CN103694350B - 跨物种特异性CD3-ε结合结构域 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3(ε)链的表位的人类结合结构域的多肽以及产生所述多肽的方法。本发明还涉及编码该多肽的核酸、包含该核酸的载体以及包含该载体的宿主细胞。在另一方面，本发明提供包含所述多肽的药物组合物和所述多肽的医学应用。在进一步方面，本发明提供鉴定包含能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε(CD3ε)的表位的跨物种特异性结合结构域的多肽的方法。

Description

跨物种特异性CD3-ε结合结构域
本发明涉及包含能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3(ε)的表位的第一人类结合结构域的多肽以及产生所述多肽的方法。本发明还涉及编码该多肽的核酸、包含该核酸的载体以及包含该载体的宿主细胞。在另一方面，本发明提供包含所述多肽的药物组合物和所述多肽的医学应用。
T细胞识别受克隆型地分布的αβ和γδT细胞受体(TcR)介导，这些受体与肽MHC(pMHC)的肽负载分子相互作用(Davis & Bjorkman,Nature334(1988),395-402)。TcR的抗原特异性链不具备信号传导结构域，但代替地偶合于保守的多亚基信号传导器CD3(Call,Cell111(2002),967-979，Alarcon,Immunol.Rev.191(2003),38-46，MalissenImmunol.Rev.191(2003),7-27)。TcR连接藉以直接传达至信号传导器的机制仍是T细胞生物学的根本问题(Alarcon,上述引文；Davis,Cell110(2002),285-287)。看起来明显的是，持续的T细胞响应牵涉共同受体接合、TcR低聚和免疫突触中TcR-pMHC复合体的更高级的排列(Davis & van der Merwe,Curr.Biol.11(2001),R289-R291，Davis,Nat.Immunol.4(2003),217-224)。然而，很早的TcR信号传导在不存在这些事件时发生，并可包括配体诱导的CD3ε构象变化(Alarcon,上述引文；Davis(2002),上述引文；Gil,J.Biol.Chem.276(2001),11174-11179，Gil,Cell109(2002),901-912)。信号传导复合体的ε、γ、δ和δ亚基彼此缔合以形成CD3的ε-γ异二聚体、CD3的ε-δ异二聚体和CD3的δ-δ同二聚体(Call,上述引文)。不同研究已经揭示，CD3分子对于αβTcR的适当细胞表面表达和正常T细胞发育是重要的(Berkhout,J.Biol.Chem.263(1988),8528-8536，Wang,J.Exp.Med.188(1998),1375-1380，Kappes,Curr.Opin.Immunol.7(1995),441-447)。小鼠CD3的εγ异二聚体的胞外域片段的溶液结构显示，εγ亚基两者都是C2-set Ig结构域，它们彼此相互作用以形成异常的侧-对-侧二聚体构型(Sun,Cell105(2001),913-923)。尽管富含半胱氨酸的主干（stalk）表现为在驱使CD3二聚化中起重要作用(Su,上述引文，Borroto,J.Biol.Chem.273(1998),12807-12816)，但是通过CD3ε与CD3γ的细胞外结构域相互作用足以组装这些蛋白与TcRβ(Manolios,Eur.J.Immunol.24(1994),84-92，Manolios & Li,Immunol.Cell Biol.73(1995),532-536)。尽管仍有争论，但TcR的优势化学计量学最可能包含一个αβTcR、一个CD3的εγ异二聚体、一个CD3的εδ异二聚体和一个CD3的δδ同二聚体(Call,上述引文)。由于人类CD3的εγ异二聚体在免疫应答中的关键作用，近来解释了结合于治疗抗体OKT3的该复合体的晶体结构(Kjer-Nielsen,PNAS101,(2004),7675-7680)。
许多治疗策略通过靶向TcR信号传导、尤其是临床上广泛用于免疫抑制方案的抗人类CD3的单克隆抗体(mAb)来调节T细胞免疫性。CD3特异性小鼠mAb OKT3是第一个批准用于人类的mAb(Sgro,Toxicology105(1995),23-29)，并且作为免疫抑制剂在临床上广泛用于移植(Chatenoud,Clin.Transplant7(1993),422-430，Chatenoud,Nat.Rev.Immunol.3(2003),123-132，Kumar,Transplant.Proc.30(1998),1351-1352)、1型糖尿病(Chatenoud(2003),上述引文)和银屑病(Utset,J.Rheumatol.29(2002),1907-1913)。而且，抗CD3的mAb可诱导部分T细胞信号传导和克隆无反应性(Smith,J.Exp.Med.185(1997),1413-1422)。已在文献中描述OKT3为有效的T细胞促分裂原(Van Wauve,J.Immunol.124(1980),2708-18)以及有效的T细胞杀伤剂(Wong,Transplantation50(1990),683-9)。OKT3以时间依赖性方式表现这两种活性；在导致细胞因子释放的T细胞早期激活之后，进一步施用时，OKT3在后来阻断所有已知的T细胞功能。正是由于这种后来对T细胞功能的阻断，OKT3得以作为免疫抑制剂如此广泛应用在治疗方案中，以减少或甚至消除同种异体移植组织排斥。
OKT3逆转同种异体移植组织排斥最有可能是通过阻断所有T细胞的功能，T细胞在急性排斥中起主要作用。OKT3与人类T细胞膜中的CD3复合体反应并阻断其功能，该CD3复合体与T细胞的抗原识别结构(TCR)缔合并对信号转导是必需的。TCR/CD3的哪个亚基被OKT3结合已经是很多研究的主题。尽管一些证据指出OKT3对TCR/CD3复合体的ε亚基的特异性(Tunnacliffe,Int.Immunol.1(1989),546-50；Kjer-Nielsen,PNAS101,(2004),7675-7680)。进一步的证据已经显示，OKT3结合TCR/CD3复合体要求该复合体的其它亚基存在(Salmeron,J.Immunol.147(1991),3047-52)。
对CD3分子有特异性的其它众所周知的抗体列在Tunnacliffe,Int.Immunol.1(1989),546-50。如上所述，这种CD3特异性抗体能够诱导各种T细胞应答，诸如淋巴因子的产生(Von Wussow,J.Immunol.127(1981),1197；Palacious,J.Immunol.128(1982),337)、增殖(Van Wauve,J.Immunol.124(1980),2708-18)和抑制性T细胞的诱导(Kunicka，在"Lymphocyte Typing II(淋巴细胞分型II)"1(1986),223)。即，取决于实验条件，CD3特异性单克隆抗体可抑制或诱导细胞毒性(Leewenberg,J.Immunol.134(1985),3770；Phillips,J.Immunol.136(1986)1579；Platsoucas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(1981),4500；Itoh,Cell.Immunol.108(1987),283-96；Mentzer,J.Immunol.135(1985),34；Landegren,J.Exp.Med.155(1982),1579；Choi(2001),Eur.J.Immunol.31,94-106；Xu(2000),CellImmunol.200,16-26；Kimball(1995),Transpl.Immunol.3,212-221)。
尽管本领域中描述的许多CD3抗体已被报道为识别CD3复合体的CD3ε亚基，但是它们中大多数实际上结合构象表位，并因此仅识别天然环境中的TCR的CD3ε。构象表位的特征为存在两个或更多个不连续的氨基酸残基，它们在一级序列中是分开的，但当多肽折叠成天然蛋白/抗原时聚集到分子表面上(Sela,(1969)Science166,1365和Laver,(1990)Cell61,553-6)。本领域中描述的被CD3ε抗体结合的构象表位可分为两组。在主要组中，所述表位由例如CD3ε链和CD3γ或CD3δ链的两个CD3亚基形成。例如，若干研究中已发现，最广泛使用的CD3ε单克隆抗体OKT3、WT31、UCHT1、7D6和Leu-4不结合于以CD3-ε链单转染的细胞。然而，这些抗体给以CD3ε加CD3γ或CD3δ的组合双转染的细胞染色(Tunnacliffe,上述引文；Law,Int.Immunol.14(2002),389-400；Salmeron,J.Immunol.147(1991),3047-52；Coulie,Eur.J.Immunol.21(1991),1703-9)。在第二个较小的组中，构象表位在CD3ε亚基本身中形成。这组的一个成员是例如mAb APA1/1，其针对变性的CD3ε而产生(Risueno,Blood106(2005),601-8)。总之，本领域描述的大多数CD3ε抗体识别位于CD3的两个或更多个亚基上的构象表位。因此，形成这些表位的三维结构的不连续的氨基酸残基可位于CD3ε亚基本身上或位于CD3ε亚基和其它CD3亚基诸如CD3γ或CD3δ上。
关于CD3抗体的另一个问题是已发现许多CD3抗体为物种特异性的。抗CD3单克隆抗体（如对任何其它单克隆抗体通常认为是适用的）通过高度特异性识别它们的靶分子而起作用。它们仅识别其靶CD3分子上的单个位点或表位。例如，对CD3复合体特异性的最广泛使用和最佳表征的单克隆抗体之一是OKT-3。该抗体与黑猩猩CD3反应但不与其它灵长类诸如猕猴的CD3同系物、或狗的CD3反应(Sandusky等人,J.Med.Primatol.15(1986),441-451)。抗CD3单克隆抗体UCHT-1也与黑猩猩的CD3反应但不与猕猴的CD3反应(自己的数据)。另一方面，也有识别猕猴抗原但不识别其人类对应物的单克隆抗体的实例。这一组的一个实例是针对猕猴CD3的单克隆抗体FN-18(Uda等人,J.Med.Primatol.30(2001),141-147)。有趣的是，已发现，由于猕猴CD3抗原的多态性，来自约12%食蟹猴的外周淋巴细胞缺少与抗恒河猴CD3单克隆抗体(FN-18)的反应性。Uda等人描述不与FN-18抗体反应的食蟹猴CD3序列中两个氨基酸的置换，与和FN-18抗体反应的衍生自动物的CD3相比较(Uda等人,J MedPrimatol.32(2003),105-10；Uda等人,J Med Primatol.33(2004),34-7)。
CD3单克隆抗体和其片段固有的这种区分能力即物种特异性是将其开发为治疗人类疾病的治疗剂的显著障碍。为了获得市场许可，任何新的候选药物必须经过严格测试。这种测试可细分为临床前阶段和临床阶段：前者在动物中进行，而后者（进一步细分为通常已知的临床I期、II期和III期）在人类患者中进行。临床前测试的目的是证实候选药物具有期望的活性和最重要地是安全的。只有已经在临床前测试中证实了候选药物在动物中的安全性和可能的效力时，该候选药物才将会被相关监管机构批准在人类中进行临床测试。可以以下三种方式测试候选药物在动物中的安全性，(i)在相关物种中，即在候选药物可识别直向同源抗原的物种中，(ii)在包含人类抗原的转基因动物中和(iii)通过使用可结合动物中存在的直向同源抗原的候选药物的替代物。转基因动物的限制是该技术一般限于啮齿类动物。在啮齿类动物和人类之间存在生理学的显著差异，并且安全性结果不能容易地推测到人类。候选药物的替代物的限制是与实际候选药物相比不同的物质组成，以及所用动物通常是具有上述限制的啮齿类动物。因此，在啮齿类动物中产生的临床前数据对于候选药物具有有限的预测力。安全性测试的所选方法是使用相关物种，优选地为低等灵长类。本领域描述的适于在人类中治疗干预的CD3结合分子目前的限制是，相关物种是高等灵长类，尤其是黑猩猩。黑猩猩被认为是濒危物种，并且由于其类似人类的特征，使用这种动物进行药物安全性测试在欧洲已被禁止，而且在别处也被高度限制。
本发明涉及一种多肽，其包含能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε(ε)链的表位的优选地为人类的结合结构域，其中所述表位是包括在由SEQ ID NO.2、4、6或8组成的组中的氨基酸序列的一部分。显示在SEQ ID NO.2、4、6和8的序列及其功能片段是背景独立的CD3表位。
本发明的益处是提供了一种多肽，所述多肽包含表现对人类和非黑猩猩灵长类CD3ε(ε)链的跨物种特异性的结合结构域，其可用于临床前评价这些结合结构域在灵长类中的安全性、活性和/或药物代谢动力学概况，并且可以相同形式作为人类的药物。相同分子可用于临床前动物研究以及人类临床研究。这导致高度可比的结果和与物种特异性替代物分子相比大大提高的动物研究预测力。本发明中，意外地鉴定了CD3ε细胞外结构域的N末端1-27个氨基酸残基的多肽片段，所述多肽片段从其在CD3复合体中的天然环境中取出(并融合于异源氨基酸序列诸如EpCAM或免疫球蛋白Fc部分)时保持其三维结构完整性，这一点不同于本领域中描述的CD3ε的所有其它已知表位。
本发明中提供的CD3表位的背景独立性对应于CD3ε的前27个N末端氨基酸或此27个氨基酸的段的功能片段。本文所用关于CD3表位的短语“背景独立的”是指本文描述的创造性的结合分子/抗体分子的结合不导致抗原决定簇或表位周围的构象、序列或结构的改变或修饰。相反，由常规CD3结合分子(如，WO99/54440或WO04/106380中公开的)所识别的CD3表位位于CD3ε链C末端至背景独立的表位的N末端1-27氨基酸，其中它仅当被埋入ε链的其余部分且通过ε链与CD3γ或δ链的异二聚化而保持在正确位置时才采取正确构象。
作为本文提供的双特异性结合分子的一部分并针对背景独立的CD3表位产生(和指导)的抗CD3结合分子提供了令人惊讶的关于T细胞重新分布的临床改进，以及因此提供了更有利的安全性概况。不受限于理论，由于该CD3表位是背景独立的，其形成自主的自给自足的亚结构域而不太影响CD3复合体的其余部分，因此本文提供的CD3结合分子比识别背景依赖性CD3表位的常规CD3结合分子(如WO99/54440中提供的分子)诱导CD3构象的较少变构改变。
作为双特异性结合分子一部分的本发明CD3结合分子的CD3表位的背景独立性与以本发明CD3结合分子治疗的初始阶段中较少的T细胞重新分布有关，这导致与本领域已知的识别背景依赖性CD3表位的常规CD3结合分子相比本发明CD3结合分子的更佳的安全性概况。尤其是，由于以CD3结合分子治疗的初始阶段中的T细胞重新分布是CNS不良事件的主要风险因素，因此本发明的CD3结合分子通过识别背景独立的而不是背景依赖性CD3表位而具有超过本领域已知的CD3结合分子的实质的安全性优势。在以常规CD3结合分子治疗的初始阶段中具有关于T细胞重新分布的这种CNS不良事件的患者通常遭受精神混乱和定向障碍，在一些情况下也遭受小便失禁。精神混乱是精神状态的改变，其中患者不能够以他或她通常的清晰水平进行思考。所述患者通常难以集中精力，并且思维不仅变模糊和不清楚，还经常显著地减慢。在以常规CD3结合分子治疗的初始阶段中具有关于T细胞重新分布的CNS不良事件的患者也可能遭受失忆。经常地，精神混乱导致识别人和/或地点或判断时间和日期的能力的丧失。定向障碍的感觉在精神混乱中是常见的，并且决策能力受损。在以常规CD3结合分子治疗的初始阶段中关于T细胞重新分布的CNS不良事件还可包括模糊的言语和/或选词困难。该疾患可损害语言的表达和理解以及读和写。除了小便失禁，在一些患者中，眩晕和头昏还可伴随在以常规CD3结合分子治疗的初始阶段中关于T细胞重新分布的CNS不良事件。
所述CD3ε的27个氨基酸的N末端多肽片段中三维结构的维持可用于产生优选地为人类的结合结构域，所述结合结构域在体外能够结合于N末端CD3ε多肽片段并且在体内以相同结合亲和力结合到T细胞上天然的CD3复合体(的CD3ε亚基)。这些数据有力地指出，本文所述的N末端片段形成类似于其在体内正常存在的结构的三级构象。进行了关于CD3ε的N末端多肽片段氨基酸1-27结构完整性的重要性的一个非常敏感的测试。将CD3ε的N末端多肽片段的氨基酸1-27的单个氨基酸改变为丙氨酸(丙氨酸扫描)以测试CD3ε的N末端多肽片段的氨基酸1-27对于轻微破坏的敏感性。作为本发明双特异性结合分子一部分的CD3特异性抗体分子被用于测试与CD3ε的N末端多肽片段的氨基酸1-27的丙氨酸突变体的结合(参见所附的实施例5)。在所述片段N末端顶端的前五个氨基酸残基和在CD3ε的N末端多肽片段的氨基酸1-27的位置23和25的两个氨基酸的个别交换对于抗体分子的结合是关键的。将位置1-5区域中的包括残基Q(位置1的谷氨酰胺)、D(位置2的天冬氨酸)、G(位置3的甘氨酸)、N(位置4的天冬酰胺)和E(位置5的谷氨酸)的氨基酸残基置换为丙氨酸，破坏了本发明优选地为人类的结合分子与所述片段的结合。而对至少一些本发明的优选地为人类的结合分子而言，在所述片段C末端的两个氨基酸残基T(位置23的苏氨酸)和I(位置25的异亮氨酸)减少对本发明的优选地为人类的结合分子的结合能。
出乎意料地，已发现如此分离的优选地为人类的结合分子不仅识别人类CD3ε的N末端片段，还识别各种灵长类CD3ε的相应同源片段，所述灵长类包括新世界猴(狨猴Marmoset、普通狨猴Callithrix jacchus；绒顶柽柳猴Saguinus oedipus；松鼠猴Saimirisciureus)和旧世界猴(食蟹猕猴Macaca fascicularis，也称为食蟹猴CynomolgusMonkey；或猕猴Macaca mulatta，也称为恒河猴Rhesus Monkey)。因此，检测到本发明CD3结合分子的多灵长类特异性。以下序列分析证实，人类和灵长类在CD3ε细胞外结构域的N末端有高度同源的序列段。
在本发明中已发现，产生对CD3ε特异性的优选地为人类的结合分子是可能的，其中相同的分子可用于临床前动物测试，以及临床研究和甚至人类治疗。这是因为优选地为人类的结合分子的意外的鉴定，所述结合分子除了结合于人类CD3ε(且因为与黑猩猩对应物可能的遗传相似性)，还结合于非黑猩猩灵长类（包括新世界猴和旧世界猴）的所述抗原的同系物。如以下实施例所示，所述CD3ε特异性的优选地为人类的结合分子可整合入双特异性单链抗体以产生针对包括但不限于癌症或免疫病症的各种疾病的治疗。因此，构建以在系统发生上(与人类相距)远的物种中测试的替代的CD3ε结合结构域或包括替代的CD3ε结合结构域的双特异性单链抗体的需求消失了。结果是，可以将与预期在临床测试以及随后的市场许可和治疗药物施用中给人类施用的完全相同的分子用于动物临床前测试。使用与后来施用于人类相同的分子用于临床前动物测试的能力实际上消除或至少大大减少了在临床前动物测试中获得的数据对人类情况有受限的适用性的危险。简言之，使用与将实际施用于人类的相同的分子在动物中获得临床前安全性数据对于确保数据对人类相关情况的适用性起很大作用。相反，在常规方法中使用替代物分子，所述替代物分子必须与用于临床前安全性评估的动物测试系统在分子水平相适应。因此，有待在人类治疗中使用的分子实际上在序列上并且还可能在结构上不同于在药物代谢动力学参数和/或生物活性临床前测试中使用的替代物分子，其结果是在临床前动物测试中获得的数据对人类情况具有有限的适用性/可转移性。使用替代物分子要求对全新的构建体进行构建、产生、纯化和表征。这导致获得该分子必需的额外的开发费用和时间。总之，除了将用于人类治疗的实际药物之外，必须单独开发替代物，以至于不得不进行两种分子的两条开发线。因此，本文所述的表现跨物种特异性的人类结合分子或基于抗体的构建体的主要优势是相同的分子可用于人类治疗和临床前动物测试。
优选地，能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位的本发明的结合分子是人类来源的。此外，因为本发明的人类结合分子的人类来源，将结合分子施用于人类患者时最大可能程度地排除了针对所述结合分子的免疫反应的产生。
作为本发明双特异性结合分子一部分的优选地为人类的CD3ε特异性结合分子的另一主要优势是它们在各种灵长类中临床前测试的适用性。候选药物在动物中的行为应理想地指示该候选药物在施用于人类时的预期行为。结果是，从这种临床前测试获得的数据应该因此一般对于人类情况具有高预测力。然而，如从最近关于TGN1412(CD28单克隆抗体)的I期临床试验的悲惨结果所认识到的，候选药物在灵长类物种和人类中可能不同地作用：尽管在所述抗体的临床前测试中在以食蟹猴进行的动物研究中已观察到无或仅有有限的副作用，但是六个人类患者在施用所述抗体后发展了多器官衰竭(Lancet368(2006),2206-7)。这些不期望的反面事件的结果表明，将临床前测试限于仅一种(灵长类)物种可能不是充分的。本发明的CD3ε特异性人类结合分子结合于一系列新世界和旧世界猴的事实可能有助于克服上述情况中所面临的问题。因此，本发明提供在开发和测试人类治疗药物时将物种效应差异最小化的手段和方法。
使用作为本发明双特异性结合分子一部分的优选地为人类的跨物种特异性CD3ε结合结构域，也不再需要使测试动物适应于意欲施用于人类的候选药物，诸如例如，创造转基因动物。所述CD3ε特异性的优选地为人类的结合分子(或包含所述结合分子的双特异性单链抗体)根据本发明的应用和方法展现出跨物种特异性，可直接用于非黑猩猩灵长类临床前测试，且不需要对动物的任何遗传操纵。如本领域技术人员公知的，将测试动物适应于候选药物的方法通常具有危险，所述危险是指在临床前安全性测试中获得的结果由于动物的改变而对人类具有较少的代表性和预测性。例如，在转基因动物中，转基因编码的蛋白通常高度过表达。因此，针对该蛋白抗原的抗体的生物活性获得的数据对于所述蛋白在其中以低得多的、更生理水平表达的人类的预测价值可能是有限的。
表现跨物种特异性的、CD3ε特异性的优选地为人类的结合分子(或包含所述结合分子的双特异性单链抗体)的用途的进一步优势是避免了作为濒危物种的黑猩猩用于动物测试的事实。黑猩猩与人类的亲缘关系最近，且最近基于基因组测序数据被归类于人科动物(Wildman等人,PNAS100(2003),7181)。因此，以黑猩猩获得的数据通常被认为对于人类具有高度预测性。然而，因为其作为濒危物种的状态，可用于医学实验的黑猩猩的数量是高度受限的。如上所述的，维持黑猩猩用于动物测试因此既昂贵又存在伦理问题。使用本发明的CD3ε特异性的优选地为人类的结合分子(或包含所述结合分子的双特异性单链抗体)在临床前测试期间避免了伦理异议和经济负担，并且不妨碍获得的动物测试数据的质量，即适用性。基于此，使用CD3ε特异性的优选地为人类的结合分子(或包含所述结合分子的双特异性单链抗体)为在黑猩猩中进行的研究提供了合理的替代方案。
本发明的CD3ε特异性的优选地为人类的结合分子(或包含所述结合分子的双特异性单链抗体)的进一步优势是在使用其作为动物临床前测试的一部分时，例如在药物代谢动力学动物研究过程中，抽取多个血液样品的能力。与以较低等的动物例如小鼠相比，使用非黑猩猩灵长类能够更容易地获得多个血液抽取物。多个血液样品的抽取允许连续测试血液参数以确定由本发明的优选地为人类的结合分子(或双特异性单链抗体)诱导的生物效应。此外，多个血液样品的抽取使研究者能够评价如上定义的优选地为人类的结合分子(或包含所述结合分子的双特异性单链抗体)的药物代谢动力学概况。此外，可能由所述优选地为人类的结合分子(或包含所述结合分子的双特异性单链抗体)诱导的反映在血液参数里的潜在副作用可在施用所述抗体期间抽取的不同血液样品中测量。这允许测定本文定义的优选地为人类的结合分子(或包含所述结合分子的双特异性单链抗体)的潜在毒性概况。
表现跨物种特异性的本文定义的优选地为人类的结合分子(或双特异性单链抗体)的优势可简略地概括如下：
第一，用于临床前测试的本文定义的优选地为人类的结合分子(或双特异性单链抗体)与用于人类治疗的结合分子是相同的。因此，不再需要开发药物代谢动力学性质和生物活性可能不同的两种独立的分子。这是非常有利的，因为例如与常规的替代物方法相比之下药物代谢动力学结果更直接地转移和应用于人类环境。
第二，使用本文定义的优选地为人类的结合分子(或双特异性单链抗体)制备人类治疗剂比替代物方法需要更低的成本和劳力。
第三，本文定义的优选地为人类的结合分子(或双特异性单链抗体)可用于不仅在一种灵长类物种中，而且在一系列不同的灵长类物种中的临床前测试，从而限制灵长类和人类之间潜在的物种差异的风险。
第四，避免把濒危物种黑猩猩用于动物测试。
第五，可抽取多个血液样品用于大规模的药物代谢动力学研究。
第六，因为根据本发明优选实施方案的优选地为人类的结合分子的人类来源，当施用于人类患者时，针对所述结合分子的免疫反应的产生被最小化。排除了对来自非人类物种如小鼠的候选药物特异性的抗体产生免疫应答的诱导，所述诱导导致针对鼠来源的治疗分子的人类-抗-小鼠抗体(HAMA)的形成。
术语“蛋白”是本领域公知的，并且描述生物化合物。蛋白包含一个或多个氨基酸链(多肽)，借此氨基酸经由肽键彼此结合。本文所用的术语“多肽”描述一组分子，其由多于30个氨基酸组成。根据本发明，多肽的组包括“蛋白”，只要该蛋白由单个多肽组成。并且与所述定义一致，术语“多肽”描述蛋白片段，只要这些片段由多于30个氨基酸组成。多肽可进一步形成多聚体，诸如二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即由多于一个多肽分子组成。形成这种二聚体、三聚体等的多肽分子可为相同或不相同的。因此，这种多聚体的相应的更高级结构称为同或异二聚体、同或异三聚体等。异多聚体(hereteromultimer)的一个实例是抗体分子，其在天然存在形式下由两条相同的多肽轻链和两条相同的多肽重链组成。术语“多肽”和“蛋白”还指天然修饰的多肽/蛋白，其中所述修饰通过例如翻译后修饰如糖基化、乙酰化、磷酸化和类似修饰实现。这种修饰是本领域公知的。
本文所用的“人类”和“人”是指物种智人(Homo sapiens)。就本文所述的构建体的医学应用而言，人类患者将以相同分子治疗。
与本发明分子在上下文中一起使用的术语“人类来源”描述可衍生自人类文库或具有对应于人类等价物的结构/序列的分子。因此，具有对应于人类序列类似物的氨基酸序列的蛋白，如，具有在骨架中对应于人类种系序列的氨基酸序列的抗体片段，被理解为人类来源的分子。
本文所用的“非黑猩猩灵长类”或“非黑猩灵长类”或其语法变体是指除了黑猩猩之外、即除了属于黑猩猩属的动物的任何灵长类，并且包括物种倭黑猩猩(Pan paniscus)和黑猩猩(Pan troglodytes)，也称为黑猩猩Anthropopithecus troglodytes或猴Simiasatyrus。“灵长类”、“灵长类物种”、“灵长类”或其语法变体表示分为原猴和类人猿两种亚目的真哺乳亚纲哺乳动物目，并包括人、猿、猴和狐猴。具体地，本文所用的“灵长类”包括原猴亚目Strepsirrhini(非眼镜猴的原猴)，其包括狐猴型下目Lemuriformes(本身包括鼠狐猴总科Cheirogaleoidea和狐猴总科Lemuroidea)、指猴型下目Chiromyiformes(本身包括指猴科Daubentoniidae)和懒猴型下目Lorisiformes(本身包括懒猴科Lorisidae和婴猴科Galagidae)。本文所用的“灵长类”还包括简鼻亚目Haplorrhini，其包括跗猴型下目Tarsiiformes(本身包括跗猴科Tarsiidae)、类人猿下目Simiiformes(本身包括阔鼻小目Platyrrhini，或新世界猴，和狭鼻小目Catarrhini，其包括猕猴总科Cercopithecidea或旧世界猴)。
本发明含义中，非黑猩猩灵长类物种可理解为狐猴、眼镜猴、长臂猿、狨猴(属于卷尾猴科Cebidae的新世界猴)或旧世界猴(属于猕猴总科Cercopithecoidea)。
本文所用的“旧世界猴”包括属于猕猴总科Cercopithecoidea的任何猴，其本身细分为以下科：猕猴亚科Cercopithecinae，其主要是非洲的但包括亚洲和北非的各种猕猴属；和疣猴亚科Colobinae，其包括大多数亚洲属但也包括非洲疣猴。
具体地，在猕猴亚科Cercopithecinae中，有利的非黑猩猩灵长类可来自长尾猴族Cercopithecini，在短肢猴属Allenopithecus内(艾伦氏沼泽猴（Allen’s Swamp Monkey）、短肢猴Allenopithecus nigroviridis)；在侏长尾猴属Miopithecus内(安哥拉侏长尾猴（Angolan Talapoin）、侏长尾猴Miopithecus talapoin；加蓬侏长尾猴（Gabon Talapoin）、侏长尾猴Miopithecus ogouensis)；在赤猴属Erythrocebus内(Patas猴、赤猴Erythrocebus patas)；在绿猴属Chlorocebus内(绿猴、绿猴Chlorocebus sabaceus；黑长尾猴（Grivet）、绿猴Chlorocebus aethiops；Bale山长尾黑颚猴（Bale MountainsVervet）、绿猴Chlorocebus djamdjamensis；Tantalus猴、绿猴Chlorocebus tantalus；长尾黑颚猴（Vervet Monkey）、绿猴Chlorocebus pygerythrus；狗尾猴（Malbrouck）、绿猴Chlorocebus cynosuros)；或在长尾猴属Cercopithecus内(Dryas猴或Salongo猴、长尾猴Cercopithecus dryas；Diana猴、长尾猴Cercopithecus diana；Roloway猴、长尾猴Cercopithecus roloway；大斑鼻猴（Greater Spot-nosed Monkey）、长尾猴Cercopithecusnictitans；蓝猴、长尾猴Cercopithecus mitis；银猴（Silver Monkey）、长尾猴Cercopithecus doggetti；金猴（Golden Monkey）、长尾猴Cercopithecus kandti；Sykes氏猴、长尾猴Cercopithecus albogularis；Mona猴、长尾猴Cercopithecus mona；Campbell氏Mona猴、长尾猴Cercopithecus campbelli；Lowe氏Mona猴、长尾猴Cercopithecus lowei；有冠（Crested）Mona猴、长尾猴Cercopithecus pogonias；Wolf氏Mona猴、长尾猴Cercopithecus wolfi；Dent氏Mona猴、长尾猴Cercopithecus denti；小斑鼻猴（LesserSpot-nosed Monkey）、长尾猴Cercopithecus petaurista；白喉长尾猴（White-throatedGuenon）、长尾猴Cercopithecus erythrogaster、Sclater氏长尾猴、长尾猴Cercopithecussclateri；红耳长尾猴、长尾猴Cercopithecus erythrotis；髭长尾猴（MoustachedGuenon）、长尾猴Cercopithecus cephus；红尾猴、长尾猴Cercopithecus ascanius；L'Hoest氏猴、长尾猴Cercopithecus lhoesti；Preuss氏猴、长尾猴Cercopithecus preussi；太阳尾猴（Sun-tailed Monkey）、长尾猴Cercopithecus solatus；Hamlyn氏猴或枭面猴（Owl-faced Monkey）、长尾猴Cercopithecus hamlyni；De Brazza氏猴、长尾猴Cercopithecus neglectus)。
可选地，猕猴亚科Cercopithecinae和狒狒族Papionini中的有利的非黑猩猩灵长类可来自猕猴属Macaca内(地中海（Barbary）猕猴、猕猴Macaca sylvanus；狮尾猕猴、猕猴Macaca silenus；南方豚尾猕猴或Beruk、猕猴Macaca nemestrina；北方豚尾猕猴、猕猴Macaca leonina；Pagai岛猕猴或Bokkoi、猕猴Macaca pagensis；Siberut猕猴、猕猴Macacasiberu；沼泽猕猴（Moor Macaque）、猕猴Macaca maura；穿靴猕猴、猕猴Macaca ochreata；Tonkean猕猴、猕猴Macaca tonkeana；Heck氏猕猴、猕猴Macaca hecki；Gorontalo猕猴、猕猴Macaca nigriscens；Celebes有冠猕猴或黑“类人猿”、猕猴Macaca nigra；食蟹猴（Cynomolgus monkey）或吃螃蟹的猕猴或长尾猕猴或Kera、食蟹猕猴Macacafascicularis；短尾猕猴（Stump-tailed Macaque）或熊猕猴、猕猴Macaca arctoides；恒河猕猴、猕猴Macaca mulatta；台湾岩石猕猴（Formosan Rock Macaque）、猕猴Macacacyclopis；日本猕猴、猕猴Macaca fuscata；Toque猕猴、猕猴Macaca sinica；冠毛猕猴（Bonnet Macaque）、猕猴Macaca radiata；地中海猕猴、猕猴Macaca sylvanmus；Assam猕猴、猕猴Macaca assamensis；西藏猕猴或Milne-Edwards氏猕猴、猕猴Macaca thibetana；Arunachal猕猴或Munzala、猕猴Macaca munzala)；在Lophocebus属中(灰颊白眉猴、Lophocebus albigena；Lophocebus albigena albigena；Lophocebus albigena osmani；Lophocebus albigena johnstoni；黑色有冠白眉猴、Lophocebus aterrimus；Opdenbosch氏白眉猴、Lophocebus opdenboschi；高原白眉猴、Lophocebus kipunji)；在狒狒属Papio中(阿拉伯狒狒Hamadryas Baboon、狒狒Papio hamadryas；几内亚狒狒（Guinea Baboon）、狒狒Papio papio；橄榄狒狒（Olive Baboon）、狒狒Papio anubis；黄狒狒、狒狒Papiocynocephalus；大狒狒（Chacma Baboon）、狒狒Papio ursinus)；在狮尾狒狒属中(狮尾狒狒、狮尾狒狒Theropithecus gelada)；在白眉猴属Cercocebus内(乌黑白眉猴SootyMangabey、白眉猴Cercocebus atys；白眉猴Cercocebus atys atys；白眉猴Cercocebusatys lunulatus；有领白眉猴（Collared Mangabey）、白眉猴Cercocebus torquatus；敏捷白眉猴（Agile Mangabey）、白眉猴Cercocebus agilis；金腹白眉猴（Golden-belliedMangabey）、白眉猴Cercocebus chrysogaster、塔纳河白眉猴（Tana River Mangabey）、白眉猴Cercocebus galeritus；狲氏白眉猴（Sanje Mangabey）、白眉猴Cercocebus sanjei)；或在山魈属Mandrillus中(山魈（Mandrill）、山魈Mandrillus sphinx；鬼狒（Drill）、山魈Mandrillus leucophaeus)。
最优选的是食蟹猕猴Macaca fascicularis(也称为食蟹猴（Cynomolgusmonkey），因此在实施例中称为“食蟹猴”)和猕猴Macaca mulatta(恒河猴(rhesusmonkey)，称为“恒河猴”(“rhesus”))。
在疣猴亚科Colobinae中，有利的非黑猩猩灵长类可来自非洲群，在疣猴属Colobus中(黑色疣猴、疣猴Colobus satanas；安哥拉疣猴、疣猴Colobus angolensis；王疣猴（King Colobus）、疣猴Colobus polykomos；熊疣猴（Ursine Colobus）、疣猴Colobusvellerosus；披斗篷疣猴（Mantled Guereza）、疣猴Colobus guereza)；在红疣猴属Piliocolobus中(西方红疣猴、红疣猴Piliocolobus badius；红疣猴Piliocolobus badiusbadius；红疣猴Piliocolobus badius temminckii；红疣猴Piliocolobus badiuswaldronae；Pennant氏疣猴、红疣猴Piliocolobus pennantii；红疣猴Piliocolobuspennantii pennantii；红疣猴Piliocolobus pennantii epieni；红疣猴Piliocolobuspennantii bouvieri；Preuss氏红疣猴、Piliocolobus preussi；Thollon氏红疣猴、Piliocolobus tholloni；中非红疣猴、红疣猴Piliocolobus foai；红疣猴Piliocolobusfoai foai；红疣猴Piliocolobus foai ellioti；红疣猴Piliocolobus foai oustaleti；红疣猴Piliocolobus foai semlikiensis；红疣猴Piliocolobus foai parmentierorum；乌干达红疣猴、红疣猴Piliocolobus tephrosceles；Uzyngwa红疣猴、红疣猴Piliocolobusgordonorum；Zanzibar红疣猴、红疣猴Piliocolobus kirkii；塔纳河红疣猴、红疣猴Piliocolobus rufomitratus)；或在绿疣猴属Procolobus中(橄榄疣猴Olive Colobus、绿疣猴Procolobus verus)。
在疣猴亚科Colobinae中，有利的非黑猩猩灵长类可选地来自叶猴(叶片猴子)群，在长尾叶猴属Semnopithecus内(尼泊尔灰叶猴（Nepal Gray Langur）、长尾叶猴Semnopithecus schistaceus；克什米尔灰叶猴、长尾叶猴Semnopithecus ajax；Tarai灰叶猴、长尾叶猴Semnopithecus hector、北方平原灰叶猴、长尾叶猴Semnopithecusentellus；黑脚灰叶猴、长尾叶猴Semnopithecus hypoleucos；南方平原灰叶猴、长尾叶猴Semnopithecus dussumieri；簇毛灰叶猴（Tufted Gray Langur）、长尾叶猴Semnopithecuspriam)；在乌叶猴属Trachypithecus的T.vetulus群中(紫脸叶猴、乌叶猴Trachypithecusvetulus；Nilgiri叶猴、乌叶猴Trachypithecus johnii)；在乌叶猴属Trachypithecus的T.cristatus群中(爪哇Lutung、乌叶猴Trachypithecus auratus；银色叶猴或银色Lutung、乌叶猴Trachypithecus cristatus；印度支那Lutung、乌叶猴Trachypithecus germaini；Tenasserim Lutung、乌叶猴Trachypithecus barbei)；在乌叶猴属Trachypithecus的T.obscurus群中(暗色叶猴（Dusky Leaf Monkey）或眼镜叶猴（Spectacled Leaf Monkey）、乌叶猴Trachypithecus obscurus；Phayre氏叶猴、乌叶猴Trachypithecus phayrei)；在乌叶猴属Trachypithecus的T.pileatus群中(戴帽叶猴、乌叶猴Trachypithecus pileatus；Shortridge氏叶猴、乌叶猴Trachypithecus shortridgei；Gee氏金色叶猴、乌叶猴Trachypithecus geei)；在乌叶猴属Trachypithecus的T.francoisi群中(Francois氏叶猴、乌叶猴Trachypithecus francoisi；Hatinh叶猴、乌叶猴Trachypithecushatinhensis；白头叶猴、乌叶猴Trachypithecus poliocephalus；老挝叶猴、乌叶猴Trachypithecus laotum；Delacour氏叶猴、乌叶猴Trachypithecus delacouri；印度支那黑色叶猴、乌叶猴Trachypithecus ebenus)；或在叶猴属Presbytis中(苏门答腊叶猴（Sumatran Surili）、叶猴Presbytis melalophos；带纹叶猴（Banded Surili）、叶猴Presbytis femoralis；沙捞越叶猴（Sarawak Surili）、Presbytis chrysomelas；白腿叶猴（White-thighed Surili）、叶猴Presbytis siamensis；白额叶猴（White-frontedSurili）、叶猴Presbytis frontata；爪哇叶猴（Javan Surili）、叶猴Presbytis comata；Thomas氏叶猴、叶猴Presbytis thomasi；Hose氏叶猴、叶猴Presbytis hosei；栗红叶猴（Maroon Leaf Monkey）、叶猴Presbytis rubicunda；孟他维叶猴（Mentawai Langur）或Joja、叶猴Presbytis potenziani；纳土纳岛叶猴（Natuna Island Surili）、叶猴Presbytis natunae)。
在疣猴亚科Colobinae中，有利的非黑猩猩灵长类可选地来自怪鼻猴群，在白臀叶猴属Pygathrix中(红腿白臀叶猴（Red-shanked Douc）、白臀叶猴Pygathrix nemaeus；黑腿白臀叶猴、白臀叶猴Pygathrix nigripes；灰腿白臀叶猴、白臀叶猴Pygathrix cinerea)；在仰鼻猴属Rhinopithecus中(金色扁鼻猴（Golden Snub-nosed Monkey）、金丝猴Rhinopithecus roxellana；黑色扁鼻猴、滇金丝猴Rhinopithecus bieti；灰色扁鼻猴、黔金丝猴Rhinopithecus brelichi；Tonkin扁鼻叶猴、越南金丝猴Rhinopithecusavunculus)；在长鼻猴属Nasalis中(长鼻猴（Proboscis Monkey）、长鼻猴Nasalislarvatus)；或在豚尾叶猴属Simias中(豚尾叶猴（Pig-tailed Langur）、豚尾叶猴Simiasconcolor)。
本文所用的术语“狨猴（marmoset）”表示狨属Callithrix的任何新世界猴，例如属于狨亚属Callithrix(sic!)的大西洋狨猴(常见狨猴、狨Callithrix(Callithrix)jacchus；黑色簇毛狨猴（Black-tufted Marmoset）、丛尾狨Callithrix(Callithrix)penicillata；Wied氏狨猴、狨Callithrix(Callithrix)kuhlii；白头狨猴、狨Callithrix(Callithrix)geoffroyi；黄头狨猴（Buffy-headed Marmoset）、狨Callithrix(Callithrix)flaviceps；黄色簇毛狨猴（Buffy-tufted Marmoset）、狨Callithrix(Callithrix)aurita)；属于Mico亚属的亚马逊狨猴(Rio Acari狨猴、狨Callithrix(Mico)acariensis；Manicore狨猴、狨Callithrix(Mico)manicorensis；银色狨猴、狨Callithrix(Mico)argentata；白狨猴、狨Callithrix(Mico)leucippe；Emilia氏狨猴、狨Callithrix(Mico)emiliae；黑头狨猴、狨Callithrix(Mico)nigriceps；Marca氏狨猴、狨Callithrix(Mico)marcai；黑尾狨猴、狨Callithrix(Mico)melanura；Santarem狨猴、白肩狨Callithrix(Mico)humeralifera；Maués狨猴、狨Callithrix(Mico)mauesi；金白狨猴、黄肢狨Callithrix(Mico)chrysoleuca；Hershkovitz氏狨猴、狨Callithrix(Mico)intermedia；Satere狨猴、狨Callithrix(Mico)saterei)；属于Callibella亚属的Roosmalens氏倭狨猴(Callithrix(Callibella)humilis)；或属于倭狨亚属Cebuella的侏儒狨猴（PygmyMarmoset）(Callithrix(Cebuella)pygmaea)。
其它属的新世界猴包括柽柳猴属Saguinus的绢毛猴（tamarin）(包括绒顶柽柳猴S.oedipus群、赤掌柽柳猴S.midas群、黑须柽柳猴S.nigricollis群、长须柽柳猴S.mystax群、两色柽柳猴S.bicolor群和烙印柽柳猴S.inustus群)和松鼠猴属Samiri的松鼠猴(如，松鼠猴Saimiri sciureus、巴拿马松鼠猴Saimiri oerstedii、马河松鼠猴Saimiri ustus、亚马逊松鼠猴Saimiri boliviensis、黑松鼠猴Saimiri vanzolini)。
关于本发明的术语“结合结构域”表征与给定靶结构/抗原/表位特异性结合/相互作用的多肽的结构域。因此，结合结构域是“抗原相互作用位点”。根据本发明，术语“抗原相互作用位点”定义多肽的基序，其能够与特异性抗原或特异性抗原组，如，不同物种中的相同抗原特异性相互作用。所述结合/相互作用还理解为定义“特异性的识别”。根据本发明，术语“特异性地识别”是指抗体分子能够与抗原(如，本文定义的人类CD3抗原)的至少两个、优选地至少三个、更优选地至少四个氨基酸特异性相互作用和/或结合。这种结合可以“锁钥原则”的特异性示例。因此，作为其一级、二级或三级结构的结果以及所述结构二级修饰的结果，结合结构域的氨基酸序列中的特异性基序与抗原彼此结合。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可同样导致所述位点与抗原的简单结合。而且，抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可选地导致信号的启动，如，因为抗原构象改变、抗原寡聚化等的诱导作用。根据本发明的结合结构域的一个优选实例是抗体。结合结构域可为单克隆或多克隆抗体或衍生自单克隆或多克隆抗体。
术语“抗体”包括仍保留结合特异性的衍生物或其功能片段。产生抗体的技术是本领域公知的并描述于，如，Harlow和Lane，“Antibodies,A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988和Harlow和Lane“UsingAntibodies:A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)”Cold Spring HarborLaboratory Press,1999。术语“抗体”还包括免疫球蛋白(Ig)的不同类(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(诸如IgG1、IgG2等)。这些抗体可用于，例如本发明的多肽或融合蛋白的免疫沉淀、亲和纯化和免疫定位，以及监测这种多肽例如在重组原核或真核细胞培养物或生物体中的存在和量。
术语“抗体”的定义还包括诸如嵌合、单链和人源化抗体以及抗体片段尤其是如Fab片段的实施方案。抗体片段或衍生物还包括F(ab')2、Fv、scFv片段或包括仅一个可变结构域的单结构域抗体、单可变结构域抗体或免疫球蛋白单可变结构域，所述可变结构域可为独立于其它V区或结构域而特异性地结合抗原或表位的VH或VL；参见，例如，Harlow和Lane(1988)和(1999)，上述引文。这种免疫球蛋白单可变结构域不仅包括分离的抗体单可变结构域多肽，还包括更大的多肽，其中所述更大的多肽包括抗体单可变结构域多肽序列的一个或多个单体。
各种程序是本领域已知的并可用于产生这种抗体和/或片段。因此，可通过模拟肽来产生(抗体)衍生物。进一步，描述单链抗体生产的技术(尤其参见美国专利4,946,778)可适于产生对所选多肽具有特异性的单链抗体。而且，转基因动物可用于表达对本发明的多肽和融合蛋白具有特异性的人源化抗体。为了制备单克隆抗体，可使用提供由连续细胞系培养物所产生的抗体的任何技术。这种技术的实例包括杂交瘤技术(和MilsteinNature256(1975),495-497)、三源杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor,ImmunologyToday4(1983),72)和产生人类单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗),Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。在BIAcore系统中所用的表面等离子体共振可用于增加噬菌体抗体的效力，所述噬菌体抗体结合于靶多肽诸如CD3ε的表位(Schier,Human Antibodies Hybridomas7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods183(1995),7-13)。在本发明上下文中还设想，术语“抗体”包括可在下文所述的宿主中表达的抗体构建体，如可通过尤其是病毒或质粒载体转染和/或转导的抗体构建体。
根据本发明使用的术语“特异性相互作用”是指结合(结构域)分子与多肽不产生或不显著产生交叉反应，其中所述多肽具有与那些被结合分子结合的多肽相似的结构，且可能被表达在与感兴趣的多肽相同的细胞中。可测试一组被研究的结合分子的交叉反应性，例如通过评估所述组的结合分子在常规条件下的结合（参阅例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册),Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1988和Using Antibodies:A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册),ColdSpring Harbor Laboratory Press,1999）。结合结构域与特异性抗原的特异性相互作用的实例包括配体对其受体的特异性。所述定义特别地包括配体的相互作用，其中所述配体与其特异性受体结合后诱导信号。也特别包括于所述定义中的所述相互作用的实例为抗原决定簇(表位)与抗体的结合结构域(抗原结合位点)的相互作用。
本文所用的术语“跨物种特异性”或“物种间特异性”是指本文所述的结合结构域与人类和非黑猩猩灵长类中相同的靶分子的结合。因此，“跨物种特异性”或“物种间特异性”应理解为对不同物种中表达的相同分子X但不对除了X以外的分子的物种间反应性。识别如人类CD3ε的单克隆抗体对非黑猩猩灵长类CD3ε如猕猴CD3ε的跨物种的特异性可例如由FACS分析确定。以以下方式进行FACS分析：测试相应的单克隆抗体对分别地表达所述人类和非黑猩猩灵长类CD3ε抗原的人类和非黑猩猩灵长类细胞如猕猴细胞的结合。合适的测定显示于以下实施例。
本文所用的CD3ε表示作为T细胞受体的一部分表达的分子，并具有现有技术中通常描述的含义。在人类中，其包括单独或独立组合形式的所有已知CD3亚基，例如CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3α和CD3β。本文所指的非黑猩猩灵长类的CD3抗原是，例如，食蟹猕猴Macaca fascicularis CD3和猕猴Macaca mulatta CD3。在食蟹猕猴Macaca fascicularis中，其包括CD3εFN-18阴性和CD3εFN-18阳性、CD3γ和CD3δ。在猕猴Macaca mulatta中，其包括CD3ε、CD3γ和CD3δ。优选地，本文所用的所述CD3是CD3ε。
人类CD3ε表示在GenBank登录号NM_000733中，并包括SEQ ID NO.1。人类CD3γ表示在GenBank登录号NM_000073中。人类CD3δ表示在GenBank登录号NM_000732中。
食蟹猕猴Macaca fascicularis的CD3ε“FN-18阴性”(即因为上述的多态性而不被单克隆抗体FN-18识别的CD3ε)表示在GenBank登录号AB073994中。
食蟹猕猴Macaca fascicularis的CD3ε“FN-18阳性”(即被单克隆抗体FN-18识别的CD3ε)表示在GenBank登录号AB073993中。食蟹猕猴Macaca fascicularis的CD3γ表示在GenBank登录号AB073992中。食蟹猕猴Macaca fascicularis的CD3δ表示在GenBank登录号AB073991中。
可由本领域中描述的重组技术鉴定和分离猕猴Macaca mulatta的各CD3ε、γ和δ同系物的核酸序列和氨基酸序列(Sambrook等人Molecular Cloning:A LaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)；Cold Spring Harbor Laboratory Press,第3版2001)。经适当修改，这可适用于本文定义的其它非黑猩猩灵长类的CD3ε、γ和δ同系物。在所附的实施例中描述了普通狨猴Callithrix jacchus、松鼠猴Saimiri sciureus和绒顶柽柳猴Saguinus oedipus的氨基酸序列的鉴定。普通狨猴Callithrix jacchus的CD3ε细胞外结构域的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:3中，绒顶柽柳猴Saguinus oedipus的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:5中，且松鼠猴Saimiri sciureus的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:7中。
与上述一致，术语“表位”定义抗原决定簇，其被以上定义的结合分子特异性地结合/鉴定。结合结构域或分子可特异性地与构象或连续表位结合/相互作用，这对靶结构如人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链是独特的。多肽抗原的构象或不连续表位表征为两个或更多个不连续的氨基酸残基的存在，其中所述氨基酸残基在一级序列中是分开的，但当多肽折叠成天然蛋白/抗原时在分子表面上聚集(Sela,(1969)Science166,1365和Laver,(1990)Cell61,553-6)。对表位有贡献的两个或更多个不连续的氨基酸残基存在于一个或多个多肽链的分开的部分上。当多肽链折叠为三维结构以构成表位时，这些残基在分子表面上聚集。相反，连续或线性表位由两个或更多个不连续的氨基酸残基组成，其中所述氨基酸残基存在于多肽链的单个线性区段中。本发明中，“背景依赖性”CD3表位是指所述表位的构象。仅当被埋入ε链的其余部分且由ε链与CD3γ或δ链异二聚化而保持在正确位置时，位于CD3ε链的这种背景依赖性表位可产生其正确构象。相反，本文提供的背景独立的CD3表位是指CD3ε的N末端1-27氨基酸残基多肽或其功能片段。当从CD3复合体中的天然环境取出时，这种N末端1-27氨基酸残基多肽或其功能片段保持其三维结构完整性和正确构象。因此，作为CD3ε细胞外结构域的一部分的N末端1-27氨基酸残基多肽或其功能片段的背景独立性，代表与WO2004/106380中关于制备人类结合分子的方法描述的CD3ε表位完全不同的表位。所述方法使用单独表达的重组CD3ε。这种单独表达的重组CD3ε的构象不同于其天然形式中采用的构象，即，其中TCR/CD3复合体的CD3ε亚基作为与TCR/CD3复合体的CD3δ或CD3γ亚基的非共价复合体的一部分存在的形式。当这种单独表达的重组CD3ε蛋白用作从抗体文库选择抗体的抗原时，从该文库鉴定对这种抗原具有特异性的抗体，尽管这种文库不包含对自体抗原/自身抗原具有特异性的抗体。这是因为以下事实：单独表达的重组CD3ε蛋白不存在于体内；其不是自身抗原。因此，表达特异性针对该蛋白的抗体的B细胞亚群在体内还未被耗尽；从这种B细胞构建的抗体文库将含有对单独表达的重组CD3ε蛋白具有特异性的抗体的遗传物质。
然而，由于背景独立的N末端1-27氨基酸残基多肽或其功能片段是以其天然形式折叠的表位，按照本发明的结合结构域不能由基于WO04/106380中描述的方法的方法鉴定。因此，在测试中可验证，WO2004/106380中公开的结合分子不能结合于CD3ε链的N末端1-27氨基酸残基。因此，常规抗CD3结合分子或抗CD3抗体分子(如，WO99/54440中公开的)结合CD3ε链的位置比本文提供的背景独立的N末端1-27氨基酸残基多肽或功能片段距C末端更近。现有技术抗体分子OKT3和UCHT-1在氨基酸残基35至85之间也具有对TCR/CD3复合体的ε亚基的特异性，且因此这些抗体的表位也是距C末端更近。此外，UCHT-1在氨基酸残基43至77之间的区结合于CD3ε链(Tunnacliffe,Int.Immunol.1(1989),546-50；Kjer-Nielsen,PNAS101,(2004),7675-7680；Salmeron,J.Immunol.147(1991),3047-52)。因此，现有技术的抗CD3分子不结合于且不直接针对本文定义的背景独立的N末端1-27氨基酸残基表位(或其功能片段)。
为了产生包括在本发明多肽例如本文定义的双特异性单链抗体中的优选地为人类的结合结构域，可使用例如结合于人类CD3ε和非黑猩猩灵长类CD3ε(如，猕猴CD3ε)二者的单克隆抗体。
在本发明多肽的优选实施方案中，所述非黑猩猩灵长类是旧世界猴。在所述多肽的更优选实施方案中，所述旧世界猴是狒狒属（Papio genus）猕猴属（Macaque genus）的猴。最优选地，所述猕猴属的猴是阿萨姆（Assamese）猕猴（Macaca assamensis）、地中海猴(Macaca sylvanus)、冠毛猕猴(Macaca radiata)、穿靴猕猴或苏拉威西（Sulawesi）穿靴猕猴(Macaca ochreata)、苏拉威西有冠（crested）猕猴(Macaca nigra)、台湾岩石猕猴(Macaca cyclopsis)、日本雪猕猴或日本猕猴(Macaca fuscata)、食蟹猴或食蟹猕猴或长尾猕猴或爪哇猕猴(食蟹猕猴Macaca fascicularis)、狮尾猕猴(Macaca silenus)、豚尾猕猴(Macaca nemestrina)、恒河猕猴(猕猴Macaca mulatta)、西藏猕猴(Macacathibetana)、Tonkean猕猴(Macaca tonkeana)、Toque猕猴(Macaca sinica)、短尾猕猴或红脸猕猴或熊猴(Macaca arctoides)、或沼泽猕猴(Macaca maurus)。最优选地，所述狒狒属的猴是阿拉伯狒狒、Papio hamadryas；几内亚狒狒、Papio papio；橄榄狒狒、Papioanubis；黄狒狒、Papio cynocephalus；大狒狒、Papio ursinus。
在本发明多肽的可选优选实施方案中，所述非黑猩猩灵长类是新世界猴。在多肽的更优选实施方案中，所述新世界猴是Callithrix属(狨猴)、Saguinus属或Samiri属的猴。最优选地，所述Callithrix属的猴是普通狨猴Callithrix jacchus，所述Saguinus属的猴是绒顶柽柳猴Saguinus oedipus且所述Samiri属的猴是松鼠猴Saimiri sciureus。
如本文上述的，本发明多肽以第一结合结构域结合人类和非黑猩猩灵长类CD3ε(ε)链的表位，其中所述表位是包含在由如SEQ ID NO.2、4、6或8所示的27个氨基酸残基组成的组中的氨基酸序列的一部分或其功能片段。
与本发明一致，对本发明多肽优选地是，所述表位是包含26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸的氨基酸序列的一部分。
更优选地，其中所述表位至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(Q-D-G-N-E-D)。
在本发明中，N末端1-27氨基酸残基的功能片段是指所述功能片段仍是背景独立的表位，当从其CD3复合体中的天然环境取出(并融合于异源氨基酸序列诸如EpCAM或免疫球蛋白Fc部分，如实施例3.1显示的)时，保持其三维结构完整性。在CD3ε的27个氨基酸N末端多肽或其功能片段中的三维结构的维持可用于产生结合结构域，所述结合结构域在体外结合于N末端CD3ε多肽片段并且以相同的结合亲和力在体内结合于T细胞上的天然CD3复合体(的CD3ε亚基)。在本发明中，N末端1-27氨基酸残基的功能片段是指本文提供的CD3结合分子仍可以背景独立的方式结合于这种功能片段。本领域技术人员懂得用于确定表位的哪个氨基酸残基被这种抗CD3结合分子识别的表位定位方法(如，丙氨酸扫描)。
在本发明优选实施方案中，本发明多肽包含能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位的(第一)结合结构域和能够结合于细胞表面抗原的第二结合结构域。
本文所用的术语“细胞表面抗原”表示展示在细胞表面的分子。在大多数情形中，该分子将位于细胞的质膜中或质膜之上以使该分子的至少一部分在三级形式上保持从细胞外的可接近性。位于质膜中的细胞表面分子的非限制性实例是跨膜蛋白，其在它的三级构象中包含亲水性和疏水性的区。在此处，至少一个疏水区允许细胞表面分子嵌入或插入细胞的疏水质膜，而亲水区在质膜的任一侧分别地延伸入胞质和细胞外间隙。位于质膜上的细胞表面分子的非限制性实例是已在半胱氨酸残基处修饰以具有棕榈酰基的蛋白、已在C末端半胱氨酸残基处修饰以具有法呢基的蛋白或已在C末端修饰以具有糖基磷脂酰肌醇(“GPI”)锚的蛋白。这些基团允许蛋白共价连接到质膜的外表面，在那里其保持可接近性以被细胞外分子诸如抗体识别。细胞表面抗原的实例包括EGFR、EGFRvIII、MCSP、碳酸酐酶IX(CAIX)、CD30、CD33、Her2/neu、IgE、CD44v6和Muc-1。此外，相应的细胞表面抗体的实例包括对特定疾病或疾患，即癌症、自身免疫疾病或包括病毒感染的感染性疾病的特征性的抗原。因此，术语“细胞表面抗原”明确地包括病毒蛋白质例如暴露于感染的细胞表面的天然的、未加工的病毒蛋白(被描述尤其是乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和HIV-1的包膜蛋白)。
