Dimezilaminopropil)-A/'-etilkarbodiimid hidrohlorid/ N-Hidroksisukcinimida prema standardnim procedurama. Rastvor. fuzionog proteina 1-27 CD3-Fc je zatim dodat stvarajući tako stablnu kovelentnu vezu proteina za sloj dekstrana Biacore čipa. Nevezani protein je uklonjen intenzivnim ispiranjem pa zatim blokiranjem neizreagovanih preostalih NHS-aktiviranih karboksi grupa dodatkom rastvora etanolamina. Uspeh kuplovanja proteina je potvrđen jačim signalom koji je izmeren kao jedinica odgovora (Response Units) u odnosu na signal pre kuplovanja. Referentna ćelija je pripremljena kao što je opisano ali bez dodatka rastvora proteina.

[0187]Prečišćeno bispecifično antitelo EGFR-21-63 LH x H2C HLP je detaljno dijalizirano u odnosu na HBS-EP pufer (Biacore, Uppsala, Svveden) ua Slide-A-Lyzer® Mini Dialvsis Unit (Pierce, Rockford-ll, USA). Koncentracija proteina posle dijalize je određena apsorpcijom na UV280 nm dajući tako koncentraciju od 43 ug/ml.

[0188]Rastvor proteina je prebačen na ploču sa 96 ležišta i serijski je razblažen dodatkom HBS-EP pufera u odnosu 1:1 u sledećih 10 ležišta.

[0189]Merenja rezonance površinskih plazmona su izvedena pojedinačnim uzimanja uzoraka sa svih 11 ležišta. Protočne ćelije su regenerisane dodatkom acetatnog pufera između merenja da bi se oslobodio vezani protein.

[0190]Signali vezivanja molekula bispecifičnog antitela molecules su dobijeni odbijanjem signala koji potiče od referentne ćelij od signala dobijenog merenjem ćelije koja je konjugaovana sa 1-27 CD3-Fc proteinom. Krive asocijacije i disocijacije su merene kao jedinide odgovora (engl. Response Units) i snimane. Konstante vezivanja su izračunate pomoću softvera za fitovanje krivihBiacore® curve fitting softvvarebaziran na Langmuir -ov modelu.

[0191]Određeno je da izračunate konstante vezivanja KD iz prvih pet koncentracije iznose 1,52 x10"<7>M.

7.2. Određivanje konstante vezivanja CD3 merenjem FACS

[0192]Da bi se testirao afinitet interspecijski specifičnog vezivanja molekula bispecifičnih antitela u odnosu na jačinu vezivanja za nativni humani CD3, izvedena je dodatna analiza zasićenja vezivanja FACS. Odabran molekul bispecifičnog antitela EGFR-21-63 LH x H2C HLP je upotrebljen da bi se pripremio niz serijskih razblaženja sa faktorom od 1:1.5 i polaznom koncentracijom od 63.3 ug/ml. Molekuli bispecifičnog antitela su inkubirani u ovim različitim koncentracijama sa 1.25 x 10<5>humanim PBMCs svaki uzorak u trajanu od 1 h, na 4°C nakon čega slede dva koraka ispiranja u PBS na 4°C. Detekcija vezanih bispecifičnih molekula antitela je izvedena pomoćuPenta- His antitela(Oiagen GmbH, Hildesheim, Germanv) u koncentraciji od 5 ug/ml u 50 ul PBS -a sa 2% FCS. Posle inkubacije od 45 minuta na 4°C i dva koraka ispiranja vezivanje Penta-His antitela je detektovano je F(ab')2 fragmentom, prečišćenim afinitivnom hromatografijom, kozjeg anti-mišjeg IgG, specifičnim za Fc-gama fragment, konjugovanim sa R-fikoeritrinom razblažen 1:100 u PBS-u sa 2% FCS -om (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Protočna citometrija je izvedena na FACS-Canto II aparatu, korišćen je softver FACS Diva za sakupljanje i analizu podataka (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). Bojenje FACS i merenje intenziteta fluorescencije je izvedeno kao što je opisano uCurrent Protocols in lmmunology(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-lnterscience, 2002). Srednje vrednosti dobijenog intenziteta fluorescencije su nacrtane u funkciiji upotrebljene koncentracije molekula bispecifičnog antitela i analizirane biomatematičkim softveromPrismu jednostranoj analizi vezivanja (hiperbola). Softver je izračunao odgovarajuće KD vrednosti koje opisuju vezivanje liganda (molekul bispecifičnog antitela) za receptor (oduzimanje CD3 pozitivnog PBMC) koje sledi zakon o dejstvu mase. Osnovna formula je sledeća: Y = Bmax x X / (Kd+X) gde je Bmax maksimalno vezivanje. KD je koncentracija liganda potrebna za dostizanje polovine maksimalnog vezivanja. Bojenje FACS je izvedeno u duplikatu, R<2>vrednosti su bolje od 0.95.

[0193]Određena polovina maksimalnog vezivanja za molekul bispecifičnog antitela EGFR-21-63 LH x H2C HLP je postignuta pri koncentraciji od 8472 ng/ml što odgovara 154 nM (1.54 x 10"<7>M) date molekulske mase od 55000 Daltona (Slika 10). Tako, afinitet EGFR-21-63 LH x H2C HLP za N-terminalne amino kiseline 1-27 humanog CD3 epsilon lanca odvojene od svog nativnog CD3-conteksta za koji se pokazalo da je jednak afinitetu EGFR-21-63 LH x H2C HLP za nativni CD3 intaktnih T ćelija.

8. StvaranjeCHOćelija koje su transfekotovane sa humanimEGFR

[0194]Ćelijska linija koja pozitivna na humani EGFR, A431 (ćelijska linija epidermoidnog karcinoma, CRL-1555, American Type Culture Collection, Rockville, MD) je upotrebljena za dobijanje celokupne RNK koja je izolovana prema indstrukcijama datim u kompletu (Oiagen, RNeasy Mini Kit, Hilden, Germany). Dobijena RNK je upotrebljena za sintezu cDNK nasumične reversne transkripcije. Za kloniranje cele sekvence humanog EGFR antigena upotrebljeni su sledeći oligonukelotidi:

[0195]Kodirajuća sekvenca je umnožena pomoću PCR (denaturacija na 94°C tokom 5 min, renaturacija na 58°C tokom 1 min, produžavanje na 72°C tokom 2 min za prvi ciklus; denaturacija na 94°C tokom 1 min, renaturacija na 58°C ui trajanju od 1 min, produžavanje na 72°C u trajanju od 2 min tokom 30 ciklusa; terminalna ekstenzija na 72°C tokom 5 min). PCR proizvod je zatim podvrgnut digestiji sa Xbal i Sali, ligirane na odgovarajuće obrađene ekspresione vektore pEF-DHFR (Raum et al., Cancer Immunol. Immunother. 2001; 50:141-150), i transformisan u E.coli. Prethodno opisana procedura je izvedena prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratorv Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Klonom čija je sekvenca proverena (SEQ ID 370, Amino kiselinska sekvenca SEQ ID 369) transfektovane su CHO ćelije kojima nedostaje DHFR (deficijentne ta DHFR), zakonstrukte za eukariotsku ekspresiju. Eukariotska ekspresija proteina u CHO ćelijama kojima nedostaje DHFR je izvedena kao što je opisao Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Genska amplifikacija konstrukta je indukovana povećanjem koncentracija metotreksata (MTX) do krajnje koncentracije od 20 nM

MTX.

9. Stvaranje CHO ćelija koje eksprimuju ekstracelularni domen cinomolgus EGFR

[0196]Sekvenca cDNK ekstracelularnog domena cinomolgus EGFR je dobijena pomoću seta od dva PCRs na cDNK debelog creva cinomolgus majmuna (Cat#: C1534090-Cy-BC; dobijen od BioCat GmbH, Heidelberg, Germanv) pod sledećim reakcionim uslovima: 1 ciklus na 94°C u trajanju od 3 minuta zatim 35 ciklusa na 94°C u trajanju od 1 minuta.na 53°C u trajanju od 1 minuta i na 72°C u trajanju od 2 minuta pa zatim konačnim ciklusom od 72°C u trajanju od 3 minuta. Korišćeni su sledeći prajmeri:

[0197]One PCR daju dva preklapajuća fragmenta (A: 1-869, B: 848-1923), koji su izolovani i sekvencirani prema standardnim protokolima pomoću PCR prajmera, i tako formiraju deo od 1923 bp cDNK sekvence cinomolgus EGFR od trećeg nuklleotidnog kodona +1 zrelog proteina do 21<st>kodona transmembranskog domena. Za genrisanje konstrukta za ekspresiju cinomolgus EGFRa cDNK fragment je dobijen sintezom gena prema standardnim protokolima ( cDNK i amino kiselinska sekvenca konstruka je data kao SEQ ID Nos 372 i 371). U ovom konstruktu, kodirajuća sekvenca za cinomolgus EGFR od amino kiseline +2 do +641 zrelog EGFR proteina je fuzionisana u kodirajuću sekvencu humanog EGFR zamenom kodirajuće sekvence amino kiselina +2 do +641. Sinteza genskog fragmenta je takođe dizajnirana tako da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta i restrikciona mesta na početku i na kraju cDNK koja kodira u suštini ekstracelularni domen cinomolgus EGFR koji je fuzionisan za transmembranu i intracelularne domene humanog EGFR. Dalje, konzervativna mutacija je uvedena na amino kiselinu 627 (4<lh>amino kiselina transmembranskog domena) mutirajući valin u leucin pri čemu se dobija restrikcino mesto (Sphl) za potrebe kloniranja. Uvedena restrikciona mesta Xbal na 5' kraju i Saii na 3' kraju, su upotrebljena u sledećim procedurama kloniranja. Sinteza genskog fragmenta je zatim kloniran preko Xbal i Sali u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). Klon sa potvrđenom sekvencom ovog plazmida je upotrebljen za transfekciju CHO/dhfr- ćelija kao što je prethodno opisano.

