PT2155788E - Aglutinantes duplamente específicos, específicos interespécies - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

AGLUTINANTES DUPLAMENTE ESPECÍFICOS, ESPECÍFICOS

INTERESPÉCIES A presente invenção tem por objecto um polipéptido que compreende um primeiro domínio humano de ligação, que é um anticorpo capaz de se ligar a um epítopo de uma cadeia CD3 (epsilon) humana e de primata não chimpanzé e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar a EGFR, Her2/neu ou IgE de um ser humano e/ou de um primata não chimpanzé, bem como um processo para a produção do referido polipéptido. A presente invenção também tem por objecto ácidos nucleicos que codificam para o polipéptido, vectores que o compreendem e células hospedeiras compreendendo o vector. Noutro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende o polipéptido mencionado e utilizações clínicas do polipéptido. 0 reconhecimento de células T é mediado por receptores de células T (RcT, TcR em inglês) alfa, beta, gama e delta, distribuídos clonotipicamente, que interagem com as moléculas carregadas com péptido do péptido MHC (pMHC) (Davis & Bjorkman, Nature 334 (1988), 395-402). As cadeias específicas do antigénio do RcT não possuem domínios de sinalização, mas, em vez disso, estão acopladas às CD3 do aparelho de sinalização de subunidades múltiplas conservadas (Call, Cell 111 (2002), 967-979, Alarcon, Immunol. Rev. 191 (2003), 38-46, Malissen Immunol. Rev. 191 (2003), 7-27) . 0 mecanismo pelo qual a ligação de RcT é

comunicada directamente ao aparelho de sinalização continua a ser uma questão fundamental na biologia das células T (Alarcon, loc. cit.; Davis, Cell 110 (2002), 285-287). Parece claro que, as respostas sustentadas das células T l envolvem o co-receptor, a oligomerização do RcT e um arranjo de ordem superior dos complexos de RcT-pMHC na sinapse imunológica (Davis & van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001) , R289-R291, Davis, Nat. Immunol. 4 (2003), 217-224). No entanto, a sinalização dos RcT ocorre muito cedo na ausência destes eventos e pode incluir uma alteração conformacional, induzida pelo ligando, em células CD3 epsilon (Alarcon, loc. cit., Davis (2002), loc. cit., Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 11174-11179, Gil, Cell 109 (2002) , 901-912). As subunidades épsilon, gama, delta e zeta do complexo de sinalização associadas umass com as outras para formar um heterodímero de CD3 épsilon-gama, um heterodímero de CD3 épsilon-delta e um homodímero de CD3 zeta-zeta (Call, loc. cit.). Vários estudos têm revelado que as moléculas CD3 são importantes para a expressão adequada na superfície celular dos RcT alfa e beta e o desenvolvimento normal das células T (Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528-8536, Wang, J. Exp. Med. 188 (1998), 1375-1380, Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 441-447). A estrutura de solução dos fragmentos do ectodomínio do heterodímero de CD3 épsilon e gama mostrou que as subunidades gama e épsilon são ambas domínios de Ig definidos em C2 que interagem uns com os outros para formar uma configuração invulgar de dímero, lado a lado (Sun, Cell 105 (2001), 913-923). Embora a base rica em cisteína pareça desempenhar um papel importante na condução da dimerização de CD3 (Su, loc. cit, Borroto, J. Biol. Chem. 273 (1998), 12807-12816), a interacção, por meio dos domínios extracelulares de CD3 épsilon e CD3 gama, é suficiente para a junção destas proteínas com RcT beta (Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84-92, Manolios & Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995), 532-536). Embora ainda controversa, a estequiometria dominante da maior parte dos RcT compreende uma RcT alfa, beta um heterodímero de CD3 épsilon gama, um 2 heterodímero de CD3 ápsilon delta e um heterodímero de CD3 zeta zeta (Call, loc. cit.) · Dado o papel central do heterodímero das CD3 épsilon e gama humanas na resposta imunitária, a estrutura cristalina deste complexo ligado ao anticorpo terapêutico 0KT3 foi recentemente explicada (Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680).

Um certo número de estratégias terapêuticas regula a imunidade das células T, visando a sinalização de RcT, especialmente os anticorpos monoclonais (Acm, mAb em inglês) de CD3 anti-humanos que são amplamente utilizados clinicamente em regimes imunossupressores. O Acm de rato específico de CD3, OKT3, foi o primeiro Acm licenciado para utilização em seres humanos (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29) e é largamente utilizado clinicamente como um agente imunossupressor no transplante (Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993), 422-430, Chatenoud, Nat. Rev. Immunol. 3 (2003), 123-132, Kumar, Transplant. Proc. 30 (1998), 1351-1352), diabetes do tipo 1 (Chatenoud (2003), loc. cit) e psoríase (Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907-1913). Além disso, os Acm anti-CD3 podem induzir a sinalização parcial de células T e a anergia clonal (Smith, J. Exp. Med. 185 (1997), 1413-1422) . Ο OKT3 tem sido descrito na literatura como um mitogénio potente de células T (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) bem como um potente assassino de células T (Wong, Transplantation 50 (1990), 683-9). Ο OKT3 exibe ambas as actividades de uma forma dependente do tempo; no seguimento da activação precoce das células T que levam à libertação de citocinas, após a administração de mais OKT3, bloqueia mais tarde todas as funções conhecidas das células T. É devido a este bloqueio tardio da função das células T que se encontrou em OKT3 uma tão ampla aplicação como imunossupressor em regimes terapêuticos para a redução ou mesmo a abolição da rejeição dos tecidos de aloenxerto. 3 0ΚΤ3 reverte a rejeição de tecido do aloenxerto, muito provavelmente através do bloqueio da função de todas as células T, as quais desempenham um papel importante na rejeição aguda. 0KT3 reage com o complexo de CD3 e bloqueia a sua função na membrana das células T humanas, o que está associada com a estrutura de reconhecimento dos antigénios das células T (RCT) e é essencial para a transdução do sinal. A subunidade de RCT/CD3 que está ligada por 0KT3 tem sido objecto de vários estudos. Embora algumas evidências tenham apontado para uma especificidade de 0KT3 para a subunidade épsilon do complexo de RCT/CD3 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680). Outras evidências mostraram que a ligação de OKT3 do complexo de RCT/CD3 requer que estejam presentes outras subunidades deste complexo (Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52).

Outros anticorpos específicos bem conhecidos para a molécula CD3 estão listados em Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50. Tal como indicado antes, esses anticorpos específicos de CD3 são capazes de induzir várias respostas das células T tal como a produção de linfocinas (Von Wussow, J. Immunol. 127 (1981), 1197; Palacious, J. Immunol. 128 (1982), 337), a sua roliferação (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) e a indução de células T supressoras (Kunicka, em "Lymphocyte Typing II" 1 (1986), 223). Ou seja, consoante as condições experimentais, o anticorpo monoclonal específico de CD3 pode inibir ou induzir citotoxicidade (Leewenberg, J. Immunol. 134 (1985), 3770; Phillips, J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas, Proc. Nat 1. Acad. Sei. USA 78 (1981), 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987), 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135 (1985), 34; Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol. 31, 94-106; Xu (2000), Cell 4

Immunol. 200, 16-26; Kimball (1995), Transpl. Immunol. 3, 212-221).

Embora muitos dos anticorpos de CD3 descritos na técnica tenham sido referidos por reconhecerem a subunidade épsilon de CD3 do complexo de CD3, a maioria deles, na verdade, ligam-se aos epítopos conformacionais e, assim, apenas reconhecem CD3 épsilon no contexto natural do RCT. Os epítopos conformacionais são caracterizados pela presença de dois ou mais resíduos de aminoácidos discretos que estão separados na sequência primária, mas se juntam na superfície da molécula quando o polipéptido se dobra em proteína natural/antigénio (Sela, (1969) Science 166, 1365 e Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Os epítopos conformacionais ligados pelos anticorpos de CD3 épsilon descritos na técnica podem ser separados em dois grupos. No grupo principal, os referidos epítopos são formados por duas subunidades de CD3, por exemplo, CD3 de cadeia épsilon e CD3 gama ou WO 2007/033230 descreve anticorpos contra a sequência EMGGITQTPYKVSISGT de CD3 que corresponde aos resíduos 6-22 de CD3 épsilon humana ou CD3 de cadeia delta.

Por exemplo, verificou-se, em vários estudos, que os anticorpos monoclonais de CD3 épsilon mais amplamente utilizados, OKT3, WT31, UCHT1, 7D6 e Leu-4 não se ligam a células transfectadas individualmente com a cadeia épsilon de CD3. No entanto, estas células coraram anticorpos, duplamente transfectadas com uma combinação de CD3 épsilon mais CD3 gama ou CD3 delta (Tunnaclif fe, loc. cit.; Law, Int. Immunol. 14 (2002), 389-400; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52; Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 1703-9). Num segundo grupo mais pequeno, o epítopo conformacional está a ser formado dentro da própria subunidade de CD3 épsilon. Um elemento deste grupo é, por 5 exemplo, o Acm APA 1/1 que actua contra CD3 épsilon desnaturado (Risueno, Blood 106 (2005), 601-8). Considerados em conjunto, a maior parte dos anticorpos de CD3 épsilon descritos na técnica reconhecem os epitopos conformacionais localizados em duas ou mais subunidades de CD3. Os resíduos de aminoácidos discretos que formam a estrutura tri-dimensional destes epitopos podem, assim, ser localizados tanto na própria subunidade épsilon de CD3 como na subunidade épsilon de CD3 e noutras subunidades de CD3, tais como as CD3 gama ou delta.

Um outro problema diz respeito aos anticorpos de CD3 pelo facto de se ter verificado que muitos anticorpos de CD3 eram espécies específicas. Os anticorpos monoclonais anti-CD3, geralmente como verdadeiros suportes para quaisquer outros anticorpos monoclonais - funcionam por meio do reconhecimento altamente específico das suas moléculas-alvo. Reconhecem apenas um único sítio ou epítopo, em sua molécula-alvo CD3. Por exemplo, um dos anticorpos monoclonais mais amplamente utilizados e os melhores caracterizados, específicos para o complexo de CD3, é OKT-3. Este anticorpo reage com CD3 de chimpanzé, mas não com o homólogo de CD3 de outros primatas, tais como CD3 de macacos ou de cães (Sandusky et al., J. Med. Primatol. 15 (1986), 441-451). O anticorpo monoclonal anti-CD3, UCHT-1, também é reactivo com CD3 de chimpanzé, mas não com CD3 de macacos (dados próprios) . Por outro lado, existem também exemplos de anticorpos monoclonais, que reconhecem antigénios de macacos, mas não os seus homólogos humanos. Um exemplo deste grupo é o anticorpo monoclonal FN-18 dirigido para CD3 de macacos (Uda et al. , J. Med. Primatol. 30 (2001), 141-147). Curiosamente, verificou-se que os linfócitos periféricos de cerca de 12 % dos macacos cinomolgos não têm reactividade com o anticorpo monoclonal 6 de CD3 de anti-macaco rhesus. Uda et al. desceveram uma substituição de dois aminoácidos na sequência de CD3 de macacos cinomolgos, que não são reactivos com os anticorpos FN-18, em comparação com CD3 derivados de animais, que são reactivas com os anticorpos FN-18 (Uda et al., J Med Primatol. 32 (2003), 105-10; Uda et al., J Med Primatol. 33 (2004), 34-7).

Apesar sesta capacidade de discriminação, isto é, a especificidade das espécies, inerentes aos anticorpos monoclonais de CD3 e aos seus fragmentos é um obstáculo significativo para o seu desenvolvimento como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças humanas. A fim de obter a aprovação do mercado, qualquer novo candidato a medicamento deve passar por ensaios rigorosos. Estes ensaios podem ser subdivididos nas fases pré-clinica e clinica: considerando esta última - pode ainda ser subdividida em fases clinicas geralmente conhecidas como fases I, II e III - realizam-se em pacientes humanos, o primeiro é realizado em animais. O objectivo do ensaio pré-clínico é demonstrar que o candidato a medicamento tem a actividade desejada e, mais importante do que tudo, é seguro. Somente quando a segurança em animais e a eficácia possível do candidato a medicamento tiver sido determinada em ensaios pré-clínicos, este candidato a medicamento será aprovado para ensaios clínicos em seres humanos, pela respectiva autoridade reguladora. Os candidatos a fármacos podem ser ensaiados quanto à segurança em animais nas três formas seguintes: (i) em espécies relevantes, isto é, uma espécie em que os candidatos a fármacos podem reconhecer os antigénios de ortólogos, (ii) num animal transgénico contendo os antigénios humanos e (iii) por utilização de um substituto para o candidato a fármaco que pode ligar os antigénios de ortólogos presentes no animal. As limitações 7 dos animais transgénicos residem no facto de esta tecnologia estar normalmente limitada a roedores. Entre roedores e seres humanos existem diferenças significativas na fisiologia e os resultados de segurança não podem ser facilmente extrapolados para seres humanos. As limitações de um substituto para o candidato a fármaco são a composição de matéria diferente em comparação com o candidato a fármaco real e, muitas vezes, os animais utilizados são roedores com a limitação indicada antes. Portanto, os dados pré-clinicos gerados em roedores são de poder preditivo limitado em relação ao candidato a fármaco. A abordagem da escolha para os ensaios de segurança é o uso de uma espécie relevante, de preferência, um primata inferior. A limitação das actuais moléculas de ligação de CD3 adequadas para a intervenção terapêutica no homem, descrita na técnica, é a de que as espécies relevantes são primatas superiores, em especial chimpanzés. Os chimpanzés são considerados como espécies ameaçadas de extinção e, devido à sua natureza semelhante à humana, o uso desses animais para os ensaios de segurança do fármaco foi proibido na Europa e é muito restrito em outros lugares. A presente invenção tem por objecto um polipéptido caracterizado pelo facto de compreender um primeiro dominio de ligação, que é um anticorpo, capaz de se ligar a um epitopo de uma cadeia de CD3S de ser humano e de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus or Saimiri sciureus, em que o epitopo faz parte de uma sequência de aminoácidos contida no grupo que consiste nas SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8 e compreende pelo menos a sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gli-Asn-Glu e um segundo dominio de ligação capaz de se ligar a EGFR, Her2/neu ou IgE de um ser humano e/ou de um primata não chimpanzé. Sequências como as ilustradas nas SEQ ID NOs. 2, 4, 6 e 8 e os seus fragmentos são de um contexto independentes dos epítopos de CD3. A vantagem da presente invenção é o fornecimento de um polipéptido compreendendo um domínio de ligação, preferencialmente humano, que é um anticorpo apresentando a especificidade de interespécies para a cadeia CD38 (épsilon) de seres humanos e primatas não chimpanzés, que pode ser utilizado tanto para a avaliação pré-clínica de actividade, segurança e/ou o perfil farmacocinético, de preferência humanos, domínios de ligação em primatas e - de forma idêntica - como fármacos em seres humanos. A mesma molécula pode ser usada em estudos pré-clínicos em animais, assim como em estudos clínicos em seres humanos. Isto leva a resultados altamente comparáveis e a um poder de previsão muito maior dos estudos com animais, em relação a moléculas substitutas específicas de interespécies. Na presente invenção, identificou-se, surpreendentemente, um fragmento polipeptídico dos resíduos de aminoácidos 1-27 do terminal N do domínio extracelular de CD3 épsilon que - em contraste com todos os outros epítopos conhecidos de células CD3 épsilon descritos na técnica - mantém a integridade da sua estrutura tridimensional quando retirado do seu ambiente natural no complexo de CD3 (e fundido com uma sequência heteróloga de aminoácidos, tal como EpCAM ou uma parte Fc de imunoglobulina). 0 contexto de independência do epítopo de CD3 providenciado na presente invenção corresponde aos primeiros 27 aminoácidos de terminal N de CD3 épsilon ou a fragmentos funcionais deste trecho de 27 aminoácidos. A frase "independente do contexto," tal como utilizada aqui, em relação ao epítopo de CD3, significa que a ligação das moléculas de ligação/anticorpo da presente invenção aqui 9 descrita não conduz a uma mudança ou a uma modificação da conformação, sequência ou estrutura que envolve o determinante antigénico ou epítopo. Em contraste, o epítopo de CD3 reconhecido por uma molécula de ligação convencional de CD3 (tal como descrito na WO 99/54440 ou WO 04/106380) está localizado na cadeia épsilon de CD3 do terminal C com os aminoácidos 1-27 de terminal N do epítopo de contexto independente, em que só retem a conformação correcta se for integrado no resto da cadeia épsilon e mantido na posição correcta por heterodimerização da cadeia épsilon quer com a cadeia gama quer com a cadeia delta de CD3.

As moléculas de ligação anti-CD3, como parte de uma molécula de ligação biespecífica, tal como aqui proporcionada e gerada (e dirigida) contra um epítopo de CD3 independente do contexto, providenciam uma melhoria clínica surpreendente no que respeita à redistribuição das células T e, deste modo, um perfil de segurança mais favorável. Sem estar limitado pela teoria, uma vez que o epítopo de CD3 é independente do contexto, formando um subdomínio autónoma auto-suficiente sem muita influência no resto do complexo de CD3, as moléculas de ligação de CD3 aqui proporcionadas induzem menos alterações alostéricas na conformação CD3 do que as moléculas de ligação convencionais de CD3 (como as moléculas descritas na WO 99/54440), que reconhece os epítopos de CD3 dependentes do contexto. A independência do contexto do epítopo de CD3 das moléculas de ligação de CD3 da presente invenção, como parte de uma molécula de ligação biespecífica, está associada com uma menor redistribuição das células T durante a fase inicial do tratamento com moléculas de ligação CD3 da presente invenção, resultando num melhor 10 perfil de segurança das moléculas de ligação de CD3 da presente invenção, em comparação com as moléculas de ligação convencionais de CD3 conhecidas na técnica, que reconhecem epitopos de CD3 dependente do contexto. Particularmente, porque a redistribuição das células T, durante a fase inicial do tratamento com moléculas de ligação CD3, é um factor de risco importante para os efeitos adversos no SNC, as moléculas de ligação CD3 da presente invenção, reconhecendo um contexto independente em vez de um epítopo de CD3 do contexto dependente, têm uma vantagem substancial de segurança sobre as moléculas de ligação CD3 conhecidas na técnica. Os doentes com esses eventos adversos do SNC relacionados com a redistribuição de células T durante a fase inicial do tratamento com moléculas de ligação convencionais de CD3 geralmente sofrem de confusão e desorientação, em alguns casos, também de incontinência urinária. A confusão é uma alteração no estado mental em que o doente não é capaz de pensar com o seu nivel normal de clareza. Geralmente, o doente tem dificuldades para se concentrar e o pensamento não só está turvo e pouco claro, mas muitas vezes está significativamente lento. Os pacientes com eventos adversos do SNC relacionadas com a redistribuição das células T durante a fase inicial do tratamento com moléculas de ligação convencionais CD3 também podem sofrer de perda de memória. Frequentemente, a confusão leva à perda da capacidade de reconhecer pessoas e/ou lugares ou de dizer o tempo e a data. Sentimentos de desorientação são comuns na confusão e a capacidade de tomada de decisão fica prejudicada. Eventos adversos do SNC relacionados com a redistribuição de células T durante a fase inicial do tratamento com moléculas de ligação convencionais CD3 pode ainda compreender um discurso perturbado e/ou dificuldade em encontrar as palavras. Este distúrbio pode prejudicar 11 tanto a expressão como a compreensão da linguagem, bem como a leitura e a escrita. Além da incontinência urinária, também a vertigem e tonturas também podem acompanhar os eventos adversos do SNC relacionados com a redistribuição de células T durante a fase inicial do tratamento com moléculas de ligação convencionais CD3 em alguns doentes. A manutenção da estrutura tridimensional, dentro do referido fragmento de polipéptido de 27 aminoácidos de terminal N de CD3 épsilon, pode ser usada para a geração de domínios de ligação, preferivelmente humanos, que se ligam ao fragmento do polipéptido de CD3 épsilon de terminal N in vitro e ao complexo de CD3 (subunidade épsilon de CD3) nas células T in vivo, com a mesma afinidade de ligação. Estes dados indicam fortemente que o fragmento de terminal N, como aqui descrito, constitui uma conformação terciária, que é semelhante à sua estrutura normalmente existente in vivo. Realizou-se um teste muito sensível para a importância da integridade estrutural do fragmento do polipéptido dos aminoácidos 1-27 de terminal N de CD3 épsilon. Os aminoácidos individuais dos aminoácidos 1-27 do fragmento do polipéptido de terminal N de CD3 épsilon foram alterados para alanina (varrimento de alanina) para ensaiar a sensibilidade dos aminoácidos 1-27 do fragmento do polipéptido de terminal N de CD3 épsilon para dissociações menores. Utilizam-se moléculas de anticorpo específicas de CD3 como parte de uma molécula de ligação biespecífica da presente invenção para ensaiar a ligação aos mutantes de alanina dos aminoácidos 1-27 do fragmento do polipéptido de terminal N da CD3 épsilon (ver exemplo 5 anexo). Permutas individuais dos primeiros cinco resíduos de aminoácidos, exactamente na extremidade do terminal N do fragmento e dois dos aminoácidos nas posições 23 e 25 dos aminoácidos 1-27 do fragmento de polipéptido de terminal N de CD3 12 épsilon foram críticos para a ligação das moléculas de anticorpos. A substituição dos resíduos de aminoácidos na região das posições 1-5 compreende os resíduos Q (glutamina na posição 1), D (ácido aspártico na posição 2), G (glicina na posição 3), N (asparagina na posição 4) e E (ácido glutâmico na posição 5) até à ligação abolida de alanina, de preferência de moléculas de ligação, preferencialmente humanas da presente invenção ao referido fragmento. Enquanto pelo menos nalgumas das moléculas de ligação da presente invenção, de preferência humanas, dois resíduos de aminoácidos na extremidade C do fragmento de T mencionado (treonina na posição 23) e I (isoleucina na posição 25), reduzem a energia de ligação a moléculas de ligação da presente invenção de preferência humanas.

Inesperadamente, verificou-se que as moléculas de ligação assim isoladas, de preferência humanas, não só reconhecem o fragmento humano de terminal N de CD3 épsilon, mas também os fragmentos homólogos correspondentes de CD3 épsilon de vários primatas, incluindo macacos do novo mundo (saguime, Callithrix jacchus; Saguinus oedipus; Saimiri sciureus) e macacos do velho mundo (Macaca fascicularis, também conhecida como Macaco cinomolgos; ou Macaca mulatta, também conhecida como macaco rhesus). Deste modo, detectou-se a especificidade de vários primatas, das moléculas de ligação CD3 da presente invenção. As análises das sequências seguintes confirmaram que os seres humanos e os primatas partilham uma sequência altamente homóloga do trecho no terminal N do domínio extracelular de CD3 épsilon.

Verificou-se, na presente invenção, tal como está definido nas reivindicações, que é possível gerar, de preferência, moléculas de ligação humanas, específicas para 13 CD3 épsilon, em que a molécula idêntica pode ser utilizada em ensaios pré-clínicos em animais, assim como em estudos clínicos e mesmo em terapêutica em seres humanos. Isto deve-se à identificação inesperada de moléculas de ligação, de preferência humanas, as quais, para além da ligação a CD3 épsilon humana (e devido à semelhança genética provável com a contraparte de chimpanzé), também se ligam aos homólogos dos antigénios referidos dos primatas não chimpanzés, incluindo macacos do novo mundo e macacos do velho mundo. Como se mostra nos exemplos seguintes, a referida CD3 épsilon específica, de preferência humana, que se liga a moléculas, pode ser integrada em anticorpos de cadeia simples biespecíficos a fim de gerar agentes terapêuticos contra diversas doenças, incluindo, mas não se limitando a cancro ou distúrbios imunológicas. Assim, a necessidade de construir um domínio de ligação de CD3 épsilon substituto ou um anticorpo de cadeia simples biespecífico que inclua, para os ensaios em espécies filogenéticas distantes (de seres humanos), desaparece. Como resultado, a mesma molécula pode ser utilizada em ensaios pré-clínicos em animais, tal como se pretende que seja administrada a seres humanos em ensaios clínicos, também após a aprovação do fármaco terapêutico pelo mercado e pela administração. A capacidade para utilizar a mesma molécula em ensaios pré-clínicos em animais, tal como na administração posterior a seres humanos, praticamente elimina ou pelo menos reduz bastante o perigo de que os dados obtidos em ensaios pré-clínicos em animais tenham uma aplicação limitada no caso de seres humanos. Em resumo, a obtenção de dados de segurança pré-clínicos em animais usando a mesma molécula que irá, na realidade, ser administrada a seres humanos, faz muito para assegurar a aplicabilidade dos dados a um cenário humano relevante. Pelo contrário, em abordagens convencionais que utilizam 14 moléculas de substituição, as referidas moléculas de substituição têm de ser molecularmente adaptadas ao sistema de ensaio de animais utilizados para a avaliação pré-clinica da segurança. Assim, a molécula a ser utilizada em terapêutica humana, de facto, difere na sequência e também provavelmente na estrutura da molécula de substituição utilizada em ensaios pré-clínicos nos parâmetros farmacocinéticos e/ou na actividade biológica, com a consequência de que os dados obtidos em ensaios pré-clínicos com animais têm uma aplicabilidade/transferência limitada para o caso de seres humanos. A utilização de moléculas sucedâneas requer a construção, a produção, a purificação e a caracterização de uma estrutura completamente nova. Isto leva a custos de desenvolvimento adicionais e tempo necessário para a obtenção dessa molécula. Em resumo, os sucedâneos têm de ser desenvolvidos separadamente, para além do fármaco real a ser utilizado em terapêutica humana, de modo que têm de se desenvolver duas linhas de desenvolvimento para as duas moléculas. Portanto, uma vantagem principal da molécula de ligação humana ou de vectores à base de anticorpos que exibam a especificidade interespécies aqui descrita, consiste no facto de se poder utilizar uma molécula idêntica para a terapêutica em seres humanos e nos ensaios pré-clínicos em animais. É preferível, para o polipéptido da presente invenção, que o primeiro domínio de ligação, que é um anticorpo capaz de se ligar a um epítopo da cadeia épsilon de CD3 de ser humano ou de primata não chimpanzé, seja de origem humana.

Além disso, devido à origem humana das moléculas de ligação humanas da presente invenção, a geração de uma reacção imunitária contra as referidas moléculas de ligação 15 está excluída, ao máximo possível, após administração das moléculas de ligação a doentes humanos.

Outra grande vantagem das moléculas de ligação, preferivelmente humanas, especificas de CD3 épsilon, como parte de uma molécula de ligação biespecífica da presente invenção é a sua aplicabilidade para ensaios pré-clínicos em vários primatas. 0 comportamento de um candidato a fármaco em animais deve, idealmente, ser indicativo do comportamento esperado desta candidato a fármaco, após administração a seres humanos. Como resultado, os dados obtidos a partir desses ensaios pré-clínicos, devem, portanto, em geral, ter um elevado poder preditivo para o caso humano. No entanto, como aprendemos com o desfecho trágico da recente fase I de ensaios clínicos com TGN 1412 (um anticorpo monoclonal de CD28), um medicamento candidato pode agir de forma diferente numa espécie de primata e em seres humanos: considerando que em ensaios pré-clínicos do referido anticorpo não se observou nenhum ou observou-se apenas um número limitado de efeitos adversos nos estudos em animais realizados com macacos cinomolgos, seis doentes humanos desenvolveram falência múltipla de órgãos após a administração do referido anticorpo (Lancet 368 (2006), 2206-7). Os resultados destes eventos negativos não desejados sugerem que pode não ser suficiente limitar os ensaios pré-clinicos apenas a uma espécie (primata). O facto de CD3 épsilon, específica das moléculas de ligação humanas da presente invenção, se ligar a uma série de macacos do novo mundo e do velho mundo pode ajudar a ultrapassar os problemas enfrentados no caso mencionado antes. Por conseguinte, a presente invenção, tal como definida nas reivindicações, tem por objecto meios e processos para minimizar as diferenças de espécies em 16 efeitos quando se estão a desenvolver fármacos para a terapêutica em seres humanos.

Utilizando o domínio de ligação de CD3 épsilon de interespécies, de preferência humano, como parte de uma molécula de ligação biespecífica da presente invenção, também já não é necessário adaptar o animal de ensaio ao candidato a medicamento destinado à administração a seres humanos, tal como, por exemplo, a criação de animais transgénicos. As moléculas de ligação específicas de CD3 épsilon, de preferência humanas (ou anticorpos de cadeia simples biespecíficos que as contêm), que exibem especificidade interespécies, de acordo com os usos e os processos da invenção, podem ser utilizadas directamente nos ensaios pré-clínicos em primatas não chimpanzés, sem qualquer manipulação genética dos animais. Como é bem conhecido dos especialistas na matéria, as abordagens em que o animal de ensaio é adaptado ao candidato a medicamento, sempre comporta o risco de que os resultados obtidos em ensaios de segurança pré-clínicos sejam menos representativos e preditivos para seres humanos, devido à modificação no animal. Por exemplo, em animais transgénicos, as proteínas codificadas pelos transgenes são muitas vezes altamente expressas em excesso. Assim, os dados obtidos para a actividade biológica de um anticorpo contra este antigénio de proteína podem estar limitados no seu valor preditivo para os seres humanos em que a proteína é expressa em níveis muito mais baixos, mais fisiológicos.

Uma outra vantagem dos usos das moléculas de ligação específicas de CD3 épsilon, de preferência humanas, (ou anticorpos de cadeia simples bi-específicos que as contêm) que exibem especificidade interespécies, é o facto de os chimpanzés, como uma espécie em extinção, serem evitados 17 para ensaios em animais. Os chimpanzés são os parentes mais próximos dos seres humanos e foram recentemente agrupados na família dos hominídeos com base nos dados de sequenciação do genoma (Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Portanto, os dados obtidos com chimpanzés são geralmente considerados como sendo altamente preditivo para seres humanos. No entanto, devido à sua condição de espécies em vias de extinção, o número de chimpanzés que pode ser utilizado para experiências médicas é muito limitado. Como referido antes, a manutenção de chimpanzés para a experimentação animal é portanto tanto onerosa como eticamente problemática. O uso de moléculas de ligação específicas de CD3 épsilon, de preferência humanas, (ou anticorpos de cadeia simples bi-específicos que as contêm) evita ambas as objeções éticas como os encargos financeiros durante os ensaios pré-clínicos, sem prejudicar a qualidade, isto é, a aplicabilidade dos dados obtidos nos ensaios em animais. À luz disto, as utilizações de moléculas de ligação específicas de CD3 épsilon, de preferência humanas, (ou anticorpos de cadeia simples bi-específicos que as contêm) são uma alternativa razoável aos estudos em chimpanzés.

Uma outra vantagem das moléculas de ligação específicas de CD3 épsilon, de preferência humanas, (ou anticorpos de cadeia simples bi-específicos que as contêm) é a capacidade de extracção de várias amostras de sangue quando se usam como parte de ensaios pré-clínicos em animais, por exemplo, no decurso de estudos farmaco-cinéticos com animais. As extracções múltiplas de sangue podem ser muito mais facilmente obtidas com um primata não chimpanzé do que com animais inferiores, por exemplo, um rato. A extracção de amostras de sangue múltiplas permite o ensaio contínuo dos parâmetros do sangue para a 18 determinação dos efeitos biológicos induzidos pelas moléculas de ligação especificas de CD3 épsilon, de preferência humanas, (ou anticorpos de cadeia simples bi-especificos que as contêm) da presente invenção. Além disso, a extracção de múltiplas amostras de sangue permite ao investigador avaliar o perfil farmacocinético das moléculas de ligação de preferência humanas, (ou anticorpos de cadeia simples bi-específicos), tal como definido na presente invenção. Além disso, os potenciais efeitos colaterais, que podem ser induzidos pela referida molécula de ligação, de preferência humana (ou anticorpos de cadeia simples bi-específico) reflectidos nos parâmetros do sangue, podem ser medidos em diferentes amostras de sangue extraídas durante o decurso da administração do referido anticorpo. Isto permite a determinação do potencial perfil de toxicidade da molécula de ligação, de preferência humana (ou anticorpos de cadeia simples bi-específico) , tal como definido no presente documento.

As vantagens das moléculas de ligação, de preferência humanas (ou anticorpos de cadeia simples bi-específicos) , tal como aqui definidas, que exibem especificidade interespécies podem ser brevemente resumidas como se segue:

Em primeiro lugar, as moléculas de ligação, de preferência humanas (ou anticorpos de cadeia simples bi-específicos), tal como aqui definidas, usadas em ensaios pré-clínicos, são as mesmas que as utilizadas na terapêutica humana. Assim, já não é necessário o desenvolvimento de duas moléculas independentes, que podem diferir nas suas propriedades farmacocinéticas e na actividade biológica. Isto é altamente vantajoso na medida em que, por exemplo, os resultados farmacocinéticos são mais directamente transferíveis e 19 aplicáveis ao caso humano do que, por exemplo, em abordagens convencionais de sucedâneos.

Em segundo lugar, os usos das moléculas de ligação, de preferência humanas (ou anticorpos de cadeia simples bi-específicos) , tal como aqui definidos, para a preparação de agentes terapêuticos para seres humanos tem menor custo e é menos trabalho intensiva do que as abordagens com sucedâneos.

Em terceiro lugar, as moléculas de ligação, de preferência humanas (ou anticorpos de cadeia simples bi-específicos), tal como aqui definidas, podem ser utilizadas para ensaios pré-clinicos, não apenas em espécies de primatas, mas numa série de diferentes espécies de primatas, limitando assim o risco de possíveis diferenças entre espécies de primatas e seres humanos.

Em quarto lugar, o chimpanzé, como espécie em perigo de extinção, é evitado para a experimentação animal.

Em quinto lugar, podem extrair-se várias amostras de sangue para extensos estudos farmacocinéticos.

Em sexto lugar, devido à origem humana das moléculas de ligação, de preferência humanas, de acordo com uma modalidade de realização preferida da presente invenção, a geração de uma reacção imunitária contra as referidas moléculas de ligação é minimizada quando administrado a doentes humanos. Exclui-se a indução de uma resposta imune com anticorpos específicos para um candidato a fármaco derivado de uma espécie não humana, como por exemplo de um rato, levando ao desenvolvimento de anticorpos humanos anti-humanos (HAMA) contra moléculas terapêuticas de origem em murino. 0 termo "proteína" é bem conhecido na técnica e descreve compostos biológicos. As proteínas compreendem uma 20 ou mais cadeias de aminoácidos (polipéptidos) , em que os aminoácidos estão ligados entre si através de uma ligação peptídica. 0 termo "polipéptido", tal como utilizado aqui, descreve um grupo de moléculas, que consiste em mais de 30 aminoácidos. De acordo com a presente invenção, o grupo de polipéptidos compreende "proteínas", desde que as proteínas contenham um único polipéptido. Também em conformidade com a definição, o termo "polipéptido", descreve fragmentos de proteínas, desde que esses fragmentos consistam em mais do que 30 aminoácidos. Os polipéptidos podem ainda formar multímeros, tais como dímeros, trímeros e oligómeros superiores, isto é, que consiste em mais do que uma molécula de polipéptido. As moléculas polipeptidicas que formam esses dímeros, trímeros, etc., podem ser idênticas ou não idênticas. As correspondentes estruturas de ordem superior desses multímeros são, por conseguinte, designadas por homo- ou heterodímeros, homo- ou heterotrímeros, etc. Um exemplo de um hereteromultímero é uma molécula de anticorpo, a qual, na sua forma de ocorrência natural, é constituída por duas cadeias leves polipeptídicas idênticas e duas cadeias polipeptídicas pesadas idênticas. Os termos "polipéptido" e "proteína" referem-se também a polipéptidos /proteínas modificados naturalmente, em que a modificação é efectuada, por exemplo, por modificações pós-tradução tais como glicosilação, acetilação, fosforilação e similares. Essas modificações são bem conhecidas na técnica.

Tal como usado aqui, "humano" e "homem" refere-se à espécie Homo sapiens. No que diz respeito às utilizações clínicas dos vectores descritas neste documento, os doentes humanos são tratados com a mesma molécula. A expressão "origem humana", tal como utilizada no contexto das moléculas da presente invenção, descreve 21 moléculas deriváveis de bibliotecas humanas ou com uma estrutura/sequência correspondente ao equivalente humano. Por conseguinte, as proteínas que possuem uma sequência de aminoácidos que corresponde à sequência humana análoga, por exemplo, um fragmento de anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos na estrutura que corresponde às sequências de linhas germinais humanas são entendidas como moléculas de origem humana.