细胞毒性T细胞的一种防御功能是感染病毒的细胞的破坏，因此，本发明的双特异性结合分子激活和重定向细胞毒性T细胞而不考虑它们本身特异性的独特性质对于慢性病毒感染的广阔领域具有很大影响。对于这些感染中的大多数而言，消除持续感染的细胞是治愈的唯一机会。针对慢性CMV和EBV感染，目前开发了继承性T细胞疗法(Rooney,C.M.,等人,Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr-virus-related lymphoproliferation(使用基因修饰的病毒特异性T淋巴细胞控制Epstein-Barr病毒相关的淋巴组织增生).Lancet,1995.345(8941):p.9-13；Walter,E.A.等人,Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus inrecipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from thedonor(通过转移来自供者的T细胞克隆在受者同种异体骨髓中针对巨细胞病毒重构细胞免疫性).N Engl J Med,1995.333(16):p.1038-44)。
慢性乙型肝炎感染显然是最受关注和最有回报的适应症之一。全世界有3.5亿至4亿人感染HBV。慢性HBV肝炎的当前治疗仍是干扰素γ和核苷或核苷酸类似物，是具有显著副作用诸如引起肝炎发作、发热、肌痛、血小板减少和抑郁的长期治疗。尽管现在有多于4种批准的治疗方案，但很少能实现消除病毒。慢性乙型肝炎中持续的炎症在多于25%的患者中导致肝硬化和肝细胞癌。而且，高达40%的慢性乙型肝炎患者将死于严重并发症，造成每年全世界60万至100万的死亡。
HBV，即嗜肝DNA病毒的原型，是包膜病毒，其松弛的环状(rc)基因组被逆转录成RNA前基因组。感染后，所述rc DNA进入肝细胞核，在那里其被完成为包含四个重叠读码框的共价闭环DNA(cccDNA)。其作为前基因组RNA和三个亚基因组RNA的转录模板。所述RNA前基因组作为mRNA起作用以翻译病毒核芯和聚合酶蛋白。感染的细胞连续地从cccDNA产生HBV表面蛋白(HBsAg)，甚至当HBV复制终止时。HBsAg由小(S)表面蛋白和大(L)表面蛋白组成，其中小表面蛋白有非常少的中部部分。HBV S和L两者均靶向内质网(ER)膜，从那里其在膜囊中由反面高尔基器向质膜运输(Gorelick,F.S.和C.Shugrue,Exiting theendoplasmic reticulum(退出内质网).Mol Cell Endocrinol,2001.177(1-2):p.13-8)。S和L蛋白在复制HBV的肝细胞表面上持久地表达，如最近显示的(Chu,C.M.和Y.F.Liaw,Membrane staining for hepatitis B surface antigen on hepatocytes:a sensitiveand specific marker of active viral replication in hepatitis B(肝细胞上乙型肝炎表面抗原的膜染色：乙型肝炎中活性病毒复制的敏感和特异性标记).J Clin Pathol,1995.48(5):p.470-3)。
将包膜蛋白暴露于细胞表面的原型病毒是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和HIV-1，它们都代表全球巨大的疾病负担。对于HIV-1病毒适应症，最近已显示，以具有Fv抗体构建体的嵌合TCR修饰的T细胞可杀死HIV-1感染的靶细胞，其中所述Fv抗体构建体指向gp120包膜蛋白(Masiero,S.,等人,T-cell engineering by a chimeric T-cellreceptor with antibody-type specificity for the HIV-1gp120(使用具有对HIV-1gp120的抗体类型特异性的嵌合T细胞受体的T细胞工程化),Gene Ther,2005.12(4):p.299-310)。在肝炎DNA病毒中，乙型肝炎病毒(HBV)表达包膜蛋白复合体HBsAg，所述HBsAg从附加型（episomal）cccDNA连续地产生，甚至当HBV复制下降时也一样。
作为完整的S和L HBV蛋白在细胞表面上的表达使得它们可以被抗体接近，这是当患者从感染的急性阶段恢复并从循环的HBsAg改变为抗HB时血清转化的标志。如果未发生血清转化，在长期的高活性抗病毒治疗后，多达30%的肝细胞也继续表达HBV S蛋白。因此，除了特异性识别细胞内加工的HBV肽并被MHC分子呈递在细胞表面的T淋巴细胞之外，其它形式的T细胞接合是可行的，目标为完整表面蛋白诸如从细胞膜外可接近的S和L抗原。使用识别乙型肝炎病毒小(S)和大(L)包膜蛋白的单链抗体片段，已经产生人工T细胞受体，其允许将移植的T细胞导向感染的肝细胞，并且在与抗原接触后允许这些T细胞被激活以分泌细胞因子并杀死感染的肝细胞。
这种方法的限制是，(i)T细胞需要细胞外操纵，(ii)用于转移T细胞受体的逆转录病毒可能导致T细胞中的插入性诱变，和(iii)一旦T细胞被转移，细胞毒性响应不能被限制。
为了克服这些限制，可产生双特异性单链抗体分子，其包含对人类和非黑猩猩灵长类CD3ε抗原具有结合特异性的第一结构域(如本发明上下文提供的)以及对感染的肝细胞的HBV或HCV包膜蛋白具有结合特异性的第二结构域，并且这些在本发明范围内。
在本发明中，还优选的是，第二结合结构域结合于人类细胞表面抗原和/或非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原。
为了产生本发明的多肽例如本文定义的双特异性单链抗体的第二结合结构域，可使用结合于相应的人类和/或非黑猩猩灵长类细胞表面抗原的单克隆抗体。例如，本文定义的双特异性多肽的适当的结合结构域可由本领域中描述的重组方法衍生自跨物种特异性单克隆抗体。结合于人类细胞表面抗原和非黑猩猩灵长类中所述细胞表面抗原的同系物的单克隆抗体可由FACS测定按上文所述进行测试。对本领域技术人员明显的是，跨物种特异性抗体还可由文献中描述的杂交瘤技术产生(Milstein和Nature256(1975),495-7)。例如，小鼠可选地以人类和非黑猩猩灵长类CD33免疫。经杂交瘤技术从这些小鼠分离产生跨物种特异性抗体的杂交瘤细胞并由FACS按上述进行分析。双特异性多肽例如本文所述的表现跨物种特异性的双特异性单链抗体的产生和分析显示在以下实施例中。表现跨物种特异性的双特异性单链抗体的优点包括下列各点。
对本发明多肽尤其优选的是，能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位的第一结合结构域包括VL区，其中所述VL区包括选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
(a)SEQ ID NO.27所示的CDR-L1、SEQ ID NO.28所示的CDR-L2和SEQ ID NO.29所示的CDR-L3；
(b)SEQ ID NO.117所示的CDR-L1、SEQ ID NO.118所示的CDR-L2和SEQ ID NO.119所示的CDR-L3；和
(c)SEQ ID NO.153所示的CDR-L1、SEQ ID NO.154所示的CDR-L2和SEQ ID NO.155所示的CDR-L3。
可变区，即可变轻链(“L”或“VL”)和可变重链(“H”或“VH”)在本领域中理解为提供抗体的结合结构域。该可变区包含互补决定区。
术语“互补决定区”(CDR)在本领域公知决定抗体的抗原特异性。术语“CDR-L”或“LCDR”是指VL中的CDR，而术语“CDR-H”或“H CDR”是指VH中的CDR。
在本发明多肽的可选地优选实施方案中，能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位的第一结合结构域包括VH区，其中所述VH区包括选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：
(a)SEQ ID NO.12所示的CDR-H1、SEQ ID NO.13所示的CDR-H2和SEQ ID NO.14所示的CDR-H3；
(b)SEQ ID NO.30所示的CDR-H1、SEQ ID NO.31所示的CDR-H2和SEQ ID NO.32所示的CDR-H3；
(c)SEQ ID NO.48所示的CDR-H1、SEQ ID NO.49所示的CDR-H2和SEQ ID NO.50所示的CDR-H3；
(d)SEQ ID NO.66所示的CDR-H1、SEQ ID NO.67所示的CDR-H2和SEQ ID NO.68所示的CDR-H3；
(e)SEQ ID NO.84所示的CDR-H1、SEQ ID NO.85所示的CDR-H2和SEQ ID NO.86所示的CDR-H3；
(f)SEQ ID NO.102所示的CDR-H1、SEQ ID NO.103所示的CDR-H2和SEQ ID NO.104所示的CDR-H3；
(g)SEQ ID NO.120所示的CDR-H1、SEQ ID NO.121所示的CDR-H2和SEQ ID NO.122所示的CDR-H3；
(h)SEQ ID NO.138所示的CDR-H1、SEQ ID NO.139所示的CDR-H2和SEQ ID NO.140所示的CDR-H3；
(i)SEQ ID NO.156所示的CDR-H1、SEQ ID NO.157所示的CDR-H2和SEQ ID NO.158所示的CDR-H3；和
(j)SEQ ID NO.174所示的CDR-H1、SEQ ID NO.175所示的CDR-H2和SEQ ID NO.176所示的CDR-H3。
还优选地，能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位的结合结构域包括VL区，其中所述VL区选自由SEQ ID NO.35、39、125、129、161或165所示的VL区组成的组。
可选地优选地，能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位的第一结合结构域包括VH区，其中所述VH区选自由SEQ ID NO.15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181所示的VH区组成的组。
更优选地，本发明多肽特征为能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位的第一结合结构域，其包括选自由以下组成的组的VL区和VH区：
(a)SEQ ID NO.17或21所示的VL区和SEQ ID NO.15或19所示的VH区；
(b)SEQ ID NO.35或39所示的VL区和SEQ ID NO.33或37所示的VH区；
(c)SEQ ID NO.53或57所示的VL区和SEQ ID NO.51或55所示的VH区；
(d)SEQ ID NO.71或75所示的VL区和SEQ ID NO.69或73所示的VH区；
(e)SEQ ID NO.89或93所示的VL区和SEQ ID NO.87或91所示的VH区；
(f)SEQ ID NO.107或111所示的VL区和SEQ ID NO.105或109所示的VH区；
(g)SEQ ID NO.125或129所示的VL区和SEQ ID NO.123或127所示的VH区；
(h)SEQ ID NO.143或147所示的VL区和SEQ ID NO.141或145所示的VH区；
(i)SEQ ID NO.161或165所示的VL区和SEQ ID NO.159或163所示的VH区；和
(j)SEQ ID NO.179或183所示的VL区和SEQ ID NO.177或181所示的VH区。
根据本发明多肽的优选实施方案，成对的VH-区和VL-区是以单链抗体(scFv)的形式存在。所述VH和VL区以VH-VL或VL-VH的顺序排列。优选地，所述VH区N末端定位于连接体序列。所述VL区C末端定位于连接体序列。
本发明上述多肽的优选实施方案特征为，能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位的第一结合结构域，其包括选自由SEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187组成的组的氨基酸序列。
本发明进一步涉及上述的多肽，其中所述第二结合结构域结合于细胞表面抗原，其优选地是肿瘤抗原。
本文所用的术语“肿瘤抗原”可理解为呈现在肿瘤细胞上的那些抗原。这些抗原可被呈现在细胞表面上，具有通常与分子的跨膜和胞质部分结合在一起的细胞外部分。这些抗原有时可仅被肿瘤细胞呈现而不被正常细胞呈现。肿瘤抗原可专门地在肿瘤细胞上表达或与正常细胞相比可代表肿瘤特异性突变。这种情况下，它们被称为肿瘤特异性抗原。更常见的是被肿瘤细胞和正常细胞呈现的抗原，它们被称为肿瘤相关性抗原。与正常细胞相比这些肿瘤相关性抗原可过表达，或因为肿瘤组织与正常组织相比具有较不紧凑的结构而容易用于肿瘤细胞中的抗体结合。本文所用的肿瘤抗原的非限制性实例是EGFR(Liu,Br.J.Cancer82/12(2000),1991-1999；Bonner,Semin.Radiat.Oncol.12(2002),11-20；Kiyota,Oncology63/1(2002),92-98；Kuan,Brain Tumor Pathol.17/2(2000),71-78)、EGFRvIII(Kuan,Brain Tumor Pathol.17/2(2000),71-78)、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)(Uemura,Br.J.Cancer81/4(1999),741-746；Longcaster,Cancer Res.61/17(2001),6394-6399；Chia,J.Clin.Oncol.19/16(2001),3660-3668；Beasley,Cancer Res.61/13(2001),5262-5267)、CD33(Abutalib,Curr Pharm Biotechnol.7(2006),343-69)、MCSP(Campoli,Crit Rev Immunol.24(2004),267-96)或IgE(Infuhr,Allergy60(2005),977-85)。
优选地肿瘤抗原选自EGFR、EGFRvIII、MCSP、EpCAM、碳酸酐酶IX(CAIX)、CD30、CD33、Her2/neu、CD44v6和Muc-1。
EGFR(也称为c-erb1或HER1)属于erbB受体酪氨酸激酶家族。当通过结合来自生长因子EGF家族的配体而被活化时，EGFR分别地与第二个EGFR或erbB受体家族的另一成员同二聚化或异二聚化，经由促分裂原活化的蛋白激酶和其它转录因子而启动信号传导级联，导致增殖、分化和修复(Olayioye,EMBO J.19(2000),3159-67)。EGFR在许多上皮癌中过表达，包括结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌和头颈癌(Mendelsohn,J.Clin.Oncol.21(2003),2787-99；Mendelsohn,J.Clin.Oncol.20(18,增刊)(2002),1S-13S；Prewett,Clin.Cancer Res.8(2002),994-1003)。在恶性肿瘤细胞中EGFR的过表达和/或突变导致激酶活性的组成型活化，造成增殖、血管生成、侵入、转移、和细胞凋亡的抑制(Mendelsohn(2003),上述引文；Ciardiello,Clin.Cancer Res.7(2001),2958-70；Perez-Soler,Oncologist9(2004),58-67)。靶向EGFR的细胞外配体结合结构域或细胞内酪氨酸激酶信号传导级联的单克隆抗体已经显示作为抗肿瘤靶的效力(Laskin,Cancer Treat.Review30(2004),1-17)。例如，竞争性地抑制EGFR的细胞外结构域以抑制受体的配体激活的西妥昔单抗(Erbitux)，即EGFR的一种人源化单克隆抗体，在2004年被食品和药品管理局(FDA)批准与拓扑异构酶抑制剂伊立替康（irinotecan）联合使用以治疗转移性结肠癌。
黑素瘤相关性细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖(proteoglycane)(MCSP)，也称为高分子量黑素瘤相关性抗原(HMW-MAA)或黑素瘤相关性蛋白聚糖，是细胞表面的多于450kDa的大的蛋白聚糖，包含250kDa的糖蛋白核芯和与其相连的糖胺聚糖链(Pluschke,PNAS93(1996),9710；Nishiyama,J.Cell Biol.114(1991),359)。MCSP的准确功能还未知。其可作为介导与细胞外基质(ECM)的细胞相互作用的粘附受体并很可能牵涉在血管生成、组织侵入和细胞扩展中(Burg,Cancer Res.59(1999),2869；Iida,J.Biol.Chem.276(2001),18786；Eisenmann,Nat.Cell Biol.1(1999),507；Iida,Cancer Res.55(1995),2177；Campoli(2004),上述引文)。MCSP可增强a4b1整联蛋白对配体的结合，且MCSP活化可由cdc42-和p130cas-依赖性机制增强整联蛋白介导的细胞扩展。MCSP经由硫酸软骨素与MT3-MMP缔合，这可降解各种ECM-蛋白。其可特异性地定位MT3-MMP于细胞ECM-粘附位点。因此，看起来两种分子都是I型胶原的侵入和I型明胶的降解所需的(Iida(2001),上述引文)。MSCP是黑素瘤的主要标志物，在那里其在肿瘤细胞表面上高度表达。其被至少90%的黑素瘤损伤表达(Natali,J.Natl.Cancer Inst.72(1984),13)。在所有黑素瘤相关性抗原中，MCSP展示最低程度的不均一性(Natali,Cancer Res.45(1985),2883)。不同于通常为MCSP阳性的表面扩展的黑素瘤(频率：60%)、有结节的黑素瘤(频率：20%)和恶性雀斑样黑素瘤(频率：10%)的原发肿瘤(Reza Ziai1987Cancer Res.47:2474)，肢端雀斑样黑素瘤的原发肿瘤(频率：5%)常常是MCSP阴性的(Kageshita,Cancer Res.51(1991),1726)。目前，美国每年有53.600例新诊断出的黑素瘤病例(2002)。总的来说黑素瘤发生率在增加。
在本发明的优选实施方案中，所述多肽是双特异性单链抗体分子。
如果候选药物是双特异性抗体，例如双特异性单链抗体，那么本文上述的关于用于临床前研究的替代物分子开发的问题进一步加剧。这种双特异性抗体要求被识别的两种抗原对给定动物物种都是跨物种特异性的，以允许在这种动物中进行安全性测试。
如上文所述的，本发明提供多肽，其包括能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位的第一结合结构域和能够结合于细胞表面抗原的第二结合结构域，其中所述第二结合结构域优选地还结合于人类和非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原。双特异性单链抗体分子作为满足本发明的优选多肽的需求的候选药物的优点是这种分子在临床前动物测试中以及在临床研究中和甚至在人类治疗中的用途。在本发明跨物种特异性的双特异性单链抗体的优选实施方案中，结合于细胞表面抗原的第二结合结构域是人类来源的。在根据本发明的跨物种特异性的双特异性分子中，结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链表位的结合结构域以VH-VL或VL-VH的顺序位于双特异性分子的N末端或C末端。以第一和第二结合结构域中VH和VL链的不同排列形式存在的根据本发明的跨物种特异性的双特异性分子的实例描述于所附的实施例。
本文所用的“双特异性单链抗体”指的是包括两个结合结构域的单多肽链。每个结合结构域包括来自抗体重链的一个可变区(“VH区”)，其中所述第一结合结构域的VH区特异性地结合于CD3ε分子，而所述第二结合结构域的VH区特异性地结合于细胞表面抗原，如以下更详细地描述的。所述两个结合结构域任选地由短多肽间隔区彼此连接。多肽间隔区的非限制性实例是Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G-G-G-G-S)和其重复序列。每个结合结构域可另外包括来自抗体轻链的一个可变区(“VL区”)，在第一和第二结合结构域各自中的VH区和VL区由多肽连接体彼此连接，例如EP623679B1中公开和要求保护的类型的多肽连接体，但在任何情况下足够长以允许第一结合结构域的VH区和VL区与第二结合结构域的VH区和VL区彼此配对，以使它们一起能够特异性地结合于对应的第一和第二分子。
根据本发明优选实施方案，以上表征的双特异性单链抗体分子在第二结合结构域中包含一组如下的序列作为CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3，所述序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:189-194、SEQ ID NO:201-206、SEQ ID NO:219-224、SEQ IDNO:237-242、SEQ ID NO:255-260、SEQ ID NO:273-279、SEQ ID NO:382-384和387-389、SEQID NO:400-402和405-407、SEQ ID NO:418-420和423-425、SEQ ID NO:436-438和441-443、SEQ ID NO:454-456和459-461、SEQ ID NO:472-474和477-479、SEQ ID NO:490-492和495-497、SEQ ID NO:508-510和513-515、
SEQ ID NO:530-532和1568-1570、SEQ ID NO:545-547和550-552、SEQ ID NO:559-561和564-566、
SEQ ID NO:577-579和582-584、
SEQ ID NO:615-617和620-622、SEQ ID NO:633-635、638、639和1571、SEQ ID NO:650-652和655-657、SEQ ID NO:668-670和673-675、SEQ ID NO:682-684和687-689、SEQ IDNO:696-698和701-703、SEQ ID NO:710-712和715-717、SEQ ID NO:724-726和729-731、SEQID NO:738-740和743-745、SEQ ID NO:752-754和757-759、SEQ ID NO:766-768和771-773、SEQ ID NO:780-782和785-787、SEQ ID NO:794-796和799-801、SEQ ID NO:808-810和813-815、SEQ ID NO:822-824和827-829、SEQ ID NO:836-838和841-843、SEQ ID NO:850-852和855-857、
SEQ ID NO:866-868和871-873、SEQ ID NO:884-886和889-891、SEQ ID NO:902-904和907-909、SEQ ID NO:920-922和925-927、SEQ ID NO:938-940和943-945、SEQ ID NO:956-958和961-963、SEQ ID NO:974-976和979-981、SEQ ID NO:992-994和997-999、SEQ IDNO:1006-1008和1011-1013、SEQ ID NO:1020-1022和1025-1027、SEQ ID NO:1034-1036和1039-1041、SEQ ID NO:1048-1050和1053-1055、SEQ ID NO:1062-1064和1067-1069、SEQID NO:1076-1078和1081-1083、SEQ ID NO:1090-1092和1095-1097、
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本发明的特别优选实施方案与以上表征的多肽有关，其中所述双特异性单链抗体分子包括选自以下的序列：
(a)SEQ ID NO.291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345或347、393、395、397、411、413、415、429、431、433、447、449、451、465、467、469、483、485、487、501、503、505、519、521、523、1336、1338、1340、538、540、542、556、570、572、574、588、590、592、626、628、630、643、645、647、661、663、665、679、693、707、721、735、749、763、777、791、805、819、833、847、861、863、877、879、881、895、897、899、913、915、917、931、933、935、949、951、953、967、969、971、985、987、989、1003、1017、1031、1045、1059、1073、1087、1101、1125、1138、1152、1166、1180、1194、1208、1222、1236、1250、1264、1278、1292、1306、1320、1334、1354、1356、1358、1372、1386、1400、1414、1428、1442、1456、1470、1484、1500、1502、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1586、1588、1602、1616、1630、1647、1649或1663任一所示的氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO.292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346或348、394、396、398、412、414、416、430、432、434、448、450、452、466、468、470、484、486、488、502、504、506、520、522、524、1337、1339、1341、539、541、543、557、571、573、575、589、591、593、627、629、631、644、646、648、662、664、666、680、694、708、722、736、750、764、778、792、806、820、834、848、862、864、878、880、882、896、898、900、914、916、918、932、934、936、950、952、954、968、970、972、986、988、990、1004、1018、1032、1046、1060、1074、1088、1102、1126、1139、1153、1167、1181、1195、1209、1223、1237、1251、1265、1279、1293、1307、1321、1335、1355、1357、1359、1373、1387、1401、1415、1429、1443、1457、1471、1485、1501、1503、1519、1521、1523、1525、1527、1529、1545、1547、1549、1551、1553、1555、1557、1559、1561、1563、1565、1567、1587、1589、1603、1617、1631、1648、1650或1664任一所示的核酸序列编码的氨基酸序列。
在本发明优选实施方案中，双特异性单链抗体对于CD3ε和对于其第二结合结构域识别的细胞表面抗原是跨物种特异性的。在更优选的实施方案中，这些双特异性单链抗体对于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε和对于人类和非黑猩猩灵长类MCSP、EGFR、EGFRvIII、碳酸酐酶IX、CD30、CD33、IgE、CD44v6、Muc-1、HBV和HCV是跨物种特异性的。在可选的实施方案中，本发明提供了一种编码本发明上述多肽的核酸序列。
本发明还涉及一种载体，其包括本发明的核酸分子。
许多合适的载体为分子生物学领域的技术人员所公知，其选择应基于功能目的，并包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和遗传工程中常规使用的其他载体。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建多种质粒和载体，参阅例如Sambrook等（上述引文中）和Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方案),Green PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1989),(1994)中描述的技术。可选地，本发明多核苷酸和载体可重建入脂质体用于递送至靶细胞中。如下文更详细讨论的，使用克隆载体来分离单独的DNA序列。相关的序列可转移进入表达载体，在该表达载体中需要特定多肽的表达。一般的克隆载体包括pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322和pGBT9。一般的表达载体包括pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT。
优选地，所述载体包括核酸序列，所述核酸序列是和编码本文定义的单链抗体构建体的核酸序列可操作地连接的调节序列。
术语“调节序列”是指DNA序列，其对于实现与它们连接的编码序列的表达是必须的。这类控制序列的性质根据宿主生物体而不同。在原核生物中，控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子。在真核生物中，控制序列通常包括启动子、终止子和在一些情况下的增强子、反式激活蛋白或转录因子。术语“控制序列”旨在包括至少其存在对于表达是必要的所有组件（component），并还可包括另外的有利组件。
术语“可操作地连接”是指其中如此表述的组件的相互关系允许它们按照其预期方式起作用的并列。与编码序列“可操作地连接”的控制序列以下述方式连接：编码序列的表达在与控制序列相适合的条件下完成。在控制序列为启动子的情况下，优选使用双链核酸对于技术人员是清楚的。
因此，所述载体优选地是表达载体。“表达载体”是可用于转化选定的宿主并提供编码序列在选定宿主中表达的构建体。表达载体可以是例如克隆载体、二元载体或整合型载体。表达包括核酸分子优选地转录为可翻译的mRNA。本领域技术人员熟知保证原核和/或真核细胞中表达的调节元件。在真核细胞的情况下，它们通常包括保证转录起始的启动子和可选的保证转录结束和转录物稳定的多聚腺苷酸信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能调节元件包括例如大肠杆菌中的PL、lac、trP或tac启动子，而允许在真核宿主细胞中表达的调节元件实例为酵母中的AOX1或GALl启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV、SV40、RSV启动子（劳氏肉瘤病毒）、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。
除负责转录起始的元件外，这类调节元件还可包括位于多核苷酸下游的转录终止信号，例如SV40多聚腺苷酸位点或tk多聚腺苷酸位点。另外，根据使用的表达系统，可以向所述核酸序列的编码序列添加前导序列，所述前导序列能够将多肽定向至细胞区室或将其分泌进入培养基，这些是本领域所熟知的，还参阅附带的实施例。前导序列在适当的阶段与翻译起始和终止序列装配，并优选为能够指导翻译的蛋白质或其一部分分泌进入周质间隙或细胞外培养基的前导序列。任选地，异源序列可编码包括赋予期望特性的N末端鉴定肽的融合蛋白，其中所述特性例如被表达的重组产物的稳定或简化的纯化，见上文。在本文中，合适的表达载体为本领域已知，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDMS、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene）、pEF-DHFR、pEF-ADA或pEF-neo(Mack等人PNAS(1995)92,7021-7025和Raum等人，Cancer Immunol Immunother(2001)50(3),141-150）或pSPORT1(GIBCO BRL）。
优选地，所述表达控制序列为能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但也可以使用原核宿主的控制序列。载体整合进适当的宿主中后，所述宿主就被保持在适合核苷酸序列高水平表达的条件下，并根据需要随后收集并纯化本发明的多肽，参阅例如附带的实施例。
可用来表达细胞周期相互作用蛋白质的另一表达系统为昆虫系统。在一个这类系统中，使用苜蓿银纹夜蛾Autographa calirornica核型多角体病毒（AcNPV）作为在秋夜蛾Spodoptera frugiperda细胞中或粉纹夜蛾TrichoPlusia幼虫中表达外源基因的载体。可将所述核酸分子的编码序列克隆进该病毒的非必需区（例如多角体蛋白基因）并置于多角体蛋白启动子控制之下。所述编码序列的成功插入将使得多角体蛋白基因失活并产生缺少外壳蛋白外壳的重组病毒。然后使用重组病毒来感染其中表达本发明蛋白的秋夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫（Smith,J.Virol.46(1983),584;Engelhard,Proc.Nat.Acad.Sci.USA91(1994),3224-3227）。
其他调节元件可包括转录和翻译增强子。有利地，本发明上述载体包括可选择的（selectable）和/或可取得的（scorable）标志物。
用于选择转化的细胞和例如植物组织和植物的可选择的标志物基因对本领域技术人员是熟知的，并包括例如以抗代谢物抗性作为选择基础的赋予甲氨蝶吟抗性的dhrr(Reiss,Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13(1994),143-149)；赋予氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素抗性的npt(Herrera-Estrella,EMBO J.2(1983),987-995)和赋予潮霉素抗性的hygro(Marsh,Gene32(1984),481-485）。已描述了其他的可选择的基因，即允许细胞使用吲哚代替色氨酸的trpB，允许细胞使用组氨醇（histinol）代替组氨酸的hisD（Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(1988),8047），允许细胞使用甘露糖的甘露糖-6-磷酸异构酶（WO94/20627）和赋予鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-（二氟甲基）-DL-鸟氨酸DFMO抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶）(McConlogue,1987,在Current Communications in MolecularBiology(现代分子生物学通讯),Cold Spring Harbor Laboratory编辑）或来自土曲霉（Aspergillus terreus）的赋予杀稻瘟素（Blasticidin S）抗性的脱氨基酶(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59(1995),2336-2338)。
有用的可取得的标志物也为本领域技术人员所知，并可商业获得。有利的是，所述标志物为编码荧光素酶（Giacomin,PI.Sci.116(1996),59-72;Scikantha,J.Bact.178(1996),121）、绿色荧光蛋白(Gerdes,FEBS Lett.389(1996),44-47）或β-葡糖醛酸酶（Jefferson,EMBO J.6(1987),3901-3907）的基因。该实施方案特别适用于简单快速筛选含有所述载体的细胞、组织和生物体。
如上所述，为了例如纯化以及基因治疗的目的，可单独或作为载体的一部分使用所述核酸分子，以在细胞中表达本发明多肽。将含有编码本发明上述任一多肽的DNA序列的核酸分子或载体引入细胞，所述细胞随后产生感兴趣的多肽。以通过离体或体内技术向细胞引入治疗基因为基础的基因疗法是基因转移最重要的应用之一。用于体外或体内基因疗法的合适的载体、方法或基因递送系统描述于文献中并为本领域技术人员所知；参阅例如Giordano,Nature Medicine2(1996),534-539；Schaper,Circ.Res.79(1996),911-919；Anderson,Science256(1992),808-813；Verma,Nature389(1994),239；Isner,Lancet348(1996),370-374；Muhlhauser,Circ.Res.77(1995),1077-1086；Onodera,Blood91(1998),30-36；Verma,Gene Ther.5(1998),692-699；Nabel,Ann.N.Y.Acad.Sci.811(1997),289-292；Verzeletti,Hum.Gene Ther.9(1998),2243-51；Wang,Nature Medicine2(1996),714-716；WO94/29469；WO97/00957、US5,580,859；US5,589,466；或Schaper,Current Opinionin Biotechnology(生物技术最新观点)7(1996),635-640。所述核酸分子和载体可设计为用于直接引入细胞或通过脂质体或病毒载体（例如腺病毒、逆转录病毒）引入细胞。优选所述细胞为种系细胞、胚细胞或卵细胞或由此衍生的细胞，最优选所述细胞为干细胞。胚胎干细胞的实例可以为特别是如Nagy,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993),8424-8428中所述的干细胞。
本发明还提供用本发明载体转化或转染的宿主。可通过向宿主中引入本发明上述载体或本发明上述核酸分子而产生所述宿主。至少一种载体或至少一种核酸分子在所述宿主中的存在可介导编码上述单链抗体构建体的基因的表达。
上述被引入宿主的本发明核酸分子或载体可以整合进宿主基因组或其可以保持在染色体之外。
宿主可以是任何原核或真核细胞。
术语“原核生物”旨在包括所有可以用DNA或RNA分子转化或转染以表达本发明蛋白的细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌、伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）、粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcescens）和枯草杆菌（Bacillussubtilis）。术语“真核的”旨在包括酵母、高等植物、昆虫和优选哺乳动物细胞。取决于重组产生方法中使用的宿主，本发明多核苷酸编码的蛋白可以是糖基化的或可以是非糖基化的。特别优选使用含有本发明多肽的编码序列的质粒或病毒，并用遗传学手段向其中融合了N末端FLAG标签和/或C末端His标签。优选所述FLAG标签长度为约4到8个氨基酸，最优选8个氨基酸。可使用本领域普通技术人员公知的任何技术将上述多核苷酸用于转化或转染宿主。此外，用于制备融合的、可操作地连接的基因并在例如哺乳动物细胞和细菌中表达它们的方法为本领域所公知(Sambrook，上述引文）。
优选所述宿主为细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
特别设想，所述宿主可以是哺乳动物细胞。特别优选的宿主细胞包括CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞系如SP2/0或NS/0。如附带的实施例中所演示的，特别优选的是CHO细胞作为宿主。
更优选所述宿主为人细胞或人细胞系，例如per.c6(Kroos,Biotechnol.Prog.,2003,19:163-168)。
在进一步的实施方案中，本发明因此涉及用于产生本发明多肽的方法，所述方法包括在允许表达本发明多肽的条件下培养本发明宿主并从培养物中回收产生的多肽。
转化的宿主可以在发酵罐中生长并根据本领域已知技术培养以达到最佳细胞生长。然后可从生长培养基、细胞裂解产物或细胞膜成分中分离本发明多肽。可通过任何常规方法例如制备型色谱分离和免疫分离来离析和纯化例如微生物所表达的本发明多肽，其中所述免疫分离例如涉及抗如本发明多肽标签的单克隆或多克隆抗体的使用或如附带的实施例中所述的。
本领域已知用于宿主培养的允许表达的条件依赖于这类方法中使用的宿主系统和表达系统/载体。本领域已知为达到允许重组多肽表达的条件而需进行修饰的参数。因此，本领域技术人员可以无需更多的创造性投入即可确定合适的条件。
表达后可根据本领域标准程序纯化本发明多肽，所述方法包括硫酸铵沉淀、亲和层析柱、柱层析、凝胶电泳和类似手段，参阅Scopes，“Protein Purification(蛋白纯化)”,Springer-Verlag,N.Y.(1982)。对于制药用途而言，优选具有至少约90%到95%均一性的大致纯的多肽，更优选98%到99%或更高均一性的大致纯的多肽。如所期望地部分纯化或纯化至均一后，可将本发明多肽用于治疗（包括体外地）或用于开发和实施测定程序。此外，用于从培养物中回收本发明多肽的方法实例在附带的实施例中详细描述。
此外，本发明提供一种组合物，其含有本发明多肽或用如上公开的方法产生的多肽。优选地，所述组合物为药物组合物。
根据本发明，术语“药物组合物”是指用于对患者，优选人类患者施用的组合物。本发明特别优选的药物组合物包含针对背景独立的CD3表位并针对其产生的结合分子。优选地，药物组合物包括载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。在优选的实施方案中，药物组合物包括用于肠胃外、透皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或通过直接注射进组织中的组合物。特别设计所述组合物通过输注或注射施用给患者。可通过不同的路径施用适当的组合物，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部或真皮内施用。尤其是，本发明提供合适组合物的不间断施用。作为非限制性实例，不间断、即连续的施用可通过小泵系统来实现，其中所述小泵系统被戴在患者中，以计量流入患者体内的治疗剂。包含针对本发明的背景独立的CD3表位并针对其产生的结合分子的药物组合物可通过使用所述泵系统而施用。此类泵系统通常为本领域已知，并且通常依赖于定期更换的、含有待注入治疗剂的药筒。当在此泵系统中更换药筒时，不间断地流入患者体内的治疗剂会随之发生暂时中断。在这种情况下，替换药筒之前的施用阶段和替换药筒之后的施用阶段仍被认为在本发明的药物治疗手段和方法的含义范围内，并且共同组成此类治疗剂的一种“不间断的施用”。
本发明的这些针对背景独立的CD3表位并针对其产生的结合分子的连续或不间断的施用可以是通过流体递送设备或小泵系统而静脉内或皮下施用的，其中所述流体递送设备或小泵系统包括一个用来将流体从储器中推出的流体推动装置和一个用来驱动所述推动装置的驱动装置。用于皮下施用的泵系统可包括用以穿透患者皮肤并递送合适组合物到患者身体的针头或插管。所述泵系统可独立于静脉、动脉或血管直接固定或连接于患者皮肤，从而允许泵系统和患者皮肤之间直接接触。泵系统可连接到患者皮肤持续24小时至数天。泵系统可为小尺寸的，并带有一个小容积的储器。作为非限制性实例，待施用的合适药物组合物的储器的容积可为0.1ml至50ml。
所述连续施用可以是通过贴在皮肤上并以一定时间间隔进行更换的贴片来透皮进行。本领域技术人员知道适合这个目的药物递送贴片系统。应当注意，透皮施用尤其适合连续施用，因为更换第一张用完的贴片可以通过同时将其替换为第二张新贴片来方便地实现，例如贴在紧邻第一张用完的贴片的皮肤表面上，并且在除去第一张贴片前立即进行。流动中断问题或电池故障问题都未出现。
包含尤其是针对背景独立的CD3表位并针对其产生的结合分子的本发明组合物还可包含药学上可接受的载体。合适药物载体的实例是本领域公知的并包括溶液，如，磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液、脂质体等。通过公知的常规方法可配制包含这种载体的组合物。制剂可包含碳水化合物、缓冲溶液、氨基酸和/或表面活性剂。碳水化合物可为非还原性糖，优选地为海藻糖、蔗糖、八硫酸酯(octasulfate)、山梨醇或木糖醇。这种制剂可用于静脉内或皮下连续施用，带有和/或不带有泵系统。氨基酸可为带电荷的氨基酸，优选地为赖氨酸、乙酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和/或组氨酸。表面活性剂可为优选地具有>1.2KD的分子量的去污剂，和/或优选地具有>3KD的分子量的聚醚。优选去污剂的非限制性实例是吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或吐温85。优选聚醚的非限制性实例是PEG3000、PEG3350、PEG4000或PEG5000。用于本发明的缓冲系统可具有优选5-9的pH，并可包括柠檬酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、组氨酸和乙酸盐。本发明的组合物可以合适剂量施用于受治疗者，合适剂量如，通过向非黑猩猩灵长类例如猕猴施用增加的剂量的表现本文所述的跨物种特异性的本发明多肽的剂量增强研究而确定。如上所述，表现本文所述的跨物种特异性的本发明多肽可有利地以相同形式用于非黑猩猩灵长类的临床前测试和作为人类药物。这些组合物还可联合其它蛋白性质和非蛋白性质的药物施用。这些药物可与包含本文定义的多肽的本发明组合物同时地施用或以定期的间隔和剂量在施用所述多肽之前或之后分开地施用。由主治医师和临床因素确定给药方案。如医药领域中众所周知，用于任意一个患者的剂量依赖于多种因素，包括患者身材大小、体表面积、年龄、将施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康和同时施用的其它药物。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯类如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外运载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内运载体包括流体和营养物补充剂、电解质补充剂（如基于林格氏葡萄糖的那些）及其类似物。还可存在防腐剂和其它添加剂例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体及诸如此类。另外，本发明的组合物可以包含蛋白质性质的载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，其优选地是人类来源的。可以设想，除了本文定义的本发明多肽之外，本发明的组合物还可以包含其他生物活性剂，这依赖于该组合物的计划用途。此类剂可以是作用于胃肠系统的药物、作为细胞生长抑制剂的药物、防止高尿酸血症(hyperurikemia)的药物、抑制免疫反应的药物（例如皮质类固醇）、调节炎性反应的药物、作用于循环系统的药物和/或本领域中已知的诸如细胞因子的剂。
本文定义的药物组合物的生物活性可例如通过细胞毒性测定确定，如在以下实施例、WO99/54440或Schlereth等人描述的(Cancer Immunol.Immunother.20(2005),1-12)。本文所用的“效力”或“体内效力”是指对本发明药物组合物治疗的响应，其使用例如标准化的NCI响应标准。使用本发明药物组合物治疗的成功或体内效力是指组合物对其预期目的的有效性，即组合物导致其期望效应即消耗病理性细胞如肿瘤细胞的能力。体内效力可由对各自的疾病实体确立的标准方法监测，其中所述方法包括但不限于白细胞计数、微分（differentials）、荧光激活细胞分选术、骨髓穿刺。此外，可使用多种疾病特异性临床化学参数和其它已确立的标准方法。而且，可以使用例如计算机辅助的X射线断层术、X射线、核磁共振X射线断层术(如，基于国家癌症研究所标准的响应评估[Cheson BD,Horning SJ,Coiffier B,Shipp MA,Fisher RI,Connors JM,Lister TA,Vose J,Grillo-Lopez A,Hagenbeek A,Cabanillas F,Klippensten D,Hiddemann W,Castellino R,Harris NL,Armitage JO,Carter W,Hoppe R,Canellos GP.Report of an international workshopto standardize response criteria for non-Hodgkin’s lymphomas(标准化非霍奇金淋巴瘤响应标准的国际研讨会报告)。NCI发起的国际研讨会.J Clin Oncol.1999Apr;17(4):1244])、正电子发射X射线断层术扫描、白细胞计数、微分、荧光激活细胞分选术、骨髓穿刺、淋巴结活体解剖/组织学和多种淋巴瘤特异性的临床化学参数（例如乳酸脱氢酶）以及其它已确立的标准方法。
开发药物诸如本发明药物组合物中的另一主要挑战是药物代谢动力学性质的可预测的调节。为此，建立候选药物的药物代谢动力学概况，即实现特定药物治疗给定疾患的能力的药物代谢动力学参数的概况。影响药物治疗特定疾病实体的能力的药物的药物代谢动力学参数包括但不限于：半衰期、分布容积、肝首过代谢和血清结合度。给定药剂的效力可被上述各参数影响。
“半衰期”指50%的被施用的药物通过生物过程例如代谢、排泄等消除所用的时间。
“肝首过代谢”指药物首次接触肝时即在肝中首过期间被代谢的倾向。“分布容积”指药物经身体各区室如细胞内和细胞外间隙、组织和器官等的保留度，和药物在这些区室中的分布。“血清结合度”指药物与血清蛋白诸如白蛋白相互作用和结合的倾向，导致减少或失去药物生物活性。
药物代谢动力学参数还包括给定量的所施用药物的生物利用度、滞后时间(Tlag)、Tmax、吸收率、更多起效（more onset）和/或Cmax。
“生物利用度”指药物在血液区室中的量。
“滞后时间”指在药物的施用和它在血液或血浆中被检测和测量到之间的时间延迟。
“Tmax”是达到药物最大血液浓度的时间，而“Cmax”是以给定药物获得的最大血液浓度。达到所述药物的生物效应所需的血液或组织浓度的时间受所有参数影响。如Schlereth等人的出版物(Cancer Immunol.Immunother.20(2005),1-12)也陈述了表现跨物种特异性的本发明多肽的优选实施方案即双特异性单链抗体的药物代谢动力学参数，其可在如上列出的非黑猩猩灵长类中进行的临床前动物测试中确定。
本文所用的术语“毒性”是指药物显露在不良事件或严重不良事件中的毒性效应。这些副作用可能指施用后药物的全身耐受性的缺乏和/或局部耐受性的缺乏。毒性还可包括药物导致的致畸或致癌效应。
本文所用的术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义了在药物施用后当即(局部耐受性)和长期应用中不引起严重不良事件的药物施用。“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”可在例如治疗和随访期中以规律的间隔评估。测量包括临床评估如器官表现，以及实验室异常的筛查。临床评估可以被实施并偏向于根据NCI-CTC和/或MedDRA标准记录/编码的正常发现。器官表现可包括例如不良事件通用术语标准v3.0（CTCAE）中所列的标准，诸如过敏反应/免疫学、血液/骨髓、心律不齐、凝结，及诸如此类。可检测的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝结概况和尿分析，以及其它体液诸如血清、血浆、淋巴液或脊髓液、液体及类似物的检查。因此可评价安全性，如通过身体检查、成像技术(即超声波、x-射线、CT扫描、磁共振成像(MRI))、使用技术设备的其它测量(即心电图)、生命特征、通过测量实验室参数并记录不良事件。例如，根据本发明的用途和方法在非黑猩猩灵长类中的不良事件可通过组织病理学和/或组织化学方法检查。
本文所用的术语“有效的和无毒的剂量”是指本文定义的双特异性单链抗体的可耐受剂量，所述剂量足够高以导致病理性细胞的清除、肿瘤的消除、肿瘤的收缩或疾病的稳定，而不会或基本不会导致主要的毒性效应。这种有效的和无毒的剂量可通过如本领域中描述的剂量增强研究来确定，并应低于引起严重不良事件(剂量限制性毒性，DLT)的剂量。
以上术语在例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derivedpharmaceuticals S6(生物技术衍生的药品的临床前安全性评估S6)；ICH HarmonisedTripartite Guideline(ICH协调的三方准则)；1997年7月16日的ICH Steering Committeemeeting（ICH指导委员会会议）中也被提及。
此外，本发明涉及包含本发明多肽的药物组合物(即包含能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链的表位的至少一个结合结构域的多肽，其中所述表位是包括在由根据本发明或根据本发明方法产生的SEQ ID NO.2、4、6或8组成的组中的氨基酸序列的一部分)，其用于预防、治疗或改善选自增生性疾病、肿瘤性疾病或免疫性病症的疾病。优选地，所述药物组合物还包含载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。
本发明的进一步方面涉及本文以上定义的或根据以上定义的方法产生的多肽用于制备预防、治疗或改善疾病的药物组合物的用途。优选地，所述疾病是增生性疾病、肿瘤性疾病或免疫病症。进一步优选地，所述肿瘤性疾病是恶性疾病，优选地为癌症。
在本发明多肽用途的另一优选实施方案中，所述药物组合物适于联合另外的药物施用，即作为综合疗法的一部分。在所述综合疗法中，活性剂可任选地与本发明多肽包括在相同药物组合物中，或可包括在分开的药物组合物中。在后一种情况中，所述分开的药物组合物适于在施用包含本发明多肽的药物组合物之前、同时或之后施用。另外的药物或药物组合物可为非蛋白质性质的化合物或蛋白质性质的化合物。在另外的药物是蛋白质性质的化合物的情况下，蛋白质性质的化合物能够为免疫效应细胞提供活化信号是有利的。
优选地，所述蛋白质性质的化合物或非蛋白质性质的化合物可与本发明多肽、上文定义的核酸分子、上文定义的载体、或上文定义的宿主同时地或非同时地施用。
本发明另一方面涉及在需要其的受治疗者中预防、治疗或改善疾病的方法，所述方法包括施用本发明有效量的药物组合物的步骤。优选地，所述疾病是增生性疾病、肿瘤性疾病或免疫病症。甚至更优选地，所述肿瘤性疾病是恶性疾病，优选地为癌症。
在本发明方法的另一优选实施方案中，所述药物组合物适于联合另外的药物施用，即作为综合疗法的一部分。在所述综合疗法中，活性剂可任选地与本发明多肽包括在相同药物组合物中，或可包括在分开的药物组合物中。在后一种情况中，所述分开的药物组合物适于在施用包含本发明多肽的药物组合物之前、同时或之后施用。另外的药物或药物组合物可为非蛋白质性质的化合物或蛋白质性质的化合物。在另外的药物是蛋白质性质的化合物的情况下，蛋白质性质的化合物能够为免疫效应细胞提供活化信号是有利的。
优选地，所述蛋白质性质的化合物或非蛋白质性质的化合物可与本发明的多肽、上文定义的核酸分子、上文定义的载体、或上文定义的宿主同时地或非同时地施用。
对本发明上述方法优选地，所述受治疗者是人类。
在进一步方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括本发明的多肽、本发明的核酸分子、本发明的载体或本发明的宿主。
本发明进一步以下列项目为特征：
第1项.一种鉴定多肽的方法，所述多肽包含能够结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε(CD3ε)表位的跨物种特异性的结合结构域，该方法包括以下步骤：
(a)将该多肽与经由C末端固定于固相的最多27个氨基酸的CD3ε细胞外结构域的N末端片段接触，其中所述N末端片段包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly(SEQ ID NO.381)或Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly(SEQ ID NO.382)；
(b)从所述片段洗脱结合的多肽；和
(c)从(b)的洗脱物分离所述多肽。
优选地，本发明上述方法鉴定的多肽是人类来源的。
本“鉴定多肽的方法”理解为从多个多肽候选物分离对CD3ε的细胞外结构域片段具有相同特异性的一个或多个不同多肽的方法以及从溶液中纯化多肽的方法，其中所述片段在它的N末端包括氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly(SEQ ID NO.381)或Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly(SEQ ID NO.382)。分离对CD3ε细胞外结构域片段具有相同特异性的一个或多个不同多肽的方法的非限制性实施方案包括选择抗原特异性结合实体的方法，如，通常用于杂交瘤筛选、筛选瞬时/稳定转染的真核宿主细胞克隆或用在噬菌体展示方法中的淘选方法。用于从溶液中纯化多肽的后一方法的非限制性实例是例如从培养物上清液或从这种培养物的制品纯化重组表达的多肽。
如上所述，用于本发明方法的片段是灵长类CD3ε分子细胞外结构域的N末端片段。不同灵长类的CD3ε分子细胞外结构域的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:1、3、5和7。N末端八聚体的两种形式描绘在SEQ ID NO:381和382。优选地该N末端对于将被本发明方法鉴定的多肽的结合是自由地可用的。在本发明上下文中术语“自由地可用的”理解为没有另外的基序（motives）诸如His-标签。这种His-标签对本发明方法鉴定的结合分子的干扰描述于所附的实施例6和34。
根据本发明方法，所述片段经由其C末端固定于固相。本领域技术人员将易于和不需要任何创造性劳动地按照本发明方法所用的实施方案来选择合适的固相支持体。固相支持体的实例包括但不限于基质例如珠(如，琼脂糖珠、琼脂糖凝胶珠、聚苯乙烯珠、葡聚糖珠)、板(培养板或多孔板(MultiWell plate))以及已知的例如来自的芯片。将片段固定/固定化于所述固相支持体的手段和方法的选择取决于所述固相支持体的选择。固定/固定化的常用方法是经由N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯偶合。支持这种偶合的化学原理以及固定/固定化的可选方法是本领域技术人员已知的，例如来自Hermanson，“BioconjugateTechniques”,Academic Press,Inc.(1996)。为了固定于/固定化到色谱支持体上，常用以下手段：NHS活化的琼脂糖凝胶(如，GE Life Science-Amersham的HiTrap-NHS)、CnBr活化的琼脂糖凝胶(如，GE Life Science-Amersham)、NHS活化的葡聚糖珠(Sigma)或活化的聚甲基丙烯酸酯。这些试剂还可用于批处理方法。此外，包括氧化铁的葡聚糖珠(如，从Miltenyi可得)可用于批处理方法。这些珠可以和用于将所述珠从溶液分离的磁体联合使用。多肽可通过使用NHS活化的羧甲基葡聚糖固定在Biacore芯片(如CM5芯片)上。合适的固相支持体的进一步实例是胺反应性的多孔板(如Nunc ImmobilizerTM板)。
根据本发明方法，所述CD3ε细胞外结构域片段可直接或经由一段氨基酸偶合于固相支持体，其中所述一段氨基酸可为连接体或另一蛋白/多肽部分。可选地，CD3ε细胞外结构域可经由一个或多个衔接分子间接偶合。
洗脱结合于固定的表位的肽的手段和方法是本领域公知的。从洗脱物分离所鉴定的多肽的方法也如此。
与本发明一致，从多个多肽候选物分离对在其N末端包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly的CD3ε细胞外结构域片段具有相同特异性的一个或多个不同多肽的方法可包括选择抗原特异性实体的如下方法的一个或多个步骤：
CD3ε特异性结合分子可选自抗体衍生的所有组成成分。噬菌体展示文库可基于标准程序构建，例如在“Phage Display:A Laboratory Manual(噬菌体展示：实验室手册)”;编辑Barbas,Burton,Scott & Silverman;Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001中所公开的。抗体文库中抗体片段的型式可为scFv，但通常还可为Fab片段或甚至是单结构域抗体片段。对于抗体片段的分离，可使用原初抗体片段文库。为了在随后治疗应用中选择潜在的低免疫原性的结合实体，人类抗体片段文库可有利于直接选择人类抗体片段。在一些情形下，它们可形成合成抗体文库的基础(Knappik等人，J Mol.Biol.2000,296:57ff)。相应的型式可为Fab、scFv(如下述的)或结构域抗体(dAb，如Holt等人,TrendsBiotechnol.2003,21:484ff综述的)。