10. Stvaranje EGFRiCD3 inetrspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula

10.1. Kloniranje interspecijski specifičnih vezivnih molekula

[0198]Generalno, svaki od molekula bispecifičnih jednolačanih antitela, sadrži domen koji ima specifičnost vezivanja inrterspecijski specifičan za CD3 epsilon čoveka i primata osim šimpanze kao i domen koj ima specifičnost vezivanja interspecijski specifičan za EGFR čoveka i primata osim šimpanze, su dizajnirani kao što je prikazano u Tabeli 1 koja sledi:

[0199]Prethodno navedeni konstrukti koji sadrže varijablne lake lance (L) i varijablne teške lance (H) domena inerspecijski specifične za EGFR čoveka i cinomolgus-a, su dobijeni sintezom gena. Sinteze genskih fragmenata su dizajnirane tako da da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta, pa zatim 19 amino kiselinski imunoglobulin čeoni peptid, nakon čega sledi u istom okviru čitanja kodirajuća sekveca respektivnog molekula bispecifičnog jednolačanog antitela, pa zatim u istom okviru čitanja, kodirajuća sekvenca od 6 histidin tagova i stop kodon. Sinteza genskog fragmenta je takođe dizajnirana tako da se uvedu odgovarajuća N- i C-terminalna restrikciona mesta. Sinteza genskog fragmenta je klonirana preko ovih restrikcionih mesta u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratorv Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Klon sa nukelotidnom sekvencom utvrđene sekvence je transfektovan u jajne ćelije kineskog hrčka (engl.Chinese hamster ovarv (CHO)) bez dihidrofolat reduktaze (DHFR) ze eukariotksu ekspresiju konstrukta.

[0200]CHO-ćelije bez DHFR (ATCC No. CRL 9096) transkfektovane su konstruktima stabilno ili prolazno , elektroporacijom ili alternativno, HEK 293 (engl.human embryonal kidney cells,ATCC Number: CRL-1573) prolazno, prema standardnim protokolima.

10.2. Ekspresijaiprečišćavanje molekula bispecifičnih jednolančanih antitela

[0201]Molekuli bispecifičnih jednolančanih antitela su eksprimirani u jajnim ćelijama kineskog hrčka (CHO). Eksprimiranje eukariotksih proteina u CHO ćelijama bez DHFR je izvedeno kao što je opisao Kaufmann RJ. (1990) Methods Enzvmol. 185, 537-566. Genska amplifikacija konstrukta je indukovana povećanjem krajnjih koncentracija MTX do 20 nM. Posle dva pasaža

stacionarne kulture, ćelije su gajene u rotirajućim bocamau tečnom soja mdijumu HyQ PF CHO bez nukleozida (sa 4.0 mM L-Glutaminom sa 0.1% Pluronic F - 68; HvCIone) tokom 7 dana pre sakupljanja. Ćelije su uklonjene centrifugiranjem i supernatant koji sadrži eksprimirani protein je skladišten na -20°C. Alternativno, konstrukti su prolazno eksprimriani u HEK 293 ćelijama. Transfekcija je izvedena sa reagensom 293fectin (Invitrogen, #12347-019) prema protokolu koji je dao proizvođač.

[0202]Akta® Explorer Svstem (GE Health Svstems) i Unicom® Software su upotrebljeni za hromatografiju. Metal helatna hromatografija ("IMAC") je izvedena pomoću Fractogel EMD chelate® (Merck) koji je nanet sa ZnCI2prema protokolu proizvođača. Kolona je ekvilibrisana sa puferom A (20 mM natrijum fosfatni pufer pH 7.2, 0.1 M NaCI) i supernatant ćelijske kulture (500 ml) je nanet na kolonu (10 ml) pri protoku od 3 ml/min. Kolona je isprana sa puferom A kako bi se uklonio nevezani uzorak. Vezani protein je eluiran primenom dvostepenog gradijenta pufera B (20 mM natrijum fosfatni pufer pH 7.2, 0.1 M NaCI, 0.5 M Imidazol) kao:

Korak 1: 20% pufer B u 6 zapremina kolona

Korak 2:100% pufer B u 6 zapremina kolona

[0203]Frakcije eluiranog proteina iz koraka 2 su sakupljene za dalje prečišćavanje. Sve hemikalije su stepena čistoće namenjena za istraživanja i nabavljene od Sigma (Deisenhofen) ili Merck (Darmstadt).

[0204]Gel filtraciona hromatografija je izvedena na HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade koloni (GE/Amersham) koja je ekvilibrisana sa Equi- puferom(25 mM Citrat, 200 mM Lizin, 5% Glicerol, pH 7.2). Eluirani uzorci proteina (protok 1 ml/min) su podvrgnuti standardnoj SDS-PAGE i VVestern Blot za detekciju. Pre prečišćavanja, kolona je kalibrisana za određivanje molekulske težine (komplet za marker molekulske težine, Sigma MW GF-200). Koncetracije proteina su određene pomoću OD280 nm.

[0205]Prečišćen protein bispecifičnog jednolančanog antitela je analiziran pomoću SDS PAGE pod redukcionim uslovima izvedenim sapre- cast4-12% Bis Tris gelovima (Invitrogen). Priprema uzorka i primena su izvedeni prema protokolu proizvođača. Molekulska težina je određena sa MultiMark protein standardom (Invitrogen). Gel je obojen koloidnim Coomassie (Invitrogen protocol). Čistoća izolovanog proteina je >95% kao što je određeno spomoću SDS-PAGE.

[0206] Bispecifično jednolančano antitelo ima molekulskutežinu od oko 52 kDa pod nativnim uslovima kao što je određeno gel filtracijom u PBS-u. Svi konstrukti su prečišćeni prema ovoj metodi.

[0207]VVestem Blot je izveden korišćenjem Optitran® BA-S83 membrane i Invitrogen Blot Module prema protokolu proizvođača. Antitela su usmerena na His Tag (Penta His, Qiagen) i kozije-anti-mišiji Ig obeležen alkalnom fosfatazom (AP) (Sigma), i BCIP/NBT (Sigma) kao supstratom. Jedna traka je detekovana na 52 kD koja odgovara prečišćenom bispecifičnom jednolančanom antitelu.

11. Određivanje konstante vezivanjaKDpotpuno interspecijski specifičnih bispecifičnih

jednolančanih antitela za fuzioni protein 1-27 CD3-Fc merenjem rezonancije površinskih

plazmona

[0208]Za određivanje afiniteta vezivanja molekula bispecifičnih jednolančanih antitela interspecijski specifičnih za EGFR primata i CD3 primata za amino kiseline 1-27 N-terminusa zrelog humanog CD3 epsilon lanca izvedeno je merenje rezonancije površinskih plazmona sa rekombinantnim fuzionim proteinom koji se sastoji od N-terminalnih amino kiselina 1-27 humanog CD3 epsilon lanca koji je fuzionisan sa Fc-delom humanog lgG1 (1-27 CD3-Fc). U tu svrhu Biacore Carboxymethyl-Dekstran CM5 čip (Biacore, Uppsala, Svveden) je instaliran na Biacore 2000® sistem (Biacore, Uppsala, Svveden). Protočna ćelija je aktivirana rastvorom N-(3-Dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrolorid/ N-Hidroksisukcinimida prema standardnim procedurama. Rastvor fuzionog proteina 1-27 CD3-Fcje zatim dodat u pri čemu nastaje stablilna kovalentna veza proteina za sloj dekstrana Biacore čipa. Nevezani protein je uklonjen intenzivnim ispiranjem pa zatim blokiranjem preostalih neizreagovanih NHS-aktiviranih karboksi grupa dodatkom rastvora etanolamina. Uspeh sprezanja proteina je potvrđemn detekcijom većeg signala meren kao jedinica Odgovora u odnosu na signal pre sprezanja. Referentna ćelija je pripremeljena kao što je opisano ali bez dodatka proteinskog rastvora.

[0209]Prečišćena jednolačana bispecifična antitela data u daljem tekstu su podešena na koncentraciju od 5 ug/ml dodatkom ith HBS-EP pufera (Biacore, Uppsala, Svveden) iprebačena na ploču sa 96 ležišta, svako od antitela u zapremini od 150 ul.

[0210]Merenje rezonancije površinskih plazmona je izvedeno za sve uzorke i protočne ćelije su regenerisane dodatkom acetatnog pufera između merenja kako bi se oslobodio vezani protein (sve prema standardnim protokolima).

[0211]Signali vezivanj bispecifičnih jednolančanih antitla su dobijena oduzimanjem signala referentne ćelije od signala dobijenog merenjem ćelija konjugovanih sa 1-27 CD3-Fc proteinom.

[0212]Krive ascijacije i disasocijacije su merene kao Jedinice odgovora i zabeležen su. Konstante vezivanja su izračunate pomoćuBiacore® curve- fittingsoftverak oji se bazira na Langmuir -ovom modelu. Izračunati afiniteti testiranih potpuno interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula za N-terminalne amino kiseline 1-27 humanog CD3 epsilona su date kao KD vrednosti i kreću se u opsegu od 2,54x10"<6>M do 2,49x10"<7>M. "LH" se odnosi na raspored varijabilnih domena kao VL-VH. "HL" se odnosi na raspored varijabilnih domena u kao VH-VL. G4H, F70, A2J, E1L, E2M, H 1 E i F6A se odnose na različite interspecijski specifične CD3 vezivne molekule. 12. Analiza vezivanja EGFRi CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela,

protočnom citometrijom

[0213]U cilju testiranja funckionalnosti konstrukata interspecijski specifičnog Bispecifičnog antitela po pitanju kapaciteta vezivanja za humani i cinomolgus EGFR i CD3, respektivno, izvedena je analiza FACS. U ove svrhe CHO ćelije transfektovane sa humanimEGFRkao što je opisano u Primeru 8 i humane CD3 pozitivne T ćelije leukemijske ćelijske linijeHPB-ALL(DSMZ, Braunschvveig, ACC483) su korišćene za testiranje vezivanja za humane antigene. Reaktivnost vezivanja za antigene cinomolgusa je testirana upotrebom dobijenog cinomolgus EGFR transfektanta kao što je opisano u Primeru 9 i T ćelijska linija 4119LnPx makakija (dobijene zahvaljući Ijubaznošću Prof Fickenscher, Hvgiene Institute, Virologv, Erlangen-Nuemberg; published in Knappe A, et al., and Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61) 200.000 ćelija respektivne ćelijske populacije je inkubirano tokom 30 min na ledu sa 50 ul prečišćenog proteina konstrukata interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela (2 ug/ml). Alternativno, upotrebljen je supernatant ćelijske kulture koja prolazno proizvodi proteine. Ćelije su dva puta isprane u PBS i vezivanje konstrukta je detektovano sa Penta His antitelom miša (Oiagen; diluted 1:20 in 50 ul PBS with 2% FCS). Posle ispiranja, vezana anti His antitela su detektovana sa Fc gama-specifičnim antitelima (Dianova) konjugovani sa fikoeritrin.razblažen 1:100 u PBS sa 2% FCS. Sveži medijum za gajenje je upotrebljen kao negativna kontrola.

[0214]Protočna citometrija je izvedena na FACS-Calibur aparatu, CellOuest softver je

upotrebljen za izvođenje i analizu podataka (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). FACS bojenje i merenje intenziteta fluorescencije je izuvedeno kao što je opisano u Current Protocols in Immunologv (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-lnterscience, 2002).