Tal como se utiliza aqui, um "primata não chimpanzé" ou as suas variantes gramaticais referem-se a qualquer outro primata excepto ao chimpanzé, isto é, com excepção de um animal pertencente ao género Pan e incluindo as espécies Pan paniscus e Pan troglodytes, também conhecidas como Anthropopithecus troglodytes ou Simia satyrus. Um "primata", "espécies de primatas", "primatas" ou as suas variantes gramaticais indicam uma ordem de mamíferos euterianos divididos em duas subordens de prossímios e antropóides e compreendendo o homem, símios, macacos e lémures. Especificamente, "primatas", tal como aqui utilizado, compreende a subordem Strepsirrhini (prossimianos não társios), incluindo a infra-ordem dos Lemuriformes (ela própria incluindo a superfamília dos Cheirogoleidae e Lemuroidge), a infra-ordem dos Chiromyiformes (ela própria incluindo a família dos Daubentoniidae) e a infra-ordem dos Lorisiformes (ela própria incluindo as famílias dos Lorisidae e Galagidae). "Primatas", tal como se utiliza aqui, também compreende a sub-ordem dos Haplorrhini, incluindo a infra-ordem dos Tarsiiformes (ela própria incluindo a família dos Tarsiidae) , a infra-ordem dos Simiiformes (ela própria incluindo os Platyrrhini ou os macacos do novo mundo e os Catarrhini, incluindo os Cercopithecidae ou os macacos do velho mundo). 22

As espécies de primatas não chimpanzés podem ser entendidas, na acepção da presente invenção, como sendo um lémure, um tárcio, um gibão, um saguim (pertencente aos macacos do novo mundo da família Cebidae) ou um macaco do velho mundo (pertencente à superfamília dos Cercopithecoidea).

Tal como aqui utilizado, um "macaco do velho mundo" compreende qualquer macaco da super-família dos Cercopithecoidea, ela própria subdividida nas famílias: Cercopithecinae, que são principalmente africanos, mas incluem o género diverso de macacos que são asiático e norte-africanos e os Colobinae, incluem a maior parte dos géneros asiáticos, mas também os macacos colobos africanos.

Especificamente, dentro da subfamília dos Cercopithecinae, um primata não chimpanzé vantajoso pode ser da tribo dos Cercopithecini, dentro do género Allenopithecus (macaco de Allen Swamp, Allenopithecus nigroviridis); dentro do género Miopithecus (talapoíno angolano, Miopithecus talapoin; talapoíno do Gabãon, Miopithecus ogouensis); dentro do género Erythrocebus macaco Patas, Erythrocebus patas); dentro do género Chlorocebus (macaco verde, Chlorocebus sabaceus; Grivet, Chlorocebus aethiops; Bale Mountains Vervet, Chlorocebus djamdjamensis', macaco tântalo, Chlorocebus tantalus; Vervet macaco verde, Chlorocebus pygerythrus; Malbrouck, Chlorocebus cynosuros); ou dentro do género Cercopithecus (macaco de dríada ou macaco de Salongo, Cercopithecus dryas; macaco de Diana, Cercopithecus diana; macaco de Roloway, Cercopithecus roloway; macaco de nariz grande, Cercopithecus nictitans; macaco azul, Cercopithecus mitis; macaco prateado, Cercopithecus doggetti; macaco dourado, Cercopithecus kandti; macaco do céu, Cercopithecus 23 albogularis; macaco mono, Cercopithecus mona; macaco mono de Campbell, Cercopithecus campbelli; macaco mono de Lowe, Cercopithecus lowei; macaco mono de cristã, Cercopithecus pogonias; macaco mono de Wolfs, Cercopithecus wolfi; macaco mono de dentes, Cercopithecus denti; macaco menor de nariz manchado, Cercopithecus petaurista; macaco de cauda longa de garganta branca, Cercopithecus erythrogaster, macaco de cauda longa de Sclater, Cercopithecus sclateri; macaco de cauda longa de orelhas vermelhas, Cercopithecus erythrotis; macaco de cauda longa de bigodes, Cercopithecus cephus; macaco de cauda longa vermelha, Cercopithecus ascanius; macaco de Hoest, Cercopithecus Ihoesti; macaco de Preuss, Cercopithecus preussi; macaco de cauda em sol, Cercopithecus solatus; macaco de Hamlyn ou macaco com cara de mocho, Cercopithecus hamlyni; macaco de Brazza, Cercopithecus neglectus) .

Alternativamente, um primata não chimpanzé vantajoso, também dentro da subfamilia dos Cercopithecinae mas dentro da tribo Papionini, pode estar dentro do género Macaca (macaca de Barbary, Macaca sylvanus; macaca de cauda de leão, Macaca silenus; macaca de cauda de porco do sul ou de Beruk, Macaca nemestrina; macaca de cauda de porco do norte, Macaca leonina; macaca da ilha de Pagai ou Bokkoi, Macaca pagensis; macaca de Siberut, Macaca siberu; macaca de Moor, Macaca maura; macaca de botas, Macaca ochreata; macaca de Tonkean, Macaca tonkeana; macaca de Heck, Macaca hecki; macaca de Gorontalo, Macaca nigriscens; macaca de cristã das Celebes ou "simio" negro, Macaca nigra; macaco Cinomolgo oumacaco que come caranguejo ou macaco de cauda longa ou Kera, Macaca fascicularis; macaca de cauda em toco ou macaca ursa, Macaca arctoides; macaca Rhesus, Macaca mulatta; macaca da rocha Formosan, Macaca cyclopis; macaca japanesa, Macaca fuscata; macaca de chapéu, Macaca sinica; macaca de boné, Macaca radiata; macaca de Barbary, Macaca sylvanus; macaca de Assam, Macaca assamensis; macaca tibetana ou macaca de Milne-Edwards, Macaca thibetana; macaca de Arunachal ou de Munzala, Macaca munzala); dentro do género Lophocebus (Mangabei de faces cinzentas, Lophocebus albigena; Lophocebus albigena albigena; Lophocebus albigena osmani; Lophocebus albigena johnstoni; Mangabei de cristã negra, Lophocebus aterrimus; Mangabei de Opdenbosch, Lophocebus opdenboschi; Mangabei das terras altas, Lophocebus kipunji); dentro do género Papio (babuíno de Hamadryas, Papio hamadryas; babuíno da Guiné, Papio papio; babuíno azeitona, Papio anubis; babuíno amarelo, Papio cynocephalus; babuíno de Chacma, Papio ursinus); within the genus Theropithecus (Gelada, Theropithecus gelada); dentro do género Cercocebus (Mangabei escuro, Cercocebus atys; Cercocebus atys atys; Cercocebus. atys lunulatus; Mangabei de colar, Cercocebus torquatus; Mangabei ágil, Cercocebus agilis; Mangabei de barriga dourada, Cercocebus chrysogaster, Mangabei do rio Tana, Cercocebus galeritus; Mangabei de Sanje, Cercocebus sanjei); ou dentro do género Mandrillus (Mandril, Mandrillus sphinx; bugio, Mandrillus leucophaeus). 0 mais preferido é a Macaca fascicularis (também conhecido como macaco cinomolgos e, por conseguinte, nos exemplos designado por "cinomolgos") e Macaca mulatta (macaco rhesus, designado por "rhesus").

Dentro da subfamília Colobinae, um primata não chimpanzé vantajoso pode ser do grupo africano, do género Colobus (colobo negro, Colobus satanas; colobo de Angola, Colobus angolensis; colobo rei, Colobus polykomos; colobo ursídeo, Colobus vellerosus; Mantled Guereza, Colobus guereza); dentro do género Piliocolobus (colobo vermelho do 25 ocidente, Piliocolobus badius; Piliocolobus badius badius; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius waldronae; colobo de pingente, Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii pennantii; Piliocolobus pennantii epieni; Piliocolobus pennantii bouvieri; colobo vermelho de Preuss, Piliocolobus preussi; colobo vermelho de Thollon, Piliocolobus tholioni, colobo vermelho da África Central, Piliocolobus foai; Piliocolobus foai foai; Piliocolobus foai elliott, Piliocolobus foai oustaleti; Piliocolobus foai semlikiensis; Piliocolobus foai parmentierorum; colobo vermelho do Uganda, Piliocolobus tephrosceles; colobo vermelho de Uzyngwa, Piliocolobus gordonorum; colobo vermelho de Zanzibar, Piliocolobus kirkii; colobo vermelho do rio Tana, Piliocolobus rufomitratus); ou dentro do género Procolobus (colobo azeitona, Procolobus verus). Dentro da subfamilia Colobinae pode ser vantajoso um primata não chimpanzé pode alternativamente ser do grupo dos Langur (macaco folha), dentro do género Semnopithecus (langur cinzento do Nepal, Semnopithecus schistaceus; langur cinzento de Caxemira, Semnopithecus ajax; langur cinzento de Tarai, Semnopithecus hector, langur cinzento das planícies do Norte, Semnopithecus entellus; langur cinzento de sapatos pretos, Semnopithecus hypoleucos; langur cinzento das planícies do sul, Semnopithecus dussumieri; langur cinzento com tufos, Semnopithecus priam); dentro do grupo dos T. vetulus ou do género Trachypithecus (Langur de cara púrpura, Trachypithecus vetulus; langur de Nilgiri, Trachypithecus johnii); dentro do grupo dos T. cristatus do género Trachypithecus (Lutung de Java, Trachypithecus auratus; macaco folheado a prata ou Lutung prateado, Trachypithecus cristatus; Lutung da Indochina, Trachypithecus germaini; lutung de Tenasserim, Trachypithecus barbei); dentro do grupo dos T. obscurus do género Trachypithecus (macaco pardo ou Spectacled Leaf 26

Monkey, Trachypithecus obscurus; Phayre's Leaf Monkey, Trachypithecus phayrei); dentro do grupo dos T. pileatus do género Trachypithecus (Langur de gorro, Trachypithecus pileatus; Langur de Shortridge, Trachypithecus shortridgei; Gee's Golden Langur, Trachypithecus gee,); dentro do grupo dos T. francoisi do género Trachypithecus (Langur de Francois, Trachypithecus francoisi; Langur de Hatinh, Trachypithecus hatinhensis; Langur de cabeça branca, Trachypithecus potiocephalus; Langur do Laos,

Trachypithecus laotum; Langur de Delacour, Trachypithecus delacouri; Langur negro indochinês, Trachypithecus ebenus); ou dentro do género Presbytis (surili da Sumatra, Presbytis melalophos; Surili de fita, Presbytis femoralis; Surili de Sarawak, Presbytis chrysomelas; White-thighed Surili, Presbytis siamensis; Surili de testa branca, Presbytis frontata; surili de Java, Presbytis comata; langur de Thomas, Presbytis thomasi; Langur de calças, Presbytis hosei; macaco castanho, Presbytis rubicunda; lagur de Mentawai ou Joja, Presbytis potenziani; surili da ilha de Natuna, Presbytis natunae).

Dentro da subfamilia Colobinae, um primata não chimpanzé vantajoso pode ser, alternativamente, do grupo Odd-Nosed, dentro do género Pygathrix (Douc de perna vermelha, Pygathrix nemaeus; Douc de perna preata, Pygathrix nigripes; Douc de perna cinzenta, Pygathrix cinerea); dentro do género Rhinopithecus (macaco dourado de nariz frio, Rhinopithecus roxellana; macaco preto de nariz frio, Rhinopithecus bieti; macaco cinzento de nariz frio, Rhinopithecus brelicht, langur de Tonkin de nariz frio, Rhinopithecus avunculus) ; dentro do género Nasalis (macaco probóscide, Nasalis larvatus); ou dentro do género Simias (Langur de cauda de porco, Simias concolor) . 27

Tal como usado aqui, o termo "sagui" indica qualquer macaco do novo mundo do género Calllthrix, por exemplo, pertencente aos saguis do Atlântico do subgénero Callithrix (sic!) (Sagui comum, Callithrix (Callithrix) jacchus; Sagui com tufos negros, Callithrix (Callithrix) penicillata; Sagui de Wied, Callithrix (Callithrix) kuhlii; Sagui de cabeça branca, Callithrix (Callithrix) geoffroyi; Sagui de caeça coberta de branco, Callithrix (Callithrix) flaviceps; Sagui de tufos brancos, Callithrix (Callithrix) aurita); pertencendo aos saguis da Amazónia do sub-género Mico (Sagui do Rio Acari, Callithrix (Mico) acariensis; Sagui de Manicore, Callithrix (Mico) manicorensis; Sagui prateado, Callithrix (Mico) argentata; Sagui branco, Callithrix (Mico) leucippe; Sagui de Emilia, Callithrix (Mico) emiliae; Sagui de cabeça negra, Callithrix (Mico) nigriceps; Sagui de Marca, Callithrix (Mico) marcai; Sagui de cauda preta, Callithrix (Mico) melanura; Sagui de Santarém, Callithrix (Mico) humeralifera; Sagui de Maués, Callithrix (Mico) mauesi; Sagui dourado e branco, Callithrix (Mico) chrysoleuca; Sagui de Hershkovitz, Callithrix (Mico) intermédia; Sagui de Satéré, Callithrix (Mico) sateret); sagui de Roosmalens' Dwarf pertendendo ao sub-género dos Callibella (Callithrix (Callibelia) humilis); ou o sagui Pygmy pertendendo ao sub-género dos Cebuella (Callithrix (Cebuella) pygmaea).

Outros géneros dos macacos do novo mundo compreendem ti-tis do género Saguinus (comprendendo o grupo dos S. oedipus, o grupo dos S. midas, o grupo dos S. nigrícollis, o grupo dos S. mystax, o grupo dos S. bicolor e o grupo dos S. inustus) e macacos-esquilo do género samaritano (por exemplo, Saimiri sciureus, Saimiri oerstedii, Saimiri ustus, Saimiri boliviensis, Saimiri vanzolini) 28 A expressão "domínio de ligação" caracteriza, em ligação com a presente invenção, um domínio de um polipéptido que se liga/interage especificamente a uma dada estrutura/antigénio/epítopo alvos. Assim, o domínio de ligação é um "sítio de interacção do antigénio". A expressão "sítio de interacção do antigénio" define, de acordo com a presente invenção, um elemento de um polipéptido, que é capaz de interagir especificamente com um antigénio específico ou com um grupo específico de antigénios, por exemplo, o antigénio idêntico em diferentes espécies. A referida ligação/interação é entendida também como definindo um "reconhecimento específico". A expressão "reconhecendo especificamente" significa, de acordo com a presente invenção, que a molécula de anticorpo é capaz de interagir especificamente com e/ou ligar-se a pelo menos dois, preferivelmente pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos quatro aminoácidos de um antigénio, por exemplo, o antigénio de CD3 humana como aqui definido. Essa ligação pode ser exemplificada pela especificidade de um "princípio de chave e fecho". Assim, os elementos específicos na sequência de aminoácidos do domínio de ligação e o antigénio ligam-se um ao outro como resultado da sua estrutura primária, secundária ou terciária, assim como o resultado de modificações secundárias da referida estrutura. A interacção específica do sítio de interacção do antigénio com o seu antigénio específico pode resultar também numa simples ligação do referido sítio ao antigénio. Além disso, a interacção específica do sítio de interacção do antigénio com o seu antigénio específico pode, alternativamente, provocar o início de um sinal, por exemplo, devido à indução de uma alteração de conformação do antigénio, uma oligomerização do antigénio, etc. Um exemplo preferido de um domínio de ligação, de acordo com a presente invenção, é um anticorpo. 0 domínio de ligação 29 pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal ou um derivado de um anticorpo monoclonal ou policlonal. 0 termo "anticorpo" compreende derivados ou os seus fragmentos funcionais que ainda mantêm a especificidade da ligação. As técnicas para a produção de anticorpos são bem conhecidas na técnica e estão descritas, por exemplo, em Harlow e Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 e Harlow e Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. 0 termo "anticorpo" também inclui as imunoglobulinas (Ig) de diferentes classes (por exemplo, IgA, IgG, IgM, IgD e IgE) e subclasses (tais como IgGl, IgG2, etc.). Estes anticorpos podem ser utilizados, por exemplo, para a imunoprecipitação, purificação por afinidade e imunolocalização dos polipéptidos ou proteínas de fusão da presente invenção, bem como para a monitorização da presença e da quantidade de tais polipéptidos, por exemplo, em culturas de células procarióticas ou eucarióticas recombinantes ou em organismos. A definição do termo "anticorpo" também inclui modalidades de realização tais como anticorpos quiméricos, de cadeia única e humanizados, bem como fragmentos de anticorpos, tais como, inter alia, fragmentos Fab. Os fragmentos de anticorpos ou os seus derivados compreendem ainda os fragmentos F(ab')2r Fv, scFv ou anticorpos de domínio único, anticorpos de domínio único variável ou domínio único variável de imunoglobulina que compreende apenas um domínio variável, que pode ser de VP ou VL, que se liga especificamente a um antigénio ou, independentemente, a epítopos de outros regiões V ou domínios; ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) e (1999), 30 loc. cit. Esse domínio único variável da imunoglobulina, engloba não só um polipéptido de domínio único variável de um anticorpo isolado, mas também polipéptidos maiores que compreendem um ou mais monómeros de uma sequência de polipéptido de domínio variável único de anticorpo.

Conhecem-se na técnica vários procedimentos que podem ser utilizados para a produção de tais anticorpos e/ou fragmentos. Assim, os derivados (do anticorpo) podem ser produzidos por simulação dos péptidos. Além disso, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (ver, inter alia, patente norte-americana 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples específicos dos polipéptido escolhidos. Além disso, os animais transgénicos podem ser utilizados para expressar anticorpos humanizados específicos para polipéptidos e proteínas de fusão da presente invenção. Para a preparação de anticorpos monoclonais, pode ser utilizada qualquer técnica proporcionando anticorpos produzidos por culturas contínuas de linhagens de células. Exemplos dessas técnicas incluem a técnica do hibridoma (Kõhler e Milstein Nature 256 (1975), 495-497), a técnica do trioma, a técnica do hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) e a técnica do hibridoma de EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). A ressonância plasmónica de superfície, tal como utilizada no sistema BIAcore, pode ser utilizada para aumentar a eficiência de anticorpos de fagos que se ligam a um epítopo de um polipéptido-alvo, tal como CD3 épsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Também se considera, no âmbito da presente invenção, que o termo "anticorpo" 31 compreende vectores de anticorpo que podem ser expressos num hospedeiro, tal como descrito aqui a seguir, por exemplo, vectores de anticorpos que podem ser transfectados e/ou transduz idos, inter alia, por meio de virus ou de vectores de plasmido. A expressão "ligação especifica", tal como utilizada de acordo com a presente invenção, significa que a molécula de ligação (dominio) não tem ou não tem significativamente reticulação com polipéptidos que têm uma estrutura similar às ligadas pela molécula de ligação e que pode ser expressa pelas mesmas células que o polipéptido de interesse. A reticulação de um painel de moléculas de ligação em investigação pode ser analisada, por exemplo, por meio da avaliação da ligação do referido painel de moléculas de ligação, em condições convencionais (ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 e Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1999). Exemplos dessa interacção especifica de um domínio de ligação com um antigénio específico compreendem a especificidade de um ligando para o seu receptor. A referida definição compreende, particularmente, a interacção de ligandos, que induz um sinal na ligação ao seu receptor específico. Exemplos da referida interacção, que também está especialmente compreendida pela referida definição, é a interacção de um determinante antigénico (epítopo) com o domínio de ligação (local de ligação antigénico) de um anticorpo. A expressão "especificidade interespécies" ou "especificidade de espécies cruzadas", tal como aqui utilizada, significa a ligação de um domínio de ligação aqui descrito com a mesma molécula-alvo em seres humanos e 32 primatas não chimpanzés. Assim, a "especificidade de espécies cruzadas" ou a "especificidade interespécies" deve ser entendida como uma reactividade interespécies com a mesma molécula X expressa em diferentes espécies, mas não com uma molécula diferente de X. A especificidade de espécies cruzadas de um anticorpo monoclonal que reconhece, por exemplo, CD3 épsilon humana, com uma CD3 épsilon de chimpanzé não primata, por exemplo CD3 épsilon de macaca, pode ser determinada, por exemplo, por análise por SCAF. A análise por SCAF é realizada de um modo que o anticorpo monoclonal respectivo é ensaiado quanto à ligação a células de primatas humanos e não chimpanzés, por exemplo, células de macaca, que expressam os referidos antigénios de CD3 épsilon humanos e de primatas não chimpanzés, respectivamente. Um ensaio apropriado está ilustrado nos exemplos seguintes.

Tal como aqui utilizado, CD3 épsilon denota uma molécula expressa como parte do receptor de células T e tem o significado que geralmente lhe é atribuído na técnica anterior. No ser humano, engloba, de forma individual ou de forma combinada independentemente, todas as subunidades de CD3 conhecidas, por exemplo CD3 épsilon, CD3 delta, CD3 gama, CD3 zeta, CD3 alfa e CD3 beta. Os antigénios de CD3 de primatas não chimpanzés, tal como aqui referidos, são, por exemplo, CD3 de Macaca fascicularis e CD3 de Macaca mulatta. Na Macaca fascicularis, engloba CD3 épsilon negativo para FN-18 e CD3 épsilon positivo para FN-18, CD3 gama e CD3 delta. Na Macaca mulatta, engloba CD3 épsilon, CD3 gama e CD3 delta. Preferencialmente, a referida CD3, tal como aqui utilizada, é a CD3 épsilon. A CD3 épsilon humana está indicada no GenBank com o No. de acesso NM_000733 e compreende a SEQ ID NO. 1. A CD3 33 gama humana está indicada no GenBank com o N°. de acesso NM_00 0 0 73. A CD3 delta humana está indicada no GenBank com o No. de acesso NM_000732. A CD3 épsilon "negativa para FN-18" de Macaca fascicularis (isto é a CD3 épsilon não reconhecida pelo anticorpo monoclonal FN-18 devido ao um polimorfismo, como indicado antes) está indicada no GenBank com o No. de acesso AB073994. A CD3 épsilon "positiva para FN-18" de Macaca fascicularis (isto é a CD3 épsilon reconhecida pelo anticorpo monoclonal FN-18) está indicada no GenBank com o No. de acesso AB073993. A CD3 gama de Macaca fascicularis está indicada no GenBank com o No. de acesso AB073992. A CD3 delta de Macaca fascicularis está indicada no GenBank com o No. de acesso AB073991.

As sequências de ácidos nucleicos e as sequências de aminoácidos dos respectivos homólogos de CD3 épsilon, gama e delta de Macaca mulatta podem ser identificadas e isoladas por meio de técnicas recombinantes descritas na técnica (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3a edição, 2001).

Isto aplica-se, mutatis mutandis, aos homólogos de CD3 épsilon, gama e delta de outros primatas não chimpanzés, tal como aqui definido. A identificação da sequência de aminoácidos de Callithrix jacchus, Saimiri sciureus e Saguinus oedipus está descrita nos exemplos em anexo. A sequência de aminoácidos do domínio extracelular de CD3 épsilon de Callithrix jacchus está representada na SEQ ID NO: 3, a de Saguinus oedipus está descrita na SEQ ID NO: 5 e a de está descrita na SEQ ID NO: 7. 34

Em linha com o anterior, o termo "epítopo" define um determinante antigénico, que está especificamente ligado/ identificado por uma molécula de ligação, tal como definido antes. 0 domínio de ligação ou as moléculas podem ligar-se especificamente ou interagir com epítopos conformacionais ou contínuos, que são únicos para a estrutura-alvo, por exemplo, a cadeia épsilon de CD3 de seres humanos e de primatas não chimpanzés. Um epítopo conformacional ou descontínuo é caracterizado pelos antigénios do polipéptido pela presença de dois ou mais resíduos de aminoácidos discretos que estão separados na sequência primária, mas se juntam na superfície da molécula quando o polipéptido se dobra na proteína natural/antigénio (Sela, (1969) Science 166, 1365 e Laver, (1990) Cell 61, 553-6) . Os dois ou mais resíduos de aminoácidos discretos que contribuem para o epítopo estão presente em secções separadas de uma ou mais cadeias de polipéptidos. Estes resíduos juntam-se na superfície da molécula quando as cadeias polipeptídicas se dobram numa estrutura tri-dimensional para constituir o epítopo. Pelo contrário, um epítopo contínuo ou linear consiste em dois ou mais resíduos de aminoácidos discretos, que estão presentes num único segmento linear de uma cadeia polipeptídica. Na presente invenção, um epítopo de CD3 "dependente do contexto" refere-se à conformação do referido epítopo. Esse epítopo, dependente do contexto, localizado na cadeia épsilon de CD3, apenas pode desenvolver a sua conformação correcta se for integrado no resto da cadeia épsilon e mantido na posição correcta por heterodimerização da cadeia épsilon, com qualquer cadeia gama ou delta de CD3. Pelo contrário, um epítopo de CD3, independente de contexto, tal como providenciado aqui, refere-se a um polipéptido com 1-27 resíduos de aminoácidos com terminal N ou um seu fragmento funcional de CD3 épsilon. Este polipéptido com 1-27 resíduos de aminoácidos 35 com terminal N ou um seu fragmento funcional mantém a sua integridade estrutural tridimensional e a conformação correcta quando retirado do seu ambiente natural no complexo de CD3. 0 polipéptido com 1-27 resíduos de aminoácidos com terminal N ou um seu fragmento funcional, independente do contexto, que faz parte do domínio extracelular de CD3 épsilon, representa, portanto, um epítopo que é completamente diferente dos epítopos de CD3 épsilon descritos em ligação com um processo para a preparação de moléculas de ligação humanas no documento WO 2004/106380. O referido processo utilizado expressa exclusivamente CD3 épsilon recombinante. A conformação deste único CD3 épsilon recombinante expresso diferia do adoptado na sua forma natural, isto é, a forma na qual a subunidade épsilon de CD3 do complexo de RCT/CD3 existe como parte de um complexo não covalente quer com CD3 delta ou com CD3 gama do complexo de RCT/CD3. Quando essa proteína de CD3 épsilon recombinante, exclusivamente expressa, é utilizada como um antigénio para a selecção de anticorpos de uma biblioteca de anticorpos, os anticorpos específicos para esse antigénio são identificados a partir da biblioteca embora tal biblioteca não contenha anticorpos com especificidade para autoantigénios. Isto é devido ao facto de apenas a proteína recombinante de CD3 épsilon expressa não existir in vivo, não é um auto-antigénio. Por conseguinte, as sub-populações de células B que expressam anticorpos específicos para esta proteína ainda não foram eliminadas in vivo; uma biblioteca de anticorpos, construída a partir dessas células B contem o material genético para os anticorpos específicos para a única proteína recombinante de CD3 épsilon.

No entanto, uma vez que o polipéptido com 1-27 resíduos de aminoácidos com terminal N ou um seu fragmento 36 funcional, de contexto independente, é um epítopo, que se dobra na sua forma natural, os domínios de ligação de acordo com a presente invenção não podem ser identificadas por meio de processos baseados na abordagem descrita em WO 04/106380. Portanto, verificou-se, em ensaios, que as moléculas de ligação, tal como descritas em WO 04/106380, não são capazes de se ligar aos 1-27 resíduos de aminoácidos com terminal N da cadeia épsilon de CD3. Assim, as moléculas de ligação convencionais anti-CD3 ou moléculas de anticorpo anti-CD3 (por exemplo, tal como descrito em WO 99/54440) ligam-se à cadeia épsilon de CD3, numa posição que está mais localizada no terminal C do que um polipéptido com 1-27 resíduos de aminoácidos com terminal N ou um seu fragmento funcional, independente do contexto, aqui providenciados. As moléculas de anticorpo da técnica anterior, 0KT3 e UCHT-1 têm também uma especificidade para a subunidade épsilon do complexo de RCT/CD3 entre os resíduos de aminoácidos 35 a 85 e, por conseguinte, o epítopo destes anticorpos está também mais localizado no terminal C. Além disso, UCHT-1 liga-se à cadeia épsilon de CD3, numa região entre os resíduos de aminoácidos 43 a 77 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52). Portanto, as moléculas anti-CD3 da técnica anterior não se ligam e não são dirigidas contra o epítopo de 1-27 resíduos de aminoácidos de terminal N, independente do contexto, aqui definido (ou um seu fragmento funcional).

Para a geração de um domínio de ligação, de preferência humano, composto por um polipéptido da presente invenção, pode-se utilizar, por exemplo, um anticorpo de cadeia simples biespecífico, tal como aqui definido, por exemplo, anticorpos monoclonais que se ligam tanto a CD3 37 épsilon humana como CD3 épsilon de primatas não chimpanzés (por exemplo, CD3 épsilon de macaca).

Numa modalidade preferida do polipéptido da presente invenção, o primata não chimpanzé é um macaco do velho mundo. Numa modalidade de realização mais preferida do polipéptido, o macaco do Velho Mundo é um macaco do género Papio Macacque. Mais preferivelmente, o macaco do género Macaca é macaca Assamese (Macaca assamensis), macaca de Barbary (Macaca sylvanus), macacas de Bonnet (Macaca radiata) , macaca calçada ou macaca calçada de Sulawesi (Macaca ochreata), macaca de cristã de Sulawesi (Macaca nigra) , macaca da rocha Formosano (Macaca cyclopsis), macaca da neve japonesa ou macaca japonesa (Macaca fuscata) , macaco cinomolgos ou macaca que come caranqguejos ou macaca de Java (Macaca fascicularis) , macaca de cauda de leão (Macaca silenus), macaca de cauda de porco (Macaca nemestrina), macaca Rhesus (Macaca mulatta) , macaca tibetana (Macaca thibetana), macaca de Tonkean (Macaca tonkeana), macaca de Toque (Macaca sinica), macaca com cauda de toco ou macaca de cara vermelha ou macaca ursa (Macaca arctoides ou macaca dos pântanos (Macaca maurus) . Mais preferivelmente, o macaco do género Papio é Hamadryas Baboon, Papio hamadryas; Guinea Baboon, Papio papio; Olive Baboon, Papio anubis; Yellow Baboon, Papio cynocephalus; Chacma Baboon, Papio ursinus.

Numa modalidade alternativa preferida do polipéptido da presente invenção, o primata não chimpanzé é um macaco do novo mundo. Numa modalidade de realização mais preferida do polipéptido, o macaco do novo mundo é um macaco do género Callithrix (sagui), do género Saguinus ou do género Saimiri. Mais preferivelmente, o macaco do género Callithrix é Callithrix jacchus, o macaco do género 38

Saguinus é Saguinus oedipus e o macaco do género Samiri é Saimiri sciureus.

Tal como aqui descrito antes, o polipéptido da presente invenção liga-se, com o primeiro domínio de ligação, a um epítopo da cadeia (épsilon) de CD3S humana e de primatas não chimpanzés, em que o epítopo faz parte de uma sequência de aminoácidos compreendida no grupo que consiste em 27 resíduos de aminoácidos, tal como ilustrado nas SEQ ID NOs. 2, 4, 6 ou 8.

Em linha com a presente invenção, é preferido, para o polipéptido da presente invenção, que o referido epítopo faça parte de uma sequência de aminoácidos que compreende 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 aminoácidos.

Mais preferencialmente, em que o referido epítopo compreende pelo menos a sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gli-Asn-Glu (Q-D-G-N-E-D).

No âmbito da presente invenção, um "fragmento funcional dos 1-27 resíduos de aminoácidos de terminal N" significa que o referido fragmento funcional é ainda um epítopo de contexto independente mantendo a sua integridade estrutural tridimensional quando retirado do seu ambiente natural no complexo de CD3 (e fundida com uma sequência heteróloga de aminoácidos, tal como uma EpCAM ou uma parte Fc de imunoglobulina, por exemplo, como se mostra no exemplo 3.1). A manutenção da estrutura tridimensional, dentro do polipéptido de 27 aminoácidos de terminal N ou de um fragmento funcional de CD3 épsilon, pode ser usada para a geração de domínios de ligação, que se ligam ao fragmento do polipéptido de CD3 épsilon de terminal N in vitro e ao 39 complexo de CD3 natural (subunidade épsilon de CD3) nas células T, in vivo, com a mesma afinidade de ligação. Na presente invenção, um fragmento funcional de 1-27 resíduos de aminoácidos de terminal N significa que as moléculas de ligação de CD3 aqui providenciadas podem ainda ligar-se a esses fragmentos funcionais de uma forma independente do contexto. Um especialista na material está ciente dos processos para mapear o epítopo para determiner quais os residues de de um epítopo que são reconhecidos por essas moléculas de ligação anti-CD3 (por exemplo, rastreio de alanina ou análise de manchas de pep).

Numa modalidade de realização preferida da presente invenção, o polipéptido da presente invenção compreende um (primeiro) domínio de ligação, tal como definido aqui e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar a um antigénio da superfície das células. A expressão "antigénio de superfície celular", tal como aqui utilizada, indica uma molécula que é exibida na superfície de uma célula. Na maioria dos casos, esta molécula estará localizada dentro ou sobre a membrana plasmática da célula de tal modo que pelo menos parte desta molécula permaneça acessível a partir do exterior da célula na forma terciária. Um exemplo não limitativo de uma molécula de superfície celular, que está localizada na membrana plasmática é uma proteína transmembranar que compreende, na sua conformação terciária, regiões de hidrofilicidade e de hidrofobicidade. Aqui, pelo menos uma região hidrofóbica permite que a molécula da superfície celular seja incorporada ou inserida na membrana plasmática hidrofóbica da célula, enquanto as regiões hidrofílicas se estendem para ambos os lados da membrana plasmática no citoplasma e no espaço extracelular, respectivamente. 40

Exemplos não limitativos de moléculas da superfície celular que estão localizadas na membrana plasmática são proteínas que tenham sido modificadas num resíduo de cisteína para suportar um grupo palmitoílo, proteínas modificadas no resíduo de cisteína do terminal C para suportar um grupo farnesilo ou proteínas que foram modificadas no terminal C para comportar uma âncora de glicosil-fosfatidil-inositol ("GPI"). Estes grupos permitem a ligação covalente de proteínas à superfície externa da membrana do plasma, onde permanecerão acessíveis para o reconhecimento por moléculas extracelulares, tais como anticorpos. Exemplos de antigénios da superfície celular incluem EGFR, EGFRvIII, MCSP, anidrase carbónica IX (CAIX), CD30, CD33, Her2/neu, IgE, CD44v6 e Muc-1. Exemplos adicionais de anticorpos correspondentes da superfície celular compreendem antigénios que são característicos de uma doença específica ou de uma perturbação, isto é, cancro, doenças auto-imunes ou doenças infecciosas, incluindo infecções virais. Por conseguinte, a expressão "antigénios da superfície celular" inclui, explicitamente, as proteínas virais, tais como proteínas naturais, proteínas virais não tratadas expostas na superfície de células infectadas (descritas inter alia para as proteínas do envelope do vírus da hepatite B, C e o VIH-1).

Uma função de defesa das células T citotóxicas é a destruição de células infectadas pelo vírus, por conseguinte, a única propriedade das moléculas de ligação biespecíficos da presente invenção para activar e redireccionar células T citotóxicas independentemente da sua especificidade autóctone tem um grande impacto no vasto campo de infecções virais crónicas. Para a maioria destas infecções, a eliminação de células infectadas persistentemente é a única possibilidade de cura. 41

Actualmente, as terapêuticas com células T adoptivas estão actualmente a ser desenvolvidas contra infecções crónicas por CMV e por VEB (Rooney, CM., et al., Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr-virus-related lymphoproliferation. Lancet, 1995. 345 (8941): p. 9-13; Walter, E.A., et al., Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med, 1995. 333 (16): p. 1038-44). A infecção de hepatite B crónica é claramente uma das indicações mais interessantes e gratificantes. Em todo o mundo, entre 350 e 400 milhões de pessoas estão infectadas com o VHB (vírus da hepatite B, HBV em inglês) . O tratamento actual da hepatite crónica por VHB repousa no interferão γ e análogos de nucleósidos ou de nucleótidos, uma terapêutica de longo prazo com efeitos secundários consideráveis, tais como a indução de crises de hepatite, febre, mialgias, trombocitopénia e depressão. Embora haja agora mais de quatro esquemas terapêuticos aprovados, a eliminação do vírus raramente é alcançada. Uma inflamação persistente na hepatite B crónica conduz a cirrose hepática e carcinoma hepatocelular, em mais de 25 % dos doentes. Além disso, até 40 % dos doentes com hepatite B crónica vão morrer de complicações graves, sendo responsável por 0,6 a 1,0 milhões de mortes por ano no mundo. O VHB, o protótipo dos Hepadnavírus é um vírus do envelope cujo genoma circular relaxado (cr) é transcrito inversamente num pregenoma de ARN. Após a infecção, o ADN cr é importado para o núcleo dos hepatócitos, onde é completado com um ADN circular, fechado covalentemente (ADNccc) contendo quatro estruturas de leitura sobrepostas. Serve como matriz de transcrição para o ARN pregenómico e 42 três ARN subgenómicos. 0 prégenoma do ARN funciona como ARNm para a tradução do núcleo virai e a proteína da polimerase. As células infectadas produzem continuamente proteína de superfície do VHB (HBsAg) a partir do ADNccc mesmo quando a replicação do VHB pára. A HBsAg consiste nas proteína de superfícies pequenas (S) com muito poucas porções de proteínas de superfície grande (L). Tanto o VHB S como o L são dirigidos para a membrana do retículo endoplasmático (RE), de onde são transportados para vesículas da membrana, através dos organelos trans de Golgi para a membrana plasmática (Gorelick, FS e C. Shugrue, Exiting the endoplasmic reticulum. Mol Cell Endocrinol, 2001. 177 (1-2): p. 13-8). As proteínas S e L são permanentemente expressas na superfície dos hepatócitos de replicação do VHB, como foi mostrado recentemente (Chu, CM e YF Liaw, Membrane staining for hepatitis B surface antigen on hepatocytes: a sensitive and specific marker of active virai replication in hepatitis B. J Clin Pathol, 1995. 48 (5) : p. 470-3) .