本领域还已知的是，在许多情形下，没有针对靶抗原的可用的免疫人类抗体源。因此，将动物以靶抗原免疫并从动物组织如脾脏或PBMC分离相应的抗体文库。N末端片段可被生物素酰化（biotinylated）或共价连接于蛋白如KLH或牛血清白蛋白(BSA)。根据常用方法，啮齿类动物被用于免疫。出于其它原因，非人类来源的一些免疫抗体的所有组成成分可尤其有利，其中所述原因例如衍生自骆驼状物种的单结构域抗体(VHH)的存在(如描述于Muyldermans,J Biotechnol.74:277；De Genst等人，Dev Como Immunol.2006,30:187ff)。因此，抗体文库相应的型式可为Fab、scFv(如下述的)或单结构域抗体(VHH)。
在一种可能的方法中，十周大的来自balb/c x C57black杂交的F1小鼠可以例如表达跨膜EpCAM的全细胞免疫，其中所述EpCAM以翻译融合的方式在N末端展示成熟CD3ε链的N末端氨基酸1至27。可选地，小鼠可以1-27CD3ε-Fc融合蛋白免疫(相应的方法描述在所附的实施例2)。加强免疫后，可获取血液样品并可在例如FACS分析中测试针对CD3阳性T细胞的抗体血清滴度。通常，免疫动物中的血清滴度显著高于未免疫动物中的血清滴度。
免疫的动物可形成构建免疫抗体文库的基础。这种文库的实例包括噬菌体展示文库。这种文库可通常基于标准程序构建，例如“Phage Display:ALaboratory Manual(噬菌体展示：实验室手册)”;编辑Barbas,Burton,Scott & Silverman;Cold Spring HarborLaboratory Press,2001中所公开的。
由于产生更多种多样的抗体文库，所述非人类抗体也可经由噬菌体展示而被人源化，其中所述抗体文库可随后在选择期间富集结合子。
在噬菌体展示方法中，使用相应的抗原作为靶分子，展示抗体文库的噬菌体池中的任一个形成了选择结合实体的基础。分离抗原特异性的抗原结合噬菌体的核心步骤称为淘选。因为抗体片段在噬菌体表面上的展示，该一般方法称为噬菌体展示。所选择的一个优选方法是使用小蛋白，诸如翻译地融合于噬菌体展示的scFv的N末端的丝状噬菌体N2结构域。本领域已知的可用于分离结合实体的另一展示方法是核糖体展示方法(综述于Groves& Osbourn,Expert Opin Biol Ther.2005,5:125ff；Lipovsek & Pluckthun,J ImmunolMethods2004,290:52ff)。
为了证明scFv噬菌体粒子结合于1-27CD3ε-Fc融合蛋白，可以PEG(聚乙二醇)从相应的培养物上清液收集携带克隆的scFv所有组成成分的噬菌体文库。ScFv噬菌体粒子可与固定化的CD3εFc融合蛋白一起孵化。固定化的CD3εFc融合蛋白可包被于固相。可洗脱结合实体，且洗脱物可用于感染新鲜的未感染的细菌宿主。成功地被编码人类scFv片段的噬菌粒拷贝转导的细菌宿主可再次进行羧苄青霉素抗性选择，并接着被例如VCMS13辅助噬菌体感染而开始第二轮抗体展示和体外选择。通常总共进行4至5轮选择。
分离的结合实体的结合可使用流式细胞测定在携带融合到表面展示的EpCAM的N末端CD3ε序列的CD3ε阳性Jurkat细胞、HPBall细胞、PBMC或被转染的真核细胞上测试（参见所附实施例4）。
第2项.根据第1项的方法，其中所述多肽包括鉴定的结合结构域，其作为能够结合于细胞表面抗原的第一结合结构域和第二结合结构域。
为了产生本发明方法鉴定的多肽（如本文定义的双特异性单链抗体）的第二结合结构域，可使用结合于人类和非黑猩猩灵长类的相应细胞表面抗原的单克隆抗体。本文所定义的双特异性多肽的适当的结合结构域例如可通过本领域所述重组方法衍生自跨物种特异性的单克隆抗体。可用上述FACS测定来测试结合到人类细胞表面抗原和所述细胞表面抗原在非黑猩猩灵长类中的同系物的单克隆抗体。文献中所述杂交瘤技术（Milstein和Nature256(1975)，495-7）也可被用来生成跨物种特异性的抗体。例如，小鼠可被人类和非黑猩猩灵长类CD33交替免疫。经杂交瘤技术可从这些小鼠分离产生跨物种特异性抗体的杂交瘤细胞并由FACS按上述进行分析。本文所述展现跨物种特异性的双特异性多肽例如双特异性单链抗体的产生和分析被显示在下述实施例中。展现跨物种特异性的双特异性单链抗体的优点包括如下列举的要点。
第3项.根据第2项的方法，其中所述第二结合结构域结合于人类和非黑猩猩灵长类的细胞表面抗原。
第4项.根据第1至3任何一项的方法，其中所述第一结合结构域是抗体。
第5项.根据第4项的方法，其中所述抗体是单链抗体。
第6项.根据第2至5任何一项的方法，其中所述第二结合结构域是抗体。
第7项.根据第1至6任何一项的方法，其中所述CD3ε的细胞外结构域的片段由具有SEQ ID NO.2、4、6或8所示的任何一个氨基酸序列的多肽的一个或多个片段组成。
第8项.根据第7项的方法，其中所述片段长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27个氨基酸残基。
第9项.根据第1至8任何一项的方法，其中所述鉴定方法是筛选多个多肽的方法，其中所述多肽包括结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε的表位的跨物种特异性结合结构域。
第10项.根据第1至8任何一项的方法，其中所述鉴定方法是纯化/分离多肽的方法，其中所述多肽包括结合于人类和非黑猩猩灵长类CD3ε的表位的跨物种特异性结合结构域。
第11项.最多27个氨基酸的CD3ε细胞外结构域的N末端片段用于产生跨物种特异性结合结构域的用途，其中所述片段包括氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly(SEQ ID NO.381)或Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly(SEQ ID NO.382)。根据本发明的所述用途，优选地，所产生的跨物种特异性结合结构域是人类来源的。
第12项.根据第11项的用途，其中所述跨物种特异性结合结构域是抗体。
第13项.根据第12项的用途，其中所述抗体是单链抗体。
第14项.根据第12至13项的用途，其中所述抗体是双特异性抗体。
这些和其他实施方案通过本发明的描述和实施例而被公开和包括。免疫学中的重组技术和方法在例如以下文献中被描述：Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual（分子克隆：实验室手册），Cold Spring Harbor Laboratory Press，第3版2001；Lefkovits，Immunology Methods Manual，The Comprehensive Sourcebook ofTechniques（免疫学方法手册，综合技术参考资料），Academic Press，1997；Golemis，Protein-Protein Interactions:A Molecular Cloning Manual（蛋白质-蛋白质相互作用：分子克隆手册），Cold Spring Laboratory Press，2002。关于根据本发明所使用的抗体、方法、用途和化合物中任一个的进一步的文献可从公共图书馆和数据库使用例如电子设备检索。例如，在互联网上可获得的公共数据库“Medline”可以被使用，例如在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/或列在EMBL服务主页http://www.embl.de/services/index.html的进一步的数据库和网址是本领域技术人员已知的，并也可使用例如http://www.google.com而获得。
附图显示：
图1
灵长类CD3ε的N末端氨基酸1-27与异源的可溶蛋白的融合。
图2
此图显示在瞬时转染的293细胞上清液中，检测由融合到人类IgG1的铰链和Fcγ部分的成熟人类CD3ε链的N末端氨基酸1-27和C末端6组氨酸标签组成的构建体的存在的ELISA测定中测量的四个重复样品的平均吸收值。标注“27aa huCD3E”的第一个柱显示所述构建体的平均吸收值，标注“irrel.SN”的第二个柱显示被作为阴性对照的无关构建体转染的293细胞上清液的平均值。所述构建体获得的值与阴性对照获得的值的比较清晰地证明了重组构建体的存在。
图3
此图显示在检测以在细胞周质表达的单链抗体的粗制品形式存在的跨物种特异性的抗CD3结合分子与构建体的结合的ELISA测定中测量的四个重复样品的平均吸收值，其中所述构建体包括融合到人类IgG1的铰链和Fcγ部分的成熟人类CD3ε链的N末端1-27氨基酸和C末端His6标签。柱从左到右显示称为A2J HLP、I2C HLP E2M HLP、F7O HLP、G4H HLP、H2C HLP、E1L HLP、F12Q HLP、F6A HLP和H1E HLP的特异性的平均吸收值。标注“阴性对照”的最右边的柱显示作为阴性对照的鼠抗人类CD3抗体的单链制品的平均吸收值。所述抗CD3特异性所获得的值与阴性对照所获得的值的比较清晰地证明了抗CD3特异性与成熟人类CD3ε链的N末端1-27氨基酸的强结合。
图4
灵长类CD3ε的N末端氨基酸1-27与异源的膜结合蛋白的融合。
图5
检测重组跨膜融合蛋白的存在的FACS测定中被测试的不同转染子的直方重叠图，其中所述重组跨膜融合蛋白由食蟹猴EpCAM和人类、狨猴、绢毛猴、松鼠猴和家猪各自的CD3ε链的N末端1-27氨基酸组成。从左至右和从上至下的直方重叠图分别显示表达包括人类27聚体（mer）、狨猴27聚体、绢毛猴27聚体、松鼠猴27聚体和猪27聚体的构建体的转染子的结果。在单个重叠图上，细线代表用含有2%的FCS而非抗Flag M2抗体的PBS孵化的样品作为阴性对照，而粗线显示用抗Flag M2抗体孵化的样品。对于每种构建体，所述直方重叠图显示抗Flag M2抗体对转染子的结合，其清楚地证明所述重组构建体在转染子上的表达。
图6
检测以在细胞周质表达的单链抗体的粗制品形式存在的跨物种特异性抗CD3结合分子与分别融合到食蟹猴EpCAM的人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε链N末端氨基酸1-27结合的FACS测定中被测试的不同转染子的直方重叠图。
图6A：
从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括人类27聚体的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果，使用被分别称为H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP和G4H HLP的CD3特异性结合分子测试。
图6B：
从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括狨猴27聚体的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果，使用被分别称为H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP和G4H HLP的CD3特异性结合分子测试。
图6C：
从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括绢毛猴27聚体的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果，使用被分别称为H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP和G4H HLP的CD3特异性结合分子测试。
图6D：
从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括松鼠猴27聚体的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果，使用被分别称为H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP和G4H HLP的CD3特异性结合分子测试。
图6E：
从左至右和从上至下的直方重叠图显示表达包括猪27聚体的1-27CD3-EpCAM的转染子的结果，使用被分别称为H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP和G4H HLP的CD3特异性结合分子测试。
在单个重叠图上，细线代表用鼠抗人类CD3抗体的单链制品孵化的样品作为阴性对照，而粗线显示用所示相应的抗CD3结合分子孵化的样品。考虑到对猪27聚体转染子的结合的缺乏和显示在图5中的构建体的表达水平，直方图的重叠图显示被测试的完全跨物种特异性的人类双特异性单链抗体的抗CD3特异性对表达包括分别融合到食蟹猴EpCAM的人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε链N末端氨基酸1-27的重组跨膜融合蛋白的细胞的特异性强结合，并因此显示所述抗CD3结合分子的多灵长类跨物种特异性。
图7
在被转染的鼠EL4T细胞上检测人类CD3ε的FACS测定。图像分析显示直方图的重叠图。粗线显示用抗人类CD3抗体UCHT-1孵化的被转染细胞。细线代表用小鼠IgG1同种型对照孵化的细胞。抗CD3抗体UCHT1的结合清楚地显示人类CD3ε链在被转染的鼠EL4T细胞的细胞表面的表达。
图8
在丙氨酸扫描实验中跨物种特异性的抗CD3抗体与丙氨酸突变体的结合。在单独的图中，柱从左到右显示以对数刻度任意单位的野生型转染子（WT）和位置1至27的所有丙氨酸突变体的计算结合值。所述结合值用下式计算：
在这个方程式中，“样品值”指的是任意单位的结合值，其描述特定的抗CD3抗体与如图所示特定的丙氨酸突变体的结合程度，“样品”指的是在特定的丙氨酸扫描转染子上测定的特定的抗CD3抗体所获得的几何平均荧光值，“阴性对照”指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的阴性对照所获得的几何平均荧光值，UCHT-1指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的UCHT-1抗体所获得的几何平均荧光值，WT指的是在野生型转染子上测定的特异性的抗CD3抗体所获得的几何平均荧光值，x表示相应的转染子，y表示相应的抗CD3抗体并且wt表示相应的转染子是野生型。单独的丙氨酸突变位置用野生型氨基酸的单字母代码和该位置的数字标注。
图8A：
此图显示跨物种特异性的抗CD3抗体A2J HLP作为嵌合IgG分子被表达的结果。在位置4（天冬酰胺）、在位置23（苏氨酸）和在位置25（异亮氨酸）突变成丙氨酸后观察到降低的结合活性。在位置1（谷氨酰胺）、在位置2（天冬氨酸）、在位置3（甘氨酸）和在位置5（谷氨酸）突变成丙氨酸后观察到结合的完全丧失。
图8B：
此图显示跨物种特异性的抗CD3抗体E2M HLP作为嵌合IgG分子被表达的结果。在位置4（天冬酰胺）、在位置23（苏氨酸）和在位置25（异亮氨酸）突变成丙氨酸后观察到降低的结合活性。在位置1（谷氨酰胺）、在位置2（天冬氨酸）、在位置3（甘氨酸）和在位置5（谷氨酸）突变成丙氨酸后观察到结合的完全丧失。
图8C：
此图显示跨物种特异性的抗CD3抗体H2C HLP作为嵌合IgG分子被表达的结果。在位置4（天冬酰胺）突变成丙氨酸后观察到降低的结合活性。在位置1（谷氨酰胺）、在位置2（天冬氨酸）、在位置3（甘氨酸）和在位置5（谷氨酸）突变成丙氨酸谷氨酰胺后观察到结合的完全丧失。
图8D：
显示跨物种特异性的抗CD3抗体F12Q HLP作为在细胞周质被表达的单链抗体被测试的结果。在位置1（谷氨酰胺）、在位置2（天冬氨酸）、在位置3（甘氨酸）和在位置5（谷氨酸）突变成丙氨酸后观察到结合的完全丧失。
图9
检测跨物种特异性的抗CD3结合分子H2C HLP与具有和不具有N末端His6标签的人类CD3结合的FACS测定。
绘制了被野生型人类CD3ε链（左侧直方图）或具有N末端His6标签的人类CD3ε链（右侧直方图）转染的EL4细胞系在检测跨物种特异性的结合分子H2C HLP的结合的FACS测定中被测试的直方重叠图。使用作为阴性对照的适当的同种型对照（细线）、作为阳性对照的抗人类CD3抗体UCHT-1（虚线）和嵌合IgG分子形式的跨物种特异性抗CD3抗体H2C HLP（粗线）孵化样品。
直方重叠图显示UCHT-1抗体对两个转染子的结合与同种型对照相当，证明了两个重组构建体的表达。直方重叠图还显示抗CD3结合分子H2C HLP只结合野生型人类CD3ε链但不结合His6-人类CD3ε链。这些结果证明游离的N末端对于跨物种特异性的抗CD3结合分子H2C HLP的结合是必要的。
图10
人类CD3阳性PBMC上的EGFR-21-63LH×H2C的饱和结合，其通过FACS分析来确定细胞上CD3结合的KD值。按照实施例7中所述进行所述测定。
图11
标明的跨物种特异性的双特异性单链构建体对以人类EGFR转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以食蟹猴EGFR转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色按照实施例12中所述进行。粗线代表使用2μg/ml纯化的蛋白孵化的细胞，其中所述细胞接着用抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化。细直方图线表示阴性对照：只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。
图12
由被重新定向于所指的靶细胞系的标明的跨物种特异性的单链构建体诱导的细胞毒性活性。A）刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类EGFR转染的CHO细胞用作靶细胞。B）猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以食蟹猴EGFR转染的CHO细胞用作靶细胞。按照实施例13中所述进行所述测定。
图13
由被重新定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类EGFR转染的CHO细胞用作靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以食蟹猴EGFR转染的CHO细胞用作靶细胞。按照实施例13中所述进行所述测定。
图14
标明的跨物种特异性的双特异性单链构建体对以人类MCSP D3转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色按照实施例17中所述进行。粗线代表使用2μg/ml纯化的蛋白孵化的细胞，其中所述细胞接着用抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化。细直方图线表示阴性对照：只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。
图15
标明的跨物种特异性的双特异性单链构建体对以人类MCSP D3转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色按照实施例17中所述进行。粗线代表使用2μg/ml纯化的蛋白孵化的细胞，其中所述细胞接着用抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化。细直方图线表示阴性对照：只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。
图16
标明的跨物种特异性的双特异性单链构建体对以人类MCSP D3转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色按照实施例17中所述进行。粗线代表使用2μg/ml纯化的单体蛋白孵化的细胞，其中所述细胞接着用抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化。细直方图线表示阴性对照：只用所述抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。
图17
由被重新定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类MCSP D3转染的CHO细胞用作靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞用作靶细胞。按照实施例18中所述进行所述测定。
图18
由被重新定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A）和B）猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞被用作靶细胞。按照实施例18中所述进行所述测定。
图19
由被重新定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)和B)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类MCSP D3转染的CHO细胞用作靶细胞。按照实施例18中所述进行所述测定。
图20
由被重新定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类MCSP D3转染的CHO细胞用作靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞用作靶细胞。按照实施例18中所述进行所述测定。
图21
由被重新定向于所指靶细胞系的标明的跨物种特异性MCSP特异性单链构建体诱导的细胞毒性活性。A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类MCSP D3转染的CHO细胞用作靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以食蟹猴MCSP D3转染的CHO细胞用作靶细胞。按照实施例18中所述进行所述测定。
图22
通过标明的单链构建体样品诱导的细胞毒性活性测量检测的MCSP和CD3跨物种特异性的双特异性单链抗体的血浆稳定性，所述样品使用50%的人类血浆分别在37℃和4℃孵化24小时，或在细胞毒性测试之前即刻加入50%的人类血浆，或者不加入血浆。以人类MCSP转染的CHO细胞用作靶细胞系，而刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞。按照实施例19中所述进行所述测定。
图23
基本上无循环CD19阳性靶B细胞(实心三角)的B-NHL患者(表4的患者号1、7、23、30、31和33)的外周血中，在静脉内输注识别常规背景依赖性CD3表位的CD3结合分子CD19×CD3的初始阶段期间绝对T细胞计数(空心方块)开始的下降和恢复(即重新分布)。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。CD19×CD3剂量在患者号旁边的括号中提供。
图24
(A)在无循环CD19阳性靶B细胞(实心三角)和以5μg/m2/24h的初始剂量连续静脉内输注CD19×CD3一天随后突然剂量增加到15μg/m2/24h的情况下发展CNS症状的B-NHL患者#19(表4)中的重复的T细胞重新分布(空心方块)。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。从通过开始于5μg/m2/24h的治疗触发的第一重新分布事件恢复循环T细胞后，从5μg/m2/24h至15μg/m2/24h的逐步剂量增加触发了T细胞重新分布的第二事件，其与主要是精神混乱和定向障碍的CNS症状的发展有关。
(B)以1.5μg/m2重复静脉内弹丸输注CD19×CD3的情况下发展CNS症状的B-NHL患者中的重复的T细胞重新分布。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。每次弹丸施用的输注时间是2至4小时。竖向箭头表示开始弹丸输注。每次弹丸施用开始时的数据点显示弹丸输注开始前即刻的T细胞计数。每次弹丸输注触发了T细胞重新分布事件，随后在下次弹丸输注前恢复T细胞计数。最后，第三次T细胞重新分布事件与在该患者中发展CNS症状有关。
图25
无循环CD19阳性靶B细胞(实心三角)的B-NHL患者#20(表4)中，在坡度开始CD19×CD3输注即在治疗前24小时中从几乎零到15μg/m2/24h平稳地逐渐增加流速期间，复杂的T细胞重新分布模式(空心方块)。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。CD19×CD3剂量在患者号旁边的括号中提供。通过在坡度阶段仍增加CD19×CD3的水平，第一次暴露于CD19×CD3触发的初始重新分布后循环血液中再出现的T细胞部分地被诱导以从循环血液再次消失。
图26
以CD19×CD3治疗期间，具有显著数目的循环CD19阳性靶B(淋巴瘤)细胞(实心三角)的B-NHL患者#13(表4)的T和B细胞计数。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。CD19×CD3剂量在患者号旁边的括号中提供。开始CD19×CD3输注后T细胞(空心方块)完全从循环消失，且直到从外周血耗尽循环CD19阳性B(淋巴瘤)细胞(实心三角)也不重新出现。
图27
基本上无循环CD19阳性靶B细胞(实心三角)和在开始输注CD19×CD3而没有稳定药物所需的另外HSA的情况下发展CNS症状(上图)的B-NHL患者#24(表4)中重复的T细胞重新分布(空心方块)。第一次从初始重新分布恢复循环T细胞后，因为缺少稳定HSA而不均匀的药物流量触发了T细胞重新分布的第二事件，其与主要是精神混乱和定向障碍的CNS症状的发展有关。当同一患者以包含用于稳定药物的另外HSA的CD19×CD3溶液正确地重新开始时，未观察到重复的T细胞重新分布(下图)且患者不再发展任何CNS症状。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。CD19×CD3剂量在患者号旁边的括号中提供。
图28
通过单价结合于背景依赖性CD3表位诱导的T细胞粘着于内皮细胞的模型。常规CD3结合分子与CD3ε上其背景依赖性表位的单价相互作用可导致CD3构象的变构改变，随后是募集Nck2到CD3ε的胞质结构域(Gil等人(2002)Cell109:901)。由于Nck2经由PINCH和ILK直接连接于整联蛋白(Legate等人(2006)Nat Rev Mol Cell Biol7:20)，故在经由常规CD3结合分子(如实施例20的CD19×CD3)与CD3ε上其背景依赖性表位结合而使得CD3构象变构改变之后，Nck2向CD3ε胞质结构域的募集通过经由内外信号传导将T细胞表面上的整联蛋白瞬时转换为其更粘着的同工型可增加T细胞对内皮细胞的粘着。
图29
用于如实施例21所述的食蟹猴体内研究的CD33-AF5VH-VL×I2CVH-VL测试材料的细胞毒性活性。在标准51铬释放测定中，以增加浓度的CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL确定CD33阳性靶细胞的特异性裂解。测定持续时间是18小时。猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞源。以食蟹猴CD33转染的CHO细胞作为靶细胞。效应细胞与靶细胞的比(E:T比)是10:1。半-最大靶细胞裂解所需的CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL的浓度(EC50)从剂量响应曲线计算，值是2.7ng/ml。
图30
(A)如实施例21所述的，通过静脉内连续输注CD33-AF5VH-VL×I2CVH-VL，CD33阳性单核细胞从食蟹猴外周血的剂量-和时间-依赖性地耗尽。如上所述治疗期后绝对循环CD33阳性单核细胞计数相对于基线(即100%)的百分比，各柱对两只食蟹猴各自的每剂量水平显示。剂量水平(即输注流速)在柱下显示。在以30μg/m2/24h的剂量治疗7天的动物1和2中，未观察到循环CD33阳性单核细胞的耗尽。在以60μg/m2/24h的剂量治疗7天的动物3和4中，循环CD33阳性单核细胞计数分别减少至基线的68%和40%。以240μg/m2/24h，治疗3天后几乎完全从外周血耗尽循环CD33阳性单核细胞(动物5和6)。以1000μg/m2/24h，从外周血耗尽循环CD33阳性单核细胞在治疗1天后已经完成(动物7和8)。
(B)以120μg/m2/24h连续输注CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL14天期间，两只食蟹猴外周血中T细胞和CD33单核细胞计数的进程。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。在开始输注前12小时期间时开始动员CD33单核细胞后，在进一步输注期间外周血中CD33单核细胞(实心三角)相对于相应的基线计数耗尽了三分之二(动物10)和50%(动物9)。循环T细胞计数(空心方块)显示有限的初始下降，随后在仍存在循环CD33阳性单核靶细胞期间恢复。
图31
用于如实施例22所述的食蟹猴体内研究的MCSP-G4VH-VL×I2CVH-VL测试材料的细胞毒性活性。以增加浓度的MCSP-G4VH-VL×I2CVH-VL在标准51铬释放测定中确定了MCSP阳性靶细胞的特异性裂解。测定持续时间是18小时。猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞源。以食蟹猴MCSP转染的CHO细胞作为靶细胞。效应细胞与靶细胞的比(E:T比)是10:1。半-最大靶细胞裂解所需的MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL的浓度(EC50)从剂量响应曲线计算，值是1.9ng/ml。
图32
在静脉内输注识别实质上背景独立的CD3表位的CD3结合分子MCSP-G4VH-VL×I2CVH-VL的初始阶段期间，食蟹猴外周血中不存在下降和随后恢复绝对T细胞计数(即重新分布)的初始事件。绝对细胞计数以每微升血液1000个细胞提供。第一数据点显示开始输注之前即刻的基线计数。MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL剂量在动物号旁边的括号中提供。在已知的不存在来自食蟹猴循环血液的MCSP阳性靶细胞时，不经由靶细胞介导的CD3交联来诱导T细胞重新分布(即绝对T细胞计数下降和随后恢复的初始事件)。而且，经由信号的T细胞重新分布(即绝对T细胞计数下降和随后恢复的初始事件)的诱导，可通过使用识别实质上背景独立的CD3表位的CD3结合分子如MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL而避免，其中T细胞可通过仅与CD3结合位点的排它的相互作用而接受该信号。
图33
标出的跨物种特异性双特异性构建体分别与以人类CD33转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CD33转染的CHO细胞和猕猴PBMC的FACS结合分析。FACS染色如实施例23.4所述的进行。粗线代表以5μg/ml纯化的双特异性单链构建体或表达跨物种特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照。未转染的CHO细胞的上清液用作阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴CD33以及人类和猕猴CD3的特异性结合。
图34
该图示显示测量细胞毒性活性的铬释放测定的结果，其中所述细胞毒性活性是由标出的跨物种特异性CD33特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的。还如所指地使用效应细胞。测定如实施例23.5所述的进行。该图示清楚地证明，对于每种构建体，人类和猕猴效应细胞分别针对人类和猕猴CD33转染的CHO细胞有效的募集细胞毒性活性。
图35
标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类CAIX转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CAIX转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色如实施例24.5所述的进行。粗线代表以2μg/ml纯化的双特异性单链构建体孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照。未转染的CHO细胞的上清液用作结合于T细胞系的阴性对照。具有无关靶特异性的单链构建体用作结合于CAIX转染的CHO细胞的阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴CAIX以及人类和猕猴CD3的特异性结合。
图36
该图示显示测量细胞毒性活性的铬释放测定的结果，其中所述细胞毒性活性是由标出的跨物种特异性CAIX特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的。还如所指地使用效应细胞。测定如实施例24.6所述的进行。图示清楚地证明，对于每种构建体，人类和猕猴效应细胞分别地针对人类和猕猴CAIX转染的CHO细胞有效的募集细胞毒性活性。
图37
使用人类T细胞作为效应细胞，由针对人类EpCAM转染的CHO细胞的标出的EpCAM特异性单链构建体所诱导的细胞毒性活性。测定如实施例部分所述的进行。图示清楚地证明每种构建体有效的募集细胞毒性活性。
效应细胞：刺激的CD4/CD56耗尽的人类PBMC。
靶细胞：以人类EpCAM转染的CHO。
图38
标出的双特异性单链构建体分别与以人类EpCAM转染的CHO细胞(2a)、未转染的CHO细胞如EpCAM和CD3阴性细胞系(2b)、人类PBMC(2c)和猕猴T细胞系4119LnPx(2d)的FACS结合分析。细胞以包含相应的双特异性单链构建体的上清液孵化。FACS染色如实施例部分所述的进行。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类EpCAM和人类以及猕猴CD3的特异性结合。
a：CHO-EpCAM(人类)
b：CHO(未转染的)
c：人类PBMC
d：猕猴4119LnPx(CD3+)。
图39
标出的跨物种特异性双特异性单链构建体与以人类EGFRvIII转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以食蟹猴EGFRvIII转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色如实施例26.3所述的进行。粗线代表以2μg/ml纯化的单体蛋白孵化，随后以抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化的细胞。细直方图线反映阴性对照：仅以抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。
图40
标出的跨物种特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的细胞毒性活性。A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类EGFRvIII转染的CHO细胞作为靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以食蟹猴EGFRvIII转染的CHO细胞作为靶细胞。测定如实施例26.3所述的进行。
图41
标出的跨物种特异性双特异性单链构建体与以人类IgE转染的J558L细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴IgE转染的J558L细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色如实施例27.2所述的进行。粗线代表以标出的跨物种特异性双特异性单链构建体转染的CHO细胞的细胞培养物上清液孵化，随后以抗his抗体和PE标记的检测抗体孵化的细胞。细直方图线反映阴性对照：仅以抗his抗体和检测抗体孵化的细胞。
图42
标出的跨物种特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的细胞毒性活性。A)刺激的CD4-/CD56-人类PBMC用作效应细胞，以人类IgE转染的J558L细胞作为靶细胞。B)猕猴T细胞系4119LnPx用作效应细胞，以猕猴IgE转染的J558L细胞作为靶细胞。测定如实施例27.2所述的进行。
图43
标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类CD44转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CD44转染的CHO细胞和猕猴PBMC的FACS结合分析。FACS染色如实施例28.6所述的进行。粗线代表以5μg/ml纯化的双特异性单链构建体孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照。含有2%FCS的PBS用作阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴CD44以及人类和猕猴CD3的特异性结合。
图44
标出的跨物种特异性双特异性单链构建体与以缺少v6外显子的人类CD44转染的CHO细胞的FACS结合分析。FACS染色如实施例28.6所述的进行。作为CD44表达的对照，将以缺少v6外显子的人类CD44转染的CHO细胞和以全长人类CD44转染的CHO细胞与抗CD44抗体孵化。粗线代表以5μg/ml纯化的双特异性单链构建体或所指的抗CD44抗体(5μg/ml)孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照。含有2%FCS的PBS用作阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对缺少v6外显子的人类CD44的结合的缺乏。以缺少v6外显子的人类CD44转染的CHO细胞上存在CD44是通过抗CD44抗体对这些细胞和以全长人类CD44转染的细胞可比的结合而证明的。FACS结合分析显示跨物种特异性双特异性单链构建体对CD44的v6外显子的特异性。
图45
该图示显示测量细胞毒性活性的铬释放测定的结果，其中所述细胞毒性活性是由标出的跨物种特异性CD44特异性单链构建体重新定向于如实施例28.1所述的以人类CD44转染的CHO细胞而诱导的。刺激的耗尽CD4和CD56的人类PBMC用作效应细胞，E:T比是10:1。测定如实施例28.7所述的进行。图示证明，对于每种构建体，人类效应细胞针对人类CD44转染的CHO细胞有效的募集细胞毒性活性。
图46
标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类CD30转染的CHO细胞、人类CD30+B细胞系MEC-1、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CD30转染的CHO细胞和猕猴PBMC的FACS结合分析。FACS染色如实施例29.5所述的进行。粗线代表以5μg/ml纯化的双特异性单链构建体孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照。含有2%FCS的PBS用作阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴CD30以及人类和猕猴CD3的特异性结合。
图47
该图示显示测量细胞毒性活性的铬释放测定的结果，其中所述细胞毒性活性是由标出的跨物种特异性CD30特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的。还如所指地使用效应细胞。测定如实施例29.6所述的进行。图示清楚地证明，对于每种构建体，人类和猕猴效应细胞分别针对对人类和猕猴CD30阳性的细胞有效的募集细胞毒性活性。
图48
标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类HER2转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴HER2转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。FACS染色如实施例30.5所述的进行。粗线代表以2μg/ml纯化的双特异性单链构建体孵化的细胞。细线反映阴性对照。含有2%FCS的PBS用作阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴HER2以及人类和猕猴CD3的特异性结合。
图49
该图示显示测量细胞毒性活性的铬释放测定的结果，其中所述细胞毒性活性是由标出的跨物种特异性HER2特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的。还如所指地使用效应细胞。测定如实施例30.6所述的进行。图示清楚地证明，对于每种构建体，显示了人类和猕猴效应细胞分别针对人类和猕猴HER2转染的CHO细胞有效的募集细胞毒性活性。
图50
监测称为E292F3HL×I2C HL的跨物种特异性双特异性单链分子纯化的SDS PAGE凝胶和Western印记。如所指的分析来自洗脱物、细胞培养物上清液(SN)和流经柱的流(FT)的样品。施加蛋白标志物(M)作为尺寸参照。SDS PAGE凝胶中具有50kDa至60kDa分子量的强蛋白条带证明以实施例31.2所述的一步纯化方法将跨物种特异性双特异性单链分子有效纯化到很高程度的纯度。检测组氨酸6标签的Western印记证实了洗脱物中蛋白条带作为跨物种特异性双特异性单链分子的身份。在该敏感检测方法中，流经样品的微弱信号进一步显示，所述纯化方法几乎完全捕获双特异性单链分子。
图51
监测称为V207C12HL×H2C HL的跨物种特异性双特异性单链分子纯化的SDS PAGE凝胶和Western印记。如所指的分析来自洗脱物、细胞培养物上清液(SN)和流经柱的流(FT)的样品。施加蛋白标志物(M)作为尺寸参照。SDS PAGE凝胶中具有50kDa至60kDa分子量的强蛋白条带证明以实施例31.2所述的一步纯化方法将跨物种特异性双特异性单链分子有效纯化到很高程度的纯度。检测组氨酸6标签的Western印记证实了洗脱物中蛋白条带作为跨物种特异性双特异性单链分子的身份。在该敏感检测方法中，流经样品的微弱信号进一步显示，所述纯化方法几乎完全捕获双特异性单链分子。
图52
监测称为AF5HL×F12QHL的跨物种特异性双特异性单链分子纯化的SDS PAGE凝胶和Western印记。如所指的分析来自洗脱物、细胞培养物上清液(SN)和流经柱的流(FT)的样品。施加蛋白标志物(M)作为尺寸参照。SDSPAGE凝胶中具有50kDa至60kDa分子量的强蛋白条带证明以实施例31.2所述的一步纯化方法将跨物种特异性双特异性单链分子有效纯化到很高程度的纯度。检测组氨酸6标签的Western印记证实了洗脱物中蛋白条带作为跨物种特异性双特异性单链分子的身份。在该敏感检测方法中，流经样品中的信号通过因上清液中的高浓度双特异性单链分子而使亲和柱饱和来解释。
图53
50%猕猴血清中AF5HL×I2CHL的标准曲线。上图示显示为了如实施例32.2所述的测定而产生的标准曲线。
下图示显示50%猕猴血清中AF5HL×I2CHL质量控制样品的结果。对于高和中QC样品，回收率高于90%，而对于低QC样品高于80%。
因此，该测定允许检测血清样品中从10ng/ml至200ng/ml(稀释前)的范围的AF5HL×I2CHL。
图54
50%猕猴血清中MCSP-G4HL×I2C HL的标准曲线。上图示显示为了如实施例32.2所述的测定而产生的标准曲线。
下图示显示50%猕猴血清中MCSP-G4HL×I2C HL质量控制样品的结果。对于高和中QC样品，回收率高于98%，而对于低QC样品高于85%。
因此，该测定允许检测血清样品中从10ng/ml至200ng/ml(稀释前)的范围的MCSP-G4HL×I2C HL。
图55
抗Flag抗体与以融合于食蟹猴EpCAM的标出的物种CD3ε的1-27N末端氨基酸转染的CHO细胞的FACS结合分析。FACS染色如实施例33.1所述的进行。粗线代表以抗Flag抗体孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照。含有2%FCS的PBS用作阴性对照。直方图显示抗Flag抗体对所有转染子的强和可比的结合，说明转染的构建体的强和相等的表达。
图56
I2C IgG1构建体与表达融合于食蟹猴EpCAM的标出的物种CD3ε的1-27N末端氨基酸的CHO细胞的FACS结合分析。FACS染色如实施例33.3所述的进行。粗线代表以50μl表达I2C IgG1构建体的细胞的细胞培养物上清液孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照。表达融合于食蟹猴EpCAM的猪CD3ε的1-27N末端氨基酸的细胞用作阴性对照。与阴性对照比较，直方图清楚地证明I2C IgG1构建体与人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε的1-27N末端氨基酸的结合。
图57
如实施例33.2所述的I2C IgG1构建体与分别地描述于实施例6.1和5.1的具有和不具有N末端His6标签的人类CD3的FACS结合分析。粗线代表分别如所指地以抗人类CD3抗体UCHT-1、5His抗体(Qiagen)和表达I2C IgG1构建体的细胞的细胞培养物上清液孵化的细胞。实心直方图反映作为阴性对照的以无关鼠IgG1抗体孵化的细胞。
上方两个直方重叠图显示与同种型对照相比，UCHT-1抗体对两种转染子可比的结合，证实了两种重组构建体的表达。中间的直方重叠图显示5his抗体与表达His6-人类CD3ε链的细胞(His6-CD3)结合但不与表达野生型CD3ε链的细胞(WT-CD3)结合。下方的直方重叠图显示I2C IgG1构建体与野生型人类CD3ε链结合但不与His6-人类CD3ε链结合。这些结果证明，自由的N末端对于跨物种特异性抗CD3结合分子I2C与CD3ε链的结合是必需的。
图58
标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类MCSP D3转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴MCSP D3转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。如实施例17所述的进行FACS染色。粗线代表分别以2μg/ml纯化的双特异性单链构建体或包含双特异性单链构建体的细胞上清液孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照。未转染的CHO细胞的上清液用作结合于T细胞系的阴性对照。具有无关靶特异性的单链构建体用作结合于MCSP D3转染的CHO细胞的阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示构建体对人类和猕猴MCSP D3以及人类和猕猴CD3的特异性结合。
图59
标出的跨物种特异性MCSP D3特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的细胞毒性活性。还如所指的使用效应细胞和效应细胞与靶的比。测定如实施例18所述的进行。图示清楚地证明了每种构建体有效的跨物种特异性募集细胞毒性活性。
图60
标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类CD33转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CD33转染的CHO细胞和猕猴PBMC的FACS结合分析。如实施例36.2所述的进行FACS染色。粗线代表以表达跨物种特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照。未转染的CHO细胞的上清液用作阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示了构建体对人类和猕猴CD33以及人类和猕猴CD3的特异性结合。
图61
该图示显示测量细胞毒性活性的铬释放测定的结果，其中所述细胞毒性活性是由标出的跨物种特异性CD33特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的。还如所指地使用效应细胞。测定如实施例36.3所述的进行。图示清楚地证明，对于每种构建体，人类和猕猴效应细胞分别针对人类和猕猴CD33转染的CHO细胞有效的募集细胞毒性活性。
图62
以1.6、2.0、3.0和4.5μg/kg的剂量每周静脉内弹丸输注PBS/5%HSA和PBS/5%HAS加单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体的黑猩猩中的T细胞重新分布。每次弹丸施用的输注时间是2小时。竖向箭头表示开始弹丸输注。每次弹丸施用开始时的数据点显示开始弹丸输注之前即刻的T细胞计数。每次弹丸输注识别常规背景依赖性CD3表位的单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体触发了T细胞重新分布事件，随后在下次弹丸输注之前T细胞恢复到基线值。
图63
包含来自选择的克隆的加Flag标签的scFv蛋白片段的周质制品的CD3特异性ELISA分析。将可溶性scFv蛋白片段的周质制品加入ELISA板的孔，这些板已经用可溶性人类CD3ε(aa1-27)-Fc融合蛋白包被并已另外用PBS3%BSA封闭。以单克隆抗Flag-生物素-标记的抗体随后是过氧化物酶-共轭的链霉亲和素进行检测。ELISA由ABTS底物溶液显影。由ELISA读数器在405nm测量OD值(y轴)。克隆名称呈现在x轴。
图64
包含来自选择的克隆的加Flag标签的scFv蛋白片段的周质制品的ELISA分析。将与图63相同的可溶性scFv蛋白片段的周质制品加入ELISA板的孔，这些板没有用人类CD3ε(aa1-27)-Fc融合蛋白而是用huIgG1(Sigma)包被，并且用PBS中的3%BSA封闭。
以单克隆抗Flag-生物素-标记的抗体随后是过氧化物酶-共轭的链霉亲和素进行检测。ELISA由ABTS底物溶液显影。由ELISA读数器在405nm测量OD值(y轴)。克隆名称呈现在x轴。
图65
标出的跨物种特异性双特异性单链构建体分别与以人类CD44转染的CHO细胞、人类CD3+T细胞系HPB-ALL、以猕猴CD44转染的CHO细胞和猕猴T细胞系4119LnPx的FACS结合分析。以人类CD44delv6转染的CHO细胞用作对照以强调标出的跨物种特异性双特异性单链构建体对CD44的特异性。如实施例39.3所述的进行FACS染色。粗线代表以包含双特异性单链构建体的细胞上清液孵化的细胞。实心直方图反映阴性对照。未转染的CHO细胞的上清液用作结合于T细胞系的阴性对照。具有无关靶特异性的单链构建体用作结合于CD44和CD44delv6转染的CHO细胞的阴性对照。对于每种跨物种特异性双特异性单链构建体，直方图的重叠图显示了构建体对人类和猕猴CD44以及人类和猕猴CD3的特异性结合。对于每种构建体的直方图的重叠图显示没有特异性结合于人类CD44delv6转染的CHO细胞。
图66
标出的跨物种特异性CD44特异性单链构建体重新定向于所指靶细胞系而诱导的细胞毒性活性。还如所指的使用效应细胞和效应细胞与靶的比。如实施例39.4所述的进行测定。图示清楚地证明了双特异性构建体中的每一种介导细胞毒性的潜能。
图67
如实施例41所述的标出的跨物种特异性双特异性单链构建体的FACS结合分析。
图68
如实施例41所述的标出的跨物种特异性结合分子诱导的细胞毒性活性。
通过以下说明性非限制性实施例进一步描述本发明，所述实施例提供对本发明和其许多优点的更好理解。
实施例
1.从非人类灵长类的血液样品鉴定CD3ε序列
下列非人类灵长类的血液样品被用来鉴定CD3ε：普通狨猴Callithrix jacchus、绒顶柽柳猴Saguinus oedipus和松鼠猴Saimiris ciureus。按照制造者的方案制备用新鲜肝素处理的全血样品以分离总细胞RNA（QIAamp RNA Blood Mini Kit，Qiagen）。根据发表的方案，提取的mRNA被转录成cDNA。简言之，用1.2μl的10×六核苷酸混合物（Roche）在70℃下将10μl沉淀的RNA孵化10分钟并储存在冰上。加入由4μl的5×SuperScript II缓冲液、0.2μl的0.1M二硫苏糖醇、0.8μl的SuperScript II（Invitrogen）、1.2μl的脱氧核糖核苷三磷酸（25μM）、0.8μl的RNA酶抑制剂（Roche）和1.8μl的无DNA酶和RNA酶的水（Roth）组成的反应混合物。所述反应混合物在室温下孵化10分钟，接着在42℃下孵化50分钟并在90℃下孵化5分钟。在冰上将反应冷却，然后加入0.8μl的RNA酶H（1U/μl，Roche）并在37℃下孵化20分钟。
来自各个物种的第一链cDNA经过了分开的35个循环的聚合酶链式反应，其使用Taq DNA聚合酶（Sigma）和根据数据库研究而设计的如下引物组合：正向引物5'-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3'（SEQ ID NO：377）；反向引物5'-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3'（SEQ IDNO：378）。被扩增的550bp的条带被凝胶纯化（凝胶提取试剂盒，Qiagen）并测序（Sequiserve，Vaterstetten/德国，见序列表）。
CD3ε普通狨猴Callithrix jacchus
核苷酸
CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG
AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTCGTAAATA
GTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGACTTTTCGGAAATGGAGCAA
AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA
CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT
氨基酸
QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ
SGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD
CD3ε绒顶柽柳猴Saguinus oedipus
核苷酸
CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG
AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTTGTAAATA
GTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGATTTTTCGGAAATGGAGCAA
AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA
CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT
氨基酸
QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ
SGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD
CD3ε松鼠猴Saimiris ciureus
核苷酸
CAGGACGGTAATGAAGAGATTGGTGATACTACCCAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG
AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACAGGAAATAAAAATGGCTCGTAAATG
ATCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAAGATTTTTCAGAAATGGAACAA
AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAACAGACCCCCACAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA
CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT
氨基酸
QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGQEIKWLVNDQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ
SGYYACLSKETPTEEASHYLYLKARVCENCVEVD
2.结合于人类和不同非黑猩猩灵长类CD3ε的N末端氨基酸1-27的跨物种特异性单链抗体片段(scFv)的产生
2.1.使用通过融合于异源可溶性蛋白从其天然CD3背景分离的CD3εN末端对小鼠进行的免疫
由balb/c×C57black杂交的十周大的F1小鼠被携带人和/或松鼠猴成熟CD3ε链最N末端的氨基酸1-27的CD3ε-Fc融合蛋白（1-27CD3-Fc）免疫。为此目的，于300μl的PBS中的40μg的1-27CD3-Fc融合蛋白与10nmol的硫代酸酯（thioate）修饰的CpG-寡核苷酸（5'-tccatgacgttcctgatgct-3'）被注射进每只小鼠的腹膜内。小鼠在21天、42天和可选择地63天后以相同方式接受加强免疫。第一次加强免疫后十天，取血液样品并用ELISA测试针对1-27CD3-Fc融合蛋白iwa的抗体血清滴度。另外，使用流式细胞计量术按照标准的方案测试针对CD3阳性人类T细胞系HPBall的滴度。血清滴度在免疫的动物中比在未免疫的动物中高得多。
2.2.免疫鼠抗体scFv文库的产生：组合的抗体文库和噬菌体展示的构建
最后一次注射后三天，收集鼠脾细胞用于根据标准方案制备总RNA。
鼠免疫球蛋白（Ig）轻链（κ）可变区（VK）和Ig重链可变区（VH）的DNA片段文库通过基于鼠脾RNA的RT-PCR使用VK和VH特异性引物而被构建。根据标准方案合成cDNA。
按照产生扩增的重链V片段的5'-XhoI和3'-BstEII识别位点和扩增的VK DNA片段的5'-SacI和3'-SpeI识别位点的方式设计引物。
为了对VH DNA片段进行PCR扩增，八个不同的5'-VH-家族特异性引物(MVH1(GC)AGGTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT；MVH2GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT；MVH3CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT；MVH4GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGGGCA；MVH5GA(AG)GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA；MVH6GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCTGGA GGT；MVH7GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA；MVH8GAG GTT CAG CTC GAG CAGTCT GGA GCT)各与一个3'-VH引物(3'MuVHBstEII tga gga gac ggt gac cgt ggt cccttg gcc cca g)组合；为了对VK链片段进行PCR扩增，七个不同的5'-VK-家族特异性引物(MUVK1CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT；MUVK2CCA GTT CCG AGC TCG TGTTGA CGC AGC CGC CC；MUVK3CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA；MUVK4CCAGTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA；MUVK5CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCCAGA CTC CA；MUVK6CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA；MUVK7CCA GTT CCGAGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA)各与一个3'-VK引物(3'MuVkHindIII/BsiW1tgg tgcact agt cgt acg ttt gat ctc aag ctt ggt ccc)组合。
使用下述PCR程序进行扩增：在94℃变性20秒；在52℃引物退火50秒和在72℃引物延伸60秒，并进行40个循环，之后在72℃进行10分钟的最后一次延伸。
450ngκ轻链片段(SacI-SpeI消化的)与1400ng嗜菌粒pComb3H5Bhis(SacI-SpeI消化的；大片段)连接。随后将所得的组合的抗体文库由电穿孔(2.5kV,0.2cm间隙的电击杯,25uFD,200Ohm,Biorad的gene-pulser电穿孔仪)转化到300ul电感受态的大肠杆菌XL1Blue细胞，得到多于107独立克隆的文库大小。一小时的表型表达后，在100ml液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5BHis载体编码的羧苄青霉素抗性的阳性转化体。随后离心收集细胞并使用可购买获得的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备。