[0215]Sposobnost vezivanja nekoliko bispecifilnih jednolančanih molekula koji su specifični za EGFR i interspecijski specifičnih za CD3 čoveka i primata osim šimpanze, su jasno detektovani kao što je prikazano na Slici 11. U FACS analizi, svi konstrukti pokazuju vezivanje za CD3 i EGFR u odnosu na medijum za gajenje i prva i druga detekcija antitela kao negativne kontrole. Prikazane su interspecijski specifičnosti bispecifilnih antitela za CD3 i EGFR antigene čoveka i cinomolgusa.

13. Bioaktivnost EGFR i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih

antitela

[0216]Bioaktivnost dobijenih bispecifičnih jednolančanih antitela je analizirana hromom 51 (<51>Cr) koji se oslobađa uin vitroprobi citotoksičnosti korišćenjem EGFR pozitivne ćelijske linije opisane u Primerima 8 i 9. Kao efetorske ćelije korišćene su stimulisane CD8 pozitivne T ćelije čoveka ili T ćelijska linija 4119LnPx makakija.

Dobijanje stimulisanih CD8+ T ćeliija je izvedenonasledeći način:

[0217]Petri sud (prečnika od 145 mm, Greiner) je prethodno obložen komercijalno dostupnim anti-CD3 specifičnim antitelom u krajnjoj koncentraciji od 1 ug/ml tokom 1 h na 37°C. Nevezani protein je uklonjen jednim korakom ispiranja sa PBS. Sveži PBMC su izolovani iz periferne krvi (30 - 50 ml krvi čoveka) pomoću Ficoll gradijentnim centrifugiranjem prema standardnim protokolima. Dodato je 3 - 5 x 10<7>PBMC-a u prethodno oboložen petri sud u 120 ml RPMI 1640 /10% FCS / IL-2 20 U/ml (Proleukin, Chiron) i stimulisano 2 dana. Trećeg dana ćelije su sakupljene, isprane jednom sa RPM11640. Dodat je IL-2 u krajnjoj koncentraciji od 20 U/ml i ponovo gajene jedan dan. CD8+ citotoksični T limfociti (CTLs) su izolovani deplecijom CD4+ T ćelija i CD56+ NK ćelija.

[0218]Ciljne ćelije su isprane dva puta sa PBS -om i obeležene sa 11,1 MBq<51>Cr u konačnoj zapremini od 100ul RPMI sa 50% FCS tokom 45 minuta na 37°C. Naknadno obeležene ciljne ćelije su isprane 3 puta sa 5 ml RPMI i zatim upotrebljene u testu citotoksičnosti. Test/ proba je izveden na ploči sa 96 ležita u ukupnoj zapremini od 250 ul kojoj je dodat RPMI (kao prethodno) u odnosu E:T od 10:1. 1 ug/ml, korišćeni su molekuli ineterspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antuitela i njihova 20-ostruka razblaženja. Alternativno, supernatant ćelijske kulture peolazno dobijenih proteina je serijski razblažen u koracima u odnosu 1:2. Vreme testiranja je 18 h i citotoksičnosti je merena kao relativne vrednosti oslobođenog hroma u supernatantu u odnosu na razliku maskimalne lize (dodakom Triton-X) i spontane liz (bez efektorskih ćelija). Sva merenja su izvedena četvorostruko. Merenja aktivnosti nroma u supernatantima su izvedena saVVizard 3" gammacounter (PerkinElmer Life Sciences GmbH, Koln, Germanv). Analiza eksperimentalnih podataka je izvdena saPrism 4 for Windows(verzija 4.02, GraphPad Softvvare Inc., San Diego, California, USA). Sigmoidalne krive doze-odgovor tipično imaju R<2>vrednosti od >0.90 kao što je određeno softverom. Vrednosti za EC50izračunate analitičkim programom su upotrebljen za poređenje bioaktivnosti.

[0219]Kao što je prikazano na Slikama 12 i 13, svi dobijeni konstrukti interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela otkrivaju citotoksičnu aktivnost na humane EGFR pozitivne ciljne ćelije izazvane humanim CD8+ ćelijama i cinomolgus EGFR pozitivne ciljne ćelije izazavane T ćelijskom linijom 4119LnPx makakija. Bispecifično jednolančano antitelo sa različitim ciljanim specifičnostima je upotrebljeno kao negativna kontrola.

14. Kloniranjeiekspresija C-terminalih, transmembranskih i skraćenih eksteracelularnuh

domena MCSP čoveka

[0220]Kodirajuća sekvenca C-terminalnog, transmembranskog i skraćenogekstracelulamog domena MCSP čoveka (amino kiselina 1538 - 2322) je dobijena sintezom gena prema standardnim protokolima (cDNK sekvenca i amino kiselinska sekvenca recombinantnog konstrukta za ekspresiju C-terminalnog, transmembranskog i skraćenog ekstracelularnog domena humanog MCSP (označen kao humani D3 odnosno D3 čoveka) pod SEQ ID NOs 374 i 373). Fragment sinteze gena je dizajniran tako da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta pa zatim kodirajuću sekvencu od 19 amino kiselina imunoglobulin čeoni peptida pa nakon toga u okviru čitanja FLAG marker, pa zatim u istom okviru čitanja čitanja sekvencu koja sadrži nekoliko restrikcionih mesta za potrebe kloniranja i kodiranja za 9 amino kiselinskih veštačkih linkera (SRTRSGSOL), nakon toga u istom okviru čitanja kodirajuću sekvencu C-terminalnih, transmembranskih i skraćenih ekstracelularnih domena MCSP čoveka i stop kodon. Restrikciona mesta su uvedena na početak i na kraj fragmenta DNK. Restrikciona mesta EcoRI na 5' kraju i Sali na 3' kraju su upotrebljena u sledećim procedurama kloniranja. Fragment je digestovan sa EcoRI i Sali i kloniran u pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) prema standardnom protokolu. Plazmid verifikovane sekvence je upotrebljen za transfekciju CHO/dhfr- ćelija (ATCC No. CRL 9096). Ćelije su gajene na RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom, kojem je dodat 10% FCS, 1% penicilin/streptomicin (sve dobijeno od Biochrom AG Berlin, Germanv) i nukleozid iz matičnog rastvora reagenasa za ćelijsku kulturu (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) do krajnje koncentracije od 10 ug/ml Adenozina, 10 ug/ml Dezoksiadenozina i 10 ug/ml Timidina, u inkubatoru na 37°C, 95% vlažnosti i 7% C02. Transfekcija je izvedena pomoćuPolyFect Transfection Reagent (OjagenGmbH, Hilden, Germanv) i 5 ug plazmida DNK prema uputstvu proizvođača. Posle gajenja u trajnju od 24 h ćelije su isprane jednom sa PBS -om i ponovo gajene u RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom i 1% penicilin/streptomicinom. Tako, podloga ne sadrži nukleoizide i ovaj deo je nanet na transfektovane ćelije. Približno 14 dana posle transfekcije zapažen je porast rezistentnih ćelija. Posle dodatnih 7 do 14 dana, transfektanti su testirani na ekspresiju konstrukta analizom FACS. 2,5x10<5>ćelija je inkubirano sa 50 ul anti-Flag-M2 antitela (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) razblaženih do 5 ug/mlu PBS -u sa 2% FCS. Vezano antitelo detektovano je F(ab')2 fragmentom, prečišćenim afinitivnom hromatografijom, kozjeg anti-mišjeg IgG, specifičnim za Fc-gama fragment, konjugovanim sa R-fikoeritrinom posebno razblažen 1:100 u PBS sa 2% FCS (ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany).

15. Kloniranje i ekspresija C-terminalnih, transmembranskihiskraćenih ekstracelularnih

domena MCSP makakija

[0221]Sekvenca cDNK C-terminalnih, transmembranskih i skraćenihekstracelularnih domena MCSP makakija (označeni kao makaki D3) dobijena je pomoćue seta od tri PCRs na cDNK kože makaki majumuna (Cat No. C1534218-Cy-BC; BioCat GmbH, Heidelberg, Germany) pod sledećim reakcionim uslovima : 1 ciklus na 94°C, 3 min., 40 ciklus na 94°C u trajanju od 0,5 min., 52°C u trajanju od 0,5 min. i72"C u trajanju od 1,75 min., terminalni ciklus na 72°C u trajanju od 3 min.. Korišćeni su sledeći prajmeti:

[0222]Ovi PCRs dali su tri preklapajuća fragmenta (A: 1-1329, B: 1229-2428, C: 1782-2547)

koji su izolovani i sekvencirani prema standardnim protokolima koristeći PCR prajemre i tako su dobijene porcije od 2547 bp sekvence cDNK makaki MCSP (sekvenca cDNK i amino kiselinska sekvenca ove porcije MCSP makaki su naveden kao SEQ ID NOs 376 i 375) od 74 bp uzvodno od kodirajuće sekvence C-terminalnog domena do 121 bp nizvodno od stop kodona. Sledeći PCR koristi sledeće reakcione uslove: 1 ciklus na 94°C u trajanju od 3 min, 10 ciklusa na 94°C u trajanju od 1 min, 52°C u trajanju od 1 min i 72°C u trajanju od 2,5 min, terminalni ciklus na 72°C u trajanju od 3 min je primenjen da poveže PCR proizvode prethodno navedene reakcije A i B. Korišćeni su sledeći prajmeri:

[0223]prajemri za ovaj PCR su dizajnirani tako da uvedu restrikciona mesta na početku i na kraju fragmenta cDNK koji kodira C- terminalne, transmembranske i skraćene ekstracelularne domene MCSP makakija. Uvedena restrikciona mesta Mfel na 5' kraju i Sali na 3' kraju, su upotrebljena u sledećim procedurama kloniranja. Fragment PCR je zatim kloniran via Mfel i Sali u Bluescript plazmid koji sadrži EcoRI/Mfel fragment prethodno navedenog pEF-DHFR plazmida (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) zamenom C-terminalih, transmembranskih i skraćenih ekstracelularni domena MCSP čoveka. Sinteza genskog fragmenta koji sadrži kodirajuće sekvence imunoglobulina čeonog peptida i Flag marker kao i veštački linker (SRTRSGSOL) u okviru sa 5' krajem fragmenta cDNK koji kodira C-terminalne, transmembranske i skraćene ekstracelularne domene MCSP makakija. Ovaj vektor je korišćen za transfekciju CHO/dhfr- ćelija (ATCC No. CRL 9096). Ćelije su gajene u RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom kojem su dodati 10% FCS, 1% penicilin/ streptomicin (svi od Biochrom AG Berlin, Germanv) i nukleozidi iz matičnog rastvora reagenasa za ćelijske kulture (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) do krajnje koncetracije od 10 ug/ml Adenozin, 10 ug/ml Dezoksiadenozin i 10 ug/ml Timidin, u inkubatoru na 37°C, 95% vlažnosti i 7% C02. Transfekcija je izvedena saPolyFect Transfection Reagent(Ojagen GmbH, Hilden, Germanv) i 5 ug plazmidne DNK prema instrukcijama proizvođača. Posle gajenje od 24 h, ćelije su jednom isprane sa PBS -om i opet gajene u RPM11640 sa stabilizovanim glutaminom i 1% penicilin/streptomicinom. Tako, medijum za gajenje ne sadrži nukleozide i shodno tome, deo je nanet samo na transfektovane ćelije. Oko 14 dana posle transfekcije, zapažen je rast rezistentnih ćelija. Posle još 7 do 14 dana, transfektanti su testirani na eksprrimiranje rekombinantnog konstrukt via FACS. 2,5x10<5>ćelija je inkubirano sa 50 ul anti-Flag-M2 antitela (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) razblaženo do 5 ug/ml u PBS -u sa 2% FCS Vezano antitelo detektovano je F(ab')2 fragmentom, prečišćenim afinitivnom hromatografijom, kozjeg anti-mišjeg IgG, specifičnim za Fc-gama fragment, konjugovanim sa R-fikoeritrinom, razblaženo do 1:100 u PBS sa 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Nevvmarket, Suffolk, UK). Uzorci su mereni na FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germanv).