Os vírus protótipos que expõem as proteínas do envelope na superfície da célula são o vírus da hepatite B (VHB) , o vírus da hepatite C (VHC) e o VIH-1, os quais representam, globalmente, uma enorme carga da doença. Para a indicação do vírus VIH-1, foi recentemente demonstrado que as células T modificadas por um RCT quimérico com uma estrutura de anticorpo Fv dirigida contra a proteína de envelope gpl20 podem matar as células-alvo infectadas com VIH-1 (Masiero, S., et al., T-cell engineering by a chimeric T-cell receptor with antibody-type specificity for the HIV-1 gp120. Gene Ther, 2005. 12 (4): p. 299-310). Dos vírus hepaADN, o vírus da hepatite B (VHB) expressa o complexo da proteína do envelope HBsAg que é continuamente 43 produzido a partir do ADNccc epissomal mesmo quando a replicação do VHB desaparece. A expressão como proteínas intactas de VHB S e L na superfície das células torna-as acessíveis a anticorpos que são a marca de seroconversão quando os doentes recuperam da fase aguda das infecções e alteram a circulação de HBsAg para antiHBs. Se não ocorrer a seroconversão, até 30 % dos hepatócitos continuam a expressar a proteína S do VHB, também pós-terapêutica antiviral de longa duração. Assim, para além dos linfócitos T que reconhecem especificamente os péptidos de VHB processados intracelularmente e apresentados por moléculas de MHC na superfície das células, outras formas de envolvimento de células T são viáveis, destinadas à proteína de superfície intacta, tais como os antigénios S e L acessíveis na membrana celular externa. Utilizam-se fragmentos de anticorpos de cadeia simples que reconhecem as proteínas pequenos (S) e grandes (L) do envelope do vírus da hepatite B, os receptores de células T artificiais que tenham sido gerados, que permitem dirigir as células T enxertadas para os hepatócitos infectados e depois da activação do contacto com o antigénio destas células T para segregar citocinas e matar os hepatócitos infectados. A limitação desta abordagem reside no facto de (i) as células T terem de ser manipuladas in vitro, (ii) os retrovírus utilizados para transferir os receptores de células T poderem provocar a mutagénese insercional em células T e (iii) uma vez que as células T tenham sido transferidas, a resposta citotóxica não pode ser limitada.

Para ultrapassar estas limitações, moléculas de anticorpo de cadeia única biespecífico, compreendendo um 44 primeiro domínio com uma especificidade de ligação para o antigénio de CD3 épsilon de ser humano e de primata não chimpanzé (como indicado aqui no contexto da presente invenção), bem como um segundo domínio com uma especificidade de ligação para as proteínas do envelope de VHB ou de VHC de hepatócitos infectados, podem ser geradas e estão dentro do âmbito da presente invenção. Na presente invenção, é ainda preferível que o segundo domínio de ligação se ligue ao antigénio da superfície celular humana e/ou aos homólogos de primatas não chimpanzés dos antigénios da superfície de células humanas seleccionadas entre EGFR, Her2/neu ou IgE.

Para a geração do segundo domínio de ligação do polipéptido da presente invenção, por exemplo, os anticorpos de cadeia simples biespecíficos, tal como aqui definido, podem ser utilizados anticorpos monoclonais que se ligam tanto aos antigénios da superfície de células humanos como de primatas não chimpanzés. Domínios de ligação apropriados para o polipéptido biespecífico, tal como aqui definido, por exemplo, podem ser obtidos a partir de anticorpos monoclonais específicos de interespécies, pelos processos recombinantes descritos na técnica. Um anticorpo monoclonal de ligação a um antigénio da superfície celular humana e ao homólogo do referido antigénio da superfície celular em primatas não chimpanzés pode ser ensaiado por ensaios de SCAF, tal como descrito antes. É evidente, para os especialistas na matéria, que os anticorpos específicos interespécies podem também ser gerados por técnicas de hibridoma descritas na literatura (Milstein e Kõhler, Nature 256 (1975), 495-7). Por exemplo, os ratos podem ser imunizados alternativamente com CD33 humana e de primata não de chimpanzé. A partir destes ratos, as células de hibridoma produtoras de anticorpos 45 específicos de interespécies são isoladas por via da tecnologia de hibridoma e analisadas por SCAF, como antes definido. A geração e a análise de polipéptidos biespecíficos, tais como anticorpos de cadeia simples biespecíficos, que exibem especificidade interespécies, tal como aqui descrito, são demonstradas nos exemplos seguintes. As vantagens dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos que exibem especificidade de interespécies incluem os pontos enumerados a seguir. É particularmente preferido, para o polipéptido da presente invenção, que o primeiro domínio de ligação, capaz de se ligar a um epítopo da cadeia de CD3s humana e de primata não chimpanzé compreenda uma região VL compreendendo as RDC-L1, RDC-L2 e RDC-L3 seleccionadas a partir de: (a) RDC-Ll, como representado na SEQ ID NO. 27, RDC-L2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 28 e RDC-L3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 29; (b) RDC-Ll, como representado na SEQ ID NO. 117, RDC-L2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 118 e RDC-L3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 119; e (c) RDC-Ll, como representado na SEQ ID NO. 153, RDC-L2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 154 e RDC-L3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 155.

As regiões variáveis, ou seja, a cadeia leve da região variável ("L" ou "VL") e a cadeia pesada da região variável ("P" ou "VP") são conhecidos na técnica para proporcionar o domínio de ligação de um anticorpo. Estas regiões variáveis comportam regiões de determinação da complementaridade. 46 A expressão "região de determinação de complementaridade" (RDC) é bem conhecida na técnica para ditar a especificidade do antigénio de um anticorpo. 0 termo "RDC-L" ou "L da RDC" refere-se às RDC em VL, enquanto o termo "RDC-P" ou "P de RDC" refere-se às RDC na VP.

Numa modalidade preferida, alternativa do polipéptido da presente invenção, o primeiro domínio de ligação, capaz de se ligar a um epítopo da cadeia de CD3s humana e de primata não chimpanzé compreende uma região VP compreendendo as RDC-P1, RDC-P2 e RDC-P3 seleccionadas a partir de: (a) RDC-P1, como representado na SEQ ID NO. 12, RDC-P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 13 e RDC-P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 14; (b) RDC-P1, como representado na SEQ ID NO. 30, RDC-P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 31 e RDC-P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 32; (c) RDC-P1, como representado na SEQ ID NO. 48, RDC-P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 49 e RDC-P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 50; (d) RDC-P1, como representado na SEQ ID NO. 66, RDC-P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 67 e RDC-P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 68; (e) RDC-P1, como representado na SEQ ID NO. 84, RDC-P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 85 e RDC-P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 86; (f) RDC-P 1, como representado na SEQ ID NO. 102, RDC-P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 103 e RDC-P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 104; 47 . SEQ ID NO. 120, RDC- ID NO. 121 e RDC-P3, 122; . SEQ ID NO. 138, RDC- ID NO. 139 e RDC-P3, 140; SEQ ID NO. 156, RDC- ID NO. 157 e RDC-P3, 158; SEQ ID NO. 174, RDC- ID NO. 175 e RDC-P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 176. É ainda preferido que o primeiro domínio de ligação, capaz de se ligar a um epítopo da cadeia CD3s humana e de primata não chimpanzé compreenda uma região de VL seleccionada no grupo que consiste numa região VL, conforme ilustrado nas SEQ ID NO. 35, 39, 125, 129, 161 ou 165.

É alternativamente preferido que o primeiro domínio de ligação, capaz de se ligar a um epítopo da cadeia CD3s humana e de primata não chimpanzé compreenda uma região VP seleccionada no grupo que consiste numa região VP, conforme ilustrado nas SEQ ID NO. 15, 19, 33, 37, 51 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ou 181.

Mais preferencialmente, o polipéptido da presente invenção é caracterizado pelo primeiro domínio de ligação, capaz de se ligar a um epítopo de CD3s humana e de primata não chimpanzé, compreender uma região VL e uma região VP seleccionadas do grupo que consiste em: 48 (a) uma região VL, conforme ilustrado nas SEQ ID NO . 17 ou 21 e uma região VP, como representado nas SEQ ID NO. 15 ou 19; (b) uma região VL, conforme ilustrado nas SEQ ID NO . 35 ou 39 e uma região VP, como representado nas SEQ ID NO. 33 ou 3 7; (c) uma região VL, conforme ilustrado nas SEQ ID NO . 53 ou 57 e uma região VP, como representado nas SEQ ID NO. 51 ou 55; (d) uma região VL, conforme ilustrado nas SEQ ID NO . 71 ou 75 e uma região VP, como representado nas SEQ ID NO. 69 ou 73; (e) uma região VL, conforme ilustrado nas SEQ ID NO co ou 93 e uma região VP, como representado nas SEQ ID NO. 87 ou 91; (f) uma região VL , conforme ilustrado nas SEQ ID NO. 107 ou 111 e uma região VP , como representado nas SEQ ID NO. 105 ou 109; (g) uma região VL , conforme ilustrado nas SEQ ID NO. 125 ou 12 9 e uma região VP , como representado nas SEQ ID NO. 123 ou 127; (h) uma região VL , conforme ilustrado nas SEQ ID NO. 143 ou 147 e uma região VP , como representado nas SEQ ID NO. 141 ou 145; (i) uma região VL , conforme ilustrado nas SEQ ID NO. 161 ou 165 e uma região VP , como representado nas SEQ ID NO. 159 ou 163; e (j) uma região VL , conforme ilustrado nas SEQ ID NO. 179 ou 183 e uma região VP , como representado nas SEQ ID NO. 177 ou 181.

De acordo com uma modalidade de realização preferida do polipéptido da presente invenção, os pares de regiões VP e regiões VL estão no formato de um anticorpo de cadeia 49 única (scFv) . As regiões VP e VL estão dispostas na ordem VP-VL ou VL-VP. É preferível que a região VP esteja posicionada no terminal N em relação a uma sequência de ligante. A região VL está posicionada no terminal C da sequência ligante.

Uma modalidade de realização preferida do polipéptido da presente invenção descrito antes é caracterizada por o primeiro domínio de ligação, capaz de se ligar a um epítopo de CD3s humana e de primata não chimpanzé, compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada no grupo consiste nas SEQ ID NOs: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ou 187. A presente invenção ainda tem por objecto um polipéptido descrito antes, em que o segundo domínio de ligação se liga a um antigénio da superfície celular, que é, de preferência, um antigénio tumoral. A expressão "antigénio de tumor", tal como aqui utilizada, pode ser entendida como os antigénios que estão presentes em células tumorais. Estes antigénios podem estar presentes na superfície da célula, com uma parte extracelular, que está frequentemente combinada com uma parte da transmembrana e citoplasmática da molécula. Estes antigénios podem estar presentes, por vezes, apenas nas células tumorais e nunca nas normais. Os antigénios tumorais podem ser exclusivamente expressos em células de tumor ou podem representar uma mutação específica do tumor, em comparação com as células normais. Neste caso, são chamados antigénios específicos dos tumores. Mais vulgarmente são os antigénios que estão presentes em células de tumor e em células normais e são designados por antigénios associados a tumores. Estes antigénios 50 associados a tumores podem ser sobre-expressos em relação às células normais ou estão acessíveis para a ligação do anticorpo nas células tumorais devido à estrutura menos compacta do tecido do tumor em comparação com o tecido normal. Exemplos não limitativos de antigénios tumorais, tal como aqui utilizados, são EGFR (Liu, Br. J. Câncer 82/12 (2000), 1991-1999; Bonner, Semin. Radiat. Oncol. 12 (2002), 11-20; Kiyota, Oncology 63/1 (2002), 92-98; Kuan, Brain Tumor Pathol. 17/2 (2000), 71-78). EGFR (também conhecido como c-erbl ou HER1) pertence à família da tirosina-cinase do receptor erbB. Quando activado pela ligação de um ligando a partir da família dos factores de crescimento FCE, EGFR homodimeriza ou heterodimeriza com um segundo EGFR ou um outro elemento da família dos receptores erb B, respectivamente, iniciando uma cascata de sinalização através das proteínas cinases ativadoras mitogénicas e outros factores de transcrição que conduzem à proliferação, diferenciação, proliferação e reparação (Olayioye, EMBO J. 19 (2000), 3159-67). EGFR é sobre-expresso em muitos cancros epiteliais, incluindo os cancros colo-rectal, da mama, do pulmão, da cabeça e do pescoço (Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 21 (2003), 2787-99; Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 20 (18, Supl.) (2002), 1S-13S; Prewett, Clin. Câncer Res. 8 (2002), 994-1003). A sobre-expressão e/ou a mutação do EGFR em células malignas conduz à activação constitutiva de actividade da cinase, resultando na proliferação, angiogénese, invasão, metástases e inibição da apoptose (Mendelsohn (2003, loc. cit. ; Ciardiello, Clin. Câncer Res. 7 (2001), 2958-70; Perez-Soler, Oncologist 9 (2004), 58-67). Os anticorpos monoclonais que atingem o domínio de ligação do ligando extracelular ou a cascata de sinalização intracelular da tirosina-cinase do EGFR têm demonstrado eficácia como alvo 51 antitumor (Laskin, Câncer Treat. Review 30 (2004), 1-17). Por exemplo, o cetuxiAcm (Erbitux) um anticorpo monoclonal humanizado para o EGFR, que inibe competitivamente o domínio extracelular de EGFR para inibir a activação do ligando do receptor, foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) em 2004 para o tratamento do cancro do cólon metastático, em combinação com o irinotecano, inibidor de topoisomerase.

Numa modalidade de realização preferida da presente invenção, o polipéptido é uma molécula de anticorpo biespecífico de cadeia simples. Os problemas descritos aqui antes, no que diz respeito ao desenvolvimento das moléculas sucedâneas para estudos pré-clínicos é ainda mais agravado, se o candidato a fármaco for um anticorpo bi-específico, por exemplo, um anticorpo de cadeia simples bi-específico. Esse anticorpo biespecífico requer que ambos os antigénios reconhecidos sejam interespécies específicas para uma dada espécie animal para permitir os ensaios de segurança nesses animais.

Como também observado aqui antes, a presente invenção tem por objecto polipéptidos que compreendem um primeiro domínio de ligação que é um anticorpo capaz de se ligar a um epítopo de cadeia de CD3s humana e de primata não chimpanzé e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar a um antigénio da superfície celular seleccionado entre EGFR, Her2/neu ou IgE, em que o segundo domínio de ligação, de preferência, também se liga a um antigénio da superfície celular de um ser humano e/ou de um primata não chimpanzé. A vantagem das moléculas de anticorpo biespecífico de cadeia simples, como candidatos a fármacos, cumprindo os requisitos do polipéptido preferido da presente invenção, é a utilização dessas moléculas em ensaios pré-clínicos com 52 animais, assim como em estudos clínicos e ainda para a terapêutica em seres humanos. Numa modalidade de realização preferida dos anticorpos biespecíficos de cadeia simples específicos de interespécies, da presente invenção, o segundo domínio de ligação capaz de se ligar a um antigénio da superfície celular é de origem humana. Numa molécula biespecífica, especifica de interespécies, de acordo com a presente invenção, o domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo de CD3s humana e de primata não chimpanzé situa-se na ordem de VP-VL ou VL-VP no terminal N ou no terminal C da molécula biespecífica. Exemplos de moléculas biespecíficas, específicas de interespécies, de acordo com a presente invenção, em diferentes arranjos das cadeias de VP e de VL no primeiro e no segundo domínio de ligação, estão descritos nos exemplos em anexo.

Tal como utilizado aqui, um "anticorpo biespecífico de cadeia simples" indica um polipéptido de cadeia única compreendendo dois domínios de ligação. Cada domínio de ligação compreende uma região variável de uma cadeia pesada de anticorpo ("região VP"), em que a região VP do primeiro domínio de ligação se liga especificamente à molécula de CD3s e a região VP do segundo domínio de ligação liga-se especificamente a um antigénio da superfície celular, tal como definido em maior detalhe a seguir. Os dois domínios de ligação estão eventualmente ligados um ao outro por um espaçador curto de polipéptido. Um exemplo não limitante de um espaçador polipeptídico é Gli-Gli-Gli-Gli-Ser (G-G-G-S) e as suas repetições. Cada domínio de ligação pode compreender, adicionalmente, uma região variável de uma cadeia leve de anticorpo ("região VL"), a região VP e a região VL dentro de cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação ligados um ao outro através de um ligante polipeptídico, por exemplo, do tipo descrito e reivindicado 53 na EP 623679 Bl, mas, em qualquer caso, suficientemente lonqa para permitir que a reqião VP e a região VL do primeiro domínio de ligação e a região VP e a região VL do segundo domínio de ligação emparelhem uma com a outra de tal modo que, em conjunto, são capazes de se ligarem especificamente às respectivas primeira e segunda moléculas.

De acordo com uma modalidade de realização preferida da presente invenção, uma molécula do anticorpo biespecífico de cadeia simples caracterizada antes compreende um grupo de uma das seguintes sequências como RDC Pl, RDC P2, RDC P3, RDC Ll, RDC L2 e RDC L3 no segundo domínio de ligação seleccionado nas SEQ ID NO: 441 - 446, SEQ ID NO: 453 - 458, SEQ ID NO: 463 - 468, SEQ ID NO: 481 - 486.

Uma modalidade de realização particularmente preferida da presente invenção diz respeito a um polipéptido caracterizado antes, em que a molécula de anticorpo biespecífico de cadeia simples compreende uma sequência seleccionada entre: (a) uma sequência de aminoácidos tal como representada em qualquer uma das SEQ ID NOs : 389, 391, 393, 395, 397, 399, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 447, 449, 451, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 495, 497, 499, 501, 503 e 505; e (b) uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico tal como descrito em qualquer uma das SEQ ID NOs: 390, 392, 394, 396, 398, 400, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 448, 450, 452, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 496, 498, 500, 502, 504 e 506. 54

Numa modalidade de realização preferida da presente invenção, os anticorpos de cadeia simples biespecificos são específicos interespécies para CD3 épsilon e para o antigénio de tumor reconhecido pelo seu segundo domínio de ligação.

Numa modalidade alternativa, a presente invenção tem por objecto uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipéptido descrito antes da presente invenção. A presente invenção também tem por objecto um vector que compreende a molécula de ácido nucleico da presente invenção.

Muitos vectores adequados são conhecidos dos especialistas em biologia molecular, a escolha dos quais vai depender da função desejada e incluem plasmidos, cosmidos, vírus, bacteriófagos e outros vectores utilizados convencionalmente em engenharia genética. Os processos, que são bem conhecidos dos especialistas nesta técnica podem ser usados para construir vários plasmidos e vectores diferentes; ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. (loc cit. ) e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativamente, os polinucleótidos e os vectores da presente invenção podem ser reconstituídos em lipossomas para distribuição para células-alvo. Tal como discutido em maior detalhe a seguir, utilizou-se um vector de clonagem para isolar as sequências individuais de ADN. Sequências relevantes podem ser transferidas para vectores de expressão em que é necessária uma expressão de um polipéptido específico. Os vectores de clonagem típicos incluem pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 e pGBT9. Os vectores de expressão típicos incluem pTRE, 55 pCAL-n-EK, pESP-1, pOPl3CAT. Preferencialmente, o referido vector compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é uma sequência reguladora ligada operacionalmente à referida sequência de ácidos nucleicos, definida no presente documento. A expressão "sequência de regulação" refere-se a sequências de ADN, que são necessárias para efectuar a expressão de sequências codificantes às quais estão ligadas. A natureza dessas sequências de controlo difere consoante o organismo hospedeiro. Nos procariotos, as sequências de controlo geralmente incluem promotor, sitio de ligação ribossómico e terminadores. Em eucariotos, geralmente, as sequências de controlo incluem promotores, terminadores e, nalguns casos, intensificadores, transactivadores ou factores de transcrição. A expressão "sequência de controlo" pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é necessária para a expressão e pode também incluir componentes adicionais vantajosos. A expressão "ligado operacionalmente" refere-se à justaposição quando os componentes assim descritos estão numa relação que permite que funcionem da maneira pretendida. Uma sequência de controlo, tal como um promotor, "ligada operacionalmente" a uma sequência de codificação está ligada de tal maneira que a expressão da sequência de codificação é conseguida em condições compatíveis com as sequências de controlo. No caso da sequência de controlo ser um promotor, é óbvio, para um perito, que se utiliza, de preferência, um ácido nucleico de cadeia dupla.

Assim, o vector citado é, de preferência, um vector de expressão. Um "vector de expressão" é um vector que pode 56 ser usado para transformar um hospedeiro seleccionado para a expressão de uma sequência de codificação no hospedeiro seleccionado. Os vectores de expressão podem ser, por exemplo, vectores de clonagem, vectores binários ou vectores de integração. A expressão compreende a transcrição da molécula de ácido nucleico, de preferência num ARNm traduzível. Os elementos de regulação que asseguram a expressão em células procarióticas e/ou eucarióticas são bem conhecidos dos peritos na técnica. No caso de células eucarióticas, incluem, normalmente, promotores que asseguram a iniciação da transcrição e, eventualmente, asseguram sinais de terminação da transcrição e a estabilização do transcrito. Eventuais elementos de regulação que permitem a expressão em células hospedeiras procarióticas compreendem, por exemplo, o PL, promotores de lac, trp ou tac em E. coli e exemplos de elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras eucarióticas são o promotor de A0X1 ou GALl na levedura ou o promotor de CMV, SV40, VSR (vírus do sarcoma de Rous), melhorador de CMV, melhorador de SV40 ou um intrão de globina em células de mamíferos e de outros animais.

Para além destes elementos, que são responsáveis pela iniciação da transcrição, tais elementos reguladores podem também compreender sinais de terminação da transcrição, tais como o sítio de SV40-poli-A ou o sítio de tk-poli-A, a jusante do polinucleótido. Além disso, consoante o sistema de expressão utilizado, podem adicionar-se sequências líderes, capazes de dirigir o polipéptido para um compartimento celular ou segregá-lo para o meio e podem ser adicionadas à sequência de codificação da sequência de ácidos nucleicos citada e são bem conhecidos na técnica; ver também os exemplos em anexo. A sequência líder é 57 adicionada na fase apropriada com sequências de tradução, iniciação e terminação e, de preferência, uma sequência líder capaz de diriqir a secreção da proteína traduzida ou uma sua porção, para o espaço periplasmático ou meio extracelular. Opcionalmente, a sequência heteróloqa pode codificar uma proteína de fusão incluindo um péptido de identificação de terminal N, conferindo as características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso; ver supra. Neste contexto, os vectores de expressão adequados são conhecidos na técnica, tais como os vectores de expressão de ADNc de Okayama-Berg, pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcADNl, pcADN3 (In-vitroqene) , pEF-DHFR, pEF-ADA ou pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025 e Raum et al. Câncer Immunol Immunother (2001) 50 (3), 141-150) or pSPORTl (GIBCO BRL).

De preferência, as sequências de controlo da expressão serão sistemas de promotores eucarióticos em vectores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas podem utilizar-se sequências de controlo para hospedeiros procarióticos. Uma vez que o vector tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido em condições adequadas para expressão de elevado nível das sequências nucleotídicas e, conforme desejado, a recolha e a purificação do polipéptido da presente invenção podem seguir-se; ver, por exemplo, os exemplos em anexo.

Um sistema de expressão alternativo, que pode ser utilizado para expressar uma proteína que interaja com o ciclo das células, é um sistema de insecto. Nesse sistema, o vírus da poliedrose nuclear de Autographs californica (AcNPV) é utilizado como um vector para expressar genes exógenos em células de Spodoptera frugiperda ou em larvas 58 de Trichoplusia. A sequência codificante de uma molécula de ácido nucleico citada pode ser clonada numa região não essencial do vírus, tais como o gene da poliedrina e ser colocada sob o controlo do promotor da poliedrina. A inserção, bem sucedida, da referida sequência de codificação, irá tornar o gene da poliedrina inactivo e produzir vírus recombinante sem revestimento da proteína de revestimento. Os vírus recombinantes são então utilizados para infectar células de S. frugiperda ou larvas de Trichoplusia em que a proteína da presente invenção é expressa (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 91 (1994), 3224-3227).

Os elementos reguladores adicionais podem incluir melhoradores transcricionais, assim como translacionais. Vantajosamente, os vectores da presente invenção descritos antes compreendem um marcador seleccionável e/ou pontuável.

Os genes marcadores seleccionáveis úteis para a selecção de células transformadas e, por exemplo, tecidos de plantas e plantas são bem conhecidos pelos peritos na técnica e incluem, por exemplo, resistência a ant imetabólitos, como a base de selecção para dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, que confere resistência aos aminoglicósidos, neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e higro, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Já foram descritos genes adicionais seleccionáveis, nomeadamente trpB, que permite que as células utilizem indol em vez de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988), 8047); manose-6-fosfato-isomerase, que permite que as 59 células utilizem manose (WO 94/20627) e ODC (ornitina-descarboxilase) que confere resistência ao inibidor da ornitina-descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) ou desaminase de Aspergillus terreus, que confere resistência à blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995) , 2336-2338).

Marcadores pontuáveis úteis são também conhecidos pelos peritos na técnica e estão disponíveis comercialmente. Vantajosamente, o referido marcador é um gene que codifica a luciferase (Giacomin, PI. Sei. 116 (1996) , 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), a proteina fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) ou a β-glicuronidase (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Esta modalidade é particularmente útil para o rastreio simples e rápido de células, tecidos e organismos que contêm um vector citado.

Tal como descrito antes, a molécula de ácido nucleico citada pode ser usada sozinha ou como parte de um vector para expressar o polipéptido da presente invenção em células, para, por exemplo, a purificação, mas também para fins de terapêutica genética. As moléculas de ácidos nucleicos ou os vectores que contêm as sequências de ADN que codificam qualquer um dos polipéptidos da presente invenção descritos antes são introduzidas nas células que, por sua vez, produzem o polipéptido de interesse. A terapêutica génica, que se baseia na introdução de genes terapêuticos em células, por técnicas ex vivo ou in vivo, é uma das aplicações mais importantes da transferência de genes. Os vectores adequados, os processos ou os sistemas de administração de genes para a terapêutica genética in 60 vitro ou in vivo, encontram-se descritos na literatura e são conhecidos dos peritos na técnica; ver, por exemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699 ; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sei. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5.580.859; US 5.589.466; ou Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. As moléculas de ácidos nucleicos e os vectores citados antes podem ser concebidos para introdução directa ou para introdução através de lipossomas ou vectores virais (por exemplo, adenovirais, retrovirais) na célula. De preferência, a referida célula é uma linha celular germinal, célula embrionária ou célula de ovo ou derivada delas, sendo preferível que a referida célula seja uma célula estaminal. Um exemplo de uma célula estaminal embrionária pode ser, inter alia, uma célula estaminal, tal como descrita em Nagy, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993), 8424-8428. A presente invenção também tem por objecto uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vector da presente invenção. A referida célula hospedeira pode ser produzida através da introdução, no hospedeiro, do vector da presente invenção descrito antes ou da molécula de ácido nucleico da presente invenção descrita antes. A presença de pelo menos um vector ou pelo menos uma molécula de ácido nucleico na célula hospedeira pode mediar a expressão de um gene que codificar os vectores de anticorpos de cadeia única descritos antes. 61 A molécula de ácido nucleico ou o vector da presente invenção descritos, que são introduzidos na célula hospedeira podem ser quer integradom no genoma da célula hospedeira ou podem ser mantidom extracromossomicamente. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. 0 termo "procariótica" significa que inclui todas as bactérias que podem ser transformadas ou transfectadas com moléculas de ADN ou de ARN para a expressão de uma proteína da presente invenção. As células hospedeiras procarióticas podem incluir tanto bactérias gram-negativas como gram-positivas, tais como, por exemplo, E. coli, S. typhimuhum, Serratia marcescens e Bacillus subtilis. 0 termo "eucariótica" inclui leveduras, plantas superiores, células de insectos e, de preferência, de mamíferos. Consoante a célula hospedeira utilizada num processo de produção recombinante, a proteína codificada pelo polinucleótido da presente invenção pode ser glicosilada ou pode ser não glicosilada. Especialmente preferida é a utilização de um plasmido ou de um vírus que contenha a sequência de codificação do polipéptido da presente invenção fundido geneticamente com um marcador FLAG de terminal N e/ou um marcador His de terminal C. De preferência, o comprimento do referido marcador FLAG é de cerca de 4 a 8 aminoácidos, mais preferencialmente de 8 aminoácidos. Um dos poli-nucleótidos descrito antes pode ser utilizado para transformar ou transfectar a célula hospedeira utilizando qualquer uma das técnicas vulgarmente conhecidas dos peritos nesta técnica. Além disso, os processos para a preparação de genes fundidos, ligados operacionalmente e que os expressam, por exemplo, em células de mamíferos e 62 bactérias, sao bem conhecidos na técnica (Sambrook, loc cit. ) .

Preferencialmente, a célula hospedeira é uma bactéria ou uma célula de insecto, de fungos, de plantas ou de animais.

Pretende-se, especialmente, que a célula hospedeira citada seja uma célula de mamífero. As células hospedeiras particularmente preferidas compreendem as células de OHC, células de COS, linhas de células de mieloma tais como SP2/0 ou NS/0. Tal como ilustrado nos exemplos anexos, particularmente preferidas como células hospedeiras são as células de OHC.

Mais preferivelmente, a referida célula hospedeira é uma célula humana ou uma linha de células humanas, por exemplo per.cô (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19: 163-168) .

Numa outra modalidade de realização, a presente invenção tem por objecto um processo para a produção de um polipéptido da presente invenção, compreendendo o referido processo a cultura de uma célula hospedeira da presente invenção em condições que permitam a expressão do polipéptido da presente invenção e a recuperação do polipéptido produzido pela cultura.

As células hospedeiras transformadas podem crescer em fermentadores e podem ser cultivadas de acordo com técnicas conhecidas na técnica para atingir o crescimento celular óptimo. O polipéptido da presente invenção pode então ser isolado do meio de crescimento, lisados celulares ou fracções de membranas celulares. O isolamento e a 63 purificação, por exemplo, dos polipéptidos microbianamente expressos da presente invenção podem ser feitos por quaisquer meios convencionais, tais como, por exemplo, separações cromatográficas preparativas e separações imunológicas, tais como as que envolvem a utilização de anticorpos monoclonais ou policlonais dirigidos, por exemplo, contra um marcador do polipéptido da presente invenção ou como descrito nos exemplos infra.

As condições para a cultura de uma célula hospedeira, que permitem a expressão, são conhecidas na técnica como dependendo do sistema da célula hospedeira e do sistema de expressão/vector utilizado em tal processo. Os parâmetros a serem modificados, a fim de atingir as condições que permitam a expressão de um polipéptido recombinante, são conhecidos na técnica. Assim, as condições adequadas podem ser determinadas por um perito na técnica, na ausência de entrada adicional de dados da presente invenção.

Uma vez expressos, o polipéptido da presente invenção pode ser purificado, de acordo com procedimentos-padrão da técnica, incluindo precipitação com sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, electro-forese em gel e similares; ver, Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982). Os polipéptidos praticamente puros de, pelo menos cerca de 90 a 95 % de homogeneidade são preferidas e os de 98 a 99 % ou mais de homogeneidade são os mais preferidas para usos farmacêuticos. Uma vez purificado, parcialmente ou até à homogeneidade desejada, o polipéptido da presente invenção pode então ser utilizado terapeuticamente (incluindo extracorpóreamente) ou no desenvolvimento e na realização de procedimentos de ensaio. Além disso, exemplos de processos para a recuperação do polipéptido da presente 64 invenção, a partir de uma cultura, estão descritos em detalhe nos exemplos infra.

Além disso, a presente invenção tem por objecto uma composição que compreende um polipéptido da presente invenção ou um polipéptido tal como produzido pelo processo descrito antes. De preferência, a referida composição é uma composição farmacêutica.

De acordo com a presente invenção, a expressão "composição farmacêutica" refere-se a uma composição para administração a um doente, preferivelmente um doente humano. A composição farmacêutica particular preferida da presente invenção compreende moléculas de ligação dirigidas contra e geradas contra epítopos de CD3 independentes do contexto. De preferência, a composição farmacêutica compreende formulações adequadas de veiculos, estabilizantes e/ou excipientes. Numa modalidade de realização preferida, a composição farmacêutica compreende uma composição para administração parentérica, transdérmica, intraluminal, intra-arterial, intratecal e/ou intranasal ou por injecção directa no tecido. Considera-se, em particular, que a referida composição é administrada a um doente através de infusão ou de injecção. A administração das composições adequadas pode ser efectuada por diferentes vias, por exemplo, por via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica ou intradérmica. Em particular, a presente invenção tem por objecto uma composição adequada para uma administração continua. Como um exemplo não limitativo, a administração sem interrupção, isto é, a administração continua, pode ser realizada por um sistema de uma pequena bomba usada pelo doente para medir o fluxo de agente terapêutico para o corpo do doente. A composição farmacêutica compreendendo as 65 moléculas de ligação dirigidas contra e geradas contra os epitopos de CD3, independentes do contexto, da presente invenção, podem ser administradas utilizando os referidos sistemas de bomba. Esses sistemas de bombas são geralmente conhecidos na técnica e, geralmente dependem da permuta periódica de cartuchos contendo o agente terapêutico a ser infundido. Ao trocar o cartucho desse sistema de bomba, uma interrupção temporária do fluxo, ininterrupto de outro modo, do agente terapêutico, para o corpo do doente pode prosseguir. Nesse caso, a fase de administração antes da substituição do cartucho e a fase de administração no seguimento da substituição do cartucho devem também ser consideradas, na acepção do meio e processos farmacêuticos da presente invenção, formando, em conjunto, uma "administração continua" desse agente terapêutico. A administração continua ou ininterrupta destas moléculas de ligação dirigidas contra e geradas contra os epitopos de CD3, independentes do contexto, da presente invenção, pode ser intravenosa ou subcutânea por via de um dispositivo de administração de fluidos ou um sistema de bomba pequena incluindo um mecanismo de condução de fluido para dirigir o fluido para fora de um reservatório e um mecanismo de accionamento para accionar o mecanismo de accionamento. Os sistemas de bomba para administração subcutânea podem incluir uma agulha ou uma cânula para penetrar a pele de um doente fornecendo a composição apropriada ao corpo do doente. Os referidos sistemas de bomba podem ser fixados ou ligados directamente à pele do doente, de forma independente de uma veia, artéria, ou vaso sanguíneo, permitindo assim um contacto directo entre o sistema de bomba e a pele do doente. 0 sistema de bomba pode ser fixado à pele do doente durante 24 horas até vários dias. 0 sistema de bomba pode ser de pequena 66 dimensão, com um reservatório para pequenos volumes. Como exemplo não limitativo, o volume do reservatório para a composição farmacêutica adequada para ser administrada pode situar-se entre 0,1 e 50 ml. A administração continua pode ser transdérmica por meio de um adesivo usado na pele e substituído periodicamente. Um especialista na técnica tem conhecimento de sistemas de pensos para a administração de fármacos adequados para este fim. É digno de nota que a administração transdérmica é especialmente passível de administração contínua, como a troca de um primeiro adesivo esgotado pode vantajosamente ser realizada simultaneamente com a colocação de um segundo adesivo novo, por exemplo, à superfície da pele imediatamente adjacente ao primeiro penso esgotado e imediatamente antes da remoção do primeiro penso esgotado. Questões de interrupção do fluxo ou de falhas da célula de energia não surgem. A composição da presente invenção, que compreende, em especial, as moléculas de ligação dirigidas contra e geradas contra epítopos de CD3 independente do contexto, pode ainda compreender um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são bem conhecidos na técnica e incluem soluções, por exemplo, soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes de molhagem, soluções estéreis, lipossomas, etc. As composições que compreendem esses veículos podem ser formuladas por processos convencionais bem conhecidos. As formulações podem incluir hidratos de carbono, soluções tampão, aminoácidos e/ou tensioactivos. Os hidratos de carbono podem ser açúcares não redutores, de preferência, trealose, sacarose, octa-sulfato, sorbitol ou xilitol. 67

Essas formulações podem ser utilizadas para administração continua, que pode ser intraveosa ou subcutânea com e/ou sem sistemas de bomba. Os aminoácidos podem ser aminoácidos carregados, de preferência, lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato e/ou histidina. Os agentes tensio-activos podem ser detergentes, de preferência com um peso molecular de > 1,2 KD e/ou de um poliéter, de preferência com um peso molecular de > 3 KD. Exemplos não limitativos dos detergentes preferidos são o Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 ou Tween 85. Exemplos não limitativos de poliéteres preferidos são PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 ou PEG 5000. Os sistemas tampão usados na presente invenção podem ter um pH preferido de 5-9 e podem compreender citrato, succinato, fosfato, histidina e acetato. As composições da presente invenção podem ser administradas ao indivíduo, numa dose adequada, que pode ser determinada, por exemplo, por estudos de doses crescentes por administração de doses crescentes do polipéptido da presente invenção exibindo a especificidade interespécies aqui descrita para os primatas não chimpanzés, por exemplo, macacas. Como estabelecido antes, o polipéptido da presente invenção, exibindo a especificidade interespécies aqui descrita, pode ser vantajosamente utilizado de forma idêntica em ensaios pré-clínicos em primatas não chimpanzés e como fármaco em seres humanos. Estas composições podem também ser administradas em combinação com outros fármacos proteináceos e não proteináceos. Estes fármacos podem ser administrados simultaneamente com a composição compreendendo o polipéptido da presente invenção, tal como aqui definido ou separadamente, antes ou depois da administração do referido polipéptido, a intervalos e doses definidos. O regime de dosagem será determinado pelo médico assistente e por factores clínicos. Como é bem conhecido nas técnicas médicas, as dosagens para qualquer doente 68 dependem de muitos factores, incluindo o tamanho do doente, a área de superfície do corpo, a idade, o composto particular a ser administrado, o género, o tempo e a via de administração, o estado geral de saúde e outros fármacos administrados concomitantemente. As preparações para administração parentérica incluem soluções, suspensões e emulsõs assépticas, aquosas ou não aquosas. Exemplos de dissolventes não aquosos são propileno-glicol, polietileno-glicol, óleos vegetais tais como azeite e ésteres orgânicos injectáveis tais como oleato de etilo. Veículos aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo meios salinos e tamponados. Veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, cloreto de sódio e dextrose, lactato de Ringer ou óleos não voláteis. Veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de electrólitos (tais como os que se baseiam em dextrose de Ringer) e similares. Os conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, agentes antimicrobianos, anti-oxidantes, agentes quelantes, gases inertes e similares. Além disso, a composição da presente invenção pode compreender veículos proteicos, como, por exemplo, albumina do soro ou imunoglobulina, de preferência de origem humana. Considera-se que a composição da presente invenção pode compreender, para além do polipéptido da presente invenção aqui definido, ainda mais agentes biologicamente activos, em função da utilização pretendida para a composição. Esses agentes podem ser fármacos que actuam no sistema gastro-intestinal, fármacos que actuam como substâncias citostáticas, fármacos que previnem a hiperuricémia, fármacos inibidores de imunorreacções (por exemplo, corticosteróides), fármacos que regulam a resposta inflamatória, fármacos que actuam 69 sobre o sistema circulatório e/ou agentes, tais como as citocinas, conhecidos na técnica. A actividade biológica da composição farmacêutica aqui definida pode ser determinada, por exemplo, por ensaios de citotoxicidade, tal como descrito nos exemplos que se seguem, em WO 99/54440 ou por Schlereth et al. (Câncer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12). "Eficácia" ou "eficácia in vivo", tal como aqui utilizada, refere-se à resposta ao tratamento com a composição farmacêutica da presente invenção, utilizando, por exemplo, os critérios de resposta padronizados do NCI. O sucesso ou a eficácia in vivo da terapêutica, utilizando a composição farmacêutica da presente invenção, refere-se à eficácia da composição para a finalidade pretendida, ou seja, a capacidade da composição para causar o efeito desejado, isto é, a depleção de células patológicas, por exemplo, células tumorais. A eficácia in vivo pode ser monitorizada por processos-padrão estabelecidos para as respectivas entidades de doença, incluindo, mas não se limitando a contagem de glóbulos brancos, diferenciais, classificação de células activadas por fluorescência, aspiração de medula óssea. Além disso, podem utilizar-se vários parâmetros de química clínica, específicos de doenças e outros processos-padrão estabelecidos. Além disso, também se pode utilizar tomografia assistida por computador, raio X, tomografia de ressonância magnética nuclear (por exemplo, avaliação da resposta com base nos critérios do National Câncer

Institute [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann w, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Cárter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an International workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. 70 NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Abr; 17 (4): 1244]), tomografia por emissão de positrões, contagem de glóbulos brancas do sangue, diferenciais, de classificação de células activadas por fluorescência, aspiração de medula óssea, biópsias/ histologias de nódulos linfáticos e vários parâmetros de química clínica específicos do linfoma (por exemplo, lactato-desidrogenase) e outros processos padrão estabelecidos.