2800ng包含VK文库(XhoI-BstEII消化的；大片段)的该质粒-DNA与900ng重链V片段(XhoI-BstEII消化的)连接并再次由电穿孔(2.5kV,0.2cm间隙的电击杯,25uFD,200Ohm)转化到两个300ul份的电感受态的大肠杆菌XL1Blue细胞，获得多于107独立克隆的VH-VKscFv(单链可变片段)的总文库大小。
表型表达和缓慢地适应羧苄青霉素后，将包含抗体文库的大肠杆菌细胞转移到SB-羧苄青霉素(50ug/mL)选择培养基。随后以感染剂量的1012个辅助噬菌体VCSM13粒子感染包含抗体文库的大肠杆菌细胞，导致丝状M13噬菌体的产生和分泌，其中噬菌体粒子包含编码鼠scFv片段的单链pComb3H5BHis-DNA并展示作为翻译融合于噬菌体外壳蛋白III的相应的scFv蛋白。展示抗体文库的这个噬菌体池随后用于选择抗原结合实体。
2.3.基于噬菌体展示的CD3特异性结合子的选择
通过PEG8000/NaCl沉淀和离心，从对应的培养物上清液收集携带被克隆的scFv所有组成成分的噬菌体文库。将大约1011至1012个scFv噬菌体粒子重悬于0.4ml的PBS/0.1%BSA并与105至107个Jurkat细胞(CD3阳性人类T细胞系)在冰上缓慢搅动下孵化1小时。这些Jurkat细胞预先生长在富含胎牛血清(10%)、谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI培养基，通过离心收集，在PBS中洗涤并重悬于PBS/1%FCS(包含叠氮化钠)。通过以PBS/1%FCS(包含叠氮化钠)的共达五次的洗涤步骤来除去不特异性结合于Jurkat细胞的scFv噬菌体。洗涤后，通过将细胞重悬在HCl-甘氨酸pH2.2(10min孵化、随后涡旋)而从细胞洗脱结合实体，并且以2M Tris pH12中和后，洗脱物用于感染新鲜未感染的大肠杆菌XL1Blue培养物(OD600>0.5)。含有以编码人类scFv片段的噬菌粒拷贝成功转导的大肠杆菌细胞的大肠杆菌培养物再一次进行羧苄青霉素抗性选择，并接着以VCMS13辅助噬菌体感染而开始第二轮抗体展示和体外选择。通常共进行4至5轮选择。
2.4.筛选CD3特异性结合子
在选择后，对应于4和5轮淘洗的质粒DNA从大肠杆菌培养物中被分离。为了产生可溶性scFv蛋白，VH-VL-DNA片段从所述质粒（XhoI-SpeI）被切除。这些片段通过相同的限制性位点被克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建体（例如scFv）包含在scFv和His6标签之间的Flag标签（TGD YKDDDDK）以及其他的噬菌体蛋白被删除。在连接之后，每个质粒DNA池（不同淘洗轮次）被转化进100μl热激感受态大肠杆菌TG1或XL1blue并被铺在羧苄青霉素LB-琼脂上。单个克隆被挑选放入100μl的LB羧苄青霉素（50μg/ml）。
在切除基因III片段和使用1mM的IPTG诱导后，以含有VL和VH区段的pComb3H5BHis转化的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv。由于适合的信号序列，所述scFv链被输出到周质并在其中折叠成功能构象。
来自转化板的单个大肠杆菌TG1细菌菌落被挑选用于周质小量制备，并在补充了20mM的MgCl2和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基（例如10ml）中生长，并且在收集后被再溶解于PBS（例如1ml）。通过四轮在-70℃下冷冻和在37℃下解冻，细菌的外层膜被温度冲击而毁坏，而包括scFv在内的可溶性周质蛋白被释放到上清液中。在通过离心消除了完整细胞和细胞碎屑后，含有人类抗人类CD3-scFv的上清液被收集并用于进一步的检验。
2.5.CD3特异性结合子的鉴定
通过流式细胞计量术在真核细胞上测试分离的scFv的结合，其中所述真核细胞在他们的表面上表达异源性的蛋白，其中所述蛋白在它的N末端呈现CD3ε的所述前27个N末端氨基酸。
如实施例4中所述，人类T细胞受体复合体的成熟CD3ε链的N末端序列的前1-27个氨基酸（氨基酸序列：QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT）被融合到跨膜蛋白EpCAM的N末端，以致于所述N末端位于细胞外表面。另外，FLAG表位被插入N末端1-27CD3ε序列和EpCAM序列之间。这种融合产物被表达在人类胚肾（HEK）和中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。
呈现其他灵长类物种的成熟CD3ε的所述27个最N末端氨基酸的真核细胞使用相同方式制备：Saimiri ciureus（松鼠猴）（CD3ε的N末端氨基酸序列：QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT）、普通狨猴Callithrix jacchus（CD3ε的N末端氨基酸序列：QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT）和绒顶柽柳猴Saguinus oedipus（CD3ε的N末端氨基酸序列：QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT）。
对于流式细胞计量术，将2.5×105个细胞与50ul的上清液或与在含有2%FCS的50μl PBS中的5μg/ml的纯化的构建体一起孵化。以含有2%FCS的50μl PBS中2μg/ml的抗His抗体(5His抗体、无BSA,Qiagen GmbH,Hilden,FRG)检测构建体的结合。作为第二步骤试剂，使用在含有2%FCS的50μl PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab')2片段，山羊抗小鼠IgG(Fc-γ片段特异性)(Dianova,Hamburg,FRG)。在FACSscan(BD biosciences,Heidelberg,FRG)上测量样品。
结合总是通过如前面关于人和不同灵长类（如松鼠猴、普通狨猴、绒顶柽柳猴）原代T细胞的段落所述的流式细胞计量术被确认。
2.6.非人类CD3ε特异性scFv的人类/人源化等价物的产生
鼠抗CD3的scFv的VH区按照人类抗体种系氨基酸序列被比对。选择具有与非人类VH最近同源性的人类抗体种系VH序列并进行两个氨基酸序列的直接比对。有若干非人类VH的骨架残基，其区别于人类VH骨架区（“不同骨架位置”）。这些残基中的一些可促进抗体与其靶的结合与活性。
为了构建含有鼠CDR并在每个骨架位置区别于所选人类VH序列二者可能性（人类和母鼠氨基酸残基）的文库，变性的寡核苷酸被合成。这些寡核苷酸在不同的位置含有75%几率的人类残基和25%几率的鼠残基。对于一个人类VH，必须得合成例如六个这种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在末段约20个核苷酸处重叠。为此目的，每种第二引物都是反义引物。在寡核苷酸中稍后的克隆所需的限制性位点被删除。
这些引物可具有为60至90个的核苷酸长度，取决于对跨越整个V序列所需要的引物数量。
这些例如六个引物以等量被混合（例如1μl的每种引物（20至100μM的引物储液）加入20μl的PCR反应中）并加入由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物。在PCR循环控制装置中，这一混合物在94℃孵化3分钟，在65℃孵化1分钟，在62℃孵化1分钟，在59℃孵化1分钟，在56℃孵化1分钟，在52℃孵化1分钟，在50℃孵化1分钟，然后在72℃孵化10分钟。接着，所述产物在琼脂糖凝胶电泳中运行，并根据标准方法将200至400大小的产物从凝胶中分离。
这一PCR产物然后被用作标准PCR反应的模板，其中所述标准PCR反应使用包含N末端和C末端适合的克隆限制性位点的引物。根据标准方法使用琼脂糖凝胶电泳分离具有正确大小的所述DNA片段（对VH为大约350个核苷酸）。用这种方法扩增充足的VH DNA片段。这种VH片段现在是VH片段库，其中每一个在相应的不同骨架位置具有不同量的人类和鼠残基（人源化的VH库）。对于鼠抗CD3scFv的VL区进行相同程序（人源化的VL库）。
所述人源化的VH库然后与所述人源化的VL库在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis上合并以形成功能性的scFv文库，从所述文库中（在呈现在丝状噬菌体后）选择、筛选、鉴定和确认抗CD3结合子，如上所述关于亲本的非人类（鼠）抗CD3scFv。然后分析单个克隆的良好特性和氨基酸序列。那些在氨基酸序列同源性上与人类种系V区段最近的scFv是优选的，特别是在其中至少一个的CDR显示与所有人类种系V区段的关系最近的相应CDR具有多于80%氨基酸序列同一性的那些，其中所述CDR是在VH的CDR I和II以及VLκ的CDR I和II或者VLλ的CDR I和II当中。抗CD3scFv如以下的实施例10和16中所述被转换成重组双特异性单链抗体，并被进一步表征。
3.人类CD3ε链的N末端氨基酸1-27融合于IgG1的Fc部分的重组融合蛋白(1-27CD3-Fc)的产生。
3.1.1-27CD3-Fc的克隆和表达
根据标准方案由基因合成获得融合于人类免疫球蛋白IgG1的铰链和Fcγ区以及6组氨酸标签的人类CD3ε链的1-27N末端氨基酸的编码序列(重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO350和349)。基因合成片段设计为首先包含用于构建体真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是成熟人类CD3ε链胞外部分的前27个氨基酸的编码序列，框中随后是人类IgG1的铰链区和Fcγ部分的编码序列，框中随后是6组氨酸标签和终止密码子的编码序列(图1)。基因合成片段还设计为在编码融合蛋白的cDNA的开始和末尾引入限制性位点。所述被引入的限制性位点，即在5'末端的EcoRI和在3'末端的SaII，用于如下克隆程序。遵循标准方案经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)。证实序列的质粒根据制造商的方案用于在FreeStyle293表达系统(Invitrogen GmbH,Karlsruhe,Germany)中转染。3天后，收集转染子的细胞培养物上清液并在ELISA测定中检测重组构建体的存在。将Fc-γ片段特异性的抗体山羊抗人类IgG(从Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK获得)在PBS中稀释到5μg/ml并以100μl每孔包被到MaxiSorp96孔ELISA板(Nunc GmbH & Co.KG,Wiesbaden,Germany)上在4℃过夜。以含有0.05%吐温20的PBS(PBS/吐温)洗涤孔并以PBS中3%BSA(牛白蛋白，级份V,Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany)在室温(RT)封闭60分钟。随后，再次以PBS/吐温洗涤孔并随后在RT与细胞培养物上清液孵化60分钟。洗涤后，以过氧化物酶共轭的抗His6抗体(Roche Diagnostics GmbH,Roche Applied Science,Mannheim,Germany)在RT孵化孔60分钟，其中所述过氧化物酶共轭的抗His6抗体以含有1%BSA的PBS按1:500稀释。随后，以200μl PBS/吐温洗涤孔并根据制造商的方案加入100μl SIGMAFASTOPD(SIGMAFAST OPD[邻苯二胺二盐酸盐]底物溶液(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany)。通过加入100μl1M H2SO4终止反应。在PowerWaveX微板分光光度计(BioTek Instruments,Inc.,Winooski,Vermont,USA)以490nm测量显色反应并减去在620nm的背景吸收。如图2所示，与用作阴性对照的模拟转染的HEK293细胞的无关上清液相比，构建体的存在是清楚地可检测的。
3.2.跨物种特异性单链抗体与1-27CD3-Fc的结合测定。
在ELISA测定中检测CD3ε特异性的周质表达的跨物种特异性单链抗体粗制品对1-27CD3-Fc的结合。将Fc-γ片段特异性的抗体山羊抗人类IgG(Jackson ImmunoResearchEurope Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK)在PBS中稀释到5μg/ml并以100μl每孔包被到MaxiSorp96孔ELISA板(Nunc GmbH & Co.KG,Wiesbaden,Germany)在4℃过夜。以含有0.05%吐温20的PBS(PBS/吐温)洗涤孔并以含有3%BSA(牛白蛋白，级份V,Sigma-Aldrich ChemieGmbH,Taufkirchen,Germany)的PBS在RT封闭60分钟。随后以PBS/吐温洗涤孔，并与表达1-27CD3-Fc构建体的细胞上清液在RT孵化60分钟。以PBS/吐温洗涤孔并与如上述的周质表达的跨物种特异性单链抗体粗制品在室温孵化60分钟。以PBS/吐温洗涤后，孔与过氧化物酶共轭的抗Flag M2抗体(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany)在RT孵化60分钟，其中所述过氧化物酶共轭的抗Flag M2抗体以含有1%BSA的PBS按1:10000稀释。以PBS/吐温洗涤孔并根据制造商的方案与100μl SIGMAFASTOPD(OPD[邻苯二胺二盐酸盐]底物溶液(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany)孵育。以100μl1M H2SO4终止显色反应并在PowerWaveX微板分光光度计(BioTek Instruments,Inc.,Winooski,Vermont,USA)以490nm测量，减去在620nm的背景吸收。与鼠抗CD3单链抗体相比，观察到CD3ε特异性的跨物种特异性人类单链抗体对1-27CD3-Fc构建体的强结合(图3)。
4.来自不同非黑猩猩灵长类CD3ε的N末端氨基酸1-27融合于来自食蟹猴EpCAM的重组跨膜融合蛋白(1-27CD3-EpCAM)的产生。
4.1.1-27CD3-EpCAM的克隆和表达
从不同非黑猩猩灵长类(狨猴、绢毛猴、松鼠猴)和猪分离CD3ε。根据标准方案由基因合成获得了融合于加Flag标签的食蟹猴EpCAM N末端的成熟人类、普通狨猴(Callithrixjacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus oedipus)、普通松鼠猴(Saimiri sciureus)和家猪(Susscrofa；用作阴性对照)CD3ε链1-27N末端氨基酸的编码序列。重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO351至360。基因合成片段设计为首先包含BsrGI位点以允许在正确读码框中融合靶表达载体中已存在的19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，框中随后是成熟CD3ε链胞外部分N末端1-27氨基酸的编码序列，框中随后是Flag标签的编码序列，框中随后是成熟食蟹猴EpCAM跨膜蛋白的编码序列(图4)。基因合成片段还设计为在编码融合蛋白的cDNA末端引入限制性位点。在5'末端引入的限制性位点BsrGI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后遵循标准方案，经由BsrGI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF DHFR的质粒的衍生物(pEF-DHFR描述于Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)，该衍生物已经包含19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列。根据制造商的方案，证实序列的质粒用于瞬时转染293-HEK细胞，其对在175ml细胞培养瓶中附着的293-HEK细胞使用MATra-A试剂(IBA GmbH,Germany)和12μg质粒DNA。细胞培养3天后，根据标准方案经由FACS测定检测转染子的重组跨膜蛋白的细胞表面表达。为此目的，将2.5×105量的细胞与含有2%FCS的PBS中5μg/ml抗Flag M2抗体(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany)孵化。以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白共轭的亲和纯化的F(ab')2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK)检测结合的抗体。在FACScalibur(BD biosciences,Heidelberg,Germany)上测量样品。分别地由食蟹猴EpCAM和人类、狨猴、绢毛猴、松鼠猴以及猪CD3ε链的1-27N末端氨基酸组成的加Flag标签的重组跨膜融合蛋白在转染细胞上的表达是清楚地可检测的(图5)。
4.2.跨物种特异性抗CD3单链抗体与1-27CD3-EpCAM的结合
根据标准方案，在FACS测定中检测了周质表达的跨物种特异性抗CD3单链抗体粗制品对分别地融合于食蟹猴Ep-CAM的人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε链1-27N末端氨基酸的结合。为此目的，将2.5×105量的细胞与周质表达的跨物种特异性抗CD3单链抗体粗制品(如上述并根据标准方案进行制备)孵化且单链鼠抗人类CD3抗体作为阴性对照。作为二抗，5His抗体(Qiagen GmbH,Hildesheim,Germany)以50μl含有2%FCS的PBS中的5μg/ml使用。检测抗体与含有2%FCS的PBS中1：100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab')2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK)的结合。在FACScalibur(BD biosciences,Heidelberg,Germany)上测量样品。如图6(A至E)所示，观察到单链抗体对表达由融合于食蟹猴Ep-CAM的人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε1-27N末端氨基酸组成的重组跨膜融合蛋白的转染子的结合。未观察到跨物种特异性单链抗体对由用作阴性对照的融合于食蟹猴EpCAM的猪1-27N末端CD3ε组成的融合蛋白的结合。显示了抗CD3单链抗体的多灵长类跨物种特异性。以抗Flag M2抗体和跨物种特异性单链抗体获得的信号是可比的，表示跨物种特异性单链抗体对CD3ε的N末端氨基酸1-27的强结合活性。
5.由以人类CD3ε链和其丙氨酸突变体转染的小鼠细胞的丙氨酸扫描而进行的跨物种特异性抗CD3单链抗体的结合分析
5.1.人类野生型CD3ε的克隆和表达
根据标准方案由基因合成获得了人类CD3ε链的编码序列(人类CD3ε链的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO362和361)。基因合成片段设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点和在编码人类CD3ε的cDNA的始端和末端的限制性位点。在5'末端引入的限制性位点EcoRI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后遵循标准方案经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF NEO的质粒。通过常规分子克隆将DHFR的cDNA代替为新霉素抗性的cDNA而使pEF NEO衍生自pEF DHFR(Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)。证实序列的质粒用于转染在37℃、95%湿度和7%CO2下培养在RPMI中的鼠T细胞系EL4(ATCC编号：TIB-39)，其中所述RPMI含有稳定的L-谷氨酰胺并补充有10%FCS、1%青霉素/链霉素、1%HEPES、1%丙酮酸盐、1%非必需氨基酸(都来自Biochrom AG Berlin,Germany)。根据制造商的方案以SuperFect转染试剂(QiagenGmbH,Hilden,Germany)和2μg质粒DNA进行转染。24小时后，以PBS洗涤细胞并再次培养在上述含有600μg/ml G418用于选择的细胞培养基中(PAA Laboratories GmbH,Pasching,Austria)。转染16至20天后观察到长出抗性细胞。再过7至14天后，由FACS分析根据标准方案检测细胞对人类CD3ε的表达。将2.5×105个细胞与在含有2%FCS的PBS中5μg/ml的抗人类CD3抗体UCHT-1(BD biosciences,Heidelberg,Germany)孵化。以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab')2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK)检测抗体的结合。在FACSCalibur(BD biosciences,Heidelberg,Germany)上测量样品。人类野生型CD3在转染的EL4细胞上的表达显示在图7。
5.2.作为IgG1抗体的跨物种特异性抗CD3单链抗体的克隆和表达
为了提供检测跨物种特异性单链抗CD3抗体结合的改进手段，将H2CHLP、A2J HLP和E2M HLP转变为具有鼠IgG1和人类λ恒定区的IgG1抗体。根据标准方案由基因合成获得了编码相应的IgG抗体重和轻链的cDNA序列。各种特异性的基因合成片段设计为首先包含允许构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽(SEQ ID NO364和363)，框中随后是相应重链可变区或相应轻链可变区的编码序列，框中随后分别是鼠IgG1重链恒定区的编码序列(SEQ ID NO366和365)或人类λ轻链恒定区的编码序列(SEQ IDNO368和367)。在编码融合蛋白的cDNA始端和末端引入限制性位点。在5'末端的限制性位点EcoRI和在3'末端的限制性位点SaII用于如下克隆程序。根据标准方案，对于重链构建体，经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF DHFR的质粒(Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)和对于轻链构建体克隆到pEF ADA(pEF ADA描述于Raum等人,Cancer Immunol Immunother.,50(3),(2001),141-50))。证实序列的质粒用于根据制造商的方案在FreeStyle293表达系统(Invitrogen GmbH,Karlsruhe,Germany)中共转染相应的轻和重链构建体。3天后，收集转染子的细胞培养上清液并用于丙氨酸扫描实验。
5.3.用于丙氨酸扫描的人类CD3ε丙氨酸突变体的克隆和表达
通过基因合成获得了编码人类CD3ε链的27个cDNA片段，其中所述人类CD3ε野生型序列的一个密码子被交换成编码丙氨酸的密码子（GCC），这是对于相应的成熟人类CD3ε链细胞外结构域的氨基酸1-27中的每个氨基酸来说。除了交换的密码子以外，cDNA片段与上述人类野生型CD3cDNA片段相同。与上述人类野生型CD3cDNA片段相比，各构建体中只有一个密码子被代替。与野生型构建体相比在相同位置将限制性位点EcoRI和SaII引入cDNA片段。将所有丙氨酸扫描构建体克隆到pEF NEO并将证实序列的质粒转染到EL4细胞。如上述的进行转染子的转染和选择。结果是获得一组表达的构建体，其中在人类CD3ε链的第一个氨基酸，即位置1的谷氨酰胺(Q,Gln)被丙氨酸代替。被丙氨酸代替的最后一个氨基酸是在成熟人类野生型CD3ε位置27的苏氨酸(T,Thr)。对于谷氨酰胺1和苏氨酸27之间的各个氨基酸，产生了具有将野生型氨基酸交换为丙氨酸的对应的转染子。
5.4.丙氨酸扫描实验
在丙氨酸扫描实验中检测2)中描述的嵌合IgG抗体和对CD3ε特异性的跨物种特异性单链抗体。根据标准方案，由FACS测定检测抗体对以如3)描述的人类CD3ε丙氨酸突变体构建体转染的EL4细胞系的结合。2.5×105个细胞的相应转染子与50μl包含嵌合IgG抗体的细胞培养物上清液或与50μl周质表达的单链抗体粗制品孵化。对于以周质表达的单链抗体粗制品孵化的样品，将含有2%FCS的50μl PBS中5μg/ml抗Flag M2抗体(Sigma-AldrichChemie GmbH,Taufkirchen,Germany)用作二抗。对于以嵌合IgG抗体孵化的样品，二抗不是必需的。对于所有样品，以含有2%FCS的PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab’)2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK)检测抗体分子的结合。在FACSCalibur(BD biosciences,Heidelberg,Germany)上测量样品。检测到嵌合IgG分子或跨物种特异性单链抗体对以人类CD3ε丙氨酸突变体转染的EL4细胞系的差异结合。作为阴性对照，分别使用同种型对照或无关特异性的周质表达的单链抗体的粗制品。UCHT-1抗体用作人类CD3ε丙氨酸突变体表达水平的阳性对照。未评价成熟CD3ε链在位置15的酪氨酸、在位置17的缬氨酸、在位置19的异亮氨酸、在位置24的缬氨酸或在位置26的亮氨酸的氨基酸的丙氨酸突变体转染的EL4细胞系，因为表达水平非常低(数据未显示)。跨物种特异性单链抗体和嵌合IgG形式的单链抗体与被人类CD3ε丙氨酸突变体转染的EL4细胞系的结合在图8（A-D）中被显示为以任意单位表示的从所有相应的几何平均荧光样品值减去相应的阴性对照的几何平均荧光值而得的相对结合。为了补偿不同的表达水平，特定的转染子的所有样品值然后除以相应的转染子的UCHT-1抗体的几何平均荧光值。为了与特异性的野生型样品值比较，相应的特异性的所有样品值最后除以野生型样品值，从而将野生型样品值设置为1个任意单位的结合。
使用的计算以下式详细显示：
在这个方程式中，“样品值”指的是任意单位的结合值，其描述特定的抗CD3抗体与如图8（A-D）所示特定的丙氨酸突变体的结合程度，“样品”指的是在特定的丙氨酸扫描转染子上测定的特异性抗CD3抗体获得的几何平均荧光值，“阴性对照”指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的阴性对照获得的几何平均荧光值，UCHT-1指的是在特定的丙氨酸突变体上测定的UCHT-1抗体获得的几何平均荧光值，WT指的是在野生型转染子上测定的特异性的抗CD3抗体获得的几何平均荧光值，x表示相应的转染子，y表示相应的抗CD3抗体并且wt表示相应的转染子是野生型。
如在图8(A-D)可见的，IgG抗体A2J HLP显示了对成熟CD3ε链在位置4的天冬酰胺、在位置23的苏氨酸和在位置25的异亮氨酸等氨基酸的结合的显著丧失。观察到IgG抗体A2JHLP对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和在位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的完全丧失。IgG抗体E2M HLP显示对成熟CD3ε链在位置4的天冬酰胺、在位置23的苏氨酸和在位置25的异亮氨酸等氨基酸的结合的显著丧失。IgG抗体E2MHLP显示对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和在位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的完全丧失。IgG抗体H2C HLP显示对成熟CD3ε链在位置4的天冬酰胺氨基酸的结合的中级丧失，且显示对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和在位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的完全丧失。单链抗体F12QHLP显示对成熟CD3ε链在位置1的谷氨酰胺、在位置2的天冬氨酸、在位置3的甘氨酸和成熟CD3ε链在位置5的谷氨酸等氨基酸的结合的基本完全丧失。
6.跨物种特异性抗CD3结合分子H2C HLP对转染到鼠T细胞系EL4的具有和不具有N末端His6标签的人类CD3ε链的结合分析
6.1.具有N末端6组氨酸标签(His6标签)的人类CD3ε链的克隆和表达
由基因合成获得了编码具有N末端His6标签的人类CD3ε链的cDNA片段。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，框中随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，框中随后是His6标签的编码序列，框中随后是成熟人类CD3ε链的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列为SEQ ID NO380和379)。基因合成片段还设计为在cDNA的始端和末端包含限制性位点。在5'末端引入的限制性位点EcoRI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后遵循标准方案经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-NEO的质粒(如上述的)。证实序列的质粒用于转染鼠T细胞系EL4。如上述的进行转染子的转染和选择。细胞培养34天后，转染子用于下述测定。
6.2.跨物种特异性抗CD3结合分子H2C HLP与具有和不具有N末端His6标签的人类CD3ε链的结合
检测了对CD3ε有特异性的具有所述结合特异性H2C HLP的嵌合IgG抗体对具有和不具有N末端His6标签的人类CD3ε的结合。根据标准方案，由FACS测定检测抗体对分别以His6-人类CD3ε和野生型人类CD3ε转染的EL4细胞系的结合。2.5×105个转染子细胞与50μl包含嵌合IgG抗体的细胞培养物上清液或含有2%FCS的50μl PBS中5μg/ml的相应的对照抗体孵化。分别使用合适的同种型对照作为阴性对照和使用CD3特异性抗体UCHT-1作为构建体表达的阳性对照。以含有2%FCS的PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab’)2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK)检测抗体结合。样品在FACSCalibur(BD biosciences,Heidelberg,Germany)上测量。与野生型人类CD3ε转染的EL4细胞系相比，检测到具有结合特异性H2C HLP的嵌合IgG对具有N末端His6标签的人类CD3ε的结合的清晰丧失。这些结果显示，CD3ε的自由N末端对于跨物种特异性抗CD3结合特异性H2C HLP对人类CD3ε链的结合是必需的(图9)。
7.由等离子体表面共振测量确定对于灵长类EGFR和灵长类CD3跨物种特异性的双特异性单链抗体(EGFR LH×H2C HLP)对融合蛋白1-27CD3-Fc的结合常数KD，与使用荧光激活细胞分选仪(FACS)测量的对表达CD3的PBMC的结合相比较
7.1.等离子体表面共振测量
为了确定完全跨物种特异性双特异性单链抗体EGFR-21-63LH×H2CHLP对人类CD3ε链N末端氨基酸1-27的结合亲和力，以由融合于人类IgG1的Fc部分的成熟人类CD3ε链的N末端氨基酸1-27组成的重组融合蛋白(1-27CD3-Fc)进行了表面等离子体共振测量。为此目的，将Biacore羧甲基-葡聚糖CM5芯片(Biacore,Uppsala,Sweden)安装在Biacore系统(Biacore,Uppsala,Sweden)上。由N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺溶液根据标准方案活化一个流动池（flow cell）。随后加入融合蛋白1-27CD3-Fc溶液，导致蛋白与Biacore芯片的葡聚糖层的稳定共价连接。通过充分洗涤除去未结合的蛋白，随后通过加入乙醇胺溶液封闭未反应的剩余NHS-活化的羧基。蛋白偶合的成功由检测到与偶合之前的信号相比作为响应单位测量的更高的信号所证实。如所述地准备了一个参比池（reference cell）但不加入蛋白溶液。
在微型透析装置(Pierce,Rockford-II,USA)中将纯化的双特异性抗体EGFR-21-63LH×H2C HLP对HBS-EP缓冲液(Biacore,UppsalaSweden)充分透析。透析后的蛋白浓度由UV280nm吸收确定，获得43μg/m的浓度。
将蛋白溶液转移到96孔板并用HBS-EP缓冲液以1:1比例连续稀释到另外10个孔中。
通过分别对所有11个孔取样，进行表面等离子体共振测量。在测量之间以乙酸盐缓冲液将所述流动池再生以释放结合的蛋白。
通过从与1-27CD3-Fc蛋白轭合的测量池（measurement cell）的信号减去参比池的信号而获得双特异性抗体分子的结合信号。测量作为响应单位的缔合曲线和解离曲线并记录。使用基于Langmuir模型的曲线拟合软件计算结合常数。
对前五个浓度确定计算的结合常数KD为1,52×10-7M。
7.2.以FACS测量确定CD3结合常数
为了检测跨物种特异性双特异性抗体分子就对天然人类CD3的结合强度而言的亲和力，进行了另外的饱和FACS结合分析。选择的双特异性抗体分子EGFR-21-63LH×H2C HLP用于建立1:1.5比例、初始浓度63.3μg/ml的稀释排列。双特异性抗体分子在这些不同浓度下分别与1.25×105个人类PBMC于4℃孵化1小时，随后是在PBS中在4℃的两个洗涤步骤。通过使用含有2%FCS的50μl PBS中5μg/ml的5His抗体(Qiagen GmbH,Hildesheim,Germany)，进行结合的双特异性抗体分子的检测。在4℃孵化45分钟和两个洗涤步骤之后，以含有2%FCS的PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab’)2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK)检测5His抗体的结合。流式细胞计量术在FACS-Canto II仪器上进行，FACS Diva软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。将获取的荧光强度平均值作为使用的双特异性抗体分子浓度的函数绘图并由生物数学软件Prism以一侧结合分析(双曲线)来分析。所述软件计算了相应的KD值，其描述配体(双特异性抗体分子)对受体(CD3阳性PBMC亚级分)遵循质量作用法则的结合。依据的式如下：Y=Bmax×X/(Kd+X)，其中Bmax是最大结合。KD是达到半-最大结合所需的配体浓度。FACS染色进行两份，R2值好于0.95。
对双特异性抗体分子EGFR-21-63LH×H2C HLP确定的半-最大结合在浓度为8472ng/ml时达到，这在给定的55000道尔顿的分子质量下对应于154nM(1.54×10-7M)(图10)。
因此，EGFR-21-63LH×H2C HLP对从其天然CD3背景分离的人类CD3ε链N末端氨基酸1-27的亲和力被证明等于EGFR-21-63LH×H2C HLP对完整T细胞上天然CD3的亲和力。
8.以人类EGFR转染的CHO细胞的产生
对人类EGFR阳性的细胞系A431(表皮样癌细胞系,CRL-1555,美国典型培养物保藏中心,Rockville,MD)用于获得根据试剂盒手册(Qiagen,RNeasy微型试剂盒,Hilden,Germany)的说明分离的总RNA。获得的RNA通过随机引物的逆转录用于cDNA合成。对于人类EGFR抗原全长序列的克隆，使用以下寡核苷酸：
5′EGFR AG XbaI
5′-GGTCTAGAGCATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGG-3′
3′EGFR AG SaII
5′-TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT-3′
通过PCR扩增编码序列(对于第一个循环，在94℃变性5min，在58℃退火1min，在72℃延伸2min；对于30个循环，在94℃变性1min，在58℃退火1min，在72℃延伸2min；在72℃末端延长5min)。随后以XbaI和SaII消化PCR产物，连接到合适地消化的表达载体pEF-DHFR(Raum等人,Cancer Immunol.Immunother.2001;50:141-150)，并转化到大肠杆菌。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NewYork(2001))。为了构建体的真核表达，将具有验证序列的核苷酸序列(SEQ ID370,氨基酸序列SEQ ID369)的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞。真核蛋白在DHFR缺陷型CHO细胞中的表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过将甲氨蝶呤(MTX)的浓度增加至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
9.表达食蟹猴EGFR的细胞外结构域的CHO细胞的产生
食蟹猴EGFR的细胞外结构域的cDNA序列通过对食蟹猴结肠cDNA(Cat#:C1534090-Cy-BC；从BioCat GmbH,Heidelberg,Germany获得)的一组两个PCR获得，其使用如下反应条件：在94℃3分钟的1个循环，随后是94℃1分钟，53℃1分钟和72℃2分钟的35个循环，随后是72℃3分钟的末端循环。使用如下引物：
1.正向引物：5′-CGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGC-3′
反向引物：5′-CCGTCTTCCTCCATCTCATAGC-3′
2.正向引物：5′-ACATCCGGAGGTGACAGATCACGGCTCGTGC-3′
反向引物：5′-CAGGATATCCGAACGATGTGGCGCCTTCGC-3′
那些PCR产生两个重叠片段(A：1-869，B：848-1923)，根据标准方案使用PCR引物将其分离和测序，并从而提供食蟹猴EGFR的cDNA序列的1923bp的部分，其中所述部分是从成熟蛋白密码子+1的第三个核苷酸到跨膜结构域的第21个密码子。为了产生表达食蟹猴EGFR的构建体，根据标准方案通过基因合成获得了cDNA片段(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ IDNO372和371)。在该构建体中，成熟EGFR蛋白氨基酸+2到+641的食蟹猴EGFR编码序列融合到人类EGFR的编码序列，从而代替氨基酸+2到+641的编码序列。基因合成片段还设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，和在实质上编码融合于人类EGFR跨膜和细胞内结构域的食蟹猴EGFR细胞外结构域的cDNA的始端和末端的限制性位点。而且，为了克隆目的，在氨基酸627(跨膜结构域的第4个氨基酸)引入保守突变，将缬氨酸突变为亮氨酸以产生限制性位点(SphI)。在5'末端引入的限制性位点XbaI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后经由XbaI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)。该质粒的证实序列的克隆用于如上述的转染CHO/dhfr-细胞。
10.EGFR和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生
10.1.跨物种特异性结合分子的克隆
通常地，按照下面表1中所列的来设计双特异性单链抗体分子，所述双特异性单链抗体分子各自包括对人类和非黑猩猩灵长类CD3ε跨物种特异性的具有结合特异性的结构域，以及对人类和非黑猩猩灵长类EGFR跨物种特异性的具有结合特异性的结构域：
表1：抗CD3和抗EGFR跨物种特异性双特异性单链抗体分子的型式
SEQ ID（核苷酸/蛋白质） 蛋白构建体的型式（N→C）
294/293 EGFR-21-63LH×H2C HL
296/295 EGFR-21-63LH×H2C HLP
302/301 EGFR-21-63LH×A2J HLP
298/297 EGFR-21-63LH×H1E HLP
306/305 EGFR-21-63LH×E2M HLP
308/307 EGFR-21-63LH×F7O HLP
864/863 EGFR-21-63LH×I2C HL
900/899 E291C4HL×I2C HL
898/897 E291C4HL×F12Q HL
896/895 E291C4HL×H2C HL
882/881 E291H8HL×I2C HL
918/917 E292F3HL×I2C HL
936/935 E98H5HL×I2C HL
932/931 E98H5HL×H2C HL
934/933 E98H5HL×F12Q HL
972/971 E97H9HL×I2C HL
970/969 E97H9HL×F12Q HL
968/967 E97H9HL×H2C HL
954/953 E98C3HL×I2C HL
952/951 E98C3HL×F12Q HL
950/949 E98C3HL×H2C HL
990/989 E97B11HL×I2C HL
988/987 E97B11HL×F12Q HL
986/985 E97B11HL×H2C HL
1018/1017 E12E3HL×I2C HL
1032/1031 E12B7HL×I2C HL
1046/1045 E12E6HL×I2C HL
1060/1059 E12F12HL×I2C HL
1004/1003 E13B4HL×I2C HL
1074/1073 E13H7HL×I2C HL
1088/1087 E13E6HL×I2C HL
1102/1101 E13E2HL×I2C HL
包含对人类和食蟹猴EGFR跨物种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是6组氨酸标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入合适限制性位点。引入的限制性位点用于如下克隆程序。基因合成片段还设计为引入合适的N和C末端限制性位点。根据标准方案(Sambrook,MolecularCloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)；第3版，Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer ImmunolImmunother50(2001)141-150)。具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以真核表达构建体。
根据标准方案，通过电穿孔将构建体稳定地或瞬时转染到DHFR缺陷型CHO细胞(ATCC编号：CRL9096)或可选地以瞬时方式转染到HEK293(人类胚肾细胞，ATCC号：CRL-1573)。
10.2.双特异性单链抗体分子的表达和纯化
双特异性单链抗体分子在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加MTX的终浓度达20nM而诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，细胞在有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺和0.1%Pluronic F-68;HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集。离心除去细胞，并将包含表达的蛋白的上清液储存在-20℃。可选地，构建体瞬时表达在HEK293细胞中。根据制造商的方案以293fectin试剂(Invitrogen,#12347-019)进行转染。
Explorer系统(GE Health Systems)和软件用于色谱。根据制造商提供的方案，使用负载有ZnCl2的Fractogel EMD (Merck)进行固定的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)。以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl,0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：
步骤1：6柱体积的20%缓冲液B
步骤2：6柱体积的100%缓冲液B
汇集步骤2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐,200mM细胞溶素,5%甘油,pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。使洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印迹进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒,Sigma MW GF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。
在还原条件下使用SDS PAGE分析纯化的双特异性单链抗体蛋白，其中所述SDSPAGE以预制的4-12%Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行。根据制造商提供的方案，进行样品制备和应用。以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为>95%。
如PBS中凝胶过滤确定的，双特异性单链抗体在天然条件下具有约52kDa的分子量。根据该方法纯化所有构建体。
根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印迹。使用的抗体是针对His标签(5His,Qiagen)和以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig，且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性单链抗体的单个条带。
11.由表面等离子体共振测量确定完全跨物种特异性双特异性单链抗体对融合蛋白1-27CD3-Fc的结合常数KD
为了确定对灵长类EGFR和灵长类CD3具有跨物种特异性的双特异性单链抗体分子对成熟人类CD3ε链N末端氨基酸1-27的结合亲和力，以由融合于人类IgG1的Fc部分的人类CD3ε链的N末端氨基酸1-27组成的重组融合蛋白(1-27CD3-Fc)进行表面等离子体共振测量。为此目的，将Biacore羧甲基-葡聚糖CM5芯片(Biacore,Uppsala,Sweden)安装在Biacore系统(Biacore,Uppsala,Sweden)上。由N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺溶液根据标准程序活化一个流动池。随后加入融合蛋白1-27CD3-Fc溶液，导致蛋白与Biacore芯片的葡聚糖层的稳定共价连接。通过充分洗涤除去未结合的蛋白，随后通过加入乙醇胺溶液封闭剩余未反应的NHS活化的羧基。蛋白偶合的成功由检测到与偶合之前的信号相比作为响应单位测量的更高的信号所证实。如所述地准备了一个参比池但不加入蛋白溶液。
以HBS-EP缓冲液(Biacore,Uppsala,Sweden)调整下列纯化的双特异性单链抗体到5μg/ml并转移到96孔板，各孔体积150μl。
对所有样品进行表面等离子体共振测量，且测量之间以乙酸盐缓冲液再生流动池以释放结合的蛋白(都根据标准方案)。
通过从与1-27CD3-Fc蛋白轭合的测量池的信号减去参比池的信号而获得双特异性单链抗体的结合信号。
测量作为响应单位的缔合曲线和解离曲线并记录。使用基于Langmuir模型的曲线拟合软件计算结合常数。检测的完全跨物种特异性双特异性单链分子对人类CD3εN末端氨基酸1-27的计算的亲和力以KD值在以下提供，且范围从2,54×10-6M到2,49×10-7M。“LH”是指可变结构域以VL-VH顺序的排列。“HL”是指可变结构域以VH-VL顺序的排列。G4H、F70、A2J、E1L、E2M、H1E和F6A是指不同的跨物种特异性CD3结合分子。
12.EGFR和CD3跨物种特异性双特异性抗体的流式细胞计量术结合分析
为了检测跨物种特异性双特异性抗体构建体关于分别对人类和食蟹猴EGFR和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。为此目的，如实施例8描述的以人类EGFR转染的CHO细胞和人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)用于检测对人类抗原的结合。使用如实施例9描述的产生的食蟹猴EGFR转染子和猕猴T细胞系4119LnPx(由Fickenscher教授,Hygiene Institute,Virology,Erlangen-Nuernberg友情提供；发表于Knappe A等人，和Fickenscher H.,Blood2000,95,3256-61)检测对食蟹猴抗原的结合反应性。各细胞群的200.000个细胞与50μl跨物种特异性双特异性抗体构建体的纯化的蛋白(2μg/ml)在冰上孵化30min。可选地，使用瞬时产生的蛋白的细胞培养物上清液。以PBS洗涤细胞两次，以鼠5His抗体(Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测构建体的结合。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。新鲜培养基用作阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
对EGFR特异性和对人类和非黑猩猩灵长类CD3跨物种特异性的若干种双特异性单链分子的结合能力是清楚地可检测的，如图11所示。在FACS分析中，对比于作为阴性对照的培养基以及第一和第二检测抗体，所有构建体显示与CD3和EGFR结合。证明了双特异性抗体对人类和食蟹猴CD3和EGFR抗原的跨物种特异性。
13.EGFR和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体的生物活性
使用实施例8和9所述的EGFR阳性细胞系通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。分别使用刺激的人类CD8阳性T细胞或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。
刺激的CD8+T细胞的产生如下进行：
培养皿(145mm直径,Greiner)以可购买获得的抗CD3特异性抗体在1μg/ml的终浓度在37℃预包被1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将120ml RPMI1640/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并再培养一天。通过耗尽CD4+T细胞和CD56+NK细胞而分离CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
靶细胞以PBS洗涤两次并以含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11,1MBq51Cr在37℃标记45分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定，E:T比为10:1。施加1μg/ml的跨物种特异性双特异性单链抗体分子和其20个三倍稀释物。可选地，瞬时产生的蛋白的细胞培养物上清液以1:2步骤连续稀释。测定时间是18小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPadSoftware Inc.,San Diego,California,USA)进行。如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。通过分析程序计算的EC50值用于比较生物活性。
如图12和13所示，所有产生的跨物种特异性双特异性单链抗体构建体揭示了由人类CD8+细胞引起的针对人类EGFR阳性靶细胞的和由猕猴T细胞系4119LnPx引起的针对食蟹猴EGFR阳性靶细胞的细胞毒性。具有不同靶特异性的双特异性单链抗体用作阴性对照。
14.人类MCSP的C末端、跨膜和截短的细胞外结构域的克隆和表达
根据标准方案由基因合成获得了人类MCSP的C末端、跨膜和截短的细胞外结构域(氨基酸1538-2322)的编码序列(用于表达人类MCSP的C末端、跨膜和截短的细胞外结构域(称为人类D3)的重组构建体的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO374和373)。该基因合成片段设计为首先包含允许构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，框中随后是FLAG标签，框中随后是包含若干个为了克隆目的的限制性位点并编码9个氨基酸的人工连接体(SRTRSGSQL)的序列，框中随后是人类MCSP的C末端、跨膜和截短的细胞外结构域以及终止密码子的编码序列。限制性位点引入到DNA片段的始端和末端。在5'末端的限制性位点EcoRI和在3'末端的限制性位点SaII用于如下克隆程序。遵循标准方案，以EcoRI和SaII消化片段并克隆到pEF-DHFR(pEF-DHFR描述于Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)。证实序列的质粒用于转染CHO/dhfr-细胞(ATCC编号：CRL9096)。在37℃、95%湿度和7%CO2的培养箱中，细胞在含有稳定的谷氨酰胺的RPMI1640中培养，其中所述RPMI1640补充有10%FCS、1%青霉素/链霉素(都从Biochrom AGBerlin,Germany 获得)和来自细胞培养级试剂储备溶液的核苷(Sigma-Aldrich ChemieGmbH,Taufkirchen,Germany)到终浓度为10μg/ml腺苷、10μg/ml脱氧腺苷和10μg/ml胸苷。根据制造商的方案，使用PolyFect转染试剂(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)和5μg质粒DNA进行转染。培养24小时后以PBS洗涤细胞一次并再次培养在含有稳定的谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI1640中。因此，细胞培养基不包含核苷并从而对转染的细胞施加选择。转染后大约14天观察到长出抗性细胞。再过7至14天后由FACS分析来检测转染子的构建体表达。2.5×105个细胞与在含有2%FCS的PBS中稀释到5μg/ml的50μl抗Flag-M2抗体(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany)孵化。使用在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab')2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(ImmunoResearch Europe Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK)检测抗体的结合。样品在FACScalibur(BD biosciences,Heidelberg,Germany)上测量。
15.猕猴MCSP的C末端、跨膜和截短的细胞外结构域的克隆和表达
猕猴MCSP的C末端、跨膜和截短的细胞外结构域(称为猕猴D3)的cDNA序列通过对猕猴皮肤cDNA(产品目录号C1534218-Cy-BC;BioCat GmbH,Heidelberg,Germany)的一组三个PCR而获得，其使用如下反应条件：1个循环为94℃3min.，40个循环为94℃0.5min.、52℃0.5min和72℃1.75min.，末端循环为72℃3min.。使用如下引物：
正向引物：5′-GATCTGGTCTACACCATCGAGC-3′
反向引物：5′-GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG-3′
正向引物：5′-TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG-3′
反向引物：5′-CGATCAGCATCTGGGCCCAGG-3′
正向引物：5′-GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC-3′
反向引物：5′-GCCTTCACACCCAGTACTGGCC-3′
那些PCR产生三个重叠片段(A：1-1329、B：1229-2428、C：1782-2547)，根据标准方案使用PCR引物将其分离和测序，从而提供猕猴MCSP的cDNA序列的2547bp的部分(猕猴MCSP该部分的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO376和375)，其中所述2547bp的部分是从C末端结构域的编码序列上游74bp到终止密码子下游121bp。使用另一个PCR来融合前面提到的反应A和B的PCR产物，其使用如下反应条件：在94℃3min的1个循环，94℃1min，52℃1min和72℃2.5min的10个循环，72℃3min的末端循环。使用如下引物：
正向引物：
5′-tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg-3′
反向引物：5′-agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg-3′
用于该PCR的引物设计为在编码猕猴MCSP的C末端、跨膜和截短的细胞外结构域的cDNA片段的始端和末端引入限制性位点。在5'末端引入的限制性位点MfeI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后通过代替人类MCSP的C末端、跨膜和截短的细胞外结构域，经MfeI和SaII将PCR片段克隆到包含上述质粒pEF-DHFR的EcoRI/MfeI片段的Bluescript质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)。基因合成片段包含免疫球蛋白前导肽和Flag标签以及人工连接体(SRTRSGSQL)的编码序列，其中所述人工连接体在框中连接到编码猕猴MCSP的C末端、跨膜和截短的细胞外结构域的cDNA片段的5'末端。该载体用于转染CHO/dhfr-细胞(ATCC编号：CRL9096)。在37℃、95%湿度和7%CO2的培养箱中，细胞在含有稳定的谷氨酰胺的RPMI1640中培养，其中所述RPMI1640补充有10%FCS、1%青霉素/链霉素(都从Biochrom AG Berlin,Germany获得)和来自细胞培养级试剂的储备溶液的核苷(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany)到终浓度为10μg/ml腺苷、10μg/ml脱氧腺苷和10μg/ml胸苷。根据制造商的方案，使用PolyFect转染试剂(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)和5μg质粒DNA进行转染。培养24小时后，以PBS洗涤细胞一次并再次培养在含有稳定的谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI1640中。因此，细胞培养基不包含核苷并从而对转染的细胞施加选择。转染后大约14天观察到长出抗性细胞。再过7至14天后由FACS检测转染子的重组构建体表达。2.5×105个细胞与在含有2%FCS的PBS中稀释到5μg/ml的50μl抗Flag-M2抗体(Sigma-Aldrich ChemieGmbH,Taufkirchen,Germany)孵化。使用在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab')2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch Europe Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK)检测结合的抗体。样品在FACScalibur(BD biosciences,Heidelberg,Germany)上测量。
16.MCSP和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生和表征
如下表2中所列的设计了双特异性单链抗体分子，其各自包含对人类和非黑猩猩灵长类CD3ε具有跨物种特异性的结合结构域以及对人类和非黑猩猩灵长类MCSP具有跨物种特异性的结合结构域：
表2：MCSP和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体的型式