16. Dobijanje i karakterizacija MCSP i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula

[0224] Svaki od molekula bispecifičnog jednolančanog antitela koji sadrži CD3 epsilon domen interspecijski specifičan za čoveka i primata osim šimpanze kao i vezivni domen MCSP interspecijski specifičan za čoveka i primata osim šimpanze, je dizajniran kao što je dato u sledećoj Tabeli 2:

[0225]Prethodno navedeni konstrukti koji sadrže varijabilne teške lance (VH) i varijabilne lake lance (VL) domena interspecijski specifične za čoveka i makaki MCSP D3 i VH i VL domene interspecijski specifične za čoveka i makaki CD3 su dobijeni sintezom gena. Sinteza genskog fragmenta je dizajnirana tako da da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta, zatim 19 amino kiselinski imunoglobulin čeoni peptid, zatim u istom okviru čitanja kodirajuću sekvencu odgovarajućeg molekula bispecifičnog jednolančanog antitle, pa zatim u istom okviru čitanja kodirajuću skevencu histidin6-taga i stop kodon. Sinteza genskog fragmenta je takođe dizajnirana tako da uvede pogodna N- i C-terminalna restrikciona mesta. Sinteza genskog fragmenta je klonirana preko ovih restrikcionih mesta u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFRje opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) prema standardbnom protokolu (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratorv Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Različite CHO -ćelije bez DHFR transfektovane su konstruktima, stabilno ili prolazno (ATCC No. CRL 9096) elektroporacijom ili alternativno, HEK 293 ćelije (engl.human embryonal kidney cells,prevod: embrionalne ćelije bubrega čoveka, ATCC Number: CRL-1573) prolazno, prema standardnim protokolima.

[0226]Eukariotsko eksprimiranje proteina u CHO ćelijama bez DHFR je izvedeno kao što je opisao Kaufmann RJ. (1990) Methods Enzvmol. 185, 537-566. Amplifikacija gena konstrukata je indukovana dodatkom rastućih koncentracija metotreksata (MTX) do krajnjih koncentracija od 20 nM MTX. Posle dva pasaža stacionarne kulture , ćelije su gajene u rotirajućim bocama u tečnom soja medijumu bez nukelozida HyQ PF CHO.(sa 4.0 mM L-Glutaminom sa 0.1% Pluronic F - 68; HvCIone) tokom 7 dana pre sakupljanja. Ćelije su uklonjene centrifugiranjem i supernatant koji sadrži eksprimirani protein je ostavljen na - 20°C.

[0227]Akta® Explorer Svstem (GE Health Svstems) i Unicom® Softvvare su upotrebljeni za hromatografiju. Metal helatna hromatografija (engl. immobilized metal affinity chromatography; "IMAC") je izvedena koristeći Fractogel EMD chelate® (Merck) na koji je nanet ZnCI2prema instrukcijama proizvođača. Kolona je ekvilibrisana puferom A (20 mM natrijum fosfatni pufer pH 7.2, 0.1 M NaCI) i na kolonu(10 ml) pri protoku od 3 ml/min nanet je supernatant ćelijske kulture (500 ml), kolona je isprana puferom A da bi se uklonio nevezani uzorak. Vezani protein je eluiran primenom dvostepenog gradijenta pufera B (20 mM natrijum fosfatni pufer pH 7.2, 0.1 M NaCI, 0.5 M Imidazol) u skladu sa sledećim:

Korak 1: 20% pufer B u 6 zapremina kolona

Korak 2:100% pufer B u 6 zapremina kolona

[0228]Frakcije eluiranog proteina iz koraka 2 su sakupljene radi daljeg prečišćavanja.. Sve hemikalije su stepena čistoće namenjena za istraživanja i nabavljene od Sigma (Deisenhofen) ili Merck (Darmstadt).

[0229]Gel filtraciona hromatografija je izvedena na HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade koloni (GE/Amersham) koja je ekvilibrisana sa Equi- puferom(25 mM Citrat, 200 mM Lysin, 5% Glycerol, pH 7.2). Eluirani uzorci proteina (protok 1 ml/min) su podvrgnuti standardnom SDS-PAGE i VVestern Blot -u za detekciju. Pre prečišćavanja, kolona je ekvilibrisana za određivanje molekulske težine (marker komplet za molekulsku težinu, Sigma MVV GF-200). Koncetracije proteina su određene pomoću OD280 nm.

[0230]Prečišćen protein bispecifičnog jednolančanog antitela je analiziran pomoću SDS PAGE pod redukcionim uslovima izvedenim sapre- cast4-12% Bis Tris gelovima (Invitrogen). Priprema uzorka i primena su izvedeni prema protokolu proizvođača. Molekuslka težina je određena sa MultiMark protein standardom (Invitrogen). Gel je obojen koloidnim Coomassie (Invitrogen protocol). čistoća izolovanog proteina je >95% kao što je određeno spomoću SDS-PAGE.

[0231]Bispecifično jednolančano antitelo ima molekulsku težinu od oko 52 kDa pod nativnim uslovima kao što je određeno gel filtracijom u PBS-u. Svi konstrukti su prečišćeni prema ovoj metodi.

[0232] VVestem Blot je izveden korišćenjem Optitran® BA-S83 membrane i Invitrogen Blot Module prema protokolu proizvođača. Za detekciju proteina antitlea bispecifičnog jednolančanog antitlea korišćen je Hisd Tag antitelo (Penta His, Qiagen). Kozije-anti-mišiji Ig obeležen alkalnom fosfatazom (AP) (Sigma)je upotrebljeno kao sekundatrno antitelo i BCIP/NBT (Sigma) kao supstrat Jedna traka je detekovana na 52 kD koja odgovara prečišćenom bispecifičnom jednolančanom antitelu.

[0233]Alternativno, različite CHO ćelije bez DHFR transfektovane su prolazno. Ukratko, 4 x 105 ćelija po konstruktu je gajeno u 3 ml RPM11640 medijuma sa stabilizovanim glutaminom u koji je dodat 10% fetalni goveđi serum, 1% penicilin/streptomicin i nukleozidi iz osnosvnog rastvora reagensa za gajenje ćelijske kulture (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanv) do krajnje koncentracije od 10 ug/ml Adenozin, 10 ug/ml Dezoksiadenozin i10 ug/ml Timidin, u inkubatoru na 37°C, 95% vlažnosti i 7% C02 jedan dan pre transfekcije. Transfekcija je izvedena sa Fugene 6 Transfection Reagensom (Roche, # 11815091001) prema instrukcijama proizvođača. 94 ul OptiMEM medijuma (Invitrogen) i 6 ul Fugene 6 je pomešano i inkubirano 5 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim, 1.5 ug DNK po konstruktu je dodato, smeša je inkubirana 15 minuta na sobnoj temperaturi. U m eđuvremenu, CHO ćelije bez DHFR su isprane sa 1x PBS -om i resuspendovane u 1.5 ml RPMI 1640 medijuma. Transfekciona smeša je razblažena sa 600 ul RPM11640 medijuma, dodata u ćelije i inkubirana preko noći na 37°C, 95% vlažnosti i 7% C02. Dan posle transfekcije, inkubaciona zapremina svakog od pristupa je povećana na 5 ml RPM11640 medijuma. Supernatant je sakupljen posle 3 dana inkubiranja.

17. Analiza vezivanja MCSPiCD3 interspecijskispecifičnih bispecifičnihantitela

protočnom citometrijom

[0234]Da bi se testirala funkcionalnost konstrukata interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela u pogledu kapaciteta da se vežu za MCSP D3 i CD3 čoveka i makaki majmuna, respektivno, izcedena je FACS analiza. U ovu svrhu, CHO ćelije transfektovane sa MCSP D3 čoveka (kao što je opisano u Primeru 14) i CD3 pozitivna ćelijska linija T ćelija leukemije HPB-ALL čoveka(DSMZ, Braunschvveig, ACC483) su upotrebljene za testiranje vezivanja antigena čoveka. Reaktivnost vezivanja za makaki antigene je testirana koristeći dobijene makaki MCSP D3 transfektante (opisane u Primeru 15) i makaki T ćelijske linije 4119LnPx (dobijene zahvaljući ljubaznosti Prof. Fickenscher, Hvgiene Institute, Virologv, Erlangen-Nuernberg; objavljeno u Knappe A, et al., and Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). 200.000 ćelija odgovarajućih ćelijskih linija je inkubirano 30 min na ledu sa 50 ul prečišćenog proteina konstrukata interspecijski specifičnih bispecifičnih antitlea (2 ug/ml) ili supernatant ćelijske kulture transfektovanih ćelija koje eksprimuju konstrukte interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela. Ćelije su dva puta isprane u PBS -u sa 2% FCS i vezivanje konstrukta je detektovano pomoću mišijeg anti-His antitela (Penta His antitelo; Oiagen; razblaženo 1:20 u 50 ul PBS sa 2% FCS). Posle ispiranja, vezana anti-His antitela su detektovana pomoću Fc gama-specifičnog antitela (Dianova) konjugovana sa pikoeritirinom, razblažena 1:100 u PBS -u sa 2% FCS. Supernatant netransfektovanih CHO ćelija je upotrebljen kao negativna kontrola za vezivanje linija T ćelija Jednolančani konstrukt sa nevažnom ciljanom specifičnošću je upotrebljen kao negativna kontrola za vezivanje za MCSP-D3 transfektovane CHO ćelije.