Outro grande desafio no desenvolvimento de fármacos, tal como a composição farmacêutica da presente invenção, é a regulação previsível das propriedades farmacocinéticas. Para este fim, estabelece-se o perfil farmacocinético do medicamento candidato, ou seja, um perfil dos parâmetros farmacocinéticos que afectem a capacidade de um fármaco em particular para o tratamento de um determinado estado clínico. Os parâmetros farmacocinéticos do medicamento que influenciam a capacidade de um fármaco para o tratamento de uma determinada doença incluem, mas não se limitam a: semi-período de vida, volume de distribuição, metabolismo hepático de primeira passagem e grau de ligação ao soro sanguíneo. A eficácia de um dado agente de fármaco pode ser influenciada por cada um dos parâmetros mencionados antes. "Semi-período de vida" significa o tempo durante o qual 50 % de um fármaco administrado é eliminado por meio de processos biológicos, por exemplo, metabolismo, excreção, etc.

Por "metabolismo hepático de primeira passagem" entende-se a propensão de um medicamento para ser metabolizado após o primeiro contacto com o fígado, ou seja, durante a sua primeira passagem através do fígado. 71 "Volume de distribuição" significa o grau de retenção de um medicamento ao longo dos vários compartimentos do corpo, como por exemplo espaços intracelulares e extracelulares, tecidos e órgãos, etc. e a distribuição do fármaco no interior destes compartimentos. "Grau de ligação no soro do sangue" significa a propensão de um medicamento para interagir e ligar-se a proteínas séricas do sangue, tais como albumina, levando a uma diminuição ou à perda da actividade biológica do fármaco.

Os parâmetros farmacocinéticos também incluem a biodisponibilidade, o tempo de atraso (Tlag), Tmax, as taxas de absorção, mais inserção e/ou Cmax para uma dada quantidade de fármaco administrado. "Biodisponibilidade" significa a quantidade de um medicamento na zona do sangue. "Tempo de retardamento" significa o intervalo de tempo entre a administração do fármaco e a sua detecção e capacidade de medição no sangue ou no plasma. "Tmax" é o tempo após o qual se atinge a concentração máxima no sangue e "Cmax" é a concentração máxima obtida no sangue com um determinado fármaco. 0 tempo para atingir uma concentração do fármaco no sangue ou num tecido que é necessário para o seu efeito biológico é influenciado por todos os parâmetros. Os parâmetros farmacocinéticos de anticorpos de cadeia simples duplamente específicos, uma modalidade de realização preferida do polipéptido da presente invenção, exibindo especificidade interespécies, que pode ser determinada em ensaios pré-clínicos em animais primatas não chimpanzés, como indicado antes, estão também 72 estabelecidos, por exemplo, na publicação de Schlereth et al. (Câncer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12). O termo "toxicidade", tal como aqui utilizado, refere-se aos efeitos tóxicos de um fármaco manifestado em eventos adversos ou eventos adversos graves. Estes eventos adversos podem referir-se a uma falta de tolerância ao fármaco, em geral e/ou a uma falta de tolerância local após a administração. A toxicidade pode também incluir efeitos teratogénicos ou cancerígenos causados pelo fármaco.

As expressões "segurança" "segurança in vivo" ou "tolerância", tal como aqui utilizadas, definem a administração de um fármaco sem induzir efeitos adversos graves, directamente após a administração (tolerância local) e durante um período de tempo mais longo de aplicação do medicamento. A "segurança" "segurança in vivo" ou "tolerância" podem ser avaliadas, por exemplo, a intervalos regulares durante o tratamento e durante o período de acompanhamento. As medições incluem a avaliação clínica, por exemplo, manifestações de órgãos e triagem de anomalias feitas em laboratório. A avaliação clínica pode ser realizada e desviada para a observação de resultados normais gravados/codifiçados de acordo com os padrões do NCI-CTC e/ou da MedDRA. As manifestações em órgãos podem incluir critérios tais como alergia/imunologia sangue/ medula óssea, arritmia cardíaca, coagulação e similares, conforme estabelecido, por exemplo, nos critérios de terminologia comum para eventos adversos, versão v3.0 (CTCAE). Os parâmetros laboratoriais que podem ser analisados incluem, por exemplo, hematologia, química clínica, perfil de coagulação e análise de urina e exames de outros fluidos corporais, tais como soro, plasma, fluido espinal ou linfóide, licor e similares. A segurança pode, 73 portanto, ser avaliada, por exemplo, por exame físico, técnicas de imagem (ou seja, ultrassons, raios X, tomografia computadorizada (TC), imagem por ressonância magnética (IRM), outras medidas com dispositivos técnicos (por exemplo, eletrocardiograma), sinais vitais, medindo parâmetros laboratoriais e registo de eventos adversos. Por exemplo, eventos adversos em primatas não chimpanzés nos usos e processos de acordo com a presente invenção podem ser examinados por meio de processos histopatológicos e/ou histoquimicos. A expressão "dose eficaz e não tóxica", tal como aqui utilizada, refere-se a uma dose tolerável do anticorpo biespecífico de cadeia simples, tal como aqui definido, que seja suficientemente elevada para causar depleção de células patológicas, eliminação de tumores, diminuição do tamanho do tumor ou estabilização da doença sem ou praticamente sem grandes efeitos tóxicos. Essas doses eficazes e não tóxicas podem ser determinadas, por exemplo, por estudos de escalonamento da dose descritos na técnica e devem ser inferiores à dose que induz eventos adversos graves (toxicidade limitativa da dose, TLD) .

As expressões anteriores são também referidas por exemplo, no Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting em 16 de Julho de 1997.

Além disso, a presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido da presente invenção (isto é, um polipéptido que compreende pelo menos um domínio de ligação capaz de se ligar a um epítopo da cadeia épsilon de CD3 de seres humanos e 74 primatas não chimpanzés, em que o epítopo faz parte de uma sequência de aminoácidos incluída no grupo que consiste nas SEQ ID NOs. 2, 4, 6, ou 8, de acordo com a presente invenção ou produzida de acordo com o processo de acordo com a presente invenção) para a prevenção, tratamento ou melhoria de uma doença seleccionada entre uma doença proliferativa, uma doença tumoral ou um distúrbio imunológico. De preferência, a referida composição farmacêutica compreende ainda formulações adequadas de veículos, estabilizantes e/ou excipientes.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se à utilização de um polipéptido, tal como aqui definido antes ou produzido de acordo com um processo tal como aqui definido antes, para a preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção, tratamento ou melhoria de uma doença. Preferencialmente, a referida doença é uma doença proliferativa, uma doença tumoral ou um distúrbio imunológico. É ainda preferido que a referida doença tumoral seja uma doença maligna, preferivelmente cancro.

Numa outra modalidade de realização preferida da utilização do polipéptido da invenção, a referida composição farmacêutica é adequada para ser administrada em combinação com um fármaco adicional, isto é, como parte de uma terapêutica de combinação. Na referida terapêutica de combinação, eventualmente pode-se incluir, na mesma composição farmacêutica, um agente activo, tal como o polipéptido da presente invenção ou pode ser incluído numa composição farmacêutica separada. Neste último caso, a referida composição farmacêutica separada é adequada para administração antes, simultaneamente ou após a administração da referida composição farmacêutica compreendendo o polipéptido da presente invenção. 0 fármaco 75 ou a composição farmacêutica adicionais podem ser um composto não proteináceo ou um composto proteináceo. No caso desse medicamento adicional ser um composto proteico, é vantajoso que o composto proteináceo seja capaz de fornecer um sinal de activação para as células imunitárias efectoras.

De preferência, o referido composto proteico ou composto não proteico pode ser administrado simultaneamente ou não simultaneamente com o polipéptido da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico, tal como aqui definida anteriormente, um vector tal como definido aqui antes ou um hospedeiro, tal como definido aqui antes.

Um outro aspecto da presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica da presente invenção para ser utilizada no tratamento ou na melhoria de uma doença num indivíduo com a necessidade do mesmo, compreendendo o referido processo a etapa de administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da presente invenção. Preferencialmente, a referida doença é uma doença proliferativa, uma doença tumoral ou um distúrbio imunológico. É ainda mais preferido que a referida doença tumoral seja uma doença maligna, preferivelmente cancro.

Numa outra modalidade de realização preferida, a referida composição farmacêutica é adequada para ser administrada em combinação com um fármaco adicional, isto é, como parte de uma terapêutica de combinação. Na referida terapêutica de combinação, eventualmente pode-se incluir, na mesma composição farmacêutica, um agente activo, tal como o polipéptido da presente invenção ou pode ser incluído numa composição farmacêutica separada. Neste 76 último caso, a referida composição farmacêutica separada é adequada para administração antes, simultaneamente ou após a administração da referida composição farmacêutica compreendendo o polipéptido da presente invenção. 0 fármaco ou a composição farmacêutica adicional pode ser um composto não proteináceo ou um composto proteináceo. No caso desse medicamento adicional ser um composto proteico, é vantajoso que o composto proteináceo seja capaz de fornecer um sinal de activação para as células imunitárias efectoras.

De preferência, o referido composto proteico ou composto não proteico pode ser administrados simultaneamente ou não simultaneamente com o polipéptido da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico, tal como aqui definida anteriormente, um vector tal como definido aqui antes ou um hospedeiro, tal como definido aqui antes. É preferível que, no processo descrito antes da presente invenção, o referido indivíduo seja um ser humano.

Noutro aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um estojo que compreende um polipéptido da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, um vector da presente invenção ou um hospedeiro da presente invenção. A presente invenção tem ainda por objecto a seguinte lista de itens:

Item 1. Um processo para a identificação de (a) polipéptido (s) que compreendem um domínio de ligação específico interespécies capaz de se ligar a um epítopo de CD3 épsilon (CD3s) humana e de primata não chimpanzé, compreendendo esse processo as etapas de: 77 (a) o contacto do polipéptido (s) com um fragmento de terminal N do domínio extracelular de CD3s, com 27 aminoácidos no máximo, compreendendo a sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gli-Asn-Glu-Glu-Met-Gli (SEQ ID NO. 381) ou Gln-Asp-Gli-Asn-Glu-Glu-Ile-Gli (SEQ ID NO. 382), fixado por intermédio do seu terminal C a uma fase sólida; (b) a eluição do polipéptido ligado do referido fragmento; e (c) o isolamento do polipéptido a partir do produto eluído de (b).

Prefere-se que os polipéptido identificados pelo processo anterior da presente invenção sejam de origem humana. 0 presente "processo para a identificação de (a) polipéptido (s)" é entendido como um processo para o isolamento de um ou mais polipéptidos diferentes, com a mesma especificidade para o fragmento do domínio extracelular de CD3s que compreende, no seu terminal N, a sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gli-Asn-Glu-Glu-Met-Gli (SEQ ID NO 381) ou Gln-Asp-Gli-Asn-Glu-Glu-Ile-Gli (SEQ ID NO. 382) a partir de vários polipéptidos candidatos, bem como um processo para a purificação de um polipéptido a partir de uma solução. Modalidades não limitativas de um processo de isolamento de um ou mais polipéptidos diferentes, com a mesma especificidade para o fragmento do domínio extracelular de CD3s compreendem processos para a selecção de entidades de ligação específicas de antigénios, por exemplo, processos de aderência a uma superfície sólida normalmente usados para o rastreio do hibridoma, rastreio de clones transfectadas transitoriamente/ estavelmente de células hospedeiras eucarióticas ou em 78 processos de exibição de fagos. Um exemplo não limitativo deste último processo para a purificação de um polipéptido a partir de uma solução é, por exemplo, a purificação de um polipéptido expresso de forma recombinante a partir de um sobrenadante de cultura ou a partir de uma preparação dessa cultura.

Tal como afirmado antes, o fragmento utilizado neste processo é um fragmento de terminal N do dominio extracelular da molécula CD3s de primata. A sequência de aminoácidos do dominio extracelular da molécula CD3s, de diferentes primatas, está representada nas SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 7. As duas formas do octâmero, de terminal N, estão representadas nas SEQ ID NOs: 381 e 382. É preferível que este terminal N esteja disponível numa forma livre para a ligação dos polipéptidos a serem identificados pelo processo da presente invenção. A expressão "disponível numa forma livre" é entendida, no contexto da presente invenção, como livre de elementos adicionais, tais como um marcador de His. A interferência desse marcador de His, com uma molécula de ligação identificada pelo processo da presente invenção, está descrita no exemplo 6 em anexo.

De acordo com o processo mencionado antes, o referido fragmento fixa-se, através do terminal C, a uma fase sólida. Um especialista na técnica facilmente e sem qualquer ajuda da presente invenção escolherá um suporte de fase sólida adequado dependente da modalidade de realização usada do processo da presente invenção. Exemplos de um suporte sólido incluem, mas não se limitam a matrizes tais como pérolas (por exemplo, pérolas de agarose, pérolas de sefarose, pérolas de polistirol, pérolas de dextrano), placas (placas de cultura ou de placas de poços múltiplos), bem como chips conhecidos, por exemplo, da Biacore®. A 79 selecção dos meios e dos processos para a fixação/ imobilização do fragmento ao referido suporte sólido dependerão da escolha do suporte sólido. Um processo vulgarmente utilizado para a fixação/imobilização é um acoplamento por via de éster de N-hidroxissuccinimida (NHS) . A química subjacente a este acoplamento, assim como os processos alternativos de fixação/imobilização são conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo, a partir de Hermanson "Bioconjugate Techniques", Academic Press, Inc. (1996). Para a fixação/imobilização em suportes cromatográficos, utilizam-se normalmente os meios seguintes: sefarose activada por NHS (por exemplo, HiTrap-NHS da GE Life Science - Amersham), sefarose activada por CnBr (por exemplo, GE Life Science Amersham), pérolas de dextrano activadas por NHS (Sigma) ou polimetacrilato activado. Estes reagentes também podem ser utilizados numa abordagem em diferido. Além disso, as pérolas de dextrano compreendendo óxido de ferro (por exemplo, disponível na Miltenyi) podem ser utilizadas numa abordagem em lotes. Estas pérolas podem ser utilizadas em combinação com um íman para a separação das pérolas a partir de uma solução. Os polipéptidos podem ser imobilizados num chip da Biacore (por exemplo, chips CM5) pelo uso de carboximetildextrano activado. Outros exemplos de um suporte sólido adequado são as placas de aminas reactivas com múltiplas cavidades (por exemplo, placas Nunc Immobilizer™) .

De acordo com o processo mencionado antes, o referido fragmento do domínio extracelular de CD3 épsilon pode ser directamente acoplado ao suporte sólido ou através de um segmento de aminoácidos, que pode ser um ligante ou outra parte de proteína/polipéptido. Alternativamente, o domínio extracelular de CD3 épsilon 80 pode ser acoplado indirectamente através de uma ou mais moléculas adaptadoras.

Os meios e os processos para a eluição de um péptido ligado a um epitopo imobilizado são bem conhecidos na técnica. 0 mesmo é válido para os processos de isolamento dos polipéptidos identificados a partir do eluato.

Em linha com a descrição de um processo para o isolamento de um ou mais polipéptidos diferentes, com a mesma especificidade para o fragmento do domínio extracelular de CD3s que compreende, na sua sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gli-Asn-Glu-Glu-X-GIi, de terminal N, a partir de vários candidatos a polipéptidos podem compreender uma ou mais etapas dos processos que se seguem para a selecção de entidades específicos de antigénios: moléculas de ligação específicas de CD3s podem ser seleccionadas a partir de repertórios de derivados de anticorpos. Uma biblioteca de exibição de fagos pode ser construída com base em procedimentos-padrão, como por exemplo descrito em "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. O formato dos fragmentos de anticorpos na biblioteca de anticorpos pode ser scFv, mas em geral, também pode ser um fragmento Fab ou mesmo um fragmento de anticorpo de domínio único. Para o isolamento dos fragmentos de anticorpos podem utilizar-se bibliotecas de fragmentos de anticorpos naturais. Para a selecção de entidades de ligação potencialmente pouco imunogénicas, numa posterior utilização terapêutica, as bibliotecas de fragmentos de anticorpos humanos podem ser 81 favoráveis para a selecção directa de fragmentos de anticorpos humanos. Nalguns casos, podem formar a base de bibliotecas de anticorpos sintéticos (Knappik et al. J Mol. Biol. 2000, 296: 57 ff). O formato correspondente pode ser Fab, scFv (tal como descrito a seguir) , ou anticorpos de domínio (Acd [dAbs em inglês], tal como revisto em Holt et al., Trends Biotechnol. 2003, 21: 484 ff). É também conhecido na técnica que, em muitos casos, não há disponível nenhuma fonte de anticorpos imunitários humanos contra o antigénio-alvo. Portanto os animais são imunizados com o antigénio-alvo e as respectivas bibliotecas de anticorpos são isoladas a partir de tecido animal, tal como, por exemplo, o baço ou as CMSP. O fragmento de terminal N pode ser biotinilado ou ligado covalentemente a proteínas, como KLH ou albumina de soro bovino (ASB). De acordo com abordagens comuns, utilizam-se roedores para a imunização. Alguns dos repertórios de anticorpos imunes de origem não humana podem ser especialmente favoráveis, por outras razões, por exemplo, para detectar a presença de anticorpos de domínio único (VHH) derivados de espécies camelóides (tal como descrito em Muyldermans, J Biotechnol. 74: 277; De Genst et al. Dev Como Immunol. 2006, 30: 187 ff). Por conseguinte, um formato correspondente da biblioteca de anticorpos pode ser Fab, scFv (tal como descrito a seguir) ou anticorpos de domínio único (VHH).

Numa abordagem possível, podem imunizar-se ratos F1 de dez semanas de idade, resultantes de cruzamentos de murganhos Balb/cx C57 negros, com células completas expressando, por exemplo, EpCAM transmembranar de terminal N exibindo, como fusão translacional dos 82 aminoácidos 1 a 27, de terminal N, da cadeia CD3s madura. Alternativamente, os ratos podem ser imunizados com a proteína de fusão de CD3 épsilon de 1-27 aminoácidos - Fc (uma abordagem correspondente está descrita no exemplo 2 em anexo) . Após a imunização de reforço, podem colher-se as amostras de sangue e titular os anticorpos do soro contra as células T positivas para CD3 que podem ser analisadas, por exemplo, por análise por SCAF. Normalmente, os títulos séricos são significativamente mais elevados nos animais imunizados do que nos animais não imunizados. Os animais imunizados podem formar a base para a construção de bibliotecas de anticorpos imunes. Exemplos dessas bibliotecas compreendem bibliotecas de exibição de fagos. Essas bibliotecas podem ser geralmente construídas com base em procedimentos padrão, como por exemplo descrito em "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Os anticorpos não humanos podem também ser humanizados através da exibição de fagos, devido à geração de bibliotecas de anticorpos mais variáveis que podem ser posteriormente enriquecidas para aglutinantes durante a selecção.

Numa abordagem de exibição de fagos, qualquer um dos conjuntos de fagos que exibem as bibliotecas de anticorpos formam uma base para seleccionar as entidades de ligação utilizando o antigénio correspondente como molécula-alvo. A etapa central em que os antigénios específicos, os antigénios ligados a fagos são isolados é designada por aderência a uma superfície sólida. Devido à exibição dos fragmentos de anticorpos na superfície dos fagos, este processo geral é designado por exibição de fagos. Um processo 83 preferido para a selecção é a utilização de proteínas pequenas, tais como o domínio N2 de fagos filamentosos fundido translacionalmente com o terminal N do scFv exibido pelo fago. Outro processo de exibição conhecido na técnica, que pode ser usado para isolar entidades de ligação é o processo de exibição de ribossomas (revisto em Groves & Osboum, Expert Opin Biol Ther. 2005, 5: 125 ff; Lipovsek & Pluckthun, J Immunol Methods 2004, 290: 52 ff) . A fim de demonstrar a ligação de partículas de fago de scFv a uma proteína de fusão de CD3s de 1-27 aa - Fc, pode-se colher uma biblioteca de fagos comportando o repertório de scFv clonados, a partir do respectivo sobrenadante de cultura, por meio de PEG (polietileno- glicol). As partículas de fagos de ScFv podem ser incubadas com a proteína de fusão de CD3 ε - Fc imobilizada. A proteína de fusão de CD3s Fc imobilizada pode ser revestida com uma fase sólida. As entidades de ligação podem ser eluídas e o eluato pode ser utilizado para a infecção de hospedeiros bacterianos frescos não infectados. Os hospedeiros bacterianos transduzidos com sucesso com uma cópia de fagemido, que codificam um fragmento scFv humano, podem ser seleccionados novamente para a resistência à carbenicilina e, subsequentemente, infectados, por exemplo, com fagos auxiliares de VCMS 13 para iniciar o segundo ciclo de exibição de anticorpos e a seleção in vitro. Normalmente, realiza-se um total de 4 a 5 ciclos de selecções. A ligação de entidades de ligação isoladas pode ser analisada em células de Jurkat, positivas para CD3 épsilon, células HPBalI, CMSP ou células eucarióticas transfectadas que comportam a sequência de CD3s de terminal N fundida com EpCAM exibida na superfície, 84 usando um ensaio de citometria de fluxo (ver o exemplo 4 anexo).

Item 2. 0 processo do item 1, em que os polipéptidos compreendem o domínio de ligação identificado como um primeiro domínio de ligação e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar a um antigénio da superfície celular.

Para a geração do segundo domínio de ligação do polipéptido identificado pelo processo mencionado antes, por exemplo, os anticorpos de cadeia simples biespecíficos, tal como aqui definido, podem ser utilizados anticorpos monoclonais que se ligam aos antigénios da superfície de células humanas e/ou de primatas não chimpanzés. Os domínios de ligação apropriados para o polipéptido biespecífico, tal como aqui definido, podem ser obtidos, por exemplo, a partir de anticorpos monoclonais específicos de interespécies, por processos recombinantes descritos na técnica. Um anticorpo monoclonal de ligação a um antigénio da superfície celular humana e ao homólogo do referido antigénio da superfície celular em primatas não chimpanzés pode ser ensaiado por ensaios de SCAF, tal como descrito antes. Técnicas de hibridoma, tal como as descritas na literatura (Milstein e Kõhler, Nature 256 (1975), 495-7) também podem ser utilizadas para a geração de anticorpos específicos interespécies. Por exemplo, os ratos podem ser imunizados alternativamente com CD33 humana e de primata não chimpanzé. A partir destes ratos, as células de hibridoma produtoras de anticorpos específicos de interespécies podem ser isoladas por via da tecnologia de hibridoma e analisadas por SCAF, como antes definido. A geração e a análise de polipéptidos biespecíficos, tais como anticorpos de cadeia simples biespecíficos que exibem 85 especificidade interespécies, tal como aqui descrito, são demonstradas nos exemplos seguintes. As vantagens dos anticorpos de cadeia simples biespecificos que exibem especificidade de interespécies incluem os pontos enumerados a seguir.

Item 3. 0 processo do item 2, em que o segundo domínio de ligação se liga a um antigénio da superfície celular de um ser humano e/ou de um primata não chimpanzé.

Item 4. 0 processo de um qualquer dos itens 1 a 3, em que o primeiro domínio de ligação é um anticorpo.

Item 5. 0 processo do item 4, em que o anticorpo é um anticorpo de cadeia simples.

Item 6. 0 processo de um qualquer dos itens 2 a 5, em que o segundo domínio de ligação é um anticorpo.

Item 7. 0 processo de um qualquer dos itens 1 a 6, em que o fragmento do domínio extracelular de CD3s consiste em um ou mais fragmentos de um polipéptido possuindo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das apresentadas nas SEQ ID NOs. 2, 4, 6 ou 8.

Item 8. 0 processo do item 7, em que o referido fragmento tem 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 resíduos de aminoácidos de comprimento.

Item 9. O processo de um qualquer dos itens 1 a 8, em que o processo de identificação é um processo de rastreio de vários polipéptidos que compreendem um domínio de ligação específico de interespécies capaz de 86 se ligar a um epítopo de CD3s humana e de primata excepto de chimpanzé.

Item 10. 0 processo de um qualquer dos itens 1 a 8, em que o processo de identificação é um processo de purificação e isolamento de um polipéptido que compreendem um domínio de ligação específico de interespécies capaz de se ligar a um epítopo de CD3s humana e de primata excepto de chimpanzé.

Item 11. Utilização de um fragmento de terminal N do domínio extracelular de CD3s, com 27 aminoácidos no máximo, compreendendo a sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gli-Asn-Glu-Glu-Met-Gli (SEQ ID NO. 381) ou Gln-

Asp-Gli-Asn-Glu-Glu-Ile-Gli (SEQ ID NO. 382), para a geração de um domínio de ligação específico de interespécies.

Em linha com o referido uso da presente invenção, prefere-se que o domínio de ligação específico de interespécies gerado seja de origem humana.

Item 12. Utilização de acordo com o item 11, em que o domínio de ligação específico de interespécies é um anticorpo.

Item 13. Utilização de acordo com o item 12, em que o anticorpo é um anticorpo de cadeia simples.

Item 14. Utilização de acordo com o item 12 a 13, em que o anticorpo é um anticorpo duplamente específico.

Estas e outras modalidades de realização estão descritas e abrangidas na descrição e exemplos da presente invenção. As técnicas e os processos recombinantes em 87 imunologia estão descritos, por exemplo, em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a edição 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002. Outra literatura sobre qualquer um dos anticorpos, processos, utilizações e compostos a serem utilizados de acordo com a presente invenção pode ser recuperada em bibliotecas públicas e bases de dados, utilizando, por exemplo, equipamentos electrónicos. Por exemplo, a base de dados pública "Medline", disponível na internet, pode ser utilizada, por exemplo, no sítio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Outras bases de dados e sítios, tais como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ou listados na página inicial de EMBL-services no sítio http://www.embl.de/services/index.html são conhecidas dos especialistas na técnica e podem também ser obtidas utilizando, por exemplo, o http://www. google.com.

As figuras mostram:

Figura 1

Fusão dos aminoácidos 1-27 de terminal N de CD3 épsilon com uma proteína heteróloga solúvel.

Figura 2 A figura mostra os valores médios de absorção das amostras, em quadruplicado, medidos num ensaio por ELISA para detectar a presença de um vector que consiste em 1-27 aminoácidos de terminal N da cadeia épsilon de CD3 humana, madura, fundida com a porção de charneira e a porção de Fc gama de IgGl humana e um 88 marcador de 6 histidina de terminal C num sobrenadante de células 293 transfectadas de forma transiente. A primeira coluna marcada com "27 aa huCD3E" mostra o valor médio de absorção para o vector, a segunda coluna, marcada com "irrel. SN" mostra o valor médio de um sobrenadante de células 293 transfectadas com um vector irrelevante como controlo negativo. A comparação entre os valores obtidos para o vector com os valores obtidos para o controlo negativo demonstra claramente a presença do vector recombinante.

Figura 3 A figura mostra os valores médios de absorção das amostras, em quadruplicado, medidos num ensaio por ELISA para detectar a ligação de moléculas de ligação anti-CD3 especificas de interespécies, sob a forma de preparações impuras de anticorpos de cadeia simples expressos periplasmaticamente, a um vector compreendendo 1 - 27 aminoácidos de terminal N da cadeia épsilon de CD3 humana madura fundida com a porção de charneira e Fc gama de IgGl humana e um marcador de Hisô de terminal C. As colunas mostram, da esquerda para a direita, os valores médios de absorção para as especificidades designados por A2J HLP, I2C HLP, E2M HLP, F70 HLP, G4H HLP, H2C HLP, E1L HLP, F12Q HLP, F6A HLP e H1E HLP. A coluna mais à direita rotulada com "Contr. neg." mostra o valor médio da absorção para a preparação da cadeia simples de um anticorpo de CD3 anti-humano de murino, como controlo negativo. A comparação dos valores obtidos para as especificidades anti-CD3, com os valores obtidos para o controlo negativo, demonstra claramente a forte ligação das especificidades anti-CD3 a 1-27 aminoácidos de terminal N da cadeia épsilon de CD3 humana madura. 89

Figura 4

Fusão dos 1-27 aminoácidos de terminal N de CD3 épsilon de primata com uma proteína heteróloga ligada à membrana.

Figura 5 0 histograma sobrepõe diferentes transfectantes, ensaiados num ensaio de SCAF, para detectar a presença de proteínas de fusão da transmembrana recombinantes consistindo em EpCAM de cinomolgo e os 1-27 aminoácidos de terminal N da cadeia CD3 épsilon humana, de saguim, de ti-tis, de macaco-esquilo e de porcos domésticos, respectivamente. As sobreposições do histograma, da esquerda para a direita e de cima para baixo, mostram os resultados para os transfectantes que expressam os vectores que compreendem 27 mer humanos, 27 mer de saguim, 27 mer de ti-tis, 27 mer de macaco-esquilo e 27 mer de suínos, respectivamente. Nas sobreposições individuais, a linha fina representa uma amostra incubada com SBF com FCS a 2 % em vez do anticorpo M2 anti-Flag, como controlo negativo e as linhas grossas representam uma amostra incubada com o anticorpo M2 anti-Flag. Para cada vector, a sobreposição dos histogramas mostra a ligação do anticorpo M2 anti-Flag aos transfectantes, o que demonstra claramente a expressão dos vectores recombinantes nos transfectantes.

Figura 6

Sobreposições do histograma de transfectantes diferentes, ensaiados num ensaio por SCAF, para detectar a ligação das moléculas de ligação anti-CD3 específicas de interespécies, sob a forma de preparações impuras de anticorpos de cadeia simples 90 expressos periplasmaticamente com os 1-27 aminoácidos de terminais N da cadeia épsilon de CD3 humana, de titis, de saguim e de macaco esquilo, respectivamente, fundidos com EpCAM de cinomolgo.

Figura 6A:

As sobreposições do histograma, da esquerda para a direita e de cima para baixo, mostram os resultados para os transfectantes que expressam os 1-27 aa de CD3 - EpCAM compreendendo o mer 27 humano ensaiado com as moléculas de ligação especificas de CD3 designados por H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP e G4H HLP respectivamente.

Figura 6B:

As sobreposições do histograma, da esquerda para a direita e de cima para baixo, mostram os resultados para os transfectantes que expressam os 1-27 aa de CD3 - EpCAM compreendendo o mer 27 de saguim ensaiado com

as moléculas de ligação específicas de CD3 designados por H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP e G4H HLP respectivamente.

Figura 6C:

As sobreposições do histograma, da esquerda para a direita e de cima para baixo, mostram os resultados para os transfectantes que expressam os 1-27 aa de CD3 - EpCAM compreendendo o mer 27 de ti-tis ensaiado com

as moléculas de ligação específicas de CD3 designados por H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP e G4H HLP respectivamente.

Figura 6D:

As sobreposições de histograma, da esquerda para a direita e de cima para baixo, mostram os resultados 91 para os transfectantes que expressam os 1-27 aa de CD3 EpCAM compreendendo o mer 2 7 de macaco esquilo ensaiado com as moléculas de ligação especificas de CD3 designados por H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP e G4H HLP respectivamente.

Figura 6E:

As sobreposições do histograma, da esquerda para a direita e de cima para baixo, mostram os resultados para os transfectantes que expressam os 1-27 aa de CD3 - EpCAM compreendendo o mer 27 de porco ensaiado com as moléculas de ligação especificas de CD3 designados por H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP e G4H HLP respectivamente. Nas sobreposições individuais, a linha fina representa a amostra incubada com uma preparação de cadeia simples de um anticorpo de CD3 anti-humano de murino, como controlo negativo e a linha grossa mostra uma amostra incubada com as moléculas de ligação anti-CD3 respectivas indicadas. Considerando a falta de ligação aos transf ectantes de mer 27 de suínos e os níveis de expressão das estruturas apresentadas na figura 5, as sobreposições dos histogramas mostram uma ligação específica e forte das especificidades anti-CD3 ensaiadas dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos humanos totalmente específicas de inter-espécies contra células que expressam as proteínas de fusão recombinantes da transmembrana que compreendem os 1-27 aminoácidos de terminal N da cadeia épsilon de CD3 humana, de saguim, de ti-tis e de macaco-esquilo, respectivamente, fundidos com EpCAM de cinomolgo e exibem assim várias especificidades interespécies de primatas das moléculas de ligaçãoanti-CD3. 92

Figura 7 0 ensaio por SCAF para a detecção CD3 épsilon humana em células T EL4 de murino transfectadas. A análise gráfica mostra uma sobreposição de histogramas. A linha grossa mostra as células transfectadas incubadas com o anticorpo de CD3 anti-humano, UCHT-l.A linha fina representa células incubadas com um controle do isotipo de IgGl de murganho. A ligação do anticorpo anti-CD3, UCHT1, mostra claramente a expressão da cadeia CD3 épsilon humana na superfície celular de células T EL4 de murinos transfectadas.