包含对人类和猕猴MCSP D3跨物种特异性的可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的VH和VL结构域的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是组氨酸6-标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为引入合适的N和C末端限制性位点。根据标准方案(Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NewYork(2001))，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)。根据标准方案，通过电穿孔将构建体稳定地或瞬时转染到DHFR-缺陷型CHO细胞(ATCC编号：CRL9096)或可选地以瞬时方式转染到HEK293(人类胚肾细胞,ATCC编号：CRL-1573)。
在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)MethodsEnzymol.185,537-566所述的进行。通过添加增加浓度的甲氨蝶呤(MTX)达终浓度20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，使细胞在有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%Pluronic F-68;HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集。通过离心除去细胞，将包含表达的蛋白的上清液储存在-20℃。
Explorer系统(GE Health Systems)和软件用于色谱。根据制造商提供的方案，使用负载有ZnCl2的Fractogel EMD(Merck)进行固定的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)。以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl,0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：
步骤1：6柱体积的20%缓冲液B
步骤2：6柱体积的100%缓冲液B
汇集步骤2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐,200mM赖氨酸,5%甘油,pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。将洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印记进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒,Sigma MW GF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。
在还原性条件下使用SDS PAGE分析纯化的双特异性单链抗体蛋白，其中所述SDSPAGE以预制的4-12%Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行。根据制造商提供的方案，进行样品制备和应用。以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为>95%。
如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中凝胶过滤确定的，双特异性单链抗体在天然条件下具有约52kDa的分子量。根据该方法纯化所有构建体。
根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印记。为了检测双特异性单链抗体蛋白抗体，使用抗His标签抗体(5His,Qiagen)。以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig抗体用作二抗，且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性单链抗体的单个条带。
可选地，将构建体在DHFR缺陷型CHO细胞中瞬时表达。简言之，转染前一天，在37℃、95%湿度和7%CO2的培养箱中，将每构建体的4×105个细胞在含有稳定的谷氨酰胺的3mlRPMI1640完全培养基中培养，其中所述RPMI1640完全培养基补充有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和来自细胞培养级试剂的储备溶液的核苷(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany)到终浓度为10μg/ml腺苷、10μg/ml脱氧腺苷和10μg/ml胸苷。根据制造商的方案以Fugene6转染试剂(Roche,#11815091001)进行转染。将94μl OptiMEM培养基(Invitrogen)和6μl Fugene6混合并在室温孵化5分钟。随后，对于每种构建体加入1.5μgDNA，混合并在室温孵化15分钟。同时，以1×PBS洗涤DHFR缺陷型CHO细胞并重悬于1.5mlRPMI1640完全培养基。以600μl RPMI1640完全培养基稀释转染混合物，加入到细胞并在37℃、95%湿度和7%CO2孵化过夜。转染后次日，将各方法的孵化体积扩充到5ml RPMI1640完全培养基。孵化3天后，收集上清液。
17.MCSP和CD3跨物种特异性双特异性抗体的流式细胞计量术结合分析
为了检测跨物种特异性双特异性抗体构建体关于分别对人类和猕猴MCSP D3和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。为此目的，以人类MCSP D3转染的CHO细胞(如实施例14所述)和人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)用于检测对人类抗原的结合。通过使用产生的猕猴MCSP D3转染子(实施例15中描述)和猕猴T细胞系4119LnPx(由Fickenscher教授,Hygiene Institute,Virology,Erlangen-Nuernberg友情提供；发表于Knappe A等人和Fickenscher H.,Blood2000,95,3256-61)检测对猕猴抗原的结合反应性。各细胞系的200.000个细胞与50μl跨物种特异性双特异性抗体构建体的纯化的蛋白(2μg/ml)或表达跨物种特异性双特异性抗体构建体的转染的细胞的细胞培养物上清液在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测构建体的结合。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的CHO细胞的上清液用作结合于T细胞系的阴性对照。具有无关靶特异性的单链构建体用作结合于MCSP-D3转染的CHO细胞的阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
对MCSP D3具有跨物种特异性和对人类和猕猴CD3具有跨物种特异性的上述单链分子的双特异性结合是清楚地可检测的，如图14、15、16和58所示。在FACS分析中，与对应的阴性对照相比，所有构建体显示对CD3和MCSP D3的结合。证明了该双特异性抗体对人类和猕猴CD3以及MCSPD3抗原的跨物种特异性。
18.MCSP和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体的生物活性
使用实施例14和15所述的MCSP D3阳性细胞系通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。如各图所示，使用刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC、刺激的人类PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。
刺激的CD4/CD56耗尽的PBMC的产生如下进行：
培养皿(145mm直径,Greiner bio-one GmbH,Kremsmünster)的包被以终浓度1μg/ml的可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Othoclone)在37℃进行1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的120ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。根据标准方案，通过耗尽CD4+T细胞和CD56+NK细胞而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
靶细胞以PBS洗涤两次并以含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11.1MBq51Cr在37℃标记45分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板中以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定，E:T比为10:1。施加1μg/ml的跨物种特异性双特异性单链抗体分子和其20个三倍稀释物。如果使用包含跨物种特异性双特异性单链抗体分子的上清液，对于猕猴和人类细胞毒性测定分别施加其21个两倍和20个三倍稀释物。测定时间是18小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中的铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad Software Inc.,SanDiego,California,USA)进行。如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。通过分析程序计算的EC50值用于比较生物活性。
如图17至21和59所示，所有产生的跨物种特异性双特异性单链抗体构建体证明了由刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC或刺激的PBMC引起的针对人类MCSP D3阳性靶细胞的细胞毒性活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引起的针对猕猴MCSP D3阳性靶细胞的细胞毒性活性。
19.MCSP和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体的血浆稳定性
通过将双特异性单链抗体在37℃和4℃在50%人类血浆中孵化24小时随后测试生物活性而分析所产生的双特异性单链抗体在人类血浆中的稳定性。使用MCSP阳性CHO细胞系(表达如根据实施例14或15克隆的MCSP)作为靶和刺激的人类CD8阳性T细胞作为效应细胞，在铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定中研究了生物活性。
由如上所述的分析程序计算的EC50值用于比较与50%人类血浆分别在37℃和4℃孵化24小时的双特异性单链抗体和未加入血浆或在测定之前即刻与相同量血浆混合的双特异性单链抗体的生物活性。
如图22和表3所示，与未加入血浆或在测试生物活性之前即刻加入血浆的对照相比，G4H-L×I2C H-L、G4H-L×H2C H-L和G4H-L×F12Q H-L双特异性抗体的生物活性未显著减少。
表3：无血浆或加入血浆的双特异性抗体的生物活性
20.在循环靶细胞不存在下通过首先暴露于针对常规即背景依赖性CD3表位的CD3结合分子重新分布循环T细胞是与开始治疗相关的不良事件的主要风险因素
以常规CD3结合分子开始治疗后患有B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的患者中的T细胞重新分布
常规CD19×CD3结合分子是双特异性串联scFv型式的CD3结合分子(Loffler(2000,Blood,第95卷,第6期)或WO99/54440)。它由针对(i)正常和恶性人类B细胞表面上的CD19和(ii)人类T细胞上的CD3的两个不同结合部分组成。通过将T细胞上的CD3与B细胞上的CD19交联，该构建体通过T细胞的细胞毒性活性触发了正常和恶性B细胞重定向裂解。这种常规CD3结合分子识别的CD3表位位于CD3ε链，在此处仅当其被埋入ε链其余部分并通过ε链与CD3γ或δ链异二聚化而保持在正确位置时才会采取正确构象。这种高度背景依赖性表位与常规CD3结合分子的相互作用(参见如，Loffler(2000,Blood,第95卷,第6期)或WO99/54440)可诱导CD3构象的变构改变，甚至当其以纯粹单价方式发生而无任何交联时也如此，这种相互作用导致了CD3ε胞质结构域内本来隐藏的脯氨酸-富集区的暴露。暴露后，脯氨酸-富集区可募集信号转导分子Nck2，其能够触发进一步的细胞内信号。尽管这对于完全T细胞活化是不足够的，原因是完全T细胞活化确切地要求交联T细胞表面上的若干个CD3分子，例如通过B细胞表面上的若干个CD19分子来将结合的若干个抗CD3分子交联于T细胞上的若干个CD3分子，但是常规CD3结合分子对CD3ε上其背景依赖性表位的纯粹单价相互作用对于T细胞在信号传导方面来说仍是无活性的。不受限于理论，单价常规CD3结合分子(本领域已知的)当注入到人类时可诱导一些T细胞反应，甚至在没有循环靶细胞可用于CD3交联的那些情形。静脉内输注单价常规CD19×CD3结合分子到基本上没有循环CD19阳性B细胞的B-NHL患者的重要T细胞反应是开始治疗后T细胞的重新分布。已在I期临床试验中发现，该T细胞反应发生在无循环CD19阳性靶B细胞的所有个体中静脉内CD19×CD3结合分子输注的初始阶段期间，基本上独立于CD19×CD3结合分子剂量(图23)。然而，已发现CD19×CD3结合分子暴露的突然增加在这些患者中触发了与治疗开始时最初暴露T细胞于CD19×CD3结合分子几乎相同的重新分布的T细胞反应(图24A)，甚至逐渐增加的CD19×CD3结合分子暴露仍可对循环T细胞具有重新分布效应(图25)。而且，已发现在100%的所有治疗个体中不存在循环靶细胞的情况下被常规CD3结合分子如CD19×CD3结合分子(如，WO99/54440公开的)触发的这种基本上剂量-独立的重新分布的T细胞反应是关于开始治疗的不良事件的主要风险因素。
根据研究方案，在开放标记的、多中心I期患者间剂量升高试验中，招募了患有包括外套细胞淋巴瘤的复发的组织学证实的无痛B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的患者。研究方案由所有参与中心的独立伦理学委员会批准并通知负责的管理当局。CT扫描证明的可测量的疾病(至少一个损害≥1.5cm)是纳入到研究中所需的。患者通过以便携式微型泵系统以恒定流速(即剂量水平)在四周内连续静脉内输注来接受常规的CD19×CD3结合分子。在治疗前两周患者住院，之后从医院解散并继续在家治疗。对四周后无疾病进展迹象的患者提供继续治疗另外四周。迄今检测了未达到最大耐受剂量(MTD)的六个不同的剂量水平：0.5、1.5、5、15、30和60μg/m2/24h。观察各由三名患者组成的组是否没有研究方案定义为DLT的不良事件(剂量限制性毒性)。在前三名患者中出现一例DLT的情形下，将组扩大到六名患者，这在不存在第二例DLT时允许进一步的剂量升高。因此，在3名患者的组中无DLT或6名患者的组中有一例DLT的剂量水平认为是安全的。在发展DLT的所有患者中终止研究治疗。在15μg/m2/24h和30μg/m2/24h时，在几个另外的组中检测了前24h期间治疗开始的不同模式：(i)5μg/m2/24h持续前24h后逐步增加到15μg/m2/24h的维持剂量(患者组15-逐步)，(ii)平稳连续增加流速，从几乎零到15μg/m2/24h或30μg/m2/24h(患者组15-坡度和30-坡度)和(iii)从最开始以维持剂量开始(患者组15-平坦、30-平坦和60-平坦)。剂量水平0.5、1.5和5μg/m2/24h的患者组都从最开始以维持剂量开始(即平坦开始)。
外周血中绝对B细胞计数和T细胞计数的时程由如下四色FACS分析确定：
收集血液样品和例行分析
使用包含EDTA的VacutainerTM管(Becton Dickinson)，在患者组15-坡度、15-平坦、30-坡度、30-平坦和60-平坦中，于开始输注前和开始输注CD19×CD3结合分子(如WO99/54440公开的)0.75、2、6、12、24、30、48小时后以及在治疗第8、15、17、22、24、29、36、43、50、57天和结束常规CD19×CD3结合分子输注4周后获得血液样品(6ml)，其在4℃运输用于分析。在患者组15-逐步中，开始输注前和开始输注CD19×CD3结合分子6、24、30、48小时后以及在治疗第8、15、22、29、36、43、50、57天和结束CD19×CD3结合分子输注4周后获得血液样品(6ml)。在剂量水平0.5、1.5和5μg/m2/24h时，开始输注前和开始输注CD19×CD3结合分子6、24、48小时后以及在治疗第8、15、22、29、36、43、50、57天和结束CD19×CD3结合分子输注4周后获得血液样品(6ml)。在一些情况下由于操作原因，这些时间点发生轻微变动。淋巴细胞亚群的FACS分析在血液样品收集后24-48h内进行。血液样品中白细胞亚群的绝对数经过以Coulter计数器TM(Coulter)差异血液分析确定。
从血液样品分离PBMC
PBMC(外周血单核细胞)分离由修改的FicollTM梯度分离方案进行。在室温转移血液到预装有3ml BiocollTM溶液(Biochrom)的10ml LeucosepTM管(Greiner)。在摆动式转子（swing-out rotor）中以1700×g和22℃进行离心15min不减速。分离BiocollTM层上方的PBMC，以FACS缓冲液(PBS/2%FBS[胎牛血清;Biochrom])洗涤一次，离心并重悬于FACS缓冲液。所有洗涤步骤期间的离心在摆动式转子中以800×g和4℃进行4min。如果需要，通过在3ml红细胞裂解缓冲液(8.29g NH4Cl,1.00g KHCO3,0.037g EDTA,ad1.0I H2Obidest,pH7.5)中在室温孵化分离的PBMC5min进行红细胞的裂解，随后是以FACS缓冲液的洗涤步骤。
以针对细胞表面分子的荧光标记的抗体染色PBMC
单克隆抗体从Invitrogen(1产品目录号：MHCD1301,2产品目录号：MHCD1401)、Dako(5产品目录号：C7224)或Becton Dickinson(3产品目录号：555516,4产品目录号：345766)获得，根据制造商的建议使用。以如下抗体组合染色5×105-1×106个细胞：抗CD131/抗CD142(FITC)×抗CD563(PE)×抗CD34(PerCP)×抗CD195(APC)。细胞在V形96孔多滴定板(Greiner)中成团，并除去上清液。将细胞团重悬于FACS缓冲液稀释的包含特异性抗体的总体积100μl中。黑暗中在4℃进行孵化30min。随后，以FACS缓冲液洗涤样品两次并将细胞团重悬于FACS缓冲液用于流式细胞计量术分析。
由FACS流式细胞计量术检测染色的淋巴细胞
数据收集以4色BD FACSCaliburTM(Becton Dickinson)进行。对于每次测量，获取确定的淋巴细胞亚群的1×104个细胞。以程序CellQuest ProTM(Becton Dickinson)进行统计分析以获得淋巴细胞亚群百分比并对细胞表面分子表达强度进行分类。随后，将FACS确定的单淋巴细胞子集相对于总淋巴细胞(即B加T加NK细胞，由CD13/14染色排除任何骨髓细胞)的百分比与来自差异血液分析的淋巴细胞计数关联以计算T细胞(CD3+、CD56-、CD13/14-)和B细胞(CD19+、CD13/14-)的绝对细胞数。
在治疗开始时基本上没有循环CD19阳性B细胞的所有患者中，以常规CD19×CD3结合分子(如，WO99/54440公开的)治疗初始阶段的T细胞重新分布显示在(图23)。为了比较，在具有显著数目循环CD19阳性B细胞的患者中CD19×CD3结合分子治疗初始阶段的T细胞重新分布的代表性实例显示在图26。
在两种情况(即基本上无循环B细胞或有许多循环B细胞)中，治疗开始后循环T细胞计数快速减少。然而，在不存在循环B细胞时，T细胞倾向于很早回到循环血液，而T细胞回到治疗开始时具有显著数目循环B细胞的患者的循环血液通常被延迟，直到这些循环B细胞被耗尽。因此，T细胞重新分布模式的主要不同在于循环血液中T细胞重现的动力学。
在治疗4周后和在接受另外4周治疗的患者治疗8周后，以及在所有的情况治疗结束后四周，通过中心参照放射进行基于CT扫描的效力评估。所有已知损害(包括脾肿大)的消失和/或大小正常化加上在骨髓浸润的情况中从淋巴瘤细胞清除骨髓，计为完全响应(CR)。各种预定义的靶损害的两个最大直径的值的和(SPD)从基线减少至少50%定义为部分响应(PR)；减少至少25%认为是最小响应(MR)。进行性疾病(PD)定义为SPD从基线增加≥50%。SPD从基线偏差+50%到-25%认为是稳定的疾病(SD)。
34名患者中患者的统计数据、接受的剂量和临床结果概述于表4。CD19×CD3结合分子的临床抗肿瘤活性清楚地是剂量依赖性的：从5μg/m2/24h向上观察到一致地从外周血耗尽循环CD19阳性B(淋巴瘤)细胞。在15μg/m2/24h和30μg/m2/24h记录到第一次客观的临床响应(PR和CR)以及从浸润的骨髓部分和完全消除B淋巴瘤细胞的病例。最终，在60μg/m2/24h，响应率增加到100%(PR和CR)，并且在所有可评价的病例中从B淋巴瘤细胞的骨髓清除是完全的。
CD19×CD3结合分子被大多数患者良好耐受。不论因果，34名患者中1-4级的最频繁的不良事件概述于表5。CD19×CD3结合分子相关的不良事件通常是暂时和完全可逆的。尤其是，有2名基本上无循环CD19阳性B细胞的患者(表4中患者#19和#24)的治疗在早期终止，由于在CD19×CD3结合分子输注初始阶段期间重复的T细胞重新分布相关的CNS不良事件(主要症状：精神混乱和定向障碍)。
这些患者中的一个(#19)在组15-逐步中。他在前24h接受5μg/m2/24hCD19×CD3结合分子，随后突然增加到15μg/m2/24h的维持剂量。相应的T细胞重新分布模式显示以5μg/m2/24h开始输注时循环T细胞计数快速降低，随后是基本上无循环CD19阳性B细胞的循环血液中T细胞的早期重现。结果是，24h后当CD19×CD3结合分子剂量从5μg/m2/24h增加到15μg/m2/24h时外周T细胞计数已经完全恢复。因此剂量步进可触发T细胞重新分布的第二事件，如显示于图24A。这种重复的T细胞重新分布与该患者中的CNS副作用(主要症状：精神混乱和定向障碍)相关，这导致终止输注。重复的T细胞重新分布和这种CNS不良事件之间的关联也在此前各以重复的弹丸输注2至4小时接受CD19×CD3结合分子(如，WO99/54440公开的)、通常随后是2天无治疗间隔的B-NHL患者的I期临床试验中观察到(图24B)。每一个单次弹丸输注触发一次T细胞重新分布事件，该重新分布事件由循环T细胞计数快速减少和下次弹丸输注之前T细胞恢复组成。总之，与重复的T细胞重新分布有关的CNS不良事件在21名患者中的5名观察到。图24B显示弹丸输注试验的一名患者的代表性实例，其在第三次T细胞重新分布事件后发展CNS症状。一般，在弹丸输注试验中具有CNS不良事件的患者还具有低循环B细胞计数。
连续输注试验的第二名患者(#24)在组15-平坦中，其治疗由于在CD19×CD3结合分子输注初始阶段重复的T细胞重新分布相关的CNS不良事件(主要症状：精神混乱和定向障碍)而在早期终止。该患者错误地接受CD19×CD3结合分子输注而没有稳定药物所需的另外的HSA。所造成的不平稳的药物流触发了T细胞重新分布的重复事件而不是仅仅一次(图27A)，结果是因为发展CNS症状而不得不终止输注。然而，当同一患者以包含用于药物稳定的另外HSA的CD19×CD3结合分子溶液(如，WO99/54440公开的)正确地重新开始时，未观察到重复的T细胞重新分布，且患者不再发展任何CNS症状(图27B)。因为该患者基本上也没有循环B细胞，所以循环T细胞可与快速重新分布动力学作用甚至在药物暴露中发生不明显的改变，如观察到的。基本上无循环靶细胞的患者中与T细胞重新分布有关的CNS不良事件可通过T细胞粘着于内皮细胞的短暂增加、随后是循环T细胞大量同时粘着到血管壁，造成如观察到的循环血液中T细胞数连续下降来解释。T细胞大量同时粘着到血管壁可导致内皮渗透性和内皮细胞活化增加。内皮渗透性增加的结果是体液从血管内隔室转移到包括CNS间质组织的间质组织隔室。粘着的T细胞活化内皮细胞可具有促凝血效应(Monaco等人，JLeukoc Biol71(2002)659-668)，可能扰乱血流(包括大脑血流)，尤其是关于毛细血管微循环。因此，在基本上无循环靶细胞的患者中与T细胞重新分布相关的CNS不良事件可以是经由T细胞粘着于内皮细胞而导致的毛细血管泄漏和/或毛细血管微循环扰乱的结果。由T细胞重新分布的一次事件导致的内皮应激被大多数患者耐受，而由重复的T细胞重新分布导致的增强的内皮应激常常导致CNS不良事件。仅在具有低基线计数的循环T细胞的患者中，多于一次的T细胞重新分布事件才可能为较低风险的。然而，在对这种事件易感性增加的罕见情况中，由一次T细胞重新分布事件导致的有限的内皮应激也可导致CNS不良事件，如在以CD19×CD3结合分子弹丸输注试验的21名患者中的1名观察到的。
不受限于理论，在基本上无循环靶细胞的患者中T细胞粘着于内皮细胞的短暂增加可通过对常规CD3结合分子如CD19×CD3结合分子(如，WO99/54440)与CD3ε上其背景依赖性表位的单价相互作用，导致CD3构象的变构改变随后是如上述的募集Nck2于CD3ε胞质结构域的T细胞反应来解释。由于Nck2经由PINCH和ILK直接连接于整联蛋白(图28)，故在经由常规CD3结合分子如CD19×CD3结合分子与CD3ε上其背景依赖性表位结合而使得CD3构象变构改变之后，Nck2向CD3ε胞质结构域的募集可通过经由内外信号传导将T细胞表面上的整联蛋白瞬时转换为其更粘着的同工型来增加T细胞对内皮细胞的粘着。
表4.患者统计数据和临床结果
*通过Cheson标准，中心证实的完全(CR)和部分(PR)响应是粗体；MR，最小响应(≥25%至<50%)；SD，稳定的疾病；PD，进行性疾病；距初次记录响应的持续时间在括号中；+表示正在响应
a组4扩大为研究三种不同的初始治疗疗程
b在7周的无治疗间隔后以相同剂量另外治疗周期4周后，PR在治疗8周后转为CR
n.e.：不可评价，因为治疗阶段<7d
n.d.：不确定(浸润、但治疗结束时未进行第二次活检)
n.i.：治疗开始时未浸润
表5.治疗期间观察到的不良事件发生率
使用的缩写是：AE，不良事件；AP，碱性磷酸酶；LDH，乳酸脱氢酶；CRP，C-反应性蛋白；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；GGT，γ-谷氨酰转移酶；AE未包括来自患者34另外的治疗周期的数据。
如上所解释的，能够结合于背景依赖性表位的常规CD3结合分子(如，WO99/54440公开的)尽管为功能性的但导致患者中不期望的T细胞重新分布效应，产生CNS不良事件。相反，本发明的结合分子通过结合于CD3ε链的背景独立的N末端1-27氨基酸，不导致这种T细胞重新分布效应。因此，与常规CD3结合分子相比，本发明的CD3结合分子与更好的安全性概况有关。
21.通过识别表面靶抗原诱导T细胞介导的靶细胞裂解的本发明双特异性CD3结合分子在体内耗尽靶抗原阳性细胞
将CD33识别为靶抗原的本发明双特异性CD3结合分子从食蟹猴外周血耗尽CD33阳性循环单核细胞
CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL(氨基酸序列：SEQ ID NO.415)通过使用编码核苷酸序列SEQ ID NO.416在CHO细胞中表达而产生。(i)包含埋入Kozak共有序列的起始密码子的N末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)C末端His6标签随后是终止密码子的编码序列两者都符合读框地连接于核苷酸序列SEQ ID NO416，随后将通过基因合成获得的所得的DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等人，Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)的多个克隆位点。如所述地进行DHFR缺陷型CHO细胞的稳定转染，分泌CD3结合分子CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL到培养物上清液的DHFR阳性转染子的选择，以及使用密都锭(methotrexat)的基因扩增以增加表达水平(Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)。处理食蟹猴的测试材料在20升发酵罐中产生。从3次生产运转的收获物纯化蛋白是基于靶向CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL C末端His6标签的IMAC亲和色谱，随后是制备型尺寸排阻色谱(SEC)。最终无内毒素的测试材料的总产量是60mg。用于食蟹猴的CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL的分析的SEC概况揭示，测试材料几乎专门地由单体组成。在如实施例23.5所述的细胞毒性测定中测量测试材料的效能，其使用以食蟹猴CD33转染的CHO细胞作为靶细胞，猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞源(图29)。通过效应T细胞达到半-最大靶细胞裂解所需的CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL浓度(EC50)经确定为2.7ng/ml。
年轻(大约3岁大)的成年食蟹猴(食蟹猕猴Macaca fascicularis)通过在不同流速(即剂量水平)连续静脉内输注CD3结合分子CD33-AF5VH-VL×I2CVH-VL处理以研究从外周血耗尽循环CD33阳性单核细胞。这种情况等价于以常规CD3结合分子CD19×CD3(对B细胞上的CD19和T细胞上的CD3特异性的)治疗具有循环CD19阳性靶B细胞的B-NHL患者(参见如，WO99/54440)。从外周血耗尽循环CD19阳性靶B细胞已经被证明是常规CD3结合分子(如WO99/54440提供的CD19×CD3)在患有CD19阳性B细胞恶性肿瘤如B-NHL的患者中的大体临床效力的有效替代物。类似地，从外周血耗尽循环CD33阳性单核细胞被认为是本发明针对CD33的双特异性CD3结合分子如CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL在患有CD33阳性骨髓恶性肿瘤如AML(急性髓细胞性白血病)的患者中的大体临床效力的有效替代物。
连续输注根据Swivel方法如下进行：使用静脉导管对猴经股静脉插导管到尾大静脉。该导管皮下通到肩背区并外置在近尾部的肩胛骨。随后将管穿过套和保护弹簧。把套围绕动物固定，并且所述导管经由管连接于输注泵。
开始治疗前将无测试材料的施用溶液(1.25M赖氨酸,0.1%吐温80,pH7)以48ml/24h连续输注7天以允许动物适应输注条件。通过以待检测的各单独剂量水平所需的量(即CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL的流速)将CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL测试材料加入到施用溶液而开始治疗。在整个适应和治疗期每天更换输注储器。计划的治疗持续时间是7天，除了在120μg/m2/24h剂量水平动物接受14天的治疗。
循环T细胞和CD33阳性单核细胞的绝对计数的时程分别由4-或3-色FACS分析确定：
收集血液样品和例行分析
使用包含EDTA的VacutainerTM管(Becton Dickinson)，在开始输注前和开始连续输注MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL0.75、2、6、12、24、30、48、72小时后以及在治疗7和14天后(以及以120μg/m2/24h的剂量水平9天后)获得血液样品(1ml)，其在4℃运输用于分析。在一些情况下由于操作原因，这些时间点发生轻微变动。淋巴细胞亚群的FACS分析在血液样品收集后24-48h内进行。血液样品中白细胞亚群的绝对数经例行兽医实验室中差异血液分析确定。
从血液样品分离PBMC
PBMC(外周血单核细胞)分离由修改的FicollTM梯度分离方案进行。在室温转移血液到预装有1ml BiocollTM溶液(Biochrom)的5ml FalconTM管。在摆动式转子中以1700×g和22℃进行离心15min不减速。分离BiocollTM层上方的PBMC，以FACS缓冲液(PBS/2%FBS[胎牛血清;Biochrom])洗涤一次，离心并重悬于FACS缓冲液。所有洗涤步骤期间的离心在摆动式转子中以800×g和4℃进行4min。如果需要，通过在3ml红细胞裂解缓冲液(8.29g NH4Cl,1.00g KHCO3,0.037g EDTA,ad1.0I H2Obidest,pH7.5)中在室温孵化分离的PBMC5min进行红细胞的裂解，随后是以FACS缓冲液的洗涤步骤。
以针对细胞表面分子的荧光标记的抗体染色PBMC
与食蟹猴抗原反应的单克隆抗体从Becton Dickinson(1产品目录号：345784,2产品目录号：556647,3产品目录号：552851,6产品目录号：557710)、Beckman Coulter(4产品目录号：IM2470)和Miltenyi(5产品目录号：130-091-732)获得，根据制造商的建议使用。以如下抗体组合染色5×105-1×106个细胞：抗CD141(FITC)×抗CD562(PE)×抗CD33(PerCP)×抗CD194(APC)和抗CD141(FITC)×抗CD335(PE)×抗CD166(Alexa Fluor647TM)。细胞在V形96孔多滴定板(Greiner)中成团，并除去上清液。将细胞团重悬于FACS缓冲液稀释的包含特异性抗体的总体积100μl中。黑暗中在4℃进行孵化30min。随后，以FACS缓冲液洗涤样品两次并将细胞团重悬于FACS缓冲液用于流式细胞计量术分析。
由FACS流式细胞计量术检测染色的淋巴细胞
数据收集以4色BD FACSCaliburTM(Becton Dickinson)进行。对于每次测量，获取确定的淋巴细胞亚群的1×104个细胞。以程序CellQuest ProTM(Becton Dickinson)进行统计分析以获得淋巴细胞亚群百分比并对细胞表面分子表达强度进行分类。随后，将FACS确定的单淋巴细胞子集相对于总淋巴细胞(即B加T加NK细胞，由CD14染色排除骨髓细胞)的百分比与来自差异血液分析的淋巴细胞计数关联以计算T细胞(CD3+、CD56-、CD14-)的绝对细胞数。CD33阳性单核细胞的绝对数通过将来自差异血液分析的单核细胞计数乘以FACS确定的CD33阳性单核细胞(CD33+、CD14+)对所有单核细胞(CD14+)的相应的比而计算。
以CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL治疗结束时，在具有从30μg/m2/24h经60μg/m2/24h和240μg/m2/24h到1000μg/m2/24h的组间剂量升高的2只食蟹猴的4组中，绝对循环CD33阳性单核细胞计数与基线(即100%)相比的百分比显示在图30A。
如图30A所示，连续静脉内输注CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL以剂量依赖性方式诱导循环CD33阳性单核细胞的耗尽。虽然在30μg/m2/24h仍然没有循环CD33阳性单核细胞的可检测的耗尽，但是在60μg/m2/24h治疗7天后CD33阳性单核细胞计数减少的第一个趋势变得可见。在240μg/m2/24h治疗3天后循环CD33阳性单核细胞几乎完全从外周血耗尽。在1000μg/m2/24h这甚至更快达到，其中从外周血耗尽循环CD33阳性单核细胞在治疗1天后已经完全。这一发现由图30B所示的结果证实，证明在以CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL在120μg/m2/24h连续输注治疗14天的两只食蟹猴中，与相应的基线相比，循环CD33阳性单核细胞耗尽三分之二和50%。
该结果大体上而言是本发明CD3结合分子临床效力的清楚预兆，具体而言是本发明的双特异性针对CD33的CD3结合分子用于治疗CD33阳性恶性肿瘤如AML临床效力的清楚预兆。而且，如图26所示，在循环靶细胞(即CD33阳性单核细胞)存在下以CD33-AF5VH-VL×I2C VH-VL治疗的初始阶段期间的T细胞重新分布看起来比以常规CD19×CD3构建体治疗的初始阶段期间T细胞重新分布较不显著，如WO99/54440中对具有显著数的循环靶细胞(即CD19阳性B细胞)的B-NHL患者所描述的。尽管在开始CD19×CD3输注后T细胞完全从循环消失并不再重新出现，直到循环CD19阳性靶B细胞从外周血耗尽(图26)，但是开始CD33-AF5VH-VL×I2CVH-VL输注后循环T细胞最初的消失是不完全的且在循环CD33阳性靶细胞仍存在期间T细胞计数恢复(图30B)。这证实本发明的CD3结合分子(针对人类和非黑猩猩灵长类CD3ε(ε)链表位并产生，为氨基酸序列的部分或片段或全长，如SEQ ID NO.2、4、6或8提供的)通过识别背景独立的CD3表位，显示比识别背景依赖性CD3表位的常规CD3结合分子如WO99/54440提供的结合分子更有利的T细胞重新分布概况。
22.针对基本上背景独立的CD3表位的本发明CD3结合分子通过在循环靶细胞不存在下引起循环T细胞较少的重新分布而减少与开始治疗有关的不良事件风险
以本发明代表性跨物种特异性CD3结合分子开始治疗后食蟹猴中T细胞重新分布减少
MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL(氨基酸序列：SEQ ID NO.313)通过使用编码核苷酸序列SEQ ID NO.314在CHO细胞中表达而产生。(i)包含埋入Kozak共有序列的起始密码子的N末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)C末端His6标签随后是终止密码子的编码序列两者都符合读框地连接于核苷酸序列SEQ ID NO314，随后将通过基因合成获得的所得的DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等人，Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)的多个克隆位点。如所述地进行DHFR缺陷型CHO细胞的稳定转染，分泌CD3结合分子MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL到培养物上清液的DHFR阳性转染子的选择，以及使用密都锭的基因扩增以增加表达水平(Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)。处理食蟹猴的测试材料在200升发酵罐中产生。从收获物纯化蛋白是基于靶向MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL C末端His6标签的IMAC亲和色谱，随后是制备型尺寸排阻色谱(SEC)。最终无内毒素的测试材料的总产量是40mg。测试材料由70%单体、30%二聚体和少量污染的更高多聚体组成。在如实施例18所述的细胞毒性测定中测量测试材料的效能，其使用以食蟹猴MCSP转染的CHO细胞作为靶细胞，猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞源(图31)。通过效应T细胞达到半-最大靶细胞裂解所需的MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL浓度(EC50)经确定为1.9ng/ml。
年轻(大约3岁大)的成年食蟹猴(食蟹猕猴Macaca fascicularis)通过在不同流速(即剂量水平)连续静脉内输注CD3结合分子MCSP-G4VH-VL×I2CVH-VL处理以研究不存在循环靶细胞时开始治疗后循环T细胞的重新分布。尽管CD3结合分子MCSP-G4VH-VL×I2CVH-VL可识别食蟹猴MCSP和食蟹猴CD3两者，但是没有表达MCSP的循环血液细胞。因此，循环血液中可能的唯一相互作用是MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL的CD3特异性臂与T细胞上的CD3的结合。这种情况等价于以常规CD3结合分子(对B细胞上的CD19和T细胞上的CD3特异性的CD19×CD3结合分子)治疗不具有循环CD19阳性靶B细胞的B-NHL患者，如实施例20所述的。
连续输注根据Swivel方法如下进行：使用静脉导管对猴经股静脉插导管到尾大静脉。该导管皮下通到肩背区并外置在近尾部的肩胛骨。随后将管穿过套和保护弹簧。把套围绕动物固定，并且所述导管经由管连接于输注泵。
开始治疗前将无测试材料的施用溶液(1.25M赖氨酸,0.1%吐温80,pH7)以48ml/24h连续输注7天以允许动物适应输注条件。通过以待检测的各单独剂量水平所需的量(即MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL的流速)将MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL测试材料加入到施用溶液而开始治疗。在整个适应和治疗期每天更换输注储器。治疗持续时间是7天。
外周血中绝对T细胞计数的时程由如下四色FACS分析确定：
收集血液样品和例行分析
使用包含EDTA的VacutainerTM管(Becton Dickinson)，在开始输注前和开始连续输注MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL0.75、2、6、12、24、30、48、72小时后以及在治疗7天后获得血液样品(1ml)，其在4℃运输用于分析。在一些情况下由于操作原因，这些时间点发生轻微变动。淋巴细胞亚群的FACS分析在血液样品收集后24-48h内进行。血液样品中白细胞亚群的绝对数经例行兽医实验室中差异血液分析确定。
从血液样品分离PBMC
PBMC(外周血单核细胞)分离由修改的FicollTM梯度分离方案进行。在室温转移血液到预装有1ml BiocollTM溶液(Biochrom)的5ml FalconTM管。在摆动式转子中以1700×g和22℃进行离心15min不减速。分离BiocollTM层上方的PBMC，以FACS缓冲液(PBS/2%FBS[胎牛血清;Biochrom])洗涤一次，离心并重悬于FACS缓冲液。所有洗涤步骤期间的离心在摆动式转子中以800×g和4℃进行4min。如果需要，通过在3ml红细胞裂解缓冲液(8.29gNH4Cl,1.00g KHCO3,0.037g EDTA,ad1.0I H2Obidest,pH7.5)中在室温孵化分离的PBMC5min进行红细胞的裂解，随后是以FACS缓冲液的洗涤步骤。
以针对细胞表面分子的荧光标记的抗体染色PBMC
与食蟹猴抗原反应的单克隆抗体从Becton Dickinson(1产品目录号：345784,2产品目录号：556647,3产品目录号：552851)和Beckman Coulter(4产品目录号：IM2470)获得，根据制造商的建议使用。以如下抗体组合染色5×105-1×106个细胞：抗CD141(FITC)×抗CD562(PE)×抗CD33(PerCP)×抗CD194(APC)。细胞在V形96孔多滴定板(Greiner)中成团，并除去上清液。将细胞团重悬于FACS缓冲液稀释的包含特异性抗体的总体积100μl中。黑暗中在4℃进行孵化30min。随后，以FACS缓冲液洗涤样品两次并将细胞团重悬于FACS缓冲液用于流式细胞计量术分析。
由FACS流式细胞计量术检测染色的淋巴细胞
数据收集以4色BD FACSCaliburTM(Becton Dickinson)进行。对于每次测量，获取确定的淋巴细胞亚群的1×104个细胞。以程序CellQuest ProTM(Becton Dickinson)进行统计分析以获得淋巴细胞亚群百分比并对细胞表面分子表达强度进行分类。随后，将FACS确定的单淋巴细胞子集相对于总淋巴细胞(即B加T加NK细胞，由CD14染色排除骨髓细胞)的百分比与来自差异血液分析的淋巴细胞计数关联以计算T细胞(CD3+、CD56-、CD14-)的绝对细胞数。
以MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL在60、240和1000μg/m2/24h的剂量水平治疗初始阶段期间，食蟹猴中的T细胞重新分布显示在图32。这些动物在治疗初始阶段期间根本不显示任何T细胞重新分布的迹象，即在治疗开始时T细胞计数增加而不是减少。考虑到以针对背景依赖性CD3表位的常规CD3结合分子(如，WO99/54440描述的CD19×CD3构建体)开始治疗时，在无循环靶细胞的100%的所有患者中一致地观察到T细胞重新分布，这证明了在循环靶细胞不存在下以针对人类和非黑猩猩灵长类CD3ε链表位并产生的本发明CD3结合分子开始治疗时可观察到大致较少的T细胞重新分布，其中本发明的CD3结合分子由SEQ ID NO:2、4、6或8任一氨基酸序列或其片段限定。这与针对背景依赖性CD3表位的CD3结合分子如WO99/54440描述的构建体明显不同。如(除其它以外)SEQ ID NO:2、4、6或8任一(或这些序列的片段)提供的针对背景独立的CD3表位的结合分子提供了这种大致较少的(有害和不期望的)T细胞重新分布。因为以CD3结合分子治疗初始阶段期间T细胞重新分布是CNS不良事件的主要风险因素，所以本文提供的并能够识别背景独立的CD3表位的CD3结合分子具有超过本领域已知的并且针对背景依赖性CD3表位的CD3结合分子的实质益处。事实上，以MCSP-G4VH-VL×I2C VH-VL治疗的食蟹猴没有显示CNS症状的任何迹象。
CD3表位的背景独立性在本发明提供并对应于CD3ε的前27个N末端氨基酸或该27个氨基酸段的片段。该背景独立的表位从CD3复合体中其天然环境取出并融合于异源氨基酸序列而不失去其结构完整性。本文提供并针对背景独立的CD3表位产生(和针对)的抗CD3结合分子提供了关于T细胞重新分布的令人惊讶的临床改进，并因此提供了更有益的安全性概况。不受限于理论，由于其CD3表位是背景独立的，其形成自主的自给自足的亚结构域而不太影响CD3复合体的其余部分，因此本文提供的CD3结合分子比识别背景依赖性CD3表位如WO99/54440中提供的分子的常规CD3结合分子(如WO99/54440中提供的分子)诱导CD3构象的较少变构改变。结果是(再次不受限于理论)，本文提供的CD3结合分子对细胞内NcK2募集的诱导也减少，导致T细胞整联蛋白的同工型转换较少和T细胞粘着于内皮细胞较少。基本上由单体分子组成的本发明CD3结合分子(针对本文定义的背景独立的表位和针对本文定义的背景独立的表位产生)的制品是优选的。这些单体分子在避免T细胞重新分布和因此在治疗初始阶段期间CNS不良事件的风险方面甚至更有效(比二聚体或多聚体分子)。
23.CD33和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生和表征
23.1.表达人类CD33的CHO细胞的产生
根据标准方案由基因合成获得了GenBank公开的人类CD33的编码序列(登录号NM_001772)。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是成熟人类CD33蛋白的编码序列，框中随后是丝氨酸甘氨酸二肽、组氨酸6-标签和终止密码子的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO525和526)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。所引入的限制性位点，即在5'末端的EcoRI和在3'末端的SaII用于如下克隆程序。遵循标准方案，经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,Cancer Immunol.Immunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
23.2.表达猕猴CD33细胞外结构域的CHO细胞的产生
猕猴CD33的cDNA序列由对来自根据标准方案制备的猕猴骨髓的cDNA的一组3个PCR获得。使用如下反应条件：在94℃3分钟的1个循环，随后是94℃1分钟、53℃1分钟和72℃2分钟的35个循环，随后是72℃3分钟的末端循环，并使用如下引物：
3.正向引物：
5′-gaggaattcaccatgccgctgctgctactgctgcccctgctgtgggcaggggccctggctatgg-3′
反向引物：5′-gatttgtaactgtatttggtacttcc-3′
4.正向引物：5′-attccgcctccttggggatcc-3′
反向引物：5′-gcataggagacattgagctggatgg-3′
5.正向引物：5′-gcaccaacctgacctgtcagg-3′
反向引物：5'-agtgggtcgactcactgggtcctgacctctgagtattcg-3'
那些PCR产生三个重叠片段，根据标准方案使用PCR引物将其分离和测序，并从而提供猕猴CD33从成熟蛋白密码子+2的第二核苷酸到密码子+340的第三核苷酸的cDNA序列的一部分。为了产生表达猕猴CD33的构建体，根据标准方案通过基因合成获得了cDNA片段(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO527和528)。在该构建体中，从成熟CD33蛋白的氨基酸+3到+340的猕猴CD33的编码序列融合到人类CD33的编码序列，从而代替氨基酸+3到+340的人类编码序列。基因合成片段还设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点和包含编码实质上猕猴CD33的全细胞外结构域、猕猴CD33跨膜结构域和猕猴-人类嵌合细胞内CD33结构域的cDNA的片段的始端和末端的限制性位点。在5'末端引入的限制性位点XbaI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后经由XbaI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,Cancer Immunol.Immunother50(2001)141-150)。该质粒的证实序列的克隆用于如上所述地转染CHO/dhfr-细胞。
23.3.CD33和CD3跨物种特异性双特异性抗体分子的产生
跨物种特异性结合分子的克隆
通常，如下表6中所列的来设计双特异性抗体分子，其中所述双特异性抗体分子各自包含具有对人类和非黑猩猩灵长类CD3ε跨物种特异性的结合特异性的结构域以及具有对人类和非黑猩猩灵长类CD33跨物种特异性的结合特异性的结构域：
表6：抗CD3和抗CD33跨物种特异性双特异性分子的型式
包含对人类和猕猴CD33跨物种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的CD3特异性VH和VL组合的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性抗体分子的编码序列，框中随后是组氨酸6-标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入合适限制性位点。引入的限制性位点用于如下克隆程序。根据标准方案，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer ImmunolImmunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,MolecularCloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
双特异性抗体分子的表达和纯化
双特异性抗体分子在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过加入增加浓度的MTX达20nM MTX的终浓度而诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，使细胞在有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%Pluronic F-68;HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集。离心除去细胞，将包含表达的蛋白的上清液储存在-20℃。可选地，构建体瞬时表达在HEK293细胞中。根据制造商的方案以293fectin试剂(Invitrogen,#12347-019)进行转染。
Explorer系统(GE Health Systems)和软件用于色谱。根据制造商提供的方案，使用负载有ZnCl2的Fractogel EMD(Merck)进行固定的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)。以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl,0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：
步骤1：6柱体积的20%缓冲液B
步骤2：6柱体积的100%缓冲液B
汇集步骤2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐,200mM赖氨酸,5%甘油,pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。将洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印记进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒,Sigma MW GF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。
在还原性条件下使用SDS PAGE分析纯化的双特异性抗体蛋白，其中所述SDS PAGE以预制的4-12%Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行。根据制造商提供的方案，进行样品制备和应用。以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为>95%。
如PBS中的凝胶过滤所确定的，双特异性抗体在天然条件下具有约52kDa的分子量。根据该方法纯化所有构建体。
根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印记。为了检测双特异性抗体蛋白抗体，使用了抗His标签抗体(5His,Qiagen)。以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig抗体用作二抗，且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性抗体的单个条带。
23.4.CD33和CD3跨物种特异性双特异性抗体的流式细胞计量术结合分析
为了检测跨物种特异性双特异性抗体构建体关于分别对人类和猕猴CD33和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。为此目的，如实施例23.1所述的以人类CD33转染的CHO细胞和人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)用于检测对人类抗原的结合。使用如实施例23.2描述的产生的猕猴CD33转染子和猕猴PBMC(根据标准方案通过对来自猕猴的外周血的Ficoll梯度离心进行猕猴PBMC的制备)检测对猕猴抗原的结合反应性。各PBMC细胞系的200.000个细胞与50μl跨物种特异性双特异性抗体构建体的纯化的蛋白(5μg/ml)或表达跨物种特异性双特异性抗体构建体的转染的细胞的细胞培养物上清液在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测构建体的结合。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的CHO细胞的上清液用作阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
本发明CD3结合分子的人类和非黑猩猩灵长类CD3的特异性结合是清楚地可检测的，如图33所示。在FACS分析中，与对应的阴性对照相比，所有构建体显示结合于CD3和CD33。证明了双特异性抗体对人类和猕猴CD3和CD33抗原的跨物种特异性。
23.5.CD33和CD3跨物种特异性双特异性抗体的生物活性
使用实施例23.1和23.2所述的CD33阳性细胞系通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定来分析所产生的双特异性抗体的生物活性。如各图所示，使用刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。
刺激的人类PBMC的产生如下进行：
培养皿(85mm直径,Nunc)以可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Othoclone)在1μg/ml的终浓度在37℃包被1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的50ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。
靶细胞以PBS洗涤两次并以含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11.1MBq51Cr在37℃标记45分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板中以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定，E:T比为10:1。施加1μg/ml的跨物种特异性双特异性抗体分子和其20个三倍稀释物。测定时间是18小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(Perkin ElmerLife Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)进行。如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。通过分析程序计算的EC50值用于比较生物活性。
如图34所示，所有产生的跨物种特异性双特异性构建体证实了由刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC引起的针对人类CD33阳性靶细胞的细胞毒性活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引起的针对猕猴CD33阳性靶细胞的细胞毒性活性。
24.CAIX和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生和表征
24.1表达人类CAIX的CHO细胞的产生
根据标准方案，由基因合成获得了GenBank公开的人类CAIX的编码序列(登录号NM_001216)。基因合成片段设计为包含包括其前导肽的人类CAIX蛋白的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO604和605)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。所引入的限制性位点，即在5'末端的XbaI和在3'末端的SaII用于如下克隆程序。遵循标准方案，经由XbaI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,Cancer Immunol.Immunother(50)2001141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)MethodsEnzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
24.2表达猕猴CAIX的CHO细胞的产生
根据标准方案，由基因合成获得了GenBank公开的猕猴CAIX的编码序列(登录号XM_001088481)。基因合成片段设计为包含包括其前导肽的猕猴CAIX蛋白的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO606和607)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。所引入的限制性位点，即在5'末端的XbaI和在3'末端的SaII用于如下克隆程序。遵循标准方案，经由XbaI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,Cancer Immunol.Immunother(50)2001141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;ALaboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)MethodsEnzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
24.3CAIX和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生
跨物种特异性结合分子的克隆
通常，如下表7中所列的来设计双特异性单链抗体分子，其中所述双特异性单链抗体分子各自包含具有对人类和非黑猩猩灵长类CD3ε跨物种特异性的结合特异性的结构域以及具有对人类和非黑猩猩灵长类CAIX跨物种特异性的结合特异性的结构域：
表7：抗CD3和抗CAIX跨物种特异性双特异性单链抗体分子的型式