[0235]Porotočna citometrija je izvedena na aparatu FACS-Calibur; CellOuest softver je upotrebljen za sakupljanje i analizu podataka (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). FACS bijenje i merenje inteziteta fluorescencije su izvedeni kao što je opisano uCurrent Protocols in lmmunology ( Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[0236]Bispecifično vezivanje jednolančanih molekula koji su prethodno dati; koji su interspecijski specifični za MCSP D3 i interspecijski specifični za čoveka i makaki CD3 su jasno detektovani kao što je prikazano na Slikama 14, 15, 16 and 58. U FACS analizi, svi konstrukti su pokazali vezivanje za CD3 i MCSP D3 u odnosu na odgovarajuće negativne kontrole. Pokazan je Interspecijski specifičnost bispecifičnih antitela za antigene čoveka i makaki CD3 i MCSP D3.

18. Bioaktivnost MCSPiCD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolačanih antitela

[0237]Kao što je prikazano na Slikama 17 do 21, svi dobijeni konstrukti interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitlea otkrivaju citotoksične aktivnosti na MSCP pozitivne ciljne ćelije čoveka izazavane CD8+ ćelijama čoveka i MSCP pozitivne ciljne ćelije cinomolgus -a izazvane T ćelijskom linijom 4119LnPx makaki majmuna. Bispecifično jednolančano antitelo sa različitim ciljanim specifičnostima je upotrebljeno kao negativna kontrola.

19. Stabilnost MCSP i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela

u plazmi

[0238]Stabilnost dobijenih jednolančanbnih antitela u plazmi čoveka je analizirana inkubacijom bispecifičnih jednolančanh antitela u 50% plazmi čoveka na 37°C i na 4°C u trajanju od 24 h i naknadnim testiranjem bioaktivnosti. Bioaaktivnost je ispitivana u in vitro testu /probi citotoksičnosti sa oslobađanjem hroma 51 (<51>Cr) pomoću MCSP pozitivne CHO ćelijske linije (eksprmira MCSP kao kloniran prema primeru 14 ili 15) kao ciljem i stimulisanih CD8 pozitivnim T ćelijama čoveka kao efektorskim ćelijama.

[0239]EC50vrednosti izračunate analitičkim programom kao što je prethodno opisano su korišćene za poređenje bioatkivnosti bispecifičnih jednolančanih antitela inkubiranih sa 50% humanom plazmom u trajanju od 24 h na 37°C i 4°C respektivno sa bispecifičnim jednolančanim antitelima bez dodatka plazme ili pomešana sa istom količinom plazme neposredno pre testiranja.

[0240]kao što je prikazano na Slici 22 i u Tabeli 3, bioaktivnost G4 H-L x I2C H-L, G4 H-L x H2C H-L i G4 H-L x F12Q H-L bispecifičnih antitela nije značajno smanjena u odnosu na kontrole uz dodatak plazme neposredno pre testiranja bioaktivnosti.

20. Stvaranje interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula EGFR i CD3

čoveka

[0241]Molekuli bispecifičnih jednolančanih antitlea sa domenom vezivanja interspecijski specifičnim za čoveka i CD3 cinomolgusa kao i domen vezivanja interspecijski specifičan za EGFR čoveka, su dati u Tabeli 4 koja sledi:

[0242]Prethodno navedeni konstrukti koji sadrže domene varijabilnog teškog lancae (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL) interspecijski specifične za EGFR čoveka i cinomolgusa su dobijeni sintezom gena. Sinteza genskog fragmenta je dizajnirana da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta, pa zatim 19 amino kiselinski imunoglobulin čeoni peptid, nakon čega sledi u istom okviru čitanja kodirajuću sekvecu respektivnog molekula bispecifičnog jednolačanog antitela, pa zatim u istom okviru čitanja, kodirajuću sekvencu od 6 histidin tagova i stop kodon.

[0243]Sinteza genskog fragmenta je takođe dizajnirana tako da uvede pogodna N- i C-terminalna restrikciona mesta. Sinteza genskog fragmenta je klonirana preko ovih restrikcionih mesta u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) prema standardnom protokolu (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratorv Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Konstrukti su transfektovani stabilno transfektovani u CHO ćelije bez DHFR (ATCC No. CRL 9096) i svakako dobijeni i prečišćeni kao što je opisnao u Primeru 10.21. Dobijanje interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančani molekula EGFR and

CD3 i čoveka

[0244]Molekuli bispecifičnog jednolančanog antitela sa vezivnim domenom interspecijski specifičan za CD3 čoveka i cinomolgus majmuna kao i vezivnim domenom interspecijski specifičan za EGFR čoveka, su dizajnirani kao što je dato u sledećoj Tabeli 5:

[0245]Prethodno navedeni konstrukti koji sadrže domene varijabilnih teških lanaca (VH) i varijabilnih lakih lanaca (VL) interspecijski specifične za EGFR čoveka i cinomolgusa su dobijeni sintezom gena. Sinteza genskog fragmentaj dizajnirana tako da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta, pa zatim 19 amino kiselinski imunoglobulin čeoni peptid, nakon čega sledi u istom okviru čitanja kodirajuću sekvecu respektivnog molekula bispecifičnog jednolačanog antitela, pa zatim u istom okviru čitanja, kodirajuću sekvencu od 6 histidin tagova i stop kodon.

[0246]Sinteza genskog fragmenta je takođe dizajnirana tako da uvede pogodna N- i C-terminalna restrikciona mesta. Sinteza genskog fragmenta je klonirana preko ovih restrikcionih

mesta u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratorv Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Konstrukti su transfektovani stabilno transfektovani u CHO ćelije bez DHFR (ATCC No. CRL 9096) i svakako dobijeni i prečišćeni kao što je opisnao u Primeru 10.

22. Dobijanje interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula Her2/neui

CD3 čoveka

[0247]Molekuli bispecifičnih jednolančanih antitlea sa vezivnim domenom interspecijski specifičnim za CD3 čoveka i cinomolgusa kao i domenom vezivanja interspecijski-specifičnim za Her2/neu čoveka su dizajnirani kao što je dato u Tabeli 6 koja sledi:

Tabela 6: Formati Her2/neui CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela

[0248]Prethodno navedeni konstrukti koji sadrže varijabilne teške lance (VH) i varijabilne lake lance (VL) domena interspecijski specifične za HER2/neu čoveka i cinomolgusa su dobijeni sintezom gena. Sinteza genskog fragmenta je dizajnirana tako da da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta, pa zatim 19 amino kiselinski imunoglobulin čeoni peptid, nakon čega sledi u istom okviru čitanja kodirajuća sekveca respektivnog molekula bispecifičnog jednolačanog antitela, pa zatim u istom okviru čitanja, kodirajuća sekvenca od 6 histidin tagova i stop kodon.

[0249]Sinteza genskog fragmenta je takođe dizajnirana tako da uvede pogodna N- i C-terminalna restrikciona mesta. Sinteza genskog fragmenta je klonirana preko ovih restrikcionih

mesta u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratorv Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Različite CHO ćelije bez DHFR (ATCC No. CRL 9096) transkfektovane su konstruktima stabilno.a i takođe dobijenie i prečišćene kao što je opisano u Primeru 10.

23.1. Dobijanje CHO ćelija koje eksprimuju HER2 čoveka

[0250]Kodirajuća sekvenca HER2 čoveka kao štoje objavljeno u GenBank (pristupni broj X03363) dobijena je genskom sintezom prema standardnim protokolima. Fragmenti sinteze gena su dizajnirani tako da sadrže kodirajuću sekvencu HER2 proteina čoveka, uključujući njegov čeoni peptid (cDNK i amino kiselinska sekvenca konstrukta su date kao SEQ ID Br. 459 i 460). Fragment sinteze gena je takođe dizajniran tako da uvede restrikciona mesta na početku i na kraju fragmenta. Uvedena restrikciona mesta, Xbal na 5' kraju i Sali na 3' kraju, su iskorišćena u procedurama kloniranja koje sledi. Fragment sinteze gena je kloniran via Xbal i Sali u plazmid označen kao pEFDHFR (pEFDHFR je opisan uRaum et al. Cancer Immunol Immunother 50 ( 2001) 141- 150)prema standardnim protokolima. Prethodno navedene procedure su izvedene u skladu sa standardnim protokolima[ Sambrook, Molecular Cloning; A

Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour,

New York ( 2001)).Klon sa nukeotidnom sekvencom koja je potvrđen je transfektovan u ćelije CHO bez deficient DHFR za eukariotsko eksprimiranje konstrukta. Eukariotska ekspresija proteina u CHO ćelijama kojima nedostaje DHFR je izvedena kao što jeopisano Kaufmann RJ.

( 1990) Methods Enzymol. 185, 537- 566.Amplifikacija gena konstrukta je indukovana povećanjem koncentracija metotreksata (MTX) do krajnje koncentracije do 20 nM MTX.

23.2. Dobijanje ćelija CHO koje eksprimuju ekstracellularni domen Her2 makaki majmuna

[0251]Kodirajuća sekvenca za Her2 čoveka kao što je prethodno opisana je modifikovana tako da kodira amino kiseline 123 do 1038 proteina Her2 makaki majmuna kao što je objavljeno u GenBank (pristupni broj XP_001090430). Kodirajuća sekvenca za ovaj himerni protein je dobijena sintezom gena prema standardhim protokolima (cDNK i amino kiselinska sekvenca konstrukta su date kao SEQ ID Nos 461 i 462). Sinteza genskog fragmenta je takođe dizajnirana tako da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta i restrikciona mesta na početku i na kraju fragmenta. Uvedena restrikciona mesta Xbal na 5' kraju o Sali na 3' kraju, su iskorišćena u procedurama kloniranja kako sledi. Sinteza genskog fragmenta je zatim klonirana preko Xbal i Sali u plazmid označen kao pEFDHFR (pEFDHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Klon potvrđene sekvence ovog plazmida je upotrebljen za transfekciju transfect CHO/dhfr- ćelija kao što je prethodno opisano.