Figura 8 A ligação dos anticorpos anti-CD3, específicos de interespécies, com mutantes de alanina numa experiência de rastreio de alanina. Nas figuras individuais, as colunas mostram, da esquerda para a direita, os valores calculados de ligação, em unidades arbitrárias, em escala logarítmica, para o transfectante de tipo selvagem (TS) e para todos os mutantes de alanina, da posição 1 a 27. Os valores de ligação são calculados utilizando a fórmula seguinte: valorAmostra (xry) = _Amostra (x, y) -neq Contr. (x) UCHT—1 (x) —neg_Contr. (x) ) * TS (y) -neg_Contr. (ts) UCHT-1(ts)-neg_Contr. (ts)

Nesta equação, valor_Amostra significa o valor, em unidades arbitrárias, da ligação que representa o grau de ligação de um anticorpo anti-CD3 específico, a um determinado mutante de alanina, como se mostra na figura, Amostra representa o valor da média geométrica da fluorescência obtido para um determinado anticorpo anti-CD3 ensaiado num transfectante específico do varrimento de alanina, neg_Contr. significa o valor da 93 média geométrica da fluorescência obtido para o controlo negativo ensaiado num determinado mutante de alanina, UCHT-1 significa o valor da média geométrica da fluorescência obtido para o anticorpo UCHT-1 submetido a ensaios com um determinado mutante de alanina, TS, significa o valor da média geométrica de fluorescência obtido para um anticorpo anti-CD3 especifico, ensaiado num transfectante de tipo selvagem, x especifica o transfectante respectivo, y especifica o anticorpo anti-CD3 respectivo e ts especifica que o transfectante respectivo é de tipo selvagem. As posições individuais de mutantes de alanina estão indicadas com o código de letra única do aminoácido de tipo selvagem e o número da posição.

Figura 8A: A figura mostra os resultados para o anticorpo anti-CD3 especifico de interespécies, A2J HLP, expresso como molécula de IgG quimérica. Observa-se actividade de ligação reduzida para as mutações de alanina na posição 4 (asparagina), na posição 23 (treonina) e na posição 25 (isoleucina). Observa-se a perda total da ligação para as mutações com alanina na posição 1 (glutamina), na posição 2 (aspartato) , na posição 3 (glicina) e na posição 5 (glutamato).

Figura 8B: A figura mostra os resultados para o anticorpo anti-CD3 específico de interespécies, E2M HLP, expresso como molécula de IgG quimérica. Observa-se actividade de ligação reduzida para as mutações de alanina na posição 4 (asparagina), na posição 23 (treonina) e na posição 25 (isoleucina). Observa-se a perda total da ligação para as mutações com alanina na posição 1 (glutamina), 94 na posição 2 (aspartato) , na posição 3 (glicina) e na posição 5 (glutamato).

Figura 8C: A figura mostra os resultados para o anticorpo anti-CD3 específico de interespécies, H2C HLP, expresso como molécula de IgG quimérica. Observou-se actividade de ligação reduzida para as mutações com alanina na posição 4 (asparagina). Observa-se a perda total da ligação para as mutações com alanina-glutamina na posição 1 (glutamina), na posição 2 (aspartato), na posição 3 (glicina) e na posição 5 (glutamato).

Figura 8D:

Mostra os resultados para o anticorpo anti-CD3 especifico de interespécies, F12Q HLP, ensaiado como anticorpo de cadeia única expresso periplasmaticamente. Observa-se a perda total da ligação para as mutações com alanina na posição 1 (glutamina), na posição 2 (aspartato), na posição 3 (glicina) e na posição 5 (glutamato).

Figura 9

Ensaio por SCAF para a detecção da ligação da molécula de ligação anti-CD3 específica de interespécies, HLP H2C, para CD3 humana, com e sem o marcador His6 do terminal N.

As sobreposições do histograma são realizadas na linha de células EL4 transfectadas com a cadeia épsilon de CD3 humana de tipo selvagem (histograma da esquerda) ou a cadeia de CD3 épsilon humana com marcador His6 de terminal N (histograma da direita) ensaiados num ensaio de SCAF para a detecção da ligação da molécula de ligação específica de interespécies, H2C HLP. As 95 amostras são incubadas com um controlo de isotipo adequado, como controlo negativo (linha fina), anticorpo CD3 anti-humano, UCHT-1, como controlo positivo (linha a tracejado) e anticorpo anti-CD3 específico de interespécies, HLP H2C, sob a forma de uma molécula de IgG quimérica (linha grossa).

As sobreposições do histograma mostram a ligação comparável do anticorpo UCHT-1 tanto para os transfectantes, em comparação com o controlo de isotipo demonstrando a expressão de ambas as estruturas recombinantes. As sobreposições do histograma também mostram a ligação da molécula de ligação anti-CD3, H2C HLP, apenas à cadeia épsilon de CD3 humana de tipo selvagem, mas não para a cadeia épsilon de CD3 humano -His6. Estes resultados demonstram que um terminal N livre é essencial para a ligação da molécula de ligação anti-CD3 específica de interespécies, H2C HLP.

Figura 10

Ligação de saturação de EGFR-21-63 LH x H2C em CMSP humanas positivas para CD3 para determinar o valor de KD da ligação de CD3 em células, por análise por SCAF. 0 ensaio é realizado como descrito no exemplo 7.

Figura 11 A análise de ligação por SCAF das estruturas de cadeia única biespecífica, específica de interespécies, com células de OHC transfectadas com a linha de células de EGFR humano, linha de células T de CD3+ humana, HPB-ALL, células de OHC transfectadas com EGFR de cinomolgo e uma linha de células T de macaca, 4119 LnPx. A coloração de SCAF realiza-se como descrito no exemplo 12. A linha grossa representa células incubadas com 2 pg/ml de proteína purificada que são subsequentemente 96 incubadas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção marcado com PE. A linha fina do histograma reflecte o controlo negativo: células incubadas apenas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção.

Figura 12 A actividade de citotoxicidade induzida pelos designados vectores de cadeia única específicos de interespécies, EGFR, redireccionados para as linhas de células-alvo indicadas. A) e B) Utilizam-se CMSP humanas estimuladas por CD4-/CD56 são como células efectoras, células de OHC transfectadas com o EGFR humano como células-alvo. 0 ensaio é realizado como descrito no exemplo 13.

Figura 13 A actividade de citotoxicidade induzida pelos designados vectores de cadeia única específicos de interespécies, EGFR, redireccionados para as linhas de células-alvo indicadas. A) e B) Utiliza-se a linha de células 4119 LnPx de macaca estimulada por CD4-/CD56 como células efectoras e células de OHC transfectadas com o EGFR de cinimolgo como células-alvo. O ensaio é realizado como descrito no exemplo 13.

Figura 14 A análise de ligação por SCAF das estruturas de cadeia única biespecíficas, específica de interespécies com células de OHC transfectadas com a linha de células de MCSP D3 humana, linha de células T de CD3 + humana, HPB- ALL, células de OHC transfectadas com MCSP D3 de cinomolgo e uma linha de células T de macaca, 4119 LnPx. A coloraçao de SCAF realiza-se como descrito no exemplo 17. A linha grossa representa células incubadas 97 com 2 pg/ml de proteína purificada que são subsequentemente incubadas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção marcado com PE. A linha fina do histograma reflecte o controlo negativo: As células incubadas apenas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção.

Figura 15 A análise de ligação por SCAF das estruturas de cadeia única biespecíficas, especifica de interespécies com células de OHC transfectadas com a linha de células de MCSP D3 humana, linha de células T de CD3 + humana, HPB- ALL, células de OHC transfectadas com MCSP D3 de cinomolgo e uma linha de células T de macaca, 4119 LnPx. A coloraçao de SCAF realiza-se como descrito no exemplo 17. A linha grossa representa células incubadas com 2 yg/ml de proteína purificada que são subsequentemente incubadas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção marcado com PE. A linha fina do histograma reflecte o controlo negativo: As células incubadas apenas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção.

Figura 16 A análise de ligação por SCAF das estruturas de cadeia única biespecíficas, específica de interespécies com células de OHC transfectadas com a linha de células de MCSP D3 humana, linha de células T de CD3+ humana, HPB-ALL, células de OHC transfectadas com MCSP D3 de cinomolgo e uma linha de células T de macaca, 4119 LnPx. A coloração de SCAF realiza-se como descrito no exemplo 17. A linha grossa representa células incubadas com 2 pg/ml de proteína monomérica purificada que são subsequentemente incubadas com o anticorpo anti-his e o 98 anticorpo de detecção marcado com PE. A linha fina do histograma reflecte o controlo negativo: As células incubadas apenas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção.

Figura 17 A actividade de citotoxicidade induzida pelas designadas estruturas de cadeia única específica de interespécies, MCSP, redireccionadas para as linhas de células-alvo indicadas. A) Utilizam-se CMSP humanas estimuladas por CD4-/CD56 são como células efectoras, células de OHC transfectadas com o MCSP D3 humano como células-alvo. A) Utiliza-se a linha de células 4119 LnPx de macaca estimuladas por CD4-/CD56 são como células efectoras, células de OHC transfectadas com o MCSP D3 de cinimolgo, como células-alvo. 0 ensaio é realizado como descrito no exemplo 18.

Figura 18 A actividade de citotoxicidade induzida pelas designadas estruturas de cadeia única específica de

interespécies, MCSP, redireccionadas para as linhas de células-alvo indicadas. A) e B) Utiliza-se a linha de células 4119 LnPx de macaca estimuladas por CD4-/CD56 são como células efectoras, células de OHC transfectadas com o MCSP D3 de cinimolgo, como células-alvo. 0 ensaio é realizado como descrito no exemplo 18.

Figura 19 A actividade de citotoxicidade induzida pelas designadas estruturas de cadeia única específica de interespécies, MCSP, redireccionadas para as linhas de células-alvo indicadas. A) e B) Utilizam-se CMSP humanas estimuladas por CD4-/CD56 são como células 99 efectoras, células de OHC transfectadas com o MCSP D3 humano como células-alvo. 0 ensaio é realizado como descrito no exemplo 18.

Figura 20 A actividade de citotoxicidade induzida pelas designadas estruturas de cadeia única especifica de interespécies, MCSP, redireccionadas para as linhas de células-alvo indicadas. A) Utilizam-se CMSP humanas estimuladas por CD4-/CD56 são como células efectoras, células de OHC transfectadas com o MCSP D3 humano como células-alvo. A) Utiliza-se a linha de células 4119 LnPx de macaca estimuladas por CD4-/CD56 são como células efectoras, células de OHC transfectadas com o MCSP D3 de cinimolgo, como células-alvo. O ensaio é realizado como descrito no exemplo 18.

Figura 21 A actividade de citotoxicidade induzida pelos designados vectores de cadeia única especifica de interespécies, MCSP, redireccionadoss para as linhas de células-alvo indicadas. A) Utilizam-se CMSP humanas estimuladas por CD4-/CD56 são como células efectoras, células de OHC transfectadas com o MCSP D3 humano como células-alvo. A) Utiliza-se a linha de células 4119 LnPx de macaca estimuladas por CD4-/CD56 são como células efectoras, células de OHC transfectadas com o MCSP D3 de cinimolgo, como células-alvo. 0 ensaio é realizado como descrito no exemplo 18.

Figura 22

Estabilidade do plasma dos anticorpos de cadeia simples biespecificos MCSP e CD3 específicos de inter-espécies ensaiados pela medição da actividade de citotoxicidade 100 induzida por amostras das designadas estruturas de cadeia única incubadas com 50 % de plasma humano, a 37 °C e a 4 °C, durante 24 horas, respectivamente, ou com a adição de 50 % de plasma humano, imediatamente antes do ensaio de citotoxicidade ou sem a adição de plasma. As células de OHC transf ectadas com MCSP humano são utilizadas como linha de células-alvo e estimuladas com CD4-/CD56. As CMSP humanas são utilizadas como células efectoras. O ensaio é realizado como descrito no exemplo 19.

Figura 23 A análise de ligação por SCAF das estruturas de cadeia única biespecíficas, específica de interespécies com células de OHC transfectadas com a linha de células de HER2 humano, linha de células T de CD3+ humana, HPB-ALL, células de OHC transfectadas com HER2 de macaca e a linha de células T de macaca, 4119 LnPx. O ensaio, por SCAF, é realizado como descrito no exemplo 23.4. As linhas grossas representam células incubadas com 2 yg/ml, purificadas com estruturas de cadeia simples biespecíficas. As linhas finas reflectem os controlos negativos. Utilizou-se PBS com SBF, a 2 %, como controlo negativo. Para cada estrutura de cadeia simples biespecífica, especifica para interespécies, a sobreposição dos histogramas mostra a ligação específica da estrutura a HER2 humano e de macaca e CD3 humana e de macaca.

Figura 24

Os diagramas mostram os resultados dos ensaios de libertação de crómio que medem a actividade citotóxica induzida pelos vectores de cadeia simples biespecífica, especifica para interespécies, designados por HER2, 101 redireccionados para as linhas celulares-alvo indicadas. As células efectoras foram também usadas como indicado. Os ensaios são realizados como descrito no exemplo 23.5. Os diagramas demonstram claramente, para cada vector, o recrutamento potente da actividade citotóxica de células efectoras humanas e de macaca contra células de OHC transfectadas com HER2 humana e de macaca, respectivamente.

Figura 25

As análises por ELISA, especificas de CD3, de preparações periplásmicas que contêm fragmentos de proteínas scFv marcadas com Flag, a partir de clones seleccionados. As preparações periplasmáticas de fragmentos de proteínas solúveis, scFv, foram adicionadas aos poços de uma placa de ELISA, os quais tinham sido revestidos com a proteína de fusão de CD3 épsilon humana solúvel (1-27 aa) - Fc e tinham sido adicionalmente bloqueadas com PBS - ASB a 3 %. A detecção foi realizada por um anticorpo monoclonal marcado com biotina anti-Flag, seguida de estreptavidina conjugada com peroxidase. 0 ensaio por ELISA foi desenvolvido por meio de uma solução de substrato de ABTS. Os valores da DO (eixo dos yy) foram medidos a 405 nm por um leitor de ELISA. Os nomes dos clones são apresentados no eixo dos xx.

Figura 26

Análises por ELISA, de preparações periplasmáticas que contenham fragmentos de proteínas scFv marcados com Flag, a partir de clones seleccionados. As mesmas preparações periplasmáticas de fragmentos de proteínas solúveis, scFv, como na figura 25, foram adicionadas a poços de uma placa de ELISA que não tinha sido 102 revestida com a da proteína de fusão de CD3 épsilon humana (1-27 aa) - Fc, mas com huIgGI (Sigma) e bloqueadas com ASB a 3 % em SBF. A detecção foi realizada por um anticorpo monoclonal marcado com biotina anti-Flag, seguida de estreptavidina conjugada com peroxidase. 0 ensaio por ELISA foi desenvolvido por meio de uma solução de substrato de ABTS. Os valores da DO (eixo dos yy) foram medidos a 405 nm por meio de um leitor de ELISA. Os nomes dos clones estão apresentados no eixo dos xx. A presente invenção é adicionalmente descrita por meio dos seguintes exemplos ilustrativos e não limitativos que proporcionam uma melhor compreensão da presente invenção e das suas muitas vantagens.

EXEMPLOS 1. Identificação das sequências de CD3 épsilon de amostras de sangue de primatas não humanos

As amostras de sangue dos primatas não humanos que se seguem foram usadas para a identificação de CD3 épsilon: Callithrix jacchus, Saguinus oedipus e Saimiris scivreus. As amostras frescas de sangue total, tratadas com heparina, foram preparadas para o isolamento total de ARN celular, de acordo com o protocolo do fabricante (QIAamp RNA Blood Mini Kit, Qiagen) . 0 ARNm extraído foi transcrito em ADNc, de acordo com os protocolos publicados. Em resumo, incubou-se 10 μΐ de ARN precipitado com 1,2 μΐ de uma mistura de 10 x hexanucleótido (Roche), a 70 °C, durante 10 minutos e

armazenou-se em gelo. Adicionou-se uma mistura reaccional consistindo em 4 μΐ de 5x tampão de superscript II, 0,2 μΐ de ditiotreitol 0,1 M, 0,8 μΐ de superscript II 103 (Invitrogen), 1,2 μΐ de trifosfatos de desoxiribonucleósido (25 μΜ) , 0,8 μΐ de inibidor de RNAse (Roche) e 1,8 μΐ de água isenta de ADNase e RNase (Roth). A mistura reaccional foi incubada, à temperatura ambiente, durante 10 minutos, seguida de uma incubação, a 42 °C, durante 50 minutos e a 90 °C, durante 5 minutos. Arrefeceu-se a mistura reaccional em gelo antes da adição de 0,8 μΐ de ARNaseH (1 υ/μΐ, Roche) e incubou-se, durante 20 minutos, a 37 °C.

Os ADNc da primeira hélice de cada uma das espécies foram submetidos a 35 ciclos de reacções em cadeia de polimerase utilizando a polimerase Taq ADN (Sigma) e a combinação de iniciadores que se segue foi concebida pela pesquisa numa base de dados: iniciador dianteiro 5'-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3' (SEQ ID NO: 377); iniciador inverso 5'-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3' (SEQ ID NO: 378);. As bandas de 550 pb amplificadas foram purificadas em gel (estojo de extracção em gel, Qiagen) e foram sequenciadas (Sequiserve, Vaterstetten/Alemanha, ver a listagem de sequências). CD3 épsilon de Callithrix jacchus

Nucleótidos

CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG

AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTCGTAAATA

GTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGACTTTTCGGAAATGGAGCAA

AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA

CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

Aminoácidos

QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ

SGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD 104 CD3 épsilon de Saguinus oedipus Nucleótidos

CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG

AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTTGTAAATA

GTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGATTTTTCGGAAATGGAGCAA

AGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA

CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

Aminoácidos

QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ

SGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD CD3 épsilon de Saimiris ciureus

Nucleótidos

CAGGACGGTAATGAAGAGATTGGTGATACTACCCAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGG

AACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACAGGAAATAAAATGGCTCGTAAATG

ATCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAAGATTTTTCAGAAATGGAACAA 7\ TN ΦΦ 71 ΦΡΡΡΦΡΓ'Γ'ΦΡΦΓ'Ρ Ά Λ ΑΡΑΡΛ PPPPPA ΡΛΡΛΑ ΡΛ PPPPA PPP7V T»rp ΦηΦΡΦΑ i oo i ini vi inioivin

CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT

Aminoácidos

QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGQEIKWLVNDQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ

SGYYACLSKETPTEEASHYLYLKARVCENCVEVD 2. Geração da ligação de fragmentos de anticorpos de cadeia única (scFv) específicos de interespécies a 1-27 aminoácidos de terminal N de CD3 épsilon humana e de diferentes primatas não chimpanzés 105 2.1. Imunização de murganhos utilizando o terminal N de CD3 épsilon separado do contexto natural de CD3 por fusão com uma proteína heteróloga solúvel

Imunizaram-se murganhos F1 de dez semanas de idade resultantes dos cruzamentos de Balb/c x C57 negros, com a proteína de fusão Fc - CD3 épsilon portadora da maior parte dos aminoácidos 1-27 de terminal N da cadeia madura de CD3 épsilon (1-27 aa de CD3 - Fc) humana e/ou de saimiris sciureus. Com este fim, injectou-se, em cada rato, intraperitonealmente, 40 pg da proteína de fusão Fc-CD3 1-27 aa com 10 nmole de CpG-oligonucleótido modificado com tioato (5'-tccatgacgttcctgatgct-3 ' ) em 300 ul de SBF. Os murganhos receberam, da mesma forma, imunizações de reforço após 21, 42 e eventualmente 63 dias. Dez dias após a primeira imunização de reforço, colheram-se amostras de sangue e analisou-se o título de anticorpos no soro, contra a proteína de fusão CD3 (1-27 aa) - Fc por ELISA. Adicionalmente, ensaiou-se o título contra a linha de células T humanas, positivas para CD3, HPBalI, por citometria de fluxo, de acordo com protocolos-padrão. Os títulos séricos foram significativamente mais elevados nos animais imunizados do que nos não imunizados. 2.2. Geração de uma biblioteca de anticorpos de murino imunes scFv: construção de uma biblioteca combinatória de anticorpos e de exibição de fagos

Três dias após a última injecção, as células do baço de murino foram colhidas para a preparação de ARN total, de acordo com protocolos-padrão.

Construiu-se uma biblioteca de fragmentos de ADN de região variável (VK) de cadeia leve (kapa) e de região 106 variável de cadeia pesada de (VP) de imunoglobulina (Ig) de murino, por RCP-TI, em ARN de baço de murinos, utilizando iniciadores específicos de VK e de VP. 0 ADNc foi sintetizado de acordo com protocolos-padrão.

Os iniciadores foram concebidos de forma a dar origem a um sítio de reconhecimento de 5'-Xhol e de 3'-BstEII para os fragmentos de V de cadeia pesada amplificados e a um sítio de reconhecimento de 5'-Saci e 3'-Spel para fragmentos de ADN de VK amplificados.

Para a amplificação, por PCR, de fragmentos diferentes de ADN de VP, oito iniciadores específicos da família de 5' -VP (MVP1 (GC) AG GTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT; MVP2 GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT; MVP3 CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT; MVP4 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA; MVP5 GA (AG) GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA; MVP6 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT; MVP7 GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA; MVP8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT) foram combinados com um iniciador de 3'-VP (3'MuVPBstEII tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca g) ; para a amplificação, por RCP, dos fragmentos da cadeia VK, sete iniciadores diferentes, específicos da família de 5'-VK (MU VK 1 CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT; MUVK2 CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC; MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA; MUVK4 CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA; MUVK5 CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA; MUVK6 CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA; MUVK7 CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA) foram combinados com um iniciador de 3'-VK (3'MuVkHindI11/BsiWl tgg tgc act agt cgt acg ttt gat ctc aag ctt ggt ccc). 107 0 programa de RCP que se segue foi utilizado para a amplificação: desnaturação a 94 °C, durante 20 segundos; hibridação do iniciador a 52 °C, durante 50 seg e extensão do iniciador, a 72 °C durante 60 seg e 40 ciclos, seguidos de uma extensão final, de 10 min, a 72 °C.

Ligou-se 450 ng dos fragmentos de cadeia leve kapa (digeridos por Sacl-Spel) a 1.400 ng do fagemido pComb3H5Bhis (digerido por Sacl-Spel; fragmento grande). A biblioteca combinatória de anticorpos resultante foi depois transformada em 300 ul de células azuis de XL1 de Escherichia coli electrocompetentes, por electroporação (2,5 kV, 0,2 centímetros lacuna da cuvete, 25 uFD, 200 Ohm, gerador de impulsos em genes da Biorad), resultando num tamanho de biblioteca superior a 107 clones independentes. Após uma hora de expressão do fenótipo, seleccionaram-se os transformantes positivos de resistência à carbenicilina codificados pelo vector pComb3H5BHis em 100 ml de líquido do super-caldo (SC) de cultura, durante a noite. As células foram então colhidas por centrifugação e prepararam-se plasmidos usando um estojo de preparação de plasmidos comercialmente disponível (Qiagen).

Ligou-se 2800 ng desta biblioteca de VK contendo ADN de plasmido (digerido por Xhol-BstEII; fragmento grande) a 900 ng de fragmentos V de cadeia pesada (digeridos por Xhol-BstEII) e transformou-se, de novo, em duas alíquotas de 300 ul de células azuis de XL1 de Escherichia coli electrocompetentes, por electroporação (2,5 kV, 0,2 centímetros de lacuna de cuvete, 25 UFD, 200 Ohm), resultando numa biblioteca de scFv de VP-VK totais (fragmento variável de cadeia única) com uma dimensão superior a 107 clones independentes. 108

Após a expressão fenotípica e a adaptação lenta a carbenicilina, as células de E. coli contendo a biblioteca de anticorpos foram transferidas para o meio de selecção de SC-carbenicilina (50 ug/ml). As células de E. coli contendo a biblioteca de anticorpo foram então infectadas com uma dose infecciosa de 1012 partículas de fago auxiliar VCSM13, resultando na produção e na secreção de fagos M13 filamentosos, em que as partículas de fago que contêm pComb3H5BHis-ADN de hélice simples que codificam um fragmento scFv de murino e exibiram a correspondente proteína de scFv como uma fusão de tradução com a proteína III de revestimento do fago. Este conjunto de fagos,exibindo a biblioteca de anticorpos foi mais tarde utilizado para a selecção das entidades de ligação ao antigénio. 2.3. Selecção de aglutinantes específicos de CD3 baseada na exibição de fagos A biblioteca de fagos comportando o repertório de scFv clonados foi colhida do sobrenadante da respectiva cultura por meio da precipitação em PEG8000/NaCl e e centrifugação. Aproximadamente 1011 a 1012 das partículas de fagos de scFv foram novamente suspensas em 0,4 ml de SBF/ASB a 0,1 % e incubadas com 105 to 107 células de Jurkat (uma linha de células T humanas positivas para CD3), durante 1 hora, em gelo, sob agitação lenta. Estas células de Jurkat cresceram previamente em meio RPMI enriquecido com soro fetal de vitelo (10 %) , glutamina e penicilina/estreptomicina, recolhidas por centrifugação, lavadas em SBF e novamente suspensas em SBF/FCS a 1 % (contendo azida de Na). Eliminaram- -se os fagos de scFv que não se ligam especificamente às células de Jurkat, por meio de até cinco etapas de lavagem com SBF/FCS a 1 % (contendo azida de Na). 109

Após a lavagem, as entidades de ligação foram eluídas das células por meio de uma nova suspensão das células em HC1-glicina a pH 2,2 (10 min de incubação com subsequente agitação em vórtice) e, após a neutralização com tampão Tris 2 M, a pH 12, o eluato foi utilizado para infecção de uma cultura de células frescas azuis de XL1 de E. coli (D060o > 0,5). A cultura de E. coli, contendo células de E. coli, foi transduzida, com sucesso, com uma cópia de fagemido, que codifica um fragmento scFv humano, que foi novamente seleccionado para a resistência à carbenicilina e, subsequentemente, infectados com, por exemplo, com fagos auxiliares de VCMS 13 para iniciar o segundo ciclo de exibição de anticorpos e uma seleção in vitro. Normalmente, realizou-se um total de 4 a 5 ciclos de selecções. 2.4. Triagem dos aglutinantes especifos de CD3 O ADN plasmidico correspondente a 4 e 5 ciclos de aderência foi isolado a partir de culturas de E. coli após a selecção. Para a produção da proteína solúvel de scFv, fragmentos de ADN de VP-VL foram excisados a partir de plasmidos (Xhol-Spel). Estes fragmentos foram clonados por meio dos mesmos sítios de restrição no plasmido pComb3H5BFIag/His que difere do pComb3H5BHis original pelo facto de o vector de expressão (por exemplo, scFv) incluir um marcador Flag (TGD YKDDDDK) entre o scFv e o marcador His6 e eliminaram-se as proteínas de fago adicionais. Após a ligação, cada mistura (diferentes ciclos de aderência) de ADN de plasmido foi transformada em 100 μΐ de TG1 de E. coli concorrente com choque térmico ou XLI azul e plaqueadas em CL-agar de carbenicilina. As colónias individuais foram colhidas em 100 ul de CL carb (50 ug/ml). 110 A E. coli transformada com um pComb3H5BHis contendo um segmento de VL e VP produziu scFv solúvel em quantidades suficientes após excisão do fragmento de gene III e indução com IPTG 1 mM. Devido a uma sequência de sinal adequada, a cadeia de scFv de foi exportada para o periplasma, onde se dobra numa conformação funcional.

As colónias de bactérias únicas de TG1 de E. Coli das placas de transformação foram recolhidas para as preparações periplasmáticas de pequena escala e cresceram em meio SC (por exemplo, 10 ml), complementado com MgCl2 20 mM e 50 pg/ml de carbenicilina e foram novamente dissolvidas em SBF (por exemplo, 1 ml) após a colheita. Por meio de quatro ciclos de congelamento a -70 °C e descongelamento, a 37 °C, a membrana externa das bactérias foi destruída pelo choque de temperatura e as proteínas periplasmáticas solúveis, incluindo os scFvs foram libertados para o sobrenadante. Após eliminação das células e fragmentos de células intactos, por centrifugação, recolheu-se o sobrenadante contendo scFv de CD3 humanos anti-humanos e utilizou-se para uma análise posterior. 2.5. Identificação de aglutinantes específicos de CD3 A ligação dos scFvs isolados foi ensaiada por citometria de fluxo em células eucarióticas, as quais, na sua superfície, expressam uma proteína heteróloga exibindo, na sua extremidade do terminal N, os primeiros 2 7 aminoácidos do terminal N da CD3 épsilon.

Tal como descrito no exemplo 4, os primeiros aminoácidos 1-27 da sequência de terminal N da cadeia épsilon de CD3 madura da célula do complexo do receptor de células T humanas (sequência de aminoácidos: lll QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT) foram fundidos com o terminal N da proteína transmembranar EpCAM de modo que o terminal N fique localizado na superfície exterior da célula. Adicionalmente, inseriu-se um epítopo de FLAG entre a sequência de épsilon de CD3 de 1-27 aa de terminal N e a sequência de EpCAM. Este produto de fusão foi expresso em células de rim de embrião humano (REH, em inglês HEK) e células de ovário de hamster chinês (OHC, em inglês CHO).

Prepararam-se células eucarióticas exibindo a maioria dos 2 7 aminoácidos de terminal N de CD3 épsilon madura de outras espécies de primatas, da mesma maneira que para Saimiri sciureus (macaco esquilo) (sequência de aminoácidos de terminal N de CD3 épsilon: QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT), para Callithrix jacchus (sequência de aminoácidos de terminal N de CD3 épsilon: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT) e para Saguinus oedipus (sequência de aminoácidos de terminal N de CD3 épsilon: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT).

Para a citometria de fluxo, incubaram-se de 2,5 x 105 células com 50 ul de sobrenadante com 5 yg/ml de vectores purificados em 50 μΐ de SBF com FCS a 2 %. A ligação dos vectores foi detectada com um anticorpo anti-His (anticorpo penta-His, isento de ASB, Qiagen GmbH, Hilden, RFA) a 2 yg/ml em 50 μΐ de SBF com FCS a 2 %. Como um segundo reagente da etapa, utilizou-se um fragmento F(ab')2 purificado por afinidade conjugado com R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-rato (específico do fragmento Fc-gama), diluído a 1 : 100 em 50 μΐ de SBF com FCS a 2 %. (Dianova, Hamburgo, RFA) . Mediram-se as amostras num SCAFscan (BD biosciences, Heidelberg, RFA). A ligação foi sempre confirmada por citometria de fluxo, tal como descrito no parágrafo anterior, em células 112 T primárias de seres humanos e de diferentes primatas (por exemplo, saimiris sciureus, callithrix jacchus, saguinus oedipus). 2.6. Geração de equivalentes humanos/humanizado de scFvs não humanos específicos de CD3 épsilon A região VP de scFv anti-CD3 de murino foi alinhada contra as sequências de aminoácidos da linha germinativa de anticorpos humanos. Escolheu-se sequência de VP da linha germinativa do anticorpo humano, que tem a mais estreita homologia com a VP não humana e realizou-se um alinhamento directo das duas sequências de aminoácidos. Havia um certo número de resíduos da estrutura da VP não humana que diferiam das regiões da estrutura da VP humana ("posições diferentes da estrutura"). Alguns destes resíduos podem contribuir para a ligação e a actividade do anticorpo em relação ao seu alvo.

Para construir uma biblioteca que contenha as RDC de murinos e em cada posição da estrutura que difere da sequência da VP humana escolhida, sintetizaram-se ambas as hipóteses de oligonucleótidos degenerados (os resíduos de aminoácidos humanos de murino materno) . Estes oligonucleótidos incorporam, nas diferentes posições do resíduo humano, com uma probabilidade de 75 % e no resíduo de murino com uma probabilidade de 25 %. Para uma VP humana, tiveram de ser sintetizados, por exemplo, seis destes oligonucleótidos que se sobrepõem numa extensão do terminal de cerca de 20 nucleótidos. Para este fim, todos os segundos iniciadores eram iniciadores anti-paralelos. Os locais de restrição necessários para a clonagem posterior dentro dos oligonucleótidos foram excluídos. 113

Estes iniciadores podem ter um comprimento de 60 a 90 nucleótidos, consoante o número de iniciadores que foram necessárias para passar por cima de toda a sequência de V.

Por exemplo, misturaram-se seis iniciadores, em quantidades iguais (por exemplo, 1 μΐ de cada iniciador (stocks de iniciadores de 20 a 100 μΜ) com uma mistura reaccional de RCP de 20 μΐ e adicionou-se a uma mistura de RCP consistindo em tampão de RCP, nucleótidos e polimerase de Taq. Esta mistura foi incubada a 94 °C, durante 3 minutos, 65 °C, durante 1 minuto, 94 °C durante 3 minutos, 65 °C durante 1 minuto, 62 °C durante 1 minuto, 59 °C durante 1 minuto, 56 °C durante 1 minuto, 52 °C durante 1 minuto, 50 °C durante 1 minuto e a 72 °C durante 10 minutos num equipamento para ciclos de RCP. Subsequentemente, o produto foi submetido a electroforese em gel de agarose e o produto com uma dimensão de 200 a 400 foi isolado do gel, de acordo com processos-padrão.

Este produto de RCP foi então utilizado como matriz para uma reacção-padrão de RCP utilizando iniciadores que incorporam o terminal N e o terminal C de sítios de restrição adequados para clonagem. O fragmento de ADN do tamanho correcto (para uma VP com cerca de 350 nucleótidos) foi isolado por electroforese em gel de agarose, de acordo com processos-padrão. Desta forma, amplificou-se suficiente fragmento de ADN de VP. Este fragmento de VP transformou-se então numa mistura de fragmentos de VP que têm, cada um, uma quantidade diferente de resíduos humanos e de murinos nas respectivas posições diferentes da estrutura (mistura de VP humanizadas). O mesmo procedimento foi realizado para a região VL do scFv anti-CD3 de murino (mistura de VL humanizadas). 114 A mistura de VP humanizadas foi então combinado com a mistura de VL humanizadas no vector de exibição de fagos pComb3H5Bhis de modo a formar uma biblioteca de scFv funcionais a partir da qual - após a exibição em fagos filamentosos - se seleccionaram, rastrearam, identificaram e confirmaram aglutinantes anti-CD3, tal como descrito antes para o scFv anti-CD3 parental não humano (de murino). Os clones individuais foram então analisados quanto às propriedades favoráveis e as sequências de aminoácidos. Desses scFvs que estavam mais próximos em homologia das sequências de aminoácidos para segmentos de V de linhas germinativas humanas, são particularmente preferidos aqueles em que pelo menos uma RDC entre as RDC I e II da VP e a RDC I e IL de VL kapa ou a RDC I e II de VL lambda mostra mais de 80 % de identidade da sequência de aminoácidos com a respectiva RDC mais próxima de todos os segmentos de V de todas as linhas germinais humanas. Os scFvs anti-CD3 foram convertidos em anticorpos re-combinantes de cadeia simples, biespecificos, tal como descrito nos exemplos 10 e 16 que se seguem e onde são melhor caracterizados. 3. Geração de uma proteína de fusão recombinante dos ácidos aminados 1-27 de terminal N da cadeia épsilon de CD3 humana fundida com a parte Fc de uma IgGl (CD3 de 1-27 aa - Fc). 3.1. Clonagem e expressão de CD3 de 1-27 aa - Fc A sequência de codificação dos 1-27 aminoácidos de terminal N da cadeia épsilon de CD3 humana fundida com a região de charneira e a região de Fc gama da imunoglobulina humana IgGl, bem como um marcador de 6-histidina foram obtidos por síntese de genes de acordo com protocolos-padrão (a sequência de ADNc e a sequência de aminoácidos da 115 proteína de fusão recombinante estão listados nas SEQ ID NOs 350 e 349). O fragmento de síntese de genes foi concebido de modo a conter um primeiro sítio de Kozak para a expressão eucariótica do vector, seguido de um péptido líder de 19 aminoácidos da imunoglobulina, seguida na estrutura pela sequência de codificação dos primeiros 27 aminoácidos da porção extracelular da cadeia épsilon de CD3 madura humana, seguida, na estrutura, da sequência codificadora da região de charneira e da porção de Fc gama de IgGl humana, seguida, na estrutura, pela sequência de codificação de um marcador de 6-histidina e um codão de terminação (figura 1). O fragmento de síntese de genes foi também concebido de modo a introduzir locais de restrição no início e no final do ADNc que codifica para a proteína de fusão. Os sítios de restrição introduzidos, EcoRI na extremidade 5' e Sall na extremidade 3', são utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. O fragmento de síntese de genes foi clonado através de EcoRI e de Sall num plasmido designado por pEF-DHFR (pEF-DHFR está descrito em Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92 (1995) 7021-7025) seguindo protocolos-padrão. Utilizou-se um plasmido de sequência verificada para a transfecção no Sistema de Expressão FreeStyle 293 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemanha), de acordo com o protocolo do fabricante. Após 3 dias, os sobrenadantes da cultura celular dos transfectantes foram colhidos e ensaiados quanto à presença do vector recombinante, num ensaio de ELISA. Diluiu-se IgG anti-humana de cabra, o anticorpo específico do fragmento Fc gama (obtidos em Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU) em SBF até 5 pg/ml e revestiu-se com 100 μΐ por poço numa placa MaxiSorp de 96 cavidades para ELISA (Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Alemanha), durante a noite, a 4 °C. Os poços foram lavados com SBF com 0,05 % de Tween 20 (SBF/Tween e bloqueados com ASB a 3 % em 116 SBF (albumina bovina, fracção V de albumina, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha), durante 60 minutos, à temperatura ambiente (TA). Posteriormente, os poços foram lavados novamente com SBF/Tween e depois incubados com os sobrenadantes de cultura de células, durante 60 minutos, à TA. Depois de se lavarem, os poços foram incubados com um anticorpo anti-His6 conjugado com peroxidase (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) , diluido a 1 : 500 em SBF com ASB a 1%, durante 60 minutos, à TA. Posteriormente, os poços foram lavados com 200 μΐ de SBF/Tween e adicionou-se 100 μΐ da solução de substrato de OPD SIGMAFAST (SIGMAFAST OPD [dicloridrato de o-fenilenodiamina] (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha), de acordo com a o protocolo do fabricante. A reacção foi parada pela adição de 100 μΐ de H2SO4 1 M. Mediu-se a cor da reacção com um espectrofotómetro de microplacas PowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, EUA), a 490 nm e subtraiu-se a absorção inicial a 620 nm. Como se mostra na figura 2, a presença do vector, em comparação com o sobrenadante irrelevante das células REH 293 transfectadas de forma simulada, usadas como controlo negativo, foi claramente detectável. 3.2. Ensaio de ligação de anticorpos de cadeia única, específicos para inter-espécies, com CD3 de 1-27 aa - FC. A ligação de preparações impuras de anticorpos de cadeia única, específicos para inter-espécies expressos periplasmaticamente e específicos para CD3 épsilon com CD3 de 1-27 aa - Fc foi ensaiada num ensaio por ELISA. Diluiu-se IgG anti-humana de cabra, o anticorpo especifico do fragmento Fc gama (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU) em SBF até 5 pg/ml e revestiu-se com 100 μΐ por poço numa placa MaxiSorp de 96 cavidades 117 para ELISA (Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Alemanha), durante a noite, a 4 °C. Os poços foram lavados com SBF com 0,05 % de Tween 20 (SBF/Tween e bloqueados com ASB a 3 % em SBF (albumina bovina, fracção V de albumina, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha), durante 60 minutos, à TA. Em seguida, os poços foram lavados com SBF/Tween e foram incubados com sobrenadantes de células que expressam o vector de CD3 de 1-27 aa - Fc, durante 60 minutos, à TA. Os poços foram lavados com SBF/Tween e incubaram-se com preparações impuras de anticorpos de cadeia única, específicos para inter-espécies expressos peri-plasmaticamente, tal como descrito antes, durante 60 minutos, à temperatura ambiente. Após a lavagem com SBF/Tween, os poços foram incubadas com anticorpo M2 anti-Flag conjugado com peroxidase (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) , diluído a 1 : 10000 em SBF com ASB a 1 %, durante 60 minutos, à TA. Os poços foram lavados com SBF/Tween e incubados com 100 μΐ da solução de substrato de OPD SIGMAFAST (OPD [dicloridrato de o-fenilenodiamina] (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha), de acordo com a o protocolo do fabricante. Parou-se a cor da reacção com 100 μΐ de H2S04 1 M e mediu-se com um espectrofotómetro de microplacas PowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, EUA), a 490 nm e subtraiu-se a absorção inicial a 620 nm. Observou-se uma forte ligação dos anticorpos de cadeia única humanos, específicos para interespécies para CD3 épsilon com o vector de CD3 de 1-2 7 aa - Fc em comparação com um anticorpo de cadeia única anti-CD3 de murino (figura 3). 118 4. Geração de proteínas de fusão recombinantes transmembranares de CD3 épsilon de 1-27 aminoácidos de terminal N de diferentes primatas não chimpanzés, fundidas com EpCAM de macaco cinomolgos (CD3 de 1-27 aa - EpCAM).