包含对人类和猕猴CAIX跨物种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的CD3特异性VH和VL组合的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是6组氨酸标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入合适限制性位点。引入的限制性位点用于如下克隆程序。根据标准方案，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer ImmunolImmunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,MolecularCloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
24.4.双特异性单链抗体分子的表达和纯化
双特异性单链抗体分子在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过加入增加浓度的MTX达20nM MTX的终浓度而诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，使细胞在有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%PluronicF-68;HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集。通过离心除去细胞，并将包含表达的蛋白的上清液储存在-20℃。可选地，构建体瞬时表达在HEK293细胞中。根据制造商的方案，以293fectin试剂(Invitrogen,#12347-019)进行转染。
Explorer系统(GE Health Systems)和软件用于色谱。根据制造商提供的方案，使用负载有ZnCl2的Fractogel EMD(Merck)进行固定的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)。以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl,0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：
步骤1：6柱体积的20%缓冲液B
步骤2：6柱体积的100%缓冲液B
汇集步骤2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐,200mM赖氨酸,5%甘油,pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。将洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印记进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒,Sigma MW GF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。
在还原性条件下使用SDS PAGE分析纯化的双特异性单链抗体蛋白，其中所述SDSPAGE以预制的4-12%Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行。根据制造商提供的方案，进行样品制备和应用。以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为>95%。
如PBS中的凝胶过滤所确定的，双特异性单链抗体在天然条件下具有约52kDa的分子量。根据该方法纯化所有构建体。
根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印记。为了检测双特异性单链抗体蛋白抗体，使用了抗His标签抗体(5His,Qiagen)。以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig抗体用作二抗，且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性单链抗体的单个条带。
24.5CAIX和CD3跨物种特异性双特异性抗体的流式细胞计量术结合分析
为了检测跨物种特异性双特异性抗体构建体关于分别对人类和猕猴CAIX和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。为此目的，如实施例24.1所述的以人类CAIX转染的CHO细胞和人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)用于检测对人类抗原的结合。通过使用如实施例24.2所述的产生的猕猴CAIX转染子和猕猴T细胞系4119LnPx(由Fickenscher教授,Hygiene Institute,Virology,Erlangen-Nuernberg友情提供；发表于Knappe A等人和Fickenscher H.,Blood2000,95,3256-61)检测对猕猴抗原的结合反应性。各细胞系的200.000个细胞与50μl的跨物种特异性双特异性抗体构建体的纯化的蛋白(2μg/ml)或表达跨物种特异性双特异性抗体构建体的转染的细胞的细胞培养物上清液在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测构建体的结合。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的CHO细胞的上清液用作结合于T细胞系的阴性对照。具有无关靶特异性的单链构建体用作结合于CAIX转染的CHO细胞的阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
以上列出的对CAIX具有跨物种特异性的和对人类和非黑猩猩灵长类CD3具有跨物种特异性的单链分子的双特异性结合是清楚地可检测的，如图35所示。在FACS分析中，与相应的阴性对照相比，所有构建体显示结合于CD3和CAIX。证明了双特异性抗体对人类和非黑猩猩灵长类CD3和CAIX抗原的跨物种特异性。
24.6CAIX和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体的生物活性
使用实施例24.1和24.2所述的CAIX阳性细胞系通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。如各图所示，使用刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC、刺激的人类PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。
刺激的人类PBMC的产生如下进行：
培养皿(145mm直径,Greiner)以可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Othoclone)在1μg/ml的终浓度在37℃包被1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的120ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。
刺激的CD4/CD56耗尽的PBMC的产生如下进行：
培养皿(145mm直径,Greiner)以可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Othoclone)在1μg/ml的终浓度在37℃包被1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的120ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。根据标准方案，通过耗尽CD4+T细胞和CD56+NK细胞而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
靶细胞以PBS洗涤两次并以含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11.1MBq51Cr在37℃标记45分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板中以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定，如各图所示不同的E:T比为从5:1至50:1。施加1μg/ml的跨物种特异性双特异性单链抗体分子和其20个三倍稀释物。测定时间是16小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中的铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)进行。如通过软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。通过分析程序计算的EC50值用于比较生物活性。
如图36所示，所有产生的跨物种特异性双特异性单链抗体构建体揭示了由刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC或刺激的PBMC引起的针对人类CAIX阳性靶细胞的细胞毒性活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引起的针对猕猴CAIX阳性靶细胞的细胞毒性活性。
25.EpCAM和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生和表征
EpCAM-特异性双特异性抗体的构建
构建EpCAM-特异性双特异性抗体的基础是完全人类的EpCAM特异性抗体HD69(Raum等人，Cancer Immunol Immunother(2001)50:141ff)。根据标准方法从HD69DNA PCR扩增VH和VL。随后根据标准方案将VH和VL克隆到质粒，从而形成功能scFv(方向VH-连接体-VL)。随后使用引物PCR扩增该scFv构建体，从而引入可用于功能克隆到双特异性抗体型式(5'-HD69-BsrG1：5'-gacaggtgtacactccgaggtgcagctgctcgagtctgg-3'；3'-HD69-BspE1：5'-tgatagtccggatttgatctccagcttggtcc-3')的N末端BsrGI和C末端BspE1限制性位点。随后将PCR产物克隆到三个合适的表达载体(分别是H2C HL、F12Q HL和I2C)，从而编码三个功能双特异性构建体HD69HL×H2C HL、HD69HL×F12Q HL和HD69HL×I2C HL，其中所述三个合适的表达载体各自包含一个对人类和猕猴CD3具有跨物种特异性的CD3特异性VH和VL组合。随后根据标准方案，通过用于稳定转染的电穿孔将构建体转染到DHFR缺陷型CHO细胞，获得三种转染的细胞池，各池表达三种双特异性产物之一。
表8：包含人类-食蟹猴交叉特异性抗CD3部分的抗EpCAM双特异性单链抗体分子的 型式
由铬51释放的体外细胞毒性测定来分析所产生的双特异性单链抗体(在表达相应的双特异性构建体的CHO细胞的培养物上清液中)的生物活性，其使用了转染的EpCAM-阳性细胞系CHO-EpCAM(表达表面结合的人类EpCAM，公开于Raum等人，Cancer ImmunolImmunother(2001)50：141ff)作为靶细胞。使用刺激的人类CD8阳性T细胞作为效应细胞。如图37所示，所有产生的双特异性单链抗体构建体揭示了由人类CD8+细胞引起的针对人类EpCAM阳性靶细胞的细胞毒性活性。使用未转染的CHO细胞的培养物上清液作为阴性对照，其揭示没有可检测的细胞毒性。
为了证明产生的双特异性构建体对CD3臂的交叉特异性活性，进行了流式细胞计量术分析，其中证实构建体对表达人类CD3的细胞和表达猕猴CD3的细胞的结合。而且，检查了对EpCAM阳性细胞的特异性。
简言之，以人类EpCAM转染的CHO细胞和分离的人类PBMC中的人类CD3阳性T细胞用于检测对人类抗原的结合。通过使用猕猴T细胞系4119LnPx(由Fickenscher教授,HygieneInstitute,Virology,Erlangen-Nuernberg友情提供；发表于Knappe A等人和FickenscherH.,Blood2000,95,3256-61)检测对猕猴CD3抗原的结合反应性。各细胞系的200.000个细胞与表达CD3跨物种特异性双特异性抗体构建体的转染的细胞的细胞培养物上清液在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测构建体的结合。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的CHO细胞的上清液用作结合于T细胞系的阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
对人类EpCAM特异性的和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的单链分子的双特异性结合是清楚地可检测的，如图38所示。在流式细胞计量术分析中，与相应的阴性对照和EpCAM/CD3阴性CHO细胞系相比，所有构建体显示结合于CD3和EpCAM。
26EGFRvIII和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生和表征
26.1以人类EGFRvIII转染的CHO细胞的产生和表达
根据标准方案，由基因合成获得了包含细胞外结构域267个氨基酸缺失的突变体表皮生长因子受体(ΔEGFR、de2-7EGFR或EGFRvIII用作同义词)的C末端、跨膜和胞质结构域的编码序列(Kuan CT,Wikstrand CJ,Bigner DD：EGF mutant receptor vIII as amolecular target in cancer therapy(EGF突变体受体vIII在癌症治疗中作为分子靶);Endocr Relat Cancer.2001Jun;8(2):83-96)。基因合成片段设计为首先包含允许构建体的真核表达的Kozak位点，随后是24个氨基酸的前导肽的编码序列，框中随后是人类C末端细胞外结构域、跨膜和胞质结构域以及终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在DNA片段的始端和末端引入限制性位点。为了克隆目的，分别在5'和3'末端加入XbaI和SaII限制性酶识别位点。合成的基因DNA随后以XbaI和SaII消化，连接到合适地消化的表达载体pEF-DHFR，并转化到大肠杆菌。将具有验证的核苷酸序列的克隆(重组构建体的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO599和598)转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如上述的进行。
26.2食蟹猴EGFRvIII的产生和表达
类似于实施例26.1，通过缺失细胞外结构域的267个氨基酸并在融合位点(第6号氨基酸)插入新的氨基酸甘氨酸而产生食蟹猴EGFRvIII变体。基因合成片段设计为首先包含允许构建体的真核表达的Kozak位点，随后是24个氨基酸的前导肽的编码序列，框中随后是食蟹猴C末端细胞外结构域、跨膜和胞质结构域(两者都是人类的)以及终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在DNA片段的始端和末端引入限制性位点。在5'末端引入的限制性位点XbaI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。遵循标准方案，以XbaI/SaII消化片段并克隆到pEF-DHFR。证实序列的质粒用于转染CHO/dhfr-细胞(ATCC编号：CRL9096；在37℃、95%湿度和7%CO2的培养箱中，在含有从Biochrom AG Berlin,Germany获得的稳定的谷氨酰胺的RPMI1640中培养，其中所述RPMI1640补充有10%FCS、1%青霉素/链霉素(都从Biochrom AG Berlin,Germany获得)和从Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany获得的来自细胞培养级试剂的储备溶液的核苷到终浓度为10μg/ml腺苷、10μg/ml脱氧腺苷和10μg/ml胸苷)。根据制造商的方案，使用PolyFect转染试剂(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)和5μg质粒DNA进行转染。培养24小时后，以PBS洗涤细胞一次并再次培养在前述细胞培养基中，除了该培养基不补充核苷和使用透析的FCS(从Biochrom AG Berlin,Germany获得)。因此，细胞培养基不包含核苷并从而对转染的细胞施加选择。转染后大约14天观察到长出抗性细胞。再过7至14天后由FACS检测到转染子对构建体的表达为阳性。
26.3EGFRvIII和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生
通常，如下表9中所列的来设计双特异性单链抗体分子，其中所述双特异性单链抗体分子各自包含具有对人类和非黑猩猩灵长类CD3抗原的结合特异性的结构域以及具有对人类和非黑猩猩的灵长类EGFRvIII抗原的结合特异性的结构域：
表9：抗CD3和抗EGFRvIII跨物种特异性双特异性单链抗体分子的型式
包含对人类和食蟹猴EGFRvIII具有跨物种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域和对人类和猕猴CD3具有跨物种特异性的CD3特异性VH和VL组合的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是6组氨酸标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入合适限制性位点。引入的限制性位点用于如下克隆程序。根据标准方案，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。可选地，根据标准方案以瞬时方式将该构建体转染到DHFR缺陷型CHO细胞。
以人类EGFRvIII转染的CHO细胞系进行FACS结合实验以评价对人类EGFRvIII抗原的结合能力。通过采用以食蟹猴EGFRvIII转染的CHO细胞来检测对食蟹猴组织的跨物种特异性。细胞系的相同改变用于以EGFRvIII和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体进行的细胞毒性测定。除了这点以外，该测定如实施例4和5所述的进行。
如图39所示，证明了所产生的EGFRvIII和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体结合于人类和食蟹猴抗原两者并证明是完全跨物种特异性的。
如图40所示，所有产生的跨物种特异性双特异性单链抗体构建体揭示了由人类CD8+细胞引起的针对人类EGFRvIII阳性靶细胞的细胞毒性活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引起的针对食蟹猴EGFRvIII阳性靶细胞的细胞毒性活性。作为阴性对照，使用了无关的双特异性单链抗体。
27.IgE和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生和表征
27.1人类和猕猴膜结合形式的IgE的克隆和表达
小鼠细胞系J558L(从Interlab Project,lstituto Nazionale per Ia Ricercasul Cancro,Genova,Italy获得,ECACC88032902)是一种自发的失去重链的变体骨髓瘤细胞系，其合成和分泌λ轻链，用于分别地被人类和猕猴IgE膜结合的重链变体补充。为了产生这种构建体，根据标准方案由基因合成获得了合成的分子(构建体的核苷酸序列列在SEQID NO595和594)。在这些构建体中，人类和猕猴CD3ε链的编码序列分别融合于人类IgE的跨膜区。VH链的特异性创立为针对半抗原(4-羟基-3-硝基-苯基)乙酰基)(NP)。基因合成片段还设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点和包含免疫球蛋白前导序列以及在DNA的始端和末端的限制性位点。在5'末端引入的限制性位点EcoRI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于在克隆步骤中引入称为pEF-DHFR的表达质粒。序列验证后(猕猴：XM_001116734猕猴Macaca mulatta IgεC区，mRNA；人类：NC_000014智人染色体14，全序列，美国国家生物技术信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)，质粒用于如上所述地转染CHO/dhfr-细胞。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
27.2IgE和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生
通常，如下表10中所列的来设计双特异性单链抗体分子，其中所述双特异性单链抗体分子各自包含具有对人类和非黑猩猩灵长类CD3抗原的结合特异性的结构域以及具有对人类和非黑猩猩灵长类IgE抗原的结合特异性的结构域：
表10：抗CD3和抗IgE跨物种特异性双特异性单链抗体分子的型式
包含对人类和猕猴IgE跨物种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的CD3特异性VH和VL组合的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是6组氨酸标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入合适限制性位点。引入的限制性位点用于如下克隆程序。根据标准方案，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如KaufmannR.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。可选地，根据标准方案以瞬时方式将该构建体转染到DHFR缺陷型CHO细胞。
以人类IgE转染的J558L细胞系进行FACS结合实验以评价对人类IgE的结合能力。通过采用以猕猴IgE转染的J558L细胞来检测对猕猴IgE阳性细胞的跨物种特异性。细胞系的相同改变用于以IgE和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体进行的细胞毒性测定。J558L细胞系也用于以IgE和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体进行的细胞毒性测定。结合实验以及细胞毒性测定如上所述的进行。
如图41所示，证明了所产生的IgE和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体结合于人类和食蟹猴抗原两者并证明是完全跨物种特异性的。
如图42所示，所有产生的跨物种特异性双特异性单链抗体构建体揭示了由人类CD8+细胞引起的针对人类IgE阳性靶细胞的细胞毒性活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引起的针对猕猴IgE阳性靶细胞的细胞毒性活性。作为阴性对照，使用了无关的双特异性单链抗体。
28.CD44和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生和表征
28.1表达人类CD44的CHO细胞的产生
根据标准方案，由基因合成获得了GenBank公开的人类CD44(登录号AJ251595)并且还含有CD44v6外显子的编码序列。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是人类CD44蛋白和终止密码子的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO608和609)。基因合成片段还设计为在片段的始端和尾端引入限制性位点。所引入的限制性位点，即在5'末端的EcoRI和在3'末端的SaII用于如下克隆程序。遵循标准方案，经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,Cancer Immunol.Immunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
28.2表达无v6外显子的人类CD44的CHO细胞的产生
根据标准方案，由基因合成获得了GenBank公开的人类CD44(登录号AJ251595)并缺失编码v6外显子的序列的编码序列。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是无v6外显子的人类CD44蛋白和终止密码子的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO610和611)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。所引入的限制性位点，即在5'末端的EcoRI和在3'末端的SaII用于如下克隆程序。遵循标准方案，经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,Cancer Immunol.Immunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)MethodsEnzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
28.3表达猕猴CD44的CHO细胞的产生
根据标准方案，由基因合成获得了GenBank公开的猕猴CD44(登录号XM_001115359)并且还含有CD44v6外显子的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ IDNO612和613)。在所用构建体中，编码序列对应于猕猴CD44，除了在CD44蛋白信号肽第五氨基酸的密码子位置1的点突变，这导致相应于人类序列从精氨酸到色氨酸的突变。基因合成片段还设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点和在片段的始端和末端的限制性位点。在5'末端引入的限制性位点EcoRI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)。该质粒的证实序列的克隆用于如上所述地转染CHO/dhfr-细胞。
28.4CD44v6和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生
通常，如下表11中所列的来设计双特异性单链抗体分子，其中所述双特异性单链抗体分子各自包含具有对人类和非黑猩猩灵长类CD3ε跨物种特异性的结合特异性的结构域以及具有对人类和非黑猩猩灵长类CD44v6跨物种特异性的结合特异性的结构域：
表11：抗CD3和抗CD44v6跨物种特异性双特异性单链抗体分子的型式
包含对人类和猕猴CD44跨物种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的CD3特异性VH和VL组合的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是组氨酸6标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入合适限制性位点。引入的限制性位点用于如下克隆程序。根据标准方案，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer ImmunolImmunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,MolecularCloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
28.5双特异性单链抗体分子的表达和纯化
双特异性单链抗体分子在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过加入增加浓度的MTX达20nM MTX的终浓度而诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，使细胞在有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%PluronicF-68;HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集。通过离心除去细胞，并将包含表达的蛋白的上清液储存在-20℃。可选地，构建体瞬时表达在HEK293细胞中。根据制造商的方案，以293fectin试剂(Invitrogen,#12347-019)进行转染。
Explorer系统(GE Health Systems)和软件用于色谱。根据制造商提供的方案，使用负载有ZnCl2的Fractogel EMD(Merck)进行固定的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)。以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl,0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：
步骤1：6柱体积的20%缓冲液B
步骤2：6柱体积的100%缓冲液B
汇集步骤2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐,200mM赖氨酸,5%甘油,pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。将洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印记进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒,Sigma MW GF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。
在还原性条件下使用SDS PAGE分析纯化的双特异性单链抗体蛋白，其中所述SDSPAGE以预制的4-12%Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行。根据制造商提供的方案，进行样品制备和应用。以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为>95%。
如PBS中的凝胶过滤所确定的，双特异性单链抗体在天然条件下具有约52kDa的分子量。根据该方法纯化所有构建体。
根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印记。所使用的抗体针对组氨酸6标签(5His,Qiagen)和以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig，且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性单链抗体的单个条带。
28.6CD44和CD3跨物种特异性双特异性抗体的流式细胞计量术结合分析
为了检测跨物种特异性双特异性抗体构建体关于分别对人类和猕猴CD44和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。为此目的，如实施例28.1所述的以人类CD44转染的CHO细胞和人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)用于检测对人类抗原的结合。使用实施例28.3描述的产生的猕猴CD44转染子和猕猴PBMC(根据标准方案通过对来自猕猴的外周血的Ficoll梯度离心进行猕猴PBMC的制备)检测对猕猴抗原的结合反应性。使用如实施例28.2所述产生的表达无v6外显子的人类CD44的转染的CHO细胞来检测对CD44的v6外显子的特异性。各细胞系或猕猴PBMC的200.000个细胞与50μl的跨物种特异性双特异性抗体构建体的纯化的蛋白(5μg/ml)或50μl的可购买获得的抗CD44抗体(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg；也是5μg/ml)在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测构建体的结合。对于与可购买获得的抗CD44抗体孵化的样品省略抗His抗体。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体或抗CD44抗体。含有2%FCS的PBS用作阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
对CD44跨物种特异性的和对人类和非黑猩猩灵长类CD3跨物种特异性的上述单链分子的双特异性结合是清楚地可检测的，如图43所示。在FACS分析中，与对应的阴性对照相比，所有构建体显示结合于CD3和CD44。证明了双特异性抗体对人类和猕猴CD3和CD44抗原的跨物种特异性。
通过构建体对以缺少v6外显子的人类CD44转染的CHO细胞的结合的缺乏，在图44中证实了对CD44的v6外显子的特异性。这些细胞对CD44的表达由可购买获得的抗CD44抗体对这些细胞和对以全长人类CD44转染的CHO细胞可比的结合而证明。
28.7CD44和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体的生物活性
使用实施例28.1所述的CD44阳性细胞系通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。使用刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC作为效应细胞。
刺激的人类PBMC的产生如下进行：
培养皿(145mm直径,Greiner)以可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Orthoclone)在1μg/ml的终浓度在37℃包被1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的120ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。
根据标准方案，通过耗尽CD4+T细胞和CD56+NK细胞而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
靶细胞以PBS洗涤两次并以在含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11.1MBq51Cr在37℃标记45分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板以250μl补充的RPMI(如上)的总体积进行测定，E:T比为10:1。施加1μg/ml的跨物种特异性双特异性单链抗体分子和其20个三倍稀释物。测定时间是18小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)进行。如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。通过分析程序计算的EC50值用于比较生物活性。
如图45所示，所产生的跨物种特异性双特异性单链抗体构建体揭示了由刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC引起的针对人类CD44阳性靶细胞的细胞毒性活性。
29.CD30和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生和表征
29.1表达人类CD30的CHO细胞的产生
根据标准方案，由基因合成获得了GenBank公开的人类CD30的编码序列(登录号M83554)。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是成熟人类CD30蛋白和终止密码子的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO1103和1104)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。所引入的限制性位点，即在5'末端的EcoRI和在3'末端的SaII用于如下克隆程序。通过基因合成片段中编码序列的沉默突变而除去内部限制性位点(BsrGI：核苷酸243从T到C；SaII：核苷酸327从A到G；SaII：核苷酸852从A到G；EcoRI：核苷酸1248从T到C)。遵循标准方案，经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,Cancer Immunol.Immunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NewYork(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)MethodsEnzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
29.2表达猕猴CD30的CHO细胞的产生
猕猴CD30的cDNA序列通过对来自根据标准方案制备的猕猴骨髓的cDNA的一组4个PCR获得。使用如下反应条件：在94℃2分钟的1个循环，随后是94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟的35个循环，随后是72℃3分钟的末端循环，并使用如下引物：
6.正向引物：5′-cctcgccgcgctgggactgc-3′
反向引物：5′-ggtgccactggagggttccttgc-3′
7.正向引物：5′-gcttcttccattctgtctgcccagcagg-3′
反向引物：5′-ggtaggggacacagcgggcacaggagttgg-3′
8.正向引物：5′-cctggcatgatctgtgccacatcagcc-3′
反向引物：5′-gcgttgagctcctcctgggtctgg-3′
9.正向引物：5′-cctcccrgcccaagctagagcttgtgg-3′
反向引物：
5′-cgactctagagcggccgctcactttccagaggcagctgtgggcaaggggtcttctttcccttcc-3′
PCR反应在加入PCR级甜菜碱到1M终浓度下进行。那些PCR产生四个重叠片段，根据标准方案使用PCR引物将其分离和测序，并从而提供从前导肽密码子12到成熟蛋白密码子562的编码猕猴CD30的cDNA序列的部分。为了产生表达猕猴CD30的构建体，根据标准方案通过基因合成获得了cDNA片段(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO1105和1106)。在该构建体中，从前导肽氨基酸12到成熟CD30蛋白的氨基酸562的猕猴CD30编码序列融合到人类CD30的编码序列，从而代替人类编码序列的各自部分。基因合成片段还设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点和在含有编码猕猴CD30的全细胞外结构域、猕猴CD30跨膜结构域和猕猴-人类嵌合细胞内CD30结构域的cDNA的片段的始端和末端的限制性位点。在5'末端引入的限制性位点XbaI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后经由XbaI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,Cancer Immunol.Immunother50(2001)141-150)。该质粒的证实序列的克隆用于如上所述地转染CHO/dhfr-细胞。
29.3CD30和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生
跨物种特异性结合分子的克隆
通常，如下表12中所列的来设计双特异性单链抗体分子，其中所述双特异性单链抗体分子各自包含具有对人类和非黑猩猩灵长类CD3ε跨物种特异性的结合特异性的结构域以及具有对人类和非黑猩猩灵长类CD30跨物种特异性的结合特异性的结构域：
表12：抗CD3和抗CD30跨物种特异性双特异性单链抗体分子的型式
包含对人类和猕猴CD30跨物种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的CD3特异性VH和VL组合的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是6组氨酸标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入合适限制性位点。引入的限制性位点用于如下克隆程序。根据标准方案，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer ImmunolImmunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,MolecularCloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
29.4双特异性单链抗体分子的表达和纯化
双特异性单链抗体分子在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过加入增加浓度的MTX达20nM MTX的终浓度而诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，使细胞在有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%PluronicF-68;HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集。通过离心除去细胞，并将包含表达的蛋白的上清液储存在-20℃。可选地，构建体瞬时表达在HEK293细胞中。根据制造商的方案，以293fectin试剂(Invitrogen,#12347-019)进行转染。
Explorer系统(GE Health Systems)和软件用于色谱。根据制造商提供的方案，使用负载有ZnCl2的Fractogel EMD(Merck)进行固定的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)。以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下程序使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl,0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：
步骤1：6柱体积的20%缓冲液B
步骤2：6柱体积的100%缓冲液B
汇集步骤2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐,200mM赖氨酸,5%甘油,pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。将洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印记进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒,Sigma MW GF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。
在还原性条件下使用SDS PAGE分析纯化的双特异性单链抗体蛋白，其中所述SDSPAGE以预制的4-12%Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行。根据制造商提供的方案，进行样品制备和应用。以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为>95%。
如PBS中的凝胶过滤所确定的，双特异性单链抗体在天然条件下具有约52kDa的分子量。根据该方法纯化所有构建体。
根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印记。所使用的抗体针对His标签(5His,Qiagen)和以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig，且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性单链抗体的单个条带。
29.5CD30和CD3跨物种特异性双特异性抗体的流式细胞计量术结合分析
为了检测跨物种特异性双特异性抗体构建体关于分别对人类和猕猴CD30和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。为此目的，如实施例29.1所述的以人类CD30转染的CHO细胞、人类CD30阳性B细胞系MEC-1(DSMZ,Braunschweig,ACC497)和人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)用于检测对人类抗原的结合。使用如实施例29.2所述的产生的猕猴CD30转染子和猕猴T细胞系4119LnPx(由Fickenscher教授,Hygiene Institute,Virology,Erlangen-Nuernberg友情提供；发表于Knappe A等人和Fickenscher H.,Blood2000,95,3256-61)检测对猕猴抗原的结合反应性。各细胞系的200.000个细胞与50μl的跨物种特异性双特异性抗体构建体的纯化的蛋白(5μg/ml)在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠5His抗体(Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测构建体的结合。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。含有2%FCS的PBS用作阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
对CD30跨物种特异性的和对人类和非黑猩猩灵长类CD3跨物种特异性的上述单链分子的双特异性结合是清楚地可检测的，如图46所示。在FACS分析中，与阴性对照相比所有构建体显示结合于CD3和CD30。证明了双特异性抗体对人类和猕猴CD3和CD30抗原的跨物种特异性。
29.6CD30和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体的生物活性
使用人类CD30阳性B细胞系MEC-1(DSMZ,Braunschweig,ACC497)和实施例29.2所述的以猕猴CD30转染的CHO细胞通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。分别使用刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。
刺激的人类PBMC的产生如下进行：
培养皿(145mm直径,Greiner bio-one GmbH,Kremsmünster)以终浓度1μg/ml的可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Othoclone)在37℃包被1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的120ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。
根据标准方案，通过耗尽CD4+T细胞和CD56+NK细胞而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
靶细胞以PBS洗涤两次并以在含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11.1MBq51Cr在37℃标记60分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板中以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定，E:T比为10:1。施加1μg/ml的跨物种特异性双特异性单链抗体分子和其20个三倍稀释物。对于使用MEC-1和人类CD4/CD56耗尽的PBMC的测定，测定时间是4小时，而对于使用猕猴CD30转染的CHO和猕猴T细胞系4119LnPx的测定，测定时间是18小时。细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad SoftwareInc.,San Diego,California,USA)进行。如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。通过分析程序计算的EC50值用于比较生物活性。
如图47所示，所有产生的跨物种特异性双特异性单链抗体构建体证明了由刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC引起的针对人类CD30阳性靶细胞的细胞毒性活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引起的针对猕猴CD30阳性靶细胞的细胞毒性活性。
30.HER2和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生和表征
30.1表达人类HER2的CHO细胞的产生
根据标准方案，由基因合成获得了GenBank公开的人类HER2的编码序列(登录号X03363)。基因合成片段设计为包含包括其前导肽的人类HER2蛋白的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO1107和1108)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。所引入的限制性位点，即在5'末端的XbaI和在3'末端的SaII用于如下克隆程序。遵循标准方案，经由XbaI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,Cancer Immunol. Immunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;ALaboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990) MethodsEnzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
30.2表达猕猴HER2细胞外结构域的CHO细胞的产生
修饰如上述的人类HER2的编码序列以编码GenBank公开的猕猴HER2蛋白(登录号XP_001090430)的氨基酸123到1038。根据标准方案，由基因合成获得了该嵌合蛋白的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO 1109和1110)。基因合成片段还设计为包含用于构建体的真核表达的Kozak位点和在片段的始端和末端的限制性位点。在5'末端引入的限制性位点XbaI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后经由XbaI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,CancerImmunol. Immunother50(2001)141-150)。该质粒的证实序列的克隆用于如上所述地转染CHO/dhfr-细胞。
30.3HER2和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生
跨物种特异性结合分子的克隆
通常，如下表13中所列的来设计双特异性单链抗体分子，其中所述双特异性单链抗体分子各自包含具有对人类和非黑猩猩灵长类CD3ε跨物种特异性的结合特异性的结构域以及具有对人类和猕猴HER2跨物种特异性的结合特异性的结构域：
表13：抗CD3和抗HER2跨物种特异性双特异性单链抗体分子的型式
包含对人类和猕猴HER2跨物种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的CD3特异性VH和VL组合的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是6组氨酸标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入合适限制性位点。引入的限制性位点用于如下克隆程序。根据标准方案，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer ImmunolImmunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,MolecularCloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
30.4双特异性单链抗体分子的表达和纯化
双特异性单链抗体分子在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过加入增加浓度的MTX达20nM MTX的终浓度而诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，使细胞在有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%PluronicF-68;HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集。通过离心除去细胞，并将包含表达的蛋白的上清液储存在-80℃。根据制造商的方案，以293fectin试剂(Invitrogen,#12347-019)进行转染。
Explorer系统(GE Health Systems)和软件用于色谱。根据制造商提供的方案，使用负载有ZnCl2的Fractogel EMD(Merck)进行固定的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)。以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl,0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：
步骤1：6柱体积的20%缓冲液B
步骤2：6柱体积的100%缓冲液B
汇集步骤2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐,200mM赖氨酸,5%甘油,pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。将洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印记进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒,Sigma MW GF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。
在还原性条件下使用SDS PAGE分析纯化的双特异性单链抗体蛋白，其中所述SDSPAGE以预制的4-12%Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行。根据制造商提供的方案，进行样品制备和应用。以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为>95%。
如PBS中的凝胶过滤所确定的，双特异性单链抗体在天然条件下具有约52kDa的分子量。根据该方法纯化所有构建体。
根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印记。为了检测双特异性单链抗体蛋白抗体，使用了抗His标签抗体(5His,Qiagen)。以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig抗体用作二抗，且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性单链抗体的单个条带。
30.5HER2和CD3跨物种特异性双特异性抗体的流式细胞计量术结合分析
为了检测跨物种特异性双特异性抗体构建体关于分别对人类和猕猴HER2和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。为此目的，如实施例30.1所述的以人类HER2转染的CHO细胞和人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)用于检测对人类抗原的结合。使用如实施例30.2所述的产生的猕猴HER2转染子和猕猴T细胞系4119LnPx(由Fickenscher教授,Hygiene Institute,Virology,Erlangen-Nuernberg友情提供；发表于Knappe A等人和Fickenscher H.,Blood2000,95,3256-61)检测对猕猴抗原的结合反应性。各细胞系的200.000个细胞与50μl的跨物种特异性双特异性抗体构建体的纯化的蛋白(2μg/ml)在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测构建体的结合。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。含有2%FCS的PBS用作结合于T细胞系以及结合于HER2转染的CHO细胞的阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
对HER2跨物种特异性的和对人类和非黑猩猩灵长类CD3跨物种特异性的上述单链分子的双特异性结合是清楚地可检测的，如图48所示。在FACS分析中，与相应的阴性对照相比，所有构建体显示结合于CD3和HER2。证明了双特异性抗体对人类和猕猴CD3和HER2抗原的跨物种特异性。
30.6HER2和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体的生物活性
使用实施例30.1和30.2所述的HER2阳性细胞系通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。如各图所示，使用未刺激的人类CD56耗尽的PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。
未刺激的人类CD56耗尽的PBMC的产生如下进行：
根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。根据标准方案，进行CD56+NK细胞的耗尽。
靶细胞以PBS洗涤两次并以在含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11.1MBq51Cr在37℃标记45分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定，E:T比为10:1。施加1μg/ml的跨物种特异性双特异性单链抗体分子和其15-21个五倍稀释物。测定时间是18小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)进行。如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。通过分析程序计算的EC50值用于比较生物活性。
如图49所示，所有产生的跨物种特异性双特异性单链抗体构建体揭示了由未刺激的CD56耗尽的PBMC引起的针对人类HER2阳性靶细胞的细胞毒性活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引起的针对猕猴HER2阳性靶细胞的细胞毒性活性。
31.基于对应于N末端氨基酸1-27的背景独立的CD3ε表位由亲和程序纯化跨物种特异性双特异性单链分子
31.1展示分离的对应于N末端氨基酸1-27的背景独立的人类CD3ε表位的亲和柱的产生
将表达上述构建体1-27CD3-Fc(实施例3；重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO350和349)的质粒转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体，其中所述构建体1-27CD3-Fc由融合于人类免疫球蛋白IgG1的铰链和Fcγ区的人类CD3ε链的1-27N末端氨基酸组成。DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)MethodsEnzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度到达20nM MTX的终浓度而诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，使细胞在有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%Pluronic F-68;HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集。通过离心除去细胞，并将包含表达的蛋白的上清液储存在-20℃。为了分离融合蛋白，根据标准方案使用对牛、马和小鼠血清蛋白具有最小交叉反应的可购买获得的亲和纯化的山羊抗人类IgG fc片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)来制备山羊抗人类fc亲和柱。使用该亲和柱，在Explorer系统(GE Amersham)上将融合蛋白从细胞培养物上清液中分离出来并由柠檬酸洗脱。中和洗脱物并浓缩。对自由胺偶合缓冲液透析后，将纯化的融合蛋白偶合于N-羟基-琥珀酰亚胺NHS活化的1ml HiTrap柱(GE Amersham)。