23.3. Stvaranje interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekula HER2 i

CD3

3.1. Kloniranje interspecijski specifičnih vezivnih molekula

[0252]Generalno, molekuli bispecifičnihjednolančanih atitela, gde svaki molekul sadrži domen sa specifičnošću vezivanja interspecijski specifian za CD3epsilon čoveka i makakija, kao i domene sa aktivnošći vezivanja interspecijski specifičnim za HER2 čoveka i makaki, su dizajnirani kao što je opisano u Tabeeli 7:

[0253]Prethodno navedeni konstrukti sadrže varijabilne domene lakih lanaca (L) teških lanaca

(H) interspecijski specifičnih za HER2 čoveka i makakija i CD3 specifične VH i VL kombiancije interspecijski specifične za CD3 čoveka i makakija su dobijeni sintezom gena. Sinteza genskog

fragmenta je dizajnirana tako da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta, pa zatim 19 amino kiselinski imunoglobulin čeoni peptid, nakon čega sledi u istom okviru čitanja kodirajuća sekveca respektivnog molekula bispecifičnog jednolačanog antitela, pa zatim u istom okviru čitanja, kodirajuća sekvenca od 6 histidin tagova i stop kodon.

Sinteza genskog fragmenta je takođe dizajnirana tako da uvede odgovarajuća restrikciona mesta na početku i na kraju fragmenta. Uvedena restrikciona mesta su iskorišćena u procedurama kloniranja koje slede. Sinteza genskog fragmenta je klonirana preko ovih restrikcionih mesta u plazmid označen kao pEFDHFR (pEFDHFR je opisanRaum etal. Cancer Immunol Immunother 50 ( 2001) 141- 150)prema standardnim protokolima. Prethodno opisane procedure su izvedene prema standardnim protokolima( Sambrook, Molecular Cloning; A

Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour,

New York ( 2001)).Klon sa potvrđenom nukleotidnom sekvencom je transfektovan u CHO ćelije kojima nedostaje DHFR za eukariotkso eksprimiranje konstrukta. Eukariotksa ekspresija proteina u CHO ćelijama bez DHFR je izvedena kao što je opisao Kaufmann RJ. (1990) Methods Enzvmol. 185, 537-566. Genska amplifikacija konstrukta je indukovana povećanjem koncentracija metotreksata (MTX) do konačne koncetracije od 20 nM MTX.

3.2. Ekspresijaiprečišćavanje molekula bispecifičnog jednolačanog antitela

[0254]Molekuli bispecifičnih jednolančanih antitela su eksprimirani u jajnim ćelijama kineskog hrčka (engl. Chinese hamster ovary cells (CHO)). Eukariotska ekspresija proteina u CHO ćelijama kojima nedostaje DHFR je izvedena kao što je opsaoKaufmann R. J. ( 1990) Methods Enzymol. 185, 537- 566.Genska amplifikacija konstrukta je indukovana dodatkom rastućih koncentracija MTX do konačnih koncetracija od 20 nM MTX. Posle dva pasaža stacionarne kulture, ćelije su rasle u rotirajućim bocama u tečnom soja medijumu bez nukleoizda HyQ PF CHO (sa 4.0 mM L-Glutaminom sa 0.1% Pluronic F - 68; HvCIone) tokom 7 dana pre sakupljanja. Ćelije su uklonjene centrifugiranjem i supernatant koji sadrži eksprimirani protein je skladištena na -80°C. Transfekcija je izvedena sa 293fectin reagensom (Invitrogen, #12347-019) prema instrukcijama proizvođača.

[0255]Akta® Explorer Svstem (GE Health Svstems) i Unicorn® Softvvare su upotrebljeni za hromatografiju. Metal helatna hromatografija ("IMAC") je izvedena pomoću Fractogel EMD chelate® (Merck) koji je nanet sa ZnCI2prema protokolu proizvođača. Kolona je ekvilibrisana sa puferom A (20 mM natrijum fosfatni pufer pH 7.2, 0.1 M NaCI) i supernatant ćelijske kulture (500 ml) je nanet na kolonu (10 ml) pri protoku od 3 ml/min. Kolona je isprana sa puferom A kako bi se uklonio nevezani uzorak. Vezani protein je eluiran primenom dvostepenog gradijenta pufera B (20 mM natrijum fosfatni pufer pH 7.2, 0.1 M NaCI, 0.5 M Imidazol) kao:

Korak 1: 20% pufer B u 6 zapremina kolona

Korak 2:100% pufer B u 6 zapremina kolona

[0256]Frakcije eluiranog proteina iz koraka 2 su sakupljene za dalje prečišćavanje. Sve hemikalije su stepena čistoće namenjena za istraživanja i nabavljene od Sigma (Deisenhofen) ili Merck (Darmstadt).

[0257]Gel filtraciona hromatografija je izvedena na HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade koloni (GE/Amersham) koja je ekvilibrisana sa Equi- puferom(25 mM Citrat, 200 mM Lizin, 5% Glicerol, pH 7.2). Eluirani uzorci proteina (protok 1 ml/min) su podvrgnuti standardnoj SDS-PAGE i VVestern Blot za detekciju. Pre prečišćavanja, kolona je kalibrisana za određivanje molekulske težine (komplet za marker molekulske težine, Sigma MW GF-200). Koncentracije proteina su određene pomoću OD280 nm.

[0258]Prečišćen protein bispecifičnog jednolančanog antitela je analiziran pomoću SDS PAGE pod redukcionim uslovima izvedenim sapre-casf 4-12%Bis Tris gelovima (Invitrogen). Priprema uzorka i primena su izvedeni prema protokolu proizvođača. Molekulska težina je određena sa MultiMark protein standardom (Invitrogen). Gel je obojen koloidnim Coomassie (Invitrogen protocol). Čistoća izolovanog proteina je >95% kao što je određeno spomoću SDS-PAGE.

[0259] ]Bispecifično jednolančano antitelo ima molekulsku težinu od oko 52 kDa pod nativnim uslovima kao što je određeno gel filtracijom u PBS-u. Svi konstrukti su prečišćeni prema ovoj metodi.

[0260]VVestern Blot je izveden korišćenjem Optitran® BA-S83 membrane i Invitrogen Blot Module prema protokolu proizvođača. Za detekciju proteina bispecifičnog jednolančanog antitela korišćeno je His Tag antitelo (Penta His, Oiagen). Kozije-anti-mišije Ig antitelo obeleženo alkalnom fosfatazom (AP) (Sigma) je uptorebljeno kao sekundarno antitelo i BCIP/NBT (Sigma) kao supstrato. Jedna traka je detekovana na 52 kD koja odgovara prečišćenom bispecifičnom jednolančanom antitelu.

23.4. Analiza vezvivanjaHER2i CD3 interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela protočnom citometrijom

[0261]U cilju testiranja funckionalnosti konstrukata interspecijski specifičnog Bispecifičnog antitela po pitanju kapaciteta vezivanja za HER2 i CD3 čoveka i makakija, respektivno, izvedena je FACS analiza. U ove svrhe CHO ćelije transfektovane sa HER2 čoveka kao što je opisano u Primeru 23.1 i humane CD3 pozitivne T ćelije leukemijske ćelijske linije HPB-ALL (DSMZ, Braunschvveig, ACC483) su korišćene za testiranje vezivanja za antigene čoveka. Reaktivnost vezivanja za antigene makakija je testirana upotrebom dobijenog transfektanta HER2 makakija, kao što je opisano u Primeru 23.2 i T ćelijska linija 4119LnPx makakija (dobijene zahvaljući Ijubaznošću Prof Fickenscher, Hvgiene Institute, Virologv, Erlangen-Nuernberg; published in Knappe A, et al., and Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61) 200.000 ćelija respektivne ćelijske populacije je inkubirano tokom 30 min na ledu sa 50 ul prečišćenog proteina konstrukata interspecijski specifičnih bispecifičnih antitela (2 ug/ml). Ćelije su dva puta isprane u PBS sa 2% FCS i vezivanje konstrukta je detektovano sa anti- His antitelom miša (Qiagen; razblažen 1:20 u 50 ul PBS sa 2% FCS). Posle ispiranja, vezana anti - His antitela su detektovana sa Fc gama-specifičnim antitelima (Dianova) konjugovani za fikoeritrin, razblažen 1:100 u PBS sa 2% FCS. PBS sa 2% FCS je upotrebljen kao negativna kontrola za vezivanje T ćelijskih linija kao i za CHO ćelioje trasfektovane sa HER2.

[0262]Protočna citometrija je izvedena na FACS-Calibur aparatu, CellOuest softver je

upotrebljen za izvođenje i analizu podataka (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). FACS bojenje i merenje intenziteta fluorescencije je izuvedeno kao što je opisano u Current Protocols in Immunologv (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-lnterscience, 2002).

[0263]Bispecifično vezivanje jednolančanih molekula koji su interspecijski specifični za HER2 i interspecijski specifični za CD3 čoveka i primata osim šimpanze je jasno detektovana kao što je prikazano na Slici 23. U FACS analizi, svi konstrukti pokazuju vezivanje za CD3 i HER2 u odnosu na odgovarajuće negativne kontrole. Prikazana je Interspecijski specifičnost bispecifičnih antitela za CD3 i HER2 antigeni čoveka i makakija.

23.5. Bioaktivnost HER2iCD3 interspecijski specifinih bispecifičnih jednolančanih

antitela

[0264]Bioaktivnost dobijenih bispecifičnih jednolančanih antitela je analizirana hromom 51 (<51>Cr) koji se oslobađa uin vitroprobi citotoksičnosti korišćenjem HER2 pozitivne ćelijske linije ipisane u Primerima 23.1 i 23.2. Kao efetorske ćelije korišćene su stimulisane CD4/CD56 čoveka bez PBMC ili T ćelijska linija 4119LnPx makakija kao što je naznačenio na odgovarajućim slikama.