4.1. Clonagem e expressão de CD3 de 1-27 aa - EpCAM

Isolou -se CD3 épsilon de diferentes primatas não chimpanzés (saguim, ti-ti, macaco esquilo) e suínos. As sequências codificantes de 1-27 aminoácidos de terminal N da cadeia épsilon de CD3 madura, de ser humano, sagui comum (Callithrix jacchus), saguim de cabeça de algodão (Saguinus oedipus), macaco-esquilo comum (Saimiri sciureus) e suínos domésticos (Sus scrofa; utilizado como controlo negativo) fundidas com o terminal N de EpCAM de cinomolgos marcado com Flag foi obtida por sintese de genes de acordo com protocolos-padrão. A sequência de ADNc e a sequência de aminoácidos das proteínas de fusão recombinantes estão listadas nas SEQ ID NOs 351 a 360) . Os fragmentos de sintese dos genes foram concebidos de forma a conter um primeiro local de BsrGI para permitir a fusão num quadro de leitura correcto com a sequência de codificação de um péptido lider de 19 aminoácidos de imunoglobulina já presente no vector de expressão do alvo, que é seguido, na estrutura, pela sequência de codificação dos 1-27 aminoácidos de terminal N da porção extracelular das cadeias maduras de CD3 épsilon, que é seguida, na estrutura, pela sequência codificadora de um marcador Flag e seguida, na estrutura, pela sequência de codificação da proteína da estrutura transmembranar de EpCAM de cinomolgos (figura 4). Os fragmentos de síntese de genes também foram concebidos para introduzir um sítio de restrição na extremidade do ADNc que codifica para a proteína de fusão. Os sítios de restrição introduzidos, BsrGI, na extremidade 119 5' e Sall, na extremidade 3', foram utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. Os fragmentos da síntese de genes foram então clonados por via de BsrGI e Sall num derivado do plasmido designado por pEF DHFR (pEF-DHFR está descrito em Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 92 (1995) 7021-7025), que já continha a sequência codificadora do péptido líder de 19 aminoácidos da imunoglobulina, seguindo protocolos-padrão. Os plasmidos das sequências verificadas foram usados para transfectar transientemente células 293 REH usando o reagente MATra-A (IBA GmbH, Gõttingen, Alemanha) e 12 pg de ADN de plasmidos para células 293 REH aderentes em frascos de cultura de células, de 175 1-1 e de acordo com o protocolo do fabricante. Após 3 dias de cultura de células, os transfectantes foram ensaiados quanto à expressão na superfície celular da proteína transmembranar recombinante por meio de um ensaio SCAF, de acordo com protocolos-padrão. Para esse efeito, uma série de 2,5 x 105 células foram incubadas com o anticorpo M2 anti-Flag (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha), a 5 pg/ml em SBF com FCS a 2 %. 0 anticorpo ligado foi detectado com um fragmento F(ab')2 purificado por afinidade conjugado com R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-murganho, fragmento de Fc gama específico a 1 : 100 em SBF com FCS a 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Mediram-se as amostras foram num FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, RFA). Foi claramente detectável a expressão das proteínas de fusão recombinantes da transmembrana marcadas com Flag consistindo em EpCAM de cinomolgo e os 1-27 aminoácidos de terminal N da cadeia épsilon de CD3 de ser humano, saguim, ti-ti, macaco-esquilo e suínos, respectivamente, em células transfectadas (figura 5) . 120

4.2. Ligação de anticorpos de cadeia única, anti-CD3, específicos de interespécies, a CD3 de 1-27 aa - EpCAM A ligação das preparações impuras de anticorpos de cadeia única anti-CD3 específicos para interespécies expressos periplasmaticamente com as cadeias épsilon de CD3 de 1-27 aminoácidos de terminais N de seres humanos, saguim, macaco-esquilo e ti-ti, respectivamente, fundidas com Ep-CAM de cinomolgos, foi ensaiada num ensaio por SCAF, de acordo com protocolos-padrão. Para esse efeito, incubou-se 2,5 x 105 células com preparações impuras de anticorpos de cadeia única anti-CD3 específicos para interespécies expressos periplasmaticamente (a preparação foi feita tal como descrito antes e de acordo com protocolos-padrão) e um anticorpo de CD3 de cadeia única de murino anti-humano como controlo negativo. Como anticorpo secundário utilizou-se o anticorpo penta-His (Qiagen GmbH, Hildesheim, Alemanha), a 5 pg/ml em 50 μΐ de SBF com FCS a 2 %. A ligação do anticorpo foi detectada com um fragmento F(ab')2 purificado por afinidade conjugado com R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-murganho, fragmento de Fc gama específico, diluído a 1 : 100 em SBF com FCS a 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Mediram-se as amostras num FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, RFA). Como se mostra nas figuras 6 (A a E) observou-se a ligação de anticorpos de cadeia simples a transfectantes que expressam as proteínas de fusão recombinantes da transmembrana consistindo em CD3 épsilon de 1-27 aminoácidos de terminal N de ser humano, saguim, ti-ti ou macaco esquilo, fundida com EpCAM de cinomolgos. Não se observou nenhuma ligação de anticorpos de cadeia simples específicos de interespécies a uma proteína de fusão que consiste em CD3 épsilon de 1 - 27 aa de terminal N de suíno, fundida com EpCAM de cinomolgos utilizada como controlo negativo. Observou-se a 121 especificidade interespécies de vários primatas dos anticorpos de cadeia única anti-CD3. Os sinais obtidos com o anticorpo M2 anti-Flag e os anticorpos de cadeia simples específicos de interespécies foram comparáveis, o que indica uma forte actividade de ligação dos anticorpos de cadeia simples específicos de interespécies com os 1-27 aminoácidos de terminal N de CD3 épsilon. 5. Análise da ligação de anticorpos de cadeia simples anti-CD3 específicos de interespécies por varrimento de alanina de células de ratinho transfectadas com a cadeia épsilon de CD3 humana e os seus mutantes de alanina 5.1. Clonagem e expressão de CD3 épsilon humana do tipo selvagem A sequência de codificação da cadeia épsilon de CD3 humana foi obtida por síntese de genes de acordo com protocolos-padrão (sequência de ADNc e a sequência de aminoácidos da cadeia épsilon de CD3 humana estão listados nas SEQ ID NOs 362 e 361). 0 fragmento de síntese de genes foi concebido de forma a conter um local de Kozak para a expressão eucariótica da estrutura e locais de restrição no início e no final dos ADNc que codificam para CD3 épsilon humana. Os sítios de restrição introduzidos, EcoRI na extremidade 5' e Sall na extremidade 3', foram utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. 0 fragmento da síntese de genes foi então clonado através de EcoRI e de Sall num plasmido designado por pEF NEO seguindo protocolos-padrão. 0 pEF NEO derivou de pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 92 (1995) 7021-7025) substituindo o ADNc de DHFR com o ADNc da resistência à neomicina por clonagem molecular convencional. Utilizou-se uma sequência verificada de plasmido para transfectar a 122 linha celular T de murino EL4 (ATCC No. TIB-39) cultivada em meio RPMI com L-glutamina estabilizada complementada com FCS a 10 %, penicilina a 1 %/estreptomicina, HEPES a 1 %, piruvato a 1 %, aminoácidos não essenciais a 1 % (todos da Biochrom AG Berlin, Alemanha), a 37 °C, a 95 % de humidade e 7 % de CO2. A transfecção foi realizada com o reagente de transfecção SuperFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) e 2 pg de ADN de plasmido, de acordo com o protocolo do fabricante. Após 24 horas, as células foram lavadas com SBF e cultivadas de novo no meio de cultura de células mencionado antes com 600 pg/ml de G418 para a selecção (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Áustria). 16 a 20 dias após a transfecção, observou-se o crescimento de células resistentes. Depois de 7-14 dias adicionais, as células foram ensaiadas quanto à expressão de CD3 épsilon humana por análise por SCAF, de acordo com protocolos-padrão. Incubaram-se 2,5xl05 células com o anticorpo de CD3 anti-humano, UCHT-1 (BD biosciences, Heidelberg, Alemanha) a 5 pg/ml em SBF com FCS a 2 %. A ligação do anticorpo foi detectada com um fragmento F(ab')2 purificado por afinidade conjugado com R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-murganho, fragmento de Fc gama especifico, diluído a 1 : 100 em SBF com FCS a 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU) . Mediram-se as amostras num FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, RFA). A expressão de CD3 humanas de tipo selvagem em células EL4 transfectadas está ilustrada na figura 7. 5.2. Clonagem e expressão dos anticorpos de cadeia simples anti-CD3 específicos de interespécies como anticorpos IgGl

Para proporcionar meios melhorados de detecção da ligação, os anticorpos de cadeia simples anti-CD3 específicos de interespécies H2C HLP, A2J HLP e E2M HLP 123 foram convertidos em anticorpos IgGl, com IgGl de murino e regiões constantes lambda humanas. As sequências de ADNc que codificam para as respectivas cadeias pesada e leve dos anticorpos IgG foram obtidas por síntese de genes de acordo com protocolos-padrão. Os fragmentos de síntese de genes para cada especificidade foram concebidos de forma a conter um primeiro local de Kozak para permitir a expressão eucariótica do vector, que é seguido de um péptido líder de imunoglobulina de 19 aminoácidos (SEQ ID NOs: 364 e 363), que é seguido, na estrutura, pela sequência codificadora da correspondente região variável da cadeia pesada ou da respectiva região variável de cadeia leve, seguida, na estrutura, da sequência codificadora da região constante de cadeia pesada da IgGl de murino (SEQ ID Nos 366 e 365) ou a sequência de codificação da região constante de cadeia leve lambda humana (SEQ ID NO 368 e 367), respectivamente. Os sítios de restrição foram introduzidos no início e no final dos ADNc que codificam para a proteína de fusão. Os sítios de restrição EcoRI na extremidade 5' e Sall na extremidade 3', foram utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. Os fragmentos de síntese de genes foram clonados por meio de EcoRI e de Sall num plasmido designado pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 92 (1995) 7021-7025) para os vectores de cadeia pesada e pEF ADA (pEF ADA está descrito em Raum et al., Câncer immunol immunother., 50 (3), (2001), 141-50) para os vectores de cadeia leve) de acordo com protocolos-padrão. Utilizaram-se as sequências verificadas de plasmidos para a co-transfecção dos respectivos vectoress de cadeia leve e de cadeia pesada no Sistema de Expressão FreeStyle 293 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemanha), de acordo com o protocolo do fabricante. Passados 3 dias, colheram-se os sobrenadantes da cultura celular dos transfectantes e utilizaram-se para a experiência de varrimento de alanina. 124 5.3. Clonagem e expressão de mutantes de alanina de CD3 épsilon humana para o varrimento de alanina

Obtiveram-se, por síntese de genes, 27 fragmentos de ADNc que codificam para a cadeia épsilon de CD3 humana com uma troca de um codão da sequência de tipo selvagem de CD3 épsilon humana por um codão que codifica para a alanina (GCC), para cada um dos 1-27 aminoácidos do domínio extracelular da cadeia épsilon de CD3 humana madura, respectivamente. Excepto para o codão permutado, os fragmentos de ADNc foram idênticos ao fragmento de ADNc de CD3 humana de tipo selvagem mencionado antes. Apenas um codão foi substituído em cada vector em comparação com o fragmento de ADNc de CD3 humana de tipo selvagem descrito antes. Introduziram-se os locais de restrição EcoRI e Sall nos fragmentos de ADNc, em posições idênticas em comparação com a estrutura de tipo selvagem. Todas as estruturas de varrimento de alanina foram clonados em pEF NEO e as sequências verificadas de plasmidos foram transfectadas em células EL4. A transfecção e a selecção de transfectantes foram realizadas como descrito antes. Como resultado, obteve-se um painel de vectores expressos em que o primeiro aminoácido da cadeia épsilon de CD3 humana, glutamina (Q, Gin) na posição 1, foi substituído por alanina. 0 último aminoácido substituído por alanina foi a treonina (T, Tre) na posição 27 de CD3 épsilon humana madura de tipo selvagem. Para cada aminoácido entre a glutamina 1 e a treonina 27 geraram-se os respectivos transfectantes com uma troca do aminoácido de tipo selvagem por alanina. 5.4. Experiência de rastreio de alanina

Os anticorpos quiméricos IgG, tal como descrito em 2) e os anticorpos de cadeia simples específicos para 125 interespécies, específicos paraCD3 épsilon, foram ensaiados em experiências de rastreio de alanina. A ligação dos anticorpos às linhas de células EL4 transfectadas com os vectores mutantes de alanina de CD3 épsilon humana, tal como descrito no ponto 3), foi ensaiada pelo ensaio de SCAF, de acordo com protocolos-padrão. 2,5xl05 Células dos transfectantes respectivos foram incubadas com 50 μΐ de sobrenadante de cultura de células contendo os anticorpos quiméricos IgG ou com 50 μΐ de preparações impuras de anticorpos de cadeia simples expressos periplasmaticamente. Para amostras incubadas com preparações impuras de anticorpos de cadeia simples expressos periplasmaticamente, utilizou-se o anticorpo M2 anti-Flag (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) como anticorpo secundário, a 5 pg/ml em 50 μΐ de SBF com FCS a 2 %. Para amostras incubadas com os anticorpos quiméricos IgG, não foi necessário um anticorpo secundário. Para todas as amostras, a ligação das moléculas de anticorpo foi detectada com um fragmento F(ab')2 purificado por afinidade conjugado com R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-murganho, fragmento de Fc gama específico, diluído a 1 : 100 em SBF com FCS a 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Mediram-se as amostras num FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, RFA) . Detectou-se a ligação diferencial de moléculas quiméricas de IgG ou de anticorpos de cadeia simples específicos de interespécies com as linhas de células EL4 transfectadas com os mutantes de alanina de CD3 épsilon humana. Como controlo negativo, utilizou-se, respectivamente, quer um isotipo de controlo ou uma preparação impura de um anticorpo de cadeia simples expresso periplasmaticamente de especificidade irrelevante. O anticorpo UCHT-1 foi utilizado como controlo positivo para o nível de expressão dos mutantes de alanina de CD3 épsilon humana. As linhas de células EL4 transfectadas com 126 os mutantes de alanina para os aminoácidos tirosina na posição 15, valina na posição 17, isoleucina na posição 19, valina na posição 24 ou leucina na posição 26 da cadeia épsilon de CD3 madura não foram avaliadas devido aos níveis muito baixos de expressão (dados não mostrados). A ligação dos anticorpos de cadeia simples específicos de interespécies e os anticorpos de cadeia única no formato de IgG quimérica com as linhas de células EL4 transfectadas com os mutantes de alanina de CD3 épsilon humana está ilustrada na figura 8 (A-D), como ligação relativa em unidades arbitrárias com os valores das médias geométricas da fluorescência dos respectivos controlos negativos subtraídos de todos os valores das médias geométricas da fluorescência das amostras. Para compensar os diferentes níveis de expressão, todos os valores das amostras para um determinado transfectante foram então divididos pelo valor da média geométrica da fluorescência do anticorpo UCHT-1 para o respectivo transfectante. Para efeitos de comparação com o valor da amostra de tipo selvagem, de uma especificidade, todos os valores das amostras, da respectiva especificidade, foram finalmente divididos pelo valor da amostra de tipo selvagem, definindo assim o valor da amostra de tipo selvagem como 1 para uma unidade arbitrária de ligação.

Os cálculos utilizados estão apresentados em detalhe na seguinte fórmula: valor_Amostra (x,y) =_ Amostra (x,y) - neg_Contr. (x)_ UCHT-1 (x) -neg_Contr. (x) ) *TS (y) -neg_Contr. (ts) UCHT-1 (ts) -neg_Contr. (ts)

Nesta equação, valor_Amostra significa o valor, em unidades arbitrárias, de ligação que representa o grau de ligação de um anticorpo anti-CD3 específico para um 127 determinado mutante de alanina, como se mostra na figura 8 (A-D), Amostra significa o valor da média geométrica da fluorescência obtido para um determinado anticorpo anti-CD3 específico ensaiado num transfectante específico do varrimento de alanina, neg_Contr. significa o valor da média geométrica da fluorescência obtido para o controlo negativo ensaiado num determinado mutante de alanina, UCHT-1 é o valor da média geométrica da fluorescência obtido para o anticorpo UCHT-1 submetido a ensaios com um determinado mutante de alanina, TS, significa o valor da média geométrica de fluorescência obtido para um anticorpo anti-CD3 específico, ensaiado num transfectante de tipo selvagem, x especifica o transfectante respectivo, y especifica o anticorpo anti-CD3 respectivo e ts especifica que o transfectante respectivo é de tipo selvagem.

Como pode ser visto na figura 8 (A-D) , o anticorpo IgG, A2J HLP, mostrou uma perda acentuada de ligação para os aminoácidos asparagina na posição 4, treonina na posição 23 e isoleucina na posição 25 da cadeia épsilon de CD3 madura. A perda completa da ligação do anticorpo de IgG, A2J HLP, foi observada para os aminoácidos glutamina na posição 1, aspartato na posição 2, glicina na posição 3 e glutamato na posição 5 do da cadeia épsilon de CD3 madura. 0 anticorpo de IgG E2M HLP mostrou uma perda acentuada de ligação para os aminoácidos asparagina na posição 4, treonina na posição 23 e isoleucina na posição 25 da cadeia épsilon de CD3 madura. 0 anticorpo de IgG, E2M HLP, demonstrou uma perda completa de ligação para os aminoácidos glutamina na posição 1, aspartato na posição 2, glicina na posição 3 e glutamato na posição 5 do da cadeia épsilon de CD3 madura. 0 anticorpo de IgG, H2C HLP, mostrou uma perda de ligação intermédia para os aminoácidos asparagina na posição 4 da cadeia épsilon de CD3 madura e 128 mostrou uma completa perda de ligação para os aminoácidos glutamina na posição 1, aspartato na posição 2, glicina na posição 3 e glutamato na posição 5 da cadeia épsilon de CD3 madura. 0 anticorpo de cadeia única F12Q HLP demonstrou uma perda praticamente completa de ligação para os aminoácidos glutamina na posição 1, aspartato na posição 2, glicina na posição 3 da cadeia épsilon de CD3 madura e glutamato na posição 5 da cadeia épsilon de CD3 madura. 6. Análise da ligação da molécula de ligação anti-CD3 especifica de interespécies, H2C HLP, com a cadeia épsilon de CD3 humana com e sem marcador His6 do terminal N, transfectada na linha de células T de murino EL4 6.1. Clonagem e expressão da cadeia épsilon de CD3 humana com o marcador de histidina 6 do terminal N (marcador His6)

Obteve-se um fragmento de ADNc que codifica para a cadeia épsilon de CD3 humana com um marcador His6 de terminal N por sintese de genes. 0 fragmento de síntese de genes foi concebido de modo a conter um primeiro sítio de Kozak para a expressão eucariótica do vector, que é seguido, na estrutura, pela sequência codificadora de um péptido líder da imunoglobulina de 19 aminoácidos, que é seguida, na estrutura, pela sequência de codificação do marcador His6, que é seguida, na estrutura, pela sequência codificadora da cadeia épsilon de CD3 humana madura (o ADNc e as sequências de aminoácidos do vector estão listadas como SEQ ID NOs 380 e 379). 0 fragmento de síntese de genes foi também concebido de modo a conter os sítios de restrição no início e no fim do ADNc. Os sítios de restrição introduzidos, EcoRI na extremidade 5' e Sall na extremidade 3', foram utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. O fragmento da síntese de gene foi 129 então clonado através de EcoRI e de Sall num plasmido designado por pEF-NEO (como descrito antes), seguindo protocolos-padrão. Utilizou-se um plasmido de sequência verificada para transfectar a linha de células T de murino, EL4. A transfecção e a selecção dos transfectantes foram realizadas como descrito antes. Após 34 dias de cultura de células, utilizaram-se os transfectantes para o ensaio descrito a seguir.

6.2. Ligação da molécula de ligação anti-CD3 especifica de interespécies, HLP H2C, à cadeia épsilon de CD3 humana com e sem o marcador His6 de terminal N

Fez-se o ensaio de um anticorpo quimérico IgG, com a especificidade de ligação de H2C HLP específica para CD3 épsilon, para avaliar a ligação a CD3 épsilon humana com e sem marcador His6 do terminal N. A ligação do anticorpo às linhas celulares EL4 transfectaram a CD3 épsilon humana-His6 e CD3 épsilon humana de tipo selvagem, respectivamente e foi ensaiada através de um ensaio por SCAF, de acordo com protocolos-padrão. 2,5xl05 de células dos transfectantes respectivos foram incubadas com 50 μΐ de sobrenadante de cultura de células contendo o anticorpo quimérico IgG ou com 50 μΐ dos respectivos anticorpos de controlos a 5 pg/ml, em SBF com FCS a 2 %. Como controlo negativo, utilizou-se, respectivamente, um controlo do isotipo adequado e, como controlo positivo para a expressão dos vectores do anticorpo UCHT-1 específico de CD3. A ligação dos anticorpos foi detectada com um fragmento F(ab')2 purificado por afinidade conjugado com R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-murganho, fragmento de Fc gama específico, diluído a 1 : 100 em SBF com FCS a 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU) . Mediram-se as amostras num FACScalibur (BD biosciences, 130

Heidelberg, RFA) . Comparadas com a linha de células EL4 transfectada com CD3 épsilon humana de tipo selvagem, detectou-se uma clara perda de ligação da IgG quimérica com especificidade de ligação de HLP H2C a CD3 épsilon humana de com um marcador His6 do terminal N. Estes resultados mostraram que o terminal N livre de CD3 épsilon é essencial para a ligação de H2C HLP com especificidade de ligação anti-CD3 especifica de interespécies, com a cadeia épsilon de CD3 humana (figura 9). 7. Determinação da constante de ligação KD do anticorpo de cadeia simples, biespecifico, especifico para interespécies para EGFR de primatas e CD3 de primatas (EGFR LH x H2C HLP) com a proteína de fusão Fc-CD3 de 1-27 aa por medição por ressonância plasmónica de superfície, medição comparada com a ligação de superfície em comparação com a ligação às CMSP expressando CD3, medida por um separador de células activado por fluorescência (SCAF) 7.1. Medição por ressonância plasmónica de superfície

Para determinar a afinidade de ligação do anticorpo de cadeia única, biespecifico, totalmente específico de interespécies, EGFR 21-63 LH x H2C HLP, aos 1-27 aminoácidos da extremidade N da cadeia de CD3 épsilon humana, realizou-se uma medição, por ressonância plasmónica de superfície, com uma proteína de fusão recombinante que consiste nos aminoácidos 1-27 de terminal N da cadeia de épsilon de CD3 humana madura fundida com uma parte de Fc de IgGl humana (CD3 de 1-27 aa - Fc) . Para esse efeito, instalou-se um chip de carboximetil-dextrano Biacore CM5 (Biacore, Uppsala, Suécia), num sistema Biacore 2000® (Biacore, Uppsala, Suécia). Activou-se uma célula de fluxo por meio de uma solução de cloridrato de N- (3-dimetil- 131 aminopropil)-Ν' -etil-carbodi-imida/N-hidroxi-succinimida, de acordo com procedimentos-padrão. Adicionou-se uma solução da proteína de fusão Fc-CD3 de 1-27 aa, resultando numa ligação covalente estável da proteína à camada de dextrano do chip da Biacore. A proteína não ligada foi removida por lavagem exaustiva seguida de bloqueio dos grupos remanescentes de NHS - carboxi activado que não reagiram, por adição de uma solução de etanolamina. 0 sucesso do acoplamento da proteína foi confirmado por um sinal mais elevado medido como unidades de resposta, em comparação com o sinal anterior ao acoplamento. Preparou-se uma célula de referência, tal como descrito, mas sem a adição de uma solução de proteína. 0 anticorpo biespecífico purificado EGFR 21-63 LH x H2C HLP foi exaustivamente dialisado contra tampão HBS-EP (Biacore, Uppsala, Suécia) numa unidade de mini-diálise Slide-A-Lyzer® (Pierce, Rockford, II, EUA). A concentração de proteína, após a diálise, foi determinada por absorção por UV a 280 nm, resultando numa concentração de 43 pg/ml. A solução de proteína foi transferida para uma placa de 96 poços e diluída em série com tampão HBS-EP numa proporção de 1: 1 com 10 poços adicionais.

As medições por ressonância plasmónica de superfície foram feitas por amostragem, separadamente, dos 11 poços. As células de fluxo foram regeneradas com tampão de acetato entre as medições para libertar a proteína ligada.

Os sinais de ligação das moléculas de anticorpos biespecíficas foram obtidos por subtracção do sinal da célula de referência a partir do sinal medido da célula conjugado com o da proteína de CD3 de 1-27 aa - Fc. As 132 curvas de associação e de dissociação foram medidas como unidades de resposta e foram registadas. As constantes de ligação foram calculadas utilizando o programa informático de ajustamento da curva Biacore® com base no modelo de Langmuir.

Determinou-se que a constante de ligação calculada, KD, ao longo das primeiras cinco concentrações, foi de 1,52 x 10“7 M.

7.2. Determinação da constante de ligação de CD3 por medição por SCAF A fim de ensaiar a afinidade das moléculas de anticorpo biespecifico, especifico de interespécies, no que diz respeito à força de ligação a CD3 humana natural, realizou-se uma análise de ligação adicional por SCAF de saturação. A molécula de anticorpo biespecifico escolhida, EGFR 21-63 LH x H2C HLP, foi usada para estabelecer uma linha de diluição com um factor de 1:1,5 e uma concentração inicial de 63,3 yg/ml. A molécula de anticorpo biespecifico foi incubada, a estas diferentes concentrações, com 1,25 x 105 CMSP humanas, cada uma durante 1 hora, a 4 °C, seguido de duas etapas de lavagem em SBF, a 4°C. A detecção das moléculas de anticorpo biespecífico ligadas foi feita usando um anticorpo Penta-His (Qiagen GmbH, Hildesheim, Alemanha), a 5 pg/ml, em 50 μΐ de SBF com FCS a 2 %. Depois da incubação, durante 45 minutos, a 4 °C e duas etapas de lavagem, detectou-se a ligação do anticorpo Penta-His com um fragmento F(ab')2 purificado por afinidade conjugado com R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-murganho, fragmento de Fc gama especifico, diluído a 1 : 100 em SBF com FCS a 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU) . A citometria de fluxo foi realizada num aparelho de 133 SCAF-Canto II, utilizou-se o programa informático Diva de SCAF para a aquisição e a análise de dados (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). A coloração e a medição da intensidade de fluorescência, por SCAF, foram realizadas como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002) . Os valores médios da intensidade de fluorescência obtidos foram representados graficamente em função da concentração da molécula de anticorpo biespecifico utilizada e analisados pelo programa de biomatemática Prism, numa análise de ligação de um lado (hipérbole). O programa informático calculou o correspondente valor de KD que descreveu a ligação de um ligando (a molécula de anticorpo bi-especifico) a um receptor (a subtracção de CMSPde CED3 positiva), que segue a lei de acção de massas. A fórmula subjacente é a seguinte: Y = Bmax x X / (Kd+X) sendo Bmax a ligação máxima. KD é a concentração do ligando necessária para atingir metade da ligação máxima. A coloração de SCAF foi realizada em duplicado, os valores de R2 foram melhores do que 0,95. A ligação semi-máxima determinada para a molécula de anticorpo biespecifico EGFR 21-63 LH x H2C HLP foi atingida a uma concentração de 8472 ng/ml, que corresponde a 154 nM (1,54 x 10“7 M) a uma dada massa molecular de 55000 dalton (figura 10). Assim, a afinidade de EGFR 21-63 LH x H2C HLP para os 1-27 aminoácidos de terminal N da cadeia épsilon de CD3 humana, separada do contexto natural de CD3 provou ser igual à afinidade de EGFR-21-63 LH x H2C HLP para a CD3 natural em células T intactas. 134 8. Geração de células de OHC transfectadas com EGFR humano A linha de células positivas para EGFR humano, A431 (linha de células de carcinoma epidermóide, CRL-1555, American Type Culture Collection, Rockville, MD) foi usada para obter o ARN total que foi isolado de acordo com as instruções do manual do estojo (Qiagen, RNeasy Mini Kit, Hilden, Alemanha). 0 ARN obtido foi utilizado para a síntese de ADNc por transcrição inversa aleatória. Para a clonagem da sequência de comprimento completo do antigénio de EGFR humano, utilizaram-se os seguintes oligo-nucleótidos: 5' EGFR AG Xbal 5'-GGTCTAGAGCATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGG-3' 3' EGFR AG Sall 5'-TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT-3' A sequência codificadora foi amplificada por RCP (desnaturação a 94 °C durante 5 min, hibridação a 58 °C durante 1 min, alongamento a 72 °C durante 2 min para o primeiro ciclo; desnaturação a 94 °C, durante 1 minuto, hibridação a 58 °C durante 1 min, alongamento a 72 °C durante 2 min durante 30 ciclos; extensão do terminal a 72 °C durante 5 min) . O produto de RCP foi subsequentemente digerido com Xbal e Sall, ligado ao vector de expressão adequadamente digerido pEF-DHFR (Raum et al., Câncer Immunol. Immunother. 2001; 50: 141-150) e transformados em E.coli. Os procedimentos mencionados antes foram realizados de acordo com protocolos-padrão (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Um clone com a sequência de nucleótidos verificada (SEQ ID 370, sequência de aminoácidos SEQ ID 369) foi transfectado em células de OHC deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do vector. A expressão da proteína 135 eucariótica, em células de OHC deficientes em DHFR, foi efectuada tal como descrito por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação do gene do vector foi induzida por concentrações crescentes de metotrexato (MTX) até a uma concentração final até 20 nM de MTX. 9. Geração de células de OHC expressando o domínio extracelular de EGFR de cinomolgos A sequência de ADNc do domínio extracelular de EGFR de cinomolgos foi obtida por um conjunto de duas RCP no ADNc de cólon de macaco cinomolgos (Cat #: C1534090-Cy-BC; obtidas na BioCat GmbH, Heidelberg, Alemanha) usando as condições de reacção que se seguem: 1 ciclo a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 35 ciclos a 94 °C, durante 1 minuto, 53 °C durante 1 minuto e 72 °C durante 2 minutos seguido de um ciclo final a 72 °C durante 3 minutos. Utilizaram-se os iniciadores que se seguem: 1. Iniciador dianteiro: 5'-CGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGC-3' iniciador inverso: 5'-CCGTCTTCCTCCATCTCATAGC-3' 2. Iniciador dianteiro: 5'- ACATCCGGAGGTGACAGATCACGGCTCGTGC-3' iniciador inverso: 5'-CAGGATATCCGAACGATGTGGCGCCTTCGC-3'

Essas reações de RCP geraram dois fragmentos que se sobrepõem (A: 1-869, B: 848-1923), que foram isolados e sequenciados de acordo com protocolos convencionais, utilizando os iniciadores de RCP e, assim, forneceram uma porção de 1923 pb da sequência de ADNc de EGFR de cinomólogo a partir do terceiro nucleótido do codão +1 da proteína madura até ao 21° codão do domínio transmembranar. Para gerar um vector para a expressão do EGFR de 136 cinomolgos, obteve-se um fragmento de ADNc por síntese de genes de acordo com protocolos-padrão (a sequência de ADNc e de aminoácidos do vector está listada nas SEQ ID Nos 372 s 371). Neste vector, a sequência de codificação para o EGFR de cinomolgos desde o aminoácido + 2 ao +641 da proteína EGFR madura foi fundida na sequência de codificação de EGFR humano substituindo a sequência de codificação dos aminoácidos + 2 a +641. 0 fragmento de síntese de genes foi também concebido de modo a conter um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do vector e sítios de restrição no início e no final dos ADNc que codificam para, praticamente o domínio extracelular de EGFR de cinomolgos fundido com os domínios transmembranar e intracelular do EGFR humano. Além disso, uma mutação conservadora foi introduzida no aminoácido 627 (4o aminoácido do domínio transmembranar) mutando a valina em leucina para gerar um sítio de restrição (Sphl) para fins de clonagem. Os sítios de restrição introduziram Xbal na extremidade 5' e Sall na extremidade 3', foram utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. 0 fragmento de síntese de genes foi então clonado através de Xbal e de Sall num plasmido designado por pEF-DHFR (pEF-DHFR está descrito em Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92 (1995) 7021-7025). Um clone de sequência verificada deste plasmido foi usado para transfectar células OHC/dhfr, como descrito antes. 137 10. Geração de moléculas de EGFR e de CD3 de cadeia única biespecificas, especificas das inter espécies 10.1. Clonagem de moléculas de ligação especificas de interespécies

Em geral, as moléculas de anticorpo de cadeia simples, biespecificas, compreendendo, cada uma, um domínio com uma especificidade de ligação de interespécies específica para CD3 épsilon humana e de primatas não chimpanzés, bem como um domínio com uma especificidade de ligação interespécies específica para EGFR humana e de primatas não chimpanzés, foram concebidas como estabelecido no quadro 1 que se segue:

Quadro 1: Formatos de moléculas de anticorpos de cadeia única biespecíficos, anti-CD3 e anti-EGFR específicos de interespécies

SEQ ID (nucl/prot) Formatos das estruturas de proteína (N -> C) 294/293 EGFR-21-63 LP x P2C PL 296/295 EGFR-21-63 LP x P2C PLP 302/301 EGFR-21-63 LP x A2J PL 298/297 EGFR-21-63 LP x PlE PL 306/305 EGFR-21-63 LP x E2M PL 308/307 EGFR-21-63 LP x F70 PLP 390/389 EGFR1 PL x I2C PL 392/391 EGFR1 LP x I2C PL 394/393 EGFR1 PL x F12Q PL 396/395 EGFR1 LP x F12Q PL 398/397 EGFR1 PL x P2C PL 400/399 EGFR1 LP x P2C PL 448/447 EGFR1 PL x P2C PL 450/449 EGFR1 PL x F12Q LP 138

SEQ ID (nucl/prot) Formatos das estruturas de proteína (N -> C) 452/451 EGFR1 PL x I2C PL 410/409 EGFR2 PL x I2C PL 412/411 EGFR2 LP x I2C PL 414/413 EGFR2 PL x F12Q PL 416/415 EGFR2 LP x F12Q PL 418/417 EGFR2 PL x P2C PL 420/419 EGFR2 LP x P2C PL

Os vectores mencionados antes, contendo os domínios variável de cadeia leve (L) e variável da cadeia pesada (P) , interespécies, específicos para o EGFR humano e de cinomolgos, foram obtidos por síntese de genes. Os fragmentos de síntese de genes foram concebidos de forma a conter um primeiro sítio de Kozak para a expressão eucariótica do vrctor, seguido de um péptido líder da imunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido, na estrutura, pela sequência de codificação da correspondente molécula de anticorpo biespecífico de cadeia simples, seguida, na estrutura, pela sequência de codificação de um marcador de β-histidina e um codão de paragem. 0 fragmento de síntese de genes foi concebido para introduzir os sítios de restrição adequados no terminal N e no terminal C. 0 fragmento de síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição num plasmido designado por pEF-DHFR (pEF-DHFR está descrito em Raum et al. Câncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acordo com protocolos- padrão (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Um clone com a sequência de nucleótidos da sequência verificada foi transfectado em células de ovário de hamster chinês (OHC), deficientes em di-hidrofolato-redutase (DHFR), para a expressão eucariótica do elemento. 139

Os vectores foram transfectados, de forma estável ou transiente para células de OHC deficientes em DHFR (ATCC No. CRL 9096) por electroporação ou, alternativamente, para células REH 293 (células de rim embrionário humano, Número: CRL-1573) de forma transiente, de acordo com protocolos-padrão . 10.2. Expressão e purificação das moléculas de anticorpo biespecificos de cadeia simples

As moléculas de anticorpos biespecificos, de cadeia simples, foram expressas em células de ovário de hamster chinês (OHC). A expressão eucariótica da proteína, em células de OHC deficientes em DHFR, foi efectuada tal como descrito por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes dos vectores foi induzida por concentrações finais crescentes de MTX até 20 nM. Após duas passagens de cultura estacionária, as células cresceram em frascos rolantes com um meio líquido de soja PF CHO HyQ isento de nucleósidos (com L-glutamina 4,0 mM com Pluronic F -68 a 0,1 %; HyClone), durante 7 dias, antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante, contendo a proteína expressa, foi armazenado a -20 °C. Alternativamente, os vectores foram transitoriamente expressos em células REH 293. A transfecção foi realizada com o reagente 293fectin (Invitrogen, # 12347-019) de acordo com o protocolo do fabricante. O sistema de exploração Âkta® (GE Health Systems) e o programa informático Unicom® foram utilizados para a cromatografia. A cromatografia por afinidade com metal imobilizado ("CAMI", em inglês IMAC) foi realizada utilizando um quelato Fractogel EMD® (Merck), que foi 140 carregado com ZnCl2, de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com tampão A (tampão de fosfato de sódio 20 mM, a pH 7,2, NaCl 0,1 M) e o sobrenadante da cultura celular (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma velocidade de fluxo de 3 ml/min. A coluna foi lavada com tampão A para remover a amostra não ligada. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente, em duas etapas, de tampão B (tampão de fosfato de sódio 20 mM, a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M) , de acordo com o seguinte:

Etapa 1: tampão B a 20 % em 6 volumes de coluna Etapa 2: tampão B a 100 % em 6 volumes de coluna

Combinaram-se as fracções proteicas eluídas da etapa 2 para posterior purificação. Todos os produtos químicos eram de grau de investigação e foram adquiridos à Sigma (Deisenhofen) ou à Merck (Darmstadt). A cromatografia de filtração em gel foi realizada numa coluna prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com tampão Equi (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol a 5 %, a pH 7,2). As amostras de proteínas eluídas (velocidade de fluxo de 1 ml/min) foram submetidas SDS-PAGE e Western Blot normalizadas para detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (estojo de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas usando uma DO de 280 nm. A proteína purificada do anticorpo biespecífico de cadeia simples foi analisada por SDS-PAGE em condições redutoras realizadas com pré-molde de géis de Bis Tris a 4-12 % (Invitrogen) . A preparação da amostra e a aplicação foram feitas de acordo com o protocolo fornecido pelo 141 fabricante. 0 peso molecular foi determinado com o padrão de proteína Multimark (Invitrogen) . 0 gel foi corado com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada foi > 95 %, tal como determinado por SDS-PAGE . 0 anticorpo biespecífico de cadeia simples tem um peso molecular de cerca de 52 kDa, em condições naturais, conforme determinado por filtração em gel em SBF. Todos os vectores foram purificados de acordo com este processo. A análise por "Western Blot" foi realizada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e o módulo Blot da Invitrogen, de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Os anticorpos usados foram dirigidos contra o marcador de His (Penta His, Qiagen) e Ig de cabra anti-murganho marcada com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) e tendo BCIP/NBT (Sigma) como substrato. Detectou-se uma única banda a 52 kD correspondente ao anticorpo biespecífico de cadeia simples purificado. 11. Determinação da constante de ligação KD de anticorpos de cadeia simples biespecificos totalmente específicos inter-espécies, à proteína de fusão Fc-CD3 de 1-27 aa, por medição por ressonância plasmónica de superfície.