偶合后，封闭剩余的NHS基团并洗涤柱，且在包含0.1%叠氮化钠的储存缓冲液中储存在5℃。
31.2使用人类CD3肽亲和柱纯化跨物种特异性双特异性单链分子
表达跨物种特异性双特异性单链分子的细胞的200ml细胞培养物上清液经0.2μm无菌过滤并使用Explorer系统(GE Amersham)加到CD3肽亲和柱。
随后以磷酸盐缓冲盐水PBS pH7.4洗涤柱以洗去未结合的样品。洗脱以包含20mM柠檬酸和1M氯化钠的酸性缓冲液pH3.0进行。立即以级份收集器的收集管中包含的1M三羟基甲基胺TRIS pH8.3中和洗脱的蛋白。
蛋白分析由SDS PAGE和Western印记进行。
对于SDS PAGE，使用BisTris凝胶4-12%(Invitrogen)。运行缓冲液是1×MES-SDS-Puffer(Invitrogen)。施加15μl预染色的Sharp蛋白标准品(Invitrogen)作为蛋白标准。电泳在200伏120mA max进行60分钟。在软化水中洗涤凝胶，并以考马斯染色一小时。凝胶在软化水中脱色3小时。以Syngene凝胶记录系统获取图像。
对于Western印记，产生双份SDS PAGE凝胶并将蛋白电印迹到硝酸纤维素膜上。以PBS中的2%牛血清白蛋白封闭膜并以生物素酰化的鼠5His抗体(Qiagen)孵化。使用链霉亲和素碱性磷酸酶共轭物(DAKO)作为第二试剂。以BCIP/NBT底物溶液(Pierce)将印记显影。
如图50、51和52证明的，如上述的使用人类CD3肽亲和柱允许从细胞培养物上清液高度有效地纯化双特异性单链分子。因此，双特异性单链分子中包含的跨物种特异性抗CD3单链抗体经由其特异性结合特性使得用于跨物种特异性双特异性单链分子纯化的有效通用一步方法成为可能，而不需要仅为了纯化目的连接的任何标签。
32.跨物种特异性双特异性单链分子的一般药物代谢动力学测定
32.1用于药物代谢动力学测定的1-27CD3-Fc的产生
根据标准方案，由基因合成获得了融合于人类免疫球蛋白IgG1的铰链和Fcγ区的人类CD3ε链的1-27N末端氨基酸的编码序列(重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO1111和1112)。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是成熟人类CD3ε链细胞外部分的前27个氨基酸的编码序列，框中随后是人类IgG1的铰链区和Fcγ部分和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在编码融合蛋白的cDNA的始端和末端引入限制性位点。所引入的限制性位点，即在5'末端的EcoRI和在3'末端的SaII用于如下克隆程序。遵循标准方案，经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,Cancer Immunol.Immunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold SpringHarbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，使细胞在有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%Pluronic F-68;HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集。通过离心除去细胞，并将包含表达的蛋白的上清液储存在-20℃。为了分离融合蛋白，根据标准方案使用对牛、马和小鼠血清蛋白具有最小交叉反应的可购买获得的亲和纯化的山羊抗人类IgG fc片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)来制备山羊抗人类fc亲和柱。使用该亲和柱，在Explorer系统(GE Amersham)上将融合蛋白从细胞培养物上清液分离出来并由柠檬酸洗脱。中和洗脱物并浓缩。
32.2对跨物种特异性双特异性单链分子的药物代谢动力学测定
该测定是基于ECL-ELISA技术，其使用钌标记的检测在Sektor成像器(MSD)上测量碳板。第一步，将碳板(MSD高结合96孔板产品目录:L15×B-3)以5μl/孔包被50ng/ml的实施例32.1描述的纯化的1-27CD3-Fc。该板随后在25℃干燥过夜。随后板以150μl/孔使用PBS中的5%BSA(Paesel & Lorei#100568)在培养箱中伴随摇动(700rpm)在25℃封闭1h。下一步，板以PBS中0.05%的吐温洗涤三次。在PBS中的50%猕猴血清中的标准曲线通过以100ng/ml的有待在测定中检测的相应跨物种特异性双特异性单链分子开始，连续1:4稀释而产生。在PBS中的50%猕猴血清中制备质量控制(QC)样品，其根据预期的样品血清浓度，范围从1ng/ml到50ng/ml的相应跨物种特异性双特异性单链分子。将标准品、QC或未知样品以10μl/孔转移到碳板并在培养箱中伴随摇动(700rpm)在25℃孵化90min。随后板以PBS中0.05%的吐温洗涤三次。为了检测，加入25μl/孔的5His-生物素抗体(Qiagen,PBS中0.05%的吐温中200μg/ml)并在培养箱中伴随摇动(700rpm)在25℃孵化1h。在第二检测步骤，加入25μl/孔的链霉亲和素-SulfoTag溶液(MSD;产品目录:R32AD-1;批号:W0010903)并在培养箱中伴随摇动(700rpm)在25℃孵化1h。随后板以PBS中0.05%的吐温洗涤三次。最终加入150μl/孔MSD读数缓冲液(MSD,产品目录:R9ZC-1)并在Sektor成像器中对板读数。
图53和54证明了对于跨物种特异性双特异性单链分子而言，在猕猴血清样品中检测跨物种特异性双特异性单链分子的可行性。因此，双特异性单链分子中包含的跨物种特异性抗CD3单链抗体经由其特异性结合性质，使得用于检测跨物种特异性双特异性单链分子的高敏感性的通用测定成为可能。上述测定可用于药物开发所需的正式的毒理学研究范畴，并可易于修改以便用来测量与跨物种特异性双特异性单链分子的临床应用有关的患者样品。
33.来自不同非黑猩猩灵长类的CD3ε的N末端氨基酸1-27融合于来自食蟹猴的EpCAM的重组跨膜融合蛋白(1-27CD3-EpCAM)的产生。
33.11-27CD3-EpCAM的克隆和表达
从不同的非黑猩猩灵长类(狨猴、绢毛猴、松鼠猴)和猪分离CD3ε。根据标准方案，由基因合成获得了融合于加Flag标签的食蟹猴EpCAM N末端的成熟人类、普通狨猴(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinus oedipus)、普通松鼠猴(Saimirisciureus)和家猪(Sus scrofa；用作阴性对照)CD3ε链1-27N末端氨基酸的编码序列(重组融合蛋白的cDNA序列和氨基酸序列列在SEQ ID NO351至360)。基因合成片段设计为首先包含BsrGI位点以允许在正确读码框中融合靶表达载体中已存在的19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列，框中随后是成熟CD3ε链细胞外部分N末端1-27氨基酸的编码序列，框中随后是Flag标签的编码序列，框中随后是成熟食蟹猴EpCAM跨膜蛋白的编码序列。基因合成片段还设计为在编码融合蛋白的cDNA的末端引入限制性位点。在5'末端引入的限制性位点BsrGI和在3'末端引入的限制性位点SaII用于如下克隆程序。随后遵循标准方案，经由BsrGI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒的衍生物(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)，该衍生物已经包含19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽的编码序列。验证序列的质粒用于转染DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)MethodsEnzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
根据标准方案，经由FACS测定检测转染子的重组跨膜蛋白的细胞表面表达。为此目的，将2.5×105量的细胞与含有2%FCS的PBS中5μg/ml的50μl抗Flag M2抗体(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany)孵化。以含有2%FCS的PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab')2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch Europe Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK)检测结合的抗体。流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinsonbiosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
由食蟹猴EpCAM和分别地人类、狨猴、绢毛猴、松鼠猴以及猪CD3ε链的1-27N末端氨基酸组成的加Flag标签的重组跨膜融合蛋白在转染细胞上的表达是清楚地可检测的(图55)。
33.2IgG1抗体形式的跨物种特异性抗CD3单链抗体I2C HL的克隆和表达
为了提供检测跨物种特异性单链抗CD3抗体结合的改进手段，将I2CVHVL特异性转变为具有鼠IgG1和鼠κ恒定区的IgG1抗体。根据标准方案，由基因合成获得了编码IgG抗体重链的cDNA序列。基因合成片段设计为首先包含允许构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是重链可变区或轻链可变区的编码序列，框中随后分别是GenBank公开的鼠IgG1重链恒定区的编码序列(登录号AB097849)或GenBank公开的鼠κ轻链恒定区的编码序列(登录号D14630)。
在编码融合蛋白的cDNA始端和末端引入限制性位点。在5'末端的限制性位点EcoRI和在3'末端的限制性位点SaII用于如下克隆程序。根据标准方案，对于重链构建体，经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)和对于轻链构建体克隆到pEFADA(pEFADA描述于Raum等人,Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)。证实序列的质粒用于将相应的轻和重链构建体共转染到DHFR缺陷型CHO细胞用于真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨喋呤(MTX)的浓度到达20nM MTX的终浓度和脱氧柯福霉素(dCF)到达300nM dCF的终浓度来诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，收集细胞培养物上清液并用于随后的实验。
33.3IgG1抗体形式的跨物种特异性抗CD3单链抗体I2C HL对1-27CD3-EpCAM的结合
根据标准方案，在FACS测定中检测了所产生的I2C IgG1构建体对实施例33.1描述的分别融合于食蟹猴Ep-CAM的人类、狨猴、绢毛猴和松鼠猴CD3ε链的1-27N末端氨基酸的结合。为此目的，将2.5×105量的细胞与50μl的包含如实施例33.2所述的I2C IgG1构建体的细胞培养物上清液孵化。以含有2%FCS的PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab')2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch EuropeLtd.,Newmarket,Suffolk,UK)检测抗体的结合。流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
如图56所示，与由融合于食蟹猴EpCAM的猪CD3ε的1-27N末端氨基酸组成的阴性对照相比，观察到I2C IgG1构建体对表达由融合于食蟹猴EpCAM的人类、狨猴、绢毛猴或松鼠猴CD3ε的1-27N末端氨基酸组成的重组跨膜融合蛋白的转染子的结合。因此，证明了I2C的多灵长类跨物种特异性。以抗Flag M2抗体和I2C IgG1构建体获得的信号是可比的，表示跨物种特异的特异性I2C对CD3ε的N末端氨基酸1-27的强结合活性。
34.跨物种特异性抗CD3结合分子I2C对具有和不具有N末端His6标签的人类CD3ε链的结合
检测如实施例33.2所述的对CD3ε特异的具有结合特异性I2C的嵌合IgG1抗体对具有和不具有N末端His6标签的人类CD3ε的结合。抗体对分别以实施例6.1描述的His6-人类CD3ε和以实施例5.1描述的野生型人类CD3ε转染的EL4细胞系的结合根据标准方案由FACS测定检测。将转染子的2.5×105个细胞以50μl的包含I2C IgG1构建体的细胞培养物上清液或在含有2%FCS的PBS中5μg/ml的50μl相应的对照抗体孵化。分别使用合适的同种型对照作为阴性对照和对于构建体的表达使用CD3特异性抗体UCHT-1作为阳性对照。以5His抗体(Qiagen)进行His6标签的检测。以含有2%FCS的PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab’)2片段，Fc-γ片段特异性的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearchEurope Ltd.,Newmarket,Suffolk,UK)检测抗体的结合。流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
抗人类CD3抗体UCHT-1对两种转染子可比的结合证明了大约相等水平的构建体表达。5His抗体的结合证实了His6-人类GD3构建体上存在His6标签但野生型构建体上不存在。
与以野生型人类CD3ε转染的EL4细胞系相比，检测到I2C IgG1构建体对具有N末端His6标签的人类CD3ε的结合的清楚丧失。这些结果显示，CD3ε的自由N末端对于跨物种特异性抗CD3结合特异性I2C对人类CD3ε链的结合是必需的(图57)。
35.针对人类和非黑猩猩灵长类CD3和针对Muc-1的肿瘤特异性表位的双特异性单链抗体构建体
选择人类抗体种系VH序列VH33-72(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRH1(SEQ ID1486)、CDRH2(SEQ ID1487)和CDRH3(SEQ ID1488)的骨架背景。类似地，选择人类抗体种系VH序列VH33-73(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRH1(SEQID1492)、CDRH2(SEQ ID1493)和CDRH3(SEQ ID1494)的骨架背景。对于每种人类VH，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几种简并寡核苷酸。为此目的，每个第二引物是反义引物。对于VH33-72，使用如下寡核苷酸：
5'VH72-A-Xhol
GAAGTGAAGCTTCTCGAGTCTGCACGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCMT
GARACTCTCTTGTGCTGCT
3'VH72-B
CTGGCGGACCCAGTCCATCCAGGCATCACTAAAAGTGAATCCAGAAGCAGCAC
AAGAGAG
5'VH72-C
GACTGGGTCCGCCAGXCTCCAGRGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGSTGAAATTAG
AAACAAAGCCAAT
3'VH72-D
TTTGGAATCATCTCTTGAGATGGTGAACCTCCCTTCACAGACTCATCATAATAT
GTTGCATGATTATTGGCTTTGTTTCT
5'VH72-E
AGAGATGATTCCAAAARTAGMSTGTACCTGCAAATGAWMAGCTTAARARCTGAA
GACACTGSCSTTTATTACTGTACTGGG
3'VH72-F-BstEll
GACCGTGGTGACCAGAGTCCCCTGGCCCCAGTTAGCAAACTCCCCAGTACAGT
AATA
对于VH33-73，寡核苷酸如下：
5'VH73-A-Xhol
CAAGTTCAGCTGCTCGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCC
3'VH73-B
CCAGTTCATCCAGTAGTTACTGAAACTGAATCCAGAGCCARCACAGGAGAGTTT
CAKGGATCCTCGAGGTTG
5'VH73-C
TACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGKCTYCAGRGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGS
TGAAATTAGATTGAAATCTAAT
3'VH73-D
TTTGGAATCATCTCTTGAGATGGTGAACCTCCCTTTCACAGACTCCGCATAATGT
GTTGCATAATTATTAGATTTCAATCT
5'VH73-E
AGAGATGATTCCAAAARTASTGYCTACCTGCAAATGAACARCTTAARARCTGAAG
ACACTGSCRTTTATTACTGTACGGGA
3'VH73-F-BstEll
GACCGTGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAAGCAAATTGTCCCACTCCCG
TACAGTAATA
这些引物组中的每一个跨越了整个相应的VH序列。
在每一组中，引物以等量混合(如，1μl的每种引物(引物储备溶液20μM至100μM)加到20μl PCR反应)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物。该混合物在PCR循环仪中在94℃孵化3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中运行且根据标准方法从凝胶分离200至400大小的产物。
各种VH PCR产物随后用作标准PCR反应的模板，使用并入N末端和C末端合适克隆限制性位点的引物。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(对于VH，大约350个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VH DNA片段。
选择人类抗体种系VL序列VkII A18(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRL1(SEQ ID1489)、CDRL2(SEQ ID1490)和CDRL3(SEQ ID1491)的骨架背景。类似地，选择人类抗体种系VL序列VL77a(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为CDRL1(SEQID1495)、CDRL2(SEQ ID1496)和CDRL3(SEQ ID1497)的骨架背景。对于每种人类VL，必须合成末端段大约15-20个核苷酸重叠的几个简并的寡核苷酸。为此目的，每个第二引物是反义引物。缺失寡核苷酸中稍后克隆所需的限制性位点。对于VkIIA18，使用如下寡核苷酸：
5'Vk2A18-A-Sacl
CCTGATGAGCTCGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGYCTGTCASTCYTGGA
SAKCMAGCTTCCATCTCTTGC
3'Vk2A18-B
CCAATATAAATAGGTGTTTCCATTGTTGTGTACCAGGTTCTGACTAGATCTGCAA
GAGATGGAAGC
5'Vk2A18-C
ACCTATTTATATTGGTWCCTGCAGAAGYCAGGCCAGTCTCCAMAGCTCCTGATT
TATAGGGCTTCCATC
3'Vk2A18-D
CTTGAGTGTGAAATCTGTCYCTGATCCACTGCCACTGAACCTGTCTGGGACCCC
AGAAAATCGGATGGAAGCCCTATA
5'Vk2A18-E
ACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATSTGGGAGTTTAT
TWCTGCTTTCAAGGTACACAT
3'Vk2A18-F-BsiWl/Spel
CCCGATACTAGTCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTTGACCGAACGTCCA
CGGAACATGTGTACCTTGAAAGCA
对于vL77a，寡核苷酸如下：
5'Vlam7a-A-Sacl
CCTGCAGAGCTCGTTGTGACTCAGGAAYCTKCACTCACCRYATCACCTGGTGRA
ACAGTCACACTCACTTGT
3'Vlam7a-B
CCAGTTGGCATAGTTACTTGTTGTAACAGCCCCAGTACTTGAGCGACAAGTGAG
TGTGACTGT
5'Vlam7a-C
AACTATGCCAACTGGKTCCAASAAAAACCAGRTCAKKYAYYCMSTGSTCTAATAK
RTGGTACCAACAACCGA
3'VlamTa-D
GGTGAGGGCAGCCTTGYCTCCAAKCAGGGAGCCTGAGAATCTGGCAGCARYM
CMTGGTGCTCGGTTGTTGGTACC
5'V1am7a-E
AAGGCTGCCCTCACCMTCWCAGGGGYACAGMCTGAGGATGAGGCARWATATT
WGTGTGCTCTATGGTACAGC
3'VIam7a-F-BsiWliSpel
CCAGTAACTAGTCGTACGTAGGACAGTCAGTTTGGTTCCTCCACCGAACACCCA
ATGGTTGCTGTACCATAGAGCACA
这些引物组中的每一个跨越了整个相应的VL序列。
在每一组中，引物以等量混合(如，1μl的每种引物(引物储备溶液20μM至100μM)加到20μl PCR反应)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物。该混合物在PCR循环仪中在94℃孵化3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中运行且根据标准方法从凝胶分离200至400大小的产物。
各种VL PCR产物随后用作标准PCR反应的模板，使用并入N末端和C末端合适克隆限制性位点的引物。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(对于VL，大约330个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VL DNA片段。
在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis中，最终基于VH33-72的VH PCR产物(即人类/人源化VH的所有组成成分)随后与最终基于VkII A18的VLPCR产物(即人类/人源化VL的所有组成成分)组合，最终基于VH33-73的VH PCR产物(即人类/人源化VH的所有组成成分)与最终基于VL77a的VLPCR产物(即人类/人源化VL的所有组成成分)组合以形成功能scFv的两种不同文库，在丝状噬菌体上展示后如下述地从所述文库选择、筛选、鉴定和证实抗Muc-1结合子：
450ng轻链片段(SacI-SpeI消化的)与1400ng嗜菌粒pComb3H5Bhis(SacI-SpeI消化的；大片段)连接。随后将所得的组合的抗体文库由电穿孔(2.5kV,0.2cm间隙的电击杯,25uFD,200Ohm,Biorad的gene-pulser电穿孔仪)转化到300ul电感受态的大肠杆菌XL1Blue细胞，得到多于107独立克隆的文库大小。一小时的表型表达后，在100ml液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5BHis载体编码的羧苄青霉素抗性的阳性转化体。随后离心收集细胞并使用可购买获得的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备。
2800ng包含VL文库(XhoI-BstEII消化的；大片段)的该质粒-DNA与900ng重链V片段(XhoI-BstEII消化的)连接并再次由电穿孔(2.5kV,0.2间隙的电击杯,25uFD,200Ohm)转化到两个300ul份的电感受态的大肠杆菌XL1Blue细胞，获得多于107独立克隆的VH-VLscFv(单链可变片段)的总文库大小。
表型表达和缓慢地适应羧苄青霉素后，将包含抗体文库的大肠杆菌细胞转移到SB-羧苄青霉素(50ug/mL)选择培养基。随后以感染剂量的1012个辅助噬菌体VCSM13粒子感染包含抗体文库的大肠杆菌细胞，导致丝状M13噬菌体的产生和分泌，其中噬菌体粒子包含编码scFv片段的单链pComb3H5BHis-DNA并展示作为翻译融合于噬菌体外壳蛋白III的相应的scFv蛋白。展示抗体文库的这个噬菌体池用于选择抗原结合实体。
表达人类MUC-1的CHO细胞的产生
根据标准方案，由基因合成获得了GenBank公开的人类MUC-1的编码序列(登录号J05581)。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是人类MUC-1蛋白和终止密码子的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO1498和1499)。MUC-1在GenBank保藏的版本中仅包含一次的内部重复序列(核苷酸382到441)在基因合成片段中包含十六次，反映在生理学表达的MUC-1中的多个重复。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。所引入的限制性位点，即在5'末端的EcoRI和在3'末端的SaII用于如下克隆程序。通过将基因合成片段中的编码序列沉默突变而除去内部XmaI限制性位点(核苷酸441从C到T；这是第一段重复序列的最后一个核苷酸，并因此在15个随后的重复序列中相同地突变；和核苷酸2160从G到C)。遵循标准方案，经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,CancerImmunol.Immunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold SpringHarbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
为了选择抗原结合实体，通过PEG8000/NaCl沉淀和离心从相应的培养物上清液收集携带克隆的scFv所有组成成分的噬菌体文库。将大约1011至1012个scFv噬菌体粒子重悬于0.4ml的PBS/0.1%BSA并在冰上以缓慢搅动与105至107个Muc-1转染的CHO细胞(参见示例Muc-1RoK)孵化1小时。这些Muc-1转染的CHO细胞预先通过离心收集，在PBS中洗涤并重悬于PBS/1%FCS(包含叠氮化钠)。以PBS/1%FCS(包含叠氮化钠)共达五次的洗涤步骤除去不特异性结合于Muc-1转染的CHO细胞的scFv噬菌体。洗涤后，通过将细胞重悬在HCl-甘氨酸pH2.2(10min孵化、随后涡旋)从细胞洗脱结合实体，以2M Tris pH12中和后，洗脱物用于感染新鲜未感染的大肠杆菌XL1Blue培养物(OD600>0.5)。包含成功转导编码人类/人源化scFv片段的嗜菌粒拷贝的大肠杆菌细胞的大肠杆菌培养物再次对羧苄青霉素抗性选择且随后以VCMS13辅助噬菌体感染以开始第二轮抗体展示和体外选择。通常共进行4至5轮选择。
为了筛选Muc-1特异性结合子，在选择后，对应于4和5轮淘洗的质粒DNA从大肠杆菌培养物中被分离。为了产生可溶性scFv蛋白，VH-VL-DNA片段从所述质粒（XhoI-SpeI）被切除。这些片段通过相同的限制性位点被克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建体（例如scFv）包含在scFv和His6标签之间的Flag标签（D YKDDDDK）以及其他的噬菌体蛋白被删除。在连接之后，每个质粒DNA池（不同淘洗轮次）被转化进100μl热激感受态大肠杆菌TG1或XL1blue并被铺在羧苄青霉素LB-琼脂上。单个克隆被挑选放入100μl的LB羧苄青霉素（50μg/ml）。
在切除基因III片段和使用1mM的IPTG诱导后，以含有VL和VH区段的pComb3H5BHis转化的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv。由于适合的信号序列，所述scFv链被输出到周质并在其中折叠成功能构象。
来自转化板的单个大肠杆菌TG1细菌菌落被挑选用于周质小量制备，并在补充了20mM的MgCl2和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基（例如10ml）中生长，并且在收集后被再溶解于PBS（例如1ml）。通过四轮在-70℃下冷冻和在37℃下解冻，细菌的外层膜被温度冲击而毁坏，而包括scFv在内的可溶性周质蛋白被释放到上清液中。在通过离心消除了完整细胞和细胞碎屑后，收集包含抗Muc-1scFv的上清液并用于如下鉴定Muc-1特异性结合子：
scFv对Muc-1的结合由流式细胞计量术在Muc-1转染的CHO细胞上检测；使用未转染的CHO细胞作为阴性对照。
对于流式细胞计量术，将2.5×105个细胞与50ul的scFv周质制品或与含有2%FCS的50μl PBS中的5μg/ml纯化的scFv一起孵化。以含有2%FCS的50μl PBS中2μg/ml的抗His抗体(5His抗体、无BSA,Qiagen GmbH,Hilden,FRG)检测scFv的结合。作为第二步骤试剂，使用在含有2%FCS的50μl PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab')2片段，山羊抗小鼠IgG(Fc-γ片段特异性)(Dianova,Hamburg,FRG)。在FACSscan(BD biosciences,Heidelberg,FRG)上测量样品。
随后分析单个克隆的有益特征和氨基酸序列。将Muc-1特异性scFv转变为重组双特异性单链抗体，通过将Muc-1特异性scFv经由Gly4Ser1-连接体与CD3特异性scFv I2C(SEQID185)或本发明的任何其它CD3特异性scFv连接以产生结构域排列为VHMuc1-(Gly4Ser1)3-VLMuc1-Gly4Ser1-VHCD3-(Gly4Ser1)3-VLCD3或可选的结构域排列的构建体。对于在CHO细胞中表达，(i)包含埋入Kozak共有序列的起始密码子的N末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)C末端His6标签随后是终止密码子的编码序列两者都符合读框地连接于编码双特异性单链抗体的核苷酸序列，随后将通过基因合成获得的所得的DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等人，Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)的多个克隆位点。如所述地进行DHFR缺陷型CHO细胞的稳定转染，分泌双特异性单链抗体到培养物上清液的DHFR阳性转染子的选择，以及使用密都锭的基因扩增以增加表达水平(Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)。所有其它陈述的本领域程序都根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。
功能双特异性单链抗体构建体的鉴定通过流式细胞计量术分析来自转染的CHO细胞的培养物上清液进行。为此目的，对人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)和猕猴T细胞系4119LnPx检测CD3结合。对Muc-1转染的CHO细胞检测对肿瘤特异性Muc-1表位的结合。各细胞系的200.000个细胞与50μl的细胞培养物上清液在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测结合的双特异性单链抗体构建体。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的CHO细胞的上清液用作阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
只选择对人类和猕猴CD3以及对Muc-1的肿瘤特异性表位显示双特异性结合的构建体用于进一步应用。
为了产生蛋白，将表达完全功能双特异性单链抗体并适于无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%Pluronic F-68;HyClone)的CHO细胞在具有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%Pluronic F-68;HyClone)的滚瓶中生长7天。通过离心从细胞澄清培养物上清液并储存在-20℃直到纯化。作为从培养物上清液纯化双特异性单链抗体的色谱设备，使用Explorer系统(GEHealth Systems)和软件。根据制造商提供的方案，使用负载有ZnCl2的Fractogel EMD(Merck)进行固定的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)。以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl,0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：
步骤1：6柱体积的20%缓冲液B
步骤2：6柱体积的100%缓冲液B
汇集步骤2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐,200mM赖氨酸,5%甘油,pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。将洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印记进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒,Sigma MW GF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。
在还原性条件下使用SDS PAGE分析纯化的双特异性单链抗体蛋白，其中所述SDSPAGE以预制的4-12%Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行。根据制造商提供的方案，进行样品制备和应用。以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为>95%。
如PBS中的凝胶过滤所确定的，双特异性单链抗体在天然条件下具有约52kDa的分子量。根据该方法纯化所有构建体。
根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印记。为了检测双特异性单链抗体蛋白抗体，使用了抗His标签抗体(5His,Qiagen)。以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig抗体用作二抗，且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性单链抗体的单个条带。
双特异性单链抗体在人类和非黑猩猩灵长类系统中与人类和猕猴CD3和与Muc-1的肿瘤特异性表位相互作用的能力通过基于铬51(51Cr)释放的细胞毒性测定确定，其使用Muc-1转染的CHO细胞作为靶细胞和刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。
刺激的人类PBMC的产生如下进行：
培养皿(145mm直径,Nunc)以终浓度1μg/ml的可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Othoclone)在37℃包被1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的120ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。
靶细胞以PBS洗涤两次并以在含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11.1MBq51Cr在37℃标记45分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定，E:T比为10:1。施加1μg/ml的跨物种特异性双特异性单链抗体分子和其20个三倍稀释物。测定时间是18小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)进行。如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。作为效能量度的EC50值以分析程序计算。
36.CD33和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生
36.1CD33和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生
通常，如下表14中所列的来设计双特异性单链抗体分子，其中所述双特异性单链抗体分子各自包含具有对人类和猕猴CD3ε跨物种特异性的结合特异性的结构域以及具有对人类和猕猴CD33跨物种特异性的结合特异性的结构域：
表14：抗CD3和抗CD33跨物种特异性双特异性单链抗体分子的型式
包含对人类和猕猴CD33跨物种特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的CD3特异性VH和VL组合的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是组氨酸6标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入合适限制性位点。引入的限制性位点用于如下克隆程序。根据标准方案，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer ImmunolImmunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,MolecularCloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，收集细胞培养物上清液用于随后的试验。
36.2CD33和CD3跨物种特异性双特异性抗体的流式细胞计量术结合分析
为了检测跨物种特异性双特异性抗体构建体关于分别对人类和猕猴CD33和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。为此目的，如实施例23.1所述的以人类CD33转染的CHO细胞和人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)用于检测对人类抗原的结合。使用实施例23.2描述的产生的猕猴CD33转染子和猕猴PBMC(根据标准方案通过对来自猕猴外周血的Ficoll梯度离心进行猕猴PBMC的制备)检测对猕猴抗原的结合反应性。各细胞系或PBMC的200000个细胞与50μl的表达跨物种特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测构建体的结合。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的CHO细胞的上清液用作阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
对CD33跨物种特异性的和对人类和非黑猩猩灵长类CD3跨物种特异性的上述单链分子的双特异性结合是清楚地可检测的，如图60所示。在FACS分析中，与相应的阴性对照相比，所有构建体显示结合于CD3和CD33。证明了双特异性抗体对人类和猕猴CD3和CD33抗原的跨物种特异性。
36.3.CD33和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体的生物活性
使用实施例23.1和23.2所述的CD33阳性细胞系通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。如各图所示，使用刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。
培养皿(145mm直径,Greiner bio-one GmbH,Kremsmünster)以终浓度1μg/ml的可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Othoclone)在37℃包被1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的120ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。
根据标准方案，通过耗尽CD4+T细胞和CD56+NK细胞而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
靶细胞以PBS洗涤两次并以含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11.1MBq51Cr在37℃标记45分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定，E:T比为10:1。施加终浓度50%的表达跨物种特异性双特异性单链抗体分子的细胞的上清液和其20个三倍稀释物。测定时间是18小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)进行。如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。通过分析程序计算的EC50值用于比较生物活性。
如图61所示，所有产生的跨物种特异性双特异性单链抗体构建体证明了由刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC引起的针对人类CD33阳性靶细胞的细胞毒性活性和由猕猴T细胞系4119LnPx引起的针对猕猴CD33阳性靶细胞的细胞毒性活性。
37.循环黑猩猩T细胞在暴露于针对循环血液细胞中不存在的靶分子的常规双特异性CD3结合分子后的重新分布
以静脉内单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体对单只雄性黑猩猩进行剂量升高(Schlereth(2005)Cancer Res65:2882)。与在常规单链CD19/CD3双特异性抗体构建体(Loffler(2000,Blood,第95卷,第6期)或WO99/54440)中的一样，所述EpCAM/CD3构建体的CD3臂也是针对人类和黑猩猩CD3的常规背景依赖性表位。在第0天，动物接受无测试材料的50ml PBS/5%HSA，随后是分别在第7、14、21和28天以1.6、2.0、3.0和4.5μg/kg的50ml PBS/5%HSA加单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体。每次施用的输注时段是2小时。对于每次每周的输注，肌内使用2-3mg/kg舒泰(Telazol)对黑猩猩镇静，插管并置于异氟烷/O2麻醉，使平均血压稳定。将第二静脉内导管放置在相对的肢以在图62所示的时间点收集(肝素化)全血样品用于循环血液细胞的FACS分析。在标准红细胞裂解后，以与黑猩猩CD2反应的FITC标记的抗体(Becton Dickinson)染色T细胞，并且每总淋巴细胞T细胞的百分比由流式细胞计量术确定。如图62所示，单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体的每次施用引起循环T细胞的快速下降，如以单链CD19/CD3双特异性抗体构建体在基本上无循环靶B(淋巴瘤)细胞的B-NHL患者中观察到的一样。由于在人类和黑猩猩的循环血液中没有EpCAM阳性靶细胞，因此循环T细胞在暴露于单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体后的下降可仅仅归因于信号，其中T细胞经由构建体的CD3臂与常规背景依赖性CD3表位的单纯相互作用接收该信号而不存在任何靶细胞介导的交联。就像在基本上无循环靶B(淋巴瘤)细胞的B-NHL患者中暴露于单链CD19/CD3双特异性抗体构建体而诱导的T细胞重新分布一样，黑猩猩中暴露于单链EpCAM/CD3双特异性抗体构建体后的T细胞重新分布可通过对背景依赖性CD3表位的结合事件后CD3的构象变化进一步导致T细胞粘着于血管内皮的短暂增加来解释(参见实施例20)。这一发现证实，仅经由该相互作用针对背景依赖性CD3表位的常规CD3结合分子可导致外周血T细胞的重新分布模式，这与如实施例20所述的人类CNS不良事件的风险有关。
38.scFv克隆对人类CD3εN末端的特异性结合
38.1在大肠杆菌XL1Blue中scFv构建体的细菌表达
如前所述，在切除基因III片段和使用1mM的IPTG诱导后，以含有VL和VH区段的pComb3H5BHis/Flag转化的大肠杆菌XL1Blue产生足够量的可溶性scFv。所述scFv链被输出到周质并在其中折叠成功能构象。
对此实验选择如下scFv克隆：
i)如WO2004/106380所述的ScFv4-10、3-106、3-114、3-148、4-48、3-190和3-271。
ii)来自本文所述的人类抗CD3ε结合克隆H2C、F12Q和I2C的ScFv。
对于周质制品，将以相应的scFv转化、包含允许周质表达的质粒的细菌细胞生长在补充了20mM MgCl2和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基，并在收集后重新溶解在PBS中。通过四轮在-70℃下冷冻和在37℃下解冻，细菌的外层膜被渗透冲击而毁坏，而包括scFv在内的可溶性周质蛋白被释放到上清液中。在通过离心消除了完整细胞和细胞碎屑后，收集包含人类抗人类CD3-scFv的上清液并用于进一步检查。这些包含scFv的粗制上清液还将被称为周质制品(PPP)。
38.2scFv对人类CD3ε(aa1-27)-Fc融合蛋白的结合
通过将人类CD3ε(aa1-27)-Fc融合蛋白包被到96孔塑料板(Nunc,maxisorb)的孔，一般在4℃过夜而进行ELISA实验。随后除去抗原包被溶液，以PBS/0.05%吐温20洗涤孔一次，随后以PBS/3%BSA封闭至少一小时。除去封闭溶液后，加入PPP和对照溶液到孔中并在室温孵化一般一小时。随后以PBS/0.05%吐温20洗涤孔三次。结合于固定的抗原的scFv的检测使用生物素标记的抗FLAG标签抗体(M2抗Flag-Bio,Sigma,一般以1μg/ml PBS的终浓度)进行，并以过氧化物酶标记的链霉亲和素(Dianova,1μg/ml PBS)检测。通过加入ABTS底物溶液将信号显影并在405nm波长测量。所检测的样品对封闭剂和/或人类CD3ε(aa1-27)-Fc融合蛋白的人类IgG1部分的非特异性结合通过以相同试剂和对ELISA板的相同时间安排进行相同的测定来检查，其中所述ELISA板以人类IgG1(Sigma)包被。PBS用作阴性对照。
如图63所示，scFv H2C、F12Q和I2C显示对人类CD3ε(aa1-27)-Fc融合蛋白的强结合信号。人类scFv3-106、3-114、3-148、3-190、3-271、4-10和4-48(如WO2004/106380所述)不显示高于阴性对照水平的任何显著结合。
为了排除scFv H2C、F12Q和I2C对以人类CD3ε(aa1-27)-Fc融合蛋白包被的孔的阳性结合可能是因为结合于BSA(用作封闭剂)和/或人类CD3ε(aa1-27)-Fc融合蛋白的人类IgG1Fc-γ部分的可能性，平行地进行第二次ELISA实验。在第二次ELISA实验中，所有参数与第一次ELISA实验中的那些参数相同，除了在第二次ELISA实验中以人类IgG1(Sigma)而不是人类CD3ε(aa1-27)-Fc融合蛋白包被。如图64所示，检测的scFv都不显示高于背景水平的对BSA和/或人类IgG1的任何显著结合。
总之，这些结果可以总结出，识别CD3ε背景依赖性表位的常规CD3结合分子(如，WO2004/106380公开的)不特异地结合于人类CD3ε(aa1-27)区，而结合CD3ε背景独立的表位的scFv H2C、F12Q和I2C清楚地显示特异性结合于人类CD3ε的N末端27个氨基酸。
39.CD44和CD3跨物种特异性双特异性单链分子的产生
39.1跨物种特异性结合分子的克隆
通常，如下表15中所列的来设计双特异性单链抗体分子，其中所述双特异性单链抗体分子各自包含具有对人类和猕猴CD3ε跨物种特异性的结合特异性的结构域以及具有对人类和猕猴CD44跨物种特异性的结合特异性的结构域。
表15：抗CD3和抗CD44跨物种特异性双特异性单链抗体分子的型式
包含对人类和猕猴CD44跨物种特异性的可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的VH和VL结构域的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是相应的双特异性单链抗体分子的编码序列，框中随后是组氨酸6标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为引入合适的N和C末端限制性位点。根据标准方案(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以真核表达构建体。
39.2双特异性单链抗体分子的表达
将双特异性构建体在DHFR缺陷型CHO细胞中瞬时表达。简言之，转染前一天，在37℃、95%湿度和7%CO2的培养箱中，将每构建体的4×105个细胞在含有稳定的谷氨酰胺的3mlRPMI1640完全培养基中培养，其中所述RPMI1640完全培养基补充有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和来自细胞培养级试剂储备溶液的核苷(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Taufkirchen,Germany)到终浓度为10μg/ml腺苷、10μg/ml脱氧腺苷和10μg/ml胸苷。根据制造商的方案，以Fugene HD转染试剂(Roche,#04709691001)进行转染。将94μl OptiMEM培养基(Invitrogen)和6μl Fugene HD混合并在室温孵化5分钟。随后，每构建体加入1.5μgDNA，混合并在室温孵化15分钟。同时，以1×PBS洗涤DHFR缺陷型CHO细胞并重悬于1.5mlRPMI1640完全培养基。以600μl RPMI1640完全培养基稀释转染混合物，加入到细胞并在37℃、95%湿度和7%CO2下孵化过夜。转染次日，将各方法的孵化体积扩充到5ml RPMI1640完全培养基。孵化3天后收集上清液。
39.3CD44和CD3跨物种特异性双特异性抗体的流式细胞计量术结合分析
为了检测跨物种特异性双特异性抗体构建体关于分别对人类和猕猴CD44和CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。为此目的，以人类CD44转染的CHO细胞(如实施例28.1所述)和人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)用于检测对人类抗原的结合。使用产生的猕猴CD44转染子(如实施例28.3描述)和猕猴T细胞系4119LnPx(由Fickenscher教授,Hygiene Institute,Virology,Erlangen-Nuernberg友情提供；发表于Knappe A等人和Fickenscher H.,Blood2000,95,3256-61)检测对猕猴抗原的结合反应性。为了证明跨物种特异性双特异性抗体构建体对CD44的特异性，使用以人类CD44delv6转染的CHO细胞(如实施例28.2所述的产生)检测对人类CD44delv6(缺失v6外显子的CD44)的结合。各细胞系的200.000个细胞与50μl的表达跨物种特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞上清液在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测构建体的结合。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的CHO细胞的上清液用作结合于T细胞系的阴性对照。具有无关靶特异性的单链构建体用作结合于CD44和CD44delv6转染的CHO细胞的阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
对CD44跨物种特异性的和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的上述单链分子的双特异性结合是清楚地可检测的，如图65a-d所示。在图65e未观察到分子对CD44delv6的结合。因此清楚地证明了双特异性抗体对人类和猕猴CD3和CD44抗原的跨物种特异性。
39.4CD44和CD3跨物种特异性双特异性单链抗体的生物活性
使用28.1所述的人类CD44阳性细胞系通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定来分析所产生的双特异性单链抗体的生物活性。如各图所示，使用刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC、刺激的人类PBMC作为效应细胞。
刺激的CD4/CD56耗尽的PBMC的产生如下进行：
培养皿(145mm直径,Greiner bio-one GmbH,Kremsmünster)的包被以终浓度1μg/ml的可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Othoclone)在37℃进行1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的120ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。根据标准方案，通过耗尽CD4+T细胞和CD56+NK细胞而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
靶细胞以PBS洗涤两次并以含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11.1MBq51Cr在37℃标记45分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板中以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定，E:T比为10:1。含有跨物种特异性双特异性单链抗体分子的细胞上清液和其20个两倍稀释物用于人类细胞毒性测定。测定时间是18小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)进行。如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。通过分析程序计算的EC50值用于比较生物活性。
如图66所示，所有产生的跨物种特异性双特异性单链抗体构建体证明了由刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC引起的针对CD44阳性靶细胞的细胞毒性活性。
40.HCV抗原和CD3跨物种特异性双特异性串联单链抗体片段的产生
40.1.表达HCV包膜糖蛋白E2(HCV基因型1a和1b)的CHO细胞的产生
根据标准方案，由基因合成获得了各作为与人类CD4跨膜和细胞内结构域的翻译融合蛋白的丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白E2(HCV基因型1a和1b，相应亚型的HCV分离株；序列根据标准方案确定)的编码序列。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是14个氨基酸的信号肽的编码序列，随后是HCV E2包膜糖蛋白前278个(基因型1a)或279个(基因型1b)氨基酸(双myc表位序列)的编码序列，以及对应于成熟蛋白氨基酸372到433的人类CD4跨膜和细胞内结构域(如GenBank登录号M12807公开的)和终止密码子的编码序列(构建体的cDNA和氨基酸序列列在SEQ ID NO HCV-1到HCV-4，分别是基因型1a和1b)。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入限制性位点。所引入的限制性位点，即在5'末端的EcoRI和在3'末端的SaII用于如下克隆程序。遵循标准方案，经由EcoRI和SaII将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人,Cancer Immunol.Immunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold SpringHarbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达构建体。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。最终产生两种细胞系：在表面上表达HCV E2结构域基因型1a的CHO细胞系和在表面上表达HCV E2结构域基因型1b的另一CHO细胞系。
40.2跨物种双特异性串联单链抗体片段的克隆
通常，如下表16中所列的来设计双特异性串联单链抗体片段，其中所述双特异性串联单链抗体片段包含具有对人类和猕猴CD3ε跨物种特异性的结合特异性的结构域以及具有对HCV的结合特异性的结构域：
表16：抗CD3跨物种特异性和抗HCV抗原特异性双特异性串联单链抗体片段的型式
包含对HCV抗原特异性的可变轻链(L)和可变重链(H)结构域和对人类和猕猴CD3跨物种特异性的VH和VL组合的上述构建体通过基因合成获得。基因合成片段设计为首先包含用于构建体的真核表达的Kozak位点，随后是19个氨基酸的免疫球蛋白前导肽，框中随后是双特异性串联单链抗体片段的编码序列，框中随后是组氨酸6标签和终止密码子的编码序列。基因合成片段还设计为在片段的始端和末端引入合适限制性位点。引入的限制性位点用于如下克隆程序。根据标准方案，经由这些限制性位点将基因合成片段克隆到称为pEF-DHFR的质粒(pEF-DHFR描述于Raum等人，Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)。前述程序根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold SpringHarbour,New York(2001))。将具有验证序列的核苷酸序列的克隆转染到DHFR缺陷型CHO细胞以真核表达双特异性串联单链抗体片段。在DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过增加甲氨蝶呤(MTX)的浓度至终浓度达20nM MTX来诱导构建体的基因扩增。
40.3双特异性串联单链抗体片段的表达和纯化
双特异性串联单链抗体片段在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。DHFR缺陷型CHO细胞中的真核蛋白表达如Kaufmann R.J.(1990)Methods Enzymol.185,537-566所述的进行。通过加入增加浓度的MTX达20nM MTX的终浓度而诱导构建体的基因扩增。静止培养两次传代后，使细胞在有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%Pluronic F-68;HyClone)的滚瓶中生长7天随后收集。通过离心除去细胞，并将包含表达的蛋白的上清液储存在-20℃。可选地，构建体瞬时表达在HEK293细胞中。根据制造商的方案，以293fectin试剂(Invitrogen,#12347-019)进行转染。
Explorer系统(GE Health Systems)和软件用于色谱。根据制造商提供的方案，使用负载有ZnCl2的Fractogel EMD(Merck)进行固定的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)。以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl,0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：