[0265]Dobijanje stimulisanih CD4/CD56 kojima nedostaje PBMC je izvedeno na sledeći načina: Petri sud (prečnika od 85 mm, Nunc) je obložen komercijalno dostupnim anti-CD3 specifičnim antitelom (npr. OKT3, Othoclone) u krajnoj koncentraciji od 1 ug/ml u trajanju od 1h na 37°C. Nevezani protein je uklonjen jednim korakom ispiranjem sa PBS. Sveži PBMC su izolovani iz periferijske krvi (30 - 50 ml krvi čovek) centrifugiranjem u Ficoll gradijentu prema standardnim protokolima. 3 - 5 x 107 PBMC su dodati u prethodno obložen petri sud u 50 ml RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom/10% FCS / IL-2 20 U/ml (Proleukin, Chiron) i stimulisane 2 dana. Trećeg dana, ćelije su sakupljene i isprane sa RPM11640. IL-2 je dodat do krajnje koncentracije od 20 U/ml i ćelije su ponovo gajene jedan dan u istoj ćelijskoj podlozi kao što je prethodno dato. Deplecijom CD4+ T ćelija i CD56+ NK ćelija prema standardnim protokolima, obogaćeni su citotoksični T limfociti (CTLs) sa CD8+, ciljne ćelije su isprane dva puta sa PBS i označene kao 11.1 MBq<51>Cr u krajnjoj zapremini od 100 ul RPMI sa 50% FCS u trajanju od 45 minuta na 37°C. Naknadno su obeležene ciljne ćelije isprane 3 puta sa 5 ml RPMI ip otom upotrebljen u probi citotoksičnosti. Proba je izvedena na ploči sa 96 ležišta u ukupnoj zapremini od 250ul dopunjenog sa RPMI (kao prethodno) sa odnosom E:T od 1:1 ili 10:1, što je naznačeno na odgovarajućim slikama. Naneto je 1 ug/ml molekula interspecijski specifičnog bispecifičnog jednolančanih antitle i njihovih 15 - 21 petostrukih razblaženja. Vreme analize iznosi 18 h i citotoksičnost je merena kao relativna vrednost oslobođenog hroma u supernatantu u odnosu na razliku maksimalne lize (dodatak Triton-X) i spontane lize (bez efektorskih ćelija). Sva merenja su urađena u četvorostrukim ponavljanjima. Merenja aktivnosti hroma u supernatantima su izvedena sa VVizard 3" gama brojačem( Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Germany).Analiza eksperimentalnih podataka je izvedena saPrism 4 for Windows(version 4.02, GraphPad Softvvare Inc., San Diego, California, USA). Sigmoidalne krtive doze-odgovora obično imaju vrednosti R<2>>0.90 kao što je određeno softverom. EC50vrednosti su izračunate regresionom analiziom upotrebljenom za porešenje bioaktivnosti.

[0266]Kao što je prikazano na Slici 24, konstrukti interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela pokazuju citotoksičnu aktivnost na HER2 pozitivne ciljne ćelije čoveka stimulisane PBMC čoveka, kojima nedostaje CD4/CD56 i na HER2 pozitivne ciljne ćelije čoveka izazvane T ćelijskom linijom 4119LnPx makaki majmuna.

Primer 24: Kloniranje i ekspresija IgE čoveka i makakija u obliku u kom je vezan za

membranu

[0267]Ćelijska linija J558L miša (dobijena preko Interlab Project, Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova, ltaly, ECACC 88032902), ćelijska linija mijeloma koja spontano gubi varijante teškog lanca, ali sintetiše i sekretuje lambda lak lanac, upotrebljena je da se dopuni varijantom teškog lanca čoveka, odnosno makakija, vezanog za membranu respektivno. U cilju dobijanja ovakvih konstrukata, sintetički molekuli su dobijeni sintetom gena prema standardnim protokolima (nukleotidne sekvence konstrukata su sada navedene kao SEQ ID br. 507 i 508). U ovim konstruktima, kodirajuća sekvenca za c epsilon lanac čoveka i makaki majmuna su fuzionisani za transmembranski region IgE čoveka, respektivno. Ugrađena specifičnost VH lanca je usmerena na hapten (4-hidroksi-3-nitro-fenil)acetil) (NP). Sinteza genskog fragmenta je dizajnirana tako da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta i čeoni imunoglobulina i restrikciona mesta na početku i na kraju DNK. Uvedena restrikciona mesta EcoRI na 5" kraju i Sali na 3' kraju su korišćena tokom faze kloniranja u ekspresioni plaumid označen kao pEFDHFR. Posle potvrde sekvence (makaki: XM_001116734 macaca mulatta Ig epsilon C region, mRNA; čovečiji: NC_000014 Homo sapiens hromozom 14, kompletna sekvenca,National Center for Biotechnology Information, http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ entrez)plazmidi su upotrebljeni za transfekciju CHO/dhfr- ćelija kao što je prethodno opisano. Eukariotska ekpresija proteina u DHFR deficijkentnim CHO ćelijama je izvedena kao što je opisaoKaufmann RJ. ( 1990) Methods Enzymol. 185, 537- 566.Genska amplifikacija konstrukta je indukovana povećanjem koncentracija metotreksata (MTX) do krajnje koncetracije od 20 nM MTX.

Primer25: Stvaranje interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih molekulaIgEi

CD3

[0268] Generalno, molekuli bispecifičnih jednonačanih antitela, gde svaki sadrži domena koji ima specifičnost vezivanja za CD3 čoveka i cinomolgusa, kao i domen koji ima specifičnost vezivanja za IgE antigen čoveka i makakija, su dizjanirani kao što je dato u Tabeli 8 koja sledi:

[0269]Prethodno navedeni konstrukti koji sadrže varijabilne domene lakog lanca (L) i teškog lanca (H) interspecijski specifične za IgE i CD3 čoveka i makakija specifične VH i VL kombinacije interspecijski specifične za CD3 čoveka i makaki su dobijeni genskom sintezom. Sinteza genskog fragmenta je dizajnirana tako da prvo ima mesto Kozakove potrebno za eukariotsku ekspresiju konstrukta, pa zatim 19 amino kiselinski imunoglobulin čeoni peptid, nakon čega sledi u istom okviru čitanja kodirajuća sekveca respektivnog molekula bispecifičnog jednolačanog antitela, pa zatim u istom okviru čitanja kodirajuću sekvencu od 6 histidin tagova i stop kodon. Sinteza genskog fragmenta je takođe dizajnirana tako da uvode odgovarajuća restrikciona mesta na početku i na kraju fragmenta. Uvedena restrikiona mesta su upotrebljena u sledećim procedurama kloniranja. Sinteza genskog fragmenta je klonirana preko ovih restrickionih mesta u plazmid označen kao pEFDHFR prema standardnim protokolima. Klon sa potvrđenom nukleotidnom sekvencom je prebačen u CHO ćelije kojima nedostaje DHFR za eukariotksu ekspresiju konstrukta. Eukariotksa ekspresija proteina u različitim CHO ćelijama kojima nedostaje DHFR je izvedena kao što je opisaoKaufmann RJ. ( 1990) Methods Enzymol. 185, 537- 566.Genska amplifikacija konstrukta je indukovana povećanjem koncentracija metotreksata (MTX) do krajnje koncentracije od 20 nM MTX. Alternativno, CHO ćelije kojima nedostaje DHFK s u prolazno transfektovane konstruktima, prema standardnom protokolu.

[0270]Eksperimenti FACS vezivanja su izvedeni sa transfektovanom J558L ćelijskom linijom IgE čoveka kako bi se odredio kapacitet vezivanja za humani IgE. Interspecijski specifičnost na IgE pozitivne ćelije makakija je testirana raspoređivanje J558L ćelija transfektovane sa IgE makakija. Iste izmene u ćelijskim linijama se primenjuju u testu citotoksičnosti koji je izveden sa IgE i CD3 interspecijski specifičnim bispecifičnim jednolančanim antitelima. Pored ovog izvedeni su testovi kao što je opisano u primerima 4 i 5.

[0271]Kao što je naznačeno na Slici 23, dobijena interspecijski specifična bispecifična jednolančana IgE i CD3 antitela pokazuju vezivanje za antigen čoveka i cinomolgusa i tako dokazuju da su potpuno interspecied specifična.

[0272]Kao što je prikazano na Slici 24, svi od dobijenih konstrukata interspecijski specifičnih bispecifičnih jednolančanih antitela pokazuju citotoksičnu aktivnost na IgE pozitivne ciljne ćelije čoveka izazvane CD8+ ćelijama čoveka i IgE pozitivnim ciljanim ćelijama makaki majmuna izazavnim T ćelijskom linijom 4119LnPx makaki majmuna. Kao negativna kontrola, upotrebljeno je irelevantno bispecifično jednolančano antitelo.

Primer 26: Specifično vezivanje scFv klonova za N-kraj CD3 epsilon čoveka

26.1. Baktarijska ekspresija scFv konstruktata uE. coliXL1 Blue

[0273]Kao što je prethodno navedeno,E. coli XL1Blue transformisane sa pComb3H5Bhis/Flag koji sadrži VL- i VH-segment proizvode rastvorljive scFv u dovoljnim količinama posle ekscizije fragment III gena i indukcijom sa 1 mM IPTG. Lanac scFv-chain je eksprtovan u periplazmu gde se savija u funkcionalnu konformaciju.

[0274]Za ovaj eksperment odabrani su sledeći scFv klonovi: i) ScFvs 4-10, 3-106, 3-114, 3-148, 4-48, 3-190 and 3-271 kao što je opisano u WO 2004/106380. ii) ScFvs iz anti-CD3epsilon vezivnih klonova H2C čoveka. F12Q i 12C kao što je ovde opisano.

[0275]Za perioplazmiče preparate, bakterijske ćelije transformisane sa odgovarajućim plazmidima koji sadrže scFv omogućavajući periplazmičnu ekspresiju gajene su na SB-podlozi kojoj su dodati 20 mM MgCI2i karbenicilin 50ug/mli ponovo rastvorene u PBS -u posle sakupljanja. Posle četiri kruga zamrzavanja na -70°C i odmrzavanja na 37°C, spoljašnja membrana bakterije su razorene osmotskim šokom i u supernatant su oslobođeni rastvorljivi periplasmični proteini uključjujući scFvs. Posle eliminacije intaktnih ćelija i ćelijski ostataka, centrifugiranje, supernatant koji sadrži anti-humani CD3-scFvs čoveka je sakupljen i upotrebljen u daljem ispitivanju. Sirovi supernatanti koji sadrže scFv će dalje odrediti periplasmične preparate (PPP).

26.2. Vezivanje scFvs za (aa 1-27)- Fc fuzioni protein CD3 epsilon čoveka

[0276]ELISA probe su izvedene plastičnih ploča sa 96 ležišta (Nunc, maxisorb) oblaganjem (aa 1-27)- Fc fuzionim proteinom CD3 epsilon čoveka, obično na 4° C preko noći. Rastvor antigena za oblaganje je zatim uklonjen, ležišta su jednom isprana sa PBS/0.05 % Tvveen 20 i zatim blokirana sa PBS/3 % BSA u trajanju od najmanje jednog sata. Posle uklanjanja rastvora za blokiranje, rastvori PPPs i kontrole su dodati u ležišta i inkubirane obično jedan sat na soboj temperaturi. Ležišta su zatim isprana tri puta sa PBS/0.05 % Tvveen 20. Detekcija scFvs vezanih za imobilizovan antigen je izvedena koristeći Biotin-obeležen anti FLAG-tag antitelo (M2 anti Flag-Bio, Sigma, obično u krajnjoj koncentraciji od 1 ug/ml PBS) i detektovani Streptavidinom obeležnim peroksidazom (Dianova, 1 ug/ml PBS). Signal je razvijen dodatkom rastvora ABTS supstrata i meren na talasnoj dužini od 405 nm. Nespecifično vezivanje test-uzoraka za blokirajuće agense i/ili humani lgG1 deo CD3 epsilon (aa 1-27)- Fc fuzioni protein čoveka je ispitnao izvođenjem identične probe sa identičnim reagensima i identičnim vremenskim intervalnom na ELISA pločama koje su obložene lgG1 čoveka (Sigma). PBS je uptorebljen kao negativna kontrola.