Para determinar as afinidades de ligação de moléculas de anticorpos de cadeia única, biespecificos, específicos de interespécies, com EGFR e CD3 de primatas com 1-2 7 aminoácidos da extremidade N da cadeia épsilon de CD3 humana, realizou-se uma medição, por ressonância plasmónica de superfície, com uma proteína de fusão recombinante que consiste nos aminoácidos 1-27 de terminal N da cadeia de épsilon de CD3 humana de 1-27 aa, madura, fundida com uma 142 parte de Fc de IgGl humana (CD3 de 1-27 aa - Fc). Para esse efeito, instalou-se um chip de carboximetil-dextrano Biacore CM5 (Biacore, Uppsala, Suécia), num sistema Biacore 2000® (Biacore, Uppsala, Suécia). Activou-se uma célula de fluxo por meio de uma solução de cloridrato de A7-(3-di-metilaminopropil)-Ν' -etil-carbodi-imida/N-hidroxi-succin-imida, de acordo com procedimentos-padrão. Adicionou-se uma solução da proteína de fusão de Fc - CD3 de 1-27 aa, resultando numa ligação covalente estável da proteína à camada de dextrano do chip da Biacore. A proteína não ligada foi removida por lavagem exaustiva seguida de bloqueio dos grupos remanescentes de NHS - carboxi activado que não reagiram por adição de uma solução de etanolamina. 0 sucesso do acoplamento da proteína foi confirmado por detecção de um sinal mais elevado medido como unidades de resposta, em comparação com o sinal anterior ao acoplamento. Preparou-se uma célula de referência, tal como descrito, mas sem a adição da solução de proteína.

Ajustaram-se os anticorpos de cadeia simples, biespecíficos, purificados, listados a seguir, para 5 pg/ml com tampão de HBS-EP (Biacore, Uppsala, Suécia) e transferiram-se para uma placa de 96 cavidades, a um volume de 150 μΐ por cavidade.

As medições por ressonância plasmónica de superfície foram realizadas em todas as amostras e as células de fluxo foram regeneradas com tampão de acetato entre medições para libertar a proteína ligada (tudo de acordo com protocolos-padrão) .

Os sinais de ligação dos anticorposde de cadeia simples biespecíficos foram obtidos por subtracção do sinal 143 da célula de referência do sinal medido na célula conjugada com a proteina CD3 de 1-27 aa - Fc.

As curvas de associação e de dissociação foram medidos como unidades de resposta e foram registadas. As constantes de ligação foram calculadas utilizando o programa informático de ajustamento da curva da Biacore® com base no modelo de Langmuir. As afinidades calculados para as moléculas de cadeia simples, biespecificas, totalmente especificas para interespécies, com os 1-27 aminoácidos de terminal N da CD3 épsilon humana, são dadas como os valores de KD que se seguem e variam de 2,54xlCT6 M a 2,49xlCT7 M. "LP" refere-se a um arranjo de domínios variáveis na ordem VL-VP. "PL" refere-se a um arranjo de domínios variáveis na ordem VP-VL. G4H, F70, A2J, E1L, E2M, Η 1 E e F6A referem-se a diferentes moléculas de ligação de CD3 específicas de interespécies.

Molécula de anticorpo biespecífico KD (M) EGFR LP x F70 PLP 1, 01xl0“b EGFR LP x A2J PLP 2, 49xl(T' EGFR LP x E2M PLP 2,46x10 EGFR LP x PIE PLP 2,54xl0_b 12. Análise da ligação dos anticorpos biespecificos EGFR e CD3, específicos de interespécies, por citometria de fluxo A fim de ensaiar a funcionalidade dos vecotres de anticorpo biespecifico, específico de interespécies, no que diz respeito à capacidade de ligação a EGFR e a CD3 humana e de cinomolgos, respectivamente, realizou-se uma análise 144 por SCAF. Para este efeito, utilizaram-se as células de OHC transf ectadas com o EGFR humano, tal como descrito no exemplo 8 e a linha celular de leucemia de células T HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) positiva para CD3 humana, para ensaiar a ligação a antigénios humanos. A reactividade de ligação a antigénios de cinomolgos foi ensaiada usando o transfectante de EGFR de cinomolgos gerado descrito no exemplo 9 e uma linha de células T de macaca 4119LnPx (gentilmente cedida pelo Prof Fickenscher, Instituto de Higiene, Virology, Erlangen-Nuernberg, publicada em Knappe A, et al., e H. Fickenscher, Blood 2000, 95, 3256-61). 200.000 Células da respectiva população de células foram incubadas durante 30 min, em gelo, com 50 μΐ da proteína purificada dos vectores de anticorpos biespecíficos específicos de interespécies (2 pg/ml). Alternativamente, utilizou-se o sobrenadante da cultura celular das proteínas produzidas transitoriamente. As células foram lavadas duas vezes em SBF e detectou-se a ligação do vector com um anticorpo Penta His de murino (Qiagen; diluído a 1:20 em 50 μΐ de SBF com FCS a 2 %). Após a lavagem, detectaram-se os anticorpos anti-His com um anticorpo específico de Fc gama (Dianova) conjugado com ficoeritrina, diluído a 1 : 100 em SBF com FCS a 2 %. Utilizou-se um meio de cultura fresco como um controlo negativo. A citometria de fluxo foi realizada num aparelho de SCAF-Calibur, utilizou-se o programa informático CellQuest para a aquisição e a análise de dados (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). A coloração e a medição da intensidade de fluorescência, por SCAF, foram realizadas como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002) . 145 A capacidade de ligação de várias moléculas de cadeia simples bi-especificas, que são especificas para o EGFR e especificas de interespécies a CD3 humanas e de primatas não chimpanzés foi claramente detectável, tal como se mostra na figura 11. Na análise por SCAF, todos os vectores exibiram ligação a CD3 e EGFR em comparação com o meio de cultura e com o primeiro e segundo anticorpos de detecção, como controlos negativos. Demonstrou-se a especificidade do anticorpo bi-especifico interspécies com antigénios de CD3 e EGFR humanos e de cinomolgos. 13. Bioactividade dos anticorpos de cadeia única biespecíficos, específicos das interespécies EGFR e CD3 A bioactividade dos anticorpos de cadeia simples biespecificos gerados foi analisada por meio de ensaios de citotoxicidade da libertação de crómio 51 (51Cr), in vltro, usando as linhas de células positivas de EGFR descritas nos exemplos 8 e 9. Como células efectoras, utilizaram-se, respectivamente, células T positivas estimuladas para CD8 humana ou a linha de células T de macaca 4119LnPx. A geração de células T de CD8+ estimuladas foi realizada como se segue:

Pré-revestiu-se um prato de Petri (145 mm de diâmetro, Greiner) com um anticorpo específico anti-CD3, disponível comercialmente, numa concentração final de 1 pg/ml, durante 1 hora, a 37 °C. A proteína não ligada foi eliminada numa etapa de lavagem com SBF. As CMSP frescas foram isoladas do sangue periférico (30 - 50 ml de sangue humano) por centrifugação em gradiente de Ficoll, de acordo com protocolos-padrão. Adicionou-se 3 - 5 x 107 CMSP ao prato de Petri pré-revestido, em 120 ml de RPMI 1640/FCS a 10 146 %/IL-2 a 20 U/ml (Proleukin, Chiron) e estimulaou-se, durante 2 dias. No terceiro dia, as células foram recolhidas e lavadas uma vez com RPMI 1640. Adicionou-se IL-2 a uma concentração final de 20 U/ml e fez-se a cultura novamente durante um dia. Isolaram-se linfócitos T citotóxicos (LCT, em inglês CTL) CD8 + , por destruição de células T CD4+ e células AN (assassinas naturais, em inglês NK) CD56+.

As células-alvo foram lavadas duas vezes com SBF e marcadas com 11,1 MBq de 51Cr num volume final de 100 μΐ de RPMI com 50 % de FCS, durante 45 minutos, a 37 °C. Subsequentemente, as células-alvo marcadas foram lavadas 3 vezes com 5 ml de meio RPMI e depois usadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi realizado numa placa de 96 poços num volume total de 250 μΐ de RPMI completado (tal como antes) numa proporção de E : T de 10:1. Aplicou-se então 1 pg/ml das moléculas de anticorpos de cadeia única biespecificos, específicos de interespécies e fizeram-se 20 diluições tríplices. Alternativamente, diluiu-se, em série, o sobrenadante da cultura de células de proteínas produzidas transitoriamente nas etapas 1:2.0 tempo de ensaio é de 18 horas e a citotoxicidade foi medida como valores relativos de crómio libertado no sobrenadante em relação à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e à lise espontânea (sem células efectoras). Todas as medições foram realizadas em quadruplicado. A medição da actividade do crómio nos sobrenadantes foi realizada com um contador de gama Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Kõln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi realizada com o Prism 4 para Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas sigmoidais de resposta à dose normalmente tinham valores de R2 > 0,90, conforme determinado pelo programa informático. Os valores 147 de CE50, calculados pelo programa de análise, foram utilizados para comparação da bioactividade.

Como se mostra nas figuras 12 e 13, todos os vectores gerados de anticorpo de cadeia única, biespecifico, especifico de interespécies, revelaram uma actividade citotóxica contra células-alvo humanos positivas para EGFR, provocada por células CD8+ humanas e células-alvo positivas para EGFR de cinomolgos provocada pela linha de células T de macaca 4119LnPx. Utilizou-se um anticorpo biespecifico de cadeia simples com diferentes especificidades-alvo como controle negativo. 14. Clonagem e expressão dos domínios extracelulares truncados e transmembranar do terminal C de CMSP humanas A sequência de codificação do domínio extracelular truncado e transmembranar de terminal C das MCSP humanas (aminoácidos 1538-2322) foi obtida por síntese de genes de acordo com protocolos-padrão (sequência de ADNc) e a sequência de aminoácidos do vector recombinante para a expressão do domínio extracelular truncado e transmembranar de terminal C de MCSP humanas (designado como D3 humano) estão listados nas SEQ ID NOs 374 e 373) . 0 fragmento de síntese de genes foi concebido de forma a conter um primeiro sítio de Kozak para permitir a expressão eucariótica do vector seguido pela sequência de codificação de um péptido líder de imunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido, na estrutura, por um marcador FLAG, seguido, na estrutura, por uma sequência que contêm vários sítios de restrição para fins de clonagem e de codificação para um ligante artificial de 9 aminoácidos (SRTRSGSQL), seguida, na estrutura, pela sequência de codificação do do domínio extracelular truncado e transmembranar de terminal C de 148 MCSP humanas, terminal transmembranar e domínio extracelular truncado de MCSP humanas e um codão de terminação. Os sítios de restrição foram introduzidos no início e no final do fragmento de ADN. Os sítios de restrição EcoRI na extremidade 5 'e Sall na extremidade 3', foram utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. 0 fragmento foi digerido com EcoRI e Sall e clonado em pEF-DHFR (pEF-DHFR está descrito em Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92 (1995) 7021-7025) seguindo protocolos-padrão. Um plasmido de sequência verificada foi usado para transfectar células de OHC/dhfr- (ATCC No. CRL 9096) . As células foram postas em cultura em meio RPMI 1640 com glutamina estabilizada, com um suplemento de FCS a 10 %, 1% de penicilina/estreptomicina (todos obtidos na Biochrom AG de Berlim, Alemanha) e nucleósidos de uma solução concentrada de reagentes de grau de cultura de células (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) até a uma concentração final de 10 pg/ml de adenosina, 10 pg/ml desoxiadenosina e 10 pg/ml de timidina, numa incubadora, a 37 °C, a 95 % de humidade e a 7 % de CO2. A transfecção foi realizada com o reagente de transfecção PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) e 5 pg de ADN de plasmido, de acordo com o protocolo do fabricante. Após uma cultura de 24 horas, lavaram-se as células uma vez com SBF e fez-se novamente uma cultura em meio RPMI 1640 com glutamina estabilizada e 1 % de penicilina/estreptomicina. Assim, o meio de cultura celular não contém nucleósidos e assim a selecção foi aplicada às células transfectadas. Aproximadamente 14 dias após a transfecção, observou-se o crescimento de células resistentes. Após mais 7 a 14 dias, os transfectantes foram ensaiados quanto à expressão do vector por análise de SCAF. Incubaram-se 2,5 x 105 células com 50 μΐ de um anticorpo M2 anti-Flag (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) , diluído a 5 pg/ml em 149 SBF com FCS a 2 %. A ligação do anticorpo foi detectada com um fragmento F(ab')2 purificado por afinidade, conjugado com R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-murganho, fragmento de Fc gama especifico, diluído a 1 : 100 em SBF com FCS a 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Mediram-se as amostras num FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, RFA). 15. Clonagem e expressão dos domínios extracelulares truncados e transmembranares do terminal C de CMSP de macaca A sequência de ADNc dos domínios extracelular e transmembranar de terminal C de CMSP de macaca (designada como D3 de mcaca) foi obtida por um conjunto de três RCP em ADNc da pele de macaca (No. Cat. C1534218-Cy-BC; BIOCAT GmbH, Heidelberg, Alemanha) usando as condições de reacção que se seguem: 1 ciclo a 94 °C, 3 min., 40 ciclos a 94 °C durante 0,5 min., 52 °C durante 0,5 min. e 72 °C durante 1,75 min., ciclo terminal a 72 °C durante 3 min. Utilizaram-se os iniciadores que se seguem:

Iniciador Iniciador Iniciador Iniciador Iniciador Iniciador dianteiro: 5'-GATCTGGTCTACACCATCGAGC-3' inverso: 5'-GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG-3' dianteiro: 5'- TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG-3' inverso: 5'- CGATCAGCATCTGGGCCCAGG-3' dianteiro: 5'- GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC-3' inverso: 5'- GCCTTCACACCCAGTACTGGCC-3'

Essas reações de RCP geraram três fragmentos que se sobrepõem (A: 1-1329, B: 1229-2428, C: 1782-2547) que foram isolados e sequenciados de acordo com protocolos convencionais, utilizando os iniciadores de RCP e, assim, providenciaram uma porção de 2547 pb da sequência de ADNc 150 de CMSP de macaca (a sequência de ADNc e a sequência de aminoácidos desta porção de CMSP de macaca estão listadas nas SEQ ID NOs 376 e 375) a partir de 74 pb a montante da sequência de codificação do dominio de terminal C até 121 pb a jusante do codão de terminação. Outra RCP usando as condições de reacção que se seguem: utilizou-se 1 ciclo a 94 °C durante 3 min, 10 ciclos a 94 °C durante 1 min, 52 °C durante 1 min e 72 °C durante 2,5 min, ciclo terminal a 72 °C durante 3 min para fundir os produtos de RCP das reacções A e B mencionadas antes. Utilizaram-se os seguintes iniciadores:

Iniciador dianteiro: 5'-tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg-3'

Iniciador inverso: 5'-agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg-3'

Os iniciadores para esta RCP foram concebidos para introduzir sítios de restrição no início e no final do fragmento de ADNc que codifica para os domínios extracelular truncado e transmembranar de terminal C de CMSP de macaca. Os sítios de restrição introduzidos, Mfel na extremidade 5' e Sall na extremidade 3', foram utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. 0 fragmento de RCP foi então clonado através de Mfel e Sall num plasmido Bluescript contendo o fragmento de EcoRI/Mfel do plasmido pEF-DHFR mencionado antes (pEF-DHFR está descrito em Raum et al. Câncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) por substituição dos domínios extracelular truncado e transmembranar de terminal C de CMSP humanas. O fragmento de síntese de genes continha as sequências de codificação do péptido líder da imunoglobulina e o marcador Flag, bem como o ligante artificial (SRTRSGSQL) na estrutura com a extremidade 5' do fragmento de ADNc que 151 codifica para os domínios extracelular truncado e transmembranar de terminal C de CMSP de macaca. Este vector foi usado para transfectar células de OHC/dhfr- (ATCC No. CRL 9096). As células foram postas em cultura em meio RPMI 1640 com glutamina estabilizada, com um suplemento de FCS a 10 %, 1% de penicilina/estreptomicina (todos obtidos na Biochrom AG de Berlim, Alemanha) e os nucleósidos a partir de uma solução concentrada de reagentes de grau de cultura de células (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) até a uma concentração final de 10 pg/ml de adenosina, 10 pg/ml de desoxiadenosina e 10 pg/ml de timidina, numa incubadora, a 37 °C, a 95 % de humidade e a 7 % de CO2. A transfecção foi realizada com o reagente de transfecção PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) e 5 pg de ADN de plasmido, de acordo com o protocolo do fabricante. Após uma cultura, durante 24 horas, lavaram-se as células uma vez com SBF e fez-se novamente uma cultura em meio RPMI 1640 com glutamina estabilizada e 1 % de penicilina/estreptomicina. Assim, o meio de cultura celular não continha nucleósidos e assim a selecção foi aplicada às células transfectadas. Aproximadamente 14 dias após a transfecção, observa-se o crescimento de células resistentes. Após mais 7 a 14 dias, os transfectantes foram ensaiados quanto à expressão do vector recombinante por análise por SCAF. Incubaram-se 2,5 x 105 células com 50 μΐ de um anticorpo M2 anti-Flag (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) , diluído a 5 pg/ml em SBF com FCS a 2 %. 0 anticorpo ligado foi detectado com um fragmento F(ab')2, purificado por afinidade, conjugado com R-ficoeritrina, IgG de cabra anti-murganho, fragmento de Fc gama específico diluído a 1 : 100 em SBF com FCS a 2 % (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, RU). Mediram-se as amostras foram num FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, RFA). 152 16. Geração e caracterização de moléculas de cadeia única biespecificas, de CMSP e CD3 específicas interespécies

Conceberam-se moléculas de anticorpo de cadeia simples, biespecificas, compreendendo, cada uma, um domínio de ligação interespécies específico para CD3 épsilon humana e de primatas não chimpanzés, bem como um domínio de ligação específico interespécies para CMSP humanas e de primatas não chimpanzés, tal como estabelecido no quadro 2 que se segue:

Quadro 2: Formatos de anticorpos de cadeia única biespecificos, de CMSP e CD3 específicos interespécies

SEQ ID (nucl/prot) Formatos das estruturas de proteína (N -> C) 310/309 CMSP-G4 PL x P2C PL 312/311 CMSP-G4 PL x F12Q PL 314/313 CMSP-G4 PL x 12C PL 316/315 CMSP-G4 PLP x F6A PLP 318/317 CMSP-G4 PLP x P2C PLP 322/321 MCSO-G4 PLP x G4P PLP 326/325 CMSP-G4 PLP x EI L PLP 328/327 CMSP-G4 PLP x E2M PLP 332/331 CMSP-G4 PLP x F12Q PL 334/333 CMSP-G4 PLP x I2C PL 336/335 CMSP-D2 PL x P2C PL 338/337 CMSP-D2 PL x F12Q PL 340/339 CMSP-D2 PL x I2C PL 342/341 CMSP-D2 PLP x P2C PLP 344/343 CMSP-F9 PL x P2C PL 346/345 CMSP-F9 PLP x P2C PLP 348/347 CMSP-F9 PLP x G4P PLP

As estruturas mencionadas antes, contendo os domínios variável de cadeia pesada (VP) e variável de cadeia leve 153 (VL) específicos interespécies para as CMSP e D3 humanas e de macaca e os domínios VP e VL específicos interespécies para CD3 humana e de macaca foram obtidos por síntese de genes. Os fragmentos de síntese de genes foram concebidos de forma a conter um primeiro sítio de Kozak para a expressão eucariótica do vector, seguido de um péptido líder da imunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido, na estrutura, pela sequência de codificação da correspondente molécula de anticorpo biespecífico de cadeia simples, seguida, na estrutura, pela sequência de codificação de um marcador de histidina6 e um codão de terminação. 0 fragmento da síntese de genes foi também concebido para introduzir os sítios de restrição adequados no terminal N e no terminal C. 0 fragmento de síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição num plasmido designado por pEF-DHFR (o pEF-DHFR está descrito em Raum et al. Câncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acordo com protocolos-padrão (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)) . Os vectores foram transfectados, de forma estável ou transiente para células de OHC deficientes em DHFR (ATCC No. CRL 9096) por electroporação ou, alternativamente, para células REH 293 (células de rim embrionário humano, número: CRL-1573) de forma transiente, de acordo com protocolos-padrão . A expressão da proteína eucariótica, em células de OHC deficientes em DHFR, foi efectuada tal como descrito por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação do gene dos vectores foi induzida por adição de concentrações crescentes de metotrexato (MTX) até a uma concentração final de 20 nM de MTX. Após duas passagens da cultura estacionária, as células cresceram em frascos 154 rolantes com um meio líquido de soja PF CHO HyQ isento de nucleósidos (com L-glutamina 4,0 mM com Pluronic F -68 a 0,1 %; HyClone) durante 7 dias, antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína expressa são armazenadas a -20 °C. 0 sistema de exploração Ákta® (GE Health Systems) e o programa informático Unicom® foram utilizados para a cromatografia. A cromatografia por afinidade com metal imobilizado ("CAMI") foi realizada utilizando um quelato Fractogel EMD® (Merck), que foi carregado com ZnCl2, de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com tampão A (tampão de fosfato de sódio 20 mM, a pH 7,2, NaCl 0,1 M) e o sobrenadante da cultura celular (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma velocidade de fluxo de 3 ml/min. A coluna foi lavada com tampão A para remover a amostra não ligada. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente, em duas etapas, de tampão B (tampão de fosfato de sódio 20 mM, a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M), de acordo com o seguinte:

Etapa 1: tampão B a 20 % em 6 volumes de coluna Etapa 2: tampão B a 100 % em 6 volumes de coluna

Combinaram-se as fracções proteicas eluídas na etapa 2 para posterior purificação. Todos os produtos químicos são de grau de investigação e foram adquiridos à Sigma (Deisenhofen) ou à Merck (Darmstadt). A cromatografia de filtração em gel foi realizada numa coluna prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com tampão Equi (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol a 5 %, a pH 7,2). As amostras de proteínas eluídas (velocidade de fluxo de 1 ml/min) foram submetidas a SDS- 155 PAGE e a Western Blot normalizadas, para detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (estojo de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas usando uma DO de 280 nm. A proteína purificada do anticorpo biespecífico de cadeia simples foi analisada por SDS-PAGE em condições redutoras realizadas com um pré-molde de géis de Bis Tris a 4-12 % (Invitrogen). A preparação da amostra e a aplicação foram feitas de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. O peso molecular foi determinado com um padrão de proteína Multimark (Invitrogen). O gel foi corado com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada é > 95 %, tal como determinado por SDS-PAGE . O anticorpo biespecífico de cadeia simples tem um peso molecular de cerca de 52 kDa, em condições naturais, conforme determinado por filtração em gel em solução salina tamponada com fosfato (STF). Todos os vectores foram purificados de acordo com este processo. A análise por Western Blot foi realizada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e o Módulo Blot da Invitrogen, de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Para a detecção dos anticorpos de proteína de um anticorpo biespecífico de cadeia simples, utilizou-se um anticorpo de marcador anti-His (Penta His, Qiagen). Um anticorpo Ig de cabra anti-rato marcado com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) foi utilizado como anticorpo secundário e BCIP/NBT (Sigma) como substrato. Detectou-se uma única banda a 52 kD correspondente ao anticorpo biespecífico de cadeia simples purificado. 156

Alternativamente, os vectores foram transitoriamente expressos em células de OHC deficientes em DHFR. Em resumo, fez-se uma cultura de 4 x 105 células em 3 ml de meio RPMI 1640 sendo todo o meio estabilizado com glutamina, com um suplemento de soro bovino fetal a 10 %, 1 % de penicilina/estreptomicina e os nucleósidos de uma solução concentrada de reagentes de grau de cultura de células (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) até a uma concentração final de 10 pg/ml de adenosina, 10 pg/ml de desoxiadenosina e 10 pg/ml de timidina, numa incubadora, a 37 °C, a 95 % de humidade e a 7 % de CO2, um dia antes da transfecção. A transfecção foi realizada com o reagente de transfecção Fugene 6 (Roche, # 11815091001) de acordo com o protocolo do fabricante. Mistura-se 94 μΐ de meio OptiMEM (Invitrogen) e 6 μΐ de Fugene 6 e faz-se a incubação, durante 5 minutos, à temperatura ambiente. Subsequentemente, adiciona-se 1,5 pg de ADN por vector, mistura-se e faz-se a incubação, durante 15 minutos, à temperatura ambiente. Ao mesmo tempo, as células de OHC deficientes em DHFR foram lavadas com 1 x SBF e novamente suspensas em 1, 5 ml de meio RPMI 1640. A mistura de transfecção foi diluída com 600 μΐ de meio RPMI 1640, adicionou-se às células e incubou-se durante a noite, a 37 °C, a 95 % de humidade e a 7 % de CO2. No dia a seguir à transfecção, aumentou-se cada volume de incubação para 5 ml de meio RPMI 1640. Recolheu-se o sobrenadante após 3 dias de incubação. 17. Análise da ligação dos anticorpos biespecificos de CMSP e CD3, específicos interespécies, por citometria de fluxo A fim de ensaiar a funcionalidade dos vectores de anticorpo biespecífico, específico interespécies, no que diz respeito à capacidade de ligação a CMSP e CD3 humana e 157 de macaca, respectivamente, realizou-se uma análise por SCAF. Para este efeito, utilizaram-se as células de OHC transfectadas com o CMSP D3 de humanas, (tal como descrito no exemplo 14) e a linha celular de leucemia de células T HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) positiva para CD3 humana, para ensaiar a ligação a antigénios humanos. A reactividade da ligação a antigénios de macacas foi ensaiada usando o transfectante D3 de CMSP de macaca gerado (descrito no exemplo 15) e uma linha de células T de macaca, 4119LnPx (gentilmente cedidos pelo Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; publicada em Knappe A, et al., e Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Incubaram-se 200.000 células das linhas celulares respectivas, durante 30 min, em gelo, com 50 μΐ da proteína purificada dos vectores de anticorpo biespecífico, específico interespécies (2 pg/ml) ou o sobrenadante de cultura celular de células transfectadas expressando as estruturas de anticorpo biespecífico, específico interespécies. As células foram lavadas duas vezes em SBF com FCS a 2 % e detectou-se a ligação do vector com um anticorpo anti-His de murino (anticorpo Penta His Qiagen; diluído a 1:20 em 50 μΐ de SBF com FCS a 2 %). Após a lavagem, detectaram-se os anticorpos anti-His com um anticorpo específico de Fc gama (Dianova) conjugado com ficoeritrina, diluído a 1 : 100 em SBF com FCS a 2 %. Utilizou-se o sobrenadante de células de OHC não transfectadas como controlo negativo para a ligação às linhas de células T. Utilizou-se um vector de cadeia única, com uma especificidade-alvo irrelevante, como controlo negativo, para a ligação às células de OHC transfectadas com as CMSP-D3.

Realizou-se uma citometria de fluxo num aparelho de SCAF-Calibur; utilizou-se o programa informático CellQuest 158 para a aquisição e a análise de dados (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). A coloração e a medição da intensidade de fluorescência, por SCAF, foram realizadas tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002). A ligação biespecifica das moléculas de cadeia simples enumeradas antes, que são especificas para interespécies para as CMSP D3 e especificas para interespécies para CD3 humana e de macaca foi claramente detectável, como se mostra nas figuras 14, 15, 16 e 58. Na análise por SCAF todos os vectores mostraram a ligação a CD3 e D3 de CMSP em comparação com os respectivos controlos negativos. Demonstrou-se a especificidade interespécies dos anticorpos bi-especificos para os antigénios de CD3 de macaca e D3 de CMSP humanas e de macaca. 18. Boactividade dos anticorpos de cadeia única biespecificos, de CMSP e CD3 específicos interespécies

Como se mostra nas figuras 17 a 21, todos os vectores gerados de anticorpo de cadeia única, biespecificos, específico interespécies, revelaram uma actividade citotóxica contra células-alvo humanos positivas para CMSP, provocada por células CD8+ humanas e células-alvo positivas para CMSP de cinomolgos, provocada pela linha de células T de macaca 4119LnPx. Utiliza-se um anticorpo biespecífico de cadeia simples com diferentes especificidades-alvo como controlo negativo. 159 19. Estabilidade no plasma dos anticorpos de cadeia única biespecíficos, de CMSP e CD3 específicos interespécies

Analisou-se a estabilidade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos gerados por incubação dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos, em plasma humano a 50 %, a 37 °C e a 4 °C, durante 24 horas e fez-se o subsequente ensaio de bioactividade. A bioactividade foi estudada num ensaio de citotoxicidade de libertação de crómio 51 (51Cr) in vitro utilizando uma linha de células de OHC positivas para CMSP (CMSP expressas como clonadas, de acordo com o exemplo 14 ou 15) como um alvo e células T estimuladas positivas para CD8 humanas, como células efectoras.

Os valores de CE50 calculados pelo programa de análise, tal como descrito antes, são utilizados para comparação da bioactividade de anticorpos de cadeia simples biespecíficos incubados com 50 % de plasma humano durante 24 horas, a 37 °C e a 4 °C, respectivamente com os anticorpos de cadeia simples biespecíficos, sem adição de plasma ou misturados com a mesma quantidade de plasma imediatamente antes do ensaio.

Tal como se mostra na figura 22 e no quadro 3, a bioactividade dos anticorpos biespecíficos G4 P-L x I2C P-L, G4 P-L x P2C P-L e G4 P-L x F12Q P-L não foi significativamente reduzida quando comparada com os controlos sem a adição de plasma ou com a adição de plasma, imediatamente antes do ensaio da bioactividade.