步骤1：6柱体积的20%缓冲液B
步骤2：6柱体积的100%缓冲液B
汇集步骤2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐,200mM赖氨酸,5%甘油,pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。将洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印记进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒,Sigma MW GF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。
在还原性条件下使用SDS PAGE分析纯化的双特异性串联单链抗体片段，其中所述SDS PAGE以预制的4-12%Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行。根据制造商提供的方案，进行样品制备和应用。以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为>95%。
如PBS中的凝胶过滤所确定的，双特异性串联单链抗体片段在天然条件下具有约52kDa的分子量。
根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印记。使用的抗体是针对His标签(5His,Qiagen)和以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig，且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性串联单链抗体片段的单个条带。
40.4HCV抗原和CD3跨物种特异性双特异性串联单链抗体片段的流式细胞计量术结合分析
为了检测跨物种特异性双特异性串联单链抗体片段关于分别对HCV抗原和人类和猕猴CD3的结合能力的功能性，进行了FACS分析。为此目的，如实施例40.1所述的以来自两种不同HCV基因型(1a和1b)的HCV抗原E2转染的CHO细胞、人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)和猕猴T细胞系4119LnPx用于检测对相应抗原的结合。各细胞系的200000个细胞与50μl的表达跨物种特异性双特异性抗体构建体的转染细胞的细胞培养物上清液在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测双特异性串联单链抗体片段的结合。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。含有2%FCS的PBS用作阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
双特异性串联单链抗体片段对HCV抗原和对人类和非黑猩猩灵长类CD3的双特异性结合是清楚地可检测的，如图67所示。在FACS分析中，与相应的阴性对照相比，双特异性串联单链抗体片段显示结合于CD3和HCV抗原。证明了双特异性串联单链抗体片段一方面对人类和猕猴CD3的跨物种特异性和另一方面的HCV特异性。
40.5HCV抗原和CD3跨物种特异性双特异性串联单链抗体片段的生物活性
使用实施例40.1所述的HCV抗原阳性细胞系通过铬51(51Cr)释放的体外细胞毒性测定来分析双特异性串联单链抗体片段的生物活性。使用来自两个不同供者的刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC作为效应细胞。
培养皿(145mm直径,Greiner bio-one GmbH,Kremsmünster)以终浓度1μg/ml的可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Othoclone)在37℃包被1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的120ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。
根据标准方案，通过耗尽CD4+T细胞和CD56+NK细胞而富集CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
靶细胞以PBS洗涤两次并以在含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11.1MBq51Cr在37℃标记45分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板中以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定，E:T比为10:1。施加76.4μg/ml的跨物种特异性双特异性串联单链抗体片段和其20个两倍稀释物。测定时间是18小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)进行。
如图68所示，跨物种特异性双特异性串联单链抗体片段证明了针对人类HCV抗原阳性靶细胞的细胞毒性活性。
41.针对在感染的细胞表面上展示的人类和非黑猩猩灵长类CD3和肝炎病毒抗原的双特异性串联单链抗体片段
41.1乙型肝炎病毒(HBV)
末端段大约15-20个核苷酸互相重叠且其中每个第二引物是反义引物的如下简并寡核苷酸用于为CDRH1(SEQ ID1634)、CDRH2(SEQ ID1635)和CDRH3(SEQ ID1636)提供人类VH序列背景：
5'CB-VH-A-Xhol
CCACTTCTCGAGTCTGGCGSCCRASTGMWGMAGCCTGGCGSGTCCSTGMRGS
TGTCCTGCRMGGCCTCCGGC
3'C8-VH-B
CCCTGGAGCCTGCCGCACGCAGGACATGGCGTAGCCGGWGAAGGTGWAGCC
GGAGGCCKYGCAGGA
5'G8-VH-C
CGGCAGGCTCCAGGGMAGGGACTGGAATGGRTGRGCTCCATCTCCGGCTCCG
GCGGCTCCACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGG
3'CB-VH-D
CTTGGCGCAGTAGTACASGGCGGTGTCCTCGGMCCGCAGGGAGYTCAKCTSCA
XGTACASGGTGYTCKTGGAGKTGTCCCGGSTSATTGTGAMCCGGCCCTTCACG
GA
3'CB-VH-E-BstEll
GACCGTGGTGACCAGGGTGCCCTGGCCCCAGTTGCCCAGAGGGAAGTAGTAG
ATGGAGGAGCCGTAGTATTCCTGCCGGCCAGGAGGCTTGGCGCAGTAGTA
该引物组跨越了整个VH序列。在该组中，引物以等量混合(如，1μl的每种引物(引物储备溶液20μM至100μM)加到20μl PCR反应)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物。该混合物在PCR循环仪中在94℃孵化3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中运行且根据标准方法从凝胶分离200至400大小的产物。
所得的VH PCR产物随后用作标准PCR反应的模板，使用并入N末端和C末端合适克隆限制性位点的引物(引物5'C8-VH-A-XhoI和引物3'C8-VH-E-BstEII)。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(对于VH，大约350个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VH DNA片段。
末端段大约15-20个核苷酸互相重叠且其中每个第二引物是反义引物的如下简并寡核苷酸用于为CDRL1(SEQ ID1639)、CDRL2(SEQ ID1640)和CDRL3(SEQ ID1641)提供人类VL序列背景，所述CDRL1(SEQ ID1639)、CDRL2(SEQ ID1640)和CDRL3(SEQ ID1641)是附加于CDRH1(SEQ ID1634)、CDRH2(SEQ ID1635)和CDRH3(SEQ ID1636)的：
5'C8-VI-A-Sacl
CCTCAAGAGCTCGCCCTGAYGCAGCCTSCCTCCGTGTCCGTGKCCCYTGGCMA
GACCGCCMGCATGACCTGCGGCGGCAAC
3'C8-Vl-B
CAGCACAGGGGMCTGTCCTGGCTTCTGCTGATACCAGTGCACGGACTTGGAGC
CGATGTTGTTGCCGCCGCAGGTGAT
5'C8-Vl-C
CAGAAGCCAGGACAGKCCCCTGTGCTGGTCRTATACGACGACTCCGACCGCCC
TTCCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCCGGCTCC
3'C8-Vl-D
GACCTGGCAGTAGTAGTCGGCCTCGTCCMYGGCCTSCRCCCSGGAGATGGTCA
GGGTGRCGGTGKTGGCGGAGYTGGAGCCGGAGAACCG
3'CB-VI-E-BsiWl／Spel
CCCGATACTAGTCGTACGCAGCACGGTCAGCTTTGTTCCGCCGCCAAACACCA
CCAGGTCGGAGGAGGAGTCCCAGACCTGGCAGTAGTAGTCGGC
该引物组跨越了整个相应的VL序列。在该组中，引物以等量混合(如，1μl的每种引物(引物储备溶液20μM至100μM)加到20μl PCR反应)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物。该混合物在PCR循环仪中在94℃孵化3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中运行且根据标准方法从凝胶分离200至400大小的产物。
所得的VL PCR产物随后用作标准PCR反应的模板，使用了并入N末端和C末端合适克隆限制性位点的引物(引物5'C8-VI-A-SacI和引物3'C8-VI-E-BsiWI/SpeI)。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(对于VL，大约330个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VL DNA片段。
在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis中，最终VH PCR产物(即人类/人源化VH的所有组成成分)随后与其相应的最终VL PCR产物(即人类/人源化VL的所有组成成分)组合以形成功能scFv抗体片段的文库，在丝状噬菌体上展示后从所述文库如下述地选择、筛选、鉴定和证实抗HBS结合子：
450ng轻链片段(SacI-SpeI消化的)与1400ng嗜菌粒pComb3H5Bhis(SacI-SpeI消化的；大片段)连接。随后将所得的组合的抗体文库由电穿孔(2.5kV,0.2cm间隙的电击杯,25uFD,200Ohm,Biorad的gene-pulser电穿孔仪)转化到300ul电感受态的大肠杆菌XL1Blue细胞，得到多于107独立克隆的文库大小。一小时的表型表达后，在100ml液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5BHis载体编码的羧苄青霉素抗性的阳性转化体。随后离心收集细胞并使用可购买获得的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备。
2800ng包含VL文库(XhoI-BstEII消化的；大片段)的该质粒-DNA与900ng重链V片段(XhoI-BstEII消化的)连接并再次由电穿孔(2.5kV,0.2cm间隙的电击杯,25uFD,200Ohm)转化到两个300ul份的电感受态的大肠杆菌XL1Blue细胞，获得多于107独立克隆的VH-VLscFv抗体片段的总文库大小。
表型表达和缓慢地适应羧苄青霉素后，将包含抗体文库的大肠杆菌细胞转移到SB-羧苄青霉素(50ug/mL)选择培养基。随后以感染剂量的1012个辅助噬菌体VCSM13粒子感染包含抗体文库的大肠杆菌细胞，导致丝状M13噬菌体的产生和分泌，其中噬菌体粒子包含编码scFv抗体片段的单链pComb3H5BHis-DNA并展示作为翻译融合于噬菌体外壳蛋白III的相应的scFv抗体片段。展示抗体文库的这个噬菌体池用于选择抗原结合实体。
类似地，前述程序用于另一靶结合子。为此目的，末端段大约15-20个核苷酸互相重叠且其中每个第二引物是反义引物的如下简并寡核苷酸用于为CDRH1(SEQ ID1669)、CDRH2(SEQ ID1670)和CDRH3(SEQ ID1671)提供人类VH序列背景：
5'C9-VH-A-Xhol
CCACTTCTCGAGTCTGGGGSAGRGGTGRWGMAGCCTGGGRSGTCCSTGARAS
TCTCCTGTGCAGCCTCTGGA
3'C9-VH-B
CCACTCCAGCCCCTKGCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGTGTATGCCATAA77AC
TGAAGGTGWATCCACAGGCTGCACAGGA
5'C9-VH-C
GCTCCAGGCMAGGGGCTGGAGTGGRTGGSACTTATATCATATGATGGAAATAA
GAAATTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGA
3'C9-VH-D
GTAATATACAGCCGTGTCCTCAGRTCTCAGGCTGCTCAKTTSCAKATMCACCGT
CYTCKTAGAAGTGTCTCTGGTSATGGYGAMTCGGCCCTTCACGGAGTC
3'C9-VH-E-BstEll
GACCGTGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGTAGTCAAATTCCCCCCAGTACA
AGGCAATACCCCCAGATTTCGCACAGTAATATACAGCCGTGTC
作为将N末端和C末端合适克隆限制性位点并入到VH的最终标准PCR反应的引物，使用了寡核苷酸5'C9-VH-A-XhoI和3'C9-VH-E-BstEII。
类似于VH，末端段大约15-20个核苷酸互相重叠且其中每个第二引物是反义引物的如下简并寡核苷酸用于为CDRL1(SEQ ID1672)、CDRL2(SEQ ID1673)和CDRL3(SEQID1674)提供人类VL序列背景，所述CDRL1(SEQ ID1672)、CDRL2(SEQ ID1673)和CDRL3(SEQID1674)是附加于CDRH1(SEQ ID1669)、CDRH2(SEQ ID1670)和CDRH3(SEQ ID1671)的：
5'C9-VI-A-Sacl
CCTCAAGAGCTCGWACTGACTCACCCACCCTCGCTGTCAGYGGCCCCAGGACA
GAMGGYCAYGATTTCCTGTGGGGGAAAC
3'C9-VI-B
GCCTGGCWKCTGCTGATACCAGTGCACGGTTGTACTTCCAATGTTGTTTCCCCC
ACAGGAAAT
5'C9-VI-C
TGGTATCAGCAGMWGCCAGGCMMGGCCCCTRWCCTGSTCRTCTATGATGATA
ACGAGCGACCCTCAGGGATCCCTGASCGATTCTCTGGCTCC
3'C9-VI-D
CACTTGACAATAATAGTCGGCCTCATCCCCGGYTTSGASCCYGKTGATGSYCAG
GGTGGCCGAGGTCCCAGASTTGGAGCCAGAGAATCG
3'C9-VI-E-BsiWl/Spel
CCCGATACTAGTCGTACGTAGGACGGTCAGCTTCGTCCCTCCGCCGAATACCA
CATGATCACTACCACTATCCCACACTTGACAATAATAGTC
作为将N末端和C末端合适克隆限制性位点并入到VL的最终标准PCR反应的引物，使用了寡核苷酸5'C9-VI-A-SacI和3'C9-VI-E-BsiWI/SpeI。
为了选择抗原结合实体，通过PEG(聚乙二醇)8000/NaCl沉淀和离心从相应的培养物上清液收集携带克隆的scFv所有组成成分的噬菌体文库。将大约1011至1012个scFv噬菌体粒子重悬于0.4ml的PBS/0.1%BSA并与固定的HBS抗原(如，EngerixR-B,GlaxoSmithKline,Germany；HBvaxProTM,Aventis Pasteur MSD SNC,France)在轻柔搅拌下在37℃孵化2h。根据标准方案，将固定的HBS抗原(如，5μg/ml PBS)包被到孔且随后封闭孔。
以PBS/0.1%BSA(吐温20可加入到洗涤溶液以增加洗涤严格性)的洗涤步骤除去展示不特异性结合于靶抗原的scFv抗体片段的噬菌体粒子。洗涤后，通过使用HCl-甘氨酸pH2.2洗脱结合实体，以2M Tris pH12中和后，洗脱物用于感染新鲜未感染的大肠杆菌XL1Blue培养物。
为了洗脱洗脱孔中剩余的强结合实体，向洗脱孔加入200ul新鲜大肠杆菌XL1blue培养物(OD600>0.5)并在轻柔搅拌下进一步孵化10分钟。然后混合两种大肠杆菌培养物，并且再次对成功转导编码人类scFv抗体片段的嗜菌粒拷贝的细胞进行羧苄青霉素抗性选择且随后以VCMS13辅助噬菌体感染以开始第二轮抗体展示和体外选择。通常共进行4至5轮选择。
为了筛选HBS特异性结合子，在选择后，对应于4和5轮淘洗的质粒DNA从大肠杆菌培养物中被分离。为了产生可溶性scFv抗体片段，VH-VL-DNA片段从所述质粒（XhoI-SpeI）被切除。这些片段通过相同的限制性位点被克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建体（例如scFv抗体片段）包含在scFv抗体片段和His6标签之间的Flag标签（D YKDDDDK）以及其他的噬菌体蛋白被删除。在连接之后，每个质粒DNA池（不同淘洗轮次）被转化进100μl热激感受态大肠杆菌TG1或XL1blue并被铺在羧苄青霉素LB-琼脂上。单个克隆被挑选放入100μl的LB羧苄青霉素（50μg/ml）。
在切除基因III片段和使用1mM的IPTG诱导后，以含有VL和VH区段的pComb3H5BHis转化的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv抗体片段。由于适合的信号序列，所述scFv抗体片段被输出到周质并在其中折叠成功能构象。
来自转化板的单个大肠杆菌TG1细菌菌落被挑选用于周质小量制备，并在补充了20mM的MgCl2和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基（例如10ml）中生长，并且在收集后被再溶解于PBS（例如1ml）。通过四轮在-70℃下冷冻和在37℃下解冻，细菌的外层膜被温度冲击而毁坏，而包括scFv抗体片段在内的可溶性周质蛋白被释放到上清液中。在通过离心消除了完整细胞和细胞碎屑后，收集包含抗HBS scFv抗体片段的上清液并用于如下鉴定HBS特异性结合子：
将HBS抗原包被到96孔塑料板(Nunc,maxisorb)的孔，一般在4℃过夜。以PBS/0.05%吐温20洗涤孔一次，随后以PBS/3%BSA封闭至少一小时。除去封闭溶液后，加入周质制品和对照溶液到孔中并在室温孵化一般一小时。随后以PBS/0.05%吐温20洗涤孔三次。结合于固定的抗原的scFv抗体片段和对照抗体的检测使用单克隆鼠抗His6或抗FLAG标签抗体(Qiagen抗5His和M2抗Flag Sigma,一般各以1μg/ml PBS的终浓度)进行，以过氧化物酶标记的多克隆山羊抗小鼠Fab片段抗体(Dianova,1ug/ml PBS)检测。通过加入ABTS底物溶液将信号显影并在405nm波长测量。所检测的样品对封闭剂的非特异性结合通过以相同试剂和对ELISA板的相同计时进行相同测定来检查，其中所述ELISA板未以抗原包被而是仅以BSA封闭。
为了排除阳性结合可能是因为结合于BSA(在第一次ELISA实验中用作封闭剂)的可能性，平行地进行第二次ELISA实验。在第二次ELISA实验中，所有参数与第一次ELISA实验中的那些参数相同，除了在第二次ELISA实验中不以抗原包被，而是仅发生以BSA封闭。
为了鉴定由ELISA鉴定的那些HBS特异性scFv抗体片段，以加FLAG标签的scFv抗体片段随后是FITC-共轭的抗FLAG抗体对HepG2.2.15细胞(Bohne F,Chmielewski M,Ebert G等人,T cells redirected against hepatitis B virus surface proteins eliminateinfected hepatocytes(对乙型肝炎病毒表面蛋白重定向的T细胞除去了感染的肝细胞)Gastroenterology2008;134:239-47)的间接免疫荧光根据标准方案(如，免疫学最新方案(Current Protocols in Immunology),Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002,单元21.3)进行，其中所述HBS特异性scFv抗体片段还结合于HBV感染的细胞表面上展示的HBS抗原。未感染的HepG2细胞作为阴性对照。在细胞表面上最佳展示HBS抗原的HepG2.2.15细胞的培养条件描述于Bohne等人(Bohne F,Chmielewski M,Ebert G等人,T cells redirected against hepatitis B virussurface proteins eliminate infected hepatocytes(对乙型肝炎病毒表面蛋白重定向的T细胞除去了感染的肝细胞)Gastroenterology2008;134:239-47)。
随后分析了经证实特异性地结合于HBV感染的细胞表面上的HBS抗原的克隆的有益蛋白特征和氨基酸序列。将HBS特异性scFv抗体片段转变为重组双特异性串联单链抗体片段，通过将HBS特异性scFv抗体片段经由Gly4Ser1-连接体与CD3特异性scFv抗体片段I2C(SEQ ID185)或本发明的任何其它CD3特异性scFv抗体片段连接以产生结构域排列为VHMuc1-(Gly4Ser1)3-VLMuc1-Gly4Ser1-VHCD3-(Gly4Ser1)3-VLCD3或可选的结构域排列的构建体。对于在CHO细胞中表达，(i)包含埋入Kozak共有序列的起始密码子的N末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)C末端His6标签随后是终止密码子的编码序列两者都符合读框地连接于编码双特异性串联单链抗体片段的核苷酸序列，随后将通过基因合成获得的所得的DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等人，Cancer Immunol Immunother50(2001)141-150)的多个克隆位点。如所述地进行DHFR缺陷型CHO细胞的稳定转染，分泌双特异性单链抗体到培养物上清液的DHFR阳性转染子的选择，以及使用密都锭的基因扩增以增加表达水平(Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)。所有其它陈述的本领域程序都根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;A Laboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold Spring Harbour,NewYork(2001))。
通过ELISA和流式细胞计量术使用来自转染的CHO细胞的培养物上清液鉴定功能双特异性串联单链抗体片段。为此目的，对人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)和猕猴T细胞系4119LnPx检测CD3结合。各细胞系的200.000个细胞与50μl的细胞培养物上清液在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)结合的双特异性串联单链抗体片段。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的CHO细胞的上清液用作阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行，并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。如上所述的由ELISA来检测对HBS抗原的结合。对结合的双特异性串联单链抗体片段的检测使用单克隆鼠抗His6抗体(Qiagen抗5His，一般以1μg/ml PBS的终浓度)随后是过氧化物酶标记的多克隆山羊抗小鼠Fab片段抗体(Dianova,1ug/ml PBS)进行。
只选择显示对人类和猕猴CD3以及HBS抗原的双特异性结合的那些构建体用于进一步应用。
为了产生蛋白，将表达完全功能双特异性串联单链抗体片段并适于无核苷的HyQPF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%Pluronic F-68;HyClone)的CHO细胞在具有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%Pluronic F-68;HyClone)的滚瓶中生长7天。通过离心从细胞澄清培养物上清液并储存在-20℃直到纯化。作为从培养物上清液纯化双特异性串联单链抗体片段的色谱设备，使用Explorer系统(GE Health Systems)和软件。根据制造商提供的方案，使用负载有ZnCl2的Fractogel EMD(Merck)进行固定的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)。以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl,0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：
步骤1：6柱体积的20%缓冲液B
步骤2：6柱体积的100%缓冲液B
汇集步骤2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐,200mM赖氨酸,5%甘油,pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。将洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印记进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒,Sigma MW GF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。
在还原性条件下使用SDS PAGE分析纯化的双特异性串联单链抗体片段，其中所述SDS PAGE以预制的4-12%Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行。根据制造商提供的方案，进行样品制备和应用。以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为>95%。
如PBS中的凝胶过滤所确定的，双特异性串联单链抗体片段在天然条件下具有约52kDa的分子量。根据该方法纯化所有构建体。
根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印记。为了检测双特异性串联单链抗体片段，使用了抗His标签抗体(5His,Qiagen)。以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig抗体用作二抗，且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性串联单链抗体片段的单个条带。
在人类和非黑猩猩灵长类系统中，双特异性串联单链抗体片段与人类和猕猴CD3和与HBS抗原相互作用的能力由非放射性的细胞毒性测定确定，如Bohne等人描述的(BohneF,Chmielewski M,Ebert G等人,T cells redirected against hepatitis B virussurface proteins eliminated infected hepatocytes(对乙型肝炎病毒表面蛋白重定向的T细胞除去了感染的肝细胞)Gastroenterology2008;134:239-47)使用HepG2.2.15细胞作为靶细胞，和刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx而不是以嵌合T细胞受体转导的T细胞作为效应细胞。为了获得剂量-响应曲线，在细胞毒性测定中以固定的E:T比(如，10:1或5:1)滴定各种双特异性串联单链抗体片段的浓度(而不是如Bohne等人描述的E:T比)。
刺激的人类PBMC的产生如下进行：
培养皿(85mm直径,Nunc)以终浓度1μg/ml的可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Othoclone)在37℃包被1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的50ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。
来自细胞毒性测定的试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)进行。如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。作为效能量度的EC50值以分析程序计算。
41.2丙型肝炎病毒(HCV)
末端段大约15-20个核苷酸互相重叠且其中每个第二引物是反义引物的如下简并寡核苷酸用于为CDRH1(SEQ ID1652)、CDRH2(SEQ ID1653)和CDRH3(SEQ ID1654)提供人类VH序列背景：
5'HG1-VH-A-Xhol
CAGCTACTCGAGTSGGGCGSAGGACTGKTGMAGCCTKSGGRGTCCCTGAGWC
TCTCCTGCGCTG
3'HG1-VH-B
CCACTCCAGCCCCTTCCCAGGGGMCTGGCGGAYCCAGGTCCAGAAGTAACCAC
TWAAGGTAMMACCAKAGRCAGCGCACGAGAGWCTCAGGGAC
5'HC1-VH-C
CTGGGAAGGGGCTGGAGTGGRTTRGTGAAAGCAATTATAGTGGAAGTACCAGG
TACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAKTCACCATATCA
3'HC1-VH-D
ATACAGCCGTGTCCKCGGCTSTCASAGAAYTCAKCTKCAGGKAGARCKKGTTCT
KGGAGKTGTCTMYTGATATGGTGAMTGGACTCTTG
5'HC1-VH-E
AGCCGMGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGGTTGGGCGGTGGACGGT
ATGGAGGTCTGGGGCCGAGGGACCTTGGTCACCGTC
3'HG1-VH-F-BstEll
GAGACGGTGACCAAGGTCCCTCGGCCCCAGACGTCCATACC
该引物组跨越了整个VH序列。在该组中，引物以等量混合(如，1μl的每种引物(引物储备溶液20μM至100μM)加到20μl PCR反应)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物。该混合物在PCR循环仪中在94℃孵化3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中运行且根据标准方法从凝胶分离200至400大小的产物。
所得的VH PCR产物随后用作标准PCR反应的模板，使用了并入N末端和C末端合适克隆限制性位点的引物(引物5’ΗC1-VH-A-XhoI和引物3’ΗC1-VH-F-BstEII)。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(对于VH，大约350个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VH DNA片段。
末端段大约15-20个核苷酸互相重叠且其中每个第二引物是反义引物的如下简并寡核苷酸用于为CDRL1(SEQ ID1657)、CDRL2(SEQ ID1658)和CDRL3(SEQ ID1659)提供人类VL序列背景，所述CDRL1(SEQ ID1657)、CDRL2(SEQ ID1658)和CDRL3(SEQ ID1659)是附加于CDRH1(SEQ ID1652)、CDRH2(SEQ ID1653)和CDRH3(SEQ ID HC11654)的：
5'HG1-VI-A-Sacl
ACTAGCGAGCTCGWGCTGACACAGCCACCCTCG
5'HC1-VI-B
GCTGACACAGCCACCCTCGGYGTCAGKGACCCCAGGACAGASGGYCASGATCT
CCTGCTCTGGAGATGCATTGCCAAAGCAATATGC
3'HC1-VI-C
CCCTGAGGGCCTCTCATTATCTTTATATATCASCAACWYTGGGGCCKKGCCTGG
CWKCTGCTGATACCAGTAAGCATATTGCTTTGGCAATGC
5'HG1-VI-D
GATAATGAGAGGCCCTCAGGGRTCCCTGASCGATTCTCTGGCTCCARGTCAGG
GACATCAGYCTCGTTGRCCATCAGTGGASTCMRGKCAGAAGACGAGGCTGACT
A
3'HG1-Vl-E-BsiWliSpel
GCTACTACTAGTCGTACGTAGGACGGTCAGCTCGCTCCCTCCGCCGAACACCC
AGGAAGAACCACTGCTGTCTGCTGATTGACAGTAATAGTCAGCCTCGTCTTCTG
该引物组跨越了整个相应的VL序列。在该组中，引物以等量混合(如，1μl的每种引物(引物储备溶液20μM至100μM)加到20μl PCR反应)并加至由PCR缓冲液、核苷酸和Taq聚合酶组成的PCR混合物。该混合物在PCR循环仪中在94℃孵化3分钟、65℃1分钟、62℃1分钟、59℃1分钟、56℃1分钟、52℃1分钟、50℃1分钟和在72℃10分钟。随后产物在琼脂糖凝胶电泳中运行且根据标准方法从凝胶分离200至400大小的产物。
所得的VL PCR产物随后用作标准PCR反应的模板，使用了并入N末端和C末端合适克隆限制性位点的引物(引物5’HC1-VI-A-SacI和引物3’ΗC1-VI-E-BsiWI/SpeI)。根据标准方法由琼脂糖凝胶电泳分离正确大小的DNA片段(对于VL，大约330个核苷酸)。以这种方式扩增了足够的VL DNA片段。
在噬菌体展示载体pComb3H5Bhis中，最终VH PCR产物(即人类/人源化VH的所有组成成分)随后与其相应的最终VL PCR产物(即人类/人源化VL的所有组成成分)组合以形成功能scFv抗体片段的文库，在丝状噬菌体上展示后从所述文库如下述地选择、筛选、鉴定和证实抗HBS结合子：
450ng轻链片段(SacI-SpeI消化的)与1400ng嗜菌粒pComb3H5Bhis(SacI-SpeI消化的；大片段)连接。随后将所得的组合的抗体文库由电穿孔(2.5kV,0.2cm间隙的电击杯,25uFD,200Ohm,Biorad的gene-pulser电穿孔仪)转化到300ul电感受态的大肠杆菌XL1Blue细胞，得到多于107独立克隆的文库大小。一小时的表型表达后，在100ml液体超级肉汤(SB)培养物中过夜选择pComb3H5BHis载体编码的羧苄青霉素抗性的阳性转化体。随后离心收集细胞并使用可购买获得的质粒制备试剂盒(Qiagen)进行质粒制备。
2800ng包含VL文库(XhoI-BstEII消化的；大片段)的该质粒-DNA与900ng重链V片段(XhoI-BstEII消化的)连接并再次由电穿孔(2.5kV,0.2cm间隙的电击杯,25uFD,200Ohm)转化到两个300ul份电感受态的大肠杆菌XL1Blue细胞，获得多于107独立克隆的VH-VLscFv(单链可变片段)的总文库大小。
表型表达和缓慢地适应羧苄青霉素后，将包含抗体文库的大肠杆菌细胞转移到SB-羧苄青霉素(50μg/mL)选择培养基。随后以感染剂量的1012个辅助噬菌体VCSM13粒子感染包含抗体文库的大肠杆菌细胞，导致丝状M13噬菌体的产生和分泌，其中噬菌体粒子包含编码scFv抗体片段的单链pComb3H5BHis-DNA并展示作为翻译融合于噬菌体外壳蛋白III的相应的scFv抗体片段。展示抗体文库的这种噬菌体池用于选择抗原结合实体。
为此目的，通过PEG8000/NaCl沉淀和离心从相应的培养物上清液收集携带克隆的scFv抗体片段所有组成成分的噬菌体文库。将大约1011至1012个展示scFv抗体片段的噬菌体粒子重悬于0.4ml的PBS/0.1%BSA并在冰上以缓慢搅动与105至107个以如实施例40.1所述的来自HCV基因型1a和/或1b的HCV抗原E2转染的CHO细胞孵化1小时。这些HCV抗原转染的CHO细胞预先通过离心收集，在PBS中洗涤并重悬于PBS/1%FCS(包含叠氮化钠)。以PBS/1%FCS(包含叠氮化钠)共达五次的洗涤步骤除去展示不特异性结合于HCV抗原转染的CHO细胞的scFv抗体片段的噬菌体粒子。洗涤后，通过将细胞重悬在HCl-甘氨酸pH2.2(10min孵化、随后涡旋)从细胞洗脱结合实体，以2M Tris pH12中和后，洗脱物用于感染新鲜未感染的大肠杆菌XL1Blue培养物(OD600>0.5)。再次对包含成功转导编码人类/人源化scFv抗体片段的嗜菌粒拷贝的大肠杆菌细胞的大肠杆菌培养物进行羧苄青霉素抗性选择且随后以VCMS13辅助噬菌体感染以开始第二轮抗体展示和体外选择。通常共进行4至5轮选择。
为了筛选HCV抗原特异性结合子，在选择后，对应于4和5轮淘洗的质粒DNA从大肠杆菌培养物中被分离。为了产生可溶性scFv抗体片段，VH-VL-DNA片段从所述质粒（XhoI-SpeI）被切除。这些片段通过相同的限制性位点被克隆到质粒pComb3H5BFlag/His中，其中所述质粒pComb3H5BFlag/His与原始pComb3H5BHis的区别在于所述表达构建体（例如scFv抗体片段）包含在scFv抗体片段和His6标签之间的Flag标签（DYKDDDDK）以及其他的噬菌体蛋白被删除。在连接之后，每个质粒DNA池（不同淘洗轮次）被转化进100μl热激感受态大肠杆菌TG1或XL1blue并被铺在羧苄青霉素LB-琼脂上。单个克隆被挑选放入100μl的LB羧苄青霉素（50μg/ml）。
在切除基因III片段和使用1mM的IPTG诱导后，以含有VL和VH区段的pComb3H5BHis转化的大肠杆菌产生足够量的可溶性scFv抗体片段。由于适合的信号序列，所述scFv抗体片段被输出到周质并在其中折叠成功能构象。
来自转化板的单个大肠杆菌TG1细菌菌落被挑选用于周质小量制备，并在补充了20mM的MgCl2和羧苄青霉素50μg/ml的SB培养基（例如10ml）中生长，并且在收集后被再溶解于PBS（例如1ml）。通过四轮在-70℃下冷冻和在37℃下解冻，细菌的外层膜被温度冲击而毁坏，而包括scFv抗体片段在内的可溶性周质蛋白被释放到上清液中。在通过离心消除了完整细胞和细胞碎屑后，收集包含抗HCV scFv抗体片段的上清液并用于如下鉴定HCV抗原特异性结合子：
由流式细胞计量术对HCV抗原转染的CHO细胞检测scFv抗体片段对HCV的结合(参见实施例40.1)；未转染的CHO细胞用作阴性对照。
对于流式细胞计量术，将2.5×105个细胞与50ul的周质制品scFv抗体片段或与含有2%FCS的50μl PBS中的5μg/ml纯化的scFv抗体片段一起孵化。以含有2%FCS的50μl PBS中2μg/ml的抗His抗体(5His抗体、无BSA,Qiagen GmbH,Hilden,FRG)检测scFv抗体片段的结合。作为第二步骤试剂，使用在含有2%FCS的50μl PBS中1:100稀释的R-藻红蛋白-共轭的亲和纯化的F(ab')2片段，山羊抗小鼠IgG(Fc-γ片段特异性)(Dianova,Hamburg,FRG)。在FACSscan(BD biosciences,Heidelberg,FRG)上测量样品。
随后分析单个克隆的有益特征和氨基酸序列。将HCV特异性scFv抗体片段转变为重组双特异性串联单链抗体片段，通过将HCV特异性scFv抗体片段经由Gly4Ser1-连接体与CD3特异性scFv抗体片段I2C(SEQ ID185)或本发明的任何其它CD3特异性scFv抗体片段连接以产生结构域排列为VHMuc1-(Gly4Ser1)3-VLMuc1-Gly4Ser1-VHCD3-(Gly4Ser1)3-VLCD3或可选的结构域排列的构建体。对于在CHO细胞中表达，(i)包含埋入Kozak共有序列的起始密码子的N末端免疫球蛋白重链前导序列和(ii)C末端His6标签随后是终止密码子的编码序列两者都符合读框地连接于编码双特异性串联单链抗体片段的核苷酸序列，随后将通过基因合成获得的所得的DNA片段插入到表达载体pEF-DHFR(Raum等人，Cancer ImmunolImmunother50(2001)141-150)的多个克隆位点。如所述地进行DHFR缺陷型CHO细胞的稳定转染，分泌双特异性串联单链抗体片段到培养物上清液的DHFR阳性转染子的选择，以及使用密都锭的基因扩增以增加表达水平(Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025)。所有其它陈述的本领域程序都根据标准方案进行(Sambrook,Molecular Cloning;ALaboratory Manual(分子克隆；实验室手册)；第3版，Cold Spring Harbour LaboratoryPress,Cold Spring Harbour,New York(2001))。
功能双特异性串联单链抗体片段的鉴定通过流式细胞计量术分析来自转染的CHO细胞的培养物上清液进行。为此目的，对人类CD3阳性T细胞白血病细胞系HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)和猕猴T细胞系4119LnPx检测CD3结合。对HCV抗原转染的CHO细胞(参见实施例40.1)检测对HCV的结合。各细胞系的200.000个细胞与50μl的细胞培养物上清液在冰上孵化30min。以含有2%FCS的PBS洗涤细胞两次，并以鼠抗His抗体(5His抗体；Qiagen；在含有2%FCS的50μl PBS中1:20稀释)检测结合的双特异性串联单链抗体片段。洗涤后，以在含有2%FCS的PBS中1:100稀释的共轭于藻红蛋白的Fcγ-特异性抗体(Dianova)检测结合的抗His抗体。未转染的CHO细胞的上清液用作阴性对照。
流式细胞计量术在FACS-Calibur仪器上进行；并且CellQuest软件用于获取和分析数据(Becton Dickinson biosciences,Heidelberg)。如免疫学最新方案(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中描述的进行FACS染色和荧光强度的测量。
只选择显示对人类和猕猴CD3以及对HCV抗原双特异性结合的那些构建体用于进一步使用。
为了产生蛋白，将表达完全功能的双特异性串联单链抗体片段并适于无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%Pluronic F-68;HyClone)的CHO细胞在具有无核苷的HyQ PF CHO液体大豆培养基(含有4.0mM L-谷氨酰胺、0.1%PluronicF-68;HyClone)的滚瓶中生长7天。通过离心从细胞澄清培养物上清液并储存在-20℃直到纯化。作为从培养物上清液纯化双特异性串联单链抗体片段的色谱设备，使用了Explorer系统(GE Health Systems)和软件。根据制造商提供的方案，使用负载有ZnCl2的Fractogel EMD(Merck)进行固定的金属亲和色谱(“IMAC”)。以缓冲液A(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl)平衡柱并将细胞培养物上清液(500ml)以3ml/min的流速施加到柱(10ml)。以缓冲液A洗涤柱以除去未结合的样品。根据如下使用两步骤梯度的缓冲液B(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.2,0.1M NaCl,0.5M咪唑)洗脱结合的蛋白：
步骤1：6柱体积的20%缓冲液B
步骤2：6柱体积的100%缓冲液B
汇集步骤2的洗脱的蛋白级份用于进一步纯化。所有化学品都是研究级的，并且均购于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。
凝胶过滤色谱在以平衡缓冲液(25mM柠檬酸盐,200mM赖氨酸,5%甘油,pH7.2)平衡的HiLoad16/60Superdex200制备级柱(GE/Amersham)上进行。将洗脱的蛋白样品(流速1ml/min)经过标准SDS-PAGE和Western印记进行检测。在纯化前，校准柱以确定分子量(分子量标志物试剂盒,Sigma MWGF-200)。使用OD280nm确定蛋白浓度。
在还原性条件下使用SDS PAGE分析纯化的双特异性串联单链抗体片段，其中所述SDS PAGE以预制的4-12%Bis Tris凝胶(Invitrogen)进行。根据制造商提供的方案，进行样品制备和应用。以MultiMark蛋白标准品(Invitrogen)确定分子量。以胶态考马斯(Invitrogen方案)对凝胶染色。由SDS-PAGE确定的分离的蛋白的纯度为>95%。
如PBS中的凝胶过滤所确定的，双特异性串联单链抗体片段在天然条件下具有约52kDa的分子量。根据该方法纯化所有构建体。
根据制造商提供的方案，使用BA-S83膜和Invitrogen Blot Module进行Western印记。为了检测双特异性串联单链抗体片段，使用抗His标签抗体(5His,Qiagen)。以碱性磷酸酶(AP)(Sigma)标记的山羊抗小鼠Ig抗体用作二抗，且BCIP/NBT(Sigma)为底物。在52kD检测到对应于纯化的双特异性串联单链抗体片段的单个条带。
双特异性串联单链抗体片段在人类和非黑猩猩灵长类系统中与人类和猕猴CD3和与HCV抗原相互作用的效能通过基于铬51(51Cr)释放的细胞毒性测定确定，其使用HCV抗原转染的CHO细胞作为靶细胞(参见实施例40.1)和刺激的人类CD4/CD56耗尽的PBMC或猕猴T细胞系4119LnPx作为效应细胞。
刺激的人类PBMC的产生如下进行：
培养皿(85mm直径,Nunc)以终浓度1μg/ml的可购买获得的抗CD3特异性抗体(如，OKT3,Othoclone)在37℃包被1小时。通过以PBS的一个洗涤步骤除去未结合的蛋白。根据标准方案，通过Ficoll梯度离心从外周血(30-50ml人类血液)分离新鲜PBMC。将在含有稳定的谷氨酰胺/10%FCS/IL-220U/ml(阿地白介素,Chiron)的50ml RPMI1640中的3-5×107个PBMC加入预包被的培养皿中，并刺激2天。第三天收集细胞，并以RPMI1640洗涤一次。加入IL-2至终浓度为20U/ml并在与上述相同的细胞培养基中再培养细胞一天。
靶细胞以PBS洗涤两次并以含有50%FCS的终体积为100μl的RPMI中的11.1MBq51Cr在37℃标记45分钟。随后标记的靶细胞以5ml RPMI洗涤3次且随后用于细胞毒性测定。在96孔板以250μl总体积的补充的RPMI(如上)进行测定，E:T比为10:1。施加1μg/ml的跨物种特异性双特异性串联单链抗体片段和其20个三倍稀释物。测定时间是18小时，且细胞毒性测量为上清液中释放的铬相对于最大裂解(加入Triton-X)和自发裂解(无效应细胞)之间差异的相对值。所有测量进行四份。上清液中铬活性的测量以Wizard3"γ计数器(PerkinElmer Life Sciences GmbH,Germany)进行。试验数据的分析以用于Windows的Prism4(版本4.02,GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)进行。如软件所确定的，S形剂量响应曲线一般具有>0.90的R2值。作为效能量度的EC50值以分析程序计算。

Claims (21)

1.一种包含抗体的药物组合物，所述抗体包含结合于人类和普通绒猴、绒顶柽柳猴或松鼠猴CD3ε链的表位的其为IgG或scFv的第一结合结构域，其中所述表位是包括在由SEQID NO.2、4、6或8组成的组中的氨基酸序列的一部分，并且至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu，并且其中所述抗体还包含结合于细胞表面抗原的第二结合结构域，其中所述细胞表面抗原是肿瘤抗原，且其中所述第一结合结构域通过用人类和松鼠猴CD3ε的N-末端1-27氨基酸免疫小鼠并通过确认与人类和普通绒猴、绒顶柽柳猴或松鼠猴原代T细胞的结合获得。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述表位是包括在由SEQ ID NO.2、4、6和8组成的组中的氨基酸序列的一部分，并且至少包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域包含VL区，所述VL区包含选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
(a)SEQ ID NO.27所示的CDR-L1、SEQ ID NO.28所示的CDR-L2和SEQ ID NO.29所示的CDR-L3；
(b)SEQ ID NO.117所示的CDR-L1、SEQ ID NO.118所示的CDR-L2和SEQ ID NO.119所示的CDR-L3；和
(c)SEQ ID NO.153所示的CDR-L1、SEQ ID NO.154所示的CDR-L2和SEQ ID NO.155所示的CDR-L3。
4.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域包含VH区，所述VH区包含选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：
(a)SEQ ID NO.12所示的CDR-H1、SEQ ID NO.13所示的CDR-H2和SEQ ID NO.14所示的CDR-H3；
(b)SEQ ID NO.30所示的CDR-H1、SEQ ID NO.31所示的CDR-H2和SEQ ID NO.32所示的CDR-H3；
(c)SEQ ID NO.48所示的CDR-H1、SEQ ID NO.49所示的CDR-H2和SEQ ID NO.50所示的CDR-H3；
(d)SEQ ID NO.66所示的CDR-H1、SEQ ID NO.67所示的CDR-H2和SEQ ID NO.68所示的CDR-H3；
(e)SEQ ID NO.84所示的CDR-H1、SEQ ID NO.85所示的CDR-H2和SEQ ID NO.86所示的CDR-H3；
(f)SEQ ID NO.102所示的CDR-H1、SEQ ID NO.103所示的CDR-H2和SEQ ID NO.104所示的CDR-H3；
(g)SEQ ID NO.120所示的CDR-H1、SEQ ID NO.121所示的CDR-H2和SEQ ID NO.122所示的CDR-H3；
(h)SEQ ID NO.138所示的CDR-H1、SEQ ID NO.139所示的CDR-H2和SEQ ID NO.140所示的CDR-H3；
(i)SEQ ID NO.156所示的CDR-H1、SEQ ID NO.157所示的CDR-H2和SEQ ID NO.158所示的CDR-H3；和
(j)SEQ ID NO.174所示的CDR-H1、SEQ ID NO.175所示的CDR-H2和SEQ ID NO.176所示的CDR-H3。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域包含VL区，所述VL区选自由SEQ ID NO.35、39、125、129、161或165所示的VL区组成的组。
6.根据权利要求1、2和4中任一项所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域包含VH区，所述VH区选自由SEQ ID NO.15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181所示的VH区组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域包含VL区和VH区，所述VL区和VH区选自由以下组成的组：
(a)SEQ ID NO.17或21所示的VL区和SEQ ID NO.15或19所示的VH区；
(b)SEQ ID NO.35或39所示的VL区和SEQ ID NO.33或37所示的VH区；
(c)SEQ ID NO.53或57所示的VL区和SEQ ID NO.51或55所示的VH区；
(d)SEQ ID NO.71或75所示的VL区和SEQ ID NO.69或73所示的VH区；
(e)SEQ ID NO.89或93所示的VL区和SEQ ID NO.87或91所示的VH区；
(f)SEQ ID NO.107或111所示的VL区和SEQ ID NO.105或109所示的VH区；
(g)SEQ ID NO.125或129所示的VL区和SEQ ID NO.123或127所示的VH区；
(h)SEQ ID NO.143或147所示的VL区和SEQ ID NO.141或145所示的VH区；
(i)SEQ ID NO.161或165所示的VL区和SEQ ID NO.159或163所示的VH区；和
(j)SEQ ID NO.179或183所示的VL区和SEQ ID NO.177或181所示的VH区。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述第一结合结构域包含选自由SEQ IDNO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187组成的组的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述肿瘤抗原选自EGFR、EGFRvIII、MCSP、碳酸酐酶IX(CAIX)、CD30、CD33、Her2/neu、CD44v6和Muc-1。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体是双特异性单链抗体分子。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述双特异性单链抗体分子在所述第二结合结构域中包含一组如下的序列作为CDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2和CDR L3，所述序列选自由以下组成的组：
SEQ ID NO：189-194、SEQ ID NO：201-206、SEQ ID NO：219-224、SEQ ID NO：237-242、SEQ ID NO：255-260、SEQ ID NO：273-278、SEQ ID NO：382-384和387-389、SEQ ID NO：400-402和405-407、SEQ ID NO：418-420和423-425、SEQ ID NO：436-438和441-443、SEQ ID NO：454-456和459-461、SEQ ID NO：472-474和477-479、SEQ ID NO：490-492和495-497、SEQ IDNO：508-510和513-515、
SEQ ID NO：530-532和1568至1570、SEQ ID NO：545-547和550-552、SEQ ID NO：559-561和564-566、
SEQ ID NO：577-579和582-584、
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SEQ ID NO：1343-1345和1348-1350、SEQ ID NO：1361-1363和1366-1368、SEQ ID NO：1375-1377和1380-1382、SEQ ID NO：1389-1391和1394-1396、SEQ ID NO：1403-1405和1408-1410、SEQ ID NO：1417-1419和1422-1424、SEQ ID NO：1431-1433和1436-1438、SEQID NO：1445-1447和1450-1452、SEQ ID NO：1459-1461和1464-1466、SEQ ID NO：1473-1475和1478-1480、
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12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述双特异性单链抗体分子包含选自以下的序列：
(a)SEQ ID NO：291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、393、395、397、411、413、415、429、431、433、447、449、451、465、467、469、483、485、487、501、503、505、519、521、523、1336、1338、1340、538、540、542、556、570、572、574、588、590、592、626、628、630、643、645、647、661、663、665、679、693、707、721、735、749、763、777、791、805、819、833、847、861、863、877、879、881、895、897、899、913、915、917、931、933、935、949、951、953、967、969、971、985、987、989、1003、1017、1031、1045、1059、1073、1087、1101、1125、1138、1152、1166、1180、1194、1208、1222、1236、1250、1264、1278、1292、1306、1320、1334、1354、1356、1358、1372、1386、1400、1414、1428、1442、1456、1470、1484、1500、1502、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1586、1588、1602、1616、1630、1647、1649或1663任一所示的氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO：292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、394、396、398、412、414、416、430、432、434、448、450、452、466、468、470、484、486、488、502、504、506、520、522、524、1337、1339、1341、539、541、543、557、571、573、575、589、591、593、627、629、631、644、646、648、662、664、666、680、694、708、722、736、750、764、778、792、806、820、834、848、862、864、878、880、882、896、898、900、914、916、918、932、934、936、950、952、954、968、970、972、986、988、990、1004、1018、1032、1046、1060、1074、1088、1102、1126、1139、1153、1167、1181、1195、1209、1223、1237、1251、1265、1279、1293、1307、1321、1335、1355、1357、1359、1373、1387、1401、1415、1429、1443、1457、1471、1485、1501、1503、1519、1521、1523、1525、1527、1529、1545、1547、1549、1551、1553、1555、1557、1559、1561、1563、1565、1567、1587、1589、1603、1617、1631、1648、1650或1664任一所示的核酸序列编码的氨基酸序列。
13.一种核酸序列，其编码如权利要求1至12任一项所定义的多肽。
14.一种载体，其包含如权利要求13所定义的核酸序列。
15.一种宿主细胞，其是用权利要求14所定义的载体转化或转染的。
16.一种用于产生如权利要求1至12任一项所定义的多肽的方法，所述方法包括在允许如权利要求1至12任一项所定义的多肽表达的条件下培养权利要求15所定义的宿主并从培养物回收产生的多肽。
17.根据权利要求1至12任一项所述的药物组合物，其还包含载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。
18.根据权利要求1至12任一项所定义的多肽或根据权利要求16所述的方法产生的多肽在制备用于预防、治疗或改善选自增生性疾病、肿瘤性疾病或免疫病症的疾病的药物组合物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述肿瘤性疾病是恶性疾病。
20.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述药物组合物适于与另外的药物联合施用。
21.一种试剂盒，其包含如权利要求1至12任一项所定义的多肽、如权利要求13所定义的核酸分子、如权利要求14所定义的载体或如权利要求15所定义的宿主细胞。
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