[0277]Kao što je prikazano na Slici 25, scFvs H2C, F12Q i I2C pokazuju snažno vezivanje signala na humani CD3 epsilon (aa 1-27)- Fc fusion protein. Humani scFvs 3-106, 3-114, 3-148, 3-190, 3-271, 4-10 i 4-48 (kao što je opisano u WO 2004/106380) ne pokazuju bilo kakvo zančajno vezivanje iznad nivoa negativne kontrole.

[0278]DA bi bi se izbegla mogućnost pozitivnog vezivanja scFvs H2C, F12Q and 12C za ležišta obložena CD3 epsilon (aa 1-27)- Fc fuzionim proteinom čoveka koje može nastupiti usled vezivanja za BSA (upotrebljen kao blokirajući agens) i/ili humani lgG1 Fc-gama-deo CD3 epsilon (aa 1-27)- Fcfuzionog proteina čoveka, paralelno je izvedena druga ELISA proba. U drugoj ELISAprobi, svi parameteri su identični onim u prvoj ELISA probi, izuzev što u drugoj ELISA probi lgG1 čoveka (Sigma) je obložen umesto humanog CD3 epsilon (aa 1-27)- Fc fuzionog proteina. Kaop što je dato na slici Figure 26, ni jedan od testiranih scFvs nije pokazao značajno vezivanje za BSA i/ili lgG1 čoveka iznad nivoa šuma. Uzeti zajedno, ovi rezultati dozvoljavajuu doneošenje zaključka da scFvs4-10, 3-271, 3-148, 3-190, 4-48, 3-106 i 3-114 se ne vezuju specifično za (aa 1-27)- region CD3 epsilon čoveka , dok scFvs H2C, F12Q i I2C jasno pokazuju specifično vezivanje za N-terminalne 27 amino kiseline CD3 epsilon čoveka.

REFERENCE CITIRANE U OPISU

Ovaj spisak referenci koje citira Prijavilac je samo za čitaoca. On ne predstavlja deo ovog

evropskog patenta, lako su reference prikupljene s velikom pažnjom, nemoguće je isključiti

greške ili propuste, te se EPO ograđuje od svake odgovornosti u tom pogledu.

Patentna literatura citirana u opisu

•WO2007033230Ar00071• VVO9420627A f00971 •VVO9954440Ar0013lf00141r00511f01161• VV09429469Af00991•WO04106380A r0013l 100511 f00511•VVO9700957A f00991•US4946778Af00421•US5580859A r00991• WO2004106380Af00501T02741TO2771• US5589466AT00991• EP623679B1f00831

Claims (18)

1. Polipeptid koji sadrži prvi vezivni domen, koji je antitelo sposobno da se veže za epitop CD3e lanca čoveka i Callithrix jacchusa, Saguinus oedipusa ili Saimiri sciureusa, naznačen time, što je taj epitop deo aminokiselinske sekvence sadržane u grupi koju čine SEQ ID br:2, 4, 6, ili 8 i sadrži najmanje aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu, i drugi vezivni domen koji je u stanju da se veže za EGFR, Her2/neu ili IgE čoveka i/ili primata koji nisu šimpanze

2. Polipeptid kao što je definisano u zahtevu 1, naznačen time, što je epitop deo amino kiselinske sekvence sadržane u grupi koju čine SEQ ID NOs:2, 4, 6, i 8 i sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu.

3. Polipeptid iz zahteva 1 ili 2, naznačen time, što prvi vezivni domen sadrži VL region koji obuhvata CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 odabrane od: (a) CDR-L1 kakav je u SEQ ID br: 27, CDR-L2 kakav je u SEQ ID br: 28 i CDR-L3 kakav je u SEQ ID br: 29; (b) CDR-L1 kakav je u SEQ ID br:117, CDR-L2 kakav je u SEQ ID br:118 i CDR-L3 kakav je u SEQ ID br:119; i (c) CDR-L1 kakav je u SEQ ID NO:153, CDR-L2 kakav je u SEQ ID NO:154 i CDR-L3 kakavjeuSEQIDNO:155.

4. Polipeptid prema jednom od zahteva 1 ili 2, naznačen time, što prvi vezivni domen sadrži VL region koji obuhvata CDR-HL, CDR-H2 i CDR-H3 odabrane od : (a) CDR-H 1 kakav je u SEQ ID NO:12, CDR-H2 kakav je u SEQ ID NO:13 i CDR-H3 kakavjeuSEQIDNO:14; (b) CDR-H1 kakav je u SEQ ID NO:30, CDR-H2 kakav je u SEQ ID NO:31 i CDR-H3 kakav je u SEQ ID NO:32; (c) CDR-H1 kakav je u SEQ ID NO:48, CDR-H2 kakav je u SEQ ID NO:49 i CDR-H3 kakavjeuSEO. ID NO:50; (d) CDR-H 1 kakav je u SEQ ID NO:66, CDR-H2 kakav je u SEQ ID NO:67 i CDR-H3 kakavjeuSEQIDNO:68; (e) CDR-H 1 kakav je u SEQ ID NO:84, CDR-H2 kakav je u SEQ ID NO:85 i CDR-H3 kakavjeuSEQIDNO:86; (f) CDR-H 1 kakav je u SEQ ID NO: 102, CDR-H2 kakav je u SEQ ID NO: 103 i CDR-H3 kakavjeuSEQIDNO:104; (g) CDR-H 1 kakav je u SEQ ID NO:120, CDR-H2 kakav je u SEQ ID NO:121 i CDR-H3 kakav je u SEQ ID NO:122; (h) CDR-H 1 kakav je u SEQ ID NO:138, CDR-H2 kakav je u SEQ ID NO:139 i CDR-H3 kakavjeuSEQIDNO:140; (i) CDR-H 1 kakav je u SEQ ID NO: 156, CDR-H2 kakav je u SEQ ID NO: 157 i CDR-H3 kakav je u SEQ ID NO:158; and (j) CDR-H 1 kakav je u SEQ ID NO:174, CDR-H2 kakav je u SEQ ID NO:175 i CDR-H3 kakavjeuSEQIDNO:176.

5. Polipeptid prema jednom od zahteva 1 do 3, u kome prvi vezivni domen sadrži VL region odabran iz grupe koju čini VL region kakav je u SEQ ID NO:35, 39, 125, 129,161 ili 165.

6. Polipeptid prema jednom od zahteva 1 do 4, u kome prvi vezivni domen sadrži VH region odabran iz grupe koju čini VH regiona kakav je u SEQ ID NO: 15,19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ili 181.

7. Po'ipeotid prema jednom od zahteva 1 to 6, u kome prvi vezivni domen sadrži VL region i VH region odabran iz grupe koju čine: (a) VL region kakav je u SEQ ID NO:17 or 21 i VH region kakav je u SEQ I D NO:15 ili 19; (b) VL region kakav je u SEQ ID NO:35 ili 39 i VH region kakav je u SEQ ID NO:33 ili 37; (c) VL region kakav je u SEQ ID NO:53 ili 57 i VH region kakav je u SEQ ID NO:51 ili 55; (d) VL region kakav je u SEQ ID NO:71 ili 75 i VH region kakav je u SEQ ID NO:69 ili 73; (e) VL region kakav je u SEQ ID NO:89 ili 93 i VH region kakav je u SEPA ID NO:87 ili 91 ; (f) VL region kakav je u SEQ ID NO:107 ili 111 i VH region kakav je u SEQ ID NO:105 ili 109; (g) VL region kakav je u SEQ ID NO:125 ili 129 i VH region kakav je u SEQ ID NO:123 ili 127; (h) VL region kakav je u SEQ ID NO:143 ili 147 i VH region kakav je u SEQ ID NO:141 ili 145; (i) VL region kakav je u SEQ ID NO:161 ili 165 i VH region kakav je u SEQ ID NO:159 ili 163; i (j) VL region as depicted in SEQ ID NO:179 or 183 and a VH region as depicted in SEQ ID NO:177 or 181.

8. Polipeptid prema zahtevu 7, u kome prvi vezivni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187.

9. Polipeptid prema jednom od zahteva 1 do 8, gde je dati polipeptid bispecifični jednolačnani molekul antitela.

10. Polipeptid prema zahtevu 9, u kome bispecifični jednolanačni molekul antitela sadrži grupu sledećih sekvenci kao CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 i CDR L3 u drugom vezivnom domenu odabranom od SEQ ID NOs:441 - 446, SEQ ID NOs:453 - 458, SEQ ID NOs:463 - 468, SEQ ID NOs:481 - 486.

11. Polipeptid prema zahtevu 9, u kome bispecifični molekul jednolančanog antitle sadrži sekvencu odabranu od: (a) aminokiselinske sekkvence kao što je dato u SEQ ID NOs:389, 391, 393, 395, 397, 399, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 447, 449, 451, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 495, 497, 499, 501, 503 i 505; i (b) aminokiselinske sekvence koja je kodirana sekvencom nukleinskih kiselina kao što je dato u jednoj od SEQ ID NOs:390, 392, 394, 396, 398, 400, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 448, 450, 452, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 496, 498, 500, 502, 504 i 506.

12. Sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira polipeptid kao što je definisano u jednom od zahteva 1 do 11.

13. Vektor, naznačen time, što sadrži sekvenu nukleinskih kiselina kao što je definisano u zahtevu 12.

14. Ćelija-domaćin transformisana ili transfektovana vektorom definisanim u zahtevu 13

15. Proces za proizvodnju polipeptida prema bilo jedno od zahteva 1 do 11, gde navedeni proces obuhvata gajenje ćelija-domaćina definisane u zahtevu 14, pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju polipeptida koji su definisani bilo u jednom od zahteva 1 do 11 i povraćaj proizvedenog polipeptida iz kulture

16. Farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid prema jednom od zahteva 1 do 11, ili koji je proizvoden prema procesu iz zahteva 15.

17. Polipeptid prema jednom od zahteva 1 do 11, ili proizveden prema procesu iz zahteva 15 za upotrebu u prevenciji, lečenju ili ublažavanju bolesti odabrane od proliferatine bolesti, tumorske bolesti ili imunoločkih poremećaja.

18. Komplet koji sadrži polipepid kao što je definisano u jednom od zahteva 1 do 11, molekul nukleinske kiseline kao što je definisan u zahtevu 12, vektor kao što je definisan u zahtevu 13, ili ćeliju domašina kao što je definisana u zahtevu 14.