Quadro 3: bioactividade dos anticorpos biespecíficos com ou sem a adição de plasma

Estrutura Sem plasma Com plasma Plasma a 37 °C Plasma a 4°C G4 P-L x I2C P-L 300 796 902 867 160 G4 P-L x P2C P-L 496 575 2363 1449 G4 P-L x F12Q P-L 493 358 20. Geração de moléculas de cadeia única biespecificas, de EGFR e de CD3 humanas especificas interespécies

Conceberam-se moléculas de anticorpo de cadeia simples, biespecificas, com um domínio de ligação interespécies específica para CD3 humana e de cinomolgos, bem como um domínio de ligação interespécies específico para EGFR humana, tal como estabelecido no quadro 4 que se segue:

Quadro 4: Formatos de anticorpos de cadeia única biespecíficos, de EGFR e CD3, específicos interespécies

SEQ ID (nucl/prot) Formatos das estruturas de proteína (N -> C) 390/389 EGFR P-L x 12C P L 392/391 EGFR P-L x 12C P L 394/393 EGFR P-L x F12Q P L 396/395 EGFR L-P x F12Q P L 398/397 EGFR P-L x P2C P L 4 00/399 EGFR L-P x P2C P L 448/447 EGFR PL x P2C PL 450/449 EGFR PL x F12Q LP 452/451 EGFR PL x 12C PL

Os vectores mencionados antes, contendo os domínios variável de cadeia leve (L) e variáveis da cadeia pesada (P) específicos interespécies para EGFR humana e de 161 cinomolgos, foram obtidos por síntese de genes. Os fragmentos de síntese de genes foram concebidos de forma a conter um primeiro sítio de Kozak para a expressão do vector eucariótico, seguido de um péptido líder da imunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido, na estrutura, pela sequência de codificação da correspondente molécula de anticorpo biespecífico de cadeia simples, seguida, na estrutura, pela sequência de codificação de um marcador de 6-histidina e um codão de terminação. 0 fragmento de síntese de genes foi concebido para introduzir os sítios de restrição adequados no terminal N e no terminal C. 0 fragmento de síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição num plasmido designado por pEF-DHFR (pEF-DHFR está descrito em Raum et al. Câncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acordo com protocolos-padrão (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Os vectores foram transfectadas de forma estável em células de OHC deficientes em DHFR (ATCC No. CRL 9096), bem como produzidos e purificados tal como descrito no exemplo 10. 21. Geração de moléculas de cadeia única biespecíficas, de EGFR e de CD3 especificas interespécies

Conceberam-se moléculas de anticorpo de cadeia simples, biespecíficas, com um domínio de ligação de interespécies específico para CD3 humana e de cinomolgos, bem como um domínio de ligação interespécies específico para EGFR humano, como estabelecido no quadro 5 que se segue: 162

Quadro 5: Formatos de anticorpos de cadeia única biespecíficos, de EGFR e CD3, específicos interespécies

SEQ ID (nucl/prot) Formatos de estruturas de proteínas (N -► C) 410/4099 EGFR P-L x 12C P L 412/411 EGFR L-P x 12C P L 414/413 EGFR P-L x F12Q P L 416/415 EGFR L-P x F12Q P L 418/417 EGFR P-L x P2C P L 420/419 EGFR L-P x P2C P L

Os vectores mencionados antes, contendo os domínios variável de cadeia leve (L) e variável da cadeia pesada (P) interespécies específicos para o EGFR humano e de cinomolgos, foram obtidos por síntese de genes. Os fragmentos de síntese de genes foram concebidos de forma a conter um primeiro sítio de Kozak para a expressão eucariótica do vector, seguido de um péptido líder de imunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido, na estrutura, da sequência de codificação da correspondente molécula de anticorpo biespecífico de cadeia simples, seguida, na estrutura, pela sequência de codificação de um marcador de 6-histidina e um codão de terminação. 0 fragmento de síntese de genes foi concebido para introduzir os sítios de restrição adequados no terminal N e no terminal C. 0 fragmento de síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição num plasmido designado por pEF-DHFR (pEF-DHFR está descrito em Raum et al. Câncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acordo com protocolos-padrão (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Os vectores foram transfectados de forma estável em células de 163 OHC deficientes em DHFR (ATCC No. CRL 9096), bem como produzidas e purificadas tal como descrito no exemplo 10. 22. Geração de moléculas de cadeia única biespecificas, de Her2/neu and CD3 humanas específicas interespécies

Conceberam-se moléculas de anticorpo de cadeia simples, biespecificas, com um domínio de ligação interespécies específico para CD3 humana e de cinomolgos, bem como um domínio de ligação interespécies específico para Her2/neu humano, como estabelecido no quadro 6 que se segue:

Quadro 6: Formatos de anticorpos de cadeia única biespecíficos, Her2/neu e CD3 específicos interespécies

SEQ ID (nucl/prot) Formatos das estruturas de proteína (N -> C) 430/439 PER2/neu VP-VL x I2C VP VL 432/431 PER2/neu VL-VP x I2C VP VL 434/433 PER2/neu VP-VL x F12Q VP VL 436/435 PER2/neu VL-VP x F12Q VP VL 438/437 PER2/neu VP-VL x P2C VP VL 440/439 PER2/neu VL-VP x P2C VP VL

Os vectores mencionados antes, contendo os domínios variável de cadeia leve (L) e variável da cadeia pesada (P) interespécies, específicos para HER2/neu humano e de cinomolgos, foram obtidas por síntese de genes. Os fragmentos de síntese de genes foram concebidos de forma a conter um primeiro sítio de Kozak para a expressão eucariótica do vector, seguido de um péptido líder da imunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido, na estrutura, pela sequência de codificação da correspondente molécula de 164 anticorpo biespecífico de cadeia simples, seguida, na estrutura, pela sequência de codificação de um marcador de 6-histidina e um codão de terminação. 0 fragmento de síntese de genes foi concebido para introduzir os sítios de restrição adequados no terminal N e no terminal C. 0 fragmento de síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição num plasmido designado por pEF-DHFR (pEF-DHFR está descrito em Raum et al. Câncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acordo com protocolos-padrão (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)) . Os vectores foram transfectadas de forma estável em células de OHC deficientes em DHFR (ATCC No. CRL 9096), bem como produzidos e purificados tal como descrito no exemplo 10. 23.1. Geração de células de OHC que expressam HER2 humana A sequência de codificação de HER2 humana, tal como publicada no GenBank (número de acesso X03363) é obtida por síntese de genes de acordo com protocolos-padrão. O fragmento da síntese de genes é concebido de modo a conter a sequência de codificação da proteína humana HER2, incluindo o seu péptido líder (o ADNc e a sequência de aminoácidos do vector estão listados nas SEQ ID Nos 459 e 460). O fragmento de síntese de genes é também concebido de modo a introduzir os sítios de restrição no início e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos, Xbal na extremidade 5' e Sall na extremidade 3', são utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. O fragmento de síntese de genes é clonado através de Xbal e Sall num plasmido designado por pEFDHFR (pEFDHFR está descrito em Raum et al. Câncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo 165 protocolos-padrão. Os procedimentos mencionados antes são realizados de acordo com protocolos-padrão (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Um clone com a seguência de nucleótidos verificada é transfectado em células de OHC deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do vector. A expressão da proteína eucariótica, em células de OHC deficientes em DHFR, é efectuada tal como descrito por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação do gene do vector é induzida por concentrações crescentes de metotrexato (MTX) até a uma concentração final de MTX até 2 0 nM. 23.2. Geração de células de OHC expressando o domínio extracelular de Her2 de macaca A sequência de codificação de Her2 humana, tal como descrita antes, é modificada para codificar os aminoácidos 123 a 1038 da proteína Her2 de macaca, tal como publicada no GenBank (número de acesso XP_001090430). A sequência que codifica para esta proteína quimérica é obtida por síntese de genes de acordo com protocolos-padrão (o ADNc e a sequência de aminoácidos do vector estão listados nas SEQ ID Nos 461 e 462) . O fragmento de síntese de genes é concebido também de forma a conter um local de Kozak para a expressão eucariótica do vector e sítios de restrição no início e no final do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos, Xbal na extremidade 5' e Sall na extremidade 3', são utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. O fragmento de síntese de genes é então clonado através de Xbal e Sall num plasmido designado por pEFDHFR (pEFDHFR está descrito em Raum et al. (Câncer Immunol. Immunother. 50 (2001), 141 - 150). Um clone de sequência verificada 166 deste plasmido é usado para transfectar células OHC/dhfr, como descrito antes. 23.3. Geração das moléculas de cadeia única biespecificas HER2 e CD3, especificas interespécies 3.1. Clonagem de moléculas de ligação especificas interespécies

Em geral, as moléculas de anticorpo de cadeia simples, biespecificas, compreendendo, cada uma, uma especificidade de ligação interespécies especifica para CD3 épsilon humana e de macaca, bem como um domínio com uma especificidade de ligação interespécies específico para HER2 humana e de macaca, foram concebidas como estabelecido no quadro 7 que se segue:

Quadro 7: Formatos de moléculas de anticorpos de cadeia única biespecificos, anti-CD3 e anti-HER2 específicos interespécies

SEQ ID (nucl/prot) Formatos das estruturas de proteína (N -► C) 432 / 431 Per2 LP x 12C PL 436 / 435 Per2 LP x F12Q PL 440 / 439 Per2 LP x P2C PL 430 / 429 Per2 PL x I2C PL 434 / 433 Per2 PL x F12Q PL 438 / 437 Per2 PL x P2C PL 480 / 479 I2C PL x Per2 LP 478 / 477 F12Q PL x Per2 LP 476 / 475 P2C PL x Per2 LP

Os vectores mencionados antes, contendo os domínios variável de cadeia leve (L) e variável de cadeia pesada (P) interespécies, específicos para HER2 e CD3 humanas e as 167 combinações de VP e VL interespécies, específicos para CD3 humana e de macaca foram obtidos por síntese de genes. Os fragmentos de síntese de genes são concebidos de forma a conter um primeiro sítio de Kozak para a expressão eucariótica do vector, seguido de um péptido líder de imunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido, na estrutura, pela sequência de codificação da correspondente molécula de anticorpo biespecífico de cadeia simples, seguida, na estrutura, pela sequência de codificação de um marcador de 6-histidina e um codão de terminação. 0 fragmento de síntese de genes é também concebido de modo a introduzir os sítios de restrição apropriados no início e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos são utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. 0 fragmento de síntese de genes é clonado através de sítios de restrição num plasmido designado por pEFDHFR (pEFDHFR está descrito em Raum et al. Câncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo protocolos-padrão. Os procedimentos mencionados antes são realizados de acordo com protocolos-padrão (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Um clone com a sequência de nucleótidos de sequência verificada é transfectado em células de OHC deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do vector. A expressão da proteína eucariótica, em células de OHC deficientes em DHFR, é efectuada tal como descrito por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação do gene do vector é induzida por concentrações crescentes de metotrexato (MTX) até a uma concentração final de MTX até 20 nM. 3.2. Expressão e purificação das moléculas de anticorpo biespecifico de cadeia simples 168

As moléculas de anticorpos biespecíficos de cadeia simples são expressas em células de ovário de hamster chinês (OHC). A expressão da proteína eucariótica, em células de OHC deficientes em DHFR, é efectuada tal como descrito por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do vector é induzida por adição de concentrações crescentes de MTX até a uma concentração final de MTX de 20 nM. Após duas passagens de cultura estacionária, as células crescem em frascos rolantes com um meio líquido de soja PF CHO HyQ isento de nucleósidos (com L-glutamina 4,0 mM com Pluronic F -68 a 0,1 %; HyClone) durante 7 dias antes da colheita. As células são removidas por centrifugação e o sobrenadante, contendo a proteína expressa, é armazenado à temperatura de -80 °C. A transfecção é realizada com o reagente de 293fectin (Invitrogen, # 12347-019) de acordo com o protocolo do fabricante. O sistema de exploração Akta® (GE Health Systems) e o programa informático Unicom® são utilizados para a cromatografia. A cromatografia por afinidade com metal imobilizado ("CAMI", em inglês IMAC) é realizada utilizando um quelato Fractogel EMD® (Merck), que é carregado com ZnCl2, de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. A coluna é equilibrada com tampão A (tampão de fosfato de sódio 20 mM, a pH 7,2, NaCl 0,1 M) e o sobrenadante da cultura celular (500 ml) é aplicado à coluna (10 ml) a uma velocidade de fluxo de 3 ml/min. A coluna é lavada com tampão A para remover a amostra não ligada. A proteína ligada é eluída utilizando um gradiente, em duas etapas, de tampão B (tampão de fosfato de sódio 20 mM, a pH 7,2, NaCl 0,1 M, imidazol 0,5 M), de acordo com o seguinte: 169 em 6 volumes de coluna

Etapa 1: tampao B a 20 %

Etapa 2: tampão B a 100 % em 6 volumes de coluna

Combinam-se as fracções proteicas eluidas da etapa 2 para posterior purificação. Todos os produtos químicos são de grau de investigação e foram adquiridos à Sigma (Deisenhofen) ou à Merck (Darmstadt). A cromatografia de filtração em gel é realizada numa coluna prep HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com tampão Equi (citrato 25 mM, lisina 200 mM, glicerol a 5 %, a pH 7,2). As amostras de proteínas eluidas (velocidade de fluxo de 1 ml/min) são submetidas a SDS-PAGE e a Western Blot normalizadas para detecção. Antes da purificação, a coluna é calibrada para a determinação do peso molecular (estojo de marcador de peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína são determinadas usando uma DO de 280 nm. A proteína purificada do anticorpo biespecífico de cadeia simples é analisada por SDS-PAGE em condições redutoras realizadas com um pré-molde de géis de Bis Tris a 4-12 % (Invitrogen). A preparação da amostra e a aplicação são feitas de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. 0 peso molecular é determinado com o padrão de proteína Multimark (Invitrogen). O gel é corado com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen) . A pureza da proteína isolada é > 95 %, tal como determinado por SDS-PAGE . O anticorpo biespecífico de cadeia simples tem um peso molecular de cerca de 52 kDa, em condições naturais, conforme determinado por filtração em gel em SBF. Todos os vectores são purificados de acordo com este processo. 170 A análise por Western Blot é realizada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e o Módulo Blot da Invitrogen, de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Para a detecção dos anticorpos da proteína de um anticorpo biespecífico de cadeia simples, utiliza-se um anticorpo de marcador anti-His (Penta His, Qiagen). Um anticorpo Ig de cabra anti-rato marcado com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) é utilizado como anticorpo secundário e BCIP/NBT (Sigma) como substrato. Detecta-se uma única banda a 52 kD correspondente ao anticorpo biespecífico de cadeia simples purificado. 23.4, Análise da ligação, por citometria de fluxo, dos anticorpos biespecíficos HER2 e CD3 específicos interespécies A fim de ensaiar a funcionalidade dos vectores de anticorpo biespecífico, específico interespécies, no que diz respeito à capacidade de ligação a HER2 e CD3 humana e de macaca, respectivamente, realiza-se uma análise por SCAF. Para este efeito, utilizaram-se as células de OHC transf ectadas com a HER2 humana, tal como descrito no exemplo 23.1 e a linha celular de leucemia de células T HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) positiva para CD3 humana para ensaiar a ligação a antigénios humanos. A reactividade de ligação a antigénios de macacas é ensaiada usando o transfectante de HER2 de macaca gerado (descrito no exemplo 23.2) e uma linha de células T de macaca, 4119LnPx (gentilmente cedida pelo Prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; publicada em Knappe A, et al., e Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Faz-se a incubação de 200.000 células das linhas celulares respectivas, durante 30 min, em gelo, com 50 μΐ da proteína purificada dos vectores de anticorpo 171 biespecífico, específico interespécies (2 pg/ml). Lavam-se as células duas vezes em SBF com FCS a 2 % e detecta-se a ligação do vector com um anticorpo anti-His de murino (anticorpo Penta His Qiagen; diluído a 1:20 em 50 μΐ de SBF com FCS a 2 %) . Após a lavagem, detectam-se os anticorpos anti-His com um anticorpo específico de Fc gama (Dianova) conjugado com ficoeritrina, diluído a 1 : 100 em SBF com FCS a 2 %. Utiliza-se SBF com FCS a 2 % como controlo negativo para a ligação às linhas de células T, bem como com as células de OHC transfectadas de HER2.

Realiza-se uma citometria de fluxo num aparelho de SCAF-Calibur; utiliza-se o programa informático CellQuest para a aquisição e a análise de dados (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). A coloração e a medição da intensidade de fluorescência, por SCAF, são realizadas como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002). A ligação biespecífica das moléculas de cadeia simples enumeradas antes, que é específica interespécies para HER2 e específicas interespécies para CD3 humana e de primata não chimpanzé foi claramente detectável, como se mostra na figura 23. Na análise por SCAF todos os vectores mostraram a ligação a CD3 e a HER2 em comparação com os respectivos controlos negativos. Demonstra-se a especificidade interspécies dos anticorpos bi-especificos para antigénios de CD3 e HER2 humanas e de cinomolgos. 23.5. Bioactividade dos anticorpos de cadeia única biespecíficos, de HER2 e CD3, específicos interespécies 172 A bioactividade dos anticorpos de cadeia simples biespecificos gerados é analisada por libertação de crómio 51 (51Cr) em ensaios de citotoxicidade in vitro usando as linhas de células positivas de HER2 descritas nos exemplos 23.1 e 23.2. Como células efectoras usa-se CMSP estimuladas desprovidas de CD4/CD56 ou a linha de células T de macaca 4119LnPx, tal como especificado nas respectivas figuras.

A geração de CMSP estimuladas, desprovidas de CD4/CD56, faz-se como se segue: pré-reveste-se um prato de Petri (85 mm de diâmetro, Nunc) com um anticorpo especifico anti-CD3 (por exemplo, 0KT3, Othoclone), numa concentração final de 1 pg/ml, durante 1 hora, a 37 °C. A proteína não ligada é eliminada por uma etapa de lavagem com SBF. As CMSP frescas são isoladas de sangue periférico (30 - 50 ml de sangue humano) por centrifugação em gradiente de Ficoll, de acordo com protocolos-padrão. Adiciona-se 3 - 5 x 107 de CMSP ao prato de Petri pré-revestido, em 50 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/FCS a 10 %/IL-2 a 20 U/ml (Proleukin, Chiron) e estimula-se durante 2 dias. No terceiro dia, recolhem-se as células e lavam-se uma vez com RPMI 1640.Adiciona-se IL-2 até a uma concentração final de 20 U/mL e faz-se a cultura das células outra vez durante um dia, no mesmo meio de cultura de células descrito antes. Pela depleção de células T CD4+ e células AN CD56 + , de acordo com protocolos convencionais, os linfócitos T citotóxicos (LTC) de CD8+ são enriquecidos. As células-alvo são lavadas duas vezes com SBF e marcadas com 11,1, 1 MBq de 51Cr num volume final de 100 μΐ de RPMI com 50 % de FCS durante 45 minutos, a 37 °C. Subsequentemente, as células-alvo marcadas são lavadas 3 vezes com 5 ml de meio RPMI e depois usadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio realiza-se numa placa de 96 poços num volume total de 250 μΐ de RPMI suplementado (como antes) com proporções de E:T 173 de 1:1 ou 10:1, que estão especificadas nas respectivas figuras. Aplica-se 1 pg/ml de moléculas de anticorpos de cadeia única biespecificos, específicos de interespécies diluições de 15-21 vezes. O tempo de ensaio é de 18 horas e a citotoxicidade é medida como valores relativos de crómio libertado no sobrenadante relacionado com a diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e a lise espontânea (sem células efectoras). Todas as medições são realizadas em quadruplicado. A medição da actividade de crómio nos sobrenadantes é realizada com um contador de gama Wizard 3 " (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Kõln, Alemanha) . A análise dos dados experimentais é realizada com o Prism 4 para Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas sigmoidais de resposta à dose normalmente têm valores de R2 > 0,90, conforme determinado pelo programa informático. Os valores de CE50 calculados pelo programa de análise são utilizados para comparação da bioactividade.

Como se mostra na figura 24, os vectores dos anticorpos de cadeia única biespecificos, específicos interespécies demonstram actividade citotóxica contra as células-alvo positivas para HER2 humana, provocada por CMSP humanas estimuladas empobrecidas emCD4/CD56 e contra células-alvo positivas para HER2 de macaca, provocada pela linha de células de macaca 4119LnPx.

Exemplo 24: Clonagem e expressão da forma de IgE ligada à membrana humana e de macaca

Utilizou-se a linha celular J558L de murganho (obtida no Interlab Project, Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Génova, Itália, ECACC 88032902), uma linha de células de mieloma variante com perda espontânea da cadeia 174 pesada, que sintetiza e segrega uma cadeia leve lambda, para ser complementada por uma membrana ligada à variante de cadeia pesada da IgE humana e de macaca, respectivamente. A fim de gerar essas moléculas sintéticas de vectores obtidas por síntese de genes, de acordo com protocolos-padrão (as sequências de nucleótidos dos vectores estão listadas nas SEQ ID Nos 507 e 508). Nestes vectores, a sequência codificadora para a cadeia épsilon humana e de macaca, foi fundida com a região transmembranar humana de IgE, respectivamente. A estrutura construída na especificidade da cadeia VP é dirigida contra o hapteno (4-hidroxi-3-nitro-fenil)-acetilo) (NP). O fragmento de síntese de genes foi concebido também de forma a conter um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do vector e um líder de imunoglobulina e sítios de restrição no início e no final do fragmento do ADN. Os sítios de restrição EcoRI introduzidos na extremidade 5' e Sall na extremidade 3', foram utilizados durante a etapa de clonagem no plasmido de expressão designado por pEFDHFR. Após a verificação da sequência (de macaca: região C épsilon de Ig de macaca mulatta, XM_001116734, ARNm; humana: cromossoma 14 de Homo sapiens, NC_000014, sequência completa, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez) os plasmidos foram utilizados para transfectar as células de OHC/dhfr, tal como descrito antes. A expressão da proteína eucariótica, em células de OHC deficientes em DHFR, é efectuada tal como descrito por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação do gene do vrctor é induzida por concentrações crescentes de metotrexato (MTX) até a uma concentração final de MTX até 20 nM.

Exemplo 25: Geração das moléculas de cadeia única biespecíficas de IgE e CD3, específicas interespécies 175

Em geral, as moléculas de anticorpo de cadeia simples, biespecificas, compreendendo, cada uma, um domínio com uma especificidade de ligação para o antigénio de CD3 humana e de macaca, bem como um domínio com uma especificidade de ligação para o antigénio de IgE humana e de macaca, foram concebidas como estabelecido no quadro 8 que se segue:

Quadro 8: Formatos de moléculas de anticorpos de cadeia única, biespecificos, anti-CD3 e anti-IgE específicos interespécies

SEQ ID (nucl/prot) Formatos de vectores de proteína (N -> C) 496/495 IgE PL x P2C PL 498/497 IgE PL x F12Q PL 500/499 IgE PL x 12C PL 502/501 IgE LP x P2C PL 504/503 IgE LP x F12Q PL 506/505 IgE LP x 12C PL

Os vectores mencionados antes, contendo o domínio variável de cadeia leve (L) e o domínio variável de cadeia pesada (P) específicos interespécies para IgE e CD3 humanas e de macaca, específicas das combinações de VP e VL, específicas interespécies para CD3 humana e de macaca foram obtidos por síntese de genes. Os fragmentos de síntese de genes são concebidos de forma a conter um primeiro sítio de Kozak para a expressão eucariótica do vector, seguido de um péptido líder da imunoglobulina de 19 aminoácidos, seguido, na estrutura, pela sequência de codificação da correspondente molécula de anticorpo biespecífico de cadeia simples, seguida, na estrutura, pela sequência de codificação de um marcador de 6-histidina e um codão de 176 terminação. 0 fragmento de síntese de genes é também concebido de modo a introduzir os sítios de restrição apropriados no início e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos são utilizados nos procedimentos de clonagem seguintes. 0 fragmento de síntese de genes é clonado através destes sítios de restrição num plasmido designado por pEFDHFR seguindo protocolos-padrão. Um clone com a sequência de nucleótidos de sequência verificada é transfectado em células de OHC deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do vector. A expressão da proteína eucariótica, em células de OHC deficientes em DHFR, é efectuada tal como descrito por Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação dos genes do vector é induzida por concentrações crescentes de metotrexato (MTX) até a uma concentração final de MTX até 20 nM. Alternativamente, os vectores são transfectados em células de OHC deficientes em DHFR, de uma forma transiente, de acordo com protocolos-padrão.

As experiências de ligação foram realizados por SCAF com a linha celular humana transfectada de IgE, J558L, para avaliar a capacidade de ligação à IgE humana. A especificidade interespécies para as células positivas de IgE de macaca foi ensaiada através da implantação das células J558L transfectadas com a IgE de macaca. Aplicaram-se as mesmas alterações nas linhas de células aos ensaios de citotoxicidade realizados com os anticorpos de cadeia única biespecíficos, específicos interespécies, de IgE e de CD3. Para além deste, os ensaios foram realizados tal como descrito nos exemplos 4 e 5.

Tal como representado na figura 23, os anticorpos de cadeia simples biespecíficos, específicos das interespécies de IgE e CD3 gerados, cruzada demonstraram ligação tanto 177 aos antigénios humanos como os de cinomolgos e provaram ser totalmente específicos de interespécies.

Tal como se mostra na figura 24, todos os vectores geradas de anticorpo de cadeia única, biespecífico, específico interespécies, revelaram uma actividade citotóxica contra células-alvo humanas positivas para IgE, provocada por células CD8+ humanas e células-alvo positivas para IgE de macaca provocada pela linha de células T de macaca 4119LnPx. Como controlo negativo, tem-se utilizado um anticorpo de cadeia simples biespecífico irrelevante.

Exemplo 26: Ligação especifica de clones de scFv ao terminal N da CD3 épsilon humana 26.1. Expressão bacteriana de vectores de scFv em XL1 Azul de E. coli

Tal como foi mencionado antes, o azul de XL1 de E. coli, transformado com um pComb3H5BHis/Flag contendo um segmento de VL e VP, produziu scFv solúvel em quantidades suficientes, após a excisão do fragmento de gene III e a indução com IPTG 1 mM. A cadeia de scFv é exportada para o periplasma, onde se dobra numa conformação funcional.

Os clones de scFv que se seguem foram escolhidos para esta experiência: i) ScFvs 4-10, 3-106, 3-114, 3-148, 4-48, 3-190 e 3-271 tal como descrito na WO 2004/106380). ii) scFvs dos clones de ligação anti-CD 3 épsilon humana, H2C. F12Q e 12C, tal como aqui descrito. 178 as células

Para as preparações periplasmáticas, bacterianas transformadas com os plasmidos contendo os respectivos scFv que permitem a expressão periplásmica cresceram em meio SB complementado com MgCl2 2 0 mM e carbenicilina a 50 pg/ml e foram dissolvidas novamente em SBF após a colheita. Por meio de quatro ciclos de congelamento a -70 °C e descongelamento, a 37 °C, a membrana externa das bactérias foi destruída pelo choque osmótico e as proteínas periplasmáticas solúveis, incluindo os scFvs, foram libertados para o sobrenadante. Após a eliminação das células e fragmentos de células intactos, por centrifugação, recolheu-se o sobrenadante contendo scFv de CD3 humanas anti-humanos e utilizou-se para uma análise posterior. Estes sobrenadantes impuros contendo scFv serão posteriormente denominado preparações periplasmáticas (PPP). 26.2. Ligação de scFv à proteína de fusão humana CD3 épsilon (1-27 aa) - Fc

As experiências, por meio de ELISA, foram realizadas através do revestimento, com a proteína de fusão humana CD3 épsilon (1-27 aa) - Fc, dos poços de placas de plástico de 96 poços (Nunc, Maxisorb), normalmente a 4 °C, durante a noite. A solução de revestimento de antigénio foi então removida, os poços lavados uma vez com SBF/Tween 20 a 0, 05 % e, subsequentemente, bloqueados com SBF/ASB a 3 %, durante pelo menos uma hora. Após a remoção da solução de bloqueio, as PPP e as soluções de controlo foram adicionadas aos poços e incubadas durante uma hora, normalmente à temperatura ambiente. Os poços foram então lavados três vezes com SBF/Tween 20 a 0,05 %. A detecção dos scFvs ligados ao antigénio imobilizado foi realizada utilizando um anticorpo marcado com biotina, marcador anti- 179

Sigma, normalmente numa FLAG (M2 anti-Flag Bio, _ concentração final de 1 pg/ml de SBF). 0 sinal desenvolveu-se por adição de uma solução de substrato de ABTS e foi medido a um comprimento de onda de 405 nm. A ligação não especifica das amostras de ensaio ao agente de bloqueio e/ou à porção de IgGl humana da proteína de fusão humana CD3 épsilon (1-27 aa) - Fc foi examinada realizando um ensaio com reagentes idênticos e de temporização idêntica em placas de ELISA revestidas com IgGl humana (Sigma). Utilizou-se SBF como controlo negativo.

Como se mostra na figura 25, os scFvs H2C, F12Q e 12C mostram fortes sinais de ligação à proteína de fusão humana CD3 épsilon (1-27 aa) - Fc. Os scFvs humanos 3-106, 3-114, 3-148, 4-48, 3-190, 3-271, 4-10 e 4-48, (tal como descrito na WO 2004/106380) não mostram qualquer ligação significativa acima do nível do controlo negativo.

Para excluir a possibilidade de a ligação positiva dos scFvs H2C, F12Q e 12C aos poços revestidos com a proteína de fusão humana CD3 épsilon (1-27 aa) - Fc possa ser devida à ligação a ASB (utilizada como agente de bloqueio) e/ou a porção Fc gama de IgGl humana da proteína de fusão humana CD3 épsilon (1-27 aa) - Fc, realizou-se, em paralelo, uma segunda experiência por ELISA. Nesta segunda experiência de ELISA, todos os parâmetros foram idênticos aos do primeiro ensaio ELISA, excepto no facto de a segunda experiência por ELISA, a IgGl humana (Sigma) foi revestida em vez da proteína de fusão humana CD3 épsilon (1-27 aa) - Fc. Como se mostra na figura 26, nenhum dos scFvs ensaiados apresentou qualquer ligação significativa a ASB e/ou a IgGl humana, acima do nível inicial. Considerados em conjunto, estes resultados permitem concluir que os scFvs 4-10, 3-271, 3-148, 3-190, 4-48, 3-106 e 3-114 não se ligam 180 especificamente à região CD3 épsilon humana (1 - 27 aa), ao passo que os scFvs H2C, F12Q e 12C mostram claramente a ligação especifica aos 27 aminoácidos de terminal N de CD3 épsilon humana. 181

SEQUÊNCIA QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKE FSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGY : YACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD I I QDGNEEMGDTTQN PYKVSISGTTVTLT QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGY I YACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD 1 QDGNEEMGDTTQN PYKVSISGTTVTLT QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGQEIKWLVNDQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGY YACLSKETPTEEASHYLYLKARVCENCVEVD QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT GSSTGAVTSGYYPN GTKFLAP TIPO aa BB aa aa CD CD aa aa aa aa aa LU 1- z o LL humana humana Callithríx jacchus Callithríx jacchus Saguinus oedipus Saguinus oedipus Saimirí sciureus Saimirí sciureus artificial artificial DESIGNAÇÃO Domínio extracelular de CD3E humana CD3c 1- 27 humana Callithríx jacchus Domínio extracelular de CD3B Callithríx jacchus CD3s 1-27 Saguinus oedipus Domínio extracelular de CD3B Saguinus oedipus CD3e 1-27 Saimirí sciureus Domínio extracelular de CD3E Saimirí sciureus CD3e 1-27 < (O LL. 'o Zj O o K RDC -L2 of F6A SEQ ID NO. ONJ fO ΙΩ (O r- ca CD O 182

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Lisboa, 19 de Setembro de 2012. 299

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido caracterizado pelo facto de compreender um primeiro domínio de ligação, que é um anticorpo capaz de se ligar a um epítopo de uma cadeia de CD3S de ser humano e de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus ou Saimiri sciureus, em que o epítopo faz parte de uma sequência de aminoácidos contida no grupo que consiste nas SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8 e compreende pelo menos a sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gli-Asn-Glu e um segundo domínio de ligação capaz de se ligar a EGFR, Her2/neu ou IgE de um ser humano e/ou de um primata não chimpanzé.
2. 2. Polipéptido, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o epítopo fazer parte de uma sequência de aminoácidos compreendida no grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6 e 8 e compreende pelo menos a sequência de aminoácidos Gln-Asp-Gli-Asn-Glu.
3. 3. Polipéptido, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o primeiro domínio de ligação compreender uma região VL que compreende as RDC-L1, RDC-L2 e RDC-L3 seleccionadas entre: (a) RDC-L1, como representada na SEQ ID NO. 27, RDC-L2, conforme ilustrada na SEQ ID NO. 28 e RDC-L3, conforme ilustrada na SEQ ID NO. 29; (b) RDC-L1, tal como representada na SEQ ID NO. 117, RDC-L2, conforme ilustrada na SEQ ID NO. 118 e RDC-L3, conforme ilustrada na SEQ ID NO. 119 e 1 (c) RDC-L1, tal como representada na SEQ ID NO. 153, RDC-L2, conforme ilustrada na SEQ ID NO. 154 e RDC-L3, conforme ilustrada na SEQ ID NO:155.
4. 4. Polipéptido, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o primeiro domínio de ligação compreender uma região VP compreendendo RDC-P1, RDC-P2 e RDC-P3 seleccionadas entre: (a) RDC-H1, ' tal como representado na SEQ ID NO. 12, RDC- -P2, conforme ilustrada na SEQ ID NO . 13 e RDC- P3, conforme ilustrada na SEQ ID NO. 14; (b) RDC-P1, como representado na SEQ ID NO. 30, RDC- -P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO . 31 e RDC- P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 32; (c) RDC-Pl, como representado na SEQ ID NO. 48, RDC- -P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO . 49 e RDC- P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 50; (d) RDC-Pl, como representado na SEQ ID NO. 66, RDC- -P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO . 67 e RDC- P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 68; (e) RDC-Pl, como representado na SEQ ID NO. 84, RDC- -P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO . 85 e RDC- P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 86; (f) RDC-Pl, como representado na SEQ ID NO • 102, RDC- -P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 103 e RDC- P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 104 r (g) RDC-Pl, como representado na SEQ ID NO • 120, RDC- -P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 121 e RDC- P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 122 r (h) RDC-Pl, como representado na SEQ ID NO • 138, RDC- -P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 139 e RDC- P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 140 r 2 (i) RDC-P1, como representado na SEQ ID NO. 156, RDC-P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 157 e RDC-P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 158, e j) RDC-P1, como representado na SEQ ID NO. 174, RDC-P2, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 175 e RDC-P3, conforme ilustrado na SEQ ID NO:176.
5. 5. Polipéptido, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o primeiro dominio de ligação compreender uma região VL selecionada no grupo que consiste numa região VL tal como ilustrado nas SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 ou 165.
6. 6. Polipéptido, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de o primeiro dominio de ligação compreender uma região VP selecionada no grupo que consiste numa região VP tal como ilustrado nas SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ou 181.
7. 7. Polipéptido, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de o primeiro dominio de ligação compreender uma região VL e uma região VP selecionada no grupo que consiste em: (a) uma região VL, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 17 ou 21 e uma região VP, como representado na SEQ ID NO. 15 ou 19, (b) uma região VL, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 35 ou 39 e uma região VP, como representado na SEQ ID NO. 33 ou 37; 3 (c) uma região VL, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 53 ou 57 e uma região VP, como representado na SEQ ID NO. 51 ou 55; (d) uma região VL, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 71 ou 75 e uma região VP, como representado na SEQ ID NO. 69 ou 73; (e) uma região VL, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 89 ou 93, e uma região VP, como representado na SEQ ID NO. 87 ou 91; (f) uma região VL, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 107 ou 111 e uma região VP, como representado na SEQ ID NO. 105 ou 109; (g) uma região VL, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 125 ou 129 e uma região VP, como representado na SEQ ID NO. 123 ou 127; (h) uma região VL, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 143 ou 147 e uma região VP, como representado na SEQ ID NO. 141 ou 145; (i) uma região VL, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 161 ou 165 e uma região VP, como representado na SEQ ID NO. 159 ou 163; e j) a região VL, conforme ilustrado na SEQ ID NO. 179 ou 183 e uma região VP, como representado na SEQ ID NO. 177 ou 181.
8. 8. Polipéptido, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o primeiro domínio de ligação compreender uma sequência de aminoácidos selecionada no grupo que consiste nas SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, . 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ou 187.
9. 9. Polipéptido, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de o 4 referido polipéptido ser uma molécula de anticorpo de cadeia simples duplamente especifica.
10. 10. Polipéptido, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a molécula de anticorpo de cadeia simples, duplamente especifica, compreender um grupo das sequências que se seguem como RDC Pl, RDC P2, RDC P3, RDC Ll, RDC L2 e RDC L3 no segundo domínio de ligação seleccionado entre as SEQ ID NOs: 441 a 446, SEQ ID NOs: 453 a 458, SEQ ID NOs: 463 a 468, SEQ ID NOs: 481 a 486.
11. 11. Polipéptido, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a molécula de anticorpo biespecífico, de cadeia simples, compreender uma sequência seleccionada entre: (a) uma sequência de aminoacidos tal como representada em uma qualquer das SEQ ID NOs: 38 9, 391, 393, 395, 397, 399 419, 429, 431, 433, 435 469, 471, 473, 475, 477 503 e 505; e 409, 411, 413, 415, 417 437, 439, 447, 449, 451 479, 495, 497, 499, 501 (b) uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos tal como descrito em uma qualquer das SEQ ID NOs: 390, 392, 394, 396, 398, 400, 410, 412, 414, 416, 418 , 420, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 448, 450, 452 , 470, 472, 474, 476, 478, 480, 496, 498, 500, 502, 504 e 506.
12. 12. Sequência de ácidos nucleicos caracterizada pelo facto de codificar para um polipéptido tal como definido em uma qualquer das reivindicações 1 a 11. 5
13. 13. Vector, caracterizado pelo facto de compreender uma sequência de ácidos nucleicos tal como definido na reivindicação 12.
14. 14. Célula hospedeira caracterizada pelo facto de ser transformada ou transfectada com um vector tal como definido na reivindicação 13.
15. 15. Processo para a produção de um polipéptido, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo facto de compreender a cultura de uma célula hospedeira definido na reivindicação 14, em condições que permitam a expressão do polipéptido como definido em uma qualquer das reivindicações 1 a 11 e a recuperação do polipéptido produzido a partir da cultura.
16. 16. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender um polipéptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11 ou produzida de acordo com o processo da reivindicação 15.
17. 17. Polipéptido, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11 ou produzido de acordo com o processo da reivindicação 15 caracterizado pelo facto de se utilizar na prevenção, tratamento ou melhoria de uma doença selecionada entre doenças proliferativas, doença tumoral ou um distúrbio imunológico.
18. 18. Estojo caracterizado pelo facto de compreender um polipéptido, tal como definido em uma qualquer das reivindicações 1 a 11, uma molécula de ácido nucleico tal como definido na reivindicação 12, um vector, tal 6 célula 4. como definido na reivindicação 13 ou uma hospedeira, tal como definido na reivindicação 1 Lisboa, 19 de Setembro. 7